ヒオウギ抽出物を含有する細胞賦活剤とその応用
【目的】新規で優れた効果を奏効する細胞賦活剤と、それを配合した美容に役立つ皮膚外用組成物および浴用組成物を提供する。
【構成】アヤメ科植物ヒオウギから、水、低級アルコール、ポリオール系有機溶媒から選ばれる１種もしくは２種以上を用いて得られる抽出物を含有する細胞賦活剤とそれを配合した皮膚外用組成物ならびに浴用組成物。
【効果】優れた細胞賦活作用により、皮膚の老化の防止し、肌質の改善、創傷の治癒などに有効である。
【構成】アヤメ科植物ヒオウギから、水、低級アルコール、ポリオール系有機溶媒から選ばれる１種もしくは２種以上を用いて得られる抽出物を含有する細胞賦活剤とそれを配合した皮膚外用組成物ならびに浴用組成物。
【効果】優れた細胞賦活作用により、皮膚の老化の防止し、肌質の改善、創傷の治癒などに有効である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、植物由来の新規な細胞賦活剤とその応用に関するものである。さらに詳しくは、アヤメ科植物（Iridaceae）のヒオウギ（Belamcanda chinensis L.）、またはその根茎の乾燥物（生薬名：射干）からの抽出物を含有する有用かつ安全性の高い細胞賦活剤とその応用法を提供するものである。
【０００２】
【産業上の利用分野】本発明によるヒオウギの抽出物は、細胞に対して優れた賦活作用があり、しかも極めて安全性が高い。よって例えば、皮膚外用剤，頭皮・頭髪用剤，浴用剤といった各種の外用製剤類に配合して用いることによって、細胞の代謝を活性化し皮膚の老化を防止したり、あるいは肌質の改善や創傷治癒といった美容的効果が期待できる。具体的には、ローション，乳液，クリーム，オイル，パック，シャンプー，リンス，ヘアートニック，ヘアーリキッド，ボディーソープ，あるいは浴用剤（液状，粉末状，顆粒状，固形状など性状は、何れであってもよい）などへの応用が上げられる。また標記のような外用製剤の他にも、例えば栄養補強（栄養補助）などを目的とするような健康維持のための食品や飲料といったものにも配合して用いることもできる。
【０００３】
【従来の技術】植物の中には、いろいろな疾患に対する治療または抑制的効果があったり、あるいは種々の有用な生理活性が認められたりするものがあり、そうした有用な植物は古くから健康維持のために広く利用されてきた。本発明で用いるアヤメ科植物のヒオウギ（根茎の乾燥物は、生薬名：射干と呼ばれる）は、消炎，鎮咳・去痰作用，あるいは抗微生物作用といった効果があるとされ、特に、咽痛，喉痺，気管支喘息などの治療に民間薬的に利用されてきた植物である。ヒオウギ中に含まれる成分としては、イリゲニン（Irigenin），テクトリゲニン（Tectorigenin）、あるいはそれらの配糖体であるイリジン（Iridin），テクトリジン（Tectoridin）、その他ベラムカンジン（Belamcandin），イリスフロレンチン（Irisflorentin）などのイソフラボン化合物が確認されている。また薬理作用については、例えば［中薬大事典，小学館(1985.12.10)］などに記載されており、これによればヒオウギ中のテクトリゲニンとテクトリジンにヒアルロニダーゼ（Ｉ型アレルギーに関与している酵素）阻害作用や、ヒオウギの煎剤や浸剤に病原性皮膚糸状菌に対する抑制作用、またアルコール抽出物には血圧降下作用などが認められている。ヒオウギの応用に関しては、例えば、特開昭63-30417号のヒオウギ中の５種のイソフラボン化合物のＰＣＡ反応抑制作用（抗即時型アレルギー作用）による抗アレルギー剤としての利用や、特公昭58-11922号に示される含水アルコール抽出物のチロジナーゼ活性阻害作用による皮膚美白化粧料への応用といったことが提唱されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】これまで、古くから伝わる植物の有用性をもとに、その薬理作用や生理活性などについての生物学的な作用機序の解明や、またそれらにもとづく応用法などが研究されてはきたものの、一般的な日常生活に反映された形として積極的に有効利用がはかられているものは未だ少ない。本発明者らは、細胞の賦活というテーマをもとに美容と健康に役立つ植物成分の検索と、その汎用的な利用法を検討してきた。その過程において、アヤメ科植物のヒオウギの抽出物が、細胞の賦活化に不可欠なＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の産生に直接関与している解糖系の酵素：ピルビン酸キナーゼに対し、優れた活性作用を示すことを見いだし、本発明を完成した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】細胞は、生物においてそれぞれの器官または組織の主要な部分を構成し、それらの特殊な機能を主として担っている最少単位であり、その機能を果たすために必要な物質をとり入れそれをもとにした合成、分解、エネルギー保存、生成物の排出などの機能とある程度の防御機構、そしてそれらの統合機能をすべて備えている。これら細胞において、その分裂や新生、あるいは機能の一部が低下した場合、生体は恒常性を失い様々な症状や疾患などを招いたりすることから、細胞の老化についての研究は生物学的あるいは医学的な観点から、数多くの研究者らによって進められてきた。
