ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩのアミノ酸断片又はその改変体を含有する炎症性疾患予防・治療剤
【課題】炎症性サイトカインの産生、ケモカイン産生或いはＴ細胞増殖を伴う肝炎、リウマチなどの炎症性疾患に対して副作用の少ない予防・治療剤が強く望まれていた。
【解決手段】アポリポタンパク質Ａ−ＩＩの断片である配列番号２記載の範囲に存在し、少なくとも配列番号２３記載のアミノ酸配列を含む、あるいは、配列番号４、配列番号５記載のアミノ酸配列を含む８個〜３０個のアミノ酸よりなるペプチド及びその改変体が、炎症性サイトカイン、ケモカインの産生抑制、又はＴ細胞の増殖を抑制し、それらを含む製剤が炎症性疾患を予防・治療することができることを突き止め、前記課題を解決した。
【解決手段】アポリポタンパク質Ａ−ＩＩの断片である配列番号２記載の範囲に存在し、少なくとも配列番号２３記載のアミノ酸配列を含む、あるいは、配列番号４、配列番号５記載のアミノ酸配列を含む８個〜３０個のアミノ酸よりなるペプチド及びその改変体が、炎症性サイトカイン、ケモカインの産生抑制、又はＴ細胞の増殖を抑制し、それらを含む製剤が炎症性疾患を予防・治療することができることを突き止め、前記課題を解決した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性サイトカインの産生の抑制、ケモカイン産生の抑制或いはＴ細胞の増殖を抑制するペプチド又はその改変体及びそれを含有する炎症性疾患予防・治療剤である。更にいえば本発明は、ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩのアミノ酸配列において抗炎症性の作用部位を持つペプチド又はその改変体及びそれを含有する炎症性疾患予防・治療剤である。
【背景技術】
【０００２】
炎症性サイトカインの産生、ケモカイン産生或いはＴ細胞の増殖に重要な役割を果たしているのは免疫担当細胞である。血中・骨髄中などに存在するリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、好中球など）や脳、肝臓などの様々な臓器に常在する細胞（マクロファージ、樹状細胞、血管内皮細胞、組織の実質細胞など）などの免疫応答に関わる全ての細胞が免疫担当細胞であり、これらの細胞から免疫応答を活性化する液性因子としてサイトカイン、ケモカインや各種炎症性物質などが分泌される。また液性因子の他に細胞間相互作用により効果を発揮する細胞性免疫も活性化される。
【０００３】
免疫系活性化の端的な現象としての炎症は、細菌感染や化学作用、物理作用により身体組織が傷害を受けた時に免疫系が働き、それによって腫れや痛み、発熱などを起こすなどの生体防御反応によって生体に出現した症候である。このような炎症部位では様々な炎症性サイトカイン、ケモカインが産生され、炎症部位に多くのリンパ球が浸潤する。主な炎症性サイトカインとして、ＴＮＦ−αがあるが、このほかに、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１などもよく知られている。また、抗原によってリンパ球が活性化された場合には、リンパ球の中の１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１細胞）がインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）などのサイトカインを産生し、産生されたＩＬ−２及びＩＦＮ−γによって、リンパ球、特にＴ細胞が増殖及び分化することが知られている。
【０００４】
ＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）は単球走化活性因子（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：ＭＣＡＦ）とも呼ばれ、その構造的及び機能的類似点より、ＩＬ−８とファミリーを構成する。単球特異的遊走活性及び好酸球ヒスタミン遊離作用等を有し、炎症や生体防御等に深く関与していると考えられる。特に、単球の走化及び活性化作用から、各種の炎症、自己免疫疾患、動脈硬化や腫瘍などへの関与が、また、好塩基球活性化作用から、アレルギー反応への関与が推測されている。
【０００５】
ＭＣＰ−１は単球及びマクロファージに作用して、炎症局所への走化性の亢進と活性化を促す役割を担っており、いくつかの炎症反応の進展に関わっていると考えられている。従って、ＭＣＰ−１の作用を抑制する物質がこれら炎症反応の予防或いは治療に役立つと考えられ、ＭＣＰ−１に対するモノクローナル抗体（特許文献１）、抗体フラグメント（特許文献２）、レセプタータンパク質（特許文献３）が報告されている。しかし、ＭＣＰ−１の作用を抑制する物質は、臨床にはまだ使用されていない。
【０００６】
ＴＮＦ−αは、主にマクロファージから産生され、好中球、線維芽細胞、リンパ球（Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、肥満細胞などからも産生されて、腫瘍細胞を障害する（抗腫瘍効果）が、内因性発熱物質でもある。低濃度のＴＮＦ−αは、血管内皮細胞に作用し、接着分子の発現を増強し、ＩＬ−１、ＩＬ−６などのサイトカインの産生を促進させる。高濃度のＴＮＦ−αは、肝臓で、急性期蛋白質の産生を促進し、ＩＦＮ−α産生を抑制する。
【０００７】
ＴＮＦ−αは、何らかの原因によって過剰に生産され続けるとリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、２型糖尿病などさまざまな疾病を引き起こす。そのため、このような病気に罹患した患者に対してＴＮＦ−αなど炎症性サイトカインの産生を抑制する薬剤が開発されており、イブプロフェンやインドメタシン等既存の抗炎症剤の他、サリドマイド誘導体（非特許文献１参照）、ピラゾロン誘導体（非特許文献２参照）、スベリヒユ科植物のアルカロイド（特許文献４参照）、プロテオグリカン（特許文献５参照）、ＨＤＬ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びアポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（特許文献６参照）などが報告されている。
【０００８】
最近では、炎症性サイトカインの作用を抑えることによってリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、２型糖尿病等の炎症性疾患を治癒するめにＴＮＦ−α阻害薬が開発され、治療に大きく貢献している。しかしその一方で、ＴＮＦ−αモノクロール抗体製剤では、点滴後アナフィラキシー様症状（発熱、呼吸困難、気管支痙攣、血圧低下、血管浮腫、チアノーゼ、蕁麻疹）の発現や、投与後３日以上経過したあとに重篤な遅効性過敏症（筋肉痛、発疹、発熱、掻痒、浮腫、蕁麻疹）の発現が見られることがあり、さらに重要な副作用として、免疫を強力に抑制するので感染症（敗血症、真菌感染症を含む日和見感染症）に罹患しやすくなる。
【０００９】
ＩＬ−２は、主としてＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）が分泌するサイトカインで、１３３個のアミノ酸よりなる。ＩＬ−２はＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）とも呼ばれ、Ｔ細胞を増殖させるが、ＩＬ−２はＴ細胞ばかりでなく、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球等にも作用を及ぼすことが知られている。そして、これら細胞の細胞表面にはＩＬ−２受容体が発現おり、免疫及び炎症反応の重要な調節因子である。
ＩＬ−２産生抑制により、慢性関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、乾癬及び組織移植片の拒絶反応などの疾患状態で治療効果を示すことが予想される。
【００１０】
ＩＦＮ−γは、活性化されたＴ細胞で産生され免疫系と炎症反応に対して調節作用を有し、多くの疾患で組織中や血液中に検出される。ＩＦＮ−γが病態形成に強く関与していると考えられる疾患には、ウィルス感染症、ウィルス以外の微生物による感染症、慢性関節リウマチ、ＳＬＥ等の膠原病、動脈硬化、糖尿病、劇症肝炎、悪性腫瘍、川崎病等が挙げられる
【００１１】
Ｔ細胞はリンパ球の一種で、骨髄で生産された前駆細胞が胸腺での選択を経て分化成熟したものである。正常なＴ細胞は哺乳動物の免疫応答の不可欠な部分であるが、Ｔ細胞の異常な増殖により、病態が発症する場合がある。例えば、自己免疫疾患として、全身性狼瘡エリテマトーデス、慢性関節リウマチ及び多発性硬化症がある。Ｔ細胞は免疫応答の不可欠な部分である。したがって、Ｔ細胞増殖の抑制を目的とする治療法は自己免疫疾患を治療するために非常に望ましい。
【００１２】
ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩは人の血液中に常在する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要な構成成分であり、その化学構造はすでに明らかにされていて、配列番号１に示した７７個のアミノ酸からなるポリペプチドである。このヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩは、ＨＤＬ中では通常第６残基目のシステインでジスルフィド結合したダイマーとして存在することが知られている（非特許文献３）。
【００１３】
ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩの活性部位として、Ｎ末端から数えて１７番目から３０番目（１７−３０）までのアミノ酸配列及び５１番目から６０番目（５１−６０）までのアミノ酸配列を有するペプチドが知られている（特許文献７）。しかし、その他活性部位についての具体的な記載はなく、抗炎症又はサイトカインを抑制するアミノ酸配列についてもなんらの記載もない。また、ウシアポリポタンパク質Ａ−ＩＩについては、抗菌活性（特許文献８参照）について記載されている。ウシアポリポタンパク質Ａ−ＩＩ，ウシアポリポタンパク質Ａ−ＩＩフラグメント及びヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩについては、線維芽細胞増殖活性（特許文献９参照）を示すとの記載はあるが、抗炎症又はサイトカインを抑制するアミノ酸配列についてはなんらの記載もない。
【００１４】
炎症を抑制するペプチドとして、アポリポタンパク質Ａ−Ｉのフラグメント（特許文献６参照）、ＴＮＦやＩＬ−６等サイトカインを抑制するペプチド（特許文献１０）、ケモカインレセプターＣＣＲ３のアンタゴニストポリペプチド（特許文献１１）、ＡｐｏＥ受容体結合ペプチド（特許文献１２）等が知られているが、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩのフラグメントでの知見はない。
【特許文献１】特許第３９２０２１５号公報
【特許文献２】ＷＯ２００４／０２４９２１号公報
【特許文献３】特開平９−２３８６８８号公報
【特許文献４】特開２００３−２６５８６号公報
【特許文献５】特開２００７−１３１５４８号公報
【特許文献６】特表２００４−５００１０５号公報
【特許文献７】ＷＯ８７／０２０６２号公報
【特許文献８】特許第３７３４８８５号公報
【特許文献９】特許第３９１３５３７号公報
【特許文献１０】特開２００４−１９６７０７号公報
【特許文献１１】特開２００１−２９０７９号公報
【特許文献１２】特表２００５−５１１５１４号公報
【非特許文献１】Ｓ． Ｎｉｗａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ３９， ３０４４−３０４５， １９９６
【非特許文献２】Ｍ．Ｐ． Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ４７， ２７２４−２７２７， ２００４
【非特許文献３】Ｔｈｅ Ｌｉｐｉｄ Ｖｏｌ．２， Ｎｏ．３ ２４３−２４９， １９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明課題は、ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩのアミノ酸配列中の抗炎症性作用部位を持つペプチドを含む副作用のない炎症性疾患の治療、予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、７７個のアミノ酸からなるヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（配列番号１）のアミノ酸配列からの種々の断片ペプチドを調製し、それぞれの各種生理学的特性を精査した結果、ある特定のペプチド断片が抗炎症性を有することを見いだし、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）配列番号２に記載のペプチドおいて、８個〜３０個の連続したアミノ酸からなるペプチド又はその改変体を含んでなる炎症性疾患予防・治療剤。
（２）８個〜３０個の連続したアミノ酸からなるペプチド又はその改変体がＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−２の産生抑制、もしくはＴ細胞の増殖を抑制するものである（１）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（３）８個〜３０個の連続したアミノ酸からなるペプチドが配列番号２３のペプチドを含むものである（１）又は（２）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（４）配列番号２に記載のペプチドにおいて、配列番号４又は配列番号５のペプチドを含む２０〜３０個の連続したアミノ酸からなる（１）又は（２）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（５）ペプチドの改変体が、１つ以上のアミノ酸の置換、１つ以上のアミノ酸の欠失、１つ以上のアミノ酸の付加、あるいはＳ−Ｓ結合の連結によりにより生成したものである（１）〜（４）のいずれかに記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（６）ペプチドの改変体が、Ｎ末端のアセチル化又はピロ化或いはＣ末端のアミド化により生成したものである（１）〜（４）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（７）１つ以上のアミノ酸の置換が、アスパラギン或いはセリンからアラニンに置換されたものである（５）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（８）１つ以上のアミノ酸の置換が、Ｌ体のアミノ酸からＤ体のアミノ酸への置換により生成したものである（５）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（９）１つ以上のアミノ酸の付加が、極性アミノ酸によりなされたものである（５）記載の炎症性疾患予防・治療剤
