ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体、これをコードする核酸およびその用途
【課題】ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプ２および5をコードする核酸、およびこれにコードされる蛋白の提供。
【解決手段】ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体のｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ５のサブタイプをコードするメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの産生に有用である核酸の提供。関連する受容体サブユニットを同定し単離することを可能にするプローブの提供。さらに新規のメタボトロピックグルタミン酸受容体の機能に影響を与える化合物（例えば、グルタミン酸受容体機能のアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーター（活性調節因子））を同定し性状解析するための、このような受容体サブタイプの使用方法の提供。
【解決手段】ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体のｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ５のサブタイプをコードするメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの産生に有用である核酸の提供。関連する受容体サブユニットを同定し単離することを可能にするプローブの提供。さらに新規のメタボトロピックグルタミン酸受容体の機能に影響を与える化合物（例えば、グルタミン酸受容体機能のアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーター（活性調節因子））を同定し性状解析するための、このような受容体サブタイプの使用方法の提供。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸とこれによりコードされる受容体蛋白に関する。本発明の核酸は、新規のヒトメタボトロピック（metabotropic）グルタミン酸受容体サブタイプをコードする核酸に関する。本発明はまたこのような受容体サブタイプの作成方法、およびこのような受容体の機能に影響を与える化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、およびヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体のアロステリックモジュレーター）の同定および性状解析のための受容体蛋白の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸のＬ−グルタミン酸は、哺乳動物の中枢神経系の主要な興奮性神経伝達物質である。解剖学的、生化学的および電気生理学的分析は、グルタミン酸産生系が広範囲のニューロン作用過程（例えば、急速な興奮性シナプス伝達、神経伝達物質放出の制御、長期増強、学習および記憶、成長性シナプス可塑性、低酸素性虚血傷害およびニューロン細胞の死、てんかん様発作、およびいくつかの神経変性障害の病変性）に関与していることを示唆している。一般的には、モナガン（Monaghan）ら、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.，２９：３６５−４０２（１９８０）を参照。この広範囲の機能（特に学習、神経毒性および神経病理に関する機能）のために、近年グルタミン酸の作用機構を説明し規定しようという研究が始まった。
【０００３】
現在グルタミン酸受容体の分類の概要は、薬理学的基準に基づいている。グルタミン酸は、２つの主要な受容体（イオノトロピック（ionotropic）受容体とメタボトロピック（metabotropic）受容体）に分類されている受容体を介してその作用を媒介することが認められている。イオノトロピックグルタミン酸受容体は、完全な陽イオン特異的、リガンドゲート（ligand-gated）のイオンチャネルを含有し、メタボトロピックグルタミン酸受容体は、細胞内第二メッセンジャー系の活性化を介して細胞外シグナルを変換するＧ蛋白結合受容体である。イオノトロピック受容体は、受容体の薬理学的および機能的性質に基づきさらに少なくとも２つの範疇に分類されている。その２つの主要な型のイオノトロピック受容体は、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体とカイニン酸（ＫＡ）／ＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）（以前はキスカル酸、すなわちＱＵＩＳと呼ばれていた）受容体である。メタボトロピック受容体はイオノトロピックグルタミン酸受容体が結合するリガンドと同じリガンドのいくつかに結合するが、メタボトロピック受容体はＧＴＰ−結合蛋白および第二メッセンジャー（例えば、サイクリックＡＭＰ、サイクリックＧＭＰ、ジアシルグリセロール、イノシトール１，４，５−三リン酸およびカルシウム）を介してシナプスの生理機能を変更させる［例えば、グンデルセン（Gundersen）ら、Proc. R. Soc. London Ser. ２２１：１２７（１９８４）；スラデツェック（Sladeczek）ら、Nature ３１７：７１７（１９８５）；ニコレッティ（Nicoletti）ら、J. Neurosci. ６：１９０５（１９８６）；スギヤマ（Sugiyama）ら、Nature ３２５：５３１（１９８７）］。
【０００４】
メタボトロピックグルタミン酸受容体の電気生理学的および薬理学的性質は、受容体供給源として動物組織や細胞株、および非ヒト組換え受容体を用いて研究されている。ヒトの治療薬開発へのそのような研究の意義は、ヒトでない受容体サブユニットのみしか入手できないことにより限定されている。さらに、メタボトロピックグルタミン酸受容体の特性や構造が分子レベルで研究され出したのはつい最近である。しかしこのような研究は、ヒト以外の種でのみ行われている。メタボトロピックグルタミン酸受容体の生理学的および病理学的重要性の可能性により、グルタミン酸受容体の種々のクラスの代表的メンバーをコードするヒトの配列（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白）が利用（例えば、薬剤スクリーニング測定法のために）できることが必要である。そのようなヒトの配列が入手できれば、ヒトでの受容体の分布の研究、特定の受容体の修飾と種々の疾患の発生の関係の研究も可能になるであろう。
【非特許文献１】グンデルセン（Gundersen）ら、Proc. R. Soc. London Ser. ２２１：１２７（１９８４）
【非特許文献２】スラデツェック（Sladeczek）ら、Nature ３１７：７１７（１９８５）
【非特許文献３】ニコレッティ（Nicoletti）ら、J. Neurosci. ６：１９０５（１９８６）
【非特許文献４】スギヤマ（Sugiyama）ら、Nature ３２５：５３１（１９８７）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（本発明の概要）
本発明は、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプをコードする新規の核酸、およびこれにコードされる蛋白を開示する。具体的な実施態様において、新規の核酸は、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の全長ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３およびｍＧｌｕＲ５サブタイプまたはその一部をコードする。これらの核酸はメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ蛋白の産生に有用である以外に、プローブとしても有用であり、従って当業者は不要な実験をすることなく、関連する受容体サブタイプをコードする核酸を同定し単離することが可能である。
【０００６】
本発明は、新規のメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプを開示する以外に、このような受容体に影響を与える化合物（例えば、グルタミン酸受容体機能のアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーター（活性調節因子））を同定し性状解析するための、このような受容体サブタイプの使用方法を包含する。また本発明は、未知の蛋白がメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプとして機能するか否かを測定する方法を包含する。
【０００７】
（本発明の詳細な説明）
本発明において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする単離された核酸が提供される。本発明の１つの面において、ｍＧｌｕＲ１サブタイプのヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする核酸が提供される。別の面において、ｍＧｌｕＲ２サブタイプのメタボトロピックグルタミン酸受容体の少なくとも１部分をコードする核酸が提供される。さらに別の面において、ｍＧｌｕＲ３サブタイプのメタボトロピックグルタミン酸受容体をコードする核酸が提供される。さらなる面において、ｍＧｌｕＲ５サブタイプのメタボトロピックグルタミン酸受容体をコードする核酸が提供される。さらに別の面において、そのような核酸を含有する真核細胞、およびそのような核酸を発現する真核細胞が提供される。
【０００８】
また前述の核酸によりコードされる蛋白、および該蛋白に対して産生される抗体が提供される。本発明の別の面において、上記核酸のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ−選択性部分よりなる核酸プローブが提供される。
【０００９】
本明細書において、「ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ」とは、グルタミン酸産生リガンドに対する細胞のＧ−蛋白結合応答に参加する、単離されたおよび／または精製された蛋白を意味する。このような受容体サブタイプは、他のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードしない別々の遺伝子により個々にコードされる（すなわち、各サブタイプはユニークな遺伝子によりコードされる）。このような受容体サブタイプの典型的な特徴は、７つの推定されるトランスメンブレンドメインと、その前に大きな推定される細胞外アミノ末端ドメインと、その後に大きな推定される細胞内カルボキシ末端ドメインを有することである。メタボトロピックグルタミン酸受容体は、基本的にメタボトロピックグルタミン酸受容体でない他のＧ蛋白結合受容体と全くアミノ酸配列相同性を有さない。
【００１０】
メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの各々の間の関係に関して、ｍＧｌｕＲ１受容体サブタイプのアミノ酸配列は一般に、他のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプのアミノ酸配列との同一性は約７０％未満であり、典型的に観察される同一性は４５％未満である。ｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプのアミノ酸配列は一般に、他のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプのアミノ酸配列との同一性は約６０％未満であり、典型的に観察される同一性は４５％未満である。ｍＧｌｕＲ３受容体サブタイプのアミノ酸配列は一般に、他のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプのアミノ酸配列との同一性は約６０％未満であり、典型的に観察される同一性は４５％未満である。ｍＧｌｕＲ５受容体サブタイプのアミノ酸配列は一般に、他のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプのアミノ酸配列との同一性は約７０％未満であり、典型的に観察される同一性は４５％未満である。
【００１１】
上記定義に含まれるものは、一次転写体の別のスプライシングにより産生されるｍＲＮＡによりコードされる変種、および上記の生理学的および／または物理的性質の１つまたはそれ以上を有するその断片である。
【００１２】
本明細書および請求の範囲において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白の修飾物質としての「単離される」、「純粋な」という用語は、このように呼ばれるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白はヒトの手によりそのような形で産生され、従ってその本来のインビボの細胞環境からは分離されていることを示す。このヒトの介入による結果、本発明の組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよび蛋白は、天然に存在するＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白では役に立たないような方法（例えば、選択的薬剤または化合物の同定）において有用である。
【００１３】
本発明の受容体蛋白の修飾物質として使用される時、「機能性」とは、グルタミン酸産生関連リガンド（例えばＡＣＰＤまたはＡＣＰＤ様リガンド、ＱＵＩＳ、ＡＰ４など）に受容体蛋白に結合すると、Ｇ蛋白との受容体の相互作用を修飾し、これは細胞内第２メッセンジャーのレベルに影響を与え、種々の生理学的作用を引き起こす。言い換えると「機能性」とは、受容体蛋白のアゴニスト活性化の結果として応答が産生されることを意味する。
【００１４】
本明細書においてスプライス変種とは、ゲノムＤＮＡの一次転写体の差別的処理により産生され、その結果２つ以上の型のｍＲＮＡの産生に至る、変種メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする核酸を意味する。差別的に処理された一次転写体から得られるｃＤＮＡは、アミノ酸が完全に同一の領域と、異なるアミノ酸配列を有する領域を有する、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするであろう。すなわち同じゲノム配列から、多数の関連するｍＲＮＡや蛋白が得られる。得られるｍＲＮＡや蛋白はいずれも本明細書では「スプライス変種」と呼ぶ。
【００１５】
従って、前記で定義したメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするが、遺伝コードの縮重のため特定のハイブリダイゼーション条件下で開示された核酸に必ずしもハイブリダイズしない核酸も、本発明の範囲内にあると考えられる。本明細書に記載の方法または当業者に公知の方法により評価すると、そのようなサブタイプもまた、機能性受容体を形成する。典型的には、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプが代替スプライシングにより得られるＲＮＡにコードされない（すなわち、スプライス変種）なら、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする核酸とこれによりコードされるメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白は、本明細書に記載の少なくとも１つのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ核酸（およびこれによりコードされる蛋白）と実質的な配列相同性を有する。スプライス変種をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で提供されるＤＮＡまたはＲＮＡとの配列全体の相同性は９０％未満であるが、本明細書中のＤＮＡ断片とほとんど１００％の相同性を有する領域を含有し、開始コドンおよび停止コドンを含むオープンリーディングフレームをコードし、機能性メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードすることを理解すべきである。
【００１６】
ヒトｍＧｌｕＲ１サブタイプをコードするＤＮＡ配列の例は、配列番号２に記載されるものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドにより示される。現在好適な配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする。
【００１７】
別のＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ１サブタイプをコードし、高緊縮性条件下で配列番号１の実質的に配列全体、またはその大部分（すなわち、典型的には少なくともその２５−３０個の隣接ヌクレオチド）にハイブリダイズするヌクレオチドであることが特徴である。
【００１８】
本明細書において、ハイブリダイゼーションの緊縮性とは、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を意味する。当業者に公知なように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。
【００１９】
Ｔｍは、
式： 81.5℃−16.6（log１０［Ｎａ＋］）＋0.41（％Ｇ＋Ｃ）−600／ｌ
（式中、ｌはヌクレオチド中のハイブリッドの長さである）により近似的に表される。
【００２０】
配列の相同性が１％減少する毎に、Ｔｍは約１−１．５℃低下する。一般にハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応を低緊縮性条件下で行い、次に種々の（ただし、より高い緊縮性の）条件下で洗浄する。ハイブリダイゼーション緊縮性は、このような洗浄条件に関する。
【００２１】
すなわち、本明細書において、
（１）断片のハイブリダイゼーションに関して、高緊縮性条件とは、６５℃で０．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する（すなわち、本明細書で企図されるように、もしハイブリッドが６５℃で０．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定でない場合、高緊縮性条件下で安定ではないであろう）。高緊縮性条件は、例えば５０％ホルムアミド、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で４２℃でハイブリダイゼーションし、次に６５℃で０．１×ＳＳＰＥ、そして０．１％ＳＤＳによる洗浄により提供される。
（２）断片のハイブリダイゼーションに関して、中緊縮性条件とは、４２℃で５０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションし、次に６５℃で０．２×ＳＳＰＥ、そして０．２％ＳＤＳによる洗浄と同等の条件を意味する。
（３）断片のハイブリダイゼーションに関して、低緊縮性条件とは、４２℃で１０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションし、次に５０℃で１×ＳＳＰＥ、そして０．２％ＳＤＳによる洗浄と同等の条件を意味する。そして、
（４）オリゴヌクレオチド（すなわち、長さが約３０ヌクレオチド以下の合成ＤＮＡ）に関して、高緊縮性条件とは、４２℃で１０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションし、次に５０℃で１×ＳＳＰＥ、そして０．２％ＳＤＳによる洗浄に等しい条件を意味する。
【００２２】
種々の緩衝液や温度を用いてこれらの条件を再現することができ、これらは必ずしも正確である必要はないことを理解すべきである。
【００２３】
デンハルツ溶液およびＳＳＰＥ（例えば、サムブルーク、フリッチ、およびマニアチス（Sambrook, Fritsch, and Maniatis）、モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning、A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９）は、他の適当なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に、当業者に公知である。例えば、ＳＳＰＥはpH７．４のリン酸緩衝化された０．１８ＭのＮａＣｌである。ＳＳＰＥは例えば、１７５．３ｇのＮａＣｌ、２７．６ｇのＮａＨ２ＰＯ４および７．４ｇのＥＤＴＡを８００mlの水に溶解しpHを７．４に調整して、次に１リットルになるように水を加えて２０×保存溶液として調製することができる。デンハルツ溶液（デンハルト（Denhart）（１９６６）Biochem. Biophys. Res. Commun.２３：６４１を参照）は、例えば５ｇのFicoll（タイプ４００、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社（Pharmacia LKBBiotechnology、INC.）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）、５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇのウシ血清アルブミン（第５画分；シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）、そして水を５００mlになるように加え、濾過して粒状物質を除去することにより、５０×保存溶液として調製することができる。
【００２４】
ヒトｍＧｌｕＲ１サブタイプをコードする特に好適な配列は、配列番号１と実質的に同じヌクレオチド配列を有するものであり、配列番号１のコーディング配列と実質的に同じ配列を有するポリ核酸が特に好ましい。
【００２５】
本明細書において、「実質的な配列相同性」とは、少なくとも約９０％の相同性を有するヌクレオチド配列、そして典型的には９５％以上のアミノ酸の同一性を有するヌクレオチド配列を意味する。しかし、スプライス変種であること、または保存的アミノ酸置換（または縮重コドンの置換）により修飾されているため、前記レベルより低い相同性を有する蛋白（およびこのような蛋白をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ）は、本発明の範囲内にあることを理解すべきである。
【００２６】
本明細書において、「実質的に同じ」とは、本明細書に記載の実際の配列とはわずかに異なるかまたは重大でない配列の変化を有する、ＤＮＡのヌクレオチド配列、ＲＮＡのリボヌクレオチド配列、または蛋白のアミノ酸配列を意味する。実質的に同じ分子種は、開示された配列と同等であると考えられ、従って本発明の請求の範囲に包含されると考えられる。この点で「わずかに異なるかまたは重大でない配列の変化」は、開示され、特許請求のされているＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白と実質的に同じ配列が、開示され特許請求のされているヒト由来の配列と機能的に同等であることを意味する。機能的に同等の配列は、実質的に同じ方法で機能して、ヒト由来の核酸および本明細書に開示され特許請求されているアミノ酸組成物と実質的に同じ組成物を産生する。特に機能的に同じＤＮＡは、本明細書に開示されたものと同じであるか、または保存性のアミノ酸変化（例えば非極性残基を別の非極性残基で置換、または荷電残基を類似の荷電残基で置換）を有するものと実質的に同じヒト由来の蛋白をコードする。これらの変化には、当業者に認識される、蛋白の３次元構造を実質的に変化させないものが含まれる。
【００２７】
ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの一部をコードするＤＮＡ配列の例は、配列番号４に記載のものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド（随時、配列番号１３に記載の３’非翻訳配列の３４３ヌクレオチドの一部またはすべてを含む）、またはクローンＭＥＴＡＢ４０（１９９３年５月４日に整理番号７５４６５でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された）のヒトｍＧｌｕＲ２をコードする部分によりコードされるものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドにより示される。
【００２８】
寄託されたクローンは、１９９３年５月４日に「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」（the Budapest Treaty on the International Recognition of Deposits of Microorganisms for Purposes of Patent Procedure）の条件と、この条約の名のもとに公布された規則に従い、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１ パークローンドライブ（Parklawn Drive）、ロックヴィル（Rockville）、メリーランド州、アメリカ合衆国 ２０８５２）に寄託されている。この条約と規則の条件下で、およびさもなくばアメリカ合衆国の特許法や規則に従い受領する法的資格のある工業所有権事務所および他の個人、または本出願または本出願の優先権を主張する出願が提出されたかまたはこのような出願に対して何らかの特許権が与えられた国または国際組織は、寄託された物質の試料を入手することができる。特にこれに基づきまたはこの優先権を主張する出願またはこれに関する出願を取り込んでいる出願に基づき米国特許の与えられた時点で、本寄託物質の入手に関するすべての規制は永久に取り消されるであろう。
【００２９】
ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの一部をコードする好適なポリ核酸配列は、配列番号４に記載のものと同じアミノ酸配列、またはクローンＭＥＴＡＢ４０（１９９３年５月４日に整理番号７５４６５でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された）のヒトｍＧｌｕＲ２をコードする部分によりコードされるものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするものである。
【００３０】
あるいはＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプをコードするヌクレオチド配列であり、高緊縮性条件下で配列番号３またはその大部分（すなわち、典型的にはその少なくとも２５−３０個の隣接ヌクレオチド）、またはクローンＭＥＴＡＢ４０（ＡＴＣＣ整理番号７５４６５）のヒトｍＧｌｕＲ２をコードする部分とまたはその大部分とハイブリダイズするヌクレオチド配列として特徴付けられる。ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの部分をコードする特に好適な配列は、配列番号３のコーディング配列と同じヌクレオチド配列、またはクローンＭＥＴＡＢ４０のヒトｍＧｌｕＲ２コーディング部分中のコーディング配列のヌクレオチド配列を有するポリ核酸により示される。
【００３１】
ヒトｍＧｌｕＲ３受容体サブタイプをコードするＤＮＡ配列の例は、配列番号６に記載のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドにより示される。好適なポリ核酸配列は、配列番号６と同じ配列をコードするものである。
【００３２】
あるいはＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ３受容体サブタイプをコードするヌクレオチド配列であり、高緊縮性条件下で配列番号５またはその大部分（すなわち、典型的にはその少なくとも２５−３０個の隣接ヌクレオチド）とハイブリダイズするヌクレオチド配列として特徴付けられる。ヒトｍＧｌｕＲ３サブタイプの部分をコードする特に好適な配列は、配列番号５のコーディング配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有するものであり、配列番号５のコーディング配列と同じヌクレオチド配列を有するポリ核酸が最も好ましい。
【００３３】
ＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ３受容体サブタイプまたはその部分をコードするヌクレオチド配列であり、配列番号８、１０または１２のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドにより示される。好適なポリ核酸配列は、配列番号８、１０または１２と同じ配列をコードするものである。
【００３４】
あるいはＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ５受容体サブタイプをコードするヌクレオチド配列であり、高緊縮性条件下で配列番号７、９または１１の実質的に全配列、またはそれらの大部分（すなわち、典型的には少なくとも２５−３０個の隣接ヌクレオチド）にハイブリダイズするヌクレオチドとして特徴付けられる。ヒトｍＧｌｕＲ５サブタイプをコードする特に好適な配列は、配列番号７、９または１１のコーディング配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有するものであり、配列番号７、９または１１のコーディング配列と同じ配列を有するポリ核酸が最も好ましい。
【００３５】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡは、本明細書に開示したＤＮＡ（配列番号１、３、５、７、９または１１の任意のものより得られるヌクレオチドを含む）により、適当なハイブリダイゼーション条件下で適当なヒトｃＤＮＡまたはヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより単離される。適当なライブラリーは、神経組織試料（例えば、海馬や小脳組織、細胞株など）から調製される。例えばライブラリーは、その実質的に全ての受容体サブタイプコーディング配列を含むＤＮＡの一部を用いてスクリーニングされるか、あるいはそのＤＮＡの一部に基づく適当なオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングされる。
【００３６】
本明細書においてプローブは、配列番号１、３、５、７、９または１１に記載の任意のものの２５またはそれ以上の隣接する塩基と同じであるか少なくとも約２５−３０個の隣接する塩基（またはその相補物）を含む、ヌクレオチドの配列を有する１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。プローブを作成するのに好適な領域は、５’および／または３’コーディング配列、トランスメンブレンドメインをコードすると予測される配列、細胞質ループをコードすると予測される配列、シグナル配列、リガンド結合部位などがある。
【００３７】
全長ｃＤＮＡクローン、その断片、またはそのＤＮＡの部分に基づくオリゴヌクレオチドはプローブとして使用され、好ましくは容易に検出するために適当な標識物で標識される。断片がプローブとして使用される時、そのプローブのＤＮＡ配列は好ましくはＤＮＡのカルボキシ末端をコードする部分由来であり、最も好ましくはＤＮＡ配列の予測されるトランスメンブレンドメインをコードする部分を含む（ドメインは、例えばカイトとドーリトル（Kyte and Doolittle）（１９８２）、J. Mol. Biol. 第１５７巻：１０５の方法を用いて、推定されるアミノ酸配列のハイドロパシー解析に基づき予測される）。これらのプローブは例えば、グルタミン酸受容体ファミリーの追加メンバーの同定と単離のために使用される。
【００３８】
本発明の配列の特定の応用として、本発明のヌクレオチド配列をプローブとして使用して遺伝子スクリーニングを実施することができる。すなわち、任意の内因性グルタミン酸受容体に異常が存在するか否かを測定するために、グルタミン酸受容体の任意の１つまたはそれ以上の変化／修飾が関与していることが疑われる神経病理的症状を有する患者の核酸試料を、適当なプローブでスクリーニングすることができる。同様に、グルタミン酸受容体の機能不全に関連する疾患の家族歴がある患者をスクリーニングして、このような疾患に罹りやすい体質であるか否かを決定することができる。
【００３９】
本発明の別の実施態様において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプをコードするＤＮＡの同定方法が提供され、この方法は、ヒトＤＮＡを上記の核酸プローブと接触させ（使用されるプローブがポリ核酸断片の時は低緊縮性または中緊縮性条件下で接触させ、または使用されるプローブがオリゴヌクレオチドの時は高緊縮性条件下で接触させる）、そして該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを同定することよりなる。
【００４０】
ライブラリーのスクリーニング後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出して陽性クローンを同定する。同定されたクローンを制限酵素マッピングおよび／またはＤＮＡ配列解析により性状解析し、次にこれらが完全なメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡを含有するか否か（すなわち、これらが翻訳開始コドンおよび停止コドンを含有するか否か）を確認するために本明細書に記載の配列と比較することにより試験する。選択された配列が不完全な場合はこれらを用いて、同じかまたは異なるライブラリーを再スクリーニングして重複するクローンを得ることができる。もしライブラリーがゲノム性の場合は、重複クローンはエクソンとイントロンを含有してもよい。もしライブラリーがｃＤＮＡライブラリーの場合は、重複クローンはオープンリーディングフレームを含有するであろう。いずれの場合も完全なクローンは、本明細書で提供されるＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列と比較して同定される。
【００４１】
種々のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ（例えば、ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ５）をコードする、相補的なＤＮＡクローンが単離されている。各サブタイプは、異なる遺伝子にコードされているようである。本明細書に記載されるＤＮＡクローンは、各サブタイプをコードするゲノムクローンを単離し、異なる神経組織から調製されたライブラリーをスクリーニングすることにより、スプライス変種を単離するために使用できる。当業者に公知の核酸増幅法を使用して、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプのスプライス変種をコードするＤＮＡを見つけることができる。これは、公知のまたは予測される互いに異なる配列を取り囲むＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドを、ヒトＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを増幅するためのプライマーとして用いることにより達成される。増幅生成物のサイズと配列の測定により、スプライス変種の存在が明らかになる。さらにハイブリダイゼーションによるヒトゲノムＤＮＡ配列の単離により、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする転写体の異なるスプライス変種に対応する、イントロンにより分離された多数のエクソンを含有するＤＮＡが得られる。
【００４２】
必ずしもすべてのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ（およびその変種）がすべての神経組織または脳のすべての部分に発現されているのではないことは、わかっている。すなわち特定のサブタイプ（またはそのスプライス変種）をコードするｃＤＮＡを単離するためには、異なるニューロンまたは神経組織または細胞から調製されるライブラリーをスクリーニングすることが好ましい。各サブユニットをコードするＤＮＡを得るために好適なライブラリーは：ヒトｍＧｌｕＲ１をコードするＤＮＡを単離するための小脳；ｍＧｌｕＲ２をコードするＤＮＡを単離するための海馬；ｍＧｌｕＲ３をコードするＤＮＡを単離するための海馬と小脳；ｍＧｌｕＲ５をコードするＤＮＡを単離するための海馬と小脳などがある。
【００４３】
特定の受容体サブタイプをコードするＤＮＡが一旦単離されると、そのようなサブタイプ（またはそのスプライス変種）をコードするｍＲＮＡを発現する組織を決定するために、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）保護測定法が実施される。この測定法は、全細胞性ＲＮＡの複雑な混合物中の１つのＲＮＡ種を検出し定量するための高感度の手段を与える。サブタイプＤＮＡは標識され、細胞性ＲＮＡとハイブリダイズされる。もし細胞性ＲＮＡ中に相補的なｍＲＮＡが存在する場合、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが得られる。次にＲＮＡ試料をＲＮａｓｅで処理する（これは１本鎖ＲＮＡを分解する）。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、ＲＮａｓｅ分解から保護され、ゲル電気泳動やオートラジオグラフィーにより肉眼で見ることができる。特定のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするｍＲＮＡを発現する組織を決定するために、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを使用することができる。こうして、標識されたサブタイプＤＮＡは異なる脳の領域のスライスとハイブリダイズして、サブタイプｍＲＮＡ発現が肉眼で見えるようになる。
【００４４】
いくつかのヒトのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの発現の分布は、この受容体のラットでの分布とは異なる。例えばラットのｍＧｌｕＲ５サブタイプをコードするＲＮＡはラットの海馬に多く存在し、ラットの小脳にはあまり存在しない［例えば、アベ（Abe）ら、J. Biol. Chem.２６７：１３３６１−１３３６８（１９９２）を参照］が、ヒトの小脳ライブラリーからは無数のヒトｍＧｌｕＲ５をコードするｃＤＮＡが得られている。すなわちヒトとラットではいくつかのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの分布が異なっているようである。
【００４５】
前述のヌクレオチド配列はベクターに取り込んでさらに操作することができる。本明細書においてベクター（またはプラスミド）とは、異種ＤＮＡを細胞に取り込んでそれを発現または複製をさせるのに使用される、独立した成分である。このような担体（vehicle）の選択と使用は、当業者には公知である。
【００４６】
発現ベクターとは、ＤＮＡ断片の発現を制御することができる制御配列（例えばプロモーター領域）に機能的に結合したＤＮＡを発現することができるベクターを含む。すなわち発現ベクターとは、適当な宿主細胞内に取り込まれるとクローン化ＤＮＡを発現する、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ作成体（例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクター）を意味する。適当な発現ベクターは当業者に公知であり、真核細胞および／または原核細胞中で複製されるもの、およびエピソームとしてとどまるか宿主細胞ゲノム内に取り込まれるものも含まれる。真核生物の宿主細胞（特に哺乳動物細胞）中での本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの発現のために好適なプラスミドには、例えば、ｐＣＭＶ−Ｔ７−２、ｐＣＭＶ−Ｔ７−３（図１を参照）、ｐｃＤＮＡ１などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター含有ベクター、そして、ＳＶ４０プロモーター含有ベクター、およびｐＭＭＴＶＴ７（＋）またはｐＭＭＴＶＴ７（−）（本明細書に記載のように調製されたｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテク（Clontek）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）を修飾したもの）などのＭＭＴＶＬＴＲプロモーター含有ベクターがある。
【００４７】
本明細書において、プロモーター領域とは、そこに機能的に結合したＤＮＡの転写を調節するＤＮＡのセグメントを意味する。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼによる認識、結合および転写の開始に充分な特異的配列を含有する。このプロモーター領域の部分をプロモーターと呼ぶ。さらにこのプロモーター領域は、このＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始を調節する配列を含む。これらの配列はｃｉｓ作用性であるか、またはｔｒａｎｓ活性化因子に対して応答する。制御の性質により、プロモーターは構成性（constitutive）であるかまたは制御されている。本発明の実施において使用されるプロモーターの例には、ＳＶ４０早期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニー（Moloney）マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターなどがある。
【００４８】
本明細書において、「機能的に結合している」とは、ＤＮＡとヌクレオチドの制御配列やエフェクター配列（例えばプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、および他のシグナル配列）との機能的関係を意味する。例えば、ＤＮＡとプロモーターの機能的結合は、ＤＮＡの転写はプロモーターを特異的に認識してこれに結合し、ＤＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターの間の物理的および機能的結合を意味する。発現および／またはインビトロの転写を最適化するために、転写または翻訳のレベルで発現を妨害するかまたは低下させる、不適当な代替翻訳開始コドンまたは他の配列を除去するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変更することが必要なこともある。あるいはコンセンサスリボゾーム結合部位（例えば、コザック（Kozak））（１９９１）J. Biol.Chem. ２６６：１９８６７−１９８７０）を開始コドンの５’のすぐ近くに挿入して、発現を増強させることもできる。同様に、転写を増強するために、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブユニットのコーディング配列の代わりに同じアミノ酸をコードする代替コドンを用いることができる（例えば、宿主細胞のコドンの選択性が採用され、Ｇ−Ｃの豊富なドメインを減少させるなど）。さらに両生類の卵母細胞中のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブユニットの発現増強の可能性のために、サブユニットコーディング配列を随時発現作成体中に取り込むことができる（ここではコーディング配列の５’末端と３’末端は、それぞれツメガエル（Xenopus）のβ−グロビン遺伝子の５’と３’の非翻訳配列に隣接している）。例えば、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブユニットコーディング配列は、ｐＳＰ６４（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州、より入手できる）の修飾型であるベクターｐＳＰ６４Ｔに取り組むことができる（クリーグとメルトン（Krieg and Melton）（１９８４）Nucleic Acids Research １２：７０５７−７０７０を参照）。このコーディング配列は、β−グロビン遺伝子の５’末端とＳＰ６プロモーターの下流に位置する３’非翻訳配列の間に挿入される。次に得られるベクターから、インビトロの転写体が作成される。このような修飾の好ましい点（またはニーズ）は実験的に決定されている。