【０００６】特に、皮膚組織についてみれば、表皮，真皮，皮下組織を構成する組織細胞は血液、リンパなどからの栄養素や調節因子などの制御を受けながら、相互に関連して皮膚の構造や機能を保ち、生体の恒常性を維持している。すなわち、表皮は外界からの刺激や異物の侵入を防御したり、皮膚内部からの体液，電解質などの喪失の防御（バリヤー機能）といったことに、また、真皮は皮膚の支持組織としてそれぞれ重要な役割を果たしているのである。ところがこれら組織を形成する細胞の代謝が何等かの要因によって衰え、増殖能や種々の機能の低下を招くと、皮膚は潤いやつや、柔軟性、はりなどを失い、シミやシワが増えたり、傷つき易くなったりする。また肉芽形成や創傷治癒速度が低下して、時には二次的な疾患まで招いたりすることもある。
【０００７】細胞が分裂，増殖，分化あるいは恒常性維持などの働きをするためには、少なくともエネルギー源であるＡＴＰの供給が必要不可欠である。そして皮膚細胞における主要なＡＴＰの供給は、解糖系によるものとして考えられている。その解糖系において、グルコースからピルビン酸、乳酸に至るまでの反応には実に11種類の酵素が関与していることが知られているが、ＡＴＰ生産に直接関与し、しかも不可逆的な反応（解糖系の律速段階）であるホスホエノールピルビン酸からピルビン酸への反応に関与している酵素は、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）である。したがって、この酵素の活性化は皮膚細胞の賦活化に大きく関与しているものとの考えに基づき、モルモットの皮膚を用いた試験系で各種植物抽出物のＰＫ活性作用について評価を行った。その結果、ヒオウギの抽出物に優れたＰＫ活性作用が認められ、この事実に基づいて、モルモット肝臓ホモジネイトの酸素消費能力試験、および兎を用いた創傷治癒効果についても検討した結果、何れにおいても有効性が認められ本発明を完成するに至った。以下にその実施例を示し、本発明をより詳しく説明する。
【０００８】
【実施例】ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）活性作用［試料の調整］
ヒオウギの20％Ethanolによる抽出液ヒオウギの20％1,3-Butylene glycolによる抽出液ヒオウギのEthanol，1,3-Butylene glycol，水(1:1:3)混液による抽出液（尚、各抽出液の蒸発残分としては、0.5〜1.5％程度である）
［使用した動物］
ハートレー系雌性モルモット，体重300ｇ前後，各５匹［試験方法］
1)試料の投与モルモットの両腹側部をバリカンにて剪毛し、試験区及び対照区とした。試験区にはヒオウギ抽出液を１mL含ませたリント布をテープで接着し、ポリエチレンフィルムにて４時間固定した。対照区は、それぞれの溶媒にて同様に処置した。この操作を１日１回、２週間連続して行った。尚、剪毛は２日に１度行った。
2)皮膚抽出液の調整各ヒオウギ抽出液の最終投与48時間後、モルモットを脱血屠殺し、試験区および対照区皮膚を分離した。得られた皮膚をバリカンにて剪毛し、皮下組織を完全に除去した後、正確に２ｇ分離しハサミで細切後、氷冷下20mLの生理食塩水を加え超音波処理を行った。この懸濁液を5,000Ｇ，20分間遠心分離し、その上清を皮膚抽出液とした。
3)酵素活性の測定予め下記の基質混液を調整しておき、その４mLを採取しこれにモルモット皮膚抽出液100μLを加え、37℃，20分間インキュベートする。
基質混液 Tris-HCl(pH=7.5) 100mLPhospho(enol)pyruvate 3Na 0.2gMgCl2 0.02gKCl 0.02gADP 2Na 0.02g判定は、生成されたピルビン酸を2,4-ジニトロフェニルヒドラジンと反応させ吸光度510nmを測定し、次式により求めた。尚、酵素活性は、ビウレット法により求めたタンパク質量に換算し、対照区を100％とした時の試験区の活性をＴ表により区間推定した。
【数１】
［試験結果］試験に用いた各ヒオウギの抽出液は、対照区に比べ113.8〜117.3％（95％信頼区間）の酵素活性作用で明かな優位差が認められた。
【０００９】
【実施例】酸素消費能力試験［試料の調整］ヒオウギの20％Ethanol抽出液を減圧下で濃縮乾固し、精製水で0.0001％，および0.00001％溶液を調整した。