（１０）極性アミノ酸の付加が、スペーサーアミノ酸を介してなされたものである（９）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（１１）炎症性疾患が、炎症時に炎症性サイトカイン、ケモカイン或いはＴ細胞の増加を伴うものである（１）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（１２）炎症性サイトカイン、ケモカイン或いはＴ細胞の増加を伴う疾患が、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、全身性脈管炎、細菌性骨髄炎、皮膚炎、乾癬、糖尿病、肝炎、リウマチ、感染又は自己免疫疾患に伴う神経障害、神経因性疼痛、虚血再環流障害、脳炎、ギラン・バレー症候群、パーキンソン病、動脈硬化症、代謝症候群（メタボリックシンドローム）、心不全、心筋症、心筋梗塞、脳梗塞、クローン病、移植片体宿主疾患又は移植拒絶反応からなる疾患である（１１）に記載の炎症性疾患予防・治療剤。
である。
【００１７】
上記記載の各ペプチドは、「固相法」又は「液相法」として知られるペプチド合成法により、調製することができる。例えば、社団法人日本生化学会編集『生化学実験講座』、第１巻、「タンパク質ＩＶ」、第２０７〜４９５頁、１９７７年、東京化学同人発行及び社団法人日本生化学会編集『新生化学実験講座』、第１巻、「タンパク質ＶＩ」、第３〜７４頁、１９９２年、東京化学同人発行などにはペプチド合成の詳細が記載されている。また、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトオキシカルボニル）固相合成法を用いてペプチド合成機にて合成することができる。すなわち、合成する各ペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸が導入されているＦｍｏｃアミノ酸を樹脂に結合させ、（Ｉ）Ｆｍｏｃ基の脱保護と洗浄、（ＩＩ）Ｆｍｏｃアミノ酸の縮合と洗浄、の操作を繰り返してペプチド鎖を延長し、最後に最終脱保護反応させて、目的とするペプチドを合成することができる。
【００１８】
本発明のペプチドは化学合成により調製されたものに限定されず、例えば、上記（１）〜（１３）に記載されたペプチドを生産する場合には、細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、該ペプチドをコードしたポリヌクレオチドを組換え作製した発現ベクターを用いてよい。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養し、この培養物から目的のペプチドを単離、精製することによりこの発明のペプチドを採取してもよい。宿主として、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞などを適宜用いてもよい。
【００１９】
この発明のペプチドは、単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどのペプチド又は蛋白質を精製するための方法が用いられ、必要に応じて、これら方法を適宜組合せてもよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したペプチドを濃縮、また必要に応じてさらに凍結乾燥して、液状又は固状にすればよい。
【００２０】
さらに、本発明のペプチドは、通常当業者の技術常識に従ってアミノ酸の置換、欠失、或いは付加を行うことができる。すなわち、電荷密度、疎水性、親水性、サイズ及び形状などの物理的性質の公知の類似性に基づき改変が可能となる。
【００２１】
たとえば、個々のアミノ酸を置換する場合、ＬｅｕをＳｅｒに、又はその逆にＳｅｒをＬｅｕに置換することができ、ＴｈｒをＳｅｒ（又はその逆）に置換することが可能である。
【００２２】
また、ペプチドのＣ末端をアミド化、Ｎ末端のアセチル化などの修飾によってペプチドの両末端の電荷を打ち消して安定なものにすることもできる。また標的となる細胞の膜透過性向上やペプチドの溶解性向上のため、１個ないし複数個のアルギニンやリジン等の親水性アミノ酸をペプチドに直接付加、又はスペーサーとなるアミノ酸を介して本ペプチドに付加することもできる。このスペーサーとなるアミノ酸として、プロリンやグリシン等が用いられる。
【００２３】
また、システイン残基間のＳ−Ｓ結合を利用したペプチドの環状化、二量体化することによりペプチドの安定性及び活性の向上に有用な場合がある。また、グルタミンがペプチドのＮ末端にある場合にカルボキシル基とアミノ基の分子内縮合によりピロ化してピログルタミン酸に変化することがあり、その場合は、グルタミンの代わりにピログルタミン酸を付加することもできる。
【００２４】
本発明のペプチドは、そのままで或いは公知の薬学的に許容される担体や賦形剤等と混合した医薬組成物として経口又は非経口的に投与することができる。
本発明のペプチドを含む薬剤の形態のとしては、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、軟こう剤、硬膏剤、パップ剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、注射剤などが挙げられる。
【００２５】
本発明のペプチドの投与量は、患者の年令や疾患の程度により異なるが、一般には経口投与の場合には１日当たり０．１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは５μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、静脈内、筋肉内或いは皮下投与の場合には１日当たり０．１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５μｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。投与回数は、経口投与で１日１〜３回、注射では１日１〜２回に分けて投与することができる。
【００２６】
本発明のペプチドは通常の方法に従って製剤化することができる。例えば、賦形剤、補形剤、希釈剤、香味剤、香料、甘味剤、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、界面活性剤、基剤、溶剤、充填剤、増量剤、溶解補助剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩壊剤、噴射剤、保存剤、抗酸化剤、遮光剤、保湿剤、帯電防止剤、無痛化剤などを組合せて用い、製剤として製造することができる。
【００２７】
本発明のペプチドの投与経路は、経口、非経口と特に制限はないが、静脈投与、筋肉投与、皮下投与、皮内投与、経肺・経鼻などの粘膜投与等の非経口投与が好ましい。
【００２８】
本発明による炎症性疾患の予防・治療剤を、注射剤として製する場合には、常法に従い、精製されたペプチドの一定量に、例えば注射用水、生理食塩液、或いはＰＢＳ（０．１Ｍリン酸緩衝食塩水）などを加えて溶解又は均一に懸濁させるか、薬理的に許容される天然／又は合成の界面活性剤（たとえばレシチン類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ひまし油類など）を添加して分散剤とするか、所望により基材油脂を加えたものを乳化機を用いて乳化分散剤とする。さらに、これらには必要に応じて溶解補助剤（安息香酸ベンジル等）、アルコール類（一価或いはポリエチレングリコールなどの多価いずれでも良い）、ブドウ糖やその他の等張化剤（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、アスコルビン酸などの酸化防止剤などと配合してもよい。
このようにして得られた薬液は、必要に応じて除菌フィルターでろ過して無菌の薬液とし、通常適当なアンプル等に無菌的に充填して製剤とするか、必要に応じてバイアルに充填し、乾燥させた用事溶解製剤として医療の場に供する事ができる。
【００２９】
また、前項に記載した成分から、噴霧剤に適した安定剤、保存剤などの添加剤成分を選択し、吸収促進剤、帯電防止剤などをさらに添加し、液状或いは乾燥微粉末としてよい。局所への噴霧にあたり、液状噴霧剤とするか又は経肺投与或いは経鼻投与に適した粒子サイズの微粉末又は乾燥固体として適宜剤形を選択することができる。
【００３０】
ペプチドは、投与されるとしばしば体内循環から速やかに除去されるので、比較的短時間においてのみその薬理学的活性を示すこととなる。従って、治療に有効とする状態を維持するためには、生物活性のある物質を比較的大量且つ多回に投与することが好ましい。ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールの共重合体、及びポリプロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、又はポリプロリンのような水溶性ポリマーを共有結合させてそれを修飾した物質は、対応する未修飾の物質と比べて、静脈内投与後の血中においてより長い半減期を示すことが知られている。このような修飾は、水溶液への物質の溶解度を増大させ、凝集を阻止し、物質の物理的及び化学的安定性を増大させ、物質の免疫原性及び反応性も著しく減少させる場合がある。その結果、未修飾の物質に比べてより少ない投与回数で、或いはより少ない用量で、このようなポリマー物質付加体を投与することによって、所望のインビボ生物活性を達成することができる。
【００３１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、毒性が低いことから、それを結合させることは特に有用である。また、ＰＥＧを結合すると、異種性化合物の免疫原性及び抗原性を効果的に減少できることがある。ペプチドのアミノ基と反応させるのに有用なＰＥＧ試薬としは、分子量２０００〜３００００までの高純度のものだけでなく、メトキシＰＥＧアミン、マレイミド、カルボン酸などの活性化ＰＥＧ誘導体も存在し、これらＰＥＧを結合するために用いてもよい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の炎症性疾患予防・治療剤の有効物質は、ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩのアミノ酸配列において抗炎症性の作用部位を持つペプチド又はその改変体であり、副作用がないか又は殆ど副作用がなく、極めて安全で且つ確実な効果を発揮する炎症性疾患予防・治療剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下に実施例、実験例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００３４】
以下の実験例、実施例、試験例を通じて、アミノ酸の表示については、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アルギニン （Ａｒｇ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）と３文字表示とする。
実験例１（ペプチドの合成）
【００３５】
配列番号２〜２２のペプチドは、ペプチド自動合成機（４３３Ａ型：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、樹脂に固定したアミノ酸誘導体に、１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させていく方法（固相合成法）により合成した。
【００３６】
配列番号８で表されるペプチドを以下のようにして合成した。
ペプチドのＣ末端残基に相当するアミノ酸（Ａｌａ）が導入されているＦｍｏｃ−Ａｌａ−樹脂を上記ペプチド合成機の反応容器にセットし、合成機に添付されているソフトウエアーに従って、活性化剤として、１−［ビスジメチルアミノメチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウムー３−オキシドーヘキサフルオロホスフェイト（ＨＢＴｕ），１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解して反応槽に加えて反応させた。得られた樹脂をピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン中で緩やかに攪拌してＦｍｏｃ基を除いた。次にＣ末側から２番目のアミノ酸（Ｐｒｏ）を繋ぐため、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨに先と同様の試薬を加えて活性化したものと、先のＦｍｏｃ基を除いた樹脂に結合しているアミノ酸に反応させた。ここで生成したＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−樹脂から再びＦｍｏｃ基を除き、同様の方法で活性化させたＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ／ＰｙＢＯＰ溶液と反応させ、Ｃ末側から３番目までのアミノ酸を含むＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｌａ−樹脂を合成した。
【００３７】
さらに逐次同様の操作で各アミノ酸を付加し、目的とする保護ペプチド樹脂
（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｌａ−樹脂）を合成した。
【００３８】
なお、ペプチド合成に使用したアミノ酸は以下に示したものを用いた。これらのアミノ酸は、Ｌ体又はＤ体が用いられ、アセチル化、ピロ化等の修飾したアミノ酸も用いられた。
（ ）内は残基部分の反応基を保護する保護基を表す。：
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ 、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）− ＯＨ、 Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ 、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ
【００３９】
上記説明において使用されている略語の意味は以下の通りである。：
Ｔｒｔ＝トリチル、
Ｐｂｆ＝Ｎ−２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンンゾフランー５−スルフォニル、
Ｂｏｃ＝ｔ−ブトキシカルボニル、
ｔＢｕ＝ｔｅｒｔ−ブチル、
ＯｔＢｕ＝ｔｅｒｔ−ブトキシ
ＨＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾルー１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムーヘキサフルオロホスフェイト
【００４０】
まず、上記のように合成し得られた保護ペプチド樹脂（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｌａ−樹脂）のピペリジン処理で、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を脱保護した。
【００４１】