本明細書において、発現とはポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白に翻訳される過程を意味する。ポリ核酸がゲノムＤＮＡから得られる場合、適当な真核生物宿主細胞または微生物が選択されるなら、発現にはｍＲＮＡのスプライシングを含む。
【００４９】
哺乳動物細胞のトランスフェクションのための、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体をコードするＤＮＡに結合した制御成分を含有する特に好適な基礎ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをベースにしたベクター（例えば、ｐＣＭＶ−Ｔ７−２およびｐＣＭＶ−Ｔ７−３（本明細書に記載）、またはｐｃＤＮＡ１（インビトロゲン（Invitrogen）、サンジエゴ、カリホルニア州））、およびＭＭＴＶプロモーターをベースにしたベクター（例えば、ｐＭＭＴＶＴ７（＋）またはｐＭＭＴＶＴ７（−）（本明細書中に記載））、およびＳＶ４０プロモーターをベースにしたベクター（例えば、ｐＳＶβ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州））である。
【００５０】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする全長ＤＮＡは、ベクターｐＭＭＴＶＴ７（＋）、ｐＭＭＴＶＴ７（−）、ｐＣＭＶ−Ｔ７−２またはｐＣＭＶ−Ｔ７−３に挿入されている。ｐＣＭＶ−Ｔ７−２（およびｐＣＭＶ−Ｔ７−３）は、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、プロモーターのすぐ下流に存在するＳＶ４０スプライス／ドナー部位、スプライス部位の下流に位置するＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、その後にＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、そしてＴ７プロモーターとポリアデニル化シグナルの間にポリリンカーを有する、ｐＵＣ１９をベースにした哺乳動物細胞発現ベクターである。ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの間にメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプを配置させると、この作成体によりトランスフェクションされた哺乳動物の宿主細胞中で外来ＤＮＡの構成的発現（constitutive expression）が与えられる。
【００５１】
ベクターｐＭＭＴＶＴ７（＋）とｐＭＭＴＶＴ７（−）はベクターｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）を修飾することにより調製された。ｐＭＡＭｎｅｏは、デキサメタゾン誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）−ＬＴＲプロモーターに結合した（この後にＳＶ４０スプライス部位とポリアデニル化部位が続く）ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）を含有する、哺乳動物の発現ベクターである。ｐＭＡＭｎｅｏはまた、大腸菌の増殖のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性を与える蛋白をコードする）と同様に、形質転換体の選択のための大腸菌ｎｅｏ遺伝子を含有する。
【００５２】
ベクターｐＭＭＴＶＴ７（＋）は、ｐＭＡＭｎｅｏからｎｅｏ遺伝子を除去し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州）からのマルチプルクローニング部位とＴ７およびＴ３プロモーターを挿入することにより作成される。従ってｐＭＭＴＶＴ７（＋）はＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターに結合したＲＳＶ−ＬＴＲエンハンサー、ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターの下流に位置するＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ７プロモーターの下流に位置するポリリンカー、Ｔ７プロモーターの下流に位置するＴ３バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、そしてＴ３プロモーターの下流に位置するＳＶ４０スプライシング部位とポリアデニル化部位を含有する。ｐＭＡＭｎｅｏからのβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性を与える蛋白をコードする）はｐＭＭＴＶＴ７（＋）中で保持されるが、ｐＭＡＭｎｅｏ中の配向に対して配向は逆転している。
【００５３】
ベクターｐＭＭＴＶＴ７（−）はｐＭＭＴＶＴ７（＋）と同じであるが、Ｔ７プロモーターとＴ３プロモーターの位置が逆転しており、ｐＭＭＴＶＴ７（−）中のＴ３プロモーターはｐＭＭＴＶＴ７（＋）中のＴ７プロモーターがある場所に位置しており、ｐＭＭＴＶＴ７（−）中のＴ７プロモーターはｐＭＭＴＶＴ７（＋）中のＴ３プロモーターがある場所に位置している。従ってｐＭＭＴＶＴ７（＋）とｐＭＭＴＶＴ７（−）ベクターは、哺乳動物宿主細胞中で異種ＤＮＡ（ここで異種ＤＮＡはポリリンカーでベクター内に取り込まれている）が発現するのに必要な制御成分のすべてを含有している。さらにＴ７プロモーターとＴ３プロモーターはポリリンカーのどちらかの側に位置しているため、これらのプラスミドはポリリンカーでベクター内にサブクローニングされている異種ＤＮＡのインビトロ転写体の合成に使用することができる。
【００５４】
哺乳動物細胞中のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡの誘導性発現のために、ＤＮＡをｐＭＭＴＶＴ７（＋）またはｐＭＭＴＶＴ７（−）のようなプラスミド中に挿入することができる。これらのプラスミドは、機能的に関連する外来ＤＮＡのステロイド誘導性発現のためのマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ＬＴＲプロモーターを含有する。宿主細胞が細胞内への糖質コルチコイド（すなわちＭＭＴＶＬＴＲプロモーターの誘導物質）の摂取に必要な内因性糖質コルチコイド受容体を発現しない場合は、糖質コルチコイド受容体をコードするＤＮＡ（ＡＴＣＣ整理番号６７２００）で細胞を追加的にトランスフェクションする必要がある。インビトロ転写体の合成のために、ヒトｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ３、およびｍＧｌｕＲ５をコードする全長ヒトＤＮＡクローンを、ｐＩＢＩ２４（インターナショナル・バイオテクノロジーズ社（International Biotechnologies, Inc.）、ニューヘーブン、コネチカット州）、ｐＣＭＶ−Ｔ７−２、ｐＣＭＶ−Ｔ７−３（図１参照）、ｐＭＭＴＶＴ７（＋）、ｐＭＭＴＶＴ７（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Stratagene)、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州）またはｐＧＥＭ７Ｚ（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州）などの中にサブクローニングすることもできる。
【００５５】
本発明の別の実施態様において、前述のポリ核酸（すなわちＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を含有する細胞が提供される。細菌、酵母および哺乳動物のような宿主細胞は、ＤＮＡを複製しメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプを産生するために使用することができる。本発明に記載の発現ベクターの作成、インビトロ転写体の調製、哺乳動物細胞へのＤＮＡのトランスフェクション、卵母細胞の注入の方法、および受容体の発現と機能の評価のための電気生理的および他の分析方法は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５６２５とＰＣＴ／ＵＳ９２／１１０９０、および同時係属出願米国特許出願第０７／５６３，７５１号と０７／８１２，２５４号にも記載されている。これらの文献の主題はその全体が参考のため本明細書中に引用されている。
【００５６】
適当な発現ベクターへのクローン化ＤＮＡの導入法、１つのプラスミドベクターまたはプラスミドベクターの組合せ（それぞれが１つまたはそれ以上の異なる遺伝子をコードする）または線状ＤＮＡによる真核細胞のトランスフェクション、そしてトランスフェクションした細胞の選択法は公知である（例えば、サムブルーク（Sambrook）ら、（１９８９）分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参照）。異種ＤＮＡは、当業者に公知の任意の方法により宿主細胞に導入される：例えば、ＣａＰＯ４沈殿法（例えば、ウィグラー（Wigler）ら、（１９７９）、Proc. Natl. Acad. Sci.７６：１３７３−１３７６）を用いる、異種ＤＮＡをコードするベクターによるトランスフェクション。次に組換え細胞は、ＤＮＡによりコードされたサブタイプが発現される条件下で培養することができる。好適な細胞は哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、およびＬｔｋ−細胞）、酵母細胞（例えば、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）のようなメチル親和性（methilotrophic）酵母細胞）、細菌細胞（例えば大腸菌）などがある。
【００５７】
本明細書で提供されるＤＮＡは任意の真核細胞（例えば、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）（米国特許第４，８８２，２７９号、４，８３７，１４８号、４，９２９，５５５号および４，８５５，２３１号を参照）、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）などの酵母細胞）中で発現されるが、本明細書で提供されるヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡの発現のためには、Ｇ蛋白を発現する（内因性にまたは組換えで）市販の発現系や当業者に公知の他の発現系を含む哺乳動物発現系が好ましい。ＰＩ加水分解／Ｃａ＋＋シグナル経路に結合したヒトメタボトロピック受容体サブタイプをコードするＤＮＡのインビトロｍＲＮＡ転写体の発現にはツノガエル（Xenopus）卵母細胞が好適である。卵母細胞中の内因性イノシトール３’末端リン酸第二メッセンジャー介在経路は、これらの細胞におけるヒトメタボトロピック受容体の機能性発現を可能にする。組換えヒトメタボトロピック受容体を発現する卵母細胞は、卵母細胞Ｇ蛋白結合ＩＰ３生成経路を介してアゴニストに応答し、内部の貯蔵状態からＣａ＋＋を放出し、電圧固定記録法により遅延振動電流として検出される塩素チャネルを活性化すると報告されている。
【００５８】
ヒトメタボトロピック受容体の機能性組換え発現のための宿主細胞は、好ましくは内因性または組換えグアニンヌクレオチド結合蛋白（すなわちＧ蛋白）を発現する。Ｇ蛋白はα、βおよびγサブユニットよりなる高度に保存された膜関連蛋白のファミリーの１つである。αサブユニットはＧＤＰとＧＴＰに結合し、異なるＧ蛋白毎に異なる。結合した対のβおよびγサブユニットはユニークであることもそうでないこともあり、異なるα鎖が同じβγ対または異なる対に結合している［リンダーとギルマン（Linder and Gilman）、Sci. Am.２６７：５６−６５（１９９２）］。Ｇ蛋白α鎖をコードする３０以上の異なるｃＤＮＡがクローン化されている［サイモン（Simon）ら、Science ２５２：８０２（１９９１）］。４つの異なるβポリペプチドが知られている［サイモン（Simon）ら、Science ２５２：８０２（１９９１）］。同定された５つのγｃＤＮＡのうち３つがクローン化されている［ハーレー（Hurley）ら、PNAS U.S.A. ８１：６９４８（１９８４）：ガウタム（Gautam）ら、Science ２４４：９７１（１９８９）：ガウタム（Gautam）ら、PNAS U.S.A. ８７：７９７３（１９９０）：］。４番目のγｃＤＮＡ［クレウス（Kleus）ら、Science ２５９：８３２（１９９３）］と５番目のγｃＤＮＡ［フィッシャーとアロンソン（Fischer and Aronson）、Mol. Cell. Bio. １２：１５８５（１９９２）］の配列は確立されており、さらに追加のγサブユニットが存在するかも知れない［タミール（Tamir）ら、Biochemistry ３０：３９２９（１９９１）］。グアニンヌクレオチド交換とＧＴＰ加水分解により、Ｇ蛋白は活性状態と不活性状態の間で変化する。不活性Ｇ蛋白は、リガンド活性化受容体により刺激されてＧＤＰをＧＴＰに交換する。活性型では、ＧＴＰに結合したαサブユニットはβγ複合体から解離し、次にサブユニットは細胞性エフェクター分子と特異的に相互作用して細胞性応答を引き出す。異なるＧ蛋白は異なるエフェクター系（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルサイクラーゼ系）や異なる受容体と相互作用することができるため、異なる組換えヒトメタ受容体サブタイプの発現のための異なる宿主細胞を研究することは有用である。あるいは宿主細胞は、異なるＧ蛋白の異種発現のためにＧ蛋白サブユニットをコードするＤＮＡでトランスフェクションすることができる。
【００５９】
好適な実施態様において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡは、ベクターに結合され、適当な宿主細胞中に導入されて、特異的なヒトメタボトロピックルグルタミン酸受容体サブタイプまたはサブタイプの特異的な組合せを発現する、形質転換された細胞株を産生する。得られる細胞株は次に、公知の薬剤または可能性のある薬剤の受容体機能への影響の再現性のある定量的解析のために大量に産生される。他の実施態様においては、各サブタイプをコードするＤＮＡのインビトロ転写によりｍＲＮＡが産生される。このｍＲＮＡ（単一のサブタイプクローンからであってもまたはクローンの組合せからであっても）は、ツノガエル（Xenopus）卵母細胞に注入され、ここでｍＲＮＡはヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの合成を指令する。あるいは機能性ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの発現のために、サブタイプをコードするＤＮＡは卵母細胞に直接注入される。次にトランスフェクションされた哺乳動物細胞または注入された卵母細胞は、本明細書に記載の薬剤スクリーニング法に使用される。
【００６０】
ＤＮＡまたはＲＮＡが導入される真核細胞は、このようなＤＮＡまたはＲＮＡによりトランスフェクションされることができる細胞、またはこのようなＤＮＡまたはＲＮＡを注入されてＧ蛋白を（内因性にまたは組換えにより）発現することができる細胞である。好適な細胞は、内因性メタボトロピックグルタミン酸受容体を（あったとしても）ほんの少ししか発現せず、かつ一時的または安定にトランスフェクションされ、また本発明のＤＮＡやＲＮＡを発現するものである。最も好適な細胞は、異種ＤＮＡによりコードされる１つまたはそれ以上のサブタイプよりなる組換えまたは異種ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体を形成することができるものである。このような細胞は経験的に同定されるか、または容易にトランスフェクションまたは注入されることが知られているものの中から選択される。
【００６１】
ＤＮＡを導入するための細胞の例は、哺乳動物起源の細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児性腎（ＨＥＫ）細胞、アフリカミドリザル（African green monkey）細胞および当業者に公知の他の細胞）、両生類の細胞（例えば、ゼノプス・ラエビス（Xenopus laevis）卵母細胞）、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris））などがある。注入されたＲＮＡ転写体を発現するための細胞の例は、ゼノプス・ラエビス（Xenopus laevis）卵母細胞がある。ＤＮＡのトランスフェクションに好適な細胞は、当業者に公知であるかまたは経験的に同定され、ＨＥＫ２９３細胞（整理番号＃ＣＲＬ１５７３でＡＴＣＣより入手できる）；Ｌｔｋ−細胞（整理番号＃ＣＣＬ１．３でＡＴＣＣより入手できる）；ＣＯＳ−７細胞（整理番号＃ＣＲＬ１６５１でＡＴＣＣより入手できる）；ＣＨＯ細胞（整理番号＃ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１またはＣＲＬ９０９６でＡＴＣＣより入手できる）；ＤＧ４４細胞（ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞；例えば、ウーラウプ（Urlaub）ら（１９８６）Cell. Molec. Genet. １２：５５５を参照）；そしてＢＨＫ細胞（ウェクターとバセルガ（Waechter and Baserga）、PNAS U.S.A. ７９：１１０６−１１１０（１９８２）；整理番号＃ＣＲＬ１０３１４でＡＴＣＣより入手できる）を参照）がある。好適な細胞には、ＣＨＯ細胞とＨＥＫ２９３細胞があり、特に液体窒素中で凍結され次に融解されて再増殖されるＨＥＫ２９３細胞（例えば、ゴーマン（Gorman）の米国特許第５，０２４，９３９号（またスティルマン（Stillman）ら、（１９８５）Mol. Cell. Biol. ５：２０５１−２０６０も参照）に記載のもの）、ＤＧ４４細胞、ＬＴＫ−細胞などがある。使用される宿主細胞にかかわらず、使用されるリガンドに誘導されるグルタミン酸産生のバックグランドレベルの測定、またはリガンドの非存在下での宿主細胞中に存在するグルタミン酸のバックグランドレベルの測定のために、比較実験を実施すべきであることは、当業者は理解できるであろう。
【００６２】
ＤＮＡは当業者に公知の方法を用いて細胞内に安定に取り込まれるか、または一時的に発現される。安定にトランスフェクションされる哺乳動物細胞は、選択マーカー遺伝子（例えば、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ネオマイシン耐性などの遺伝子）を有する発現ベクターで細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞をマーカー遺伝子を発現する細胞に選択的な条件下で増殖させることにより調製される。一時的トランスフェクション体を調製するためには、哺乳動物細胞をレポーター遺伝子（例えば大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子）でトランスフェクションしてトランスフェクション効率を追跡する。
【００６３】
トランスフェクション体は典型的には選択性条件下では増殖せず、普通トランスフェクション後数日以内に分析されるため、選択マーカー遺伝子は一時的トランスフェクション体には含有されない。
【００６４】
このような安定トランスフェクション細胞または一時的トランスフェクション細胞を産生するために、細胞を充分な濃度のサブタイプをコードする核酸でトランスフェクションして、異種ＤＮＡにコードされるヒトサブタイプを示すヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体を形成させる。サブタイプをコードするＤＮＡの正確な量は経験的に決定されるか、または特定のサブタイプ、細胞および測定条件について最適化される。異種ＤＮＡまたはＲＮＡのみにコードされるサブタイプを含有するメタボトロピックグルタミン酸受容体を発現する組換え細胞が特に好適である。
【００６５】
異種ＤＮＡは細胞中でエピソーム成分として維持されるか、または細胞の染色体ＤＮＡに取り込まれる。次に得られる組換え細胞を培養し、この培養物またはサブ培養物からサブ培養（または、哺乳動物細胞の場合は継代する）する。組換え細胞のトランスフェクション、注入および培養法は当業者に公知である。同様に当業者に公知の蛋白精製法を用いて、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプが精製される。例えば１つまたはそれ以上のサブタイプに特異的に結合する抗体または他のリガンドが、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の親和性精製に使用される。
【００６６】
本明細書において、異種ＤＮＡまたは外来ＤＮＡおよびＲＮＡは、互いに交換して使用することができ、細胞のゲノムの一部としては天然には存在しないか、または天然に存在するものとは異なるゲノム中の位置に見いだされるＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。典型的には異種または外来ＤＮＡおよびＲＮＡは、宿主細胞に内因性ではなく人工的に細胞に取り込まれたＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。異種ＤＮＡの例としては、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡ、転写、翻訳または他の制御可能な生化学過程などに影響を与えることにより内因性ＤＮＡの発現を媒介または変更するＲＮＡまたは蛋白をコードするＤＮＡなどがある。異種ＤＮＡを発現する細胞は、同じであるかまたは異なる発現生成物をコードするＤＮＡを含有する。異種ＤＮＡは発現される必要はなく、宿主細胞ゲノム中に取り込まれるかまたはエピソーム的に維持される。
【００６７】
機能性ｍＧｌｕＲの発現を検出するために使用する種々の測定法を当業者は容易に見いだすことができる。その例としては、ＰＩターンオーバー測定法［例えば、ナカジマ（Nakajima）ら、J. Biol. Chem.２６７：２４３７−２４４２（１９９２）および実施例３．Ｃ．２を参照］、ｃＡＭＰ測定法［例えば、ナカジマ（Nakajima）ら、前述、および実施例３．Ｃ．４を参照］、カルシウムイオン流入測定法［例えば、イトウ（Ito）ら、J. Neurochem. ５６：５３１−５４０（１９９１）、および実施例３．Ｃ．１を参照］、ｃＧＭＰ測定法［例えば、スタイナー（Steiner）ら、J. Biol. Chem.２４７：１１０６−１１１３（１９７２）］、アラキドン酸放出測定法［例えば、フェルダー（Felder）ら、J. Biol.Chem.２６４：２０３５６−２０３６２（１９８９）を参照］などがある。さらに、陽イオンをベースにした測定法（本明細書に記載）を、細胞内サイクリックヌクレオチドレベルの受容体誘導変化を追跡するために使用することができる。そのような測定法は、サイクリックヌクレオチドゲートのイオンチャネルを発現する宿主細胞を使用する。例えば棹状光受容体細胞、嗅覚細胞およびウシ腎細胞中に存在するこれらのチャネル（例えば、カウプ（Kaupp）ら、Nature ３４２：７６２−７６６（１９８９）、ダレン（Dallen）ら、Nature ３４７：１８４−１８７（１９９０）、およびビエル（Biel）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１：３５０５−３５０９（１９９４））は、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの結合による活性化により陽イオンに対して透過性となる。すなわち本発明の測定法において、内因性または組換えサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルを発現する宿主細胞は、サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えることが疑われる受容体をコードする核酸（例えば、メタボトロピックグルタミン酸受容体をコードするＤＮＡ）でトランスフェクション（または注入）され、次にチャネルのサイクリックヌクレオチド活性化の量の変化を追跡する。チャネルのサイクリックヌクレオチドの活性化の変化を追跡すると、活性化された時ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの変化を引き起こす受容体を機能性であるとして間接的に同定することができる。サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルの活性化の量の変化は、チャネルを介するイオンの流入を測定するか、または電流の電気生理学的測定または細胞内陽イオンレベルの変化を測定（例えば、細胞内カルシウムの蛍光測定）することにより、決定することができる。
【００６８】
活性化によりサイクリックヌクレオチドの低下を引き起こす受容体（例えば、メタボトロピックグルタミン酸受容体）を発現する細胞の測定法において、受容体活性化化合物を測定物内の細胞に添加する前に、サイクリックヌクレオチドの細胞内レベルを上昇させる物質（例えば、フォルスコリンやＩＢＭＸ）に細胞を暴露させることが好ましい。
【００６９】
上記の測定法での使用に適した宿主細胞は、検討される受容体の発現に適した宿主細胞を含む（例えば、メタボトロピックグルタミン酸受容体の測定のためのＬ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞またはツノガエル（Xenopus）卵母細胞）。細胞は、サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルをコードする核酸と受容体をコードする核酸で連続的にトランスフェクション（または注入）されるか、または細胞は２つの核酸で同時トランスフェクションされる。実施例３Ａと３Ｂに記載の一時的または安定なトランスフェクションを実施することができる。
【００７０】
サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルでトランスフェクション（または注入）された細胞は、機能の測定の前にインキュベートされる（典型的には約２４−４８時間）。チャネルの活性は、トランスフェクションされた細胞からの引き剥がした裏返した膜パッチを用いて測定される（こうして細胞質面に達するｃＡＭＰの濃度が調節される）。トランスフェクション体はまた、内部カルシウムレベル（［Ｃａ＋＋］ｉ）の単細胞ビデオイメージングにより分析される。この方法は、細胞内カルシウムレベル（これはチャネルのサイクリックヌクレオチド活性化により制御される、チャネルを介するカルシウムの流入量とともに変化する）の測定によるサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルの分析を可能にする。イメジーング測定法は、基本的に実施例３．Ｃ．４．ｂに記載のように実施される。
【００７１】
本明細書に記載のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ベクター、受容体サブタイプおよび細胞により、選択されたメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプやその受容体サブタイプに対する抗体の産生が可能である。これは、その存在が単一のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの分析を妨害する多くの他の受容体蛋白の汚染が実質的にない、合成または組換え受容体および受容体サブタイプを調製する手段を与える。目的の受容体サブタイプが利用できることが、特定の受容体サブタイプまたはメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの組合せへの薬剤の影響を観察し、従ってヒトに特異的でありヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプまたはメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの組合せに特異的な試験系で、薬剤の初期のインビトロスクリーニングを行うことを可能にする。特異的抗体が利用できることは、インビボで発現されるサブタイプの組合せを同定することを可能にする。すなわち、このような特異的組合せは、薬剤スクリーニングの好適な標的として使用される。
【００７２】
特異的な受容体組成物への薬剤の影響を測定するためにインビトロで薬剤物質をスクリーニングすることができることは、受容体サブタイプ特異的または疾患特異的薬剤の開発とスクリーニングを可能にするはずである。また単一の受容体サブタイプまたは種々の受容体サブタイプと種々のアゴニストまたはアンタゴニストの可能性のある物質との特定の組合せを試験することにより、個々のサブタイプの機能と活性に関する追加情報が得られ、１つまたはそれ以上の受容体サブタイプと非常に特異的に相互作用することができる化合物の同定と設計を可能にするであろう。得られる薬剤は、種々の受容体サブタイプを発現する細胞を用いてスクリーニングすることにより同定される薬剤より、不要な副作用はより少ないであろう。
【００７３】
さらに種々の疾患の薬剤開発と治療法に関して、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡが利用できることは、ある種の疾患の発症に相関する遺伝子の変化（例えば、突然変異）の同定を可能にする。さらに、このような突然変異を合成ＤＮＡ配列に特異的に導入し、次にこれを実験室動物に導入するかまたはその効果を測定するためのインビトロ測定系により、そのような疾患の動物モデルの作成が可能になる。
【００７４】
別の面において、本発明は本発明のＤＮＡによりコードされる機能性ペプチド断片およびその機能性組合せよりなる。ペプチドがグルタミン酸受容体として機能するのに必須ではない配列中のアミノ酸の一部またはすべてを排除することにより、不要な実験をすることなく当業者はこのような機能性ペプチド断片を産生することができる。グルタミン酸受容体機能に必須のアミノ酸は、例えばペプチドをコードするＤＮＡの体系的消化および／またはＤＮＡへの欠失の導入により決定することができる。修飾（例えば欠失または消化）ＤＮＡは、例えばＤＮＡを転写し、次に得られるｍＲＮＡをツノガエル（Xenopus）卵母細胞に導入して、ｍＲＮＡを翻訳させることにより発現することができる。卵母細胞中のこうして発現された蛋白の機能的分析は、グルタミン酸受容体に結合しこれを機能的に活性化することが公知のリガンドに卵母細胞を暴露して、次に内因性チャネルが活性化されるか否かについて卵母細胞を追跡することにより、行われる。電流が検出されるなら、断片はグルタミン酸受容体として機能する。
【００７５】
本発明の別の実施態様において、競合的結合測定法で本発明の受容体蛋白を使用することよりなる、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプに結合する化合物の同定方法が提供される。この測定法は多数の化合物を迅速にスクリーニングして、どの化合物（もし、あるとすれば）が、特異的に結合した［３Ｈ］グルタミン酸を排除することができる（すなわち、メタボトロピックグルタミン酸受容体に結合することができる）かを調べることができる。結合することが見いだされた化合物を用いて、このような化合物が本発明の受容体のモジュレーター、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用するのか否かをさらに調べるために、さらに詳しい測定法が実施される。
【００７６】
本発明の結合測定法の別の応用は、本発明の受容体の存在の有無に関する試料（例えば生物学的液体）の測定である。例えばグルタミン酸産生経路の機能不全に関連する症状を示す患者の血清を測定して、観察される症状がこのような受容体の型の産生過剰または不足により引き起こされるのかを決めることができる。
【００７７】
本発明において企図される結合測定法は、当業者は容易に判定できるように種種の方法で実施することができる。例えばラジオリセプター測定法などの競合的結合測定法を使用することができる。
【００７８】
本発明のさらなる実施態様において、本発明のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの活性を調節する化合物を同定するための生物測定法が提供され、該方法は：
（ａ）ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡを含有する細胞（この細胞は機能性メタボトロピックグルタミン酸受容体を発現する）を、受容体の活性の調節能力を測定すべき少なくとも１つの化合物に暴露させて、
（ｂ）第二メッセンジャー活性の変化について細胞を追跡する
ことよりなる。
【００７９】
上記の生物測定法はヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体のアゴニストやアンタゴニストおよびアロステリックモジュレーターの同定を可能にする。この方法では組換えメタボトロピックグルタミン酸受容体に「未知の」すなわち試験物質と（アンタゴニスト活性が試験される時は、さらに公知のメタボトロピックグルタミン酸アゴニストの存在下で）接触させ、この「未知の」すなわち試験物質との接触後、公知のグルタミン酸受容体の第二メッセンジャー活性を追跡し、公知のグルタミン酸受容体の活性を追跡し、公知のグルタミン酸受容体の第二メッセンジャー応答を増加または減少させる物質は、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の機能性リガンド（すなわち、モジュレーター、アゴニストまたはアンタゴニスト）として同定される。追跡することができる第二メッセンジャー活性には、細胞内カルシウムイオンの濃度、ＩＰ３、ｃＡＭＰレベルの変化、またはアラキドン酸放出またはイオン電流の活性または阻害の追跡（細胞が卵母細胞の場合）がある。
【００８０】
本発明の特定の実施態様において、組換えヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体を発現する哺乳動物細胞または卵母細胞を試験化合物と接触させて、次に試験化合物がある場合またはない場合のメタボトロピックグルタミン酸受容体介在応答を比較し、化合物の存在に対する試験細胞または対照細胞（すなわち、メタボトロピックグルタミン酸受容体を発現しない細胞）のメタボトロピックグルタミン酸受容体介在応答を比較して、その調節作用を評価することができる。
【００８１】
本明細書において、「メタボトロピックグルタミン酸受容体の活性を調節する」化合物またはシグナルとは、メタボトロピックグルタミン酸受容体の活性を変化させ、化合物またはシグナルの存在下ではこれらが存在しない場合とはメタボトロピックグルタミン酸受容体の活性が異なるようになる化合物またはシグナルを意味する。特にこのような化合物またはシグナルはアゴニストやアンタゴニストを含む。アゴニストという用語は、受容体機能を活性化するグルタミン酸またはＡＣＰＤのような物質またはシグナルを意味し；アンタゴニストという用語は、アゴニストに誘導される受容体活性化を妨害する物質を意味する。アンタゴニストには競合的および非競合的アンタゴニストがある。競合的アンタゴニスト（または競合的ブロッカー）は、アゴニスト（例えば、リガンドまたは神経伝達物質）の近傍または特異的な部位と、その同じ部位または近傍に対して相互作用する。非競合的アンタゴニストまたはブロッカーは、アゴニストと相互作用する部位とは異なる部位と相互作用することにより、受容体の機能を不活性化する。
【００８２】
当業者は理解できるように、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体活性を調節する化合物（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）の同定方法には、一般に対照との比較が必要である。「対照」細胞または「対照」培養物の１つのタイプは、試験化合物に暴露された細胞または培養物と実質的に同様に処理された細胞または培養物である（ただし、対照培養物は試験化合物に暴露されない）。例えば、電圧固定電気生理学的方法を用いる方法では、細胞を浸漬している外部溶液を単に交換することにより、試験化合物の存在下または非存在下で同じ細胞を試験することができる。別のタイプの「対照」細胞または「対照」培養物は、トランスフェクションされた細胞と同一の細胞または細胞の培養物である（ただし、対照培養物に使用される細胞は、トランスフェクションされた細胞に発現される組換えヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプを発現しない）。この場合、細胞または各タイプの細胞の培養物が、測定される化合物の存在下と実質的に同じ反応条件下に暴露される時、試験化合物に対する試験細胞の応答は、受容体のない（対照）細胞の試験化合物に対する応答（または応答の欠如）と比較される。
【００８３】
本発明のさらに別の実施態様において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の第二メッセンジャー活性は、この受容体を、上記生物測定法により同定される少なくとも１つの化合物の有効量と接触させることにより調節される。
【００８４】
本発明のさらに別の実施態様において、上記の受容体蛋白に対して産生された抗体が提供される。この抗体は、受容体組織局在化、サブタイプ組成、機能性ドメインの構造の研究用、受容体の精製、および診断応用治療応用などに使用することができる。好ましくは治療用途では、使用される抗体はモノクローナル抗体である。
【００８５】
本発明の受容体蛋白またはその部分を抗体産生の抗原として用いることにより、上記の抗体は当業者に公知の標準的方法を使用して産生することができる。抗ペプチドおよび抗融合蛋白抗体ともに使用することができる［例えば、バホウト（Bahouth）ら、（１９９１）Trends Parmacol Sci. 第１２巻：３３８−３４３;Current Protocols in Molecular Biology（アウスベル（Ausubel）ら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、ニューヨーク（１９８９）］。免疫原として（合成ペプチドまたは組換え産生細菌融合蛋白として）使用するためのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの部分を選択する場合に考慮すべき因子は、抗原性、入手し易さ（すなわち、細胞外ドメインおよび細胞質ドメイン）、特定のサブタイプに特異的であるかなどである。
【００８６】
サブタイプ特異的抗体が利用できることは、（例えば、正常の脳組織対疾患の脳組織中の）種々のサブタイプの分布と発現密度を追跡するのに免疫組織学的方法を使用することを可能にする。このような抗体はまた、診断および治療応用に利用できる。
【００８７】
本発明のさらに別の実施態様において、有効量の上記の抗体に本発明の受容体を接触させることにより、該受容体のイオンチャネル活性を調節する方法が提供される。
【００８８】
本発明の抗体は、標準的方法（例えば、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、または皮下注射、移植または経皮的投与法など）により、対象者に投与することができる。当業者は、使用される投与法により、投与型、治療処方などを容易に決定することができる。
【００８９】
本発明のさらなる実施態様において、細胞内サイクリックヌクレオチドレベルの受容体に誘導される変化を追跡するための、陽イオンベースの生物測定法が提供され、該生物測定法は：
内因性または組換えサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルを発現する宿主細胞に、細胞内サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えることが疑われる受容体をコードする核酸を導入し、そして
細胞内サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えることが疑われる、該受容体に対するリガンドの存在下または非存在下で、サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルのサイクリックヌクレオチド活性化の量の変化を追跡することよりなる。
【００９０】
以下の非限定的実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００９１】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体をコードするＤＮＡの単離
Ａ．ｍＧｌｕＲ５受容体ｃＤＮＡ
ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
【００９２】
ヒト海馬組織から単離したＲＮＡを、標準的方法［例えば、グブラーとホフマン（Gubler and Hoffman）、（１９８３）Gene ２５：２６３−２６９］に従い、オリゴｄＴ−プライムした１本鎖ｃＤＮＡの合成のための鋳型として使用した。１本鎖ｃＤＮＡを２本鎖ｃＤＮＡに変換し、そのｃＤＮＡの末端にＥｃｏＲＩ／ＳｎａＢＩ／ＸｈｏＩアダプターを付け加えた。アガロースゲル電気泳動を用いてサイズによりｃＤＮＡを分離し、＞２．５kbのものをＥｃｏＲＩ消化したλｇｔ１０バクテリオファージベクターに結合させた。得られる一次ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー（約２×１０５組換え体）を、ラットｍＧｌｕＲ１受容体（ヌクレオチド１から１７２３＋５’非翻訳配列；マス（Masu）ら、（１９９１）Nature ３４９：７６０−７６５を参照）をコードするＤＮＡの断片に対するハイブリダイゼーションについてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、４２℃で５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５０％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳおよび２００μg／mlの変性した超音波処理したニシン精子ＤＮＡ中で行ない、洗浄は６５℃で１×ＳＳＰＥと０．２％ＳＤＳ中で行なった。３２７３塩基対を含有するハイブリダイズする１つのプラーク（ＭＥＴＡＢ１）を同定した。
【００９３】
追加のヒトｍＧｌｕＲ５コーディングクローンを得るために、ＭＥＴＡＢ１を放射標識し、以下のように調製した２つのヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用した。ランダムプライマーを使用して、ヒト小脳組織から単離したＲＮＡから最初のｃＤＮＡ合成をプライムしてｃＤＮＡを合成した。長さを基準にしてｃＤＮＡをプールし、２つのライブラリーを作成した：１つは２．８kb以上の長さの挿入体を有し（すなわち、大挿入体ライブラリー）、もう１つは１−２．８kbの長さの挿入体を有する（すなわち、中挿入体ライブラリー）。ラットｍＧｌｕＲ１ＤＮＡ断片へのハイブリダイゼーションに対して海馬ライブラリーをスクリーニングするために使用したのと同じハイブリダイゼーション条件を用いて、ＭＥＴＡＢ１に対するハイブリダイゼーションについてライブラリーをスクリーニングした。洗浄は５５℃で１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で行なった。大挿入体ライブラリー中に１つのハイブリダイズするプラーク（ＭＥＴＡＢ２）を同定し、中挿入体ライブラリー中に４つのハイブリダイズするプラーク（ＭＥＴＡＢ３−ＭＥＴＡＢ６）を同定した。
【００９４】
ヒトｍＧｌｕＲ５をコードするＤＮＡの別のスクリーニングで、ＭＥＴＡＢ１により大挿入体または中挿入体小脳ライブラリーをスクリーニングするのに使用した条件と同じ条件を用いて、サイズが１−２kbの範囲の挿入体を含有するランダムにプライムしたヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー（２×１０６組換え体）および中挿入体小脳ｃＤＮＡライブラリーを、放射能標識したＭＥＴＡＢ５へのハイブリダイゼーションについてスクリーニングした。海馬ライブラリーに３つのハイブリダイズするプラーク（ＭＥＴＡＢ１０−ＭＥＴＡＢ１２）が同定され、小脳ライブラリーの別の一次スクリーニングで５つの追加のハイブリダイズするプラーク（ＭＥＴＡＢ１３−ＭＥＴＡＢ１７）が同定された。選択されたプラークを精製した。
【００９５】
単離されたクローンの性状解析
