ヒアルロン酸ナトリウムの断片とレチノイドを組み合わせる局所用組成物
【課題】皮膚科学または化粧品学の分野で、局所用調製物に使用することができ、皮膚組織の萎縮に関連する皮膚病であって、皮膚の保湿状態を改善すること、つまり、例えばコルチコイドによる治療の副作用である皮膚萎縮を減少させること、皺を減少させること、光に誘起されたものであるか否かを問わず皮膚老化を防止すること、表皮および真皮の細胞活性を再開させること、皮膚の状態の回復、その弾力を増加させることが必要な皮膚病の防止または治療に用いる組成物の提供。
【解決手段】分子量が５０，０００および７５０，０００Ｄａの間に含まれるヒアルロン酸塩の一つまたは複数の断片、ならびに必要に応じてレチノイドを作用成分として含むことを特徴とする、局所塗布用組成物。
【解決手段】分子量が５０，０００および７５０，０００Ｄａの間に含まれるヒアルロン酸塩の一つまたは複数の断片、ならびに必要に応じてレチノイドを作用成分として含むことを特徴とする、局所塗布用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒアルロン酸塩を主成分にした局所用組成物、そして化粧品学および皮膚科学におけるそれらの使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸塩（ＨＡ）は細胞外基質の主成分である。ＨＡは、軟骨などの「硬組織」と呼ばれる組織内に存在するコンドロイチン硫酸などのその他のグリコサミノグリカンとは対照的に、「軟組織」と呼ばれる結合組織内にとりわけ存在している。したがって、それは主として皮膚内に大量に見出される。
【０００３】
ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの反復単位で構成された、硫酸化していない直鎖状のグリコサミノグリカンである。（Ｔａｍｍｉ Ｒ．， Ａｇｒｅｎ ＵＭ．， Ｔｕｈｋａｎｅｎ ＡＬ．， Ｔａｍｍｉ Ｍ． Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｓｋｉｎ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２９（２）：１−８１， １９９４）。
【０００４】
正常な皮膚において、ＨＡは真皮線維芽細胞と表皮ケラチノサイトによって主として合成される（前掲、Ｔａｍｍｉ Ｒ．）。その残基が負に帯電しているので、ＨＡは皮膚の弾性を保つことを可能にする水のポンプの役割を果たす。ＨＡは、結合組織の栄養素、ホルモン、ビタミンおよび無機塩の拡散制御と、炎症反応を引き起こす可能性のある代謝廃棄物の排出において主たる役割を果たす。年齢とともに、ＨＡの量とその重合度が低下し、結果的に結合組織内に保持される水分の量が減る。このとき皮膚は老化の過程を辿り、線維症の増加と弾性線維の含有量の低下に至る。
【０００５】
正常なヒトの皮膚において、ＨＡは高分子量（６００，０００〜１，０００，０００Ｄａ）のポリマーの形で存在する。皮膚の中でのＨＡの生理的分解は、（１）ＣＤ４４を介したケラチノサイトによる内在化と、（２）ヒアルロニダーゼによる中間的サイズの断片への細胞内での断片化（６０，０００〜３００，０００Ｄａ）によって起きる。断片化したＨＡはケラチノサイトから遊離し、基底膜を通過し、リンパ管内に直接放出される（前掲、Ｔａｍｍｉ Ｒ．他）。
【０００６】
炎症状態において、低分子量の形のＨＡの蓄積が動物において証明されている。炎症の間、フィブリンなどの血小板の走化性因子が、ヒアルロニダーゼの分泌によってＨＡを分解する線維芽細胞の集注と活性化を刺激し、その結果、ＨＡの小さな断片が組織において高度に濃縮される。このＨＡの小さな断片の発生は、顆粒球によって放出された、あるいは紫外線を照射した皮膚内の酸素の反応種による脱重合、または低分子量の断片のデノボ合成などの各種のメカニズムによっても起きる。いくつもの研究が示唆したところでは、高分子量または低分子量のＨＡは、細胞と組織にさまざまな生物学的影響を及ぼす可能性がある（ＭｃＫｅｅ ＣＭ．， Ｐｅｎｎｏ ＭＢ．， Ｃｏｗｍａｎ Ｍ．， Ｂｕｒｄｉｃｋ ＭＤ．， Ｓｔｒｉｅｔｅｒ ＲＭ．， Ｂａｏ Ｃ．， Ｎｏｂｌｅ ＰＷ． Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ（ＨＡ） ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎｄｕｃｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＨＡ ｓｉｚｅ ａｎｄ ＣＤ４４． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ． ９８（１０）：２４０３−１３， １９９６； Ｔｅｒｍｅｅｒ ＣＣ．， Ｈｅｎｎｉｅｓ Ｊ．， Ｖｏｉｔｈ Ｕ．， Ａｈｒｅｎｓ Ｔ．， Ｗｅｉｓｓ ＪＭ．， Ｐｒｅｈｍ Ｐ．， Ｓｉｍｏｎ ＪＣ． Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １６５（４）：１８６３−７０， ２０００； Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ＫＡ．， Ｂｏｗｉｅ ＡＧ．， Ｓｋｅｆｆｉｎｇｔｏｎ ＢＳ．， Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ＬＡ．， Ｒａｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｚｅｔａ，ａｎｄ Ｉ ｋａｐｐａ Ｂ ｋｉｎａｓｅｓ １ ａｎｄ ２ ａｒｅ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ＣＤ４４ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ｂｙ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｔ−２４ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １６４（４）：２０５３−６３， ２０００）。
【０００７】
