ＩＧＦが病態の亢進に関与している癌、末端肥大症、糖尿病性合併症等の疾患の治療のための医薬品が求められている。ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩと特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を生産する形質転換体、該抗体または該抗体断片の製造法および該抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ヒトインスリン様成長因子−Ｉ（以下、ｈＩＧＦ−Ｉと記す）およびヒトインスリン様成長因子−ＩＩ（以下、ｈＩＧＦ−ＩＩと記す）と特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を生産する形質転換体、該抗体または該抗体断片の製造法および該抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬に関する。
【背景技術】
ＩＧＦは、乳房、前立腺、肺、結腸などの器官の上皮系細胞の増殖、分化、細胞死（アポトーシス）の制御に重要な役割を果たしており、その生物活性は、ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、ＩＧＦ−Ｒと表記する）を介在する（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，３，１９９５）。また、ＩＧＦの代謝を抑制されているだけでなく、ＩＧＦの運搬およびＩＧＦの受容体への結合を制御している１０種類のＩＧＦ結合蛋白質（ＩＧＦ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、ＩＧＦＢＰと表記する）が存在する（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４，１１８４３，１９８９）。
ＩＧＦには、一本鎖のポリペプチドからなるＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの２種類が存在し、いずれもインスリンの前駆体であるプロインスリンとアミノ酸レベルで約４０％の相同性を有している（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６８，１８３，１９９６）。生体内では、インスリン受容体、ＩＧＦ−Ｉ受容体（以下、ＩＧＦ−ＩＲと表記する）、ＩＧＦ−ＩＩ受容体（以下、ＩＧＦ−ＩＩＲと表記する）、およびインスリン受容体とＩＧＦ−ＩＲのハイブリッド受容体が、ＩＧＦの受容体として機能している。
インスリン受容体およびＩＧＦ−ＩＲは、いずれもチロシンキナーゼ型受容体であり（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，１４３，１９９５、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，４７，２３５，１９９８）、両者のアミノ酸レベルでの相同性は約６０％である。インスリン受容体およびＩＧＦ−ＩＲは、それぞれの特有のリガンドであるインスリンおよびＩＧＦ−Ｉに対して高い結合特異性を有するが、インスリン、ＩＧＦ−ＩあるいはＩＧＦ−ＩＩのそれぞれとも結合性を有する（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６３，１１４８６，１９８８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，７３９３，１９９３）。また、インスリン受容体とＩＧＦ−ＩＲの各サブユニットからなるハイブリッド受容体は、インスリンよりもＩＧＦ−Ｉに対して高い結合特異性を有しており、ＩＧＦ−ＩＲとして機能していると考えられているが、生体内での役割は不明である（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，３−３４，１９９５、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，１４３，１９９５）。ＩＧＦ−ＩＩＲは、ＩＧＦファミリーのうちＩＧＦ−ＩＩとのみ結合できるが、チロシンキナーゼ活性を有していないためＩＧＦ−ＩＩのアンタゴニストとして機能していると考えられている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，９４，１２９８１，１９９７）。以上のように、２種のＩＧＦは、これら４種の受容体に加え、１０種のＩＧＦ結合蛋白質（以下、ＩＧＦＢＰと表記する）と複雑なネットワークを形成し、生体内で機能している。
ＩＧＦは、肉腫、白血病、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、甲状腺癌、脳腫瘍、卵巣癌、子宮癌等の多種類の癌で発現が認められており、これらの癌細胞に対して強い増殖促進作用を示すことが知られている（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，６５，３１１，１９９２、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，１５９１，１９９１、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２２，５４、１９９５、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，５４，５０２，１９９７、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７，１７６４，１９９６）。また、転移性の高い癌では、転移性の低い癌よりもＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＲの発現が高いことが知られており（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，６５，８１２，１９９６）、癌の転移にもＩＧＦの関与が示唆されている。ＩＧＦの細胞増殖促進作用は、主にＩＧＦ−ＩＲを介した作用であるが（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，４２９８，１９９５、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２８，６０７１，１９９９）、一部の乳癌細胞では、ＩＧＦ−ＩＩがインスリン受容体を介して作用することも知られている（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，２４７１，１９９９）。
臨床的および疫学的な検討においても、乳癌（Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｓ，１１，１５６６，２００２、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２９Ａ，４９２，１９９３）、神経膠腫、肺癌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎｓｉｔｕｔｅ，９２，７３７，２０００）、大腸癌（Ｇｕｔ，４４，７０４，１９９９）、前立腺癌（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２，２９４２，２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９，５６３，１９９８）、卵巣癌（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１０１，５４９，２００２）、膀胱癌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６９，７１４，２００３）および骨肉腫などの多くの癌組織におけるＩＧＦあるいはＩＧＦ−ＩＲ、または血清ＩＧＦ量の増加が報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９２，１４７２，２０００）。更に、ＩＧＦ−ＩＲが発現している癌患者は、予後が不良となることが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，３０７９，１９９７）。
また、細胞死誘導活性を有するインターフェロンあるいは腫瘍壊死因子により誘導される大腸癌細胞の細胞死は、ＩＧＦ−Ｉにより抑制されることが知られている。また、多形膠芽腫患者由来の初代培養細胞では、放射線感受性の癌細胞と比較して、放射線耐性の癌細胞ではＩＧＦ−ＩＲおよびリン酸化ＩＧＦ−ＩＲの発現量が増大していること、更に放射線感受性の癌細胞の上皮増殖因子受容体の機能を阻害した場合、ＩＧＦ−ＩＲの発現量が増大することが知られている。以上のことから、ＩＧＦは癌細胞の増殖促進効果だけでなく、ＩＧＦ−ＩＲを介して癌細胞のサバイバルシグナルを増強し、癌細胞の薬剤耐性取得にも関与している（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９３，１８５２，２００１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０，１９１３，２００１、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０，２００７，２０００、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２，２００，２００２）。
さらに、癌以外の疾患でも、ＩＧＦの関与が示唆されている疾患が報告されている。巨人症、末端肥大症では成長ホルモンの異常分泌により、二次的にＩＧＦが異常発現し、病態の亢進に関与していると考えられている（Ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ＆ ＩＧＦ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，９８，２００３）。また、糖尿病性合併症（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，１７０６，１９９７、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２７４，Ｆ１０４５，１９９８）、リウマチ性関節炎の病態形成にもＩＧＦ−Ｉの関与が示唆されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８１，５０，１９９６、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３９，１５５６，１９９６）。
モデル動物を用いた研究においても、ＩＧＦと種々の疾患の関係が検討されている。ヒト前立腺癌細胞移植モデルマウスでは、アンドロゲン非依存性増殖能の獲得に伴い、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＲの発現が上昇することが知られている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，６２７６，２００１）。また、血清中のＩＧＦの大部分は肝臓で生産されるが、肝臓でのみＩＧＦ−Ｉを欠損したマウスでは同所移植した大腸癌の増殖が抑制されることから、血清中のＩＧＦが腫瘍増殖に関与していることも知られている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２，１０３０，２００２）。ＩＧＦを体内局所に発現させたマウスでは、腫瘍の出現あるいは過形成が認められる（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２，８５３，２００３、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ，６０，１５６１，２０００、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９，１３７７９，１９９４）。
以上のように、ＩＧＦ、ＩＧＦ−ＲおよびＩＧＦＢＰは癌の発生、増殖、および転移だけでなく、末端肥大症、糖尿病性合併症やリウマチ性関節炎などにおいても重要な役割を果たしている。
これまでに、ＩＧＦとＩＧＦ−Ｒ間のシグナル伝達を阻害することによる抗腫瘍効果が検討されており、ＩＧＦ−ＩＲを標的とした抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３，５０７３，２００３、ＷＯ０２／５３５９６）、ＩＧＦ−Ｒ阻害剤（ＷＯ９９／２８３４７）、あるいは血清中のＩＧＦを抑制できるＩＧＦＢＰが動物モデルにおいて抗腫瘍効果を示すことが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２，３５３０，２００２）。
しかし、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体では、マウスに移植されたエストロゲン非依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着は阻害するものの、エストロゲン依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着や生着したヒト乳癌細胞の増殖は抑制されないことが示されており、ＩＧＦ−ＩＲの作用阻害のみでは、十分な抗腫瘍効果が得られないことが示されている（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２２，１０１，１９９２）。
ＩＧＦに対する抗体（以下、抗ｈＩＧＦ抗体と表記する）としては、種々の抗体が知られている。代表的なヒトＩＧＦ−Ｉに対する抗体（以下、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体と表記する）としては抗ｈＩＧＦ−Ｉマウス抗体ｓｍ１．２（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８１，２３８９，１９８４）が、あるいはヒトＩＧＦ−ＩＩに対する抗体（以下、抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体と表記する）としては、抗ｈＩＧＦ−ＩＩマウス抗体Ｓ１Ｆ２（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２４，８７０，１９８９）があげられる。ｓｍ１．２は、ＩＧＦ−ＩＩに対して４０％の、ＳＩＦ２はｈＩＧＦ−Ｉに対して１０％程度の交差反応性を有しており、両抗体ともそれぞれｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩ依存性の細胞増殖を阻害できることが知られている。
ヒト以外の動物の抗体、例えばマウス抗体をヒトに投与すると、マウス抗体が異物として認識されることにより副作用を惹起するばかりか、投与抗体の消失が早く治療上有用ではない。これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体をヒト型キメラ抗体あるいはヒト型相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体などのヒト化抗体にすることが試みられている。ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８１，６８５１，１９８４）、ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域中のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２，１９８６）。これらのヒト化抗体は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体に比較してヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、免疫原性および血中での安定性に関しては、ヒト型キメラ抗体では、ヒトに投与した場合、マウス抗体に比べて血中半減期が約６倍伸びたことが報告されている（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２９Ａ，４９２，１９９３）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体においても、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，１１１８，１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８５，６６８，１９９５）。即ち、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分子として作製することができる。最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、ヒト化抗体を含めた抗体からＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３，１９８８）、ｄｓＦｖ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２，２４９，１９９５）、ＣＤＲを含むペプチド（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１，２９６６，１９９６）などのより分子量の小さい抗体断片の作製が可能となっている。これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ分子量が小さい為、標的組織への移行性に優れている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２，３４０２，１９９２）。
【発明の開示】
本発明の目的は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩと特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を生産する形質転換体、該抗体または該抗体断片の製造法および該抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬等を提供することにある。
本発明は以下の（１）〜（２８）に関する。
（１） ヒトインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびヒトインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）と特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（２） ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合の強さが同程度である（１）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（３） バイオセンサービアコアで測定されるヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合定数が１×１０^９Ｍ^−１以上である（１）または（２）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（４） 抗体分子のクラスがＩｇＧである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（５） 遺伝子組換え抗体がヒトＩＧＦに対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（６） 遺伝子組換え抗体または抗体断片のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７で表される（５）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（７） 遺伝子組換え抗体または抗体断片のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で表される（５）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（８） 遺伝子組換え抗体または抗体断片のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７で表され、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で表される（５）〜（７）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（９） 遺伝子組換え抗体または該抗体活性断片のＶＨが、配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（８）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１０） 遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＬが、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（８）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１１） 遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、およびＶＬが、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（１０）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１２） 遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、およびＶＬが、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（１１）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１３） 遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（１１）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１４） 遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）または（１２）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１５） 遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＬが配列番号２７、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含む請求項５〜８または１２のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１６） 遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２７、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）、（１２）、（１４）または（１５）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１７） 遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）、（１２）、（１４）〜（１６）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１８） 遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）、（１２）、（１４）〜（１６）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１９） 遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）、（１２）、（１４）〜（１６）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（２０） 遺伝子組換え抗体がヒト型ＣＤＲ移植抗体である（１）〜（１９）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（２１） 抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）〜（１９）のいずれか１項に記載の抗体断片。
（２２） （１）〜（２１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（２３） （２２）に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
（２４） （２３）に記載の発現ベクターを導入して得られる形質転換体。
（２５） （２４）に記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物中に（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から該遺伝子組換え抗体または該抗体断片を単離し、精製する工程を含む、遺伝子組換え抗体または該抗体断片を製造する方法。
（２６） （１）〜（２１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬。
（２７） （１〜（２１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を有効成分として含有するＩＧＦ関連疾患の治療薬。
（２８） ＩＧＦ関連疾患が、癌、末端肥大症および糖尿病性合併症である（２７）に記載の治療薬。
本発明の遺伝子組換え抗体または該抗体断片としては、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩと特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの生物学的活性を阻害する遺伝子組換え抗体または該抗体断片であれば、いかなる遺伝子組換え抗体または該抗体断片も包含されるが、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合の強さが同程度である遺伝子組換え抗体または該抗体断片が好ましい。
本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩと特異的に結合できる遺伝子組換え抗体または該抗体断片は、例えば、ｈＩＧＦ−Ｉに対するモノクローナル抗体でｈＩＧＦ−ＩＩに対する交差反応性を有するモノクローナル抗体あるいはｈＩＧＦ−ＩＩに対するモノクローナル抗体でｈＩＧＦ−Ｉに対する交差反応性を有するモノクローナル抗体から、遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
抗体のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合の強さが同程度であるとは、抗体がｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対して同程度の結合活性を有していることをいう。