制限酵素マッピングとＤＮＡ配列解析による精製したプラークの挿入体の性状解析から、単離されたクローンによりヒトｍＧｌｕＲ５転写体の少なくとも３つの明らかなスプライス変種が表されていることが判明した。ＭＥＴＡＢ１の分析により、これは翻訳開始コドンを含有するが翻訳停止コドンは含有しないことが示された。推測されるアミノ酸配列は、ラットのｍＧｌｕＲ１の推測されるアミノ酸配列に約７０％同一であり、ラットのｍＧｌｕＲ５の推測されるアミノ酸配列とは＞９０％の同一性を有している［アベ（Abe）ら、（１９９２）J. Biol. Bhem. ２６７：１３３６１−１３３６８］。
【００９６】
ＭＥＴＡＢ５のＤＮＡ配列解析は、ＭＥＴＡＢ５は５’末端でＭＥＴＡＢ１の３’末端と重複し、３’方向へ追加の３４３ヌクレオチドが続いていることを示した。ＭＥＴＡＢ１とＭＥＴＡＢ５の重複領域を比較すると、ＭＥＴＡＢ１はＭＥＴＡＢ５に存在しない９６ヌクレオチドを有していた（すなわち、ＭＥＴＡＢ１はＭＥＴＡＢ５に対して９６ヌクレオチド挿入を含有する）。ＭＥＴＡＢ５はまた、翻訳停止コドンを持っていない。ＭＥＴＡＢ１２挿入体は５’末端でＭＥＴＡＢ５の３’末端と重複するが、さらに３’末端方向に延長して翻訳停止コドンを有する。
【００９７】
ＭＥＴＡＢ２のＤＮＡ配列解析により、５’末端の最初の８６９ヌクレオチドはＭＥＴＡＢ１の３’末端の一部と重複し、同じであった。しかし、ＭＥＴＡＢ１とＭＥＴＡＢ２の配列はＭＥＴＡＢ１の９６ヌクレオチド挿入の最初で分岐していた。ＭＥＴＡＢ２は３’末端方向に約２７００ヌクレオチド延長し、ＭＥＴＡＢ１との分岐点の４ヌクレオチドだけ３’方向に推定翻訳停止コドンを有する。
【００９８】
ＭＥＴＡＢ４の部分的ＤＮＡ配列解析は、これが別のヒトメタボトロピック受容体であるｍＧｌｕＲ１の一部を含有することを示していた（実施例１．Ｂ．を参照）。
【００９９】
全長ｍＧｌｕＲ５ ｃＤＮＡ作成体の調製
ｃＤＮＡのインビトロ転写体の調製および／または哺乳動物細胞でのｃＤＮＡの発現に使用するために、ヒトｍＧｌｕＲ５転写体の３つの推定スプライス変種を表す全長作成体（ｍＧｌｕＲ５ａ、ｍＧｌｕＲ５ｂそしてｍＧｌｕＲ５ｃと呼ぶ）を作成し、発現ベクター中に取り込むことができる。典型的に使用される基礎となる発現ベクターは、ｐＣＭＶ−Ｔ７−３またはｐＣＭＶ−Ｔ７−２である（図１を参照）。プラスミドｐＣＭＶ−Ｔ７−３はｐＵＣ１９ベースのベクターであり、ＣＭＶ（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー、プロモーターのすぐ下流に位置するＳＶ４０スプライスドナー／スプライスアクセプター部位、ＳＶ４０スプライス部位のすぐ下流に位置するＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ７プロモーターの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびＴ７プロモーターとポリアデニル化シグナルの間のポリリンカーを含有する。すなわちこのベクターは、哺乳動物宿主細胞中での異種ＤＮＡの発現に必要なすべての制御成分を含有する（異種ＤＮＡはポリリンカーでベクターに取り込まれる）。さらにＴ７プロモーターはポリリンカーのすぐ上流に位置するため、このプラスミドは、ポリリンカーでベクターにサブクローニングされた異種ＤＮＡのインビトロ転写体の合成に使用される。ｐＣＭＶ−Ｔ７−３とｐＣＭＶ−Ｔ７−２は、ポリリンカー中の制限酵素部位の配向のみが異なる。
【０１００】
全長ｍＧｌｕＲ５ａ作成体（配列番号７を参照）を調製するために、クローンＭＥＴＡＢ１、ＭＥＴＡＢ５およびＭＥＴＡＢ１２の部分を一緒に結合させた。まず操作を容易にするために、ＭＥＴＡＢ１、ＭＥＴＡＢ５およびＭＥＴＡＢ１２の挿入体をＥｃｏＲＩ断片としてλｇｔ１０から別々に、ＥｃｏＲＩ消化ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州）に移した。ＭＥＴＡＢ１挿入体を含有するｐＧＥＭ−７ＺｆベクターをＳｃａＩ／ＮｈｅＩで消化して、アンピシリン耐性遺伝子の５’半分とＭＥＴＡＢ１挿入体の５’部分（配列番号７のヌクレオチド１−２７２４）を含有する３．８kb断片を放出させた。ＭＥＴＡＢ５の挿入体を含有するｐＧＥＭ−７ＺｆベクターをＳｃａＩ／ＮｈｅＩで消化して、アンピシリン耐性遺伝子の３’半分とＭＥＴＡＢ５挿入体の３’部分（配列番号７のヌクレオチド２７２５−３４６９）を含有する２．６kb断片を放出させ、この断片を、ＭＥＴＡＢ１を含有するｐＧＥＭ−７Ｚｆベクターからの３．８kb断片に結合させてｐＧＥＭ−ＭＥＴＡＢ１＋５を作成した。ｐＧＥＭ−ＭＥＴＡＢ１＋５をＳｃａＩ／ＮｈｅＩで消化して、アンピシリン耐性遺伝子の５’半分と配列番号７のヌクレオチド１−３３１６を含有する４．４kb断片を放出させた。次にこの４．４kb断片を、ＭＥＴＡＢ１２挿入体を含有するｐＧＥＭ−７ＺｆベクターのＳｃａＩ／ＮｈｅＩ（部分）消化により得られた２．６kb断片［この２．６kb断片はアンピシリン耐性遺伝子の３’半分とＭＥＴＡＢ１２の３’部分（配列番号７のヌクレオチド３３１７−４０８５）を含有する］に結合させた。得られたベクターはｐＧＥＭ−７Ｚｆ中に完全なｍＧｌｕＲ５ａコーディング配列を含有していた。全長ｍＧｌｕＲ５ａ ｃＤＮＡを、Ａａｔ II（平滑末端）−Ｈｉｎｄ III断片としてベクターから単離し、ＮｏｔＩ（平滑末端）／Ｈｉｎｄ III消化ｐＣＭＶ−Ｔ７−３にサブクローニングして、作成体ｍＧｌｕＲ５ａ１を作成した。
【０１０１】
要約すると、作成体ｍＧｌｕＲ５ａ１は、ＭＥＴＡＢ１からの５’非翻訳配列の３６９塩基対（配列番号７のヌクレオチド１−３６９）と、ｍＧｌｕＲ５受容体のｍＧｌｕＲ５ａ変種の完全なコーディング配列（配列番号７のヌクレオチド３７０−３９１２）、および３’非翻訳配列の１７３塩基対（配列番号７のヌクレオチド３９１３−４０８５）を含有する。ｍＧｌｕＲ５ａをコードする配列は、哺乳動物宿主細胞中で受容体を発現するために、そしてツノガエル（Xenopus）卵母細胞で発現されるＤＮＡのインビトロ転写体を作成するのに使用するために、ｐＣＭＶ−Ｔ７−３中の制御成分に機能的に結合している。
【０１０２】
２つの追加のｍＧｌｕＲ５ａ作成体（ｍＧｌｕＲ５ａ２とｍＧｌｕＲ５ａ３）を、最初のｍＧｌｕＲ５ａ作成体の５’非翻訳領域を修飾して調製した。上記のｍＧｌｕＲ５ａ作成体は、提唱されている翻訳開始コドン（配列番号７のヌクレオチド３７０から３７２）に先行する５’非翻訳領域中に７つのおそらく不適切なＡＴＧコドンを含有する。ｍＧｌｕＲ５ａ１作成体をＢＡｌ３１で消化して、以下を行う：（１）配列の２５５ヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド１−２５５であり、上流のＡＴＧトリプレット７つのうち６つを含有する）を除去して、ｍＧｌｕＲ５ａ２を作成する、そして（２）配列の３４８ヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド１−３４８であり、上流のＡＴＧトリプレットのすべてを含有する）を除去して、ｍＧｌｕＲ５ａ３を作成する。すなわち、ｍＧｌｕＲ５ａ２は、５’非翻訳配列の一部が欠如していること以外はｍＧｌｕＲ５ａ１と同じであり、従って提唱される翻訳開始コドンの上流に１つのみのＡＴＧトリプレットを含有する。同様に、ｍＧｌｕＲ５ａ３は、提唱される翻訳開始コドンの上流のすべてのＡＴＧトリプレットが欠如していること以外はｍＧｌｕＲ５ａ１と同じであり、５’非翻訳配列の２１ヌクレオチドのみを含有する。
【０１０３】
３つ目のｍＧｌｕＲ５ａ作成体（ＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａ）は、以下のようにｍＧｌｕＲ５ａのＭＭＴＶプロモーター制御発現に使用するために調製した。ｍＧｌｕＲ５ａ３をＸｂａＩで消化した。ＳＶ４０スプライス部位、全長ｍＧｌｕＲ５ａコーディング配列（および５’非翻訳配列の２１ヌクレオチドと３’非翻訳配列の１７３ヌクレオチド）、およびポリアデニル化シグナルを含有する４．１kb断片を単離し、平滑末端とし、ｐＢＲ３２２の２kbのＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ（平滑末端）断片に結合させて、ｐＢＲ−ｈｍＧｌｕＲ５を作成した。ＭＭＴＶＬＴＲプロモーターとアンピシリンおよびネオマイシン耐性遺伝子を含有するベクターｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）をＢａｍＨＩで消化して、ネオマイシン耐性遺伝子を除去し、再結合させた。次にこのベクターをＥｃｏＲＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子を含有する断片を逆配向で大きい方のベクター断片に再結合させてｐＭＡＭｎｅｏ ａｍｐｏｐｐを作成した。このベクターをＰｓｔＩ／ＮｈｅＩで消化して、アンピシリン耐性遺伝子の５’部分とＭＭＴＶ−ＬＴＲを含有する２．３kbの断片を単離した。プラスミドｐＢＲ−ｈｍＧｌｕＲ５をＰｓｔＩ／ＸｂａＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子の３’部分とｍＧｌｕＲ５ａ配列（ＳＶ４０スプライス部位とポリアデニル化シグナルとともに）を含有する５．３kbの断片を、ｐＭＡＭｎｅｏ ａｍｐｏｐｐの２．３kbのＰｓｔ／ＮｈｅＩ断片に結合させてＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａを作成した。
【０１０４】
すなわち、ｐＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａは、ＭＭＴＶ−ＬＴＲを含有し、ｍＧｌｕＲ５ａ ＤＮＡ（配列番号７のヌクレオチド３４９−４０８５を含有する）と機能的に結合したＳＶ４０スプライス部位が続き、この後にポリアデニル化シグナルが続く。
【０１０５】
４つ目のｍＧｌｕＲ５ａ作成体（ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ５）は、以下のようにｍＧｌｕＲ５ａのＳＶ４０プロモーター制御発現に使用するために調製した。ｍＧｌｕＲ５ａ３をＸｈｏＩで部分的に消化し、クレノウ（Klenow）で処理し、自身と再結合させ、こうしてｍＧｌｕＲ５ａ ＤＮＡの３’に位置するＸｈｏＩ部位を破壊した。次にプラスミドをＳｃａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＳＶ４０スプライス部位、全長ｍＧｌｕＲ５ａコーディング配列（および５’非翻訳配列の２１ヌクレオチドと３’非翻訳配列の１７３ヌクレオチド）、ポリアデニル化シグナルおよびアンピシリン耐性遺伝子の３’部分を含有する断片を作成した。プラスミドｐＳＶβ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）をＳｃａＩ／ＸｈｏＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子とＳＶ４０早期プロモーターを含有する断片を、ｍＧｌｕＲ５ａ ＤＮＡを含有するＳｃａＩ／ＸｈｏＩ断片に結合させて、ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ５を作成した。すなわち、ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ５は、ＳＶ４０早期プロモーターを含有し、ｍＧｌｕＲ５ａ ＤＮＡ（配列番号７のヌクレオチド３４９−４０８５を含有する）と機能的に結合したＳＶ４０スプライス部位が続き、この後にポリアデニル化シグナルが続く。
【０１０６】
全長ｍＧｌｕＲ５ｂ作成体を調製するために、ｍＧｌｕＲ５ａ作成体
（ｍＧｌｕＲ１ａ１、ｍＧｌｕＲ５ａ２またはｍＧｌｕＲ５ａ３）をＮｈｅＩ／ＰｍｌＩで消化し、配列番号７のヌクレオチド２７２５−３０２０を含有する断片を放出させる。次に残りのベクター断片を、ＭＥＴＡＢ１からの単離したＮｈｅＩ／ＰｍｌＩ断片に結合させる。得られるベクター（ｍＧｌｕＲ５ｂ）は、配列番号７のヌクレオチド２９９９と３０００の間に位置する９６塩基対の挿入体（配列番号９のヌクレオチド３０００−３０９５）を含有する以外は、これが得られたｍＧｌｕＲ５ａ作成体と同じである。配列番号９は、ベクターｍＧｌｕＲ５ａ１から調製した全長ｍＧｌｕＲ５ｂ ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列である。
【０１０７】
全長ｍＧｌｕＲ５ｃ作成体を調製するために、ｍＧｌｕＲ５ａ作成体
（ｍＧｌｕＲ１ａ１、ｍＧｌｕＲ５ａ２またはｍＧｌｕＲ５ａ３）をＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII（Ｈｉｎｄ III部位は、ｍＧｌｕＲ５ａベクターのｐＣＭＶ−Ｔ７−３部分のポリリンカー内に存在する）で消化し、配列番号７のヌクレオチド２７２５−４０８５を含有する断片を放出させる。次に残りのベクター断片を、ＭＥＴＡＢ２から単離したＮｈｅＩ／Ｈｉｎｄ III断片に結合させる。得られる全長ｃＤＮＡ（ｍＧｌｕＲ５ｃ）（配列番号１１）は、コーディング配列の最初の２６３０ヌクレオチドについては、これが調製されたｍＧｌｕＲ５ａ作成体と同じであるが、コーディング配列のヌクレオチド２６３１で、ｍＧｌｕＲ５ｃとｍＧｌｕＲ５ａのコーディング配列は分岐（例えば、配列番号７のヌクレオチド３０００で始まる）し、ｍＧｌｕＲ５ｃコーディング配列はコーディング配列のヌクレオチド２６３１としてグアニンヌクレオチドを有し、その後に翻訳停止コドン（配列番号１１のヌクレオチド３００１−３００３）が続く。
【０１０８】
Ｂ．ｍＧｌｕＲ１受容体ｃＤＮＡ
ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
中挿入体小脳ライブラリーを、ラットのｍＧｌｕＲ１受容体（ヌクレオチド１から３０３１および５’非翻訳配列：マス（Masu）ら、（１９９１）Nature ３４９：７６０−７６５）をコードするＤＮＡの断片へのハイブリダイゼーションについてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、４２℃で５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５０％ホルムアルミド、０．２％ＳＤＳおよび２００μg／mlの変性した超音波処理したニシン精子ＤＮＡ中で行ない、洗浄は５５℃で１×ＳＳＰＥと０．２％ＳＤＳ中で行なった。３つのハイブリダイズするクローン（ＭＥＴＡＢ７−ＭＥＴＡＢ９）が同定された。
【０１０９】
次のスクリーニングで、ヒト中挿入体小脳ｃＤＮＡライブラリーの１×１０６組換え体の各平板を、追加のヒトｍＧｌｕＲ１クローンとプローブ結合させた。この平板をまず、ラットのｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド１−１２５６（および５’非翻訳配列）を含有するＤＮＡ断片（すなわち、５’プローブ）とハイブリダイゼーションさせ、次にクローンＭＥＴＡＢ７−ＭＥＴＡＢ９を同定したこの前のスクリーニングで使用したものと同じハイブリダイゼーション条件と洗浄条件を用いて、ラットｍＧｌｕＲ１ａ ｃＤＮＡのヌクレオチド２０７５−３３１０を含有するＤＮＡ断片（すなわち、３’プローブ）に連続してハイブリダイズさせた。５’プローブへのハイブリダイゼーションにより３つのクローン（ＭＥＴＡＢ１８、ＭＥＴＡＢ２１およびＭＥＴＡＢ２２）が同定され、そして３’プローブへのハイブリダイゼーションにより４つのクローン（ＭＥＴＡＢ１４、ＭＥＴＡＢ２０、ＭＥＴＡＢ３２およびＭＥＴＡＢ３５）が同定された。
【０１１０】
このラットのｍＧｌｕＲ１断片をプローブとして使用して、さらなるｍＧｌｕＲ１クローンのために大挿入体ヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションと洗浄条件は、中挿入体小脳ライブラリーから６つのｍＧｌｕＲ１クローンを単離した時に使用したものと同じである（例えば、ハイブリダイゼーション溶液では２０％ホルムアルデヒドを使用した）。３つのプラーク（ＭＥＴＡＢ５８、ＭＥＴＡＢ５９およびＭＥＴＡＢ６０）がプローブにハイブリダイズした。
【０１１１】
単離されたクローンの性状解析
精製したプラークの挿入体を制限酵素マッピングとＤＮＡ配列解析により性状解析した。ＭＥＴＡＢ５８は、約２．８kbであり、５’非翻訳配列、翻訳開始コドンおよび約２．３kbのコーディング配列を含有する。ＭＥＴＡＢ５８の３’末端は、ＭＥＴＡＢ１４の５’末端と重複する。ＭＥＴＡＢ１４は３’方向へ約７００塩基対延長し、翻訳停止コドンを含有する。すなわち、ＭＥＴＡＢ５８とＭＥＴＡＢ１４は重複して、全長ｍＧｌｕＲ１受容体をコードする（配列番号１を参照）。他のクローンも、翻訳開始コドンと翻訳停止コドンの間に位置するｍＧｌｕＲ１コーディング配列の部分からのヌクレオチド配列を含有する、部分ｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡである。
【０１１２】
ヒトｍＧｌｕＲ１転写体の３’末端をコードする追加のクローンがヒトｃＤＮＡライブラリー中に存在するか否かを測定するために、海馬／脳幹神経節および小脳ライブラリーからのｃＤＮＡの核酸増幅を行なった。５’プライマーは配列番号１のヌクレオチド２２１８から２２４０よりなり、３’プライマーは、ラットのｍＧｌｕＲ１ａコーディング配列のアミノ酸８９０−８９７に基づく縮重オリゴヌクレオチドであった（ピン（Pin）ら、（１９９２）Neurobiology ８９：１０３３１−１０３３５を参照）。増幅生成物をゲル電気泳動で解析した。海馬／脳幹神経節中にのみ１つの生成物（すなわち、５００塩基対断片）が検出された。
【０１１３】
ｍＧｌｕＲ１転写体の３’末端を示す追加のクローンを得るために、海馬および小脳ｃＤＮＡライブラリーを、前述のヒトｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡを得るのに使用した条件と同様の条件を使用してラットのｍＧｌｕＲ１ａ ｃＤＮＡの３’末端からの断片（例えば、ラットのｍＧｌｕＲ１ａ ｃＤＮＡの約２kbのＮｃｏＩ／ＣｌａＩ断片）でスクリーニングすることができる。このプローブは、択一的にスプライスされるようではないｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡの３’部分に対応する。次にハイブリダイズするクローンを制限酵素マッピングとＤＮＡ配列決定により解析して、異なる３’末端が示されるか否かを決定する。
【０１１４】
全長ｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡ作成体の調製
ヒトｍＧｌｕＲ１受容体のＢ型をコードする全長作成体を調製するために、クローンＭＥＴＡＢ５８とＭＥＴＡＢ１４の一部を結合させた。ＭＥＴＡＢ５８をＥｃｏＲＩ／ＡｃｃＩで消化し、配列番号１のヌクレオチド１５４−２６１２を含有する２４５９塩基対の断片を単離する。ＭＥＴＡＢ１４の７０４塩基対断片（配列番号１のヌクレオチド２６１３−３３２１を含有する）を、ＭＥＴＡＢ１４のＡｃｃＩ／ＸｈｏＩ消化により単離する。次にこの断片をＭＥＴＡＢ５８の２４５９塩基対に結合させて、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ消化ベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−３に結合させる。ヒトｍＧｌｕＲ１Ｂをコードする得られた作成体は、５’非翻訳配列の２３４ヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド１５４−３８７）、全ｍＧｌｕＲ１Ｂコーディング配列（配列番号１のヌクレオチド３８８−３１０８）、および３’非翻訳配列の２１３ヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド３１０９−３３２１）を含有する。ｍＧｌｕＲ１Ｂをコードする配列は、哺乳動物細胞中での発現のためのｐＣＭＶ−Ｔ７−３中の制御成分に機能的に結合している。
【０１１５】
種々のヒト組織中で実際に発現されるｍＧｌｕＲ５およびｍＧｌｕＲ１受容体を決定するために、種々の方法が使用できる。例えば、本明細書に記載のｍＧｌｕＲ転写体の挿入／欠失（すなわち、分岐の領域）の５’と３’に位置するヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、種々の組織から単離されたＲＮＡおよび／または種々の組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーの核酸増幅をプライムすることができる。増幅生成物の有無および生成物のサイズは、組織中で発現される変種を示す。生成物はまた、ＤＮＡ配列解析により詳細に性状解析される。
【０１１６】
ＲＮａｓｅ保護測定法を用いて、種々の組織中で発現される変種転写体を決定することもできる。これらの測定法は、総細胞性ＲＮＡの複雑な混合物中のＲＮＡ種を検出し定量するための感度の良い方法である。ｍＧｌｕＲＤＮＡの一部を標識し、細胞性ＲＮＡとハイブリダイズさせる。細胞性ＲＮＡ中に相補的なｍＲＮＡが存在する場合は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成する。次にこのＲＮＡ試料をＲＮａｓｅで処理して、１本鎖ＲＮＡを分解させる。ＲＮＡ−ＤＮＡはＲＮａｓｅ分解から保護され、ゲル電気泳動やオートラジオグラフィーにより目視できるようにされる。
【０１１７】
例えばヒトｍＧｌｕＲ ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションによるヒトメタボトロピック受容体をコードする配列を含有するゲノムクローンの単離と、引き続くクローンの性状解析は、ｍＧｌｕＲ一次転写体の可能なスプライス変種に関してさらなる情報を与える。
【０１１８】
Ｃ．ｍＧｌｕＲ３受容体ｃＤＮＡ
ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡ合成をプライムさせ、次にλｇｔ１０ベクターへの結合について１．０−２．８kbのｃＤＮＡを選択することにより作成された）を、ラットｍＧｌｕＲ２ ｃＤＮＡの５００塩基対のＳｍａＩ／ＸｂａＩ断片とラットｍＧｌｕＲ３ ｃＤＮＡの３kbのＡｃｃＩ／ＢａｍＨＩ断片へのハイブリダイゼーションについて選択した［タナベ（Tanabe）ら、（１９９２）Neuron ８：１６９−１７９］。ハイブリダイゼーションは、４２℃で５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５０％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳおよび２００μg／mlの変性した超音波処理したニシン精子ＤＮＡ中で行ない、洗浄は６５℃で０．５×ＳＳＰＥと０．２％ＳＤＳ中で行なった。３つのハイブリダイズするクローン（ＭＥＴＡＢ４０、ＭＥＴＡＢ４１、およびＭＥＴＡＢ４５）が同定された。
【０１１９】
次にＭＥＴＡＢ４５の５’末端の一部（すなわち、最初の２４４塩基対；配列番号５のヌクレオチド２６３４−２８７７）を用いて、増幅した小脳ライブラリー（ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡ合成をプライムし、次にλｇｔ１０ベクターへの結合について＞２．８kbのｃＤＮＡを選択することにより作成される）、そして増幅した海馬ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡ合成をプライムし、次にλｇｔ１０ベクターへの結合について＞２．０kbのｃＤＮＡを選択することにより作成される）を追加のｍＧｌｕＲ３についてスクリーニングした。各ライブラリーから１００万のクローンがスクリーニングされた。ハイブリダイゼーション条件と洗浄条件は、海馬ライブラリーからのＭＥＴＡＢ４０、ＭＥＴＡＢ４１およびＭＥＴＡＢ４５を単離するのに使用したものと同じである。３つのハイブリダイズするクローンが各ライブラリーで同定された（小脳ライブラリーではＭＥＴＡＢ４６、ＭＥＴＡＢ４９およびＭＥＴＡＢ５０、そして海馬ライブラリーではＭＥＴＡＢ４７、ＭＥＴＡＢ４８およびＭＥＴＡＢ５１Ｂ）。
【０１２０】
単離したクローンの性状解析
精製したプラークの挿入体を、制限酵素マッピングとＤＮＡ配列解析により性状解析した。単離したクローンのおのおのは、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体の一部をコードするクローンメタボトロピック４０（例えば実施例１．Ｄ．を参照）を除いて、ヒトｍＧｌｕＲ３受容体の一部である。クローンＭＥＴＡＢ４１、ＭＥＴＡＢ４５、ＭＥＴＡＢ４７−４９は、ｍＧｌｕＲ３コーディング配列の３’からの配列および翻訳停止コドンを含有する。クローンＭＥＴＡＢ４６、ＭＥＴＡＢ５０およびＭＥＴＡＢ５１Ｂは、ｍＧｌｕＲ３ ｃＤＮＡの５’末端からの配列（翻訳開始コドンと種々の量の５’非翻訳配列を含む）を含有する。
【０１２１】
全長ｍＧｌｕＲ３ ｃＤＮＡ作成体の調製
ＭＥＴＡＢ４８とＭＥＴＡＢ４６またはＭＥＴＡＢ５１Ｂの一部を結合させて、全長ヒトｍＧｌｕＲ３コーディング配列を含有する４つの作成体を調製した。この全長コーディング配列は配列番号５（ヌクレオチド１０６４−３７０３）に与えられる。クローンＭＥＴＡＢ４６とＭＥＴＡＢ５１Ｂの挿入体は、ＥｃｏＲＩ断片としてｐＣＭＶ−Ｔ７−３中に別々にサブクローニングされた。クローンＭＥＴＡＢ４８の挿入体は、ＥｃｏＲＩ断片としてｐＣＭＶ−Ｔ７−２にサブクローニングされた。
【０１２２】
作成体ｍＧｌｕＲ３Ｂを作成するために、ＭＥＴＡＢ５１Ｂ挿入体を含有するｐＣＭＶ−Ｔ７−３プラスミドをＳｃａＩ／Ｂｇｌ IIで消化し、アンピシリン耐性遺伝子の５’半分とＭＥＴＡＢ５１Ｂ挿入体の５’部分（配列番号５のヌクレオチド７４８−１６７１）を含有する２．６kbの断片を単離した。この断片を、ＭＥＴＡＢ４８の挿入体を有するｐＣＭＶ−Ｔ７−２プラスミドのＳｃａＩ／Ｂｇｌ II消化物から単離した４．３kbの断片［この４．３kbの断片はアンピシリン耐性遺伝子の３’半分とＭＥＴＡＢ４８の３’部分を有する（配列番号５のヌクレオチド１６７２−３９１９）］に結合させた。得られた作成体（ｍＧｌｕＲ３Ｂ）は、３１６ヌクレオチドの５’非翻訳配列（配列番号５のヌクレオチド７４８−１０６３）、全ｍＧｌｕＲ３コーディング配列（配列番号５のヌクレオチド１０６４−３７０３）、および２１６ヌクレオチドの３’非翻訳配列（配列番号５のヌクレオチド３７０４−３９１９）を含有する。ｍＧｌｕＲ３Ｂをコードする配列は、哺乳動物細胞中での発現のためにベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−３とｐＣＭＶ−Ｔ７−２からの制御成分に機能的に結合している。
【０１２３】
作成体ｍＧｌｕＲ３Ｃを作成するために、ＭＥＴＡＢ４６の挿入体を有するｐＣＭＶ−Ｔ７−３プラスミドを、ＳｃａＩ／Ｂｇｌ IIで消化し、アンピシリン耐性遺伝子の５’半分とＭＥＴＡＢ４６の５’部分を含有する３．４kbの断片（配列番号５のヌクレオチド１−１６７１）を単離した。この断片を、ＭＥＴＡＢ４８の作成体ｍＧｌｕＲ３Ｂで使用したものと同じＳｃａＩ／Ｂｇｌ II断片に結合させた。得られた作成体（ｍＧｌｕＲ３Ｃ）は、５’非翻訳配列の１０６３ヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド１−１０６３）、全ｍＧｌｕＲ３コーディング配列（配列番号５のヌクレオチド１０６４−３７０３）、および３’非翻訳配列の２１６ヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド３７０４−３９１９）を含有する。このｍＧｌｕＲ３Ｃをコードする配列は、哺乳動物細胞中での発現のためにベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−２とｐＣＭＶ−Ｔ７−３からの制御成分に機能的に結合している。
【０１２４】
作成体ｍＧｌｕＲ３Ａは、ｍＧｌｕＲ３ＣをＥｃｏＲＶとＮｏｔＩで消化して、配列番号５のヌクレオチド１−１０３５を含有する断片を除去して、ＮｏｔＩ部位を平滑末端として、次に大きい方のベクター断片を再結合させることにより作成した。作成体ｍＧｌｕＲ３Ａは、２８ヌクレオチドの５’非翻訳配列（配列番号５のヌクレオチド１０３６−１０６３）、全ｍＧｌｕＲ３コーディング配列（配列番号５のヌクレオチド１０６４−３７０３）、および２１６ヌクレオチドの３’非翻訳配列（配列番号５のヌクレオチド３７０４−３９１９）を含有する。このｍＧｌｕＲ３Ａをコードする配列は、哺乳動物細胞中での発現のためにベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−３とｐＣＭＶ−Ｔ７−２からの制御成分に機能的に結合している。
【０１２５】
作成体ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ３Ｃ（ｍＧｌｕＲ３のＳＶ４０プロモーター制御発現に使用するため）を作成するために、ＭＥＴＡＢ４６の挿入体を有するｐＣＭＶ−Ｔ７−３プラスミドをＳｃａＩ／ＮｏｔＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子の３’部分と全ＭＥＴＡＢ４６挿入体を含有する断片を単離した。プラスミドｐＳＶβをＳｃａＩ／ＮｏｔＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子５’部分とＳＶ４０早期プロモーターおよびスプライス部位を含有する断片を、ＭＥＴＡＢ４６を有するｐＣＭＶ−Ｔ７−３ベクターからのＳｃａＩ／ＮｏｔＩ断片に結合させて、ｐＳＶ−ＭＥＴＡＢ４６を作成した。プラスミドｐＳＶ−ＭＥＴＡＢ４６をＳｃａＩ／Ｂｇｌ IIで消化し、アンピシリン耐性遺伝子の５’部分、ＳＶ４０早期プロモーターおよびスプライス部位そしてＭＥＴＡＢ４６の５’部分（配列番号５のヌクレオチド１−１６７１）を含有する断片を単離した。この断片を、作成体ｍＧｌｕＲ３ＢやｍＧｌｕＲ３Ｃで使用したものと同じＭＥＴＡＢ４８のＳｃａＩ／Ｂｇｌ II断片に結合させた。得られた作成体（ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ３Ｃ）は、ＳＶ４０プロモーターを含有し、ｍＧｌｕＲ３ ＤＮＡ（配列番号５のヌクレオチド１−３９１９を含有する）と機能的に結合したＳＶ４０スプライス部位が続き、この後にポリアデニル化シグナルが続く。
【０１２６】
Ｄ．ｍＧｌｕＲ２受容体ｃＤＮＡ
実施例１．Ｃ．に記載したようにヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーからクローンＭＥＴＡＢ４０を単離した。このＭＥＴＡＢ４０の挿入体ｃＤＮＡは長さが１１００塩基対であり、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体の３’末端（翻訳停止コドンと３’末端非翻訳配列を含む）をコードする。ＭＥＴＡＢ４０の最初の３５５ヌクレオチドは配列番号３に提供され、ＭＥＴＡＢ４０の最後の３４３ヌクレオチド（すべて３’非翻訳配列からである）は配列番号１３に提供される。
【０１２７】
ｍＧｌｕＲ２転写体の５’部分を示すＤＮＡを含有するクローンを単離するために、ＭＥＴＡＢ４０の５’末端に対応するオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションについて、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。ハイブリダイズするクローンを精製し、ＤＮＡ配列解析により性状解析する。ＭＥＴＡＢ４０に重複し翻訳開始コドンを含有するクローンを、適当な制限部位でＭＥＴＡＢ４０に結合させて、全長ｍＧｌｕＲ２をコードするｃＤＮＡ作成体を作成することができる。
【実施例２】
【０１２８】
卵母細胞中の組換えヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の発現
ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡを含有する作成体から調製したインビトロ転写体を、ツノガエル（Xenopus）卵母細胞に注入した。２電極の電位固定法（例えば、スツマー（Stuhmer）（1992）Meth. Enzymol. ２０７：３１９−３３９を参照）を用いて、卵母細胞トランスメンブレン電流の電気生理的測定を行なった。
【０１２９】
Ａ．インビトロ転写体の調製
作成体ｍＧｌｕＲ５ａ３中に含有されるメタボトロピック受容体ｃＤＮＡのキャップされた組換え転写体を、メガスクリプト（Megascript）キット（カタログ番号＃１３３４、アンビオン社（Ambion Inc.）、オースチン、テキサス州）を用いて、線状化したプラスミドから合成した。各合成転写体の質量を紫外吸光度法により測定し、各転写体の完全性をアガロースゲルの電気泳動により測定した。
【０１３０】
Ｂ．電気生理学
卵母細胞１つにつき、１０−５０ngのメタボトロピック受容体転写体を、ツノガエル（Xenopus）卵母細胞に注入した。卵母細胞の調製と注入は、ダスカル（Dascal）の方法［（１９８７）Crit. Rev. Biochem. ２２：３１７−３８７］に従って行なった。ｍＲＮＡ注入の２から６日後、２電極電位固定法を用いて卵母細胞を試験した。細胞はリンゲル溶液（１１５mM ＮａＣｌ、２．５mM ＫＣｌ、１．８mM ＣａＣｌ２、１０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．３）浴に浸漬し、膜電位は−８０から−１００mVに固定した。薬剤含有溶液の６０μlずつをピペットで直接浴に入れた。アクソテープ（AXOTAPE）バージョン１．２ソフトウェア（アクソン・インスツルメンツ（Axon Instruments）、フォスターシティ、カリホルニア州）を用いてＰＣ−３８６中のラボマスター（Labmaster）データ採取ボードを用いて２−５Hzでデータをサンプリングした。データをレーザープリンターに取り出すか、またはシグマプロット（Sigmaplot）バージョン５．０を用いてプロットした。
【０１３１】
メタボトロピック受容体調節化合物（すなわち、０．００１−０．１μMキスカル酸、０．１−１０μMグルタミン酸および０．１−３００μM １Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤ（１−アミノ−シクロペンチル−１，３−ジカルボン酸）を浴に適用し、トランスメンブレン電流を記録した。化合物の適用後相当の電流が検出された。種々の量の各化合物を適用後の電流を比較する用量応答試験で、電流の大きさは各化合物の濃度の上昇に伴い増加することが明らかになった。これらのデータを解析した結果、各化合物のＥＣ５０を計算することができ、これを化合物の相対電位の測定に使用した。
【実施例３】
【０１３２】
哺乳動物細胞におけるヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブユニットの組換え発現
ヒト胎児性腎（ＨＥＫ）細胞とチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（すなわち、ＤＧ４４細胞；ウーラウプ（Urlaub）ら（１９８６）Som. Cell. Molec. Genet. １２：５５５を参照）を、ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションさせた。種々の方法（例えば、イノシオトールリン酸（ＩＰ１）測定法、Ｃａ＋＋−感受性蛍光指示薬ベースの測定法、および［３Ｈ］−グルタミン酸結合測定法）を用いて、メタボトロピック受容体の発現について解析した。
【０１３３】
Ａ．ＨＥＫ２９３細胞の一時的トランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞を、ｍＧｌｕＲ５ａ（作成体ｍＧｌｕＲ５ａ２とｍＧｌｕＲ５ａ３および作成体ＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａ）受容体をコードするＤＮＡで一時的トランスフェクションを行なった。約２×１０６のＨＥＫ２９３細胞を標準的ＣａＰＯ４トランスフェクション法［ウィグラー（Wigler）ら、（１９７９）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A ７６：１３７３−１３７６を参照］に従い、目的のプラスミドの５−１８μg（あるトランスフェクション体においては０．１８μg、実施例３．Ｃ．２．を参照）で一時的にトランスフェクションした。さらにＣＭＶプロモーターに融合した大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する、プラスミドｐＣＭＶβｇａｌ（クロンテック・ラボラトリーズ（Clontech Laboratories）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）０．５−２μgを、レポーター遺伝子として同時トランスフェクションして、トランスフェクションの効率を追跡した。β−ガラクトシダーゼとＸ−ｇａｌ基質を含む反応の生成物の直接染色により、β−ガラクトシダーゼ発現についてトランスフェクション体を解析した［ジョーンズ（Jones）（１９８６）EMBO ５：３１３３−３１４２］。トランスフェクション体はまた、β−ガラクトシダーゼ活性の測定によるβ−ガラクトシダーゼ発現について解析することもできる［ミラー（Miller）（１９７２）分子遺伝子学実験（Experiments in Molecular Genetics）のPP. ３５２−３５５, コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）］。
【０１３４】
５μgのＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５Ａで一時的トランスフェクションを行なったＨＥＫ２９３細胞は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターに機能的に結合した糖質コルチコイド受容体をコードするＤＮＡを含有するｐＲＳｈＧＲ（ＡＴＣＣ整理番号６７２００）５μgと同時トランスフェクションをした。これらの細胞における糖質コルチコイド受容体の同時トランスフェクションは、細胞への糖質コルチコイド（例えば、デキサメタゾン）の添加によるＭＭＴＶプロモーター−ｍＧｌｕＲ５ａＤＮＡの発現の誘導を確実にする。
【０１３５】
ＨＥＫ細胞のこれらのトランスフェクションの効率は、標準的効率に典型的なものであった（すなわち、約５０％）。
【０１３６】
Ｂ．哺乳動物細胞の安定なトランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞、Ｌｔｋ−細胞およびＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞は、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて安定にトランスフェクションすることができる［Current Protocols in Molecular Biology, Vol.１，ワイリー・インターサイエンス（Wiley Inter-Science）、増刊１４号、単元９．１．１．−９．１．９（１９９０）］。ＣＨＯ細胞を宿主として使用するときは、ヒトメタボトロピック受容体をコードするｃＤＮＡの発現を制御するにはＳＶ４０プロモーターの使用が一般に好ましい。それぞれ１−２×１０６細胞を含有する１０cmのプレートを、メタボトロピック受容体をコードするＤＮＡ約５−１０μgと選択マーカー（例えば、ネオマイシン−耐性遺伝子（すなわち、ＨＥＫ２９３形質転換体の選択にはネオマイシン耐性遺伝子（すなわち、ｐＳＶ２ｎｅｏ）、Ｌｔｋ−細胞トランスフェクション体にはチミジンキナーゼ遺伝子、またはＤＧ４４細胞形質転換体の選択にはジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子））をコードするＤＮＡ ０．５−１μgを含有するＤＮＡ／リン酸カルシウム沈殿物でトランスフェクションする。適当な培地中で約１４日間の増殖の後、コロニーが形成され、クローニングシリンダーを用いて個々に単離される。次に単離物を限界希釈を行いスクリーニングして、例えば後述の方法を用いてメタボトロピック受容体を発現するものを同定する。
【０１３７】
Ｃ．トランスフェクション体の解析
１．蛍光指示薬に基づく測定
アゴニストによるＧ蛋白結合メタボトロピック受容体の活性化により、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解／細胞内Ｃａ＋＋シグナル化経路および／または阻害性ｃＡＭＰカスケードが刺激される。細胞内カルシウム濃度の一時的上昇の検出法は、ＰＩ加水分解／Ｃａ＋＋動員（mobilization）経路またはＰＩ加水分解／Ｃａ＋＋動員（mobilization）経路と阻害性ｃＡＭＰカスケードの両方にカップリングしたメタボトロピック受容体の機能性発現の解析に適用できる。細胞内カルシウムレベルを測定する１つの方法は、カルシウム感受性蛍光指示薬を用いる。
【０１３８】
フルオ−３（fluo−３）やフラ−２（fura−２）（モレキュラー・プローブズ社（Molecular Probes Inc.）、ユージーン（Eugene）、オレゴン州）のようなカルシウム感受性指示薬は、膜透過性であるアセトキシメチルエステルとして入手できる。アセトキシメチルエステル型の指示薬が細胞内に入ると、サイトゾル性エステラーゼによりエステル基は除去され、このため遊離の指示薬はサイトゾル内に捕捉される。遊離の指示薬とカルシウムが相互作用すると、指示薬の蛍光強度が増加する。従って、指示薬を含有する細胞の細胞内Ｃａ＋＋濃度の上昇は直接蛍光の増強（または、フラ−２を使用する時は、２つの波長での蛍光の比率の増強）として発現される。メタボトロピック受容体を測定するための自動蛍光検出装置が、本出願人の係属中の米国特許出願第０７／８１２，２５４号およびその対応するＰＣＴ特許出願ＵＳ９２／１１０９０号（参考のためその全体が本明細書中に引用される）に記載されている。さらに細胞内Ｃａ＋＋振動を目視できるようにするために蛍光イメージング法を使用することができる。
【０１３９】
ヒトｍＧｌｕＲ５ａ受容体をコードするＤＮＡで一時的トランスフェクションを行なったＨＥＫ細胞を、自動蛍光指示薬ベースの測定法と蛍光イメージング測定法を用いて、機能性組換えメタボトロピック受容体の発現について解析した。同様に、メタボトロピック受容体ＤＮＡで安定にトランスフェクションした細胞も、これらの測定法系を用いて機能性メタボトロピック受容体について解析した。
【０１４０】
ａ．自動蛍光測定法
２×１０５細胞／ウェルの濃度でポリ−Ｌ−リジンでプレコーティングし、２０μMフルオ−３、０．２％プルロニック（Pluronic）Ｆ−１２７をＨＢＳ（１２５mM ＮａＣｌ、５mM ＫＣｌ、１．８mM ＣａＣｌ２、０．６２mM ＭｇＣｌ２、２０mMグルコース、２０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．４）中に含有する培地中で、２０℃で２時間インキュベートしてフルオ−３を充填した９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク（Nunc）、カタログ番号１−６７０８、アラメダ・インダストリーズ（Alameda Industries）、エスコンジド（Escondido）、カリホルニア州）に、トランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞（またはｐＣＭＶ−Ｔ７−３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞）およびｍＧｌｕＲ５ａをコードするＤＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を広げた。次に細胞を測定緩衝液（すなわち、ＨＢＳ）で洗浄した。次にマイクロタイタープレートを蛍光プレートリーダー（例えば、フルオロスカン（Fluoroskan）II、ラボ・プロダクツ・インターナショナル社（Lab Products International, Ltd.）、ラレー（Raleigh）、ノースカロライナ州）に入れ、各ウェルの基礎蛍光を測定し記録してから、ウェルにキスカル酸、グルタミン酸、トランス−ＡＣＰＤ（１−アミノ−シクロペンタン−１，３−ジカルボン酸）、１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤ、ＡＰ３（２−アミノ−３−ホスホノプロピオン酸）、ＡＰ５（２−アミノ−５−ホスホノペンタノン酸）、およびＣＮＱＸ（６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン）を添加した。アゴニストの添加後ウェルの蛍光を繰り返し（０．６３秒間隔で７５回読む）追跡する。
【０１４１】
