ヒト以外のトランスジェニック動物における内因性免疫グロブリン発現の抑制
本発明は１つまたはいくつかのヒトまたはヒト化免疫グロブリン導入遺伝子座を発現する遺伝子操作されたヒト以外のトランスジェニック動物における内因性抗体発現の抑制に関する新規研究法を提供する。内因性免疫グロブリン発現するＢ細胞においてのみ毒素のような自殺遺伝子を選択発現するが、ヒト（化）免疫グロブリンを発現するＢ細胞では発現しないことにより、ヒト以外のトランスジェニック動物における内因性免疫グロブリン発現を抑制する。この方法によりトランスジェニック動物の血液、乳または卵中のヒト化またはヒト抗体をコードする導入遺伝子座の優勢な発現が可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞では自殺遺伝子を選択的に発現するが、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖のような外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖を発現するＢ細胞では発現しないことにより、ヒト以外のトランスジェニック動物における内因性免疫グロブリン発現を抑制する方法に関する。この方法により例えばヒト以外のトランスジェニック動物の血液、乳および卵中のヒトまたはヒト化抗体の優勢な発現が可能になる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトマウスキメラ抗体を発現するマウスの作製は非特許文献１に記載されている。ヒト免疫グロブリンポリペプチドを発現するマウスの作製は非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４により記載されており、ならびにＢＡＣクローンを用いるトランスジェニックマウスの作製は非特許文献５に記載されている。ヒト抗体を発現するウシの作製は非特許文献６に記載されている。
【０００３】
動物における遺伝子導入は非特許文献７に記載されている。トランスジェニックウサギの作製は非特許文献８；および非特許文献９に記載されている。トランスジェニックニワトリの作製は非特許文献１０；および非特許文献１１；および非特許文献１２に記載されている。
【０００４】
免疫グロブリン発現の損傷を有するウサギは非特許文献１３；ならびに非特許文献１４に記載されている。ガンマグロブリン血症のニワトリは非特許文献１５；および非特許文献１６に記載されている。
【０００５】
細胞からの動物のクローニングは非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；および非特許文献２１に記載されている。ウサギの核移植クローニングは非特許文献２２、非特許文献２３に記載されている。
【０００６】
ヒト（化）免疫グロブリン導入遺伝子座を発現するヒト以外のトランスジェニック動物の生成およびかかるトランスジェニック動物からの抗体の生成は特許文献１、特許文献２ならびに特許文献３、特許文献４；および特許文献５に詳細に記載されている。キメラ哺乳動物宿主の相同組換えは特許文献６に例示されている。ＤＮＡを胚に導入するための方法は特許文献７に記載されている。胚性幹細胞の維持および増殖は特許文献８に記載されている。
【０００７】
毒素基盤の研究法を用いる自殺遺伝子は非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３に記載されている。無毒性プロドラッグ酵素研究法を用いる自殺遺伝子は非特許文献３４に記載されている。
【０００８】
２Ａペプチド配列を含有するウイルス性タンパク質の切断活性は非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７、非特許文献３８、非特許文献３９に記載されている。
【０００９】
リコンビナーゼおよびその特性は非特許文献４０に記載されている。２つの核酸の非常に特異的な配列間の相同組換えを認識および触媒する部位特異的リコンビナーゼが公知である。例えば部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属するφＣ３１およびＲ４が公知である（非特許文献４１；非特許文献４２）。ヒトおよびマウスゲノムを含むいくつかのゲノムでは偽ａｔｔＰ部位が天然にある（非特許文献４３）。８．９ｋｂの大型のＶＩＩコラーゲンｃＤＮＡの一次前駆患者皮膚細胞へのインビトロでのφＣ３１インテグラーゼ媒介遺伝子移入は非特許文献４４に報告されている。トランスジェニック哺乳動物の操作におけるφＣ３１、ＴＰ９０１−１およびＲ４ファージインテグラーゼの使用は非特許文献４５で実証されている。
【００１０】
Ｂ細胞を含む細胞のアブレーションは非特許文献４６、非特許文献４７および非特許文献４８に記載されている。
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９２／０３９１８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／１２４３７号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５５４５８０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５８１４３１８号明細書
【特許文献５】米国特許第５５７０４２９号明細書
【特許文献６】米国特許第５４１６２６０号明細書
【特許文献７】米国特許第５５６７６０７号明細書
【特許文献８】米国特許第５４５３３５７号明細書
【非特許文献１】Ｐｌｕｓｃｈｋｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９８年、２１５：２７−３７
【非特許文献２】Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ １９８９年、３３８：３５０−２
【非特許文献３】Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５年、１３（１）：６５−９３
【非特許文献４】Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７年、８（４）：４５５−８
【非特許文献５】Ｙａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７年、１５：８５９−６５
【非特許文献６】Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００２年、２０（９）：８８９−８９４
【非特許文献７】Ｗａｌｌ ＲＪ、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２００２年、５７（１）：１８９−２０１
【非特許文献８】Ｆａｎ，Ｊ．ら、Ｐａｔｈｏｌ Ｉｎｔ．１９９９年、４９：５８３−９４
【非特許文献９】Ｂｒｅｍら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．１９９６年、４４：５６−６２
【非特許文献１０】Ｅｔｃｈｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９７年、６２：４３３−４５０
【非特許文献１１】Ｐａｉｎら、Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ １９９９年、１６５（３−４）：２１２−９
【非特許文献１２】Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １９９８年、１６：１０５０−１０５３
【非特許文献１３】Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３年、１５０：２７８３−２７９３
【非特許文献１４】Ｌａｍｏｙｉ ＥおよびＭａｇｅ ＲＧ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８５年、１６２：１１４９−１１６０
【非特許文献１５】Ｆｒｏｍｍｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７０年、１０５（ｌ）：１−６
【非特許文献１６】Ｂｅｎｅｄｉｃｔら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１９７７年、８８（２）：１９７−２０５
【非特許文献１７】Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ １９９８年、３９４：３６９−３７４
【非特許文献１８】Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８年、２８０：１２５６−１２５８
【非特許文献１９】Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８年、１６：６４２−６４６
【非特許文献２０】Ａ．Ｅ．Ｓｃｈｎｉｅｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７年、２７８：２１３０−２１３３
【非特許文献２１】Ｋ．Ｈ．Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ １９９６年、３８０：６４−６６
【非特許文献２２】Ｓｔｉｃｅら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １９８８年、３９：６５７−６６４
【非特許文献２３】Ｃｈａｌｌａｈ−Ｊａｃｑｕｅｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００３年、８（４）：２９５−２９９
【非特許文献２４】Ｌｅｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８３年、２２０：５１５−７
【非特許文献２５】Ｍａｘｗｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８６年、４６：４６６０−４６６４
【非特許文献２６】Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｃｅｌｌ １９８７年、５０：４３５−４４３
【非特許文献２７】Ｍａｘｗｅｌｌら、Ｃｅｌｌ １９９１年、５１：４２９９−４３０４
【非特許文献２８】Ｍａｘｗｅｌｌら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９９２年、７：４５７−４６２
【非特許文献２９】Ａｇｕｉｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９５年、９２：１０１９２−１０１９６
【非特許文献３０】Ｇｒｉｅｓｈａｍｍｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９８年、１９７：２３４−２４７
【非特許文献３１】Ｂａｒｔｅｌｌら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２０００年、６３：４０９−４１６
【非特許文献３２】Ｅｒｌａｎｄｓｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００１年、１９４：５５７−５７０
【非特許文献３３】Ｌｅｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００２年、１３：５３３−５４２
【非特許文献３４】Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、２００４年
【非特許文献３５】Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９２年、１９０：７５４−７６２
【非特許文献３６】Ｒｙａｎら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７２：２７２７−２７３２（１９９１）
【非特許文献３７】Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２００１年、８２：１０２７−１０４１
【非特許文献３８】Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２００１年、８２：１０１３−１０２５
【非特許文献３９】Ｓｚｙｍａｃｚａｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００４年、２２（５）：５８９−５９４
【非特許文献４０】Ｋｏｌｂ Ａ．Ｆ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００２年、４１：６５−８０
【非特許文献４１】Ｇｒｏｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００年、９７：５９９５−６０００
【非特許文献４２】Ｏｌｉｖａｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２年、２０（１１）：１１２４−８
【非特許文献４３】Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００１年、２１：３９２６−３９３４
【非特許文献４４】Ｏｒｔｉｚ−Ｕｒｄａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８：１１６６−１１７０（２００２）
【非特許文献４５】Ｈｏｌｌｉｓら、Ｒｅｐｒｏ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００３年、１：７９
【非特許文献４６】Ｅｒｌａｎｄｓｓｏｎら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９４（５）：５５７−５７０（２００１）
【非特許文献４７】Ｍａｘｗｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９１年、５１：４２９９−４３０４
【非特許文献４８】Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｃｅｌｌ １９８７年、５０：４３５−４４３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
本発明はトランスジェニック動物における内因性免疫グロブリン生成を抑制するための方法に関する。方法は内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞において自殺遺伝子を選択的に発現するが、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンを発現するＢ細胞では自殺遺伝子を発現しないことを伴う。とりわけ本発明は１つまたはいくつかのヒトまたはヒト（化）免疫グロブリン導入遺伝子座を含有するヒト以外のトランスジェニック動物において内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現を抑制するための方法に関係する。結果的にヒト（化）導入遺伝子座はヒト以外のトランスジェニック動物において遺伝子再構成および変異過程を被り、実質的に内因性免疫グロブリン生成の不在下で多様化されたヒト（化）抗体レパートリーを生成することができる。
【００１３】
とりわけ本発明はヒト以外のトランスジェニック動物の内因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞では少なくとも１つの自殺遺伝子を選択的に発現するが、外因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞では発現しないことを含み、それにより内因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞は枯渇し、そして内因性免疫グロブリンの生成は抑制されるが、外因性免疫グロブリンの生成は抑制されない、外因性免疫グロブリン導入遺伝子座を担持するヒト以外のトランスジェニック動物のＢ細胞における内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）生成の選択的抑制のための方法に関係する。好ましい実施態様では、外因性免疫グロブリンはヒト化免疫グロブリン重および／または軽鎖配列である。
【００１４】
さらなる態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物のＢ細胞に導入された自殺遺伝子はＢ細胞特異的プロモーターの制御下にあり、そしてリコンビナーゼ配列によりフランキングされている。
【００１５】
なお別のさらなる態様では、さらに該組換え配列を認識するリコンビナーゼをコードする発現構築物の一部としてヒト以外のトランスジェニック動物のＢ細胞にヒト（化）免疫グロブリン鎖導入遺伝子座を導入し、ここで自殺遺伝子の発現はヒト化免疫グロブリン導入遺伝子座を発現するＢ細胞におけるリコンビナーゼの発現により活性化される。
【００１６】
特定の態様では、自殺遺伝子は細菌性、真菌性、昆虫性および植物毒素からなる群から選択される。好ましい実施態様では、自殺遺伝子はジフテリア毒素Ａ鎖である。
【００１７】
別の実施態様では、自殺遺伝子はプロドラッグ変換酵素である。この実施態様の１つの態様では、プロドラッグ変換酵素は非哺乳動物起源である。さらなる態様では非哺乳動物プロドラッグ変換酵素はウイルス性チミジンキナーゼ（ＴＫ）、細菌性サイトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、細菌性カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、ニトロリダクターゼ（ＮＲ）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ペニシリン−Ｇアミダーゼ（ＰＧＡ）、β−ラクタマーゼ、多剤活性化酵素（ＭＤＡＥ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、西洋ワサビベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびデオキシリボヌクレオチドキナーゼ（ＤＲＮＫ）からなる群から選択される。
【００１８】
さらに別の実施態様では、プロドラッグ変換酵素はヒト起源である。さらなる態様では、ヒトプロドラッグ変換酵素はデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）、β−グルクロニダーゼ（−Ｇｌｕ）およびチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）からなる群から選択される。
【００１９】
別の態様では、リコンビナーゼＣｒｅ、Ｃｒｅ様、Ｆ１ｐ、φＣ３１、λインテグラーゼ、ファージＲ４リコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１リコンビナーゼ、原核細胞性トランスポーゼス、真核細胞性トランスポーゼス、ウイルス性レトロトランスポーゼス、ショウジョウバエコピア様レトロトランスポーゼスおよび非ウイルス性レトロトランスポーゼスからなる群から選択される。さらなる実施態様では、トランスポーゼスまたはレトロトランスポーゼスはＴｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎｌ０００、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ショウジョウバエマリナー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス、ショウジョウバエＰエレメント、トウモロコシＡｃ、Ｄｓ、Ｍｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、ドット、Ｍｕ、Ｉ、Ｌ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）およびミノスからなる群から選択される。
【００２０】
１つの実施態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物は若年期に遺伝子再構成により抗体多様化を実質的に停止する。さらなる実施態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物は生まれて１か月以内に抗体多様化を実質的に停止する。
【００２１】
別の実施態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物はげっ歯類、ウサギ、鳥類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウマからなる群から選択される。好ましい実施態様では、げっ歯類はマウスまたはラットである。
【００２２】
特定の態様では、本発明は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重および／または軽鎖導入遺伝子座、自己切断ペプチドおよびリコンビナーゼをさらに含む第１の導入遺伝子を含む遺伝子導入発現構築物に関係する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、Ｂ細胞特異的プロモーターの制御下にあり、そしてリコンビナーゼにより認識される組換え部位によりフランキングされた自殺遺伝子をさらに含む第２の導入遺伝子を含む遺伝子導入発現構築物に関係する。
【００２４】
１つの実施態様では、本発明はヒトまたはヒト化免疫グロブリン重および／または軽鎖遺伝子座、自己切断ペプチドおよびリコンビナーゼをさらに含む第１の導入遺伝子、ならびにＢ細胞特異的プロモーターの制御下にあり、そしてリコンビナーゼにより認識される組換え部位によりフランキングされた自殺遺伝子をさらに含む第２の導入遺伝子を含む遺伝子導入発現構築物に関係する。
【００２５】
１つの実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物はＣｒｅ、Ｃｒｅ様、Ｆｌｐ、φＣ３１、λインテグラーゼ、ファージＲ４およびＴＰ９０１−１リコンビナーゼからなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼを含む。
【００２６】
別の実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物は原核細胞性または真核細胞性のいずれかのトランスポーゼスであるリコンビナーゼを含む。
【００２７】
さらに別の実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物はウイルス性、ショウジョウバエコピア様または非ウイルス性レトロトランスポーゼスのいずれかであるリコンビナーゼを含む。
【００２８】
さらなる実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物はＴｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎｌ０００、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ショウジョウバエマリナー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス、ショウジョウバエＰエレメント、トウモロコシＡｃ、Ｄｓ、Ｍｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、ドット、Ｍｕ、Ｉ、Ｌ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）およびミノスからなる群から選択されるリコンビナーゼを含む。
【００２９】
特定の実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物はｌｏｘ Ｐ部位、ＦＲＴ部位、細菌性ゲノム組換え部位およびファージ組換え部位からなる群から選択される組換え部位を含む。
【００３０】
さらなる実施態様では、細菌性ゲノム組換え部位はａｔｔＢであり、そしてファージ組換え部位はａｔｔＰまたは偽ａｔｔＰまたは偽ａｔｔＢ部位である。
【００３１】
特定の実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物はウイルス性２Ａ／２Ｂまたは２Ａ様／２Ｂ配列から得られる自己切断ペプチドを含む。
【００３２】
さらなる実施態様では、ウイルスはピコルナウイルス科ウイルスファミリー、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウイルスファミリー、ピコルナウイルス様昆虫ウイルスファミリーからなる群、またはＣ型ロタウイルスファミリーから選択される。さらに別の実施態様では、ウイルスは口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウイルスまたはゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）からなる群から選択される。
【００３３】
特定の実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ、ｍｂ−１、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶｐｒｅＢ、免疫グロブリンカッパ軽鎖、免疫グロブリンラムダ軽鎖および免疫グロブリンＪ−鎖またはその修飾体からなる群から選択されるプロモーター／エンハンサーを用いてＢ細胞において特異的に発現される自殺遺伝子を含む。好ましい実施態様では、Ｂ細胞特異的プロモーター／エンハンサーはカッパ軽鎖遺伝子プロモーターまたはその修飾体である。
【００３４】
１つの態様では本発明は、内因性免疫グロブリン生成が内因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞における自殺遺伝子の選択的発現により抑制されるが、ヒト（化）免疫グロブリンを発現するＢ細胞は自殺遺伝子を発現せず、そしてしたがって増殖するヒト以外の動物を生成する方法に関係する。
【００３５】
とりわけ本発明は前記した遺伝子導入発現構築物を発現するヒト以外のトランスジェニック動物に関係する。
【００３６】
１つの実施態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物は実質的に遺伝子変換により抗体多様性を生じる。
【００３７】
全ての態様において、好ましいヒト以外の動物には、限定するものではないがげっ歯類（例えばマウス、ラット）、ウサギ、鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ロバおよびその他の家畜が含まれる。好ましい実施態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物はマウスまたはラットのいずれかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
定義
特記しない場合、本明細書で用いる技術的および科学的用語は本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（ニューヨーク、ニューヨーク州、１９９４年）およびＭａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（ニューヨーク、ニューヨーク州、１９９２年）は本出願で用いる多くの用語に対する一般的な手引きを当業者に提供する。
【００３９】
当業者は本明細書に記載したものに類似するかまたは均等である多くの方法および材料を認識し、それを本発明の実施にあたり用いることができる。実際に本発明は記載した方法および材料に何ら限定されるものではない。本発明の目的のために以下の用語を後記で定義する。
【００４０】
「Ｂ細胞」は免疫グロブリン遺伝子セグメントの再構成を被り、そしてそのライフサイクルのいくつかの段階で免疫グロブリン遺伝子を発現することができるＢ系統細胞として定義される。これらの細胞には、限定するものではないが初期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未成熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、形質細胞等が含まれる。
【００４１】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は同一の構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特異的抗原に対して結合特異性を呈するが、免疫グロブリンは抗体および抗原特異性を欠如するその他の抗体様分子の双方を含む。「抗体」なる用語は本明細書では最も広義で用いられ、そして具体的には、限定するものではないがモノクローナル抗体（モノクローナル抗体全長を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）およびそれが望ましい特異性を呈する限り抗体フラグメントに及ぶ。
【００４２】
本明細書で用いる「Ｉｇ遺伝子セグメント」なる用語はＩｇ分子の種々の部分をコードするＤＮＡのセグメントを意味し、それは動物およびヒトの生殖細胞系列に存在し、そしてＢ細胞で一緒になって再構成されたＩｇ遺伝子を形成する。したがって、本明細書で用いるＩｇ遺伝子セグメントはＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメントおよびＣ領域遺伝子セグメントを含む。ＶＤＪまたはＶＪセグメントの機能的再構成の結果、免疫グロブリン重または軽鎖の発現に至る。
【００４３】
本明細書で用いる「ヒトＩｇ遺伝子導入遺伝子座または遺伝子座またはセグメント」なる用語はヒトＩｇ遺伝子座またはそのセグメントの天然発生配列、ヒトＩｇ遺伝子座またはそのセグメントの天然発生配列の変性形態、およびヒトＩｇ遺伝子座またはそのセグメントの天然発生配列によりコードされるポリペプチドに実質的に同一のポリペプチド配列をコードする合成配列の双方を含む。この局面で、「実質的に」とはアミノ酸配列同一性の程度が少なくとも約８５％〜９５％、または少なくとも約９０％〜９５％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％であることを意味する。特定の好ましい実施態様では、ヒトＩｇ遺伝子セグメントはヒトにおいて免疫グロブリン分子に非免疫原性にする。ここでは「ヒトまたはヒト化免疫グロブリン（Ｉｇ）重および／または軽鎖遺伝子座」または「ヒトまたはヒト化Ｉｇ遺伝子座」なる用語は互換的に用いられる。
【００４４】
「ヒト抗体」および「ヒト免疫グロブリン」なる用語は完全なヒト配列を含む抗体および免疫グロブリン分子を意味するために用いられる。
【００４５】
本明細書で用いる「ヒト化抗体」および「ヒト化免疫グロブリン」なる用語はヒト免疫グロブリンポリペプチド配列（またはヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列）の少なくとも一部を含む免疫グロブリン分子を意味する。本発明のヒト化免疫グロブリン分子を、ヒト化免疫グロブリン分子を生成するように操作されたヒト以外のトランスジェニック動物から単離することができる。かかるヒト化免疫グロブリン分子は、動物から調製された、または動物に由来する細胞から調製された非ヒト化免疫グロブリン分子に相対して、霊長類、特にヒトに対して免疫原性が低い。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体は遺伝子変換および遺伝子変換動物における体細胞超変異によりさらに多様化された免疫グロブリン（Ｉｇ）および抗体を含む。かかるヒト化Ｉｇまたは抗体はヒトにより天然に作成されたものではないので（ヒトは遺伝子変換によりその抗体レパートリーを多様化しないので）、それらは「ヒト」ではなく、そしてしかもヒト化Ｉｇまたは抗体はその構造でヒトＩｇ配列を有するので、それらはヒトに対して免疫原性ではない。