［浮遊液 Krebs-Ringer Bicarbonate(KBR) の調整］
0.90％NaCl 100 mL1.15％KCl 4 mL1.22％CaCl2 3 mL2.11％KH2PO4 1 mL3.82％MgSO4・7H2O 1 mL1.30％NaHCO3 21 mL合計 130 mL8.5％リン酸でpH＝7.4に調整した。
［肝臓ホモジネートの調整］ハートレー系モルモット（雌性）の肝臓を取り出し、生理食塩水でよく洗浄した後、同量のKRBを加え氷水中でホモジナイズし、50％肝臓ホモジネートを調整した。
［測定機器］
TAIYO O2 UPTESTER （大洋科学工業株式会社製）
［酸素消費量の測定］反応容器中に試料1.0mL，KRB2.0mL，肝臓ホモジネート0.5mLを入れる。コントロールには試料の代わりに精製水を等量加える。また肝臓ホモジネートを添加しないブランクを設定する。容器のフタに、CO2吸収剤（2N-NaOH）を湿らせたろ紙を貼り、密閉する。容器を37℃の恒温槽に入れ15分間インキュベートした後、測定を開始し、５分毎に毛細管を移動した水の量を目盛板より読み取る。ブランクから大気圧等の影響により毛細管中を移動した空気量を求め、真の酸素消費量を求める。
［試験結果］酸素消費量の経時変化を図１に示す。ヒオウギの20％Ethanol抽出物は、モルモット肝細胞を用いた酸素消費量テストにおいて、酸素の消費量を増大させる効果が得られた。本発明による他の溶媒の抽出物についても同様に検討したが、これとほぼ同等な効果が得られた。
【図１】
【００１０】
【実施例】創傷治癒効果［被験薬物の調整］
ヒオウギの20％Ethanolによる抽出液ヒオウギのEthanolによる抽出液ヒオウギの20％1,3-Butylene glycolによる抽出液ヒオウギの1,3-Butylene glycolによる抽出液ヒオウギの20％Propylene glycolによる抽出液ヒオウギのEthanol，1,3-Butylene glycol，水(1:1:3)混液による抽出液（尚、各抽出液の蒸発残分としては、0.5〜1.5％程度である）
上記の各ヒオウギ抽出液(２mL)を親水軟膏(10g)に混合し、調整した。また対照としてそれぞれの溶媒のみを加えたものを調整した。
［使用した動物］
白色日本家ウサギ，雌性，体重3,500ｇ前後，３匹［試験方法］ウサギの耳介内側を脱毛クリームにて除毛し、24時間後、麻酔下で直径5mmのトレパン，ピンセット，メスにて深さ0.2mmの人工円形潰瘍を２箇所づつ、約１cmの間隔で作成した。潰瘍部からの止血を確認した後、左の耳介内面に試料の軟膏、右の耳介内面には対照の軟膏を塗布した。翌日より、定時に潰瘍部を透明フィルムに写しとり画像解析装置にて面積を測定した。尚、軟膏の塗布は創傷の測定後に、１日１回行った。
［試験結果］試験開始後、10日目の面積は、各対照区14.4〜15.9mm2であるのに対し、試験区の方は、4.8〜5.7mm2ですべての抽出液に効果が認められた。
【００１１】
【実施例】安全性試験1)皮膚一次刺激性試験ヒオウギのEthanol，1,3-Butylene glycol，水(1:1:3)の抽出液（蒸発残分としては、1.4％程度）を、背部を除毛した兎（１群３匹，体重3,800ｇ前後）の皮膚に貼付した。判定は、貼付後24，48，72時間に一次刺激性の評点法により紅斑および浮腫を指標として行った。その結果、すべての動物において、何等、紅斑および浮腫を認めず陰性と判定された。
2)皮膚累積刺激性試験ヒオウギのEthanol，1,3-Butylene glycol，水(1:1:3)の抽出液（蒸発残分としては、1.4％程度）を、側腹部を除毛（2×4cm2）したハートレー系モルモット（雌性，１群５匹，体重320ｇ前後）の皮膚に１日１回，週５回，0.5mL／動物当りを塗布した。塗布は４週に渡って、また除毛は各週の最終塗布日に行った。判定は、各週の最終日の翌日に一次刺激性の評点法により紅斑および浮腫を指標として行った。その結果、すべての動物において、塗布後１〜４週目に渡って何等、紅斑および浮腫を認めず陰性と判定された。
3)急性毒性試験ヒオウギのEthanol抽出液を減圧下にて溶媒を完全に留去し、試験前、４時間絶食させたddy系マウス（１群５匹，体重30ｇ）に2,000mg／kg量経口投与し、毒性症状の発現、程度などを経時的に観察した。その結果、すべてのマウスにおいて14日間何等異常を認めず、また解剖の結果も異常がなかった。LD50は2,000mg／kg以上と判定された。
【００１２】
【実施例】各種外用製剤の製造本発明によるヒオウギ由来の細胞賦活剤を使用し、いくらかの外用製剤を製造した。以下にその処方例を示すが、本発明による細胞賦活剤の用途は、これらに限定されるわけではない。
1)ローションの製造例 次の処方によりローションを製造した。