マウスとヒトの皮膚に塗布された中間分子量（５０，０００〜２５０，０００Ｄａ）のＨＡが表皮と真皮の層を通過するということが証明されている。分解産物は、皮膚にＨＡを塗布してから２時間後に血清内に出現する。血清内に回収されたＨＡの分子量は、皮膚に塗布されたＨＡのそれをわずかに下回り、このことが、ＨＡの皮膚の通過はより小さなサイズ（１００〜１０，０００Ｄａ）の断片だけに限定されないことを証明している（Ｂｒｏｗｎ ＴＪ．， Ａｌｃｏｒｎ Ｄ， Ｆｒａｓｅｒ ＪＲ． Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｓｋｉｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ． １１３（５）：７４０−６， １９９９）。
【０００８】
ビタミンＡ（レチノール）とその天然および合成の誘導体は、集合的にレチノイドと呼ばれ、とりわけ胚発生、増殖、視覚機能、成長調節、および細胞分化現象に顕著な影響のある、きわめて多種多様な物質を構成する（Ｂｌｏｍｈｏｆｆ Ｒ． ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７１：９５１−９９０； Ｓｐｏｒｎ Ｍ．Ｂ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ， ２nd Ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）。
【０００９】
天然レチノイドは、（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｉｎ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８２），１２９，１−５）に定義された下記の一般式（Ｉ）によって定義される。
【化１】
この式において、
Ｒ＝ＣＨ2ＯＨはレチノール（ＲＯＬ）に対応し、
Ｒ＝ＣＨＯはレチナール（ＲＡＬ）に対応し、
Ｒ＝ＣＯＯＨはレチノイン酸（ＲＡ）に対応する。
【００１０】
レチノイドの生物学的影響には、レチノイドと、ＲＡＲ（レチノイン酸受容体）タイプやＲＸＲ（レチノイン酸Ｘ受容体）タイプの核受容体との相互作用が介在する。受容体ＲＡＲの既知のリガンドは、ビタミンＡ酸の形のトランス異性体（トランスレチノイン酸）である。
【００１１】
上皮細胞を含む、多数の細胞タイプにおいて、ＲＯＬはレチニルエステルに代謝される。
【００１２】
皮膚科学におけるレチノイドの重要性は、ビタミンＡ欠乏が原因である皮膚異常を有する動物における最初の観察にさかのぼる（Ｗｏｌｂａｃｈ ｅｔ Ｈｏｗｅ， Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅｄ． ４３：７５３）。
【００１３】
今日では、きわめて多数のレチノイドが合成されている。主たる使用分野は、依然として、光線性角化症、座瘡などの、皮膚における徴候、および乾癬やダリエー病などの角質化異常の、局所または経口での一般的な治療である。
【００１４】
他方で、レチノイドとのいくつかの組合せまたは連携も知られている。
・細胞分化に作用する分子と免疫調節に作用する分子の組合せ、例えば、皮膚リンパ腫におけるレチノイドと化学療法との組合せ（Ｔｈｅｓｔｒｕｐ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１８：８１１−８１８）。
・例えばソラーレンとの連携による、レチノイドと光線療法との組合せ（Ｓａｕｒａｔ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ １７７：２１８−２２４）。
・レチノイド代謝に影響する分子の組合せ。これは例えば、レチノイド代謝を阻害し、活性ホルモンの細胞内の割合の増加を可能にするアゾールとビタミンＤ誘導体との間の相互作用の場合である（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． （１９９２） ２８６：７５５−７６０， Ｊｕｇｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｋｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９８）。
【００１５】
他方で、局所塗布した場合のレチノイドの主な副作用の一つとして炎症が依然として誘発されることが知られている。この作用は治療のコンプライアンスに対する重大な障害となるおそれがある。
【００１６】
レチノイド族の一つであるレチンアルデヒド（ＲＡＬ）はビタミンＡの天然代謝物であり、現在ヒトにおいて局所塗布に用いられている。ＲＡＬは、表皮過形成と同時にＣ５７ＢＬ／６マウスと無毛のＳＫＨ１（ＳＫＨ１ ｈａｉｒｌｅｓｓ）マウスの毛包表皮および毛包間表皮内でＣＤ４４とＨＡの発現の明らかな増加を誘発して、皮膚内で生物活性を発揮することが証明された。これらの作用はレチノイン酸（ＲＡ）およびレチノール（ＲＯＬ）の局所塗布の後でも観測された。しかしながら、ＣＤ４４の発現とＨＡの発現は、ＲＡまたはＲＯＬで処理されたマウスよりもＲＡＬで処理されたマウスにおいてはるかに大幅に増加した。
【００１７】
ＣＤ４４は多形の膜貫通型糖タンパクであり、選択的スプライシングと翻訳後修飾によって発生したいくつものアイソフォームを有する。最近の研究において、出願人は、マウスの皮膚内でのＣＤ４４の二つの主要な機能が、（１）細胞外刺激に応じたケラチノサイト増殖の調節と、（２）局部におけるＨＡの恒常性の維持であることを証明した（Ｋａｙａ Ｇ．， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｉ．， Ｊｏｒｃａｎｏ ＪＬ．， Ｖａｓｓａｌｌｉ Ｐ．， Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ Ｉ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４４ ｉｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｂｅａｒｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＣＤ４４ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ａ ｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｓ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． １１（８）：９９６−１００７， １９９７）。