ヒト型Ｆｃレセプター発現細胞、及びそれを用いたヒト型Ｆｃレセプターの製造方法
【課題】 遺伝子工学手法を用いてヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを工業的に製造すること。
【解決の手段】 可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを形質転換することで得られる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを安定的に発現するＣＨＯ細胞を用いて生産することで、前記課題を解決することができた。
【解決の手段】 可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを形質転換することで得られる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを安定的に発現するＣＨＯ細胞を用いて生産することで、前記課題を解決することができた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工学的手法により得られた、ヒト型Ｆｃレセプターを発現する細胞、および前記細胞を用いたヒト型Ｆｃレセプターの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターとは免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、あるいは、同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の結合ドメインによって認識する。これによって一定の免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる（非特許文献１）。Ｆｃレセプターは、さらに、サブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。なかでも、ＦｃγＲＩとＩｇＧの結合親和性は高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩはＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであり、単球とマクロファージ上に構成的に発現され、好中球および好酸球上においては誘導的に発現される。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域の境界にあるアミノ酸システインを介した共有結合によりホモダイマーを形成している（非特許文献１）。
【０００３】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に、自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。
【０００４】
ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列は非特許文献３により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）あるいは動物細胞を利用した発現が報告されている（非特許文献４）。
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の大腸菌を利用した発現系ではＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量が極めて低く、また、発現したタンパク質は菌体内発現のため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化等の操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、非特許文献４に記載の動物細胞を用いた系では、ＦｃγＲＩの菌体外ドメイン遺伝子をｐＭＳベクターに導入し、それをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に形質転換させることで細胞外にＦｃγＲＩを発現させているが、一過性の発現のため、ＦｃγＲＩの工業的な生産には不向きであった。
【０００６】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９
【非特許文献４】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【非特許文献５】Ｙａｓｕｋａｗａ Ｋ．等、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０８，６７３，１９９０
【非特許文献６】Ｃ．Ｃｈｅｎ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，２７４５，１９８７
【非特許文献７】Ｇ．Ｕｒｌａｎｄ等，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７７，４２１６，１９８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本発明は、前記問題点を解決し、遺伝子工学手法を用いてヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを安定的に発現可能な細胞、およびそれを用いたヒト型ＦｃγＲＩの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
（１）可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを形質転換することにより得られる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを安定的に発現するＣＨＯ細胞。
（２）可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全ＤＮＡ配列のうち膜貫通領域を除去した配列であることを特徴とする、（１）に記載の細胞。
（３）可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全ＤＮＡ配列のうち膜貫通領域を除去した配列中の少なくとも１塩基が他のヌクレオチドに置換、および／または欠失、および／または付加されている配列であることを特徴とする、（１）に記載の細胞。
（４）発現プラスミドがＳＶ４０プロモーター系に由来するＤＮＡ配列を含んでいることを特徴とする、（１）から（３）に記載の細胞。
（５）発現プラスミドがさらにジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含んでいることを特徴とする、（４）に記載の細胞。
（６）（１）から（５）に記載の細胞を用いることを特徴とする、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列
本発明の細胞を取得する際に用いる、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列は、報告されているヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列に適当な修飾を加えることで、本来なら膜タンパク質であるＦｃγＲＩを細胞外に分泌させることが可能なＤＮＡ配列である。前記適当な修飾法としては、終止コドンを細胞外領域あるいは膜貫通領域に挿入する方法、膜貫通領域を除去する方法が例示できるが、膜貫通領域を除去する方法が好ましい。配列番号１にはヒト型ＦｃγＲＩの全アミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が示されており、このアミノ酸中、細胞外領域はアミノ酸番号１から２７７番のアミノ酸配列に相当し、膜貫通領域は２７８番から２９９番目のアミノ酸配列に相当する（略図を図１に示す）。前記細胞外領域あるいは膜貫通領域に終止コドンを挿入することは、インビトロミュータジェネシス（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような、ＤＮＡに突然変異を挿入するための市販のキットを用いて行なうことができ、前記膜貫通領域を除去することも、前記市販のキットを用いて行なうことができる。また、適当なオリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲ法により、前記細胞外領域あるいは膜貫通領域に終止コドンを挿入したもの、または前記膜貫通領域を除去したものを調製してもよい。
【００１０】
また、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全塩基配列のうち膜貫通領域を除去した配列中の少なくとも１塩基が他のヌクレオチドに置換、および／または欠失、および／または付加されている配列であっても、宿主細胞から分泌され、かつ、ヒト型ＦｃγＲＩの活性を保持するものは前記ＤＮＡ配列を有しているものとみなすことができる。ヌクレオチド配列の置換としては、あるアミノ酸をコードするヌクレオチドから別のアミノ酸をコードするヌクレオチドへの変換を例示することができる。なお、前記ＤＮＡ配列はヒト型ＦｃγＲＩのｃＤＮＡ等を出発材料として作製してもよいし、人工的に合成してもよい。
【００１１】
さらに、前記ＤＮＡ配列中には、発現した可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの簡便な精製を目的に、タグ配列を付加させてもよい。タグ配列とはヒトＦｃγＲＩに限らず、遺伝子工学に多用されるオリゴアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ポリヒスチジンタグ、Ｃ−ｍｙｃタグを例示することができる。タグ配列の付加は前記ＤＮＡ配列の５’末端側、３’末端側いずれもよい。
２．発現プラスミド