重量％ １．ソルビット ２ ２．１,３−ブチレングリコール ２ ３．ポリエチレングリコール1000 １ ４．ポリオキシエチレンオレイルエーテル（25E.O.） ２ ５．エタノール １０ ６．ヒオウギ抽出液(20％Ethanol ex.) １０ ７．pH調整剤 適量 ８．防腐剤 適量 ９．精製水 １００とする残余2)乳液の製造例次の処方により乳液を製造した。
重量％ １．スクワラン ３ ２．ワセリン １ ３．ステアリルアルコール ０.３ ４．ソルビタンモノステアレート １.５ ５．ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレート ３ ６．１,３−ブチレングリコール ５ ７．ヒオウギ抽出液(20%1,3-Butylene glycol ex.) ５ ８．防腐剤 適量 ９．精製水 １００とする残余3)クリームの製造例次の処方によりクリームを製造した。
重量％ １．スクワラン ２０ ２．ミツロウ ５ ３．精製ホホバ油 ５ ４．グリセリンモノステアレート ２ ５．ソルビタンモノステアレート ２ ６．ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート ２ ７．グリセリン ５ ８．ヒオウギ抽出液(1,3-Butylene glycol ex.) ５ ９．防腐剤 適量 10．精製水 １００とする残余4)シャンプーの製造例次の処方によりシャンプーを製造した。
重量％ １．ラウリル硫酸トリエタノールアミン ５ ２．ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸Ｎａ １２ ３．１,３−ブチレングリコール ４ ４．ラウリン酸ジエタノールアミド ２ ５．エデト酸二ナトリウム ０.１ ６．ヒオウギ抽出液(20%1,3-Butylene glycol ex.) １０ ７．防腐剤 適量 ８．精製水 １００とする残余5)ヘアーリキッドの製造例次の処方によりヘアーリキッドを製造した。
重量％ １．エタノール ２９ ２．ポリオキシプロピレンブチルエーテルリン酸 １０ ３．ポリオキシプロピレンモノブチルエーテル ５ ４．トリエタノールアミン １ ５．ヒオウギ抽出液(Ethanol,1,3-BG,水(1:1:3)ex.) ５ ６．防腐剤 適量 ７．精製水 １００とする残余6)ボディーソープの製造例次の処方によりボディーソープを製造した。
重量％ １．ラウリン酸カリウム １５ ２．ミリスチン酸カリウム ５ ３．プロピレングリコール ５ ４．ヒオウギ抽出液(20％Propylene Glycol ex.) １５ ５．pH調整剤 適量 ６．防腐剤 適量 ７．精製水 １００とする残余7)浴用剤（Ａタイプ）の製造例次の処方により浴用剤を製造した。
重量％ １．炭酸水素ナトリウム ５８ ２．無水硫酸ナトリウム ３０ ３．ホウ砂 ２ ４．ヒオウギ抽出液(40％Ethanol ex.)の乾燥粉末 １０8)浴用剤（Ｂタイプ）の製造例次の処方により浴用剤を製造した。
重量％ １．精製ホホバ油 ５ ２．ポルオキシエチレンソルビタンモノラウレート ２０ ３．グリセリンモノステアレート ５ ４．流動パラフィン ２ ５．ラウリン酸ジエタノールアミド ３ ６．ヒオウギ抽出液(50％Propylene glycol ex.) ２５ ７．精製水 １００とする残余
【００１３】
【実施例】各種外用製剤の使用試験実施例で製造したローションおよび浴用剤を男女パネラー（各15名）に１カ月間自由に使用してもらい使用感についてのアンケート調査を求めた。その結果は、表１の通りである。
【表１】
【００１４】
【発明の効果】本発明によるヒオウギ由来の細胞賦活剤は、その効果に優れしかも安全性が高い。これを例えば、日常的に用いる各種の皮膚外用製剤に配合し、それらを繰り返し用いることによって、皮膚細胞を賦活化し肌質を改善する効果や創傷治癒効果といった美容的効果が得られる。すなわち、肌に潤い，つや，柔軟性，はりなどを保持させ、皮膚本来の恒常性を維持することができる。本発明によるヒオウギのこのような新規な美容的効果と、それに基づく応用法は、極めて日常的な方法によって人の美容と健康に役立つことにつながり、また植物の有効利用の拡大ということからも産業上にもたらす効果は大きい。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒオウギの20％Ethanol抽出物によるモルモット肝細胞の酸素消費量に与える影響を表したグラフである。
【０００１】本発明は、植物由来の新規な細胞賦活剤とその応用に関するものである。さらに詳しくは、アヤメ科植物（Iridaceae）のヒオウギ（Belamcanda chinensis L.）、またはその根茎の乾燥物（生薬名：射干）からの抽出物を含有する有用かつ安全性の高い細胞賦活剤とその応用法を提供するものである。
【０００２】