一般に、トランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞の蛍光は、これらの化合物のどれを添加しても変化しなかった。ｍＧｌｕＲ５ａ３またはＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａ作成体のいずれかで一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の蛍光は、グルタミン酸、キスカル酸、トランス−ＡＣＰＤ、または１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤの添加に応答して上昇した。蛍光はピーク値まで増加し、次に時間とともに化合物の添加前の細胞の基礎レベルまで低下した。ｍＧｌｕＲ５ａ２でトランスフェクションした細胞について、グルタミン酸、キスカル酸またはトランス−ＡＣＰＤ刺激蛍光の増強に対するＡＰ３、ＡＰ５またはＣＮＱＸの影響を調べた。これらの化合物（ＡＰ３、ＡＰ５、またはＣＮＱＸ）のいずれも、これらの細胞中のアゴニスト誘導蛍光増強を阻害しなかった。
【０１４２】
種々の量のグルタミン酸、キスカル酸または１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤを添加後に測定したピーク蛍光値を比較する用量応答試験で、ピーク蛍光の大きさは各化合物の濃度の上昇に伴い増加することが明らかになった。これらのデータを解析した結果、各化合物のＥＣ５０を計算することができ、これを化合物の相対電位の測定に使用した。
【０１４３】
ＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａおよびｐＲＳｈｇＧＲ（糖質コルチコイド受容体作成体）で一時的に同時トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞も、この蛍光測定法で解析した。これらの細胞の蛍光は１００μMのキスカル酸に応答して増加し、測定前に細胞をデキサメタゾン（約１Ｍ）で３７℃で１６時間プレインキュベートするとピーク応答は大きかった。
【０１４４】
ｂ．蛍光イメージング測定法
細胞内Ｃａ＋＋濃度のメタボトロピック受容体介在変化を目視できるようにするために、ｍＧｌｕＲ５ａ３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞とトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞（対照）を、デジタルビデオイメージングで解析した。暗所中で室温で２５分間細胞を１μMのフラ−２（アセトキシメチルエステル）に暴露することにより、トランスフェクション体（ガラス挿入底を有する３５mm培養皿あたり４×１０５細胞）をフラ−２で充填した。次に細胞をＤＭＥＭで３回そしてリンゲル溶液（１６０mM ＮａＣｌ、５mM ＫＣｌ、２mM ＣａＣｌ２、１mM ＭｇＣｌ２、１１mMグルコース、５mM ＨＥＰＥＳ、pH７．３）で４回洗浄した。
【０１４５】
次にトランスフェクション体と非トランスフェクション細胞を、紫外光源として１５０Ｗのキセノンランプを有するアキシオベルト（Axiovert）１００ＴＶ倒立顕微鏡（ツァイス（Zeiss）、オーベルコフレン（Oberkochren）、ドイツ）のステージの上に広げた。４０×１．３Ｎ．Ａ．油浸対物レンズを介して細胞を３４０nmと３８０nmで交互励起するのに、イメージ１フルオル（Fluor）システム（ユニバーサル・イメージング（Univeersal Imaging）、ウェストチェスター、ペンシルバニア州）を使用した。５１０nmより長い波長で出る光を、ＣＣＤ７２強化ＣＣＤカメラ（エム・ティー・アイ ダーゲ（ＭＴＩ Dage）、ミシガン・シティ、インディアナ州）により集め、デジタル化した。３４０nmと３８０nmの励起イメージからバックグランドの蛍光を差し引いた。補正値を使用して３４０／３８０強度比を計算した。較正していないフラ−２比は、細胞内Ｃａ＋＋濃度の変化の信頼できる指標である。
【０１４６】
較正していないフラ−２比を用いて、休止細胞内Ｃａ＋＋濃度（約１００nM）を紫色で、高細胞内Ｃａ＋＋濃度（約１μM）を赤色で疑色イメージを作成した。実験の各比率のイメージについて、定量解析のために、各細胞の１２×１２ピクセル領域内の平均比をソフトウェアにより計算し、さらに解析しグラフを描くために表に取り込んだ。
【０１４７】
ＨＥＫ２９３細胞は、ＰＩ加水分解／Ｃａ＋＋動員経路の受容体介在活性化に必要な細胞内成分を発現することを証明するために、トランスフェクション体と非トランスフェクション細胞（内因性Ｇ蛋白結合ムスカリン性アセチルコリン受容体を発現する）を１mMのカルバミルコリン（ＣＣｈ；ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト）に暴露し、細胞内Ｃａ＋＋濃度の上昇を追跡した。典型的には、イメージング試験でＣＣｈの添加に応答して、大多数の細胞の細胞内Ｃａ＋＋濃度の上昇が検出された。
【０１４８】
トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞およびトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞を、１００μMキスカル酸に応答して細胞内Ｃａ＋＋濃度が上昇するか否かについて追跡した。平均すると、非トランスフェクション細胞の細胞内Ｃａ＋＋濃度は、キスカル酸への暴露後増加しない。これに対して、トランスフェクションした細胞の２６．７±２２．３％のＣａ＋＋濃度は１００μMのキスカル酸の添加に応答して増加した。
【０１４９】
２．ホスファチジルイノシトール加水分解（ＩＰ１）測定法
Ｇ蛋白結合メタボトロピック受容体のアゴニストによる活性化により、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解経路が刺激されるため、ＰＩ加水分解の生成物（例えば、ＩＰ３、ＩＰ２またはＩＰ１）の増加を検出する方法は、ＰＩ加水分解／Ｃａ＋＋動員経路またはＰＩ加水分解／Ｃａ＋＋動員経路と阻害性ｃＡＭＰカスケードにカップリングしたメタボトロピック受容体の機能性発現の解析に応用することができる。ＰＩの加水分解により生成されるＩＰ１および／またはＩＰ２および／またはＩＰ３を測定する１つの方法は、細胞膜リン脂質内への［３Ｈ］−ミオ−イノシトールを取り込み、次に［３Ｈ］−ＩＰ１、［３Ｈ］−ＩＰ２および［３Ｈ］−ＩＰ３を分離し、以下のように各画分の放射能を定量する。
ｍＧｌｕＲ５ａ３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を、８×１０５細胞／ウェルで２４ウェルのマイクロタイタープレートに広げた。細胞を数時間沈降させ、プレートの底に付着させた後、２μCiの［３Ｈ］−ミオ−イノシトール（アマーシャム（Amersham）、カタログ番号＃ＰＴ６−２７１、アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州；比活性＝１７．７Ci／mmol）を各ウェルに添加し３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ニコンダイアフォト（Nikon Diaphot）倒立顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の形態の健常性を評価し、ウェルがコンフルエント（confluent）な細胞層を含有するか否かを測定した。次に培地を吸引し、細胞を０．５mlのクレブス重炭酸緩衝液［１１７．９mM ＮａＣｌ、４．７２mM ＫＣｌ、２．５４mM ＣａＣｌ２、１．１８mM ＭｇＳＯ４、１．１９mM ＫＨ２ＰＯ４、２５mM ＮａＨＣＯ３、１１．１mMデキストロース（９５％ Ｏ２、５％ ＣＯ２、pH７．４で平衡化されている）］で２回洗浄した。細胞を室温で４５分間インキュベートした。次に各ウェルから緩衝液を吸引し、細胞を洗浄し、０．５ml／ウェルで室温で４５分間インキュベートした。次に緩衝液を各ウェルから吸引し、次に１０mM ＮａＣｌの代わりに１０mMのＬｉＣｌを含有する４５０μlのクレブス重炭酸緩衝液（ＩＰ１のイノシトールと無機リンへの加水分解を防ぐために）とともに細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。
【０１５０】
メタボトロピック受容体調節化合物による細胞の処理を始める前に、５０μlのクレブス重炭酸緩衝液（対照）または化合物の最終濃度の１０×のものを各ウェルに添加し、４０分間インキュベートを続けた。各ウェルに１mlの氷冷メタノールを加えてインキュベートを停止させた。
【０１５１】
細胞からＩＰ１を単離するために、プラスチックピペットのチップでプレートの細胞を掻き取って、細胞懸濁物を１２×７５mmガラス試験管に移した。試験管を完全にボルテックス混合し、各反応混合物の１５０μl分（すなわち、総量の１０分の１）を別の試験管に移して蛋白を測定した。１mlのクロロホルムによる抽出により、放射標識膜リン脂質から水溶性リン酸イノシトールを分離した。試験管を室温で３０分間インキュベートした後、４℃で５００×ｇで５分間遠心分離した。［３Ｈ］−リン酸イノシトールを含有する水（上）層を、アクセルＱＭＡセパク（Accell ＱＭＡ ＳＥＰ−ＰＡＫ）カラム（ミリポア（Millipore）、カリホルニア州）に接続した１０mlのシリンジに移した（これは、２０mlのシンチレーションバイアルに集められるように変更したアマーシャム・スーパーセパレーター（Amersham Superseparator）装置に結合してある）。カートリッジに水（１０ml）を入れて［３Ｈ］−イノシトール前駆体を除き、次に４mlの０．０２Ｍトリエチルアンモニウム水素炭酸化緩衝液（ＴＥＡＢ、フルカ（Fluka）；ニューヨーク）を加えた。カートリッジから［３Ｈ］−ＩＰ１、［３Ｈ］−ＩＰ２そして［３Ｈ］−ＩＰ３を別々に除去するために、４mlの０．１Ｍ ＴＥＡＢ、４mlの０．３Ｍ ＴＥＡＢ、そして４mlの０．４Ｍ ＴＥＡＢをカートリッジに連続的に添加して、画分を溶出させ、大きいシンチレーションバイアルに採取した。エコルメ・カクテル（Ecolume cocktail）（１５ml；ＩＣＮ；カリホルニア州）を各バイアルに加え、次にシンチレーション計測して別々の画分の各ＩＰの量を測定した。蛋白濃度は、バイオラッド（Bio−Rad）蛋白マイクロ測定法（バイオラッド（Bio−Rad）、リッチモンド、カリホルニア州）を用いて測定した。
【０１５２】
この測定法で測定した時、１８μgのｍＧｌｕＲ５ａ３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞は、比較的高い基礎レベルのＩＰ１を示した。しかし、０．１８μgのｍＧｌｕＲ５ａ３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞は、低い基礎ＩＰ１レベルを示し、１mMのグルタミン酸、１mMのキスカル酸または１mMの１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤで処理した時はＩＰ１レベルの検出できる増加を示した。ＩＰ１レベルのキスカル酸に誘導される増加は、１mMのＡＰ３により影響を受けなかった。
【０１５３】
ｍＧｌｕＲ５ａ３でトランスフェクションした細胞に、種々の濃度のグルタミン酸、キスカル酸または１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤの添加後測定したＩＰ１レベルを比較した用量応答試験では、各化合物の濃度の上昇とともにＩＰ１レベルが増加することを示していた。これらのデータの解析により、各化合物のＥＣ５０を計算することができ、これを化合物の相対電位の測定に使用した。
【０１５４】
３．メタボトロピック受容体リガンド結合測定法
ｍＧｌｕＲ５ａ３またはｐＵＣ１９（陰性対照）で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ細胞を、［３Ｈ］−グルタミン酸結合について解析した。陽性対照として結合測定法にラット脳の膜を加えた。
【０１５５】
ａ．膜の調製
ｉ．ラット前脳膜
シェープ（Schoepp）ら［（１９９２）Neurosci. Lett. １４５：１００］が記載したように、ラット前脳膜を調製した。簡単に説明すると、１０個のラット脳からの基本的に脳皮質、線条体と海馬よりなる前脳を、２．５mM ＣａＣｌ２、pH７．６を含有する５０部の３０mMの氷冷トリス−塩酸中で、ポリトロン（Polytron）（ブリンクマン（Brinkman）、ウェストベリー（Westbury）、ニューヨーク州））を用いてホモゲナイズした。ホモゲネートを４℃で３０、０００×ｇで１５分間遠心分離した。上澄液を捨て、ポリトロンを用いてペレットを５０部の緩衝液に再懸濁し、懸濁物を３０、０００×ｇで１５分間遠心分離した。この工程を２回繰り返した。ペレットを緩衝液に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。次に懸濁物を４℃で３０、０００×ｇで１５分間遠心分離した。この工程を３回繰り返した。最終ペレットを１５部の５０mM トリス−塩酸、pH７．６に再懸濁し、分注し、急速に凍結し、−７０℃で保存した。
【０１５６】
ii．トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞およびトランスフェクションしないＨＥＫ２９３細胞の膜
ｍＧｌｕＲ５ａをコードするＤＮＡまたはｐＵＣ１９（陰性対照）でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から膜を調製するために、組織培養プレートから細胞を掻き取り、プレートを５mlのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水：１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７mM ＫＨ２ＰＯ４）で洗浄した。卓上型遠心分離機で細胞を低速度で遠心分離し、細胞ペレットをＰＢＳで洗浄した。０．５mM ＰＭＳＦ、pH７．６を含有する５０mMトリス−塩酸２０部に、細胞ペレットを再懸濁した。ダウンス（Dounce）（テフロン（登録商標）／ガラス）ホモゲナイザー中で１０−２０ストロークを用いて、細胞を氷の上でホモゲナイズした。ホモゲネートを４℃で１２０、０００×ｇで３０分間遠心分離した。最終の膜ペレットを、０．５mM ＰＭＳＦ、pH７．６を含有する５０mMトリス−塩酸再懸濁した。膜調製物を分注し、急速に凍結し、−７０１℃で保存した。蛋白濃度は、ブラッドフォード（Bradford）［（１９７６）Anal. Biochem.７２：２４８］の方法で測定した。
【０１５７】
ｂ．［３Ｈ］−グルタミン酸結合測定法
ラット前脳の膜中のメタボトロピック受容体への［３Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合は、基本的にシェープ（Schoepp）ら（前述）が記載したように調製した。測定の日に凍結ホモゲネートを融解し、５０mMトリス−塩酸、pH７．６で３回洗浄した。最終ペレットを５０mMトリス−塩酸、pH７．６に再懸濁した。蛋白濃度は、ブラッドフォード（Bradford）［（１９７６）Anal. Biochem.７２：２４８］の方法で測定した。懸濁物を３０、０００×ｇで１５分間遠心分離し、ペレットを１mg／mlの濃度で測定緩衝液（５０mMトリス−塩酸、０．５mM ＰＭＳＦ、０．１％ＢＳＡ、pH７．６）に再懸濁した。膜懸濁物を、総量０．５mlの測定緩衝液［イオノトロピックグルタミン酸受容体への［３Ｈ］−グルタミン酸の結合を組織するために、１００μM ＮＭＤＡ（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）、１００μM ＡＭＰＡおよび１００μMカイニン酸（リサーチ・バイオケミカルズ社（Research Biochemiclas Inc）、ナチック（Natick）、マサチューセッツ州）を含有し、塩化物依存性摂取部位への［３Ｈ］−グルタミン酸の結合を阻害するために、１００μM ＳＩＴＳ（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）を含有する］中で、３重測定で１０または１００nMの［３Ｈ］−グルタミン酸（ニュー・イングランド・ニュクレア（New England Nuclear）、ボストン、マサチューセッツ州；カタログ番号ＮＥＴ−４９０、比活性＝５７．４Ci／mmol）と、氷上で４５分間インキュベートした。ＳＭ−２４ローター（ソーバル（Sorvall）、ウィルミントン（Wilmington）、デラウェア（Delaware））中で４℃で２０、０００×ｇで５分間遠心分離して、結合した放射能を遊離の放射能から分離した。ペレットを５−６mlの氷冷５０mMトリス−塩酸、pH７．６で２回洗浄した。ペレットを５mlのエコルメシンチレーションカクテル（Ecolume scintillation cocktail）中でボルテックス混合して可溶化させた。ベックマン（Beckman）シンチレーション計測機で放射能を測定した。総結合量から、１mMのグルタミン酸の存在下で得られた非特異的結合量を引いて、特異的結合量を求めた。
【０１５８】
ｍＧｌｕＲ５ａをコードするＤＮＡまたはｐＵＣ１９でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への［３Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合を、基本的にラット脳の膜への結合の測定で記載したように測定したが、若干の修飾を行なった。測定の日に凍結ホモゲネートを融解し、ＭＲ−１５０高速冷却マイクロ遠心分離機（ペニンスラ・ラボラトリーズ社（Peninsula Laboratories Inc.）、ベルモント（Belmont）、カリホルニア州）で遠心分離した。ペレットを測定緩衝液（５０mMトリス−塩酸、０．５mM ＰＭＳＦ、０．１％ＢＳＡ、pH７．６）で２回洗浄し、最終ペレットを１mg／mlの濃度で測定緩衝液に再懸濁した。ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡおよびカイニン酸を測定混合物から除きながら、ＨＥＫ２９３細胞を［３Ｈ］−グルタミン酸への結合について解析した。
【０１５９】
２００μgの膜と１００nMの［３Ｈ］−グルタミン酸を用いて、ラット脳の膜への［３Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合を測定した。総結合量対非特異結合量の比は約２：１であった。
【０１６０】
ｍＧｌｕＲ５ａ３またはｐＵＣ１９でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への［３Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合を、２００μgの膜と１００nMの［３Ｈ］−グルタミン酸を用いて測定した。ｍＧｌｕＲ５ａ３でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への特異的結合量は、ｐＵＣ１９でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への結合量より有意に高かった。競合結合試験を行い、種々の濃度の非標識グルタミン酸の存在下でｍＧｌｕＲ５ａ３でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への［３Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合の量を測定した。これらの試験で得られたデータからＩＣ５０値を求めた。
【０１６１】
４．サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）測定
ａ．ＲＩＡベースの測定
ある種のＧ蛋白結合受容体の活性化は、ｃＡＭＰの（増加ではなく）低下を引き起こすため、細胞内ｃＡＭＰレベルの測定法は、哺乳動物宿主細胞中で発現される組換えヒトメタボトロピック受容体を評価するのに使用される。ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡまたはｐＵＣ１９（陰性対照）で一時的にまたは安定にトランスフェクションした哺乳動物細胞を、５×１０５細胞／ウェルの濃度で２４ウェルのマイクロタイタープレートに広げ、一晩インキュベートさせる。翌日、ニコンダイアフォト（Nikon Diaphot）倒立顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の形態の健常性を評価し、ウェルはコンフルエントな細胞層を含有するか否かを測定した。次に培地を吸引し、細胞を、１mMのＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン；シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）と０．１％ＢＳＡを含有するクレブス重炭酸緩衝液０．５ml（ＰＩ加水分解測定法で使用したものと同じ緩衝液：実施例３．Ｃ．２を参照）で２回洗浄した。あるいはクレブス重炭酸緩衝液の代わりに１×ＰＢＳを使用することもできる。各洗浄の後に３７℃で３０分間インキュベートを行う。各ウェルから緩衝液を吸引し、次に細胞を、１mMのＩＢＭＸと０．１％ＢＳＡを含有する０．２mlのクレブス重炭酸緩衝液で３７℃で２０分間インキュベートする。
【０１６２】
メタボトロピック受容体調節化合物による細胞の処理を始める前に、５０μlのクレブス重炭酸緩衝液（最終濃度の５×のフォルスコリンの有りまたは無し）を、一部の細胞（基礎対照）に加え、一部の細胞（試験細胞）に最小濃度の５×の化合物および最終濃度の５×のフォルスコリンを加え、３７℃で１５分間インキュベートする。１５分間のインキュベートの最後に、１％トリトンＸ−１００溶液２５μlを加えて反応を停止させ、インキュベートをさらに１０分間続ける。溶解した細胞および細胞懸濁物を、プラスチックピペットのチップで１２×７５mmのポリプロピレン試験管に移す。各ウェルを、１mMのＩＢＭＸと０．１％ＢＳＡを含有するクレブス重炭酸緩衝液７５μlで洗浄する。洗浄物を細胞溶解物を一緒にする。細胞溶解懸濁物を２３００×ｇで５分間遠心分離し、ＲＩＡキット（アマーシャム・ライフサイエンシーズ（Amersham Life Sciences）カタログ＃ＴＲＫ４３２；アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）を用いて、上澄液のｃＡＭＰレベルを測定する。
【０１６３】
ｂ．サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルに基づく測定法
５％の規定補足ウシ血清（ハイクローン（Hyclone））を含有するダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ギブコ（ＧＩＢＣＯ））（１００Ｕ／mlのペニシリンと１００μg／mlの硫酸ストレプトマイシンを含む）中で、ＨＥＫ２９３細胞を単層で増殖させた（１０cmのポリ−Ｄ−リジン被覆プレート当たり約２×１０６細胞）。ＣＭＶプロモーターに結合した５μgのｐＣＭＶ−ＯＣＮＡ（嗅覚性サイクリックヌクレオチドゲートのチャネル（ダレン（Dhallen）らを参照、前述）、２μgのｐＣＭＶ−βｇａｌ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）、および対照プラスミドとしての１３μgのｐＵＣ１９を用いて、細胞をリン酸カルシウム法（アウスベル（Ausubel）ら、前述、pp９．１．１−９．１．７）で一時的にトランスフェクションした。ベクターｐＣＭＶ−ＯＣＮＡは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳからの約３．０kbのＥｃｏＲＩ断片として嗅覚性サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルをコードするＤＮＡを単離し、得られた断片をＥｃｏＲＩ消化ｐＣＭＶ−Ｔ７−３に結合させることにより、作成した。トランスフェクションの６時間後、リン酸カルシウム沈殿物を洗い流し、１０％透析胎児牛血清（ハイクローン（Hyclone））、１００Ｕ／mlのペニシリン、１００μg／mlのストレプトマイシン、および２mMグルタミンが補足されたＤＭＥＭを細胞に与えた。β−ガラクトシダーゼ活性の測定によるトランスフェクション効率は、５０−７０％であった。
【０１６４】
嗅覚性サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルＤＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ細胞を、２４−４８時間インキュベートしてから、機能を試験した。まず、細胞質の面に達するｃＡＭＰの濃度が調節できるように（例えば、単一チャネル記録（Single Channel Recording）、サクマンとネヘル（Sakman and Neher）編、プレヌム・プレス（Plenum Press）、ニューヨーク、（１９８３））、トランスフェクションした細胞から引っ張った裏返した膜パッチを用いて、電気生理学的にチャネルの活性を測定した。パッチの両面を、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないリンゲル液に接触させた。１つのパッチでは、１mMのｃＡＭＰの存在下で膜電位を−１００から＋１００mVへ２秒で勾配をつけて電流を発生させた。この結果は、チャネルが機能的に発現されていることを示唆していた。
【０１６５】
トランスフェクション体もまた、細胞内カルシウムレベル（［Ｃａ＋＋］）の単細胞ビデオイメージングにより解析した。この方法は、細胞内カルシウムレベルの測定（これはチャネルのサイクリックヌクレオチド活性化により制御される、チャネルを介するカルシウムの流入量とともに変化する）によるサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルの分析を可能にする。イメジーング測定法は、基本的に実施例３．Ｃ．１．ｂに記載のように実施したが、若干の修飾を行なった。色素を充填後、細胞をツァイスアクシオヴェルト（Zeiss Axiovert）顕微鏡と１００Ｗの水銀ランプ、デージ（Dage）増強ＣＣＤカメラ、そしてイメージ−１（Image−１）ハードウェアとイメージ処理のソフトウェアを用いて観察した。このソフトウェアは、２０×１．３Ｎ．Ａ．油浸対物レンズを介して細胞を３５０nmと３８５nmの交互励起を調節した（典型的には５秒毎）。５１０nmより長い波長で出る光を、ＣＣＤカメラにより集め、デジタル化し、３５０nmと３８５nmの励起イメージからバックグランドの発光を差し引いた後、３５０／３８５強度比を計算した。
【０１６６】
定量的解析のために、実験の各比率イメージについてソフトウェアにより各細胞の１２×１２ピクセル領域内の３５０／３８５平均比を計算し、さらに解析しグラフを描くために表に取り込んだ。フラ−２シグナルを未変性の細胞で較正し、細胞をリンゲル液（１０μMイオノマイシン、１０mM ＥＧＴＡを含有し、およびＣａ＋＋の添加無し）に接触させてＲｍｉｎを得た。次に細胞をリンゲル液（１０μMイオノマイシン、１０mM Ｃａ＋＋を含有する）に接触させて３回洗浄してＲｍａｘを得た。生きている細胞中のフラ−２のＫｄ２５０nMとグリンキーウイックツ（Grynkiewicz）ら（J. Biol. Chem.２６０：３４４０（１９８５））を使用して、静止［Ｃａ＋＋］ｉは典型的には１００nMであった。
【０１６７】
これらの実験で、細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる物質にＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション体を暴露し、以後の［Ｃａ＋＋］ｉの変化を追跡した。１００μMのフォルスコリン（アデニルシクラーゼのアクチベータ）の添加に応答して、６４個の細胞の平均した結果と各細胞で、［Ｃａ＋＋］ｉにわずかな増加が見られた。１mMのＩＢＭＸ（ｃＡＭＰホスホジエステラーゼの阻害剤）の添加後、さらに有意な増加が見られた。対照実験では、６４個の非トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞中の１つのみが、細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇に対応して、［Ｃａ＋＋］ｉの増加を示した。この応答は一時的であり、サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルＤＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞中で見られた持続性応答とは明らかに異なっていた。
【０１６８】
これらの結果は、サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルを発現するＨＥＫ細胞は、活性化された時細胞内サイクリックヌクレオチドレベルに変化を引き起こす受容体（例えば、メタボトロピック受容体）の測定において宿主細胞として使用できることを証明している。
【０１６９】
５．ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析
ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションした細胞はまた、ノーザンブロット解析により対応する転写体の発現について解析することができる。ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションした約１×１０７個の細胞から総ＲＮＡを単離し、１０−１５μgのＲＮＡをノーザンハイブリダイゼーション解析に使用した。ヒトメタボトロピック受容体をコードするプラスミドからの挿入体をニックトランスレーションし、プローブとして使用した。ノーザンブロットハイブリダイゼーションの典型的な条件は以下の通りである：
ハイブリダイゼーションは、４２℃で５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５０％ホルムアルミド中で行ない、洗浄は６５℃で０．２×ＳＳＰＥと０．１％ＳＤＳ中で行なった。
【０１７０】
本発明をいくつかの好適な実施態様を参照して詳細に説明したが、ここに記載され特許請求のされている本発明の精神と範囲を逸脱することなくその修飾や変更が可能であることが理解されるであろう。
【０１７１】
（配列の要約）
配列番号１は、本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ（ｍＧｌｕＲ１Ｂ）をコードするＤＮＡの核酸配列（およびその推定アミノ酸配列）である。
配列番号２は、配列番号１のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの一部をコードする部分クローンのヌクレオチド配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号４は、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされるヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの一部のアミノ酸配列である。
配列番号５は、本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ（ｍＧｌｕＲ３）をコードするＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号６は、配列番号５のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号７は、本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ５ａ１）をコードするＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号８は、配列番号７のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号９は、本発明のｍＧｌｕＲ５変種メタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ５ｂ）をコードするＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号１０は、配列番号９のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号１１は、本発明のｍＧｌｕＲ５変種メタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ５ｃ）をコードするＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号１２は、配列番号１１のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号１３は、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの３’非翻訳配列の３４３ヌクレオチドである。
【０１７２】
（配列表）
（１）一般情報：
（i） 出願人：ダゲット，ロリー（Daggett, Lorrie）
エリス，スティーブン・ビー（Ellis, Steven B.）
ルー，チェン（Lu, Chen）
ポンツラー，アーロン（Pontsler, Aaron）
ジョンソン，エドウィン・シー（Johnson, Edwin C.）
ヘス，ステファン・ディー（Hess, Stephen D.）
（ii）発明の名称：ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体、これをコードする核酸およびその用途
（iii）配列の数：１３
（iv）連絡住所：
（Ａ）宛名：プリティー、シュレーダー、ブルーゲマンおよびクラーク（Pretty, Schroeder, Brueggemann & Clark）
（Ｂ）通り：４４４サウス・フラワー通り、スイート２０００（444 South Flower Street, Suite 2000 ）
（Ｃ）市：ロサンゼルス
（Ｄ）州：カリホルニア
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号：９００７１
（v） コンピューターで読める形式：
（Ａ）媒体の型：フロッピー（登録商標）ディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．０（PatentIn Release #1.0）、バージョン＃１．２５
（vi）現行出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：１９９４年６月２日
（Ｃ）分類：
（vii）先行出願のデータ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ０８／０７２、５７４
（Ｂ）出願日：１９９３年６月４日
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：ライター，ステファン・イー（Reiter, Stephen E.）
（Ｂ）登録番号：３１，１９２
（Ｃ）参照／整理番号：ＦＰ４１ ９７７２
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話：６１９−５４６−４７３７
（Ｂ）ファックス：６１９−５４６−９３９２
（２）配列番号：１の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：３３２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：３８８．．３１０８
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ヒトｍＧｌｕＲ１Ｂ”
（xi）配列：配列番号：１：
【０１７３】
（２）配列番号：２の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：９０６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白
（xi）配列：配列番号：２：
【０１７４】
（２）配列番号：３の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：３５５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．３５４
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ヒトｍＧｌｕＲ２断片”
（xi）配列：配列番号：３：
【０１７５】
（２）配列番号：４の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：１１８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白
（xi）配列：配列番号：４：
【０１７６】
（２）配列番号：５の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：３９１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１０６４．．３７０３
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ヒトｍＧｌｕＲ３”
（xi）配列：配列番号：５：
【０１７７】
（２）配列番号：６の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：８７９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白
（xi）配列：配列番号：６：
【０１７８】
（２）配列番号：７の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：４０８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：３７０．．３９１２
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ヒトｍＧｌｕＲ５Ａ”
（xi）配列：配列番号：７：
【０１７９】
（２）配列番号：８の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：１１８０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白
（xi）配列：配列番号：８：
【０１８０】
（２）配列番号：９の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：４１８１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：３７０．．４００８
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ヒトｍＧｌｕＲ５Ｂ”／注＝“ヌクレオチド２９９８と２９９９の間に９６塩基対が挿入されたｍＧｌｕＲ５Ａ変種”
（xi）配列：配列番号：９：
【０１８１】
（２）配列番号：１０の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：１２１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白
（xi）配列：配列番号：１０：
【０１８２】
（２）配列番号：１１の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：３２８２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：３７０．．３００３
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ヒトｍＧｌｕＲ５Ｃ”／注＝“３’末端が切り取られたｍＧｌｕＲ５ａの変種”
（xi）配列：配列番号：１１：
【０１８３】
（２）配列番号：１２の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：８７７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白
（xi）配列：配列番号：１２：
【０１８４】
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：３４３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：種々の特徴
（Ｂ）存在位置：１．．３４３
（Ｄ）他の情報：／注＝“ｍＧｌｕＲ２の部分配列−３’非翻訳配列”
（xi）配列：配列番号：１３：
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】図１は、ＣＭＶプロモーターをベースにしたベクターであるｐＣＭＶ−Ｔ７−２とｐＣＭＶ−Ｔ７−３を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸とこれによりコードされる受容体蛋白に関する。本発明の核酸は、新規のヒトメタボトロピック（metabotropic）グルタミン酸受容体サブタイプをコードする核酸に関する。本発明はまたこのような受容体サブタイプの作成方法、およびこのような受容体の機能に影響を与える化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、およびヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体のアロステリックモジュレーター）の同定および性状解析のための受容体蛋白の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸のＬ−グルタミン酸は、哺乳動物の中枢神経系の主要な興奮性神経伝達物質である。解剖学的、生化学的および電気生理学的分析は、グルタミン酸産生系が広範囲のニューロン作用過程（例えば、急速な興奮性シナプス伝達、神経伝達物質放出の制御、長期増強、学習および記憶、成長性シナプス可塑性、低酸素性虚血傷害およびニューロン細胞の死、てんかん様発作、およびいくつかの神経変性障害の病変性）に関与していることを示唆している。一般的には、モナガン（Monaghan）ら、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.，２９：３６５−４０２（１９８０）を参照。この広範囲の機能（特に学習、神経毒性および神経病理に関する機能）のために、近年グルタミン酸の作用機構を説明し規定しようという研究が始まった。
【０００３】
現在グルタミン酸受容体の分類の概要は、薬理学的基準に基づいている。グルタミン酸は、２つの主要な受容体（イオノトロピック（ionotropic）受容体とメタボトロピック（metabotropic）受容体）に分類されている受容体を介してその作用を媒介することが認められている。イオノトロピックグルタミン酸受容体は、完全な陽イオン特異的、リガンドゲート（ligand-gated）のイオンチャネルを含有し、メタボトロピックグルタミン酸受容体は、細胞内第二メッセンジャー系の活性化を介して細胞外シグナルを変換するＧ蛋白結合受容体である。イオノトロピック受容体は、受容体の薬理学的および機能的性質に基づきさらに少なくとも２つの範疇に分類されている。その２つの主要な型のイオノトロピック受容体は、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体とカイニン酸（ＫＡ）／ＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）（以前はキスカル酸、すなわちＱＵＩＳと呼ばれていた）受容体である。メタボトロピック受容体はイオノトロピックグルタミン酸受容体が結合するリガンドと同じリガンドのいくつかに結合するが、メタボトロピック受容体はＧＴＰ−結合蛋白および第二メッセンジャー（例えば、サイクリックＡＭＰ、サイクリックＧＭＰ、ジアシルグリセロール、イノシトール１，４，５−三リン酸およびカルシウム）を介してシナプスの生理機能を変更させる［例えば、グンデルセン（Gundersen）ら、Proc. R. Soc. London Ser. ２２１：１２７（１９８４）；スラデツェック（Sladeczek）ら、Nature ３１７：７１７（１９８５）；ニコレッティ（Nicoletti）ら、J. Neurosci. ６：１９０５（１９８６）；スギヤマ（Sugiyama）ら、Nature ３２５：５３１（１９８７）］。
【０００４】