結合活性は、公知の測定法により数値化することができる。公知の測定法としては、酵素免疫学的測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法と記す）や表面プラズモン共鳴の原理（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ、１４５，２２９，１９９１）などを利用したバイオセンサー法（以下、バイオセンサービアコアと記す）などが用いられる。バイオセンサービアコアによる測定は、２分子間の結合と解離に伴うセンサーチップ表面で生じる微量な質量変化を光学現象により、ＳＰＲシグナルとして検出するものである。
ＥＬＩＳＡ法による測定法としては、例えば、固相化した抗原に対して結合する抗体量を測定するＥＬＩＳＡ法で得られるＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩに対する結果を比較する方法や、同様のＥＬＩＳＡ法において抗体の反応時に抗原を同時に添加して、固相化した抗原に結合する抗体量の減少を測定する競合ＥＬＩＳＡ法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８）で得られるＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩに対する結果を比較する方法などによって、抗体のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両者に対する結合活性を測定する方法などがあげられる。
抗体がｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対して同程度の結合活性を有していることとは、上記の測定法により数値化された抗体のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性を比較して、抗体のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性を１としたとき、ｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性が０．１〜１０、好ましくは０．２〜５、さらに好ましくは０．５〜２、最も好ましくは１であることをいう。
ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩ両者の生物活性を阻害する能力とは、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに特異的な受容体を介するｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩからのシグナル伝達を阻害して、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの持つ生物学的活性を阻害することなどがあげられ、例えば、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩと、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに特異的な受容体との結合を阻害することがあげられる。このような抗体が持つ抗原の生物活性を阻害する活性は、抗体の中和活性ともいう。
ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの持つ生物学的活性としては、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに特異的な受容体を介して、細胞の増殖を促進する活性などがあげられる。
ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに特異的な受容体とは、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩと結合することができる受容体をいい、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＩＧＦ−ＩＩ受容体、インスリン受容体およびＩＧＦ−Ｉとインスリン受容体のハイブリッド受容体などがあげられる。
本発明の遺伝子組換え抗体または該抗体断片としては、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩと特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有していればいかなる遺伝子組換え抗体または該抗体断片も包含されるが、バイオセンサービアコアで測定されるヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合定数が好ましくは１×１０^９Ｍ^−１以上、より好ましくは２×１０^９Ｍ^−１以上、さらに好ましくは３×１０^９Ｍ^−１以上、最も好ましくは５×１０^９Ｍ^−１以上である遺伝子組換え抗体または該抗体断片が好適に用いられる。
本発明の遺伝子組換え抗体は、遺伝子工学的手法を用いて作製される抗体をいう。このような遺伝子組換え抗体としては、好ましくはヒト抗体の定常領域を含む遺伝子組換え抗体、より好ましくはヒト抗体の定常領域と可変領域のフレームワーク（以下、ＦＲと記す）を含んでなる遺伝子組換え抗体が望ましい。このような遺伝子組換え抗体は、例えば、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相補性決定領域（以下、ＣＤＲと記す）移植抗体、遺伝子組換え非ヒト動物によって作製されたハイブリドーマより生産されるヒト抗体、遺伝子工学的手法を用いてモノクローン化されたヒト抗体などがあげられる。また、人為的に作製された抗体遺伝子ライブラリーから選抜された抗体のＣＤＲを、適当なヒト抗体のＦＲなどと連結させ、さらにヒト抗体の定常領域などと連結させて作製された遺伝子組換え抗体なども含まれる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物の抗体重鎖可変領域（以下、可変領域はＶ領域、重鎖はＨ鎖としてＨＶまたはＶＨと記す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬと記す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと記す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬと記す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどのハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３およびγ４クラスといったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体としては、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有するヒト型キメラ抗体であればいかなるものでも含まれるが、具体的には抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）を元に製造されるヒト型キメラ抗体、ＶＨが配列番号２および／またはＶＬが配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体、形質転換体ＫＭ３００２（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９６）により生産される抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２などがあげられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨおよびＶＬ中の適切な位置に移植して作製される抗体を意味する。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ配列に移植したＶ領域のアミノ酸配列を設計し、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ配列に移植したＶ領域アミノ酸配列は、数箇所の変異を導入した配列を設計してもよい。この様にして設計されたアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。置換されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３およびγ４クラスといったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体としては、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体であればいかなるものでも含まれ、好ましくは抗ヒトＩＧＦ抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、ラットハイブリドーマＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）により生産される抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号５、６、７および／または抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号８、９、１０で表されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
これらのヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物のなかでも、抗体のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列および配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＬが配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列および配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列および配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列および配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体が好ましく、抗体のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体がより好ましい。
具体的には、抗体のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＬが配列番号２７で表されるアミノ酸配列、配列番号２８で表されるアミノ酸配列または配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体および抗体のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体があげられる。
ヒト抗体としては、遺伝子組換え非ヒト動物から作製されたハイブリドーマより生産されるヒト抗体、あるいは遺伝子工学的手法を用いてモノクローン化されたヒト抗体などがあげられる。
本来ヒト抗体とは、天然にヒト体内に存在する抗体を示すが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩によりモノクローナルなヒト抗体の作製が可能となった。
本発明のヒト抗体としては、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有するヒト抗体であればいかなるものでも含まれるが、具体的には遺伝子工学的手法あるいは細胞工学的手法により、ヒト抗体産生細胞を作製し、該細胞により生産されたヒト抗体や、あるいはヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物から通常のハイブリドーマ作製法により得られたモノクローナル抗体などが含まれる。
遺伝子工学的手法によりヒト抗体産生細胞を作製する方法としては、例えば、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたヒト抗体ファージライブラリーを作製し、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収する方法があげられる。該抗体断片は、更に蛋白質工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換する方法などがあげられる。
細胞工学的手法によりヒト抗体産生細胞を作製する方法としては、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させて不死化させた後、限界希釈法によるクローニングを経て、該抗体を産生する継代培養が可能なリンパ球を単離する方法があげられる。該リンパ球を培養し、該培養物中より目的の抗体を精製し、取得する方法などがあげられる。
人為的に作製された抗体遺伝子ライブラリーから選抜された抗体のＣＤＲを、適当なヒト抗体のＦＲなどと連結させ、さらにヒト抗体の定常領域などと連結し、遺伝子組換え抗体を作製する場合の人為的抗体遺伝子ライブラリーとしては、抗体産生細胞の集団から作製された抗体遺伝子ライブラリーや、該抗体遺伝子ライブラリーに無作為変異を導入してライブラリーのレパートリーが増大された抗体遺伝子ライブラリーなどが含まれる。
本発明の抗体断片としては、上記抗体の可変領域の一部あるいは全部を含み、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体活性断片などが含まれる。抗体断片としては、以下に示す、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦ（ａｂ’）_２は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有するＦ（ａｂ’）_２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと記す）を用いて、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨの順で連結されたポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のｓｃＦｖは、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。ｄｉａｂｏｄｙが持つ二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベタターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明のｄｓＦｖは、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体は、本発明の抗体および抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを遺伝子工学的あるいは化学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明の遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体および抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
本発明の化学的に結合させた抗体の誘導体は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体および抗体断片のＨ鎖あるいはＬ鎖のＮ末端側あるいはＣ末端側、抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体および抗体断片中の糖鎖などに放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法（抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４）により結合させることにより製造することができる。
放射性同位元素としては、^１３１Ｉ、^１２５Ｉなどがあげられ、例えば、クロラミンＴ法などにより抗体に結合させることができる。
低分子の薬剤としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤（臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社、１９９６）、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤（炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社、１９８２）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと記す）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体および抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε−アミノ基の修飾剤（特昭６１−１７８９２６）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特昭５６−２３５８７）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特平２−１１７９２０）などがあげられる。
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン、例えば、ヒトインターロイキン２（以下、ｈＩＬ−２と記す）、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＧＭ−ＣＳＦと記す）、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＭ−ＣＳＦと記す）、ヒトインターロイキン１２（以下、ｈＩＬ−１２と記す）などがあげられる。また、癌細胞を直接障害する活性を有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との融合抗体ついては、抗体および抗体断片をコードするｃＤＮＡと蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させた融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
以下に、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、かつ、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有するヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製方法、該抗体断片の作製方法、ならびにそれらの活性の評価方法、および本発明のヒト化抗体または該抗体断片の使用方法について説明する。
１．ヒト化抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとしては、ヒト抗体のＣＨおよび／またはＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と記す）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと記す）などがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７，１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，２７，２２３，１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７８，１５２７，１９８１）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３，１９９０）などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７，１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１４９，９６０，１９８７）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ，４１，４７９，１９８５）とエンハンサー（Ｃｅｌｌ，３３，７１７，１９８３）などがあげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と記す）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１，１９９４）。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９，１９９８）などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得する。
マウス抗体などを産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージあるいはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分あるいはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマから全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３，１９８７）、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）などがあげられる。また、ハイブリドーマからｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｃｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などがあげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）、あるいは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）やＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８，１９９２）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４，１９８９）、λＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９，１９８５）、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２８０，１９８３）およびｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８５）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，２７１，１９９２）、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５９，１７７−１９０，１９６８）、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８，１９８３）、ＮＭ５２２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，１，１９８３）、Ｋ８０２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，１１８，１９６６）およびＪＭ１０５（Ｇｅｎｅ，３８，２７５，１９８５）などが用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、放射性同位元素あるいは蛍光標識、あるいは酵素標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法と記す；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、ジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７４，５４６３，１９７７）などの反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などを用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することによって見出すことができる。
さらに、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどに対してＢＬＡＳＴ法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０，１９９０）などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として、５’末端に適当な制限酵素の認識配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを増幅し、それぞれを上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮して塩基配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらをＰＣＲ法により連結する。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、ＶＨ、ＶＬとも４〜６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記２（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応による連結後、ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドクローンを取得する。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６，１９９１）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのアミノ酸残基のみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与している。ＣＤＲの移植時には、それらアミノ酸残基がヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに由来するアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。このため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、抗体の立体構造を維持するアミノ酸残基および間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらをＣＤＲの由来となったヒト以外の動物の抗体配列中に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６，１９９１）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１２，５３５，１９７７）あるいはコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１，１９９４）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて上記２（４）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、上記２（４）および（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
