ヒトサイトメガロウイルス中和抗体およびその使用
本発明は、ヒトサイトメガロウイルスに特異的であり、高親和性で結合する中和抗体、ならびにかかる抗体を産生する不死化Ｂ細胞に関する。また、本発明の抗体は、感染の中和に対しても高い力価を有する。また、本発明は、抗体が結合するエピトープ、ならびにスクリーニング方法や疾患の診断および治療法における抗体およびエピトープの使用にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載した全ての文書は、参照することによりそれら全体が本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ヒトサイトメガロウイルスに対する特異性を有する抗体、好ましくは、その特異性を有するモノクローナル抗体およびかかるモノクローナル抗体を産生する不死化Ｂ細胞に関する。また、本発明は、抗体が結合するエピトープならびにスクリーニング方法と疾患の診断、予防法および治療法における抗体およびエピトープの使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）は、免疫抑制成人においておよび胎児に感染次第、重度の病態を生じさせ得る広く分布している病原体であり、アテローム性動脈硬化等の慢性疾患に関与するとされている。ｈＣＭＶは、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞および造血細胞を含む複数の細胞型に感染する［１］。候補ワクチンとして開発されている、ｈＣＭＶの生体外で増殖される弱毒化株は、内皮細胞指向性がないが、一方で、線維芽細胞に感染する能力を保持する［２］。現在では、２つのウイルス糖タンパク質複合体が、ｈＣＭＶの向細胞性を制御することが分かっている。ｇＨ、ｇＬおよびｇＯの複合体が線維芽細胞の感染に必要であるが、一方で、ｇＨ、ｇＬおよびＵＬ１３１−ＵＬ１２８遺伝子によってコードされたタンパク質の複合体は、内皮細胞、上皮細胞および樹枝状細胞の感染に関与する［２−８］。
【０００４】
高力価免疫グロブリンは、移植に付随するｈＣＭＶ疾患の予防法のために既に商品化されており、最新の知見により、それらが妊婦における治療効果を有することが示唆される［９］。この治療手段は、伝達可能な少量の中和抗体によって制限されており、したがって、高中和能を持つヒト抗体（ヒトモノクローナル抗体等）の有効性が非常に所望されるであろう。しかしながら、ｈＣＭＶ中和抗体の標的はまだ確立されていない。先行研究により、ｇＢおよびｇＨが潜在的標的として識別された。しかしながら、ｇＨ（ＭＳＬ１０９）に対するヒト化抗体は、臨床治験にいかなる有意な効果も示さなかった［１０，１１］。これまでに記載された全ての中和抗体は、それらが高濃度でのみｈＣＭＶ感染を中和するために、低い中和能を有した。例えば、抗体ＭＳＬ−１０９は、１０μｇ／ｍｌの濃度で５０％中和活性のみを示し、生体内効果の欠如を説明し得る［１１］。抗ｈＣＭＶ抗体の中和能力は、典型的には、標的細胞として線維芽細胞を使用して測定される。しかしながら、ｈＣＭＶは、内皮細胞、上皮細胞および白血球細胞等の他の細胞型に感染することによって病態を生じさせることが知られている。高力価で非線維芽標的細胞の感染を中和することが可能である利用可能な任意のモノクローナル抗体はないように思われる。また、ＵＬ１２８およびＵＬ１３０に対する最近記載された中和抗体も内皮細胞の感染の中和において非常に低い作用を示した［７］。
【０００５】
したがって、ｈＣＭＶに対する中和抗体の産生、ならびにかかる抗体が結合する標的の解明に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ｈＣＭＶ感染を中和し、ｈＣＭＶ感染の中和において特に高い力価を有する抗体および抗体断片の産生に基づく。低濃度のみが所定量のウイルスを中和するために必要であるため、かかる抗体が望ましい。これは、より高レベルの保護を容易にさせるとともに、抗体の投与は少量である。ヒトモノクローナル抗体およびかかる抗体を分泌する不死化Ｂ細胞クローンもまた本発明の範囲内に含まれる。
【０００７】
発明者は、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの組み合わせに向けられた抗体が、ｈＣＭＶの中和に特に効果的であることを発見した。この組み合わせは、抗体により認識されるエピトープを形成するＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの複合体であり得るか、または抗体は、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの一方に向けられ得、他のタンパク質の存在が特異性にとって不可欠である。
【０００８】
また、本発明は、抗体が結合するエピトープの特徴付けおよび免疫学的応答の惹起におけるそのエピトープの使用にも関する。
【０００９】
また、本発明は、本発明の抗体およびそれらが結合するエピトープが関与する種々の方法および使用にも関する。
【００１０】
本発明の抗体
本発明は、ｈＣＭＶの中和において特に高い力価を有するモノクローナルまたは組換え抗体を提供する。また、本発明は、これらの組換えまたはモノクローナル抗体の断片、例えば、ｈＣＭＶタンパク質ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａに特異的な少なくとも１つの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を保持する、特に抗体の抗原結合活性を保持する断片も提供する。
【００１１】
本明細書において、「ｈＣＭＶの中和において高い力価」は、本発明の抗体分子が、例えばＭＳＬ−１０９と比べて、当技術分野において既知の抗体よりもはるかに低い濃度で、標準的なアッセイにおいてｈＣＭＶを中和することを意味する。
【００１２】
好ましくは、本発明の抗体分子は、０．１６μｇ／ｍｌ以下（つまり、０．１５、０．１２５、０．１、０．０７５、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１６、０．０１５、０．０１２５、０．０１、０．００７５、０．００５、０．００４、またはそれ以下）、好ましくは、０．０１６μｇ／ｍｌ以下（１０−８以下、好ましくは、１０−９Ｍ以下、好ましくは、１０−１０Ｍ以下、つまり１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、またはそれ以下の抗体濃度）の濃度で中和することができる。これは、ｈＣＭＶの同じ力価の中和に必要なＭＳＬ−１０９の濃度と比較して、非常に低濃度の抗体のみが、生体外ｈＣＭＶの臨床分離株の５０％中和に必要とされることを意味する。好ましくは、ｈＣＭＶの臨床分離株による内皮細胞、上皮細胞および樹枝状細胞の感染の５０％中和に必要な本発明の抗体の濃度は、ＭＳＬ１０９によって必要とされる濃度よりも５０倍以上（つまり、７５、１００、１５０、２００以上）低い。力価は、当技術分野において説明されるような標準的な中和アッセイを使用して測定することができる。
【００１３】
本発明の抗体は、ｈＣＭＶを中和することができる。好ましくは、本発明による抗体は、線維芽細胞または内皮細胞の感染を予防する。より好ましくは、本発明による抗体は、内皮細胞の感染を予防する。好ましくは、本発明による抗体は、線維芽細胞および内皮細胞の両方の感染を予防する。また、本発明の抗体は、好ましくは、樹枝状細胞および網膜細胞等の上皮細胞の感染も予防する。
【００１４】
これらの抗体は、適切な処方後に予防薬もしくは治療薬として、または診断ツールとして使用することができる。
【００１５】
「中和抗体」は、ホスト内の感染を開始するおよび／または永続化させる病原体の能力を中和することができるものである。本発明は、中和モノクローナルヒト抗体を提供し、該抗体は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）からの抗原を認識する。
【００１６】
好ましくは、本発明による抗体は、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの組み合わせに対する特異性を有する。
【００１７】
好ましくは、本発明による抗体は、本明細書において１Ｆ１１または２Ｆ４と称されるモノクローナル抗体である。これらの抗体は、最初に、ｈＣＭＶ感染ドナーから単離され、１Ｆ１１または２Ｆ４と称される不死化Ｂ細胞クローンによって産生される。これらの抗体は、内皮細胞、上皮細胞、網膜細胞および樹枝状細胞のｈＣＭＶ感染を中和することが分かった。加えて、異なるｈＣＭＶ感染ドナーから単離された該抗体５Ａ２および９Ａ１１は、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの組み合わせに対する同様の特異性と、そして内皮細胞、上皮細胞、網膜細胞および樹枝状細胞のｈＣＭＶ感染を中和する能力を示す。これらの抗体は、それぞれ５Ａ２および９Ａ１１と称される不死化Ｂ細胞クローンによって産生される。
【００１８】
１Ｆ１１は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖から成る。２Ｆ４は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖から成る。抗体重鎖のＣＤＲは、それぞれＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と称する。同様に、抗体軽鎖のＣＤＲは、それぞれＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と称する。ＣＤＲアミノ酸の位置は、ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ位置２７から３８、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ位置５６から６５およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ位置１０５から１１７として、ＩＭＧＴ番号付けシステム［１２、１３、１４］に従って定義する。
【００１９】
５Ａ２は、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖から成る。
【００２０】
これらの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を表１に示す。
【表１】
【００２１】
また、本発明は、１Ｆ１１または２Ｆ４（配列番号１〜３または１１〜１３）からの１つ以上の（つまり、１つ、２つまたは３つ全ての）重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含む抗体も含む。また、５Ａ２（配列番号３３〜３５）からの１つ以上の（つまり、１つ、２つまたは３つ全ての）重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含む抗体も含む。
【００２２】
好ましくは、本発明による抗体は、（ｉ）ＤＲＨ１に対して配列番号１、ＣＤＲＨ２に対して配列番号２、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号３、または（ｉｉ）ＣＤＲＨ１に対して配列番号１１、ＣＤＲＨ２に対して配列番号１２、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号１３を含む重鎖を含む。本発明によるさらに好適な抗体は、ＣＤＲＨ１に対して配列番号３３、ＣＤＲＨ２に対して配列番号３４、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号３５を含む重鎖を含む。
【００２３】
また、本発明は、１Ｆ１１または２Ｆ４（配列番号４〜６または１４〜１６）からの１つ以上の（つまり、１つ、２つまたは３つ全ての）軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体も含む。また、５Ａ２（配列番号３６〜３８）からの１つ以上の（つまり、１つ、２つまたは３つ全ての）軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体も含む。
【００２４】
好ましくは、本発明による抗体は、（ｉ）ＣＤＲＬ１に対して配列番号４、ＣＤＲＬ２に対して配列番号５、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号６、または（ｉｉ）ＣＤＲＬ１に対して配列番号１４、ＣＤＲＬ２に対して配列番号１５、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号１６を含む軽鎖を含む。本発明によるさらに好適な抗体は、ＤＲＬ１に対して配列番号３６、ＣＤＲＬ２に対して配列番号３７、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号３８を含む軽鎖を含む。
【００２５】
好ましくは、本発明による抗体は、配列番号７、１７または３９に示される配列を有する重鎖を含む。好ましくは、本発明による抗体は、配列番号８、１８または４０に示される配列を有する軽鎖を含む。
【００２６】
また、１Ｆ１１からの１つ以上のＣＤＲおよび２Ｆ４からの１つ以上のＣＤＲを含むハイブリッド抗体分子も存在し得る。好ましくは、かかるハイブリッド抗体は、１Ｆ１１からの３つのＣＤＲおよび２Ｆ４からの３つのＣＤＲを含む。したがって、好適なハイブリッド抗体は、ｉ）１Ｆ１１からの３つの軽鎖ＣＤＲおよび２Ｆ４からの３つの重鎖ＣＤＲ、またはｉｉ）１Ｆ１１からの３つの重鎖ＣＤＲおよび２Ｆ４からの３つの軽鎖ＣＤＲを含む。代替として、かかるハイブリッドは、５Ａ２からの１つ以上のＣＤＲを含有し得る。
【００２７】
また、本発明は、軽鎖および重鎖の一部または全てならびに本発明のＣＤＲをコードする核酸配列も含む。本発明による好適な核酸配列は、配列番号９（１Ｆ１１重鎖可変領域をコードする）、配列番号１０（１Ｆ１１軽鎖可変領域をコードする）、配列番号１９（２Ｆ４重鎖可変領域をコードする）、および配列番号２０（２Ｆ４軽鎖可変領域をコードする）を含む。種々のＣＤＲをコードする好適な核酸配列は、配列番号２１（１Ｆ１１ ＣＤＲＨ１をコードする）、配列番号２２（１Ｆ１１ ＣＤＲＨ２をコードする）、配列番号２３（１Ｆ１１ ＣＤＲＨ３をコードする）、配列番号２４（１Ｆ１１ ＣＤＲＬ１をコードする）、配列番号２５（１Ｆ１１ ＣＤＲＬ２をコードする）、配列番号２６（１Ｆ１１ ＣＤＲＬ３をコードする）、配列番号２７（２Ｆ４ ＣＤＲＨ１をコードする）、配列番号２８（２Ｆ４ ＣＤＲＨ２をコードする）、配列番号２９（２Ｆ４ ＣＤＲＨ３をコードする）、配列番号３０（２Ｆ４ ＣＤＲＬ１をコードする）、配列番号３１（２Ｆ４ ＣＤＲＬ２をコードする）および配列番号３２（２Ｆ４ ＣＤＲＬ３をコードする）を含む。本発明によるさらに好適な核酸配列は、配列番号４１（５Ａ２重鎖可変領域をコードする）、配列番号４２（５Ａ２軽鎖可変領域をコードする）、配列番号４３（５Ａ２ ＣＤＲＨ１をコードする）、配列番号４４（５Ａ２ ＣＤＲＨ２をコードする）、配列番号４５（５Ａ２ ＣＤＲＨ３をコードする）、配列番号４６（５Ａ２ ＣＤＲＬ１をコードする）、配列番号４７（５Ａ２ ＣＤＲＬ２をコードする）、配列番号４８（５Ａ２ ＣＤＲＬ３をコードする）を含む。遺伝暗号の冗長性に起因して、同じアミノ酸配列をコードするこれらの配列の変異体が存在するであろう。
【００２８】
また、変異抗体も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本出願に示した配列の変異体もまた本発明の範囲内に含まれる。かかる変異体は、上記のような遺伝暗号の縮重に起因して生じ得る。代替として、自然変異体は、転写または翻訳の誤りに起因して産生され得る。また、２Ｆ４の変異体も本明細書に開示する。この変異体は、２Ｆ４重鎖アミノ酸配列（配列番号１７）のＣ端末側終端で付加的な２つのセリン残基を含む。したがって、２Ｆ４のこの変異体は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖から成る。変異体重鎖をコードする核酸配列は、配列番号５０に示される。したがって、２Ｆ４変異体重鎖（配列番号４９）を含む抗体は本発明の範囲内に含まれる。
【００２９】
向上した親和性を有する抗体配列のさらなる変異体は、当技術分野において既知の方法を使用して得ることができ、本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸置換は、さらに向上した親和性を持つ抗体を得るために使用され得る。代替として、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、抗体を産生するための発現系において翻訳の効率を向上させるために使用され得る。
【００３０】
好ましくは、かかる変異抗体配列は、本出願に示した配列と７０％以上（つまり、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を共有する。好ましくは、かかる配列同一性は、参照配列（つまり、本出願に示した配列）の全長に関して算出される。好ましくは、本明細書に参照される同一性の割合（％）は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって指定される初期パラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックス、ギャップオープンペナルティ＝１１およびギャップ伸長ペナルティ＝１］を使用して、ＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を用いて決定される。
【００３１】
ベクター、例えば、本発明による核酸配列を含む発現ベクターが本発明の範囲内にさらに含まれる。かかるベクターで形質転換された細胞も本発明の範囲内に含まれる。
【００３２】
また、本発明は、モノクローナル抗体１Ｆ１１または２Ｆ４に結合することが可能なエピトープに結合する該モノクローナル抗体にも関する。また、本発明は、モノクローナル抗体５Ａ２に結合することが可能なエピトープに結合する該モノクローナル抗体にも関する。
【００３３】
モノクローナルおよび組換え抗体は、個々のポリペプチドまたはそれらが向けられる他の抗原の識別および精製に特に有用である。本発明の抗体は、それらが、免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において試薬として用いられ得るという点で、付加的な有用性を有する。これらの用途において、抗体は、放射性同位元素、蛍光分子または酵素等の分析的に検出可能な試薬で標識することができる。また、抗体は、抗原の分子的識別および特徴付け（エピトープマッピング）のためにも使用され得る。
【００３４】
本発明の抗体は、治療部位への送達のために薬物に連結することができるか、またはｈＣＭＶに感染した細胞等の関心細胞を含む部位の画像化を容易にさせるように、検出可能な標識に連結することができる。薬物および検出可能な標識に抗体を連結するための方法は、検出可能な標識を使用して画像化するための方法のように、当技術分野において既知である。標識された抗体は、様々な標識を用いる様々なアッセイにおいて用いられ得る。本発明の抗体と関心エピトープ（ｈＣＭＶエピトープ）との抗体−抗原複合体の形成の検出は、抗体に検出可能な物質を付着させることによって容易にすることができる。適切な検出手段は、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光体、化学発光物質、色素原、酵素基質または補助因子、酵素阻害薬、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素等の標識の使用を含む。適切な酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み、発光物質の例は、ルミノールであり、生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、ならびに適切な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈを含む。かかる標識された試薬は、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫測定法等の様々な既知のアッセイにおいて使用され得る。例えば、参考文献１５−１８を参照されたい。
【００３５】
本発明による抗体は、細胞毒、治療薬、または放射性金属イオンもしくは放射性同位元素等の治療部分に抱合され得る。放射性同位元素の例としては、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｄ−１０９、Ｔｃ−９９、Ｉｎ−１１１等が挙げられるが、これらに限定されない。かかる抗体抱合体は、所与の生物学的応答を改変するために使用することができ、薬物部分は、古典的な化学治療薬に制限されると解釈されるものではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を持つタンパク質またはポリペプチドであり得る。かかるタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素等の毒素を含み得る。
【００３６】
かかる治療部分を抗体に抱合する技術は既知である。例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．２４３−２５６； ｅｄ．Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９８７）“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｅｄ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２ｄ ｅｄ；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．６２３−６５３；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ'８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．ｐｐ．４７５−５０６（Ｅｄｉｔｒｉｃｅ Ｋｕｒｔｉｓ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ，１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５），ｐｐ．３０３−３１６；およびＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−１５８を参照されたい。