【００４６】
「導入遺伝子または導入遺伝子構築物」は、天然または動物または動物の細胞において通常見出されない合成タンパク質をコードする配列を有するＤＮＡフラグメントである。本明細書で用いる「導入遺伝子構築物」なる用語は、構造的な「目的の遺伝子」および遺伝子移入を促進するその他の配列を含有するポリヌクレオチド分子を意味する。本発明は２つの導入遺伝子構築物：（１）ヒトＩｇ遺伝子座−自己切断ペプチド−リコンビナーゼおよび（２）免疫細胞特異的自殺導入遺伝子構築物に言及する。
【００４７】
「遺伝子導入発現構築物」は、ヒト以外のトランスジェニック動物の特異的な細胞内で一時的または細胞特異的または目的の導入遺伝子の発現強化のいずれかのために必要なその他の調節ＤＮＡ配列と一緒に、本発明の１つまたはいくつかの導入遺伝子構築物をコードする配列を伴うＤＮＡフラグメントを意味する。
【００４８】
「ヒト（化）Ｉｇ遺伝子座−自己切断ペプチド−リコンビナーゼ導入遺伝子または導入遺伝子構築物」は、単一のｍＲＮＡに転写される導入遺伝子構築物を意味し、それは後記で論じる自己切断メカニズムのために２つのポリペプチド、主にヒト（化）免疫グロブリン鎖およびリコンビナーゼに翻訳される。
【００４９】
本明細書で用いる「自己切断ペプチド」なる用語は、ペプチド配列自体の中の２つのアミノ酸残基の間に生じる切断活性を随伴するペプチド配列を意味する。例えば２Ａ／２Ｂペプチドまたは２Ａ／２Ｂ様ペプチドでは、切断は２Ａペプチド上のグリシン残基と２Ｂペプチド上のプロリン残基との間で生じる。これは２Ａ／２Ｂペプチドの２Ａグリシン残基と２Ｂプロリン残基との間の正常なペプチド形成が損なわれている翻訳の間の「リボソームスキップ機構」によって生じ、２Ｂペプチドの残りの翻訳には影響することはない。かかるリボソームスキップ機構は当分野において周知であり、そして単一のメッセンジャーＲＮＡによりコードされるいくつかのタンパク質の発現のためのいくつかのウイルスにより用いられることが解っている。
【００５０】
本明細書で用いる「リコンビナーゼ」なる用語は、「組換え部位」と称される定義された部位間の部位特異的組換えを促進することができる酵素の群を意味し、ここで２つの組換え部位は単一の核酸分子内で物理的に分かれているか、または別個の核酸分子上にある。２つの定義された組換え部位の配列は同一である必要はない。リコンビナーゼの群の中には「インテグラーゼ」（例えばＣｒｅ、Ｃｒｅ様、ＦＬＰおよびλインテグラーゼのような部位特異的リコンビナーゼ）および「リゾルベース／インベルターゼ」（例えばφＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼおよびＴＰ−９０１インテグラーゼ）を含むいくつかのサブファミリーがある。「リコンビナーゼ」なる用語にはまた、限定するものではないが原核細胞性または真核細胞性トランスポーゼス、ウイルス性またはショウジョウバエコピア様または哺乳動物レトロトランスポーゼスを含む非ウイルス性レトロトランスポーゼスも含まれる。原核細胞性トランスポーゼスの実例には、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎｌ０００、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１等の転位可能なエレメントでコードされるトランスポーゼスが含まれる。真核細胞性トランスポーゼスにはショウジョウバエマリナー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス、ショウジョウバエＰエレメント、トウモロコシＡｃおよびＤｓエレメント等の転位可能なエレメントでコードされるトランスポーゼスが含まれる。レトロトランスポーゼスにはＬ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）およびミノス等でコードされるものが含まれる。トランスポーゼスをＭｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、ドット、Ｍｕ、Ｉ転位性エレメントからなる群から選択することもできる。
【００５１】
本明細書で用いる「野生型組換え部位」なる用語は通常インテグラーゼのようなリコンビナーゼにより用いられる組換え部位を意味する。
【００５２】
「偽組換え部位」とは、部位がその野生型組換え部位の配列と同一の配列を有していなくても、リコンビナーゼが組換えを促進することができる部位を意味する。
【００５３】
本明細書で用いる「自殺遺伝子または自殺導入遺伝子」なる用語は、発現が遺伝子を発現する細胞の死亡に至るタンパク質をコードする遺伝子を意味する。例えばタンパク質は毒素（例えばジフテリア毒素Ａ鎖）または無毒性のプロドラッグを毒性生成物に変換する酵素（例えばチミジンキナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、チトクロームＰ４５０アイソザイム、デオキシリボヌクレオチドキナーゼ、ニトロリダクターゼ等）でよい。自殺遺伝子がプロドラッグ変換酵素をコードする場合、それを発現する細胞はプロドラッグに暴露された時点で死亡する。本明細書で用いる「自殺遺伝子生成物」なる用語は「自殺遺伝子」によりコードされるタンパク質を意味する。自殺遺伝子発現は免疫細胞特異的プロモーターにより、好ましくはＢ細胞プロモーターにより駆動される。
【００５４】
「自殺遺伝子発現の不活性化を可能にする配列」なる用語はリコンビナーゼにより認識される自殺遺伝子をフランキングする組換え部位を意味する。
【００５５】
「プロドラッグ」なる用語は代謝によりインビボで毒性生成物、代謝物または薬物に変換可能である化合物を意味する。
【００５６】
「内因性Ｉｇ（免疫グロブリン）発現Ｂ細胞」および「内因性Ｂ細胞」なる用語は互換的に用いられ、そして動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座を発現するこれらのＢ細胞を意味する。本発明のＢ細胞はそのゲノムに自殺遺伝子を含有する。内因性Ｂ細胞は自殺遺伝子を発現し、そしてその結果、最終的に枯渇し、そしてしたがって動物の内因性Ｉｇ発現が抑制される。
【００５７】
「外因性Ｉｇ（免疫グロブリン）発現Ｂ細胞」および「外因性Ｂ細胞」なる用語は、かかるＢ細胞に導入された外因性ヒト（化）Ｉｇ導入遺伝子座の産生性再構成を被るヒト以外の動物のこれらのＢ細胞を意味する。ヒト（化）Ｉｇ遺伝子座は、これもまた部位特異的リコンビナーゼをコードする発現構築物の一部としてかかるＢ細胞に導入される。ヒト（化）Ｉｇ遺伝子座の産生性再構成の結果、ヒト（化）Ｉｇおよび導入遺伝子コード化リコンビナーゼの発現に至る。結果として、Ｂ細胞のゲノムから自殺遺伝子が切除され、そして細胞は細胞死を免れる。したがって好ましくは、トランスジェニック動物により発現されるＩｇ生成物はヒト（化）免疫グロブリンである。
【００５８】
「自殺遺伝子の選択的発現」とは好ましくは免疫細胞内での、さらに好ましくはＢ細胞内での、そして最も好ましくは内因性Ｂ細胞内での自殺遺伝子生成物の発現を意味する。免疫細胞またはＢ細胞内での自殺遺伝子の選択的発現は各々免疫特異的またはＢ細胞特異的プロモーターを用いることにより達成されて自殺遺伝子発現を駆動する。
【００５９】
「選択的不活性化」なる用語は、外因性Ｂ細胞のゲノムからの自殺遺伝子またはその部分の選択的切除を意味する。自殺遺伝子は外因性Ｂ細胞において発現される導入遺伝子コード化リコンビナーゼにより認識される組換え部位によりフランキングされるので、自殺遺伝子は切除されるかまたは不活性化される。
【００６０】
Ｉｇ生成細胞の「枯渇」は、ヒト以外のまたは非ヒト化Ｉｇを発現する内因性Ｂ細胞集団の部分的または完全な死滅、瀕死および／または除去として定義される。さらに後記で説明するように、選択されるトランスジェニック動物が、抗体再構成が若年期に停止するものである場合、内因性Ｂ細胞の枯渇はさらに有効であり得る。
【００６１】
「内因性免疫グロブリン生成の選択的抑制」は、自殺遺伝子を発現する内因性Ｂ細胞の枯渇による、ヒト以外のトランスジェニック動物の内因性免疫グロブリンの生成の選択的抑制を意味する。したがって、トランスジェニック動物により優勢に発現される免疫グロブリン生成物はヒト（化）免疫グロブリンである。
【００６２】
「抗体多様性」および「抗体レパートリー」なる用語は互換的に用いられ、そして生物が発現できる全抗体特異性全体を意味する。
【００６３】
遺伝子再構成および遺伝子変換を行う能力を有するＩｇ遺伝子座はまた本明細書では「機能的」Ｉｇ遺伝子座をも意味し、そして機能的Ｉｇ遺伝子座により作成された多様性を有する抗体はまた本明細書では「機能的」抗体または抗体の「機能的」レパートリーをも意味する。
【００６４】
「モノクローナル抗体」なる用語はＢ細胞の単一のクローンにより合成された抗体分子を意味する。
【００６５】
「ポリクローナル抗体」なる用語はＢ細胞の集団により合成された抗体分子の集団を意味するために用いられる。
【００６６】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」なる用語は互換的に用いられ、そして単数または複数で用いられる場合、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、これは未修飾ＲＮＡもしくＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでよい。したがって、例えば本明細書で定義するようなポリヌクレオチドには、限定するものではないが一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖もしくはさらに典型的には二本鎖でよいか、または一本鎖および二本鎖領域を含んでよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。加えて、本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語はＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む三本鎖領域を意味する。かかる領域の鎖は同一の分子から、または異なる分子からでよい。領域は１つまたはそれより多い分子全てを含んでよいが、さらに典型的にはいくつかの分子のある領域のみを伴う。三本鎖らせん領域の分子の１つはオリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」なる用語は具体的にはｃＤＮＡを含む。その用語は１つまたはそれより多い修飾塩基を含有するＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。したがって、安定性またはその他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンのような通常でない塩基またはトリチウム化塩基のような修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは本明細書で定義する「ポリヌクレオチド」の用語に含まれる。一般に「ポリヌクレオチド」なる用語は未修飾ポリヌクレオチドの全ての化学的、酵素的および／または代謝的修飾形態、ならびにウイルスおよび単純細胞および複雑型細胞を含む細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特性の化学的形態を包含する。
【００６７】
本明細書で用いる「ヒト以外の（トランスジェニック）動物」には、限定するものではないが例えばヒト以外の霊長類、げっ歯類（例えばマウスおよびラット）、例えばウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマおよびロバのような非げっ歯類哺乳動物、ならびに鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等）のような哺乳動物が含まれる。本明細書で用いる「非霊長類動物」なる用語には、限定するものではないが前記で具体的に列挙した哺乳動物を含む霊長類以外の哺乳動物が含まれる。
【００６８】
「一次抗体レパートリーを創成するために実質的に遺伝子変換および／または体細胞超変異により抗体多様性を創成する動物」または「遺伝子変換動物」なる語句および文法的な均等は抗体多様化の主要な機構が、遺伝子再構成と対照的に遺伝子変換および／または超変異であるかかる動物を意味するために用いられる。かかる動物には、限定するものではないがウサギ、鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等）ウシおよびブタが含まれる。特に好ましいヒト以外の動物はウサギおよびニワトリである。
【００６９】
動物による「若年期の抗体遺伝子再構成の停止」とは、典型的には免疫グロブリン遺伝子の再構成が生まれて１か月以内に停止するこれらの動物を意味する。かかる動物の実例には、限定するものではないがウサギ、鳥類（例えばニワトリ）、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタおよびウマである。
【００７０】
詳細な説明
本発明は、例えば動物を（複数の）ヒト（化）免疫グロブリンの発現にさらに適当なものにする目的で、ヒト以外の動物における内因性免疫グロブリン生成を抑制するための方法を提供する。
【００７１】
本発明によれば、内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞における自殺遺伝子の選択的発現により、内因性免疫グロブリン生成は（複数の）ヒト（化）免疫グロブリンのような外因性免疫グロブリン配列を発現するヒト以外のトランスジェニック動物において選択的に抑制される。自殺遺伝子は導入遺伝子として動物のゲノムに組み込まれ、そして例えばヒト（化）Ｉｇ導入遺伝子座をも導入する遺伝子導入発現構築物の一部として、または別個に例えば別個の遺伝子導入発現構築物を用いて導入され得る。後者の場合、２つの発現構築物を同時にまたは異なる時間でトランスジェニック動物に導入することができる。
【００７２】
自殺遺伝子は免疫特異的プロモーター、好ましくはＢ細胞特異的プロモーターを用いて動物のＢ細胞において発現され、そしてリコンビナーゼにより認識される組換え配列によりフランキングされる。したがって、組換え配列によりフランキングされた自殺遺伝子は初期には動物の全てのＢ細胞に存在する。「外因性Ｂ細胞」では、ヒト（化）免疫グロブリン−自己切断ペプチド−リコンビナーゼ分子をコードする外因性免疫グロブリン導入遺伝子座の産生性再構成はかかるＢ細胞におけるリコンビナーゼの選択的発現に至る。リコンビナーゼはかかる細胞において自殺遺伝子をフランキングする組換え部位を認識する。結果的に外因性Ｂ細胞では自殺遺伝子は選択的に切除され、それは結果的に細胞死を免れる。対照的に内因性Ｂ細胞の内因性免疫グロブリン遺伝子座の産生性再構成はリコンビナーゼの発現に至らない。結果的に内因性Ｂ細胞における自殺遺伝子発現はこの細胞集団の死亡に至り、そしてその結果ヒト以外のトランスジェニック動物によるヒト（化）免疫グロブリンの発現を抑制することなく内因性免疫グロブリン生成を抑制する。
【００７３】
導入遺伝子は１つまたはいくつかの天然または、通常動物もしくは動物の細胞において見出されない合成タンパク質をコードする配列を有するＤＮＡフラグメントである。前核のマイクロインジェクション、トランスフェクション、核移植クローニング、精子媒介の遺伝子移入、精巣媒介の遺伝子移入等を含む種々の技術により、（複数の）ＤＮＡフラグメントを動物のゲノムに導入することができる。本発明は２つの導入遺伝子または導入遺伝子構築物（１）ヒトＩｇ遺伝子座−自己切断ペプチド−リコンビナーゼ導入遺伝子および（２）免疫細胞特異的自殺導入遺伝子に言及する。各々の導入遺伝子はその独自の調節配列に作動可能なように連結されている。例えば自殺遺伝子の発現はＢ細胞特異的プロモーターにより駆動され得る。２つの導入遺伝子構築物は２つの別個のベクターまたは同一のベクター（プラスミド）に存在し得る。１つの実施態様では、２つの導入遺伝子構築物を別個の時点で導入することができる。これに代えて、双方の導入遺伝子構築物を同時に動物に導入することができる。好ましい実施態様では、自殺導入遺伝子の発現は、重鎖再構成を生じた後に起こるように調節される。後記で論じる機構から明白であるように、これは外因性Ｂ細胞におけるリコンビナーゼの発現のための時間、そしてしたがって外因性Ｂ細胞のゲノムからの自殺遺伝子のリコンビナーゼ媒介の切除、したがってかかる細胞における自殺遺伝子発現の停止のための時間を見越している。加えて、本発明の方法で用いるベクターは選択を可能にするためにゲンタマイシン、ネオマイシン、カナマイシン等のような抗生物質選択マーカーをコードするＤＮＡ配列を含有できる。
【００７４】
本発明の１つの態様では、導入遺伝子は自己切断ペプチド（例えば２Ａペプチドまたは２Ａ様ペプチド）をコードするＤＮＡ配列を含む。導入遺伝子の免疫グロブリンコード化配列とリコンビナーゼコード化配列の間の自己切断ペプチドコード化配列の挿入により１つのメッセンジャーＲＮＡの生成に至る。しかしながらこのｍＲＮＡの翻訳の結果、ペプチドの自己切断機構のために２つの別個のタンパク質、（複数の）免疫グロブリンおよびリコンビナーゼに至る。したがってリコンビナーゼの発現をＶＤＪまたはＶＪセグメントの機能的再構成と結びつけることができる。
【００７５】
本発明の１つのかかる実施態様では、自己切断はピコルナウイルス科ウイルスファミリー、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウイルスファミリー、ピコルナウイルス様昆虫ウイルスファミリーを含む、またはＣ型ロタウイルスファミリーからのウイルスの２Ａ／２Ｂペプチドまたは２Ａ様／２Ｂ配列により媒介される。ピコルナウイルス科ウイルスファミリーにはエンテロ、ライノ、カルディオおよびアフトならびに口蹄疫（ＦＭＤＶ）ウイルスが含まれる。ピコルナウイルス様昆虫ウイルスファミリーには感染性フラシェリー病ウイルス（ＩＦＶ）、ショウジョウバエＣウイルス（ＤＣＶ）、急性ミツバチ麻痺病ウイルス（ＡＢＰＶ）およびコオロギ麻痺病ウイルス（ＣｒＰＶ）ならびに昆虫ウイルスゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）のようなウイルスが含まれる。Ｃ型ロタウイルスファミリーにはウシ、ブタおよびヒトＣ型ロタウイルが含まれる。さらなる実施態様では、切断配列はポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、メンゴウイルス、ブタテシオウイルス−１、またはタイラーネズミ脳炎ウイルス（ＴＭＥＶ）等のいずれかからの２Ａ様／２Ｂ配列を含み得る。好ましい実施態様では、自己切断タンパク質配列は口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウイルスまたはゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）のいずれかの２Ａ／２Ｂペプチドである。Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：７５４−７６２（１９９２）、Ｒｙａｎら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７２：２７２７−２７３２（１９９１）、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８２：１０２７−１０４１（２００１）、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８２：１０１３−１０２５（２００１）、Ｓｚｙｍａｃｚａｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２（５）：５８９−５９４（２００４）。
【００７６】
本発明の方法で用いるその他の導入遺伝子は部位特異的リコンビナーゼをコードする。部位特異的リコンビナーゼは２つの核酸、例えばＤＮＡセグメント間の相同組換えを触媒する。これらのリコンビナーゼは組換えの双方のパートナーの非常に特異的な配列を認識する。触媒の機構は様々な型の部位特異的リコンビナーゼで異なってよいが、それらは全て、基礎を成す機構に関わらず本明細書に含まれ、そして本発明の実施に適当である。
【００７７】
特定の実施態様では、リコンビナーゼは例えばＣｒｅ、Ｆｌｐリコンビナーゼ等でよい。ＣｒｅおよびＦｌｐは２つの最も一般的に用いられる酵素であり、それは非常に特異的なＤＮＡ配列に作用するのみである。Ｃｒｅは２つの３４塩基対長のｌｏｘＰ部位間でＤＮＡの組換えを触媒するが、Ｆｌｐはｆｒｔ部位を標的とする。真核細胞のＤＮＡの部位特異的組換えのためのＣｒｅリコンビナーゼの使用は米国特許第４９５９３１７号に記載されている。真核細胞のトランスフェクションのための部位特異的リコンビナーゼの使用は米国特許第６６３２６７２号に記載されている。部位特異的組換えは一般に米国特許第４６７３６４０号に記載されている。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ基盤のクローニング系は例えばＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト、カリフォルニア州）（Ｃｒｅａｔｏｒ（商標））またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州）（Ｅｃｈｏ（商標））から市販により入手可能である。
【００７８】
別の実施態様では、リコンビナーゼはλインテグラーゼ、φＣ３１、ＴＰ９０１−１およびＲ４からなる群から選択されるファージによりコードされる部位特異的リコンビナーゼでよい。φＣ３１およびＲ４は部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属するが、ＴＰ９０１−１は拡張されたリゾルベースファミリーに属する。Ｒ４インテグラーゼはストレプトミセス・パルブルスのファージＲ４のゲノムから誘導された部位特異的一方向性リコンビナーゼである。部位特異的インテグラーゼＴＰ９０１−１はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスのファージＴＰ９０１−１によりコードされる。λは大腸菌に感染する鋳型バクテリオファージである。ファージは組換えのための１つの結合部位（ａｔｔＰ）を有し、そして大腸菌細菌ゲノムは組換えのための１つの結合部位（ａｔｔＢ）を有する。本発明の局面では、野生型組換え部位を例えば相同系から誘導し、そして異種性配列に随伴させることができる。したがってａｔｔＢ部位をその他の系に置いてインテグラーゼの基質として作用させることができる。さらに別の実施態様では、リコンビナーゼは細菌ゲノム組換え部位（ａｔｔＢ）およびファージゲノム組換え部位（ａｔｔＰ）の間の組換えを触媒することができるか、または第１の部位は偽ａｔｔＢ部位を含むことができ、そして／もしくは第２の部位は偽ａｔｔＰ部位を含むことができるかまたはその逆である（Ｇｒｏｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：５９９５−６０００（２０００）；Ｏｌｉｖａｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１１）：１１２４−８（２００２））；（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、Ｍｏｌ． ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：３９２６−３９３４（２００１））；Ｈｏｌｌｉｓら、Ｒｅｐｒｏ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１：７９（２００３））。「偽組換え部位」とは、たとえ部位がその野生型組換え部位の配列と同一の配列を有せずとも、リコンビナーゼが組換えを促進できる部位を意味する。
【００７９】
さらに別の実施態様では、リコンビナーゼはトランスポーゼスまたはレトロトランスポーゼスでよい。トランスポゾンまたはレトロトランスポーゼスはカットアンドペースト機構によりその転位を触媒する酵素であり、そして任意の導入遺伝子の移入または挿入に用いることができる。これらはヒト、鳥類、げっ歯類等のような脊椎動物を含む広範な種のゲノムへの任意のＤＮＡ配列の挿入または移入のための非ウイルス性および非相同性の方法を提供する。例えばショウジョウバエエレメントマリナーはそれ自体をニワトリ生殖細胞系に転位させることが示された（Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１０５０−１０５３（１９９８））。ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス系を用いるマウスおよびヒトゲノムのような哺乳動物系への長期間の導入遺伝子発現またはトランスポゾンＤＮＡの効率的な挿入はＹａｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：３５−４１（２０００）；Ｄｕｐｕｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：４４９５−４４９９（２００２）およびＧｅｕｒｔｓら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１０８−１１７（２００３）により実証されている。Ｌ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）、ミノスのようなその他のトランスポーゼスは脊椎動物種において活性であることが示されており、そしてしたがって遺伝子移入に、または挿入変異ベクターとして有用である（Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ，Ｄａｖｉｄ Ａ．、Ｒｅｐｒｏ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１：８０（２００３））。トランスポーゼスの実例としては、限定するものではないが原核細胞性または真核細胞性トランスポーゼス、ウイルス性、ショウジョウバエコピア様または哺乳動物レトロトランスポーゼス等を含む非ウイルス性レトロトランスポーゼスが含まれる。原核細胞性トランスポーゼスには、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎｌ０００、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１等の転位可能なエレメントでコードされるトランスポーゼスが含まれる。真核細胞性トランスポーゼスにはショウジョウバエマリナー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス、ショウジョウバエＰエレメント、トウモロコシＡｃおよびＤｓエレメント等の転位可能なエレメントでコードされるトランスポーゼスが含まれる。レトロトランスポーゼスにはＬ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）、ミノス等でコードされるものが含まれる。トランスポーゼスをＭｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、ドット、Ｍｕ、およびＩ転位性エレメントからなる群から選択することもできる。
【００８０】
本発明の１つの態様では、前記した部位特異的リコンビナーゼ認識部位によりフランキングされた自殺遺伝子を用いて内因性Ｂ細胞を選択的に死滅させる。自殺遺伝子を組換え部位でフランキングすることにより、外因性Ｂ細胞においてのみリコンビナーゼまたはトランスポゾンの発現時の自殺遺伝子の不活性化に至る。自殺遺伝子発現の不活性化は自殺遺伝子またはその部分の切除により達成することができる。これに代えて、自殺遺伝子の発現に必要な配列を切除の標的とすることができる。別の研究法によれば、ＤＮＡフラグメントの反転または挿入によりトランスポゾンジャンピング、トランスポゾン挿入または反転のために自殺遺伝子発現を不活性化することができる。
【００８１】
本発明の実施において用いる自殺遺伝子には毒素遺伝子および毒性生成物を生じる無毒性プロドラッグ変換酵素が含まれる。本発明の方法において用いることができる活性毒素およびそのフラグメントには、例えばジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴＡ）のような細菌性毒素もしくはそのフラグメント、シグマ毒素、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌由来）等またはリシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＡＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセン、殺虫性毒素、は虫類毒液等のような植物もしくは真菌毒素およびその非結合活性フラグメントが含まれる。好ましい実施態様では、用いる毒素はジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴＡ）である。
【００８２】
標的Ｂ細胞に導入された自殺遺伝子がプロドラッグ変換酵素をコードする場合、酵素は特異的無毒性プロドラッグを活性化して最終的に標的Ｂ細胞を死滅させる毒性代謝物を創成する。この研究法では、内因性Ｂ細胞生成を抑制するために２工程処理方法を設計することができる。第１工程では、当分野において公知の種々の方式で外来酵素のための遺伝子を発現させるかまたはＢ細胞に分配することができる。第２工程では、動物に投与されたプロドラッグは最終的にそれを死滅させる酵素を発現するＢ細胞により活性化されて毒性代謝物になる。
【００８３】
自殺遺伝子として有用なプロドラッグ変換酵素は一般に２つの主要なクラスで見出されている。第１のクラスはヒト対応物を伴うかまたは伴わない非哺乳動物起源の酵素である。実例にはウイルス性チミジンキナーゼ（ＴＫ）、細菌性サイトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、細菌性カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、ニトロリダクターゼ（ＮＲ）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ペニシリン−Ｇアミダーゼ（ＰＧＡ）、βラクタマーゼ、多剤活性化酵素（ＭＤＡＥ）、βガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、西洋ワサビベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびデオキシリボヌクレオチドキナーゼ（ＤＲＮＫ）が含まれる。第２のクラスはヒト起源の酵素からなる。これにはデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）、β−グルクロニダーゼ（−Ｇｌｕ）およびチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソザイムが含まれる。酵素プロドラッグ系のさらなる実例はＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ（Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、２００４年）の表１に列挙されており、それを出典明示により本明細書の一部とする。したがって本発明で自殺遺伝子として用いるプロドラッグ変換酵素には、限定するものではないが前記したように非哺乳動物、非ヒト起源およびヒト起源の酵素が含まれる。