例えば、上記２（４）および（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングすることができる。
（７）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記２（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、サル腎臓由来細胞株ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８４，７４１３，１９８７）、発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などにより測定できる。
（８）ヒト化抗体の安定発現
上記２（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）などがあげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下、ＹＢ２／０細胞と表記する）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換体は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と記す）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地にウシ胎児血清などの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡにより測定できる。また、形質転換細胞は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系などを利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＰＡＧＥと表記する：Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）やウエスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などで測定することができる。
２．抗体断片の作製
抗体断片は、上記１および２に記載の抗ｈＩＧＦ抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うなどの方法があげられる。
蛋白質化学的手法としては、ペプシン、パパインなどの蛋白質分解酵素を用いた部位特異的切断、精製などの方法があげられる。
抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。
また、Ｆａｂは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、ＦａｂをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１，１９８８）などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。
リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）。
（２）Ｆ（ａｂ’）_２の作製
Ｆ（ａｂ’）_２は、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）_２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）。また、下記３（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサンなどのようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢ［５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）］で処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、上記３（２）に記載のＦ（ａｂ’）_２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’をコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えばＦａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができるリフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラムなどを用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、ｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＆ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８，１９９４）などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（５）ｄｉａｂｏｄｙの作製
ｄｉａｂｏｄｙは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および、２（５）に記載の抗体のＶＨとＶＬをリンカーがコードするアミノ酸残基が８残基以下となるように連結したＤＮＡを作製し、ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターにクローニングし、ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを作製することができる。ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターとしては、ｄｉａｂｏｄｙをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８，１９９４）などがあげられる。ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにｄｉａｂｏｄｙを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｉａｂｏｄｙとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。まず、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７，１９９４）などがあげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＶＨおよびＶＬポリペプチドを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからＶＨおよびＶＬポリペプチドを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７，１９９４）。
（７）ＣＤＲペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などがあげられる。
発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＣＤＲペプチドを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからＣＤＲペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７，１９９４）。
３．ヒト化抗体または該抗体断片の活性評価方法
培養上清中あるいは精製した抗ｈＩＧＦヒト化抗体のｈＩＧＦに対する結合活性は、ＥＬＩＳＡ法およびバイオセンサービアコアなどにより測定することができる。また、上記１．（７）に示したｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株のｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏの増殖に対する抗体の影響を検討することにより、ｈＩＧＦの機能を阻害する本発明の抗体の活性を測定することができる。
（１）ＥＬＩＳＡによる活性評価
結合ＥＬＩＳＡとは、抗原を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに固定化し、第一抗体として反応させ、第一抗体を認識することができる標識した二次抗体を反応させて、標識物を検出することにより、抗原と抗体との結合活性を測定する方法である。
具体的には、固定化する抗原としては、ｈＩＧＦ−ＩやｈＩＧＦ−ＩＩの精製蛋白質や部分配列を有するペプチドがあげられる。第一抗体としては、ハイブリドーマなどの培養上清あるいは精製抗体などの測定対象物があげられる。第二抗体としては、第一抗体を認識することができる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射性同位元素などで標識した抗体があげられる。具体的には、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗ラットイムノグロブリン（以下、ｒＩｇと表記する）マウス抗体などがあげられる。
競合ＥＬＩＳＡとは、あらかじめｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、測定対象物である抗体と、ｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩとを同時に添加して、反応させ、プレートに固定化した抗原と反応対象物である抗体の反応を、反応液中に添加したもう一種あるいは同一の抗原が阻害することを、プレートに結合する一次抗体の量の変化で測定する方法である。抗体の結合量の変化は抗体に対する二次抗体により検出する。また、天然型のｈＩＧＦおよびｈＩＧＦの部分ペプチドを用いた競合ＥＬＩＳＡにより、天然型のｈＩＧＦとの反応性および抗原エピトープを解析することができる。抗体がｈＩＧＦの立体構造を認識しているか否かは、通常行われる構造的解析法により調べることができる。構造的解析法としては、例えば、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴法などがあげられる。
（２）バイオセンサービアコアによる活性評価
バイオセンサービアコアによる測定は、２分子間の結合と解離に伴うセンサーチップ表面で生じる微量な質量変化を光学現象により、ＳＰＲシグナルとして検出するものである。本法での測定から導きだされた結合速度定数（以下、Ｋａｓｓと表記する）、解離速度定数（以下、Ｋｄｉｓｓと表記する）から、Ｋ_Ａ＝Ｋａｓｓ／Ｋｄｉｓｓで計算される結合定数（以下、Ｋ_Ａと表記する）が算出される。Ｋ_Ａは、Ｍ^−１の単位で表される。バイオセンサービアコアでの測定は、添付の使用説明書に従って至適な測定条件下で行うことができる。至適な測定条件としては、センサーチップへ固定化するリガンドの量は、式１により算出される最小値と式２で算出される最大値の間の範囲であることが好ましい。また、アナライトの結合量は、式３で算出される最大結合量以下であることが好ましい。式１、式２および式３において、リガンドとはセンサーチップに固定化する分子を示し、アナライトとは流路系を介して添加する分子を示し、Ｓとはリガンドの結合部位数を示す。ＲＵとは、Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔの略であり、センサーチップ表面での単位面積あたりの質量の変化量を示し、１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ２に相当する。バイオセンサービアコアでの測定では、最大結合量が維持できるように流速および洗浄条件を設定することにより、蛋白質の結合様式に則った結合定数の解析を行うことができる。
（式１）
最小固定化量（ＲＵ）＝２００×１／Ｓ×（リガンドの分子量／アナライトの分子量）
（式２）
最大固定化量（ＲＵ）＝１０００×１／Ｓ×（リガンドの分子量／アナライトの分子量）
（式３）
最大結合量＝アナライトの分子量×リガンドの固定化量（ＲＵ）／リガンドの分子量×Ｓ
４．本発明のヒト化抗体または該抗体断片の使用方法
本発明の抗ｈＩＧＦ抗体およびその抗体断片は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩと特異的にかつ同程度の強さで結合し、かつ、その機能を阻害するため、ｈＩＧＦ介在性疾患および異常なｈＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患などの治療に有用であると考えられる。また、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内において免疫原性を示さず、反復投与が可能であり、かつ、その効果が長期間に渡り持続することが期待される。
ｈＩＧＦ介在性疾患および異常なｈＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患としては、癌、末端肥大症および糖尿病合併症などがあげられる。
本発明の抗ｈＩＧＦ抗体およびその抗体断片は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、蛋白質またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
本発明の抗ｈＩＧＦ抗体およびその抗体断片は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体および抗体断片そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体および抗体断片を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。該抗体および抗体断片、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
［実施例１］
抗ヒトＩＧＦヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
（１）抗ヒトＩＧＦヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
抗ヒトＩＧＦヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
参考例５の１．項で決定した抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８（ラットＩｇＧ２ｂ）のＶＨ（配列番号２）のＣＤＲのアミノ酸配列を移植するための、ヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。
公的データベースより、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＦＲと最も高い相同性を有するヒト抗体のＦＲを検索した結果、抗体ＣＡＭ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７７，３２３９−３２４３，１９８０）が最も高い８１．６％の相同性を有していた。そこで、抗体ＣＡＭ（以下、Ｃａｍと記す）のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を基に、抗ｈＩＧＦヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体と記す）のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
ＣａｍのＦＲには、アミノ酸配列が一義的に決定されていない箇所が４箇所（１３番目、７４番目、７７番目、９０番目）存在し、また、ヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列では一般的でないアミノ酸残基が、３番目と４０番目に認められた。そこで、これらのアミノ酸残基については、免疫原性をより低下させるため、ヒト抗体で高い頻度で認められるアミノ酸残基（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）へ改変した。このようにして設計したＣａｍ由来のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号１１に記載のＶＨのアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０を設計した。
更に、Ｃａｍとは異なるヒト抗体ＦＲからなる抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
Ｋａｂａｔらは、既知の様々なヒト抗体のＶＨをそのアミノ酸配列の相同性から３種類のサブグループ（ＨＳＧ Ｉ〜ＩＩＩ）に分類し、さらに、それら各サブグループの共通配列を報告している（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）。この様な共通配列を有する抗体は、ヒトにおいて、免疫原性が低いことが期待されることから、この共通配列のＦＲを基に抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を設計した。より活性の高い抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のＶＨの３種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するアミノ酸配列を検索した。相同性の検索結果を第１表に示した。第１表に示したように、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨ領域のＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＩＩのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有していた。

以上の結果から、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩＩＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号５４に記載の抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０（３）を設計した。
次に、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。参考例５の１．で決定した抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬ（配列番号４）のＣＤＲのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。
Ｋａｂａｔらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（ＨＳＧ Ｉ〜ＩＶ）に分類し、さらにそれら各サブグループの共通配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を報告している。そこで、ヒト抗体のＶＬの４種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を検索した。相同性の検索結果を第２表に示した。第２表に示したように、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬ領域のＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＶのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有していた。

以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号１４に記載の抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０を設計した。
また、２番目に相同性の高いヒト抗体のＶＬはサブグループＩであった。そこで、サブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号５５に記載の抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０（１）を設計した。
上記で設計した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０およびＨＶ０（３）、ならびにＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０およびＬＶ０（１）は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列であるが、一般にヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは抗原との結合活性が低下してしまうことが多く、それを回避するため、ヒト抗体とヒト以外の動物の抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、抗原との結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基をＣＤＲのアミノ酸配列とともに移植することが行われている。そこで、本実施例においても、抗原との結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定した。
まず、上記で設計した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０とＨＶ０（３）、および抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０とＬＶ０（１）からなる４通りの組み合わせのヒト型ＣＤＲ移植抗体［以下、ＣａｍＨＶ０のアミノ酸配列を有するＶＨとＬＶ０のアミノ酸配列を有するＶＬを組み合わせた抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をＣａｍＨＶ０／ＬＶ０などと記す；ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０、ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０（１）、ＨＶ０（３）ＬＶ０およびＨＶ０（３）ＬＶ０（１）。］のＶ領域の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェアＰｒｏ−Ｅｘｐｌｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）、ＲａｓＭｏｌ（Ｇｌａｘｏ社製）またはＶｉｅｗｅｒ Ｌｉｔｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．社製）を用いて、それぞれ添付の使用説明書に従い、行った。同様に、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも構築した。更に、それぞれのヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列において、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶ領域のアミノ酸配列中に認められるアミノ酸残基と異なっている残基について、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のアミノ酸配列中のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる改変体の三次元構造モデルを同様に構築し、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８、およびそれぞれの改変体の元となった４通りの組み合わせのヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域の三次元構造を比較した。
その結果、改変体のＶ領域のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の抗原との結合活性に影響を与えると考えられる残基として、ＣａｍＨＶ０では１番目のＧｌｎ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇを選択した。さらに、三次元構造モデルからでは抗体の活性への影響は明らかではなかったが、４２番目のアミノ酸は一般にＧｌｙであるのに対して、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８ではＴｈｒであり、本アミノ酸残基が抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８において特異的な役割を果たしている可能性が考えられたため、本残基も改変候補として選択した。同様に、ＨＶ０（３）では４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇを、ＬＶ０では４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌを、ＬＶ０（１）では４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅをそれぞれ選択した。
このようにして選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つを抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶ領域のアミノ酸配列中のアミノ残基へ改変し、様々な改変を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計した。
（２）ＣａｍＨＶ０をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（１）で設計したアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０をコードするｃＤＮＡを以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列のＮ末端に配列番号２の１番目から１９番目のアミノ酸配列に相当する抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖の分泌シグナル配列を連結した。該配列を配列番号１２に示した。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮した。
変換した遺伝子コドンを連結して、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、配列番号１３に示した。該塩基配列の５’末端と３’末端に、ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列を含むＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列をそれぞれ付加し、ＣａｍＨＶ０をコードする塩基配列とした。該塩基配列を５’末端側から約１５０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順にして、配列番号３０、３１、３２および３３で表される４本の合成オリゴＤＮＡ（ファスマック社製）を合成した。