次にＮ−メチル−２−ピロリジノンにて洗浄後、メチレンクロライドにて洗浄し、さらに窒素ガスを吹き付けることにより乾燥させた。
樹脂を取り出し、クリベージ溶液を加え、反応させることにより側鎖保護基の除去と樹脂からのペプチドの切り出しを行い、配列番号８に記載のペプチドからなる粗ペプチドをエーテル沈殿とした後、沈殿をろ取した。
【００４２】
また、配列番号８以外の配列番号２〜２２に記載のペプチドを含む粗ペプチド溶液についても、これらと同様の操作を行って調製した。また、Ｄ体ペプチドはＤ体のアミノ酸を用いた。
実験例２（ペプチドの精製）
【００４３】
実験例１で得た粗ペプチド溶液を、ＯＤＳカラム（ＹＭＣ ＯＤＳ， ３０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し、配列番号２〜２２に記載のアミノ酸配列を有するトリフルオロ酢酸塩体ペプチドを得た。
実験例３（Ｃ末端アミドペプチドの作製）
【００４４】
４８−６７（Ｃ末端アミドペプチド）番のペプチド（配列番号１１）で表されるペプチドの合成を以下のようにした。実施例１と同じペプチド自動合成機を用いてＣ端末アミド作製用 Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡを出発樹脂単体とし、Ｃ端末から配列に従って各Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として逐次ペプチド鎖の延長を行った。合成し得られた保護ペプチド樹脂にピペリジン処理によりＮ末端Ｆｍｏｃ基を脱保護し、続いてトリフルオロ酢酸を用いて、側鎖保護基の除去と樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド溶液を得た。実験例２と同様に精製し、配列番号１１のトリフルオロ酢酸塩体ペプチドを得た。配列番号１１以外の配列番号１２、１３、１５、２０、２２に記載のペプチドを含む粗ペプチド溶液についても、これらと同様の操作を行って調製した。
実験例４（ジスルフィド結合型環状化ペプチドの作製）
【００４５】
配列番号１２で表されるペプチドの合成を以下のようにした。実施例１と同じペプチド自動合成機を用いてＣ末端がアミドの場合はＣ端末アミド作製用 Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡを出発樹脂単体とし、Ｃ端末から配列に従って各Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として逐次ペプチド鎖の延長を行った。合成し得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸を用いて側鎖保護基の脱保護と樹脂からの切り出しを行った。得られた粗ペプチド溶液を５０％酢酸水溶液とし、ヨウ素水溶液を混ぜて反応させジスルフィド結合型環状化ペプチドとした。環状化の進行を高速液体クロマトグラフにて確認後、実験例２と同様に精製し、配列番号１２のトリフルオロ酢酸塩体ペプチドを得た。配列番号１２以外の配列番号１３及び１６に記載のペプチドを含む粗ペプチド溶液についても、これらと同様の操作を行って調製した。
実験例５（ジスルフィド結合型二量体ペプチドの作製）
【００４６】
配列番号２１で表されるペプチドの合成を以下のようにした。実施例１と同じペプチド自動合成機を用いてＣ末端がアミドの場合はＣ端末アミド作製用 Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡを出発樹脂単体とし、Ｃ端末から配列に従って各Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として逐次ペプチド鎖の延長を行った。合成し得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸を用いて側鎖保護基の脱保護と樹脂からの切り出しを行った。得られたチオール基遊離の粗ペプチド溶液を５０％酢酸水溶液とし、ヨウ素水溶液を混ぜて反応させジスルフィド結合型二量体ペプチドとした。二量化の進行を高速液体クロマトグラフにて確認後、実験例２と同様に精製し、配列番号２１のトリフルオロ酢酸塩体ペプチドを得た。配列番号２２に記載のペプチドを含む粗ペプチド溶液についても、これらと同様の操作を行って調製した。
実験例６（塩交換）
【００４７】
配列番号４及び１１で表されるペプチドについては、トリフルオロ酢酸塩体を酢酸水溶液に溶解し、ダウエックスイオン交換樹脂にて塩交換し酢酸塩体とした。
実験例７（ペプチドの純度）
【００４８】
実験例１〜６で取得したペプチドは、ＰＢＳにて溶解しペプチド溶液として、ＯＤＳカラム（ＹＭＣ ＯＤＳ， ４．６×１５０ｍｍ），（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３， ４．６×２５０ｍｍ）又は（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＰＲＥＰ ＯＤＳ， ４．６×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開し、吸光度２２０ｎｍを測定することにより純度を確認した。
その結果を次に示す。
配列番号２のペプチドは９６．８％、
配列番号３のペプチドは９５．９％、
配列番号４のペプチドは９７．９％、
配列番号５のペプチドは９８．７％、
配列番号６のペプチドは９２．１％、
配列番号７のペプチドは９５．４％、
配列番号８のペプチドは９４．２％、
配列番号９のペプチドは９５．９％、
配列番号１０のペプチドは９５．４％、
配列番号１１のペプチドは９９．６％、
配列番号１２のペプチドは９６．３％、
配列番号１３のペプチドは９７．６％、
配列番号１４のペプチドは９８．６％、
配列番号１５のペプチドは９８．９％、
配列番号１６のペプチドは９７．５％、
配列番号１７のペプチドは９８．４％、
配列番号１８のペプチドは９８．４％、
配列番号１９のペプチドは９５．０％、
配列番号２０のペプチドは９９．３％、
配列番号２１のペプチドは９９．２％、
配列番号２２のペプチドは９８．４％
上記の通り、いずれも高純度のペプチドが得られた。
配列番号２〜２２のぺプチドについて純度を測定したクロマトグラムを図１〜２１に示した。
【００４９】
ただし、配列番号１は国際公開番号ＷＯ／２００８／１３３２２５に準じて製造した。
実験例８（試験管内活性測定）
【００５０】
「ヒト単球様細胞株ＴＨＰ−１由来マクロファージを用いた試験：ＭＣＰ−１産生」
ペプチド（配列番号２、３、１０、１１、１２及び１３）の生理活性は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激下、ＭＣＰ−１の産生量を測定し、無作用であるＰＢＳでの産生量と比較し、ＭＣＰ−１産生抑制活性として評価した。同様に配列番号１も実施した。
すなはち、ヒト単球性細胞株ＴＨＰ−１を９６穴プレートに２×１０４／ｗｅｌｌ（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）で播種した、その際にホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を終濃度１００ｎＭで添加し３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。新たにＰＭＡ含有培地（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）と交換しさらに２４時間培養を行なった。細胞を洗浄後、別に実験例１〜６で取得したペプチドを、もしくは溶媒コントロールのＰＢＳを５０ｕＬ／ｗｅｌｌで添加し、刺激としてＬＰＳ（Ｅ． ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ社製）を終濃度０．１μｇ／ｍＬとなるように５０ｕＬ／ｗｅｌｌで加え３７℃、５％ＣＯ２条件下で９時間もしくは２４時間培養した。その後、培養上清中のＭＣＰ−１（Ｈｕｍａｎ ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ； Ｒ&Ｄ社製）を測定した。
結果を表１及び表２に示す。なお、以下の表における「値」は、ｎ＝２の平均値（％）である。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【表２】
表１に示されるように、配列番号１３で１５％及び配列番号１１で２２％までのＭＣＰ−１産生抑制を示し、その他のペプチドも配列番号１に比べＭＣＰ−１産生抑制を示した。また、表２に示されるように、配列番号３では０．０１〜０．１２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にて用量依存的なＭＣＰ−１産生抑制を示した。
【００５３】
実験例９（試験管内活性測定）
「ラットミクログリア細胞を用いた試験：ＴＮＦ−α産生」
ペプチド（配列番号５，７，８，９及び１１）の生理活性は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激下、ＴＮＦ−αの産生量を測定し、無作用であるＰＢＳでの産生量と比較し、ＴＮＦ−α産生抑制活性として評価した。同様に配列番号１も実施した。
すなわち、ラット新生児由来ミクログリア細胞を住友ベークライト社より購入し、同社Ｎｅｒｖｅ−Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ<ミクログリア>の培養方法に従い一週間ほど培養してから試験系に用いた。培養後ミクログリア細胞はミクログリア用細胞培養液（住友ベークライト社）に懸濁し、５×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ細胞培養用プレート（コーニング社）に播種して一夜培養した。培養液をミクログリア用試験液（住友ベークライト社）に交換し、別に実験例１〜６で取得したペプチドもしくは溶媒コントロールのＰＢＳを５０ｕＬ／ｗｅｌｌ添加し、最終濃度２５ｎｇ／ｍＬとなるようにＬＰＳ（Ｅ． ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ社製）を１５０ｕＬ／ｗｅｌｌ加えて３７℃、ＣＯ２インキュベーターで４時間培養した。上清を回収し、上清中のＴＮＦ−α（Ｒａｔ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ； Ｒ&Ｄ社製）を測定した。
その結果を表３、表４に示す。
【００５４】
【表３】
【００５５】
【表４】
表３に示されるように、配列番号８で０％、配列番号９で１％、配列番号７で１８％及び配列番号１１で１９％までのＭＣＰ−１産生抑制を示し、その他のペプチドも配列番号１に比べＴＮＦ−α産生抑制を示した。また、表４に示されるように、配列番号１１では０．０２５〜０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にて用量依存的なＴＮＦ−α産生抑制を示した。
【実施例１】
【００５６】
リポポリサッカライド（Ｅ． ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ社製）を用いて発症させた炎症モデルマウスを用い、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α生成の亢進が、本発明のペプチド製剤で抑制されること確認した。
まず、実験１〜６で得られたペプチド（配列番号８）をＰＢＳに溶解し、濃度０．２５μｇ／ｍｌの澄明な溶液とした。これを、０．２２μｍの口径のフィルター（ミリポア社製）でろ過し、ペプチド製剤を作製した。
実験用に、８週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールス・リバー社製）１８匹を準備した。そのうちの６匹に、このペプチド製剤を、ペプチドとして５μｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与した（ペプチド投与群）。１０分後、ペプチド投与群の６匹と他の６匹（対照群）の計１２匹に、リポポリサッカライド溶液１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に単回投与した。一方、ペプチド溶液及びＬＰＳ溶液のいずれも投与しなかったマウス６匹を正常群とした。
ペプチド溶液を投与してから２時間後に炭酸ガス麻酔下で腹部大動脈より採血してＥＤＴＡ加血漿を得た。この血漿中の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）値を測定し、それぞれ平均±標準誤差を算出した。ＴＮＦ−α値に関する統計学的解析は、正常群に対する対照群と対照群に対するペプチド投与群の効果について、それぞれスチューデントのｔ検定（Ｅｘｃｅｌ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を行った。その結果を図２２に示した。
図２２に示されるように、対照群では、正常群と比較して血漿中のＴＮＦ−α値の増加が顕著に認められた。しかし、対照群で認められたＴＮＦ−α値の増加は、ペプチド製剤投与群では顕著に抑制された。ペプチド投与群において、ペプチド投与によると思われる副作用は見られなかった。
【実施例２】
【００５７】
λ−Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎを用いて発症させたカラゲニン誘発足蹠浮腫モデルを用い、血漿由来ヒトアポリポプロテインＡＩＩ（ｐＡＰＯ）及びアポリポプロテインＡＩＩの断片ペプチド（配列番号８）の浮腫抑制効果について検討した。
５週齢の雄性ＩＣＲマウス（日本チャールス・リバー社製）１６匹を準備し、そのうち１２匹に生理食塩液で１．０ｗ／ｖ％に調製したλ−Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ（和光純薬社製）溶液を、左後肢の足蹠に５０μＬ／足の用量で局所投与し、足蹠浮腫モデルを誘発させた。この１２匹中、４匹はλ−Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ溶液投与３０分前に、ｐＡＰＯの生理食塩溶液をｐＡＰＯとして４ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内単回投与し（ｐＡＰＯ群）、別の４匹には配列番号８の生理食塩溶液を、ペプチドとして５μｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に単回投与した（ペプチド群）。又別の４匹には、λ−Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ以外何も投与せず対照群とした。残る４匹については、何も投与せず、正常群とした。これら１６匹について、λ−Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ投与前及び投与１、３、５及び７時間後に左後肢の足根関節部腫脹をノギスで測定し、それぞれ平均±標準誤差を算出した。その結果を図２３に示した。