出願人は、ＨＡの皮膚沈着と表皮萎縮も引き起こす可能性がある硬化性萎縮性苔癬を患っている患者において、表皮のＣＤ４４の発現が減少していることも観測した（Ｋａｙａ Ｇ．， Ａｕｇｓｂｕｒｇｅｒ Ｅ．， Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ Ｋ．， Ｓａｕｒａｔ ＪＨ． Ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ＣＤ４４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ａｂｎｏｒｍａｌ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｄｅｒｍｉｓ ｉｎ ｌｉｃｈｅｎ ｓｃｌｅｒｏｓｕｓ ａｎｄ ａｔｒｏｐｈｉｃｕｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ． １１５（６）：１０５４−８， ２０００）。
【００１８】
ＣＤ４４は、細胞−細胞および細胞−基質の相互作用に関与する。最近の研究が明らかにしたところでは、ＣＤ４４とＨＡ断片の対（ＣＤ４４−ＨＡＦ）は、有糸分裂とＨＡの新合成を誘導する（Ｌａｕｒｅｎｔ ＴＣ， Ｌａｕｒｅｎｔ ＵＢ， Ｆｒａｓｅｒ ＪＲ． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ： Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７４（２）：１−７， １９９６）。ＨＡとＲＡＬの表皮および真皮への作用は、したがって、ＣＤ４４によって仲介されると思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
現在、高分子量のＨＡの無機塩を含有する医薬品と化粧品、とりわけＨｅａｌｏｎ、Ｈｙａｌｇａｎ、Ｐｒｏｖｉｓｃ、Ｖｉｔｒａｘ、および、Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｄｒｕｇ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第３２版、１９９９、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｉｔｏｒに挙げられたものが存在する。
【００２０】
しかしながら、ＨＡは分子量が大きいので皮膚を通過しにくい。
【００２１】
その故に、国際公開第０２／０７６４７０号パンフレットにおいて、出願人は、Ｎ−アセチル−グルコサミンをレチノイドに組み合わせた組成物を提案している。この組合せは、インビトロで、表皮細胞によるヒアルロン酸合成を相乗的に増加させる。インビボで配合物を適用した後に得られた結果はいっさい記載されていない。
【００２２】
特開平１１−２７９０４２号公報は、硫酸化したヒアルロン酸の断片を主成分とする組成物を記載しているが、前記断片は好適には１，０００と５０，０００Ｄａの間に含まれる分子量を有し、硫酸基は化学式中の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の全体の１０から９０％を占める。低分子量のこれらの断片は、皮膚の弾性を維持する活性およびケラチン化を防止する活性がきわめて高い。反対に、硫酸化していないヒアルロン酸の断片は、試験において不活性であることがわかった。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
しかるに、発明者らは意外なことに、分子量が５０，０００と７５０，０００Ｄａの間に含まれる断片状の加水分解された硫酸化していないＨＡが、皮膚に対する生物活性を有し、これら断片がレチノイドと組み合わされたときに皮膚が増幅するということを示した。
【００２４】
結果的に、本発明は、５０，０００と７５０，０００Ｄａの間に含まれる低分子量のヒアルロン酸塩の一つまたは複数の断片を作用成分として含むことを特徴とする、局所塗布用の組成物を対象とする。
【００２５】
本発明の推奨実施態様において、ヒアルロン酸塩断片の分子量は５０，０００と２５０，０００Ｄａの間、あるいは２５０，０００と７５０，０００Ｄａの間に含まれる。
【００２６】
本発明のもう一つの推奨実施態様において、組成物はさらに少なくとも一つのレチノイドを含有している。
【００２７】
分子量が５０，０００と７５０，０００Ｄａの間に含まれるヒアルロン酸塩断片とレチノイドとの組合せは、ケラチノサイトによるヒアルロン酸合成に相乗的な効果がある。
【００２８】
本発明の趣旨において、レチノイドは、レチノールおよびその異性体、レチナール、レチノイン酸およびその異性体、ならびにレチノイン酸エステルを意味する。
【００２９】
ヒアルロン酸塩は、任意の塩、とりわけヒアルロン酸ナトリウムを意味する。
【００３０】
本発明による局所用組成物は、着色剤、シリコーン油、レチノイドもしくは着色色素、防腐剤、植物油、酸化防止剤、無機塩、増粘剤、ｐＨ調整剤、紫外線吸収剤、ビタミン、または皮膚科学および薬学において許容される他のいっさいの賦形剤も含有することができる。
【００３１】
本発明による組成物は、皺のある皮膚、乾燥している皮膚などの予防または改善のために化粧品学または皮膚科学において使用可能であり、皮膚のしまりと潤いを維持することを可能にする。
【００３２】
本発明による組成物は、皮膚科学または化粧品学の分野で、局所用調製物に使用することができ、皮膚組織の萎縮に関連する皮膚病であって、皮膚の保湿状態を改善すること、つまり、例えばコルチコイドによる治療の副作用である皮膚萎縮を減少させること、皺を減少させること、光に誘起されたものであるか否かを問わず皮膚老化を防止すること、表皮および真皮の細胞活性を再開させること、皮膚の状態の回復、その弾力を増加させることが必要な皮膚病の防止または治療を目的としている。
【００３３】