各合成オリゴＤＮＡを最終濃度が０．１μＭとなるようにＫＯＤ−ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の反応液に加え、更に０．４μＭ Ｔ３プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）、０．４μＭ Ｔ７プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）および１単位のＫＯＤ−ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、合計５０μＬとし、ＰＣＲ反応を行った。反応条件は９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃６０秒間のサイクルを３５サイクルで行った。反応後、該反応液を１．５％アガロース電気泳動により分画し、約０．５ｋｂｐ付近の遺伝子断片を、ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて回収した。回収した遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）およびＸｈｏＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて、消化反応を行った後に、該反応液を１．５％アガロース電気泳動により分画し、制限酵素処理された遺伝子断片をゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて回収した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（以下、ｐＢＳと記す）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を上記遺伝子断片と同様に制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）およびＸｈｏＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて、消化反応を行った後、分画、回収し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて添付説明書に従いｐＢＳとＣａｍＨＶ０遺伝子断片の連結反応を行った。連結反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換株よりミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付説明書に従いプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析し、目的のアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０をコードする塩基配列を含む、第１図に示したプラスミドｐＢＳ／ＣａｍＨＶ０を取得した。
（３）抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨの改変体をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（１）で設計した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨの改変体をコードするｃＤＮＡの構築は以下のように行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８で見られる遺伝子コドンとなるように行った。また、ＰＣＲ反応はＫＯＤ−ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、添付説明書に従って行った。
以下で使用した合成オリゴＤＮＡはファスマック社製のものを使用した。
（３−１） １番目のＧｌｎをＧｌｕへ、９７番目のＡｌａをＴｈｒへ、９８番目のＡｒｇをＴｈｒへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、ＱＡＲと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（２）で得られたｐＢＳ／ＣａｍＨＶ０を鋳型として、配列番号３８で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号４１で表される合成オリゴＤＮＡを用いて、９４℃３０秒間、５８℃４５秒間、７２℃６０秒間のサイクルを３５サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。反応後、実施例１（２）と同様にして該反応液を１．５％アガロース電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した後、回収した遺伝子断片をｐＢＳにクローニングして、目的のアミノ酸配列ＱＡＲをコードする、配列番号１７で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＱＡＲを取得した。
（３−２） １番目のＧｌｎをＧｌｕへ、４２番目のＧｌｙをＴｈｒへ、９７番目のＡｌａをＴｈｒへ、９８番目のＡｒｇをＴｈｒへ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、ＱＧＡＲと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（２）で得られたｐＢＳ／ＣａｍＨＶ０を鋳型として、配列番号３８で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号３９で表される合成オリゴＤＮＡを用いて約２５０ｂｐの５’−ＱＧ遺伝子断片を、また、配列番号４０で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号４１で表される合成オリゴＤＮＡを用いて約２５０ｂｐの３’−ＧＡＲ遺伝子断片を、それぞれ上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応で増幅後、１．５％アガロース電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した。回収したそれぞれの遺伝子断片、５’−ＱＧ遺伝子断片の５’末端に位置するＴ３プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）および３’−ＧＡＲ遺伝子断片の３’末端に位置するＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて上記（３−２）と同様にしてＰＣＲ反応を行った。反応後、実施例１（２）と同様にして該反応液を１．５％アガロース電気泳動により約５００ｂｐの遺伝子断片を分画、回収した後、回収した遺伝子断片をｐＢＳにクローニングして、目的の配列番号２６で示されるアミノ酸配列ＱＧＡＲをコードする、配列番号１８で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＱＧＡＲを取得した。
（４）ＬＶ０をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（１）で設計したアミノ酸配列ＬＶ０をコードするｃＤＮＡを以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列のＮ末端に配列番号４の１番目から２２番目のアミノ酸配列に相当する抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＬ鎖の分泌シグナル配列を連結した。該配列を配列番号１５に示した。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮した。
変換した遺伝子コドンを連結して、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、配列番号１６に示した。該塩基配列の５’末端と３’末端にヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列を含むＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列をそれぞれ付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１５０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順にして、配列番号３４、３５、３６および３７で表される４本の合成オリゴＤＮＡを合成した。
各合成オリゴＤＮＡを用いて、実施例１の（２）と同様にしてＰＣＲ反応からｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列ＬＶ０をコードする、配列番号１６で示されるｃＤＮＡを含む、第１図に示したプラスミドｐＢＳ／ＬＶ０を取得した。
（５）抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＬの改変体をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（１）で設計した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＬの改変体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの構築は以下のように行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８で見られる遺伝子コドンとなるように行った。また、ＰＣＲ反応はＫＯＤ−ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、添付説明書に従って行った。
（５−１） ４番目のＭｅｔをＬｅｕへ、９番目のＡｓｐをＴｈｒへ、１０番目のＳｅｒをＴｈｒへ、１１番目のＬｅｕをＭｅｔへ、１５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、２２番目のＡｓｎをＴｈｒへ、３５番目のＴｙｒをＰｈｅへ、４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへ、６９番目のＡｓｐをＳｅｒへ、７０番目のＰｈｅをＴｙｒへ、７１番目のＴｈｒをＳｅｒへ、８２番目のＶａｌをＡｌａへ、８４番目のＶａｌをＴｈｒへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、Ａｌｌと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
アミノ酸配列Ａｌｌをコードする、配列番号１９で示されるｃＤＮＡの塩基配列を５’末端側から約１５０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順にして、配列番号４６、４７、４８および４９で表される合成オリゴＤＮＡを合成した。
各オリゴＤＮＡを用い実施例１（２）と同様にして、ＰＣＲ反応からｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列Ａｌｌをコードする、配列番号１９で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／Ａｌｌを取得した。
（５−２） ４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへ、８２番目のＶａｌをＡｌａへ、８４番目のＶａｌをＴｈｒへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、ＰＬＬＶＶと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（４）で得られたｐＢＳ／ＬＶ０を鋳型として、配列番号４２で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号５０で表される合成オリゴＤＮＡを用いて、５’−ＰＬＬ遺伝子断片を、また、配列番号４４で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号４９で表される合成オリゴＤＮＡを用いて３’−ＶＶ遺伝子断片をそれぞれ上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行った。反応後、実施例１（２）と同様にして該反応液を１．５％アガロースゲル電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した。回収したそれぞれの遺伝子断片、５’−ＰＬＬ遺伝子断片の５’末端に位置するＴ３プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）および３’−ＶＶ遺伝子断片の３’末端に位置するＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応からｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列ＰＬＬＶＶをコードする、配列番号２０で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＰＬＬＶＶを取得した。
（５−３） ２２番目のＡｓｎをＴｈｒへ、４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへ、８２番目のＶａｌをＡｌａへ、８４番目のＶａｌをＴｈｒへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、ＮＰＬＬＶＶと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（４）で得られたｐＢＳ／ＬＶ０を鋳型として、配列番号４２で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号４３で表される合成オリゴＤＮＡを用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、ＮＰＬＬ遺伝子断片を増幅し、実施例１（２）と同様にして該反応液を１．５％アガロースゲル電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した。回収したＮＰＬＬ遺伝子断片および配列番号５０で表される合成オリゴＤＮＡを用いて上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、５’−ＮＰＬＬ遺伝子断片を増幅し、実施例１（２）と同様にして該反応液を１．５％アガロースゲル電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した。回収した５’−ＮＰＬＬ遺伝子断片、上記（５−２）で得られた３’−ＶＶ遺伝子断片、Ｔ３プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）およびＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−２）と同様にしてＰＣＲ反応から、ｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列ＮＰＬＬＶＶをコードする、配列番号２１で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＮＰＬＬＶＶを取得した。
（５−４） ２２番目のＡｓｎをＴｈｒへ、３５番目のＴｙｒをＰｈｅへ、４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、ＮＹＰＬＬと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
上記（５−４）で得られたｐＢＳ／ＮＰＬＬＶＶを鋳型として、配列番号５０で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号５３で表される合成オリゴＤＮＡを用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、５’−ＮＹＰＬＬ−１遺伝子断片を回収した。一方、実施例１（４）で得られたｐＢＳ／ＬＶ０を鋳型として、配列番号４４で表される合成オリゴＤＮＡとＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、３’−ＬＶ０遺伝子断片を回収した。５’−ＮＹＰＬＬ−１遺伝子断片、３’−ＬＶ０遺伝子断片、Ｔ３プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）およびＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−２）と同様にしてＰＣＲ反応から、ｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列ＮＹＰＬＬをコードする、配列番号２２で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＮＹＰＬＬを取得した。
（５−５） ２２番目のＡｓｎをＴｈｒへ、３５番目のＴｙｒをＰｈｅへ、４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへ、６９番目のＡｓｐをＳｅｒへ、７０番目のＰｈｅをＴｙｒへ、７１番目のＴｈｒをＳｅｒへ、８２番目のＶａｌをＡｌａへ、８４番目のＶａｌをＴｈｒへそれぞれへ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
上記（５−４）で得られたｐＢＳ／ＮＹＰＬＬを鋳型として、配列番号４５で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号５０で表される合成オリゴＤＮＡを用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、５’−ＮＹＰＬＬ−２遺伝子断片を回収した。一方、上記（５−１）で得られたｐＢＳ／Ａｌｌを鋳型として、配列番号４４で表される合成オリゴＤＮＡおよびＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、３’−３Ａｌｌ遺伝子断片を回収した。５’−ＮＹＰＬＬ−２遺伝子断片、３’−３Ａｌｌ遺伝子断片、Ｔ３プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）およびＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−２）と同様にしてＰＣＲ反応から、ｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的の配列番号２７に示されるアミノ酸配列ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌをコードする、配列番号２３で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌを取得した。
（５−６） ４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、６９番目のＡｓｐをＳｅｒへ、７０番目のＰｈｅをＴｙｒへ、７１番目のＴｈｒをＳｅｒへそれぞれ変換した改変体のアミノ酸配列（以下、ＰＬＤＦＴと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（４）で得られたｐＢＳ／ＬＶ０を鋳型として、配列番号５１で表される合成オリゴＤＮＡとＭ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、５’−ＰＬ遺伝子断片を回収した。一方、ｐＢＳ／ＬＶ０を鋳型として、配列番号５２で表される合成オリゴＤＮＡとＭ１３Ｍ２０プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、３’−ＤＦＴ遺伝子断片を回収した。５’−ＰＬ遺伝子断片、３’−ＤＦＴ遺伝子断片、Ｍ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）およびＭ１３Ｍ２０プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−２）と同様にしてＰＣＲ反応から、ｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的の配列番号２８に示されるアミノ酸配列ＰＬＤＦＴをコードする、配列番号２４で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＰＬＤＦＴを取得した。
（５−７） ４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへ、６９番目のＡｓｐをＳｅｒへ、７０番目のＰｈｅをＴｙｒへ、７１番目のＴｈｒをＳｅｒへそれぞれ変換した改変体のアミノ酸配列（以下、ＰＬＬＤＦＴと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
上記で得られたｐＢＳ／ＰＬＬＶＶを鋳型として、配列番号４５で表される合成オリゴＤＮＡとＭ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、５’−ＰＬＬ遺伝子断片を回収した。５’−ＰＬＬ遺伝子断片、上記（５−６）で得られた３’−ＤＦＴ遺伝子断片、Ｍ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）およびＭ１３Ｍ２０プライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−２）と同様にしてＰＣＲ反応から、ｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的の配列番号２９に示されるアミノ酸配列ＰＬＬＤＦＴをコードする、配列番号２５で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＰＬＬＤＦＴを取得した。
［実施例２］
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の発現
（１）抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の適当な位置に実施例１（２）および（４）で取得したアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０またはアミノ酸配列ＬＶ０をコードするｃＤＮＡおよびこれらの改変体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを挿入し、各種抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体発現ベクターを以下のようにして構築した。
アミノ酸配列ＣａｍＨＶ０、ＱＡＲおよびＱＧＡＲをコードするｃＤＮＡとｐＫＡＮＴＥＸ９３をそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＩで処理し、１．５％アガロースゲル電気泳動により、それぞれ約０．５ｋｂｐ、１２ｋｂｐの遺伝子断片を分離、回収した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてｐＫＡＮＴＥＸ９３とアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０、ＱＡＲおよびＱＧＡＲをコードする遺伝子断片を連結し、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＡＲおよびｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲを取得した。
次にＶＬｃＤＮＡを挿入するため、アミノ酸配列ＬＶ０、ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌ、ＰＬＤＦＴおよびＰＬＬＤＦＴをコードするｃＤＮＡと上記で得られたｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＡＲおよびｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで処理した後、１．５％アガロースゲル電気泳動により、それぞれ約０．４５ｋｂｐ、１２．５ｋｂｐの遺伝子断片を分離し、ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて回収した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＡＲまたはｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲと各種ＶＬ遺伝子断片とを連結反応させ、連結反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換株よりミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付説明書に従いプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析し、第２図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＡＲ／ＬＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲ／ＬＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌ、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴおよびｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴを取得した。
（２）抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた安定発現
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた安定発現は、以下のように行った。
実施例２の（１）で得られた各抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体発現ベクターの１０μｇを４×１０^６細胞のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）により導入後、４０ｍＬのＨ−ＳＦＭ（５）培地［ＦＣＳを５％含むＨ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換体のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、実施例２（５）に記載のヒトＩｇＧ定量ＥＬＩＳＡを行い抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体発現細胞の選択を行った。
培養上清中に抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の発現が認められたウェルの形質転換体については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ｄｈｆｒ遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと表記する）の阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＨ−ＳＦＭ（５）に１〜２×１０^５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェル培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換体がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の濃度を、実施例２（５）に記載のヒトＩｇＧ定量ＥＬＩＳＡに準じて行い抗体発現量を確認した。