図２３に示したとおり、対照群では左後肢の腫脹が顕著に認められた。これに対し、ｐＡＰＯ群では５時間目より抑制効果が見られたが、ペプチド群では１時間目より明らかな抑制効果が見られ、７時間目まで効果が持続したことから、配列番号４、配列番号５或いは配列番号２２のアミノ酸を含む本配列番号８のペプチドにおいて、炎症性疾患症状の効果的な軽減が確認され、その効果は、断片ペプチドより投与量の多かった血漿由来ヒトアポリポプロテインＡＩＩに比べ、驚く程度に勝っていた。
【実施例３】
【００５８】
「マウスＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた試験：ＩＦＮ−γ産生」
ペプチド（配列番号４、１１及び１４）の生理活性は、コンカナバリンＡ刺激下、ＩＦＮ−γの産生量を測定し、無作用であるＰＢＳでの産生量と比較し、ＩＦＮ−γ産生抑制活性として評価した。同様に配列番号１も実施した。
すなわち、Ｂａｌｂ／ｃマウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞を取得した。脾臓細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（ベクトンディッキンソン社）で処理し、ＦＩＴＣビーズ（ミルテニー社）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を単離した。９６穴プレートに１×１０６／ｗｅｌｌ（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）で播種後、種々の濃度のペプチド、もしくは溶媒コントロールのＰＢＳを５０ｕＬ／ｗｅｌｌで添加し、刺激としてコンカナバリンＡを終濃度１μｇ／ｍＬとなるように５０ｕＬ／ｗｅｌｌで加え３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。その後、培養上清中のＩＦＮ−γを特異的なＥＬＩＳＡ（Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ； Ｒ&Ｄ社製）にて測定した。
その結果を表５、表６に示す。
【００５９】
【表５】
【００６０】
【表６】
表５に示されるように、配列番号４で８％、配列番号１１で１２％及び配列番号１４で１８％までのＩＦＮ−γ産生抑制を示した。また、表６に示されるように、配列番号４では０．２５〜１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にて用量依存的なＩＦＮ−γ産生抑制を示した。
【実施例４】
【００６１】
「ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた試験：細胞増殖」
ペプチド（配列番号１０、１１、１３、１５、２０及び２２）の生理活性は、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激下、細胞増殖活性を測定し、無作用であるＰＢＳでの産生量と比較し、細胞増殖抑制活性として評価した。同様に配列番号１も実施した。
すなわち、ヒト血中よりＣＤ４陽性Ｔ細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニー社）で単離した。抗ヒトＣＤ３抗体固相化９６穴プレートに５×１０４／ｗｅｌｌ（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）で播種後、種々の濃度のペプチド、もしくは溶媒コントロールのＰＢＳを５０ｕＬ／ｗｅｌｌで添加し、さらに刺激として抗ヒトＣＤ２８抗体を終濃度５ μｇ／ｍＬとなるように５０ｕＬ／ｗｅｌｌで加え３７℃、５％ＣＯ２条件下で９６時間培養した。その後、培養上清液にて細胞増殖活性をＷＳＴ−１法（Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ−１ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ； タカラバイオ社製）にて測定した。
その結果を表７、表８に示す。
【００６２】
【表７】
【００６３】
【表８】
表７に示されるように、配列番号１１で９％、配列番号２０で１１％、配列番号１５で１２％及び配列番号１０で１４％までの細胞増殖抑制活性を示し、その他のペプチドも配列番号１に比べ細胞増殖抑制活性を示した。また、表８に示されるように、配列番号１３では０．０３１２５〜０．１２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にて用量依存的な細胞増殖抑制活性を示した。
【実施例５】
【００６４】
「マウスＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた試験：ＩＬ−２産生」
ペプチド（配列番号４、５、６、１１及び１４）の生理活性は、コンカナバリンＡ刺激下、ＩＬ―２の産生量を測定し、無作用であるＰＢＳでの産生量と比較し、ＩＬ−２産生抑制活性として評価した。同様に配列番号１も実施した。
すなわち、Ｂａｌｂ／ｃマウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞を取得した。脾臓細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（ベクトンディッキンソン社）で処理し、ＦＩＴＣビーズ（ミルテニー社）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を単離した。９６穴プレートに１×１０６／ｗｅｌｌ（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）で播種後、種々の濃度のペプチド、もしくは溶媒コントロールのＰＢＳを５０ｕＬ／ｗｅｌｌで添加し、刺激としてコンカナバリンＡを終濃度１μｇ／ｍＬとなるように５０ｕＬ／ｗｅｌｌで加え３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。その後、培養上清中のＩＬ−２を特異的なＥＬＩＳＡ（Ｍｏｕｓｅ ＩＬ−２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ； Ｒ&Ｄ社製）にて測定した。
その結果を表９、表１０に示す。
【００６５】
【表９】
【００６６】
【表１０】
表９に示されるように、配列番号４、５及び１１で１８％までのＩＬ−２産生抑制を示し、その他のペプチドも配列番号１に比べＩＬ−２産生抑制を示した。また、表１０に示されるように、配列番号１４では０．２５〜１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にて用量依存的なＩＬ−２産生抑制を示した。
【実施例６】
【００６７】
「ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた試験：ＩＬ−２産生」
ペプチド（配列番号５、７、１０、１１、１４、１６、１７、１８、１９及び２１）の生理活性は、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激下、ＩＬ―２の産生量を測定し、無作用であるＰＢＳでの産生量と比較し、ＩＬ−２産生抑制活性として評価した。同様に配列番号１も実施した。
すなわち、ヒト血中よりＣＤ４陽性Ｔ細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニー社）で単離した。抗ヒトＣＤ３抗体固相化９６穴プレートに５×１０４／ｗｅｌｌ（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）で播種後、種々の濃度のペプチド、もしくは溶媒コントロールのＰＢＳを５０ｕＬ／ｗｅｌｌで添加し、さらに刺激として抗ヒトＣＤ２８抗体を終濃度５ μｇ／ｍＬとなるように５０ｕＬ／ｗｅｌｌで加え３７℃、５％ＣＯ２条件下で９６時間培養した。その後、培養上清中のＩＬ―２を特異的なＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ ＩＬ−２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ； Ｒ&Ｄ社製）にて測定した。
その結果を表１１、表１２に示す。
【００６８】
【表１１】
【００６９】
【表１２】
表１１に示されるように、配列番号１１で０％、配列番号１０で４％、配列番号１８で８％及び配列番号１７で１４％までのＩＬ−２産生抑制を示し、その他のペプチドも配列番号１に比べＩＬ−２産生抑制を示した。また表１２に示されるように、配列番号１１では０．０６２５〜０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にて用量依存的なＩＬ−２産生抑制を示した。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
炎症性サイトカインの産生、ケモカイン産生或いはＴ細胞増殖を伴う炎症性疾患の患者に対し、少量の本ペプチドを用いることで、副作用の伴わない予防・治療が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号２）
【図２】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号３）
【図３】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号４）
【図４】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号５）
【図５】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号６）
【図６】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号７）
【図７】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号８）
【図８】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号９）
【図９】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１０）
【図１０】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１１）
【図１１】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１２）
【図１２】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１３）
【図１３】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１４）
【図１４】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１５）
【図１５】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１６）
【図１６】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１７）
【図１７】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１８）
【図１８】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１９）
【図１９】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号２０）
【図２０】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号２１）
【図２１】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号２２）
【図２２】ＬＰＳ誘発炎症モデルマウスにおけるＴＮＦ−α測定結果
【図２３】カラゲニンによる浮腫誘発モデルマウスのペプチドによる抑制効果
【符号の説明】
【００７２】
図２２における符号
＊＊：ｐ<０．０１（正常群に対して）
＃＃：ｐ<０．０１（対照群に対して）
図２３における符号
○：正常群、●：対照群、×：ｐＡＰＯ群、◆：ペプチド群
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性サイトカインの産生の抑制、ケモカイン産生の抑制或いはＴ細胞の増殖を抑制するペプチド又はその改変体及びそれを含有する炎症性疾患予防・治療剤である。更にいえば本発明は、ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩのアミノ酸配列において抗炎症性の作用部位を持つペプチド又はその改変体及びそれを含有する炎症性疾患予防・治療剤である。
【背景技術】
【０００２】
炎症性サイトカインの産生、ケモカイン産生或いはＴ細胞の増殖に重要な役割を果たしているのは免疫担当細胞である。血中・骨髄中などに存在するリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、好中球など）や脳、肝臓などの様々な臓器に常在する細胞（マクロファージ、樹状細胞、血管内皮細胞、組織の実質細胞など）などの免疫応答に関わる全ての細胞が免疫担当細胞であり、これらの細胞から免疫応答を活性化する液性因子としてサイトカイン、ケモカインや各種炎症性物質などが分泌される。また液性因子の他に細胞間相互作用により効果を発揮する細胞性免疫も活性化される。
【０００３】
免疫系活性化の端的な現象としての炎症は、細菌感染や化学作用、物理作用により身体組織が傷害を受けた時に免疫系が働き、それによって腫れや痛み、発熱などを起こすなどの生体防御反応によって生体に出現した症候である。このような炎症部位では様々な炎症性サイトカイン、ケモカインが産生され、炎症部位に多くのリンパ球が浸潤する。主な炎症性サイトカインとして、ＴＮＦ−αがあるが、このほかに、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１などもよく知られている。また、抗原によってリンパ球が活性化された場合には、リンパ球の中の１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１細胞）がインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）などのサイトカインを産生し、産生されたＩＬ−２及びＩＦＮ−γによって、リンパ球、特にＴ細胞が増殖及び分化することが知られている。
【０００４】
ＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）は単球走化活性因子（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：ＭＣＡＦ）とも呼ばれ、その構造的及び機能的類似点より、ＩＬ−８とファミリーを構成する。単球特異的遊走活性及び好酸球ヒスタミン遊離作用等を有し、炎症や生体防御等に深く関与していると考えられる。特に、単球の走化及び活性化作用から、各種の炎症、自己免疫疾患、動脈硬化や腫瘍などへの関与が、また、好塩基球活性化作用から、アレルギー反応への関与が推測されている。
【０００５】