【産業上の利用分野】本発明によるヒオウギの抽出物は、細胞に対して優れた賦活作用があり、しかも極めて安全性が高い。よって例えば、皮膚外用剤，頭皮・頭髪用剤，浴用剤といった各種の外用製剤類に配合して用いることによって、細胞の代謝を活性化し皮膚の老化を防止したり、あるいは肌質の改善や創傷治癒といった美容的効果が期待できる。具体的には、ローション，乳液，クリーム，オイル，パック，シャンプー，リンス，ヘアートニック，ヘアーリキッド，ボディーソープ，あるいは浴用剤（液状，粉末状，顆粒状，固形状など性状は、何れであってもよい）などへの応用が上げられる。また標記のような外用製剤の他にも、例えば栄養補強（栄養補助）などを目的とするような健康維持のための食品や飲料といったものにも配合して用いることもできる。
【０００３】
【従来の技術】植物の中には、いろいろな疾患に対する治療または抑制的効果があったり、あるいは種々の有用な生理活性が認められたりするものがあり、そうした有用な植物は古くから健康維持のために広く利用されてきた。本発明で用いるアヤメ科植物のヒオウギ（根茎の乾燥物は、生薬名：射干と呼ばれる）は、消炎，鎮咳・去痰作用，あるいは抗微生物作用といった効果があるとされ、特に、咽痛，喉痺，気管支喘息などの治療に民間薬的に利用されてきた植物である。ヒオウギ中に含まれる成分としては、イリゲニン（Irigenin），テクトリゲニン（Tectorigenin）、あるいはそれらの配糖体であるイリジン（Iridin），テクトリジン（Tectoridin）、その他ベラムカンジン（Belamcandin），イリスフロレンチン（Irisflorentin）などのイソフラボン化合物が確認されている。また薬理作用については、例えば［中薬大事典，小学館(1985.12.10)］などに記載されており、これによればヒオウギ中のテクトリゲニンとテクトリジンにヒアルロニダーゼ（Ｉ型アレルギーに関与している酵素）阻害作用や、ヒオウギの煎剤や浸剤に病原性皮膚糸状菌に対する抑制作用、またアルコール抽出物には血圧降下作用などが認められている。ヒオウギの応用に関しては、例えば、特開昭63-30417号のヒオウギ中の５種のイソフラボン化合物のＰＣＡ反応抑制作用（抗即時型アレルギー作用）による抗アレルギー剤としての利用や、特公昭58-11922号に示される含水アルコール抽出物のチロジナーゼ活性阻害作用による皮膚美白化粧料への応用といったことが提唱されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】これまで、古くから伝わる植物の有用性をもとに、その薬理作用や生理活性などについての生物学的な作用機序の解明や、またそれらにもとづく応用法などが研究されてはきたものの、一般的な日常生活に反映された形として積極的に有効利用がはかられているものは未だ少ない。本発明者らは、細胞の賦活というテーマをもとに美容と健康に役立つ植物成分の検索と、その汎用的な利用法を検討してきた。その過程において、アヤメ科植物のヒオウギの抽出物が、細胞の賦活化に不可欠なＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の産生に直接関与している解糖系の酵素：ピルビン酸キナーゼに対し、優れた活性作用を示すことを見いだし、本発明を完成した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】細胞は、生物においてそれぞれの器官または組織の主要な部分を構成し、それらの特殊な機能を主として担っている最少単位であり、その機能を果たすために必要な物質をとり入れそれをもとにした合成、分解、エネルギー保存、生成物の排出などの機能とある程度の防御機構、そしてそれらの統合機能をすべて備えている。これら細胞において、その分裂や新生、あるいは機能の一部が低下した場合、生体は恒常性を失い様々な症状や疾患などを招いたりすることから、細胞の老化についての研究は生物学的あるいは医学的な観点から、数多くの研究者らによって進められてきた。
【０００６】特に、皮膚組織についてみれば、表皮，真皮，皮下組織を構成する組織細胞は血液、リンパなどからの栄養素や調節因子などの制御を受けながら、相互に関連して皮膚の構造や機能を保ち、生体の恒常性を維持している。すなわち、表皮は外界からの刺激や異物の侵入を防御したり、皮膚内部からの体液，電解質などの喪失の防御（バリヤー機能）といったことに、また、真皮は皮膚の支持組織としてそれぞれ重要な役割を果たしているのである。ところがこれら組織を形成する細胞の代謝が何等かの要因によって衰え、増殖能や種々の機能の低下を招くと、皮膚は潤いやつや、柔軟性、はりなどを失い、シミやシワが増えたり、傷つき易くなったりする。また肉芽形成や創傷治癒速度が低下して、時には二次的な疾患まで招いたりすることもある。