【００８４】
本発明で有用である適当なプロドラッグには、限定するものではないがガンシクロビル、アシクロビル、５−（アジリジン−１−イル）−２，３ジニトロベナミド、カペシタビン、イリノテカン、カルバマート基盤の２０（Ｓ）−カンプトテシン、ジニトロベンズアミドアジリジンＣＢ１９５４およびそのナイトロジェンマスタード類似体ＳＮ２３８６２、２−アミノアントラセン（２−ＡＡ）および４−イポメアノール（４−ＩＭ）等が含まれる。本発明で有用であるプロドラッグのさらなる実例は対応するその活性化酵素と共にＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ（Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、２００４年）の表１に列挙されており、それを出典明示により本明細書の一部とする。酵素活性化プロドラッグはしばしば、例えばエタニダゾール、フルオソール、ミソニダゾール、ニモラゾール、テモポルフィン、トリアパザミンのような放射線増感薬、またはカスパーゼのようなその他のアポトーシス剤の発現を用いるその他の細胞死滅方法と組み合わせて用いられることがあり、標的内因性Ｉｇ発現Ｂ細胞を死滅させる相乗効果を導く。
【００８５】
したがって自殺遺伝子の発現は種々の機構により内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞を排除することができる。例えばＤＴＡの発現によりタンパク質合成の阻止および続く細胞死に至る。チミジンキナーゼはガンシクロビルおよびアシクロビルをその対応する一リン酸形態にリン酸化し、それは続いて細胞性キナーゼにより毒性の三リン酸誘導体に変換される。毒性三リン酸の分裂細胞ＤＮＡへの取り込みにより細胞死に至る。ニトロリダクターゼは５−（アジリジン−１−イル）−２，３ジニトロベナミドを２−および４−ヒドロキシルアミノ誘導体に変換し、そのときに細胞性チオエステルを有する４−ヒドロキシルアミノ誘導体の非酵素反応によりＤＮＡを架橋することができる強力な細胞毒性二価性アルキル化剤が作成される。当分野において公知の自殺遺伝子は本発明において有用であるが、これらの自殺遺伝子が内因性Ｂ細胞を排除するように作用する（複数の）機構に束縛または限定されることはない。
【００８６】
本発明の好ましい実施態様では、自殺遺伝子は野生型または偽組換え部位（例えばＣｒｅにより認識されるｌｏｘＰ部位またはＦｌｐにより認識されるＦＲＴ部位）によりフランキングされたジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴＡ）をコードする。
【００８７】
本発明の別の実施態様では、自殺遺伝子は 野生型または偽組換え部位によりフランキングされたチミジンキナーゼをコードする。
【００８８】
１つの実施態様では、部位特異的リコンビナーゼ認識部位によりフランキングされた自殺遺伝子を、ヒトＩｇ遺伝子座−自己切断ペプチド−リコンビナーゼ導入遺伝子の導入の前、同時または後のいずれかに、別個の遺伝子導入ベクターで動物に導入する。別の実施態様では、部位特異的リコンビナーゼ認識部位によりフランキングされた自殺遺伝子をヒトＩｇ遺伝子座−リコンビナーゼ導入遺伝子のためのものとして同一の遺伝子導入ベクターで動物に導入する。全ての態様で、自殺遺伝子は動物ゲノムに組み込まれ、そして免疫細胞においてのみ特異的に発現されることを確実にする免疫細胞特異的プロモーターにより、および好ましくはＢ細胞においてのみ特異的に発現されることを確実にし、その他の細胞型では発現されないＢ細胞特異的プロモーターにより、その発現が駆動される。
【００８９】
自殺遺伝子の発現はＢ細胞特異的プロモーターにより制御されて、その発現は非Ｂ細胞またはヒト以外のトランスジェニック動物の組織では「スイッチオフ」になる。Ｂ細胞特異的遺伝子の発現を制御するプロモーター（およびエンハンサー）、またはその変種もしくは操作された部分は自殺遺伝子のかかるＢ細胞特異的発現に有用である。Ｂ細胞特異的遺伝子のプロモーター／エンハンサーの実例には、限定するものではないがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ（Ｂ２９またはＩｇベータとしても公知である）、ｍｂ−１（Ｉｇアルファとしても公知）、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶｐｒｅＢ、免疫グロブリンカッパ軽鎖、免疫グロブリンラムダ軽鎖、免疫グロブリンＪ−鎖等のプロモーター／エンハンサーが含まれる。好ましい実施態様では、カッパ軽鎖遺伝子プロモーター／エンハンサーが自殺遺伝子のＢ細胞特異的発現を駆動する。
【００９０】
したがって、内因性免疫グロブリン生成の抑制の結果、ヒト（化）Ｉｇ導入遺伝子座の優勢な発現に至る。換言すれば、内因性Ｂ細胞の枯渇によりヒト（化）抗体の富化に至る。好ましくは、内因性Ｂ細胞の富化は１００％に近くなる。
【００９１】
本発明のさらに別の態様では、導入遺伝子は免疫グロブリン重鎖および／もしくは免疫グロブリン軽鎖またはその部分をコードする。遺伝子座は生殖細胞系の立体配置または再構成形態でよい。コード化配列またはその部分はヒト免疫グロブリンをコードすることができ、その結果ヒト（化）抗体の発現に至る。
【００９２】
ヒト（化）抗体をコードする（複数の）導入遺伝子は１つまたはいくつかのヒトＩｇセグメント（例えばヒトＩｇＶ、Ｄ、ＪまたはＣ遺伝子セグメント）を含有するＩｇ遺伝子座またはＩｇ遺伝子座の大部分を含有する。これに代えて、導入遺伝子はヒト免疫グロブリン遺伝子座またはその大部分である。かかるヒトＩｇ遺伝子座またはかかる修飾されたＩｇ遺伝子座またはＩｇ遺伝子座の修飾された部分を含有する導入遺伝子もまた本明細書では「ヒト（化）Ｉｇ導入遺伝子座」と称され、ヒト以外のトランスジェニック動物において再構成を被ることができ、それによりヒト免疫グロブリンポリペプチド配列の少なくとも一部を有する抗体の多様化されたレパートリーが生成される。
【００９３】
免疫グロブリン重および軽鎖遺伝子は個々の遺伝子によりコードされ、そしてイントロン配列により分けられたいくつかのセグメントを含む。したがってヒト免疫グロブリン重鎖のための遺伝子は第１４染色体で見出される。重鎖（ＶＨ）の可変領域は３つの遺伝子セグメント（Ｖ、ＤおよびＪセグメント）、続いてＣ領域をコード化する同義遺伝子を含む。Ｖ領域は大型のスペーサーによってＣ領域から分けられ、そしてＶ、ＤおよびＪセグメントをコードする個々の遺伝子もまたスペーサーによって分けられる。
【００９４】
２つの型の免疫グロブリン軽鎖：κおよびλがある。ヒトκ軽鎖の遺伝子は第２染色体に見出され、そしてヒトλ軽鎖の遺伝子は第２２染色体に見出される。抗体軽鎖の可変領域は別個の遺伝子セグメントによりコードされるＶセグメントおよびＪセグメントを含む。κ軽鎖遺伝子の生殖細胞系立体配置では、およそ１００〜２００Ｖ領域遺伝子が直線的な配置で存在し、各遺伝子はそれ独自のリーダー配列、続いておよそ５Ｊ遺伝子セグメントおよびＣ領域遺伝子セグメントを有する。全てのＶ領域はイントロンにより分けられ、そして同様にＶ、ＪおよびＣ領域遺伝子セグメントを分けるイントロンが存在する。
【００９５】
感染に対して保護する免疫系の能力は、抗体の多様なレパートリーを創成するために特殊化された遺伝的な仕組みにある。Ｂ細胞の抗体コード化遺伝子は可変（Ｖ）領域の結合部位の無数の組み合わせを可能にする様式で組み立てられる。１０１２より多い可能な結合構造がかかる機構から生じると推測される。ヒトを含む全ての動物において抗体産生過程は免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）および連結（Ｊ）セグメントを組換えることにより始まる。この工程の後に、動物種に依存して２つの一般的な機構を用いて抗体の多様な結合構造を生成する。
【００９６】
ヒトおよびマウスのようないくつかの動物では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座にＶ、ＤおよびＪセグメントの複数のコピー、ならびに免疫グロブリン軽鎖伝子座にＶおよびＪセグメントの複数のコピーが存在する。これらの動物における抗体多様性は一次的には遺伝子再構成、すなわち再構成された重鎖可変領域および軽鎖可変領域を形成するための遺伝子セグメントの異なる組み合わせにより作成される。しかしながら別の動物（例えばウサギ、鳥類、例えばニワトリ、ガチョウおよびアヒル、ヒツジ、ヤギならびにウシ）では、遺伝子再構成は抗体多様性の作成においてあまり大きな役割を果たさない。例えば、ウサギでは、非常に限定された数のＶ遺伝子セグメントのみ、もっともよくあるのはＶ領域の３’末端のＶ遺伝子セグメントが遺伝子再構成に用いられて近接するＶＤＪセグメントを形成する。ニワトリでは、１つのＶ遺伝子セグメント（Ｄ領域に隣接するもの、すなわち「３’近位Ｖ遺伝子セグメント」）のみ、１つのＤセグメントおよび１つのＪセグメントのみを重鎖再構成で用い、そして１つのＶ遺伝子セグメント（３’近位Ｖ遺伝子セグメント）および１つのＪセグメントのみを軽鎖再構成で用いる。したがってこれらの動物では初期に再構成された可変領域配列の中では多様性が少ししかなく、それは連結部多様化の結果である。再構成されたＩｇ遺伝子のさらなる多様化は、上流Ｖ遺伝子セグメントから誘導される短い配列が、再構成されたＩｇ遺伝子のＶ遺伝子セグメント内の短い配列を置き換える過程である遺伝子変換により達成される。抗体配列のさらなる多様化を超変異により作成することができる。
【００９７】
免疫グロブリン（抗体）は５つのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤ）に属し、各々は免疫防御において異なる生物学的役割を有している。血液中に最も豊富であり、そして感染に対する応答において強力であるのはＩｇＧクラスである。ヒトＩｇＧクラス内にはＦｃドメインを含む重鎖定常領域の構造により決定される４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプ）がある。抗体のＦ（ａｂ）ドメインは抗原の特異的配列（エピトープ）に結合するが、抗体のＦｃドメインは抗原を排除するために免疫系のその他の構成成分を補充および活性化する。
【００９８】
元来の抗体および免疫グロブリンは通常約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる。各軽鎖は（複数の）共有結合性ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重および軽鎖はまた規則正しい間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一方の末端で可変ドメイン（ＶＨ）を有し、多くの定常ドメインがそれに続く。各軽鎖は一方の末端で可変ドメイン（ＶＬ）、およびその他方の末端で定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインとアラインされ、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインとアラインされている。特定のアミノ酸残基は軽鎖および重鎖可変ドメイン間のインターフェースを形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）；ＮｏｖｏｔｎｙおよびＨａｂｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５））。
【００９９】
「可変」なる用語は可変ドメインの特定の部分が抗体間の配列で大きく異なるという事実を意味し、そしてその特定の抗原に関する特定の各抗体の結合および特異性において用いられる。しかしながら可変性は抗体の可変ドメインにわたって均一に分布されるわけではない。それは双方共に軽鎖および重鎖可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と称される３つのセグメントに集中している。可変ドメインのさらに高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と称される。元来の重および軽鎖の可変ドメインは各々３つのＣＤＲによりつながれた４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域により近接近してまとまり、そしてその他の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，、ベセスダ、メリーランド州（１９９１年）参照）。定常ドメインは抗体の抗原に対する結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような種々のエフェクター機能を呈する。
【０１００】
ヒト動物導入遺伝子座の創成により高収率で多様化された高親和性ヒト（化）（ポリクローナル）抗体を発現するトランスジェニック動物の創成が可能になる。一般にヒト以外の動物における免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座のヒト化は１つまたはそれより多いヒトＩｇ遺伝子セグメントの動物のゲノムへの組み込みを伴い、ヒト（化）免疫グロブリン遺伝子座を創成する。したがってヒト（化）Ｉｇ重鎖遺伝子座の創成は１つまたはそれより多いＶおよび／もしくはＤおよび／もしくはＪセグメント、ならびに／またはＣ領域セグメントの動物ゲノムへの組み込みを伴う。同様に、ヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座の創成は１つまたはそれより多いＶおよび／もしくはＪセグメント、ならびに／またはＣ領域セグメントの動物ゲノムへの組み込みを伴う。
【０１０１】
染色体位置に関わらず、本発明のヒト（化）Ｉｇ遺伝子座はヒト以外の動物において遺伝子再構成および遺伝子変換および超変異を被る能力を有し、それによりヒト（化）Ｉｇ分子の多様化されたレパートリーを生成する。遺伝子再構成および遺伝子変換を被る能力を有するＩｇ遺伝子座は「機能的」Ｉｇ遺伝子座とも称され、そして機能的Ｉｇ遺伝子座により作成された多様性を有する抗体は「機能的」抗体または抗体分子の「機能的」レパートリーとも称される。
【０１０２】
１つの態様では、抗体レパートリーの多様化が若年期に停止する動物が本発明において有用である。Ｂ細胞は造血幹細胞から発達する。抗原暴露の前にＢ細胞は一連の成熟工程を被り、その最終生成物は成熟Ｂ細胞であり、それはその他の細胞表面シグナリング分子と一緒にその細胞表面に独特な膜結合性ＩｇＭおよびしばしばＩｇＤを発現する。ヒトでは遺伝子再構成による抗体多様化は一生にわたって生じるが、その他の動物では、抗体レパートリーの多様化は若年期に、典型的には生まれて１か月以内に停止する。
【０１０３】
免疫グロブリン遺伝子の再構成が若年期に停止する動物では、この限定された期間に生成された全てまたはほとんどのＢ細胞を死滅させることにより効果的に内因性免疫グロブリン生成の持続的または永続的な抑止に至る。１つまたはいくつかのヒトまたはヒト化免疫グロブリン導入遺伝子座を含有するトランスジェニック動物では、これにより動物の内因性免疫グロブリン生成の不在下でのヒトまたはヒト化免疫グロブリンの生成が可能になる。このように遺伝子再構成が若年期に停止する動物では（複数の）内因性免疫グロブリンの発現が効果的に抑制され得る。かかる動物の実例は、限定するものではないがウサギ、鳥類（例えばニワトリ）、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタおよびウマである。
【０１０４】
本発明によれば、ヒト（化）免疫グロブリンを作ることができるトランスジェニック動物は、動物の（１つまたは複数の）レシピエント細胞に本明細書に前記した１つまたはそれより多い遺伝子導入ベクターを導入することにより作られ、その１つはヒト（化）Ｉｇ遺伝子座を担持し、そして遺伝的に修飾された（１つまたは複数の）レシピエント細胞から動物を誘導する。
【０１０５】
レシピエント細胞は例えば遺伝子変換および／または超変異により抗体多様性を作成するヒト以外の動物、例えば鳥類（例えばニワトリ）、ウサギ、ウシ等由来でよい。かかる動物では３’近位Ｖ遺伝子セグメントは免疫グロブリンの生成に優先的に用いられる。動物の３’近位Ｖ遺伝子セグメントを置換することか、または３’近位Ｖ遺伝子セグメントの近接近で配置されることのいずれかにより、導入遺伝子ベクターのＩｇ遺伝子座へのヒトＶ遺伝子セグメントの組み込むことで、大部分の免疫グロブリンでのヒトＶ領域ポリペプチド配列の発現に至る。これに代えて、再構成されたヒトＶ（Ｄ）Ｊセグメントを導入遺伝子ベクターの免疫グロブリン遺伝子座のＪ遺伝子座に挿入することができる。
【０１０６】
無作為組み込みによるかまたは標的組み込みにより、ヒト（化）Ｉｇ遺伝子座および自殺遺伝子を含有する目的の遺伝子を含有する遺伝子導入ベクターを（１つまたは複数の）レシピエント細胞に導入し、そして次に（１つまたは複数の）レシピエント細胞のゲノムに組み込むことができる。
【０１０７】
無作為組み込みのために、標準的な遺伝子導入技術によりヒト（化）Ｉｇ遺伝子座を含有する遺伝子導入ベクターを動物のレシピエント細胞に導入することができる。例えば遺伝子導入ベクターを受精卵母細胞の前核に直接注射することができる。また卵母細胞の受精の前に精子の遺伝子導入ベクターとのコインキュベーションにより遺伝子導入ベクターを導入することもできる。受精卵母細胞からトランスジェニック動物を発達させることができる。遺伝子導入ベクターを導入する別の方式は、胚性幹細胞をトランスフェクトし、そして続いて遺伝的に修飾された胚性幹細胞を発達中の胚に注射することによる。これに代えて遺伝子導入ベクター（裸でまたは促進剤と組み合わせて）を発達中の胚に直接注射することができる。最終的に、トランスジェニック動物の少なくともいくつかの体細胞のゲノムに組み込まれたヒト（化）Ｉｇ導入遺伝子を含有する胚からキメラトランスジェニック動物を生成する。
【０１０８】
特定の実施態様では、ヒト（化）Ｉｇ遺伝子座を含有する導入遺伝子は内因性免疫グロブリン遺伝子の発現が損なわれた動物株から誘導されたレシピエント細胞（例えば受精卵母細胞または発達中の胚）のゲノムにランダムに組み込まれる。かかる動物株の使用によりヒト（化）遺伝子導入Ｉｇ遺伝子座からの免疫グロブリン分子の優先的な発現が可能になる。かかる動物の実例には、アリシアおよびバジレアウサギ株、ならびに無ガンマグロブリン血症ニワトリ株、ならびに免疫グロブリンノックアウトマウスが含まれる。これに代えて、ヒト（化）免疫グロブリン導入遺伝子または遺伝子座を有するトランスジェニック動物を内因性免疫グロブリンの発現が損なわれた動物株と交配させることができる。損なわれた内因性Ｉｇ遺伝子座およびヒト（化）遺伝子導入Ｉｇ遺伝子座に関してホモ接合性の子孫を得ることができる。
【０１０９】
標的組み込みのために、遺伝子導入ベクターを胚性幹細胞または既に分化した体細胞のような適切な動物レシピエント細胞に導入することができる。その後、導入遺伝子が動物ゲノムに組み込まれ、そして相同組換えにより対応する内因性Ｉｇ遺伝子座を置換した細胞を標準的な方法により選択することができる。例えばＫｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００４年６月６日を参照のこと。次いで選択した細胞を除核した核移植単位細胞、例えば卵母細胞または胚性幹細胞と融合することができ、その細胞は全能性であり、そして機能的新生仔を形成することができる。十分に確立されている従来技術に従って融合を実施する。また卵母細胞の除核および核移植を注入ピペットを用いる顕微手術により実施することもできる。（例えばＷａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ ３９４：３６９（１９９８）参照。）得られた卵細胞を次いで適切な培地中で培養し、そして同期化したレシピエントに移入してトランスジェニック動物を作成する。これに代えて選択された遺伝的に修飾された細胞を発達中の胚に注射することができ、それを続いてキメラ動物に発達させる。
【０１１０】
さらに本発明によれば、その１つが内因性Ｉｇ遺伝子セグメントのフランキング配列に相同である５’および３’フランキング配列に連結されたヒトＩｇ遺伝子セグメントを担持する本明細書にて前記した１つまたはそれより多い組換えベクターを（１つまたは複数の）レシピエント細胞に導入し、次いで相同組換えにより内因性Ｉｇ遺伝子セグメントがヒトＩｇ遺伝子セグメントにより置き換えられている細胞を選択し、そして選択された遺伝的に修飾された（１つまたは複数の）レシピエント細胞から動物を誘導することにより、ヒト（化）免疫グロブリンを生成できるトランスジェニック動物を作ることもできる。
【０１１１】
遺伝子導入ベクターの標的挿入に類似して、この研究法においてレシピエント細胞として使用するのに適切な細胞には胚性幹細胞または既に分化した体細胞が含まれる。任意の実行可能な手段、例えばトランスフェクションによりヒトＩｇ遺伝子セグメントを担持する組換えベクターをかかるレシピエント細胞に導入することができる。その後相同組換えによりヒトＩｇ遺伝子セグメントが対応する内因性Ｉｇ遺伝子セグメントと置き換わっている細胞を標準的な方法により選択することができる。これらの遺伝的に修飾された細胞をトランスジェニック動物のクローニングのための核移植手順における核ドナー細胞として提供することができる。これに代えて選択された遺伝的に修飾された胚性幹細胞を発達中の胚に注射することができ、それを続いてキメラ動物に発達させることができる。
【０１１２】
具体的な実施態様では、胚期の間に導入遺伝子を胚に直接注射することにより、またはそれらを妊娠母体もしくは産卵するメンドリに間接的に注射することにより本発明の導入遺伝子構築物をトランスジェニック動物に導入することができる。結果的に動物の免疫グロブリン分子を発現する内因性Ｂ細胞は枯渇し得て、そして故にトランスジェニック子孫が抗原での免疫に応答してヒト（化）抗体を優勢に生成する。
【０１１３】
前記の方法のいずれかにより生成されたトランスジェニック動物は本発明の別の実施態様を形成する。トランスジェニック動物は少なくとも１つの、すなわち１つまたはそれより多い、そこからヒト（化）抗体の機能的レパートリーが生成されるヒト（化）Ｉｇ遺伝子座および自殺遺伝子をゲノムに有する。
【０１１４】
具体的な実施態様では、本発明は１つまたはそれより多いヒト（化）Ｉｇ遺伝子座および自殺遺伝子をゲノムに有するトランスジェニックウサギを提供する。本発明のトランスジェニックウサギはヒト（化）Ｉｇ遺伝子座を再構成および遺伝子変換し、そしてヒト（化）抗体の機能的レパートリーを発現することができる。
【０１１５】
別の具体的な実施態様では、本発明は１つまたはそれより多いヒト（化）Ｉｇ遺伝子座および自殺遺伝子をゲノムに有するトランスジェニックニワトリを提供する。本発明のトランスジェニックニワトリはヒト（化）Ｉｇ遺伝子座を再構成および遺伝子変換し、そしてヒト（化）抗体の機能的レパートリーを発現することができる。別の具体的な実施態様では、本発明は１つまたはそれより多いヒト（化）Ｖ領域および自殺遺伝子をゲノムに有するトランスジェニックマウスを提供する。ヒト（化）Ｖ領域はヒト以外のスペーサー配列によりフランキングされた少なくとも２つのヒトＶ遺伝子セグメントを含む。トランスジェニックマウスはヒトＶエレメントを再構成し、そして抗体の機能的レパートリーを発現することができる。
【０１１６】
抗原での免疫が該トランスジェニック動物における同一抗原に対するヒト（化）抗体の生成を招く。
【０１１７】
本発明の好ましい実施態様は、内因性Ｂ細胞を枯渇させるためにヒト（化）Ｉｇ遺伝子座および少なくとも１つの自殺遺伝子を有し、そしてヒト（化）ポリクローナル抗血清を生成するトランスジェニック動物に向けられているが、霊長類化Ｉｇ遺伝子座および霊長類化ポリクローナル抗血清を有するトランスジェニック動物もまた本発明の精神内にあることは理解されよう。ヒト（化）ポリクローナル抗血清組成物に類似して霊長類化ポリクローナル抗血清組成物は、ヒト個体における免疫原性が低下している可能性がある。
【０１１８】
一度多様化されたヒト（化）免疫グロブリン分子を生成することができるヒト以外のトランスジェニック動物が作られると（さらに後記で説明するように）、抗原で動物を免疫することによりヒト（化）免疫グロブリンおよび抗原に対するヒト（化）抗体調製物を容易に得ることができる。種々の抗原を用いてトランスジェニック宿主動物を免疫することができる。かかる抗原には、微生物、例えばウイルスおよび単細胞生物（例えば細菌および菌類）、生存、弱毒化もしくは死亡した、微生物のフラグメント、または微生物から単離された抗原分子が含まれる。
【０１１９】
動物を免疫するのに用いるための好ましい細菌性抗原には、莢膜多糖類５および８型のような黄色ブドウ球菌からの精製抗原、アルファ毒素のような毒性因子の組換え体、アドヘシン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、およびフィブロネクチン結合タンパク質が含まれる。好ましい細菌性抗原にはまた黄色ブドウ球菌、緑膿菌、腸球菌、エンテロバクターおよび肺炎桿菌の弱毒体、またはこれらの細菌細胞からの培養上澄みも含まれる。免疫に用いることができるその他の細菌性抗原には精製リポ多糖類（ＬＰＳ）、莢膜抗原、莢膜多糖類および／または外膜タンパク質の組換え体、フィブロネクチン結合タンパク質、内毒素、ならびに緑膿菌、腸球菌、エンテロバクターおよび肺炎桿菌の外毒素が含まれる。
【０１２０】
真菌に対する抗体の作成のための好ましい抗原には、真菌の弱毒体またはその外膜タンパク質が含まれ、その真菌には、限定するものではないがカンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリスおよびクリプトコッカス・ネオホルマンスが含まれる。
【０１２１】
ウイルスに対する抗体を作成するために免疫で用いるための好ましい抗原には、エンベロープタンパク質およびウイルスの弱毒体が含まれ、そのウイルスには、限定するものではないが呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）（特にＦプロテイン）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢＶおよびＨＳＶが含まれる。
【０１２２】
単離された腫瘍細胞または腫瘍細胞系を有するトランスジェニック動物を免疫することにより癌の処置のための治療用抗体を作成することができ、腫瘍関連抗原には、限定するものではないがＨｅｒ−２−ｎｅｕ抗原（それに対する抗体は乳癌の処置に有用である）；ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＣＤ５３抗原（それに対する抗体はＢ細胞リンパ腫の処置に有用である）、（３）前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）（それに対する抗体は前立腺癌の処置に有用である）、および１７−１Ａ分子（それに対する抗体は結腸癌の処置に有用である）が含まれる。
【０１２３】
任意の都合のよい様式で、補助剤を伴うかまたは伴わずに抗原をトランスジェニック宿主動物に投与することができ、そして予め決定されたスケジュールに従って投与することができる。
【０１２４】
免疫後、抗原に特異的な医薬品等級のポリクローナル抗体の精製のために免疫したトランスジェニック動物からの血清または乳を分画することができる。トランスジェニック鳥類の場合、卵黄を分画することにより抗体を作ることもできる。クロマトグラフィー（親和性、イオン交換、ゲルろ過等）、硫酸アンモニウムのような塩、エタノールのような有機溶媒またはポリエチレングリコールのようなポリマーを用いる選択的沈殿により、濃縮され、精製された免疫グロブリン分画を得ることができる。
【０１２５】
分画されたヒト（化）抗体をヒトでの静脈内投与に適当な無毒性のパイロジェン不含培地、例えば滅菌緩衝食塩水に溶解または希釈することができる。
【０１２６】
投与に用いられる抗体調製物は一般に、免疫グロブリン濃度が０．１から１００ｍｇ／ｍｌ、さらに通常的には１から１０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする。抗体調製物は種々のアイソタイプの免疫グロブリンを含有できる。これに代えて、抗体調製物はただ１つのアイソタイプ、または多くの選択されたアイソタイプの抗体を含有することができる。
【０１２７】
ヒト（化）モノクローナル抗体を作るために、その動物の内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞が枯渇している、免疫トランスジェニック動物から脾臓細胞を単離する。単離した脾臓細胞を、ハイブリドーマの生成のために形質転換された細胞系との細胞融合に用いるか、または抗体コード化ｃＤＮＡを標準的な分子生物学技術によりクローン化し、そしてトランスフェクトされた細胞中で発現させる。モノクローナル抗体を作るための手順は当分野において十分に確立されている。例えば欧州特許出願第０５８３９８０Ａｌ号（「Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｒａｂｂｉｔｓ」）、米国特許第４９７７０８１号（「Ｓｔａｂｌｅ Ｒａｂｂｉｔ−Ｍｏｕｓｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ Ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」）、国際公開公報第９７／１６５３７号（「Ｓｔａｂｌｅ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｂ−ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ」）、および欧州特許第０４９１０５７Ｂ１号（「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｗｈｉｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｅｓ Ａｖｉａｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ」）（それらの開示は出典明示により本明細書の一部とする）参照。クローン化されたｃＤＮＡからのモノクローナル抗体のインビトロ生成はＡｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ」、Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４２：１５９（２０００）およびＢｕｒｔｏｎ， Ｄ． Ｒ．、「Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ」、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：８７（１９９５）（それらの開示は出典明示により本明細書の一部とする）により記載されている。
【０１２８】
たいていの場合、抗体調製物は未修飾免疫グロブリン、すなわち例えば化学物質または酵素によりさらなる修飾を加えていない動物から調製したヒト（化）抗体からなる。これに代えて免疫グロブリン分画を酵素消化（例えばペプシン、パパイン、プラスミン、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼ等で）、加熱等のような処理に供する、および／またはさらに分画することができる。
【０１２９】