ＭＣＰ−１は単球及びマクロファージに作用して、炎症局所への走化性の亢進と活性化を促す役割を担っており、いくつかの炎症反応の進展に関わっていると考えられている。従って、ＭＣＰ−１の作用を抑制する物質がこれら炎症反応の予防或いは治療に役立つと考えられ、ＭＣＰ−１に対するモノクローナル抗体（特許文献１）、抗体フラグメント（特許文献２）、レセプタータンパク質（特許文献３）が報告されている。しかし、ＭＣＰ−１の作用を抑制する物質は、臨床にはまだ使用されていない。
【０００６】
ＴＮＦ−αは、主にマクロファージから産生され、好中球、線維芽細胞、リンパ球（Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、肥満細胞などからも産生されて、腫瘍細胞を障害する（抗腫瘍効果）が、内因性発熱物質でもある。低濃度のＴＮＦ−αは、血管内皮細胞に作用し、接着分子の発現を増強し、ＩＬ−１、ＩＬ−６などのサイトカインの産生を促進させる。高濃度のＴＮＦ−αは、肝臓で、急性期蛋白質の産生を促進し、ＩＦＮ−α産生を抑制する。
【０００７】
ＴＮＦ−αは、何らかの原因によって過剰に生産され続けるとリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、２型糖尿病などさまざまな疾病を引き起こす。そのため、このような病気に罹患した患者に対してＴＮＦ−αなど炎症性サイトカインの産生を抑制する薬剤が開発されており、イブプロフェンやインドメタシン等既存の抗炎症剤の他、サリドマイド誘導体（非特許文献１参照）、ピラゾロン誘導体（非特許文献２参照）、スベリヒユ科植物のアルカロイド（特許文献４参照）、プロテオグリカン（特許文献５参照）、ＨＤＬ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びアポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（特許文献６参照）などが報告されている。
【０００８】
最近では、炎症性サイトカインの作用を抑えることによってリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、２型糖尿病等の炎症性疾患を治癒するめにＴＮＦ−α阻害薬が開発され、治療に大きく貢献している。しかしその一方で、ＴＮＦ−αモノクロール抗体製剤では、点滴後アナフィラキシー様症状（発熱、呼吸困難、気管支痙攣、血圧低下、血管浮腫、チアノーゼ、蕁麻疹）の発現や、投与後３日以上経過したあとに重篤な遅効性過敏症（筋肉痛、発疹、発熱、掻痒、浮腫、蕁麻疹）の発現が見られることがあり、さらに重要な副作用として、免疫を強力に抑制するので感染症（敗血症、真菌感染症を含む日和見感染症）に罹患しやすくなる。
【０００９】
ＩＬ−２は、主としてＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）が分泌するサイトカインで、１３３個のアミノ酸よりなる。ＩＬ−２はＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）とも呼ばれ、Ｔ細胞を増殖させるが、ＩＬ−２はＴ細胞ばかりでなく、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球等にも作用を及ぼすことが知られている。そして、これら細胞の細胞表面にはＩＬ−２受容体が発現おり、免疫及び炎症反応の重要な調節因子である。
ＩＬ−２産生抑制により、慢性関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、乾癬及び組織移植片の拒絶反応などの疾患状態で治療効果を示すことが予想される。
【００１０】
ＩＦＮ−γは、活性化されたＴ細胞で産生され免疫系と炎症反応に対して調節作用を有し、多くの疾患で組織中や血液中に検出される。ＩＦＮ−γが病態形成に強く関与していると考えられる疾患には、ウィルス感染症、ウィルス以外の微生物による感染症、慢性関節リウマチ、ＳＬＥ等の膠原病、動脈硬化、糖尿病、劇症肝炎、悪性腫瘍、川崎病等が挙げられる
【００１１】
Ｔ細胞はリンパ球の一種で、骨髄で生産された前駆細胞が胸腺での選択を経て分化成熟したものである。正常なＴ細胞は哺乳動物の免疫応答の不可欠な部分であるが、Ｔ細胞の異常な増殖により、病態が発症する場合がある。例えば、自己免疫疾患として、全身性狼瘡エリテマトーデス、慢性関節リウマチ及び多発性硬化症がある。Ｔ細胞は免疫応答の不可欠な部分である。したがって、Ｔ細胞増殖の抑制を目的とする治療法は自己免疫疾患を治療するために非常に望ましい。
【００１２】
ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩは人の血液中に常在する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要な構成成分であり、その化学構造はすでに明らかにされていて、配列番号１に示した７７個のアミノ酸からなるポリペプチドである。このヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩは、ＨＤＬ中では通常第６残基目のシステインでジスルフィド結合したダイマーとして存在することが知られている（非特許文献３）。
【００１３】
ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩの活性部位として、Ｎ末端から数えて１７番目から３０番目（１７−３０）までのアミノ酸配列及び５１番目から６０番目（５１−６０）までのアミノ酸配列を有するペプチドが知られている（特許文献７）。しかし、その他活性部位についての具体的な記載はなく、抗炎症又はサイトカインを抑制するアミノ酸配列についてもなんらの記載もない。また、ウシアポリポタンパク質Ａ−ＩＩについては、抗菌活性（特許文献８参照）について記載されている。ウシアポリポタンパク質Ａ−ＩＩ，ウシアポリポタンパク質Ａ−ＩＩフラグメント及びヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩについては、線維芽細胞増殖活性（特許文献９参照）を示すとの記載はあるが、抗炎症又はサイトカインを抑制するアミノ酸配列についてはなんらの記載もない。
【００１４】
炎症を抑制するペプチドとして、アポリポタンパク質Ａ−Ｉのフラグメント（特許文献６参照）、ＴＮＦやＩＬ−６等サイトカインを抑制するペプチド（特許文献１０）、ケモカインレセプターＣＣＲ３のアンタゴニストポリペプチド（特許文献１１）、ＡｐｏＥ受容体結合ペプチド（特許文献１２）等が知られているが、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩのフラグメントでの知見はない。
【特許文献１】特許第３９２０２１５号公報
【特許文献２】ＷＯ２００４／０２４９２１号公報
【特許文献３】特開平９−２３８６８８号公報
【特許文献４】特開２００３−２６５８６号公報
【特許文献５】特開２００７−１３１５４８号公報
【特許文献６】特表２００４−５００１０５号公報
【特許文献７】ＷＯ８７／０２０６２号公報
【特許文献８】特許第３７３４８８５号公報
【特許文献９】特許第３９１３５３７号公報
【特許文献１０】特開２００４−１９６７０７号公報
【特許文献１１】特開２００１−２９０７９号公報
【特許文献１２】特表２００５−５１１５１４号公報
【非特許文献１】Ｓ． Ｎｉｗａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ３９， ３０４４−３０４５， １９９６
【非特許文献２】Ｍ．Ｐ． Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ４７， ２７２４−２７２７， ２００４
【非特許文献３】Ｔｈｅ Ｌｉｐｉｄ Ｖｏｌ．２， Ｎｏ．３ ２４３−２４９， １９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明課題は、ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩのアミノ酸配列中の抗炎症性作用部位を持つペプチドを含む副作用のない炎症性疾患の治療、予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、７７個のアミノ酸からなるヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（配列番号１）のアミノ酸配列からの種々の断片ペプチドを調製し、それぞれの各種生理学的特性を精査した結果、ある特定のペプチド断片が抗炎症性を有することを見いだし、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）配列番号２に記載のペプチドおいて、８個〜３０個の連続したアミノ酸からなるペプチド又はその改変体を含んでなる炎症性疾患予防・治療剤。
（２）８個〜３０個の連続したアミノ酸からなるペプチド又はその改変体がＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−２の産生抑制、もしくはＴ細胞の増殖を抑制するものである（１）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（３）８個〜３０個の連続したアミノ酸からなるペプチドが配列番号２３のペプチドを含むものである（１）又は（２）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（４）配列番号２に記載のペプチドにおいて、配列番号４又は配列番号５のペプチドを含む２０〜３０個の連続したアミノ酸からなる（１）又は（２）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（５）ペプチドの改変体が、１つ以上のアミノ酸の置換、１つ以上のアミノ酸の欠失、１つ以上のアミノ酸の付加、あるいはＳ−Ｓ結合の連結によりにより生成したものである（１）〜（４）のいずれかに記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（６）ペプチドの改変体が、Ｎ末端のアセチル化又はピロ化或いはＣ末端のアミド化により生成したものである（１）〜（４）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（７）１つ以上のアミノ酸の置換が、アスパラギン或いはセリンからアラニンに置換されたものである（５）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（８）１つ以上のアミノ酸の置換が、Ｌ体のアミノ酸からＤ体のアミノ酸への置換により生成したものである（５）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（９）１つ以上のアミノ酸の付加が、極性アミノ酸によりなされたものである（５）記載の炎症性疾患予防・治療剤
（１０）極性アミノ酸の付加が、スペーサーアミノ酸を介してなされたものである（９）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（１１）炎症性疾患が、炎症時に炎症性サイトカイン、ケモカイン或いはＴ細胞の増加を伴うものである（１）記載の炎症性疾患予防・治療剤。
（１２）炎症性サイトカイン、ケモカイン或いはＴ細胞の増加を伴う疾患が、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、全身性脈管炎、細菌性骨髄炎、皮膚炎、乾癬、糖尿病、肝炎、リウマチ、感染又は自己免疫疾患に伴う神経障害、神経因性疼痛、虚血再環流障害、脳炎、ギラン・バレー症候群、パーキンソン病、動脈硬化症、代謝症候群（メタボリックシンドローム）、心不全、心筋症、心筋梗塞、脳梗塞、クローン病、移植片体宿主疾患又は移植拒絶反応からなる疾患である（１１）に記載の炎症性疾患予防・治療剤。
である。
【００１７】
上記記載の各ペプチドは、「固相法」又は「液相法」として知られるペプチド合成法により、調製することができる。例えば、社団法人日本生化学会編集『生化学実験講座』、第１巻、「タンパク質ＩＶ」、第２０７〜４９５頁、１９７７年、東京化学同人発行及び社団法人日本生化学会編集『新生化学実験講座』、第１巻、「タンパク質ＶＩ」、第３〜７４頁、１９９２年、東京化学同人発行などにはペプチド合成の詳細が記載されている。また、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトオキシカルボニル）固相合成法を用いてペプチド合成機にて合成することができる。すなわち、合成する各ペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸が導入されているＦｍｏｃアミノ酸を樹脂に結合させ、（Ｉ）Ｆｍｏｃ基の脱保護と洗浄、（ＩＩ）Ｆｍｏｃアミノ酸の縮合と洗浄、の操作を繰り返してペプチド鎖を延長し、最後に最終脱保護反応させて、目的とするペプチドを合成することができる。
【００１８】
本発明のペプチドは化学合成により調製されたものに限定されず、例えば、上記（１）〜（１３）に記載されたペプチドを生産する場合には、細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、該ペプチドをコードしたポリヌクレオチドを組換え作製した発現ベクターを用いてよい。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養し、この培養物から目的のペプチドを単離、精製することによりこの発明のペプチドを採取してもよい。宿主として、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞などを適宜用いてもよい。
【００１９】
この発明のペプチドは、単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどのペプチド又は蛋白質を精製するための方法が用いられ、必要に応じて、これら方法を適宜組合せてもよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したペプチドを濃縮、また必要に応じてさらに凍結乾燥して、液状又は固状にすればよい。
【００２０】
さらに、本発明のペプチドは、通常当業者の技術常識に従ってアミノ酸の置換、欠失、或いは付加を行うことができる。すなわち、電荷密度、疎水性、親水性、サイズ及び形状などの物理的性質の公知の類似性に基づき改変が可能となる。
【００２１】
たとえば、個々のアミノ酸を置換する場合、ＬｅｕをＳｅｒに、又はその逆にＳｅｒをＬｅｕに置換することができ、ＴｈｒをＳｅｒ（又はその逆）に置換することが可能である。
【００２２】
また、ペプチドのＣ末端をアミド化、Ｎ末端のアセチル化などの修飾によってペプチドの両末端の電荷を打ち消して安定なものにすることもできる。また標的となる細胞の膜透過性向上やペプチドの溶解性向上のため、１個ないし複数個のアルギニンやリジン等の親水性アミノ酸をペプチドに直接付加、又はスペーサーとなるアミノ酸を介して本ペプチドに付加することもできる。このスペーサーとなるアミノ酸として、プロリンやグリシン等が用いられる。
【００２３】
また、システイン残基間のＳ−Ｓ結合を利用したペプチドの環状化、二量体化することによりペプチドの安定性及び活性の向上に有用な場合がある。また、グルタミンがペプチドのＮ末端にある場合にカルボキシル基とアミノ基の分子内縮合によりピロ化してピログルタミン酸に変化することがあり、その場合は、グルタミンの代わりにピログルタミン酸を付加することもできる。