【０００７】細胞が分裂，増殖，分化あるいは恒常性維持などの働きをするためには、少なくともエネルギー源であるＡＴＰの供給が必要不可欠である。そして皮膚細胞における主要なＡＴＰの供給は、解糖系によるものとして考えられている。その解糖系において、グルコースからピルビン酸、乳酸に至るまでの反応には実に11種類の酵素が関与していることが知られているが、ＡＴＰ生産に直接関与し、しかも不可逆的な反応（解糖系の律速段階）であるホスホエノールピルビン酸からピルビン酸への反応に関与している酵素は、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）である。したがって、この酵素の活性化は皮膚細胞の賦活化に大きく関与しているものとの考えに基づき、モルモットの皮膚を用いた試験系で各種植物抽出物のＰＫ活性作用について評価を行った。その結果、ヒオウギの抽出物に優れたＰＫ活性作用が認められ、この事実に基づいて、モルモット肝臓ホモジネイトの酸素消費能力試験、および兎を用いた創傷治癒効果についても検討した結果、何れにおいても有効性が認められ本発明を完成するに至った。以下にその実施例を示し、本発明をより詳しく説明する。
【０００８】
【実施例】ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）活性作用［試料の調整］
ヒオウギの20％Ethanolによる抽出液ヒオウギの20％1,3-Butylene glycolによる抽出液ヒオウギのEthanol，1,3-Butylene glycol，水(1:1:3)混液による抽出液（尚、各抽出液の蒸発残分としては、0.5〜1.5％程度である）
［使用した動物］
ハートレー系雌性モルモット，体重300ｇ前後，各５匹［試験方法］
1)試料の投与モルモットの両腹側部をバリカンにて剪毛し、試験区及び対照区とした。試験区にはヒオウギ抽出液を１mL含ませたリント布をテープで接着し、ポリエチレンフィルムにて４時間固定した。対照区は、それぞれの溶媒にて同様に処置した。この操作を１日１回、２週間連続して行った。尚、剪毛は２日に１度行った。
2)皮膚抽出液の調整各ヒオウギ抽出液の最終投与48時間後、モルモットを脱血屠殺し、試験区および対照区皮膚を分離した。得られた皮膚をバリカンにて剪毛し、皮下組織を完全に除去した後、正確に２ｇ分離しハサミで細切後、氷冷下20mLの生理食塩水を加え超音波処理を行った。この懸濁液を5,000Ｇ，20分間遠心分離し、その上清を皮膚抽出液とした。
3)酵素活性の測定予め下記の基質混液を調整しておき、その４mLを採取しこれにモルモット皮膚抽出液100μLを加え、37℃，20分間インキュベートする。
基質混液 Tris-HCl(pH=7.5) 100mLPhospho(enol)pyruvate 3Na 0.2gMgCl2 0.02gKCl 0.02gADP 2Na 0.02g判定は、生成されたピルビン酸を2,4-ジニトロフェニルヒドラジンと反応させ吸光度510nmを測定し、次式により求めた。尚、酵素活性は、ビウレット法により求めたタンパク質量に換算し、対照区を100％とした時の試験区の活性をＴ表により区間推定した。
【数１】
［試験結果］試験に用いた各ヒオウギの抽出液は、対照区に比べ113.8〜117.3％（95％信頼区間）の酵素活性作用で明かな優位差が認められた。
【０００９】
【実施例】酸素消費能力試験［試料の調整］ヒオウギの20％Ethanol抽出液を減圧下で濃縮乾固し、精製水で0.0001％，および0.00001％溶液を調整した。
［浮遊液 Krebs-Ringer Bicarbonate(KBR) の調整］
0.90％NaCl 100 mL1.15％KCl 4 mL1.22％CaCl2 3 mL2.11％KH2PO4 1 mL3.82％MgSO4・7H2O 1 mL1.30％NaHCO3 21 mL合計 130 mL8.5％リン酸でpH＝7.4に調整した。
［肝臓ホモジネートの調整］ハートレー系モルモット（雌性）の肝臓を取り出し、生理食塩水でよく洗浄した後、同量のKRBを加え氷水中でホモジナイズし、50％肝臓ホモジネートを調整した。
［測定機器］
TAIYO O2 UPTESTER （大洋科学工業株式会社製）
［酸素消費量の測定］反応容器中に試料1.0mL，KRB2.0mL，肝臓ホモジネート0.5mLを入れる。コントロールには試料の代わりに精製水を等量加える。また肝臓ホモジネートを添加しないブランクを設定する。容器のフタに、CO2吸収剤（2N-NaOH）を湿らせたろ紙を貼り、密閉する。容器を37℃の恒温槽に入れ15分間インキュベートした後、測定を開始し、５分毎に毛細管を移動した水の量を目盛板より読み取る。ブランクから大気圧等の影響により毛細管中を移動した空気量を求め、真の酸素消費量を求める。
