【課題】細胞中で安定に保持され、大きなサイズの外来遺伝子を簡便に挿入し、細胞に導入することができるヒト人工染色体ベクター及びその作製方法の提供。
【解決手段】長腕遠位及び／又は短腕遠位が削除されたヒト２１番染色体断片を含み、長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されているヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクター及びその作製方法。ヒト人工染色体ベクターを用いた外来ＤＮＡの導入方法、外来ＤＮＡ発現細胞の作製方法及びタンパク質の製造方法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
長腕遠位及び／又は短腕遠位が削除されたヒト２１番染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体ベクター。
【請求項２】
ヒト２１番染色体断片が約２〜１６Ｍｂである、請求項１記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項３】
ヒト２１番染色体の長腕遠位が２１ｑ１１領域内で削除されている、請求項１又は２記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項４】
ヒト２１番染色体の長腕遠位がＡＬ１６３２０４において削除されている、請求項３記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項５】
ヒト２１番染色体の短腕遠位が２１ｐ領域内で削除されている、請求項１又は２記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項６】
ヒト２１番染色体の短腕遠位がＡＬ１６３２０１において削除されている、請求項５記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項７】
ヒト２１番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項８】
部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素である、請求項７記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項９】
部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である、請求項７又は８記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項１０】
部位特異的組換え酵素の認識部位がヒト２１番染色体の長腕近位のＡＬ１６３２０３に挿入されている、請求項７〜９のいずれか１項に記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項１１】
長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除が人工テロメア配列との置換によるものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項１２】
ヒト人工染色体ベクターの作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）ヒト２１番染色体を保持する細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト２１番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；並びに
（ｃ）上記ヒト２１番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
を含む、上記作製方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）において、ヒト２１番染色体を保持する細胞が相同組換え効率の高いものである、請求項１２記載の作製方法。
【請求項１４】
相同組換え効率の高い細胞がニワトリＤＴ４０細胞由来のものである、請求項１３記載の作製方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）において、ヒト２１番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除を人工テロメア配列との置換により行うものである、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）において、ヒト２１番染色体の長腕遠位をＡＬ１６３２０４において削除する、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）において、ヒト２１番染色体の短腕遠位をＡＬ１６３２０１において削除する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）において、部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素である、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）において、部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項２０】
部位特異的組換え酵素の認識部位をヒト２１番染色体の長腕近位のＡＬ１６３２０３に挿入する、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項２１】
請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の作製方法により得られる、ヒト人工染色体ベクター。
【請求項２２】
請求項１〜１１又は２１のいずれか１項に記載のヒト人工染色体ベクターを保持する細胞。
【請求項２３】
請求項１２〜２０のいずれか１項に記載された作製方法において、以下のステップ：
（ｄ）部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト２１番染色体に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
をさらに含むことを特徴とする、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターの作製方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の作製方法により得られる、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクター。
【請求項２５】
請求項２４記載の外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターを保持する細胞。
【請求項２６】
請求項２５記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項２７】
外来ＤＮＡを受容細胞に導入する方法であって、以下のステップ：
（ａ）ヒト２１番染色体を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト２１番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）上記ヒト２１番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｄ）部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト２１番染色体に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｅ）上記ヒト２１番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｆ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
（ｇ）融合した受容細胞において外来ＤＮＡの導入を確認するステップ；
を含む、上記導入方法。
【請求項２８】
受容細胞が動物細胞である、請求項２７記載の導入方法。
【請求項２９】
動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８記載の導入方法。
【請求項３０】
受容細胞が多分化能を有する細胞である、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の導入方法。
【請求項３１】
多分化能を有する細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は間葉系幹細胞若しくは組織幹／前駆細胞である、請求項３０記載の導入方法。
【請求項３２】
外来ＤＮＡを発現する細胞の作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）ヒト２１番染色体を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト２１番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）上記ヒト２１番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｄ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト２１番染色体に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｅ）上記ヒト２１番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｆ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
（ｇ）融合した受容細胞において外来ＤＮＡを発現する細胞を選択するステップ；
を含む、上記作製方法。
【請求項３３】
受容細胞が動物細胞である、請求項３２記載の導入方法。
【請求項３４】
動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項３３記載の導入方法。
【請求項３５】
受容細胞が多分化能を有する細胞である、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の導入方法。
【請求項３６】
多分化能を有する細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は間葉系幹細胞若しくは組織幹／前駆細胞である、請求項３５記載の導入方法。
【請求項３７】
タンパク質の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）ヒト２１番染色体を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト２１番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）上記ヒト２１番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｄ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト２１番染色体にタンパク質をコードする外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｅ）上記ヒト２１番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｆ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
（ｇ）融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
（ｈ）得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ；
を含む、上記製造方法。
【請求項３８】
タンパク質が、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、血液凝固因子、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１５、ＣＤ４０リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α―１アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子（ＧＩＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ストローマ由来因子（ＳＤＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポイエチン、神経成長因子（ＮＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ウイント（Ｗｎｔ）からなる群より選択されるものである、請求項３７記載の製造方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【公開番号】特開２０１０−４８８７（Ｐ２０１０−４８８７Ａ）
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８５５３０（Ｐ２００９−１８５５３０）
【出願日】平成２１年８月１０日（２００９．８．１０）
【分割の表示】特願２００４−５４１２９１（Ｐ２００４−５４１２９１）の分割
【原出願日】平成１５年１０月３日（２００３．１０．３）
【出願人】（０００００１０２９）協和発酵キリン株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】