本発明を以下の実施例と図によって説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】未処理動物、および、実施例１および２に記述した調製方法によって得られた調製物５、調製物３または調製物７で毎日二回処理した動物における、表皮内で測定されたＨＡの量を示している。
【図２】未処理動物、および、実施例１および２で調製した調製物５、３または７で処理した動物における、真皮内のＨＡの量を示している。
【図３】図３は、調製物１〜４の組成および効果を示した表１〜４である。
【図４】図４は、調製物５〜８の組成および効果を示した表５〜７である。
【実施例１】
【００３５】
局所的に用いられたヒアルロン酸塩断片の効果
【００３６】
１．材料と方法
１．１．調製物
３つのタイプのヒアルロン酸塩断片（ＨＡＦ）を評価した。
・超高分子量のＨＡＦ（１，０００，０００−２，０００，０００Ｄａ）
・低分子量のＨＡＦ（５０，０００−７５０，０００Ｄａ）
−ＨＡＦ（２５０，０００―７５０，０００Ｄａ）
−ＨＡＦ（５０，０００−２５０，０００Ｄａ）
・超低分子量のＨＡＦ（１，０００−２０，０００Ｄａ）
これらの断片を従来の化粧品調製物内に含め、その二つの組成の例を下記の表１に示した。
【表１】
【００３７】
１．２ ＨＡＦ活性の測定
各群につき３頭の無毛のＳＫＨ１（ＳＫＨ１ ｈａｉｒｌｅｓｓ）マウスを使用する。
【００３８】
さまざまな調製物を局所的に塗布した。
【００３９】
表皮の厚みを目盛り付きの接眼レンズ（Ｚｅｉｓｓ）で測定する。倍率４０倍で、マウス１頭あたり５つの領域の平均を出す。
【００４０】
倍率４０倍で、マウス１頭あたり５つの領域の平均を出して真皮細胞の数を算定し、真皮の細胞充実性を評価する。
【００４１】
表皮と真皮の増殖細胞の数を、抗Ｋｉ−６７抗体（ラット抗マウス抗体、Ｄａｋｏ）によるＫｉ６７の免疫標識によって明らかにした。
【００４２】
真皮内のヒアルロン酸塩の存在を、ＥＬＩＳＡ技術（Ｃｏｒｇｅｎｉｘ）に従って、毎日二回の割合でさまざまな調製物を塗布した後に測定し、コロイド鉄での着色によって、組織切片上のヒアルロン酸塩を明らかにした。
【００４３】
２．結果
２．１．表皮の厚み、真皮の細胞充実性、および増殖細胞の数に対する効果
結果を表２および表３にまとめた。
【００４４】
本発明による低分子量のＨＡＦを配合し、局所的に塗布された調製物２および３は、それぞれ高分子量および超低分子量のＨＡＦを含有する調製物１および４と比較して、無毛のＳＫＨ１マウス（ＳＫＨ１ ｈａｉｒｌｅｓｓ）において、表皮の厚みと真皮の細胞充実性で有意の増加を示す（表２）。調製物３も、調製物１と４と比較して、無毛のＳＫＨ１マウス（ＳＫＨ１ ｈａｉｒｌｅｓｓ）において、表皮と真皮の増殖細胞の数の有意の増加を示す（表３）。
【００４５】
調製物２および３の局所塗布は、真皮の表層と深層で細胞充実性の増加を誘発する。数が増えた細胞は主として、十分に発育した小胞体を有する、活性化した表現型を示す線維芽細胞である。
【００４６】
２．２．真皮内のＨＡの割合に対する効果
結果を表４にまとめた。
【００４７】
真皮内のＨＡの存在を、調製物２および３について検出した（調製物３＞調製物２）。
【００４８】
ＨＡの割合は、調製物１および４を塗布した後では検出できない。
【００４９】
このようにして発明者らは、低分子量のＨＡＦを局所塗布すると２つの大きな結果が得られることを示した。
１−増殖細胞の増加を伴う大幅な表皮過形成、
２−線維芽細胞の大幅な増加を伴う、真皮表層内に集中したＨＡの蓄積。
このような結果は、高分子量または超低分子量のＨＡＦでは観察されない。
【実施例２】
【００５０】
レチノイドと低分子量のＨＡＦの組合せの効果
１．材料と方法
表５の断片は、先に例示したような従来の化粧品調製物内に含まれている。
【００５１】
２．結果
結果を、表６および７ならびに図１および２にまとめた。調製物６および７の局所塗布は肥厚した表皮の箇所の数を増加させる。
【００５２】
ＲＡＬ単体（調製物５）の塗布の効果は、低分子量のＨＡＦをＲＡＬと組み合わせた調製物８で得られる効果と同等であり、ＲＡＬと超低分子量の断片との間に相乗作用がないことを示している。
【００５３】
ＨＡＦ−ＲＡＬの組合せの相乗作用は、調製物６および７で、真皮の細胞充実性についてとくに顕著である（表５参照）。
【００５４】
調製物６および７の局所塗布も、真皮ＨＡの着色を増加させる（調製物７＞調製物６）（表７参照）。
【００５５】
ＨＡＦ−ＲＡＬの組合せの相乗作用もまた、上述のさまざまな調製物で処理したマウスの真皮と表皮内のＨＡの存在をＥＬＩＳＡ測定して明らかにした。
【００５６】
結果は、ＲＡＬ単体（調製物５）またはＨＡＦ単体（調製物３）による処理と比較して、ＨＡＦ−ＲＡＬの組合せ（調製物７）による処置の後に、真皮内でも（図２）表皮内でも（図１）ＨＡ産生の有意の増加を示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００５７】
【特許文献１】国際公開第０２／０７６４７０号パンフレット
【特許文献２】特開平１１−２７９０４２号公報
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒアルロン酸塩を主成分にした局所用組成物、そして化粧品学および皮膚科学におけるそれらの使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸塩（ＨＡ）は細胞外基質の主成分である。ＨＡは、軟骨などの「硬組織」と呼ばれる組織内に存在するコンドロイチン硫酸などのその他のグリコサミノグリカンとは対照的に、「軟組織」と呼ばれる結合組織内にとりわけ存在している。したがって、それは主として皮膚内に大量に見出される。
【０００３】
ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの反復単位で構成された、硫酸化していない直鎖状のグリコサミノグリカンである。（Ｔａｍｍｉ Ｒ．， Ａｇｒｅｎ ＵＭ．， Ｔｕｈｋａｎｅｎ ＡＬ．， Ｔａｍｍｉ Ｍ． Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｓｋｉｎ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２９（２）：１−８１， １９９４）。
【０００４】