本発明の好ましい実施態様はヒト化抗体を生成するヒト以外のトランスジェニック動物における内因性免疫グロブリン生成の抑制のための方法に向けられており、それにより望ましいヒト（化）免疫グロブリンの富化が可能になる。１つの実施態様では、当分野において公知の方法を用いてヒト（化）免疫グロブリン遺伝子を含む導入遺伝子、自己切断ペプチドおよびリコンビナーゼをトランスジェニック動物に導入し、外因性Ｂ細胞と称されるＢ細胞における付随するヒト（化）免疫グロブリンおよびリコンビナーゼ遺伝子の発現を確実にする。本明細書に記載した、または当分野において周知の任意の種々のリコンビナーゼ、自己切断ペプチドまたは免疫グロブリン遺伝子を導入遺伝子で用いることができる。さらにこの実施態様では、内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞における自殺遺伝子の選択的発現により内因性免疫グロブリン生成の抑制が達成され、そしてしたがって細胞死により枯渇する。対応して、導入遺伝子の発現によりリコンビナーゼ媒介機構を介して自殺遺伝子は外因性Ｂ細胞のゲノムから切除される。したがって外因性Ｂ細胞は生存し、そしてヒト（化）免疫グロブリンをコードする導入遺伝子を産生的に生成する。以前に記載した、および当分野において公知の様々な自殺遺伝子は本発明の実施態様である。この実施態様の１つの態様では、導入遺伝子を介して自殺遺伝子をトランスジェニック動物のゲノムに導入し、そしてその発現を免疫細胞特異的プロモーターにより、好ましくはＢ細胞特異的プロモーターにより駆動してＢ細胞において自殺遺伝子を選択的に発現させ、したがって非Ｂ細胞集団の不必要な細胞死を防御する。本明細書にて記載した、または当分野において周知の種々の免疫細胞およびＢ細胞特異的プロモーターを用いてＢ細胞において自殺遺伝子を選択的に発現させることができる。別の実施態様では、本発明で用いるトランスジェニック動物は遺伝子変換動物であるか、または若年期に停止する遺伝子再構成により抗体多様化を被ることができる。さらに前記した方法を用いて作成した遺伝子導入ベクターおよびトランスジェニック動物もまた本発明の実施態様である。
【０１３０】
本発明をさらに説明するが、決して以下の実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１３１】
実施例１
ｌｏｘＰが導入されたＤＴ−Ａ発現ベクターの構築
ＤＴ−Ａ自殺遺伝子のＢ細胞特異的発現を達成するために、ウサギカッパ１をコードするＢＡＣクローン１７９Ｌ１（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ４９５８２７）を修飾する。Ｖ１の下流のスペーサーからＪ遺伝子座を通るカッパ１遺伝子座、イントロンエンハンサー、定常領域をコードするエクソン、３’エンハンサーの下流の配列に対する３’エンハンサーを含むＢＡＣクローンの４６ｋｂフラグメントをＥＴクローニングによりサブクローニングする。さらなるゲンタマイシン選択カセットを有するｐＢＥＬＯＢＡＣベクター骨格をＢＡＣ１７９Ｌ１に相同な５０ｂｐを有するプライマーでＰＣＲ増幅する。加えて順方向プライマーはＡｔｔＢインテグラーゼ認識部位およびＰｖｕＩ制限酵素認識部位を有する。加えて逆方向プライマーはＰｖｕＩ制限酵素認識部位を有する。
【０１３２】
【化１】
【０１３３】
【化２】
ＥＴクローニングのために、ＰＣＲ生成物をＢＡＣ１７９Ｌ１ならびに誘導ラムダファージ組換え酵素Ｒｅｄα、Ｒｅｄβおよびγを含有するストレプトマイシン抵抗性大腸菌株に形質転換する。これらの組換えタンパク質を同時トランスフェクトしたプラスミド（プラスミドｐＳＣ１０１−γβαを有するＤＨ１０Ｂ大腸菌）またはゲノムに組み込まれたラムダプロファージ（ＤＹ３８０大腸菌株）のいずれかから発現させる。ゲンタマイシンを用いて陽性クローン１７９Ｌ１（４６ｋｂ）を選択し、そして制限酵素消化により確認する。
【０１３４】
５’から３’の２つのＳＶ４０ポリＡ部位−ｌｏｘＰ部位−ウサギカッパ１プロモーター−ＤＴ−Ａ−ＦＲＴ部位−ｌｏｘＰ部位−２つのＳＶ４０ポリＡ部位からなるＤＮＡフラグメントを化学的に合成する。ＦＬＰ媒介の組み込みによりカナマイシン選択カセットをＦＲＴ部位に導入する。サブクローニングされた１７９Ｌ１の４６ｋｂフラグメント（４６ｋｂ）に相同な５０ｂｐを有するプライマーで合成フラグメントをＰＣＲ増幅する。ＥＴクローニングによりＪ遺伝子座を合成ＤＴ−Ａフラグメントに対して変化させる。カナマイシンを用いて陽性クローンを選択し、そして制限酵素分析により確認する。
【０１３５】
再度ＦＬＰ媒介組換えによりカナマイシン選択カセットを除去する。カナマイシン抵抗性の喪失により陽性クローンを選択し、そして制限酵素消化およびシークエンシングにより確認する。
【０１３６】
最終構築物はＶ１の下流のスペーサー、合成ＤＴ−Ａフラグメント、イントロンエンハンサー、定常領域をコードするエクソン、３’エンハンサーの下流の配列に対する３’エンハンサーを含む。
【０１３７】
構築物をトランスジェニック動物の作成に用いる。
【０１３８】
実施例２
ＩｇＭの膜形態、２Ａ自己切断ペプチド、Ｃｒｅリコンビナーゼからなる融合タンパク質をコードするヒト（化）重鎖遺伝子座の構築
定常、可変、および連結遺伝子セグメントまたは３’エンハンサー領域に特異的なプローブを用いてゲノムＤＮＡライブラリーからウサギ免疫グロブリン重鎖遺伝子座配列を含有するＢＡＣおよびフォスミドクローンを単離した。単離したＢＡＣ２７Ｎ５（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ３８６６９６）、２１９Ｄ２３（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ３８６６９５）、２２５Ｐ１８（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ３８６６９７）、３８Ａ２（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ３８６６９４）およびフォスミドＦｏｓ１５Ｂ（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ３８６６９６８）をシークエンシングした（Ｒｏｓら、Ｇｅｎｅ ３３０：４９−５９）。
【０１３９】
ＥＴクローニングによる大腸菌における相同組換えにより選択した免疫グロブリンコード化配列を対応するヒト対応物と交換した（Ｅ−Ｃｈｉａｎｇ Ｌｅｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７３：５６−６５；Ｄａｉｇｕａｎ Ｙｕら、ＰＮＡＳ ９７：５９７８−５９８３；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：１５５５−１５５７；Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：１３１４−１３１７）。
【０１４０】
これに代えて、インビトロでライゲーションおよび続く大腸菌の形質転換によりＤＮＡフラグメントを組換えした。インビトロライゲーションおよび形質転換、ＥＴクローニングにより、またはＣｒｅリコンビナーゼ媒介組み込みによりＢＡＣおよび／またはＦｏｓｌ５Ｂまたはその部分を組み合わせた。
【０１４１】
ＥＴクローニングのために標的配列を含有するベクターを、誘導ラムダファージ組換え酵素Ｒｅｄα、Ｒｅｄβおよびγを含有するストレプトマイシン抵抗性大腸菌株に形質転換した。同時トランスフェクトしたプラスミド（プラスミドｐＳＣ１０１−γβαを有するＤＨ１０Ｂ大腸菌）またはゲノムに組み込まれたラムダプロファージ（ＤＹ３８０大腸菌株）のいずれかからこれらの組換えタンパク質を発現させた。ＥＴクローニング手順は２つの相同組換え工程を包含した。
【０１４２】
第１の工程では、標的遺伝子座を選択−対抗選択カセット（例えばネオマイシンに対する抵抗性（ｎｅｏ）およびストレプトマイシンに対する感受性（ｒｐｓＬ）を付与するｎｅｏ−ｒｐｓＬ）により置き換えた。ｎｅｏ−抵抗性コロニーを単離した後、相同組換えによる選択カセットの挿入を制限酵素分析および部分的シークエンシングにより確認した。
【０１４３】
第２の工程では、ｒｐｓＬ−ｎｅｏ選択カセットを新しい配列と交換した。制限分析およびシークエンシングによりストレプトマイシン抵抗性クローンを分析した。ＥＴクローニング手順に用いたフラグメントは２０から５０ｂｐ長のフランキング配列を有し、それは標的配列と同一であった。ライゲーションに用いた配列はその３’および５’末端で適切な制限酵素部位を有した。これらの部位は天然発生部位であるか、または適切な部位を含有するプライマーを用いるＰＣＲにより導入されたかのいずれかであった。
【０１４４】
これに代えて配列を合成により作成した。
【０１４５】
ＥＴクローニングによりウサギＪＨ、ＢＡＣ２１９Ｄ２３のＣμおよびＢＡＣ２７Ｎ５のＣγの対応するそのヒト対応物との置き換えによりヒト化重鎖を構築した。ＥＴクローニング手順に用いたヒト配列をヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。
【０１４６】
ヒトＣμ、ＣγおよびＪＨ遺伝子セグメントをウサギ標的配列に相同な５０ｂｐを有するプライマーを用いて増幅した。
【０１４７】
【化３】
ＢＡＣクローン２２５Ｐ１８のクローン２１９Ｄ２３との、およびＢＡＣ２７Ｎ５のフォスミド１５Ｂとのライゲーションの後、ライゲートした構築物を大腸菌に形質転換し、そしてＣｒｅリコンビナーゼ媒介挿入によりつないだ。これにより１８ウサギ可変遺伝子、ウサギＤ領域、ヒトＪ領域、ヒトＣμ、ヒトＣγ、ウサギＣε、ウサギＣα４および３’エンハンサーエレメントからなる機能的遺伝子座に至った。
【０１４８】
自己切断Ｆ２Ａペプチドの配列およびＣＲＥリコンビナーゼのコドン最適化コード化配列（ｉＣＲＥ）を含むＤＮＡフラグメントを化学的に合成する。
【０１４９】
【化４】
ＥＴクローニングによりＩｇＭのＭ２膜エクソンを合成Ｍ２−Ｆ２Ａ−ｉＣＲＥフラグメントに対して変化させる。
【０１５０】
ＥＴクローニング手順は２つの相同組換え工程を包含した。第１の工程では、標的遺伝子座を選択−対抗選択カセット（例えばネオマイシンに対する抵抗性（ｎｅｏ）およびストレプトマイシンに対する感受性（ｒｐｓＬ）を付与するｎｅｏ−ｒｐｓＬ）により置き換える。このためにｒｐｓＬ−ｎｅｏ選択カセットを標的配列に相同な５０ｂｐを有するプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。ｎｅｏ−抵抗性コロニーを単離した後、相同組換えによる選択カセットの挿入を制限酵素分析および部分的シークエンシングにより確認する。
【０１５１】
第２の工程では、ｒｐｓＬ−ｎｅｏ選択カセットを合成Ｍ２−Ｆ２Ａ−ｉＣＲＥフラグメントと交換する。ストレプトマイシン抵抗性により陽性クローンを同定し、そして制限分析およびシークエンシングにより分析する。
【０１５２】
得られたＢＡＣをトランスジェニック動物作成に使用する。
【０１５３】
実施例３
ヒト化軽鎖遺伝子座の構築
ウサギゲノムＢＡＣライブラリーのスクリーニングによりウサギ軽鎖Ｋ１遺伝子セグメント（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ４９５８２７、ＡＹ４９５８２６）を含有する２つのＢＡＣ（１７９Ｌ１および２１５Ｍ２２）の同定に至った。
【０１５４】
前記したようにＥＴクローニングによりウサギＣκ１をヒトＣκアロタイプＫｍ３と交換した。
【０１５５】
ヒトＣκ（アロタイプＫｍ３）を標的配列に相同な５０ｂｐフランキング配列を有するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
【０１５６】
【化５】
ホモロジーアームはウサギ生殖細胞系カッパ（ｂ５；ジェンバンク受け入れ番号Ｋ０１３６３）の公開されている配列に基づいて設計され、そしてＣκのイントロン−エクソン境界に適合した。
【０１５７】
ＢＡＣ１７９Ｌ１におけるヒトＣκに対するウサギＣκの交換をシークエンシングにより確認した。
【０１５８】
ＢＡＣ１７９Ｌ１−ｈｕＣｋを２つのＥＴクローニングにより修飾した。ＢＡＣ１７９Ｌ１に相同な５０ｂｐを有するプライマーを用いてネオマイシン選択カセットを増幅した。加えて順方向プライマーはｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ部位を有した。ＰＣＲ生成物をＥＴクローニングに使用した。ネオマイシンで陽性クローンを選択し、そして制限酵素消化およびシークエンシングにより正確性を確かめた。ＢＡＣ１７９Ｌ１に相同な５０ｂｐ配列を含有するプライマーを用いてゼオシン選択カセットを増幅した。加えて順方向プライマーはｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ部位を有した。ＰＣＲ生成物をＥＴクローニングに使用した。ゼオシンで陽性クローンを選択し、そして制限酵素消化およびシークエンシングにより正確性を確かめた。
【０１５９】
ＢＡＣ２１５Ｍ２２をＥＴクローニングにより修飾した。ＢＡＣ２１５Ｍ２２に相同な５０ｂｐを有するプライマーを用いてゲンタマイシン抵抗性遺伝子を増幅した。加えて順方向プライマーはｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ部位を有し、そして逆方向プライマーはｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ部位を有した。ＰＣＲ生成物をＥＴクローニングに使用した。得られたクローンをゲンタマイシンで選択し、そして制限酵素消化およびシークエンシングにより正確性を確かめた。
【０１６０】
【化６】
【０１６１】
【化７】
修飾されたＢＡＣ１７９Ｌ１および２２５Ｍ２２をｉ−ＣｅｕＩおよびｉ−ＳｃｅＩで切断した。９８ｋｂおよび１３２ｋｂのフラグメントを精製し、そしてライゲートした。得られたクローンをカナマイシンおよびクロラムフェニコールで選択し、そして制限酵素消化、ｉ−ＳｃｅＩおよびｉ−ＣｅｕＩ制限部位を含有する領域のＰＣＲ、ならびにシークエンシングにより正確性を確かめた。得られたＢＡＣを１７９−２１５−ｈｕＣｋと称した。
【０１６２】
ＥＴクローニングによりＢＡＣ１７９−２１５−ｈｕＣｋのウサギＪｋ１およびＪｋ２を合成ヒト再構成カッパ１ＶＪ遺伝子により置き換えた。ウサギプロモーター、ウサギリーダー、ウサギイントロンおよびヒトＶＪ遺伝子を有するＤＮＡフラグメントを化学的に合成した。合成ヒトＶＪのコドン使用を最適化してウサギＶカッパ遺伝子に対して最高のＤＮＡ配列相同性を達成した。
【０１６３】
ＢＡＣ１７９Ｌ１に相同な５０ｂｐを有する順方向プライマーならびにゲンタマイシン抵抗性遺伝子およびＦＲＴ部位に相同な逆方向プライマーを用いて合成ヒトＶＪをＰＣＲ増幅した。ＦＲＴ部位を有する順方向プライマーならびにＢＡＣ１７９Ｌ１およびＦＲＴ部位に相同な５０ｂｐを有する逆方向プライマーを用いてゲンタマイシン抵抗性遺伝子を増幅した。合成ヒトＶＪ遺伝子のための順方向プライマーおよびゲンタマイシン抵抗性遺伝子のための逆方向プライマーを用いてオーバーラップ伸長ＰＣＲによりヒト合成ヒトＶＪおよびゲンタマイシン抵抗性遺伝子を組み合わせた。得られたフラグメントをＥＴクローニングに使用した。陽性クローンをゲンタマイシンで選択し、そして制限酵素消化およびシークエンシングにより正確性を確かめた。
【０１６４】
【化８】
部位特異的組換えによりＦｌｐリコンビナーゼの発現を介してゲンタマイシン抵抗性遺伝子を除去した。組換えの後、１つのＦＲＴが残った。ＥＴクローニングによりＦＲＴ部位を削除した。合成ヒトＶＪからの２３２ｂｐフラグメントをＰＣＲにより増幅し、そしてＥＴクローニングに使用した。得られたコロニーをＦＲＴ部位の喪失に関してＰＣＲによりスクリーニングし、そしてシークエンシングにより確認した。
【０１６５】
ＥＴクローニングによりＢＡＣ１７９−２１５−ｈｕＣｋのネオマイシン抵抗性遺伝子を置き換えた。ＢＡＣ１７９−２１５−ｈｕＣｋに相同な５０ｂｐを有するプライマーを用いてゲンタマイシン抵抗性（ｐＲｅｐ−Ｇｅｎｔａ；Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ）遺伝子をＰＣＲにより増幅した。加えて順方向プライマーはｌｏｘＰ部位、ａｔｔＢ部位およびＰｖｕＩ制限部位を有した。得られたクローンをゲンタマイシンで選択し、そして制限酵素消化およびシークエンシングにより正確性を確かめた。
【０１６６】
得られたＢＡＣをトランスジェニック動物の作成に使用した。
【０１６７】
【化９】
実施例４
ヒト化重鎖免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウスおよびウサギの作成
カッパ軽鎖プロモーター／エンハンサー配列の制御下でヒト化重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座およびｌｏｘＰが導入されたジフテリア毒素Ａ遺伝子を含有するトランスジェニックウサギおよびマウスを、受精卵母細胞の前核へのＤＮＡの注射および、続く里親への胚の移入により作成する。トランスジェニック創始動物をＰＣＲにより同定する。ヒト（化）免疫グロブリンＭおよびＧの発現をＥＬＩＳＡにより測定する。ヒト化ＩｇＧの発現は１〜５ｍｇ／ｍｌである。マウスおよびウサギＩｇＧの発現は各々１〜５μｇ／ｍｌである。
【０１６８】
実施例５
ヒト化重鎖免疫グロブリンを発現するトランスジェニックニワトリの作成
精巣媒介の遺伝子移入によりトランスジェニックニワトリを作成する。ＤＮＡ構築物を
（５０μｇ）を０．９％ＮａＣｌ ５００μｌ中リポフェクション試薬（スーパーフェクト）２５０μｌと混合し、そしてオンドリの精巣に注射する。３〜４週後、トランスジェニック精子を有するオンドリをＰＣＲ分析により同定し、そしてメンドリと交配させる。トランスジェニック子孫をＰＣＲにより同定する。ヒト化ＩｇＧの発現は１〜５ｍｇ／ｍｌである。ニワトリＩｇＹの発現は各々１〜５μｇ／ｍｌである。
【０１６９】
本開示全体にわたって引用した全ての参照文献はそこに引用された参照文献と一緒に出典明示により本明細書の一部とする。
【０１７０】
本発明を特定の実施態様を参照することにより説明したが、そのように限定されるものではない。種々の修飾を容易に利用でき、そして本発明が取り組む方式を実質的に変化させることなく実施できることは当業者には理解されよう。かかる修飾の全てが、具体的には本明細書にて特許請求される本発明の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】外因性免疫グロブリン（Ｉｇ）発現Ｂ細胞および内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）発現Ｂ細胞で生じる事象の説明図である。２つの導入遺伝子（Ｉｇ重鎖遺伝子座およびＤＴＡ）を有する細胞では、遺伝子導入免疫グロブリン重鎖遺伝子座の産生性再構成の結果、重鎖（ＨＣ）およびＣｒｅリコンビナーゼの発現に至る。続いて、Ｃｒｅ媒介の組換えの結果、ＤＴＡ発現カセットのループアウトに至る。したがって、ＤＴＡは発現されず、そして遺伝子導入免疫グロブリンＨＣ遺伝子座を発現するかかる外因性Ｂ細胞は生存する。内因性ＨＣ遺伝子座の産生性再構成の結果、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現には至らない。したがって、ＤＴＡ発現カセットは活性化され、そしてかかる内因性Ｂ細胞は死亡する。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞では自殺遺伝子を選択的に発現するが、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖のような外因性免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖を発現するＢ細胞では発現しないことにより、ヒト以外のトランスジェニック動物における内因性免疫グロブリン発現を抑制する方法に関する。この方法により例えばヒト以外のトランスジェニック動物の血液、乳および卵中のヒトまたはヒト化抗体の優勢な発現が可能になる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトマウスキメラ抗体を発現するマウスの作製は非特許文献１に記載されている。ヒト免疫グロブリンポリペプチドを発現するマウスの作製は非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４により記載されており、ならびにＢＡＣクローンを用いるトランスジェニックマウスの作製は非特許文献５に記載されている。ヒト抗体を発現するウシの作製は非特許文献６に記載されている。
【０００３】
動物における遺伝子導入は非特許文献７に記載されている。トランスジェニックウサギの作製は非特許文献８；および非特許文献９に記載されている。トランスジェニックニワトリの作製は非特許文献１０；および非特許文献１１；および非特許文献１２に記載されている。
【０００４】
免疫グロブリン発現の損傷を有するウサギは非特許文献１３；ならびに非特許文献１４に記載されている。ガンマグロブリン血症のニワトリは非特許文献１５；および非特許文献１６に記載されている。
【０００５】
細胞からの動物のクローニングは非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；および非特許文献２１に記載されている。ウサギの核移植クローニングは非特許文献２２、非特許文献２３に記載されている。
【０００６】
ヒト（化）免疫グロブリン導入遺伝子座を発現するヒト以外のトランスジェニック動物の生成およびかかるトランスジェニック動物からの抗体の生成は特許文献１、特許文献２ならびに特許文献３、特許文献４；および特許文献５に詳細に記載されている。キメラ哺乳動物宿主の相同組換えは特許文献６に例示されている。ＤＮＡを胚に導入するための方法は特許文献７に記載されている。胚性幹細胞の維持および増殖は特許文献８に記載されている。
【０００７】
毒素基盤の研究法を用いる自殺遺伝子は非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３に記載されている。無毒性プロドラッグ酵素研究法を用いる自殺遺伝子は非特許文献３４に記載されている。
【０００８】
２Ａペプチド配列を含有するウイルス性タンパク質の切断活性は非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７、非特許文献３８、非特許文献３９に記載されている。
【０００９】
リコンビナーゼおよびその特性は非特許文献４０に記載されている。２つの核酸の非常に特異的な配列間の相同組換えを認識および触媒する部位特異的リコンビナーゼが公知である。例えば部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属するφＣ３１およびＲ４が公知である（非特許文献４１；非特許文献４２）。ヒトおよびマウスゲノムを含むいくつかのゲノムでは偽ａｔｔＰ部位が天然にある（非特許文献４３）。８．９ｋｂの大型のＶＩＩコラーゲンｃＤＮＡの一次前駆患者皮膚細胞へのインビトロでのφＣ３１インテグラーゼ媒介遺伝子移入は非特許文献４４に報告されている。トランスジェニック哺乳動物の操作におけるφＣ３１、ＴＰ９０１−１およびＲ４ファージインテグラーゼの使用は非特許文献４５で実証されている。
【００１０】
Ｂ細胞を含む細胞のアブレーションは非特許文献４６、非特許文献４７および非特許文献４８に記載されている。
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９２／０３９１８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／１２４３７号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５５４５８０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５８１４３１８号明細書
【特許文献５】米国特許第５５７０４２９号明細書
【特許文献６】米国特許第５４１６２６０号明細書
【特許文献７】米国特許第５５６７６０７号明細書
【特許文献８】米国特許第５４５３３５７号明細書
【非特許文献１】Ｐｌｕｓｃｈｋｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９８年、２１５：２７−３７
【非特許文献２】Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ １９８９年、３３８：３５０−２
【非特許文献３】Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５年、１３（１）：６５−９３
【非特許文献４】Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７年、８（４）：４５５−８
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【非特許文献６】Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００２年、２０（９）：８８９−８９４
【非特許文献７】Ｗａｌｌ ＲＪ、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２００２年、５７（１）：１８９−２０１
【非特許文献８】Ｆａｎ，Ｊ．ら、Ｐａｔｈｏｌ Ｉｎｔ．１９９９年、４９：５８３−９４
【非特許文献９】Ｂｒｅｍら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．１９９６年、４４：５６−６２
【非特許文献１０】Ｅｔｃｈｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９７年、６２：４３３−４５０
【非特許文献１１】Ｐａｉｎら、Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ １９９９年、１６５（３−４）：２１２−９
【非特許文献１２】Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １９９８年、１６：１０５０−１０５３
【非特許文献１３】Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３年、１５０：２７８３−２７９３
【非特許文献１４】Ｌａｍｏｙｉ ＥおよびＭａｇｅ ＲＧ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８５年、１６２：１１４９−１１６０
【非特許文献１５】Ｆｒｏｍｍｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７０年、１０５（ｌ）：１−６
【非特許文献１６】Ｂｅｎｅｄｉｃｔら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１９７７年、８８（２）：１９７−２０５
【非特許文献１７】Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ １９９８年、３９４：３６９−３７４
【非特許文献１８】Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８年、２８０：１２５６−１２５８
【非特許文献１９】Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８年、１６：６４２−６４６
【非特許文献２０】Ａ．Ｅ．Ｓｃｈｎｉｅｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７年、２７８：２１３０−２１３３
【非特許文献２１】Ｋ．Ｈ．Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ １９９６年、３８０：６４−６６
【非特許文献２２】Ｓｔｉｃｅら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １９８８年、３９：６５７−６６４
【非特許文献２３】Ｃｈａｌｌａｈ−Ｊａｃｑｕｅｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００３年、８（４）：２９５−２９９
【非特許文献２４】Ｌｅｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８３年、２２０：５１５−７
【非特許文献２５】Ｍａｘｗｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８６年、４６：４６６０−４６６４
【非特許文献２６】Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｃｅｌｌ １９８７年、５０：４３５−４４３
【非特許文献２７】Ｍａｘｗｅｌｌら、Ｃｅｌｌ １９９１年、５１：４２９９−４３０４
【非特許文献２８】Ｍａｘｗｅｌｌら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９９２年、７：４５７−４６２
【非特許文献２９】Ａｇｕｉｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９５年、９２：１０１９２−１０１９６
【非特許文献３０】Ｇｒｉｅｓｈａｍｍｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９８年、１９７：２３４−２４７
【非特許文献３１】Ｂａｒｔｅｌｌら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２０００年、６３：４０９−４１６
【非特許文献３２】Ｅｒｌａｎｄｓｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００１年、１９４：５５７−５７０
【非特許文献３３】Ｌｅｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００２年、１３：５３３−５４２
【非特許文献３４】Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、２００４年
【非特許文献３５】Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９２年、１９０：７５４−７６２
【非特許文献３６】Ｒｙａｎら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７２：２７２７−２７３２（１９９１）
【非特許文献３７】Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２００１年、８２：１０２７−１０４１
【非特許文献３８】Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２００１年、８２：１０１３−１０２５
【非特許文献３９】Ｓｚｙｍａｃｚａｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００４年、２２（５）：５８９−５９４
【非特許文献４０】Ｋｏｌｂ Ａ．Ｆ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００２年、４１：６５−８０
【非特許文献４１】Ｇｒｏｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００年、９７：５９９５−６０００
【非特許文献４２】Ｏｌｉｖａｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２年、２０（１１）：１１２４−８
【非特許文献４３】Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００１年、２１：３９２６−３９３４
【非特許文献４４】Ｏｒｔｉｚ−Ｕｒｄａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８：１１６６−１１７０（２００２）
【非特許文献４５】Ｈｏｌｌｉｓら、Ｒｅｐｒｏ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００３年、１：７９
