ヒトのプログラムされたデスレセプターＰＤ−１に対する抗体
【課題】ヒトおよびカニクイザルのＰＤ−１に結合する単離された抗体および抗体断片の提供。
【解決手段】ヒトおよびカニクイザルのＰＤ−１に結合する単離された抗体および抗体断片せある、いくつかの実施形態において抗体または抗体断片は、ヒトＰＤ−Ｌ１およびヒトＰＤ−Ｌ２のヒトＰＤ−１への結合を遮断する。いくつかの実施形態において本発明のＰＤ−１抗体または抗体断片は、特定な配列からなるアミノ酸配列のＣＤＲ（抗体相補性決定領域）を含む。
【解決手段】ヒトおよびカニクイザルのＰＤ−１に結合する単離された抗体および抗体断片せある、いくつかの実施形態において抗体または抗体断片は、ヒトＰＤ−Ｌ１およびヒトＰＤ−Ｌ２のヒトＰＤ−１への結合を遮断する。いくつかの実施形態において本発明のＰＤ−１抗体または抗体断片は、特定な配列からなるアミノ酸配列のＣＤＲ（抗体相補性決定領域）を含む。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
プログラムされたデスレセプター１（ＰＤ−１）は、活性化されたＴ細胞およびＢ細胞において主に発現される免疫抑制受容体である。そのリガンドとの相互作用はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でＴ細胞応答を減弱させることが示されている。ＰＤ−１とそのリガンドの１つＰＤ−Ｌ１との相互作用の遮断は、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を増強することが示されており、したがって免疫系による腫瘍細胞の排除において有益でありうる。
【０００２】
ＰＤ−１（遺伝子Ｐｄｃｄ１によってコードされる）は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に関連する免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である。ＰＤ−１は、そのリガンド（ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）との結合で抗原受容体シグナル伝達を負に制御することが示されている。マウスＰＤ−１の構造は解析されており、ヒトＰＤ−Ｌ１を伴うマウスＰＤ−１の共結晶構造も同様である（非特許文献１；非特許文献２）。ＰＤ−１などのファミリーの構成員は、リガンド結合に関与するＩｇ可変型（Ｖ型）ドメインおよびシグナル伝達分子の結合に関与する細胞質側尾部を含有するＩ型膜貫通型糖タンパク質である。ＰＤ−１の細胞質側尾部は、２個のチロシンに基づくシグナル伝達モチーフ、ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ）およびＩＴＳＭ（免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ）を含有する。
【０００３】
Ｔ細胞の刺激に続いて、ＰＤ−１は、その細胞質側尾部内のＩＴＳＭモチーフにチロシンホスファターゼＳＨＰ−２を補充し、ＣＤ３Ｔ細胞シグナル伝達カスケードに関与するＣＤ３ζ、ＰＫＣθおよびＺＡＰ７０などのエフェクター分子の脱リン酸化を導く。ＰＤ−１がＴ細胞応答を下方調節する機構は、ＣＴＬＡ−４の機構と、両分子が重複した一連のシグナル伝達タンパク質を制御することから似てはいるが異なっている（非特許文献３）。Ｂｅｎｎｅｔｔおよび協力者らは、Ｔ細胞シグナル伝達のＰＤ−１介在抑制が活性化シグナルおよび抑制シグナルの両方が同じ表面にある場合にだけ有効であることを示し、ＰＤ−１シグナル伝達機構が時空間的に決定されることを示唆している（非特許文献４）。
【０００４】
ＰＤ−１は、活性化されたリンパ球（末梢ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞ならびに単球）で発現されることが示され、胸腺の発達の際にＣＤ４−ＣＤ８−（ダブルネガティブ）Ｔ細胞およびＮＫ−Ｔ細胞で発現されることも示されている。
【０００５】
ＰＤ−１に対するリガンド（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）は、恒常的に発現されているか、または、非造血性組織および種々の腫瘍型を含むさまざまな細胞型において誘導されうる。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄系細胞および樹状細胞（ＤＣ）において発現されるが、微小血管内皮細胞および、心臓、肺などの非リンパ器官などの末梢細胞においても発現される。対照的にＰＤ−Ｌ２は、マクロファージおよびＤＣにおいてのみ見いだされる。ＰＤ−１リガンドの発現様式は、末梢性寛容の維持におけるＰＤ−１の役割について示唆的であり、末梢における自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞の応答を制御するために役立ちうる。両リガンドは、ＩｇＶおよびＩｇＣ様ドメインの両方を細胞外領域に含むＩ型膜貫通型受容体である。両リガンドは、未知のシグナル伝達モチーフを有する短い細胞質側領域を含む。
【０００６】
今日までに多数の研究が、ＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてリンパ球増殖の抑制を導くことを示している。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の破壊は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を増大させ、かつ細胞周期の進行を遮断することが示されている。Ｐｄｃｄ１−／−マウスでの最初の研究は、劇的な免疫表現型を同定しなかった。しかし高齢マウスは、Ｐｄｃｄｌ欠損を戻し交配した株によって異なる自然発症の自己免疫疾患を発症した。これらは、ループス様増殖性関節炎（Ｃ５７ＢＬ／６）（非特許文献５）、胎児性心筋炎（ＢＡＬＢ／ｃ）（非特許文献６）、およびＩ型糖尿病（ＮＯＤ）（非特許文献７）を含む。総合的に、ノックアウト動物の分析は、ＰＤ−１が主に末梢性寛容の誘導および制御において機能するという理解を導いている。したがってＰＤ−１経路の治療用遮断は、免疫寛容の克服において有益でありうる。そのような選択的遮断は、癌または感染症の治療およびワクチン接種（予防用または治療用のいずれでも）の際の免疫を高めることにおいて有用でありうる。
【０００７】
癌におけるＰＤ−１の役割は、文献において立証されている。腫瘍微小環境が有効な免疫性の破壊から腫瘍細胞を保護できることが知られている。近年ＰＤ−Ｌ１は、多数のマウスおよびヒトの腫瘍において発現される（かつＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞系の大部分においてＩＦＮγによって誘導可能である）ことが示されており、免疫回避を介在すると推定される（非特許文献８；非特許文献９）。
【０００８】
ヒトにおいて（腫瘍浸潤リンパ球における）ＰＤ−１および／または（腫瘍細胞における）ＰＤ−Ｌ１の発現は、免疫組織化学によって評価された多数の原発性腫瘍の生検において見いだされている。そのような組織として、肺、肝臓、卵巣、子宮頸部、皮膚、大腸、神経膠腫、膀胱、乳房、腎臓、食道、胃、口腔扁平上皮細胞、尿路上皮細胞および膵臓の癌ならびに頭頸部の腫瘍が挙げられる（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献９；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。より著しくは、腫瘍細胞におけるＰＤ−リガンド発現は、複数の腫瘍型にわたって癌患者の予後不良と関連している（非特許文献１６で概説されている）。
【０００９】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断は、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫の増強を導くことができ、したがって免疫系による腫瘍細胞の排除において有益でありえた。この課題に取り組むために、多数の研究が実施された。侵襲性膵臓癌のマウスモデルにおいて、Ｔ．Ｎｏｍｉら（非特許文献１７）は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断の治療効果を示した。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかに対する抗体の投与は、腫瘍増殖を顕著に抑制した。抗体遮断は、腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を効果的に促進し、ＩＦＮγ、グランザイムＢおよびパーフォリンを含む抗腫瘍エフェクターの上方制御を生じた。さらに該著者らは、ＰＤ−１遮断は相乗効果をもたらすために化学療法と効果的に組み合わせうることを示した。マウスでの扁平上皮癌のモデルを使用する他の研究において、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の抗体遮断は、腫瘍増殖を顕著に抑制した（非特許文献１８）。
【００１０】
他の研究においてＰＤ−Ｌ１でのマウス肥満細胞腫系への形質移入は、腫瘍特異的ＣＴＬクローンと同時培養した場合に腫瘍細胞の溶解の減少を生じた。抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂを加えた場合に溶解は回復した（非特許文献８）。ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断は、マウス腫瘍モデルにおいて養子Ｔ細胞移入療法の効果を増大させることが示された（非特許文献９）。癌治療におけるＰＤ−１の役割についてのさらなる証拠は、ＰＤ−１ノックアウトマウスで実施された実験によってもたらされる。ＰＤ−Ｌ１発現骨髄腫細胞は、野生型動物においてのみ増殖し（腫瘍の増殖およびそれに伴う動物の死を生じる）、ＰＤ−１欠損マウスにおいては増殖しない（非特許文献８）。
【００１１】
ヒトでの研究において、非特許文献１９）は、完全なヒト抗ＰＤ−１抗体を使用するＰＤ−１遮断は、ワクチン抗原およびワクチン接種された個体由来の細胞を使用するｅｘ ｖｉｖｏ刺激アッセイにおいて腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）の絶対数を増加させることを示した。同様の研究においてＰＤ−Ｌ１の抗体遮断は、腫瘍関連抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の細胞溶解活性の増強および腫瘍特異的ＴＨ細胞によるサイトカイン産生の増大を生じた（非特許文献２０）。同著者らは、抗ＣＴＬＡ−４遮断と組み合わせて使用する場合にＰＤ−Ｌ１遮断がｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍特異的Ｔ細胞応答を増大させることを示した。
【００１２】
総合的に、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路は、癌治療用の抗体療法の開発のための十分に検証された標的である。抗ＰＤ−１抗体は、慢性ウイルス感染においても有用でありうる。急性ウイルス感染後に生成されたメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は、高度に機能的でありかつ防御免疫の重要な成分を構成する。対照的に慢性の感染は、ウイルス特異的Ｔ細胞応答の機能障害（消耗）の程度の変化によってしばしば特徴付けられ、この欠陥が宿主が持続性の病原体を排除できない主な理由である。感染の初期において機能的なエフェクターＴ細胞が最初に生成されるが、慢性的な感染の過程においてそれらは徐々に機能を失う。Ｂａｒｂｅｒら（非特許文献２１）は、ＬＣＭＶの研究室株で感染させたマウスが血液中および他の組織における高レベルのウイルスを生じる慢性感染を発症することを示した。これらのマウスは、最初強いＴ細胞応答を発現したが、Ｔ細胞の消耗により最終的には感染に屈服した。著者らは、慢性的に感染したマウスにおけるエフェクターＴ細胞の数および機能の低下は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を遮断する抗体の注射によって回復できることを見いだした。
【００１３】
近年、ＰＤ−１がＨＩＶに感染した個体由来のＴ細胞で高度に発現されていることならびに受容体発現がＴ細胞機能障害および疾患の進行と関連することが示されている（非特許文献２２；非特許文献２３）。両方の研究においてリガンドＰＤ−Ｌ１の遮断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶ特異的ＩＦＮγ産生細胞の増殖を顕著に増加させた。
【００１４】
他の研究もウイルス感染の管理におけるＰＤ−１経路の重要性に関連している。ＰＤ−１ノックアウトマウスは、野生型マウスよりも優れたアデノウイルス感染の管理を示す（非特許文献２４）。同様にＨＢＶ特異的Ｔ細胞のＨＢＶトランスジェニック動物への養子移入は、肝炎を惹起する（非特許文献２５）。これらの動物の疾患の状態は、肝臓での抗原認識および肝臓細胞によるＰＤ−１の上方制御の結果として変動する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇ， Ｘ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２０巻：３３７〜３４７頁（２００４年）
【非特許文献２】Ｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０５巻：３０１１〜６頁（２００８年）
【非特許文献３】Ｐａｒｒｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５巻：９５４３〜９５５３頁
【非特許文献４】Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｆ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０巻：７１１〜８頁（２００３年）
【非特許文献５】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０巻：１５６３〜１５７２頁（１９９８年）
【非特許文献６】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９１巻：３１９〜３２２頁（２００１年）
【非特許文献７】Ｗａｎｇ Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １０２巻：１１８２３〜１１８２８頁（２００５年）
【非特許文献８】Ｉｗａｉ Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９巻：１２２９３〜１２２９７頁（２００２年）
【非特許文献９】Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３巻：６５０１〜６５０５頁（２００３年）
【非特許文献１０】Ｂｒｏｗｎ Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０巻：１２５７〜１２６６頁（２００３年）
【非特許文献１１】Ｄｏｎｇ Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８巻：７９３〜８００頁（２００２年）
【非特許文献１２】Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３巻：７４６２〜７４６７頁（２００３年）
【非特許文献１３】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒ．Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６巻：３３８１〜５頁（２００６年）
【非特許文献１４】Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３巻：１７５７〜６１頁（２００７年）
【非特許文献１５】Ｎｏｍｉ Ｔ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３巻：２１５１〜７頁（２００７年）
【非特許文献１６】Ｏｋａｚａｋｉ ａｎｄ Ｈｏｎｊｏ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９巻：８１３〜８２４頁（２００７年）
【非特許文献１７】Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３巻：２１５１〜２１５７頁（２００７年）
【非特許文献１８】Ｔｓｕｓｈｉｍａ Ｆ．ら、Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ．４２巻：２６８〜２７４頁（２００６年）
【非特許文献１９】Ｒ．Ｍ．Ｗｏｎｇら（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９巻：１２２３〜１２３４頁（２００７年）
【非特許文献２０】Ｂｌａｎｋ Ｃ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１１９巻：３１７〜３２７頁（２００６年）
【非特許文献２１】Ｂａｒｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ４３９巻：６８２〜６８７頁（２００６年）
【非特許文献２２】Ｄａｙら、Ｎａｔｕｒｅ４４３巻：３５０〜４頁（２００６年）
【非特許文献２３】Ｔｒａｕｔｍａｎｎ Ｌ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２巻：１１９８〜２０２頁（２００６年）
【非特許文献２４】Ｉｗａｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８巻：３９〜５０頁（２００３年）
【非特許文献２５】Ｉｓｏｇａｗａ Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２３巻：５３〜６３頁（２００５年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、ヒトおよびカニクイザルのＰＤ−１に結合する単離された抗体および抗体断片を提供する。いくつかの実施形態において抗体または抗体断片は、ヒトＰＤ−Ｌ１およびヒトＰＤ−Ｌ２のヒトＰＤ−１への結合を遮断する。いくつかの実施形態において本発明のＰＤ−１抗体または抗体断片は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０から選択される１つまたは複数のＣＤＲ（抗体相補性決定領域）を含み、さらなる実施形態においては、配列番号１２、１３、１４、１８、１９および２０の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲならびに／または配列番号９、１０、１１、１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において抗体または抗体断片は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはその断片である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ａ．配列番号９、１０、１１、１５、１６および１７からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体、ならびに／または
ｂ．配列番号１２、１３、１４、１８、１９および２０からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体
を含む、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片。
（項目２）
ａ．配列番号９、１０および１１の軽鎖ＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体、ならびに配列番号１２、１３および１４の重鎖ＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体、または
ｂ．配列番号１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体、ならびに配列番号１８、１９および２０の重鎖ＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体
を含む、項目１に記載の抗体または抗体断片。
（項目３）
ａ．ｉ．配列番号５もしくはその変異体、
ｉｉ．配列番号７もしくはその変異体、
ｉｉｉ．配列番号３０のアミノ酸残基２０から１３９もしくはその変異体、および
ｉｖ．配列番号３０のアミノ酸残基２０から１３９に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含み、
ｂ．ｉ．配列番号６もしくはその変異体、
ｉｉ．配列番号８もしくはその変異体、
ｉｉｉ．配列番号３２のアミノ酸残基２０から１３０もしくはその変異体、
ｉｖ．配列番号３３のアミノ酸残基２０から１３０もしくはその変異体、
ｖ．配列番号３４のアミノ酸残基２０から１３０もしくはその変異体、および
ｖｉ．配列番号３２、３３もしくは３４のアミノ酸残基２０から１３０に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
をさらに含む、項目２に記載の抗体または抗体断片。
（項目４）
ａ．ｉ．配列番号３１のアミノ酸残基２０から４６６もしくはその変異体、および
ｉｉ．配列番号３５のアミノ酸残基２０から４６９もしくはその変異体
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、
ならびに
ｂ．ｉ．配列番号３６のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体、
ｉｉ．配列番号３７のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体、および
ｉｉｉ．配列番号３８のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、項目１に記載の抗体。
（項目５）
（１つまたは複数の）任意の前記変異体が３個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含みうる、項目１から４のいずれかに記載の抗体または抗体断片。
（項目６）
ａ．ヒト重鎖定常領域、もしくは２０個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含むその変異体、および／または
ｂ．ヒト軽鎖定常領域、もしくは２０個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含むその変異体
をさらに含む、項目１から３のいずれかに記載の抗体。
（項目７）
前記ヒト重鎖定常領域がγ４もしくはγ１ヒト重鎖定常領域、または２０個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含むその変異体を含む、項目６に記載の抗体。
（項目８）
ａ．約１００ｐＭのＫＤまたはそれより低いＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｂ．約３０ｐＭのＫＤまたはそれより低いＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｃ．配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｄ．配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｅ．約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｆ．約１×１０６ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｇ．約２×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｈ．約２．７×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｉ．約３×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｊ．約１ｎＭのＩＣ５０またはそれより低いＩＣ５０でヒトＰＤ−Ｌ１またはヒトＰＤ−Ｌ２のヒトＰＤ−１への結合を遮断する、
項目１から７のいずれかに記載の抗体または抗体断片。
（項目９）
項目１から４に記載のいずれかの抗体とＰＤ−１上の結合エピトープについて競合し、以下の特徴：
ａ．約１００ｐＭのＫＤまたはそれより低いＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｂ．約３０ｐＭのＫＤまたはそれより低いＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｃ．配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｄ．配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｅ．約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｆ．約１×１０６ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｇ．約２×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｈ．約２．７×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｉ．約３×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、または
ｊ．約１ｎＭのＩＣ５０またはそれより低いＩＣ５０でヒトＰＤ−Ｌ１またはヒトＰＤ−Ｌ２のヒトＰＤ−１への結合を遮断する、
のうち１つを有する
単離された抗体または抗体断片。
（項目１０）
ａ．キメラ抗体もしくはその断片、
ｂ．ヒト抗体もしくはその断片、
ｃ．ヒト化抗体もしくはその断片、または
ｄ．Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびダイアボディーからなる群から選択される抗体断片
である、項目１から９のいずれかに記載の抗体または抗体断片。
（項目１１）
Ｔ細胞の活性化を増大させる、項目１から１０のいずれかに記載の抗体または抗体断片。
（項目１２）
項目１から７のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
（項目１３）
項目１２に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目１４）
項目１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目１５）
ａ．前記核酸配列が発現される条件下で、培地中で項目１４に記載の宿主細胞を培養し、それにより前記軽鎖および前記重鎖可変領域を含むポリペプチドを産生するステップと、
ｂ．該宿主細胞または該培地から該ポリペプチドを回収するステップと
を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を産生する方法。
（項目１６）
薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて、項目１から１１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を含む組成物。
（項目１７）
免疫細胞を項目１から１１に記載の抗体のいずれか１つと接触させるステップを含む、該免疫細胞の活性を増大させる方法。
（項目１８）
治療有効量の項目１から１１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、免疫細胞の活性を増大させる方法。
（項目１９）
ａ．癌の治療のため、
ｂ．感染症もしくは感染性疾患の治療のため、または
ｃ．ワクチンアジュバントとして
使用される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記対象由来の試料においてｅｘ ｖｉｖｏでＴ細胞活性化を測定するステップをさらに含み、Ｔ細胞活性における増大が前記治療を継続すべきであることを示すか、または前記治療が成功する可能性を予測する、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
Ｔ細胞活性における前記増大が
ａ．ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびＩＬ−１３からなる群から選択される１つまたは複数のサイトカインのＳＥＢ誘発産生を測定するステップ、または
ｂ．ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびＩＬ−１３からなる群から選択されるサイトカインのＴＴ誘発産生を測定するステップ
によって決定される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
ａ．免疫細胞活性化を増大させるための、
ｂ．癌を治療するための、または
ｃ．感染症もしくは感染性疾患を治療するための
薬剤の調製のための、項目１から１１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片の使用。
（項目２３）
診断的使用のための、項目１から１１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片の使用。
【００１７】
一実施形態において本発明は、配列番号９、１０および１１のＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体を含む軽鎖、ならびに／または配列番号１２、１３および１４のＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体を含む重鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００１８】
他の実施形態において本発明は、配列番号１５、１６および１７のＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体を含む軽鎖、ならびに／または配列番号１８、１９および２０のＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体を含む重鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００１９】
一実施形態において本発明は、配列番号５の重鎖可変領域もしくはその変異体、および／または配列番号６もしくはその変異体を含む軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片を含む。
【００２０】
一実施形態において本発明は、配列番号７の重鎖可変領域もしくはその変異体、および／または配列番号８もしくはその変異体を含む軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片を提供する。
【００２１】
一実施形態において本発明は、配列番号３０のアミノ酸残基２０から１３９もしくはその変異体を含む重鎖可変領域、および／または配列番号３２のアミノ酸残基２０から１３０もしくはその変異体を含む軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片を含む。
【００２２】
一実施形態において本発明は、配列番号３０のアミノ酸残基２０から１３９もしくはその変異体を含む重鎖可変領域、および／または配列番号３３のアミノ酸残基２０から１３０もしくはその変異体を含む軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片を含む。
【００２３】
一実施形態において本発明は、配列番号３０のアミノ酸残基２０から１３９もしくはその変異体を含む重鎖可変領域、および／または配列番号３４のアミノ酸残基２０から１３０もしくはその変異体を含む軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片を含む。
【００２４】
一実施形態において本発明は、配列番号３０のアミノ酸残基２０から１３９に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号３２、３３または３４のアミノ酸残基２０から１３０に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片を含む。
【００２５】
一実施形態において本発明は、配列番号３１のアミノ酸残基２０から４６６もしくはその変異体を含む重鎖、および／または配列番号３６のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体を含む軽鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００２６】
一実施形態において本発明は、配列番号３１のアミノ酸残基２０から４６６もしくはその変異体を含む重鎖、および／または配列番号３７のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体を含む軽鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００２７】
一実施形態において本発明は、配列番号３１のアミノ酸残基２０から４６６もしくはその変異体を含む重鎖、および／または配列番号３８のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体を含む軽鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００２８】
一実施形態において本発明は、配列番号３５のアミノ酸残基２０から４６９もしくはその変異体を含む重鎖、および／または配列番号３６のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体を含む軽鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００２９】
一実施形態において本発明は、配列番号３５のアミノ酸残基２０から４６９もしくはその変異体を含む重鎖、および／または配列番号３７のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体を含む軽鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００３０】
一実施形態において本発明は、配列番号３５のアミノ酸残基２０から４６９もしくはその変異体を含む重鎖、および／または配列番号３８のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体を含む軽鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００３１】
任意の上記実施形態において本発明の抗体または抗体断片の変異体は、１個、２個または３個の保存的に改変されたアミノ酸置換を含みうる。
【００３２】
任意の上記実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、ヒト重鎖定常領域もしくは２０個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含むその変異体、および／またはヒト軽鎖定常領域もしくは２０個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含むその変異体、を含みうる。いくつかの実施形態において変異体は、１０個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含みうる。いくつかの実施形態において変異体は、５個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含みうる。いくつかの実施形態において変異体は、３個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含みうる。任意の上記実施形態においてヒト重鎖定常領域またはその変異体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものでありうる。
【００３３】
任意の上に記載の実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合できる。他の実施形態において抗体または抗体断片は、約３０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合できる。他の実施形態において抗体または抗体断片は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合できる。他の実施形態において抗体または抗体断片は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合できる。
【００３４】
任意の上に記載の実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。一実施形態において抗体または抗体断片は、約１×１０６ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。
【００３５】
任意の上に記載の実施形態において抗体または抗体断片は、約２×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。一実施形態において抗体または抗体断片は、約２．７×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。一実施形態において抗体または抗体断片は、約３×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。
【００３６】
ＫＤ、ｋａｓｓｏｃおよびｋｄｉｓｓｏｃ値は、任意の利用可能な方法を使用して測定されうる。好ましい実施形態において解離（ｄｉｓｓａｏｃｉａｔｉｏｎ）定数は、生物光学干渉法（ｂｉｏ−ｌｉｇｈｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（例えば実施例２で記載されるＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ法）を使用して測定される。他の好ましい実施形態において解離（ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）定数は、表面プラズモン共鳴（例えばＢｉａｃｏｒｅ）またはＫｉｎｅｘａを使用して測定されうる。
【００３７】
さらに任意の上に記載の実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、ヒトＰＤ−Ｌ１またはヒトＰＤ−Ｌ２のヒトＰＤ−１への結合を約１ｎＭ以下のＩＣ５０で遮断できる。リガンド結合の遮断は、例えば本明細書の（ｈｅｒｅｕｂ）実施例に記載のＦＡＣＳ法またはＦＭＡＴ法などの当技術分野において公知の任意の方法を使用して測定することができ、かつＩＣ５０を算出されうる。
【００３８】
本発明は、ヒトＰＤ−１上の結合エピトープに対して上に記載の任意の抗体と競合し、かつヒトＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２のヒトＰＤ−１への結合を約１ｎＭ以下のＩＣ５０で遮断する抗体または抗体断片も含む。
【００３９】
本発明は、ヒトＰＤ−１上の結合エピトープについて上に記載の任意の抗体と競合し、かつ約１００ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する抗体または抗体断片も含む。一実施形態において抗体または抗体断片は、約３０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する。
【００４０】
本発明は、ヒトＰＤ−１上の結合エピトープについて上に記載の任意の抗体と競合し、かつ配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する抗体または抗体断片も含む。
【００４１】
本発明は、ヒトＰＤ−１上の結合エピトープについて上に記載の任意の抗体と競合し、かつ配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する抗体または抗体断片も含む。
【００４２】