メタボトロピックグルタミン酸受容体の電気生理学的および薬理学的性質は、受容体供給源として動物組織や細胞株、および非ヒト組換え受容体を用いて研究されている。ヒトの治療薬開発へのそのような研究の意義は、ヒトでない受容体サブユニットのみしか入手できないことにより限定されている。さらに、メタボトロピックグルタミン酸受容体の特性や構造が分子レベルで研究され出したのはつい最近である。しかしこのような研究は、ヒト以外の種でのみ行われている。メタボトロピックグルタミン酸受容体の生理学的および病理学的重要性の可能性により、グルタミン酸受容体の種々のクラスの代表的メンバーをコードするヒトの配列（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白）が利用（例えば、薬剤スクリーニング測定法のために）できることが必要である。そのようなヒトの配列が入手できれば、ヒトでの受容体の分布の研究、特定の受容体の修飾と種々の疾患の発生の関係の研究も可能になるであろう。
【非特許文献１】グンデルセン（Gundersen）ら、Proc. R. Soc. London Ser. ２２１：１２７（１９８４）
【非特許文献２】スラデツェック（Sladeczek）ら、Nature ３１７：７１７（１９８５）
【非特許文献３】ニコレッティ（Nicoletti）ら、J. Neurosci. ６：１９０５（１９８６）
【非特許文献４】スギヤマ（Sugiyama）ら、Nature ３２５：５３１（１９８７）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（本発明の概要）
本発明は、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプをコードする新規の核酸、およびこれにコードされる蛋白を開示する。具体的な実施態様において、新規の核酸は、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の全長ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３およびｍＧｌｕＲ５サブタイプまたはその一部をコードする。これらの核酸はメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ蛋白の産生に有用である以外に、プローブとしても有用であり、従って当業者は不要な実験をすることなく、関連する受容体サブタイプをコードする核酸を同定し単離することが可能である。
【０００６】
本発明は、新規のメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプを開示する以外に、このような受容体に影響を与える化合物（例えば、グルタミン酸受容体機能のアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーター（活性調節因子））を同定し性状解析するための、このような受容体サブタイプの使用方法を包含する。また本発明は、未知の蛋白がメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプとして機能するか否かを測定する方法を包含する。
【０００７】
（本発明の詳細な説明）
本発明において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする単離された核酸が提供される。本発明の１つの面において、ｍＧｌｕＲ１サブタイプのヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする核酸が提供される。別の面において、ｍＧｌｕＲ２サブタイプのメタボトロピックグルタミン酸受容体の少なくとも１部分をコードする核酸が提供される。さらに別の面において、ｍＧｌｕＲ３サブタイプのメタボトロピックグルタミン酸受容体をコードする核酸が提供される。さらなる面において、ｍＧｌｕＲ５サブタイプのメタボトロピックグルタミン酸受容体をコードする核酸が提供される。さらに別の面において、そのような核酸を含有する真核細胞、およびそのような核酸を発現する真核細胞が提供される。
【０００８】
また前述の核酸によりコードされる蛋白、および該蛋白に対して産生される抗体が提供される。本発明の別の面において、上記核酸のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ−選択性部分よりなる核酸プローブが提供される。
【０００９】
本明細書において、「ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ」とは、グルタミン酸産生リガンドに対する細胞のＧ−蛋白結合応答に参加する、単離されたおよび／または精製された蛋白を意味する。このような受容体サブタイプは、他のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードしない別々の遺伝子により個々にコードされる（すなわち、各サブタイプはユニークな遺伝子によりコードされる）。このような受容体サブタイプの典型的な特徴は、７つの推定されるトランスメンブレンドメインと、その前に大きな推定される細胞外アミノ末端ドメインと、その後に大きな推定される細胞内カルボキシ末端ドメインを有することである。メタボトロピックグルタミン酸受容体は、基本的にメタボトロピックグルタミン酸受容体でない他のＧ蛋白結合受容体と全くアミノ酸配列相同性を有さない。
【００１０】
メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの各々の間の関係に関して、ｍＧｌｕＲ１受容体サブタイプのアミノ酸配列は一般に、他のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプのアミノ酸配列との同一性は約７０％未満であり、典型的に観察される同一性は４５％未満である。ｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプのアミノ酸配列は一般に、他のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプのアミノ酸配列との同一性は約６０％未満であり、典型的に観察される同一性は４５％未満である。ｍＧｌｕＲ３受容体サブタイプのアミノ酸配列は一般に、他のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプのアミノ酸配列との同一性は約６０％未満であり、典型的に観察される同一性は４５％未満である。ｍＧｌｕＲ５受容体サブタイプのアミノ酸配列は一般に、他のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプのアミノ酸配列との同一性は約７０％未満であり、典型的に観察される同一性は４５％未満である。
【００１１】
上記定義に含まれるものは、一次転写体の別のスプライシングにより産生されるｍＲＮＡによりコードされる変種、および上記の生理学的および／または物理的性質の１つまたはそれ以上を有するその断片である。
【００１２】
本明細書および請求の範囲において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白の修飾物質としての「単離される」、「純粋な」という用語は、このように呼ばれるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白はヒトの手によりそのような形で産生され、従ってその本来のインビボの細胞環境からは分離されていることを示す。このヒトの介入による結果、本発明の組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよび蛋白は、天然に存在するＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白では役に立たないような方法（例えば、選択的薬剤または化合物の同定）において有用である。
【００１３】
本発明の受容体蛋白の修飾物質として使用される時、「機能性」とは、グルタミン酸産生関連リガンド（例えばＡＣＰＤまたはＡＣＰＤ様リガンド、ＱＵＩＳ、ＡＰ４など）に受容体蛋白に結合すると、Ｇ蛋白との受容体の相互作用を修飾し、これは細胞内第２メッセンジャーのレベルに影響を与え、種々の生理学的作用を引き起こす。言い換えると「機能性」とは、受容体蛋白のアゴニスト活性化の結果として応答が産生されることを意味する。
【００１４】
本明細書においてスプライス変種とは、ゲノムＤＮＡの一次転写体の差別的処理により産生され、その結果２つ以上の型のｍＲＮＡの産生に至る、変種メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする核酸を意味する。差別的に処理された一次転写体から得られるｃＤＮＡは、アミノ酸が完全に同一の領域と、異なるアミノ酸配列を有する領域を有する、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするであろう。すなわち同じゲノム配列から、多数の関連するｍＲＮＡや蛋白が得られる。得られるｍＲＮＡや蛋白はいずれも本明細書では「スプライス変種」と呼ぶ。
【００１５】
従って、前記で定義したメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするが、遺伝コードの縮重のため特定のハイブリダイゼーション条件下で開示された核酸に必ずしもハイブリダイズしない核酸も、本発明の範囲内にあると考えられる。本明細書に記載の方法または当業者に公知の方法により評価すると、そのようなサブタイプもまた、機能性受容体を形成する。典型的には、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプが代替スプライシングにより得られるＲＮＡにコードされない（すなわち、スプライス変種）なら、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする核酸とこれによりコードされるメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白は、本明細書に記載の少なくとも１つのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ核酸（およびこれによりコードされる蛋白）と実質的な配列相同性を有する。スプライス変種をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で提供されるＤＮＡまたはＲＮＡとの配列全体の相同性は９０％未満であるが、本明細書中のＤＮＡ断片とほとんど１００％の相同性を有する領域を含有し、開始コドンおよび停止コドンを含むオープンリーディングフレームをコードし、機能性メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードすることを理解すべきである。
【００１６】
ヒトｍＧｌｕＲ１サブタイプをコードするＤＮＡ配列の例は、配列番号２に記載されるものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドにより示される。現在好適な配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする。
【００１７】
別のＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ１サブタイプをコードし、高緊縮性条件下で配列番号１の実質的に配列全体、またはその大部分（すなわち、典型的には少なくともその２５−３０個の隣接ヌクレオチド）にハイブリダイズするヌクレオチドであることが特徴である。
【００１８】
本明細書において、ハイブリダイゼーションの緊縮性とは、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を意味する。当業者に公知なように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。
【００１９】
Ｔｍは、
式： 81.5℃−16.6（log１０［Ｎａ＋］）＋0.41（％Ｇ＋Ｃ）−600／ｌ
（式中、ｌはヌクレオチド中のハイブリッドの長さである）により近似的に表される。
【００２０】
配列の相同性が１％減少する毎に、Ｔｍは約１−１．５℃低下する。一般にハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応を低緊縮性条件下で行い、次に種々の（ただし、より高い緊縮性の）条件下で洗浄する。ハイブリダイゼーション緊縮性は、このような洗浄条件に関する。
【００２１】
すなわち、本明細書において、
（１）断片のハイブリダイゼーションに関して、高緊縮性条件とは、６５℃で０．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する（すなわち、本明細書で企図されるように、もしハイブリッドが６５℃で０．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定でない場合、高緊縮性条件下で安定ではないであろう）。高緊縮性条件は、例えば５０％ホルムアミド、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で４２℃でハイブリダイゼーションし、次に６５℃で０．１×ＳＳＰＥ、そして０．１％ＳＤＳによる洗浄により提供される。
（２）断片のハイブリダイゼーションに関して、中緊縮性条件とは、４２℃で５０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションし、次に６５℃で０．２×ＳＳＰＥ、そして０．２％ＳＤＳによる洗浄と同等の条件を意味する。
（３）断片のハイブリダイゼーションに関して、低緊縮性条件とは、４２℃で１０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションし、次に５０℃で１×ＳＳＰＥ、そして０．２％ＳＤＳによる洗浄と同等の条件を意味する。そして、
（４）オリゴヌクレオチド（すなわち、長さが約３０ヌクレオチド以下の合成ＤＮＡ）に関して、高緊縮性条件とは、４２℃で１０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションし、次に５０℃で１×ＳＳＰＥ、そして０．２％ＳＤＳによる洗浄に等しい条件を意味する。
【００２２】
種々の緩衝液や温度を用いてこれらの条件を再現することができ、これらは必ずしも正確である必要はないことを理解すべきである。
【００２３】
デンハルツ溶液およびＳＳＰＥ（例えば、サムブルーク、フリッチ、およびマニアチス（Sambrook, Fritsch, and Maniatis）、モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning、A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９）は、他の適当なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に、当業者に公知である。例えば、ＳＳＰＥはpH７．４のリン酸緩衝化された０．１８ＭのＮａＣｌである。ＳＳＰＥは例えば、１７５．３ｇのＮａＣｌ、２７．６ｇのＮａＨ２ＰＯ４および７．４ｇのＥＤＴＡを８００mlの水に溶解しpHを７．４に調整して、次に１リットルになるように水を加えて２０×保存溶液として調製することができる。デンハルツ溶液（デンハルト（Denhart）（１９６６）Biochem. Biophys. Res. Commun.２３：６４１を参照）は、例えば５ｇのFicoll（タイプ４００、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社（Pharmacia LKBBiotechnology、INC.）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）、５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇのウシ血清アルブミン（第５画分；シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）、そして水を５００mlになるように加え、濾過して粒状物質を除去することにより、５０×保存溶液として調製することができる。
【００２４】
ヒトｍＧｌｕＲ１サブタイプをコードする特に好適な配列は、配列番号１と実質的に同じヌクレオチド配列を有するものであり、配列番号１のコーディング配列と実質的に同じ配列を有するポリ核酸が特に好ましい。
【００２５】
本明細書において、「実質的な配列相同性」とは、少なくとも約９０％の相同性を有するヌクレオチド配列、そして典型的には９５％以上のアミノ酸の同一性を有するヌクレオチド配列を意味する。しかし、スプライス変種であること、または保存的アミノ酸置換（または縮重コドンの置換）により修飾されているため、前記レベルより低い相同性を有する蛋白（およびこのような蛋白をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ）は、本発明の範囲内にあることを理解すべきである。
【００２６】
本明細書において、「実質的に同じ」とは、本明細書に記載の実際の配列とはわずかに異なるかまたは重大でない配列の変化を有する、ＤＮＡのヌクレオチド配列、ＲＮＡのリボヌクレオチド配列、または蛋白のアミノ酸配列を意味する。実質的に同じ分子種は、開示された配列と同等であると考えられ、従って本発明の請求の範囲に包含されると考えられる。この点で「わずかに異なるかまたは重大でない配列の変化」は、開示され、特許請求のされているＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白と実質的に同じ配列が、開示され特許請求のされているヒト由来の配列と機能的に同等であることを意味する。機能的に同等の配列は、実質的に同じ方法で機能して、ヒト由来の核酸および本明細書に開示され特許請求されているアミノ酸組成物と実質的に同じ組成物を産生する。特に機能的に同じＤＮＡは、本明細書に開示されたものと同じであるか、または保存性のアミノ酸変化（例えば非極性残基を別の非極性残基で置換、または荷電残基を類似の荷電残基で置換）を有するものと実質的に同じヒト由来の蛋白をコードする。これらの変化には、当業者に認識される、蛋白の３次元構造を実質的に変化させないものが含まれる。
【００２７】
ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの一部をコードするＤＮＡ配列の例は、配列番号４に記載のものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド（随時、配列番号１３に記載の３’非翻訳配列の３４３ヌクレオチドの一部またはすべてを含む）、またはクローンＭＥＴＡＢ４０（１９９３年５月４日に整理番号７５４６５でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された）のヒトｍＧｌｕＲ２をコードする部分によりコードされるものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドにより示される。
【００２８】
寄託されたクローンは、１９９３年５月４日に「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」（the Budapest Treaty on the International Recognition of Deposits of Microorganisms for Purposes of Patent Procedure）の条件と、この条約の名のもとに公布された規則に従い、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１ パークローンドライブ（Parklawn Drive）、ロックヴィル（Rockville）、メリーランド州、アメリカ合衆国 ２０８５２）に寄託されている。この条約と規則の条件下で、およびさもなくばアメリカ合衆国の特許法や規則に従い受領する法的資格のある工業所有権事務所および他の個人、または本出願または本出願の優先権を主張する出願が提出されたかまたはこのような出願に対して何らかの特許権が与えられた国または国際組織は、寄託された物質の試料を入手することができる。特にこれに基づきまたはこの優先権を主張する出願またはこれに関する出願を取り込んでいる出願に基づき米国特許の与えられた時点で、本寄託物質の入手に関するすべての規制は永久に取り消されるであろう。
【００２９】
ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの一部をコードする好適なポリ核酸配列は、配列番号４に記載のものと同じアミノ酸配列、またはクローンＭＥＴＡＢ４０（１９９３年５月４日に整理番号７５４６５でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された）のヒトｍＧｌｕＲ２をコードする部分によりコードされるものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするものである。
【００３０】
あるいはＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプをコードするヌクレオチド配列であり、高緊縮性条件下で配列番号３またはその大部分（すなわち、典型的にはその少なくとも２５−３０個の隣接ヌクレオチド）、またはクローンＭＥＴＡＢ４０（ＡＴＣＣ整理番号７５４６５）のヒトｍＧｌｕＲ２をコードする部分とまたはその大部分とハイブリダイズするヌクレオチド配列として特徴付けられる。ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの部分をコードする特に好適な配列は、配列番号３のコーディング配列と同じヌクレオチド配列、またはクローンＭＥＴＡＢ４０のヒトｍＧｌｕＲ２コーディング部分中のコーディング配列のヌクレオチド配列を有するポリ核酸により示される。
【００３１】
ヒトｍＧｌｕＲ３受容体サブタイプをコードするＤＮＡ配列の例は、配列番号６に記載のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドにより示される。好適なポリ核酸配列は、配列番号６と同じ配列をコードするものである。
【００３２】
あるいはＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ３受容体サブタイプをコードするヌクレオチド配列であり、高緊縮性条件下で配列番号５またはその大部分（すなわち、典型的にはその少なくとも２５−３０個の隣接ヌクレオチド）とハイブリダイズするヌクレオチド配列として特徴付けられる。ヒトｍＧｌｕＲ３サブタイプの部分をコードする特に好適な配列は、配列番号５のコーディング配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有するものであり、配列番号５のコーディング配列と同じヌクレオチド配列を有するポリ核酸が最も好ましい。
【００３３】
ＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ３受容体サブタイプまたはその部分をコードするヌクレオチド配列であり、配列番号８、１０または１２のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドにより示される。好適なポリ核酸配列は、配列番号８、１０または１２と同じ配列をコードするものである。
【００３４】
あるいはＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ５受容体サブタイプをコードするヌクレオチド配列であり、高緊縮性条件下で配列番号７、９または１１の実質的に全配列、またはそれらの大部分（すなわち、典型的には少なくとも２５−３０個の隣接ヌクレオチド）にハイブリダイズするヌクレオチドとして特徴付けられる。ヒトｍＧｌｕＲ５サブタイプをコードする特に好適な配列は、配列番号７、９または１１のコーディング配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有するものであり、配列番号７、９または１１のコーディング配列と同じ配列を有するポリ核酸が最も好ましい。
【００３５】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡは、本明細書に開示したＤＮＡ（配列番号１、３、５、７、９または１１の任意のものより得られるヌクレオチドを含む）により、適当なハイブリダイゼーション条件下で適当なヒトｃＤＮＡまたはヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより単離される。適当なライブラリーは、神経組織試料（例えば、海馬や小脳組織、細胞株など）から調製される。例えばライブラリーは、その実質的に全ての受容体サブタイプコーディング配列を含むＤＮＡの一部を用いてスクリーニングされるか、あるいはそのＤＮＡの一部に基づく適当なオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングされる。
【００３６】
本明細書においてプローブは、配列番号１、３、５、７、９または１１に記載の任意のものの２５またはそれ以上の隣接する塩基と同じであるか少なくとも約２５−３０個の隣接する塩基（またはその相補物）を含む、ヌクレオチドの配列を有する１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。プローブを作成するのに好適な領域は、５’および／または３’コーディング配列、トランスメンブレンドメインをコードすると予測される配列、細胞質ループをコードすると予測される配列、シグナル配列、リガンド結合部位などがある。
【００３７】
全長ｃＤＮＡクローン、その断片、またはそのＤＮＡの部分に基づくオリゴヌクレオチドはプローブとして使用され、好ましくは容易に検出するために適当な標識物で標識される。断片がプローブとして使用される時、そのプローブのＤＮＡ配列は好ましくはＤＮＡのカルボキシ末端をコードする部分由来であり、最も好ましくはＤＮＡ配列の予測されるトランスメンブレンドメインをコードする部分を含む（ドメインは、例えばカイトとドーリトル（Kyte and Doolittle）（１９８２）、J. Mol. Biol. 第１５７巻：１０５の方法を用いて、推定されるアミノ酸配列のハイドロパシー解析に基づき予測される）。これらのプローブは例えば、グルタミン酸受容体ファミリーの追加メンバーの同定と単離のために使用される。
【００３８】
本発明の配列の特定の応用として、本発明のヌクレオチド配列をプローブとして使用して遺伝子スクリーニングを実施することができる。すなわち、任意の内因性グルタミン酸受容体に異常が存在するか否かを測定するために、グルタミン酸受容体の任意の１つまたはそれ以上の変化／修飾が関与していることが疑われる神経病理的症状を有する患者の核酸試料を、適当なプローブでスクリーニングすることができる。同様に、グルタミン酸受容体の機能不全に関連する疾患の家族歴がある患者をスクリーニングして、このような疾患に罹りやすい体質であるか否かを決定することができる。
【００３９】
本発明の別の実施態様において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプをコードするＤＮＡの同定方法が提供され、この方法は、ヒトＤＮＡを上記の核酸プローブと接触させ（使用されるプローブがポリ核酸断片の時は低緊縮性または中緊縮性条件下で接触させ、または使用されるプローブがオリゴヌクレオチドの時は高緊縮性条件下で接触させる）、そして該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを同定することよりなる。
【００４０】
ライブラリーのスクリーニング後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出して陽性クローンを同定する。同定されたクローンを制限酵素マッピングおよび／またはＤＮＡ配列解析により性状解析し、次にこれらが完全なメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡを含有するか否か（すなわち、これらが翻訳開始コドンおよび停止コドンを含有するか否か）を確認するために本明細書に記載の配列と比較することにより試験する。選択された配列が不完全な場合はこれらを用いて、同じかまたは異なるライブラリーを再スクリーニングして重複するクローンを得ることができる。もしライブラリーがゲノム性の場合は、重複クローンはエクソンとイントロンを含有してもよい。もしライブラリーがｃＤＮＡライブラリーの場合は、重複クローンはオープンリーディングフレームを含有するであろう。いずれの場合も完全なクローンは、本明細書で提供されるＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列と比較して同定される。
【００４１】
種々のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ（例えば、ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ５）をコードする、相補的なＤＮＡクローンが単離されている。各サブタイプは、異なる遺伝子にコードされているようである。本明細書に記載されるＤＮＡクローンは、各サブタイプをコードするゲノムクローンを単離し、異なる神経組織から調製されたライブラリーをスクリーニングすることにより、スプライス変種を単離するために使用できる。当業者に公知の核酸増幅法を使用して、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプのスプライス変種をコードするＤＮＡを見つけることができる。これは、公知のまたは予測される互いに異なる配列を取り囲むＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドを、ヒトＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを増幅するためのプライマーとして用いることにより達成される。増幅生成物のサイズと配列の測定により、スプライス変種の存在が明らかになる。さらにハイブリダイゼーションによるヒトゲノムＤＮＡ配列の単離により、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする転写体の異なるスプライス変種に対応する、イントロンにより分離された多数のエクソンを含有するＤＮＡが得られる。
【００４２】
必ずしもすべてのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ（およびその変種）がすべての神経組織または脳のすべての部分に発現されているのではないことは、わかっている。すなわち特定のサブタイプ（またはそのスプライス変種）をコードするｃＤＮＡを単離するためには、異なるニューロンまたは神経組織または細胞から調製されるライブラリーをスクリーニングすることが好ましい。各サブユニットをコードするＤＮＡを得るために好適なライブラリーは：ヒトｍＧｌｕＲ１をコードするＤＮＡを単離するための小脳；ｍＧｌｕＲ２をコードするＤＮＡを単離するための海馬；ｍＧｌｕＲ３をコードするＤＮＡを単離するための海馬と小脳；ｍＧｌｕＲ５をコードするＤＮＡを単離するための海馬と小脳などがある。
【００４３】
特定の受容体サブタイプをコードするＤＮＡが一旦単離されると、そのようなサブタイプ（またはそのスプライス変種）をコードするｍＲＮＡを発現する組織を決定するために、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）保護測定法が実施される。この測定法は、全細胞性ＲＮＡの複雑な混合物中の１つのＲＮＡ種を検出し定量するための高感度の手段を与える。サブタイプＤＮＡは標識され、細胞性ＲＮＡとハイブリダイズされる。もし細胞性ＲＮＡ中に相補的なｍＲＮＡが存在する場合、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが得られる。次にＲＮＡ試料をＲＮａｓｅで処理する（これは１本鎖ＲＮＡを分解する）。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、ＲＮａｓｅ分解から保護され、ゲル電気泳動やオートラジオグラフィーにより肉眼で見ることができる。特定のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするｍＲＮＡを発現する組織を決定するために、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを使用することができる。こうして、標識されたサブタイプＤＮＡは異なる脳の領域のスライスとハイブリダイズして、サブタイプｍＲＮＡ発現が肉眼で見えるようになる。
【００４４】
いくつかのヒトのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの発現の分布は、この受容体のラットでの分布とは異なる。例えばラットのｍＧｌｕＲ５サブタイプをコードするＲＮＡはラットの海馬に多く存在し、ラットの小脳にはあまり存在しない［例えば、アベ（Abe）ら、J. Biol. Chem.２６７：１３３６１−１３３６８（１９９２）を参照］が、ヒトの小脳ライブラリーからは無数のヒトｍＧｌｕＲ５をコードするｃＤＮＡが得られている。すなわちヒトとラットではいくつかのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの分布が異なっているようである。
【００４５】
前述のヌクレオチド配列はベクターに取り込んでさらに操作することができる。本明細書においてベクター（またはプラスミド）とは、異種ＤＮＡを細胞に取り込んでそれを発現または複製をさせるのに使用される、独立した成分である。このような担体（vehicle）の選択と使用は、当業者には公知である。
【００４６】
発現ベクターとは、ＤＮＡ断片の発現を制御することができる制御配列（例えばプロモーター領域）に機能的に結合したＤＮＡを発現することができるベクターを含む。すなわち発現ベクターとは、適当な宿主細胞内に取り込まれるとクローン化ＤＮＡを発現する、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ作成体（例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクター）を意味する。適当な発現ベクターは当業者に公知であり、真核細胞および／または原核細胞中で複製されるもの、およびエピソームとしてとどまるか宿主細胞ゲノム内に取り込まれるものも含まれる。真核生物の宿主細胞（特に哺乳動物細胞）中での本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの発現のために好適なプラスミドには、例えば、ｐＣＭＶ−Ｔ７−２、ｐＣＭＶ−Ｔ７−３（図１を参照）、ｐｃＤＮＡ１などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター含有ベクター、そして、ＳＶ４０プロモーター含有ベクター、およびｐＭＭＴＶＴ７（＋）またはｐＭＭＴＶＴ７（−）（本明細書に記載のように調製されたｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテク（Clontek）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）を修飾したもの）などのＭＭＴＶＬＴＲプロモーター含有ベクターがある。
【００４７】
本明細書において、プロモーター領域とは、そこに機能的に結合したＤＮＡの転写を調節するＤＮＡのセグメントを意味する。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼによる認識、結合および転写の開始に充分な特異的配列を含有する。このプロモーター領域の部分をプロモーターと呼ぶ。さらにこのプロモーター領域は、このＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始を調節する配列を含む。これらの配列はｃｉｓ作用性であるか、またはｔｒａｎｓ活性化因子に対して応答する。制御の性質により、プロモーターは構成性（constitutive）であるかまたは制御されている。本発明の実施において使用されるプロモーターの例には、ＳＶ４０早期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニー（Moloney）マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターなどがある。
【００４８】
本明細書において、「機能的に結合している」とは、ＤＮＡとヌクレオチドの制御配列やエフェクター配列（例えばプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、および他のシグナル配列）との機能的関係を意味する。例えば、ＤＮＡとプロモーターの機能的結合は、ＤＮＡの転写はプロモーターを特異的に認識してこれに結合し、ＤＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターの間の物理的および機能的結合を意味する。発現および／またはインビトロの転写を最適化するために、転写または翻訳のレベルで発現を妨害するかまたは低下させる、不適当な代替翻訳開始コドンまたは他の配列を除去するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変更することが必要なこともある。あるいはコンセンサスリボゾーム結合部位（例えば、コザック（Kozak））（１９９１）J. Biol.Chem. ２６６：１９８６７−１９８７０）を開始コドンの５’のすぐ近くに挿入して、発現を増強させることもできる。同様に、転写を増強するために、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブユニットのコーディング配列の代わりに同じアミノ酸をコードする代替コドンを用いることができる（例えば、宿主細胞のコドンの選択性が採用され、Ｇ−Ｃの豊富なドメインを減少させるなど）。さらに両生類の卵母細胞中のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブユニットの発現増強の可能性のために、サブユニットコーディング配列を随時発現作成体中に取り込むことができる（ここではコーディング配列の５’末端と３’末端は、それぞれツメガエル（Xenopus）のβ−グロビン遺伝子の５’と３’の非翻訳配列に隣接している）。例えば、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブユニットコーディング配列は、ｐＳＰ６４（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州、より入手できる）の修飾型であるベクターｐＳＰ６４Ｔに取り組むことができる（クリーグとメルトン（Krieg and Melton）（１９８４）Nucleic Acids Research １２：７０５７−７０７０を参照）。このコーディング配列は、β−グロビン遺伝子の５’末端とＳＰ６プロモーターの下流に位置する３’非翻訳配列の間に挿入される。次に得られるベクターから、インビトロの転写体が作成される。このような修飾の好ましい点（またはニーズ）は実験的に決定されている。
本明細書において、発現とはポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白に翻訳される過程を意味する。ポリ核酸がゲノムＤＮＡから得られる場合、適当な真核生物宿主細胞または微生物が選択されるなら、発現にはｍＲＮＡのスプライシングを含む。
【００４９】
哺乳動物細胞のトランスフェクションのための、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体をコードするＤＮＡに結合した制御成分を含有する特に好適な基礎ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをベースにしたベクター（例えば、ｐＣＭＶ−Ｔ７−２およびｐＣＭＶ−Ｔ７−３（本明細書に記載）、またはｐｃＤＮＡ１（インビトロゲン（Invitrogen）、サンジエゴ、カリホルニア州））、およびＭＭＴＶプロモーターをベースにしたベクター（例えば、ｐＭＭＴＶＴ７（＋）またはｐＭＭＴＶＴ７（−）（本明細書中に記載））、およびＳＶ４０プロモーターをベースにしたベクター（例えば、ｐＳＶβ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州））である。
【００５０】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする全長ＤＮＡは、ベクターｐＭＭＴＶＴ７（＋）、ｐＭＭＴＶＴ７（−）、ｐＣＭＶ−Ｔ７−２またはｐＣＭＶ−Ｔ７−３に挿入されている。ｐＣＭＶ−Ｔ７−２（およびｐＣＭＶ−Ｔ７−３）は、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、プロモーターのすぐ下流に存在するＳＶ４０スプライス／ドナー部位、スプライス部位の下流に位置するＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、その後にＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、そしてＴ７プロモーターとポリアデニル化シグナルの間にポリリンカーを有する、ｐＵＣ１９をベースにした哺乳動物細胞発現ベクターである。ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの間にメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプを配置させると、この作成体によりトランスフェクションされた哺乳動物の宿主細胞中で外来ＤＮＡの構成的発現（constitutive expression）が与えられる。
【００５１】
ベクターｐＭＭＴＶＴ７（＋）とｐＭＭＴＶＴ７（−）はベクターｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）を修飾することにより調製された。ｐＭＡＭｎｅｏは、デキサメタゾン誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）−ＬＴＲプロモーターに結合した（この後にＳＶ４０スプライス部位とポリアデニル化部位が続く）ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）を含有する、哺乳動物の発現ベクターである。ｐＭＡＭｎｅｏはまた、大腸菌の増殖のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性を与える蛋白をコードする）と同様に、形質転換体の選択のための大腸菌ｎｅｏ遺伝子を含有する。
【００５２】
ベクターｐＭＭＴＶＴ７（＋）は、ｐＭＡＭｎｅｏからｎｅｏ遺伝子を除去し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州）からのマルチプルクローニング部位とＴ７およびＴ３プロモーターを挿入することにより作成される。従ってｐＭＭＴＶＴ７（＋）はＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターに結合したＲＳＶ−ＬＴＲエンハンサー、ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターの下流に位置するＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ７プロモーターの下流に位置するポリリンカー、Ｔ７プロモーターの下流に位置するＴ３バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、そしてＴ３プロモーターの下流に位置するＳＶ４０スプライシング部位とポリアデニル化部位を含有する。ｐＭＡＭｎｅｏからのβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性を与える蛋白をコードする）はｐＭＭＴＶＴ７（＋）中で保持されるが、ｐＭＡＭｎｅｏ中の配向に対して配向は逆転している。
【００５３】
ベクターｐＭＭＴＶＴ７（−）はｐＭＭＴＶＴ７（＋）と同じであるが、Ｔ７プロモーターとＴ３プロモーターの位置が逆転しており、ｐＭＭＴＶＴ７（−）中のＴ３プロモーターはｐＭＭＴＶＴ７（＋）中のＴ７プロモーターがある場所に位置しており、ｐＭＭＴＶＴ７（−）中のＴ７プロモーターはｐＭＭＴＶＴ７（＋）中のＴ３プロモーターがある場所に位置している。従ってｐＭＭＴＶＴ７（＋）とｐＭＭＴＶＴ７（−）ベクターは、哺乳動物宿主細胞中で異種ＤＮＡ（ここで異種ＤＮＡはポリリンカーでベクター内に取り込まれている）が発現するのに必要な制御成分のすべてを含有している。さらにＴ７プロモーターとＴ３プロモーターはポリリンカーのどちらかの側に位置しているため、これらのプラスミドはポリリンカーでベクター内にサブクローニングされている異種ＤＮＡのインビトロ転写体の合成に使用することができる。
【００５４】