正常な皮膚において、ＨＡは真皮線維芽細胞と表皮ケラチノサイトによって主として合成される（前掲、Ｔａｍｍｉ Ｒ．）。その残基が負に帯電しているので、ＨＡは皮膚の弾性を保つことを可能にする水のポンプの役割を果たす。ＨＡは、結合組織の栄養素、ホルモン、ビタミンおよび無機塩の拡散制御と、炎症反応を引き起こす可能性のある代謝廃棄物の排出において主たる役割を果たす。年齢とともに、ＨＡの量とその重合度が低下し、結果的に結合組織内に保持される水分の量が減る。このとき皮膚は老化の過程を辿り、線維症の増加と弾性線維の含有量の低下に至る。
【０００５】
正常なヒトの皮膚において、ＨＡは高分子量（６００，０００〜１，０００，０００Ｄａ）のポリマーの形で存在する。皮膚の中でのＨＡの生理的分解は、（１）ＣＤ４４を介したケラチノサイトによる内在化と、（２）ヒアルロニダーゼによる中間的サイズの断片への細胞内での断片化（６０，０００〜３００，０００Ｄａ）によって起きる。断片化したＨＡはケラチノサイトから遊離し、基底膜を通過し、リンパ管内に直接放出される（前掲、Ｔａｍｍｉ Ｒ．他）。
【０００６】
炎症状態において、低分子量の形のＨＡの蓄積が動物において証明されている。炎症の間、フィブリンなどの血小板の走化性因子が、ヒアルロニダーゼの分泌によってＨＡを分解する線維芽細胞の集注と活性化を刺激し、その結果、ＨＡの小さな断片が組織において高度に濃縮される。このＨＡの小さな断片の発生は、顆粒球によって放出された、あるいは紫外線を照射した皮膚内の酸素の反応種による脱重合、または低分子量の断片のデノボ合成などの各種のメカニズムによっても起きる。いくつもの研究が示唆したところでは、高分子量または低分子量のＨＡは、細胞と組織にさまざまな生物学的影響を及ぼす可能性がある（ＭｃＫｅｅ ＣＭ．， Ｐｅｎｎｏ ＭＢ．， Ｃｏｗｍａｎ Ｍ．， Ｂｕｒｄｉｃｋ ＭＤ．， Ｓｔｒｉｅｔｅｒ ＲＭ．， Ｂａｏ Ｃ．， Ｎｏｂｌｅ ＰＷ． Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ（ＨＡ） ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎｄｕｃｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＨＡ ｓｉｚｅ ａｎｄ ＣＤ４４． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ． ９８（１０）：２４０３−１３， １９９６； Ｔｅｒｍｅｅｒ ＣＣ．， Ｈｅｎｎｉｅｓ Ｊ．， Ｖｏｉｔｈ Ｕ．， Ａｈｒｅｎｓ Ｔ．， Ｗｅｉｓｓ ＪＭ．， Ｐｒｅｈｍ Ｐ．， Ｓｉｍｏｎ ＪＣ． Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １６５（４）：１８６３−７０， ２０００； Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ＫＡ．， Ｂｏｗｉｅ ＡＧ．， Ｓｋｅｆｆｉｎｇｔｏｎ ＢＳ．， Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ＬＡ．， Ｒａｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｚｅｔａ，ａｎｄ Ｉ ｋａｐｐａ Ｂ ｋｉｎａｓｅｓ １ ａｎｄ ２ ａｒｅ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ＣＤ４４ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ｂｙ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｔ−２４ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １６４（４）：２０５３−６３， ２０００）。
【０００７】
マウスとヒトの皮膚に塗布された中間分子量（５０，０００〜２５０，０００Ｄａ）のＨＡが表皮と真皮の層を通過するということが証明されている。分解産物は、皮膚にＨＡを塗布してから２時間後に血清内に出現する。血清内に回収されたＨＡの分子量は、皮膚に塗布されたＨＡのそれをわずかに下回り、このことが、ＨＡの皮膚の通過はより小さなサイズ（１００〜１０，０００Ｄａ）の断片だけに限定されないことを証明している（Ｂｒｏｗｎ ＴＪ．， Ａｌｃｏｒｎ Ｄ， Ｆｒａｓｅｒ ＪＲ． Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｓｋｉｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ． １１３（５）：７４０−６， １９９９）。
【０００８】
ビタミンＡ（レチノール）とその天然および合成の誘導体は、集合的にレチノイドと呼ばれ、とりわけ胚発生、増殖、視覚機能、成長調節、および細胞分化現象に顕著な影響のある、きわめて多種多様な物質を構成する（Ｂｌｏｍｈｏｆｆ Ｒ． ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７１：９５１−９９０； Ｓｐｏｒｎ Ｍ．Ｂ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ， ２nd Ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）。
【０００９】
天然レチノイドは、（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｉｎ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８２），１２９，１−５）に定義された下記の一般式（Ｉ）によって定義される。
【化１】
この式において、
Ｒ＝ＣＨ2ＯＨはレチノール（ＲＯＬ）に対応し、
Ｒ＝ＣＨＯはレチナール（ＲＡＬ）に対応し、
Ｒ＝ＣＯＯＨはレチノイン酸（ＲＡ）に対応する。
【００１０】
レチノイドの生物学的影響には、レチノイドと、ＲＡＲ（レチノイン酸受容体）タイプやＲＸＲ（レチノイン酸Ｘ受容体）タイプの核受容体との相互作用が介在する。受容体ＲＡＲの既知のリガンドは、ビタミンＡ酸の形のトランス異性体（トランスレチノイン酸）である。
【００１１】