本発明は、ヒトＰＤ−１上の結合エピトープについて上に記載の任意の抗体と競合し、かつ約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する抗体または抗体断片も含む。一実施形態において抗体または抗体断片は、約１×１０６ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。
【００４３】
本発明は、ヒトＰＤ−１上の結合エピトープについて上に記載の任意の抗体と競合し、かつ約２×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する抗体または抗体断片も含む。一実施形態において抗体または抗体断片は、約２．７×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。一実施形態において抗体または抗体断片は、約３×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。
【００４４】
いくつかの実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、キメラ抗体またはキメラ抗体の断片である。
【００４５】
いくつかの実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、ヒト抗体またはヒト抗体の断片である。
【００４６】
いくつかの実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、ヒト化抗体またはヒト化抗体の断片である。
【００４７】
いくつかの実施形態において本発明の抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはＦ（ａｂ’）２抗体断片である。
【００４８】
いくつかの実施形態において本発明の抗体断片は、ダイアボディーである。
【００４９】
本発明は、ヒトＰＤ−１に結合する上に記載の抗体または抗体断片のいずれか１つを含む二重特異性抗体も含む。
【００５０】
いくつかの実施形態において本発明の単離された抗ＰＤ−１抗体および抗体断片は、当業者に公知の典型的な手段によって測定されるＴ細胞活性化（免疫細胞増殖の増大、サイトカイン分泌の増大またはＣＤ２５および／もしくはＣＤ６９などの活性化マーカーの発現を非限定的に含む）を増大させる。
【００５１】
上に記載の任意の実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのブドウ球菌エンテロトキシンＢまたは破傷風トキソイドでの刺激後に免疫応答を増強できる。増大した免疫活性化は、例えば免疫細胞（Ｔ細胞など）の増殖または免疫細胞によるサイトカイン産生（例えばＴ細胞によるＩＮＦγもしくはＩＬ−２の産生）を定量することである当業者に公知の方法を使用して決定できる。
【００５２】
本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体および抗体断片をコードする核酸も含む。配列番号５から２０および３０〜３８において開示のアミノ酸配列（リーダー配列を含むまたは含まない）のいずれか１つをコードする核酸は、本発明に含まれる。配列番号１から４および２１から２９を含む核酸（リーダー配列をコードする核酸を含むまたは含まない）も、本発明に含まれる。
【００５３】
本発明は、本発明の抗体または抗体断片をコードする核酸を含む細胞および発現ベクターも含む。さらに本発明は、（ａ）核酸配列が発現される条件下で、培地中で本発明の抗体または抗体断片をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、それにより軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを産生するステップと、（ｂ）宿主細胞または培地からポリペプチドを回収するステップとを含む、本発明の抗体または抗体断片を産生する方法を含む。
【００５４】
本発明は、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて、本発明の抗体または抗体断片を含む組成物も含む。
【００５５】
本発明は、本発明の抗体または抗体断片の治療有効量をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、免疫細胞の活性を増大させる方法も含む。一実施形態においてこの方法は、癌を治療するために使用されうる。他の実施形態においてこの方法は、感染症または感染性疾患を治療するために使用されうる。さらに他の実施形態においてこの方法は、ワクチンアジュバントとして使用されうる。いくつかの実施形態においてこの方法は、第２の治療用薬物または治療様式をさらに投与するステップを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において本発明は、免疫細胞の活性を増大させる方法であって、治療有効量の本発明の抗体または抗体断片を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、対象由来の試料におけるＴ細胞活性化をｅｘ ｖｉｖｏで測定するステップをさらに含み、Ｔ細胞活性における増大が治療を継続すべきであることを示す方法を含む。他の実施形態において本発明は、免疫細胞の活性を増大させる方法であって、治療有効量の本発明の抗体または抗体断片を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、対象由来の試料におけるＴ細胞活性化をｅｘ ｖｉｖｏで測定するステップをさらに含み、Ｔ細胞活性化における増大が治療が成功する可能性を予測する方法を含む。一実施形態においてＴ細胞活性における増大は、（ｉ）ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびＩＬ−１３からなる群から選択される１つまたは複数のサイトカインのＳＥＢ誘発産生を測定するステップ、または（ｉｉ）ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびＩＬ−１３からなる群から選択されるサイトカインのＴＴ誘発産生を測定するステップによって決定される。
【００５７】
本発明は、免疫応答を増大させる薬物の調製のための本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗体断片の使用も含む。
【００５８】
本発明は、癌を治療するための薬物の調製のための本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗体断片の使用も含む。
【００５９】
本発明は、ワクチンアジュバントとしての本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗体断片の使用も含む。
【００６０】
本発明は、細菌性毒素または放射性毒素などの治療剤に連結した本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗体断片を含む免疫複合体も含む。細胞毒作用物質の非限定的な例として、タキソール、サイトカラシンＢ、マイトマイシン、エトポシドおよびビンクリスチンまたは他の代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質および抗有糸分裂剤が挙げられる。
【００６１】
本発明は、免疫細胞と本発明の抗体または抗体断片のいずれか１つとを接触させるステップを含む、免疫細胞の活性を増大させるまたは免疫細胞の下方調節を低減する方法も含む。この方法は、癌もしくは感染性疾患（慢性ウイルス性感染症など）を治療するために使用されることができ、または予防用もしくは治療用ワクチンのためのアジュバントとして使用されうる。
【００６２】
本発明は、免疫細胞を抗原および抗ＰＤ−１抗体または抗体断片と、抗原への免疫応答が増大されるかまたは増強されるように接触させるステップを含む抗原への免疫応答を増大させる方法も含む。この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ（対象中で）またはｅｘ ｖｉｖｏで実施されうる。
【００６３】
いくつかの実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、第２の治療薬または治療様式と組み合わされうる。一実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、組換えサイトカインまたは分泌された免疫性因子の適用を伴う癌治療と組み合わされうる。組合せの非限定的な例として、抗ＰＤ−１抗体と組換えＩＬ−２または組換えＩＦＮα２とを黒色腫または腎細胞癌の治療のために組み合わせることが挙げられる。組換えＩＬ−２は、癌患者においてＴ細胞の増殖を増強する。組換えＩＦＮα２は、癌細胞の増殖を抑制するが、治療を受ける患者において癌細胞、抗原提示細胞および他の体細胞上のＰＤ−１に対する抑制型リガンドの発現も増大させる。抗ＰＤ−１は、癌または感染性疾患の治療のために有用であると考えられうる他のサイトカインと組み合わされうる。
【００６４】
いくつかの実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、癌または感染性疾患を予防または治療するためにワクチンと組み合わされうる。非限定的な例として抗ＰＤ−１は、治療される癌または感染症に関連する１つもしくは複数の抗原を含有するタンパク質、ペプチドもしくはＤＮＡのワクチンと、またはそのような抗原でパルスした樹状細胞を含むワクチンと組み合わされうる。他の実施形態は、（弱毒化）癌細胞ワクチンまたはまるごとのウイルスワクチンを伴う抗ＰＤ−１の使用を含む。一実施形態は、ＧＭ−ＣＳＦを分泌するように工学的に操作されたまるごとの細胞の癌ワクチンと抗ＰＤ−１療法との組合せを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、癌または感染性疾患のケアの標準法であると考えられる治療と組み合わされうる。そのような組合せについての論理的根拠は、抗ＰＤ−１によって同時に増大する免疫活性化がケア治療の標準法への初期の臨床反応を誘発または促進し、持続的臨床反応および疾患の長期免疫管理を誘導することである。
【００６６】
一実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片での治療は、化学療法と組み合わされうる。細胞傷害性薬物を使用する化学療法は、癌細胞死を生じ、それにより腫瘍抗原の放出が増大する。腫瘍抗原の可用性のそのような増大は、抗ＰＤ−１治療との相乗作用を生じうる。非限定的な例は、黒色腫の治療のためのデカルバジンもしくはテモゾロミドまたは膵臓癌のためのゲムシタビンの使用によって提供される。
【００６７】
一実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片での治療は、放射線療法と組み合わされうる。放射線療法は、癌細胞死を生じ、免疫細胞の提示および活性化のための腫瘍抗原の可用性が増大する。
【００６８】
別の実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片での治療は、対象から癌細胞を除く手術と組み合わされうる。
【００６９】
他の実施形態において抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗体断片は、ホルモン剥奪もしくは血管新生の抑制のために使用される標的薬剤、または腫瘍細胞において活性な標的タンパク質を含み、ＰＤ−１遮断と相乗効果を生じうる療法と組み合わされることができ、全ては、腫瘍細胞死および免疫刺激腫瘍抗原の可用性の増強を生じる。抗ＰＤ−１抗体または抗体断片との組合せにおいて、増大したＴ細胞活性化は、癌の持続的な免疫管理を生じうる。
【００７０】
いくつかの実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、癌または感染性疾患の治療のために有用である他の治療用抗体と組み合わされうる。非限定的な例は、抗ＰＤ−１抗体とＨｅｒ２／ｎｅｕを標的とするまたはＥＧＦ受容体を標的とする抗体との組合せによって提供される。他の非限定的な例において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、ＶＥＧＦまたはその受容体を標的とする治療と組み合わされる。他の実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、抗ＣＴＬＡ−４と組み合わされる。さらに他の非限定的な例において抗ＰＤ−１は、ＲＳＶを標的とする抗体と組み合わされる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ハイブリドーマ上清由来の固定化抗体は、固定化した抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８で刺激したジャーカットＥ６．２．１１細胞によるＩＬ−２分泌を低減できることを示す実験結果を示すグラフである。
【図２】ヒトＰＤ−１に対する抗体がＰＤ−１に結合することを示す実験結果を示すグラフである。図２Ａは、タンパク質ＥＬＩＳＡにおける、精製ＰＤ−１／Ｆｃへの抗ＰＤ−１抗体の用量依存的結合を示すグラフである。図２Ｂは、ＣＥＬＩＳＡにおける、ｈＰＤ−１を形質移入したＣＨＯ細胞の表面で発現されるＰＤ−１への抗ＰＤ−１抗体の用量依存的結合を示すグラフである。
【図３】ＰＤ−１に対する抗体がヒトＰＤ−１を形質移入したＣＨＯ細胞へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合について競合することを示すＦＭＡＴ実験の結果を示すグラフである。図３Ａは、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９ならびに少ない程度でのＪ１１６によるＰＤ−Ｌ１の結合の用量依存的な抑制を示すグラフである。図３Ｂは、ＰＤ−Ｌ２の用量依存的な抑制を示すグラフである。
【図４】健常ドナー血液細胞によるＳＥＢ刺激ＩＬ−２産生は、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＣＴＬＡ−４抗体の存在下で増強されることを示す実験結果を示す棒グラフである。棒は、ドナー間のＩＬ−２における平均倍数増加（±ＳＥＭ）を示す。各棒内の数値は、示したドナー数を示す。マウス（ｍ）ＩｇＧ１は、抗ＰＤ−１．０８Ａ（０８Ａ）、抗ＰＤ−１．０９Ａ（０９Ａ）および抗ＰＤ−Ｌ１についてのアイソタイプ対照である。マウス（ｍ）ＩｇＧ２は、抗ＣＴＬＡ−４についてのアイソタイプ対照である。各ＩＬ−２値を倍数変化を決定するためにそれ自体の対照と比較する（ＩＬ−２の倍数変化４は、ＳＥＢ単独の場合と比較した場合のＩＬ−２産生における４００％増大を意味する）。なし＝ＳＥＢ単独
【図５】リコール抗原破傷風トキソイドで刺激された場合に抗ＰＤ−１抗体がＴ細胞増殖およびサイトカイン分泌（ＩＬ−２およびＩＦＮγ）を、促進することを示す実験結果を示すグラフである。図５は、濃度依存的ＩＦＮγ分泌を示す。
【図６】生物光学干渉法によって測定した抗ＰＤ−１抗体についてのｋａｓｓｏｃおよびｋｄｉｓｓｏｃ速度を示すグラフである。斜線は、理論的に算出されるＫＤ値を示す。抗体は、右側にＫＤによる昇順で列挙される。
【図７】健常ドナー血液細胞によるＳＥＢ刺激ＩＬ−２産生は、２５μｇ／ｍｌマウス（０９Ａ）、またはヒト化抗ＰＤ−１抗体（ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７）の存在下で増大されることを示す実験結果を示す棒グラフである。棒は、ドナー３名の間のＩＬ−２における平均倍数増加（±ＳＥＭ）を示す。マウス（ｍ）ＩｇＧ１は、抗ＰＤ−１．０９Ａ（０９Ａ）についてのアイソタイプ対照である。ヒト（ｈ）ＩｇＧ４は、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７抗体についてのアイソタイプ対照である。各ＩＬ−２値を倍数変化を決定するためにそれ自体の対照と比較する。なし＝ＳＥＢ単独
【発明を実施するための形態】
【００７２】
（発明の詳細な説明）
略語および定義
本発明の詳細な記載および実施例を通じて以下の略語が使用される。
【００７３】
ｈＰＤ−１．０８Ａ マウスモノクローナル抗ｈＰＤ−１抗体
ｈＰＤ−１．０９Ａ マウスモノクローナル抗ｈＰＤ−１抗体
０８Ａ−ＶＨ ｈＰＤ−１．０８Ａハイブリドーマから単離されたＶＨ
０８Ａ−ＶＫ ｈＰＤ−１．０８Ａハイブリドーマから単離されたＶＫ
０９Ａ−ＶＨ ｈＰＤ−１．０９Ａハイブリドーマから単離されたＶＨ
０９Ａ−ＶＫ ｈＰＤ−１．０９Ａハイブリドーマから単離されたＶＫ
ｃ１０９Ａ ｈＰＤ−１．０９Ａ抗体のキメラＩｇＧ１バージョン
ｃ１０９Ａ−ＶＨ ｈＩｇＧ１定常領域に融合しているマウス０９Ａ−ＶＨからなるキメラ重鎖
ｃ１０９Ａ−ＶＫ ヒトκ定常領域に融合しているマウス０９Ａ−ＶＫからなるキメラ軽鎖
１０９Ａ−Ｈ 復帰突然変異を含まないヒト化ＩｇＧ１ ０９Ａ重鎖配列
４０９Ａ−Ｈ ＦＷＲ復帰突然変異を含まないヒト化ＩｇＧ４−０９Ａ重鎖配列
Ｋ０９Ａ−Ｌ−１１ 長さ１１ＡＡのＣＤＲ１を独自に有するフレームワークを含むヒト化０９Ａ−κ配列
Ｋ０９Ａ−Ｌ−１６ 長さ１６ＡＡのＣＤＲ１を独自に有するフレームワークを含むヒト化０９Ａ−κ配列
Ｋ０９Ａ−Ｌ−１７ 長さ１７ＡＡのＣＤＲ１を独自に有するフレームワークを含むヒト化０９Ａ−κ配列
ｈ４０９Ａ１１ ４０９Ａ−Ｈの配列を含む重鎖およびＫ０９Ａ−Ｌ−１１の配列を含む軽鎖を含む０９Ａ抗体のヒト化ＩｇＧ４バージョン
ｈ４０９Ａ１６ ４０９Ａ−Ｈの配列を含む重鎖およびＫ０９Ａ−Ｌ−１６の配列を含む軽鎖を含む０９Ａ抗体のヒト化ＩｇＧ４バージョン
ｈ４０９Ａ１７ ４０９Ａ−Ｈの配列を含む重鎖およびＫ０９Ａ−Ｌ−１７の配列を含む軽鎖を含む０９Ａ抗体のヒト化ＩｇＧ４バージョン
ｈＰＤ−１ ヒトＰＤ−１タンパク質
ＣＤＲ 免疫グロブリン可変領域中の相補性決定領域、Ｋａｂａｔ番号付け方式を使用して定義される
ＥＣ５０ ５０％有効性または結合を生じる濃度
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着検定法
ＦＷ 抗体フレームワーク領域、ＣＤＲ領域を除く免疫グロブリン可変領域
ＨＲＰ 西洋わさびペルオキシダーゼ
ＩＬ−２ インターロイキン２
ＩＦＮ インターフェロン
ＩＣ５０ ５０％抑制を生じる濃度
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ
Ｋａｂａｔ Ｅｌｖｉｎ Ａ Ｋａｂａｔによって開発された免疫グロブリン配列比較（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）および番号付け方式
ｍＡｂ モノクローナル抗体
ＭＥＳ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＮＨＳ 正常ヒト血清
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＡＭ ヒツジ抗マウス（ＩｇＧ）ポリクローナル抗体
Ｖ領域 異なる抗体間の配列において可変であるＩｇＧ鎖のセグメント。軽鎖におけるＫａｂａｔ残基１０９および重鎖における１１３に及ぶ。
【００７４】
ＶＨ 免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＫ 免疫グロブリンκ軽鎖可変領域。
【００７５】
「抗体」は、リガンドのその受容体への結合の抑制または受容体のリガンド誘発シグナル伝達の抑制によるなどの所望の生物学的活性を示す任意の形態の抗体を指す。したがって「抗体」は、最も広義で使用され、具体的には非限定的にモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体含む）、ポリクローナル抗体および多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）に及ぶ。
【００７６】
「抗体断片」および「抗体結合断片」は、典型的には親抗体の抗原結合領域または可変領域（例えば１つまたは複数のＣＤＲ）の少なくとも一部を含む抗原結合断片および抗体の類似物を意味する。抗体断片は、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持する。典型的には抗体断片は、活性をモルベースで表す場合に親の結合活性の少なくとも１０％の結合活性を保持する。好ましくは抗体断片は、標的に対して親抗体の結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％またはそれを超える結合親和性を保持する。抗体断片の例として、それだけに限らないがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ダイアボディー、直鎖抗体、例えばｓｃ−Ｆｖ、ユニボディー（Ｇｅｎｍａｂ由来の技術）である単鎖抗体分子、ナノボディー（Ｄｏｍａｎｔｉｓ由来の技術）、ドメイン抗体（Ａｂｌｙｎｘ由来の技術）、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。工学的に操作された抗体変異体は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ（２００５年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３巻：１１２６〜１１３６頁において概説されている。
【００７７】
「Ｆａｂ断片」は、軽鎖１つならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域で構成されている。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【００７８】
「Ｆｃ領域」は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含有する。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって維持している。
【００７９】
「Ｆａｂ’断片」は、軽鎖１つさらに、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域も、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成するために２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されうるように含有する１つの重鎖の一部を含有する。
【００８０】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、軽鎖２つ、およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含有する重鎖２つを、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖の間に形成されるように含有する。したがってＦ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって維持される２つのＦａｂ’断片から構成される。
【００８１】
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域を欠損している。
【００８２】
「単鎖Ｆｖ抗体」（または「ｓｃＦｖ抗体」）は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片を指し、これらのドメインは、１本のポリペプチド鎖に存在する。一般にＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖについての概説として、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ （１９９４年）ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁を参照されたい。国際特許出願公開ＷＯ８８／０１６４９ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号も参照されたい。
【００８３】
「ダイアボディー」は、２個の抗原結合部位を有する小さな抗体断片である。断片は、同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）。同じ鎖上の２つのドメイン間で対合させるには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは他の鎖の相補性ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディーは、例えばＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１およびＨｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０巻：６４４４〜６４４８頁においてさらに十分に記載されている。
【００８４】
「ドメイン抗体断片」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域だけを含有する免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片である。場合により２つ以上のＶＨ領域が二価ドメイン抗体断片を作り出すようにペプチドリンカーに共有結合的に結合する。二価ドメイン抗体断片の２つのＶＨ領域は、同じまたは異なる抗原を標的にできる。
【００８５】
本発明の抗体断片は、例えば通常重鎖間ジスルフィド結合に関与するヒンジシステインの少なくとも１つが本明細書に記載のとおりに変更されている場合に、ジスルフィド結合能力が低下している重鎖の二量体化（または多量体化）を可能にする定常領域の十分な部分を含みうる。他の実施形態において抗体断片、例えばＦｃ領域を含むものは、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能および／または補体結合など（例えば抗体がＡＤＣＣ機能または補体結合に必要なグリコシル化特性を有する場合）の、無傷の抗体中に存在する場合にＦｃ領域に通常付随する少なくとも１つの生物学的機能を保持する。
【００８６】
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同である一方で、（１つまたは複数の）鎖の残部が他の種に由来するかまたは他の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同である、ならびに所望の生物学的活性を示す範囲でそのような抗体の断片である抗体を指す（例えば米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１巻：６８５１〜６８５５頁を参照されたい）。
【００８７】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最少配列を含有するキメラ抗体である。大部分についてヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および適応力を有するマウス、ラットまたはヒトではない霊長類などのヒトではない種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見いだされない残基を含みうる。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するために行われる。一般にヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、およびＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、任意選択で免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照されたい。
【００８８】
本明細書において使用される用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、配列比較によって定義される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基、例えば軽鎖可変ドメイン中の２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）残基、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）残基（Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．を参照されたい）、さらに／または構造的に定義される「超可変ループ」（ＨＶＬ）例えば軽鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）残基、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）残基由来の残基（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋｌ、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１〜９１７頁を参照されたい）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００８９】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される、かつ／または本明細書において開示するヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作られている抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。この定義は、具体的には非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を排除する。
【００９０】
「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から同定され、分離され、かつ／または回収されたものである。その天然の環境の混入成分は、抗体の診断または治療用使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含みうる。いくつかの実施形態において抗体は、（１）ローリー法によって決定されるように抗体で９５重量％を超えて、および最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用により、Ｎ末端の少なくとも１５残基もしくは内部アミノ酸配列を得るために十分な程度まで、または（３）クーマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製される。単離された抗体は、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないことになることから、組換え細胞内でインサイチュの抗体を含む。しかし通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００９１】
「単離された」核酸分子は、抗体核酸の天然の供給源においてそれが通常関連している少なくとも１つの混入核酸分子から同定および分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、それが天然で見いだされる形態もしくは状態にある以外のものである。したがって単離された核酸分子は、天然の細胞内に存在する場合の核酸分子とは区別される。しかし単離された核酸分子は、例えば核酸分子が天然の細胞においてとは異なる染色体中の位置にある場合に、通常抗体を発現する細胞内に含まれる核酸分子を含む。
【００９２】
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同質の抗体の集団から得た抗体を指す、すなわち集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる天然に生じる可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して誘導されている。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して誘導された異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して誘導されている。修飾語「モノクローナル」は、実質的に同質な抗体の集団から得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体産生を必要とするとは解釈されない。例えば本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻：４９５頁によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ３５２巻：６２４〜６２８頁およびＭａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２２巻：５８１〜５９７頁に記載された技術を使用するファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。本明細書におけるモノクローナル抗体は、詳細には「キメラ」抗体を含む。
【００９３】
本明細書において使用する用語「免疫細胞」は、造血系由来であり、かつ免疫応答において役割を演じる細胞を含む。免疫細胞として、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球および顆粒球などの骨髄系細胞が挙げられる。
【００９４】
本明細書において使用する「免疫複合体」は、細菌性毒素、細胞毒性薬物または放射性毒素などの治療用成分に結合した抗ＰＤ−１抗体またはその断片を指す。毒性成分は、当技術分野において利用可能な方法を使用して本発明の抗体に結合されうる。
【００９５】
以下の核酸多義性記号は、本明細書において使用される、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｓ＝ＧまたはＣ、およびＷ＝ＡまたはＴ。
【００９６】
本明細書において使用する配列「変異体」は、本開示の配列とは１つまたは複数のアミノ酸残基で異なるが、得られる分子の生物学的活性を保持している配列を指す。
【００９７】
「保存的に改変された変異体」または「保存的アミノ酸置換」は、当業者に公知のアミノ酸の置換を指し、得られる分子の生物学的活性を変えることなく一般に作製されうる。当業者は、一般にポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸の置換が生物学的活性を実質的に変えないことを認識する（例えばＷａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、２２４頁（４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９８７年）を参照されたい）。そのような例示的な置換は、好ましくは以下に列挙するものに従って行われる：
【００９８】
【数１】
本明細書において使用する、２つの配列間で「％同一性」は、配列が共有する同一の位置の数の関数を指し（すなわち、％相同＝同一の位置の数／位置の総数×１００）、２つの配列の最適な配列比較ために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。配列の比較および２つの配列間の同一性百分率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成されうる。例えば２つのアミノ酸配列間の同一性百分率は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４巻：１１〜１７頁（１９８８年））のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を使用して決定されうる。加えて２つのアミノ酸配列間の同一性百分率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み入れられているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８巻：４４４〜４５３頁（１９７０年））アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびにギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ重み１、２、３、４、５または６を使用して決定されうる。
【００９９】
本明細書において使用する用語「約」は、当業者によって決定される特定の値に対する許容可能な誤差範囲内の値を指し、その値がどのように測定または決定されたかに、すなわち測定系の限界にある程度依存する。例えば「約」は、当技術分野において一実施あたり１以内の標準偏差または１を超える標準偏差を意味できる。代替えとして「約」または「を本質的に含む」は、２０％までの範囲を意味できる。さらに具体的に生物学的システムまたはプロセスに関して、用語は値の一桁まで、または５倍までを意味できる。本出願書類および本特許請求の範囲において具体的な値が提供される場合、他に明記しない限り、「約」または「を本質的に含む」の意味は、具体的な値について許容可能な誤差範囲内であると推定されるべきである。
【０１００】
リガンド／受容体、抗体／抗原、または他の結合対に関する場合「特異的に」結合するは、タンパク質および／または他の生物体の不均質な集団におけるタンパク質、例えばＰＤ−１、の存在の決定要因である結合反応を示す。したがって、指定の条件下では、特定のリガンド／抗原は特定の受容体／抗体に結合し、試料中に存在する他のタンパク質には顕著な量では結合しない。
【０１０１】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生体液に適用される場合に「投与」および「処置」は、外因性の薬学的、治療用、診断用の薬剤または組成物の動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生体液への接触を指す。「投与」および「処置」は、例えば治療用、薬物動態学的、診断用、研究用および実験用の方法を指すことができる。細胞の処理は、試薬の細胞への接触、および液が細胞に接触している場合に試薬の液への接触を包含する。「投与」および「処置」は、例えば細胞の、試薬による、診断用、結合組成物による、または他の細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの処置、も意味する。
【０１０２】
「有効量」は、医学的状態の症状または兆候を改善または予防するために十分な量を包含する。有効量は、診断を可能にするまたは促進するために十分な量も意味する。具体的な対象についての有効量は、治療される状態、患者の健康全般、投与の方法経路および用量、ならびに副作用（ｓｉｄｅ ａｆｆｅｃｔ）の重症度などの要因に依存して変動できる。有効量は、顕著な副作用または毒性作用を避ける最大用量または投薬手順でありうる。効果は、診断的指標またはパラメーターの改善を少なくとも５％、通常は少なくとも１０％、より通常には少なくとも２０％、最も通常は少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％、理想的には少なくとも７０％、より理想的には少なくとも８０％、および最も理想的には少なくとも９０％生じ、１００％は正常な対象によって示される診断パラメーターと定義される（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら（１９９６年）Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１年）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ．、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫを参照されたい）。
【０１０３】
モノクローナル抗体
ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体は、被験体にＰＤ−１抗原を注射し、次いで所望の配列または機能特性を有する抗体を発現しているハイブリドーマを単離する当技術分野における知識および技術によって作製できる。
【０１０４】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手段を使用して（例えばモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、かつ配列決定される。ハイブリドーマは、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されるとＤＮＡは、発現ベクターに入ることができ、次いで組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得るために、他に免疫グロブリンタンパク質を産生しないＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞に形質移入される。抗体の組換え産生は、より詳細に以下に記載される。