【００３７】
代替として、抗体は、第２の抗体に抱合して、参考文献１９に記載されるように、抗体ヘテロ抱合体を形成することができる。加えて、標識と発明の抗体との間でリンカーが使用され得る［２０］。抗体、またはその抗原結合断片は、当技術分野において既知の放射性ヨード、インジウム、イットリウム、または他の放射性粒子で直接標識され得る［２１］。治療は、同時に投与またはその後投与される抱合抗体と非抱合抗体の治療の組み合わせから成り得る［２２、２３］。
【００３８】
本発明の抗体は、固体支持体に付着され得る。
【００３９】
加えて、抗体は、例えば、それらの循環半減期を増大するために、ポリマーへの共有結合的抱合によって化学的に修飾することができる。好適なポリマー、およびそれらをペプチドに付着させる方法は、参考文献２４−２７に記載される。好適なポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎＯ−−Ｒを有し、Ｒは、水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基等の保護基であることができる。好ましくは、保護基は、１から８個の炭素を有し、より好ましくは、それはメチルである。記号ｎは、好ましくは、１から１，０００、より好ましくは、２から５００の間の正の整数である。ＰＥＧは、１，０００から４０，０００、より好ましくは、２，０００から２０，０００、最も好ましくは、３，０００から１２，０００の好適な平均分子量を有する。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、より好ましくは、それは末端ヒドロキシ基である。それは、阻害薬上の遊離アミノ基と反応するように好ましくは活性化されるヒドロキシ基である。しかしながら、反応基の型および量は、本発明の共有結合的に抱合されたＰＥＧ／抗体を達成するために変化し得ることが理解される。
【００４０】
また、水溶性ポリオキシエチル化ポリオールも本発明において有用である。それらは、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）等を含む。ＰＯＧは好適である。その理由の１つは、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、例えば、動物およびヒトにおけるモノ、ジ、トリグリセリド中に自然発生する骨格と同じ骨格であるためである。したがって、この分枝は、必ずしも体内の異質物質とは見られないであろう。ＰＯＧは、ＰＥＧと同程度である好適な分子量を有する。ＰＯＧの構造は、参考文献２８に記載され、ＰＯＧ／ＩＬ−２抱合体の考察は参考文献２４に見られる。
【００４１】
循環半減期を増大させるための別の薬物送達系は、リポソームである。リポソーム送達系を調製する方法は、参考文献２９、３０および３１で論じられる。他の薬物送達系は当技術分野において既知であり、例えば、参考文献３２および３３に記述される。
【００４２】
本発明の抗体は、好ましくは、精製された形態で提供される。典型的には、抗体は、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在し、例えば、９０重量％未満、通常６０％未満、およびさらに通常５０％未満の組成物が他のポリペプチドで構成される。
【００４３】
本発明の抗体は、非ヒト（異種）ホスト、例えばマウスにおいて免疫原性であり得る。抗体は、非ヒトホストにおいて免疫原性であるが、ヒトホストにおいては免疫原性でないイディオトープを有し得る。ヒトが使用するための本発明の抗体は、マウス、ヤギ、ウサギ、ラット、非霊長類哺乳類等のホストから得ることができないもの、およびヒト化によって、または異種マウスから得ることができないものを含む。
【００４４】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭつまり、α、γまたはμ重鎖）であることができるが、概してＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプ内で、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスであり得る。本発明の抗体は、κまたはλ軽鎖を有し得る。
【００４５】
抗体の産生
本発明によるモノクローナル抗体は、当技術分野において既知の方法のうちの１つで生成することができる。ハイブリドーマ技術を使用してモノクローナル抗体を生成するための一般手法は既知である［３４、３５］。好ましくは、参考文献３６に記述される代替的なＥＢＶ不死化方法が使用される。
【００４６】
参考文献３６に記述される方法を使用して、本発明の抗体を産生するＢ細胞は、多クローン性Ｂ細胞活性化因子の存在下においてＥＢＶで形質転換することができる。ＥＢＶでの形質転換は標準的な技術であり、多クローン性Ｂ細胞活性化因子を含むように容易に適合することができる。
【００４７】
細胞増殖および分化の付加的な刺激薬を、効率をさらに増強させるために形質転換ステップ時に添加することができる。これらの刺激薬は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５等のサイトカインであり得る。特に好適な態様において、ＩＬ−２は、不死化の効率をさらに向上させるために不死化ステップ時に添加されるが、その使用は必須ではない。
【００４８】
次いで、これらの方法を使用して産生した不死化Ｂ細胞を、当技術分野において既知の方法を使用して培養し、抗体をそこから単離することができる。
【００４９】
モノクローナル抗体は、所望される場合、濾過、遠心分離、およびＨＰＬＣまたは親和性クロマトグラフィ等の種々のクロマトグラフ法を使用してさらに精製され得る。製薬等級抗体を産生するための技術を含む、モノクローナル抗体を精製する技術は、当技術分野において既知である。
【００５０】
本発明のモノクローナル抗体の断片は、ペプシンもしくはパパイン等の酵素での消化を含む方法によって、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断によって、モノクローナル抗体から得ることができる。代替として、モノクローナル抗体の断片は、重鎖または軽鎖の配列の一部のクローニングおよび発現によって得ることができる。抗体「断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片を含む。また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖から派生する一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）も包含し、例えば、本発明は、本発明の抗体からのＣＤＲを含むｓｃＦｖを含む。また、重鎖または軽鎖単量体および二量体ならびに単鎖抗体、例えば、重鎖および軽鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結される一本鎖Ｆｖも含む。
【００５１】
分子生物学の標準的な技術を、本発明の抗体または抗体の断片をコードするＤＮＡ配列を調製するために使用することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、完全にまたは部分的に合成され得る。部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を必要に応じて使用することができる。
【００５２】
任意の適切なホスト細胞／ベクター系は、本発明の抗体分子またはその断片をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用され得る。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片、特にＦｖ断片および単鎖抗体断片、例えば、一本鎖Ｆｖｓ等の抗体断片の発現のために、細菌、例えば大腸菌、および他の微生物系が部分的に使用され得る。真核生物、例えば哺乳類ホスト細胞発現系は、完全な抗体分子を含む、より大きな抗体分子の産生のために使用され得る。適切な哺乳類ホスト細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞を含む。
【００５３】
また、本発明は、本発明による抗体分子を産生するための工程も提供し、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現をもたらすのに適した条件下で、本発明のベクターを含むホスト細胞を培養するステップと、抗体分子を単離するステップとを含む。
【００５４】
抗体分子は、重鎖または軽鎖ポリペプチドのみを含み得、その場合においては、重鎖または軽鎖ポリペプチドコード配列のみを、ホスト細胞を形質移入するために使用する必要がある。重鎖および軽鎖の両方を含む産物を産生するために、細胞系は、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターの２つのベクターを形質移入され得る。代替として、単一ベクターが使用され得、該ベクターは、軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。
【００５５】
代替として、本発明による抗体は、ｉ）細胞内で本発明による核酸配列を発現するステップ、およびｉｉ）発現された抗体産物を単離するステップによって産生され得る。加えて、方法は、ｉｉｉ）抗体を精製するステップを含み得る。
【００５６】
Ｂ細胞のスクリーニングおよび単離
形質転換されたＢ細胞を、所望の抗原特異性の抗体を産生するものに対してスクリーニングし、次いで、個々のＢ細胞クローンは、陽性細胞から産生することができる。
【００５７】
スクリーニングステップは、ＥＬＩＳＡ、組織または細胞（形質移入された細胞を含む）の染色、中和アッセイまたは所望の抗原特異性を識別するための当技術分野において既知の多くの他の方法のうちの１つによって行われ得る。アッセイは、単純抗原認識に基づいて選択し得るか、または、例えば、抗原結合抗体だけではなく中和抗体を選択し、標的細胞の特徴、たとえば、それらのシグナリングカスケード、それらの形、それらの増殖速度、他の細胞に影響するそれらの能力、他の細胞もしくは他の試薬または条件の変化による影響に対するそれらの応答、それらの分化状態等を変化させることができる抗体を選択する等のような、所望の機能にさらに基づいて選択され得る。
【００５８】
陽性細胞の混合物から個々のクローンを分離するクローニングステップは、限界希釈法，顕微操作、細胞分類による単細胞沈着、または当技術分野において既知の別の方法を使用して行われ得る。好ましくは、クローニングは、限界希釈法を使用して行われる。
【００５９】
本発明の不死化Ｂ細胞クローンは、例えば、モノクローナル抗体源として、研究のための関心モノクローナル抗体をコードする核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）源等として、種々の方法で使用することができる。
【００６０】
本発明は、不死化Ｂメモリーリンパ球を含む組成物を提供し、該リンパ球は、ｈＣＭＶに特異的な高中和能力を持つ抗体を産生し、該抗体は、１日当たり細胞ごとに５ｐｇ以上産生される。また、本発明は、不死化Ｂメモリーリンパ球のクローンを含む組成物を提供し、該クローンは、ｈＣＭＶに特異的な高親和性を持つモノクローナル抗体を産生し、該抗体は、１日当たりクローンごとに１０Ｎｎｇ以上産生される。好ましくは、該クローンは、ｈＣＭＶ感染の中和において、高い力価を持つモノクローナル抗体を産生する。
【００６１】
本発明による好適な不死化Ｂ細胞クローンは、１Ｆ１１および２Ｆ４である。さらに好適なクローンは、５Ａ２および９Ａ１１である。
【００６２】
エピトープ
上記のように、本発明の抗体は、それらが結合するエピトープをマッピングするために使用することができる。出願者は、内皮細胞、上皮細胞、網膜細胞および樹枝状細胞のｈＣＭＶ感染を中和する抗体１Ｆ１１、２Ｆ４、５Ａ２および９Ａ１１が、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの組み合わせ上に見られるエピトープに向けられることを発見した。出願者は、この理論に制約されることを望まないが、抗体１Ｆ１１および２Ｆ４が、これらの２つのタンパク質によって形成される高次構造エピトープに結合すると考えられる。また、５Ａ２および９Ａ１１も、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａによって形成されるかかる高次構造エピトープに結合すると考えられる。
【００６３】
１Ｆ１１、２Ｆ４、５Ａ２、および９Ａ１１が、線維芽細胞の感染を中和しない事実に起因して、これらの抗体は、ヒトモノクローナル抗体１０Ｃ６、５Ｆ１、６Ｂ４および７Ｈ３に対する異なるエピトープを認識すると仮定される。さらに、モノクローナル抗体１０Ｃ６、５Ｆ１、７Ｈ３および６Ｂ４は、ｇＢの機能的エピトープに結合すると考えられる。
【００６４】
これらの抗体によって認識されるエピトープは、多くの使用があり得る。精製された形態または合成形態でのエピトープおよびミモトープは、免疫学的応答（つまり、ワクチンとして、または他の使用のために抗体を産生するため）を惹起するために、またはエピトープもしくはミモトープと免役反応する抗体に対して患者血清をスクリーニングするために使用することができる。好ましくは、かかるエピトープもしくはミモトープ、またはかかるエピトープもしくはミモトープを含む抗原は、免疫反応を向上させるためのワクチンとして使用される。また、本発明の抗体は、ワクチンの質をモニターする方法、特に、ワクチン中の抗原が、正しい高次構造において正しいエピトープを含有することを確認する方法において使用することもできる。
【００６５】
また、エピトープは、該エピトープに結合するリガンドのスクリーニングにおいても有用であり得る。このようなリガンドは、好ましくは、エピトープをブロックするため、感染を予防する。このようなリガンドは、本発明の範囲内に包含される。
【００６６】
組換え発現
また、本発明の不死化メモリーＢリンパ球は、その後の組換え発現に対する抗体遺伝子のクローニングのために核酸源としても使用し得る。組換え源からの発現は、例えば、安定性、再現性、培養の容易さ等の理由で、Ｂ細胞またはハイブリドーマからの発現よりも、医薬目的上より一般的である。
【００６７】
したがって、本発明は、組換え細胞を調製するための方法を提供し、（ｉ）関心抗体をコードするＢ細胞クローンから１つ以上の核酸（例えば、重鎖および／または軽鎖遺伝子）を得るステップと、（ｉｉ）発現ホスト内における関心抗体の発現を可能にするように、そのホスト内に核酸を挿入するステップとを含む。
【００６８】
同様に、本発明は、組換え細胞を調製するための方法を提供し、（ｉ）関心抗体をコードするＢ細胞クローンから核酸を配列決定するステップと、ステップ（ｉ）からの配列情報を使用して、発現ホスト内における関心抗体の発現を可能にするように、そのホスト内に挿入するために核酸を調製するステップとを含む。
【００６９】
また、本発明は、組換え細胞を調製する方法を提供し、モノクローナル関心抗体をコードする１つ以上の核酸でホスト細胞を形質転換するステップを含み、該核酸は、本発明の不死化Ｂ細胞クローンから派生した核酸である。したがって、最初に、該核酸を調製し、次いで、ホスト細胞を形質転換するためにそれを使用する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【００７０】
次いで、本発明のこれらの組換え細胞は、発現および培養目的で使用することができる。それらは、大規模の薬剤生産のための抗体の発現に特に有用である。また、それらは、医薬組成物の活性成分としても使用することができる。任意の適切な培養技術を使用することができ、その技術には、静置培養、ローラーボトル培養、腹水、中空糸型バイオリアクターカートリッジ、モジュラーミニファーメンター、攪拌槽、マイクロキャリア培養、セラミック中子灌流等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
Ｂ細胞から免疫グロブリン遺伝子を得る、および配列決定するための方法は、当技術分野において既知である（例えば、参考文献３７を参照）。
【００７２】
発現ホストは、好ましくは、真核細胞であり、酵母および動物細胞、特に、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６［Ｃｒｕｃｅｌｌ、参考文献３８］またはＨＫＢ-１１［Ｂａｙｅｒ、参考文献３９＆４０］細胞、骨髄腫細胞［４１＆４２］等）等のヒト細胞、ならびに植物細胞を含む。好適な発現ホストは、特に、それ自体ではヒトにおいて免疫原性ではない糖鎖構造を用いて、本発明の抗体をグリコシル化することができる。無血清培地中で増殖することができる血清発現ホストが好適である。動物由来の産物が存在しない培養物中で増殖することができる発現ホストが好適である。
【００７３】
発現ホストは、細胞系を得るために培養され得る。
【００７４】
本発明は、関心抗体をコードする１つ以上の核酸分子（例えば、重鎖および軽鎖遺伝子）を調製するための方法を提供し、（ｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローンを調製するステップと、（ｉｉ）関心抗体をコードするＢ細胞クローンを核酸から得るステップとを含む。また、本発明は、関心抗体をコードする核酸配列を得るための方法を提供し、（ｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローンを調製するステップと、（ｉｉ）関心抗体をコードするＢ細胞クローンから核酸を配列決定するステップとを含む。
【００７５】
また、本発明は、関心抗体をコードする核酸分子を調製する方法も提供し、本発明の形質転換されたＢ細胞から得られたＢ細胞クローンから核酸を得るステップを含む。したがって、最初に、Ｂ細胞クローンを得、次いで、それから核酸を調製する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【００７６】
本発明は、（例えば、医薬用途のために）抗体を調製するための方法を提供し、（ｉ）関心抗体を発現する選択したＢ細胞クローンから１つ以上の核酸（例えば、重鎖および軽鎖遺伝子を得るステップおよび／または配列決定するステップと、（ｉｉ）核酸を挿入するか、または核酸を使用して、関心抗体を発現することができる発現ホストを調製するステップと、（ｉｉｉ）関心抗体が発現される条件下で、発現ホストを培養または継代培養するステップと、任意に、（ｉｖ）関心抗体を精製するステップとを含む。
【００７７】
また、本発明は、抗体を調製する方法も提供し、関心抗体が発現される条件下で、発現ホスト細胞集団を培養または継代培養するステップと、任意に、関心抗体を精製するステップとを含み、該発現ホスト細胞集団は、（ｉ）上記のように調製されたＢメモリーリンパ球の集団により産生される関心抗体を発現する選択したＢ細胞をコードする核酸を提供するステップ、（ｉｉ）関心抗体を発現することができる発現ホスト内に核酸を挿入するステップ、および（ｉｉｉ）該発現ホスト細胞集団を産生するために、該挿入した核酸を含む発現ホストを培養または継代培養するステップによって調製された。したがって、最初に、組換え発現ホストを調製し、次いで、抗体を発現するためにそれを培養する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【００７８】
医薬組成物
医薬品の活性成分としての抗体の使用は、現在では広範囲にわたり、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））（トラスツズマブ）、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、レオプロ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、ゼヴァリン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、オマリズマブ、シナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））（パリビズマブ）、ゼナパックス（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））（ダクリズマブ）等の製品を含む。
【００７９】
したがって、本発明は、本発明の抗体、および／またはかかる抗体をコードする核酸、および／またはかかる抗体を発現する不死化Ｂ細胞、および／または本発明の抗体により認識されるエピトープを含有する医薬組成物を提供する。また、医薬組成物は、投与を可能にするように、医薬的に許容可能な担体も含有し得る。担体は、それ自体が、組成物を受け取る個人に有害である抗体の産生を誘導すべきではなく、毒性であるべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子等の大型かつ代謝速度が遅い巨大分子であり得る。
【００８０】
医薬的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩等の鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩等の有機酸の塩を使用することができる。
【００８１】
治療用組成物中の医薬的に許容可能な担体は、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノール等の液体をさらに含有し得る。加えて、湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝物質等の補助物質がかかる組成物中に存在し得る。かかる担体は、患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁液として医薬組成物を製剤化することが可能である。