培養上清中に抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の発現が認められたウェルの形質転換体については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨ−ＳＦＭ（５）で増殖可能かつ、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体を高発現する形質転換体を得た。該形質転換体の培養上清中に含まれるヒトＩｇＧの定量を実施例２（５）に記載のヒトＩｇＧ定量ＥＬＩＳＡにより行い、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の発現量の最も多いＭＴＸ耐性形質転換体を取得した。ＭＴＸ耐性形質転換体は必要に応じて、１〜２回の限界希釈法による単一細胞化を行い、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の発現量の最も多い形質転換クローンを取得した。
以下において、各抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をそれぞれのＶ領域のアミノ酸配列を組み合わせて、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０が導入された形質転換体から生産される抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をＣａｍＨＶ０／ＬＶ０と、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＡＲ／ＬＶ０が導入された形質転換体から生産される抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をＱＡＲ／ＬＶ０と、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲ／ＬＶ０が導入された形質転換体から生産される抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をＱＧＡＲ／ＬＶ０と、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌが導入された形質転換体で生産される抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体からＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌと、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴが導入された形質転換体から生産される抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴとおよびプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴが導入された形質転換体から生産される抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴとそれぞれ称す。
（３）抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の培養上清からの精製
実施例２（２）で得られた各抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体を発現する形質転換体を、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭ、を含むＧＩＴ培地（大日本製薬社製）５００ｍＬに、１〜２×１０^５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、２Ｌローラーボトル（ファルコン社製）に分注した。３７℃インキュベーター内で７〜８日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清約１ＬよりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、各種抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体を精製した。
（４）抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の抗原への結合活性の評価（結合ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレートに固定化する抗原としては、ｈＩＧＦ−Ｉ（藤沢薬品社製）とメチル化ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）とのコンジュゲートを作製して、使用した。すなわち、蒸留水に溶解したメチル化ＢＳＡを、メチル化ＢＳＡ：ｈＩＧＦ−Ｉ＝１：８（重量比）になるように４℃で混合し、１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌して、メチル化ＢＳＡとｈＩＧＦ−Ｉのコンジュゲートを取得した（以下、ｍＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉと記す）。
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、上述のｍＢＳＡ−ｈＩＧＦ−ＩをｈＩＧＦ−Ｉの濃度として２０ｎｇ／ｍＬで５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと記す）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、各種形質転換体の培養上清あるいは精製した各種抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体を５０μＬ／ウェルで分注し、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと記す）で洗浄後、２０００倍に希釈したＨＲＰ標識化抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体として５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と記す）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
（５）ヒトＩｇＧ定量ＥＬＩＳＡ（サンドイッチＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）をＰＢＳで２０００倍に希釈し、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させプレートを作製した。ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて残存する活性基をブロックする操作以降の操作は、上記の実施例２（４）に記載の結合ＥＬＩＳＡと同様に行った。
［実施例３］
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の反応性の確認
実施例２（３）で得られた各種抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の精製標品については、実施例２（４）に記載の結合ＥＬＩＳＡ、または下記に示す実施例３（２）に記載のバイオセンサービアコア（ビアコア社製）を用いたｈＩＧＦとの結合親和性の測定法などを用いて、ｈＩＧＦへの結合活性を検討した。以下の検討において、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２は、参考例６（４）に記載の方法に従って精製したものを用いた。
（１）ｍＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉに対する結合ＥＬＩＳＡ
実施例２（３）に記載した方法により精製した各種抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｍＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉへの結合活性を検討した。結果を第３図に示した。第３図ａに示したように、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＣＤＲのみをヒト抗体ＣａｍのＦＲおよびＶＬのサブグループＩＶの共通配列のＦＲに移植した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０では、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２に比べ、ｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性が約１／５０に低下していた。そこで、各ＦＲのアミノ酸を改変することによりｈＩＧＦ−Ｉ結合活性の増加を検討した。
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０からＶＨの１番目のＧｌｎをＧｌｕへ、９７番目のＡｌａをＴｈｒへ、９８番目のＡｒｇをＴｈｒへそれぞれ改変した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＡＲ／ＬＶ０では、第３図ａに示したように、ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０に比べてｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性の増加は認められなかった。しかし、１番目のＧｌｎをＧｌｕへ、９７番目のＡｌａをＴｈｒへ、９８番目のＡｒｇをＴｈｒへのアミノ酸改変に加えて、４２番目のＧｌｙをＴｈｒへ改変した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０では、第３図ａに示したように、ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０と比較して約２５倍の結合活性の上昇が認められ、その活性は、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２の結合活性の約１／２であった。
以上の結果から、ＣａｍＨＶ０の１番目のＧｌｎをＧｌｕへ、９７番目のＡｌａをＴｈｒへ、９８番目のＡｒｇをＴｈｒへのアミノ酸改変に加えて、４２番目のＧｌｙをＴｈｒへ改変することでｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性を上昇させることが可能であること、また、三次元構造モデルでは活性への寄与が不明であった４２番目のＧｌｙは、本抗体の活性に非常に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
一方、ＶＬの改変体については、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０からＶＬの２２番目のＡｓｎをＴｈｒへ、３５番目のＴｙｒをＰｈｅへ、４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへ、６９番目のＡｓｐをＳｅｒへ、７０番目のＰｈｅをＴｙｒへ、７１番目のＴｈｒをＳｅｒへ、８２番目のＶａｌをＡｌａへ、８４番目のＶａｌをＴｈｒへそれぞれ改変した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３ＡｌｌのｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性は、第３図ａに示したように、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０と比較して約２５倍の結合活性の上昇が認められ、その活性は、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２の結合活性の約１／２の結合活性であった。以上の結果から、上記のＶＬの改変によってｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性を上昇させることが可能であることが明らかとなった。そこで、アミノ酸配列がＱＧＡＲであるＶＨとアミノ酸配列がＮＹＰＬＬ３ＡｌｌであるＶＬとを組み合わせた抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３ＡｌｌのｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性を検討した。結果を第３図ｂに示した。その結果、このようなＶＨとＶＬを組み合わせた抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌは、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２と同等の結合活性を示すことが確認された。
次に、ＶＬの改変体ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌの１０残基の改変したアミノ酸残基の中から、活性上昇に重要なアミノ酸残基を特定するため、改変アミノ酸残基数が少ないアミノ酸配列がＰＬＤＦＴであるＶＬの改変体およびＰＬＬＤＦＴであるＶＬの改変体と、アミノ酸配列がＱＧＡＲであるＶＨの改変体とをぞれぞれ組み合わせた抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴおよび抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴのｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性を検討した。
結果を第３図ｂに示した。その結果、これら２種類の抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴおよび抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴは、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２と同等のｈＩＧＦ−Ｉへの結合活性を示すことが明らかとなった。
（２）バイオセンサービアコアを用いた結合親和性の測定
抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２と上記の実施例２（３）で精製した各種抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩへの結合活性をバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ２０００（ビアコア社製）を用いて以下のようにして、結合親和性として測定した。サンプルの希釈と測定中の反応緩衝液には、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｐＨ７．４）（ビアコア社製）を用いた。
センサーチップＣＭ−５（ビアコア社製）に、アミンカップリングキット（ビアコア社製）を用いて、１８．５ｐｇ／ｍｍ^２でリコンビナントｈＩＧＦ−Ｉ（藤沢薬品社製）を、２６．７ｐｇ／ｍｍ^２でｈＩＧＦ−ＩＩ（Ｒ＆Ｄ社製）を固定化し、アナライトとして１０μｇ／ｍＬより２倍希釈で５段階に希釈した各種抗体を、流速５μＬ／分で４分間添加し、結合反応を観察した後、５分間にわたって解離反応を観察した。解離反応後、３０ｍＭ塩酸の５μＬを１回添加してセンサーチップ表面を再生した。反応は２５℃で行った。各濃度における反応曲線から、結合速度定数Ｋａｓｓおよび解離速度定数Ｋｄｉｓｓを算出し、これから各抗体の結合定数Ｋ_Ａ（Ｍ^−１）を算出した。結果を第３表に示した。

抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０は、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２に比べ、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａが、それぞれ約１／１７、約１／６に低下していた。
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＡＲ／ＬＶ０では、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０に比べて結合親和性の増加は殆ど認められないが、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０では、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａが、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０に比べて、約５倍増加した。
一方、ＶＬの抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌでは、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａが、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０に比べて、それぞれ約８倍、約５倍増加していた。更に、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌでは、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａが、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０に比べて、それぞれ約１４倍、約１０倍増加していた。
改変アミノ酸残基が最適化されたアミノ酸配列ＰＬＤＦＴまたはアミノ酸配列ＰＬＬＤＦＴを有するＶＬとアミノ酸配列ＱＧＡＲを有するＶＨを組み合わせた抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴまたは抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴのｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合親和性は、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌおよび抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２とほぼ同等であり、改変アミノ酸残基の減少よる活性低下は認められなかった。
［実施例４］
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ依存性増殖阻害効果
上記実施例２（３）で得られた抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体精製標品のｈＩＧＦ依存性増殖に対する阻害活性を以下のようにして確認した。
ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）をＴＦ／ＢＳＡ培地［Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）に１０μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）、２００μｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した培地］で５×１０^４細胞／ｍＬに調製し、９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルで分注した。さらに、ＴＦ／ＢＳＡ培地で４０〜８０ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈したｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩを５０μＬ／ウェルで、ＴＦ／ＢＳＡ培地で各濃度に希釈した各抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体を５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で５日間培養した。培養後、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ社製）を２０μＬ／ウェルで分注し、さらに、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で２〜３時間培養した後に、ＯＤ４５０ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４５０と表記する）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
結果を第４図から第６図にそれぞれ示した。各抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ依存性増殖に対する阻害活性は、上記実施例３の結合ＥＬＩＳＡによるｈＩＧＦ−Ｉとの結合活性およびバイオセンサービアコアを用いて測定したｈＩＧＦとの結合親和性の測定結果と良く相関していた。即ち、高いｈＩＧＦとの結合親和性を有する抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体は、高いｈＩＧＦ依存性増殖に対する阻害活性を有しており、作製した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のうち、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌ、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴ、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴは、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２と同等のｈＩＧＦ依存性増殖に対する阻害活性を有していることが示された。
以上の結果は、本実施例で作製した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌ、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴおよび抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴが、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩに対する高い結合親和性およびｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩの生物活性に対する高い中和活性を有していることを示している。また、これらの抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体は、そのほとんどのアミノ酸残基がヒト抗体の配列に由来することから、ｈＩＧＦの機能がその病態形成に関わる様々なヒト疾患の治療薬として有用である。
参考例
（参考例１）
抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の作製
（１）非ヒト動物の免疫
組換え型ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）は、免疫原性を高める目的で以下の方法でメチル化ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、２回蒸留水に溶解したメチル化ＢＳＡを、メチル化ＢＳＡ：ｈＩＧＦ−Ｉ＝１：４（重量比）になるように４℃で混合し、１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌した。その後、連結針付きシリンジを用いて完全フロインドアジュバントあるいは不完全フロインドアジュバントと容量比１：１で混合し、免疫原（以下、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉアジュバンドと記す）とした。
５週令雌ＳＤラットに、完全フロインドアジュバントを用いて上記のように調製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉアジュバンド（１００μｇのｈＩＧＦ−Ｉ相当量）を投与し、２週間後より不完全フロインドアジュバントを用いて同様に調製した免疫原を１週間に１回、計４回投与した。
眼底静脈叢より採血し、その血清中の抗体価を参考例１（４）項に示す結合ＥＬＩＳＡで調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し、赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に使用した。
（２）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を通常培地で培養し、細胞融合時に２×１０^７個以上の細胞を確保して、細胞融合に使用した。
（３）ハイブリドーマの作製
参考例１（１）項で得られたラット脾細胞と（２）項で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞に３７℃で攪拌しながら、１．０×１０^２個のラット脾細胞あたり０．２〜１．０ｍＬの融合培地（２ｇのＰＥＧ−１０００、２ｍＬのＭＥＭ、０．７ｍＬのジメチルスルホキシドの混液）を加え、１〜２分間毎に１〜２ｍＬのＭＥＭ培地を数回加えた後、さらに、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、緩やかに細胞をほぐした後、１００ｍＬのＨＡＴ培地｛通常培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地に１．５ｍＭグルタミン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび１０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳと記す）を加えた培地］に０．１ｍＭヒポキサンチン、１５μＭチミジンおよび０．４μＭアミノプテリンを加えた培地｝に懸濁した。
この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。この培養上清を参考例１（４）項に示す結合ＥＬＩＳＡを用いて、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉに反応して、陰性対照であるメチル化ＢＳＡ−ＢＳＡ［ＢＳＡを用いて上記参考例１（１）と同様の反応を行い作製したコンジュゲート］に反応しないウェルを選び、さらにＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）と通常培地に換え、２回の単一細胞化を行い、抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。