【０１０５】
さらなる実施形態において抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁に記載されている技術を使用して生成される抗体ファージライブラリーから単離されうる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁およびＭａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２巻：５８１〜５９７頁は、ファージライブラリーを使用するマウスおよびヒトの抗体の単離をそれぞれ記載している。次の刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁）、ならび非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ ｖｉｖｏ組換えを記載している（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９３年、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１巻：２２６５〜２２６６頁）。したがってこれらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替法である。
【０１０６】
キメラ抗体
抗体ＤＮＡは、例えばヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を相同なマウス配列の代わりに置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：６８５１頁）、または免疫グロブリンではない物質（例えばタンパク質ドメイン）のコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによっても改変されうる。典型的には、そのような免疫グロブリンではない物質は、抗体の定常ドメインの代わりをするか、または、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有する他の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作るために抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりをする。
【０１０７】
ヒト化抗体およびヒト抗体
ヒト化抗体は、ヒトではない供給源由来の１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と称され、典型的には「移入」可変ドメインから取り込まれる。ヒト化は、一般にＷｉｎｔｅｒおよび協力者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９巻：１５３４〜１５３６頁）に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することによって実施されうる。したがってそのような「ヒト化」抗体は、無傷のより実質的に少ないヒト可変ドメインがヒトではない種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際にヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および場合によりいくつかのＦＲ残基がヒトではない、例えばげっ歯類の抗体中の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１０８】
ヒト化抗体の作製において使用される軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「最適な」方法により、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリーに対して選別される。その結果げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体用のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受けいれられる（Ｓｉｍｓら、１９８７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１巻：２２９６頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１頁）。他の方法は、軽鎖および重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体の共通配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体用に使用されうる（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９巻：４２８５頁；Ｐｒｅｓｔａら、１９９３、 Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１５１巻：２６２３頁）。
【０１０９】
抗体が抗原に対する高い親和性および他の有益な生物学的特性を保持してヒト化されることは、さらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によりヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用する親配列および種々の概念的なヒト化産物の分析の工程によって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な３次元立体配置構造を例示および表示するコンピュータープログラムは、利用可能である。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析、を可能にする。このようにＦＲ残基は、（１つまたは複数の）標的抗原に対する親和性の増大などの所望の抗体の特性が達成されるように、レシピエント配列および移入配列から選択および組み合わせられることができる。一般にＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合に影響を及ぼすことに関与する。
【０１１０】
抗体のヒト化は、直接的なタンパク質工学的作業である。ほとんど全てのマウス抗体は、ＣＤＲ移植によってヒト化されることができ、抗原結合は保持される。Ｌｏ， Ｂｅｎｎｙ， Ｋ．Ｃ．、ｅｄｉｔｏｒ、ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２４８巻、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、２００４年を参照されたい。
【０１１１】
代替えとして、免疫化において、内在性の免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全なレパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えばマウス）を産生することがいまや可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスでの抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ欠損は、内在性の抗体産生の完全な抑制を生じることが記載されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの、そのような生殖系列変異マウスへの移入は、抗原曝露でのヒト抗体の産生を生じる。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０巻：２５５１頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ ３６２巻：２５５〜２５８頁；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３年、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７巻：３３頁およびＤｕｃｈｏｓａｌら、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ ３５５巻：２５８頁を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにも由来できる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１年Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７巻：３８１頁；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１年、２２２巻：５８１〜５９７頁；Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４巻：３０９頁）。
【０１１２】
抗体精製
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内、周辺質間隙に産生されるか、または培地に直接分泌されうる。抗体が細胞内に産生される場合、最初の段階として宿主細胞または溶解断片のいずれかの粒子細片は、例えば遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０巻：１６３〜１６７頁は、Ｅ．ｃｏｌｉの周辺質間隙に分泌される抗体の単離のための手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて融解する。細胞細片は、遠心分離によって除去されうる。抗体が培地に分泌される場合は、そのような発現系由来の上清を一般的には最初に、市販で入手可能なタンパク質濃縮用フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、任意の前述のステップにタンパク質分解を阻害するために含まれてよく、抗生物質は外来性の混入物の増殖を防ぐために含まれてよい。
【０１１３】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して、好ましい精製技術であるアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製されうる。プロテインＡの親和性リガンドとしての適合性は、種および抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域のアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用されうる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、１９８３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２巻：１〜１３頁）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、１９８６年、ＥＭＢＯ Ｊ ５巻：１５６７１５７５頁）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。細孔制御されたガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成されうるよりもより早い流速およびより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）レジン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が、精製のために有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術も回収される抗体に依存して利用可能である。
【０１１４】
一実施形態において糖タンパク質は、調製物からフコース含有糖タンパク質を除き、したがってフコースを含まない糖タンパク質を富化するためにレクチン基質での吸着（例えばレクチン親和性カラム）を使用して精製されうる。
【０１１５】
医薬製剤
本発明は、本発明のＰＤ−１抗体または抗体断片の医薬製剤を含む。医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、抗体およびその断片は、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８４年）を参照されたい。治療剤および診断剤の製剤は、生理学的に許容される単体、賦形剤または安定化剤と、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液または懸濁液の形態で混合することによって調製されうる（例えばＨａｒｄｍａｎら、（２００１年）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ａｖｉｓら（ｅｄｓ．）（１９９３年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０年））Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ （２０００年）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照されたい）。
【０１１６】
単独または免疫抑制剤との組合せで投与される抗体組成物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物での標準的薬学的手順によって決定されうる。毒性量と治療有効量との間の用量比が、治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との比として表されうる。これらの細胞培養アッセイおよび動物の研究から得られるデータは、ヒトでの使用のための投与量範囲を製剤化することにおいて使用されうる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性が殆どないか、または無しでのＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用する投与形態および使用する投与経路に依存してこの範囲内で変えることができる。
【０１１７】
投与の適切な経路は、筋肉内、静脈内または皮下投与などの非経口投与および経口投与を含む。医薬組成物中で使用されるまたは本発明の方法を実行するための抗体の投与は、経口摂取、吸入、局所投与または皮膚、皮下、腹腔内、非経口、動脈内または静脈内注射などのさまざまな従来の方法で実施されうる。一実施形態において本発明の結合化合物は、静脈内に投与される。他の実施形態において本発明の結合化合物は、皮下に投与される。
【０１１８】
代替えとして、例えば、しばしばデポー製剤または徐放性製剤での作用部位に直接での抗体の注射を介して、抗体を全身的様式よりは局所に投与できる。さらに標的化した薬物送達系で抗体を投与できる。
【０１１９】
抗体、サイトカインおよび小分子の適切な用量の選択における指針は、入手可能である（例えばＷａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６年）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）（１９９１年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）（１９９３年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｂａｅｒｔら、（２００３年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８巻：６０１〜６０８頁；Ｍｉｌｇｒｏｍら、（１９９９年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１巻：１９６６〜１９７３頁；Ｓｌａｍｏｎら、（２００１年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４巻：７８３〜７９２頁；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら、（２０００年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２巻：６１３〜６１９頁；Ｇｈｏｓｈら、（２００３年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８巻：２４〜３２頁；Ｌｉｐｓｋｙら、（２０００年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３巻：１５９４〜１６０２頁を参照されたい）。
【０１２０】
適切な用量の決定は、臨床医によって、例えば治療に影響するまたは治療に影響すると予測される当技術分野において公知または疑われるパラメーターまたは因子を使用して行われる。一般に、用量は、最適用量より幾分か少ない量から始め、その後任意の負の副作用と比較して所望のまたは最適な効果が達成されるまで少量ずつ増加させる。重要な診断指標は、症状、例えば炎症または産生される炎症性サイトカインのレベルの測定を含む。
【０１２１】
抗体、抗体断片およびサイトカインは、持続注入によって、または例えば１日、１週間もしくは１週間に１〜７回の間隔での投薬によって提供されうる。用量は静脈内、皮下、腹腔内、皮膚、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、脳内、脊髄内、または吸引によって提供されうる。好ましい投与プロトコールは、重大な望ましくない副作用を避ける最高の用量または投与頻度を含むものである。１週間の合計用量は、一般的には体重１ｋｇあたり少なくとも０．０５μｇ、より一般的には体重１ｋｇあたり少なくとも０．２μｇ、最も一般的には体重１ｋｇあたり少なくとも０．５μｇ、典型的には体重１ｋｇあたり少なくとも１μｇ、より典型的には体重１ｋｇあたり少なくとも１０μｇ、最も典型的には体重１ｋｇあたり少なくとも１００μｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも０．２ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも１．０ｍｇ、最も好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも２．０ｍｇ、最適には体重１ｋｇあたり少なくとも１０ｍｇ、より最適には体重１ｋｇあたり少なくとも２５ｍｇ、最も最適には体重１ｋｇあたり少なくとも５０ｍｇである（例えばＹａｎｇら、（２００３年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９巻：４２７〜４３４頁；Ｈｅｒｏｌｄら、（２００２年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６巻：１６９２〜１６９８頁；Ｌｉｕら、（１９９９年）Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７巻：４５１〜４５６頁；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら、（２０００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２巻：１３３〜１４４頁を参照されたい）。小分子治療、例えばペプチド模倣物、天然物または有機化学物質の望ましい用量は、１ｋｇあたりのモルベースでの抗体またはポリペプチドについてとほぼ同じである。
【０１２２】
本明細書において使用する「抑制」、または「治療する」または「治療」は、疾患に関連する症状の発症の遅延および／または該疾患で発症するもしくは発症が予測されるそのような症状の重症度の低減を含む。用語は、さらに発症している症状の改善、追加的症状の予防、およびそのような症状の元となる原因の改善または予防を含む。したがって用語は、有益な結果が疾患を有する脊椎動物対象に与えられていることを意味する。
【０１２３】
本明細書において使用する用語「治療有効量」または「有効量」は、単独でまたは追加的治療剤との組合せで細胞、組織、または対象に投与された場合に治療される疾患または状態を予防または改善するために有効である、抗ＰＤ−１抗体またはその断片の量を指す。治療有効量は、さらに、症状の改善、例えば関連する医学的状態の治療、治癒、予防もしくは改善またはそのような状態の治療、治癒、予防もしくは改善の速度の増加を生じるために十分な化合物の量を指す。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合、治療有効量は、成分単独でのそれを意味する。組合せに適用される場合治療有効量は、組合せで連続的にまたは同時に投与されるかにかかわらず、治療効果を生じる活性成分の組み合わされた量を指す。治療剤の有効量は、典型的には少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％および最も好ましくは少なくとも５０％症状を低減する。
【０１２４】
第２の治療剤を伴う同時投与または治療のための方法は、当技術分野において十分に周知であり、例えばＨａｒｄｍａｎら、（ｅｄｓ．）（２００１年）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０ｔｈ ｅｄ．、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｐｏｏｌｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（ｅｄｓ．）（２００１年）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ．、ＰＡ；Ｃｈａｂｎｅｒ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ（ｅｄｓ．）（２００１年）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ．、ＰＡを参照されたい。
【０１２５】
本発明の医薬組成物は、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤または代謝拮抗剤、腫瘍標的剤、免疫刺激剤または免疫調節剤または、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤もしくは他の毒性作用物質と結合した抗体を非限定的に含む他の薬物も含有できる。医薬組成物は、手術、化学療法および放射線などの他の治療様式と共にも使用されうる。
【０１２６】
典型的な獣医学的、実験的または研究用対象として、サル、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ウマおよびヒトが挙げられる。
【０１２７】
本発明の抗体および抗体断片についての治療的使用
ヒトＰＤ−１に特異的に結合する本発明の抗体または抗原結合断片は、免疫応答を増大、増強、刺激または上方制御するために使用されうる。本発明の抗体および抗体断片は、Ｔ細胞媒介の免疫応答の増大によって治療されうる障害を有する対象を治療するために特に適切である。好ましい対象は、免疫応答を増強する必要のあるヒト患者を含む。
【０１２８】
癌
本発明の抗体または抗原結合断片は、癌を治療する（すなわち腫瘍細胞の増殖または生存を抑制する）ために使用されうる。本発明の抗体を使用して増殖が抑制されうる好ましい癌は、典型的には免疫療法に応答する癌を含むが、免疫療法にこれまで関連がなかった癌も含む。治療について好ましい癌の非限定的例として、黒色腫（例えば転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば明細胞癌）、前立腺癌（例えばホルモン難治性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部の扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、神経膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫および他の腫瘍性悪性疾患が挙げられる。追加的に、本発明は、本発明の抗体を使用して増殖が抑制されうる難治性または再発性悪性疾患を含む。
【０１２９】
本発明の抗体または抗体断片は、単独であるいは、他の抗腫瘍性剤もしくは免疫原性薬剤（例えば、弱毒化された癌性細胞、腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む））、腫瘍由来抗原もしくは核酸でパルスされた樹状細胞などの抗原提示細胞、免疫刺激サイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＦＮａ２、ＧＭ−ＣＳＦ＿）および非限定的にＧＭ−ＣＳＦなどの免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子で形質移入された細胞、標準的癌治療法（例えば化学療法、放射線療法もしくは手術）、または他の抗体（非限定的にＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、他の増殖因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−ＩＢＢおよびＩＣＯＳに対する抗体を含む）との組合せで使用されうる。
【０１３０】
感染性疾患
本発明の抗体または抗体断片は、感染症および感染性疾患を予防または治療するためにも使用されうる。抗体または抗体断片は、病原体、毒素および自己抗原への免疫応答を刺激するために、単独でまたはワクチンとの組合せで使用されうる。抗体またはその抗原結合断片は、非限定的にヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルスクラスＡ、ＢおよびＣ、エプスタインバーウイルス（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）、ヒト（ｈｙｍａｎ）サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルスなどの、ヒトに感染性のウイルスへの免疫応答を刺激するために使用されうる。抗体またはその抗原結合断片は、細菌性または真菌性寄生生物および他の病原体での感染への免疫応答を刺激するために使用されうる。
【０１３１】
ワクチン接種アジュバント
本発明の抗体または抗体断片は、他の組換えタンパク質および／またはペプチド（腫瘍抗原または癌細胞など）と結合してこれらのタンパク質への免疫応答を増大させるために（すなわちワクチン接種手順において）使用されうる。
【０１３２】
例えば抗ＰＤ−１抗体およびその抗体断片は、抗ＰＤ−１抗体と目的の抗原（例えばワクチン）との同時投与によって抗原特異的免疫応答を刺激するために使用されうる。したがって他の態様において本発明は、（ｉ）抗原、および（ｉｉ）本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合成分を、対象における抗原への免疫応答が増強されるように対象に投与するステップを含む、対象において抗原への免疫応答を増強する方法を提供する。抗原は、例えば腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来抗原でありうる。そのような抗原の非限定的例として、腫瘍抗原、またはウイルス、細菌もしくは他の病原体由来の抗原が限定なく挙げられる。
【０１３３】
Ｔｈ２介在性疾患
本発明の抗ＰＤ−１抗体および抗体断片は、喘息およびアレルギーなどのＴｈ２介在性疾患を治療するためにも使用されうる。これは、本発明の抗体がＴｈ１応答の誘発を支援できるという発見に基づく。したがって本発明の抗体は、より（ｍｏｆｒｅ）バランスのとれた免疫応答を作り出すためにＴｈ２介在性疾患において使用されうる。
【０１３４】
Ｔ細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ活性化
本発明の抗体および抗原断片は、抗原特異的Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ活性化および増殖、ならびに腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を増加させるためのこれらの細胞のレシピエントへの養子移入のためにも使用されうる。これらの方法は、ＣＭＶなどの感染性物質へのＴ細胞応答を活性化させるためにも使用されうる。抗ＰＤ−１抗体の存在下でのｅｘ ｖｉｖｏ活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度および活性を増大させることが期待されうる。
【０１３５】
他の組合せ療法
既に記載されたとおり本発明の抗ＰＤ−１抗体は、１つまたは複数の他の治療剤、例えば細胞傷害性剤、放射毒性剤または免疫抑制剤と同時投与されうる。抗体は、該薬剤（免疫複合体として）と結合されうるか、または該薬剤とは別に投与されうる。後者の場合（別々の投与）、抗体は該薬剤の前、後もしくは同時に投与されることができ、または他の既知の療法と同時投与されうる。
【０１３６】
本発明の抗体および抗原結合断片は、ドナーに移植された腫瘍特異的Ｔ細胞の効果を増大させるためにも使用されうる。
【０１３７】
本発明の抗体および抗体断片の非治療用使用
非治療用使用についての抗ＰＤ−１抗体の市場は、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって販売されている、フローサイトメトリー分析、免疫組織化学およびｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイにおける使用のためのＪ１１６およびＪ１０５モノクローナル抗ｈＰＤ−１抗体、ならびにＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによって販売されている、フローサイトメトリー、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡにおける使用のためのｍａｂ１０８６、モノクローナル抗ｈＰＤ−１抗体、の商業的販売によって示されるとおり既に存在する。本発明の抗体は、Ｊ１１６、Ｊ１０５および／またはＭａｂ１０８６によって現在果たされている任意の非治療用目的のために使用されうる。
【０１３８】
本発明の抗体は、親和性精製剤として使用されうる。
【０１３９】
抗体は、例えば特定の細胞、組織または血清中のＰＤ−１の発現を検出するための、診断用アッセイにおいても有用である。診断用の適用において、抗体は典型的には（直接または間接のいずれかで）検出可能成分で標識される。以下の分類：ビオチン、蛍光色素、放射性ヌクレオチド、酵素、ヨウ素および生合成標識に一般に分けられ得る多数の標識が使用可能である。
【０１４０】
本発明の抗体は、競合的結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイならびに免疫沈降アッセイなどの任意の既知のアッセイ法において使用されうる。Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．１９８７年）
抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイのためにも使用されうる。一般に抗体は、放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ３５Ｓまたは１８Ｆなど）で標識して、免疫シンチグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）、または陽電子放出断層撮影を使用して、抗原またはそれを発現する細胞を限局化し得る。
【０１４１】
材料の寄託
ヒト化抗体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ構築物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に寄託されている。ｈ４０９Ａ−１１、ｈ４０９Ａ−１６およびｈ４０９Ａ−１７の重鎖をコードするＤＮＡを含有するプラスミドは、２００８年６月９日に寄託され、０８１４６９＿ＳＰＤ−Ｈと認定された。ｈ４０９Ａ１１の軽鎖をコードするＤＮＡを含有するプラスミドは、２００８年６月９日に寄託され、０８０１４７０＿ＳＰＤ−Ｌ−１１と認定された。ｈ４０９Ａ１６の軽鎖をコードするＤＮＡを含有するプラスミドは、２００８年６月９日に寄託され、０８０１４７１＿ＳＰＤ−Ｌ−１６と認定された。ｈ４０９Ａ１７の軽鎖をコードするＤＮＡを含有するプラスミドは、２００８年６月９日に寄託され、０８０１４７２＿ＳＰＤ−Ｌ−１７と指定された。寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の規定およびその規則（ブダペスト条約）に基づいて行われた。
【０１４２】
上に記載された明細書は、当業者に本発明を実施可能にするために十分であると考えられる。寄託された実施形態は、本発明の一態様の単一の例示の目的であり、機能的に同等である任意の培養物は本発明の範囲内であることから、本発明は、寄託された培養物によって範囲を限定されない。本明細書の材料の寄託は、本明細書に含まれる書面による説明が、その最良の様式を含む本発明の任意の態様の実施を可能にするために不適切であるとの承認を構成するものでなく、本特許請求の範囲をそれが提示する具体的な例示に限定すると解釈されるべきでもない。実際に、本明細書に示されかつ記載されるものに加えての本発明の種々の変更は、上の記載から当業者に明らかになり、かつ添付の特許請求の範囲内である。
【０１４３】
本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解される。しかしそれらは、本発明の範囲を限定するとして解釈されるべきではない。本明細書において述べる全ての文献および特許の引用は、明確に参照として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１４４】
（実施例１）
抗ＰＤ−１抗体の免疫化および選択
ｈＰＤ−１ｃＤＮＡでのマウスの免疫化
ヒトＰＤ−１（「ｈＰＤ−１」）受容体に対する抗体を生成するために、ｈＰＤ−１受容体のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって得て、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にサブクローン化した。次にＣＨＯ−Ｋ１細胞をｈＰＤ−１で安定に形質移入し、発現をフローサイトメトリーを使用してモニターした。ヒトＰＤ−１を膜上に発現するＣＨＯ−Ｋ１クローンを単離し、ＣＨＯ−ｈＰＤ１と名付けた。
【０１４５】
Ｈｅｌｉｏｓ ｇｅｎｅ ｇｕｎ（ＢｉｏＲａｄ）およびＤＮＡ ｃｏａｔｅｄ ｇｏｌｄ ｂｕｌｌｅｔｓ（ＢｉｏＲａｄ）を製造者の説明書に従って使用して遺伝子銃免疫化によってマウスを免疫化した。簡潔には１μｍの金粒子をｈＰＤ−１ ｃＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した）と、指示のある場合はマウスＦｌｔ３ＬおよびマウスＧＭ−ＣＳＦ用の市販の発現ベクター（どちらもＡｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ ＮＤから）とで２：１：１の割合でコートした。合計１μｇのプラスミドＤＮＡを５００μｇのｇｏｌｄ ｂｕｌｌｅｔをコートするために使用した。
【０１４６】
具体的には、７〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、遺伝子銃によって、２、３または４サイクルのショットを両耳に受けさせて耳で免疫化した（表Ｉを参照されたい）。マウス１匹は、５×１０６ＣＨＯ−ｈＰＤ１細胞を用いた最終追加免疫を腹腔に受けた。およそ１：１０００の抗ｈＰＤ−１力価がマウス血清において２回のＤＮＡ免疫化後に、ＣＨＯ−ｈＰＤ１対ＣＨＯ−Ｋ１親細胞を使用する細胞ＥＬＩＳＡによって検出可能であった。最終免疫化の４日後、マウスを屠殺し、赤血球除去脾臓細胞集団を以前記載されたとおり（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２巻：６９〜７７頁；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９巻：１２５〜１３４頁）調製し、−１４０℃で凍結した。
【０１４７】
【表１】
抗ＰＤ−１抗体産生Ｂ細胞の選択
抗ヒトＰＤ−１抗体産生Ｂ細胞クローンを選択するために、ｈＰＤ−１ ＤＮＡ免疫化マウス、すなわちマウス７３０、７３１および７３８（表１を参照されたい）由来の赤血球除去脾臓細胞２×１０７個をＢ細胞培養のためにプールした。脾臓細胞をＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２／１０％子ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）で３７℃、１時間、プラスチック培養フラスコ中で単球を除くためにインキュベートした。非接着細胞を１回のＣＨＯ−Ｋ１細胞でのネガティブパニング、続いてＣＨＯ−ｈＰＤ１細胞でのポジティブパニングにかけた。両方の選択手順は、２１ｃｍ２ペトリ皿またはＴ２５培養フラスコでコンフルエントに増殖した培養物において３７℃、１時間実施した（細胞培養物は使用前に合計線量２０００ＲＡＤまで照射した）。ポジティブパニング後、未結合細胞を、０．１３２％ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏおよび０．１％ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏを補充したＰＢＳでの１０回洗浄によって除去した。最後に結合性Ｂ細胞をトリプシン処理によって回収した。
【０１４８】
選択したＢ細胞を培養し、Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９巻：１２５〜１３４頁に記載のとおり不死化した。簡潔には、選択したＢ細胞を、平底９６ウェル組織培養プレート中の７．５％（ｖ／ｖ）Ｔ細胞上清および５００００照射（２５００ＲＡＤ）ＥＬ−４ Ｂ５栄養細胞と最終容量２００μＬのＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２／１０％子ウシ血清中で混合した。８日目に、上清をそれらの抗ＰＤ−１反応性についてＣＨＯ−ｈＰＤ−１細胞ＥＬＩＳＡによって以下の手順を使用して選別した。ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−ｈＰＤ−１細胞をコンフルエントまで平底９６ウェルプレートで、５０μＬ ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２、１０％ＦＢＳ中で培養した。次に５０μＬの免疫グロブリン含有上清を３７℃、１時間で加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄後、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２／１０％ＦＢＳ中の１００μＬ（１：１０００希釈）ヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）を３７℃、１時間で加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄後、固定化免疫グロブリンをＵＰＯ／ＴＭＢ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｂｏｘｔｅｌ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で可視化した。
【０１４９】