【００８２】
好適な投与形態は、例えば、注射または注入による、例えば、ボーラス投与または持続注入よる非経口投与に適した形態を含む。製品が注射または注入のためのものである場合、それは、油性または水性媒体中で懸濁液、溶液または乳濁液の形態を取り得、そしてそれは、懸濁剤、防腐剤、安定剤および／または分散剤等の製剤化剤を含有し得る。代替として、抗体分子は、使用前の適切な滅菌液との再構成のために、乾燥状態であり得る。
【００８３】
製剤化され次第、本発明の組成物は、被験体に直接投与することができる。組成物は、ヒト被験体への投与に適合されることが好ましい。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、局所、皮下、鼻腔内、腸内、舌下、膣内または直腸経路を含むが、これらに限定されないあらゆる経路によって投与され得る。また、本発明の医薬組成物を投与するためにハイポスプレーも使用され得る。典型的には、治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注入物質として調製され得る。また、注入前に、液体媒体中の溶液または懸濁液に適した固形も調製され得る。
【００８５】
組成物の直接的な送達は、概して、注射、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内送達によって達成されるか、または組織の間質腔に送達される。また、組成物は、病変内にも投与することができる。投薬治療は、単回投与計画または複数回投与計画であってもよい。既知の抗体ベースの医薬品は、例えば、医薬品を毎日、毎週、毎月等送達すべきかどうか等の投与頻度に関する手引きを提供する。また、頻度および用量は、症状の重症度にも依存し得る。
【００８６】
本発明の組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注入物質として調製され得る。また、注入前に、液体媒体中の溶液または懸濁液に適した固形も調製することができる（例えば、防腐剤を含有する滅菌水との再構成のために、シナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））およびハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））等の凍結乾燥された組成物）。組成物は、局所投与のために、例えば、軟膏、クリームまたは粉末として調製され得る。組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤もしくはカプセルとして、スプレーとして、またはシロップ（任意に、香味づけたもの）として調製され得る。組成物は、微粉末またはスプレーを使用して、例えば、肺内投与のために吸入剤として調製され得る。組成物は、坐薬または腟坐薬として調製され得る。組成物は、経鼻、経耳または経眼投与のために、例えば、ドロップとして調製され得る。組成物は、組み合わされた組成物が、患者への投与直前に再構成できるように設計されたキット形態であり得る。例えば、凍結乾燥された抗体は、滅菌水または滅菌緩衝液を有するキット形態で提供することができる。
【００８７】
組成物中の活性成分は、抗体分子であることが理解されるであろう。したがって、それは、胃腸管における分解に影響されやすい。したがって、組成物が胃腸管を用いた経路によって投与されるのであれば、組成物は、分解から抗体を保護するが、それが胃腸管から吸収され次第、抗体を放出する薬物を含有する必要がある。
【００８８】
医薬的に許容可能な担体の詳細な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２で入手可能である。
【００８９】
本発明の医薬組成物は、概して、５．５から８．５、好ましくは、６から８、より好ましくは、約７のｐＨを有する。ｐＨは、緩衝液の使用によって維持され得る。組成物は、無菌であり得るか、および／またはピロゲンを含み得ない。組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。本発明の医薬組成物は、好ましくは、密封容器中に供給される。
【００９０】
医薬組成物は、本発明の１つ以上の抗体および／もしくは本発明の１つ以上の不死化Ｂ細胞ならびに／または本発明の抗体に結合するエピトープを含むポリペプチドの有効量、つまり、所望の疾患または状態を治療する、寛解させる、もしくは予防するのに十分な、または検出可能な治療効果を呈するのに十分な量を含む。また、治療効果は、身体症状の軽減も含む。任意の特定の被験体に対する正確な有効量は、被験体のサイズおよび健康、状態の性質および程度、ならびに治療学または投与のために選択された治療学の組み合わせに依存する。所与の状況に対する有効量は、日常的な実験によって決定され、臨床従事者の判断内にある。本発明の目的で、有効用量は、概して、投与される個人における本発明の組成物の約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇである。既知の抗体ベースの医薬品は、この点における手引きを提供し、例えば、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、２１ｍｇ／ｍｌ溶液の静脈内注入によって投与され、初期負荷用量は体重１ｋｇあたり４ｍｇであり、毎週の維持量は体重１ｋｇあたり２ｍｇであり、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））は、３７５ｍｇ／ｍ２を毎週投与される。
【００９１】
組成物は、本発明の１つより多い（例えば、２、３、４、５等）抗体を含むことができ、特に、そのような抗体が異なる抗原（または同じ抗原中の異なるエピトープ）に結合し、相加的または相乗的治療効果をもたらす場合においてそのようにされる。例えば、１つの抗体は、ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ組み合わせ（または複合体）に結合し得、一方で、別の抗体はｇＨに結合し得る。さらなる実施例において、１つの抗体は、ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ組み合わせ（または複合体）に結合し得、一方で、別の抗体はｇＢに結合し得る。したがって、１つの抗体は、線維芽細胞の感染を媒介するメカニズムに標的され得、一方で、もう１つの抗体は、内皮細胞の感染を媒介するメカニズムに標的され得る。最適な臨床効果が得られるように、それは、ｈＣＭＶ感染および維持の両方のメカニズムに対応するという利点があり得るだろう。
【００９２】
本発明の抗体は、例えば、化学療法化合物とともに、放射線療法等とともに等、他の治療学とともに（組み合わせて、または別々に）投与され得る。好適な治療化合物は、ガンシクロビル、ホスカルネットおよびシドホビル等の抗ウイルス化合物を含む。かかる組み合わせ治療法は、単独で投与する場合に、個々の治療薬に対する治療効果の相加的または相乗的向上を提供する。「相乗作用」という用語は、各それぞれの活性薬剤の個々の効果の和よりも大きい２つ以上の活性薬剤の併用効果を説明するために使用する。したがって、２つ以上の薬剤の併用効果が活性または工程の「相乗的阻害」をもたらす場合、それは、活性または工程の阻害が、各それぞれの活性薬剤の阻害効果の和よりも大きいことを意図する。「相乗的治療効果」という用語は、２つ以上の治療の組み合わせで観察された治療効果を指し、治療効果（多数のパラメータのいずれかによって測定されたような）は、それぞれ個々の治療で観察された個々の治療効果の和よりも大きい。
【００９３】
抗体は、ｈＣＭＶ感染の治療に対して以前に反応を示さなかった、つまり、抗ｈＣＭＶ治療に対して抵抗性を示したそれらの患者に投与され得る。かかる治療は、抗ウイルス剤を用いた以前の治療を含み得る。これは、例えば、ｈＣＭＶの抗ウイルス耐性株による感染に起因し得る。
【００９４】
本発明の抗体を含む本発明の組成物において、抗体は、好ましくは、組成物中の総タンパク質の少なくとも５０重量％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上）を占める。したがって、抗体は、精製された形態である。
【００９５】
本発明は、医薬品を調製する方法を提供し、（ｉ）本発明の抗体を調製するステップと、（ｉｉ）精製された抗体と１つ以上の医薬的に許容可能な担体とを混合するステップ、とを含む。
【００９６】
また、本発明は、医薬品を調製する方法も提供し、抗体を１つ以上の医薬的に許容可能な担体とを混合するステップを含み、抗体は、本発明の形質転換されたＢ細胞から得られたモノクローナル抗体である。したがって、最初に、モノクローナル抗体を得、次いで、医薬品を調製する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【００９７】
治療目的のために抗体またはＢ細胞を送達することの代替案として、核酸が原位置で被験体内に発現され、所望の治療効果を提供できるように、関心モノクローナル抗体（またはその活性断片）をコードする核酸（典型的には、ＤＮＡ）を被験体に送達することが可能である。適切な遺伝子治療法および核酸送達ベクターは、当技術分野において既知である。
【００９８】
本発明の組成物は、免疫原性組成物であり得、より好ましくは、ｈＣＭＶタンパク質ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの組み合わせ上に見られるエピトープを含む抗原を含むワクチン組成物である。代替的な組成物は、（ｉ）ｈＣＭＶタンパク質ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの組み合わせ上に見られるエピトープを含む抗原、ならびに（ｉｉ）ｈＣＭＶ ｇＢ上に見られるエピトープを含む抗原を含み得る。本発明によるワクチンは、予防のため（つまり、感染を防止するため）または治療のため（つまり、感染を治療するため）にいずれかであり得るが、典型的には、予防のためである。
【００９９】
組成物は、特に複数回投与形式でパッケージされる場合に、抗菌薬を含み得る。
【０１００】
組成物は、界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含み得る。界面活性剤は、概して低い濃度、例えば、０．０１％未満で存在する。
【０１０１】
組成物は、浸透圧を与えるためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌの濃度が典型的である。
【０１０２】
組成物は、特に、それらが凍結乾燥される場合か、またはそれらが、凍結乾燥された材料から再構成された材料を含む場合に、例えば、約１５〜３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）で、糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）を含む。凍結乾燥のための組成物のｐＨは、凍結乾燥前に約６．１に調整され得る。
【０１０３】
また、本発明の組成物は、１つ以上の免疫調節剤も含み得る。好ましくは、１つ以上の免疫調節剤は、アジュバントを含む。
【０１０４】
本発明の組成物は、ｈＣＭＶ感染に効果的に対応するために、好ましくは、細胞媒介の免疫学的応答ならびに液性免疫学的応答の両方を誘発する。この免疫学的応答は、好ましくは、持続性（例えば、中和）抗体と、ｈＣＭＶへの曝露後に急速に応答することができる細胞媒介の免疫との両方を誘発する。
【０１０５】
医学的治療および用途
本発明の抗体またはその断片は、ｈＣＭＶ感染の治療、ｈＣＭＶ感染の予防またはｈＣＭＶ感染の診断のために使用され得る。
【０１０６】
診断方法は、抗体または抗体断片を試料と接触させるステップを含む。かかる試料は、例えば、唾液腺、肺、肝臓，膵臓、腎臓、耳、眼、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳または皮膚から取った組織試料であり得る。また、診断方法は、抗原／抗体複合体の検出も含む。
【０１０７】
したがって、本発明は、治療法で用いるための（ｉ）本発明による抗体、（ｉｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローン、（ｉｉｉ）１Ｆ１１もしくは２Ｆ４のうちの１つに結合することが可能なエピトープ、または（ｉｖ）５Ａ２もしくは９Ａ１１のうちの１つに結合することが可能なエピトープを提供する。
【０１０８】
また、患者を治療する方法も提供し、（ｉ）本発明による抗体、（ｉｉ）１Ｆ１１もしくは２Ｆ４のうちの１つに結合することが可能なエピトープ、または（ｉｉｉ）５Ａ２もしくは９Ａ１１のうちの１つに結合することが可能なエピトープを、その患者に投与する方法を含む。
【０１０９】
また、本発明は、ｈＣＭＶ感染の予防もしくは治療のための薬物の製造において、（ｉ）本発明による抗体、（ｉｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローン、（ｉｉｉ）１Ｆ１１もしくは２Ｆ４のうちの１つに結合することが可能なエピトープ、（ｉｖ）１Ｆ１１もしくは２Ｆ４のうちの１つに結合することが可能なエピトープに結合する抗体、（ｖ）５Ａ２もしくは９Ａ１１のうちの１つに結合することが可能なエピトープ、または（ｖｉ）５Ａ２もしくは９Ａ１１のうちの１つに結合することが可能なエピトープに結合する抗体の使用も提供する。
【０１１０】
本発明は、薬物としての使用のための本発明の組成物を提供する。また、患者の治療および／または患者の診断のための薬物の製造における、本発明の抗体および／またはかかる抗体が結合するエピトープを含むタンパク質の使用も提供する。また、被験体を治療するための、および／または患者に診断を行う方法も提供し、それらを本発明の組成物に投与するステップを含む。被験体は、好ましくは、ヒトである。治療処置の有効性を確認する一方法は、本発明の組成物の投与後に、疾患症状をモニターするステップを包含する。治療は、単回投与計画または複数回投与計画であることができる。本発明はＣＭＶ感染のために有用である。
【０１１１】
好ましくは、本発明による抗体、不死化Ｂ細胞クローン、エピトープまたは組成物は、特に、ｈＣＭＶ感染の危険性がある、または感染しやすい被験体のグループに投与される。かかる被験体グループは、ＨＩＶに罹患するまたは移植患者等の免疫抑制治療法を受ける被験体等の免疫不全被験体を含む。
【０１１２】
本発明の抗体は、受動免疫法において使用することができる。
【０１１３】
また、本発明において記述した抗体およびその断片は、ｈＣＭＶ感染の診断のためのキットにおいても使用され得る。
【０１１４】
本発明において記述したモノクローナル抗体１Ｆ１１または２Ｆ４に結合することが可能なエピトープは、防御抗ｈＣＭＶ抗体の存在を検出することによって、ワクチン接種手順の有効性をモニターするためのキットにおいて使用され得る。
【０１１５】
本発明において記述したモノクローナル抗体５Ａ２または９Ａ１１に結合することが可能なエピトープは、防御抗ｈＣＭＶ抗体の存在を検出することによって、ワクチン接種手順の有効性をモニターするためのキットにおいて使用され得る。
【０１１６】
また、本発明において記述した抗体およびその断片は、所望の免疫原性でのワクチン製造をモニターするためのキットにおいても使用され得る。
【０１１７】
また、本発明は、医薬品を調製する方法を提供し、モノクローナル抗体を１つ以上の医薬的に許容可能な担体と混合するステップを含み、モノクローナル抗体は、本発明の発現ホストから得られたモノクローナル抗体である。したがって、最初に、モノクローナル抗体を得て（例えば、それを発現するおよび／またはそれを精製する）、次いで、それを医薬担体と混合する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【０１１８】
本発明の形質転換されたＢ細胞から始めて、各ステップでの任意の最適化を用いる培養、継代培養、クローニング、サブクローニング、配列決定、核酸調製等の種々のステップを、形質転換されたＢ細胞によって発現される抗体を永続化させるために行うことができる。好適な実施形態において、上記の方法は、抗体をコードする核酸に適用される最適化の技術（例えば、親和性成熟または最適化）をさらに含む。本発明は、そのようなステップ時に使用および調製される全ての細胞、核酸、ベクター、配列、抗体等を包含する。
【０１１９】
これらの全ての方法において、発現ホスト内で使用される核酸は、ある種の核酸配列を挿入、欠失または修正するように、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の間で操作され得る。かかる操作からの変更は、制限酵素部位を導入するため、コドン利用を修正するため、転写および／または翻訳制御配列を追加または最適化するため等の変更を含むが、これらに限定されない。また、コードされたアミノ酸を変化させるために、核酸を変更することも可能である。例えば、それは、１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）アミノ酸置換、１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）アミノ酸欠失および／または抗体のアミノ酸配列への１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）アミノ酸挿入を導入するために有用であり得る。このような点突然変異は、エフェクター機能、抗原結合親和性、翻訳後修飾、免疫原性等を修飾することができるか、共有結合基（例えば、標識）の付着のためにアミノ酸を導入することができるか、またはタグ（例えば、精製目的で）を導入することができる。突然変異は、特異的部位に導入することができるか、または、ランダムとその後の淘汰（例えば、分子進化）により導入することができる。
【０１２０】
一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、独占的にＸから成るか、または、例えばＸ＋Ｙ等の何らかの付加的なものを含み得る。
【０１２１】
単語「実質的に」は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないこともある。単語「実質的に」は、必要に応じて本発明の定義から削除され得る。
【０１２２】
数値ｘに関連する「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１２３】
本明細書で用いる場合、「疾患」という用語は、概して、正常機能を損ない、そして、典型的には、特徴的な徴候および症状によって顕在化し、ヒトもしくは動物の寿命および生活の質を減少させる、ヒトもしくは動物の体の、またはその一部の異常な状態を全てが反映するという点で、「障害」および「状態」（医学的状態等の場合）と同義語であることが意図され、それらと同じ意味で使用される。
【０１２４】
本明細書で用いる場合、患者の「治療」への言及は、予防および予防法を含むことを意図する。「患者」という用語は、ヒトを含む全ての哺乳類を意味する。患者の例としては、ヒト、雌ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、およびウサギが挙げられる。好ましくは、患者はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ヒトモノクローナル抗体（１）１Ｆ１１および（２）２Ｆ４がｈＣＭＶタンパク質の複合体を沈殿させ、その一方、不適切なＩｇＧは沈殿させないことを実証するＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２】ヒトモノクローナル抗体（Ａ）１Ｆ１１および２Ｆ４ならびに（Ｂ）５Ａ２および９Ａ１１が、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａ遺伝子産物によって生成された高次構造エピトープを認識することを実証するＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図３】１Ｆ１１および２Ｆ４の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ配列は太字で示す。
【図４】ヒトモノクローナル抗体７Ｈ３、１０Ｃ６、５Ｆ１および６Ｂ４が、ｈＣＭＶタンパク質ｇＢ上のエピトープを認識することを実証するＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５】５Ａ２の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ配列は太字で示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２６】
実施例１：Ｂ細胞のクローニングおよびｈＣＭＶ中和活性のスクリーニング
血清中に高いｈＣＭＶ中和抗体力価を持つ２つのドナーを確認した。メモリーＢ細胞を、参考文献３６に記述されるように、ＥＢＶおよびＣｐＧを使用して単離および不死化した。つまり、メモリーＢ細胞を、ＣＤ２２ビーズを使用してネガティブ選択により単離し、続いて特異的抗体および細胞分類を使用してＩｇＭ＋、ＩｇＤ＋ＩｇＡ＋Ｂ細胞を除去した。ＣｐＧ２００６の存在下において、分類した細胞（ＩｇＧ＋）をＥＢＶで不死化し、同種単核細胞を照射した。それぞれ５０メモリーＢ細胞を含有する同型培養物を、２０の９６ウェルＵ字形底プレートに配置した。２週間後、培養上清を採取し、別々のアッセイにおいて線維芽細胞または上皮細胞のいずれかのｈＣＭＶ感染を中和するそれらの能力を試験した。Ｂ細胞クローンを、参考文献３６に記述されるように、陽性多クローン性培養物から単離した。選択したクローンの上清中のＩｇＧ濃度は、ＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡを使用して決定した。
【０１２７】