哺乳動物細胞中のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡの誘導性発現のために、ＤＮＡをｐＭＭＴＶＴ７（＋）またはｐＭＭＴＶＴ７（−）のようなプラスミド中に挿入することができる。これらのプラスミドは、機能的に関連する外来ＤＮＡのステロイド誘導性発現のためのマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ＬＴＲプロモーターを含有する。宿主細胞が細胞内への糖質コルチコイド（すなわちＭＭＴＶＬＴＲプロモーターの誘導物質）の摂取に必要な内因性糖質コルチコイド受容体を発現しない場合は、糖質コルチコイド受容体をコードするＤＮＡ（ＡＴＣＣ整理番号６７２００）で細胞を追加的にトランスフェクションする必要がある。インビトロ転写体の合成のために、ヒトｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ３、およびｍＧｌｕＲ５をコードする全長ヒトＤＮＡクローンを、ｐＩＢＩ２４（インターナショナル・バイオテクノロジーズ社（International Biotechnologies, Inc.）、ニューヘーブン、コネチカット州）、ｐＣＭＶ−Ｔ７−２、ｐＣＭＶ−Ｔ７−３（図１参照）、ｐＭＭＴＶＴ７（＋）、ｐＭＭＴＶＴ７（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Stratagene)、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州）またはｐＧＥＭ７Ｚ（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州）などの中にサブクローニングすることもできる。
【００５５】
本発明の別の実施態様において、前述のポリ核酸（すなわちＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を含有する細胞が提供される。細菌、酵母および哺乳動物のような宿主細胞は、ＤＮＡを複製しメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプを産生するために使用することができる。本発明に記載の発現ベクターの作成、インビトロ転写体の調製、哺乳動物細胞へのＤＮＡのトランスフェクション、卵母細胞の注入の方法、および受容体の発現と機能の評価のための電気生理的および他の分析方法は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５６２５とＰＣＴ／ＵＳ９２／１１０９０、および同時係属出願米国特許出願第０７／５６３，７５１号と０７／８１２，２５４号にも記載されている。これらの文献の主題はその全体が参考のため本明細書中に引用されている。
【００５６】
適当な発現ベクターへのクローン化ＤＮＡの導入法、１つのプラスミドベクターまたはプラスミドベクターの組合せ（それぞれが１つまたはそれ以上の異なる遺伝子をコードする）または線状ＤＮＡによる真核細胞のトランスフェクション、そしてトランスフェクションした細胞の選択法は公知である（例えば、サムブルーク（Sambrook）ら、（１９８９）分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参照）。異種ＤＮＡは、当業者に公知の任意の方法により宿主細胞に導入される：例えば、ＣａＰＯ４沈殿法（例えば、ウィグラー（Wigler）ら、（１９７９）、Proc. Natl. Acad. Sci.７６：１３７３−１３７６）を用いる、異種ＤＮＡをコードするベクターによるトランスフェクション。次に組換え細胞は、ＤＮＡによりコードされたサブタイプが発現される条件下で培養することができる。好適な細胞は哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、およびＬｔｋ−細胞）、酵母細胞（例えば、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）のようなメチル親和性（methilotrophic）酵母細胞）、細菌細胞（例えば大腸菌）などがある。
【００５７】
本明細書で提供されるＤＮＡは任意の真核細胞（例えば、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）（米国特許第４，８８２，２７９号、４，８３７，１４８号、４，９２９，５５５号および４，８５５，２３１号を参照）、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）などの酵母細胞）中で発現されるが、本明細書で提供されるヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡの発現のためには、Ｇ蛋白を発現する（内因性にまたは組換えで）市販の発現系や当業者に公知の他の発現系を含む哺乳動物発現系が好ましい。ＰＩ加水分解／Ｃａ＋＋シグナル経路に結合したヒトメタボトロピック受容体サブタイプをコードするＤＮＡのインビトロｍＲＮＡ転写体の発現にはツノガエル（Xenopus）卵母細胞が好適である。卵母細胞中の内因性イノシトール３’末端リン酸第二メッセンジャー介在経路は、これらの細胞におけるヒトメタボトロピック受容体の機能性発現を可能にする。組換えヒトメタボトロピック受容体を発現する卵母細胞は、卵母細胞Ｇ蛋白結合ＩＰ３生成経路を介してアゴニストに応答し、内部の貯蔵状態からＣａ＋＋を放出し、電圧固定記録法により遅延振動電流として検出される塩素チャネルを活性化すると報告されている。
【００５８】
ヒトメタボトロピック受容体の機能性組換え発現のための宿主細胞は、好ましくは内因性または組換えグアニンヌクレオチド結合蛋白（すなわちＧ蛋白）を発現する。Ｇ蛋白はα、βおよびγサブユニットよりなる高度に保存された膜関連蛋白のファミリーの１つである。αサブユニットはＧＤＰとＧＴＰに結合し、異なるＧ蛋白毎に異なる。結合した対のβおよびγサブユニットはユニークであることもそうでないこともあり、異なるα鎖が同じβγ対または異なる対に結合している［リンダーとギルマン（Linder and Gilman）、Sci. Am.２６７：５６−６５（１９９２）］。Ｇ蛋白α鎖をコードする３０以上の異なるｃＤＮＡがクローン化されている［サイモン（Simon）ら、Science ２５２：８０２（１９９１）］。４つの異なるβポリペプチドが知られている［サイモン（Simon）ら、Science ２５２：８０２（１９９１）］。同定された５つのγｃＤＮＡのうち３つがクローン化されている［ハーレー（Hurley）ら、PNAS U.S.A. ８１：６９４８（１９８４）：ガウタム（Gautam）ら、Science ２４４：９７１（１９８９）：ガウタム（Gautam）ら、PNAS U.S.A. ８７：７９７３（１９９０）：］。４番目のγｃＤＮＡ［クレウス（Kleus）ら、Science ２５９：８３２（１９９３）］と５番目のγｃＤＮＡ［フィッシャーとアロンソン（Fischer and Aronson）、Mol. Cell. Bio. １２：１５８５（１９９２）］の配列は確立されており、さらに追加のγサブユニットが存在するかも知れない［タミール（Tamir）ら、Biochemistry ３０：３９２９（１９９１）］。グアニンヌクレオチド交換とＧＴＰ加水分解により、Ｇ蛋白は活性状態と不活性状態の間で変化する。不活性Ｇ蛋白は、リガンド活性化受容体により刺激されてＧＤＰをＧＴＰに交換する。活性型では、ＧＴＰに結合したαサブユニットはβγ複合体から解離し、次にサブユニットは細胞性エフェクター分子と特異的に相互作用して細胞性応答を引き出す。異なるＧ蛋白は異なるエフェクター系（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルサイクラーゼ系）や異なる受容体と相互作用することができるため、異なる組換えヒトメタ受容体サブタイプの発現のための異なる宿主細胞を研究することは有用である。あるいは宿主細胞は、異なるＧ蛋白の異種発現のためにＧ蛋白サブユニットをコードするＤＮＡでトランスフェクションすることができる。
【００５９】
好適な実施態様において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡは、ベクターに結合され、適当な宿主細胞中に導入されて、特異的なヒトメタボトロピックルグルタミン酸受容体サブタイプまたはサブタイプの特異的な組合せを発現する、形質転換された細胞株を産生する。得られる細胞株は次に、公知の薬剤または可能性のある薬剤の受容体機能への影響の再現性のある定量的解析のために大量に産生される。他の実施態様においては、各サブタイプをコードするＤＮＡのインビトロ転写によりｍＲＮＡが産生される。このｍＲＮＡ（単一のサブタイプクローンからであってもまたはクローンの組合せからであっても）は、ツノガエル（Xenopus）卵母細胞に注入され、ここでｍＲＮＡはヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの合成を指令する。あるいは機能性ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの発現のために、サブタイプをコードするＤＮＡは卵母細胞に直接注入される。次にトランスフェクションされた哺乳動物細胞または注入された卵母細胞は、本明細書に記載の薬剤スクリーニング法に使用される。
【００６０】
ＤＮＡまたはＲＮＡが導入される真核細胞は、このようなＤＮＡまたはＲＮＡによりトランスフェクションされることができる細胞、またはこのようなＤＮＡまたはＲＮＡを注入されてＧ蛋白を（内因性にまたは組換えにより）発現することができる細胞である。好適な細胞は、内因性メタボトロピックグルタミン酸受容体を（あったとしても）ほんの少ししか発現せず、かつ一時的または安定にトランスフェクションされ、また本発明のＤＮＡやＲＮＡを発現するものである。最も好適な細胞は、異種ＤＮＡによりコードされる１つまたはそれ以上のサブタイプよりなる組換えまたは異種ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体を形成することができるものである。このような細胞は経験的に同定されるか、または容易にトランスフェクションまたは注入されることが知られているものの中から選択される。
【００６１】
ＤＮＡを導入するための細胞の例は、哺乳動物起源の細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児性腎（ＨＥＫ）細胞、アフリカミドリザル（African green monkey）細胞および当業者に公知の他の細胞）、両生類の細胞（例えば、ゼノプス・ラエビス（Xenopus laevis）卵母細胞）、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris））などがある。注入されたＲＮＡ転写体を発現するための細胞の例は、ゼノプス・ラエビス（Xenopus laevis）卵母細胞がある。ＤＮＡのトランスフェクションに好適な細胞は、当業者に公知であるかまたは経験的に同定され、ＨＥＫ２９３細胞（整理番号＃ＣＲＬ１５７３でＡＴＣＣより入手できる）；Ｌｔｋ−細胞（整理番号＃ＣＣＬ１．３でＡＴＣＣより入手できる）；ＣＯＳ−７細胞（整理番号＃ＣＲＬ１６５１でＡＴＣＣより入手できる）；ＣＨＯ細胞（整理番号＃ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１またはＣＲＬ９０９６でＡＴＣＣより入手できる）；ＤＧ４４細胞（ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞；例えば、ウーラウプ（Urlaub）ら（１９８６）Cell. Molec. Genet. １２：５５５を参照）；そしてＢＨＫ細胞（ウェクターとバセルガ（Waechter and Baserga）、PNAS U.S.A. ７９：１１０６−１１１０（１９８２）；整理番号＃ＣＲＬ１０３１４でＡＴＣＣより入手できる）を参照）がある。好適な細胞には、ＣＨＯ細胞とＨＥＫ２９３細胞があり、特に液体窒素中で凍結され次に融解されて再増殖されるＨＥＫ２９３細胞（例えば、ゴーマン（Gorman）の米国特許第５，０２４，９３９号（またスティルマン（Stillman）ら、（１９８５）Mol. Cell. Biol. ５：２０５１−２０６０も参照）に記載のもの）、ＤＧ４４細胞、ＬＴＫ−細胞などがある。使用される宿主細胞にかかわらず、使用されるリガンドに誘導されるグルタミン酸産生のバックグランドレベルの測定、またはリガンドの非存在下での宿主細胞中に存在するグルタミン酸のバックグランドレベルの測定のために、比較実験を実施すべきであることは、当業者は理解できるであろう。
【００６２】
ＤＮＡは当業者に公知の方法を用いて細胞内に安定に取り込まれるか、または一時的に発現される。安定にトランスフェクションされる哺乳動物細胞は、選択マーカー遺伝子（例えば、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ネオマイシン耐性などの遺伝子）を有する発現ベクターで細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞をマーカー遺伝子を発現する細胞に選択的な条件下で増殖させることにより調製される。一時的トランスフェクション体を調製するためには、哺乳動物細胞をレポーター遺伝子（例えば大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子）でトランスフェクションしてトランスフェクション効率を追跡する。
【００６３】
トランスフェクション体は典型的には選択性条件下では増殖せず、普通トランスフェクション後数日以内に分析されるため、選択マーカー遺伝子は一時的トランスフェクション体には含有されない。
【００６４】
このような安定トランスフェクション細胞または一時的トランスフェクション細胞を産生するために、細胞を充分な濃度のサブタイプをコードする核酸でトランスフェクションして、異種ＤＮＡにコードされるヒトサブタイプを示すヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体を形成させる。サブタイプをコードするＤＮＡの正確な量は経験的に決定されるか、または特定のサブタイプ、細胞および測定条件について最適化される。異種ＤＮＡまたはＲＮＡのみにコードされるサブタイプを含有するメタボトロピックグルタミン酸受容体を発現する組換え細胞が特に好適である。
【００６５】
異種ＤＮＡは細胞中でエピソーム成分として維持されるか、または細胞の染色体ＤＮＡに取り込まれる。次に得られる組換え細胞を培養し、この培養物またはサブ培養物からサブ培養（または、哺乳動物細胞の場合は継代する）する。組換え細胞のトランスフェクション、注入および培養法は当業者に公知である。同様に当業者に公知の蛋白精製法を用いて、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプが精製される。例えば１つまたはそれ以上のサブタイプに特異的に結合する抗体または他のリガンドが、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の親和性精製に使用される。
【００６６】
本明細書において、異種ＤＮＡまたは外来ＤＮＡおよびＲＮＡは、互いに交換して使用することができ、細胞のゲノムの一部としては天然には存在しないか、または天然に存在するものとは異なるゲノム中の位置に見いだされるＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。典型的には異種または外来ＤＮＡおよびＲＮＡは、宿主細胞に内因性ではなく人工的に細胞に取り込まれたＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。異種ＤＮＡの例としては、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡ、転写、翻訳または他の制御可能な生化学過程などに影響を与えることにより内因性ＤＮＡの発現を媒介または変更するＲＮＡまたは蛋白をコードするＤＮＡなどがある。異種ＤＮＡを発現する細胞は、同じであるかまたは異なる発現生成物をコードするＤＮＡを含有する。異種ＤＮＡは発現される必要はなく、宿主細胞ゲノム中に取り込まれるかまたはエピソーム的に維持される。
【００６７】
機能性ｍＧｌｕＲの発現を検出するために使用する種々の測定法を当業者は容易に見いだすことができる。その例としては、ＰＩターンオーバー測定法［例えば、ナカジマ（Nakajima）ら、J. Biol. Chem.２６７：２４３７−２４４２（１９９２）および実施例３．Ｃ．２を参照］、ｃＡＭＰ測定法［例えば、ナカジマ（Nakajima）ら、前述、および実施例３．Ｃ．４を参照］、カルシウムイオン流入測定法［例えば、イトウ（Ito）ら、J. Neurochem. ５６：５３１−５４０（１９９１）、および実施例３．Ｃ．１を参照］、ｃＧＭＰ測定法［例えば、スタイナー（Steiner）ら、J. Biol. Chem.２４７：１１０６−１１１３（１９７２）］、アラキドン酸放出測定法［例えば、フェルダー（Felder）ら、J. Biol.Chem.２６４：２０３５６−２０３６２（１９８９）を参照］などがある。さらに、陽イオンをベースにした測定法（本明細書に記載）を、細胞内サイクリックヌクレオチドレベルの受容体誘導変化を追跡するために使用することができる。そのような測定法は、サイクリックヌクレオチドゲートのイオンチャネルを発現する宿主細胞を使用する。例えば棹状光受容体細胞、嗅覚細胞およびウシ腎細胞中に存在するこれらのチャネル（例えば、カウプ（Kaupp）ら、Nature ３４２：７６２−７６６（１９８９）、ダレン（Dallen）ら、Nature ３４７：１８４−１８７（１９９０）、およびビエル（Biel）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１：３５０５−３５０９（１９９４））は、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの結合による活性化により陽イオンに対して透過性となる。すなわち本発明の測定法において、内因性または組換えサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルを発現する宿主細胞は、サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えることが疑われる受容体をコードする核酸（例えば、メタボトロピックグルタミン酸受容体をコードするＤＮＡ）でトランスフェクション（または注入）され、次にチャネルのサイクリックヌクレオチド活性化の量の変化を追跡する。チャネルのサイクリックヌクレオチドの活性化の変化を追跡すると、活性化された時ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの変化を引き起こす受容体を機能性であるとして間接的に同定することができる。サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルの活性化の量の変化は、チャネルを介するイオンの流入を測定するか、または電流の電気生理学的測定または細胞内陽イオンレベルの変化を測定（例えば、細胞内カルシウムの蛍光測定）することにより、決定することができる。
【００６８】
活性化によりサイクリックヌクレオチドの低下を引き起こす受容体（例えば、メタボトロピックグルタミン酸受容体）を発現する細胞の測定法において、受容体活性化化合物を測定物内の細胞に添加する前に、サイクリックヌクレオチドの細胞内レベルを上昇させる物質（例えば、フォルスコリンやＩＢＭＸ）に細胞を暴露させることが好ましい。
【００６９】
上記の測定法での使用に適した宿主細胞は、検討される受容体の発現に適した宿主細胞を含む（例えば、メタボトロピックグルタミン酸受容体の測定のためのＬ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞またはツノガエル（Xenopus）卵母細胞）。細胞は、サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルをコードする核酸と受容体をコードする核酸で連続的にトランスフェクション（または注入）されるか、または細胞は２つの核酸で同時トランスフェクションされる。実施例３Ａと３Ｂに記載の一時的または安定なトランスフェクションを実施することができる。
【００７０】
サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルでトランスフェクション（または注入）された細胞は、機能の測定の前にインキュベートされる（典型的には約２４−４８時間）。チャネルの活性は、トランスフェクションされた細胞からの引き剥がした裏返した膜パッチを用いて測定される（こうして細胞質面に達するｃＡＭＰの濃度が調節される）。トランスフェクション体はまた、内部カルシウムレベル（［Ｃａ＋＋］ｉ）の単細胞ビデオイメージングにより分析される。この方法は、細胞内カルシウムレベル（これはチャネルのサイクリックヌクレオチド活性化により制御される、チャネルを介するカルシウムの流入量とともに変化する）の測定によるサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルの分析を可能にする。イメジーング測定法は、基本的に実施例３．Ｃ．４．ｂに記載のように実施される。
【００７１】
本明細書に記載のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ベクター、受容体サブタイプおよび細胞により、選択されたメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプやその受容体サブタイプに対する抗体の産生が可能である。これは、その存在が単一のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの分析を妨害する多くの他の受容体蛋白の汚染が実質的にない、合成または組換え受容体および受容体サブタイプを調製する手段を与える。目的の受容体サブタイプが利用できることが、特定の受容体サブタイプまたはメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの組合せへの薬剤の影響を観察し、従ってヒトに特異的でありヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプまたはメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの組合せに特異的な試験系で、薬剤の初期のインビトロスクリーニングを行うことを可能にする。特異的抗体が利用できることは、インビボで発現されるサブタイプの組合せを同定することを可能にする。すなわち、このような特異的組合せは、薬剤スクリーニングの好適な標的として使用される。
【００７２】
特異的な受容体組成物への薬剤の影響を測定するためにインビトロで薬剤物質をスクリーニングすることができることは、受容体サブタイプ特異的または疾患特異的薬剤の開発とスクリーニングを可能にするはずである。また単一の受容体サブタイプまたは種々の受容体サブタイプと種々のアゴニストまたはアンタゴニストの可能性のある物質との特定の組合せを試験することにより、個々のサブタイプの機能と活性に関する追加情報が得られ、１つまたはそれ以上の受容体サブタイプと非常に特異的に相互作用することができる化合物の同定と設計を可能にするであろう。得られる薬剤は、種々の受容体サブタイプを発現する細胞を用いてスクリーニングすることにより同定される薬剤より、不要な副作用はより少ないであろう。
【００７３】
さらに種々の疾患の薬剤開発と治療法に関して、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡが利用できることは、ある種の疾患の発症に相関する遺伝子の変化（例えば、突然変異）の同定を可能にする。さらに、このような突然変異を合成ＤＮＡ配列に特異的に導入し、次にこれを実験室動物に導入するかまたはその効果を測定するためのインビトロ測定系により、そのような疾患の動物モデルの作成が可能になる。
【００７４】
別の面において、本発明は本発明のＤＮＡによりコードされる機能性ペプチド断片およびその機能性組合せよりなる。ペプチドがグルタミン酸受容体として機能するのに必須ではない配列中のアミノ酸の一部またはすべてを排除することにより、不要な実験をすることなく当業者はこのような機能性ペプチド断片を産生することができる。グルタミン酸受容体機能に必須のアミノ酸は、例えばペプチドをコードするＤＮＡの体系的消化および／またはＤＮＡへの欠失の導入により決定することができる。修飾（例えば欠失または消化）ＤＮＡは、例えばＤＮＡを転写し、次に得られるｍＲＮＡをツノガエル（Xenopus）卵母細胞に導入して、ｍＲＮＡを翻訳させることにより発現することができる。卵母細胞中のこうして発現された蛋白の機能的分析は、グルタミン酸受容体に結合しこれを機能的に活性化することが公知のリガンドに卵母細胞を暴露して、次に内因性チャネルが活性化されるか否かについて卵母細胞を追跡することにより、行われる。電流が検出されるなら、断片はグルタミン酸受容体として機能する。
【００７５】
本発明の別の実施態様において、競合的結合測定法で本発明の受容体蛋白を使用することよりなる、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプに結合する化合物の同定方法が提供される。この測定法は多数の化合物を迅速にスクリーニングして、どの化合物（もし、あるとすれば）が、特異的に結合した［３Ｈ］グルタミン酸を排除することができる（すなわち、メタボトロピックグルタミン酸受容体に結合することができる）かを調べることができる。結合することが見いだされた化合物を用いて、このような化合物が本発明の受容体のモジュレーター、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用するのか否かをさらに調べるために、さらに詳しい測定法が実施される。
【００７６】
本発明の結合測定法の別の応用は、本発明の受容体の存在の有無に関する試料（例えば生物学的液体）の測定である。例えばグルタミン酸産生経路の機能不全に関連する症状を示す患者の血清を測定して、観察される症状がこのような受容体の型の産生過剰または不足により引き起こされるのかを決めることができる。
【００７７】
本発明において企図される結合測定法は、当業者は容易に判定できるように種種の方法で実施することができる。例えばラジオリセプター測定法などの競合的結合測定法を使用することができる。
【００７８】
本発明のさらなる実施態様において、本発明のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの活性を調節する化合物を同定するための生物測定法が提供され、該方法は：
（ａ）ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡを含有する細胞（この細胞は機能性メタボトロピックグルタミン酸受容体を発現する）を、受容体の活性の調節能力を測定すべき少なくとも１つの化合物に暴露させて、
（ｂ）第二メッセンジャー活性の変化について細胞を追跡する
ことよりなる。
【００７９】
上記の生物測定法はヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体のアゴニストやアンタゴニストおよびアロステリックモジュレーターの同定を可能にする。この方法では組換えメタボトロピックグルタミン酸受容体に「未知の」すなわち試験物質と（アンタゴニスト活性が試験される時は、さらに公知のメタボトロピックグルタミン酸アゴニストの存在下で）接触させ、この「未知の」すなわち試験物質との接触後、公知のグルタミン酸受容体の第二メッセンジャー活性を追跡し、公知のグルタミン酸受容体の活性を追跡し、公知のグルタミン酸受容体の第二メッセンジャー応答を増加または減少させる物質は、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の機能性リガンド（すなわち、モジュレーター、アゴニストまたはアンタゴニスト）として同定される。追跡することができる第二メッセンジャー活性には、細胞内カルシウムイオンの濃度、ＩＰ３、ｃＡＭＰレベルの変化、またはアラキドン酸放出またはイオン電流の活性または阻害の追跡（細胞が卵母細胞の場合）がある。
【００８０】
本発明の特定の実施態様において、組換えヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体を発現する哺乳動物細胞または卵母細胞を試験化合物と接触させて、次に試験化合物がある場合またはない場合のメタボトロピックグルタミン酸受容体介在応答を比較し、化合物の存在に対する試験細胞または対照細胞（すなわち、メタボトロピックグルタミン酸受容体を発現しない細胞）のメタボトロピックグルタミン酸受容体介在応答を比較して、その調節作用を評価することができる。
【００８１】
本明細書において、「メタボトロピックグルタミン酸受容体の活性を調節する」化合物またはシグナルとは、メタボトロピックグルタミン酸受容体の活性を変化させ、化合物またはシグナルの存在下ではこれらが存在しない場合とはメタボトロピックグルタミン酸受容体の活性が異なるようになる化合物またはシグナルを意味する。特にこのような化合物またはシグナルはアゴニストやアンタゴニストを含む。アゴニストという用語は、受容体機能を活性化するグルタミン酸またはＡＣＰＤのような物質またはシグナルを意味し；アンタゴニストという用語は、アゴニストに誘導される受容体活性化を妨害する物質を意味する。アンタゴニストには競合的および非競合的アンタゴニストがある。競合的アンタゴニスト（または競合的ブロッカー）は、アゴニスト（例えば、リガンドまたは神経伝達物質）の近傍または特異的な部位と、その同じ部位または近傍に対して相互作用する。非競合的アンタゴニストまたはブロッカーは、アゴニストと相互作用する部位とは異なる部位と相互作用することにより、受容体の機能を不活性化する。
【００８２】
当業者は理解できるように、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体活性を調節する化合物（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）の同定方法には、一般に対照との比較が必要である。「対照」細胞または「対照」培養物の１つのタイプは、試験化合物に暴露された細胞または培養物と実質的に同様に処理された細胞または培養物である（ただし、対照培養物は試験化合物に暴露されない）。例えば、電圧固定電気生理学的方法を用いる方法では、細胞を浸漬している外部溶液を単に交換することにより、試験化合物の存在下または非存在下で同じ細胞を試験することができる。別のタイプの「対照」細胞または「対照」培養物は、トランスフェクションされた細胞と同一の細胞または細胞の培養物である（ただし、対照培養物に使用される細胞は、トランスフェクションされた細胞に発現される組換えヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプを発現しない）。この場合、細胞または各タイプの細胞の培養物が、測定される化合物の存在下と実質的に同じ反応条件下に暴露される時、試験化合物に対する試験細胞の応答は、受容体のない（対照）細胞の試験化合物に対する応答（または応答の欠如）と比較される。
【００８３】
本発明のさらに別の実施態様において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の第二メッセンジャー活性は、この受容体を、上記生物測定法により同定される少なくとも１つの化合物の有効量と接触させることにより調節される。
【００８４】
本発明のさらに別の実施態様において、上記の受容体蛋白に対して産生された抗体が提供される。この抗体は、受容体組織局在化、サブタイプ組成、機能性ドメインの構造の研究用、受容体の精製、および診断応用治療応用などに使用することができる。好ましくは治療用途では、使用される抗体はモノクローナル抗体である。
【００８５】
本発明の受容体蛋白またはその部分を抗体産生の抗原として用いることにより、上記の抗体は当業者に公知の標準的方法を使用して産生することができる。抗ペプチドおよび抗融合蛋白抗体ともに使用することができる［例えば、バホウト（Bahouth）ら、（１９９１）Trends Parmacol Sci. 第１２巻：３３８−３４３;Current Protocols in Molecular Biology（アウスベル（Ausubel）ら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、ニューヨーク（１９８９）］。免疫原として（合成ペプチドまたは組換え産生細菌融合蛋白として）使用するためのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの部分を選択する場合に考慮すべき因子は、抗原性、入手し易さ（すなわち、細胞外ドメインおよび細胞質ドメイン）、特定のサブタイプに特異的であるかなどである。
【００８６】
サブタイプ特異的抗体が利用できることは、（例えば、正常の脳組織対疾患の脳組織中の）種々のサブタイプの分布と発現密度を追跡するのに免疫組織学的方法を使用することを可能にする。このような抗体はまた、診断および治療応用に利用できる。
【００８７】
本発明のさらに別の実施態様において、有効量の上記の抗体に本発明の受容体を接触させることにより、該受容体のイオンチャネル活性を調節する方法が提供される。
【００８８】
本発明の抗体は、標準的方法（例えば、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、または皮下注射、移植または経皮的投与法など）により、対象者に投与することができる。当業者は、使用される投与法により、投与型、治療処方などを容易に決定することができる。
【００８９】
本発明のさらなる実施態様において、細胞内サイクリックヌクレオチドレベルの受容体に誘導される変化を追跡するための、陽イオンベースの生物測定法が提供され、該生物測定法は：
内因性または組換えサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルを発現する宿主細胞に、細胞内サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えることが疑われる受容体をコードする核酸を導入し、そして
細胞内サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えることが疑われる、該受容体に対するリガンドの存在下または非存在下で、サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルのサイクリックヌクレオチド活性化の量の変化を追跡することよりなる。
【００９０】
以下の非限定的実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００９１】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体をコードするＤＮＡの単離
Ａ．ｍＧｌｕＲ５受容体ｃＤＮＡ
ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
【００９２】
ヒト海馬組織から単離したＲＮＡを、標準的方法［例えば、グブラーとホフマン（Gubler and Hoffman）、（１９８３）Gene ２５：２６３−２６９］に従い、オリゴｄＴ−プライムした１本鎖ｃＤＮＡの合成のための鋳型として使用した。１本鎖ｃＤＮＡを２本鎖ｃＤＮＡに変換し、そのｃＤＮＡの末端にＥｃｏＲＩ／ＳｎａＢＩ／ＸｈｏＩアダプターを付け加えた。アガロースゲル電気泳動を用いてサイズによりｃＤＮＡを分離し、＞２．５kbのものをＥｃｏＲＩ消化したλｇｔ１０バクテリオファージベクターに結合させた。得られる一次ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー（約２×１０５組換え体）を、ラットｍＧｌｕＲ１受容体（ヌクレオチド１から１７２３＋５’非翻訳配列；マス（Masu）ら、（１９９１）Nature ３４９：７６０−７６５を参照）をコードするＤＮＡの断片に対するハイブリダイゼーションについてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、４２℃で５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５０％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳおよび２００μg／mlの変性した超音波処理したニシン精子ＤＮＡ中で行ない、洗浄は６５℃で１×ＳＳＰＥと０．２％ＳＤＳ中で行なった。３２７３塩基対を含有するハイブリダイズする１つのプラーク（ＭＥＴＡＢ１）を同定した。
【００９３】
追加のヒトｍＧｌｕＲ５コーディングクローンを得るために、ＭＥＴＡＢ１を放射標識し、以下のように調製した２つのヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用した。ランダムプライマーを使用して、ヒト小脳組織から単離したＲＮＡから最初のｃＤＮＡ合成をプライムしてｃＤＮＡを合成した。長さを基準にしてｃＤＮＡをプールし、２つのライブラリーを作成した：１つは２．８kb以上の長さの挿入体を有し（すなわち、大挿入体ライブラリー）、もう１つは１−２．８kbの長さの挿入体を有する（すなわち、中挿入体ライブラリー）。ラットｍＧｌｕＲ１ＤＮＡ断片へのハイブリダイゼーションに対して海馬ライブラリーをスクリーニングするために使用したのと同じハイブリダイゼーション条件を用いて、ＭＥＴＡＢ１に対するハイブリダイゼーションについてライブラリーをスクリーニングした。洗浄は５５℃で１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で行なった。大挿入体ライブラリー中に１つのハイブリダイズするプラーク（ＭＥＴＡＢ２）を同定し、中挿入体ライブラリー中に４つのハイブリダイズするプラーク（ＭＥＴＡＢ３−ＭＥＴＡＢ６）を同定した。
【００９４】
ヒトｍＧｌｕＲ５をコードするＤＮＡの別のスクリーニングで、ＭＥＴＡＢ１により大挿入体または中挿入体小脳ライブラリーをスクリーニングするのに使用した条件と同じ条件を用いて、サイズが１−２kbの範囲の挿入体を含有するランダムにプライムしたヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー（２×１０６組換え体）および中挿入体小脳ｃＤＮＡライブラリーを、放射能標識したＭＥＴＡＢ５へのハイブリダイゼーションについてスクリーニングした。海馬ライブラリーに３つのハイブリダイズするプラーク（ＭＥＴＡＢ１０−ＭＥＴＡＢ１２）が同定され、小脳ライブラリーの別の一次スクリーニングで５つの追加のハイブリダイズするプラーク（ＭＥＴＡＢ１３−ＭＥＴＡＢ１７）が同定された。選択されたプラークを精製した。
【００９５】
単離されたクローンの性状解析
制限酵素マッピングとＤＮＡ配列解析による精製したプラークの挿入体の性状解析から、単離されたクローンによりヒトｍＧｌｕＲ５転写体の少なくとも３つの明らかなスプライス変種が表されていることが判明した。ＭＥＴＡＢ１の分析により、これは翻訳開始コドンを含有するが翻訳停止コドンは含有しないことが示された。推測されるアミノ酸配列は、ラットのｍＧｌｕＲ１の推測されるアミノ酸配列に約７０％同一であり、ラットのｍＧｌｕＲ５の推測されるアミノ酸配列とは＞９０％の同一性を有している［アベ（Abe）ら、（１９９２）J. Biol. Bhem. ２６７：１３３６１−１３３６８］。
【００９６】
ＭＥＴＡＢ５のＤＮＡ配列解析は、ＭＥＴＡＢ５は５’末端でＭＥＴＡＢ１の３’末端と重複し、３’方向へ追加の３４３ヌクレオチドが続いていることを示した。ＭＥＴＡＢ１とＭＥＴＡＢ５の重複領域を比較すると、ＭＥＴＡＢ１はＭＥＴＡＢ５に存在しない９６ヌクレオチドを有していた（すなわち、ＭＥＴＡＢ１はＭＥＴＡＢ５に対して９６ヌクレオチド挿入を含有する）。ＭＥＴＡＢ５はまた、翻訳停止コドンを持っていない。ＭＥＴＡＢ１２挿入体は５’末端でＭＥＴＡＢ５の３’末端と重複するが、さらに３’末端方向に延長して翻訳停止コドンを有する。
【００９７】
ＭＥＴＡＢ２のＤＮＡ配列解析により、５’末端の最初の８６９ヌクレオチドはＭＥＴＡＢ１の３’末端の一部と重複し、同じであった。しかし、ＭＥＴＡＢ１とＭＥＴＡＢ２の配列はＭＥＴＡＢ１の９６ヌクレオチド挿入の最初で分岐していた。ＭＥＴＡＢ２は３’末端方向に約２７００ヌクレオチド延長し、ＭＥＴＡＢ１との分岐点の４ヌクレオチドだけ３’方向に推定翻訳停止コドンを有する。
【００９８】
ＭＥＴＡＢ４の部分的ＤＮＡ配列解析は、これが別のヒトメタボトロピック受容体であるｍＧｌｕＲ１の一部を含有することを示していた（実施例１．Ｂ．を参照）。
【００９９】
全長ｍＧｌｕＲ５ ｃＤＮＡ作成体の調製
ｃＤＮＡのインビトロ転写体の調製および／または哺乳動物細胞でのｃＤＮＡの発現に使用するために、ヒトｍＧｌｕＲ５転写体の３つの推定スプライス変種を表す全長作成体（ｍＧｌｕＲ５ａ、ｍＧｌｕＲ５ｂそしてｍＧｌｕＲ５ｃと呼ぶ）を作成し、発現ベクター中に取り込むことができる。典型的に使用される基礎となる発現ベクターは、ｐＣＭＶ−Ｔ７−３またはｐＣＭＶ−Ｔ７−２である（図１を参照）。プラスミドｐＣＭＶ−Ｔ７−３はｐＵＣ１９ベースのベクターであり、ＣＭＶ（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー、プロモーターのすぐ下流に位置するＳＶ４０スプライスドナー／スプライスアクセプター部位、ＳＶ４０スプライス部位のすぐ下流に位置するＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ７プロモーターの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびＴ７プロモーターとポリアデニル化シグナルの間のポリリンカーを含有する。すなわちこのベクターは、哺乳動物宿主細胞中での異種ＤＮＡの発現に必要なすべての制御成分を含有する（異種ＤＮＡはポリリンカーでベクターに取り込まれる）。さらにＴ７プロモーターはポリリンカーのすぐ上流に位置するため、このプラスミドは、ポリリンカーでベクターにサブクローニングされた異種ＤＮＡのインビトロ転写体の合成に使用される。ｐＣＭＶ−Ｔ７−３とｐＣＭＶ−Ｔ７−２は、ポリリンカー中の制限酵素部位の配向のみが異なる。
【０１００】
全長ｍＧｌｕＲ５ａ作成体（配列番号７を参照）を調製するために、クローンＭＥＴＡＢ１、ＭＥＴＡＢ５およびＭＥＴＡＢ１２の部分を一緒に結合させた。まず操作を容易にするために、ＭＥＴＡＢ１、ＭＥＴＡＢ５およびＭＥＴＡＢ１２の挿入体をＥｃｏＲＩ断片としてλｇｔ１０から別々に、ＥｃｏＲＩ消化ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州）に移した。ＭＥＴＡＢ１挿入体を含有するｐＧＥＭ−７ＺｆベクターをＳｃａＩ／ＮｈｅＩで消化して、アンピシリン耐性遺伝子の５’半分とＭＥＴＡＢ１挿入体の５’部分（配列番号７のヌクレオチド１−２７２４）を含有する３．８kb断片を放出させた。ＭＥＴＡＢ５の挿入体を含有するｐＧＥＭ−７ＺｆベクターをＳｃａＩ／ＮｈｅＩで消化して、アンピシリン耐性遺伝子の３’半分とＭＥＴＡＢ５挿入体の３’部分（配列番号７のヌクレオチド２７２５−３４６９）を含有する２．６kb断片を放出させ、この断片を、ＭＥＴＡＢ１を含有するｐＧＥＭ−７Ｚｆベクターからの３．８kb断片に結合させてｐＧＥＭ−ＭＥＴＡＢ１＋５を作成した。ｐＧＥＭ−ＭＥＴＡＢ１＋５をＳｃａＩ／ＮｈｅＩで消化して、アンピシリン耐性遺伝子の５’半分と配列番号７のヌクレオチド１−３３１６を含有する４．４kb断片を放出させた。次にこの４．４kb断片を、ＭＥＴＡＢ１２挿入体を含有するｐＧＥＭ−７ＺｆベクターのＳｃａＩ／ＮｈｅＩ（部分）消化により得られた２．６kb断片［この２．６kb断片はアンピシリン耐性遺伝子の３’半分とＭＥＴＡＢ１２の３’部分（配列番号７のヌクレオチド３３１７−４０８５）を含有する］に結合させた。得られたベクターはｐＧＥＭ−７Ｚｆ中に完全なｍＧｌｕＲ５ａコーディング配列を含有していた。全長ｍＧｌｕＲ５ａ ｃＤＮＡを、Ａａｔ II（平滑末端）−Ｈｉｎｄ III断片としてベクターから単離し、ＮｏｔＩ（平滑末端）／Ｈｉｎｄ III消化ｐＣＭＶ−Ｔ７−３にサブクローニングして、作成体ｍＧｌｕＲ５ａ１を作成した。
【０１０１】
要約すると、作成体ｍＧｌｕＲ５ａ１は、ＭＥＴＡＢ１からの５’非翻訳配列の３６９塩基対（配列番号７のヌクレオチド１−３６９）と、ｍＧｌｕＲ５受容体のｍＧｌｕＲ５ａ変種の完全なコーディング配列（配列番号７のヌクレオチド３７０−３９１２）、および３’非翻訳配列の１７３塩基対（配列番号７のヌクレオチド３９１３−４０８５）を含有する。ｍＧｌｕＲ５ａをコードする配列は、哺乳動物宿主細胞中で受容体を発現するために、そしてツノガエル（Xenopus）卵母細胞で発現されるＤＮＡのインビトロ転写体を作成するのに使用するために、ｐＣＭＶ−Ｔ７−３中の制御成分に機能的に結合している。
【０１０２】