このＢ細胞培養物から、１３個のｈＰＤ−１反応性の上清が同定され、プラスチック上に固定化された場合にジャーカットＴ細胞活性化を抑制することを示し、陽性ウェルからのＢ細胞クローンを、刊行された手順（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２巻：６９〜７７頁；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９巻：１２５〜１３４頁）に従ってミニ電気融合によって不死化した。具体的には、Ｂ細胞を１０６個のＮＳ−１骨髄腫細胞と混合し、血清をＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２での洗浄によって除去した。次に細胞をプロナーゼ溶液で３分間処理し、続いて融合培地で洗浄した。電気融合を５０μＬ融合容器で、３０ｓ、２ＭＨｚ、４００Ｖ／ｃｍの交流電場に続いて、１０μｓ、３ｋＶ／ｃｍのスクウェア、高電場パルスおよび再度の３０ｓ、２ＭＨｚ、４００Ｖ／ｃｍの交流電場によって実施した。最後に融合容器の内容物をハイブリドーマ選択培地に移し、限界希釈条件下で９６ウェルプレートに蒔いた。融合の１４日後、培養物をハイブリドーマの増殖について検査し、ｈＰＤ−１への抗体反応性の存在について選別した。この手順は、ｈＰＤ−１．０５Ａ、ｈＰＤ−１．０６Ｂ、ｈＰＤ−１．０８Ａ、ｈＰＤ−１．０９ＡおよびｈＰＤ−１．１３Ａと名付ける５種の異なる抗ｈＰＤ−１ハイブリドーマをもたらし、それらの完全性を保護するために限界希釈によってサブクローン化し、抗体を産生するためにさらに培養した。これらのハイブリドーマから得た上清は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激におけるジャーカットＥ６．２．１１細胞からのＩＬ−２産生を強く抑制した（図１および以下の本文を参照されたい）。
【０１５０】
ジャーカットＥ６．１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を限界希釈によって標準的方法を使用してサブクローン化し、サブクローンをＣＤ３およびＣＤ２８の交差結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）でＩＬ−２を産生する増大した能力について検査した。高ＩＬ−２産生サブクローンを得て、次にジャーカットＥ６．２．１１と名付け、さらなるアッセイにおいて使用した。Ｃｏｓｔａｒ３３７０ ９６ウェルアッセイプレートを５μｇ／ｍＬヒツジ抗マウスＩｇ（ＳＡＭ）で一晩、４℃でコートした。過剰量のＳＡＭを除去し、プレートを１ウェルあたり２００μＬのＰＢＳ／１０％ウシ胎仔血清で１時間、室温でブロックした。ＰＢＳで３回洗浄後、ウェルを１ウェルあたり１００μＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、１０または６０ｎｇ／ｍＬ）で１時間、３７℃でコートした。ＰＢＳで３回洗浄後、１ウェルあたり５０μＬのＰＢＳ／１０％ウシ胎仔血清および１ウェルあたり５０μＬのＢ細胞またはハイブリドーマ上清を３０分間、３７℃で加えた。ＰＢＳで３回洗浄後、１ウェルあたり１２０μＬの細胞懸濁液、ジャーカットＥ６．２．１１細胞（ＤＭＥＭ／Ｆ１２／１０％ウシ胎仔血清中の、１ウェルあたり細胞２×１０５個＋０．５μｇ／ｍＬ抗ＣＤ２８（Ｓａｎｑｕｉｎ ＃Ｍ１６５０、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ＮＬ））を加えた。６時間培養後、上清をＩＬ−２産生について標準的サンドイッチＥＬＩＳＡをＰｈａｒｍｉｎｇｅｎからの抗ｈＩＬ−２捕捉抗体とビオチン化検出抗体との対および検出試薬としてストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で使用して検査した。これらの抗体の効力をＰＤ−Ｌ１と比較して決定するために、ｍＡｂの小さな群を大規模に産生させた。ｍＡｂをプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した（実施例２を参照されたい）。精製した抗体、ｈＰＤ−Ｌ１／Ｆｃ（組換えヒトＢ７−Ｈ１／Ｆｃキメラ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）またはネガティブコントロールとしてのマウスＩｇＧ１κ（Ｓｉｇｍａから）を同じ濃度でプレートに抗ＣＤ３と共に上に記載のとおりコートした。ジャーカットＥ６．２．１１細胞および抗ＣＤ２８を６時間加え、Ｔ細胞活性化を上清に産生されたＩＬ−２によって測定した。抗体のうち２つ（ｈＰＤ１．０８ＡおよびｈＰＤ１．０９Ａ）は、固定化ＰＤ−Ｌ１／Ｆｃと比較して８〜１０倍強い抑制を示した。
【０１５１】
（実施例２）
マウス抗ＰＤ−１抗体の精製および特徴付け
抗ＰＤ−１産生ハイブリドーマの安定化および抗ＰＤ−１抗体の精製
クローン細胞集団を各ハイブリドーマから、それらを複数回（＞４）の限界希釈にさらすことによって得た。次いで安定なハイブリドーマを無血清条件でＣＥＬＬｉｎｅバイオリアクター（Ｉｎｔｅｇｒａ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して６から８日間培養した。細胞を内側の容器の無血清培地中に１ｍＬあたり細胞３×１０６個の密度で１５ｍＬに蒔き、およそ１ｍＬあたり細胞４×１０７個に８日間かけて増殖させた。外側の容器を１０％までのＢＣＳ（仔ウシ血清）で補充した培地で満たした。６日目から８日目に、内側の容器の培養物を回収し、１５ｍＬ ＳＦ培地で洗浄し、ハイブリドーマと再播種した。バイオリアクター上清および洗浄液を合わせ、遠心分離で澄ませた。得られた上清を０．２２μＭ濾過膜で濾過した。抗体精製のために、上清を１：１で高塩濃度の結合緩衝液（１Ｍ グリシン／２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ９．０）に希釈し、ｍＡｂをプロテインＧ ＨｉＴｒａｐ ５ｍＬカラム（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。ＰＢＳで洗浄後、結合抗体を０．１Ｍグリシン ｐＨ＝２．７を使用して溶出し、３Ｍ Ｔｒｉｓを使用するｐＨ中和が続いた。最後に緩衝液をＰＤ−１０ゲル濾過カラム（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢＳに交換し、抗体をＵｌｔｒａ−１５遠心濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮し、分光光度法を使用して定量した。
【０１５２】
市販の抗体
以下の市販の抗体を本明細書に記載の種々の研究において使用した：抗ＰＤ−１抗体クローンＪ１１６（＃１４−９９８９）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。抗ＣＴＬＡ−４クローン１４Ｄ３（ｍＡｂ １６−１５２９）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。抗ＰＤ−１クローン１９２１０６（ｍＡｂ１０８６）はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入した（＃ｍＡｂ１０８６）。アイソタイプ対照抗体ｍＩｇＧ１、κ、クローンＭＯＰＣ２１はＳｉｇｍａから購入した（＃Ｍ９２６９）。アイソタイプ対照ｍＩｇＧ１κ（ｍＡｂ １６−４７１４）およびＩｇＧ２ａκ（ｍＡｂ １６−４７２４）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
【０１５３】
結合活性
タンパク質に基づく、および細胞に基づくＥＬＩＳＡ（「ＣＥＬＩＳＡ」）実験を見かけの結合親和性（ＥＣ５０値として報告される）を決定するために使用した。場合により、抗ＰＤ−１抗体の結合を市販の抗ＰＤ−１抗体Ｊ１１６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＭａｂ１０８６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）のそれと比較した。
【０１５４】
タンパク質ＥＬＩＳＡを、抗体のヒトＰＤ−１／Ｆｃへの相対結合の決定のために使用した。ｈＰＤ−１／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＭａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に４時間、室温（または４℃、一晩）でのインキュベーションによって固定化した。非特異的結合部位をＰＢＳＴ中の３％ＢＳＡとの１時間、室温でのインキュベーションによってブロックした。コーティング後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。抗ＰＤ−１抗体の希釈物を結合緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）中に調製し、固定化融合タンパク質と１時間、２５℃でインキュベートした。結合後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、結合緩衝液中に１／４０００で希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と１時間、２５℃でインキュベートし、再び洗浄し、ＴＭＢを使用して発色させた。ＥＬＩＳＡ結果を図２に示す。最大半量の結合での濃度を相対結合親和性の測定値として報告する（表ＩＩ）。
【０１５５】
ＣＨＯ−ｈＰＤ−１細胞への結合もＣＥＬＩＳＡによって評価した。ＣＥＬＩＳＡのためにＣＨＯ−ｈＰＤ−１細胞を８０から１００パーセントコンフルエントまで５０μＬ培地（ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’Ｓ １２Ｆ、１０％ＦＢＳ）中で培養した。次に種々の濃度の精製ｍＡｂを含有する５０μＬ培地を１時間、３７℃で加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでの３回洗浄後、１００μＬヤギ−抗マウス−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｃａｔ ＃１０３０−０５）（培地中に１：１０００希釈）を１時間、３７℃で加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでさらに３回洗浄後、固定化免疫グロブリンを比色定量のペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で可視化した。ペルオキシダーゼ活性による吸光度（４５０ｎｍ）の増加をマイクロタイタープレートリーダーで測定した。図２は、抗体ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａにおける濃度と結合との間の用量応答関係を示す。タンパク質および細胞の結合研究の結果を表ＩＩにまとめる。
【０１５６】
生物光学干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）による動態解析
抗体の結合特性をさらに特徴付けるために、それぞれをＯｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）での生物光学干渉法を使用して概要を示し、結合動態を明らかにし、および平衡結合定数を算出した。このアッセイは、ＰＤ−１Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）の、標準的アミン化学を使用するアミン反応性バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）へのカップリングによって実施された。次いで抗ＰＤ−１ｍＡｂのバイオセンサーへの結合およびバイオセンサーからの解離を種々の抗体濃度で観察した。具体的には、アミン反応性バイオセンサーを、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ＝５．５を含むウェルに５分間浸漬することによって予め湿らせた。次いでバイオセンサーを０．１Ｍ ＮＨＳ／０．４Ｍ ＥＤＣ混合物を５分間使用して活性化した。ＰＤ−１／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、バイオセンサーを０．１Ｍ ＭＥＳ中の１２μｇ／ｍＬ ＰＤ−１／Ｆｃの溶液に７．５分間浸漬することによってカップリングさせた。バイオセンサーの表面を１Ｍエタノールアミン溶液を５分間使用してクエンチさせた。バイオセンサーをＰＢＳ中に５分間、平衡化させた。抗ＰＤ−１ｍＡｂの会合を、種々の抗体濃度（ＰＢＳ中、１０〜８０ｎＭ精製抗体＞９９％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）を含むウェル中にバイオセンサーを置き、干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を３０分間モニターすることによって観察した。解離は、バイオセンサーをＰＢＳ中に移し、干渉シグナルを６０分間モニターした後に測定した。観察された会合速度および解離速度（ｋｏｂｓおよびｋｄ）を、検査した全ての濃度を含む１：１結合の包括的フィットモデルを使用して適合させ、平衡結合定数ＫＤを算出した。動態研究からの結果を表ＩＩおよび下の図６に示す。
【０１５７】
【表２】
モノクローナル抗体のうちの２つ、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａは、このアッセイを使用して検査した任意の他のｍＡｂよりも相当に強く結合し、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａについて決定されたＫＤがそれぞれ２４ｐＭおよび２２ｐＭであった。検査した他の抗ＰＤ−１抗体と比較して、親和性の増大は、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａについて測定されたより遅い解離速度および顕著に早い会合速度による。
【０１５８】
リガンド遮断
フローサイトメトリーを使用して研究したリガンド結合の遮断。ヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞を接着培養フラスコから解離させ、種々の濃度の抗ＰＤ−１抗体、および一定濃度（６００ｎｇ／ｍＬ）の未標識ｈＰＤ−Ｌ１／Ｆｃまたは組換えヒトＰＤ−Ｌ２／Ｆｃ融合タンパク質（どちらもＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから）と９６ウェルプレートで混合した。混合物を３０分間氷上で平衡化させ、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＣＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＦｃとさらに１５分間、氷上でインキュベートした。細胞を再びＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを非線形回帰を使用するＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で分析し、ＩＣ５０値を算出した。
【０１５９】
算出したＩＣ５０値を表ＩＩにまとめる。抗体０５Ａ、０６Ｂおよび１３Ａは、ｈＰＤ−１の結合について６００ｐＭから３ｎＭの間のＫＤを示すと確定された。強力な結合にもかかわらず、これらの抗体それぞれは、ｈＰＤ−１へのｈＰＤ−Ｌ１の結合の遮断についてＩＣ５０＞１０ｎＭを示した。市販で入手できる抗ＰＤ−１抗体Ｊ１１６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、結合について、この実験の範囲外に算出されたＩＣ５０（＞１００，ｎＭ）を有してＰＤ−Ｌ１と弱く競合した。対照マウスＩｇＧ１は、ＰＤ−１結合についてＰＤ−Ｌ１と競合しない。対照的に高親和性抗体ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａは、１ｎＭより低いＩＣ５０値でＰＤ−Ｌ１結合を抑制したが、ＰＤ−Ｌ２結合はＩＣ５０値１〜２ｎＭ程度で遮断した（表ＩＩ）。ＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−Ｌ１よりも２から６倍高い親和性でＰＤ−１に結合するとより早く報告された。（Ｙｏｕｎｇｎａｋ Ｐ．ら、２００３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０７巻、６７２〜６７７頁）
リガンド遮断は、蛍光比色微量容積アッセイ（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ ａｓｓａｙ）技術（ＦＭＡＴ）を使用する同質的競合アッセイおよび検出を使用して確認された。簡潔には、ＣＨＯ．ｈＰＤ−１を接着培養フラスコから解離させ、種々の濃度の抗ＰＤ−１抗体および一定濃度（６００ｎｇ／ｍＬ）のｈＰＤ−Ｌ１／ＦｃまたはｈＰＤ−Ｌ２／Ｆｃ融合タンパク質（どちらもＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから）と混合し、９６ウェルプレート中で蛍光色素（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。混合物を９０分間、３７℃で平衡化させ、ＡＢ８２００Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して読み取った。データは非線形回帰を使用するＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で分析し、ＩＣ５０値を算出した。図３は、リガンド遮断の程度は抗体濃度によって決定されることを示す用量応答実験の結果を示す。ｈＰＤ−Ｌ１／ＦｃおよびｈＰＤ−Ｌ２／Ｆｃの両方のＣＨＯ−ｈＰＤ−１細胞への結合は、ｈＰＤ−１．０８Ａ、ｈＰＤ−１．０９Ａおよび（より少ない程度で）Ｊ１１６によって用量依存的な様式で完全に抑制されうる。算出されたＩＣ５０データを表ＩＩにまとめる。フローサイトメトリーを使用して得られた結果を確認して、高親和性抗体ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａは、ＰＤ−Ｌ１結合を１ｎＭより低いＩＣ５０値で抑制した。
【０１６０】
種の交差反応
抗体の種の交差反応性を評価するために、マウスおよびｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ＰＤ−１受容体をＰＣＲによってクローン化し、安定に形質移入したＣＨＯ−Ｋ１細胞を作製した。抗体をカニクイザル受容体への結合についてＣＥＬＩＳＡを使用して検査した。市販の抗体Ｊ１１６、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａは、ヒトおよびカニクイザルＰＤ−１に同等な親和性で結合し、ｈＰＤ−Ｌ１／ＦｃおよびｈＰＤ−Ｌ２／ＦｃのカニクイザルＰＤ−１への結合をヒトＰＤ−１と比較して同様の有効性で遮断することが見いだされた。カニクイザルＰＤ−１の細胞外部分のアミノ酸配列がヒトＰＦ−１のそれと９７％同一であることが見いだされたことから、これは驚くべきことではない。ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍａｃａｑｕｅ由来のＰＤ−１に加えて、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａは、ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ由来のＰＤ−１も実施例３に記載のＳＥＭ刺激血液細胞培養物中で機能的に遮断した。検査した抗体で、使用したいずれのアッセイにおいても検出可能な親和性でマウスＰＤ−１に結合したものはなかった。
【０１６１】
要約として、ジャーカット機能を調整する能力に基づいて単離した５個の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を精製し、かつ特徴付けた。これらの抗体は、ＰＤ−１に強く結合し（解離定数２０ｐＭから３ｎＭの範囲で）、さまざまなＩＣ５０値でＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方と相互作用の遮断をできた。これらの抗ｈＰＤ−１ｍＡｂの４個は、市販で入手可能な最も良い抗ＰＤ−１ｍＡｂより相当に良かった。受容体アンタゴニストとして作用する溶液中に加えた場合に各抗体は、最終的にはＴ細胞応答を増強した（実施例３を参照されたい）。
【０１６２】
（実施例３）
抗ＰＤ−１抗体の機能的プロファイリング
ＳＥＢへのヒトＴ細胞応答は、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａによって増強される。
【０１６３】
抗ＰＤ−１抗体をＴ細胞活性を増強するそれらの能力についてｉｎ ｖｉｔｒｏで、健常ボランティア由来の血液細胞を使用して検査した。ヒトＰＤ−１受容体を遮断することの機能的結果を特徴付けるために使用したアッセイは、Ｖβ３およびＶβ８ Ｔ細胞受容体鎖を発現する全てのＴ細胞に結合し、かつ活性化するためにブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を利用した。健常人ドナー血液を得て、培地中に１：１０で希釈した。希釈した全血を９６ウェル丸底プレートに蒔き（１ウェルあたり１５０μｌ）、３０〜６０分間、ｍＡｂとさまざまな濃度でプレインキュベートした。次いでＳＥＢを１０ｎｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲の種々の濃度で加えた。培養２から４日後に上清を回収し、産生されたＩＬ−２の量をＥＬＩＳＡ（実施例１に記載）を使用して、または標準的多重技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｐｌａｔｆｏｒｍ−Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅサイトカイン検出キット）を使用して定量した。１００ｎｇ／ｍＬから最大１０μｇ／ｍＬまでのＳＥＢの滴定は、全血細胞によるＩＬ−２産生を顕著に刺激した。通常、１μｇ／ｍＬのＳＥＢでの刺激２〜４日後にＥＬＩＳＡによって、ドナーに依存して、１００から１０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２が検出可能であった。ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａの添加は、対照マウスＩｇＧ１を超えて、検査した最高抗体濃度（２５μｇ／ｍＬ）で平均２から４倍にＩＬ−２産生を増強した。刺激指数は、一連の独立の健常ボランティアで実施した実験について平均した（図４）。これらの実験は、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａの両方が希釈全血細胞のＳＥＢ刺激でＩＬ−２産生を増強したことを示した。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の両方（しかしＰＤ−Ｌ２ではない）の発現レベルは、全血細胞のＳＥＢ刺激後に徐々に上方制御された（フローサイトメトリーによる定量）。抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ５、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１６−５９８２）および抗ＣＴＬＡ−４（クローン１４Ｄ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１６−１５２９）も、同様の条件下でＩＬ−２産生の増加を誘発し、同時刺激経路の操作後にＴ細胞活性を定量するためのＳＥＢ刺激アッセイの使用をさらに検証した発見を導いた（図４）。抗ＰＤ−１抗体によって増強されたＩＬ−２産生は、用量依存的であることが見いだされた。ＩＬ−２に加えてＬｕｍｉｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって、ＴＮＴα、ＩＬ−１７、ＩＬ−７、ＩＬ−６およびＩＦＮγのレベルもｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａによって顕著に調節されることが見いだされた。これらの実験の結果は、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９ＡをヒトＴ細胞応答を刺激するために使用できることを示す。
【０１６４】
抗ＰＤ−１抗体ｈＰＤ−１．０９ＡをＴ細胞活性を増強するその能力についてｉｎ ｖｉｔｒｏで癌患者由来の血液細胞を使用してさらに検査した。進行黒色腫（１名）または前立腺癌（３名）を有する患者由来の血液を上の手順に従って検査した。サイトカイン定量の結果を表ＩＩＩに、細胞を２５μｇ／ｍＬ ｈＰＤ−１．０９Ａの存在下で刺激した場合を抗体非存在下でのＳＥＢ刺激と比較して、産生されたサイトカインの増加倍数で表す。要約すると、ｈＰＤ−１．０９Ａは、４名の各患者についてＳＥＢ誘発ＩＬ−２産生を２から３．５倍増加させたことが見いだされた。同様にＴＮＴα、ＩＬ−１７およびＩＦＮγの産生は、増強され、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の産生は減少した。これらの実験は、ｈＰＤ−１．０９Ａが癌患者においてＴ細胞応答を刺激する能力を有することを示す。さらにこれらの実験は、Ｔｈ１応答に対する選好性を示唆する。
【０１６５】
【表３】
ＴＴチャレンジに対するヒトリコールＴ細胞応答は、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａによって増強される。
【０１６６】
抗ヒトＰＤ−１抗体遮断受容体のその天然のリガンドとの相互作用の機能的効果を要約するために使用された他のアッセイは、破傷風トキソイド（ＴＴ）抗原を健常人ドナー血液における既存のメモリーＴ細胞を刺激するために使用した。この目的を達成するために、新鮮調製ＰＢＭＣ（細胞２×１０５個）を９６ウェル丸底プレートの完全ＲＰＭＩ１６４０培地（５％熱不活性化ヒト血清を含む）に蒔き、さまざまな濃度の検査抗体とプレインキュベートし、１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＴ（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で刺激した。細胞を３〜７日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、その後上清を回収した。サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＩＬ−２およびＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ検出抗体対セット）および多重分析（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｐｌａｔｆｏｒｍ−Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅサイトカイン検出キット）によって決定した。ＰＤ−１の遮断は、抗原単独と比較して、増殖を増強し、かつＩＦＮγおよびＩＬ−２を含むサイトカイン産生を顕著に増強した（図５）。Ｌｕｍｉｎｅｘ分析は、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−６の産生がＰＤ−１遮断で増加することを明らかにした。
【０１６７】
ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト細胞でのヒトＰＤ−１の染色
ＳＥＢ刺激血液細胞がＰＤ−１の増強された発現をフローサイトメトリーで示したことから、これらの細胞を、ｈＰＤ−１．０９Ａが組織学的使用のためのホルマリン固定パラフィン包埋組織においてＰＤ−１を検出できるかどうかを決定するために使用した。ヒトドナー末梢血単核球を、０．１μｇ／ｍＬ ＳＥＢで３日間刺激し、その後非接着細胞（主にリンパ球）を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離（１１００ｒｐｍ、５分間）した。細胞を１０分間、４％ホルムアルデヒドで固定し、細胞沈渣をアガロースに包埋し、エタノール（７０％、８０％、９６％および１００％と続いて）およびキシレン中で脱水し、その後パラフィンに包埋した。切片（４μｍ）をガラススライドにマウントし、水和させ（キシレン、エタノール１００％、９６％、８０％、７０％、ＰＢＳ緩衝液）、その後加熱したクエン酸緩衝液への抗原回収を標準的方法を使用して実施した。ペルオキシダーゼ活性を０．３％Ｈ２Ｏ２を含む１００％メタノールを使用して遮断し、スライドを水およびＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎでリンスした。切片をｈＰＤ−１．０９Ａと１．５時間、室温でインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでリンスし、標準的検出法が続いた。スライドをヘマトキシリンで３０秒間、室温で対比染色し、キシレンで脱水し、マウントして顕微鏡検査した。これらの実験は、ＳＥＢ刺激ＰＢＣＭ培養物由来のリンパ球は、未刺激のＰＢＭＣ培養物とは対照的に、ｈＰＤ−１．０９Ａで（アイソタイプ対照と比較した場合）強く染まり、ｈＰＤ−１．０９Ａが診断試薬として有用であることを示した。
【０１６８】
（実施例４）
抗ＰＤ−１抗体配列および続くヒト化
免疫グロブリンｃＤＮＡのクローニング
縮重プライマーＰＣＲに基づく方法を使用して、ハイブリドーマｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａによって発現されるマウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定した。簡潔には、重鎖および軽鎖についての遺伝子特異的ｃＤＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｒａｄ ＃１７０８８９６）を製造者の説明書に従って使用して生成した。使用したＰＣＲプライマーは、Ｉｇ−プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ ＃６９８３１−３）に基づいた。縮重ＰＣＲ反応は、ＴａｑポリメラーゼをＮｏｖａｇｅｎプライマーセット手順書に従って使用して実施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。重鎖および軽鎖の可変領域の両方について予測される増幅産物サイズは、約５００塩基対である。適切なバンドをもたらした反応からのＴａｑ−増幅ＰＣＲ産物２μｌをｐＣＲ４ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｋ４５９５−４０）にクローン化し、ＤＨ５−αＥ．ｃｏｌｉに製造者による指示のとおり形質転換した。クローンをユニバーサルＭ１３順方向および逆方向プライマーを使用してコロニーＰＣＲによって選別し、各反応から２から３クローンをＤＮＡ配列分析用に選択した。
【０１６９】
クローンをユニバーサルプライマーＭ１３順方向、Ｍ１３逆方向、Ｔ３およびＴ７を使用して両方向に配列決定した。各クローンについての各配列決定反応の結果をＳｅｑｍａｎを使用して分析した。共通配列を、ＮＣＢＩ Ｉｇ−Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を使用して、生殖系列および再配列Ｉｇ可変領域配列のデータベースに対して探索した。ｈＰＤ−１．０８ＡについてのＢｌａｓｔの結果は、ストップコドンが導入されていない生産性（インフレーム）に再配列された重鎖を同定した。２種の異なる配列、１つはストップコドンが導入されていない生産性（インフレーム）に再配列された軽鎖、他方はＦＲ４領域中にストップコドンに至るフレームシフトを含有する非生産的に再配列された配列、をコードする軽鎖クローンが同定された。観察された非生産的増殖不能転写物は、おそらく骨髄腫融合相手由来であり（Ｃａｒｒｏｌｌ Ｗ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５巻：９９１〜９９５頁（１９８８年）排除した。
【０１７０】
ｈＰＤ−１．０９ＡについてのＢｌａｓｔの結果は、ストップコドンが導入されていない生産性（インフレーム）に再配列された重鎖および軽鎖を同定した。発現されたタンパク質のアミノ酸配列は、質量分析によって確認した。配列を添付の配列表で開示し、表ＩＶに列挙する。
【０１７１】
【表４−１】
【０１７２】
【表４−２】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｉｎ： ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤに従って注釈を付けた。
【０１７３】
キメラｃ１０９Ａ抗体の構築および発現
キメラ軽鎖および重鎖を、マウスｈＰＤ−１．０９Ａ ＶＬおよびＶＨ領域のＰＣＲでクローン化したｃＤＮＡをヒトκおよびＩｇＧ１定常領域にそれぞれ連結することによって構築した。マウスｃＤＮＡ配列の５’および３’末端を、各鎖に適切なリーダー配列および既存の組換え抗体発現ベクターへのクローニングを可能にする制限部位を付加するために設計したＰＣＲプライマーを使用して改変した。
【０１７４】
ＣＯＳ−７細胞（１ｍＬあたり１０７個で０．７ｍＬ）に各キメラ重鎖および軽鎖発現プラスミド１０μｇを電気穿孔した。次いでこれらの細胞を８ｍＬ 増殖培地中で３日間培養した。サンドイッチＥＬＩＳＡを、ＣＯＳ−７形質移入体由来の上清中の抗体濃度を測定するために使用した。これは、形質移入されたＣＯＳ−７細胞は、３種の別々の形質移入体で約２９５ｎｇ／ｍＬのキメラＩｇＧ１−κ抗体を分泌したことを示した。
【０１７５】
形質移入されたＣＯＳ−７細胞によって産生されたキメラ抗体の結合は、ＰＤ−１結合ＥＬＩＳＡおよびＣＥＬＩＳＡ（実施例２を参照されたい）を使用して測定し、マウス抗体に匹敵する親和性でＰＤ−１に結合することを示した。
【０１７６】
ヒト化抗体設計
ｈＰＤ−１．０９Ａ抗体をＭＲＣＴ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）によりＣＤＲ移植技術を使用してヒト化した（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい）。簡潔には、マウス抗体ｈＰＤ−１．０９Ａの可変鎖配列をＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）タンパク質データバンクにおいて入手可能な配列と比較した。ｈＰＤ−１．０９Ａの相同性モデルを最も近いＶＨおよびＶＫ構造に基づいて生成した。ｈＰＤ−１．０９Ａに最も高い同一性を有するヒト配列を同定し、分析した（Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４巻：４８７〜４９９頁（１９９２年）；Ｍｏｒｅａ Ｖ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０巻：２６７〜２７０頁（２０００年）；Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６巻：６５１〜６６３頁（１９８５年））。ＣＤＲ移植重鎖および軽鎖を構築するために最も適切なヒトフレームワークを同定した。
【０１７７】
重鎖について、ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６３８２９でコードされるフレームワークを最も適切であると決定した。ｈＰＤ−１．０９Ａ ＶＫ配列の分析は、そのＣＤＲ１の長さ（１５残基）が任意のヒトＶＫにおいて見いだされないことを示す。このため３種の異なるＣＤＲ１の長さ（１１、１６および１７残基）のフレームワークを、どのＣＤＲ１の長さがｈＰＤ−１．０９Ａ ＶＫの挙動を再生するのかを検査するために分析した。その構造中において重要である選択された残基においてｈＰＤ−１．０９Ａ ＶＫに最も高い同一性を有し、ＣＤＲ１の長さ１１、１６および１７を有するヒトＶＫ配列を同定した。ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ２９４６９のフレームワークをＫ１０９Ａ−Ｌ−１１に基づいて選択した。ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６４１３５由来のフレームワークをＫ０９Ａ−Ｌ−１６に基づいて選択し、ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ７２４３１由来のフレームワークをＫ０９Ａ−Ｌ−１７に基づいて選択した。
【０１７８】
ストレートグラフト（ｓｔｒａｉｇｈｔ ｇｒａｆｔ）を各鎖に対する発現構築物を生成するために実施した。１０９Ａ−Ｈ、Ｋ０９Ａ−Ｌ−１１、Ｋ０９Ａ−Ｌ−１６およびＫ０９Ａ−Ｌ−１７のＤＮＡおよびタンパク質配列を添付の配列表（表ＩＶ）において開示する。
【０１７９】
セリン２４１（Ｋａｂａｔ番号）がプロリンに転換された安定化Ａｄａｉｒ変異を有する（Ａｎｇａｌ Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｏｌ．３０巻：１０５〜１０８頁（１９９３年））ヒト化ｈ１０９Ａ抗体のＩｇＧ４バージョンを生成した。この配列は、配列番号２３および３１で開示される。
【０１８０】
（実施例５）
ヒト化抗ＰＤ−１抗体の結合特性および機能特性
産生および精製
ヒト化抗体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７をＣＨＯ−Ｓ細胞の一過的形質移入によって産生させた。細胞をＣＤ−ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏ）およびＣ５４６７培地（Ｓｉｇｍａ）で８日間、振盪フラスコ中で増殖させた。抗体をプロテインＡクロマトグラフィーによって細胞上清から精製し、洗浄し、１Ｍ酢酸を使用して溶出し、３Ｍ Ｔｒｉｓを使用して中和した。最後に緩衝液を、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基でｐＨ５．５に調整した１００ｍＭ酢酸に交換した。
【０１８１】
結合および動態解析
見かけの結合親和性を決定するために（ＥＣ５０値として報告される）タンパク質に基づく、および細胞に基づくＥＬＩＳＡを実施例２に記載のとおり実施した。ヒト化抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１／Ｆｃおよび細胞で発現されるＰＤ−１にマウス親抗体に匹敵するＥＣ５０値でそれぞれ結合した（表Ｖ）。
【０１８２】
抗体の動態学的な結合特性も実施例２に記載のとおり生物光学干渉法を使用して実施した（図６）。ヒト化抗体の２つｈ４０９Ａ１１およびｈ４０９Ａ１６は、ｈ４０９Ａ１１およびｈ４０９Ａ１６について決定されたＫＤがそれぞれ２９ｐＭおよび２７ｐＭであって（表Ｖ）、このアッセイを使用して検査した他のいずれのｍＡｂよりも相当強く結合した。検査した他の抗ＰＤ−１抗体と比較して、増大した親和性は、主により遅い解離速度による。マウス親抗体と同様に、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６は、１２０ｐＭより低く決定されたＫＤでカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）ＰＤ−１への結合を示した。
【０１８３】
リガンド遮断
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合を遮断するヒト化抗体の能力を、実施例２に記載のとおりＦＭＡＴ競合アッセイを使用する同質的競合アッセイおよび検出を使用して測定した。
【０１８４】
ｈＰＤ−Ｌ１／ＦｃおよびｈＰＤ−Ｌ２／Ｆｃの両方のＣＨＯ−ｈＰＤ１細胞への結合は、検査した任意のヒト化抗体によって用量依存的に完全に抑制し得る。算出されたＩＣ５０データを表Ｖにまとめる。親マウス抗体ｈＰＤ−１．０９Ａと同様に、ヒト化ｍＡｂ、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７のそれぞれは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２結合を１ｎＭより低いＩＣ５０値で抑制した。マウス親抗体と同様に、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７は、約１ｎＭより低く算出されたＩＣ５０でカニクイザルＰＤ−１へのリガンド結合の抑制を示した。
【０１８５】
【表５】
ＳＥＢへのヒトＴ細胞の応答はヒト化ｍＡｂによって増強される。
【０１８６】
ヒト化抗ＰＤ−１抗体をＴ細胞活性を増強させるそれらの能力についてｉｎ ｖｉｔｒｏで、実施例３に記載のとおり健常人ボランティア由来の血液細胞を使用して検査した。上清を培養４日後に回収し、産生されたＩＬ−２の量をＥＬＩＳＡを使用して定量した。ヒト化ＰＤ−１抗体は、ＳＥＢによって刺激されたＩＬ−２産生を増大させる能力を示した（図７）。追加的にヒト化ＰＤ−１抗体は、実施例３において記載されたのと同様に、癌患者の血液においてＳＥＢ誘発ＩＬ−２産生を増大させた。
【０１８７】
要約として、ヒト化ｍＡｂ ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７は、ヒト化過程において全ての機能的活性を保持した。ｈ４０９Ａ１１およびｈ４０９Ａ１６ｍＡｂは、ヒト化においてマウスの親抗体ｈＰＤ１０９Ａの親和性を全て保持した。