ウイルス中和アッセイのために、滴定量の臨床ｈＣＭＶ分離株を、等容積の培養上清または中和抗体を含有するヒト血清希釈と混合した。室温でのインキュベーションの１時間後、混合物を９６ウェル平底プレート中の内皮細胞（例えばＨＵＶＥＣ細胞）または線維芽細胞のいずれかの融合性単層に添加し、３７℃で２日間インキュベートした。上清を捨て、細胞を冷メタノールで固定し、ｈＣＭＶ早期抗原に対するマウスモノクローナル抗体の混合物と、続いてフルオレセイン標識ヤギ抗マウスＩｇで染色した。プレートは、蛍光顕微鏡を使用して分析した。中和抗体の非存在下において、感染した細胞は約１０００／視野であり、一方、飽和濃度の中和抗体の存在下において、感染は完全に阻害された。中和力価は、ｈＣＭＶ感染の５０％減少をもたらす抗体（μｇ／ｍｌ）の濃度として示す。
【０１２８】
表２は、異なる３つの型の抗体が同定されたことを示す。線維芽細胞の感染を中和できる抗体、内皮細胞の感染を中和できる抗体およびその両方の感染を中和できる抗体である。これは、異なるタンパク質が特定の細胞型に対する指向性に関与するという以前のデータと一致する［７］。内皮細胞の中和に加えて、１Ｆ１１および２Ｆ４は、網膜細胞等の上皮細胞、および樹枝状細胞の感染を中和することが観察された（データは示していない）。
【表２】
【０１２９】
一部の抗体は、０．３から０．５μｇ／ｍｌの範囲のＩｇＧ濃度で線維芽細胞および内皮細胞の両方を中和した。他の抗体（１Ｆ１１、５Ａ２、９Ａ１１および２Ｆ４）は、線維芽細胞のｈＣＭＶ感染を中和できなかったが、内皮細胞の感染を中和し、０．００１から０．００４μｇ／ｍｌ（以前より既知の抗体よりも１０００倍を超えて強力）という極めて低い濃度で中和した。
【０１３０】
初期の特徴付け以後、５Ｆ１は、ｇＨではなくむしろｇＢのエピトープに結合すると判断されたことに留意されたい。これは、ｇＢをブロックすることにより、７Ｈ３、１０Ｃ６および６Ｂ４に見られる、線維芽細胞の感染の中和を可能とすることを実証する結果と一致する。
【０１３１】
実施例２：モノクローナル抗体によって認識される標的抗原の識別
ヒトＭＲＣ−９線維芽細胞を、臨床ｈＣＭＶ分離株に感染させた。３日後、細胞を３５Ｓメチオニンおよびシステインで代謝的に標識した。溶解物の事前排除後、ヒトモノクローナル抗体１Ｆ１１および２Ｆ４を添加し、免疫複合体を、タンパク質Ａビーズの添加によって沈殿させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解した（図１）。不適切な特異性を持つヒトモノクローナルＩｇＧ抗体を、陰性対照として使用した。結果は、ヒトモノクローナル抗体１Ｆ１１および２Ｆ４が、ＣＭＶタンパク質の複合体を沈殿させることを示す。
【０１３２】
ヒトモノクローナル抗体の特異性をマッピングするため、単一ペプチドを欠く赤血球凝集素（ＨＡ）タグ付ＵＬ１２８Δ１−２７、ＵＬ１３０Δ１−２５およびＵＬ１３１ＡΔ１−１８ｈＣＭＶタンパク質をコードする発現ベクターを構築した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、これらのベクターを単独で、または組み合わせで形質移入した。３６時間後、細胞を固定し、透過処理して、抗ＨＡ抗体（形質移入の効率を制御するため）およびモノクローナル抗体で、続いてヤギ抗ヒトＩｇＧで染色した。不適切な特異性を持つＨｕＭａｂ ＩｇＧを陰性対照として使用した。図２Ａは、ヒトモノクローナル抗体１Ｆ１１および２Ｆ４が、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａ遺伝子産物によって生成される高次構造エピトープを認識することを示す。図２Ｂは、ヒトモノクローナル抗体５Ａ２および９Ａ１１が、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａ遺伝子産物によって生成される高次構造エピトープを認識することを示す。
【０１３３】
結論
上記の結果は、ヒト内皮細胞のｈＣＭＶ感染を、高い力価および選択性で中和することが可能な２つのヒトモノクローナル抗体を定義する。認識したエピトープを同定するため、抗体を、ｈＣＭＶ感染細胞からのタンパク質を免疫沈降するそれらの能力に関して試験した（図１）。ヒトＭａｂ１Ｆ１１および２Ｆ４は、約１５、３３〜３５および約１００キロダルトンの見かけの分子量を有する幾つかのタンパク質を沈殿させた。これらのパターンは、ｇＨ、ｇＬおよびＵＬ１２８、ＵＬ１３０ならびに可能性としてＵＬ１３１Ａを含有する複合体の沈殿と一致する。
【０１３４】
これらの抗体の標的をより良く定義するため、ＨＡタグ付ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａをコードするベクターを形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を染色するそれらの能力を特徴付けた。図２Ａに示すように、１Ｆ１１および２Ｆ４は、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａを同時発現する細胞のみを染色したため、それらが、２つの遺伝子産物によって決定された高次構造エピトープを認識することが示唆される。この結論は、ウエスタンプロットにおいて、これらの抗体が、還元かつ変性状態下で行われたウエスタンプロットによる感染または形質移入細胞の溶解物と反応しないという事実に裏付けられる（データは示していない）。
【０１３５】
５Ａ２および９Ａ１１に関しても同様の結果を観察した。図２ｂは、これらの抗体が、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａを同時発現する細胞のみを染色したため、それらが２つの遺伝子産物によって決定された高次構造エピトープを認識することが示唆されることを示す。
【０１３６】
実施例３：モノクローナル抗体によって認識される標的抗原のさらなる識別
線維芽細胞の感染を中和するヒトモノクローナル抗体の特異性をマッピングするため、全長ｇＢをコードする発現ベクターを構築した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、このベクターを形質移入した。３６時間後、細胞を固定し、透過処理して、ヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭａｂ）と、続いてヤギ抗ヒトＩｇＧで染色した。図４は、（不適切な特異性のＩｇＧ抗体ではなく）モノクローナル抗体７Ｈ３、１０Ｃ６、５Ｆ１、および６Ｂ４が、ｇＢを形質移入した細胞を特異的に染色したため、それらがｇＢのエピトープを認識することが示唆されることを示す。注目すべきは、モノクローナル抗体１０Ｃ６、５Ｆ１および６Ｂ４が、線維芽細胞および内皮細胞の感染を中和し、一方で、モノクローナル抗体７Ｈ３が、（内皮細胞のではなく）線維芽細胞の感染を中和することである。この概念により、モノクローナル抗体１０Ｃ６、５Ｆ１、および６Ｂ４が、モノクローナル抗体７Ｈ３により結合されているエピトープとは異なるｇＢの機能的エピトープに結合することが示唆される。
【０１３７】
本発明は、例としてのみ記載され、本発明の範囲および精神の範囲内で変更がなされ得ることを理解されよう。
【０１３８】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載した全ての文書は、参照することによりそれら全体が本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ヒトサイトメガロウイルスに対する特異性を有する抗体、好ましくは、その特異性を有するモノクローナル抗体およびかかるモノクローナル抗体を産生する不死化Ｂ細胞に関する。また、本発明は、抗体が結合するエピトープならびにスクリーニング方法と疾患の診断、予防法および治療法における抗体およびエピトープの使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）は、免疫抑制成人においておよび胎児に感染次第、重度の病態を生じさせ得る広く分布している病原体であり、アテローム性動脈硬化等の慢性疾患に関与するとされている。ｈＣＭＶは、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞および造血細胞を含む複数の細胞型に感染する［１］。候補ワクチンとして開発されている、ｈＣＭＶの生体外で増殖される弱毒化株は、内皮細胞指向性がないが、一方で、線維芽細胞に感染する能力を保持する［２］。現在では、２つのウイルス糖タンパク質複合体が、ｈＣＭＶの向細胞性を制御することが分かっている。ｇＨ、ｇＬおよびｇＯの複合体が線維芽細胞の感染に必要であるが、一方で、ｇＨ、ｇＬおよびＵＬ１３１−ＵＬ１２８遺伝子によってコードされたタンパク質の複合体は、内皮細胞、上皮細胞および樹枝状細胞の感染に関与する［２−８］。
【０００４】
高力価免疫グロブリンは、移植に付随するｈＣＭＶ疾患の予防法のために既に商品化されており、最新の知見により、それらが妊婦における治療効果を有することが示唆される［９］。この治療手段は、伝達可能な少量の中和抗体によって制限されており、したがって、高中和能を持つヒト抗体（ヒトモノクローナル抗体等）の有効性が非常に所望されるであろう。しかしながら、ｈＣＭＶ中和抗体の標的はまだ確立されていない。先行研究により、ｇＢおよびｇＨが潜在的標的として識別された。しかしながら、ｇＨ（ＭＳＬ１０９）に対するヒト化抗体は、臨床治験にいかなる有意な効果も示さなかった［１０，１１］。これまでに記載された全ての中和抗体は、それらが高濃度でのみｈＣＭＶ感染を中和するために、低い中和能を有した。例えば、抗体ＭＳＬ−１０９は、１０μｇ／ｍｌの濃度で５０％中和活性のみを示し、生体内効果の欠如を説明し得る［１１］。抗ｈＣＭＶ抗体の中和能力は、典型的には、標的細胞として線維芽細胞を使用して測定される。しかしながら、ｈＣＭＶは、内皮細胞、上皮細胞および白血球細胞等の他の細胞型に感染することによって病態を生じさせることが知られている。高力価で非線維芽標的細胞の感染を中和することが可能である利用可能な任意のモノクローナル抗体はないように思われる。また、ＵＬ１２８およびＵＬ１３０に対する最近記載された中和抗体も内皮細胞の感染の中和において非常に低い作用を示した［７］。
【０００５】
したがって、ｈＣＭＶに対する中和抗体の産生、ならびにかかる抗体が結合する標的の解明に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ｈＣＭＶ感染を中和し、ｈＣＭＶ感染の中和において特に高い力価を有する抗体および抗体断片の産生に基づく。低濃度のみが所定量のウイルスを中和するために必要であるため、かかる抗体が望ましい。これは、より高レベルの保護を容易にさせるとともに、抗体の投与は少量である。ヒトモノクローナル抗体およびかかる抗体を分泌する不死化Ｂ細胞クローンもまた本発明の範囲内に含まれる。
【０００７】
発明者は、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの組み合わせに向けられた抗体が、ｈＣＭＶの中和に特に効果的であることを発見した。この組み合わせは、抗体により認識されるエピトープを形成するＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの複合体であり得るか、または抗体は、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの一方に向けられ得、他のタンパク質の存在が特異性にとって不可欠である。
【０００８】
また、本発明は、抗体が結合するエピトープの特徴付けおよび免疫学的応答の惹起におけるそのエピトープの使用にも関する。
【０００９】
また、本発明は、本発明の抗体およびそれらが結合するエピトープが関与する種々の方法および使用にも関する。
【００１０】
本発明の抗体
本発明は、ｈＣＭＶの中和において特に高い力価を有するモノクローナルまたは組換え抗体を提供する。また、本発明は、これらの組換えまたはモノクローナル抗体の断片、例えば、ｈＣＭＶタンパク質ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａに特異的な少なくとも１つの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を保持する、特に抗体の抗原結合活性を保持する断片も提供する。
【００１１】
本明細書において、「ｈＣＭＶの中和において高い力価」は、本発明の抗体分子が、例えばＭＳＬ−１０９と比べて、当技術分野において既知の抗体よりもはるかに低い濃度で、標準的なアッセイにおいてｈＣＭＶを中和することを意味する。
【００１２】
好ましくは、本発明の抗体分子は、０．１６μｇ／ｍｌ以下（つまり、０．１５、０．１２５、０．１、０．０７５、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１６、０．０１５、０．０１２５、０．０１、０．００７５、０．００５、０．００４、またはそれ以下）、好ましくは、０．０１６μｇ／ｍｌ以下（１０−８以下、好ましくは、１０−９Ｍ以下、好ましくは、１０−１０Ｍ以下、つまり１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、またはそれ以下の抗体濃度）の濃度で中和することができる。これは、ｈＣＭＶの同じ力価の中和に必要なＭＳＬ−１０９の濃度と比較して、非常に低濃度の抗体のみが、生体外ｈＣＭＶの臨床分離株の５０％中和に必要とされることを意味する。好ましくは、ｈＣＭＶの臨床分離株による内皮細胞、上皮細胞および樹枝状細胞の感染の５０％中和に必要な本発明の抗体の濃度は、ＭＳＬ１０９によって必要とされる濃度よりも５０倍以上（つまり、７５、１００、１５０、２００以上）低い。力価は、当技術分野において説明されるような標準的な中和アッセイを使用して測定することができる。
【００１３】
本発明の抗体は、ｈＣＭＶを中和することができる。好ましくは、本発明による抗体は、線維芽細胞または内皮細胞の感染を予防する。より好ましくは、本発明による抗体は、内皮細胞の感染を予防する。好ましくは、本発明による抗体は、線維芽細胞および内皮細胞の両方の感染を予防する。また、本発明の抗体は、好ましくは、樹枝状細胞および網膜細胞等の上皮細胞の感染も予防する。
【００１４】
これらの抗体は、適切な処方後に予防薬もしくは治療薬として、または診断ツールとして使用することができる。
【００１５】
「中和抗体」は、ホスト内の感染を開始するおよび／または永続化させる病原体の能力を中和することができるものである。本発明は、中和モノクローナルヒト抗体を提供し、該抗体は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）からの抗原を認識する。
【００１６】
好ましくは、本発明による抗体は、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの組み合わせに対する特異性を有する。
【００１７】
好ましくは、本発明による抗体は、本明細書において１Ｆ１１または２Ｆ４と称されるモノクローナル抗体である。これらの抗体は、最初に、ｈＣＭＶ感染ドナーから単離され、１Ｆ１１または２Ｆ４と称される不死化Ｂ細胞クローンによって産生される。これらの抗体は、内皮細胞、上皮細胞、網膜細胞および樹枝状細胞のｈＣＭＶ感染を中和することが分かった。加えて、異なるｈＣＭＶ感染ドナーから単離された該抗体５Ａ２および９Ａ１１は、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの組み合わせに対する同様の特異性と、そして内皮細胞、上皮細胞、網膜細胞および樹枝状細胞のｈＣＭＶ感染を中和する能力を示す。これらの抗体は、それぞれ５Ａ２および９Ａ１１と称される不死化Ｂ細胞クローンによって産生される。
【００１８】
１Ｆ１１は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖から成る。２Ｆ４は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖から成る。抗体重鎖のＣＤＲは、それぞれＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と称する。同様に、抗体軽鎖のＣＤＲは、それぞれＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と称する。ＣＤＲアミノ酸の位置は、ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ位置２７から３８、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ位置５６から６５およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ位置１０５から１１７として、ＩＭＧＴ番号付けシステム［１２、１３、１４］に従って定義する。
【００１９】
５Ａ２は、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖から成る。
【００２０】
これらの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を表１に示す。
【表１】
【００２１】
また、本発明は、１Ｆ１１または２Ｆ４（配列番号１〜３または１１〜１３）からの１つ以上の（つまり、１つ、２つまたは３つ全ての）重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含む抗体も含む。また、５Ａ２（配列番号３３〜３５）からの１つ以上の（つまり、１つ、２つまたは３つ全ての）重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含む抗体も含む。
【００２２】
好ましくは、本発明による抗体は、（ｉ）ＤＲＨ１に対して配列番号１、ＣＤＲＨ２に対して配列番号２、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号３、または（ｉｉ）ＣＤＲＨ１に対して配列番号１１、ＣＤＲＨ２に対して配列番号１２、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号１３を含む重鎖を含む。本発明によるさらに好適な抗体は、ＣＤＲＨ１に対して配列番号３３、ＣＤＲＨ２に対して配列番号３４、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号３５を含む重鎖を含む。
【００２３】
また、本発明は、１Ｆ１１または２Ｆ４（配列番号４〜６または１４〜１６）からの１つ以上の（つまり、１つ、２つまたは３つ全ての）軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体も含む。また、５Ａ２（配列番号３６〜３８）からの１つ以上の（つまり、１つ、２つまたは３つ全ての）軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体も含む。
【００２４】
好ましくは、本発明による抗体は、（ｉ）ＣＤＲＬ１に対して配列番号４、ＣＤＲＬ２に対して配列番号５、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号６、または（ｉｉ）ＣＤＲＬ１に対して配列番号１４、ＣＤＲＬ２に対して配列番号１５、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号１６を含む軽鎖を含む。本発明によるさらに好適な抗体は、ＤＲＬ１に対して配列番号３６、ＣＤＲＬ２に対して配列番号３７、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号３８を含む軽鎖を含む。
【００２５】
好ましくは、本発明による抗体は、配列番号７、１７または３９に示される配列を有する重鎖を含む。好ましくは、本発明による抗体は、配列番号８、１８または４０に示される配列を有する軽鎖を含む。
【００２６】
また、１Ｆ１１からの１つ以上のＣＤＲおよび２Ｆ４からの１つ以上のＣＤＲを含むハイブリッド抗体分子も存在し得る。好ましくは、かかるハイブリッド抗体は、１Ｆ１１からの３つのＣＤＲおよび２Ｆ４からの３つのＣＤＲを含む。したがって、好適なハイブリッド抗体は、ｉ）１Ｆ１１からの３つの軽鎖ＣＤＲおよび２Ｆ４からの３つの重鎖ＣＤＲ、またはｉｉ）１Ｆ１１からの３つの重鎖ＣＤＲおよび２Ｆ４からの３つの軽鎖ＣＤＲを含む。代替として、かかるハイブリッドは、５Ａ２からの１つ以上のＣＤＲを含有し得る。
【００２７】
また、本発明は、軽鎖および重鎖の一部または全てならびに本発明のＣＤＲをコードする核酸配列も含む。本発明による好適な核酸配列は、配列番号９（１Ｆ１１重鎖可変領域をコードする）、配列番号１０（１Ｆ１１軽鎖可変領域をコードする）、配列番号１９（２Ｆ４重鎖可変領域をコードする）、および配列番号２０（２Ｆ４軽鎖可変領域をコードする）を含む。種々のＣＤＲをコードする好適な核酸配列は、配列番号２１（１Ｆ１１ ＣＤＲＨ１をコードする）、配列番号２２（１Ｆ１１ ＣＤＲＨ２をコードする）、配列番号２３（１Ｆ１１ ＣＤＲＨ３をコードする）、配列番号２４（１Ｆ１１ ＣＤＲＬ１をコードする）、配列番号２５（１Ｆ１１ ＣＤＲＬ２をコードする）、配列番号２６（１Ｆ１１ ＣＤＲＬ３をコードする）、配列番号２７（２Ｆ４ ＣＤＲＨ１をコードする）、配列番号２８（２Ｆ４ ＣＤＲＨ２をコードする）、配列番号２９（２Ｆ４ ＣＤＲＨ３をコードする）、配列番号３０（２Ｆ４ ＣＤＲＬ１をコードする）、配列番号３１（２Ｆ４ ＣＤＲＬ２をコードする）および配列番号３２（２Ｆ４ ＣＤＲＬ３をコードする）を含む。本発明によるさらに好適な核酸配列は、配列番号４１（５Ａ２重鎖可変領域をコードする）、配列番号４２（５Ａ２軽鎖可変領域をコードする）、配列番号４３（５Ａ２ ＣＤＲＨ１をコードする）、配列番号４４（５Ａ２ ＣＤＲＨ２をコードする）、配列番号４５（５Ａ２ ＣＤＲＨ３をコードする）、配列番号４６（５Ａ２ ＣＤＲＬ１をコードする）、配列番号４７（５Ａ２ ＣＤＲＬ２をコードする）、配列番号４８（５Ａ２ ＣＤＲＬ３をコードする）を含む。遺伝暗号の冗長性に起因して、同じアミノ酸配列をコードするこれらの配列の変異体が存在するであろう。
【００２８】