その結果、第７図に示した反応性を有する抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６９、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７０、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７１、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７２および抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７３をそれぞれ産生する６クローンのハイブリドーマを取得した。各ハイブリドーマが産生する抗体のサブクラスを、サブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡにより検討した結果、いずれもＩｇＧ２ｂであった。
（４）モノクローナル抗体の選択（結合ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレートに固定化する抗原としては、参考例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉおよび陰性対照としてメチル化ＢＳＡ−ＢＳＡを用いた。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、上述の抗原をｈＩＧＦ−ＩあるいはＢＳＡの濃度として１０μｇ／ｍＬで５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと記す）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、被免疫ラット抗血清、抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清あるいは精製した抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体を５０μＬ／ウェルで分注し、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと記す）で洗浄後、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を二次抗体として５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と記す）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
（５）モノクローナル抗体の精製 プリスタン処理した８週令Ｂａｌｂ／ｃヌード雌マウスに参考例１（３）で得られたハイブリドーマを５〜２０×１０^６細胞／匹でそれぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマが腹水癌化したマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去した。その後、カプリル酸沈殿法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）によりＩｇＧ画分を精製し、精製モノクローナル抗体とした。
（参考例２）
抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体の反応性の検討
（１）ｈＩＧＦ−Ｉの天然の立体構造に対する反応性
参考例１（３）で選択された６種類の抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を保つｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を、以下に示す競合ＥＬＩＳＡで調べた。
参考例１（４）に示した、参考例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉを固定化したプレートを準備し、２０μｇ／ｍＬより５倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−Ｉを５０μＬ／ウェルで分注後、抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体の精製抗体を希釈した溶液（抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８：６．０μｇ／ｍＬ、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７０：１．０μｇ／ｍＬ、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７１：０．１６μｇ／ｍＬ、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７２：７．０μｇ／ｍＬ、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７３：１．２μｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で２時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
第８図に示したように、抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体はいずれもｈＩＧＦ−Ｉの液層中の天然の立体構造と反応性を示した。また、本系において、最も高い感度を示した抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８では、液相系に含まれる１６ｎｇ／ｍＬまでの濃度の天然の立体構造を有するｈＩＧＦ−Ｉを検出可能であった。
（２）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉの競合的ＥＬＩＳＡでの反応性
抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８は、上記（１）においてｈＩＧＦ−Ｉの立体構造を認識している可能性が示唆された。しかしながら、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８は、アミノ酸一次配列を認識している可能性も考えられるため、ｈＩＧＦ−Ｉ部分ペプチドとの反応性を解析した。
（２−１）ｈＩＧＦ−Ｉの部分ペプチドの合成
ＷＯ０１／６４７５４に記載の方法に従って、ｈＩＧＦ−Ｉの部分ペプチドを合成した。合成したペプチドは、ｈＩＧＦ−Ｉの１−１８番目（配列番号５６、以下、ｐ１−１８と記す）、１４−３０番目（配列番号５７、以下、ｐ１４−３０と記す）、２４−３５番目（配列番号５８、以下、ｐ２４−３５と記す）、２９−４１番目（配列番号５９、以下、ｐ２９−４１と記す）、３６−４７番目（配列番号６０、以下、ｐ３６−４７と記す）、４１−５６番目（配列番号６１、以下、ｐ４１−５６と記す）、５２−７０番目（配列番号６２、以下、ｐ５２−７０と記す）、５３−６１番目（配列番号６３、以下、ｐ５３−６１と記す）、６１−７０番目（配列番号６４、以下、ｐ６１−７０と記す）に相当するペプチドであり、ｈＩＧＦ−Ｉの全長を網羅するように設計した。上記ペプチドにおいては、内部に存在するＣｙｓについては、ＳｅｒあるいはＡｌａに置換した配列を合成した。また、４１−５６番目に相当する配列については、内部のＣｙｓを有する配列（配列番号６５、以下、ｐ４１−５６Ｃと記す）も合成した。
（２−２）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の抗原認識部位の解析
上記（２−１）で合成した各種ペプチドを用いて、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の抗原認識部位の解析を以下に示す競合ＥＬＩＳＡで検討した。
参考例１（４）に示したように抗原を固定化したプレートを準備し、４．０μｇ／ｍＬに希釈した抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を５０μＬ／ウェルで分注後、５０μｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に希釈した各種ペプチド溶液の単独あるいは種々の組合せ、あるいはｈＩＧＦ−Ｉを５０μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、二次抗体として４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のＯＤ４１５を１００とした相対値（％）で表示した。
結果を第９図に示した。第９図に示したように、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合は、ｈＩＧＦ−Ｉにより濃度依存的に阻害されたが、各種ペプチドでは、単独あるいは組合せに拘わらず、阻害活性は認められなかった。以上の結果は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８が、ｈＩＧＦ−Ｉの単なるアミノ酸一次配列ではなく、ｈＩＧＦ−Ｉの立体構造を認識していることを強く示唆する。
（３）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の競合的ＥＬＩＳＡによる交差反応性の確認
精製した抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩＩおよびヒトインスリンに対する交差反応性を、以下に示した競合ＥＬＩＳＡで検討した。抗原としては、ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）、ｈＩＧＦ−ＩＩ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）およびヒトインスリン（和光純薬社製）を使用した。
参考例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉ抗原、あるいは参考例１（１）と同様に作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−ＩＩ抗原を、参考例１（４）項に示した方法に従って、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉ抗原は０．１μｇ／ｍＬの濃度で、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−ＩＩ抗原は１．０μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ固定化したプレートを準備し、０．６μｇ／ｍＬに希釈した抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８を２５μＬ／ウェルで分注後、２０μｇ／ｍＬより４倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩあるいはヒトインスリンを２５μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、二次抗体として抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の場合は、１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて使用した。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のＯＤ４１５を１００として相対値（％）で表示した。
結果を第１０図に示した。第１０図Ａに示したように、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩで強く阻害された。同様に、第１０図Ｂに示したように、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩで強く阻害された。すなわち、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩとｈＩＧＦ−ＩＩの両方に同程度の強さで反応できることを示している。一方、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩへの結合は、ヒトインスリンでは阻害されなかった。
（参考例３）
抗ＩＧＦ抗体とＩＧＦとの反応性の確認
抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８と二種類の市販抗ｈＩＧＦ抗体との、抗原への反応性の比較を以下のようにして検討した。抗体としては、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。抗原としては、ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）、ｈＩＧＦ−ＩＩ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）およびヒトインスリン（和光純薬社製）を使用した。
（１）表面プラズモン共鳴を用いた結合強度の測定
抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８と、抗原であるｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性を解析するために、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体ｓｍ１．２、および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体Ｓ１Ｆ２の３種の抗体の、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合強度を表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ２０００（ビアコア社製）を用いて以下のように測定した。アナライトの希釈並びに測定中の反応緩衝液としては、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｐＨ７．４）（ビアコア社製）を用いた。
センサーチップＣＭ−５（ビアコア社製）に、アミンカップリング（ビアコア社製）を用いて、３６．０ｐｇ／ｍｍ^２でｈＩＧＦ−Ｉをあるいは４１．７ｐｇ／ｍｍ^２でｈＩＧＦ−ＩＩを固定化し、測定物として２０μｇ／ｍＬより２倍希釈で６段階に希釈した３種類の抗体を、流速２０μＬ／分で２分間添加した後、５分間にわたって測定物の解離を観察した。反応は２５℃で行った。各濃度における結合反応曲線から、結合速度定数Ｋａｓｓ、並びに解離速度定数Ｋｄｉｓｓを算出し、これから各抗体の結合定数Ｋ_Ａ（Ｍ^−１）を算出した。結合定数Ｋ_Ａは、Ｋ_Ａ＝Ｋａｓｓ／Ｋｄｉｓｓで計算される。結果を第４表に示した。


抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対するＫ_Ａは７．８６×１０^９Ｍ^−１であり、ｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａは８．６３×１０^９Ｍ^−１であった。抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａの比は、ほぼ１：１であり、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８はｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの両者に同程度に強力に結合できることが示された。一方、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体ｓｍ１．２のｈＩＧＦ−Ｉに対するＫ_Ａは１．８６×１０^８Ｍ^−１、ｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａは７．３５×１０^７Ｍ^−１であった。抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａは、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体ｓｍ１．２のＫ_Ａと比較してｈＩＧＦ−Ｉに対しては約４２倍、ｈＩＧＦ−ＩＩに対しては約１２０倍であった。また、市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体Ｓ１Ｆ２のｈＩＧＦ−Ｉに対するＫ_Ａは４．６２×１０^８Ｍ^−１、ｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａは２．４×１０^９Ｍ^−１であった。抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａは、市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体Ｓ１Ｆ２のＫ_Ａと比較してｈＩＧＦ−Ｉに対しては約１８倍、ｈＩＧＦ−ＩＩに対しては約３．６倍であった。すなわち抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２と比較して、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩのそれぞれに強い結合力を有していることが示された。
（参考例４）
ｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞の増殖に対する抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の影響
（１）ｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞の構築
以下のようにしてヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）にｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子を導入した形質転換体を作製した。
（１−１）ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子のクローニングおよび発現ベクターの作製
１×１０^７個のヒト肺癌細胞株ＰＣ−９細胞（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，３９，１５，１９７６）から、ＲＮＡ調製キットＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、４５．６μｇの全ＲＮＡを調製した。調製した全ＲＮＡのうち５μｇを使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ｃＤＮＡを合成した。
合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによってｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子をクローニングした。ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子増幅用のプライマーとして、配列番号６６と配列番号６７に示した塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを設計した。それぞれの合成ＤＮＡは５’末端にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、並びにｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。実際には、上述で得られたヒト肺癌細胞株ＰＣ−９細胞から合成したｃＤＮＡの２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ（＋）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＫＯＤ（＋）Ｂｕｆｆｅｒ １（東洋紡績社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、２ｍＭ塩化マグネシウム、１μＭの配列番号６６と６７に示した塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）を用いて、９４℃にて１分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間のサイクルを３０サイクル行った。それぞれの反応液５０μＬを制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）およびＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．５ｋｂのｈＩＧＦ−１をコードする遺伝子のＰＣＲ産物を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化後、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下、ＣＩＡＰと表記する；Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）で末端を脱リン酸化して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたそれぞれのＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとしＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）７．５μＬを加えて１６℃で一晩反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株より各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を決定した。その結果、目的であるｈＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子配列を有する第１１図に示したプラスミドｐＢＳ（ＩＩ）ＳＫ（−）／ｈＩＧＦ−Ｉを得た。
次に、上記で得られたｐＢＳ（ＩＩ）ＳＫ（−）／ｈＩＧＦ−ＩのｈＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を含む制限酵素断片（ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ）とｐＫＡＮＴＥＸ９３のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片とを連結して、第１１図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉを構築した。プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉの塩基配列を上記と同様に塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７を用いて決定した。その結果、目的のｈＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉを得た。
（１−２）ｈＩＧＦ−Ｉ形質転換体の作製
上記（１−１）で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉを動物細胞に導入して、ｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞を以下のよう作製した。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉを制限酵素ＡａｔＩＩ（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、８μｇを４×１０^６細胞のヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）により導入後、１５ｍＬのＲＰＭＩ培地［１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、Ｔ７５フラスコ（スミロン社製）に移した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．２ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示すＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ形質転換株（以下、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉと表記する）が取得された。
（２）Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の培養上清に産生されたｈＩＧＦ−Ｉの定量
上記（１）で作製したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞内において導入したｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子が発現して、該細胞がｈＩＧＦ−Ｉを産生しているかを確認するために、以下の実験を行った。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞をＲＰＭＩ培地で培養を行った後、培養上清を回収して、培養上清中に含まれるｈＩＧＦ−Ｉ量を以下のＥＬＩＳＡ法により測定した。
参考例１（４）に示した、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉを固定化したプレートを準備し、陽性対象として２μｇ／ｍＬより５倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−Ｉ、あるいはＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞またはＡ５４９細胞の培養上清を２５μｌ／ウェルで分注後、ＢＳＡ−ＰＢＳで０．６μｇ／ｍＬに希釈した抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の精製抗体を分注し、混合して室温で２時間反応させた。反応後Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで分注し、室温１時間で反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１０００倍希釈した抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで５回洗浄した後、ＡＢＴＳ基質溶液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘを用いて測定した。
結果を第１２図に示した。第１２図Ａに示したように、ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子が導入されていないＡ５４９細胞の培養上清に対してｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子が導入されたＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の培養上清では、明らかに結合活性は低下していることから、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞はｈＩＧＦ−Ｉを発現していることが示された。