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
プログラムされたデスレセプター１（ＰＤ−１）は、活性化されたＴ細胞およびＢ細胞において主に発現される免疫抑制受容体である。そのリガンドとの相互作用はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でＴ細胞応答を減弱させることが示されている。ＰＤ−１とそのリガンドの１つＰＤ−Ｌ１との相互作用の遮断は、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を増強することが示されており、したがって免疫系による腫瘍細胞の排除において有益でありうる。
【０００２】
ＰＤ−１（遺伝子Ｐｄｃｄ１によってコードされる）は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に関連する免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である。ＰＤ−１は、そのリガンド（ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）との結合で抗原受容体シグナル伝達を負に制御することが示されている。マウスＰＤ−１の構造は解析されており、ヒトＰＤ−Ｌ１を伴うマウスＰＤ−１の共結晶構造も同様である（非特許文献１；非特許文献２）。ＰＤ−１などのファミリーの構成員は、リガンド結合に関与するＩｇ可変型（Ｖ型）ドメインおよびシグナル伝達分子の結合に関与する細胞質側尾部を含有するＩ型膜貫通型糖タンパク質である。ＰＤ−１の細胞質側尾部は、２個のチロシンに基づくシグナル伝達モチーフ、ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ）およびＩＴＳＭ（免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ）を含有する。
【０００３】
Ｔ細胞の刺激に続いて、ＰＤ−１は、その細胞質側尾部内のＩＴＳＭモチーフにチロシンホスファターゼＳＨＰ−２を補充し、ＣＤ３Ｔ細胞シグナル伝達カスケードに関与するＣＤ３ζ、ＰＫＣθおよびＺＡＰ７０などのエフェクター分子の脱リン酸化を導く。ＰＤ−１がＴ細胞応答を下方調節する機構は、ＣＴＬＡ−４の機構と、両分子が重複した一連のシグナル伝達タンパク質を制御することから似てはいるが異なっている（非特許文献３）。Ｂｅｎｎｅｔｔおよび協力者らは、Ｔ細胞シグナル伝達のＰＤ−１介在抑制が活性化シグナルおよび抑制シグナルの両方が同じ表面にある場合にだけ有効であることを示し、ＰＤ−１シグナル伝達機構が時空間的に決定されることを示唆している（非特許文献４）。
【０００４】
ＰＤ−１は、活性化されたリンパ球（末梢ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞ならびに単球）で発現されることが示され、胸腺の発達の際にＣＤ４−ＣＤ８−（ダブルネガティブ）Ｔ細胞およびＮＫ−Ｔ細胞で発現されることも示されている。
【０００５】
ＰＤ−１に対するリガンド（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）は、恒常的に発現されているか、または、非造血性組織および種々の腫瘍型を含むさまざまな細胞型において誘導されうる。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄系細胞および樹状細胞（ＤＣ）において発現されるが、微小血管内皮細胞および、心臓、肺などの非リンパ器官などの末梢細胞においても発現される。対照的にＰＤ−Ｌ２は、マクロファージおよびＤＣにおいてのみ見いだされる。ＰＤ−１リガンドの発現様式は、末梢性寛容の維持におけるＰＤ−１の役割について示唆的であり、末梢における自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞の応答を制御するために役立ちうる。両リガンドは、ＩｇＶおよびＩｇＣ様ドメインの両方を細胞外領域に含むＩ型膜貫通型受容体である。両リガンドは、未知のシグナル伝達モチーフを有する短い細胞質側領域を含む。
【０００６】
今日までに多数の研究が、ＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてリンパ球増殖の抑制を導くことを示している。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の破壊は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を増大させ、かつ細胞周期の進行を遮断することが示されている。Ｐｄｃｄ１−／−マウスでの最初の研究は、劇的な免疫表現型を同定しなかった。しかし高齢マウスは、Ｐｄｃｄｌ欠損を戻し交配した株によって異なる自然発症の自己免疫疾患を発症した。これらは、ループス様増殖性関節炎（Ｃ５７ＢＬ／６）（非特許文献５）、胎児性心筋炎（ＢＡＬＢ／ｃ）（非特許文献６）、およびＩ型糖尿病（ＮＯＤ）（非特許文献７）を含む。総合的に、ノックアウト動物の分析は、ＰＤ−１が主に末梢性寛容の誘導および制御において機能するという理解を導いている。したがってＰＤ−１経路の治療用遮断は、免疫寛容の克服において有益でありうる。そのような選択的遮断は、癌または感染症の治療およびワクチン接種（予防用または治療用のいずれでも）の際の免疫を高めることにおいて有用でありうる。
【０００７】
癌におけるＰＤ−１の役割は、文献において立証されている。腫瘍微小環境が有効な免疫性の破壊から腫瘍細胞を保護できることが知られている。近年ＰＤ−Ｌ１は、多数のマウスおよびヒトの腫瘍において発現される（かつＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞系の大部分においてＩＦＮγによって誘導可能である）ことが示されており、免疫回避を介在すると推定される（非特許文献８；非特許文献９）。
【０００８】
ヒトにおいて（腫瘍浸潤リンパ球における）ＰＤ−１および／または（腫瘍細胞における）ＰＤ−Ｌ１の発現は、免疫組織化学によって評価された多数の原発性腫瘍の生検において見いだされている。そのような組織として、肺、肝臓、卵巣、子宮頸部、皮膚、大腸、神経膠腫、膀胱、乳房、腎臓、食道、胃、口腔扁平上皮細胞、尿路上皮細胞および膵臓の癌ならびに頭頸部の腫瘍が挙げられる（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献９；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。より著しくは、腫瘍細胞におけるＰＤ−リガンド発現は、複数の腫瘍型にわたって癌患者の予後不良と関連している（非特許文献１６で概説されている）。
【０００９】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断は、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫の増強を導くことができ、したがって免疫系による腫瘍細胞の排除において有益でありえた。この課題に取り組むために、多数の研究が実施された。侵襲性膵臓癌のマウスモデルにおいて、Ｔ．Ｎｏｍｉら（非特許文献１７）は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断の治療効果を示した。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかに対する抗体の投与は、腫瘍増殖を顕著に抑制した。抗体遮断は、腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を効果的に促進し、ＩＦＮγ、グランザイムＢおよびパーフォリンを含む抗腫瘍エフェクターの上方制御を生じた。さらに該著者らは、ＰＤ−１遮断は相乗効果をもたらすために化学療法と効果的に組み合わせうることを示した。マウスでの扁平上皮癌のモデルを使用する他の研究において、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の抗体遮断は、腫瘍増殖を顕著に抑制した（非特許文献１８）。
【００１０】
他の研究においてＰＤ−Ｌ１でのマウス肥満細胞腫系への形質移入は、腫瘍特異的ＣＴＬクローンと同時培養した場合に腫瘍細胞の溶解の減少を生じた。抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂを加えた場合に溶解は回復した（非特許文献８）。ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断は、マウス腫瘍モデルにおいて養子Ｔ細胞移入療法の効果を増大させることが示された（非特許文献９）。癌治療におけるＰＤ−１の役割についてのさらなる証拠は、ＰＤ−１ノックアウトマウスで実施された実験によってもたらされる。ＰＤ−Ｌ１発現骨髄腫細胞は、野生型動物においてのみ増殖し（腫瘍の増殖およびそれに伴う動物の死を生じる）、ＰＤ−１欠損マウスにおいては増殖しない（非特許文献８）。
【００１１】
ヒトでの研究において、非特許文献１９）は、完全なヒト抗ＰＤ−１抗体を使用するＰＤ−１遮断は、ワクチン抗原およびワクチン接種された個体由来の細胞を使用するｅｘ ｖｉｖｏ刺激アッセイにおいて腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）の絶対数を増加させることを示した。同様の研究においてＰＤ−Ｌ１の抗体遮断は、腫瘍関連抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の細胞溶解活性の増強および腫瘍特異的ＴＨ細胞によるサイトカイン産生の増大を生じた（非特許文献２０）。同著者らは、抗ＣＴＬＡ−４遮断と組み合わせて使用する場合にＰＤ−Ｌ１遮断がｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍特異的Ｔ細胞応答を増大させることを示した。
【００１２】
総合的に、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路は、癌治療用の抗体療法の開発のための十分に検証された標的である。抗ＰＤ−１抗体は、慢性ウイルス感染においても有用でありうる。急性ウイルス感染後に生成されたメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は、高度に機能的でありかつ防御免疫の重要な成分を構成する。対照的に慢性の感染は、ウイルス特異的Ｔ細胞応答の機能障害（消耗）の程度の変化によってしばしば特徴付けられ、この欠陥が宿主が持続性の病原体を排除できない主な理由である。感染の初期において機能的なエフェクターＴ細胞が最初に生成されるが、慢性的な感染の過程においてそれらは徐々に機能を失う。Ｂａｒｂｅｒら（非特許文献２１）は、ＬＣＭＶの研究室株で感染させたマウスが血液中および他の組織における高レベルのウイルスを生じる慢性感染を発症することを示した。これらのマウスは、最初強いＴ細胞応答を発現したが、Ｔ細胞の消耗により最終的には感染に屈服した。著者らは、慢性的に感染したマウスにおけるエフェクターＴ細胞の数および機能の低下は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を遮断する抗体の注射によって回復できることを見いだした。
【００１３】
近年、ＰＤ−１がＨＩＶに感染した個体由来のＴ細胞で高度に発現されていることならびに受容体発現がＴ細胞機能障害および疾患の進行と関連することが示されている（非特許文献２２；非特許文献２３）。両方の研究においてリガンドＰＤ−Ｌ１の遮断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶ特異的ＩＦＮγ産生細胞の増殖を顕著に増加させた。
【００１４】
他の研究もウイルス感染の管理におけるＰＤ−１経路の重要性に関連している。ＰＤ−１ノックアウトマウスは、野生型マウスよりも優れたアデノウイルス感染の管理を示す（非特許文献２４）。同様にＨＢＶ特異的Ｔ細胞のＨＢＶトランスジェニック動物への養子移入は、肝炎を惹起する（非特許文献２５）。これらの動物の疾患の状態は、肝臓での抗原認識および肝臓細胞によるＰＤ−１の上方制御の結果として変動する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇ， Ｘ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２０巻：３３７〜３４７頁（２００４年）
【非特許文献２】Ｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０５巻：３０１１〜６頁（２００８年）
【非特許文献３】Ｐａｒｒｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５巻：９５４３〜９５５３頁
【非特許文献４】Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｆ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０巻：７１１〜８頁（２００３年）
【非特許文献５】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０巻：１５６３〜１５７２頁（１９９８年）
【非特許文献６】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９１巻：３１９〜３２２頁（２００１年）
【非特許文献７】Ｗａｎｇ Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １０２巻：１１８２３〜１１８２８頁（２００５年）
【非特許文献８】Ｉｗａｉ Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９巻：１２２９３〜１２２９７頁（２００２年）
【非特許文献９】Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３巻：６５０１〜６５０５頁（２００３年）
【非特許文献１０】Ｂｒｏｗｎ Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０巻：１２５７〜１２６６頁（２００３年）
【非特許文献１１】Ｄｏｎｇ Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８巻：７９３〜８００頁（２００２年）
【非特許文献１２】Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３巻：７４６２〜７４６７頁（２００３年）
【非特許文献１３】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒ．Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６巻：３３８１〜５頁（２００６年）
【非特許文献１４】Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３巻：１７５７〜６１頁（２００７年）
【非特許文献１５】Ｎｏｍｉ Ｔ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３巻：２１５１〜７頁（２００７年）
【非特許文献１６】Ｏｋａｚａｋｉ ａｎｄ Ｈｏｎｊｏ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９巻：８１３〜８２４頁（２００７年）
【非特許文献１７】Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３巻：２１５１〜２１５７頁（２００７年）
【非特許文献１８】Ｔｓｕｓｈｉｍａ Ｆ．ら、Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ．４２巻：２６８〜２７４頁（２００６年）
【非特許文献１９】Ｒ．Ｍ．Ｗｏｎｇら（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９巻：１２２３〜１２３４頁（２００７年）
【非特許文献２０】Ｂｌａｎｋ Ｃ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１１９巻：３１７〜３２７頁（２００６年）
【非特許文献２１】Ｂａｒｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ４３９巻：６８２〜６８７頁（２００６年）
【非特許文献２２】Ｄａｙら、Ｎａｔｕｒｅ４４３巻：３５０〜４頁（２００６年）
【非特許文献２３】Ｔｒａｕｔｍａｎｎ Ｌ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２巻：１１９８〜２０２頁（２００６年）
【非特許文献２４】Ｉｗａｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８巻：３９〜５０頁（２００３年）
【非特許文献２５】Ｉｓｏｇａｗａ Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２３巻：５３〜６３頁（２００５年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、ヒトおよびカニクイザルのＰＤ−１に結合する単離された抗体および抗体断片を提供する。いくつかの実施形態において抗体または抗体断片は、ヒトＰＤ−Ｌ１およびヒトＰＤ−Ｌ２のヒトＰＤ−１への結合を遮断する。いくつかの実施形態において本発明のＰＤ−１抗体または抗体断片は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０から選択される１つまたは複数のＣＤＲ（抗体相補性決定領域）を含み、さらなる実施形態においては、配列番号１２、１３、１４、１８、１９および２０の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲならびに／または配列番号９、１０、１１、１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において抗体または抗体断片は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはその断片である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ａ．配列番号９、１０、１１、１５、１６および１７からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体、ならびに／または
ｂ．配列番号１２、１３、１４、１８、１９および２０からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体
を含む、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片。
（項目２）
ａ．配列番号９、１０および１１の軽鎖ＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体、ならびに配列番号１２、１３および１４の重鎖ＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体、または
ｂ．配列番号１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体、ならびに配列番号１８、１９および２０の重鎖ＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体
を含む、項目１に記載の抗体または抗体断片。
（項目３）
ａ．ｉ．配列番号５もしくはその変異体、
ｉｉ．配列番号７もしくはその変異体、
ｉｉｉ．配列番号３０のアミノ酸残基２０から１３９もしくはその変異体、および
ｉｖ．配列番号３０のアミノ酸残基２０から１３９に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含み、
ｂ．ｉ．配列番号６もしくはその変異体、
ｉｉ．配列番号８もしくはその変異体、
ｉｉｉ．配列番号３２のアミノ酸残基２０から１３０もしくはその変異体、
ｉｖ．配列番号３３のアミノ酸残基２０から１３０もしくはその変異体、
ｖ．配列番号３４のアミノ酸残基２０から１３０もしくはその変異体、および
ｖｉ．配列番号３２、３３もしくは３４のアミノ酸残基２０から１３０に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
をさらに含む、項目２に記載の抗体または抗体断片。
（項目４）
ａ．ｉ．配列番号３１のアミノ酸残基２０から４６６もしくはその変異体、および
ｉｉ．配列番号３５のアミノ酸残基２０から４６９もしくはその変異体
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、
ならびに
ｂ．ｉ．配列番号３６のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体、
ｉｉ．配列番号３７のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体、および
ｉｉｉ．配列番号３８のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、項目１に記載の抗体。
（項目５）
（１つまたは複数の）任意の前記変異体が３個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含みうる、項目１から４のいずれかに記載の抗体または抗体断片。
（項目６）
ａ．ヒト重鎖定常領域、もしくは２０個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含むその変異体、および／または
ｂ．ヒト軽鎖定常領域、もしくは２０個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含むその変異体
をさらに含む、項目１から３のいずれかに記載の抗体。
（項目７）
前記ヒト重鎖定常領域がγ４もしくはγ１ヒト重鎖定常領域、または２０個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含むその変異体を含む、項目６に記載の抗体。
（項目８）
ａ．約１００ｐＭのＫＤまたはそれより低いＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｂ．約３０ｐＭのＫＤまたはそれより低いＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｃ．配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｄ．配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｅ．約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｆ．約１×１０６ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｇ．約２×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｈ．約２．７×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｉ．約３×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｊ．約１ｎＭのＩＣ５０またはそれより低いＩＣ５０でヒトＰＤ−Ｌ１またはヒトＰＤ−Ｌ２のヒトＰＤ−１への結合を遮断する、
項目１から７のいずれかに記載の抗体または抗体断片。
（項目９）
項目１から４に記載のいずれかの抗体とＰＤ−１上の結合エピトープについて競合し、以下の特徴：
ａ．約１００ｐＭのＫＤまたはそれより低いＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｂ．約３０ｐＭのＫＤまたはそれより低いＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｃ．配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｄ．配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する、
ｅ．約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｆ．約１×１０６ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｇ．約２×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｈ．約２．７×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、
ｉ．約３×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する、または
ｊ．約１ｎＭのＩＣ５０またはそれより低いＩＣ５０でヒトＰＤ−Ｌ１またはヒトＰＤ−Ｌ２のヒトＰＤ−１への結合を遮断する、
のうち１つを有する
単離された抗体または抗体断片。
（項目１０）
ａ．キメラ抗体もしくはその断片、
ｂ．ヒト抗体もしくはその断片、
ｃ．ヒト化抗体もしくはその断片、または
ｄ．Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびダイアボディーからなる群から選択される抗体断片
である、項目１から９のいずれかに記載の抗体または抗体断片。
（項目１１）
Ｔ細胞の活性化を増大させる、項目１から１０のいずれかに記載の抗体または抗体断片。
（項目１２）
項目１から７のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
（項目１３）
項目１２に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目１４）
項目１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目１５）
ａ．前記核酸配列が発現される条件下で、培地中で項目１４に記載の宿主細胞を培養し、それにより前記軽鎖および前記重鎖可変領域を含むポリペプチドを産生するステップと、
ｂ．該宿主細胞または該培地から該ポリペプチドを回収するステップと
を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を産生する方法。
（項目１６）
薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて、項目１から１１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を含む組成物。
（項目１７）
免疫細胞を項目１から１１に記載の抗体のいずれか１つと接触させるステップを含む、該免疫細胞の活性を増大させる方法。
（項目１８）
治療有効量の項目１から１１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、免疫細胞の活性を増大させる方法。
（項目１９）
ａ．癌の治療のため、
ｂ．感染症もしくは感染性疾患の治療のため、または
ｃ．ワクチンアジュバントとして
使用される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記対象由来の試料においてｅｘ ｖｉｖｏでＴ細胞活性化を測定するステップをさらに含み、Ｔ細胞活性における増大が前記治療を継続すべきであることを示すか、または前記治療が成功する可能性を予測する、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
Ｔ細胞活性における前記増大が
ａ．ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびＩＬ−１３からなる群から選択される１つまたは複数のサイトカインのＳＥＢ誘発産生を測定するステップ、または
ｂ．ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびＩＬ−１３からなる群から選択されるサイトカインのＴＴ誘発産生を測定するステップ
によって決定される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
ａ．免疫細胞活性化を増大させるための、
ｂ．癌を治療するための、または
ｃ．感染症もしくは感染性疾患を治療するための
薬剤の調製のための、項目１から１１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片の使用。
（項目２３）
診断的使用のための、項目１から１１のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片の使用。
【００１７】
一実施形態において本発明は、配列番号９、１０および１１のＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体を含む軽鎖、ならびに／または配列番号１２、１３および１４のＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体を含む重鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００１８】
他の実施形態において本発明は、配列番号１５、１６および１７のＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体を含む軽鎖、ならびに／または配列番号１８、１９および２０のＣＤＲ、もしくは任意の該配列の変異体を含む重鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００１９】
一実施形態において本発明は、配列番号５の重鎖可変領域もしくはその変異体、および／または配列番号６もしくはその変異体を含む軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片を含む。
【００２０】
一実施形態において本発明は、配列番号７の重鎖可変領域もしくはその変異体、および／または配列番号８もしくはその変異体を含む軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片を提供する。
【００２１】
一実施形態において本発明は、配列番号３０のアミノ酸残基２０から１３９もしくはその変異体を含む重鎖可変領域、および／または配列番号３２のアミノ酸残基２０から１３０もしくはその変異体を含む軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片を含む。
【００２２】
一実施形態において本発明は、配列番号３０のアミノ酸残基２０から１３９もしくはその変異体を含む重鎖可変領域、および／または配列番号３３のアミノ酸残基２０から１３０もしくはその変異体を含む軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片を含む。
【００２３】
一実施形態において本発明は、配列番号３０のアミノ酸残基２０から１３９もしくはその変異体を含む重鎖可変領域、および／または配列番号３４のアミノ酸残基２０から１３０もしくはその変異体を含む軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片を含む。
【００２４】
一実施形態において本発明は、配列番号３０のアミノ酸残基２０から１３９に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号３２、３３または３４のアミノ酸残基２０から１３０に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片を含む。
【００２５】
一実施形態において本発明は、配列番号３１のアミノ酸残基２０から４６６もしくはその変異体を含む重鎖、および／または配列番号３６のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体を含む軽鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００２６】
一実施形態において本発明は、配列番号３１のアミノ酸残基２０から４６６もしくはその変異体を含む重鎖、および／または配列番号３７のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体を含む軽鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００２７】
一実施形態において本発明は、配列番号３１のアミノ酸残基２０から４６６もしくはその変異体を含む重鎖、および／または配列番号３８のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体を含む軽鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００２８】
一実施形態において本発明は、配列番号３５のアミノ酸残基２０から４６９もしくはその変異体を含む重鎖、および／または配列番号３６のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体を含む軽鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００２９】
一実施形態において本発明は、配列番号３５のアミノ酸残基２０から４６９もしくはその変異体を含む重鎖、および／または配列番号３７のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体を含む軽鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００３０】
一実施形態において本発明は、配列番号３５のアミノ酸残基２０から４６９もしくはその変異体を含む重鎖、および／または配列番号３８のアミノ酸残基２０から２３７もしくはその変異体を含む軽鎖を含み、ヒトＰＤ−１に結合する単離された抗体または抗体断片を提供する。
【００３１】
任意の上記実施形態において本発明の抗体または抗体断片の変異体は、１個、２個または３個の保存的に改変されたアミノ酸置換を含みうる。
【００３２】
任意の上記実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、ヒト重鎖定常領域もしくは２０個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含むその変異体、および／またはヒト軽鎖定常領域もしくは２０個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含むその変異体、を含みうる。いくつかの実施形態において変異体は、１０個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含みうる。いくつかの実施形態において変異体は、５個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含みうる。いくつかの実施形態において変異体は、３個までの保存的に改変されたアミノ酸置換を含みうる。任意の上記実施形態においてヒト重鎖定常領域またはその変異体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものでありうる。
【００３３】
任意の上に記載の実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合できる。他の実施形態において抗体または抗体断片は、約３０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合できる。他の実施形態において抗体または抗体断片は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合できる。他の実施形態において抗体または抗体断片は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合できる。
【００３４】
任意の上に記載の実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。一実施形態において抗体または抗体断片は、約１×１０６ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。
【００３５】
任意の上に記載の実施形態において抗体または抗体断片は、約２×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。一実施形態において抗体または抗体断片は、約２．７×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。一実施形態において抗体または抗体断片は、約３×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。
【００３６】
ＫＤ、ｋａｓｓｏｃおよびｋｄｉｓｓｏｃ値は、任意の利用可能な方法を使用して測定されうる。好ましい実施形態において解離（ｄｉｓｓａｏｃｉａｔｉｏｎ）定数は、生物光学干渉法（ｂｉｏ−ｌｉｇｈｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（例えば実施例２で記載されるＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ法）を使用して測定される。他の好ましい実施形態において解離（ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）定数は、表面プラズモン共鳴（例えばＢｉａｃｏｒｅ）またはＫｉｎｅｘａを使用して測定されうる。
【００３７】
さらに任意の上に記載の実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、ヒトＰＤ−Ｌ１またはヒトＰＤ−Ｌ２のヒトＰＤ−１への結合を約１ｎＭ以下のＩＣ５０で遮断できる。リガンド結合の遮断は、例えば本明細書の（ｈｅｒｅｕｂ）実施例に記載のＦＡＣＳ法またはＦＭＡＴ法などの当技術分野において公知の任意の方法を使用して測定することができ、かつＩＣ５０を算出されうる。
【００３８】
本発明は、ヒトＰＤ−１上の結合エピトープに対して上に記載の任意の抗体と競合し、かつヒトＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２のヒトＰＤ−１への結合を約１ｎＭ以下のＩＣ５０で遮断する抗体または抗体断片も含む。
【００３９】
本発明は、ヒトＰＤ−１上の結合エピトープについて上に記載の任意の抗体と競合し、かつ約１００ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する抗体または抗体断片も含む。一実施形態において抗体または抗体断片は、約３０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する。
【００４０】
本発明は、ヒトＰＤ−１上の結合エピトープについて上に記載の任意の抗体と競合し、かつ配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する抗体または抗体断片も含む。
【００４１】
本発明は、ヒトＰＤ−１上の結合エピトープについて上に記載の任意の抗体と競合し、かつ配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同程度のＫＤでヒトＰＤ−１に結合する抗体または抗体断片も含む。
【００４２】
本発明は、ヒトＰＤ−１上の結合エピトープについて上に記載の任意の抗体と競合し、かつ約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する抗体または抗体断片も含む。一実施形態において抗体または抗体断片は、約１×１０６ １／Ｍ・ｓまたはそれより速いｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。
【００４３】
本発明は、ヒトＰＤ−１上の結合エピトープについて上に記載の任意の抗体と競合し、かつ約２×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合する抗体または抗体断片も含む。一実施形態において抗体または抗体断片は、約２．７×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。一実施形態において抗体または抗体断片は、約３×１０−５ １／ｓまたはそれより遅いｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ−１に結合できる。
【００４４】
いくつかの実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、キメラ抗体またはキメラ抗体の断片である。