また、変異抗体も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本出願に示した配列の変異体もまた本発明の範囲内に含まれる。かかる変異体は、上記のような遺伝暗号の縮重に起因して生じ得る。代替として、自然変異体は、転写または翻訳の誤りに起因して産生され得る。また、２Ｆ４の変異体も本明細書に開示する。この変異体は、２Ｆ４重鎖アミノ酸配列（配列番号１７）のＣ端末側終端で付加的な２つのセリン残基を含む。したがって、２Ｆ４のこの変異体は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖から成る。変異体重鎖をコードする核酸配列は、配列番号５０に示される。したがって、２Ｆ４変異体重鎖（配列番号４９）を含む抗体は本発明の範囲内に含まれる。
【００２９】
向上した親和性を有する抗体配列のさらなる変異体は、当技術分野において既知の方法を使用して得ることができ、本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸置換は、さらに向上した親和性を持つ抗体を得るために使用され得る。代替として、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、抗体を産生するための発現系において翻訳の効率を向上させるために使用され得る。
【００３０】
好ましくは、かかる変異抗体配列は、本出願に示した配列と７０％以上（つまり、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を共有する。好ましくは、かかる配列同一性は、参照配列（つまり、本出願に示した配列）の全長に関して算出される。好ましくは、本明細書に参照される同一性の割合（％）は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって指定される初期パラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックス、ギャップオープンペナルティ＝１１およびギャップ伸長ペナルティ＝１］を使用して、ＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を用いて決定される。
【００３１】
ベクター、例えば、本発明による核酸配列を含む発現ベクターが本発明の範囲内にさらに含まれる。かかるベクターで形質転換された細胞も本発明の範囲内に含まれる。
【００３２】
また、本発明は、モノクローナル抗体１Ｆ１１または２Ｆ４に結合することが可能なエピトープに結合する該モノクローナル抗体にも関する。また、本発明は、モノクローナル抗体５Ａ２に結合することが可能なエピトープに結合する該モノクローナル抗体にも関する。
【００３３】
モノクローナルおよび組換え抗体は、個々のポリペプチドまたはそれらが向けられる他の抗原の識別および精製に特に有用である。本発明の抗体は、それらが、免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において試薬として用いられ得るという点で、付加的な有用性を有する。これらの用途において、抗体は、放射性同位元素、蛍光分子または酵素等の分析的に検出可能な試薬で標識することができる。また、抗体は、抗原の分子的識別および特徴付け（エピトープマッピング）のためにも使用され得る。
【００３４】
本発明の抗体は、治療部位への送達のために薬物に連結することができるか、またはｈＣＭＶに感染した細胞等の関心細胞を含む部位の画像化を容易にさせるように、検出可能な標識に連結することができる。薬物および検出可能な標識に抗体を連結するための方法は、検出可能な標識を使用して画像化するための方法のように、当技術分野において既知である。標識された抗体は、様々な標識を用いる様々なアッセイにおいて用いられ得る。本発明の抗体と関心エピトープ（ｈＣＭＶエピトープ）との抗体−抗原複合体の形成の検出は、抗体に検出可能な物質を付着させることによって容易にすることができる。適切な検出手段は、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光体、化学発光物質、色素原、酵素基質または補助因子、酵素阻害薬、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素等の標識の使用を含む。適切な酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み、発光物質の例は、ルミノールであり、生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、ならびに適切な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈを含む。かかる標識された試薬は、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫測定法等の様々な既知のアッセイにおいて使用され得る。例えば、参考文献１５−１８を参照されたい。
【００３５】
本発明による抗体は、細胞毒、治療薬、または放射性金属イオンもしくは放射性同位元素等の治療部分に抱合され得る。放射性同位元素の例としては、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｄ−１０９、Ｔｃ−９９、Ｉｎ−１１１等が挙げられるが、これらに限定されない。かかる抗体抱合体は、所与の生物学的応答を改変するために使用することができ、薬物部分は、古典的な化学治療薬に制限されると解釈されるものではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を持つタンパク質またはポリペプチドであり得る。かかるタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素等の毒素を含み得る。
【００３６】
かかる治療部分を抗体に抱合する技術は既知である。例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．２４３−２５６； ｅｄ．Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９８７）“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｅｄ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２ｄ ｅｄ；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．６２３−６５３；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ'８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．ｐｐ．４７５−５０６（Ｅｄｉｔｒｉｃｅ Ｋｕｒｔｉｓ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ，１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５），ｐｐ．３０３−３１６；およびＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−１５８を参照されたい。
【００３７】
代替として、抗体は、第２の抗体に抱合して、参考文献１９に記載されるように、抗体ヘテロ抱合体を形成することができる。加えて、標識と発明の抗体との間でリンカーが使用され得る［２０］。抗体、またはその抗原結合断片は、当技術分野において既知の放射性ヨード、インジウム、イットリウム、または他の放射性粒子で直接標識され得る［２１］。治療は、同時に投与またはその後投与される抱合抗体と非抱合抗体の治療の組み合わせから成り得る［２２、２３］。
【００３８】
本発明の抗体は、固体支持体に付着され得る。
【００３９】
加えて、抗体は、例えば、それらの循環半減期を増大するために、ポリマーへの共有結合的抱合によって化学的に修飾することができる。好適なポリマー、およびそれらをペプチドに付着させる方法は、参考文献２４−２７に記載される。好適なポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎＯ−−Ｒを有し、Ｒは、水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基等の保護基であることができる。好ましくは、保護基は、１から８個の炭素を有し、より好ましくは、それはメチルである。記号ｎは、好ましくは、１から１，０００、より好ましくは、２から５００の間の正の整数である。ＰＥＧは、１，０００から４０，０００、より好ましくは、２，０００から２０，０００、最も好ましくは、３，０００から１２，０００の好適な平均分子量を有する。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、より好ましくは、それは末端ヒドロキシ基である。それは、阻害薬上の遊離アミノ基と反応するように好ましくは活性化されるヒドロキシ基である。しかしながら、反応基の型および量は、本発明の共有結合的に抱合されたＰＥＧ／抗体を達成するために変化し得ることが理解される。
【００４０】
また、水溶性ポリオキシエチル化ポリオールも本発明において有用である。それらは、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）等を含む。ＰＯＧは好適である。その理由の１つは、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、例えば、動物およびヒトにおけるモノ、ジ、トリグリセリド中に自然発生する骨格と同じ骨格であるためである。したがって、この分枝は、必ずしも体内の異質物質とは見られないであろう。ＰＯＧは、ＰＥＧと同程度である好適な分子量を有する。ＰＯＧの構造は、参考文献２８に記載され、ＰＯＧ／ＩＬ−２抱合体の考察は参考文献２４に見られる。
【００４１】
循環半減期を増大させるための別の薬物送達系は、リポソームである。リポソーム送達系を調製する方法は、参考文献２９、３０および３１で論じられる。他の薬物送達系は当技術分野において既知であり、例えば、参考文献３２および３３に記述される。
【００４２】
本発明の抗体は、好ましくは、精製された形態で提供される。典型的には、抗体は、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在し、例えば、９０重量％未満、通常６０％未満、およびさらに通常５０％未満の組成物が他のポリペプチドで構成される。
【００４３】
本発明の抗体は、非ヒト（異種）ホスト、例えばマウスにおいて免疫原性であり得る。抗体は、非ヒトホストにおいて免疫原性であるが、ヒトホストにおいては免疫原性でないイディオトープを有し得る。ヒトが使用するための本発明の抗体は、マウス、ヤギ、ウサギ、ラット、非霊長類哺乳類等のホストから得ることができないもの、およびヒト化によって、または異種マウスから得ることができないものを含む。
【００４４】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭつまり、α、γまたはμ重鎖）であることができるが、概してＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプ内で、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスであり得る。本発明の抗体は、κまたはλ軽鎖を有し得る。
【００４５】
抗体の産生
本発明によるモノクローナル抗体は、当技術分野において既知の方法のうちの１つで生成することができる。ハイブリドーマ技術を使用してモノクローナル抗体を生成するための一般手法は既知である［３４、３５］。好ましくは、参考文献３６に記述される代替的なＥＢＶ不死化方法が使用される。
【００４６】
参考文献３６に記述される方法を使用して、本発明の抗体を産生するＢ細胞は、多クローン性Ｂ細胞活性化因子の存在下においてＥＢＶで形質転換することができる。ＥＢＶでの形質転換は標準的な技術であり、多クローン性Ｂ細胞活性化因子を含むように容易に適合することができる。
【００４７】
細胞増殖および分化の付加的な刺激薬を、効率をさらに増強させるために形質転換ステップ時に添加することができる。これらの刺激薬は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５等のサイトカインであり得る。特に好適な態様において、ＩＬ−２は、不死化の効率をさらに向上させるために不死化ステップ時に添加されるが、その使用は必須ではない。
【００４８】
次いで、これらの方法を使用して産生した不死化Ｂ細胞を、当技術分野において既知の方法を使用して培養し、抗体をそこから単離することができる。
【００４９】
モノクローナル抗体は、所望される場合、濾過、遠心分離、およびＨＰＬＣまたは親和性クロマトグラフィ等の種々のクロマトグラフ法を使用してさらに精製され得る。製薬等級抗体を産生するための技術を含む、モノクローナル抗体を精製する技術は、当技術分野において既知である。
【００５０】
本発明のモノクローナル抗体の断片は、ペプシンもしくはパパイン等の酵素での消化を含む方法によって、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断によって、モノクローナル抗体から得ることができる。代替として、モノクローナル抗体の断片は、重鎖または軽鎖の配列の一部のクローニングおよび発現によって得ることができる。抗体「断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片を含む。また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖から派生する一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）も包含し、例えば、本発明は、本発明の抗体からのＣＤＲを含むｓｃＦｖを含む。また、重鎖または軽鎖単量体および二量体ならびに単鎖抗体、例えば、重鎖および軽鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結される一本鎖Ｆｖも含む。
【００５１】
分子生物学の標準的な技術を、本発明の抗体または抗体の断片をコードするＤＮＡ配列を調製するために使用することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、完全にまたは部分的に合成され得る。部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を必要に応じて使用することができる。
【００５２】
任意の適切なホスト細胞／ベクター系は、本発明の抗体分子またはその断片をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用され得る。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片、特にＦｖ断片および単鎖抗体断片、例えば、一本鎖Ｆｖｓ等の抗体断片の発現のために、細菌、例えば大腸菌、および他の微生物系が部分的に使用され得る。真核生物、例えば哺乳類ホスト細胞発現系は、完全な抗体分子を含む、より大きな抗体分子の産生のために使用され得る。適切な哺乳類ホスト細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞を含む。
【００５３】
また、本発明は、本発明による抗体分子を産生するための工程も提供し、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現をもたらすのに適した条件下で、本発明のベクターを含むホスト細胞を培養するステップと、抗体分子を単離するステップとを含む。
【００５４】
抗体分子は、重鎖または軽鎖ポリペプチドのみを含み得、その場合においては、重鎖または軽鎖ポリペプチドコード配列のみを、ホスト細胞を形質移入するために使用する必要がある。重鎖および軽鎖の両方を含む産物を産生するために、細胞系は、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターの２つのベクターを形質移入され得る。代替として、単一ベクターが使用され得、該ベクターは、軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。
【００５５】
代替として、本発明による抗体は、ｉ）細胞内で本発明による核酸配列を発現するステップ、およびｉｉ）発現された抗体産物を単離するステップによって産生され得る。加えて、方法は、ｉｉｉ）抗体を精製するステップを含み得る。
【００５６】
Ｂ細胞のスクリーニングおよび単離
形質転換されたＢ細胞を、所望の抗原特異性の抗体を産生するものに対してスクリーニングし、次いで、個々のＢ細胞クローンは、陽性細胞から産生することができる。
【００５７】
スクリーニングステップは、ＥＬＩＳＡ、組織または細胞（形質移入された細胞を含む）の染色、中和アッセイまたは所望の抗原特異性を識別するための当技術分野において既知の多くの他の方法のうちの１つによって行われ得る。アッセイは、単純抗原認識に基づいて選択し得るか、または、例えば、抗原結合抗体だけではなく中和抗体を選択し、標的細胞の特徴、たとえば、それらのシグナリングカスケード、それらの形、それらの増殖速度、他の細胞に影響するそれらの能力、他の細胞もしくは他の試薬または条件の変化による影響に対するそれらの応答、それらの分化状態等を変化させることができる抗体を選択する等のような、所望の機能にさらに基づいて選択され得る。
【００５８】
陽性細胞の混合物から個々のクローンを分離するクローニングステップは、限界希釈法，顕微操作、細胞分類による単細胞沈着、または当技術分野において既知の別の方法を使用して行われ得る。好ましくは、クローニングは、限界希釈法を使用して行われる。
【００５９】
本発明の不死化Ｂ細胞クローンは、例えば、モノクローナル抗体源として、研究のための関心モノクローナル抗体をコードする核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）源等として、種々の方法で使用することができる。
【００６０】
本発明は、不死化Ｂメモリーリンパ球を含む組成物を提供し、該リンパ球は、ｈＣＭＶに特異的な高中和能力を持つ抗体を産生し、該抗体は、１日当たり細胞ごとに５ｐｇ以上産生される。また、本発明は、不死化Ｂメモリーリンパ球のクローンを含む組成物を提供し、該クローンは、ｈＣＭＶに特異的な高親和性を持つモノクローナル抗体を産生し、該抗体は、１日当たりクローンごとに１０Ｎｎｇ以上産生される。好ましくは、該クローンは、ｈＣＭＶ感染の中和において、高い力価を持つモノクローナル抗体を産生する。
【００６１】
本発明による好適な不死化Ｂ細胞クローンは、１Ｆ１１および２Ｆ４である。さらに好適なクローンは、５Ａ２および９Ａ１１である。
【００６２】
エピトープ
上記のように、本発明の抗体は、それらが結合するエピトープをマッピングするために使用することができる。出願者は、内皮細胞、上皮細胞、網膜細胞および樹枝状細胞のｈＣＭＶ感染を中和する抗体１Ｆ１１、２Ｆ４、５Ａ２および９Ａ１１が、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの組み合わせ上に見られるエピトープに向けられることを発見した。出願者は、この理論に制約されることを望まないが、抗体１Ｆ１１および２Ｆ４が、これらの２つのタンパク質によって形成される高次構造エピトープに結合すると考えられる。また、５Ａ２および９Ａ１１も、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａによって形成されるかかる高次構造エピトープに結合すると考えられる。
【００６３】
１Ｆ１１、２Ｆ４、５Ａ２、および９Ａ１１が、線維芽細胞の感染を中和しない事実に起因して、これらの抗体は、ヒトモノクローナル抗体１０Ｃ６、５Ｆ１、６Ｂ４および７Ｈ３に対する異なるエピトープを認識すると仮定される。さらに、モノクローナル抗体１０Ｃ６、５Ｆ１、７Ｈ３および６Ｂ４は、ｇＢの機能的エピトープに結合すると考えられる。
【００６４】
これらの抗体によって認識されるエピトープは、多くの使用があり得る。精製された形態または合成形態でのエピトープおよびミモトープは、免疫学的応答（つまり、ワクチンとして、または他の使用のために抗体を産生するため）を惹起するために、またはエピトープもしくはミモトープと免役反応する抗体に対して患者血清をスクリーニングするために使用することができる。好ましくは、かかるエピトープもしくはミモトープ、またはかかるエピトープもしくはミモトープを含む抗原は、免疫反応を向上させるためのワクチンとして使用される。また、本発明の抗体は、ワクチンの質をモニターする方法、特に、ワクチン中の抗原が、正しい高次構造において正しいエピトープを含有することを確認する方法において使用することもできる。
【００６５】
また、エピトープは、該エピトープに結合するリガンドのスクリーニングにおいても有用であり得る。このようなリガンドは、好ましくは、エピトープをブロックするため、感染を予防する。このようなリガンドは、本発明の範囲内に包含される。
【００６６】
組換え発現
また、本発明の不死化メモリーＢリンパ球は、その後の組換え発現に対する抗体遺伝子のクローニングのために核酸源としても使用し得る。組換え源からの発現は、例えば、安定性、再現性、培養の容易さ等の理由で、Ｂ細胞またはハイブリドーマからの発現よりも、医薬目的上より一般的である。
【００６７】
したがって、本発明は、組換え細胞を調製するための方法を提供し、（ｉ）関心抗体をコードするＢ細胞クローンから１つ以上の核酸（例えば、重鎖および／または軽鎖遺伝子）を得るステップと、（ｉｉ）発現ホスト内における関心抗体の発現を可能にするように、そのホスト内に核酸を挿入するステップとを含む。
【００６８】
同様に、本発明は、組換え細胞を調製するための方法を提供し、（ｉ）関心抗体をコードするＢ細胞クローンから核酸を配列決定するステップと、ステップ（ｉ）からの配列情報を使用して、発現ホスト内における関心抗体の発現を可能にするように、そのホスト内に挿入するために核酸を調製するステップとを含む。
【００６９】