（３）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞の増殖に対する影響
細胞自身が産生するｈＩＧＦ−Ｉに依存した細胞増殖（以下オートクリン細胞増殖と表記する）を抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８が阻害できるかを、上記（１）で作製したｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子導入細胞Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を用いて、調べた。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞を１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、ＲＰＭＩ培地と表記する）で培養した後、それぞれ２×１０^５個／ｍＬの細胞密度になるように１０μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン（ＧＩＢＣＯ社製）、２００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（−ＦＣＳ，−Ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、無血清培地と表記する）に懸濁した。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞の細胞懸濁液を９６ウェルプレート（スミロン社製）に１００μＬ／ウェルで分注した後、各ウェルに無血清培地で２００μｇ／ｍＬより５倍希釈系で段階的に希釈した抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で５日間培養した。培養後、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ社製）を２０μＬ／ウェルで分注し、さらに、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で４時間培養した後に、ＯＤ４５０をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
結果を第１３図に示した。横軸は、培養時の各ウェル中の抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８濃度を示した。破線に示される抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８非添加のＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の増殖性は、実線に示されるｈＩＧＦ−Ｉを産生しないＡ５４９細胞の増殖性と比較した場合、明らかに増加している。これは、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞が自己産生するｈＩＧＦ−ＩによってＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞自身の増殖を促すオートクリン増殖を示しているものである。この第１３図に表されるようなオートクリン増殖は、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の培養時に抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を添加した場合に、濃度依存的に阻害された。一方、Ａ５４９細胞の増殖性には、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８は影響を及ぼさなかった。すなわち、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８は、細胞自身が生産するｈＩＧＦ−Ｉによるオートクリン細胞増殖を阻害できることが示された。
（４）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞の足場非依存性増殖への影響
癌化した細胞は、軟寒天中などの細胞接着のない浮遊状態にも関わらず増殖することができる足場非依存性増殖能を有している。この足場非依存性増殖能は、細胞の造腫瘍性と非常に密接に関連しており、ｈＩＧＦ−Ｉが関与していると考えられている。抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８が細胞の足場非依存性増殖を阻害できるかを、上記（１）で作製したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を用いて、以下のようにして調べた。
暖めた０．３％ ａｇａｒ ｎｏｂｌｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）を含む、ＲＰＭＩ培地（以下、ａｇａｒ−ＲＰＭＩ培地と記す）を、１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）に１ｍＬ／ウェルで分注し、数十分室温で放置してゲル化させたプレートを準備した。Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞をＲＰＭＩ培地で培養した後、１×１０^３個／ｍＬの細胞密度になるように暖めたａｇａｒ−ＲＰＭＩ培地に懸濁した。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞の細胞懸濁液を、１ｍＬ／ウェルで各ウェルに層積した。数分間室温で放置し、ゲル化させた後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で４週間培養した。培養後、各ウェル内に形成されたコロニー数を顕微鏡下で測定した。
結果を第１４図に示した。第１４図に示したようにｈＩＧＦ−Ｉを産生するＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の足場非依存性の細胞増殖性は、Ａ５４９細胞の足場非依存性の細胞増殖性と比較して上昇していた。また、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の軟寒天中での培養時に１０μｇ／ｍＬの抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を添加した場合には、足場非依存性の細胞増殖は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８の添加により完全に阻害された。すなわち、足場非依存性の細胞増殖にはｈＩＧＦ−Ｉが関与しており、ｈＩＧＦ−Ｉ依存的な足場非依存性の細胞増殖は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８により阻害されることが示された。
（５）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞に対する腫瘍増殖阻害効果
上記（１）で作製したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を用いて、ｈＩＧＦ−Ｉが関与するｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍形成に対する、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の腫瘍増殖阻害効果を、以下のように検討した。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞をＲＰＭＩ培地で培養した後、それぞれ１×１０^６個／ｍＬの細胞密度になるようにＰＢＳに懸濁した。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞の細胞懸濁液の１００μＬを６週齢、ヌードマウスＢａｌｂ／ｃ Ａｊｃ−１ ｎｕ（メス）の右胸部に皮下移植した。マウス１匹当たりの移植した細胞数は、１×１０^７個となる。移植直後から、マウス１匹につき５００μｇの抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を１週間に２回、合計８回にわたって尾静脈から投与した。陰性対象として、同一の腫瘍皮下移植マウスに対してＰＢＳ投与を同時に行った。細胞移植から５日間経過時点から、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）は、腫瘍の長径、短径および高さから、長径×短径×高さ×０．５２３６の式を用いて、算出した。
結果を第１５図に示した。Ａ５４９細胞とｈＩＧＦ−Ｉを生産しているＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を移植したマウスの間で、皮下腫瘍の増殖性を比較したとき、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を移植したマウスの皮下腫瘍の方が、腫瘍の増殖は亢進していた。また、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を移植したマウスでは、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を投与した場合、皮下腫瘍の増殖は、顕著に阻害された。このことは、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８が、ｈＩＧＦ−Ｉの阻害によりｉｎ ｖｉｖｏにおいても腫瘍の増殖を阻害できることを明確に示している。
（参考例５）
抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の遺伝子クローニング
抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶ領域をコードするｃＤＮＡを以下のようにして、単離、解析した。
（１）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８産生ハイブリドーマからのｍＲＮＡの調製
５×１０^７個の抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８産生ハイブリドーマ細胞ＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）より、ｍＲＮＡの調製キットであるＦａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ハイブリドーマＫＭ１４６８細胞由来のｍＲＮＡを２７μｇ調製した。
（２）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記（１）で取得したハイブリドーマＫＭ１４６８細胞のｍＲＮＡの５μｇから、ＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプター配列が連結されたｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡの全量を２０μＬの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＧクラス抗体のＨ鎖に対応する約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片とκクラスのＬ鎖に対応する約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてそれぞれ約１．０μｇ回収した。次に、λＺＡＰＩＩ Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、ＶＨとＶＬそれぞれのｃＤＮＡ断片０．１μｇ相当と、キットに添付されている制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅで末端を脱リン酸化されたλＺＡＰＩＩベクターの１μｇを、添付の使用説明書に従い、連結した。連結後のそれぞれの反応液のうち２．５μＬをＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングし、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーとして５×１０^４個、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブラリーとして４×１０^４個のファージクローンを取得した。次に、各々のファージを常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）に従い、ナイロンメンブレンフィルターＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）上に固定した。
（３）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡのクローニング
上記（２）で作製した抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリー、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブリーのナイロンメンブレンフィルターを、ＥＣＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のＣ領域のｃＤＮＡ［Ｈ鎖はマウスＣγ２ｂのｃＤＮＡ断片（Ｎａｔｕｒｅ，２８３，７８６ １９８０）、Ｌ鎖はマウスＣκのｃＤＮＡ断片（Ｃｅｌｌ，２２，１９７，１９８０）］をプローブとして検出し、プローブに強く結合したファージクローンをＨ鎖、Ｌ鎖各１０クローン取得した。次に、λＺＡＰＩＩ Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の使用説明書に従い、ｉｎｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎ法により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従って反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長の機能的なＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１４６８Ｈ５−２およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１４６８Ｌ５−１を得た。
（４）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶ領域のアミノ酸配列の解析
プラスミドｐＫＭ１４６８Ｈ５−２に含まれていた抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨの全塩基配列を配列番号１に、それから推定された抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨの全アミノ酸配列を配列番号２に、プラスミドｐＫＭ１４６８Ｌ５−１に含まれていた抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬの全塩基配列を配列番号３に、それから推定された抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬの全アミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示した。なお、配列番号２および４に記載したアミノ酸配列にそれぞれ対応する塩基配列は、配列番号１および３に記載したもの以外に無数に存在するが、それらはすべて本発明の範囲に包含される。既知の抗体の配列データ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）との比較および精製した抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬのＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖をコードする完全長ｃＤＮＡであり、ＶＨについては、配列番号２に示したアミノ酸配列の１から１９番目が、ＶＬについては、配列番号４に示したアミノ酸配列の１から２２番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
次に、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベース［ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（Ｒｅｌｅａｓｅ ３９．０）、ＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒｅｌｅａｓｅ ６５．０）］をＢＬＡＳＴ法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０，１９９０）により検索した。その結果、ＶＨおよびＶＬともに完全に一致する配列は認められず、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬは新規なアミノ酸配列を有していることが確認された。
また、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５、６および７に、ＶＬのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号８、９および１０にそれぞれ示した。
（参考例６）
抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の作製
（１）抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒトＩｇＧ１、κクラスの抗体を発現できるヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と参考例５（３）で得られた抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドを用いて抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８に由来する抗ｈＩＧＦ−Ｉヒト型キメラ抗体発現ベクターを以下のようにして構築した。
まず、ＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬｃＤＮＡをアミノ酸配列が変化しないように発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３に挿入するため、ＰＣＲによって抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬｃＤＮＡを再構築した。プライマーとして、ＶＨｃＤＮＡ用に配列番号６８と配列番号６９の塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを、ＶＬｃＤＮＡ用に配列番号７０と配列番号７１の塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを設計した。それぞれの合成ＤＮＡは５’末端にｐＫＡＮＴＥＸ９３へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。実際には、参考例５（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１４６８Ｈ５−２の２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭの配列番号６７と６８に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９８℃にて１５秒間、６５℃にて２秒間、７４℃にて３０秒間のサイクルを２５サイクル行った。同様に、参考例５（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１４６８Ｌ５−１の２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭの配列番号６９と７０に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、上記と同様の方法でＰＣＲを行なった。それぞれの反応液１０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．５ｋｂのＶＨのＰＣＲ産物、約０．４３ｋｂのＶＬのＰＣＲ産物をそれぞれ回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）で消化後、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下、ＣＩＡＰと表記する；Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）で末端を脱リン酸化して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたそれぞれのＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）７．５μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）０．３μＬを加えて２２℃で一晩反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株より各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を決定した。こうして目的の塩基配列を有する第１６図に示したプラスミドｐＫＭ１４６８ＶＨおよびｐＫＭ１４６８ＶＬを得た。
次に、上記で得られたｐＫＭ１４６８ＶＨのＶＨｃＤＮＡを含む制限酵素断片（ＮｏｔＩ−ＡｐａＩ）をヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ部位に挿入し、第１７図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｈを構築した。さらに、上記で得られたｐＫＭ１４６８ＶＬのＶＬｃＤＮＡを含む制限酵素断片（ＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ）をプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８ＨのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ部位に挿入し、第１７図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉを構築した。プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉを用いて、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＶＨおよびＶＬｃＤＮＡの塩基配列を決定した結果、目的のＶＨおよびＶＬｃＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
（３）抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
上記（２）で得られた抗ｈＩＧＦキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉを用いて抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の動物細胞での発現を以下のようにして行った。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉを制限酵素ＡａｔＩＩ（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、１０μｇを４×１０^６細胞のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）により導入後、４０ｍＬのＨ−ＳＦＭ（５）培地［ＦＣＳを５％含むＨ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換体のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の濃度を後述の本参考例（５）に示す結合ＥＬＩＳＡにより測定した。
培養上清中に抗ｈＩＧＦキメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換体については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ｄｈｆｒ遺伝子産物のＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＨ−ＳＦＭ（５）に１〜２×１０^５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェル培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換体を誘導した。形質転換体がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の濃度を後述の本参考例（５）に示す結合ＥＬＩＳＡにより測定した。培養上清中に抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換体については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨ−ＳＦＭ（５）で増殖可能かつ、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体を高発現する形質転換体を得た。得られた形質転換体については、２回の限界希釈法による単一細胞化を行い、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の発現の最も高い形質転換体を得た。抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８に由来する抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体産生形質転換細胞株としては、形質転換体ＫＭ３００２があげられる。なお、形質転換体ＫＭ３００２は、平成１４年４月２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６ 郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７９９６として寄託されている。
（４）抗ｈＩＧＦキメラ抗体の培養上清からの精製