上皮細胞を含む、多数の細胞タイプにおいて、ＲＯＬはレチニルエステルに代謝される。
【００１２】
皮膚科学におけるレチノイドの重要性は、ビタミンＡ欠乏が原因である皮膚異常を有する動物における最初の観察にさかのぼる（Ｗｏｌｂａｃｈ ｅｔ Ｈｏｗｅ， Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅｄ． ４３：７５３）。
【００１３】
今日では、きわめて多数のレチノイドが合成されている。主たる使用分野は、依然として、光線性角化症、座瘡などの、皮膚における徴候、および乾癬やダリエー病などの角質化異常の、局所または経口での一般的な治療である。
【００１４】
他方で、レチノイドとのいくつかの組合せまたは連携も知られている。
・細胞分化に作用する分子と免疫調節に作用する分子の組合せ、例えば、皮膚リンパ腫におけるレチノイドと化学療法との組合せ（Ｔｈｅｓｔｒｕｐ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１８：８１１−８１８）。
・例えばソラーレンとの連携による、レチノイドと光線療法との組合せ（Ｓａｕｒａｔ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ １７７：２１８−２２４）。
・レチノイド代謝に影響する分子の組合せ。これは例えば、レチノイド代謝を阻害し、活性ホルモンの細胞内の割合の増加を可能にするアゾールとビタミンＤ誘導体との間の相互作用の場合である（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． （１９９２） ２８６：７５５−７６０， Ｊｕｇｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｋｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９８）。
【００１５】
他方で、局所塗布した場合のレチノイドの主な副作用の一つとして炎症が依然として誘発されることが知られている。この作用は治療のコンプライアンスに対する重大な障害となるおそれがある。
【００１６】
レチノイド族の一つであるレチンアルデヒド（ＲＡＬ）はビタミンＡの天然代謝物であり、現在ヒトにおいて局所塗布に用いられている。ＲＡＬは、表皮過形成と同時にＣ５７ＢＬ／６マウスと無毛のＳＫＨ１（ＳＫＨ１ ｈａｉｒｌｅｓｓ）マウスの毛包表皮および毛包間表皮内でＣＤ４４とＨＡの発現の明らかな増加を誘発して、皮膚内で生物活性を発揮することが証明された。これらの作用はレチノイン酸（ＲＡ）およびレチノール（ＲＯＬ）の局所塗布の後でも観測された。しかしながら、ＣＤ４４の発現とＨＡの発現は、ＲＡまたはＲＯＬで処理されたマウスよりもＲＡＬで処理されたマウスにおいてはるかに大幅に増加した。
【００１７】
ＣＤ４４は多形の膜貫通型糖タンパクであり、選択的スプライシングと翻訳後修飾によって発生したいくつものアイソフォームを有する。最近の研究において、出願人は、マウスの皮膚内でのＣＤ４４の二つの主要な機能が、（１）細胞外刺激に応じたケラチノサイト増殖の調節と、（２）局部におけるＨＡの恒常性の維持であることを証明した（Ｋａｙａ Ｇ．， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｉ．， Ｊｏｒｃａｎｏ ＪＬ．， Ｖａｓｓａｌｌｉ Ｐ．， Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ Ｉ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４４ ｉｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｂｅａｒｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＣＤ４４ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ａ ｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｓ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． １１（８）：９９６−１００７， １９９７）。出願人は、ＨＡの皮膚沈着と表皮萎縮も引き起こす可能性がある硬化性萎縮性苔癬を患っている患者において、表皮のＣＤ４４の発現が減少していることも観測した（Ｋａｙａ Ｇ．， Ａｕｇｓｂｕｒｇｅｒ Ｅ．， Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ Ｋ．， Ｓａｕｒａｔ ＪＨ． Ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ＣＤ４４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ａｂｎｏｒｍａｌ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｄｅｒｍｉｓ ｉｎ ｌｉｃｈｅｎ ｓｃｌｅｒｏｓｕｓ ａｎｄ ａｔｒｏｐｈｉｃｕｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ． １１５（６）：１０５４−８， ２０００）。
【００１８】
ＣＤ４４は、細胞−細胞および細胞−基質の相互作用に関与する。最近の研究が明らかにしたところでは、ＣＤ４４とＨＡ断片の対（ＣＤ４４−ＨＡＦ）は、有糸分裂とＨＡの新合成を誘導する（Ｌａｕｒｅｎｔ ＴＣ， Ｌａｕｒｅｎｔ ＵＢ， Ｆｒａｓｅｒ ＪＲ． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ： Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７４（２）：１−７， １９９６）。ＨＡとＲＡＬの表皮および真皮への作用は、したがって、ＣＤ４４によって仲介されると思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