また、本発明は、組換え細胞を調製する方法を提供し、モノクローナル関心抗体をコードする１つ以上の核酸でホスト細胞を形質転換するステップを含み、該核酸は、本発明の不死化Ｂ細胞クローンから派生した核酸である。したがって、最初に、該核酸を調製し、次いで、ホスト細胞を形質転換するためにそれを使用する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【００７０】
次いで、本発明のこれらの組換え細胞は、発現および培養目的で使用することができる。それらは、大規模の薬剤生産のための抗体の発現に特に有用である。また、それらは、医薬組成物の活性成分としても使用することができる。任意の適切な培養技術を使用することができ、その技術には、静置培養、ローラーボトル培養、腹水、中空糸型バイオリアクターカートリッジ、モジュラーミニファーメンター、攪拌槽、マイクロキャリア培養、セラミック中子灌流等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
Ｂ細胞から免疫グロブリン遺伝子を得る、および配列決定するための方法は、当技術分野において既知である（例えば、参考文献３７を参照）。
【００７２】
発現ホストは、好ましくは、真核細胞であり、酵母および動物細胞、特に、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６［Ｃｒｕｃｅｌｌ、参考文献３８］またはＨＫＢ-１１［Ｂａｙｅｒ、参考文献３９＆４０］細胞、骨髄腫細胞［４１＆４２］等）等のヒト細胞、ならびに植物細胞を含む。好適な発現ホストは、特に、それ自体ではヒトにおいて免疫原性ではない糖鎖構造を用いて、本発明の抗体をグリコシル化することができる。無血清培地中で増殖することができる血清発現ホストが好適である。動物由来の産物が存在しない培養物中で増殖することができる発現ホストが好適である。
【００７３】
発現ホストは、細胞系を得るために培養され得る。
【００７４】
本発明は、関心抗体をコードする１つ以上の核酸分子（例えば、重鎖および軽鎖遺伝子）を調製するための方法を提供し、（ｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローンを調製するステップと、（ｉｉ）関心抗体をコードするＢ細胞クローンを核酸から得るステップとを含む。また、本発明は、関心抗体をコードする核酸配列を得るための方法を提供し、（ｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローンを調製するステップと、（ｉｉ）関心抗体をコードするＢ細胞クローンから核酸を配列決定するステップとを含む。
【００７５】
また、本発明は、関心抗体をコードする核酸分子を調製する方法も提供し、本発明の形質転換されたＢ細胞から得られたＢ細胞クローンから核酸を得るステップを含む。したがって、最初に、Ｂ細胞クローンを得、次いで、それから核酸を調製する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【００７６】
本発明は、（例えば、医薬用途のために）抗体を調製するための方法を提供し、（ｉ）関心抗体を発現する選択したＢ細胞クローンから１つ以上の核酸（例えば、重鎖および軽鎖遺伝子を得るステップおよび／または配列決定するステップと、（ｉｉ）核酸を挿入するか、または核酸を使用して、関心抗体を発現することができる発現ホストを調製するステップと、（ｉｉｉ）関心抗体が発現される条件下で、発現ホストを培養または継代培養するステップと、任意に、（ｉｖ）関心抗体を精製するステップとを含む。
【００７７】
また、本発明は、抗体を調製する方法も提供し、関心抗体が発現される条件下で、発現ホスト細胞集団を培養または継代培養するステップと、任意に、関心抗体を精製するステップとを含み、該発現ホスト細胞集団は、（ｉ）上記のように調製されたＢメモリーリンパ球の集団により産生される関心抗体を発現する選択したＢ細胞をコードする核酸を提供するステップ、（ｉｉ）関心抗体を発現することができる発現ホスト内に核酸を挿入するステップ、および（ｉｉｉ）該発現ホスト細胞集団を産生するために、該挿入した核酸を含む発現ホストを培養または継代培養するステップによって調製された。したがって、最初に、組換え発現ホストを調製し、次いで、抗体を発現するためにそれを培養する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【００７８】
医薬組成物
医薬品の活性成分としての抗体の使用は、現在では広範囲にわたり、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））（トラスツズマブ）、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、レオプロ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、ゼヴァリン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、オマリズマブ、シナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））（パリビズマブ）、ゼナパックス（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））（ダクリズマブ）等の製品を含む。
【００７９】
したがって、本発明は、本発明の抗体、および／またはかかる抗体をコードする核酸、および／またはかかる抗体を発現する不死化Ｂ細胞、および／または本発明の抗体により認識されるエピトープを含有する医薬組成物を提供する。また、医薬組成物は、投与を可能にするように、医薬的に許容可能な担体も含有し得る。担体は、それ自体が、組成物を受け取る個人に有害である抗体の産生を誘導すべきではなく、毒性であるべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子等の大型かつ代謝速度が遅い巨大分子であり得る。
【００８０】
医薬的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩等の鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩等の有機酸の塩を使用することができる。
【００８１】
治療用組成物中の医薬的に許容可能な担体は、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノール等の液体をさらに含有し得る。加えて、湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝物質等の補助物質がかかる組成物中に存在し得る。かかる担体は、患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁液として医薬組成物を製剤化することが可能である。
【００８２】
好適な投与形態は、例えば、注射または注入による、例えば、ボーラス投与または持続注入よる非経口投与に適した形態を含む。製品が注射または注入のためのものである場合、それは、油性または水性媒体中で懸濁液、溶液または乳濁液の形態を取り得、そしてそれは、懸濁剤、防腐剤、安定剤および／または分散剤等の製剤化剤を含有し得る。代替として、抗体分子は、使用前の適切な滅菌液との再構成のために、乾燥状態であり得る。
【００８３】
製剤化され次第、本発明の組成物は、被験体に直接投与することができる。組成物は、ヒト被験体への投与に適合されることが好ましい。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、局所、皮下、鼻腔内、腸内、舌下、膣内または直腸経路を含むが、これらに限定されないあらゆる経路によって投与され得る。また、本発明の医薬組成物を投与するためにハイポスプレーも使用され得る。典型的には、治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注入物質として調製され得る。また、注入前に、液体媒体中の溶液または懸濁液に適した固形も調製され得る。
【００８５】
組成物の直接的な送達は、概して、注射、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内送達によって達成されるか、または組織の間質腔に送達される。また、組成物は、病変内にも投与することができる。投薬治療は、単回投与計画または複数回投与計画であってもよい。既知の抗体ベースの医薬品は、例えば、医薬品を毎日、毎週、毎月等送達すべきかどうか等の投与頻度に関する手引きを提供する。また、頻度および用量は、症状の重症度にも依存し得る。
【００８６】
本発明の組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注入物質として調製され得る。また、注入前に、液体媒体中の溶液または懸濁液に適した固形も調製することができる（例えば、防腐剤を含有する滅菌水との再構成のために、シナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））およびハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））等の凍結乾燥された組成物）。組成物は、局所投与のために、例えば、軟膏、クリームまたは粉末として調製され得る。組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤もしくはカプセルとして、スプレーとして、またはシロップ（任意に、香味づけたもの）として調製され得る。組成物は、微粉末またはスプレーを使用して、例えば、肺内投与のために吸入剤として調製され得る。組成物は、坐薬または腟坐薬として調製され得る。組成物は、経鼻、経耳または経眼投与のために、例えば、ドロップとして調製され得る。組成物は、組み合わされた組成物が、患者への投与直前に再構成できるように設計されたキット形態であり得る。例えば、凍結乾燥された抗体は、滅菌水または滅菌緩衝液を有するキット形態で提供することができる。
【００８７】
組成物中の活性成分は、抗体分子であることが理解されるであろう。したがって、それは、胃腸管における分解に影響されやすい。したがって、組成物が胃腸管を用いた経路によって投与されるのであれば、組成物は、分解から抗体を保護するが、それが胃腸管から吸収され次第、抗体を放出する薬物を含有する必要がある。
【００８８】
医薬的に許容可能な担体の詳細な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２で入手可能である。
【００８９】
本発明の医薬組成物は、概して、５．５から８．５、好ましくは、６から８、より好ましくは、約７のｐＨを有する。ｐＨは、緩衝液の使用によって維持され得る。組成物は、無菌であり得るか、および／またはピロゲンを含み得ない。組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。本発明の医薬組成物は、好ましくは、密封容器中に供給される。
【００９０】
医薬組成物は、本発明の１つ以上の抗体および／もしくは本発明の１つ以上の不死化Ｂ細胞ならびに／または本発明の抗体に結合するエピトープを含むポリペプチドの有効量、つまり、所望の疾患または状態を治療する、寛解させる、もしくは予防するのに十分な、または検出可能な治療効果を呈するのに十分な量を含む。また、治療効果は、身体症状の軽減も含む。任意の特定の被験体に対する正確な有効量は、被験体のサイズおよび健康、状態の性質および程度、ならびに治療学または投与のために選択された治療学の組み合わせに依存する。所与の状況に対する有効量は、日常的な実験によって決定され、臨床従事者の判断内にある。本発明の目的で、有効用量は、概して、投与される個人における本発明の組成物の約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇである。既知の抗体ベースの医薬品は、この点における手引きを提供し、例えば、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、２１ｍｇ／ｍｌ溶液の静脈内注入によって投与され、初期負荷用量は体重１ｋｇあたり４ｍｇであり、毎週の維持量は体重１ｋｇあたり２ｍｇであり、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））は、３７５ｍｇ／ｍ２を毎週投与される。
【００９１】
組成物は、本発明の１つより多い（例えば、２、３、４、５等）抗体を含むことができ、特に、そのような抗体が異なる抗原（または同じ抗原中の異なるエピトープ）に結合し、相加的または相乗的治療効果をもたらす場合においてそのようにされる。例えば、１つの抗体は、ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ組み合わせ（または複合体）に結合し得、一方で、別の抗体はｇＨに結合し得る。さらなる実施例において、１つの抗体は、ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ組み合わせ（または複合体）に結合し得、一方で、別の抗体はｇＢに結合し得る。したがって、１つの抗体は、線維芽細胞の感染を媒介するメカニズムに標的され得、一方で、もう１つの抗体は、内皮細胞の感染を媒介するメカニズムに標的され得る。最適な臨床効果が得られるように、それは、ｈＣＭＶ感染および維持の両方のメカニズムに対応するという利点があり得るだろう。
【００９２】
本発明の抗体は、例えば、化学療法化合物とともに、放射線療法等とともに等、他の治療学とともに（組み合わせて、または別々に）投与され得る。好適な治療化合物は、ガンシクロビル、ホスカルネットおよびシドホビル等の抗ウイルス化合物を含む。かかる組み合わせ治療法は、単独で投与する場合に、個々の治療薬に対する治療効果の相加的または相乗的向上を提供する。「相乗作用」という用語は、各それぞれの活性薬剤の個々の効果の和よりも大きい２つ以上の活性薬剤の併用効果を説明するために使用する。したがって、２つ以上の薬剤の併用効果が活性または工程の「相乗的阻害」をもたらす場合、それは、活性または工程の阻害が、各それぞれの活性薬剤の阻害効果の和よりも大きいことを意図する。「相乗的治療効果」という用語は、２つ以上の治療の組み合わせで観察された治療効果を指し、治療効果（多数のパラメータのいずれかによって測定されたような）は、それぞれ個々の治療で観察された個々の治療効果の和よりも大きい。
【００９３】
抗体は、ｈＣＭＶ感染の治療に対して以前に反応を示さなかった、つまり、抗ｈＣＭＶ治療に対して抵抗性を示したそれらの患者に投与され得る。かかる治療は、抗ウイルス剤を用いた以前の治療を含み得る。これは、例えば、ｈＣＭＶの抗ウイルス耐性株による感染に起因し得る。
【００９４】
本発明の抗体を含む本発明の組成物において、抗体は、好ましくは、組成物中の総タンパク質の少なくとも５０重量％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上）を占める。したがって、抗体は、精製された形態である。
【００９５】
本発明は、医薬品を調製する方法を提供し、（ｉ）本発明の抗体を調製するステップと、（ｉｉ）精製された抗体と１つ以上の医薬的に許容可能な担体とを混合するステップ、とを含む。
【００９６】
また、本発明は、医薬品を調製する方法も提供し、抗体を１つ以上の医薬的に許容可能な担体とを混合するステップを含み、抗体は、本発明の形質転換されたＢ細胞から得られたモノクローナル抗体である。したがって、最初に、モノクローナル抗体を得、次いで、医薬品を調製する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【００９７】
治療目的のために抗体またはＢ細胞を送達することの代替案として、核酸が原位置で被験体内に発現され、所望の治療効果を提供できるように、関心モノクローナル抗体（またはその活性断片）をコードする核酸（典型的には、ＤＮＡ）を被験体に送達することが可能である。適切な遺伝子治療法および核酸送達ベクターは、当技術分野において既知である。
【００９８】
本発明の組成物は、免疫原性組成物であり得、より好ましくは、ｈＣＭＶタンパク質ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの組み合わせ上に見られるエピトープを含む抗原を含むワクチン組成物である。代替的な組成物は、（ｉ）ｈＣＭＶタンパク質ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの組み合わせ上に見られるエピトープを含む抗原、ならびに（ｉｉ）ｈＣＭＶ ｇＢ上に見られるエピトープを含む抗原を含み得る。本発明によるワクチンは、予防のため（つまり、感染を防止するため）または治療のため（つまり、感染を治療するため）にいずれかであり得るが、典型的には、予防のためである。
【００９９】
組成物は、特に複数回投与形式でパッケージされる場合に、抗菌薬を含み得る。
【０１００】
組成物は、界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含み得る。界面活性剤は、概して低い濃度、例えば、０．０１％未満で存在する。
【０１０１】
組成物は、浸透圧を与えるためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌの濃度が典型的である。
【０１０２】
組成物は、特に、それらが凍結乾燥される場合か、またはそれらが、凍結乾燥された材料から再構成された材料を含む場合に、例えば、約１５〜３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）で、糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）を含む。凍結乾燥のための組成物のｐＨは、凍結乾燥前に約６．１に調整され得る。
【０１０３】
また、本発明の組成物は、１つ以上の免疫調節剤も含み得る。好ましくは、１つ以上の免疫調節剤は、アジュバントを含む。
【０１０４】
本発明の組成物は、ｈＣＭＶ感染に効果的に対応するために、好ましくは、細胞媒介の免疫学的応答ならびに液性免疫学的応答の両方を誘発する。この免疫学的応答は、好ましくは、持続性（例えば、中和）抗体と、ｈＣＭＶへの曝露後に急速に応答することができる細胞媒介の免疫との両方を誘発する。
【０１０５】
医学的治療および用途
本発明の抗体またはその断片は、ｈＣＭＶ感染の治療、ｈＣＭＶ感染の予防またはｈＣＭＶ感染の診断のために使用され得る。
【０１０６】
診断方法は、抗体または抗体断片を試料と接触させるステップを含む。かかる試料は、例えば、唾液腺、肺、肝臓，膵臓、腎臓、耳、眼、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳または皮膚から取った組織試料であり得る。また、診断方法は、抗原／抗体複合体の検出も含む。
【０１０７】
したがって、本発明は、治療法で用いるための（ｉ）本発明による抗体、（ｉｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローン、（ｉｉｉ）１Ｆ１１もしくは２Ｆ４のうちの１つに結合することが可能なエピトープ、または（ｉｖ）５Ａ２もしくは９Ａ１１のうちの１つに結合することが可能なエピトープを提供する。
【０１０８】
また、患者を治療する方法も提供し、（ｉ）本発明による抗体、（ｉｉ）１Ｆ１１もしくは２Ｆ４のうちの１つに結合することが可能なエピトープ、または（ｉｉｉ）５Ａ２もしくは９Ａ１１のうちの１つに結合することが可能なエピトープを、その患者に投与する方法を含む。
【０１０９】
また、本発明は、ｈＣＭＶ感染の予防もしくは治療のための薬物の製造において、（ｉ）本発明による抗体、（ｉｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローン、（ｉｉｉ）１Ｆ１１もしくは２Ｆ４のうちの１つに結合することが可能なエピトープ、（ｉｖ）１Ｆ１１もしくは２Ｆ４のうちの１つに結合することが可能なエピトープに結合する抗体、（ｖ）５Ａ２もしくは９Ａ１１のうちの１つに結合することが可能なエピトープ、または（ｖｉ）５Ａ２もしくは９Ａ１１のうちの１つに結合することが可能なエピトープに結合する抗体の使用も提供する。
【０１１０】
本発明は、薬物としての使用のための本発明の組成物を提供する。また、患者の治療および／または患者の診断のための薬物の製造における、本発明の抗体および／またはかかる抗体が結合するエピトープを含むタンパク質の使用も提供する。また、被験体を治療するための、および／または患者に診断を行う方法も提供し、それらを本発明の組成物に投与するステップを含む。被験体は、好ましくは、ヒトである。治療処置の有効性を確認する一方法は、本発明の組成物の投与後に、疾患症状をモニターするステップを包含する。治療は、単回投与計画または複数回投与計画であることができる。本発明はＣＭＶ感染のために有用である。
【０１１１】
好ましくは、本発明による抗体、不死化Ｂ細胞クローン、エピトープまたは組成物は、特に、ｈＣＭＶ感染の危険性がある、または感染しやすい被験体のグループに投与される。かかる被験体グループは、ＨＩＶに罹患するまたは移植患者等の免疫抑制治療法を受ける被験体等の免疫不全被験体を含む。
【０１１２】
本発明の抗体は、受動免疫法において使用することができる。
【０１１３】
また、本発明において記述した抗体およびその断片は、ｈＣＭＶ感染の診断のためのキットにおいても使用され得る。
【０１１４】
本発明において記述したモノクローナル抗体１Ｆ１１または２Ｆ４に結合することが可能なエピトープは、防御抗ｈＣＭＶ抗体の存在を検出することによって、ワクチン接種手順の有効性をモニターするためのキットにおいて使用され得る。
【０１１５】
本発明において記述したモノクローナル抗体５Ａ２または９Ａ１１に結合することが可能なエピトープは、防御抗ｈＣＭＶ抗体の存在を検出することによって、ワクチン接種手順の有効性をモニターするためのキットにおいて使用され得る。
【０１１６】
また、本発明において記述した抗体およびその断片は、所望の免疫原性でのワクチン製造をモニターするためのキットにおいても使用され得る。
【０１１７】
また、本発明は、医薬品を調製する方法を提供し、モノクローナル抗体を１つ以上の医薬的に許容可能な担体と混合するステップを含み、モノクローナル抗体は、本発明の発現ホストから得られたモノクローナル抗体である。したがって、最初に、モノクローナル抗体を得て（例えば、それを発現するおよび／またはそれを精製する）、次いで、それを医薬担体と混合する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【０１１８】