【非特許文献４６】Ｅｒｌａｎｄｓｓｏｎら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９４（５）：５５７−５７０（２００１）
【非特許文献４７】Ｍａｘｗｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９１年、５１：４２９９−４３０４
【非特許文献４８】Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｃｅｌｌ １９８７年、５０：４３５−４４３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
本発明はトランスジェニック動物における内因性免疫グロブリン生成を抑制するための方法に関する。方法は内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞において自殺遺伝子を選択的に発現するが、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンを発現するＢ細胞では自殺遺伝子を発現しないことを伴う。とりわけ本発明は１つまたはいくつかのヒトまたはヒト（化）免疫グロブリン導入遺伝子座を含有するヒト以外のトランスジェニック動物において内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現を抑制するための方法に関係する。結果的にヒト（化）導入遺伝子座はヒト以外のトランスジェニック動物において遺伝子再構成および変異過程を被り、実質的に内因性免疫グロブリン生成の不在下で多様化されたヒト（化）抗体レパートリーを生成することができる。
【００１３】
とりわけ本発明はヒト以外のトランスジェニック動物の内因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞では少なくとも１つの自殺遺伝子を選択的に発現するが、外因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞では発現しないことを含み、それにより内因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞は枯渇し、そして内因性免疫グロブリンの生成は抑制されるが、外因性免疫グロブリンの生成は抑制されない、外因性免疫グロブリン導入遺伝子座を担持するヒト以外のトランスジェニック動物のＢ細胞における内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）生成の選択的抑制のための方法に関係する。好ましい実施態様では、外因性免疫グロブリンはヒト化免疫グロブリン重および／または軽鎖配列である。
【００１４】
さらなる態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物のＢ細胞に導入された自殺遺伝子はＢ細胞特異的プロモーターの制御下にあり、そしてリコンビナーゼ配列によりフランキングされている。
【００１５】
なお別のさらなる態様では、さらに該組換え配列を認識するリコンビナーゼをコードする発現構築物の一部としてヒト以外のトランスジェニック動物のＢ細胞にヒト（化）免疫グロブリン鎖導入遺伝子座を導入し、ここで自殺遺伝子の発現はヒト化免疫グロブリン導入遺伝子座を発現するＢ細胞におけるリコンビナーゼの発現により活性化される。
【００１６】
特定の態様では、自殺遺伝子は細菌性、真菌性、昆虫性および植物毒素からなる群から選択される。好ましい実施態様では、自殺遺伝子はジフテリア毒素Ａ鎖である。
【００１７】
別の実施態様では、自殺遺伝子はプロドラッグ変換酵素である。この実施態様の１つの態様では、プロドラッグ変換酵素は非哺乳動物起源である。さらなる態様では非哺乳動物プロドラッグ変換酵素はウイルス性チミジンキナーゼ（ＴＫ）、細菌性サイトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、細菌性カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、ニトロリダクターゼ（ＮＲ）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ペニシリン−Ｇアミダーゼ（ＰＧＡ）、β−ラクタマーゼ、多剤活性化酵素（ＭＤＡＥ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、西洋ワサビベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびデオキシリボヌクレオチドキナーゼ（ＤＲＮＫ）からなる群から選択される。
【００１８】
さらに別の実施態様では、プロドラッグ変換酵素はヒト起源である。さらなる態様では、ヒトプロドラッグ変換酵素はデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）、β−グルクロニダーゼ（−Ｇｌｕ）およびチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）からなる群から選択される。
【００１９】
別の態様では、リコンビナーゼＣｒｅ、Ｃｒｅ様、Ｆ１ｐ、φＣ３１、λインテグラーゼ、ファージＲ４リコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１リコンビナーゼ、原核細胞性トランスポーゼス、真核細胞性トランスポーゼス、ウイルス性レトロトランスポーゼス、ショウジョウバエコピア様レトロトランスポーゼスおよび非ウイルス性レトロトランスポーゼスからなる群から選択される。さらなる実施態様では、トランスポーゼスまたはレトロトランスポーゼスはＴｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎｌ０００、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ショウジョウバエマリナー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス、ショウジョウバエＰエレメント、トウモロコシＡｃ、Ｄｓ、Ｍｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、ドット、Ｍｕ、Ｉ、Ｌ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）およびミノスからなる群から選択される。
【００２０】
１つの実施態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物は若年期に遺伝子再構成により抗体多様化を実質的に停止する。さらなる実施態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物は生まれて１か月以内に抗体多様化を実質的に停止する。
【００２１】
別の実施態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物はげっ歯類、ウサギ、鳥類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウマからなる群から選択される。好ましい実施態様では、げっ歯類はマウスまたはラットである。
【００２２】
特定の態様では、本発明は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重および／または軽鎖導入遺伝子座、自己切断ペプチドおよびリコンビナーゼをさらに含む第１の導入遺伝子を含む遺伝子導入発現構築物に関係する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、Ｂ細胞特異的プロモーターの制御下にあり、そしてリコンビナーゼにより認識される組換え部位によりフランキングされた自殺遺伝子をさらに含む第２の導入遺伝子を含む遺伝子導入発現構築物に関係する。
【００２４】
１つの実施態様では、本発明はヒトまたはヒト化免疫グロブリン重および／または軽鎖遺伝子座、自己切断ペプチドおよびリコンビナーゼをさらに含む第１の導入遺伝子、ならびにＢ細胞特異的プロモーターの制御下にあり、そしてリコンビナーゼにより認識される組換え部位によりフランキングされた自殺遺伝子をさらに含む第２の導入遺伝子を含む遺伝子導入発現構築物に関係する。
【００２５】
１つの実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物はＣｒｅ、Ｃｒｅ様、Ｆｌｐ、φＣ３１、λインテグラーゼ、ファージＲ４およびＴＰ９０１−１リコンビナーゼからなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼを含む。
【００２６】
別の実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物は原核細胞性または真核細胞性のいずれかのトランスポーゼスであるリコンビナーゼを含む。
【００２７】
さらに別の実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物はウイルス性、ショウジョウバエコピア様または非ウイルス性レトロトランスポーゼスのいずれかであるリコンビナーゼを含む。
【００２８】
さらなる実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物はＴｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎｌ０００、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ショウジョウバエマリナー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス、ショウジョウバエＰエレメント、トウモロコシＡｃ、Ｄｓ、Ｍｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、ドット、Ｍｕ、Ｉ、Ｌ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）およびミノスからなる群から選択されるリコンビナーゼを含む。
【００２９】
特定の実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物はｌｏｘ Ｐ部位、ＦＲＴ部位、細菌性ゲノム組換え部位およびファージ組換え部位からなる群から選択される組換え部位を含む。
【００３０】
さらなる実施態様では、細菌性ゲノム組換え部位はａｔｔＢであり、そしてファージ組換え部位はａｔｔＰまたは偽ａｔｔＰまたは偽ａｔｔＢ部位である。
【００３１】
特定の実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物はウイルス性２Ａ／２Ｂまたは２Ａ様／２Ｂ配列から得られる自己切断ペプチドを含む。
【００３２】
さらなる実施態様では、ウイルスはピコルナウイルス科ウイルスファミリー、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウイルスファミリー、ピコルナウイルス様昆虫ウイルスファミリーからなる群、またはＣ型ロタウイルスファミリーから選択される。さらに別の実施態様では、ウイルスは口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウイルスまたはゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）からなる群から選択される。
【００３３】
特定の実施態様では、前記した遺伝子導入発現構築物はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ、ｍｂ−１、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶｐｒｅＢ、免疫グロブリンカッパ軽鎖、免疫グロブリンラムダ軽鎖および免疫グロブリンＪ−鎖またはその修飾体からなる群から選択されるプロモーター／エンハンサーを用いてＢ細胞において特異的に発現される自殺遺伝子を含む。好ましい実施態様では、Ｂ細胞特異的プロモーター／エンハンサーはカッパ軽鎖遺伝子プロモーターまたはその修飾体である。
【００３４】
１つの態様では本発明は、内因性免疫グロブリン生成が内因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞における自殺遺伝子の選択的発現により抑制されるが、ヒト（化）免疫グロブリンを発現するＢ細胞は自殺遺伝子を発現せず、そしてしたがって増殖するヒト以外の動物を生成する方法に関係する。
【００３５】
とりわけ本発明は前記した遺伝子導入発現構築物を発現するヒト以外のトランスジェニック動物に関係する。
【００３６】
１つの実施態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物は実質的に遺伝子変換により抗体多様性を生じる。
【００３７】
全ての態様において、好ましいヒト以外の動物には、限定するものではないがげっ歯類（例えばマウス、ラット）、ウサギ、鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ロバおよびその他の家畜が含まれる。好ましい実施態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物はマウスまたはラットのいずれかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
定義
特記しない場合、本明細書で用いる技術的および科学的用語は本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（ニューヨーク、ニューヨーク州、１９９４年）およびＭａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（ニューヨーク、ニューヨーク州、１９９２年）は本出願で用いる多くの用語に対する一般的な手引きを当業者に提供する。
【００３９】
当業者は本明細書に記載したものに類似するかまたは均等である多くの方法および材料を認識し、それを本発明の実施にあたり用いることができる。実際に本発明は記載した方法および材料に何ら限定されるものではない。本発明の目的のために以下の用語を後記で定義する。
【００４０】
「Ｂ細胞」は免疫グロブリン遺伝子セグメントの再構成を被り、そしてそのライフサイクルのいくつかの段階で免疫グロブリン遺伝子を発現することができるＢ系統細胞として定義される。これらの細胞には、限定するものではないが初期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未成熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、形質細胞等が含まれる。
【００４１】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は同一の構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特異的抗原に対して結合特異性を呈するが、免疫グロブリンは抗体および抗原特異性を欠如するその他の抗体様分子の双方を含む。「抗体」なる用語は本明細書では最も広義で用いられ、そして具体的には、限定するものではないがモノクローナル抗体（モノクローナル抗体全長を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）およびそれが望ましい特異性を呈する限り抗体フラグメントに及ぶ。
【００４２】
本明細書で用いる「Ｉｇ遺伝子セグメント」なる用語はＩｇ分子の種々の部分をコードするＤＮＡのセグメントを意味し、それは動物およびヒトの生殖細胞系列に存在し、そしてＢ細胞で一緒になって再構成されたＩｇ遺伝子を形成する。したがって、本明細書で用いるＩｇ遺伝子セグメントはＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメントおよびＣ領域遺伝子セグメントを含む。ＶＤＪまたはＶＪセグメントの機能的再構成の結果、免疫グロブリン重または軽鎖の発現に至る。
【００４３】
本明細書で用いる「ヒトＩｇ遺伝子導入遺伝子座または遺伝子座またはセグメント」なる用語はヒトＩｇ遺伝子座またはそのセグメントの天然発生配列、ヒトＩｇ遺伝子座またはそのセグメントの天然発生配列の変性形態、およびヒトＩｇ遺伝子座またはそのセグメントの天然発生配列によりコードされるポリペプチドに実質的に同一のポリペプチド配列をコードする合成配列の双方を含む。この局面で、「実質的に」とはアミノ酸配列同一性の程度が少なくとも約８５％〜９５％、または少なくとも約９０％〜９５％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％であることを意味する。特定の好ましい実施態様では、ヒトＩｇ遺伝子セグメントはヒトにおいて免疫グロブリン分子に非免疫原性にする。ここでは「ヒトまたはヒト化免疫グロブリン（Ｉｇ）重および／または軽鎖遺伝子座」または「ヒトまたはヒト化Ｉｇ遺伝子座」なる用語は互換的に用いられる。
【００４４】
「ヒト抗体」および「ヒト免疫グロブリン」なる用語は完全なヒト配列を含む抗体および免疫グロブリン分子を意味するために用いられる。
【００４５】
本明細書で用いる「ヒト化抗体」および「ヒト化免疫グロブリン」なる用語はヒト免疫グロブリンポリペプチド配列（またはヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列）の少なくとも一部を含む免疫グロブリン分子を意味する。本発明のヒト化免疫グロブリン分子を、ヒト化免疫グロブリン分子を生成するように操作されたヒト以外のトランスジェニック動物から単離することができる。かかるヒト化免疫グロブリン分子は、動物から調製された、または動物に由来する細胞から調製された非ヒト化免疫グロブリン分子に相対して、霊長類、特にヒトに対して免疫原性が低い。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体は遺伝子変換および遺伝子変換動物における体細胞超変異によりさらに多様化された免疫グロブリン（Ｉｇ）および抗体を含む。かかるヒト化Ｉｇまたは抗体はヒトにより天然に作成されたものではないので（ヒトは遺伝子変換によりその抗体レパートリーを多様化しないので）、それらは「ヒト」ではなく、そしてしかもヒト化Ｉｇまたは抗体はその構造でヒトＩｇ配列を有するので、それらはヒトに対して免疫原性ではない。
【００４６】
「導入遺伝子または導入遺伝子構築物」は、天然または動物または動物の細胞において通常見出されない合成タンパク質をコードする配列を有するＤＮＡフラグメントである。本明細書で用いる「導入遺伝子構築物」なる用語は、構造的な「目的の遺伝子」および遺伝子移入を促進するその他の配列を含有するポリヌクレオチド分子を意味する。本発明は２つの導入遺伝子構築物：（１）ヒトＩｇ遺伝子座−自己切断ペプチド−リコンビナーゼおよび（２）免疫細胞特異的自殺導入遺伝子構築物に言及する。
【００４７】
「遺伝子導入発現構築物」は、ヒト以外のトランスジェニック動物の特異的な細胞内で一時的または細胞特異的または目的の導入遺伝子の発現強化のいずれかのために必要なその他の調節ＤＮＡ配列と一緒に、本発明の１つまたはいくつかの導入遺伝子構築物をコードする配列を伴うＤＮＡフラグメントを意味する。
【００４８】
「ヒト（化）Ｉｇ遺伝子座−自己切断ペプチド−リコンビナーゼ導入遺伝子または導入遺伝子構築物」は、単一のｍＲＮＡに転写される導入遺伝子構築物を意味し、それは後記で論じる自己切断メカニズムのために２つのポリペプチド、主にヒト（化）免疫グロブリン鎖およびリコンビナーゼに翻訳される。
【００４９】
本明細書で用いる「自己切断ペプチド」なる用語は、ペプチド配列自体の中の２つのアミノ酸残基の間に生じる切断活性を随伴するペプチド配列を意味する。例えば２Ａ／２Ｂペプチドまたは２Ａ／２Ｂ様ペプチドでは、切断は２Ａペプチド上のグリシン残基と２Ｂペプチド上のプロリン残基との間で生じる。これは２Ａ／２Ｂペプチドの２Ａグリシン残基と２Ｂプロリン残基との間の正常なペプチド形成が損なわれている翻訳の間の「リボソームスキップ機構」によって生じ、２Ｂペプチドの残りの翻訳には影響することはない。かかるリボソームスキップ機構は当分野において周知であり、そして単一のメッセンジャーＲＮＡによりコードされるいくつかのタンパク質の発現のためのいくつかのウイルスにより用いられることが解っている。
【００５０】
本明細書で用いる「リコンビナーゼ」なる用語は、「組換え部位」と称される定義された部位間の部位特異的組換えを促進することができる酵素の群を意味し、ここで２つの組換え部位は単一の核酸分子内で物理的に分かれているか、または別個の核酸分子上にある。２つの定義された組換え部位の配列は同一である必要はない。リコンビナーゼの群の中には「インテグラーゼ」（例えばＣｒｅ、Ｃｒｅ様、ＦＬＰおよびλインテグラーゼのような部位特異的リコンビナーゼ）および「リゾルベース／インベルターゼ」（例えばφＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼおよびＴＰ−９０１インテグラーゼ）を含むいくつかのサブファミリーがある。「リコンビナーゼ」なる用語にはまた、限定するものではないが原核細胞性または真核細胞性トランスポーゼス、ウイルス性またはショウジョウバエコピア様または哺乳動物レトロトランスポーゼスを含む非ウイルス性レトロトランスポーゼスも含まれる。原核細胞性トランスポーゼスの実例には、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎｌ０００、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１等の転位可能なエレメントでコードされるトランスポーゼスが含まれる。真核細胞性トランスポーゼスにはショウジョウバエマリナー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス、ショウジョウバエＰエレメント、トウモロコシＡｃおよびＤｓエレメント等の転位可能なエレメントでコードされるトランスポーゼスが含まれる。レトロトランスポーゼスにはＬ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）およびミノス等でコードされるものが含まれる。トランスポーゼスをＭｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、ドット、Ｍｕ、Ｉ転位性エレメントからなる群から選択することもできる。
【００５１】
本明細書で用いる「野生型組換え部位」なる用語は通常インテグラーゼのようなリコンビナーゼにより用いられる組換え部位を意味する。
【００５２】
「偽組換え部位」とは、部位がその野生型組換え部位の配列と同一の配列を有していなくても、リコンビナーゼが組換えを促進することができる部位を意味する。
【００５３】
本明細書で用いる「自殺遺伝子または自殺導入遺伝子」なる用語は、発現が遺伝子を発現する細胞の死亡に至るタンパク質をコードする遺伝子を意味する。例えばタンパク質は毒素（例えばジフテリア毒素Ａ鎖）または無毒性のプロドラッグを毒性生成物に変換する酵素（例えばチミジンキナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、チトクロームＰ４５０アイソザイム、デオキシリボヌクレオチドキナーゼ、ニトロリダクターゼ等）でよい。自殺遺伝子がプロドラッグ変換酵素をコードする場合、それを発現する細胞はプロドラッグに暴露された時点で死亡する。本明細書で用いる「自殺遺伝子生成物」なる用語は「自殺遺伝子」によりコードされるタンパク質を意味する。自殺遺伝子発現は免疫細胞特異的プロモーターにより、好ましくはＢ細胞プロモーターにより駆動される。
【００５４】
「自殺遺伝子発現の不活性化を可能にする配列」なる用語はリコンビナーゼにより認識される自殺遺伝子をフランキングする組換え部位を意味する。
【００５５】
「プロドラッグ」なる用語は代謝によりインビボで毒性生成物、代謝物または薬物に変換可能である化合物を意味する。
【００５６】
「内因性Ｉｇ（免疫グロブリン）発現Ｂ細胞」および「内因性Ｂ細胞」なる用語は互換的に用いられ、そして動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座を発現するこれらのＢ細胞を意味する。本発明のＢ細胞はそのゲノムに自殺遺伝子を含有する。内因性Ｂ細胞は自殺遺伝子を発現し、そしてその結果、最終的に枯渇し、そしてしたがって動物の内因性Ｉｇ発現が抑制される。
【００５７】
「外因性Ｉｇ（免疫グロブリン）発現Ｂ細胞」および「外因性Ｂ細胞」なる用語は、かかるＢ細胞に導入された外因性ヒト（化）Ｉｇ導入遺伝子座の産生性再構成を被るヒト以外の動物のこれらのＢ細胞を意味する。ヒト（化）Ｉｇ遺伝子座は、これもまた部位特異的リコンビナーゼをコードする発現構築物の一部としてかかるＢ細胞に導入される。ヒト（化）Ｉｇ遺伝子座の産生性再構成の結果、ヒト（化）Ｉｇおよび導入遺伝子コード化リコンビナーゼの発現に至る。結果として、Ｂ細胞のゲノムから自殺遺伝子が切除され、そして細胞は細胞死を免れる。したがって好ましくは、トランスジェニック動物により発現されるＩｇ生成物はヒト（化）免疫グロブリンである。
【００５８】
「自殺遺伝子の選択的発現」とは好ましくは免疫細胞内での、さらに好ましくはＢ細胞内での、そして最も好ましくは内因性Ｂ細胞内での自殺遺伝子生成物の発現を意味する。免疫細胞またはＢ細胞内での自殺遺伝子の選択的発現は各々免疫特異的またはＢ細胞特異的プロモーターを用いることにより達成されて自殺遺伝子発現を駆動する。
【００５９】
「選択的不活性化」なる用語は、外因性Ｂ細胞のゲノムからの自殺遺伝子またはその部分の選択的切除を意味する。自殺遺伝子は外因性Ｂ細胞において発現される導入遺伝子コード化リコンビナーゼにより認識される組換え部位によりフランキングされるので、自殺遺伝子は切除されるかまたは不活性化される。
【００６０】
Ｉｇ生成細胞の「枯渇」は、ヒト以外のまたは非ヒト化Ｉｇを発現する内因性Ｂ細胞集団の部分的または完全な死滅、瀕死および／または除去として定義される。さらに後記で説明するように、選択されるトランスジェニック動物が、抗体再構成が若年期に停止するものである場合、内因性Ｂ細胞の枯渇はさらに有効であり得る。
【００６１】
「内因性免疫グロブリン生成の選択的抑制」は、自殺遺伝子を発現する内因性Ｂ細胞の枯渇による、ヒト以外のトランスジェニック動物の内因性免疫グロブリンの生成の選択的抑制を意味する。したがって、トランスジェニック動物により優勢に発現される免疫グロブリン生成物はヒト（化）免疫グロブリンである。
【００６２】
「抗体多様性」および「抗体レパートリー」なる用語は互換的に用いられ、そして生物が発現できる全抗体特異性全体を意味する。
【００６３】
遺伝子再構成および遺伝子変換を行う能力を有するＩｇ遺伝子座はまた本明細書では「機能的」Ｉｇ遺伝子座をも意味し、そして機能的Ｉｇ遺伝子座により作成された多様性を有する抗体はまた本明細書では「機能的」抗体または抗体の「機能的」レパートリーをも意味する。
【００６４】
「モノクローナル抗体」なる用語はＢ細胞の単一のクローンにより合成された抗体分子を意味する。
【００６５】
「ポリクローナル抗体」なる用語はＢ細胞の集団により合成された抗体分子の集団を意味するために用いられる。
【００６６】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」なる用語は互換的に用いられ、そして単数または複数で用いられる場合、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、これは未修飾ＲＮＡもしくＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでよい。したがって、例えば本明細書で定義するようなポリヌクレオチドには、限定するものではないが一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖もしくはさらに典型的には二本鎖でよいか、または一本鎖および二本鎖領域を含んでよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。加えて、本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語はＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む三本鎖領域を意味する。かかる領域の鎖は同一の分子から、または異なる分子からでよい。領域は１つまたはそれより多い分子全てを含んでよいが、さらに典型的にはいくつかの分子のある領域のみを伴う。三本鎖らせん領域の分子の１つはオリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」なる用語は具体的にはｃＤＮＡを含む。その用語は１つまたはそれより多い修飾塩基を含有するＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。したがって、安定性またはその他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンのような通常でない塩基またはトリチウム化塩基のような修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは本明細書で定義する「ポリヌクレオチド」の用語に含まれる。一般に「ポリヌクレオチド」なる用語は未修飾ポリヌクレオチドの全ての化学的、酵素的および／または代謝的修飾形態、ならびにウイルスおよび単純細胞および複雑型細胞を含む細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特性の化学的形態を包含する。
【００６７】
本明細書で用いる「ヒト以外の（トランスジェニック）動物」には、限定するものではないが例えばヒト以外の霊長類、げっ歯類（例えばマウスおよびラット）、例えばウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマおよびロバのような非げっ歯類哺乳動物、ならびに鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等）のような哺乳動物が含まれる。本明細書で用いる「非霊長類動物」なる用語には、限定するものではないが前記で具体的に列挙した哺乳動物を含む霊長類以外の哺乳動物が含まれる。
【００６８】
「一次抗体レパートリーを創成するために実質的に遺伝子変換および／または体細胞超変異により抗体多様性を創成する動物」または「遺伝子変換動物」なる語句および文法的な均等は抗体多様化の主要な機構が、遺伝子再構成と対照的に遺伝子変換および／または超変異であるかかる動物を意味するために用いられる。かかる動物には、限定するものではないがウサギ、鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等）ウシおよびブタが含まれる。特に好ましいヒト以外の動物はウサギおよびニワトリである。
【００６９】
動物による「若年期の抗体遺伝子再構成の停止」とは、典型的には免疫グロブリン遺伝子の再構成が生まれて１か月以内に停止するこれらの動物を意味する。かかる動物の実例には、限定するものではないがウサギ、鳥類（例えばニワトリ）、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタおよびウマである。
【００７０】
詳細な説明
本発明は、例えば動物を（複数の）ヒト（化）免疫グロブリンの発現にさらに適当なものにする目的で、ヒト以外の動物における内因性免疫グロブリン生成を抑制するための方法を提供する。
【００７１】