【００４５】
いくつかの実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、ヒト抗体またはヒト抗体の断片である。
【００４６】
いくつかの実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、ヒト化抗体またはヒト化抗体の断片である。
【００４７】
いくつかの実施形態において本発明の抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはＦ（ａｂ’）２抗体断片である。
【００４８】
いくつかの実施形態において本発明の抗体断片は、ダイアボディーである。
【００４９】
本発明は、ヒトＰＤ−１に結合する上に記載の抗体または抗体断片のいずれか１つを含む二重特異性抗体も含む。
【００５０】
いくつかの実施形態において本発明の単離された抗ＰＤ−１抗体および抗体断片は、当業者に公知の典型的な手段によって測定されるＴ細胞活性化（免疫細胞増殖の増大、サイトカイン分泌の増大またはＣＤ２５および／もしくはＣＤ６９などの活性化マーカーの発現を非限定的に含む）を増大させる。
【００５１】
上に記載の任意の実施形態において本発明の抗体または抗体断片は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのブドウ球菌エンテロトキシンＢまたは破傷風トキソイドでの刺激後に免疫応答を増強できる。増大した免疫活性化は、例えば免疫細胞（Ｔ細胞など）の増殖または免疫細胞によるサイトカイン産生（例えばＴ細胞によるＩＮＦγもしくはＩＬ−２の産生）を定量することである当業者に公知の方法を使用して決定できる。
【００５２】
本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体および抗体断片をコードする核酸も含む。配列番号５から２０および３０〜３８において開示のアミノ酸配列（リーダー配列を含むまたは含まない）のいずれか１つをコードする核酸は、本発明に含まれる。配列番号１から４および２１から２９を含む核酸（リーダー配列をコードする核酸を含むまたは含まない）も、本発明に含まれる。
【００５３】
本発明は、本発明の抗体または抗体断片をコードする核酸を含む細胞および発現ベクターも含む。さらに本発明は、（ａ）核酸配列が発現される条件下で、培地中で本発明の抗体または抗体断片をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、それにより軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを産生するステップと、（ｂ）宿主細胞または培地からポリペプチドを回収するステップとを含む、本発明の抗体または抗体断片を産生する方法を含む。
【００５４】
本発明は、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて、本発明の抗体または抗体断片を含む組成物も含む。
【００５５】
本発明は、本発明の抗体または抗体断片の治療有効量をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、免疫細胞の活性を増大させる方法も含む。一実施形態においてこの方法は、癌を治療するために使用されうる。他の実施形態においてこの方法は、感染症または感染性疾患を治療するために使用されうる。さらに他の実施形態においてこの方法は、ワクチンアジュバントとして使用されうる。いくつかの実施形態においてこの方法は、第２の治療用薬物または治療様式をさらに投与するステップを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において本発明は、免疫細胞の活性を増大させる方法であって、治療有効量の本発明の抗体または抗体断片を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、対象由来の試料におけるＴ細胞活性化をｅｘ ｖｉｖｏで測定するステップをさらに含み、Ｔ細胞活性における増大が治療を継続すべきであることを示す方法を含む。他の実施形態において本発明は、免疫細胞の活性を増大させる方法であって、治療有効量の本発明の抗体または抗体断片を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、対象由来の試料におけるＴ細胞活性化をｅｘ ｖｉｖｏで測定するステップをさらに含み、Ｔ細胞活性化における増大が治療が成功する可能性を予測する方法を含む。一実施形態においてＴ細胞活性における増大は、（ｉ）ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびＩＬ−１３からなる群から選択される１つまたは複数のサイトカインのＳＥＢ誘発産生を測定するステップ、または（ｉｉ）ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびＩＬ−１３からなる群から選択されるサイトカインのＴＴ誘発産生を測定するステップによって決定される。
【００５７】
本発明は、免疫応答を増大させる薬物の調製のための本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗体断片の使用も含む。
【００５８】
本発明は、癌を治療するための薬物の調製のための本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗体断片の使用も含む。
【００５９】
本発明は、ワクチンアジュバントとしての本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗体断片の使用も含む。
【００６０】
本発明は、細菌性毒素または放射性毒素などの治療剤に連結した本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗体断片を含む免疫複合体も含む。細胞毒作用物質の非限定的な例として、タキソール、サイトカラシンＢ、マイトマイシン、エトポシドおよびビンクリスチンまたは他の代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質および抗有糸分裂剤が挙げられる。
【００６１】
本発明は、免疫細胞と本発明の抗体または抗体断片のいずれか１つとを接触させるステップを含む、免疫細胞の活性を増大させるまたは免疫細胞の下方調節を低減する方法も含む。この方法は、癌もしくは感染性疾患（慢性ウイルス性感染症など）を治療するために使用されることができ、または予防用もしくは治療用ワクチンのためのアジュバントとして使用されうる。
【００６２】
本発明は、免疫細胞を抗原および抗ＰＤ−１抗体または抗体断片と、抗原への免疫応答が増大されるかまたは増強されるように接触させるステップを含む抗原への免疫応答を増大させる方法も含む。この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ（対象中で）またはｅｘ ｖｉｖｏで実施されうる。
【００６３】
いくつかの実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、第２の治療薬または治療様式と組み合わされうる。一実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、組換えサイトカインまたは分泌された免疫性因子の適用を伴う癌治療と組み合わされうる。組合せの非限定的な例として、抗ＰＤ−１抗体と組換えＩＬ−２または組換えＩＦＮα２とを黒色腫または腎細胞癌の治療のために組み合わせることが挙げられる。組換えＩＬ−２は、癌患者においてＴ細胞の増殖を増強する。組換えＩＦＮα２は、癌細胞の増殖を抑制するが、治療を受ける患者において癌細胞、抗原提示細胞および他の体細胞上のＰＤ−１に対する抑制型リガンドの発現も増大させる。抗ＰＤ−１は、癌または感染性疾患の治療のために有用であると考えられうる他のサイトカインと組み合わされうる。
【００６４】
いくつかの実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、癌または感染性疾患を予防または治療するためにワクチンと組み合わされうる。非限定的な例として抗ＰＤ−１は、治療される癌または感染症に関連する１つもしくは複数の抗原を含有するタンパク質、ペプチドもしくはＤＮＡのワクチンと、またはそのような抗原でパルスした樹状細胞を含むワクチンと組み合わされうる。他の実施形態は、（弱毒化）癌細胞ワクチンまたはまるごとのウイルスワクチンを伴う抗ＰＤ−１の使用を含む。一実施形態は、ＧＭ−ＣＳＦを分泌するように工学的に操作されたまるごとの細胞の癌ワクチンと抗ＰＤ−１療法との組合せを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、癌または感染性疾患のケアの標準法であると考えられる治療と組み合わされうる。そのような組合せについての論理的根拠は、抗ＰＤ−１によって同時に増大する免疫活性化がケア治療の標準法への初期の臨床反応を誘発または促進し、持続的臨床反応および疾患の長期免疫管理を誘導することである。
【００６６】
一実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片での治療は、化学療法と組み合わされうる。細胞傷害性薬物を使用する化学療法は、癌細胞死を生じ、それにより腫瘍抗原の放出が増大する。腫瘍抗原の可用性のそのような増大は、抗ＰＤ−１治療との相乗作用を生じうる。非限定的な例は、黒色腫の治療のためのデカルバジンもしくはテモゾロミドまたは膵臓癌のためのゲムシタビンの使用によって提供される。
【００６７】
一実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片での治療は、放射線療法と組み合わされうる。放射線療法は、癌細胞死を生じ、免疫細胞の提示および活性化のための腫瘍抗原の可用性が増大する。
【００６８】
別の実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片での治療は、対象から癌細胞を除く手術と組み合わされうる。
【００６９】
他の実施形態において抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗体断片は、ホルモン剥奪もしくは血管新生の抑制のために使用される標的薬剤、または腫瘍細胞において活性な標的タンパク質を含み、ＰＤ−１遮断と相乗効果を生じうる療法と組み合わされることができ、全ては、腫瘍細胞死および免疫刺激腫瘍抗原の可用性の増強を生じる。抗ＰＤ−１抗体または抗体断片との組合せにおいて、増大したＴ細胞活性化は、癌の持続的な免疫管理を生じうる。
【００７０】
いくつかの実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、癌または感染性疾患の治療のために有用である他の治療用抗体と組み合わされうる。非限定的な例は、抗ＰＤ−１抗体とＨｅｒ２／ｎｅｕを標的とするまたはＥＧＦ受容体を標的とする抗体との組合せによって提供される。他の非限定的な例において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、ＶＥＧＦまたはその受容体を標的とする治療と組み合わされる。他の実施形態において抗ＰＤ−１抗体または抗体断片は、抗ＣＴＬＡ−４と組み合わされる。さらに他の非限定的な例において抗ＰＤ−１は、ＲＳＶを標的とする抗体と組み合わされる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ハイブリドーマ上清由来の固定化抗体は、固定化した抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８で刺激したジャーカットＥ６．２．１１細胞によるＩＬ−２分泌を低減できることを示す実験結果を示すグラフである。
【図２】ヒトＰＤ−１に対する抗体がＰＤ−１に結合することを示す実験結果を示すグラフである。図２Ａは、タンパク質ＥＬＩＳＡにおける、精製ＰＤ−１／Ｆｃへの抗ＰＤ−１抗体の用量依存的結合を示すグラフである。図２Ｂは、ＣＥＬＩＳＡにおける、ｈＰＤ−１を形質移入したＣＨＯ細胞の表面で発現されるＰＤ−１への抗ＰＤ−１抗体の用量依存的結合を示すグラフである。
【図３】ＰＤ−１に対する抗体がヒトＰＤ−１を形質移入したＣＨＯ細胞へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合について競合することを示すＦＭＡＴ実験の結果を示すグラフである。図３Ａは、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９ならびに少ない程度でのＪ１１６によるＰＤ−Ｌ１の結合の用量依存的な抑制を示すグラフである。図３Ｂは、ＰＤ−Ｌ２の用量依存的な抑制を示すグラフである。
【図４】健常ドナー血液細胞によるＳＥＢ刺激ＩＬ−２産生は、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＣＴＬＡ−４抗体の存在下で増強されることを示す実験結果を示す棒グラフである。棒は、ドナー間のＩＬ−２における平均倍数増加（±ＳＥＭ）を示す。各棒内の数値は、示したドナー数を示す。マウス（ｍ）ＩｇＧ１は、抗ＰＤ−１．０８Ａ（０８Ａ）、抗ＰＤ−１．０９Ａ（０９Ａ）および抗ＰＤ−Ｌ１についてのアイソタイプ対照である。マウス（ｍ）ＩｇＧ２は、抗ＣＴＬＡ−４についてのアイソタイプ対照である。各ＩＬ−２値を倍数変化を決定するためにそれ自体の対照と比較する（ＩＬ−２の倍数変化４は、ＳＥＢ単独の場合と比較した場合のＩＬ−２産生における４００％増大を意味する）。なし＝ＳＥＢ単独
【図５】リコール抗原破傷風トキソイドで刺激された場合に抗ＰＤ−１抗体がＴ細胞増殖およびサイトカイン分泌（ＩＬ−２およびＩＦＮγ）を、促進することを示す実験結果を示すグラフである。図５は、濃度依存的ＩＦＮγ分泌を示す。
【図６】生物光学干渉法によって測定した抗ＰＤ−１抗体についてのｋａｓｓｏｃおよびｋｄｉｓｓｏｃ速度を示すグラフである。斜線は、理論的に算出されるＫＤ値を示す。抗体は、右側にＫＤによる昇順で列挙される。
【図７】健常ドナー血液細胞によるＳＥＢ刺激ＩＬ−２産生は、２５μｇ／ｍｌマウス（０９Ａ）、またはヒト化抗ＰＤ−１抗体（ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７）の存在下で増大されることを示す実験結果を示す棒グラフである。棒は、ドナー３名の間のＩＬ−２における平均倍数増加（±ＳＥＭ）を示す。マウス（ｍ）ＩｇＧ１は、抗ＰＤ−１．０９Ａ（０９Ａ）についてのアイソタイプ対照である。ヒト（ｈ）ＩｇＧ４は、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７抗体についてのアイソタイプ対照である。各ＩＬ−２値を倍数変化を決定するためにそれ自体の対照と比較する。なし＝ＳＥＢ単独
【発明を実施するための形態】
【００７２】
（発明の詳細な説明）
略語および定義
本発明の詳細な記載および実施例を通じて以下の略語が使用される。
【００７３】
ｈＰＤ−１．０８Ａ マウスモノクローナル抗ｈＰＤ−１抗体
ｈＰＤ−１．０９Ａ マウスモノクローナル抗ｈＰＤ−１抗体
０８Ａ−ＶＨ ｈＰＤ−１．０８Ａハイブリドーマから単離されたＶＨ
０８Ａ−ＶＫ ｈＰＤ−１．０８Ａハイブリドーマから単離されたＶＫ
０９Ａ−ＶＨ ｈＰＤ−１．０９Ａハイブリドーマから単離されたＶＨ
０９Ａ−ＶＫ ｈＰＤ−１．０９Ａハイブリドーマから単離されたＶＫ
ｃ１０９Ａ ｈＰＤ−１．０９Ａ抗体のキメラＩｇＧ１バージョン
ｃ１０９Ａ−ＶＨ ｈＩｇＧ１定常領域に融合しているマウス０９Ａ−ＶＨからなるキメラ重鎖
ｃ１０９Ａ−ＶＫ ヒトκ定常領域に融合しているマウス０９Ａ−ＶＫからなるキメラ軽鎖
１０９Ａ−Ｈ 復帰突然変異を含まないヒト化ＩｇＧ１ ０９Ａ重鎖配列
４０９Ａ−Ｈ ＦＷＲ復帰突然変異を含まないヒト化ＩｇＧ４−０９Ａ重鎖配列
Ｋ０９Ａ−Ｌ−１１ 長さ１１ＡＡのＣＤＲ１を独自に有するフレームワークを含むヒト化０９Ａ−κ配列
Ｋ０９Ａ−Ｌ−１６ 長さ１６ＡＡのＣＤＲ１を独自に有するフレームワークを含むヒト化０９Ａ−κ配列
Ｋ０９Ａ−Ｌ−１７ 長さ１７ＡＡのＣＤＲ１を独自に有するフレームワークを含むヒト化０９Ａ−κ配列
ｈ４０９Ａ１１ ４０９Ａ−Ｈの配列を含む重鎖およびＫ０９Ａ−Ｌ−１１の配列を含む軽鎖を含む０９Ａ抗体のヒト化ＩｇＧ４バージョン
ｈ４０９Ａ１６ ４０９Ａ−Ｈの配列を含む重鎖およびＫ０９Ａ−Ｌ−１６の配列を含む軽鎖を含む０９Ａ抗体のヒト化ＩｇＧ４バージョン
ｈ４０９Ａ１７ ４０９Ａ−Ｈの配列を含む重鎖およびＫ０９Ａ−Ｌ−１７の配列を含む軽鎖を含む０９Ａ抗体のヒト化ＩｇＧ４バージョン
ｈＰＤ−１ ヒトＰＤ−１タンパク質
ＣＤＲ 免疫グロブリン可変領域中の相補性決定領域、Ｋａｂａｔ番号付け方式を使用して定義される
ＥＣ５０ ５０％有効性または結合を生じる濃度
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着検定法
ＦＷ 抗体フレームワーク領域、ＣＤＲ領域を除く免疫グロブリン可変領域
ＨＲＰ 西洋わさびペルオキシダーゼ
ＩＬ−２ インターロイキン２
ＩＦＮ インターフェロン
ＩＣ５０ ５０％抑制を生じる濃度
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ
Ｋａｂａｔ Ｅｌｖｉｎ Ａ Ｋａｂａｔによって開発された免疫グロブリン配列比較（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）および番号付け方式
ｍＡｂ モノクローナル抗体
ＭＥＳ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＮＨＳ 正常ヒト血清
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＡＭ ヒツジ抗マウス（ＩｇＧ）ポリクローナル抗体
Ｖ領域 異なる抗体間の配列において可変であるＩｇＧ鎖のセグメント。軽鎖におけるＫａｂａｔ残基１０９および重鎖における１１３に及ぶ。
【００７４】
ＶＨ 免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＫ 免疫グロブリンκ軽鎖可変領域。
【００７５】
「抗体」は、リガンドのその受容体への結合の抑制または受容体のリガンド誘発シグナル伝達の抑制によるなどの所望の生物学的活性を示す任意の形態の抗体を指す。したがって「抗体」は、最も広義で使用され、具体的には非限定的にモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体含む）、ポリクローナル抗体および多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）に及ぶ。
【００７６】
「抗体断片」および「抗体結合断片」は、典型的には親抗体の抗原結合領域または可変領域（例えば１つまたは複数のＣＤＲ）の少なくとも一部を含む抗原結合断片および抗体の類似物を意味する。抗体断片は、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持する。典型的には抗体断片は、活性をモルベースで表す場合に親の結合活性の少なくとも１０％の結合活性を保持する。好ましくは抗体断片は、標的に対して親抗体の結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％またはそれを超える結合親和性を保持する。抗体断片の例として、それだけに限らないがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ダイアボディー、直鎖抗体、例えばｓｃ−Ｆｖ、ユニボディー（Ｇｅｎｍａｂ由来の技術）である単鎖抗体分子、ナノボディー（Ｄｏｍａｎｔｉｓ由来の技術）、ドメイン抗体（Ａｂｌｙｎｘ由来の技術）、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。工学的に操作された抗体変異体は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ（２００５年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３巻：１１２６〜１１３６頁において概説されている。
【００７７】
「Ｆａｂ断片」は、軽鎖１つならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域で構成されている。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【００７８】
「Ｆｃ領域」は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含有する。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって維持している。
【００７９】
「Ｆａｂ’断片」は、軽鎖１つさらに、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域も、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成するために２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されうるように含有する１つの重鎖の一部を含有する。
【００８０】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、軽鎖２つ、およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含有する重鎖２つを、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖の間に形成されるように含有する。したがってＦ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって維持される２つのＦａｂ’断片から構成される。
【００８１】
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域を欠損している。
【００８２】
「単鎖Ｆｖ抗体」（または「ｓｃＦｖ抗体」）は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片を指し、これらのドメインは、１本のポリペプチド鎖に存在する。一般にＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖについての概説として、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ （１９９４年）ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁を参照されたい。国際特許出願公開ＷＯ８８／０１６４９ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号も参照されたい。
【００８３】
「ダイアボディー」は、２個の抗原結合部位を有する小さな抗体断片である。断片は、同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）。同じ鎖上の２つのドメイン間で対合させるには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは他の鎖の相補性ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディーは、例えばＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１およびＨｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０巻：６４４４〜６４４８頁においてさらに十分に記載されている。
【００８４】
「ドメイン抗体断片」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域だけを含有する免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片である。場合により２つ以上のＶＨ領域が二価ドメイン抗体断片を作り出すようにペプチドリンカーに共有結合的に結合する。二価ドメイン抗体断片の２つのＶＨ領域は、同じまたは異なる抗原を標的にできる。
【００８５】
本発明の抗体断片は、例えば通常重鎖間ジスルフィド結合に関与するヒンジシステインの少なくとも１つが本明細書に記載のとおりに変更されている場合に、ジスルフィド結合能力が低下している重鎖の二量体化（または多量体化）を可能にする定常領域の十分な部分を含みうる。他の実施形態において抗体断片、例えばＦｃ領域を含むものは、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能および／または補体結合など（例えば抗体がＡＤＣＣ機能または補体結合に必要なグリコシル化特性を有する場合）の、無傷の抗体中に存在する場合にＦｃ領域に通常付随する少なくとも１つの生物学的機能を保持する。
【００８６】
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同である一方で、（１つまたは複数の）鎖の残部が他の種に由来するかまたは他の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同である、ならびに所望の生物学的活性を示す範囲でそのような抗体の断片である抗体を指す（例えば米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１巻：６８５１〜６８５５頁を参照されたい）。
【００８７】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最少配列を含有するキメラ抗体である。大部分についてヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および適応力を有するマウス、ラットまたはヒトではない霊長類などのヒトではない種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見いだされない残基を含みうる。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するために行われる。一般にヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、およびＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、任意選択で免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照されたい。
【００８８】
本明細書において使用される用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、配列比較によって定義される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基、例えば軽鎖可変ドメイン中の２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）残基、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）残基（Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．を参照されたい）、さらに／または構造的に定義される「超可変ループ」（ＨＶＬ）例えば軽鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）残基、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）残基由来の残基（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋｌ、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１〜９１７頁を参照されたい）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００８９】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される、かつ／または本明細書において開示するヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作られている抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。この定義は、具体的には非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を排除する。
【００９０】
「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から同定され、分離され、かつ／または回収されたものである。その天然の環境の混入成分は、抗体の診断または治療用使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含みうる。いくつかの実施形態において抗体は、（１）ローリー法によって決定されるように抗体で９５重量％を超えて、および最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用により、Ｎ末端の少なくとも１５残基もしくは内部アミノ酸配列を得るために十分な程度まで、または（３）クーマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製される。単離された抗体は、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないことになることから、組換え細胞内でインサイチュの抗体を含む。しかし通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００９１】
「単離された」核酸分子は、抗体核酸の天然の供給源においてそれが通常関連している少なくとも１つの混入核酸分子から同定および分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、それが天然で見いだされる形態もしくは状態にある以外のものである。したがって単離された核酸分子は、天然の細胞内に存在する場合の核酸分子とは区別される。しかし単離された核酸分子は、例えば核酸分子が天然の細胞においてとは異なる染色体中の位置にある場合に、通常抗体を発現する細胞内に含まれる核酸分子を含む。
【００９２】
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同質の抗体の集団から得た抗体を指す、すなわち集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる天然に生じる可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して誘導されている。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して誘導された異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して誘導されている。修飾語「モノクローナル」は、実質的に同質な抗体の集団から得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体産生を必要とするとは解釈されない。例えば本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻：４９５頁によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ３５２巻：６２４〜６２８頁およびＭａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２２巻：５８１〜５９７頁に記載された技術を使用するファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。本明細書におけるモノクローナル抗体は、詳細には「キメラ」抗体を含む。
【００９３】
本明細書において使用する用語「免疫細胞」は、造血系由来であり、かつ免疫応答において役割を演じる細胞を含む。免疫細胞として、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球および顆粒球などの骨髄系細胞が挙げられる。
【００９４】
本明細書において使用する「免疫複合体」は、細菌性毒素、細胞毒性薬物または放射性毒素などの治療用成分に結合した抗ＰＤ−１抗体またはその断片を指す。毒性成分は、当技術分野において利用可能な方法を使用して本発明の抗体に結合されうる。
【００９５】
以下の核酸多義性記号は、本明細書において使用される、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｓ＝ＧまたはＣ、およびＷ＝ＡまたはＴ。
【００９６】
本明細書において使用する配列「変異体」は、本開示の配列とは１つまたは複数のアミノ酸残基で異なるが、得られる分子の生物学的活性を保持している配列を指す。
【００９７】
「保存的に改変された変異体」または「保存的アミノ酸置換」は、当業者に公知のアミノ酸の置換を指し、得られる分子の生物学的活性を変えることなく一般に作製されうる。当業者は、一般にポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸の置換が生物学的活性を実質的に変えないことを認識する（例えばＷａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、２２４頁（４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９８７年）を参照されたい）。そのような例示的な置換は、好ましくは以下に列挙するものに従って行われる：
【００９８】
【数１】
本明細書において使用する、２つの配列間で「％同一性」は、配列が共有する同一の位置の数の関数を指し（すなわち、％相同＝同一の位置の数／位置の総数×１００）、２つの配列の最適な配列比較ために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。配列の比較および２つの配列間の同一性百分率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成されうる。例えば２つのアミノ酸配列間の同一性百分率は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４巻：１１〜１７頁（１９８８年））のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を使用して決定されうる。加えて２つのアミノ酸配列間の同一性百分率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み入れられているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８巻：４４４〜４５３頁（１９７０年））アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびにギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ重み１、２、３、４、５または６を使用して決定されうる。
【００９９】
本明細書において使用する用語「約」は、当業者によって決定される特定の値に対する許容可能な誤差範囲内の値を指し、その値がどのように測定または決定されたかに、すなわち測定系の限界にある程度依存する。例えば「約」は、当技術分野において一実施あたり１以内の標準偏差または１を超える標準偏差を意味できる。代替えとして「約」または「を本質的に含む」は、２０％までの範囲を意味できる。さらに具体的に生物学的システムまたはプロセスに関して、用語は値の一桁まで、または５倍までを意味できる。本出願書類および本特許請求の範囲において具体的な値が提供される場合、他に明記しない限り、「約」または「を本質的に含む」の意味は、具体的な値について許容可能な誤差範囲内であると推定されるべきである。
【０１００】
リガンド／受容体、抗体／抗原、または他の結合対に関する場合「特異的に」結合するは、タンパク質および／または他の生物体の不均質な集団におけるタンパク質、例えばＰＤ−１、の存在の決定要因である結合反応を示す。したがって、指定の条件下では、特定のリガンド／抗原は特定の受容体／抗体に結合し、試料中に存在する他のタンパク質には顕著な量では結合しない。
【０１０１】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生体液に適用される場合に「投与」および「処置」は、外因性の薬学的、治療用、診断用の薬剤または組成物の動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生体液への接触を指す。「投与」および「処置」は、例えば治療用、薬物動態学的、診断用、研究用および実験用の方法を指すことができる。細胞の処理は、試薬の細胞への接触、および液が細胞に接触している場合に試薬の液への接触を包含する。「投与」および「処置」は、例えば細胞の、試薬による、診断用、結合組成物による、または他の細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの処置、も意味する。
【０１０２】
「有効量」は、医学的状態の症状または兆候を改善または予防するために十分な量を包含する。有効量は、診断を可能にするまたは促進するために十分な量も意味する。具体的な対象についての有効量は、治療される状態、患者の健康全般、投与の方法経路および用量、ならびに副作用（ｓｉｄｅ ａｆｆｅｃｔ）の重症度などの要因に依存して変動できる。有効量は、顕著な副作用または毒性作用を避ける最大用量または投薬手順でありうる。効果は、診断的指標またはパラメーターの改善を少なくとも５％、通常は少なくとも１０％、より通常には少なくとも２０％、最も通常は少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％、理想的には少なくとも７０％、より理想的には少なくとも８０％、および最も理想的には少なくとも９０％生じ、１００％は正常な対象によって示される診断パラメーターと定義される（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら（１９９６年）Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１年）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ．、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫを参照されたい）。
【０１０３】
モノクローナル抗体
ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体は、被験体にＰＤ−１抗原を注射し、次いで所望の配列または機能特性を有する抗体を発現しているハイブリドーマを単離する当技術分野における知識および技術によって作製できる。
【０１０４】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手段を使用して（例えばモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、かつ配列決定される。ハイブリドーマは、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されるとＤＮＡは、発現ベクターに入ることができ、次いで組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得るために、他に免疫グロブリンタンパク質を産生しないＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞に形質移入される。抗体の組換え産生は、より詳細に以下に記載される。
【０１０５】
さらなる実施形態において抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁に記載されている技術を使用して生成される抗体ファージライブラリーから単離されうる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁およびＭａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２巻：５８１〜５９７頁は、ファージライブラリーを使用するマウスおよびヒトの抗体の単離をそれぞれ記載している。次の刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁）、ならび非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ ｖｉｖｏ組換えを記載している（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９３年、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１巻：２２６５〜２２６６頁）。したがってこれらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替法である。