２つの追加のｍＧｌｕＲ５ａ作成体（ｍＧｌｕＲ５ａ２とｍＧｌｕＲ５ａ３）を、最初のｍＧｌｕＲ５ａ作成体の５’非翻訳領域を修飾して調製した。上記のｍＧｌｕＲ５ａ作成体は、提唱されている翻訳開始コドン（配列番号７のヌクレオチド３７０から３７２）に先行する５’非翻訳領域中に７つのおそらく不適切なＡＴＧコドンを含有する。ｍＧｌｕＲ５ａ１作成体をＢＡｌ３１で消化して、以下を行う：（１）配列の２５５ヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド１−２５５であり、上流のＡＴＧトリプレット７つのうち６つを含有する）を除去して、ｍＧｌｕＲ５ａ２を作成する、そして（２）配列の３４８ヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド１−３４８であり、上流のＡＴＧトリプレットのすべてを含有する）を除去して、ｍＧｌｕＲ５ａ３を作成する。すなわち、ｍＧｌｕＲ５ａ２は、５’非翻訳配列の一部が欠如していること以外はｍＧｌｕＲ５ａ１と同じであり、従って提唱される翻訳開始コドンの上流に１つのみのＡＴＧトリプレットを含有する。同様に、ｍＧｌｕＲ５ａ３は、提唱される翻訳開始コドンの上流のすべてのＡＴＧトリプレットが欠如していること以外はｍＧｌｕＲ５ａ１と同じであり、５’非翻訳配列の２１ヌクレオチドのみを含有する。
【０１０３】
３つ目のｍＧｌｕＲ５ａ作成体（ＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａ）は、以下のようにｍＧｌｕＲ５ａのＭＭＴＶプロモーター制御発現に使用するために調製した。ｍＧｌｕＲ５ａ３をＸｂａＩで消化した。ＳＶ４０スプライス部位、全長ｍＧｌｕＲ５ａコーディング配列（および５’非翻訳配列の２１ヌクレオチドと３’非翻訳配列の１７３ヌクレオチド）、およびポリアデニル化シグナルを含有する４．１kb断片を単離し、平滑末端とし、ｐＢＲ３２２の２kbのＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ（平滑末端）断片に結合させて、ｐＢＲ−ｈｍＧｌｕＲ５を作成した。ＭＭＴＶＬＴＲプロモーターとアンピシリンおよびネオマイシン耐性遺伝子を含有するベクターｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）をＢａｍＨＩで消化して、ネオマイシン耐性遺伝子を除去し、再結合させた。次にこのベクターをＥｃｏＲＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子を含有する断片を逆配向で大きい方のベクター断片に再結合させてｐＭＡＭｎｅｏ ａｍｐｏｐｐを作成した。このベクターをＰｓｔＩ／ＮｈｅＩで消化して、アンピシリン耐性遺伝子の５’部分とＭＭＴＶ−ＬＴＲを含有する２．３kbの断片を単離した。プラスミドｐＢＲ−ｈｍＧｌｕＲ５をＰｓｔＩ／ＸｂａＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子の３’部分とｍＧｌｕＲ５ａ配列（ＳＶ４０スプライス部位とポリアデニル化シグナルとともに）を含有する５．３kbの断片を、ｐＭＡＭｎｅｏ ａｍｐｏｐｐの２．３kbのＰｓｔ／ＮｈｅＩ断片に結合させてＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａを作成した。
【０１０４】
すなわち、ｐＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａは、ＭＭＴＶ−ＬＴＲを含有し、ｍＧｌｕＲ５ａ ＤＮＡ（配列番号７のヌクレオチド３４９−４０８５を含有する）と機能的に結合したＳＶ４０スプライス部位が続き、この後にポリアデニル化シグナルが続く。
【０１０５】
４つ目のｍＧｌｕＲ５ａ作成体（ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ５）は、以下のようにｍＧｌｕＲ５ａのＳＶ４０プロモーター制御発現に使用するために調製した。ｍＧｌｕＲ５ａ３をＸｈｏＩで部分的に消化し、クレノウ（Klenow）で処理し、自身と再結合させ、こうしてｍＧｌｕＲ５ａ ＤＮＡの３’に位置するＸｈｏＩ部位を破壊した。次にプラスミドをＳｃａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＳＶ４０スプライス部位、全長ｍＧｌｕＲ５ａコーディング配列（および５’非翻訳配列の２１ヌクレオチドと３’非翻訳配列の１７３ヌクレオチド）、ポリアデニル化シグナルおよびアンピシリン耐性遺伝子の３’部分を含有する断片を作成した。プラスミドｐＳＶβ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）をＳｃａＩ／ＸｈｏＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子とＳＶ４０早期プロモーターを含有する断片を、ｍＧｌｕＲ５ａ ＤＮＡを含有するＳｃａＩ／ＸｈｏＩ断片に結合させて、ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ５を作成した。すなわち、ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ５は、ＳＶ４０早期プロモーターを含有し、ｍＧｌｕＲ５ａ ＤＮＡ（配列番号７のヌクレオチド３４９−４０８５を含有する）と機能的に結合したＳＶ４０スプライス部位が続き、この後にポリアデニル化シグナルが続く。
【０１０６】
全長ｍＧｌｕＲ５ｂ作成体を調製するために、ｍＧｌｕＲ５ａ作成体
（ｍＧｌｕＲ１ａ１、ｍＧｌｕＲ５ａ２またはｍＧｌｕＲ５ａ３）をＮｈｅＩ／ＰｍｌＩで消化し、配列番号７のヌクレオチド２７２５−３０２０を含有する断片を放出させる。次に残りのベクター断片を、ＭＥＴＡＢ１からの単離したＮｈｅＩ／ＰｍｌＩ断片に結合させる。得られるベクター（ｍＧｌｕＲ５ｂ）は、配列番号７のヌクレオチド２９９９と３０００の間に位置する９６塩基対の挿入体（配列番号９のヌクレオチド３０００−３０９５）を含有する以外は、これが得られたｍＧｌｕＲ５ａ作成体と同じである。配列番号９は、ベクターｍＧｌｕＲ５ａ１から調製した全長ｍＧｌｕＲ５ｂ ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列である。
【０１０７】
全長ｍＧｌｕＲ５ｃ作成体を調製するために、ｍＧｌｕＲ５ａ作成体
（ｍＧｌｕＲ１ａ１、ｍＧｌｕＲ５ａ２またはｍＧｌｕＲ５ａ３）をＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII（Ｈｉｎｄ III部位は、ｍＧｌｕＲ５ａベクターのｐＣＭＶ−Ｔ７−３部分のポリリンカー内に存在する）で消化し、配列番号７のヌクレオチド２７２５−４０８５を含有する断片を放出させる。次に残りのベクター断片を、ＭＥＴＡＢ２から単離したＮｈｅＩ／Ｈｉｎｄ III断片に結合させる。得られる全長ｃＤＮＡ（ｍＧｌｕＲ５ｃ）（配列番号１１）は、コーディング配列の最初の２６３０ヌクレオチドについては、これが調製されたｍＧｌｕＲ５ａ作成体と同じであるが、コーディング配列のヌクレオチド２６３１で、ｍＧｌｕＲ５ｃとｍＧｌｕＲ５ａのコーディング配列は分岐（例えば、配列番号７のヌクレオチド３０００で始まる）し、ｍＧｌｕＲ５ｃコーディング配列はコーディング配列のヌクレオチド２６３１としてグアニンヌクレオチドを有し、その後に翻訳停止コドン（配列番号１１のヌクレオチド３００１−３００３）が続く。
【０１０８】
Ｂ．ｍＧｌｕＲ１受容体ｃＤＮＡ
ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
中挿入体小脳ライブラリーを、ラットのｍＧｌｕＲ１受容体（ヌクレオチド１から３０３１および５’非翻訳配列：マス（Masu）ら、（１９９１）Nature ３４９：７６０−７６５）をコードするＤＮＡの断片へのハイブリダイゼーションについてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、４２℃で５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５０％ホルムアルミド、０．２％ＳＤＳおよび２００μg／mlの変性した超音波処理したニシン精子ＤＮＡ中で行ない、洗浄は５５℃で１×ＳＳＰＥと０．２％ＳＤＳ中で行なった。３つのハイブリダイズするクローン（ＭＥＴＡＢ７−ＭＥＴＡＢ９）が同定された。
【０１０９】
次のスクリーニングで、ヒト中挿入体小脳ｃＤＮＡライブラリーの１×１０６組換え体の各平板を、追加のヒトｍＧｌｕＲ１クローンとプローブ結合させた。この平板をまず、ラットのｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド１−１２５６（および５’非翻訳配列）を含有するＤＮＡ断片（すなわち、５’プローブ）とハイブリダイゼーションさせ、次にクローンＭＥＴＡＢ７−ＭＥＴＡＢ９を同定したこの前のスクリーニングで使用したものと同じハイブリダイゼーション条件と洗浄条件を用いて、ラットｍＧｌｕＲ１ａ ｃＤＮＡのヌクレオチド２０７５−３３１０を含有するＤＮＡ断片（すなわち、３’プローブ）に連続してハイブリダイズさせた。５’プローブへのハイブリダイゼーションにより３つのクローン（ＭＥＴＡＢ１８、ＭＥＴＡＢ２１およびＭＥＴＡＢ２２）が同定され、そして３’プローブへのハイブリダイゼーションにより４つのクローン（ＭＥＴＡＢ１４、ＭＥＴＡＢ２０、ＭＥＴＡＢ３２およびＭＥＴＡＢ３５）が同定された。
【０１１０】
このラットのｍＧｌｕＲ１断片をプローブとして使用して、さらなるｍＧｌｕＲ１クローンのために大挿入体ヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションと洗浄条件は、中挿入体小脳ライブラリーから６つのｍＧｌｕＲ１クローンを単離した時に使用したものと同じである（例えば、ハイブリダイゼーション溶液では２０％ホルムアルデヒドを使用した）。３つのプラーク（ＭＥＴＡＢ５８、ＭＥＴＡＢ５９およびＭＥＴＡＢ６０）がプローブにハイブリダイズした。
【０１１１】
単離されたクローンの性状解析
精製したプラークの挿入体を制限酵素マッピングとＤＮＡ配列解析により性状解析した。ＭＥＴＡＢ５８は、約２．８kbであり、５’非翻訳配列、翻訳開始コドンおよび約２．３kbのコーディング配列を含有する。ＭＥＴＡＢ５８の３’末端は、ＭＥＴＡＢ１４の５’末端と重複する。ＭＥＴＡＢ１４は３’方向へ約７００塩基対延長し、翻訳停止コドンを含有する。すなわち、ＭＥＴＡＢ５８とＭＥＴＡＢ１４は重複して、全長ｍＧｌｕＲ１受容体をコードする（配列番号１を参照）。他のクローンも、翻訳開始コドンと翻訳停止コドンの間に位置するｍＧｌｕＲ１コーディング配列の部分からのヌクレオチド配列を含有する、部分ｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡである。
【０１１２】
ヒトｍＧｌｕＲ１転写体の３’末端をコードする追加のクローンがヒトｃＤＮＡライブラリー中に存在するか否かを測定するために、海馬／脳幹神経節および小脳ライブラリーからのｃＤＮＡの核酸増幅を行なった。５’プライマーは配列番号１のヌクレオチド２２１８から２２４０よりなり、３’プライマーは、ラットのｍＧｌｕＲ１ａコーディング配列のアミノ酸８９０−８９７に基づく縮重オリゴヌクレオチドであった（ピン（Pin）ら、（１９９２）Neurobiology ８９：１０３３１−１０３３５を参照）。増幅生成物をゲル電気泳動で解析した。海馬／脳幹神経節中にのみ１つの生成物（すなわち、５００塩基対断片）が検出された。
【０１１３】
ｍＧｌｕＲ１転写体の３’末端を示す追加のクローンを得るために、海馬および小脳ｃＤＮＡライブラリーを、前述のヒトｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡを得るのに使用した条件と同様の条件を使用してラットのｍＧｌｕＲ１ａ ｃＤＮＡの３’末端からの断片（例えば、ラットのｍＧｌｕＲ１ａ ｃＤＮＡの約２kbのＮｃｏＩ／ＣｌａＩ断片）でスクリーニングすることができる。このプローブは、択一的にスプライスされるようではないｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡの３’部分に対応する。次にハイブリダイズするクローンを制限酵素マッピングとＤＮＡ配列決定により解析して、異なる３’末端が示されるか否かを決定する。
【０１１４】
全長ｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡ作成体の調製
ヒトｍＧｌｕＲ１受容体のＢ型をコードする全長作成体を調製するために、クローンＭＥＴＡＢ５８とＭＥＴＡＢ１４の一部を結合させた。ＭＥＴＡＢ５８をＥｃｏＲＩ／ＡｃｃＩで消化し、配列番号１のヌクレオチド１５４−２６１２を含有する２４５９塩基対の断片を単離する。ＭＥＴＡＢ１４の７０４塩基対断片（配列番号１のヌクレオチド２６１３−３３２１を含有する）を、ＭＥＴＡＢ１４のＡｃｃＩ／ＸｈｏＩ消化により単離する。次にこの断片をＭＥＴＡＢ５８の２４５９塩基対に結合させて、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ消化ベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−３に結合させる。ヒトｍＧｌｕＲ１Ｂをコードする得られた作成体は、５’非翻訳配列の２３４ヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド１５４−３８７）、全ｍＧｌｕＲ１Ｂコーディング配列（配列番号１のヌクレオチド３８８−３１０８）、および３’非翻訳配列の２１３ヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド３１０９−３３２１）を含有する。ｍＧｌｕＲ１Ｂをコードする配列は、哺乳動物細胞中での発現のためのｐＣＭＶ−Ｔ７−３中の制御成分に機能的に結合している。
【０１１５】
種々のヒト組織中で実際に発現されるｍＧｌｕＲ５およびｍＧｌｕＲ１受容体を決定するために、種々の方法が使用できる。例えば、本明細書に記載のｍＧｌｕＲ転写体の挿入／欠失（すなわち、分岐の領域）の５’と３’に位置するヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、種々の組織から単離されたＲＮＡおよび／または種々の組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーの核酸増幅をプライムすることができる。増幅生成物の有無および生成物のサイズは、組織中で発現される変種を示す。生成物はまた、ＤＮＡ配列解析により詳細に性状解析される。
【０１１６】
ＲＮａｓｅ保護測定法を用いて、種々の組織中で発現される変種転写体を決定することもできる。これらの測定法は、総細胞性ＲＮＡの複雑な混合物中のＲＮＡ種を検出し定量するための感度の良い方法である。ｍＧｌｕＲＤＮＡの一部を標識し、細胞性ＲＮＡとハイブリダイズさせる。細胞性ＲＮＡ中に相補的なｍＲＮＡが存在する場合は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成する。次にこのＲＮＡ試料をＲＮａｓｅで処理して、１本鎖ＲＮＡを分解させる。ＲＮＡ−ＤＮＡはＲＮａｓｅ分解から保護され、ゲル電気泳動やオートラジオグラフィーにより目視できるようにされる。
【０１１７】
例えばヒトｍＧｌｕＲ ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションによるヒトメタボトロピック受容体をコードする配列を含有するゲノムクローンの単離と、引き続くクローンの性状解析は、ｍＧｌｕＲ一次転写体の可能なスプライス変種に関してさらなる情報を与える。
【０１１８】
Ｃ．ｍＧｌｕＲ３受容体ｃＤＮＡ
ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡ合成をプライムさせ、次にλｇｔ１０ベクターへの結合について１．０−２．８kbのｃＤＮＡを選択することにより作成された）を、ラットｍＧｌｕＲ２ ｃＤＮＡの５００塩基対のＳｍａＩ／ＸｂａＩ断片とラットｍＧｌｕＲ３ ｃＤＮＡの３kbのＡｃｃＩ／ＢａｍＨＩ断片へのハイブリダイゼーションについて選択した［タナベ（Tanabe）ら、（１９９２）Neuron ８：１６９−１７９］。ハイブリダイゼーションは、４２℃で５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５０％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳおよび２００μg／mlの変性した超音波処理したニシン精子ＤＮＡ中で行ない、洗浄は６５℃で０．５×ＳＳＰＥと０．２％ＳＤＳ中で行なった。３つのハイブリダイズするクローン（ＭＥＴＡＢ４０、ＭＥＴＡＢ４１、およびＭＥＴＡＢ４５）が同定された。
【０１１９】
次にＭＥＴＡＢ４５の５’末端の一部（すなわち、最初の２４４塩基対；配列番号５のヌクレオチド２６３４−２８７７）を用いて、増幅した小脳ライブラリー（ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡ合成をプライムし、次にλｇｔ１０ベクターへの結合について＞２．８kbのｃＤＮＡを選択することにより作成される）、そして増幅した海馬ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡ合成をプライムし、次にλｇｔ１０ベクターへの結合について＞２．０kbのｃＤＮＡを選択することにより作成される）を追加のｍＧｌｕＲ３についてスクリーニングした。各ライブラリーから１００万のクローンがスクリーニングされた。ハイブリダイゼーション条件と洗浄条件は、海馬ライブラリーからのＭＥＴＡＢ４０、ＭＥＴＡＢ４１およびＭＥＴＡＢ４５を単離するのに使用したものと同じである。３つのハイブリダイズするクローンが各ライブラリーで同定された（小脳ライブラリーではＭＥＴＡＢ４６、ＭＥＴＡＢ４９およびＭＥＴＡＢ５０、そして海馬ライブラリーではＭＥＴＡＢ４７、ＭＥＴＡＢ４８およびＭＥＴＡＢ５１Ｂ）。
【０１２０】
単離したクローンの性状解析
精製したプラークの挿入体を、制限酵素マッピングとＤＮＡ配列解析により性状解析した。単離したクローンのおのおのは、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体の一部をコードするクローンメタボトロピック４０（例えば実施例１．Ｄ．を参照）を除いて、ヒトｍＧｌｕＲ３受容体の一部である。クローンＭＥＴＡＢ４１、ＭＥＴＡＢ４５、ＭＥＴＡＢ４７−４９は、ｍＧｌｕＲ３コーディング配列の３’からの配列および翻訳停止コドンを含有する。クローンＭＥＴＡＢ４６、ＭＥＴＡＢ５０およびＭＥＴＡＢ５１Ｂは、ｍＧｌｕＲ３ ｃＤＮＡの５’末端からの配列（翻訳開始コドンと種々の量の５’非翻訳配列を含む）を含有する。
【０１２１】
全長ｍＧｌｕＲ３ ｃＤＮＡ作成体の調製
ＭＥＴＡＢ４８とＭＥＴＡＢ４６またはＭＥＴＡＢ５１Ｂの一部を結合させて、全長ヒトｍＧｌｕＲ３コーディング配列を含有する４つの作成体を調製した。この全長コーディング配列は配列番号５（ヌクレオチド１０６４−３７０３）に与えられる。クローンＭＥＴＡＢ４６とＭＥＴＡＢ５１Ｂの挿入体は、ＥｃｏＲＩ断片としてｐＣＭＶ−Ｔ７−３中に別々にサブクローニングされた。クローンＭＥＴＡＢ４８の挿入体は、ＥｃｏＲＩ断片としてｐＣＭＶ−Ｔ７−２にサブクローニングされた。
【０１２２】
作成体ｍＧｌｕＲ３Ｂを作成するために、ＭＥＴＡＢ５１Ｂ挿入体を含有するｐＣＭＶ−Ｔ７−３プラスミドをＳｃａＩ／Ｂｇｌ IIで消化し、アンピシリン耐性遺伝子の５’半分とＭＥＴＡＢ５１Ｂ挿入体の５’部分（配列番号５のヌクレオチド７４８−１６７１）を含有する２．６kbの断片を単離した。この断片を、ＭＥＴＡＢ４８の挿入体を有するｐＣＭＶ−Ｔ７−２プラスミドのＳｃａＩ／Ｂｇｌ II消化物から単離した４．３kbの断片［この４．３kbの断片はアンピシリン耐性遺伝子の３’半分とＭＥＴＡＢ４８の３’部分を有する（配列番号５のヌクレオチド１６７２−３９１９）］に結合させた。得られた作成体（ｍＧｌｕＲ３Ｂ）は、３１６ヌクレオチドの５’非翻訳配列（配列番号５のヌクレオチド７４８−１０６３）、全ｍＧｌｕＲ３コーディング配列（配列番号５のヌクレオチド１０６４−３７０３）、および２１６ヌクレオチドの３’非翻訳配列（配列番号５のヌクレオチド３７０４−３９１９）を含有する。ｍＧｌｕＲ３Ｂをコードする配列は、哺乳動物細胞中での発現のためにベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−３とｐＣＭＶ−Ｔ７−２からの制御成分に機能的に結合している。
【０１２３】
作成体ｍＧｌｕＲ３Ｃを作成するために、ＭＥＴＡＢ４６の挿入体を有するｐＣＭＶ−Ｔ７−３プラスミドを、ＳｃａＩ／Ｂｇｌ IIで消化し、アンピシリン耐性遺伝子の５’半分とＭＥＴＡＢ４６の５’部分を含有する３．４kbの断片（配列番号５のヌクレオチド１−１６７１）を単離した。この断片を、ＭＥＴＡＢ４８の作成体ｍＧｌｕＲ３Ｂで使用したものと同じＳｃａＩ／Ｂｇｌ II断片に結合させた。得られた作成体（ｍＧｌｕＲ３Ｃ）は、５’非翻訳配列の１０６３ヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド１−１０６３）、全ｍＧｌｕＲ３コーディング配列（配列番号５のヌクレオチド１０６４−３７０３）、および３’非翻訳配列の２１６ヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド３７０４−３９１９）を含有する。このｍＧｌｕＲ３Ｃをコードする配列は、哺乳動物細胞中での発現のためにベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−２とｐＣＭＶ−Ｔ７−３からの制御成分に機能的に結合している。
【０１２４】
作成体ｍＧｌｕＲ３Ａは、ｍＧｌｕＲ３ＣをＥｃｏＲＶとＮｏｔＩで消化して、配列番号５のヌクレオチド１−１０３５を含有する断片を除去して、ＮｏｔＩ部位を平滑末端として、次に大きい方のベクター断片を再結合させることにより作成した。作成体ｍＧｌｕＲ３Ａは、２８ヌクレオチドの５’非翻訳配列（配列番号５のヌクレオチド１０３６−１０６３）、全ｍＧｌｕＲ３コーディング配列（配列番号５のヌクレオチド１０６４−３７０３）、および２１６ヌクレオチドの３’非翻訳配列（配列番号５のヌクレオチド３７０４−３９１９）を含有する。このｍＧｌｕＲ３Ａをコードする配列は、哺乳動物細胞中での発現のためにベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−３とｐＣＭＶ−Ｔ７−２からの制御成分に機能的に結合している。
【０１２５】
作成体ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ３Ｃ（ｍＧｌｕＲ３のＳＶ４０プロモーター制御発現に使用するため）を作成するために、ＭＥＴＡＢ４６の挿入体を有するｐＣＭＶ−Ｔ７−３プラスミドをＳｃａＩ／ＮｏｔＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子の３’部分と全ＭＥＴＡＢ４６挿入体を含有する断片を単離した。プラスミドｐＳＶβをＳｃａＩ／ＮｏｔＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子５’部分とＳＶ４０早期プロモーターおよびスプライス部位を含有する断片を、ＭＥＴＡＢ４６を有するｐＣＭＶ−Ｔ７−３ベクターからのＳｃａＩ／ＮｏｔＩ断片に結合させて、ｐＳＶ−ＭＥＴＡＢ４６を作成した。プラスミドｐＳＶ−ＭＥＴＡＢ４６をＳｃａＩ／Ｂｇｌ IIで消化し、アンピシリン耐性遺伝子の５’部分、ＳＶ４０早期プロモーターおよびスプライス部位そしてＭＥＴＡＢ４６の５’部分（配列番号５のヌクレオチド１−１６７１）を含有する断片を単離した。この断片を、作成体ｍＧｌｕＲ３ＢやｍＧｌｕＲ３Ｃで使用したものと同じＭＥＴＡＢ４８のＳｃａＩ／Ｂｇｌ II断片に結合させた。得られた作成体（ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ３Ｃ）は、ＳＶ４０プロモーターを含有し、ｍＧｌｕＲ３ ＤＮＡ（配列番号５のヌクレオチド１−３９１９を含有する）と機能的に結合したＳＶ４０スプライス部位が続き、この後にポリアデニル化シグナルが続く。
【０１２６】
Ｄ．ｍＧｌｕＲ２受容体ｃＤＮＡ
実施例１．Ｃ．に記載したようにヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーからクローンＭＥＴＡＢ４０を単離した。このＭＥＴＡＢ４０の挿入体ｃＤＮＡは長さが１１００塩基対であり、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体の３’末端（翻訳停止コドンと３’末端非翻訳配列を含む）をコードする。ＭＥＴＡＢ４０の最初の３５５ヌクレオチドは配列番号３に提供され、ＭＥＴＡＢ４０の最後の３４３ヌクレオチド（すべて３’非翻訳配列からである）は配列番号１３に提供される。
【０１２７】
ｍＧｌｕＲ２転写体の５’部分を示すＤＮＡを含有するクローンを単離するために、ＭＥＴＡＢ４０の５’末端に対応するオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションについて、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。ハイブリダイズするクローンを精製し、ＤＮＡ配列解析により性状解析する。ＭＥＴＡＢ４０に重複し翻訳開始コドンを含有するクローンを、適当な制限部位でＭＥＴＡＢ４０に結合させて、全長ｍＧｌｕＲ２をコードするｃＤＮＡ作成体を作成することができる。
【実施例２】
【０１２８】
卵母細胞中の組換えヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の発現
ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡを含有する作成体から調製したインビトロ転写体を、ツノガエル（Xenopus）卵母細胞に注入した。２電極の電位固定法（例えば、スツマー（Stuhmer）（1992）Meth. Enzymol. ２０７：３１９−３３９を参照）を用いて、卵母細胞トランスメンブレン電流の電気生理的測定を行なった。
【０１２９】
Ａ．インビトロ転写体の調製
作成体ｍＧｌｕＲ５ａ３中に含有されるメタボトロピック受容体ｃＤＮＡのキャップされた組換え転写体を、メガスクリプト（Megascript）キット（カタログ番号＃１３３４、アンビオン社（Ambion Inc.）、オースチン、テキサス州）を用いて、線状化したプラスミドから合成した。各合成転写体の質量を紫外吸光度法により測定し、各転写体の完全性をアガロースゲルの電気泳動により測定した。
【０１３０】
Ｂ．電気生理学
卵母細胞１つにつき、１０−５０ngのメタボトロピック受容体転写体を、ツノガエル（Xenopus）卵母細胞に注入した。卵母細胞の調製と注入は、ダスカル（Dascal）の方法［（１９８７）Crit. Rev. Biochem. ２２：３１７−３８７］に従って行なった。ｍＲＮＡ注入の２から６日後、２電極電位固定法を用いて卵母細胞を試験した。細胞はリンゲル溶液（１１５mM ＮａＣｌ、２．５mM ＫＣｌ、１．８mM ＣａＣｌ２、１０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．３）浴に浸漬し、膜電位は−８０から−１００mVに固定した。薬剤含有溶液の６０μlずつをピペットで直接浴に入れた。アクソテープ（AXOTAPE）バージョン１．２ソフトウェア（アクソン・インスツルメンツ（Axon Instruments）、フォスターシティ、カリホルニア州）を用いてＰＣ−３８６中のラボマスター（Labmaster）データ採取ボードを用いて２−５Hzでデータをサンプリングした。データをレーザープリンターに取り出すか、またはシグマプロット（Sigmaplot）バージョン５．０を用いてプロットした。
【０１３１】
メタボトロピック受容体調節化合物（すなわち、０．００１−０．１μMキスカル酸、０．１−１０μMグルタミン酸および０．１−３００μM １Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤ（１−アミノ−シクロペンチル−１，３−ジカルボン酸）を浴に適用し、トランスメンブレン電流を記録した。化合物の適用後相当の電流が検出された。種々の量の各化合物を適用後の電流を比較する用量応答試験で、電流の大きさは各化合物の濃度の上昇に伴い増加することが明らかになった。これらのデータを解析した結果、各化合物のＥＣ５０を計算することができ、これを化合物の相対電位の測定に使用した。
【実施例３】
【０１３２】
哺乳動物細胞におけるヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブユニットの組換え発現
ヒト胎児性腎（ＨＥＫ）細胞とチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（すなわち、ＤＧ４４細胞；ウーラウプ（Urlaub）ら（１９８６）Som. Cell. Molec. Genet. １２：５５５を参照）を、ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションさせた。種々の方法（例えば、イノシオトールリン酸（ＩＰ１）測定法、Ｃａ＋＋−感受性蛍光指示薬ベースの測定法、および［３Ｈ］−グルタミン酸結合測定法）を用いて、メタボトロピック受容体の発現について解析した。
【０１３３】
Ａ．ＨＥＫ２９３細胞の一時的トランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞を、ｍＧｌｕＲ５ａ（作成体ｍＧｌｕＲ５ａ２とｍＧｌｕＲ５ａ３および作成体ＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａ）受容体をコードするＤＮＡで一時的トランスフェクションを行なった。約２×１０６のＨＥＫ２９３細胞を標準的ＣａＰＯ４トランスフェクション法［ウィグラー（Wigler）ら、（１９７９）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A ７６：１３７３−１３７６を参照］に従い、目的のプラスミドの５−１８μg（あるトランスフェクション体においては０．１８μg、実施例３．Ｃ．２．を参照）で一時的にトランスフェクションした。さらにＣＭＶプロモーターに融合した大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する、プラスミドｐＣＭＶβｇａｌ（クロンテック・ラボラトリーズ（Clontech Laboratories）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）０．５−２μgを、レポーター遺伝子として同時トランスフェクションして、トランスフェクションの効率を追跡した。β−ガラクトシダーゼとＸ−ｇａｌ基質を含む反応の生成物の直接染色により、β−ガラクトシダーゼ発現についてトランスフェクション体を解析した［ジョーンズ（Jones）（１９８６）EMBO ５：３１３３−３１４２］。トランスフェクション体はまた、β−ガラクトシダーゼ活性の測定によるβ−ガラクトシダーゼ発現について解析することもできる［ミラー（Miller）（１９７２）分子遺伝子学実験（Experiments in Molecular Genetics）のPP. ３５２−３５５, コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）］。
【０１３４】
５μgのＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５Ａで一時的トランスフェクションを行なったＨＥＫ２９３細胞は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターに機能的に結合した糖質コルチコイド受容体をコードするＤＮＡを含有するｐＲＳｈＧＲ（ＡＴＣＣ整理番号６７２００）５μgと同時トランスフェクションをした。これらの細胞における糖質コルチコイド受容体の同時トランスフェクションは、細胞への糖質コルチコイド（例えば、デキサメタゾン）の添加によるＭＭＴＶプロモーター−ｍＧｌｕＲ５ａＤＮＡの発現の誘導を確実にする。
【０１３５】
ＨＥＫ細胞のこれらのトランスフェクションの効率は、標準的効率に典型的なものであった（すなわち、約５０％）。
【０１３６】
Ｂ．哺乳動物細胞の安定なトランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞、Ｌｔｋ−細胞およびＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞は、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて安定にトランスフェクションすることができる［Current Protocols in Molecular Biology, Vol.１，ワイリー・インターサイエンス（Wiley Inter-Science）、増刊１４号、単元９．１．１．−９．１．９（１９９０）］。ＣＨＯ細胞を宿主として使用するときは、ヒトメタボトロピック受容体をコードするｃＤＮＡの発現を制御するにはＳＶ４０プロモーターの使用が一般に好ましい。それぞれ１−２×１０６細胞を含有する１０cmのプレートを、メタボトロピック受容体をコードするＤＮＡ約５−１０μgと選択マーカー（例えば、ネオマイシン−耐性遺伝子（すなわち、ＨＥＫ２９３形質転換体の選択にはネオマイシン耐性遺伝子（すなわち、ｐＳＶ２ｎｅｏ）、Ｌｔｋ−細胞トランスフェクション体にはチミジンキナーゼ遺伝子、またはＤＧ４４細胞形質転換体の選択にはジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子））をコードするＤＮＡ ０．５−１μgを含有するＤＮＡ／リン酸カルシウム沈殿物でトランスフェクションする。適当な培地中で約１４日間の増殖の後、コロニーが形成され、クローニングシリンダーを用いて個々に単離される。次に単離物を限界希釈を行いスクリーニングして、例えば後述の方法を用いてメタボトロピック受容体を発現するものを同定する。
【０１３７】
Ｃ．トランスフェクション体の解析
１．蛍光指示薬に基づく測定
アゴニストによるＧ蛋白結合メタボトロピック受容体の活性化により、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解／細胞内Ｃａ＋＋シグナル化経路および／または阻害性ｃＡＭＰカスケードが刺激される。細胞内カルシウム濃度の一時的上昇の検出法は、ＰＩ加水分解／Ｃａ＋＋動員（mobilization）経路またはＰＩ加水分解／Ｃａ＋＋動員（mobilization）経路と阻害性ｃＡＭＰカスケードの両方にカップリングしたメタボトロピック受容体の機能性発現の解析に適用できる。細胞内カルシウムレベルを測定する１つの方法は、カルシウム感受性蛍光指示薬を用いる。
【０１３８】
フルオ−３（fluo−３）やフラ−２（fura−２）（モレキュラー・プローブズ社（Molecular Probes Inc.）、ユージーン（Eugene）、オレゴン州）のようなカルシウム感受性指示薬は、膜透過性であるアセトキシメチルエステルとして入手できる。アセトキシメチルエステル型の指示薬が細胞内に入ると、サイトゾル性エステラーゼによりエステル基は除去され、このため遊離の指示薬はサイトゾル内に捕捉される。遊離の指示薬とカルシウムが相互作用すると、指示薬の蛍光強度が増加する。従って、指示薬を含有する細胞の細胞内Ｃａ＋＋濃度の上昇は直接蛍光の増強（または、フラ−２を使用する時は、２つの波長での蛍光の比率の増強）として発現される。メタボトロピック受容体を測定するための自動蛍光検出装置が、本出願人の係属中の米国特許出願第０７／８１２，２５４号およびその対応するＰＣＴ特許出願ＵＳ９２／１１０９０号（参考のためその全体が本明細書中に引用される）に記載されている。さらに細胞内Ｃａ＋＋振動を目視できるようにするために蛍光イメージング法を使用することができる。
【０１３９】
ヒトｍＧｌｕＲ５ａ受容体をコードするＤＮＡで一時的トランスフェクションを行なったＨＥＫ細胞を、自動蛍光指示薬ベースの測定法と蛍光イメージング測定法を用いて、機能性組換えメタボトロピック受容体の発現について解析した。同様に、メタボトロピック受容体ＤＮＡで安定にトランスフェクションした細胞も、これらの測定法系を用いて機能性メタボトロピック受容体について解析した。
【０１４０】
ａ．自動蛍光測定法
２×１０５細胞／ウェルの濃度でポリ−Ｌ−リジンでプレコーティングし、２０μMフルオ−３、０．２％プルロニック（Pluronic）Ｆ−１２７をＨＢＳ（１２５mM ＮａＣｌ、５mM ＫＣｌ、１．８mM ＣａＣｌ２、０．６２mM ＭｇＣｌ２、２０mMグルコース、２０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．４）中に含有する培地中で、２０℃で２時間インキュベートしてフルオ−３を充填した９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク（Nunc）、カタログ番号１−６７０８、アラメダ・インダストリーズ（Alameda Industries）、エスコンジド（Escondido）、カリホルニア州）に、トランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞（またはｐＣＭＶ−Ｔ７−３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞）およびｍＧｌｕＲ５ａをコードするＤＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を広げた。次に細胞を測定緩衝液（すなわち、ＨＢＳ）で洗浄した。次にマイクロタイタープレートを蛍光プレートリーダー（例えば、フルオロスカン（Fluoroskan）II、ラボ・プロダクツ・インターナショナル社（Lab Products International, Ltd.）、ラレー（Raleigh）、ノースカロライナ州）に入れ、各ウェルの基礎蛍光を測定し記録してから、ウェルにキスカル酸、グルタミン酸、トランス−ＡＣＰＤ（１−アミノ−シクロペンタン−１，３−ジカルボン酸）、１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤ、ＡＰ３（２−アミノ−３−ホスホノプロピオン酸）、ＡＰ５（２−アミノ−５−ホスホノペンタノン酸）、およびＣＮＱＸ（６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン）を添加した。アゴニストの添加後ウェルの蛍光を繰り返し（０．６３秒間隔で７５回読む）追跡する。
【０１４１】
一般に、トランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞の蛍光は、これらの化合物のどれを添加しても変化しなかった。ｍＧｌｕＲ５ａ３またはＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａ作成体のいずれかで一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の蛍光は、グルタミン酸、キスカル酸、トランス−ＡＣＰＤ、または１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤの添加に応答して上昇した。蛍光はピーク値まで増加し、次に時間とともに化合物の添加前の細胞の基礎レベルまで低下した。ｍＧｌｕＲ５ａ２でトランスフェクションした細胞について、グルタミン酸、キスカル酸またはトランス−ＡＣＰＤ刺激蛍光の増強に対するＡＰ３、ＡＰ５またはＣＮＱＸの影響を調べた。これらの化合物（ＡＰ３、ＡＰ５、またはＣＮＱＸ）のいずれも、これらの細胞中のアゴニスト誘導蛍光増強を阻害しなかった。
【０１４２】
種々の量のグルタミン酸、キスカル酸または１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤを添加後に測定したピーク蛍光値を比較する用量応答試験で、ピーク蛍光の大きさは各化合物の濃度の上昇に伴い増加することが明らかになった。これらのデータを解析した結果、各化合物のＥＣ５０を計算することができ、これを化合物の相対電位の測定に使用した。
【０１４３】
ＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａおよびｐＲＳｈｇＧＲ（糖質コルチコイド受容体作成体）で一時的に同時トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞も、この蛍光測定法で解析した。これらの細胞の蛍光は１００μMのキスカル酸に応答して増加し、測定前に細胞をデキサメタゾン（約１Ｍ）で３７℃で１６時間プレインキュベートするとピーク応答は大きかった。
【０１４４】
ｂ．蛍光イメージング測定法
細胞内Ｃａ＋＋濃度のメタボトロピック受容体介在変化を目視できるようにするために、ｍＧｌｕＲ５ａ３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞とトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞（対照）を、デジタルビデオイメージングで解析した。暗所中で室温で２５分間細胞を１μMのフラ−２（アセトキシメチルエステル）に暴露することにより、トランスフェクション体（ガラス挿入底を有する３５mm培養皿あたり４×１０５細胞）をフラ−２で充填した。次に細胞をＤＭＥＭで３回そしてリンゲル溶液（１６０mM ＮａＣｌ、５mM ＫＣｌ、２mM ＣａＣｌ２、１mM ＭｇＣｌ２、１１mMグルコース、５mM ＨＥＰＥＳ、pH７．３）で４回洗浄した。
【０１４５】
次にトランスフェクション体と非トランスフェクション細胞を、紫外光源として１５０Ｗのキセノンランプを有するアキシオベルト（Axiovert）１００ＴＶ倒立顕微鏡（ツァイス（Zeiss）、オーベルコフレン（Oberkochren）、ドイツ）のステージの上に広げた。４０×１．３Ｎ．Ａ．油浸対物レンズを介して細胞を３４０nmと３８０nmで交互励起するのに、イメージ１フルオル（Fluor）システム（ユニバーサル・イメージング（Univeersal Imaging）、ウェストチェスター、ペンシルバニア州）を使用した。５１０nmより長い波長で出る光を、ＣＣＤ７２強化ＣＣＤカメラ（エム・ティー・アイ ダーゲ（ＭＴＩ Dage）、ミシガン・シティ、インディアナ州）により集め、デジタル化した。３４０nmと３８０nmの励起イメージからバックグランドの蛍光を差し引いた。補正値を使用して３４０／３８０強度比を計算した。較正していないフラ−２比は、細胞内Ｃａ＋＋濃度の変化の信頼できる指標である。
【０１４６】
較正していないフラ−２比を用いて、休止細胞内Ｃａ＋＋濃度（約１００nM）を紫色で、高細胞内Ｃａ＋＋濃度（約１μM）を赤色で疑色イメージを作成した。実験の各比率のイメージについて、定量解析のために、各細胞の１２×１２ピクセル領域内の平均比をソフトウェアにより計算し、さらに解析しグラフを描くために表に取り込んだ。
【０１４７】
ＨＥＫ２９３細胞は、ＰＩ加水分解／Ｃａ＋＋動員経路の受容体介在活性化に必要な細胞内成分を発現することを証明するために、トランスフェクション体と非トランスフェクション細胞（内因性Ｇ蛋白結合ムスカリン性アセチルコリン受容体を発現する）を１mMのカルバミルコリン（ＣＣｈ；ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト）に暴露し、細胞内Ｃａ＋＋濃度の上昇を追跡した。典型的には、イメージング試験でＣＣｈの添加に応答して、大多数の細胞の細胞内Ｃａ＋＋濃度の上昇が検出された。
【０１４８】
トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞およびトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞を、１００μMキスカル酸に応答して細胞内Ｃａ＋＋濃度が上昇するか否かについて追跡した。平均すると、非トランスフェクション細胞の細胞内Ｃａ＋＋濃度は、キスカル酸への暴露後増加しない。これに対して、トランスフェクションした細胞の２６．７±２２．３％のＣａ＋＋濃度は１００μMのキスカル酸の添加に応答して増加した。
【０１４９】
２．ホスファチジルイノシトール加水分解（ＩＰ１）測定法
Ｇ蛋白結合メタボトロピック受容体のアゴニストによる活性化により、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解経路が刺激されるため、ＰＩ加水分解の生成物（例えば、ＩＰ３、ＩＰ２またはＩＰ１）の増加を検出する方法は、ＰＩ加水分解／Ｃａ＋＋動員経路またはＰＩ加水分解／Ｃａ＋＋動員経路と阻害性ｃＡＭＰカスケードにカップリングしたメタボトロピック受容体の機能性発現の解析に応用することができる。ＰＩの加水分解により生成されるＩＰ１および／またはＩＰ２および／またはＩＰ３を測定する１つの方法は、細胞膜リン脂質内への［３Ｈ］−ミオ−イノシトールを取り込み、次に［３Ｈ］−ＩＰ１、［３Ｈ］−ＩＰ２および［３Ｈ］−ＩＰ３を分離し、以下のように各画分の放射能を定量する。