【００２４】
本発明のペプチドは、そのままで或いは公知の薬学的に許容される担体や賦形剤等と混合した医薬組成物として経口又は非経口的に投与することができる。
本発明のペプチドを含む薬剤の形態のとしては、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、軟こう剤、硬膏剤、パップ剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、注射剤などが挙げられる。
【００２５】
本発明のペプチドの投与量は、患者の年令や疾患の程度により異なるが、一般には経口投与の場合には１日当たり０．１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは５μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、静脈内、筋肉内或いは皮下投与の場合には１日当たり０．１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５μｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。投与回数は、経口投与で１日１〜３回、注射では１日１〜２回に分けて投与することができる。
【００２６】
本発明のペプチドは通常の方法に従って製剤化することができる。例えば、賦形剤、補形剤、希釈剤、香味剤、香料、甘味剤、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、界面活性剤、基剤、溶剤、充填剤、増量剤、溶解補助剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩壊剤、噴射剤、保存剤、抗酸化剤、遮光剤、保湿剤、帯電防止剤、無痛化剤などを組合せて用い、製剤として製造することができる。
【００２７】
本発明のペプチドの投与経路は、経口、非経口と特に制限はないが、静脈投与、筋肉投与、皮下投与、皮内投与、経肺・経鼻などの粘膜投与等の非経口投与が好ましい。
【００２８】
本発明による炎症性疾患の予防・治療剤を、注射剤として製する場合には、常法に従い、精製されたペプチドの一定量に、例えば注射用水、生理食塩液、或いはＰＢＳ（０．１Ｍリン酸緩衝食塩水）などを加えて溶解又は均一に懸濁させるか、薬理的に許容される天然／又は合成の界面活性剤（たとえばレシチン類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ひまし油類など）を添加して分散剤とするか、所望により基材油脂を加えたものを乳化機を用いて乳化分散剤とする。さらに、これらには必要に応じて溶解補助剤（安息香酸ベンジル等）、アルコール類（一価或いはポリエチレングリコールなどの多価いずれでも良い）、ブドウ糖やその他の等張化剤（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、アスコルビン酸などの酸化防止剤などと配合してもよい。
このようにして得られた薬液は、必要に応じて除菌フィルターでろ過して無菌の薬液とし、通常適当なアンプル等に無菌的に充填して製剤とするか、必要に応じてバイアルに充填し、乾燥させた用事溶解製剤として医療の場に供する事ができる。
【００２９】
また、前項に記載した成分から、噴霧剤に適した安定剤、保存剤などの添加剤成分を選択し、吸収促進剤、帯電防止剤などをさらに添加し、液状或いは乾燥微粉末としてよい。局所への噴霧にあたり、液状噴霧剤とするか又は経肺投与或いは経鼻投与に適した粒子サイズの微粉末又は乾燥固体として適宜剤形を選択することができる。
【００３０】
ペプチドは、投与されるとしばしば体内循環から速やかに除去されるので、比較的短時間においてのみその薬理学的活性を示すこととなる。従って、治療に有効とする状態を維持するためには、生物活性のある物質を比較的大量且つ多回に投与することが好ましい。ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールの共重合体、及びポリプロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、又はポリプロリンのような水溶性ポリマーを共有結合させてそれを修飾した物質は、対応する未修飾の物質と比べて、静脈内投与後の血中においてより長い半減期を示すことが知られている。このような修飾は、水溶液への物質の溶解度を増大させ、凝集を阻止し、物質の物理的及び化学的安定性を増大させ、物質の免疫原性及び反応性も著しく減少させる場合がある。その結果、未修飾の物質に比べてより少ない投与回数で、或いはより少ない用量で、このようなポリマー物質付加体を投与することによって、所望のインビボ生物活性を達成することができる。
【００３１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、毒性が低いことから、それを結合させることは特に有用である。また、ＰＥＧを結合すると、異種性化合物の免疫原性及び抗原性を効果的に減少できることがある。ペプチドのアミノ基と反応させるのに有用なＰＥＧ試薬としは、分子量２０００〜３００００までの高純度のものだけでなく、メトキシＰＥＧアミン、マレイミド、カルボン酸などの活性化ＰＥＧ誘導体も存在し、これらＰＥＧを結合するために用いてもよい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の炎症性疾患予防・治療剤の有効物質は、ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＩのアミノ酸配列において抗炎症性の作用部位を持つペプチド又はその改変体であり、副作用がないか又は殆ど副作用がなく、極めて安全で且つ確実な効果を発揮する炎症性疾患予防・治療剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下に実施例、実験例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００３４】
以下の実験例、実施例、試験例を通じて、アミノ酸の表示については、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アルギニン （Ａｒｇ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）と３文字表示とする。
実験例１（ペプチドの合成）
【００３５】
配列番号２〜２２のペプチドは、ペプチド自動合成機（４３３Ａ型：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、樹脂に固定したアミノ酸誘導体に、１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させていく方法（固相合成法）により合成した。
【００３６】
配列番号８で表されるペプチドを以下のようにして合成した。
ペプチドのＣ末端残基に相当するアミノ酸（Ａｌａ）が導入されているＦｍｏｃ−Ａｌａ−樹脂を上記ペプチド合成機の反応容器にセットし、合成機に添付されているソフトウエアーに従って、活性化剤として、１−［ビスジメチルアミノメチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウムー３−オキシドーヘキサフルオロホスフェイト（ＨＢＴｕ），１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解して反応槽に加えて反応させた。得られた樹脂をピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン中で緩やかに攪拌してＦｍｏｃ基を除いた。次にＣ末側から２番目のアミノ酸（Ｐｒｏ）を繋ぐため、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨに先と同様の試薬を加えて活性化したものと、先のＦｍｏｃ基を除いた樹脂に結合しているアミノ酸に反応させた。ここで生成したＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−樹脂から再びＦｍｏｃ基を除き、同様の方法で活性化させたＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ／ＰｙＢＯＰ溶液と反応させ、Ｃ末側から３番目までのアミノ酸を含むＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｌａ−樹脂を合成した。
【００３７】
さらに逐次同様の操作で各アミノ酸を付加し、目的とする保護ペプチド樹脂
（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｌａ−樹脂）を合成した。
【００３８】
なお、ペプチド合成に使用したアミノ酸は以下に示したものを用いた。これらのアミノ酸は、Ｌ体又はＤ体が用いられ、アセチル化、ピロ化等の修飾したアミノ酸も用いられた。
（ ）内は残基部分の反応基を保護する保護基を表す。：
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ 、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）− ＯＨ、 Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ 、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ
【００３９】
上記説明において使用されている略語の意味は以下の通りである。：
Ｔｒｔ＝トリチル、
Ｐｂｆ＝Ｎ−２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンンゾフランー５−スルフォニル、
Ｂｏｃ＝ｔ−ブトキシカルボニル、
ｔＢｕ＝ｔｅｒｔ−ブチル、
ＯｔＢｕ＝ｔｅｒｔ−ブトキシ
ＨＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾルー１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムーヘキサフルオロホスフェイト
【００４０】
まず、上記のように合成し得られた保護ペプチド樹脂（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｌａ−樹脂）のピペリジン処理で、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を脱保護した。
【００４１】
次にＮ−メチル−２−ピロリジノンにて洗浄後、メチレンクロライドにて洗浄し、さらに窒素ガスを吹き付けることにより乾燥させた。
樹脂を取り出し、クリベージ溶液を加え、反応させることにより側鎖保護基の除去と樹脂からのペプチドの切り出しを行い、配列番号８に記載のペプチドからなる粗ペプチドをエーテル沈殿とした後、沈殿をろ取した。
【００４２】
また、配列番号８以外の配列番号２〜２２に記載のペプチドを含む粗ペプチド溶液についても、これらと同様の操作を行って調製した。また、Ｄ体ペプチドはＤ体のアミノ酸を用いた。
実験例２（ペプチドの精製）
【００４３】
実験例１で得た粗ペプチド溶液を、ＯＤＳカラム（ＹＭＣ ＯＤＳ， ３０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し、配列番号２〜２２に記載のアミノ酸配列を有するトリフルオロ酢酸塩体ペプチドを得た。
実験例３（Ｃ末端アミドペプチドの作製）
【００４４】
４８−６７（Ｃ末端アミドペプチド）番のペプチド（配列番号１１）で表されるペプチドの合成を以下のようにした。実施例１と同じペプチド自動合成機を用いてＣ端末アミド作製用 Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡを出発樹脂単体とし、Ｃ端末から配列に従って各Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として逐次ペプチド鎖の延長を行った。合成し得られた保護ペプチド樹脂にピペリジン処理によりＮ末端Ｆｍｏｃ基を脱保護し、続いてトリフルオロ酢酸を用いて、側鎖保護基の除去と樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド溶液を得た。実験例２と同様に精製し、配列番号１１のトリフルオロ酢酸塩体ペプチドを得た。配列番号１１以外の配列番号１２、１３、１５、２０、２２に記載のペプチドを含む粗ペプチド溶液についても、これらと同様の操作を行って調製した。
実験例４（ジスルフィド結合型環状化ペプチドの作製）
【００４５】
配列番号１２で表されるペプチドの合成を以下のようにした。実施例１と同じペプチド自動合成機を用いてＣ末端がアミドの場合はＣ端末アミド作製用 Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡを出発樹脂単体とし、Ｃ端末から配列に従って各Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として逐次ペプチド鎖の延長を行った。合成し得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸を用いて側鎖保護基の脱保護と樹脂からの切り出しを行った。得られた粗ペプチド溶液を５０％酢酸水溶液とし、ヨウ素水溶液を混ぜて反応させジスルフィド結合型環状化ペプチドとした。環状化の進行を高速液体クロマトグラフにて確認後、実験例２と同様に精製し、配列番号１２のトリフルオロ酢酸塩体ペプチドを得た。配列番号１２以外の配列番号１３及び１６に記載のペプチドを含む粗ペプチド溶液についても、これらと同様の操作を行って調製した。
実験例５（ジスルフィド結合型二量体ペプチドの作製）
【００４６】
配列番号２１で表されるペプチドの合成を以下のようにした。実施例１と同じペプチド自動合成機を用いてＣ末端がアミドの場合はＣ端末アミド作製用 Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡを出発樹脂単体とし、Ｃ端末から配列に従って各Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として逐次ペプチド鎖の延長を行った。合成し得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸を用いて側鎖保護基の脱保護と樹脂からの切り出しを行った。得られたチオール基遊離の粗ペプチド溶液を５０％酢酸水溶液とし、ヨウ素水溶液を混ぜて反応させジスルフィド結合型二量体ペプチドとした。二量化の進行を高速液体クロマトグラフにて確認後、実験例２と同様に精製し、配列番号２１のトリフルオロ酢酸塩体ペプチドを得た。配列番号２２に記載のペプチドを含む粗ペプチド溶液についても、これらと同様の操作を行って調製した。
実験例６（塩交換）
【００４７】
配列番号４及び１１で表されるペプチドについては、トリフルオロ酢酸塩体を酢酸水溶液に溶解し、ダウエックスイオン交換樹脂にて塩交換し酢酸塩体とした。
実験例７（ペプチドの純度）
【００４８】