参考例５（３）で得られた抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体を発現する形質転換細胞株ＫＭ３００２を、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭ、Ｄａｉｇｏ’ｓ ＧＦ２１（和光純薬社製）を５％の濃度で含むＨ−ＳＦＭに１〜２×１０^５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１７５ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１００ｍＬずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で５〜７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清約１ＬよりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２を精製し、約１０．２ｍｇの精製蛋白質を取得した。得られた抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２の約４μｇを、公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）に従って電気泳動し、分子量および精製度を調べた。その結果を第１８図に示した。精製した抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２は、非還元条件下では分子量が約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）の１本のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、ＩｇＧクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）と一致し、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。また、精製した抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて解析した結果、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列と一致することを確認した。
（５）抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のｈＩＧＦに対する反応性
抗ｈＩＧＦラット抗体ＫＭ１４６８および抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を参考例１（４）に示したＥＬＩＳＡにより検討した。ただし、ＥＬＩＳＡプレートに固定化したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉの濃度は、０．５μｇ／ｍＬ、二次抗体として、ラット抗体の場合は、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）、キメラ抗体の場合は、１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ１抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて行った。第１９図に示したように、抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２は、ｈＩＧＦ−Ｉに対する抗体濃度依存的な結合活性を示した。また、その活性は、二次抗体が異なるため、直接の比較は困難であるが、抗ｈＩＧＦラット抗体ＫＭ１４６８と同等であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
本発明は、ヒトインスリン様成長因子−Ｉ（以下、ｈＩＧＦ−Ｉと記す）およびヒトインスリン様成長因子−ＩＩ（以下、ｈＩＧＦ−ＩＩと記す）と特異的にかつ同程度の強さで結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を生産する形質転換体、該抗体または該抗体断片の製造法および該抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬を提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドｐＢＳ／ＣａｍＨＶ０およびｐＢＳ／ＬＶ０の造成工程を示した図である。
第２図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０の造成工程を示した図である。
第３図は、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ−Ｉに対する特異的な反応性を示した図である（結合ＥＬＩＳＡ）。横軸は抗体濃度を、縦軸は結合活性を吸光度（４１５ｎｍ）でそれぞれ示す。ａには、□で示した抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２、○で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０、△で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＡＲ／ＬＶ０、■で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０および●で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌの結果を、ｂには□で示した抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２、○で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０、◇で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０、△で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌ、●で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴおよび■で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴの結果をそれぞれ示す。
第４図は、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ依存的な細胞増殖阻害効果を示した図である。ａは１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、ｂは２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩ存在下での結果をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が細胞の増殖の値を吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）でそれぞれ示す。図中実線はｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインを、破線はｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ非添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインをそれぞれ示す。□は抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２、○は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０、△は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＡＲ／ＬＶ０、■は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０の結果をそれぞれ示す。
第５図は、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ依存的な細胞増殖阻害効果を示した図である。ａは１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、ｂは２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩ存在下での結果をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が細胞の増殖の値を吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）でそれぞれ示す。図中実線はｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインを、破線はｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ非添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインをそれぞれ示す。□は抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２、○は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０、△は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０、◇は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌ、■は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌの結果をそれぞれ示す。
第６図は、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ依存的な細胞増殖阻害効果を示した。ａは１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、ｂは２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩ存在下での結果をそれぞれ示した。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が細胞の増殖の値を吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）でそれぞれ示す。図中実線はｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインを、破線はｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ非添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインをそれぞれ示す。□は抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２、◇は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０、■は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴ、●は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴ、▲は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌの結果をそれぞれ示す。
第７図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体のｈＩＧＦ−Ｉに対する特異的な反応性を示した図である（結合ＥＬＩＳＡ）。図中、黒塗りのバーはメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉを抗原に、白抜きのバーはメチル化ＢＳＡ−ＢＳＡを抗原に用いた時の結果を示す。
第８図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を有するｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を示した図である（競合ＥＬＩＳＡ）。◇は抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８、■は抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４７０、△は抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４７１、×は抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４７２、○は抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４７３の結果をそれぞれ示す。
第９図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合における各種ペプチドによる阻害活性を示した図である。横軸は各種ペプチド濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は結合活性（％）をそれぞれ示す。Ａには●で示したｐ１−１８、□で示したｐ２４−３５、■で示したｐ２９−４１、△で示したｐ３６−４７、◇で示したｐ６１−７０、◆で示したｐ１４−３０、×で示したｐ４１−５６の結果を、Ｂには○で示したｈＩＧＦ−Ｉ、●で示したｐ４１−５６Ｃ、□で示したｐ５２−７０、■で示したｐ１−１８およびｐ４１−５６Ｃ、△で示したｐ１−１８およびｐ５２−７０、▲で示したｐ４１−５６Ｃおよびｐ５２−７０、◇で示したｐ１−１８、ｐ４１−５６Ｃおよびｐ５２−７０の結果をそれぞれ示す。
第１０図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩへの結合に対する、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩおよびヒトインスリンでの阻害活性を示した図である。Ａが抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８とｈＩＧＦ−Ｉとの結合、Ｂが抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８とｈＩＧＦ−ＩＩとの結合に対する各因子による阻害をそれぞれ示す。横軸が各種因子濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が因子非添加時を１００％としたときの結合活性（％）を示す。■はｈＩＧＦ−Ｉ、○はｈＩＧＦ−ＩＩ、△はヒトインスリンの結果をそれぞれ示す。
第１１図は、プラスミドｐＢＳ（ＩＩ）ＳＫ（−）／ｈＩＧＦ−１およびｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉの造成工程を示した図である。
第１２図は、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞におけるｈＩＧＦ−Ｉの発現を示した図である。Ａは、組換えｈＩＧＦ−Ｉ蛋白質による阻害度を示す。横軸は添加した組換えｈＩＧＦ−Ｉ蛋白質の濃度、縦軸は結合活性（ＯＤ４１５）を示す。破線は組換えｈＩＧＦ−Ｉ蛋白質非添加時の結果を示す。Ｂは、Ａ５４９細胞およびＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の培養上清中に含まれるｈＩＧＦ−Ｉを示す。白抜きはＡ５４９細胞、網掛けはＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞をそれぞれ示す。
第１３図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞に対する細胞増殖阻害効果を示した図である。破線は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８非添加のＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の増殖性を、実線は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８非添加のＡ５４９細胞の細胞増殖をそれぞれ示す。■は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を添加したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の増殖性を、○は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を添加したＡ５４９細胞の増殖性をそれぞれ示す。
第１４図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８の足場非依存性増殖阻害効果を示した図である。図中の白抜きのカラムはＡ５４９細胞のコロニー形成数を、網掛けのカラムはＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の形成数を、黒塗りのカラムは抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を添加したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の形成数をそれぞれ示す。
第１５図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の抗腫瘍効果を示した図である。横軸は腫瘍移植後の経過日数を、縦軸は腫瘍体積をそれぞれ示す。Ａ５４９細胞を移植したマウスのうち、●は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８非添加時を、○は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８添加時をそれぞれ示す。Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を移植したマウスのうち、■は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８非添加時を、□は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８添加時をそれぞれ示す。
第１６図は、プラスミドｐＫＭ１４６８ＶＨおよびｐＫＭ１４６８ＶＬの造成工程を示した図である。
第１７図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉの造成工程を示した図である。
第１８図は、精製した抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーンＭが非還元時は高分子量マーカーおよび還元時は低分子量マーカー、レーン１が抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２の泳動パターンをそれぞれ示す。
第１９図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８および抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２のｈＩＧＦ−Ｉに対する反応をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が結合活性（ＯＤ４１５）をそれぞれ示す。○が抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８、●が抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２の反応性をそれぞれ示す。
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【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびヒトインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）と特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項２】
ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合の強さが同程度である請求の範囲１に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項３】
バイオセンサービアコアで測定されるヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合定数が１×１０^９Ｍ^−１以上である請求の範囲１または２に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項４】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項５】
遺伝子組換え抗体が、ヒトＩＧＦに対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項６】
遺伝子組換え抗体、または抗体断片のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７で表される請求の範囲５に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項７】
遺伝子組換え抗体または抗体断片のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で表される請求の範囲５に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項８】
遺伝子組換え抗体、または抗体断片のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７で表され、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で表される請求の範囲５〜７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項９】
遺伝子組換え抗体または該抗体活性断片のＶＨが、配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１０】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＬが、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１１】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、およびＶＬが、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜１０のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１２】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、およびＶＬが、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜１１のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１３】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜１１のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１４】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８または１２のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１５】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＬが配列番号２７、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８または１２のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１６】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２７、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８、１２、１４または１５のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１７】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８、１２、１４〜１６のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１８】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８、１２、１４〜１６のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１９】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８、１２、１４〜１６のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項２０】
遺伝子組換え抗体がヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求の範囲１〜１９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項２１】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求の範囲１〜１９のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項２２】
請求の範囲１〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項２３】
請求の範囲２２に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項２４】
請求の範囲２３に記載の発現ベクターを導入して得られる形質転換体。
【請求項２５】
請求の範囲２４に記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物中に請求項１〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から該遺伝子組換え抗体または該抗体断片を単離し、精製する工程を含む、遺伝子組換え抗体または該抗体断片を製造する方法。
【請求項２６】
請求の範囲１〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬。
【請求項２７】
請求の範囲１〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を有効成分として含有するＩＧＦ関連疾患の治療薬。
【請求項２８】
ＩＧＦ関連疾患が、癌、末端肥大症および糖尿病性合併症である請求項２７に記載の治療薬。

【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２８５１５
【国際公開日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４１５２（Ｐ２００５−５１４１５２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４４５３
【国際出願日】平成１６年９月２４日（２００４．９．２４）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】