ｍＧｌｕＲ５ａ３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を、８×１０５細胞／ウェルで２４ウェルのマイクロタイタープレートに広げた。細胞を数時間沈降させ、プレートの底に付着させた後、２μCiの［３Ｈ］−ミオ−イノシトール（アマーシャム（Amersham）、カタログ番号＃ＰＴ６−２７１、アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州；比活性＝１７．７Ci／mmol）を各ウェルに添加し３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ニコンダイアフォト（Nikon Diaphot）倒立顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の形態の健常性を評価し、ウェルがコンフルエント（confluent）な細胞層を含有するか否かを測定した。次に培地を吸引し、細胞を０．５mlのクレブス重炭酸緩衝液［１１７．９mM ＮａＣｌ、４．７２mM ＫＣｌ、２．５４mM ＣａＣｌ２、１．１８mM ＭｇＳＯ４、１．１９mM ＫＨ２ＰＯ４、２５mM ＮａＨＣＯ３、１１．１mMデキストロース（９５％ Ｏ２、５％ ＣＯ２、pH７．４で平衡化されている）］で２回洗浄した。細胞を室温で４５分間インキュベートした。次に各ウェルから緩衝液を吸引し、細胞を洗浄し、０．５ml／ウェルで室温で４５分間インキュベートした。次に緩衝液を各ウェルから吸引し、次に１０mM ＮａＣｌの代わりに１０mMのＬｉＣｌを含有する４５０μlのクレブス重炭酸緩衝液（ＩＰ１のイノシトールと無機リンへの加水分解を防ぐために）とともに細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。
【０１５０】
メタボトロピック受容体調節化合物による細胞の処理を始める前に、５０μlのクレブス重炭酸緩衝液（対照）または化合物の最終濃度の１０×のものを各ウェルに添加し、４０分間インキュベートを続けた。各ウェルに１mlの氷冷メタノールを加えてインキュベートを停止させた。
【０１５１】
細胞からＩＰ１を単離するために、プラスチックピペットのチップでプレートの細胞を掻き取って、細胞懸濁物を１２×７５mmガラス試験管に移した。試験管を完全にボルテックス混合し、各反応混合物の１５０μl分（すなわち、総量の１０分の１）を別の試験管に移して蛋白を測定した。１mlのクロロホルムによる抽出により、放射標識膜リン脂質から水溶性リン酸イノシトールを分離した。試験管を室温で３０分間インキュベートした後、４℃で５００×ｇで５分間遠心分離した。［３Ｈ］−リン酸イノシトールを含有する水（上）層を、アクセルＱＭＡセパク（Accell ＱＭＡ ＳＥＰ−ＰＡＫ）カラム（ミリポア（Millipore）、カリホルニア州）に接続した１０mlのシリンジに移した（これは、２０mlのシンチレーションバイアルに集められるように変更したアマーシャム・スーパーセパレーター（Amersham Superseparator）装置に結合してある）。カートリッジに水（１０ml）を入れて［３Ｈ］−イノシトール前駆体を除き、次に４mlの０．０２Ｍトリエチルアンモニウム水素炭酸化緩衝液（ＴＥＡＢ、フルカ（Fluka）；ニューヨーク）を加えた。カートリッジから［３Ｈ］−ＩＰ１、［３Ｈ］−ＩＰ２そして［３Ｈ］−ＩＰ３を別々に除去するために、４mlの０．１Ｍ ＴＥＡＢ、４mlの０．３Ｍ ＴＥＡＢ、そして４mlの０．４Ｍ ＴＥＡＢをカートリッジに連続的に添加して、画分を溶出させ、大きいシンチレーションバイアルに採取した。エコルメ・カクテル（Ecolume cocktail）（１５ml；ＩＣＮ；カリホルニア州）を各バイアルに加え、次にシンチレーション計測して別々の画分の各ＩＰの量を測定した。蛋白濃度は、バイオラッド（Bio−Rad）蛋白マイクロ測定法（バイオラッド（Bio−Rad）、リッチモンド、カリホルニア州）を用いて測定した。
【０１５２】
この測定法で測定した時、１８μgのｍＧｌｕＲ５ａ３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞は、比較的高い基礎レベルのＩＰ１を示した。しかし、０．１８μgのｍＧｌｕＲ５ａ３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞は、低い基礎ＩＰ１レベルを示し、１mMのグルタミン酸、１mMのキスカル酸または１mMの１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤで処理した時はＩＰ１レベルの検出できる増加を示した。ＩＰ１レベルのキスカル酸に誘導される増加は、１mMのＡＰ３により影響を受けなかった。
【０１５３】
ｍＧｌｕＲ５ａ３でトランスフェクションした細胞に、種々の濃度のグルタミン酸、キスカル酸または１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤの添加後測定したＩＰ１レベルを比較した用量応答試験では、各化合物の濃度の上昇とともにＩＰ１レベルが増加することを示していた。これらのデータの解析により、各化合物のＥＣ５０を計算することができ、これを化合物の相対電位の測定に使用した。
【０１５４】
３．メタボトロピック受容体リガンド結合測定法
ｍＧｌｕＲ５ａ３またはｐＵＣ１９（陰性対照）で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ細胞を、［３Ｈ］−グルタミン酸結合について解析した。陽性対照として結合測定法にラット脳の膜を加えた。
【０１５５】
ａ．膜の調製
ｉ．ラット前脳膜
シェープ（Schoepp）ら［（１９９２）Neurosci. Lett. １４５：１００］が記載したように、ラット前脳膜を調製した。簡単に説明すると、１０個のラット脳からの基本的に脳皮質、線条体と海馬よりなる前脳を、２．５mM ＣａＣｌ２、pH７．６を含有する５０部の３０mMの氷冷トリス−塩酸中で、ポリトロン（Polytron）（ブリンクマン（Brinkman）、ウェストベリー（Westbury）、ニューヨーク州））を用いてホモゲナイズした。ホモゲネートを４℃で３０、０００×ｇで１５分間遠心分離した。上澄液を捨て、ポリトロンを用いてペレットを５０部の緩衝液に再懸濁し、懸濁物を３０、０００×ｇで１５分間遠心分離した。この工程を２回繰り返した。ペレットを緩衝液に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。次に懸濁物を４℃で３０、０００×ｇで１５分間遠心分離した。この工程を３回繰り返した。最終ペレットを１５部の５０mM トリス−塩酸、pH７．６に再懸濁し、分注し、急速に凍結し、−７０℃で保存した。
【０１５６】
ii．トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞およびトランスフェクションしないＨＥＫ２９３細胞の膜
ｍＧｌｕＲ５ａをコードするＤＮＡまたはｐＵＣ１９（陰性対照）でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から膜を調製するために、組織培養プレートから細胞を掻き取り、プレートを５mlのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水：１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７mM ＫＨ２ＰＯ４）で洗浄した。卓上型遠心分離機で細胞を低速度で遠心分離し、細胞ペレットをＰＢＳで洗浄した。０．５mM ＰＭＳＦ、pH７．６を含有する５０mMトリス−塩酸２０部に、細胞ペレットを再懸濁した。ダウンス（Dounce）（テフロン（登録商標）／ガラス）ホモゲナイザー中で１０−２０ストロークを用いて、細胞を氷の上でホモゲナイズした。ホモゲネートを４℃で１２０、０００×ｇで３０分間遠心分離した。最終の膜ペレットを、０．５mM ＰＭＳＦ、pH７．６を含有する５０mMトリス−塩酸再懸濁した。膜調製物を分注し、急速に凍結し、−７０１℃で保存した。蛋白濃度は、ブラッドフォード（Bradford）［（１９７６）Anal. Biochem.７２：２４８］の方法で測定した。
【０１５７】
ｂ．［３Ｈ］−グルタミン酸結合測定法
ラット前脳の膜中のメタボトロピック受容体への［３Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合は、基本的にシェープ（Schoepp）ら（前述）が記載したように調製した。測定の日に凍結ホモゲネートを融解し、５０mMトリス−塩酸、pH７．６で３回洗浄した。最終ペレットを５０mMトリス−塩酸、pH７．６に再懸濁した。蛋白濃度は、ブラッドフォード（Bradford）［（１９７６）Anal. Biochem.７２：２４８］の方法で測定した。懸濁物を３０、０００×ｇで１５分間遠心分離し、ペレットを１mg／mlの濃度で測定緩衝液（５０mMトリス−塩酸、０．５mM ＰＭＳＦ、０．１％ＢＳＡ、pH７．６）に再懸濁した。膜懸濁物を、総量０．５mlの測定緩衝液［イオノトロピックグルタミン酸受容体への［３Ｈ］−グルタミン酸の結合を組織するために、１００μM ＮＭＤＡ（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）、１００μM ＡＭＰＡおよび１００μMカイニン酸（リサーチ・バイオケミカルズ社（Research Biochemiclas Inc）、ナチック（Natick）、マサチューセッツ州）を含有し、塩化物依存性摂取部位への［３Ｈ］−グルタミン酸の結合を阻害するために、１００μM ＳＩＴＳ（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）を含有する］中で、３重測定で１０または１００nMの［３Ｈ］−グルタミン酸（ニュー・イングランド・ニュクレア（New England Nuclear）、ボストン、マサチューセッツ州；カタログ番号ＮＥＴ−４９０、比活性＝５７．４Ci／mmol）と、氷上で４５分間インキュベートした。ＳＭ−２４ローター（ソーバル（Sorvall）、ウィルミントン（Wilmington）、デラウェア（Delaware））中で４℃で２０、０００×ｇで５分間遠心分離して、結合した放射能を遊離の放射能から分離した。ペレットを５−６mlの氷冷５０mMトリス−塩酸、pH７．６で２回洗浄した。ペレットを５mlのエコルメシンチレーションカクテル（Ecolume scintillation cocktail）中でボルテックス混合して可溶化させた。ベックマン（Beckman）シンチレーション計測機で放射能を測定した。総結合量から、１mMのグルタミン酸の存在下で得られた非特異的結合量を引いて、特異的結合量を求めた。
【０１５８】
ｍＧｌｕＲ５ａをコードするＤＮＡまたはｐＵＣ１９でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への［３Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合を、基本的にラット脳の膜への結合の測定で記載したように測定したが、若干の修飾を行なった。測定の日に凍結ホモゲネートを融解し、ＭＲ−１５０高速冷却マイクロ遠心分離機（ペニンスラ・ラボラトリーズ社（Peninsula Laboratories Inc.）、ベルモント（Belmont）、カリホルニア州）で遠心分離した。ペレットを測定緩衝液（５０mMトリス−塩酸、０．５mM ＰＭＳＦ、０．１％ＢＳＡ、pH７．６）で２回洗浄し、最終ペレットを１mg／mlの濃度で測定緩衝液に再懸濁した。ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡおよびカイニン酸を測定混合物から除きながら、ＨＥＫ２９３細胞を［３Ｈ］−グルタミン酸への結合について解析した。
【０１５９】
２００μgの膜と１００nMの［３Ｈ］−グルタミン酸を用いて、ラット脳の膜への［３Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合を測定した。総結合量対非特異結合量の比は約２：１であった。
【０１６０】
ｍＧｌｕＲ５ａ３またはｐＵＣ１９でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への［３Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合を、２００μgの膜と１００nMの［３Ｈ］−グルタミン酸を用いて測定した。ｍＧｌｕＲ５ａ３でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への特異的結合量は、ｐＵＣ１９でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への結合量より有意に高かった。競合結合試験を行い、種々の濃度の非標識グルタミン酸の存在下でｍＧｌｕＲ５ａ３でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への［３Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合の量を測定した。これらの試験で得られたデータからＩＣ５０値を求めた。
【０１６１】
４．サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）測定
ａ．ＲＩＡベースの測定
ある種のＧ蛋白結合受容体の活性化は、ｃＡＭＰの（増加ではなく）低下を引き起こすため、細胞内ｃＡＭＰレベルの測定法は、哺乳動物宿主細胞中で発現される組換えヒトメタボトロピック受容体を評価するのに使用される。ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡまたはｐＵＣ１９（陰性対照）で一時的にまたは安定にトランスフェクションした哺乳動物細胞を、５×１０５細胞／ウェルの濃度で２４ウェルのマイクロタイタープレートに広げ、一晩インキュベートさせる。翌日、ニコンダイアフォト（Nikon Diaphot）倒立顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の形態の健常性を評価し、ウェルはコンフルエントな細胞層を含有するか否かを測定した。次に培地を吸引し、細胞を、１mMのＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン；シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）と０．１％ＢＳＡを含有するクレブス重炭酸緩衝液０．５ml（ＰＩ加水分解測定法で使用したものと同じ緩衝液：実施例３．Ｃ．２を参照）で２回洗浄した。あるいはクレブス重炭酸緩衝液の代わりに１×ＰＢＳを使用することもできる。各洗浄の後に３７℃で３０分間インキュベートを行う。各ウェルから緩衝液を吸引し、次に細胞を、１mMのＩＢＭＸと０．１％ＢＳＡを含有する０．２mlのクレブス重炭酸緩衝液で３７℃で２０分間インキュベートする。
【０１６２】
メタボトロピック受容体調節化合物による細胞の処理を始める前に、５０μlのクレブス重炭酸緩衝液（最終濃度の５×のフォルスコリンの有りまたは無し）を、一部の細胞（基礎対照）に加え、一部の細胞（試験細胞）に最小濃度の５×の化合物および最終濃度の５×のフォルスコリンを加え、３７℃で１５分間インキュベートする。１５分間のインキュベートの最後に、１％トリトンＸ−１００溶液２５μlを加えて反応を停止させ、インキュベートをさらに１０分間続ける。溶解した細胞および細胞懸濁物を、プラスチックピペットのチップで１２×７５mmのポリプロピレン試験管に移す。各ウェルを、１mMのＩＢＭＸと０．１％ＢＳＡを含有するクレブス重炭酸緩衝液７５μlで洗浄する。洗浄物を細胞溶解物を一緒にする。細胞溶解懸濁物を２３００×ｇで５分間遠心分離し、ＲＩＡキット（アマーシャム・ライフサイエンシーズ（Amersham Life Sciences）カタログ＃ＴＲＫ４３２；アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）を用いて、上澄液のｃＡＭＰレベルを測定する。
【０１６３】
ｂ．サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルに基づく測定法
５％の規定補足ウシ血清（ハイクローン（Hyclone））を含有するダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ギブコ（ＧＩＢＣＯ））（１００Ｕ／mlのペニシリンと１００μg／mlの硫酸ストレプトマイシンを含む）中で、ＨＥＫ２９３細胞を単層で増殖させた（１０cmのポリ−Ｄ−リジン被覆プレート当たり約２×１０６細胞）。ＣＭＶプロモーターに結合した５μgのｐＣＭＶ−ＯＣＮＡ（嗅覚性サイクリックヌクレオチドゲートのチャネル（ダレン（Dhallen）らを参照、前述）、２μgのｐＣＭＶ−βｇａｌ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）、および対照プラスミドとしての１３μgのｐＵＣ１９を用いて、細胞をリン酸カルシウム法（アウスベル（Ausubel）ら、前述、pp９．１．１−９．１．７）で一時的にトランスフェクションした。ベクターｐＣＭＶ−ＯＣＮＡは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳからの約３．０kbのＥｃｏＲＩ断片として嗅覚性サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルをコードするＤＮＡを単離し、得られた断片をＥｃｏＲＩ消化ｐＣＭＶ−Ｔ７−３に結合させることにより、作成した。トランスフェクションの６時間後、リン酸カルシウム沈殿物を洗い流し、１０％透析胎児牛血清（ハイクローン（Hyclone））、１００Ｕ／mlのペニシリン、１００μg／mlのストレプトマイシン、および２mMグルタミンが補足されたＤＭＥＭを細胞に与えた。β−ガラクトシダーゼ活性の測定によるトランスフェクション効率は、５０−７０％であった。
【０１６４】
嗅覚性サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルＤＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ細胞を、２４−４８時間インキュベートしてから、機能を試験した。まず、細胞質の面に達するｃＡＭＰの濃度が調節できるように（例えば、単一チャネル記録（Single Channel Recording）、サクマンとネヘル（Sakman and Neher）編、プレヌム・プレス（Plenum Press）、ニューヨーク、（１９８３））、トランスフェクションした細胞から引っ張った裏返した膜パッチを用いて、電気生理学的にチャネルの活性を測定した。パッチの両面を、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないリンゲル液に接触させた。１つのパッチでは、１mMのｃＡＭＰの存在下で膜電位を−１００から＋１００mVへ２秒で勾配をつけて電流を発生させた。この結果は、チャネルが機能的に発現されていることを示唆していた。
【０１６５】
トランスフェクション体もまた、細胞内カルシウムレベル（［Ｃａ＋＋］）の単細胞ビデオイメージングにより解析した。この方法は、細胞内カルシウムレベルの測定（これはチャネルのサイクリックヌクレオチド活性化により制御される、チャネルを介するカルシウムの流入量とともに変化する）によるサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルの分析を可能にする。イメジーング測定法は、基本的に実施例３．Ｃ．１．ｂに記載のように実施したが、若干の修飾を行なった。色素を充填後、細胞をツァイスアクシオヴェルト（Zeiss Axiovert）顕微鏡と１００Ｗの水銀ランプ、デージ（Dage）増強ＣＣＤカメラ、そしてイメージ−１（Image−１）ハードウェアとイメージ処理のソフトウェアを用いて観察した。このソフトウェアは、２０×１．３Ｎ．Ａ．油浸対物レンズを介して細胞を３５０nmと３８５nmの交互励起を調節した（典型的には５秒毎）。５１０nmより長い波長で出る光を、ＣＣＤカメラにより集め、デジタル化し、３５０nmと３８５nmの励起イメージからバックグランドの発光を差し引いた後、３５０／３８５強度比を計算した。
【０１６６】
定量的解析のために、実験の各比率イメージについてソフトウェアにより各細胞の１２×１２ピクセル領域内の３５０／３８５平均比を計算し、さらに解析しグラフを描くために表に取り込んだ。フラ−２シグナルを未変性の細胞で較正し、細胞をリンゲル液（１０μMイオノマイシン、１０mM ＥＧＴＡを含有し、およびＣａ＋＋の添加無し）に接触させてＲｍｉｎを得た。次に細胞をリンゲル液（１０μMイオノマイシン、１０mM Ｃａ＋＋を含有する）に接触させて３回洗浄してＲｍａｘを得た。生きている細胞中のフラ−２のＫｄ２５０nMとグリンキーウイックツ（Grynkiewicz）ら（J. Biol. Chem.２６０：３４４０（１９８５））を使用して、静止［Ｃａ＋＋］ｉは典型的には１００nMであった。
【０１６７】
これらの実験で、細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる物質にＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション体を暴露し、以後の［Ｃａ＋＋］ｉの変化を追跡した。１００μMのフォルスコリン（アデニルシクラーゼのアクチベータ）の添加に応答して、６４個の細胞の平均した結果と各細胞で、［Ｃａ＋＋］ｉにわずかな増加が見られた。１mMのＩＢＭＸ（ｃＡＭＰホスホジエステラーゼの阻害剤）の添加後、さらに有意な増加が見られた。対照実験では、６４個の非トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞中の１つのみが、細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇に対応して、［Ｃａ＋＋］ｉの増加を示した。この応答は一時的であり、サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルＤＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞中で見られた持続性応答とは明らかに異なっていた。
【０１６８】
これらの結果は、サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルを発現するＨＥＫ細胞は、活性化された時細胞内サイクリックヌクレオチドレベルに変化を引き起こす受容体（例えば、メタボトロピック受容体）の測定において宿主細胞として使用できることを証明している。
【０１６９】
５．ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析
ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションした細胞はまた、ノーザンブロット解析により対応する転写体の発現について解析することができる。ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションした約１×１０７個の細胞から総ＲＮＡを単離し、１０−１５μgのＲＮＡをノーザンハイブリダイゼーション解析に使用した。ヒトメタボトロピック受容体をコードするプラスミドからの挿入体をニックトランスレーションし、プローブとして使用した。ノーザンブロットハイブリダイゼーションの典型的な条件は以下の通りである：
ハイブリダイゼーションは、４２℃で５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５０％ホルムアルミド中で行ない、洗浄は６５℃で０．２×ＳＳＰＥと０．１％ＳＤＳ中で行なった。
【０１７０】
本発明をいくつかの好適な実施態様を参照して詳細に説明したが、ここに記載され特許請求のされている本発明の精神と範囲を逸脱することなくその修飾や変更が可能であることが理解されるであろう。
【０１７１】
（配列の要約）
配列番号１は、本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ（ｍＧｌｕＲ１Ｂ）をコードするＤＮＡの核酸配列（およびその推定アミノ酸配列）である。
配列番号２は、配列番号１のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの一部をコードする部分クローンのヌクレオチド配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号４は、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされるヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの一部のアミノ酸配列である。
配列番号５は、本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ（ｍＧｌｕＲ３）をコードするＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号６は、配列番号５のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号７は、本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ５ａ１）をコードするＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号８は、配列番号７のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号９は、本発明のｍＧｌｕＲ５変種メタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ５ｂ）をコードするＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号１０は、配列番号９のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号１１は、本発明のｍＧｌｕＲ５変種メタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ５ｃ）をコードするＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号１２は、配列番号１１のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。
配列番号１３は、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの３’非翻訳配列の３４３ヌクレオチドである。
【０１７２】
（配列表）
（１）一般情報：
（i） 出願人：ダゲット，ロリー（Daggett, Lorrie）
エリス，スティーブン・ビー（Ellis, Steven B.）
ルー，チェン（Lu, Chen）
ポンツラー，アーロン（Pontsler, Aaron）
ジョンソン，エドウィン・シー（Johnson, Edwin C.）
ヘス，ステファン・ディー（Hess, Stephen D.）
（ii）発明の名称：ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体、これをコードする核酸およびその用途
（iii）配列の数：１３
（iv）連絡住所：
（Ａ）宛名：プリティー、シュレーダー、ブルーゲマンおよびクラーク（Pretty, Schroeder, Brueggemann & Clark）
（Ｂ）通り：４４４サウス・フラワー通り、スイート２０００（444 South Flower Street, Suite 2000 ）
（Ｃ）市：ロサンゼルス
（Ｄ）州：カリホルニア
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号：９００７１
（v） コンピューターで読める形式：
（Ａ）媒体の型：フロッピー（登録商標）ディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．０（PatentIn Release #1.0）、バージョン＃１．２５
（vi）現行出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：１９９４年６月２日
（Ｃ）分類：
（vii）先行出願のデータ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ０８／０７２、５７４
（Ｂ）出願日：１９９３年６月４日
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：ライター，ステファン・イー（Reiter, Stephen E.）
（Ｂ）登録番号：３１，１９２
（Ｃ）参照／整理番号：ＦＰ４１ ９７７２
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話：６１９−５４６−４７３７
（Ｂ）ファックス：６１９−５４６−９３９２
（２）配列番号：１の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：３３２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：３８８．．３１０８
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ヒトｍＧｌｕＲ１Ｂ”
（xi）配列：配列番号：１：
【０１７３】
（２）配列番号：２の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：９０６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白
（xi）配列：配列番号：２：
【０１７４】
（２）配列番号：３の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：３５５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．３５４
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ヒトｍＧｌｕＲ２断片”
（xi）配列：配列番号：３：
【０１７５】
（２）配列番号：４の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：１１８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白
（xi）配列：配列番号：４：
【０１７６】
（２）配列番号：５の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：３９１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１０６４．．３７０３
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ヒトｍＧｌｕＲ３”
（xi）配列：配列番号：５：
【０１７７】
（２）配列番号：６の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：８７９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白
（xi）配列：配列番号：６：
【０１７８】
（２）配列番号：７の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：４０８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：３７０．．３９１２
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ヒトｍＧｌｕＲ５Ａ”
（xi）配列：配列番号：７：
【０１７９】
（２）配列番号：８の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：１１８０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白
（xi）配列：配列番号：８：
【０１８０】
（２）配列番号：９の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：４１８１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：３７０．．４００８
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ヒトｍＧｌｕＲ５Ｂ”／注＝“ヌクレオチド２９９８と２９９９の間に９６塩基対が挿入されたｍＧｌｕＲ５Ａ変種”
（xi）配列：配列番号：９：
【０１８１】
（２）配列番号：１０の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：１２１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白
（xi）配列：配列番号：１０：
【０１８２】
（２）配列番号：１１の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：３２８２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：３７０．．３００３
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ヒトｍＧｌｕＲ５Ｃ”／注＝“３’末端が切り取られたｍＧｌｕＲ５ａの変種”
（xi）配列：配列番号：１１：
【０１８３】
（２）配列番号：１２の情報：
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：８７７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白
（xi）配列：配列番号：１２：
【０１８４】
（i） 配列の特色：
（Ａ）長さ：３４３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：種々の特徴
（Ｂ）存在位置：１．．３４３
（Ｄ）他の情報：／注＝“ｍＧｌｕＲ２の部分配列−３’非翻訳配列”
（xi）配列：配列番号：１３：
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】図１は、ＣＭＶプロモーターをベースにしたベクターであるｐＣＭＶ−Ｔ７−２とｐＣＭＶ−Ｔ７−３を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）から選択されることを特徴とする単離されたＤＮＡ：
（ａ）配列番号３に記載の全コード領域を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３に記載の全コード領域を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、高緊縮性条件下でハイブリダイズし、かつヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）としての活性を有する蛋白をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白をコードすることを特徴とする単離されたＤＮＡ：
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸を欠失、置換および／または付加して（ａ）の蛋白から得られ、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）としての活性を有する蛋白。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＤＮＡによりコードされる単離された蛋白。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のＤＮＡのうち、少なくとも１４の連続する塩基、またはその相補的な塩基よりなる、核酸プローブ。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のＤＮＡに相補的な単離されたｍＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のＤＮＡを含有する真核細胞。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のＤＮＡを発現する真核細胞。
【請求項８】
請求項５に記載のｍＲＮＡを発現する両生類卵母細胞。
【請求項９】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）をコードするＤＮＡの同定方法であって、
請求項４に記載の核酸プローブと、ヒトＤＮＡを、該核酸プローブがポリ核酸断片の時は低緊縮性ハイブリダイゼーション条件から中緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で、該核酸プローブがオリゴヌクレオチドの時は高緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で、接触させて、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを同定することを特徴とするＤＮＡの同定方法。
【請求項１０】
競合的結合測定法において、請求項３に記載の蛋白を用いることを特徴とする、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）に結合する化合物の同定方法。
【請求項１１】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）の活性を調節する化合物を同定するための生物学的測定法であって、
（ａ）請求項７に記載の真核細胞を、受容体サブタイプの第二メッセンジャー活性の調節能力を測定すべき少なくとも１つの化合物に暴露させ、
（ｂ）その後、該第二メッセンジャー活性の変化について該真核細胞を追跡することを特徴とする生物学的測定法。
【請求項１２】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）を、請求の範囲第１１項に記載の生物測定法により同定される少なくとも１つの化合物に、該化合物が有効量存在する状態で接触させることを特徴とする、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）の第二メッセンジャー活性の調節方法。
【請求項１３】
請求項３に記載の蛋白またはその免疫原性を発現する部位に対する抗体。
【請求項１４】
該抗体はモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）を、請求項１４項に記載のモノクロナール抗体に、該抗体が有効量存在する状態で接触させることよりなる、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）の第二メッセンジャー活性の調節方法。
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）から選択されることを特徴とする単離されたＤＮＡ：
（ａ）配列番号３に記載の全コード領域を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３に記載の全コード領域を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、高緊縮性条件下でハイブリダイズし、かつヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）としての活性を有する蛋白をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白をコードすることを特徴とする単離されたＤＮＡ：
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸を欠失、置換および／または付加して（ａ）の蛋白から得られ、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）としての活性を有する蛋白。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＤＮＡによりコードされる単離された蛋白。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のＤＮＡのうち、少なくとも１４の連続する塩基、またはその相補的な塩基よりなる、核酸プローブ。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のＤＮＡに相補的な単離されたｍＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のＤＮＡを含有する真核細胞。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のＤＮＡを発現する真核細胞。
【請求項８】
請求項５に記載のｍＲＮＡを発現する両生類卵母細胞。
【請求項９】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）をコードするＤＮＡの同定方法であって、
請求項４に記載の核酸プローブと、ヒトＤＮＡを、該核酸プローブがポリ核酸断片の時は低緊縮性ハイブリダイゼーション条件から中緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で、該核酸プローブがオリゴヌクレオチドの時は高緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で、接触させて、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを同定することを特徴とするＤＮＡの同定方法。
【請求項１０】
競合的結合測定法において、請求項３に記載の蛋白を用いることを特徴とする、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）に結合する化合物の同定方法。
【請求項１１】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）の活性を調節する化合物を同定するための生物学的測定法であって、
（ａ）請求項７に記載の真核細胞を、受容体サブタイプの第二メッセンジャー活性の調節能力を測定すべき少なくとも１つの化合物に暴露させ、
（ｂ）その後、該第二メッセンジャー活性の変化について該真核細胞を追跡することを特徴とする生物学的測定法。
【請求項１２】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）を、請求の範囲第１１項に記載の生物測定法により同定される少なくとも１つの化合物に、該化合物が有効量存在する状態で接触させることを特徴とする、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）の第二メッセンジャー活性の調節方法。
【請求項１３】
請求項３に記載の蛋白またはその免疫原性を発現する部位に対する抗体。
【請求項１４】
該抗体はモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）を、請求項１４項に記載のモノクロナール抗体に、該抗体が有効量存在する状態で接触させることよりなる、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ２（ヒトｍＧｌｕＲ２）の第二メッセンジャー活性の調節方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−２５４９１５（Ｐ２００６−２５４９１５Ａ）
【公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−８５２８９（Ｐ２００６−８５２８９）
【出願日】平成１８年３月２７日（２００６．３．２７）
【分割の表示】特願２００４−３４０５０４（Ｐ２００４−３４０５０４）の分割
【原出願日】平成６年６月３日（１９９４．６．３）
【出願人】（５０００１９９４８）シビア・ニューロサイエンシーズ・インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２７日（２００６．３．２７）
【分割の表示】特願２００４−３４０５０４（Ｐ２００４−３４０５０４）の分割
【原出願日】平成６年６月３日（１９９４．６．３）
【出願人】（５０００１９９４８）シビア・ニューロサイエンシーズ・インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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