［試験結果］酸素消費量の経時変化を図１に示す。ヒオウギの20％Ethanol抽出物は、モルモット肝細胞を用いた酸素消費量テストにおいて、酸素の消費量を増大させる効果が得られた。本発明による他の溶媒の抽出物についても同様に検討したが、これとほぼ同等な効果が得られた。
【図１】
【００１０】
【実施例】創傷治癒効果［被験薬物の調整］
ヒオウギの20％Ethanolによる抽出液ヒオウギのEthanolによる抽出液ヒオウギの20％1,3-Butylene glycolによる抽出液ヒオウギの1,3-Butylene glycolによる抽出液ヒオウギの20％Propylene glycolによる抽出液ヒオウギのEthanol，1,3-Butylene glycol，水(1:1:3)混液による抽出液（尚、各抽出液の蒸発残分としては、0.5〜1.5％程度である）
上記の各ヒオウギ抽出液(２mL)を親水軟膏(10g)に混合し、調整した。また対照としてそれぞれの溶媒のみを加えたものを調整した。
［使用した動物］
白色日本家ウサギ，雌性，体重3,500ｇ前後，３匹［試験方法］ウサギの耳介内側を脱毛クリームにて除毛し、24時間後、麻酔下で直径5mmのトレパン，ピンセット，メスにて深さ0.2mmの人工円形潰瘍を２箇所づつ、約１cmの間隔で作成した。潰瘍部からの止血を確認した後、左の耳介内面に試料の軟膏、右の耳介内面には対照の軟膏を塗布した。翌日より、定時に潰瘍部を透明フィルムに写しとり画像解析装置にて面積を測定した。尚、軟膏の塗布は創傷の測定後に、１日１回行った。
［試験結果］試験開始後、10日目の面積は、各対照区14.4〜15.9mm2であるのに対し、試験区の方は、4.8〜5.7mm2ですべての抽出液に効果が認められた。
【００１１】
【実施例】安全性試験1)皮膚一次刺激性試験ヒオウギのEthanol，1,3-Butylene glycol，水(1:1:3)の抽出液（蒸発残分としては、1.4％程度）を、背部を除毛した兎（１群３匹，体重3,800ｇ前後）の皮膚に貼付した。判定は、貼付後24，48，72時間に一次刺激性の評点法により紅斑および浮腫を指標として行った。その結果、すべての動物において、何等、紅斑および浮腫を認めず陰性と判定された。
2)皮膚累積刺激性試験ヒオウギのEthanol，1,3-Butylene glycol，水(1:1:3)の抽出液（蒸発残分としては、1.4％程度）を、側腹部を除毛（2×4cm2）したハートレー系モルモット（雌性，１群５匹，体重320ｇ前後）の皮膚に１日１回，週５回，0.5mL／動物当りを塗布した。塗布は４週に渡って、また除毛は各週の最終塗布日に行った。判定は、各週の最終日の翌日に一次刺激性の評点法により紅斑および浮腫を指標として行った。その結果、すべての動物において、塗布後１〜４週目に渡って何等、紅斑および浮腫を認めず陰性と判定された。
3)急性毒性試験ヒオウギのEthanol抽出液を減圧下にて溶媒を完全に留去し、試験前、４時間絶食させたddy系マウス（１群５匹，体重30ｇ）に2,000mg／kg量経口投与し、毒性症状の発現、程度などを経時的に観察した。その結果、すべてのマウスにおいて14日間何等異常を認めず、また解剖の結果も異常がなかった。LD50は2,000mg／kg以上と判定された。
【００１２】
【実施例】各種外用製剤の製造本発明によるヒオウギ由来の細胞賦活剤を使用し、いくらかの外用製剤を製造した。以下にその処方例を示すが、本発明による細胞賦活剤の用途は、これらに限定されるわけではない。
1)ローションの製造例 次の処方によりローションを製造した。
重量％ １．ソルビット ２ ２．１,３−ブチレングリコール ２ ３．ポリエチレングリコール1000 １ ４．ポリオキシエチレンオレイルエーテル（25E.O.） ２ ５．エタノール １０ ６．ヒオウギ抽出液(20％Ethanol ex.) １０ ７．pH調整剤 適量 ８．防腐剤 適量 ９．精製水 １００とする残余2)乳液の製造例次の処方により乳液を製造した。
重量％ １．スクワラン ３ ２．ワセリン １ ３．ステアリルアルコール ０.３ ４．ソルビタンモノステアレート １.５ ５．ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレート ３ ６．１,３−ブチレングリコール ５ ７．ヒオウギ抽出液(20%1,3-Butylene glycol ex.) ５ ８．防腐剤 適量 ９．精製水 １００とする残余3)クリームの製造例次の処方によりクリームを製造した。
重量％ １．スクワラン ２０ ２．ミツロウ ５ ３．精製ホホバ油 ５ ４．グリセリンモノステアレート ２ ５．ソルビタンモノステアレート ２ ６．ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート ２ ７．グリセリン ５ ８．ヒオウギ抽出液(1,3-Butylene glycol ex.) ５ ９．防腐剤 適量 10．精製水 １００とする残余4)シャンプーの製造例次の処方によりシャンプーを製造した。