【０１０６】
キメラ抗体
抗体ＤＮＡは、例えばヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を相同なマウス配列の代わりに置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：６８５１頁）、または免疫グロブリンではない物質（例えばタンパク質ドメイン）のコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによっても改変されうる。典型的には、そのような免疫グロブリンではない物質は、抗体の定常ドメインの代わりをするか、または、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有する他の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作るために抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりをする。
【０１０７】
ヒト化抗体およびヒト抗体
ヒト化抗体は、ヒトではない供給源由来の１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と称され、典型的には「移入」可変ドメインから取り込まれる。ヒト化は、一般にＷｉｎｔｅｒおよび協力者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９巻：１５３４〜１５３６頁）に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することによって実施されうる。したがってそのような「ヒト化」抗体は、無傷のより実質的に少ないヒト可変ドメインがヒトではない種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際にヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および場合によりいくつかのＦＲ残基がヒトではない、例えばげっ歯類の抗体中の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１０８】
ヒト化抗体の作製において使用される軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「最適な」方法により、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリーに対して選別される。その結果げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体用のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受けいれられる（Ｓｉｍｓら、１９８７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１巻：２２９６頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１頁）。他の方法は、軽鎖および重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体の共通配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体用に使用されうる（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９巻：４２８５頁；Ｐｒｅｓｔａら、１９９３、 Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１５１巻：２６２３頁）。
【０１０９】
抗体が抗原に対する高い親和性および他の有益な生物学的特性を保持してヒト化されることは、さらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によりヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用する親配列および種々の概念的なヒト化産物の分析の工程によって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な３次元立体配置構造を例示および表示するコンピュータープログラムは、利用可能である。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析、を可能にする。このようにＦＲ残基は、（１つまたは複数の）標的抗原に対する親和性の増大などの所望の抗体の特性が達成されるように、レシピエント配列および移入配列から選択および組み合わせられることができる。一般にＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合に影響を及ぼすことに関与する。
【０１１０】
抗体のヒト化は、直接的なタンパク質工学的作業である。ほとんど全てのマウス抗体は、ＣＤＲ移植によってヒト化されることができ、抗原結合は保持される。Ｌｏ， Ｂｅｎｎｙ， Ｋ．Ｃ．、ｅｄｉｔｏｒ、ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２４８巻、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、２００４年を参照されたい。
【０１１１】
代替えとして、免疫化において、内在性の免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全なレパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えばマウス）を産生することがいまや可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスでの抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ欠損は、内在性の抗体産生の完全な抑制を生じることが記載されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの、そのような生殖系列変異マウスへの移入は、抗原曝露でのヒト抗体の産生を生じる。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０巻：２５５１頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ ３６２巻：２５５〜２５８頁；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３年、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７巻：３３頁およびＤｕｃｈｏｓａｌら、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ ３５５巻：２５８頁を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにも由来できる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１年Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７巻：３８１頁；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１年、２２２巻：５８１〜５９７頁；Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４巻：３０９頁）。
【０１１２】
抗体精製
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内、周辺質間隙に産生されるか、または培地に直接分泌されうる。抗体が細胞内に産生される場合、最初の段階として宿主細胞または溶解断片のいずれかの粒子細片は、例えば遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０巻：１６３〜１６７頁は、Ｅ．ｃｏｌｉの周辺質間隙に分泌される抗体の単離のための手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて融解する。細胞細片は、遠心分離によって除去されうる。抗体が培地に分泌される場合は、そのような発現系由来の上清を一般的には最初に、市販で入手可能なタンパク質濃縮用フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、任意の前述のステップにタンパク質分解を阻害するために含まれてよく、抗生物質は外来性の混入物の増殖を防ぐために含まれてよい。
【０１１３】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して、好ましい精製技術であるアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製されうる。プロテインＡの親和性リガンドとしての適合性は、種および抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域のアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用されうる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、１９８３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２巻：１〜１３頁）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、１９８６年、ＥＭＢＯ Ｊ ５巻：１５６７１５７５頁）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。細孔制御されたガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成されうるよりもより早い流速およびより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）レジン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が、精製のために有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術も回収される抗体に依存して利用可能である。
【０１１４】
一実施形態において糖タンパク質は、調製物からフコース含有糖タンパク質を除き、したがってフコースを含まない糖タンパク質を富化するためにレクチン基質での吸着（例えばレクチン親和性カラム）を使用して精製されうる。
【０１１５】
医薬製剤
本発明は、本発明のＰＤ−１抗体または抗体断片の医薬製剤を含む。医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、抗体およびその断片は、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８４年）を参照されたい。治療剤および診断剤の製剤は、生理学的に許容される単体、賦形剤または安定化剤と、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液または懸濁液の形態で混合することによって調製されうる（例えばＨａｒｄｍａｎら、（２００１年）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ａｖｉｓら（ｅｄｓ．）（１９９３年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０年））Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ （２０００年）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照されたい）。
【０１１６】
単独または免疫抑制剤との組合せで投与される抗体組成物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物での標準的薬学的手順によって決定されうる。毒性量と治療有効量との間の用量比が、治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との比として表されうる。これらの細胞培養アッセイおよび動物の研究から得られるデータは、ヒトでの使用のための投与量範囲を製剤化することにおいて使用されうる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性が殆どないか、または無しでのＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用する投与形態および使用する投与経路に依存してこの範囲内で変えることができる。
【０１１７】
投与の適切な経路は、筋肉内、静脈内または皮下投与などの非経口投与および経口投与を含む。医薬組成物中で使用されるまたは本発明の方法を実行するための抗体の投与は、経口摂取、吸入、局所投与または皮膚、皮下、腹腔内、非経口、動脈内または静脈内注射などのさまざまな従来の方法で実施されうる。一実施形態において本発明の結合化合物は、静脈内に投与される。他の実施形態において本発明の結合化合物は、皮下に投与される。
【０１１８】
代替えとして、例えば、しばしばデポー製剤または徐放性製剤での作用部位に直接での抗体の注射を介して、抗体を全身的様式よりは局所に投与できる。さらに標的化した薬物送達系で抗体を投与できる。
【０１１９】
抗体、サイトカインおよび小分子の適切な用量の選択における指針は、入手可能である（例えばＷａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６年）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）（１９９１年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）（１９９３年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｂａｅｒｔら、（２００３年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８巻：６０１〜６０８頁；Ｍｉｌｇｒｏｍら、（１９９９年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１巻：１９６６〜１９７３頁；Ｓｌａｍｏｎら、（２００１年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４巻：７８３〜７９２頁；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら、（２０００年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２巻：６１３〜６１９頁；Ｇｈｏｓｈら、（２００３年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８巻：２４〜３２頁；Ｌｉｐｓｋｙら、（２０００年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３巻：１５９４〜１６０２頁を参照されたい）。
【０１２０】
適切な用量の決定は、臨床医によって、例えば治療に影響するまたは治療に影響すると予測される当技術分野において公知または疑われるパラメーターまたは因子を使用して行われる。一般に、用量は、最適用量より幾分か少ない量から始め、その後任意の負の副作用と比較して所望のまたは最適な効果が達成されるまで少量ずつ増加させる。重要な診断指標は、症状、例えば炎症または産生される炎症性サイトカインのレベルの測定を含む。
【０１２１】
抗体、抗体断片およびサイトカインは、持続注入によって、または例えば１日、１週間もしくは１週間に１〜７回の間隔での投薬によって提供されうる。用量は静脈内、皮下、腹腔内、皮膚、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、脳内、脊髄内、または吸引によって提供されうる。好ましい投与プロトコールは、重大な望ましくない副作用を避ける最高の用量または投与頻度を含むものである。１週間の合計用量は、一般的には体重１ｋｇあたり少なくとも０．０５μｇ、より一般的には体重１ｋｇあたり少なくとも０．２μｇ、最も一般的には体重１ｋｇあたり少なくとも０．５μｇ、典型的には体重１ｋｇあたり少なくとも１μｇ、より典型的には体重１ｋｇあたり少なくとも１０μｇ、最も典型的には体重１ｋｇあたり少なくとも１００μｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも０．２ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも１．０ｍｇ、最も好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも２．０ｍｇ、最適には体重１ｋｇあたり少なくとも１０ｍｇ、より最適には体重１ｋｇあたり少なくとも２５ｍｇ、最も最適には体重１ｋｇあたり少なくとも５０ｍｇである（例えばＹａｎｇら、（２００３年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９巻：４２７〜４３４頁；Ｈｅｒｏｌｄら、（２００２年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６巻：１６９２〜１６９８頁；Ｌｉｕら、（１９９９年）Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７巻：４５１〜４５６頁；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら、（２０００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２巻：１３３〜１４４頁を参照されたい）。小分子治療、例えばペプチド模倣物、天然物または有機化学物質の望ましい用量は、１ｋｇあたりのモルベースでの抗体またはポリペプチドについてとほぼ同じである。
【０１２２】
本明細書において使用する「抑制」、または「治療する」または「治療」は、疾患に関連する症状の発症の遅延および／または該疾患で発症するもしくは発症が予測されるそのような症状の重症度の低減を含む。用語は、さらに発症している症状の改善、追加的症状の予防、およびそのような症状の元となる原因の改善または予防を含む。したがって用語は、有益な結果が疾患を有する脊椎動物対象に与えられていることを意味する。
【０１２３】
本明細書において使用する用語「治療有効量」または「有効量」は、単独でまたは追加的治療剤との組合せで細胞、組織、または対象に投与された場合に治療される疾患または状態を予防または改善するために有効である、抗ＰＤ−１抗体またはその断片の量を指す。治療有効量は、さらに、症状の改善、例えば関連する医学的状態の治療、治癒、予防もしくは改善またはそのような状態の治療、治癒、予防もしくは改善の速度の増加を生じるために十分な化合物の量を指す。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合、治療有効量は、成分単独でのそれを意味する。組合せに適用される場合治療有効量は、組合せで連続的にまたは同時に投与されるかにかかわらず、治療効果を生じる活性成分の組み合わされた量を指す。治療剤の有効量は、典型的には少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％および最も好ましくは少なくとも５０％症状を低減する。
【０１２４】
第２の治療剤を伴う同時投与または治療のための方法は、当技術分野において十分に周知であり、例えばＨａｒｄｍａｎら、（ｅｄｓ．）（２００１年）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０ｔｈ ｅｄ．、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｐｏｏｌｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（ｅｄｓ．）（２００１年）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ．、ＰＡ；Ｃｈａｂｎｅｒ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ（ｅｄｓ．）（２００１年）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ．、ＰＡを参照されたい。
【０１２５】
本発明の医薬組成物は、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤または代謝拮抗剤、腫瘍標的剤、免疫刺激剤または免疫調節剤または、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤もしくは他の毒性作用物質と結合した抗体を非限定的に含む他の薬物も含有できる。医薬組成物は、手術、化学療法および放射線などの他の治療様式と共にも使用されうる。
【０１２６】
典型的な獣医学的、実験的または研究用対象として、サル、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ウマおよびヒトが挙げられる。
【０１２７】
本発明の抗体および抗体断片についての治療的使用
ヒトＰＤ−１に特異的に結合する本発明の抗体または抗原結合断片は、免疫応答を増大、増強、刺激または上方制御するために使用されうる。本発明の抗体および抗体断片は、Ｔ細胞媒介の免疫応答の増大によって治療されうる障害を有する対象を治療するために特に適切である。好ましい対象は、免疫応答を増強する必要のあるヒト患者を含む。
【０１２８】
癌
本発明の抗体または抗原結合断片は、癌を治療する（すなわち腫瘍細胞の増殖または生存を抑制する）ために使用されうる。本発明の抗体を使用して増殖が抑制されうる好ましい癌は、典型的には免疫療法に応答する癌を含むが、免疫療法にこれまで関連がなかった癌も含む。治療について好ましい癌の非限定的例として、黒色腫（例えば転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば明細胞癌）、前立腺癌（例えばホルモン難治性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部の扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、神経膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫および他の腫瘍性悪性疾患が挙げられる。追加的に、本発明は、本発明の抗体を使用して増殖が抑制されうる難治性または再発性悪性疾患を含む。
【０１２９】
本発明の抗体または抗体断片は、単独であるいは、他の抗腫瘍性剤もしくは免疫原性薬剤（例えば、弱毒化された癌性細胞、腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む））、腫瘍由来抗原もしくは核酸でパルスされた樹状細胞などの抗原提示細胞、免疫刺激サイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＦＮａ２、ＧＭ−ＣＳＦ＿）および非限定的にＧＭ−ＣＳＦなどの免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子で形質移入された細胞、標準的癌治療法（例えば化学療法、放射線療法もしくは手術）、または他の抗体（非限定的にＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、他の増殖因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−ＩＢＢおよびＩＣＯＳに対する抗体を含む）との組合せで使用されうる。
【０１３０】
感染性疾患
本発明の抗体または抗体断片は、感染症および感染性疾患を予防または治療するためにも使用されうる。抗体または抗体断片は、病原体、毒素および自己抗原への免疫応答を刺激するために、単独でまたはワクチンとの組合せで使用されうる。抗体またはその抗原結合断片は、非限定的にヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルスクラスＡ、ＢおよびＣ、エプスタインバーウイルス（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）、ヒト（ｈｙｍａｎ）サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルスなどの、ヒトに感染性のウイルスへの免疫応答を刺激するために使用されうる。抗体またはその抗原結合断片は、細菌性または真菌性寄生生物および他の病原体での感染への免疫応答を刺激するために使用されうる。
【０１３１】
ワクチン接種アジュバント
本発明の抗体または抗体断片は、他の組換えタンパク質および／またはペプチド（腫瘍抗原または癌細胞など）と結合してこれらのタンパク質への免疫応答を増大させるために（すなわちワクチン接種手順において）使用されうる。
【０１３２】
例えば抗ＰＤ−１抗体およびその抗体断片は、抗ＰＤ−１抗体と目的の抗原（例えばワクチン）との同時投与によって抗原特異的免疫応答を刺激するために使用されうる。したがって他の態様において本発明は、（ｉ）抗原、および（ｉｉ）本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合成分を、対象における抗原への免疫応答が増強されるように対象に投与するステップを含む、対象において抗原への免疫応答を増強する方法を提供する。抗原は、例えば腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来抗原でありうる。そのような抗原の非限定的例として、腫瘍抗原、またはウイルス、細菌もしくは他の病原体由来の抗原が限定なく挙げられる。
【０１３３】
Ｔｈ２介在性疾患
本発明の抗ＰＤ−１抗体および抗体断片は、喘息およびアレルギーなどのＴｈ２介在性疾患を治療するためにも使用されうる。これは、本発明の抗体がＴｈ１応答の誘発を支援できるという発見に基づく。したがって本発明の抗体は、より（ｍｏｆｒｅ）バランスのとれた免疫応答を作り出すためにＴｈ２介在性疾患において使用されうる。
【０１３４】
Ｔ細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ活性化
本発明の抗体および抗原断片は、抗原特異的Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ活性化および増殖、ならびに腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を増加させるためのこれらの細胞のレシピエントへの養子移入のためにも使用されうる。これらの方法は、ＣＭＶなどの感染性物質へのＴ細胞応答を活性化させるためにも使用されうる。抗ＰＤ−１抗体の存在下でのｅｘ ｖｉｖｏ活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度および活性を増大させることが期待されうる。
【０１３５】
他の組合せ療法
既に記載されたとおり本発明の抗ＰＤ−１抗体は、１つまたは複数の他の治療剤、例えば細胞傷害性剤、放射毒性剤または免疫抑制剤と同時投与されうる。抗体は、該薬剤（免疫複合体として）と結合されうるか、または該薬剤とは別に投与されうる。後者の場合（別々の投与）、抗体は該薬剤の前、後もしくは同時に投与されることができ、または他の既知の療法と同時投与されうる。
【０１３６】
本発明の抗体および抗原結合断片は、ドナーに移植された腫瘍特異的Ｔ細胞の効果を増大させるためにも使用されうる。
【０１３７】
本発明の抗体および抗体断片の非治療用使用
非治療用使用についての抗ＰＤ−１抗体の市場は、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって販売されている、フローサイトメトリー分析、免疫組織化学およびｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイにおける使用のためのＪ１１６およびＪ１０５モノクローナル抗ｈＰＤ−１抗体、ならびにＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによって販売されている、フローサイトメトリー、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡにおける使用のためのｍａｂ１０８６、モノクローナル抗ｈＰＤ−１抗体、の商業的販売によって示されるとおり既に存在する。本発明の抗体は、Ｊ１１６、Ｊ１０５および／またはＭａｂ１０８６によって現在果たされている任意の非治療用目的のために使用されうる。
【０１３８】
本発明の抗体は、親和性精製剤として使用されうる。
【０１３９】
抗体は、例えば特定の細胞、組織または血清中のＰＤ−１の発現を検出するための、診断用アッセイにおいても有用である。診断用の適用において、抗体は典型的には（直接または間接のいずれかで）検出可能成分で標識される。以下の分類：ビオチン、蛍光色素、放射性ヌクレオチド、酵素、ヨウ素および生合成標識に一般に分けられ得る多数の標識が使用可能である。
【０１４０】
本発明の抗体は、競合的結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイならびに免疫沈降アッセイなどの任意の既知のアッセイ法において使用されうる。Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．１９８７年）
抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイのためにも使用されうる。一般に抗体は、放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ３５Ｓまたは１８Ｆなど）で標識して、免疫シンチグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）、または陽電子放出断層撮影を使用して、抗原またはそれを発現する細胞を限局化し得る。
【０１４１】
材料の寄託
ヒト化抗体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ構築物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に寄託されている。ｈ４０９Ａ−１１、ｈ４０９Ａ−１６およびｈ４０９Ａ−１７の重鎖をコードするＤＮＡを含有するプラスミドは、２００８年６月９日に寄託され、０８１４６９＿ＳＰＤ−Ｈと認定された。ｈ４０９Ａ１１の軽鎖をコードするＤＮＡを含有するプラスミドは、２００８年６月９日に寄託され、０８０１４７０＿ＳＰＤ−Ｌ−１１と認定された。ｈ４０９Ａ１６の軽鎖をコードするＤＮＡを含有するプラスミドは、２００８年６月９日に寄託され、０８０１４７１＿ＳＰＤ−Ｌ−１６と認定された。ｈ４０９Ａ１７の軽鎖をコードするＤＮＡを含有するプラスミドは、２００８年６月９日に寄託され、０８０１４７２＿ＳＰＤ−Ｌ−１７と指定された。寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の規定およびその規則（ブダペスト条約）に基づいて行われた。
【０１４２】
上に記載された明細書は、当業者に本発明を実施可能にするために十分であると考えられる。寄託された実施形態は、本発明の一態様の単一の例示の目的であり、機能的に同等である任意の培養物は本発明の範囲内であることから、本発明は、寄託された培養物によって範囲を限定されない。本明細書の材料の寄託は、本明細書に含まれる書面による説明が、その最良の様式を含む本発明の任意の態様の実施を可能にするために不適切であるとの承認を構成するものでなく、本特許請求の範囲をそれが提示する具体的な例示に限定すると解釈されるべきでもない。実際に、本明細書に示されかつ記載されるものに加えての本発明の種々の変更は、上の記載から当業者に明らかになり、かつ添付の特許請求の範囲内である。
【０１４３】
本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解される。しかしそれらは、本発明の範囲を限定するとして解釈されるべきではない。本明細書において述べる全ての文献および特許の引用は、明確に参照として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１４４】
（実施例１）
抗ＰＤ−１抗体の免疫化および選択
ｈＰＤ−１ｃＤＮＡでのマウスの免疫化
ヒトＰＤ−１（「ｈＰＤ−１」）受容体に対する抗体を生成するために、ｈＰＤ−１受容体のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって得て、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にサブクローン化した。次にＣＨＯ−Ｋ１細胞をｈＰＤ−１で安定に形質移入し、発現をフローサイトメトリーを使用してモニターした。ヒトＰＤ−１を膜上に発現するＣＨＯ−Ｋ１クローンを単離し、ＣＨＯ−ｈＰＤ１と名付けた。
【０１４５】
Ｈｅｌｉｏｓ ｇｅｎｅ ｇｕｎ（ＢｉｏＲａｄ）およびＤＮＡ ｃｏａｔｅｄ ｇｏｌｄ ｂｕｌｌｅｔｓ（ＢｉｏＲａｄ）を製造者の説明書に従って使用して遺伝子銃免疫化によってマウスを免疫化した。簡潔には１μｍの金粒子をｈＰＤ−１ ｃＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した）と、指示のある場合はマウスＦｌｔ３ＬおよびマウスＧＭ−ＣＳＦ用の市販の発現ベクター（どちらもＡｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ ＮＤから）とで２：１：１の割合でコートした。合計１μｇのプラスミドＤＮＡを５００μｇのｇｏｌｄ ｂｕｌｌｅｔをコートするために使用した。
【０１４６】
具体的には、７〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、遺伝子銃によって、２、３または４サイクルのショットを両耳に受けさせて耳で免疫化した（表Ｉを参照されたい）。マウス１匹は、５×１０６ＣＨＯ−ｈＰＤ１細胞を用いた最終追加免疫を腹腔に受けた。およそ１：１０００の抗ｈＰＤ−１力価がマウス血清において２回のＤＮＡ免疫化後に、ＣＨＯ−ｈＰＤ１対ＣＨＯ−Ｋ１親細胞を使用する細胞ＥＬＩＳＡによって検出可能であった。最終免疫化の４日後、マウスを屠殺し、赤血球除去脾臓細胞集団を以前記載されたとおり（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２巻：６９〜７７頁；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９巻：１２５〜１３４頁）調製し、−１４０℃で凍結した。
【０１４７】
【表１】
抗ＰＤ−１抗体産生Ｂ細胞の選択
抗ヒトＰＤ−１抗体産生Ｂ細胞クローンを選択するために、ｈＰＤ−１ ＤＮＡ免疫化マウス、すなわちマウス７３０、７３１および７３８（表１を参照されたい）由来の赤血球除去脾臓細胞２×１０７個をＢ細胞培養のためにプールした。脾臓細胞をＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２／１０％子ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）で３７℃、１時間、プラスチック培養フラスコ中で単球を除くためにインキュベートした。非接着細胞を１回のＣＨＯ−Ｋ１細胞でのネガティブパニング、続いてＣＨＯ−ｈＰＤ１細胞でのポジティブパニングにかけた。両方の選択手順は、２１ｃｍ２ペトリ皿またはＴ２５培養フラスコでコンフルエントに増殖した培養物において３７℃、１時間実施した（細胞培養物は使用前に合計線量２０００ＲＡＤまで照射した）。ポジティブパニング後、未結合細胞を、０．１３２％ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏおよび０．１％ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏを補充したＰＢＳでの１０回洗浄によって除去した。最後に結合性Ｂ細胞をトリプシン処理によって回収した。
【０１４８】
選択したＢ細胞を培養し、Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９巻：１２５〜１３４頁に記載のとおり不死化した。簡潔には、選択したＢ細胞を、平底９６ウェル組織培養プレート中の７．５％（ｖ／ｖ）Ｔ細胞上清および５００００照射（２５００ＲＡＤ）ＥＬ−４ Ｂ５栄養細胞と最終容量２００μＬのＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２／１０％子ウシ血清中で混合した。８日目に、上清をそれらの抗ＰＤ−１反応性についてＣＨＯ−ｈＰＤ−１細胞ＥＬＩＳＡによって以下の手順を使用して選別した。ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−ｈＰＤ−１細胞をコンフルエントまで平底９６ウェルプレートで、５０μＬ ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２、１０％ＦＢＳ中で培養した。次に５０μＬの免疫グロブリン含有上清を３７℃、１時間で加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄後、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２／１０％ＦＢＳ中の１００μＬ（１：１０００希釈）ヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）を３７℃、１時間で加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄後、固定化免疫グロブリンをＵＰＯ／ＴＭＢ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｂｏｘｔｅｌ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で可視化した。
【０１４９】
このＢ細胞培養物から、１３個のｈＰＤ−１反応性の上清が同定され、プラスチック上に固定化された場合にジャーカットＴ細胞活性化を抑制することを示し、陽性ウェルからのＢ細胞クローンを、刊行された手順（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２巻：６９〜７７頁；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９巻：１２５〜１３４頁）に従ってミニ電気融合によって不死化した。具体的には、Ｂ細胞を１０６個のＮＳ−１骨髄腫細胞と混合し、血清をＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２での洗浄によって除去した。次に細胞をプロナーゼ溶液で３分間処理し、続いて融合培地で洗浄した。電気融合を５０μＬ融合容器で、３０ｓ、２ＭＨｚ、４００Ｖ／ｃｍの交流電場に続いて、１０μｓ、３ｋＶ／ｃｍのスクウェア、高電場パルスおよび再度の３０ｓ、２ＭＨｚ、４００Ｖ／ｃｍの交流電場によって実施した。最後に融合容器の内容物をハイブリドーマ選択培地に移し、限界希釈条件下で９６ウェルプレートに蒔いた。融合の１４日後、培養物をハイブリドーマの増殖について検査し、ｈＰＤ−１への抗体反応性の存在について選別した。この手順は、ｈＰＤ−１．０５Ａ、ｈＰＤ−１．０６Ｂ、ｈＰＤ−１．０８Ａ、ｈＰＤ−１．０９ＡおよびｈＰＤ−１．１３Ａと名付ける５種の異なる抗ｈＰＤ−１ハイブリドーマをもたらし、それらの完全性を保護するために限界希釈によってサブクローン化し、抗体を産生するためにさらに培養した。これらのハイブリドーマから得た上清は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激におけるジャーカットＥ６．２．１１細胞からのＩＬ−２産生を強く抑制した（図１および以下の本文を参照されたい）。
【０１５０】