本発明によれば、内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞における自殺遺伝子の選択的発現により、内因性免疫グロブリン生成は（複数の）ヒト（化）免疫グロブリンのような外因性免疫グロブリン配列を発現するヒト以外のトランスジェニック動物において選択的に抑制される。自殺遺伝子は導入遺伝子として動物のゲノムに組み込まれ、そして例えばヒト（化）Ｉｇ導入遺伝子座をも導入する遺伝子導入発現構築物の一部として、または別個に例えば別個の遺伝子導入発現構築物を用いて導入され得る。後者の場合、２つの発現構築物を同時にまたは異なる時間でトランスジェニック動物に導入することができる。
【００７２】
自殺遺伝子は免疫特異的プロモーター、好ましくはＢ細胞特異的プロモーターを用いて動物のＢ細胞において発現され、そしてリコンビナーゼにより認識される組換え配列によりフランキングされる。したがって、組換え配列によりフランキングされた自殺遺伝子は初期には動物の全てのＢ細胞に存在する。「外因性Ｂ細胞」では、ヒト（化）免疫グロブリン−自己切断ペプチド−リコンビナーゼ分子をコードする外因性免疫グロブリン導入遺伝子座の産生性再構成はかかるＢ細胞におけるリコンビナーゼの選択的発現に至る。リコンビナーゼはかかる細胞において自殺遺伝子をフランキングする組換え部位を認識する。結果的に外因性Ｂ細胞では自殺遺伝子は選択的に切除され、それは結果的に細胞死を免れる。対照的に内因性Ｂ細胞の内因性免疫グロブリン遺伝子座の産生性再構成はリコンビナーゼの発現に至らない。結果的に内因性Ｂ細胞における自殺遺伝子発現はこの細胞集団の死亡に至り、そしてその結果ヒト以外のトランスジェニック動物によるヒト（化）免疫グロブリンの発現を抑制することなく内因性免疫グロブリン生成を抑制する。
【００７３】
導入遺伝子は１つまたはいくつかの天然または、通常動物もしくは動物の細胞において見出されない合成タンパク質をコードする配列を有するＤＮＡフラグメントである。前核のマイクロインジェクション、トランスフェクション、核移植クローニング、精子媒介の遺伝子移入、精巣媒介の遺伝子移入等を含む種々の技術により、（複数の）ＤＮＡフラグメントを動物のゲノムに導入することができる。本発明は２つの導入遺伝子または導入遺伝子構築物（１）ヒトＩｇ遺伝子座−自己切断ペプチド−リコンビナーゼ導入遺伝子および（２）免疫細胞特異的自殺導入遺伝子に言及する。各々の導入遺伝子はその独自の調節配列に作動可能なように連結されている。例えば自殺遺伝子の発現はＢ細胞特異的プロモーターにより駆動され得る。２つの導入遺伝子構築物は２つの別個のベクターまたは同一のベクター（プラスミド）に存在し得る。１つの実施態様では、２つの導入遺伝子構築物を別個の時点で導入することができる。これに代えて、双方の導入遺伝子構築物を同時に動物に導入することができる。好ましい実施態様では、自殺導入遺伝子の発現は、重鎖再構成を生じた後に起こるように調節される。後記で論じる機構から明白であるように、これは外因性Ｂ細胞におけるリコンビナーゼの発現のための時間、そしてしたがって外因性Ｂ細胞のゲノムからの自殺遺伝子のリコンビナーゼ媒介の切除、したがってかかる細胞における自殺遺伝子発現の停止のための時間を見越している。加えて、本発明の方法で用いるベクターは選択を可能にするためにゲンタマイシン、ネオマイシン、カナマイシン等のような抗生物質選択マーカーをコードするＤＮＡ配列を含有できる。
【００７４】
本発明の１つの態様では、導入遺伝子は自己切断ペプチド（例えば２Ａペプチドまたは２Ａ様ペプチド）をコードするＤＮＡ配列を含む。導入遺伝子の免疫グロブリンコード化配列とリコンビナーゼコード化配列の間の自己切断ペプチドコード化配列の挿入により１つのメッセンジャーＲＮＡの生成に至る。しかしながらこのｍＲＮＡの翻訳の結果、ペプチドの自己切断機構のために２つの別個のタンパク質、（複数の）免疫グロブリンおよびリコンビナーゼに至る。したがってリコンビナーゼの発現をＶＤＪまたはＶＪセグメントの機能的再構成と結びつけることができる。
【００７５】
本発明の１つのかかる実施態様では、自己切断はピコルナウイルス科ウイルスファミリー、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウイルスファミリー、ピコルナウイルス様昆虫ウイルスファミリーを含む、またはＣ型ロタウイルスファミリーからのウイルスの２Ａ／２Ｂペプチドまたは２Ａ様／２Ｂ配列により媒介される。ピコルナウイルス科ウイルスファミリーにはエンテロ、ライノ、カルディオおよびアフトならびに口蹄疫（ＦＭＤＶ）ウイルスが含まれる。ピコルナウイルス様昆虫ウイルスファミリーには感染性フラシェリー病ウイルス（ＩＦＶ）、ショウジョウバエＣウイルス（ＤＣＶ）、急性ミツバチ麻痺病ウイルス（ＡＢＰＶ）およびコオロギ麻痺病ウイルス（ＣｒＰＶ）ならびに昆虫ウイルスゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）のようなウイルスが含まれる。Ｃ型ロタウイルスファミリーにはウシ、ブタおよびヒトＣ型ロタウイルが含まれる。さらなる実施態様では、切断配列はポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、メンゴウイルス、ブタテシオウイルス−１、またはタイラーネズミ脳炎ウイルス（ＴＭＥＶ）等のいずれかからの２Ａ様／２Ｂ配列を含み得る。好ましい実施態様では、自己切断タンパク質配列は口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウイルスまたはゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）のいずれかの２Ａ／２Ｂペプチドである。Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：７５４−７６２（１９９２）、Ｒｙａｎら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７２：２７２７−２７３２（１９９１）、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８２：１０２７−１０４１（２００１）、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８２：１０１３−１０２５（２００１）、Ｓｚｙｍａｃｚａｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２（５）：５８９−５９４（２００４）。
【００７６】
本発明の方法で用いるその他の導入遺伝子は部位特異的リコンビナーゼをコードする。部位特異的リコンビナーゼは２つの核酸、例えばＤＮＡセグメント間の相同組換えを触媒する。これらのリコンビナーゼは組換えの双方のパートナーの非常に特異的な配列を認識する。触媒の機構は様々な型の部位特異的リコンビナーゼで異なってよいが、それらは全て、基礎を成す機構に関わらず本明細書に含まれ、そして本発明の実施に適当である。
【００７７】
特定の実施態様では、リコンビナーゼは例えばＣｒｅ、Ｆｌｐリコンビナーゼ等でよい。ＣｒｅおよびＦｌｐは２つの最も一般的に用いられる酵素であり、それは非常に特異的なＤＮＡ配列に作用するのみである。Ｃｒｅは２つの３４塩基対長のｌｏｘＰ部位間でＤＮＡの組換えを触媒するが、Ｆｌｐはｆｒｔ部位を標的とする。真核細胞のＤＮＡの部位特異的組換えのためのＣｒｅリコンビナーゼの使用は米国特許第４９５９３１７号に記載されている。真核細胞のトランスフェクションのための部位特異的リコンビナーゼの使用は米国特許第６６３２６７２号に記載されている。部位特異的組換えは一般に米国特許第４６７３６４０号に記載されている。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ基盤のクローニング系は例えばＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト、カリフォルニア州）（Ｃｒｅａｔｏｒ（商標））またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州）（Ｅｃｈｏ（商標））から市販により入手可能である。
【００７８】
別の実施態様では、リコンビナーゼはλインテグラーゼ、φＣ３１、ＴＰ９０１−１およびＲ４からなる群から選択されるファージによりコードされる部位特異的リコンビナーゼでよい。φＣ３１およびＲ４は部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属するが、ＴＰ９０１−１は拡張されたリゾルベースファミリーに属する。Ｒ４インテグラーゼはストレプトミセス・パルブルスのファージＲ４のゲノムから誘導された部位特異的一方向性リコンビナーゼである。部位特異的インテグラーゼＴＰ９０１−１はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスのファージＴＰ９０１−１によりコードされる。λは大腸菌に感染する鋳型バクテリオファージである。ファージは組換えのための１つの結合部位（ａｔｔＰ）を有し、そして大腸菌細菌ゲノムは組換えのための１つの結合部位（ａｔｔＢ）を有する。本発明の局面では、野生型組換え部位を例えば相同系から誘導し、そして異種性配列に随伴させることができる。したがってａｔｔＢ部位をその他の系に置いてインテグラーゼの基質として作用させることができる。さらに別の実施態様では、リコンビナーゼは細菌ゲノム組換え部位（ａｔｔＢ）およびファージゲノム組換え部位（ａｔｔＰ）の間の組換えを触媒することができるか、または第１の部位は偽ａｔｔＢ部位を含むことができ、そして／もしくは第２の部位は偽ａｔｔＰ部位を含むことができるかまたはその逆である（Ｇｒｏｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：５９９５−６０００（２０００）；Ｏｌｉｖａｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１１）：１１２４−８（２００２））；（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、Ｍｏｌ． ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：３９２６−３９３４（２００１））；Ｈｏｌｌｉｓら、Ｒｅｐｒｏ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１：７９（２００３））。「偽組換え部位」とは、たとえ部位がその野生型組換え部位の配列と同一の配列を有せずとも、リコンビナーゼが組換えを促進できる部位を意味する。
【００７９】
さらに別の実施態様では、リコンビナーゼはトランスポーゼスまたはレトロトランスポーゼスでよい。トランスポゾンまたはレトロトランスポーゼスはカットアンドペースト機構によりその転位を触媒する酵素であり、そして任意の導入遺伝子の移入または挿入に用いることができる。これらはヒト、鳥類、げっ歯類等のような脊椎動物を含む広範な種のゲノムへの任意のＤＮＡ配列の挿入または移入のための非ウイルス性および非相同性の方法を提供する。例えばショウジョウバエエレメントマリナーはそれ自体をニワトリ生殖細胞系に転位させることが示された（Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１０５０−１０５３（１９９８））。ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス系を用いるマウスおよびヒトゲノムのような哺乳動物系への長期間の導入遺伝子発現またはトランスポゾンＤＮＡの効率的な挿入はＹａｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：３５−４１（２０００）；Ｄｕｐｕｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：４４９５−４４９９（２００２）およびＧｅｕｒｔｓら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１０８−１１７（２００３）により実証されている。Ｌ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）、ミノスのようなその他のトランスポーゼスは脊椎動物種において活性であることが示されており、そしてしたがって遺伝子移入に、または挿入変異ベクターとして有用である（Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ，Ｄａｖｉｄ Ａ．、Ｒｅｐｒｏ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１：８０（２００３））。トランスポーゼスの実例としては、限定するものではないが原核細胞性または真核細胞性トランスポーゼス、ウイルス性、ショウジョウバエコピア様または哺乳動物レトロトランスポーゼス等を含む非ウイルス性レトロトランスポーゼスが含まれる。原核細胞性トランスポーゼスには、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎｌ０００、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１等の転位可能なエレメントでコードされるトランスポーゼスが含まれる。真核細胞性トランスポーゼスにはショウジョウバエマリナー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス、ショウジョウバエＰエレメント、トウモロコシＡｃおよびＤｓエレメント等の転位可能なエレメントでコードされるトランスポーゼスが含まれる。レトロトランスポーゼスにはＬ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）、ミノス等でコードされるものが含まれる。トランスポーゼスをＭｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、ドット、Ｍｕ、およびＩ転位性エレメントからなる群から選択することもできる。
【００８０】
本発明の１つの態様では、前記した部位特異的リコンビナーゼ認識部位によりフランキングされた自殺遺伝子を用いて内因性Ｂ細胞を選択的に死滅させる。自殺遺伝子を組換え部位でフランキングすることにより、外因性Ｂ細胞においてのみリコンビナーゼまたはトランスポゾンの発現時の自殺遺伝子の不活性化に至る。自殺遺伝子発現の不活性化は自殺遺伝子またはその部分の切除により達成することができる。これに代えて、自殺遺伝子の発現に必要な配列を切除の標的とすることができる。別の研究法によれば、ＤＮＡフラグメントの反転または挿入によりトランスポゾンジャンピング、トランスポゾン挿入または反転のために自殺遺伝子発現を不活性化することができる。
【００８１】
本発明の実施において用いる自殺遺伝子には毒素遺伝子および毒性生成物を生じる無毒性プロドラッグ変換酵素が含まれる。本発明の方法において用いることができる活性毒素およびそのフラグメントには、例えばジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴＡ）のような細菌性毒素もしくはそのフラグメント、シグマ毒素、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌由来）等またはリシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＡＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセン、殺虫性毒素、は虫類毒液等のような植物もしくは真菌毒素およびその非結合活性フラグメントが含まれる。好ましい実施態様では、用いる毒素はジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴＡ）である。
【００８２】
標的Ｂ細胞に導入された自殺遺伝子がプロドラッグ変換酵素をコードする場合、酵素は特異的無毒性プロドラッグを活性化して最終的に標的Ｂ細胞を死滅させる毒性代謝物を創成する。この研究法では、内因性Ｂ細胞生成を抑制するために２工程処理方法を設計することができる。第１工程では、当分野において公知の種々の方式で外来酵素のための遺伝子を発現させるかまたはＢ細胞に分配することができる。第２工程では、動物に投与されたプロドラッグは最終的にそれを死滅させる酵素を発現するＢ細胞により活性化されて毒性代謝物になる。
【００８３】
自殺遺伝子として有用なプロドラッグ変換酵素は一般に２つの主要なクラスで見出されている。第１のクラスはヒト対応物を伴うかまたは伴わない非哺乳動物起源の酵素である。実例にはウイルス性チミジンキナーゼ（ＴＫ）、細菌性サイトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、細菌性カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、ニトロリダクターゼ（ＮＲ）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ペニシリン−Ｇアミダーゼ（ＰＧＡ）、βラクタマーゼ、多剤活性化酵素（ＭＤＡＥ）、βガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、西洋ワサビベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびデオキシリボヌクレオチドキナーゼ（ＤＲＮＫ）が含まれる。第２のクラスはヒト起源の酵素からなる。これにはデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）、β−グルクロニダーゼ（−Ｇｌｕ）およびチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソザイムが含まれる。酵素プロドラッグ系のさらなる実例はＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ（Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、２００４年）の表１に列挙されており、それを出典明示により本明細書の一部とする。したがって本発明で自殺遺伝子として用いるプロドラッグ変換酵素には、限定するものではないが前記したように非哺乳動物、非ヒト起源およびヒト起源の酵素が含まれる。
【００８４】
本発明で有用である適当なプロドラッグには、限定するものではないがガンシクロビル、アシクロビル、５−（アジリジン−１−イル）−２，３ジニトロベナミド、カペシタビン、イリノテカン、カルバマート基盤の２０（Ｓ）−カンプトテシン、ジニトロベンズアミドアジリジンＣＢ１９５４およびそのナイトロジェンマスタード類似体ＳＮ２３８６２、２−アミノアントラセン（２−ＡＡ）および４−イポメアノール（４−ＩＭ）等が含まれる。本発明で有用であるプロドラッグのさらなる実例は対応するその活性化酵素と共にＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ（Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、２００４年）の表１に列挙されており、それを出典明示により本明細書の一部とする。酵素活性化プロドラッグはしばしば、例えばエタニダゾール、フルオソール、ミソニダゾール、ニモラゾール、テモポルフィン、トリアパザミンのような放射線増感薬、またはカスパーゼのようなその他のアポトーシス剤の発現を用いるその他の細胞死滅方法と組み合わせて用いられることがあり、標的内因性Ｉｇ発現Ｂ細胞を死滅させる相乗効果を導く。
【００８５】
したがって自殺遺伝子の発現は種々の機構により内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞を排除することができる。例えばＤＴＡの発現によりタンパク質合成の阻止および続く細胞死に至る。チミジンキナーゼはガンシクロビルおよびアシクロビルをその対応する一リン酸形態にリン酸化し、それは続いて細胞性キナーゼにより毒性の三リン酸誘導体に変換される。毒性三リン酸の分裂細胞ＤＮＡへの取り込みにより細胞死に至る。ニトロリダクターゼは５−（アジリジン−１−イル）−２，３ジニトロベナミドを２−および４−ヒドロキシルアミノ誘導体に変換し、そのときに細胞性チオエステルを有する４−ヒドロキシルアミノ誘導体の非酵素反応によりＤＮＡを架橋することができる強力な細胞毒性二価性アルキル化剤が作成される。当分野において公知の自殺遺伝子は本発明において有用であるが、これらの自殺遺伝子が内因性Ｂ細胞を排除するように作用する（複数の）機構に束縛または限定されることはない。
【００８６】
本発明の好ましい実施態様では、自殺遺伝子は野生型または偽組換え部位（例えばＣｒｅにより認識されるｌｏｘＰ部位またはＦｌｐにより認識されるＦＲＴ部位）によりフランキングされたジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴＡ）をコードする。
【００８７】
本発明の別の実施態様では、自殺遺伝子は 野生型または偽組換え部位によりフランキングされたチミジンキナーゼをコードする。
【００８８】
１つの実施態様では、部位特異的リコンビナーゼ認識部位によりフランキングされた自殺遺伝子を、ヒトＩｇ遺伝子座−自己切断ペプチド−リコンビナーゼ導入遺伝子の導入の前、同時または後のいずれかに、別個の遺伝子導入ベクターで動物に導入する。別の実施態様では、部位特異的リコンビナーゼ認識部位によりフランキングされた自殺遺伝子をヒトＩｇ遺伝子座−リコンビナーゼ導入遺伝子のためのものとして同一の遺伝子導入ベクターで動物に導入する。全ての態様で、自殺遺伝子は動物ゲノムに組み込まれ、そして免疫細胞においてのみ特異的に発現されることを確実にする免疫細胞特異的プロモーターにより、および好ましくはＢ細胞においてのみ特異的に発現されることを確実にし、その他の細胞型では発現されないＢ細胞特異的プロモーターにより、その発現が駆動される。
【００８９】
自殺遺伝子の発現はＢ細胞特異的プロモーターにより制御されて、その発現は非Ｂ細胞またはヒト以外のトランスジェニック動物の組織では「スイッチオフ」になる。Ｂ細胞特異的遺伝子の発現を制御するプロモーター（およびエンハンサー）、またはその変種もしくは操作された部分は自殺遺伝子のかかるＢ細胞特異的発現に有用である。Ｂ細胞特異的遺伝子のプロモーター／エンハンサーの実例には、限定するものではないがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ（Ｂ２９またはＩｇベータとしても公知である）、ｍｂ−１（Ｉｇアルファとしても公知）、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶｐｒｅＢ、免疫グロブリンカッパ軽鎖、免疫グロブリンラムダ軽鎖、免疫グロブリンＪ−鎖等のプロモーター／エンハンサーが含まれる。好ましい実施態様では、カッパ軽鎖遺伝子プロモーター／エンハンサーが自殺遺伝子のＢ細胞特異的発現を駆動する。
【００９０】
したがって、内因性免疫グロブリン生成の抑制の結果、ヒト（化）Ｉｇ導入遺伝子座の優勢な発現に至る。換言すれば、内因性Ｂ細胞の枯渇によりヒト（化）抗体の富化に至る。好ましくは、内因性Ｂ細胞の富化は１００％に近くなる。
【００９１】
本発明のさらに別の態様では、導入遺伝子は免疫グロブリン重鎖および／もしくは免疫グロブリン軽鎖またはその部分をコードする。遺伝子座は生殖細胞系の立体配置または再構成形態でよい。コード化配列またはその部分はヒト免疫グロブリンをコードすることができ、その結果ヒト（化）抗体の発現に至る。
【００９２】
ヒト（化）抗体をコードする（複数の）導入遺伝子は１つまたはいくつかのヒトＩｇセグメント（例えばヒトＩｇＶ、Ｄ、ＪまたはＣ遺伝子セグメント）を含有するＩｇ遺伝子座またはＩｇ遺伝子座の大部分を含有する。これに代えて、導入遺伝子はヒト免疫グロブリン遺伝子座またはその大部分である。かかるヒトＩｇ遺伝子座またはかかる修飾されたＩｇ遺伝子座またはＩｇ遺伝子座の修飾された部分を含有する導入遺伝子もまた本明細書では「ヒト（化）Ｉｇ導入遺伝子座」と称され、ヒト以外のトランスジェニック動物において再構成を被ることができ、それによりヒト免疫グロブリンポリペプチド配列の少なくとも一部を有する抗体の多様化されたレパートリーが生成される。
【００９３】
免疫グロブリン重および軽鎖遺伝子は個々の遺伝子によりコードされ、そしてイントロン配列により分けられたいくつかのセグメントを含む。したがってヒト免疫グロブリン重鎖のための遺伝子は第１４染色体で見出される。重鎖（ＶＨ）の可変領域は３つの遺伝子セグメント（Ｖ、ＤおよびＪセグメント）、続いてＣ領域をコード化する同義遺伝子を含む。Ｖ領域は大型のスペーサーによってＣ領域から分けられ、そしてＶ、ＤおよびＪセグメントをコードする個々の遺伝子もまたスペーサーによって分けられる。
【００９４】
２つの型の免疫グロブリン軽鎖：κおよびλがある。ヒトκ軽鎖の遺伝子は第２染色体に見出され、そしてヒトλ軽鎖の遺伝子は第２２染色体に見出される。抗体軽鎖の可変領域は別個の遺伝子セグメントによりコードされるＶセグメントおよびＪセグメントを含む。κ軽鎖遺伝子の生殖細胞系立体配置では、およそ１００〜２００Ｖ領域遺伝子が直線的な配置で存在し、各遺伝子はそれ独自のリーダー配列、続いておよそ５Ｊ遺伝子セグメントおよびＣ領域遺伝子セグメントを有する。全てのＶ領域はイントロンにより分けられ、そして同様にＶ、ＪおよびＣ領域遺伝子セグメントを分けるイントロンが存在する。
【００９５】
感染に対して保護する免疫系の能力は、抗体の多様なレパートリーを創成するために特殊化された遺伝的な仕組みにある。Ｂ細胞の抗体コード化遺伝子は可変（Ｖ）領域の結合部位の無数の組み合わせを可能にする様式で組み立てられる。１０１２より多い可能な結合構造がかかる機構から生じると推測される。ヒトを含む全ての動物において抗体産生過程は免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）および連結（Ｊ）セグメントを組換えることにより始まる。この工程の後に、動物種に依存して２つの一般的な機構を用いて抗体の多様な結合構造を生成する。
【００９６】
ヒトおよびマウスのようないくつかの動物では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座にＶ、ＤおよびＪセグメントの複数のコピー、ならびに免疫グロブリン軽鎖伝子座にＶおよびＪセグメントの複数のコピーが存在する。これらの動物における抗体多様性は一次的には遺伝子再構成、すなわち再構成された重鎖可変領域および軽鎖可変領域を形成するための遺伝子セグメントの異なる組み合わせにより作成される。しかしながら別の動物（例えばウサギ、鳥類、例えばニワトリ、ガチョウおよびアヒル、ヒツジ、ヤギならびにウシ）では、遺伝子再構成は抗体多様性の作成においてあまり大きな役割を果たさない。例えば、ウサギでは、非常に限定された数のＶ遺伝子セグメントのみ、もっともよくあるのはＶ領域の３’末端のＶ遺伝子セグメントが遺伝子再構成に用いられて近接するＶＤＪセグメントを形成する。ニワトリでは、１つのＶ遺伝子セグメント（Ｄ領域に隣接するもの、すなわち「３’近位Ｖ遺伝子セグメント」）のみ、１つのＤセグメントおよび１つのＪセグメントのみを重鎖再構成で用い、そして１つのＶ遺伝子セグメント（３’近位Ｖ遺伝子セグメント）および１つのＪセグメントのみを軽鎖再構成で用いる。したがってこれらの動物では初期に再構成された可変領域配列の中では多様性が少ししかなく、それは連結部多様化の結果である。再構成されたＩｇ遺伝子のさらなる多様化は、上流Ｖ遺伝子セグメントから誘導される短い配列が、再構成されたＩｇ遺伝子のＶ遺伝子セグメント内の短い配列を置き換える過程である遺伝子変換により達成される。抗体配列のさらなる多様化を超変異により作成することができる。
【００９７】
免疫グロブリン（抗体）は５つのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤ）に属し、各々は免疫防御において異なる生物学的役割を有している。血液中に最も豊富であり、そして感染に対する応答において強力であるのはＩｇＧクラスである。ヒトＩｇＧクラス内にはＦｃドメインを含む重鎖定常領域の構造により決定される４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプ）がある。抗体のＦ（ａｂ）ドメインは抗原の特異的配列（エピトープ）に結合するが、抗体のＦｃドメインは抗原を排除するために免疫系のその他の構成成分を補充および活性化する。
【００９８】
元来の抗体および免疫グロブリンは通常約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる。各軽鎖は（複数の）共有結合性ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重および軽鎖はまた規則正しい間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一方の末端で可変ドメイン（ＶＨ）を有し、多くの定常ドメインがそれに続く。各軽鎖は一方の末端で可変ドメイン（ＶＬ）、およびその他方の末端で定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインとアラインされ、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインとアラインされている。特定のアミノ酸残基は軽鎖および重鎖可変ドメイン間のインターフェースを形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）；ＮｏｖｏｔｎｙおよびＨａｂｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５））。
【００９９】
「可変」なる用語は可変ドメインの特定の部分が抗体間の配列で大きく異なるという事実を意味し、そしてその特定の抗原に関する特定の各抗体の結合および特異性において用いられる。しかしながら可変性は抗体の可変ドメインにわたって均一に分布されるわけではない。それは双方共に軽鎖および重鎖可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と称される３つのセグメントに集中している。可変ドメインのさらに高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と称される。元来の重および軽鎖の可変ドメインは各々３つのＣＤＲによりつながれた４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域により近接近してまとまり、そしてその他の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，、ベセスダ、メリーランド州（１９９１年）参照）。定常ドメインは抗体の抗原に対する結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような種々のエフェクター機能を呈する。
【０１００】
ヒト動物導入遺伝子座の創成により高収率で多様化された高親和性ヒト（化）（ポリクローナル）抗体を発現するトランスジェニック動物の創成が可能になる。一般にヒト以外の動物における免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座のヒト化は１つまたはそれより多いヒトＩｇ遺伝子セグメントの動物のゲノムへの組み込みを伴い、ヒト（化）免疫グロブリン遺伝子座を創成する。したがってヒト（化）Ｉｇ重鎖遺伝子座の創成は１つまたはそれより多いＶおよび／もしくはＤおよび／もしくはＪセグメント、ならびに／またはＣ領域セグメントの動物ゲノムへの組み込みを伴う。同様に、ヒト化Ｉｇ軽鎖遺伝子座の創成は１つまたはそれより多いＶおよび／もしくはＪセグメント、ならびに／またはＣ領域セグメントの動物ゲノムへの組み込みを伴う。
【０１０１】