重量％ １．ラウリル硫酸トリエタノールアミン ５ ２．ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸Ｎａ １２ ３．１,３−ブチレングリコール ４ ４．ラウリン酸ジエタノールアミド ２ ５．エデト酸二ナトリウム ０.１ ６．ヒオウギ抽出液(20%1,3-Butylene glycol ex.) １０ ７．防腐剤 適量 ８．精製水 １００とする残余5)ヘアーリキッドの製造例次の処方によりヘアーリキッドを製造した。
重量％ １．エタノール ２９ ２．ポリオキシプロピレンブチルエーテルリン酸 １０ ３．ポリオキシプロピレンモノブチルエーテル ５ ４．トリエタノールアミン １ ５．ヒオウギ抽出液(Ethanol,1,3-BG,水(1:1:3)ex.) ５ ６．防腐剤 適量 ７．精製水 １００とする残余6)ボディーソープの製造例次の処方によりボディーソープを製造した。
重量％ １．ラウリン酸カリウム １５ ２．ミリスチン酸カリウム ５ ３．プロピレングリコール ５ ４．ヒオウギ抽出液(20％Propylene Glycol ex.) １５ ５．pH調整剤 適量 ６．防腐剤 適量 ７．精製水 １００とする残余7)浴用剤（Ａタイプ）の製造例次の処方により浴用剤を製造した。
重量％ １．炭酸水素ナトリウム ５８ ２．無水硫酸ナトリウム ３０ ３．ホウ砂 ２ ４．ヒオウギ抽出液(40％Ethanol ex.)の乾燥粉末 １０8)浴用剤（Ｂタイプ）の製造例次の処方により浴用剤を製造した。
重量％ １．精製ホホバ油 ５ ２．ポルオキシエチレンソルビタンモノラウレート ２０ ３．グリセリンモノステアレート ５ ４．流動パラフィン ２ ５．ラウリン酸ジエタノールアミド ３ ６．ヒオウギ抽出液(50％Propylene glycol ex.) ２５ ７．精製水 １００とする残余
【００１３】
【実施例】各種外用製剤の使用試験実施例で製造したローションおよび浴用剤を男女パネラー（各15名）に１カ月間自由に使用してもらい使用感についてのアンケート調査を求めた。その結果は、表１の通りである。
【表１】
【００１４】
【発明の効果】本発明によるヒオウギ由来の細胞賦活剤は、その効果に優れしかも安全性が高い。これを例えば、日常的に用いる各種の皮膚外用製剤に配合し、それらを繰り返し用いることによって、皮膚細胞を賦活化し肌質を改善する効果や創傷治癒効果といった美容的効果が得られる。すなわち、肌に潤い，つや，柔軟性，はりなどを保持させ、皮膚本来の恒常性を維持することができる。本発明によるヒオウギのこのような新規な美容的効果と、それに基づく応用法は、極めて日常的な方法によって人の美容と健康に役立つことにつながり、また植物の有効利用の拡大ということからも産業上にもたらす効果は大きい。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒオウギの20％Ethanol抽出物によるモルモット肝細胞の酸素消費量に与える影響を表したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】アヤメ科植物ヒオウギ又はその根茎の乾燥物から、水、低級アルコール、ポリオール系有機溶媒から選ばれる１種もしくは２種以上を用いて得られる抽出物を含有する細胞賦活剤
【請求項２】アヤメ科植物ヒオウギ又はその根茎の乾燥物から得られる請求項第１項記載の細胞賦活剤を配合した皮膚外用組成物
【請求項３】アヤメ科植物ヒオウギ又はその根茎の乾燥物から得られる請求項第１項記載の細胞賦活剤を配合した浴用組成物
【請求項１】アヤメ科植物ヒオウギ又はその根茎の乾燥物から、水、低級アルコール、ポリオール系有機溶媒から選ばれる１種もしくは２種以上を用いて得られる抽出物を含有する細胞賦活剤
【請求項２】アヤメ科植物ヒオウギ又はその根茎の乾燥物から得られる請求項第１項記載の細胞賦活剤を配合した皮膚外用組成物
【請求項３】アヤメ科植物ヒオウギ又はその根茎の乾燥物から得られる請求項第１項記載の細胞賦活剤を配合した浴用組成物
【図１】
【公開番号】特開平７−１３８１７９
【公開日】平成７年（１９９５）５月３０日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平５−３０９８５８
【出願日】平成５年（１９９３）１１月１５日
【出願人】（０００１１９４７２）一丸ファルコス株式会社 (78)
【公開日】平成７年（１９９５）５月３０日
【国際特許分類】
【出願日】平成５年（１９９３）１１月１５日
【出願人】（０００１１９４７２）一丸ファルコス株式会社 (78)
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