現在、高分子量のＨＡの無機塩を含有する医薬品と化粧品、とりわけＨｅａｌｏｎ、Ｈｙａｌｇａｎ、Ｐｒｏｖｉｓｃ、Ｖｉｔｒａｘ、および、Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｄｒｕｇ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第３２版、１９９９、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｉｔｏｒに挙げられたものが存在する。
【００２０】
しかしながら、ＨＡは分子量が大きいので皮膚を通過しにくい。
【００２１】
その故に、国際公開第０２／０７６４７０号パンフレットにおいて、出願人は、Ｎ−アセチル−グルコサミンをレチノイドに組み合わせた組成物を提案している。この組合せは、インビトロで、表皮細胞によるヒアルロン酸合成を相乗的に増加させる。インビボで配合物を適用した後に得られた結果はいっさい記載されていない。
【００２２】
特開平１１−２７９０４２号公報は、硫酸化したヒアルロン酸の断片を主成分とする組成物を記載しているが、前記断片は好適には１，０００と５０，０００Ｄａの間に含まれる分子量を有し、硫酸基は化学式中の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の全体の１０から９０％を占める。低分子量のこれらの断片は、皮膚の弾性を維持する活性およびケラチン化を防止する活性がきわめて高い。反対に、硫酸化していないヒアルロン酸の断片は、試験において不活性であることがわかった。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
しかるに、発明者らは意外なことに、分子量が５０，０００と７５０，０００Ｄａの間に含まれる断片状の加水分解された硫酸化していないＨＡが、皮膚に対する生物活性を有し、これら断片がレチノイドと組み合わされたときに皮膚が増幅するということを示した。
【００２４】
結果的に、本発明は、５０，０００と７５０，０００Ｄａの間に含まれる低分子量のヒアルロン酸塩の一つまたは複数の断片を作用成分として含むことを特徴とする、局所塗布用の組成物を対象とする。
【００２５】
本発明の推奨実施態様において、ヒアルロン酸塩断片の分子量は５０，０００と２５０，０００Ｄａの間、あるいは２５０，０００と７５０，０００Ｄａの間に含まれる。
【００２６】
本発明のもう一つの推奨実施態様において、組成物はさらに少なくとも一つのレチノイドを含有している。
【００２７】
分子量が５０，０００と７５０，０００Ｄａの間に含まれるヒアルロン酸塩断片とレチノイドとの組合せは、ケラチノサイトによるヒアルロン酸合成に相乗的な効果がある。
【００２８】
本発明の趣旨において、レチノイドは、レチノールおよびその異性体、レチナール、レチノイン酸およびその異性体、ならびにレチノイン酸エステルを意味する。
【００２９】
ヒアルロン酸塩は、任意の塩、とりわけヒアルロン酸ナトリウムを意味する。
【００３０】
本発明による局所用組成物は、着色剤、シリコーン油、レチノイドもしくは着色色素、防腐剤、植物油、酸化防止剤、無機塩、増粘剤、ｐＨ調整剤、紫外線吸収剤、ビタミン、または皮膚科学および薬学において許容される他のいっさいの賦形剤も含有することができる。
【００３１】
本発明による組成物は、皺のある皮膚、乾燥している皮膚などの予防または改善のために化粧品学または皮膚科学において使用可能であり、皮膚のしまりと潤いを維持することを可能にする。
【００３２】
本発明による組成物は、皮膚科学または化粧品学の分野で、局所用調製物に使用することができ、皮膚組織の萎縮に関連する皮膚病であって、皮膚の保湿状態を改善すること、つまり、例えばコルチコイドによる治療の副作用である皮膚萎縮を減少させること、皺を減少させること、光に誘起されたものであるか否かを問わず皮膚老化を防止すること、表皮および真皮の細胞活性を再開させること、皮膚の状態の回復、その弾力を増加させることが必要な皮膚病の防止または治療を目的としている。
【００３３】
本発明を以下の実施例と図によって説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】未処理動物、および、実施例１および２に記述した調製方法によって得られた調製物５、調製物３または調製物７で毎日二回処理した動物における、表皮内で測定されたＨＡの量を示している。
【図２】未処理動物、および、実施例１および２で調製した調製物５、３または７で処理した動物における、真皮内のＨＡの量を示している。
【図３】図３は、調製物１〜４の組成および効果を示した表１〜４である。
【図４】図４は、調製物５〜８の組成および効果を示した表５〜７である。
【実施例１】
【００３５】
局所的に用いられたヒアルロン酸塩断片の効果
【００３６】
１．材料と方法
１．１．調製物
３つのタイプのヒアルロン酸塩断片（ＨＡＦ）を評価した。
・超高分子量のＨＡＦ（１，０００，０００−２，０００，０００Ｄａ）
・低分子量のＨＡＦ（５０，０００−７５０，０００Ｄａ）
−ＨＡＦ（２５０，０００―７５０，０００Ｄａ）
−ＨＡＦ（５０，０００−２５０，０００Ｄａ）
・超低分子量のＨＡＦ（１，０００−２０，０００Ｄａ）
これらの断片を従来の化粧品調製物内に含め、その二つの組成の例を下記の表１に示した。
【表１】
【００３７】
１．２ ＨＡＦ活性の測定
各群につき３頭の無毛のＳＫＨ１（ＳＫＨ１ ｈａｉｒｌｅｓｓ）マウスを使用する。
【００３８】
さまざまな調製物を局所的に塗布した。
【００３９】
表皮の厚みを目盛り付きの接眼レンズ（Ｚｅｉｓｓ）で測定する。倍率４０倍で、マウス１頭あたり５つの領域の平均を出す。
【００４０】
倍率４０倍で、マウス１頭あたり５つの領域の平均を出して真皮細胞の数を算定し、真皮の細胞充実性を評価する。
【００４１】
表皮と真皮の増殖細胞の数を、抗Ｋｉ−６７抗体（ラット抗マウス抗体、Ｄａｋｏ）によるＫｉ６７の免疫標識によって明らかにした。
【００４２】
真皮内のヒアルロン酸塩の存在を、ＥＬＩＳＡ技術（Ｃｏｒｇｅｎｉｘ）に従って、毎日二回の割合でさまざまな調製物を塗布した後に測定し、コロイド鉄での着色によって、組織切片上のヒアルロン酸塩を明らかにした。
【００４３】
２．結果
２．１．表皮の厚み、真皮の細胞充実性、および増殖細胞の数に対する効果
結果を表２および表３にまとめた。
【００４４】