ジャーカットＥ６．１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を限界希釈によって標準的方法を使用してサブクローン化し、サブクローンをＣＤ３およびＣＤ２８の交差結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）でＩＬ−２を産生する増大した能力について検査した。高ＩＬ−２産生サブクローンを得て、次にジャーカットＥ６．２．１１と名付け、さらなるアッセイにおいて使用した。Ｃｏｓｔａｒ３３７０ ９６ウェルアッセイプレートを５μｇ／ｍＬヒツジ抗マウスＩｇ（ＳＡＭ）で一晩、４℃でコートした。過剰量のＳＡＭを除去し、プレートを１ウェルあたり２００μＬのＰＢＳ／１０％ウシ胎仔血清で１時間、室温でブロックした。ＰＢＳで３回洗浄後、ウェルを１ウェルあたり１００μＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、１０または６０ｎｇ／ｍＬ）で１時間、３７℃でコートした。ＰＢＳで３回洗浄後、１ウェルあたり５０μＬのＰＢＳ／１０％ウシ胎仔血清および１ウェルあたり５０μＬのＢ細胞またはハイブリドーマ上清を３０分間、３７℃で加えた。ＰＢＳで３回洗浄後、１ウェルあたり１２０μＬの細胞懸濁液、ジャーカットＥ６．２．１１細胞（ＤＭＥＭ／Ｆ１２／１０％ウシ胎仔血清中の、１ウェルあたり細胞２×１０５個＋０．５μｇ／ｍＬ抗ＣＤ２８（Ｓａｎｑｕｉｎ ＃Ｍ１６５０、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ＮＬ））を加えた。６時間培養後、上清をＩＬ−２産生について標準的サンドイッチＥＬＩＳＡをＰｈａｒｍｉｎｇｅｎからの抗ｈＩＬ−２捕捉抗体とビオチン化検出抗体との対および検出試薬としてストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で使用して検査した。これらの抗体の効力をＰＤ−Ｌ１と比較して決定するために、ｍＡｂの小さな群を大規模に産生させた。ｍＡｂをプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した（実施例２を参照されたい）。精製した抗体、ｈＰＤ−Ｌ１／Ｆｃ（組換えヒトＢ７−Ｈ１／Ｆｃキメラ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）またはネガティブコントロールとしてのマウスＩｇＧ１κ（Ｓｉｇｍａから）を同じ濃度でプレートに抗ＣＤ３と共に上に記載のとおりコートした。ジャーカットＥ６．２．１１細胞および抗ＣＤ２８を６時間加え、Ｔ細胞活性化を上清に産生されたＩＬ−２によって測定した。抗体のうち２つ（ｈＰＤ１．０８ＡおよびｈＰＤ１．０９Ａ）は、固定化ＰＤ−Ｌ１／Ｆｃと比較して８〜１０倍強い抑制を示した。
【０１５１】
（実施例２）
マウス抗ＰＤ−１抗体の精製および特徴付け
抗ＰＤ−１産生ハイブリドーマの安定化および抗ＰＤ−１抗体の精製
クローン細胞集団を各ハイブリドーマから、それらを複数回（＞４）の限界希釈にさらすことによって得た。次いで安定なハイブリドーマを無血清条件でＣＥＬＬｉｎｅバイオリアクター（Ｉｎｔｅｇｒａ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して６から８日間培養した。細胞を内側の容器の無血清培地中に１ｍＬあたり細胞３×１０６個の密度で１５ｍＬに蒔き、およそ１ｍＬあたり細胞４×１０７個に８日間かけて増殖させた。外側の容器を１０％までのＢＣＳ（仔ウシ血清）で補充した培地で満たした。６日目から８日目に、内側の容器の培養物を回収し、１５ｍＬ ＳＦ培地で洗浄し、ハイブリドーマと再播種した。バイオリアクター上清および洗浄液を合わせ、遠心分離で澄ませた。得られた上清を０．２２μＭ濾過膜で濾過した。抗体精製のために、上清を１：１で高塩濃度の結合緩衝液（１Ｍ グリシン／２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ９．０）に希釈し、ｍＡｂをプロテインＧ ＨｉＴｒａｐ ５ｍＬカラム（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。ＰＢＳで洗浄後、結合抗体を０．１Ｍグリシン ｐＨ＝２．７を使用して溶出し、３Ｍ Ｔｒｉｓを使用するｐＨ中和が続いた。最後に緩衝液をＰＤ−１０ゲル濾過カラム（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢＳに交換し、抗体をＵｌｔｒａ−１５遠心濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮し、分光光度法を使用して定量した。
【０１５２】
市販の抗体
以下の市販の抗体を本明細書に記載の種々の研究において使用した：抗ＰＤ−１抗体クローンＪ１１６（＃１４−９９８９）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。抗ＣＴＬＡ−４クローン１４Ｄ３（ｍＡｂ １６−１５２９）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。抗ＰＤ−１クローン１９２１０６（ｍＡｂ１０８６）はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入した（＃ｍＡｂ１０８６）。アイソタイプ対照抗体ｍＩｇＧ１、κ、クローンＭＯＰＣ２１はＳｉｇｍａから購入した（＃Ｍ９２６９）。アイソタイプ対照ｍＩｇＧ１κ（ｍＡｂ １６−４７１４）およびＩｇＧ２ａκ（ｍＡｂ １６−４７２４）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
【０１５３】
結合活性
タンパク質に基づく、および細胞に基づくＥＬＩＳＡ（「ＣＥＬＩＳＡ」）実験を見かけの結合親和性（ＥＣ５０値として報告される）を決定するために使用した。場合により、抗ＰＤ−１抗体の結合を市販の抗ＰＤ−１抗体Ｊ１１６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＭａｂ１０８６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）のそれと比較した。
【０１５４】
タンパク質ＥＬＩＳＡを、抗体のヒトＰＤ−１／Ｆｃへの相対結合の決定のために使用した。ｈＰＤ−１／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＭａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に４時間、室温（または４℃、一晩）でのインキュベーションによって固定化した。非特異的結合部位をＰＢＳＴ中の３％ＢＳＡとの１時間、室温でのインキュベーションによってブロックした。コーティング後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。抗ＰＤ−１抗体の希釈物を結合緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）中に調製し、固定化融合タンパク質と１時間、２５℃でインキュベートした。結合後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、結合緩衝液中に１／４０００で希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と１時間、２５℃でインキュベートし、再び洗浄し、ＴＭＢを使用して発色させた。ＥＬＩＳＡ結果を図２に示す。最大半量の結合での濃度を相対結合親和性の測定値として報告する（表ＩＩ）。
【０１５５】
ＣＨＯ−ｈＰＤ−１細胞への結合もＣＥＬＩＳＡによって評価した。ＣＥＬＩＳＡのためにＣＨＯ−ｈＰＤ−１細胞を８０から１００パーセントコンフルエントまで５０μＬ培地（ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’Ｓ １２Ｆ、１０％ＦＢＳ）中で培養した。次に種々の濃度の精製ｍＡｂを含有する５０μＬ培地を１時間、３７℃で加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでの３回洗浄後、１００μＬヤギ−抗マウス−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｃａｔ ＃１０３０−０５）（培地中に１：１０００希釈）を１時間、３７℃で加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでさらに３回洗浄後、固定化免疫グロブリンを比色定量のペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で可視化した。ペルオキシダーゼ活性による吸光度（４５０ｎｍ）の増加をマイクロタイタープレートリーダーで測定した。図２は、抗体ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａにおける濃度と結合との間の用量応答関係を示す。タンパク質および細胞の結合研究の結果を表ＩＩにまとめる。
【０１５６】
生物光学干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）による動態解析
抗体の結合特性をさらに特徴付けるために、それぞれをＯｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）での生物光学干渉法を使用して概要を示し、結合動態を明らかにし、および平衡結合定数を算出した。このアッセイは、ＰＤ−１Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）の、標準的アミン化学を使用するアミン反応性バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）へのカップリングによって実施された。次いで抗ＰＤ−１ｍＡｂのバイオセンサーへの結合およびバイオセンサーからの解離を種々の抗体濃度で観察した。具体的には、アミン反応性バイオセンサーを、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ＝５．５を含むウェルに５分間浸漬することによって予め湿らせた。次いでバイオセンサーを０．１Ｍ ＮＨＳ／０．４Ｍ ＥＤＣ混合物を５分間使用して活性化した。ＰＤ−１／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、バイオセンサーを０．１Ｍ ＭＥＳ中の１２μｇ／ｍＬ ＰＤ−１／Ｆｃの溶液に７．５分間浸漬することによってカップリングさせた。バイオセンサーの表面を１Ｍエタノールアミン溶液を５分間使用してクエンチさせた。バイオセンサーをＰＢＳ中に５分間、平衡化させた。抗ＰＤ−１ｍＡｂの会合を、種々の抗体濃度（ＰＢＳ中、１０〜８０ｎＭ精製抗体＞９９％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）を含むウェル中にバイオセンサーを置き、干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を３０分間モニターすることによって観察した。解離は、バイオセンサーをＰＢＳ中に移し、干渉シグナルを６０分間モニターした後に測定した。観察された会合速度および解離速度（ｋｏｂｓおよびｋｄ）を、検査した全ての濃度を含む１：１結合の包括的フィットモデルを使用して適合させ、平衡結合定数ＫＤを算出した。動態研究からの結果を表ＩＩおよび下の図６に示す。
【０１５７】
【表２】
モノクローナル抗体のうちの２つ、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａは、このアッセイを使用して検査した任意の他のｍＡｂよりも相当に強く結合し、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａについて決定されたＫＤがそれぞれ２４ｐＭおよび２２ｐＭであった。検査した他の抗ＰＤ−１抗体と比較して、親和性の増大は、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａについて測定されたより遅い解離速度および顕著に早い会合速度による。
【０１５８】
リガンド遮断
フローサイトメトリーを使用して研究したリガンド結合の遮断。ヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞を接着培養フラスコから解離させ、種々の濃度の抗ＰＤ−１抗体、および一定濃度（６００ｎｇ／ｍＬ）の未標識ｈＰＤ−Ｌ１／Ｆｃまたは組換えヒトＰＤ−Ｌ２／Ｆｃ融合タンパク質（どちらもＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから）と９６ウェルプレートで混合した。混合物を３０分間氷上で平衡化させ、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＣＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＦｃとさらに１５分間、氷上でインキュベートした。細胞を再びＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを非線形回帰を使用するＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で分析し、ＩＣ５０値を算出した。
【０１５９】
算出したＩＣ５０値を表ＩＩにまとめる。抗体０５Ａ、０６Ｂおよび１３Ａは、ｈＰＤ−１の結合について６００ｐＭから３ｎＭの間のＫＤを示すと確定された。強力な結合にもかかわらず、これらの抗体それぞれは、ｈＰＤ−１へのｈＰＤ−Ｌ１の結合の遮断についてＩＣ５０＞１０ｎＭを示した。市販で入手できる抗ＰＤ−１抗体Ｊ１１６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、結合について、この実験の範囲外に算出されたＩＣ５０（＞１００，ｎＭ）を有してＰＤ−Ｌ１と弱く競合した。対照マウスＩｇＧ１は、ＰＤ−１結合についてＰＤ−Ｌ１と競合しない。対照的に高親和性抗体ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａは、１ｎＭより低いＩＣ５０値でＰＤ−Ｌ１結合を抑制したが、ＰＤ−Ｌ２結合はＩＣ５０値１〜２ｎＭ程度で遮断した（表ＩＩ）。ＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−Ｌ１よりも２から６倍高い親和性でＰＤ−１に結合するとより早く報告された。（Ｙｏｕｎｇｎａｋ Ｐ．ら、２００３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０７巻、６７２〜６７７頁）
リガンド遮断は、蛍光比色微量容積アッセイ（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ ａｓｓａｙ）技術（ＦＭＡＴ）を使用する同質的競合アッセイおよび検出を使用して確認された。簡潔には、ＣＨＯ．ｈＰＤ−１を接着培養フラスコから解離させ、種々の濃度の抗ＰＤ−１抗体および一定濃度（６００ｎｇ／ｍＬ）のｈＰＤ−Ｌ１／ＦｃまたはｈＰＤ−Ｌ２／Ｆｃ融合タンパク質（どちらもＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから）と混合し、９６ウェルプレート中で蛍光色素（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。混合物を９０分間、３７℃で平衡化させ、ＡＢ８２００Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して読み取った。データは非線形回帰を使用するＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で分析し、ＩＣ５０値を算出した。図３は、リガンド遮断の程度は抗体濃度によって決定されることを示す用量応答実験の結果を示す。ｈＰＤ−Ｌ１／ＦｃおよびｈＰＤ−Ｌ２／Ｆｃの両方のＣＨＯ−ｈＰＤ−１細胞への結合は、ｈＰＤ−１．０８Ａ、ｈＰＤ−１．０９Ａおよび（より少ない程度で）Ｊ１１６によって用量依存的な様式で完全に抑制されうる。算出されたＩＣ５０データを表ＩＩにまとめる。フローサイトメトリーを使用して得られた結果を確認して、高親和性抗体ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａは、ＰＤ−Ｌ１結合を１ｎＭより低いＩＣ５０値で抑制した。
【０１６０】
種の交差反応
抗体の種の交差反応性を評価するために、マウスおよびｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ ＰＤ−１受容体をＰＣＲによってクローン化し、安定に形質移入したＣＨＯ−Ｋ１細胞を作製した。抗体をカニクイザル受容体への結合についてＣＥＬＩＳＡを使用して検査した。市販の抗体Ｊ１１６、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａは、ヒトおよびカニクイザルＰＤ−１に同等な親和性で結合し、ｈＰＤ−Ｌ１／ＦｃおよびｈＰＤ−Ｌ２／ＦｃのカニクイザルＰＤ−１への結合をヒトＰＤ−１と比較して同様の有効性で遮断することが見いだされた。カニクイザルＰＤ−１の細胞外部分のアミノ酸配列がヒトＰＦ−１のそれと９７％同一であることが見いだされたことから、これは驚くべきことではない。ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍａｃａｑｕｅ由来のＰＤ−１に加えて、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａは、ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ由来のＰＤ−１も実施例３に記載のＳＥＭ刺激血液細胞培養物中で機能的に遮断した。検査した抗体で、使用したいずれのアッセイにおいても検出可能な親和性でマウスＰＤ−１に結合したものはなかった。
【０１６１】
要約として、ジャーカット機能を調整する能力に基づいて単離した５個の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を精製し、かつ特徴付けた。これらの抗体は、ＰＤ−１に強く結合し（解離定数２０ｐＭから３ｎＭの範囲で）、さまざまなＩＣ５０値でＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方と相互作用の遮断をできた。これらの抗ｈＰＤ−１ｍＡｂの４個は、市販で入手可能な最も良い抗ＰＤ−１ｍＡｂより相当に良かった。受容体アンタゴニストとして作用する溶液中に加えた場合に各抗体は、最終的にはＴ細胞応答を増強した（実施例３を参照されたい）。
【０１６２】
（実施例３）
抗ＰＤ−１抗体の機能的プロファイリング
ＳＥＢへのヒトＴ細胞応答は、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａによって増強される。
【０１６３】
抗ＰＤ−１抗体をＴ細胞活性を増強するそれらの能力についてｉｎ ｖｉｔｒｏで、健常ボランティア由来の血液細胞を使用して検査した。ヒトＰＤ−１受容体を遮断することの機能的結果を特徴付けるために使用したアッセイは、Ｖβ３およびＶβ８ Ｔ細胞受容体鎖を発現する全てのＴ細胞に結合し、かつ活性化するためにブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を利用した。健常人ドナー血液を得て、培地中に１：１０で希釈した。希釈した全血を９６ウェル丸底プレートに蒔き（１ウェルあたり１５０μｌ）、３０〜６０分間、ｍＡｂとさまざまな濃度でプレインキュベートした。次いでＳＥＢを１０ｎｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲の種々の濃度で加えた。培養２から４日後に上清を回収し、産生されたＩＬ−２の量をＥＬＩＳＡ（実施例１に記載）を使用して、または標準的多重技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｐｌａｔｆｏｒｍ−Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅサイトカイン検出キット）を使用して定量した。１００ｎｇ／ｍＬから最大１０μｇ／ｍＬまでのＳＥＢの滴定は、全血細胞によるＩＬ−２産生を顕著に刺激した。通常、１μｇ／ｍＬのＳＥＢでの刺激２〜４日後にＥＬＩＳＡによって、ドナーに依存して、１００から１０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２が検出可能であった。ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａの添加は、対照マウスＩｇＧ１を超えて、検査した最高抗体濃度（２５μｇ／ｍＬ）で平均２から４倍にＩＬ−２産生を増強した。刺激指数は、一連の独立の健常ボランティアで実施した実験について平均した（図４）。これらの実験は、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａの両方が希釈全血細胞のＳＥＢ刺激でＩＬ−２産生を増強したことを示した。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の両方（しかしＰＤ−Ｌ２ではない）の発現レベルは、全血細胞のＳＥＢ刺激後に徐々に上方制御された（フローサイトメトリーによる定量）。抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ５、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１６−５９８２）および抗ＣＴＬＡ−４（クローン１４Ｄ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１６−１５２９）も、同様の条件下でＩＬ−２産生の増加を誘発し、同時刺激経路の操作後にＴ細胞活性を定量するためのＳＥＢ刺激アッセイの使用をさらに検証した発見を導いた（図４）。抗ＰＤ−１抗体によって増強されたＩＬ−２産生は、用量依存的であることが見いだされた。ＩＬ−２に加えてＬｕｍｉｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって、ＴＮＴα、ＩＬ−１７、ＩＬ−７、ＩＬ−６およびＩＦＮγのレベルもｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａによって顕著に調節されることが見いだされた。これらの実験の結果は、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９ＡをヒトＴ細胞応答を刺激するために使用できることを示す。
【０１６４】
抗ＰＤ−１抗体ｈＰＤ−１．０９ＡをＴ細胞活性を増強するその能力についてｉｎ ｖｉｔｒｏで癌患者由来の血液細胞を使用してさらに検査した。進行黒色腫（１名）または前立腺癌（３名）を有する患者由来の血液を上の手順に従って検査した。サイトカイン定量の結果を表ＩＩＩに、細胞を２５μｇ／ｍＬ ｈＰＤ−１．０９Ａの存在下で刺激した場合を抗体非存在下でのＳＥＢ刺激と比較して、産生されたサイトカインの増加倍数で表す。要約すると、ｈＰＤ−１．０９Ａは、４名の各患者についてＳＥＢ誘発ＩＬ−２産生を２から３．５倍増加させたことが見いだされた。同様にＴＮＴα、ＩＬ−１７およびＩＦＮγの産生は、増強され、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の産生は減少した。これらの実験は、ｈＰＤ−１．０９Ａが癌患者においてＴ細胞応答を刺激する能力を有することを示す。さらにこれらの実験は、Ｔｈ１応答に対する選好性を示唆する。
【０１６５】
【表３】
ＴＴチャレンジに対するヒトリコールＴ細胞応答は、ｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａによって増強される。
【０１６６】
抗ヒトＰＤ−１抗体遮断受容体のその天然のリガンドとの相互作用の機能的効果を要約するために使用された他のアッセイは、破傷風トキソイド（ＴＴ）抗原を健常人ドナー血液における既存のメモリーＴ細胞を刺激するために使用した。この目的を達成するために、新鮮調製ＰＢＭＣ（細胞２×１０５個）を９６ウェル丸底プレートの完全ＲＰＭＩ１６４０培地（５％熱不活性化ヒト血清を含む）に蒔き、さまざまな濃度の検査抗体とプレインキュベートし、１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＴ（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で刺激した。細胞を３〜７日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、その後上清を回収した。サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＩＬ−２およびＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ検出抗体対セット）および多重分析（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｐｌａｔｆｏｒｍ−Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅサイトカイン検出キット）によって決定した。ＰＤ−１の遮断は、抗原単独と比較して、増殖を増強し、かつＩＦＮγおよびＩＬ−２を含むサイトカイン産生を顕著に増強した（図５）。Ｌｕｍｉｎｅｘ分析は、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−６の産生がＰＤ−１遮断で増加することを明らかにした。
【０１６７】
ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト細胞でのヒトＰＤ−１の染色
ＳＥＢ刺激血液細胞がＰＤ−１の増強された発現をフローサイトメトリーで示したことから、これらの細胞を、ｈＰＤ−１．０９Ａが組織学的使用のためのホルマリン固定パラフィン包埋組織においてＰＤ−１を検出できるかどうかを決定するために使用した。ヒトドナー末梢血単核球を、０．１μｇ／ｍＬ ＳＥＢで３日間刺激し、その後非接着細胞（主にリンパ球）を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離（１１００ｒｐｍ、５分間）した。細胞を１０分間、４％ホルムアルデヒドで固定し、細胞沈渣をアガロースに包埋し、エタノール（７０％、８０％、９６％および１００％と続いて）およびキシレン中で脱水し、その後パラフィンに包埋した。切片（４μｍ）をガラススライドにマウントし、水和させ（キシレン、エタノール１００％、９６％、８０％、７０％、ＰＢＳ緩衝液）、その後加熱したクエン酸緩衝液への抗原回収を標準的方法を使用して実施した。ペルオキシダーゼ活性を０．３％Ｈ２Ｏ２を含む１００％メタノールを使用して遮断し、スライドを水およびＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎでリンスした。切片をｈＰＤ−１．０９Ａと１．５時間、室温でインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでリンスし、標準的検出法が続いた。スライドをヘマトキシリンで３０秒間、室温で対比染色し、キシレンで脱水し、マウントして顕微鏡検査した。これらの実験は、ＳＥＢ刺激ＰＢＣＭ培養物由来のリンパ球は、未刺激のＰＢＭＣ培養物とは対照的に、ｈＰＤ−１．０９Ａで（アイソタイプ対照と比較した場合）強く染まり、ｈＰＤ−１．０９Ａが診断試薬として有用であることを示した。
【０１６８】
（実施例４）
抗ＰＤ−１抗体配列および続くヒト化
免疫グロブリンｃＤＮＡのクローニング
縮重プライマーＰＣＲに基づく方法を使用して、ハイブリドーマｈＰＤ−１．０８ＡおよびｈＰＤ−１．０９Ａによって発現されるマウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定した。簡潔には、重鎖および軽鎖についての遺伝子特異的ｃＤＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｒａｄ ＃１７０８８９６）を製造者の説明書に従って使用して生成した。使用したＰＣＲプライマーは、Ｉｇ−プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ ＃６９８３１−３）に基づいた。縮重ＰＣＲ反応は、ＴａｑポリメラーゼをＮｏｖａｇｅｎプライマーセット手順書に従って使用して実施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。重鎖および軽鎖の可変領域の両方について予測される増幅産物サイズは、約５００塩基対である。適切なバンドをもたらした反応からのＴａｑ−増幅ＰＣＲ産物２μｌをｐＣＲ４ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｋ４５９５−４０）にクローン化し、ＤＨ５−αＥ．ｃｏｌｉに製造者による指示のとおり形質転換した。クローンをユニバーサルＭ１３順方向および逆方向プライマーを使用してコロニーＰＣＲによって選別し、各反応から２から３クローンをＤＮＡ配列分析用に選択した。
【０１６９】
クローンをユニバーサルプライマーＭ１３順方向、Ｍ１３逆方向、Ｔ３およびＴ７を使用して両方向に配列決定した。各クローンについての各配列決定反応の結果をＳｅｑｍａｎを使用して分析した。共通配列を、ＮＣＢＩ Ｉｇ−Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を使用して、生殖系列および再配列Ｉｇ可変領域配列のデータベースに対して探索した。ｈＰＤ−１．０８ＡについてのＢｌａｓｔの結果は、ストップコドンが導入されていない生産性（インフレーム）に再配列された重鎖を同定した。２種の異なる配列、１つはストップコドンが導入されていない生産性（インフレーム）に再配列された軽鎖、他方はＦＲ４領域中にストップコドンに至るフレームシフトを含有する非生産的に再配列された配列、をコードする軽鎖クローンが同定された。観察された非生産的増殖不能転写物は、おそらく骨髄腫融合相手由来であり（Ｃａｒｒｏｌｌ Ｗ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５巻：９９１〜９９５頁（１９８８年）排除した。
【０１７０】
ｈＰＤ−１．０９ＡについてのＢｌａｓｔの結果は、ストップコドンが導入されていない生産性（インフレーム）に再配列された重鎖および軽鎖を同定した。発現されたタンパク質のアミノ酸配列は、質量分析によって確認した。配列を添付の配列表で開示し、表ＩＶに列挙する。
【０１７１】
【表４−１】
【０１７２】
【表４−２】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｉｎ： ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤに従って注釈を付けた。
【０１７３】
キメラｃ１０９Ａ抗体の構築および発現
キメラ軽鎖および重鎖を、マウスｈＰＤ−１．０９Ａ ＶＬおよびＶＨ領域のＰＣＲでクローン化したｃＤＮＡをヒトκおよびＩｇＧ１定常領域にそれぞれ連結することによって構築した。マウスｃＤＮＡ配列の５’および３’末端を、各鎖に適切なリーダー配列および既存の組換え抗体発現ベクターへのクローニングを可能にする制限部位を付加するために設計したＰＣＲプライマーを使用して改変した。
【０１７４】
ＣＯＳ−７細胞（１ｍＬあたり１０７個で０．７ｍＬ）に各キメラ重鎖および軽鎖発現プラスミド１０μｇを電気穿孔した。次いでこれらの細胞を８ｍＬ 増殖培地中で３日間培養した。サンドイッチＥＬＩＳＡを、ＣＯＳ−７形質移入体由来の上清中の抗体濃度を測定するために使用した。これは、形質移入されたＣＯＳ−７細胞は、３種の別々の形質移入体で約２９５ｎｇ／ｍＬのキメラＩｇＧ１−κ抗体を分泌したことを示した。
【０１７５】
形質移入されたＣＯＳ−７細胞によって産生されたキメラ抗体の結合は、ＰＤ−１結合ＥＬＩＳＡおよびＣＥＬＩＳＡ（実施例２を参照されたい）を使用して測定し、マウス抗体に匹敵する親和性でＰＤ−１に結合することを示した。
【０１７６】
ヒト化抗体設計
ｈＰＤ−１．０９Ａ抗体をＭＲＣＴ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）によりＣＤＲ移植技術を使用してヒト化した（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい）。簡潔には、マウス抗体ｈＰＤ−１．０９Ａの可変鎖配列をＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）タンパク質データバンクにおいて入手可能な配列と比較した。ｈＰＤ−１．０９Ａの相同性モデルを最も近いＶＨおよびＶＫ構造に基づいて生成した。ｈＰＤ−１．０９Ａに最も高い同一性を有するヒト配列を同定し、分析した（Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４巻：４８７〜４９９頁（１９９２年）；Ｍｏｒｅａ Ｖ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０巻：２６７〜２７０頁（２０００年）；Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６巻：６５１〜６６３頁（１９８５年））。ＣＤＲ移植重鎖および軽鎖を構築するために最も適切なヒトフレームワークを同定した。
【０１７７】
重鎖について、ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６３８２９でコードされるフレームワークを最も適切であると決定した。ｈＰＤ−１．０９Ａ ＶＫ配列の分析は、そのＣＤＲ１の長さ（１５残基）が任意のヒトＶＫにおいて見いだされないことを示す。このため３種の異なるＣＤＲ１の長さ（１１、１６および１７残基）のフレームワークを、どのＣＤＲ１の長さがｈＰＤ−１．０９Ａ ＶＫの挙動を再生するのかを検査するために分析した。その構造中において重要である選択された残基においてｈＰＤ−１．０９Ａ ＶＫに最も高い同一性を有し、ＣＤＲ１の長さ１１、１６および１７を有するヒトＶＫ配列を同定した。ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ２９４６９のフレームワークをＫ１０９Ａ−Ｌ−１１に基づいて選択した。ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６４１３５由来のフレームワークをＫ０９Ａ−Ｌ−１６に基づいて選択し、ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ７２４３１由来のフレームワークをＫ０９Ａ−Ｌ−１７に基づいて選択した。
【０１７８】
ストレートグラフト（ｓｔｒａｉｇｈｔ ｇｒａｆｔ）を各鎖に対する発現構築物を生成するために実施した。１０９Ａ−Ｈ、Ｋ０９Ａ−Ｌ−１１、Ｋ０９Ａ−Ｌ−１６およびＫ０９Ａ−Ｌ−１７のＤＮＡおよびタンパク質配列を添付の配列表（表ＩＶ）において開示する。
【０１７９】
セリン２４１（Ｋａｂａｔ番号）がプロリンに転換された安定化Ａｄａｉｒ変異を有する（Ａｎｇａｌ Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｏｌ．３０巻：１０５〜１０８頁（１９９３年））ヒト化ｈ１０９Ａ抗体のＩｇＧ４バージョンを生成した。この配列は、配列番号２３および３１で開示される。
【０１８０】
（実施例５）
ヒト化抗ＰＤ−１抗体の結合特性および機能特性
産生および精製
ヒト化抗体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７をＣＨＯ−Ｓ細胞の一過的形質移入によって産生させた。細胞をＣＤ−ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏ）およびＣ５４６７培地（Ｓｉｇｍａ）で８日間、振盪フラスコ中で増殖させた。抗体をプロテインＡクロマトグラフィーによって細胞上清から精製し、洗浄し、１Ｍ酢酸を使用して溶出し、３Ｍ Ｔｒｉｓを使用して中和した。最後に緩衝液を、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基でｐＨ５．５に調整した１００ｍＭ酢酸に交換した。
【０１８１】
結合および動態解析
見かけの結合親和性を決定するために（ＥＣ５０値として報告される）タンパク質に基づく、および細胞に基づくＥＬＩＳＡを実施例２に記載のとおり実施した。ヒト化抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１／Ｆｃおよび細胞で発現されるＰＤ−１にマウス親抗体に匹敵するＥＣ５０値でそれぞれ結合した（表Ｖ）。
【０１８２】
抗体の動態学的な結合特性も実施例２に記載のとおり生物光学干渉法を使用して実施した（図６）。ヒト化抗体の２つｈ４０９Ａ１１およびｈ４０９Ａ１６は、ｈ４０９Ａ１１およびｈ４０９Ａ１６について決定されたＫＤがそれぞれ２９ｐＭおよび２７ｐＭであって（表Ｖ）、このアッセイを使用して検査した他のいずれのｍＡｂよりも相当強く結合した。検査した他の抗ＰＤ−１抗体と比較して、増大した親和性は、主により遅い解離速度による。マウス親抗体と同様に、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６は、１２０ｐＭより低く決定されたＫＤでカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）ＰＤ−１への結合を示した。
【０１８３】
リガンド遮断
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合を遮断するヒト化抗体の能力を、実施例２に記載のとおりＦＭＡＴ競合アッセイを使用する同質的競合アッセイおよび検出を使用して測定した。
【０１８４】
ｈＰＤ−Ｌ１／ＦｃおよびｈＰＤ−Ｌ２／Ｆｃの両方のＣＨＯ−ｈＰＤ１細胞への結合は、検査した任意のヒト化抗体によって用量依存的に完全に抑制し得る。算出されたＩＣ５０データを表Ｖにまとめる。親マウス抗体ｈＰＤ−１．０９Ａと同様に、ヒト化ｍＡｂ、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７のそれぞれは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２結合を１ｎＭより低いＩＣ５０値で抑制した。マウス親抗体と同様に、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７は、約１ｎＭより低く算出されたＩＣ５０でカニクイザルＰＤ−１へのリガンド結合の抑制を示した。
【０１８５】
【表５】
ＳＥＢへのヒトＴ細胞の応答はヒト化ｍＡｂによって増強される。
【０１８６】
ヒト化抗ＰＤ−１抗体をＴ細胞活性を増強させるそれらの能力についてｉｎ ｖｉｔｒｏで、実施例３に記載のとおり健常人ボランティア由来の血液細胞を使用して検査した。上清を培養４日後に回収し、産生されたＩＬ−２の量をＥＬＩＳＡを使用して定量した。ヒト化ＰＤ−１抗体は、ＳＥＢによって刺激されたＩＬ−２産生を増大させる能力を示した（図７）。追加的にヒト化ＰＤ−１抗体は、実施例３において記載されたのと同様に、癌患者の血液においてＳＥＢ誘発ＩＬ−２産生を増大させた。
【０１８７】
要約として、ヒト化ｍＡｂ ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７は、ヒト化過程において全ての機能的活性を保持した。ｈ４０９Ａ１１およびｈ４０９Ａ１６ｍＡｂは、ヒト化においてマウスの親抗体ｈＰＤ１０９Ａの親和性を全て保持した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−２５４０９２（Ｐ２０１２−２５４０９２Ａ）
【公開日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１８５５７３（Ｐ２０１２−１８５５７３）
【出願日】平成２４年８月２４日（２０１２．８．２４）
【分割の表示】特願２０１０−５１３２０１（Ｐ２０１０−５１３２０１）の分割
【原出願日】平成２０年６月１３日（２００８．６．１３）
【出願人】（５１２０５９９３６）エム・エス・ディー・オス・ベー・フェー (24)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１８５５７３（Ｐ２０１２−１８５５７３）
【出願日】平成２４年８月２４日（２０１２．８．２４）
【分割の表示】特願２０１０−５１３２０１（Ｐ２０１０−５１３２０１）の分割
【原出願日】平成２０年６月１３日（２００８．６．１３）
【出願人】（５１２０５９９３６）エム・エス・ディー・オス・ベー・フェー (24)
【Ｆターム（参考）】
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