染色体位置に関わらず、本発明のヒト（化）Ｉｇ遺伝子座はヒト以外の動物において遺伝子再構成および遺伝子変換および超変異を被る能力を有し、それによりヒト（化）Ｉｇ分子の多様化されたレパートリーを生成する。遺伝子再構成および遺伝子変換を被る能力を有するＩｇ遺伝子座は「機能的」Ｉｇ遺伝子座とも称され、そして機能的Ｉｇ遺伝子座により作成された多様性を有する抗体は「機能的」抗体または抗体分子の「機能的」レパートリーとも称される。
【０１０２】
１つの態様では、抗体レパートリーの多様化が若年期に停止する動物が本発明において有用である。Ｂ細胞は造血幹細胞から発達する。抗原暴露の前にＢ細胞は一連の成熟工程を被り、その最終生成物は成熟Ｂ細胞であり、それはその他の細胞表面シグナリング分子と一緒にその細胞表面に独特な膜結合性ＩｇＭおよびしばしばＩｇＤを発現する。ヒトでは遺伝子再構成による抗体多様化は一生にわたって生じるが、その他の動物では、抗体レパートリーの多様化は若年期に、典型的には生まれて１か月以内に停止する。
【０１０３】
免疫グロブリン遺伝子の再構成が若年期に停止する動物では、この限定された期間に生成された全てまたはほとんどのＢ細胞を死滅させることにより効果的に内因性免疫グロブリン生成の持続的または永続的な抑止に至る。１つまたはいくつかのヒトまたはヒト化免疫グロブリン導入遺伝子座を含有するトランスジェニック動物では、これにより動物の内因性免疫グロブリン生成の不在下でのヒトまたはヒト化免疫グロブリンの生成が可能になる。このように遺伝子再構成が若年期に停止する動物では（複数の）内因性免疫グロブリンの発現が効果的に抑制され得る。かかる動物の実例は、限定するものではないがウサギ、鳥類（例えばニワトリ）、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタおよびウマである。
【０１０４】
本発明によれば、ヒト（化）免疫グロブリンを作ることができるトランスジェニック動物は、動物の（１つまたは複数の）レシピエント細胞に本明細書に前記した１つまたはそれより多い遺伝子導入ベクターを導入することにより作られ、その１つはヒト（化）Ｉｇ遺伝子座を担持し、そして遺伝的に修飾された（１つまたは複数の）レシピエント細胞から動物を誘導する。
【０１０５】
レシピエント細胞は例えば遺伝子変換および／または超変異により抗体多様性を作成するヒト以外の動物、例えば鳥類（例えばニワトリ）、ウサギ、ウシ等由来でよい。かかる動物では３’近位Ｖ遺伝子セグメントは免疫グロブリンの生成に優先的に用いられる。動物の３’近位Ｖ遺伝子セグメントを置換することか、または３’近位Ｖ遺伝子セグメントの近接近で配置されることのいずれかにより、導入遺伝子ベクターのＩｇ遺伝子座へのヒトＶ遺伝子セグメントの組み込むことで、大部分の免疫グロブリンでのヒトＶ領域ポリペプチド配列の発現に至る。これに代えて、再構成されたヒトＶ（Ｄ）Ｊセグメントを導入遺伝子ベクターの免疫グロブリン遺伝子座のＪ遺伝子座に挿入することができる。
【０１０６】
無作為組み込みによるかまたは標的組み込みにより、ヒト（化）Ｉｇ遺伝子座および自殺遺伝子を含有する目的の遺伝子を含有する遺伝子導入ベクターを（１つまたは複数の）レシピエント細胞に導入し、そして次に（１つまたは複数の）レシピエント細胞のゲノムに組み込むことができる。
【０１０７】
無作為組み込みのために、標準的な遺伝子導入技術によりヒト（化）Ｉｇ遺伝子座を含有する遺伝子導入ベクターを動物のレシピエント細胞に導入することができる。例えば遺伝子導入ベクターを受精卵母細胞の前核に直接注射することができる。また卵母細胞の受精の前に精子の遺伝子導入ベクターとのコインキュベーションにより遺伝子導入ベクターを導入することもできる。受精卵母細胞からトランスジェニック動物を発達させることができる。遺伝子導入ベクターを導入する別の方式は、胚性幹細胞をトランスフェクトし、そして続いて遺伝的に修飾された胚性幹細胞を発達中の胚に注射することによる。これに代えて遺伝子導入ベクター（裸でまたは促進剤と組み合わせて）を発達中の胚に直接注射することができる。最終的に、トランスジェニック動物の少なくともいくつかの体細胞のゲノムに組み込まれたヒト（化）Ｉｇ導入遺伝子を含有する胚からキメラトランスジェニック動物を生成する。
【０１０８】
特定の実施態様では、ヒト（化）Ｉｇ遺伝子座を含有する導入遺伝子は内因性免疫グロブリン遺伝子の発現が損なわれた動物株から誘導されたレシピエント細胞（例えば受精卵母細胞または発達中の胚）のゲノムにランダムに組み込まれる。かかる動物株の使用によりヒト（化）遺伝子導入Ｉｇ遺伝子座からの免疫グロブリン分子の優先的な発現が可能になる。かかる動物の実例には、アリシアおよびバジレアウサギ株、ならびに無ガンマグロブリン血症ニワトリ株、ならびに免疫グロブリンノックアウトマウスが含まれる。これに代えて、ヒト（化）免疫グロブリン導入遺伝子または遺伝子座を有するトランスジェニック動物を内因性免疫グロブリンの発現が損なわれた動物株と交配させることができる。損なわれた内因性Ｉｇ遺伝子座およびヒト（化）遺伝子導入Ｉｇ遺伝子座に関してホモ接合性の子孫を得ることができる。
【０１０９】
標的組み込みのために、遺伝子導入ベクターを胚性幹細胞または既に分化した体細胞のような適切な動物レシピエント細胞に導入することができる。その後、導入遺伝子が動物ゲノムに組み込まれ、そして相同組換えにより対応する内因性Ｉｇ遺伝子座を置換した細胞を標準的な方法により選択することができる。例えばＫｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００４年６月６日を参照のこと。次いで選択した細胞を除核した核移植単位細胞、例えば卵母細胞または胚性幹細胞と融合することができ、その細胞は全能性であり、そして機能的新生仔を形成することができる。十分に確立されている従来技術に従って融合を実施する。また卵母細胞の除核および核移植を注入ピペットを用いる顕微手術により実施することもできる。（例えばＷａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ ３９４：３６９（１９９８）参照。）得られた卵細胞を次いで適切な培地中で培養し、そして同期化したレシピエントに移入してトランスジェニック動物を作成する。これに代えて選択された遺伝的に修飾された細胞を発達中の胚に注射することができ、それを続いてキメラ動物に発達させる。
【０１１０】
さらに本発明によれば、その１つが内因性Ｉｇ遺伝子セグメントのフランキング配列に相同である５’および３’フランキング配列に連結されたヒトＩｇ遺伝子セグメントを担持する本明細書にて前記した１つまたはそれより多い組換えベクターを（１つまたは複数の）レシピエント細胞に導入し、次いで相同組換えにより内因性Ｉｇ遺伝子セグメントがヒトＩｇ遺伝子セグメントにより置き換えられている細胞を選択し、そして選択された遺伝的に修飾された（１つまたは複数の）レシピエント細胞から動物を誘導することにより、ヒト（化）免疫グロブリンを生成できるトランスジェニック動物を作ることもできる。
【０１１１】
遺伝子導入ベクターの標的挿入に類似して、この研究法においてレシピエント細胞として使用するのに適切な細胞には胚性幹細胞または既に分化した体細胞が含まれる。任意の実行可能な手段、例えばトランスフェクションによりヒトＩｇ遺伝子セグメントを担持する組換えベクターをかかるレシピエント細胞に導入することができる。その後相同組換えによりヒトＩｇ遺伝子セグメントが対応する内因性Ｉｇ遺伝子セグメントと置き換わっている細胞を標準的な方法により選択することができる。これらの遺伝的に修飾された細胞をトランスジェニック動物のクローニングのための核移植手順における核ドナー細胞として提供することができる。これに代えて選択された遺伝的に修飾された胚性幹細胞を発達中の胚に注射することができ、それを続いてキメラ動物に発達させることができる。
【０１１２】
具体的な実施態様では、胚期の間に導入遺伝子を胚に直接注射することにより、またはそれらを妊娠母体もしくは産卵するメンドリに間接的に注射することにより本発明の導入遺伝子構築物をトランスジェニック動物に導入することができる。結果的に動物の免疫グロブリン分子を発現する内因性Ｂ細胞は枯渇し得て、そして故にトランスジェニック子孫が抗原での免疫に応答してヒト（化）抗体を優勢に生成する。
【０１１３】
前記の方法のいずれかにより生成されたトランスジェニック動物は本発明の別の実施態様を形成する。トランスジェニック動物は少なくとも１つの、すなわち１つまたはそれより多い、そこからヒト（化）抗体の機能的レパートリーが生成されるヒト（化）Ｉｇ遺伝子座および自殺遺伝子をゲノムに有する。
【０１１４】
具体的な実施態様では、本発明は１つまたはそれより多いヒト（化）Ｉｇ遺伝子座および自殺遺伝子をゲノムに有するトランスジェニックウサギを提供する。本発明のトランスジェニックウサギはヒト（化）Ｉｇ遺伝子座を再構成および遺伝子変換し、そしてヒト（化）抗体の機能的レパートリーを発現することができる。
【０１１５】
別の具体的な実施態様では、本発明は１つまたはそれより多いヒト（化）Ｉｇ遺伝子座および自殺遺伝子をゲノムに有するトランスジェニックニワトリを提供する。本発明のトランスジェニックニワトリはヒト（化）Ｉｇ遺伝子座を再構成および遺伝子変換し、そしてヒト（化）抗体の機能的レパートリーを発現することができる。別の具体的な実施態様では、本発明は１つまたはそれより多いヒト（化）Ｖ領域および自殺遺伝子をゲノムに有するトランスジェニックマウスを提供する。ヒト（化）Ｖ領域はヒト以外のスペーサー配列によりフランキングされた少なくとも２つのヒトＶ遺伝子セグメントを含む。トランスジェニックマウスはヒトＶエレメントを再構成し、そして抗体の機能的レパートリーを発現することができる。
【０１１６】
抗原での免疫が該トランスジェニック動物における同一抗原に対するヒト（化）抗体の生成を招く。
【０１１７】
本発明の好ましい実施態様は、内因性Ｂ細胞を枯渇させるためにヒト（化）Ｉｇ遺伝子座および少なくとも１つの自殺遺伝子を有し、そしてヒト（化）ポリクローナル抗血清を生成するトランスジェニック動物に向けられているが、霊長類化Ｉｇ遺伝子座および霊長類化ポリクローナル抗血清を有するトランスジェニック動物もまた本発明の精神内にあることは理解されよう。ヒト（化）ポリクローナル抗血清組成物に類似して霊長類化ポリクローナル抗血清組成物は、ヒト個体における免疫原性が低下している可能性がある。
【０１１８】
一度多様化されたヒト（化）免疫グロブリン分子を生成することができるヒト以外のトランスジェニック動物が作られると（さらに後記で説明するように）、抗原で動物を免疫することによりヒト（化）免疫グロブリンおよび抗原に対するヒト（化）抗体調製物を容易に得ることができる。種々の抗原を用いてトランスジェニック宿主動物を免疫することができる。かかる抗原には、微生物、例えばウイルスおよび単細胞生物（例えば細菌および菌類）、生存、弱毒化もしくは死亡した、微生物のフラグメント、または微生物から単離された抗原分子が含まれる。
【０１１９】
動物を免疫するのに用いるための好ましい細菌性抗原には、莢膜多糖類５および８型のような黄色ブドウ球菌からの精製抗原、アルファ毒素のような毒性因子の組換え体、アドヘシン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、およびフィブロネクチン結合タンパク質が含まれる。好ましい細菌性抗原にはまた黄色ブドウ球菌、緑膿菌、腸球菌、エンテロバクターおよび肺炎桿菌の弱毒体、またはこれらの細菌細胞からの培養上澄みも含まれる。免疫に用いることができるその他の細菌性抗原には精製リポ多糖類（ＬＰＳ）、莢膜抗原、莢膜多糖類および／または外膜タンパク質の組換え体、フィブロネクチン結合タンパク質、内毒素、ならびに緑膿菌、腸球菌、エンテロバクターおよび肺炎桿菌の外毒素が含まれる。
【０１２０】
真菌に対する抗体の作成のための好ましい抗原には、真菌の弱毒体またはその外膜タンパク質が含まれ、その真菌には、限定するものではないがカンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリスおよびクリプトコッカス・ネオホルマンスが含まれる。
【０１２１】
ウイルスに対する抗体を作成するために免疫で用いるための好ましい抗原には、エンベロープタンパク質およびウイルスの弱毒体が含まれ、そのウイルスには、限定するものではないが呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）（特にＦプロテイン）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢＶおよびＨＳＶが含まれる。
【０１２２】
単離された腫瘍細胞または腫瘍細胞系を有するトランスジェニック動物を免疫することにより癌の処置のための治療用抗体を作成することができ、腫瘍関連抗原には、限定するものではないがＨｅｒ−２−ｎｅｕ抗原（それに対する抗体は乳癌の処置に有用である）；ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＣＤ５３抗原（それに対する抗体はＢ細胞リンパ腫の処置に有用である）、（３）前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）（それに対する抗体は前立腺癌の処置に有用である）、および１７−１Ａ分子（それに対する抗体は結腸癌の処置に有用である）が含まれる。
【０１２３】
任意の都合のよい様式で、補助剤を伴うかまたは伴わずに抗原をトランスジェニック宿主動物に投与することができ、そして予め決定されたスケジュールに従って投与することができる。
【０１２４】
免疫後、抗原に特異的な医薬品等級のポリクローナル抗体の精製のために免疫したトランスジェニック動物からの血清または乳を分画することができる。トランスジェニック鳥類の場合、卵黄を分画することにより抗体を作ることもできる。クロマトグラフィー（親和性、イオン交換、ゲルろ過等）、硫酸アンモニウムのような塩、エタノールのような有機溶媒またはポリエチレングリコールのようなポリマーを用いる選択的沈殿により、濃縮され、精製された免疫グロブリン分画を得ることができる。
【０１２５】
分画されたヒト（化）抗体をヒトでの静脈内投与に適当な無毒性のパイロジェン不含培地、例えば滅菌緩衝食塩水に溶解または希釈することができる。
【０１２６】
投与に用いられる抗体調製物は一般に、免疫グロブリン濃度が０．１から１００ｍｇ／ｍｌ、さらに通常的には１から１０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする。抗体調製物は種々のアイソタイプの免疫グロブリンを含有できる。これに代えて、抗体調製物はただ１つのアイソタイプ、または多くの選択されたアイソタイプの抗体を含有することができる。
【０１２７】
ヒト（化）モノクローナル抗体を作るために、その動物の内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞が枯渇している、免疫トランスジェニック動物から脾臓細胞を単離する。単離した脾臓細胞を、ハイブリドーマの生成のために形質転換された細胞系との細胞融合に用いるか、または抗体コード化ｃＤＮＡを標準的な分子生物学技術によりクローン化し、そしてトランスフェクトされた細胞中で発現させる。モノクローナル抗体を作るための手順は当分野において十分に確立されている。例えば欧州特許出願第０５８３９８０Ａｌ号（「Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｒａｂｂｉｔｓ」）、米国特許第４９７７０８１号（「Ｓｔａｂｌｅ Ｒａｂｂｉｔ−Ｍｏｕｓｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ Ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」）、国際公開公報第９７／１６５３７号（「Ｓｔａｂｌｅ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｂ−ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ」）、および欧州特許第０４９１０５７Ｂ１号（「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｗｈｉｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｅｓ Ａｖｉａｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ」）（それらの開示は出典明示により本明細書の一部とする）参照。クローン化されたｃＤＮＡからのモノクローナル抗体のインビトロ生成はＡｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ」、Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４２：１５９（２０００）およびＢｕｒｔｏｎ， Ｄ． Ｒ．、「Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ」、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：８７（１９９５）（それらの開示は出典明示により本明細書の一部とする）により記載されている。
【０１２８】
たいていの場合、抗体調製物は未修飾免疫グロブリン、すなわち例えば化学物質または酵素によりさらなる修飾を加えていない動物から調製したヒト（化）抗体からなる。これに代えて免疫グロブリン分画を酵素消化（例えばペプシン、パパイン、プラスミン、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼ等で）、加熱等のような処理に供する、および／またはさらに分画することができる。
【０１２９】
本発明の好ましい実施態様はヒト化抗体を生成するヒト以外のトランスジェニック動物における内因性免疫グロブリン生成の抑制のための方法に向けられており、それにより望ましいヒト（化）免疫グロブリンの富化が可能になる。１つの実施態様では、当分野において公知の方法を用いてヒト（化）免疫グロブリン遺伝子を含む導入遺伝子、自己切断ペプチドおよびリコンビナーゼをトランスジェニック動物に導入し、外因性Ｂ細胞と称されるＢ細胞における付随するヒト（化）免疫グロブリンおよびリコンビナーゼ遺伝子の発現を確実にする。本明細書に記載した、または当分野において周知の任意の種々のリコンビナーゼ、自己切断ペプチドまたは免疫グロブリン遺伝子を導入遺伝子で用いることができる。さらにこの実施態様では、内因性免疫グロブリンを発現するＢ細胞における自殺遺伝子の選択的発現により内因性免疫グロブリン生成の抑制が達成され、そしてしたがって細胞死により枯渇する。対応して、導入遺伝子の発現によりリコンビナーゼ媒介機構を介して自殺遺伝子は外因性Ｂ細胞のゲノムから切除される。したがって外因性Ｂ細胞は生存し、そしてヒト（化）免疫グロブリンをコードする導入遺伝子を産生的に生成する。以前に記載した、および当分野において公知の様々な自殺遺伝子は本発明の実施態様である。この実施態様の１つの態様では、導入遺伝子を介して自殺遺伝子をトランスジェニック動物のゲノムに導入し、そしてその発現を免疫細胞特異的プロモーターにより、好ましくはＢ細胞特異的プロモーターにより駆動してＢ細胞において自殺遺伝子を選択的に発現させ、したがって非Ｂ細胞集団の不必要な細胞死を防御する。本明細書にて記載した、または当分野において周知の種々の免疫細胞およびＢ細胞特異的プロモーターを用いてＢ細胞において自殺遺伝子を選択的に発現させることができる。別の実施態様では、本発明で用いるトランスジェニック動物は遺伝子変換動物であるか、または若年期に停止する遺伝子再構成により抗体多様化を被ることができる。さらに前記した方法を用いて作成した遺伝子導入ベクターおよびトランスジェニック動物もまた本発明の実施態様である。
【０１３０】
本発明をさらに説明するが、決して以下の実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１３１】
実施例１
ｌｏｘＰが導入されたＤＴ−Ａ発現ベクターの構築
ＤＴ−Ａ自殺遺伝子のＢ細胞特異的発現を達成するために、ウサギカッパ１をコードするＢＡＣクローン１７９Ｌ１（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ４９５８２７）を修飾する。Ｖ１の下流のスペーサーからＪ遺伝子座を通るカッパ１遺伝子座、イントロンエンハンサー、定常領域をコードするエクソン、３’エンハンサーの下流の配列に対する３’エンハンサーを含むＢＡＣクローンの４６ｋｂフラグメントをＥＴクローニングによりサブクローニングする。さらなるゲンタマイシン選択カセットを有するｐＢＥＬＯＢＡＣベクター骨格をＢＡＣ１７９Ｌ１に相同な５０ｂｐを有するプライマーでＰＣＲ増幅する。加えて順方向プライマーはＡｔｔＢインテグラーゼ認識部位およびＰｖｕＩ制限酵素認識部位を有する。加えて逆方向プライマーはＰｖｕＩ制限酵素認識部位を有する。
【０１３２】
【化１】
【０１３３】
【化２】
ＥＴクローニングのために、ＰＣＲ生成物をＢＡＣ１７９Ｌ１ならびに誘導ラムダファージ組換え酵素Ｒｅｄα、Ｒｅｄβおよびγを含有するストレプトマイシン抵抗性大腸菌株に形質転換する。これらの組換えタンパク質を同時トランスフェクトしたプラスミド（プラスミドｐＳＣ１０１−γβαを有するＤＨ１０Ｂ大腸菌）またはゲノムに組み込まれたラムダプロファージ（ＤＹ３８０大腸菌株）のいずれかから発現させる。ゲンタマイシンを用いて陽性クローン１７９Ｌ１（４６ｋｂ）を選択し、そして制限酵素消化により確認する。
【０１３４】
５’から３’の２つのＳＶ４０ポリＡ部位−ｌｏｘＰ部位−ウサギカッパ１プロモーター−ＤＴ−Ａ−ＦＲＴ部位−ｌｏｘＰ部位−２つのＳＶ４０ポリＡ部位からなるＤＮＡフラグメントを化学的に合成する。ＦＬＰ媒介の組み込みによりカナマイシン選択カセットをＦＲＴ部位に導入する。サブクローニングされた１７９Ｌ１の４６ｋｂフラグメント（４６ｋｂ）に相同な５０ｂｐを有するプライマーで合成フラグメントをＰＣＲ増幅する。ＥＴクローニングによりＪ遺伝子座を合成ＤＴ−Ａフラグメントに対して変化させる。カナマイシンを用いて陽性クローンを選択し、そして制限酵素分析により確認する。
【０１３５】
再度ＦＬＰ媒介組換えによりカナマイシン選択カセットを除去する。カナマイシン抵抗性の喪失により陽性クローンを選択し、そして制限酵素消化およびシークエンシングにより確認する。
【０１３６】
最終構築物はＶ１の下流のスペーサー、合成ＤＴ−Ａフラグメント、イントロンエンハンサー、定常領域をコードするエクソン、３’エンハンサーの下流の配列に対する３’エンハンサーを含む。
【０１３７】
構築物をトランスジェニック動物の作成に用いる。
【０１３８】
実施例２
ＩｇＭの膜形態、２Ａ自己切断ペプチド、Ｃｒｅリコンビナーゼからなる融合タンパク質をコードするヒト（化）重鎖遺伝子座の構築
定常、可変、および連結遺伝子セグメントまたは３’エンハンサー領域に特異的なプローブを用いてゲノムＤＮＡライブラリーからウサギ免疫グロブリン重鎖遺伝子座配列を含有するＢＡＣおよびフォスミドクローンを単離した。単離したＢＡＣ２７Ｎ５（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ３８６６９６）、２１９Ｄ２３（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ３８６６９５）、２２５Ｐ１８（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ３８６６９７）、３８Ａ２（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ３８６６９４）およびフォスミドＦｏｓ１５Ｂ（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ３８６６９６８）をシークエンシングした（Ｒｏｓら、Ｇｅｎｅ ３３０：４９−５９）。
【０１３９】
ＥＴクローニングによる大腸菌における相同組換えにより選択した免疫グロブリンコード化配列を対応するヒト対応物と交換した（Ｅ−Ｃｈｉａｎｇ Ｌｅｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７３：５６−６５；Ｄａｉｇｕａｎ Ｙｕら、ＰＮＡＳ ９７：５９７８−５９８３；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：１５５５−１５５７；Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：１３１４−１３１７）。
【０１４０】
これに代えて、インビトロでライゲーションおよび続く大腸菌の形質転換によりＤＮＡフラグメントを組換えした。インビトロライゲーションおよび形質転換、ＥＴクローニングにより、またはＣｒｅリコンビナーゼ媒介組み込みによりＢＡＣおよび／またはＦｏｓｌ５Ｂまたはその部分を組み合わせた。
【０１４１】
ＥＴクローニングのために標的配列を含有するベクターを、誘導ラムダファージ組換え酵素Ｒｅｄα、Ｒｅｄβおよびγを含有するストレプトマイシン抵抗性大腸菌株に形質転換した。同時トランスフェクトしたプラスミド（プラスミドｐＳＣ１０１−γβαを有するＤＨ１０Ｂ大腸菌）またはゲノムに組み込まれたラムダプロファージ（ＤＹ３８０大腸菌株）のいずれかからこれらの組換えタンパク質を発現させた。ＥＴクローニング手順は２つの相同組換え工程を包含した。
【０１４２】
第１の工程では、標的遺伝子座を選択−対抗選択カセット（例えばネオマイシンに対する抵抗性（ｎｅｏ）およびストレプトマイシンに対する感受性（ｒｐｓＬ）を付与するｎｅｏ−ｒｐｓＬ）により置き換えた。ｎｅｏ−抵抗性コロニーを単離した後、相同組換えによる選択カセットの挿入を制限酵素分析および部分的シークエンシングにより確認した。
【０１４３】
第２の工程では、ｒｐｓＬ−ｎｅｏ選択カセットを新しい配列と交換した。制限分析およびシークエンシングによりストレプトマイシン抵抗性クローンを分析した。ＥＴクローニング手順に用いたフラグメントは２０から５０ｂｐ長のフランキング配列を有し、それは標的配列と同一であった。ライゲーションに用いた配列はその３’および５’末端で適切な制限酵素部位を有した。これらの部位は天然発生部位であるか、または適切な部位を含有するプライマーを用いるＰＣＲにより導入されたかのいずれかであった。
【０１４４】
これに代えて配列を合成により作成した。
【０１４５】
ＥＴクローニングによりウサギＪＨ、ＢＡＣ２１９Ｄ２３のＣμおよびＢＡＣ２７Ｎ５のＣγの対応するそのヒト対応物との置き換えによりヒト化重鎖を構築した。ＥＴクローニング手順に用いたヒト配列をヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。
【０１４６】
ヒトＣμ、ＣγおよびＪＨ遺伝子セグメントをウサギ標的配列に相同な５０ｂｐを有するプライマーを用いて増幅した。
【０１４７】
【化３】
ＢＡＣクローン２２５Ｐ１８のクローン２１９Ｄ２３との、およびＢＡＣ２７Ｎ５のフォスミド１５Ｂとのライゲーションの後、ライゲートした構築物を大腸菌に形質転換し、そしてＣｒｅリコンビナーゼ媒介挿入によりつないだ。これにより１８ウサギ可変遺伝子、ウサギＤ領域、ヒトＪ領域、ヒトＣμ、ヒトＣγ、ウサギＣε、ウサギＣα４および３’エンハンサーエレメントからなる機能的遺伝子座に至った。
【０１４８】
自己切断Ｆ２Ａペプチドの配列およびＣＲＥリコンビナーゼのコドン最適化コード化配列（ｉＣＲＥ）を含むＤＮＡフラグメントを化学的に合成する。
【０１４９】
【化４】
ＥＴクローニングによりＩｇＭのＭ２膜エクソンを合成Ｍ２−Ｆ２Ａ−ｉＣＲＥフラグメントに対して変化させる。
【０１５０】
ＥＴクローニング手順は２つの相同組換え工程を包含した。第１の工程では、標的遺伝子座を選択−対抗選択カセット（例えばネオマイシンに対する抵抗性（ｎｅｏ）およびストレプトマイシンに対する感受性（ｒｐｓＬ）を付与するｎｅｏ−ｒｐｓＬ）により置き換える。このためにｒｐｓＬ−ｎｅｏ選択カセットを標的配列に相同な５０ｂｐを有するプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。ｎｅｏ−抵抗性コロニーを単離した後、相同組換えによる選択カセットの挿入を制限酵素分析および部分的シークエンシングにより確認する。
【０１５１】
第２の工程では、ｒｐｓＬ−ｎｅｏ選択カセットを合成Ｍ２−Ｆ２Ａ−ｉＣＲＥフラグメントと交換する。ストレプトマイシン抵抗性により陽性クローンを同定し、そして制限分析およびシークエンシングにより分析する。
【０１５２】
得られたＢＡＣをトランスジェニック動物作成に使用する。
【０１５３】
実施例３
ヒト化軽鎖遺伝子座の構築
ウサギゲノムＢＡＣライブラリーのスクリーニングによりウサギ軽鎖Ｋ１遺伝子セグメント（ジェンバンク受け入れ番号ＡＹ４９５８２７、ＡＹ４９５８２６）を含有する２つのＢＡＣ（１７９Ｌ１および２１５Ｍ２２）の同定に至った。
【０１５４】
前記したようにＥＴクローニングによりウサギＣκ１をヒトＣκアロタイプＫｍ３と交換した。
【０１５５】
ヒトＣκ（アロタイプＫｍ３）を標的配列に相同な５０ｂｐフランキング配列を有するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
【０１５６】
【化５】
ホモロジーアームはウサギ生殖細胞系カッパ（ｂ５；ジェンバンク受け入れ番号Ｋ０１３６３）の公開されている配列に基づいて設計され、そしてＣκのイントロン−エクソン境界に適合した。
【０１５７】
ＢＡＣ１７９Ｌ１におけるヒトＣκに対するウサギＣκの交換をシークエンシングにより確認した。
【０１５８】
ＢＡＣ１７９Ｌ１−ｈｕＣｋを２つのＥＴクローニングにより修飾した。ＢＡＣ１７９Ｌ１に相同な５０ｂｐを有するプライマーを用いてネオマイシン選択カセットを増幅した。加えて順方向プライマーはｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ部位を有した。ＰＣＲ生成物をＥＴクローニングに使用した。ネオマイシンで陽性クローンを選択し、そして制限酵素消化およびシークエンシングにより正確性を確かめた。ＢＡＣ１７９Ｌ１に相同な５０ｂｐ配列を含有するプライマーを用いてゼオシン選択カセットを増幅した。加えて順方向プライマーはｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ部位を有した。ＰＣＲ生成物をＥＴクローニングに使用した。ゼオシンで陽性クローンを選択し、そして制限酵素消化およびシークエンシングにより正確性を確かめた。
【０１５９】
ＢＡＣ２１５Ｍ２２をＥＴクローニングにより修飾した。ＢＡＣ２１５Ｍ２２に相同な５０ｂｐを有するプライマーを用いてゲンタマイシン抵抗性遺伝子を増幅した。加えて順方向プライマーはｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ部位を有し、そして逆方向プライマーはｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ部位を有した。ＰＣＲ生成物をＥＴクローニングに使用した。得られたクローンをゲンタマイシンで選択し、そして制限酵素消化およびシークエンシングにより正確性を確かめた。
【０１６０】
【化６】
【０１６１】
【化７】
修飾されたＢＡＣ１７９Ｌ１および２２５Ｍ２２をｉ−ＣｅｕＩおよびｉ−ＳｃｅＩで切断した。９８ｋｂおよび１３２ｋｂのフラグメントを精製し、そしてライゲートした。得られたクローンをカナマイシンおよびクロラムフェニコールで選択し、そして制限酵素消化、ｉ−ＳｃｅＩおよびｉ−ＣｅｕＩ制限部位を含有する領域のＰＣＲ、ならびにシークエンシングにより正確性を確かめた。得られたＢＡＣを１７９−２１５−ｈｕＣｋと称した。
【０１６２】
ＥＴクローニングによりＢＡＣ１７９−２１５−ｈｕＣｋのウサギＪｋ１およびＪｋ２を合成ヒト再構成カッパ１ＶＪ遺伝子により置き換えた。ウサギプロモーター、ウサギリーダー、ウサギイントロンおよびヒトＶＪ遺伝子を有するＤＮＡフラグメントを化学的に合成した。合成ヒトＶＪのコドン使用を最適化してウサギＶカッパ遺伝子に対して最高のＤＮＡ配列相同性を達成した。