本発明による低分子量のＨＡＦを配合し、局所的に塗布された調製物２および３は、それぞれ高分子量および超低分子量のＨＡＦを含有する調製物１および４と比較して、無毛のＳＫＨ１マウス（ＳＫＨ１ ｈａｉｒｌｅｓｓ）において、表皮の厚みと真皮の細胞充実性で有意の増加を示す（表２）。調製物３も、調製物１と４と比較して、無毛のＳＫＨ１マウス（ＳＫＨ１ ｈａｉｒｌｅｓｓ）において、表皮と真皮の増殖細胞の数の有意の増加を示す（表３）。
【００４５】
調製物２および３の局所塗布は、真皮の表層と深層で細胞充実性の増加を誘発する。数が増えた細胞は主として、十分に発育した小胞体を有する、活性化した表現型を示す線維芽細胞である。
【００４６】
２．２．真皮内のＨＡの割合に対する効果
結果を表４にまとめた。
【００４７】
真皮内のＨＡの存在を、調製物２および３について検出した（調製物３＞調製物２）。
【００４８】
ＨＡの割合は、調製物１および４を塗布した後では検出できない。
【００４９】
このようにして発明者らは、低分子量のＨＡＦを局所塗布すると２つの大きな結果が得られることを示した。
１−増殖細胞の増加を伴う大幅な表皮過形成、
２−線維芽細胞の大幅な増加を伴う、真皮表層内に集中したＨＡの蓄積。
このような結果は、高分子量または超低分子量のＨＡＦでは観察されない。
【実施例２】
【００５０】
レチノイドと低分子量のＨＡＦの組合せの効果
１．材料と方法
表５の断片は、先に例示したような従来の化粧品調製物内に含まれている。
【００５１】
２．結果
結果を、表６および７ならびに図１および２にまとめた。調製物６および７の局所塗布は肥厚した表皮の箇所の数を増加させる。
【００５２】
ＲＡＬ単体（調製物５）の塗布の効果は、低分子量のＨＡＦをＲＡＬと組み合わせた調製物８で得られる効果と同等であり、ＲＡＬと超低分子量の断片との間に相乗作用がないことを示している。
【００５３】
ＨＡＦ−ＲＡＬの組合せの相乗作用は、調製物６および７で、真皮の細胞充実性についてとくに顕著である（表５参照）。
【００５４】
調製物６および７の局所塗布も、真皮ＨＡの着色を増加させる（調製物７＞調製物６）（表７参照）。
【００５５】
ＨＡＦ−ＲＡＬの組合せの相乗作用もまた、上述のさまざまな調製物で処理したマウスの真皮と表皮内のＨＡの存在をＥＬＩＳＡ測定して明らかにした。
【００５６】
結果は、ＲＡＬ単体（調製物５）またはＨＡＦ単体（調製物３）による処理と比較して、ＨＡＦ−ＲＡＬの組合せ（調製物７）による処置の後に、真皮内でも（図２）表皮内でも（図１）ＨＡ産生の有意の増加を示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００５７】
【特許文献１】国際公開第０２／０７６４７０号パンフレット
【特許文献２】特開平１１−２７９０４２号公報
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皺のある皮膚、乾燥している皮膚を改善もしくは予防するため、皮膚組織の萎縮に関連する皮膚病を改善もしくは予防するため、皮膚萎縮を減少するため、皺を減少させるため、皮膚老化を防止するため、表皮および真皮の細胞活性を再開させるため、皮膚の状態を回復させるため、ならびに／または弾力性を増加させるための局所用組成物の使用方法であって、前記組成物が、分子量が５０，０００および７５０，０００Ｄａの間に含まれるヒアルロン酸塩の一つまたは複数の断片を作用成分として含み、レチナールをさらに含有し、表皮および真皮の両方に効果的であることを特徴とする使用方法。
【請求項２】
ヒアルロン酸塩断片の分子量が、５０，０００Ｄａと２５０，０００Ｄａとの間に含まれることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヒアルロン酸塩断片の分子量が、２５０，０００Ｄａと７５０，０００Ｄａとの間に含まれることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１】
皺のある皮膚、乾燥している皮膚を改善もしくは予防するため、皮膚組織の萎縮に関連する皮膚病を改善もしくは予防するため、皮膚萎縮を減少するため、皺を減少させるため、皮膚老化を防止するため、表皮および真皮の細胞活性を再開させるため、皮膚の状態を回復させるため、ならびに／または弾力性を増加させるための局所用組成物の使用方法であって、前記組成物が、分子量が５０，０００および７５０，０００Ｄａの間に含まれるヒアルロン酸塩の一つまたは複数の断片を作用成分として含み、レチナールをさらに含有し、表皮および真皮の両方に効果的であることを特徴とする使用方法。
【請求項２】
ヒアルロン酸塩断片の分子量が、５０，０００Ｄａと２５０，０００Ｄａとの間に含まれることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヒアルロン酸塩断片の分子量が、２５０，０００Ｄａと７５０，０００Ｄａとの間に含まれることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−２５５００１（Ｐ２０１２−２５５００１Ａ）
【公開日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１７０７５６（Ｐ２０１２−１７０７５６）
【出願日】平成２４年８月１日（２０１２．８．１）
【分割の表示】特願２００６−５５０２４５（Ｐ２００６−５５０２４５）の分割
【原出願日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【出願人】（５０６２６０４０１）
【氏名又は名称原語表記】ＰＩＥＲＲＥ ＦＡＢＲＥ ＤＥＲＭＯ−ＣＯＳＭＥＴＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年８月１日（２０１２．８．１）
【分割の表示】特願２００６−５５０２４５（Ｐ２００６−５５０２４５）の分割
【原出願日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【出願人】（５０６２６０４０１）
【氏名又は名称原語表記】ＰＩＥＲＲＥ ＦＡＢＲＥ ＤＥＲＭＯ−ＣＯＳＭＥＴＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
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