実験例１〜６で取得したペプチドは、ＰＢＳにて溶解しペプチド溶液として、ＯＤＳカラム（ＹＭＣ ＯＤＳ， ４．６×１５０ｍｍ），（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３， ４．６×２５０ｍｍ）又は（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＰＲＥＰ ＯＤＳ， ４．６×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開し、吸光度２２０ｎｍを測定することにより純度を確認した。
その結果を次に示す。
配列番号２のペプチドは９６．８％、
配列番号３のペプチドは９５．９％、
配列番号４のペプチドは９７．９％、
配列番号５のペプチドは９８．７％、
配列番号６のペプチドは９２．１％、
配列番号７のペプチドは９５．４％、
配列番号８のペプチドは９４．２％、
配列番号９のペプチドは９５．９％、
配列番号１０のペプチドは９５．４％、
配列番号１１のペプチドは９９．６％、
配列番号１２のペプチドは９６．３％、
配列番号１３のペプチドは９７．６％、
配列番号１４のペプチドは９８．６％、
配列番号１５のペプチドは９８．９％、
配列番号１６のペプチドは９７．５％、
配列番号１７のペプチドは９８．４％、
配列番号１８のペプチドは９８．４％、
配列番号１９のペプチドは９５．０％、
配列番号２０のペプチドは９９．３％、
配列番号２１のペプチドは９９．２％、
配列番号２２のペプチドは９８．４％
上記の通り、いずれも高純度のペプチドが得られた。
配列番号２〜２２のぺプチドについて純度を測定したクロマトグラムを図１〜２１に示した。
【００４９】
ただし、配列番号１は国際公開番号ＷＯ／２００８／１３３２２５に準じて製造した。
実験例８（試験管内活性測定）
【００５０】
「ヒト単球様細胞株ＴＨＰ−１由来マクロファージを用いた試験：ＭＣＰ−１産生」
ペプチド（配列番号２、３、１０、１１、１２及び１３）の生理活性は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激下、ＭＣＰ−１の産生量を測定し、無作用であるＰＢＳでの産生量と比較し、ＭＣＰ−１産生抑制活性として評価した。同様に配列番号１も実施した。
すなはち、ヒト単球性細胞株ＴＨＰ−１を９６穴プレートに２×１０４／ｗｅｌｌ（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）で播種した、その際にホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を終濃度１００ｎＭで添加し３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。新たにＰＭＡ含有培地（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）と交換しさらに２４時間培養を行なった。細胞を洗浄後、別に実験例１〜６で取得したペプチドを、もしくは溶媒コントロールのＰＢＳを５０ｕＬ／ｗｅｌｌで添加し、刺激としてＬＰＳ（Ｅ． ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ社製）を終濃度０．１μｇ／ｍＬとなるように５０ｕＬ／ｗｅｌｌで加え３７℃、５％ＣＯ２条件下で９時間もしくは２４時間培養した。その後、培養上清中のＭＣＰ−１（Ｈｕｍａｎ ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ； Ｒ&Ｄ社製）を測定した。
結果を表１及び表２に示す。なお、以下の表における「値」は、ｎ＝２の平均値（％）である。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【表２】
表１に示されるように、配列番号１３で１５％及び配列番号１１で２２％までのＭＣＰ−１産生抑制を示し、その他のペプチドも配列番号１に比べＭＣＰ−１産生抑制を示した。また、表２に示されるように、配列番号３では０．０１〜０．１２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にて用量依存的なＭＣＰ−１産生抑制を示した。
【００５３】
実験例９（試験管内活性測定）
「ラットミクログリア細胞を用いた試験：ＴＮＦ−α産生」
ペプチド（配列番号５，７，８，９及び１１）の生理活性は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激下、ＴＮＦ−αの産生量を測定し、無作用であるＰＢＳでの産生量と比較し、ＴＮＦ−α産生抑制活性として評価した。同様に配列番号１も実施した。
すなわち、ラット新生児由来ミクログリア細胞を住友ベークライト社より購入し、同社Ｎｅｒｖｅ−Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ<ミクログリア>の培養方法に従い一週間ほど培養してから試験系に用いた。培養後ミクログリア細胞はミクログリア用細胞培養液（住友ベークライト社）に懸濁し、５×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ細胞培養用プレート（コーニング社）に播種して一夜培養した。培養液をミクログリア用試験液（住友ベークライト社）に交換し、別に実験例１〜６で取得したペプチドもしくは溶媒コントロールのＰＢＳを５０ｕＬ／ｗｅｌｌ添加し、最終濃度２５ｎｇ／ｍＬとなるようにＬＰＳ（Ｅ． ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ社製）を１５０ｕＬ／ｗｅｌｌ加えて３７℃、ＣＯ２インキュベーターで４時間培養した。上清を回収し、上清中のＴＮＦ−α（Ｒａｔ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ； Ｒ&Ｄ社製）を測定した。
その結果を表３、表４に示す。
【００５４】
【表３】
【００５５】
【表４】
表３に示されるように、配列番号８で０％、配列番号９で１％、配列番号７で１８％及び配列番号１１で１９％までのＭＣＰ−１産生抑制を示し、その他のペプチドも配列番号１に比べＴＮＦ−α産生抑制を示した。また、表４に示されるように、配列番号１１では０．０２５〜０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にて用量依存的なＴＮＦ−α産生抑制を示した。
【実施例１】
【００５６】
リポポリサッカライド（Ｅ． ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ社製）を用いて発症させた炎症モデルマウスを用い、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α生成の亢進が、本発明のペプチド製剤で抑制されること確認した。
まず、実験１〜６で得られたペプチド（配列番号８）をＰＢＳに溶解し、濃度０．２５μｇ／ｍｌの澄明な溶液とした。これを、０．２２μｍの口径のフィルター（ミリポア社製）でろ過し、ペプチド製剤を作製した。
実験用に、８週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールス・リバー社製）１８匹を準備した。そのうちの６匹に、このペプチド製剤を、ペプチドとして５μｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与した（ペプチド投与群）。１０分後、ペプチド投与群の６匹と他の６匹（対照群）の計１２匹に、リポポリサッカライド溶液１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に単回投与した。一方、ペプチド溶液及びＬＰＳ溶液のいずれも投与しなかったマウス６匹を正常群とした。
ペプチド溶液を投与してから２時間後に炭酸ガス麻酔下で腹部大動脈より採血してＥＤＴＡ加血漿を得た。この血漿中の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）値を測定し、それぞれ平均±標準誤差を算出した。ＴＮＦ−α値に関する統計学的解析は、正常群に対する対照群と対照群に対するペプチド投与群の効果について、それぞれスチューデントのｔ検定（Ｅｘｃｅｌ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を行った。その結果を図２２に示した。
図２２に示されるように、対照群では、正常群と比較して血漿中のＴＮＦ−α値の増加が顕著に認められた。しかし、対照群で認められたＴＮＦ−α値の増加は、ペプチド製剤投与群では顕著に抑制された。ペプチド投与群において、ペプチド投与によると思われる副作用は見られなかった。
【実施例２】
【００５７】
λ−Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎを用いて発症させたカラゲニン誘発足蹠浮腫モデルを用い、血漿由来ヒトアポリポプロテインＡＩＩ（ｐＡＰＯ）及びアポリポプロテインＡＩＩの断片ペプチド（配列番号８）の浮腫抑制効果について検討した。
５週齢の雄性ＩＣＲマウス（日本チャールス・リバー社製）１６匹を準備し、そのうち１２匹に生理食塩液で１．０ｗ／ｖ％に調製したλ−Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ（和光純薬社製）溶液を、左後肢の足蹠に５０μＬ／足の用量で局所投与し、足蹠浮腫モデルを誘発させた。この１２匹中、４匹はλ−Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ溶液投与３０分前に、ｐＡＰＯの生理食塩溶液をｐＡＰＯとして４ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内単回投与し（ｐＡＰＯ群）、別の４匹には配列番号８の生理食塩溶液を、ペプチドとして５μｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に単回投与した（ペプチド群）。又別の４匹には、λ−Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ以外何も投与せず対照群とした。残る４匹については、何も投与せず、正常群とした。これら１６匹について、λ−Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ投与前及び投与１、３、５及び７時間後に左後肢の足根関節部腫脹をノギスで測定し、それぞれ平均±標準誤差を算出した。その結果を図２３に示した。
図２３に示したとおり、対照群では左後肢の腫脹が顕著に認められた。これに対し、ｐＡＰＯ群では５時間目より抑制効果が見られたが、ペプチド群では１時間目より明らかな抑制効果が見られ、７時間目まで効果が持続したことから、配列番号４、配列番号５或いは配列番号２２のアミノ酸を含む本配列番号８のペプチドにおいて、炎症性疾患症状の効果的な軽減が確認され、その効果は、断片ペプチドより投与量の多かった血漿由来ヒトアポリポプロテインＡＩＩに比べ、驚く程度に勝っていた。
【実施例３】
【００５８】
「マウスＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた試験：ＩＦＮ−γ産生」
ペプチド（配列番号４、１１及び１４）の生理活性は、コンカナバリンＡ刺激下、ＩＦＮ−γの産生量を測定し、無作用であるＰＢＳでの産生量と比較し、ＩＦＮ−γ産生抑制活性として評価した。同様に配列番号１も実施した。
すなわち、Ｂａｌｂ／ｃマウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞を取得した。脾臓細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（ベクトンディッキンソン社）で処理し、ＦＩＴＣビーズ（ミルテニー社）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を単離した。９６穴プレートに１×１０６／ｗｅｌｌ（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）で播種後、種々の濃度のペプチド、もしくは溶媒コントロールのＰＢＳを５０ｕＬ／ｗｅｌｌで添加し、刺激としてコンカナバリンＡを終濃度１μｇ／ｍＬとなるように５０ｕＬ／ｗｅｌｌで加え３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。その後、培養上清中のＩＦＮ−γを特異的なＥＬＩＳＡ（Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ； Ｒ&Ｄ社製）にて測定した。
その結果を表５、表６に示す。
【００５９】
【表５】
【００６０】
【表６】
表５に示されるように、配列番号４で８％、配列番号１１で１２％及び配列番号１４で１８％までのＩＦＮ−γ産生抑制を示した。また、表６に示されるように、配列番号４では０．２５〜１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にて用量依存的なＩＦＮ−γ産生抑制を示した。
【実施例４】
【００６１】
「ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた試験：細胞増殖」
ペプチド（配列番号１０、１１、１３、１５、２０及び２２）の生理活性は、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激下、細胞増殖活性を測定し、無作用であるＰＢＳでの産生量と比較し、細胞増殖抑制活性として評価した。同様に配列番号１も実施した。
すなわち、ヒト血中よりＣＤ４陽性Ｔ細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニー社）で単離した。抗ヒトＣＤ３抗体固相化９６穴プレートに５×１０４／ｗｅｌｌ（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）で播種後、種々の濃度のペプチド、もしくは溶媒コントロールのＰＢＳを５０ｕＬ／ｗｅｌｌで添加し、さらに刺激として抗ヒトＣＤ２８抗体を終濃度５ μｇ／ｍＬとなるように５０ｕＬ／ｗｅｌｌで加え３７℃、５％ＣＯ２条件下で９６時間培養した。その後、培養上清液にて細胞増殖活性をＷＳＴ−１法（Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ−１ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ； タカラバイオ社製）にて測定した。
その結果を表７、表８に示す。
【００６２】
【表７】
【００６３】
【表８】
表７に示されるように、配列番号１１で９％、配列番号２０で１１％、配列番号１５で１２％及び配列番号１０で１４％までの細胞増殖抑制活性を示し、その他のペプチドも配列番号１に比べ細胞増殖抑制活性を示した。また、表８に示されるように、配列番号１３では０．０３１２５〜０．１２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にて用量依存的な細胞増殖抑制活性を示した。
【実施例５】
【００６４】
「マウスＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた試験：ＩＬ−２産生」