【０１６３】
ＢＡＣ１７９Ｌ１に相同な５０ｂｐを有する順方向プライマーならびにゲンタマイシン抵抗性遺伝子およびＦＲＴ部位に相同な逆方向プライマーを用いて合成ヒトＶＪをＰＣＲ増幅した。ＦＲＴ部位を有する順方向プライマーならびにＢＡＣ１７９Ｌ１およびＦＲＴ部位に相同な５０ｂｐを有する逆方向プライマーを用いてゲンタマイシン抵抗性遺伝子を増幅した。合成ヒトＶＪ遺伝子のための順方向プライマーおよびゲンタマイシン抵抗性遺伝子のための逆方向プライマーを用いてオーバーラップ伸長ＰＣＲによりヒト合成ヒトＶＪおよびゲンタマイシン抵抗性遺伝子を組み合わせた。得られたフラグメントをＥＴクローニングに使用した。陽性クローンをゲンタマイシンで選択し、そして制限酵素消化およびシークエンシングにより正確性を確かめた。
【０１６４】
【化８】
部位特異的組換えによりＦｌｐリコンビナーゼの発現を介してゲンタマイシン抵抗性遺伝子を除去した。組換えの後、１つのＦＲＴが残った。ＥＴクローニングによりＦＲＴ部位を削除した。合成ヒトＶＪからの２３２ｂｐフラグメントをＰＣＲにより増幅し、そしてＥＴクローニングに使用した。得られたコロニーをＦＲＴ部位の喪失に関してＰＣＲによりスクリーニングし、そしてシークエンシングにより確認した。
【０１６５】
ＥＴクローニングによりＢＡＣ１７９−２１５−ｈｕＣｋのネオマイシン抵抗性遺伝子を置き換えた。ＢＡＣ１７９−２１５−ｈｕＣｋに相同な５０ｂｐを有するプライマーを用いてゲンタマイシン抵抗性（ｐＲｅｐ−Ｇｅｎｔａ；Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ）遺伝子をＰＣＲにより増幅した。加えて順方向プライマーはｌｏｘＰ部位、ａｔｔＢ部位およびＰｖｕＩ制限部位を有した。得られたクローンをゲンタマイシンで選択し、そして制限酵素消化およびシークエンシングにより正確性を確かめた。
【０１６６】
得られたＢＡＣをトランスジェニック動物の作成に使用した。
【０１６７】
【化９】
実施例４
ヒト化重鎖免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウスおよびウサギの作成
カッパ軽鎖プロモーター／エンハンサー配列の制御下でヒト化重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座およびｌｏｘＰが導入されたジフテリア毒素Ａ遺伝子を含有するトランスジェニックウサギおよびマウスを、受精卵母細胞の前核へのＤＮＡの注射および、続く里親への胚の移入により作成する。トランスジェニック創始動物をＰＣＲにより同定する。ヒト（化）免疫グロブリンＭおよびＧの発現をＥＬＩＳＡにより測定する。ヒト化ＩｇＧの発現は１〜５ｍｇ／ｍｌである。マウスおよびウサギＩｇＧの発現は各々１〜５μｇ／ｍｌである。
【０１６８】
実施例５
ヒト化重鎖免疫グロブリンを発現するトランスジェニックニワトリの作成
精巣媒介の遺伝子移入によりトランスジェニックニワトリを作成する。ＤＮＡ構築物を
（５０μｇ）を０．９％ＮａＣｌ ５００μｌ中リポフェクション試薬（スーパーフェクト）２５０μｌと混合し、そしてオンドリの精巣に注射する。３〜４週後、トランスジェニック精子を有するオンドリをＰＣＲ分析により同定し、そしてメンドリと交配させる。トランスジェニック子孫をＰＣＲにより同定する。ヒト化ＩｇＧの発現は１〜５ｍｇ／ｍｌである。ニワトリＩｇＹの発現は各々１〜５μｇ／ｍｌである。
【０１６９】
本開示全体にわたって引用した全ての参照文献はそこに引用された参照文献と一緒に出典明示により本明細書の一部とする。
【０１７０】
本発明を特定の実施態様を参照することにより説明したが、そのように限定されるものではない。種々の修飾を容易に利用でき、そして本発明が取り組む方式を実質的に変化させることなく実施できることは当業者には理解されよう。かかる修飾の全てが、具体的には本明細書にて特許請求される本発明の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】外因性免疫グロブリン（Ｉｇ）発現Ｂ細胞および内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）発現Ｂ細胞で生じる事象の説明図である。２つの導入遺伝子（Ｉｇ重鎖遺伝子座およびＤＴＡ）を有する細胞では、遺伝子導入免疫グロブリン重鎖遺伝子座の産生性再構成の結果、重鎖（ＨＣ）およびＣｒｅリコンビナーゼの発現に至る。続いて、Ｃｒｅ媒介の組換えの結果、ＤＴＡ発現カセットのループアウトに至る。したがって、ＤＴＡは発現されず、そして遺伝子導入免疫グロブリンＨＣ遺伝子座を発現するかかる外因性Ｂ細胞は生存する。内因性ＨＣ遺伝子座の産生性再構成の結果、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現には至らない。したがって、ＤＴＡ発現カセットは活性化され、そしてかかる内因性Ｂ細胞は死亡する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト以外のトランスジェニック動物の内因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞において少なくとも１つの自殺遺伝子を選択的に発現するが、外因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞では発現しないこと含み、それにより内因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞は枯渇し、そして内因性免疫グロブリンの生成は抑制されるが該外因性免疫グロブリンの生成は抑制されない外因性免疫グロブリン導入遺伝子座を担持する該ヒト以外のトランスジェニック動物のＢ細胞における内因性免疫グロブリン生成の選択的抑制のための方法。
【請求項２】
該外因性免疫グロブリンがヒト（化）免疫グロブリン重および／または軽鎖配列である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ヒト以外のトランスジェニック動物のＢ細胞に導入された該自殺遺伝子がＢ細胞特異的プロモーターの制御下にあり、そして組換え配列によりフランキングされる請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該ヒト（化）免疫グロブリン鎖導入遺伝子座をさらに該組換え配列を認識するリコンビナーゼをコードする発現構築物の一部として該ヒト以外のトランスジェニック動物のＢ細胞に導入し、ここで該自殺遺伝子の発現が該ヒト（化）免疫グロブリン導入遺伝子座を発現するＢ細胞における該リコンビナーゼの発現により不活性化される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該自殺遺伝子が細菌性、真菌性、殺虫性および植物の毒素からなる群から選択される請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該自殺遺伝子がジフテリア毒素Ａ鎖である請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項７】
該自殺遺伝子がプロドラッグ変換酵素である請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
プロドラッグ変換酵素が非哺乳動物起源である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
非哺乳動物起源の該プロドラッグ変換酵素がウイルス性チミジンキナーゼ（ＴＫ）、細菌性サイトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、細菌性カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、ニトロリダクターゼ（ＮＲ）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ペニシリン−Ｇアミダーゼ（ＰＧＡ）、β−ラクタマーゼ、多剤活性化酵素（ＭＤＡＥ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、西洋ワサビベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびデオキシリボヌクレオチドキナーゼ（ＤＲＮＫ）からなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プロドラッグ変換酵素がヒト起源である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト起源のプロドラッグ変換酵素がデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）、β−グルクロニダーゼ（−Ｇｌｕ）およびチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）からなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該リコンビナーゼがＣｒｅ、Ｃｒｅ様、Ｆｌｐ、φＣ３１、λインテグラーゼ、ファージＲ４リコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１リコンビナーゼ、原核細胞性トランスポーゼス、真核細胞性トランスポーゼス、ウイルス性レトロトランスポーゼス、ショウジョウバエコピア様レトロトランスポーゼスおよび非ウイルス性レトロトランスポーゼスからなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
該トランスポーゼスまたはレトロトランスポーゼスがＴｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎｌ０００、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ショウジョウバエマリナー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス、ショウジョウバエＰエレメント、トウモロコシＡｃ、Ｄｓ、Ｍｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、ドット、Ｍｕ、Ｉ、Ｌ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）およびミノスからなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該ヒト以外のトランスジェニック動物が若年期の遺伝子再構成により抗体多様化を実質的に停止する請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
該ヒト以外のトランスジェニック動物が生まれて１か月以内に抗体多様化を実質的に停止する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該ヒト以外のトランスジェニック動物がげっ歯類、ウサギ、鳥類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウマからなる群から選択される請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
該げっ歯類がマウスまたはラットである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（１）導入遺伝子、（２）ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重および／または軽鎖導入遺伝子座（３）自己切断ペプチドならびに（４）リコンビナーゼを含む遺伝子導入発現構築物。
【請求項１９】
（１）導入遺伝子および（２）Ｂ細胞特異的プロモーターの制御下であり、そしてリコンビナーゼにより認識される組換え部位によりフランキングされた自殺遺伝子を含む遺伝子導入発現構築物。
【請求項２０】
ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重および／または軽鎖遺伝子座、自己切断ペプチドおよびリコンビナーゼをさらに含む第１の導入遺伝子ならびにＢ細胞特異的プロモーターの制御下であり、そして該リコンビナーゼにより認識される組換え部位によりフランキングされた自殺遺伝子をさらに含む第２の導入遺伝子を含む遺伝子導入発現構築物。
【請求項２１】
該リコンビナーゼがＣｒｅ、Ｃｒｅ様、Ｆｌｐ、φＣ３１、λインテグラーゼ、ファージＲ４リコンビナーゼおよびＴＰ９０１−１リコンビナーゼからなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼである請求項１８、１９または２０に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２２】
該リコンビナーゼが原核細胞性または真核細胞性トランスポーゼスのいずれかである請求項１８、１９または２０に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２３】
該リコンビナーゼがウイルス性、ショウジョウバエコピア様または非ウイルス性レトロトランスポーゼスのいずれかである請求項２２に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２４】
該レトロトランスポーゼスがＴｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎｌ０００、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ショウジョウバエマリナー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス、ショウジョウバエＰエレメント、トウモロコシＡｃ、Ｄｓ、Ｍｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、ドット、Ｍｕ、Ｉ、Ｌ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）およびミノスからなる群から選択される請求項２３に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２５】
該組換え部位がｌｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、細菌性ゲノム組換え部位およびファージ組換え部位からなる群から選択される請求項１９または２０に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２６】
該細菌性ゲノム組換え部位がａｔｔＢであり、そして該ファージ組換え部位がａｔｔＰまたは偽ａｔｔＰまたは偽ａｔｔＢ部位である請求項２５に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２７】
該自己切断ペプチドがウイルス性２Ａ／２Ｂまたは２Ａ様／２Ｂ配列から得られる請求項１８または２０に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２８】
該ウイルスがピコルナウイルス科ウイルスファミリー、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウイルスファミリー、ピコルナウイルス様昆虫ウイルスファミリーからなる群からまたはＣ型ロタウイルスファミリーから選択される請求項２７に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２９】
該ウイルスが口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウイルス、またはゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）からなる群から選択される請求項２７に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項３０】
ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ、ｍｂ−１、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶｐｒｅＢ、免疫グロブリンカッパ軽鎖、免疫グロブリンラムダ軽鎖および免疫グロブリンＪ鎖またはその修飾体からなる群から選択されるプロモーター／エンハンサーを用いてＢ細胞において該自殺遺伝子が特異的に発現される請求項１９または２０に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項３１】
該Ｂ細胞特異的プロモーター／エンハンサーがカッパ軽鎖遺伝子プロモーターまたはその修飾体である請求項３０に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項３２】
請求項１８および１９または２０に記載の遺伝子導入発現構築物を発現するヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３３】
実質的に遺伝子変換により抗体多様性を作成する請求項３２に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３４】
げっ歯類、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウを含む鳥類からなる群から選択される請求項３２に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３５】
マウスまたはラットのいずれかである請求項３４に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１】
ヒト以外のトランスジェニック動物の内因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞において少なくとも１つの自殺遺伝子を選択的に発現するが、外因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞では発現しないこと含み、それにより内因性免疫グロブリンを生成するＢ細胞は枯渇し、そして内因性免疫グロブリンの生成は抑制されるが該外因性免疫グロブリンの生成は抑制されない外因性免疫グロブリン導入遺伝子座を担持する該ヒト以外のトランスジェニック動物のＢ細胞における内因性免疫グロブリン生成の選択的抑制のための方法。
【請求項２】
該外因性免疫グロブリンがヒト（化）免疫グロブリン重および／または軽鎖配列である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ヒト以外のトランスジェニック動物のＢ細胞に導入された該自殺遺伝子がＢ細胞特異的プロモーターの制御下にあり、そして組換え配列によりフランキングされる請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該ヒト（化）免疫グロブリン鎖導入遺伝子座をさらに該組換え配列を認識するリコンビナーゼをコードする発現構築物の一部として該ヒト以外のトランスジェニック動物のＢ細胞に導入し、ここで該自殺遺伝子の発現が該ヒト（化）免疫グロブリン導入遺伝子座を発現するＢ細胞における該リコンビナーゼの発現により不活性化される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該自殺遺伝子が細菌性、真菌性、殺虫性および植物の毒素からなる群から選択される請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該自殺遺伝子がジフテリア毒素Ａ鎖である請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項７】
該自殺遺伝子がプロドラッグ変換酵素である請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
プロドラッグ変換酵素が非哺乳動物起源である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
非哺乳動物起源の該プロドラッグ変換酵素がウイルス性チミジンキナーゼ（ＴＫ）、細菌性サイトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、細菌性カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、ニトロリダクターゼ（ＮＲ）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ペニシリン−Ｇアミダーゼ（ＰＧＡ）、β−ラクタマーゼ、多剤活性化酵素（ＭＤＡＥ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、西洋ワサビベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびデオキシリボヌクレオチドキナーゼ（ＤＲＮＫ）からなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プロドラッグ変換酵素がヒト起源である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト起源のプロドラッグ変換酵素がデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）、β−グルクロニダーゼ（−Ｇｌｕ）およびチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）からなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該リコンビナーゼがＣｒｅ、Ｃｒｅ様、Ｆｌｐ、φＣ３１、λインテグラーゼ、ファージＲ４リコンビナーゼ、ＴＰ９０１−１リコンビナーゼ、原核細胞性トランスポーゼス、真核細胞性トランスポーゼス、ウイルス性レトロトランスポーゼス、ショウジョウバエコピア様レトロトランスポーゼスおよび非ウイルス性レトロトランスポーゼスからなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
該トランスポーゼスまたはレトロトランスポーゼスがＴｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎｌ０００、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ショウジョウバエマリナー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス、ショウジョウバエＰエレメント、トウモロコシＡｃ、Ｄｓ、Ｍｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、ドット、Ｍｕ、Ｉ、Ｌ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）およびミノスからなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該ヒト以外のトランスジェニック動物が若年期の遺伝子再構成により抗体多様化を実質的に停止する請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
該ヒト以外のトランスジェニック動物が生まれて１か月以内に抗体多様化を実質的に停止する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該ヒト以外のトランスジェニック動物がげっ歯類、ウサギ、鳥類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウマからなる群から選択される請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
該げっ歯類がマウスまたはラットである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（１）導入遺伝子、（２）ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重および／または軽鎖導入遺伝子座（３）自己切断ペプチドならびに（４）リコンビナーゼを含む遺伝子導入発現構築物。
【請求項１９】
（１）導入遺伝子および（２）Ｂ細胞特異的プロモーターの制御下であり、そしてリコンビナーゼにより認識される組換え部位によりフランキングされた自殺遺伝子を含む遺伝子導入発現構築物。
【請求項２０】
ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重および／または軽鎖遺伝子座、自己切断ペプチドおよびリコンビナーゼをさらに含む第１の導入遺伝子ならびにＢ細胞特異的プロモーターの制御下であり、そして該リコンビナーゼにより認識される組換え部位によりフランキングされた自殺遺伝子をさらに含む第２の導入遺伝子を含む遺伝子導入発現構築物。
【請求項２１】
該リコンビナーゼがＣｒｅ、Ｃｒｅ様、Ｆｌｐ、φＣ３１、λインテグラーゼ、ファージＲ４リコンビナーゼおよびＴＰ９０１−１リコンビナーゼからなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼである請求項１８、１９または２０に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２２】
該リコンビナーゼが原核細胞性または真核細胞性トランスポーゼスのいずれかである請求項１８、１９または２０に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２３】
該リコンビナーゼがウイルス性、ショウジョウバエコピア様または非ウイルス性レトロトランスポーゼスのいずれかである請求項２２に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２４】
該レトロトランスポーゼスがＴｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎｌ０００、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ショウジョウバエマリナー、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポーゼス、ショウジョウバエＰエレメント、トウモロコシＡｃ、Ｄｓ、Ｍｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、ドット、Ｍｕ、Ｉ、Ｌ１、Ｔｏｌ２ Ｔｃ１、Ｔｃ３、マリナー（Ｈｉｍａｒ１）、マリナー（ｍｏｓ１）およびミノスからなる群から選択される請求項２３に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２５】
該組換え部位がｌｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、細菌性ゲノム組換え部位およびファージ組換え部位からなる群から選択される請求項１９または２０に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２６】
該細菌性ゲノム組換え部位がａｔｔＢであり、そして該ファージ組換え部位がａｔｔＰまたは偽ａｔｔＰまたは偽ａｔｔＢ部位である請求項２５に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２７】
該自己切断ペプチドがウイルス性２Ａ／２Ｂまたは２Ａ様／２Ｂ配列から得られる請求項１８または２０に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２８】
該ウイルスがピコルナウイルス科ウイルスファミリー、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウイルスファミリー、ピコルナウイルス様昆虫ウイルスファミリーからなる群からまたはＣ型ロタウイルスファミリーから選択される請求項２７に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項２９】
該ウイルスが口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａ（ＥＲＡＶ）ウイルス、またはゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）からなる群から選択される請求項２７に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項３０】
ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ、ｍｂ−１、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶｐｒｅＢ、免疫グロブリンカッパ軽鎖、免疫グロブリンラムダ軽鎖および免疫グロブリンＪ鎖またはその修飾体からなる群から選択されるプロモーター／エンハンサーを用いてＢ細胞において該自殺遺伝子が特異的に発現される請求項１９または２０に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項３１】
該Ｂ細胞特異的プロモーター／エンハンサーがカッパ軽鎖遺伝子プロモーターまたはその修飾体である請求項３０に記載の遺伝子導入発現構築物。
【請求項３２】
請求項１８および１９または２０に記載の遺伝子導入発現構築物を発現するヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３３】
実質的に遺伝子変換により抗体多様性を作成する請求項３２に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３４】
げっ歯類、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウを含む鳥類からなる群から選択される請求項３２に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３５】
マウスまたはラットのいずれかである請求項３４に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５１７６００（Ｐ２００８−５１７６００Ａ）
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３８１１０（Ｐ２００７−５３８１１０）
【出願日】平成１７年１０月２１日（２００５．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３８０９５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４７３６７
【国際公開日】平成１８年５月４日（２００６．５．４）
【出願人】（５０６０１１５０４）セラピューティック ヒューマン ポリクローナルズ， インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２１日（２００５．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３８０９５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４７３６７
【国際公開日】平成１８年５月４日（２００６．５．４）
【出願人】（５０６０１１５０４）セラピューティック ヒューマン ポリクローナルズ， インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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