本発明の形質転換されたＢ細胞から始めて、各ステップでの任意の最適化を用いる培養、継代培養、クローニング、サブクローニング、配列決定、核酸調製等の種々のステップを、形質転換されたＢ細胞によって発現される抗体を永続化させるために行うことができる。好適な実施形態において、上記の方法は、抗体をコードする核酸に適用される最適化の技術（例えば、親和性成熟または最適化）をさらに含む。本発明は、そのようなステップ時に使用および調製される全ての細胞、核酸、ベクター、配列、抗体等を包含する。
【０１１９】
これらの全ての方法において、発現ホスト内で使用される核酸は、ある種の核酸配列を挿入、欠失または修正するように、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の間で操作され得る。かかる操作からの変更は、制限酵素部位を導入するため、コドン利用を修正するため、転写および／または翻訳制御配列を追加または最適化するため等の変更を含むが、これらに限定されない。また、コードされたアミノ酸を変化させるために、核酸を変更することも可能である。例えば、それは、１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）アミノ酸置換、１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）アミノ酸欠失および／または抗体のアミノ酸配列への１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）アミノ酸挿入を導入するために有用であり得る。このような点突然変異は、エフェクター機能、抗原結合親和性、翻訳後修飾、免疫原性等を修飾することができるか、共有結合基（例えば、標識）の付着のためにアミノ酸を導入することができるか、またはタグ（例えば、精製目的で）を導入することができる。突然変異は、特異的部位に導入することができるか、または、ランダムとその後の淘汰（例えば、分子進化）により導入することができる。
【０１２０】
一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、独占的にＸから成るか、または、例えばＸ＋Ｙ等の何らかの付加的なものを含み得る。
【０１２１】
単語「実質的に」は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないこともある。単語「実質的に」は、必要に応じて本発明の定義から削除され得る。
【０１２２】
数値ｘに関連する「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１２３】
本明細書で用いる場合、「疾患」という用語は、概して、正常機能を損ない、そして、典型的には、特徴的な徴候および症状によって顕在化し、ヒトもしくは動物の寿命および生活の質を減少させる、ヒトもしくは動物の体の、またはその一部の異常な状態を全てが反映するという点で、「障害」および「状態」（医学的状態等の場合）と同義語であることが意図され、それらと同じ意味で使用される。
【０１２４】
本明細書で用いる場合、患者の「治療」への言及は、予防および予防法を含むことを意図する。「患者」という用語は、ヒトを含む全ての哺乳類を意味する。患者の例としては、ヒト、雌ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、およびウサギが挙げられる。好ましくは、患者はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ヒトモノクローナル抗体（１）１Ｆ１１および（２）２Ｆ４がｈＣＭＶタンパク質の複合体を沈殿させ、その一方、不適切なＩｇＧは沈殿させないことを実証するＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２】ヒトモノクローナル抗体（Ａ）１Ｆ１１および２Ｆ４ならびに（Ｂ）５Ａ２および９Ａ１１が、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａ遺伝子産物によって生成された高次構造エピトープを認識することを実証するＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図３】１Ｆ１１および２Ｆ４の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ配列は太字で示す。
【図４】ヒトモノクローナル抗体７Ｈ３、１０Ｃ６、５Ｆ１および６Ｂ４が、ｈＣＭＶタンパク質ｇＢ上のエピトープを認識することを実証するＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５】５Ａ２の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ配列は太字で示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２６】
実施例１：Ｂ細胞のクローニングおよびｈＣＭＶ中和活性のスクリーニング
血清中に高いｈＣＭＶ中和抗体力価を持つ２つのドナーを確認した。メモリーＢ細胞を、参考文献３６に記述されるように、ＥＢＶおよびＣｐＧを使用して単離および不死化した。つまり、メモリーＢ細胞を、ＣＤ２２ビーズを使用してネガティブ選択により単離し、続いて特異的抗体および細胞分類を使用してＩｇＭ＋、ＩｇＤ＋ＩｇＡ＋Ｂ細胞を除去した。ＣｐＧ２００６の存在下において、分類した細胞（ＩｇＧ＋）をＥＢＶで不死化し、同種単核細胞を照射した。それぞれ５０メモリーＢ細胞を含有する同型培養物を、２０の９６ウェルＵ字形底プレートに配置した。２週間後、培養上清を採取し、別々のアッセイにおいて線維芽細胞または上皮細胞のいずれかのｈＣＭＶ感染を中和するそれらの能力を試験した。Ｂ細胞クローンを、参考文献３６に記述されるように、陽性多クローン性培養物から単離した。選択したクローンの上清中のＩｇＧ濃度は、ＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡを使用して決定した。
【０１２７】
ウイルス中和アッセイのために、滴定量の臨床ｈＣＭＶ分離株を、等容積の培養上清または中和抗体を含有するヒト血清希釈と混合した。室温でのインキュベーションの１時間後、混合物を９６ウェル平底プレート中の内皮細胞（例えばＨＵＶＥＣ細胞）または線維芽細胞のいずれかの融合性単層に添加し、３７℃で２日間インキュベートした。上清を捨て、細胞を冷メタノールで固定し、ｈＣＭＶ早期抗原に対するマウスモノクローナル抗体の混合物と、続いてフルオレセイン標識ヤギ抗マウスＩｇで染色した。プレートは、蛍光顕微鏡を使用して分析した。中和抗体の非存在下において、感染した細胞は約１０００／視野であり、一方、飽和濃度の中和抗体の存在下において、感染は完全に阻害された。中和力価は、ｈＣＭＶ感染の５０％減少をもたらす抗体（μｇ／ｍｌ）の濃度として示す。
【０１２８】
表２は、異なる３つの型の抗体が同定されたことを示す。線維芽細胞の感染を中和できる抗体、内皮細胞の感染を中和できる抗体およびその両方の感染を中和できる抗体である。これは、異なるタンパク質が特定の細胞型に対する指向性に関与するという以前のデータと一致する［７］。内皮細胞の中和に加えて、１Ｆ１１および２Ｆ４は、網膜細胞等の上皮細胞、および樹枝状細胞の感染を中和することが観察された（データは示していない）。
【表２】
【０１２９】
一部の抗体は、０．３から０．５μｇ／ｍｌの範囲のＩｇＧ濃度で線維芽細胞および内皮細胞の両方を中和した。他の抗体（１Ｆ１１、５Ａ２、９Ａ１１および２Ｆ４）は、線維芽細胞のｈＣＭＶ感染を中和できなかったが、内皮細胞の感染を中和し、０．００１から０．００４μｇ／ｍｌ（以前より既知の抗体よりも１０００倍を超えて強力）という極めて低い濃度で中和した。
【０１３０】
初期の特徴付け以後、５Ｆ１は、ｇＨではなくむしろｇＢのエピトープに結合すると判断されたことに留意されたい。これは、ｇＢをブロックすることにより、７Ｈ３、１０Ｃ６および６Ｂ４に見られる、線維芽細胞の感染の中和を可能とすることを実証する結果と一致する。
【０１３１】
実施例２：モノクローナル抗体によって認識される標的抗原の識別
ヒトＭＲＣ−９線維芽細胞を、臨床ｈＣＭＶ分離株に感染させた。３日後、細胞を３５Ｓメチオニンおよびシステインで代謝的に標識した。溶解物の事前排除後、ヒトモノクローナル抗体１Ｆ１１および２Ｆ４を添加し、免疫複合体を、タンパク質Ａビーズの添加によって沈殿させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解した（図１）。不適切な特異性を持つヒトモノクローナルＩｇＧ抗体を、陰性対照として使用した。結果は、ヒトモノクローナル抗体１Ｆ１１および２Ｆ４が、ＣＭＶタンパク質の複合体を沈殿させることを示す。
【０１３２】
ヒトモノクローナル抗体の特異性をマッピングするため、単一ペプチドを欠く赤血球凝集素（ＨＡ）タグ付ＵＬ１２８Δ１−２７、ＵＬ１３０Δ１−２５およびＵＬ１３１ＡΔ１−１８ｈＣＭＶタンパク質をコードする発現ベクターを構築した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、これらのベクターを単独で、または組み合わせで形質移入した。３６時間後、細胞を固定し、透過処理して、抗ＨＡ抗体（形質移入の効率を制御するため）およびモノクローナル抗体で、続いてヤギ抗ヒトＩｇＧで染色した。不適切な特異性を持つＨｕＭａｂ ＩｇＧを陰性対照として使用した。図２Ａは、ヒトモノクローナル抗体１Ｆ１１および２Ｆ４が、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａ遺伝子産物によって生成される高次構造エピトープを認識することを示す。図２Ｂは、ヒトモノクローナル抗体５Ａ２および９Ａ１１が、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａ遺伝子産物によって生成される高次構造エピトープを認識することを示す。
【０１３３】
結論
上記の結果は、ヒト内皮細胞のｈＣＭＶ感染を、高い力価および選択性で中和することが可能な２つのヒトモノクローナル抗体を定義する。認識したエピトープを同定するため、抗体を、ｈＣＭＶ感染細胞からのタンパク質を免疫沈降するそれらの能力に関して試験した（図１）。ヒトＭａｂ１Ｆ１１および２Ｆ４は、約１５、３３〜３５および約１００キロダルトンの見かけの分子量を有する幾つかのタンパク質を沈殿させた。これらのパターンは、ｇＨ、ｇＬおよびＵＬ１２８、ＵＬ１３０ならびに可能性としてＵＬ１３１Ａを含有する複合体の沈殿と一致する。
【０１３４】
これらの抗体の標的をより良く定義するため、ＨＡタグ付ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａをコードするベクターを形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を染色するそれらの能力を特徴付けた。図２Ａに示すように、１Ｆ１１および２Ｆ４は、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａを同時発現する細胞のみを染色したため、それらが、２つの遺伝子産物によって決定された高次構造エピトープを認識することが示唆される。この結論は、ウエスタンプロットにおいて、これらの抗体が、還元かつ変性状態下で行われたウエスタンプロットによる感染または形質移入細胞の溶解物と反応しないという事実に裏付けられる（データは示していない）。
【０１３５】
５Ａ２および９Ａ１１に関しても同様の結果を観察した。図２ｂは、これらの抗体が、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａを同時発現する細胞のみを染色したため、それらが２つの遺伝子産物によって決定された高次構造エピトープを認識することが示唆されることを示す。
【０１３６】
実施例３：モノクローナル抗体によって認識される標的抗原のさらなる識別
線維芽細胞の感染を中和するヒトモノクローナル抗体の特異性をマッピングするため、全長ｇＢをコードする発現ベクターを構築した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、このベクターを形質移入した。３６時間後、細胞を固定し、透過処理して、ヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭａｂ）と、続いてヤギ抗ヒトＩｇＧで染色した。図４は、（不適切な特異性のＩｇＧ抗体ではなく）モノクローナル抗体７Ｈ３、１０Ｃ６、５Ｆ１、および６Ｂ４が、ｇＢを形質移入した細胞を特異的に染色したため、それらがｇＢのエピトープを認識することが示唆されることを示す。注目すべきは、モノクローナル抗体１０Ｃ６、５Ｆ１および６Ｂ４が、線維芽細胞および内皮細胞の感染を中和し、一方で、モノクローナル抗体７Ｈ３が、（内皮細胞のではなく）線維芽細胞の感染を中和することである。この概念により、モノクローナル抗体１０Ｃ６、５Ｆ１、および６Ｂ４が、モノクローナル抗体７Ｈ３により結合されているエピトープとは異なるｇＢの機能的エピトープに結合することが示唆される。
【０１３７】
本発明は、例としてのみ記載され、本発明の範囲および精神の範囲内で変更がなされ得ることを理解されよう。
【０１３８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルスの中和において高い力価を有する中和抗体。
【請求項２】
前記抗体は、１０−８Ｍ以下の親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ｈＣＭＶ臨床分離株の５０％中和に必要な抗体の濃度は、０．１μｇ／ｍｌ以下である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ＭＳＬ１０９よりもｈＣＭＶに対して少なくとも５０倍高い親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、ｈＣＭＶタンパク質ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａの組み合わせに特異的である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号１〜６、１１〜１６または３３〜３８のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号１〜３、１１〜１３または３３〜３５のうちの１つ以上を含む重鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
ＣＤＲＨ１に対して配列番号１、ＣＤＲＨ２に対して配列番号２、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号３を含む重鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ＣＤＲＨ１に対して配列番号１１、ＣＤＲＨ２に対して配列番号１２、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号１３を含む重鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
ＣＤＲＨ１に対して配列番号３３、ＣＤＲＨ２に対して配列番号３４、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号３５を含む重鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号４〜６、１４〜１６または３６〜３８のうちの１つ以上を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
ＣＤＲＬ１に対して配列番号４、ＣＤＲＬ２に対して配列番号５、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号６を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
ＣＤＲＬ１に対して配列番号１４、ＣＤＲＬ２に対して配列番号１５、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号１６を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
ＣＤＲＬ１に対して配列番号３６、ＣＤＲＬ２に対して配列番号３７、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号３８を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
前記重鎖は、配列番号７に示される配列を有する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１６】
前記重鎖は、配列番号１７に示される配列を有する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１７】
前記重鎖は、配列番号３９に示される配列を有する、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１８】
前記軽鎖は、配列番号８に示される配列を有する、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１９】
前記軽鎖は、配列番号１８に示される配列を有する、請求項１３に記載の抗体。
【請求項２０】
前記軽鎖は、配列番号４０に示される配列を有する、請求項１４に記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体は、ヒトモノクローナル抗体である、前記いずれかの請求項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体は、モノクローナル抗体１Ｆ１１である、請求項１５または請求項１８に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体は、モノクローナル抗体２Ｆ４である、請求項１６または請求項１９に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体は、モノクローナル抗体５Ａ２である、請求項１７または請求項２０に記載の抗体。
【請求項２５】
請求項７または請求項１１に記載の抗体に結合することが可能なエピトープに結合する抗体。
【請求項２６】
前記いずれかの請求項に記載の抗体の断片。
【請求項２７】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片である、請求項２６に記載の断片。
【請求項２８】
前記いずれかの請求項に記載の抗体または断片をコードする、核酸分子。
【請求項２９】
前記核酸分子は、配列番号９、１０、１９、２０、２１〜３２、または４１〜４８のいずれか１つを含む、請求項２８に記載の核酸分子。
【請求項３０】
請求項２８または請求項２９に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３１】
請求項３０に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３２】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体を発現する、不死化Ｂ細胞クローン。
【請求項３３】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体に結合する、エピトープ。
【請求項３４】
請求項３３に記載のエピトープを含む、免疫原性ポリペプチド。
【請求項３５】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体を産生する方法であって、（ｉ）請求項１０に記載の不死化Ｂ細胞クローンを培養するステップと、（ｉｉ）抗体を単離するステップと、を含む、方法。
【請求項３６】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体もしくは断片、請求項２８もしくは請求項２９に記載の核酸、請求項３２に記載の不死化Ｂ細胞クローン、または請求項３４に記載の免疫原性ポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項３７】
第１のエピトープに特異的な第１の抗体または断片、および第２のエピトープに特異的な第２の抗体または断片を含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
医薬的に許容可能な希釈剤または担体をさらに含む、請求項３６または請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
治療法もしくは診断に使用するための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体もしくは断片、請求項２８もしくは請求項２９に記載の核酸、請求項３２に記載の不死化Ｂ細胞クローン、または請求項３４に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項４０】
（ｉ）ｈＣＭＶ感染の治療のための薬物の製造における、または（ｉｉ）ワクチンにおける、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体または断片、請求項２８もしくは請求項２９に記載の核酸、請求項３２に記載の不死化Ｂ細胞クローン、または請求項３４に記載の免疫原性ポリペプチドの使用。
【請求項４１】
ｈＣＭＶ感染の治療のための薬物の製造における、第１のエピトープに特異的な請求項１〜２７のいずれか１項に記載の第１の抗体または断片、および第２のエピトープに特異的な請求項１〜２７のいずれか１項に記載の第２の抗体または断片の使用。
【請求項４２】