ペプチド（配列番号４、５、６、１１及び１４）の生理活性は、コンカナバリンＡ刺激下、ＩＬ―２の産生量を測定し、無作用であるＰＢＳでの産生量と比較し、ＩＬ−２産生抑制活性として評価した。同様に配列番号１も実施した。
すなわち、Ｂａｌｂ／ｃマウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞を取得した。脾臓細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（ベクトンディッキンソン社）で処理し、ＦＩＴＣビーズ（ミルテニー社）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を単離した。９６穴プレートに１×１０６／ｗｅｌｌ（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）で播種後、種々の濃度のペプチド、もしくは溶媒コントロールのＰＢＳを５０ｕＬ／ｗｅｌｌで添加し、刺激としてコンカナバリンＡを終濃度１μｇ／ｍＬとなるように５０ｕＬ／ｗｅｌｌで加え３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。その後、培養上清中のＩＬ−２を特異的なＥＬＩＳＡ（Ｍｏｕｓｅ ＩＬ−２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ； Ｒ&Ｄ社製）にて測定した。
その結果を表９、表１０に示す。
【００６５】
【表９】
【００６６】
【表１０】
表９に示されるように、配列番号４、５及び１１で１８％までのＩＬ−２産生抑制を示し、その他のペプチドも配列番号１に比べＩＬ−２産生抑制を示した。また、表１０に示されるように、配列番号１４では０．２５〜１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にて用量依存的なＩＬ−２産生抑制を示した。
【実施例６】
【００６７】
「ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた試験：ＩＬ−２産生」
ペプチド（配列番号５、７、１０、１１、１４、１６、１７、１８、１９及び２１）の生理活性は、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激下、ＩＬ―２の産生量を測定し、無作用であるＰＢＳでの産生量と比較し、ＩＬ−２産生抑制活性として評価した。同様に配列番号１も実施した。
すなわち、ヒト血中よりＣＤ４陽性Ｔ細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニー社）で単離した。抗ヒトＣＤ３抗体固相化９６穴プレートに５×１０４／ｗｅｌｌ（１００ｕＬ／ｗｅｌｌ）で播種後、種々の濃度のペプチド、もしくは溶媒コントロールのＰＢＳを５０ｕＬ／ｗｅｌｌで添加し、さらに刺激として抗ヒトＣＤ２８抗体を終濃度５ μｇ／ｍＬとなるように５０ｕＬ／ｗｅｌｌで加え３７℃、５％ＣＯ２条件下で９６時間培養した。その後、培養上清中のＩＬ―２を特異的なＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ ＩＬ−２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ； Ｒ&Ｄ社製）にて測定した。
その結果を表１１、表１２に示す。
【００６８】
【表１１】
【００６９】
【表１２】
表１１に示されるように、配列番号１１で０％、配列番号１０で４％、配列番号１８で８％及び配列番号１７で１４％までのＩＬ−２産生抑制を示し、その他のペプチドも配列番号１に比べＩＬ−２産生抑制を示した。また表１２に示されるように、配列番号１１では０．０６２５〜０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にて用量依存的なＩＬ−２産生抑制を示した。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
炎症性サイトカインの産生、ケモカイン産生或いはＴ細胞増殖を伴う炎症性疾患の患者に対し、少量の本ペプチドを用いることで、副作用の伴わない予防・治療が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号２）
【図２】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号３）
【図３】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号４）
【図４】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号５）
【図５】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号６）
【図６】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号７）
【図７】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号８）
【図８】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号９）
【図９】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１０）
【図１０】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１１）
【図１１】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１２）
【図１２】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１３）
【図１３】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１４）
【図１４】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１５）
【図１５】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１６）
【図１６】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１７）
【図１７】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１８）
【図１８】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号１９）
【図１９】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号２０）
【図２０】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号２１）
【図２１】ペプチドの純度を確認した逆相クロマトグラフィーの結果（配列番号２２）
【図２２】ＬＰＳ誘発炎症モデルマウスにおけるＴＮＦ−α測定結果
【図２３】カラゲニンによる浮腫誘発モデルマウスのペプチドによる抑制効果
【符号の説明】
【００７２】
図２２における符号
＊＊：ｐ<０．０１（正常群に対して）
＃＃：ｐ<０．０１（対照群に対して）
図２３における符号
○：正常群、●：対照群、×：ｐＡＰＯ群、◆：ペプチド群
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のペプチドおいて、８個〜３０個の連続したアミノ酸からなるペプチド又はその改変体を含んでなる炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項２】
８個〜３０個の連続したアミノ酸からなるペプチド又はその改変体がＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−２の産生抑制、もしくはＴ細胞の増殖を抑制するものである請求項１記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項３】
８個〜３０個の連続したアミノ酸からなるペプチドが配列番号２３のペプチドを含むものである請求項１又は２記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項４】
配列番号２に記載のペプチドにおいて、配列番号４又は配列番号５のペプチドを含む２０〜３０個の連続したアミノ酸からなる請求項１又は２記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項５】
ペプチドの改変体が、１つ以上のアミノ酸の置換、１つ以上のアミノ酸の欠失、１つ以上のアミノ酸の付加、あるいはＳ−Ｓ結合の連結によりにより生成したものである請求項１〜４のいずれかに記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項６】
ペプチドの改変体が、Ｎ末端のアセチル化又はピロ化或いはＣ末端のアミド化により生成したものである請求項１〜４記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項７】
１つ以上のアミノ酸の置換が、アスパラギン或いはセリンからアラニンに置換されたものである請求項５記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項８】
１つ以上のアミノ酸の置換が、Ｌ体のアミノ酸からＤ体のアミノ酸への置換により生成したものである請求項５記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項９】
１つ以上のアミノ酸の付加が、極性アミノ酸によりなされたものである請求項５記載の炎症性疾患予防・治療剤
【請求項１０】
極性アミノ酸の付加が、スペーサーアミノ酸を介してなされたものである請求項９記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項１１】
炎症性疾患が、炎症時に炎症性サイトカイン、ケモカイン或いはＴ細胞の増加を伴うものである請求項１記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項１２】
炎症性サイトカイン、ケモカイン或いはＴ細胞の増加を伴う疾患が、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、全身性脈管炎、細菌性骨髄炎、皮膚炎、乾癬、糖尿病、肝炎、リウマチ、感染又は自己免疫疾患に伴う神経障害、神経因性疼痛、虚血再環流障害、脳炎、ギラン・バレー症候群、パーキンソン病、動脈硬化症、代謝症候群（メタボリックシンドローム）、心不全、心筋症、心筋梗塞、脳梗塞、クローン病、移植片体宿主疾患又は移植拒絶反応からなる疾患である請求項１１に記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項１】
配列番号２に記載のペプチドおいて、８個〜３０個の連続したアミノ酸からなるペプチド又はその改変体を含んでなる炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項２】
８個〜３０個の連続したアミノ酸からなるペプチド又はその改変体がＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−２の産生抑制、もしくはＴ細胞の増殖を抑制するものである請求項１記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項３】
８個〜３０個の連続したアミノ酸からなるペプチドが配列番号２３のペプチドを含むものである請求項１又は２記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項４】
配列番号２に記載のペプチドにおいて、配列番号４又は配列番号５のペプチドを含む２０〜３０個の連続したアミノ酸からなる請求項１又は２記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項５】
ペプチドの改変体が、１つ以上のアミノ酸の置換、１つ以上のアミノ酸の欠失、１つ以上のアミノ酸の付加、あるいはＳ−Ｓ結合の連結によりにより生成したものである請求項１〜４のいずれかに記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項６】
ペプチドの改変体が、Ｎ末端のアセチル化又はピロ化或いはＣ末端のアミド化により生成したものである請求項１〜４記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項７】
１つ以上のアミノ酸の置換が、アスパラギン或いはセリンからアラニンに置換されたものである請求項５記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項８】
１つ以上のアミノ酸の置換が、Ｌ体のアミノ酸からＤ体のアミノ酸への置換により生成したものである請求項５記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項９】
１つ以上のアミノ酸の付加が、極性アミノ酸によりなされたものである請求項５記載の炎症性疾患予防・治療剤
【請求項１０】
極性アミノ酸の付加が、スペーサーアミノ酸を介してなされたものである請求項９記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項１１】
炎症性疾患が、炎症時に炎症性サイトカイン、ケモカイン或いはＴ細胞の増加を伴うものである請求項１記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項１２】
炎症性サイトカイン、ケモカイン或いはＴ細胞の増加を伴う疾患が、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、全身性脈管炎、細菌性骨髄炎、皮膚炎、乾癬、糖尿病、肝炎、リウマチ、感染又は自己免疫疾患に伴う神経障害、神経因性疼痛、虚血再環流障害、脳炎、ギラン・バレー症候群、パーキンソン病、動脈硬化症、代謝症候群（メタボリックシンドローム）、心不全、心筋症、心筋梗塞、脳梗塞、クローン病、移植片体宿主疾患又は移植拒絶反応からなる疾患である請求項１１に記載の炎症性疾患予防・治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開２０１０−１２０９３７（Ｐ２０１０−１２０９３７Ａ）
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２４５１６７（Ｐ２００９−２４５１６７）
【出願日】平成２１年１０月２６日（２００９．１０．２６）
【出願人】（０００２３１６４８）日本製薬株式会社 (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２６日（２００９．１０．２６）
【出願人】（０００２３１６４８）日本製薬株式会社 (17)
【Ｆターム（参考）】
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