患者は、ｈＣＭＶに対する従来の治療に対して抵抗性がある、請求項４０または請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記患者は、抗ウイルス剤を、事前投与、事後投与または同時投与される、請求項４０または請求項４１に記載の使用。
【請求項４４】
前記抗ウイルス剤は、ガンシクロビル、ホスカルネットまたはシドホビルから選択される、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記患者は、免疫不全である、請求項４０または請求項４１に記載の使用。
【請求項４６】
前記患者は、ＨＩＶを有するか、または移植患者である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記第１の抗体または断片は、ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ複合体に特異的である、請求項３７に記載の組成物または請求項４１に記載の使用。
【請求項４８】
前記第２の抗体または断片は、ｇＨに特異的である、請求項４７に記載の組成物または使用。
【請求項４９】
請求項３６〜３８または４７〜４８のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、被験体を治療するための方法。
【請求項５０】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体もしくは断片または請求項２８もしくは請求項２９に記載の核酸を含む、ｈＣＭＶ感染の診断のためのキット。
【請求項５１】
組換え細胞を調製する方法であって、（ｉ）請求項３２に定義されるＢ細胞クローンから核酸を配列決定するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの配列情報を使用して、発現ホスト内における関心抗体の発現を可能にするように、そのホスト内に挿入するために核酸を調製するステップと、を含む、方法。
【請求項５２】
前記核酸は、制限部位を導入するため、コドン利用を変更するため、ならびに／または転写および／もしくは翻訳制御配列を最適化するために、ステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間で操作される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記発現ホストは、真核細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記真核細胞は、酵母細胞、動物細胞または植物細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記動物細胞は、哺乳類細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記動物細胞は、ＣＨＯまたはヒト細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ヒト細胞は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＫＢ−１１細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体を産生するための方法であって、関心抗体が発現される条件下で、請求項５１に記載の方法によって得られる発現ホストを培養または継代培養するステップと、任意に、（ｉｖ）前記関心抗体を精製するステップを含む、方法。
【請求項５９】
ｈＣＭＶに対する免疫学的応答を誘導することができるポリペプチドをスクリーニングする方法であって、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体または断片を使用して、ポリペプチドライブラリーをスクリーニングするステップを含む、方法。
【請求項６０】
ワクチン中の抗原が、正しい高次構造において正しいエピトープを含有することを確認することによって、抗ｈＣＭＶワクチンの質をモニターするための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体または断片の使用。
【請求項６１】
前記抗体は、内皮細胞、網膜細胞等の上皮細胞、および樹枝状細胞等の骨髄系細胞の感染を予防する、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６２】
ｈＣＭＶ臨床分離株による内皮細胞、上皮細胞および樹枝状細胞の５０％中和に必要な抗体の濃度は、０．１μｇ／ｍｌ以下である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６３】
抗体の濃度は、０．０１μｇ／ｍｌ以下である、請求項６２に記載の抗体。
【請求項６４】
前記上皮細胞は、網膜細胞である、請求項６２に記載の抗体。
【請求項６５】
前記抗体は、ｈＣＭＶタンパク質ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａの組み合わせに特異的である、請求項６２に記載の抗体。
【請求項６６】
（ｉ）治療法における、（ｉｉ）ｈＣＭＶ感染を治療するための薬物の製造における、または（ｉｉｉ）ワクチンとしての使用のための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体に特異的に結合するエピトープ。
【請求項６７】
ｈＣＭＶ感染を中和することができるリガンドをスクリーニングするための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体に特異的に結合するエピトープ。
【請求項６８】
ｈＣＭＶ臨床分離株による内皮細胞、上皮細胞および樹枝状細胞の５０％中和に必要な抗体の濃度は、ＭＳＬ１０９によって必要とされる濃度よりも５０倍以上低い、請求項１に記載の抗体。
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルスの中和において高い力価を有する中和抗体。
【請求項２】
前記抗体は、１０−８Ｍ以下の親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ｈＣＭＶ臨床分離株の５０％中和に必要な抗体の濃度は、０．１μｇ／ｍｌ以下である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ＭＳＬ１０９よりもｈＣＭＶに対して少なくとも５０倍高い親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、ｈＣＭＶタンパク質ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａの組み合わせに特異的である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号１〜６、１１〜１６または３３〜３８のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号１〜３、１１〜１３または３３〜３５のうちの１つ以上を含む重鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
ＣＤＲＨ１に対して配列番号１、ＣＤＲＨ２に対して配列番号２、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号３を含む重鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ＣＤＲＨ１に対して配列番号１１、ＣＤＲＨ２に対して配列番号１２、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号１３を含む重鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
ＣＤＲＨ１に対して配列番号３３、ＣＤＲＨ２に対して配列番号３４、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号３５を含む重鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号４〜６、１４〜１６または３６〜３８のうちの１つ以上を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
ＣＤＲＬ１に対して配列番号４、ＣＤＲＬ２に対して配列番号５、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号６を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
ＣＤＲＬ１に対して配列番号１４、ＣＤＲＬ２に対して配列番号１５、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号１６を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
ＣＤＲＬ１に対して配列番号３６、ＣＤＲＬ２に対して配列番号３７、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号３８を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
前記重鎖は、配列番号７に示される配列を有する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１６】
前記重鎖は、配列番号１７に示される配列を有する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１７】
前記重鎖は、配列番号３９に示される配列を有する、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１８】
前記軽鎖は、配列番号８に示される配列を有する、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１９】
前記軽鎖は、配列番号１８に示される配列を有する、請求項１３に記載の抗体。
【請求項２０】
前記軽鎖は、配列番号４０に示される配列を有する、請求項１４に記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体は、ヒトモノクローナル抗体である、前記いずれかの請求項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体は、モノクローナル抗体１Ｆ１１である、請求項１５または請求項１８に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体は、モノクローナル抗体２Ｆ４である、請求項１６または請求項１９に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体は、モノクローナル抗体５Ａ２である、請求項１７または請求項２０に記載の抗体。
【請求項２５】
請求項７または請求項１１に記載の抗体に結合することが可能なエピトープに結合する抗体。
【請求項２６】
前記いずれかの請求項に記載の抗体の断片。
【請求項２７】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片である、請求項２６に記載の断片。
【請求項２８】
前記いずれかの請求項に記載の抗体または断片をコードする、核酸分子。
【請求項２９】
前記核酸分子は、配列番号９、１０、１９、２０、２１〜３２、または４１〜４８のいずれか１つを含む、請求項２８に記載の核酸分子。
【請求項３０】
請求項２８または請求項２９に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３１】
請求項３０に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３２】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体を発現する、不死化Ｂ細胞クローン。
【請求項３３】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体に結合する、エピトープ。
【請求項３４】
請求項３３に記載のエピトープを含む、免疫原性ポリペプチド。
【請求項３５】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体を産生する方法であって、（ｉ）請求項１０に記載の不死化Ｂ細胞クローンを培養するステップと、（ｉｉ）抗体を単離するステップと、を含む、方法。
【請求項３６】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体もしくは断片、請求項２８もしくは請求項２９に記載の核酸、請求項３２に記載の不死化Ｂ細胞クローン、または請求項３４に記載の免疫原性ポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項３７】
第１のエピトープに特異的な第１の抗体または断片、および第２のエピトープに特異的な第２の抗体または断片を含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
医薬的に許容可能な希釈剤または担体をさらに含む、請求項３６または請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
治療法もしくは診断に使用するための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体もしくは断片、請求項２８もしくは請求項２９に記載の核酸、請求項３２に記載の不死化Ｂ細胞クローン、または請求項３４に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項４０】
（ｉ）ｈＣＭＶ感染の治療のための薬物の製造における、または（ｉｉ）ワクチンにおける、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体または断片、請求項２８もしくは請求項２９に記載の核酸、請求項３２に記載の不死化Ｂ細胞クローン、または請求項３４に記載の免疫原性ポリペプチドの使用。
【請求項４１】
ｈＣＭＶ感染の治療のための薬物の製造における、第１のエピトープに特異的な請求項１〜２７のいずれか１項に記載の第１の抗体または断片、および第２のエピトープに特異的な請求項１〜２７のいずれか１項に記載の第２の抗体または断片の使用。
【請求項４２】
患者は、ｈＣＭＶに対する従来の治療に対して抵抗性がある、請求項４０または請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記患者は、抗ウイルス剤を、事前投与、事後投与または同時投与される、請求項４０または請求項４１に記載の使用。
【請求項４４】
前記抗ウイルス剤は、ガンシクロビル、ホスカルネットまたはシドホビルから選択される、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記患者は、免疫不全である、請求項４０または請求項４１に記載の使用。
【請求項４６】
前記患者は、ＨＩＶを有するか、または移植患者である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記第１の抗体または断片は、ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ複合体に特異的である、請求項３７に記載の組成物または請求項４１に記載の使用。
【請求項４８】
前記第２の抗体または断片は、ｇＨに特異的である、請求項４７に記載の組成物または使用。
【請求項４９】
請求項３６〜３８または４７〜４８のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、被験体を治療するための方法。
【請求項５０】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体もしくは断片または請求項２８もしくは請求項２９に記載の核酸を含む、ｈＣＭＶ感染の診断のためのキット。
【請求項５１】
組換え細胞を調製する方法であって、（ｉ）請求項３２に定義されるＢ細胞クローンから核酸を配列決定するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの配列情報を使用して、発現ホスト内における関心抗体の発現を可能にするように、そのホスト内に挿入するために核酸を調製するステップと、を含む、方法。
【請求項５２】
前記核酸は、制限部位を導入するため、コドン利用を変更するため、ならびに／または転写および／もしくは翻訳制御配列を最適化するために、ステップ（ｉ）と（ｉｉ）との間で操作される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記発現ホストは、真核細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記真核細胞は、酵母細胞、動物細胞または植物細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記動物細胞は、哺乳類細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記動物細胞は、ＣＨＯまたはヒト細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ヒト細胞は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＫＢ−１１細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体を産生するための方法であって、関心抗体が発現される条件下で、請求項５１に記載の方法によって得られる発現ホストを培養または継代培養するステップと、任意に、（ｉｖ）前記関心抗体を精製するステップを含む、方法。
【請求項５９】
ｈＣＭＶに対する免疫学的応答を誘導することができるポリペプチドをスクリーニングする方法であって、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体または断片を使用して、ポリペプチドライブラリーをスクリーニングするステップを含む、方法。
【請求項６０】
ワクチン中の抗原が、正しい高次構造において正しいエピトープを含有することを確認することによって、抗ｈＣＭＶワクチンの質をモニターするための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体または断片の使用。
【請求項６１】
前記抗体は、内皮細胞、網膜細胞等の上皮細胞、および樹枝状細胞等の骨髄系細胞の感染を予防する、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６２】
ｈＣＭＶ臨床分離株による内皮細胞、上皮細胞および樹枝状細胞の５０％中和に必要な抗体の濃度は、０．１μｇ／ｍｌ以下である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６３】
抗体の濃度は、０．０１μｇ／ｍｌ以下である、請求項６２に記載の抗体。
【請求項６４】
前記上皮細胞は、網膜細胞である、請求項６２に記載の抗体。
【請求項６５】
前記抗体は、ｈＣＭＶタンパク質ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａの組み合わせに特異的である、請求項６２に記載の抗体。
【請求項６６】
（ｉ）治療法における、（ｉｉ）ｈＣＭＶ感染を治療するための薬物の製造における、または（ｉｉｉ）ワクチンとしての使用のための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体に特異的に結合するエピトープ。
【請求項６７】
ｈＣＭＶ感染を中和することができるリガンドをスクリーニングするための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体に特異的に結合するエピトープ。
【請求項６８】
ｈＣＭＶ臨床分離株による内皮細胞、上皮細胞および樹枝状細胞の５０％中和に必要な抗体の濃度は、ＭＳＬ１０９によって必要とされる濃度よりも５０倍以上低い、請求項１に記載の抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５１６２２９（Ｐ２０１０−５１６２２９Ａ）
【公表日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４４４７７（Ｐ２００９−５４４４７７）
【出願日】平成２０年１月３日（２００８．１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００１１１１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８４４１０
【国際公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（５０９１９０１６３）エイチユーエムエイビーエス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (3)
【氏名又は名称原語表記】Ｈｕｍａｂｓ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月３日（２００８．１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００１１１１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８４４１０
【国際公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（５０９１９０１６３）エイチユーエムエイビーエス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (3)
【氏名又は名称原語表記】Ｈｕｍａｂｓ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
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