本発明の細胞を取得する際に用いる可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡを発現させる、すなわち可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを発現し得る複製可能な発現プラスミドは、前項で説明した可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列を発現させるためのＤＮＡ配列および宿主中でプラスミドＤＮＡを複製するための複製起点を有し、かつ、選定された宿主を形質転換できるものであれば、適宜選定し使用できる。前記ＤＮＡ配列を発現させるためのＤＮＡ配列としては、乳糖プロモータ系、トリプトファンプロモータ系、ＧＡＬ４プロモータ系、ＳＶ４０プロモータ系、アデノウイルスプロモータ系に由来する配列が例示でき、宿主との関係において適宜選定すればよいが、本発明の細胞株を取得する際に用いるプロモータ系としては、ＳＶ４０プロモータ系に由来する配列が好ましい。また、これらのプラスミドを用いて形質転換する操作にあたり、プラスミドが導入されなかった宿主と導入された宿主との選別を可能にするために、発現プラスミド中にアンピシリンといった薬剤に対する耐性を宿主に付与するためのＤＮＡ配列を含んでいるのが好ましい。
３．宿主
本発明の宿主としては、安定的にタンパク質を発現可能なＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣細胞）が好ましい。
【００１２】
また、前記宿主に、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含んだ発現プラスミドを導入し、さらに特定の薬剤に対する耐性も付与した細胞について、薬剤に対する耐性の強さから前記細胞のスクリーニングを行なうことで、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを高発現する細胞を得ることができる。前記スクリーニングにおいて、薬剤としてはメソトレキセート（ＭＴＸ）、耐性濃度としては数μＭ以上がそれぞれ好ましい。ＭＴＸに対する耐性の付与方法は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）を可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列と同一の発現プラスミドに挿入すればよい。
４．可溶性ＦｃγＲＩの精製
本発明の細胞を用いて提供される、遺伝子工学的方法により生産された可溶性ヒト型ＦｃγＲＩは、生産に用いた培養液、あるいは培養上清中から、通常の生理活性タンパク回収法によって分離精製することができる。分離回収方法としては、市販のＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィーを例示することできる。また、培養液中から前記タンパクを生産する際に、培養液中の他のタンパク質の減少、例えば、培養細胞を無血清培地で培養して前記タンパクを発現させることにより分離回収の効率を高めることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明で提供される、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを形質転換して得られた、安定的にＦｃγＲＩを発現可能なＣＨＯ細胞を用いて、ヒト型ＦｃγＲＩの生産を行ない、該タンパクを分離回収することにより、自然状態では極めて微量にしか生産されないＦｃγＲＩと同等のものである可溶性ＦｃγＲＩを工業的に製造することが可能である。本発明の細胞を用いて製造されたヒト型ＦｃγＲＩは、個体発生および免疫機構の研究、さらにはそれらの成果に基づく治療診断薬等の開発に大きな意義を持つ。また、抗ＦｃγＲＩ抗体を作製するための免疫源、さらにはＦｃγＲＩの免疫化学測定方法の標準物質として用いることもできる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実施例１ 可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドの作製
可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドの作製は、以下の方法で行なった。
（１）可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡを以下の方法で調製した。
（１−１）Ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ＳＣ１１９８４１プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）をテンプレートとし、配列番号２（５’−ＧＡ［ＡＧＡＴＣＴ］ＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＣ−３’：角かっこ部分は制限酵素ＢｇｌＩＩサイト）と配列番号３（５’−ＣＧ［ＴＣＴＡＧＡ］ＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣ−３’：角かっこ部分は制限酵素ＸｂａＩサイト）のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した。なお、ＦｃγＲＩタンパク質の調製および定量を行なうために、発現タンパク質のＣ末端側にポリヒスチジンタグが付加されるようにＰＣＲプライマーを作製した。
（１−２）ＰＣＲ反応を、９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６５℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に、７２℃・７分の条件で行なった。反応液組成を表１に示す。
【００１６】
【表１】
（１−３）ＰＣＲ反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動にて、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認した。
（１−４）目的産物に相当するＤＮＡバンドをアガロースゲルから抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社製）し、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡを調製した。
（２）（１）で調製したＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化し、これらの制限酵素により事前に消化したプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献５）とライゲーションし（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、タカラバイオ社製）、５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを添加したＬＢ寒天培地を用いて大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。
（３）（２）の形質転換体を５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを含むＬＢ培地により培養（３７℃、１８時間）し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）によりプラスミドを抽出した。
（４）抽出プラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化し、０．９％のアガロース電気泳動に供した。
【００１７】
結果、インサートサイズから設計通りであることを確認し、これをｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒとした。図２にｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒの構造概略を示す。
【００１８】
実施例２ 可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドの配列確認
実施例１で作製したｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒプラスミド（図２）に挿入されている、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）において解析した。なお、配列番号４（５’−ＡＧＣＴＧＴＡＴＧＧＧＧＴＣＡＣＴＴＣＧ−３’）と配列番号５（５’−ＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＣ−３’）と配列番号６（５’−ＡＧＴＧＧＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＴＧＣ−３’）と配列番号７（５’−ＡＧＧＡＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣ−３’）に示すオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００１９】
解析の結果、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒに挿入されている可溶性ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡの塩基配列は設計通りであることを確認した。
【００２０】
実施例３ 可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの抗体結合活性の確認
ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒプラスミド（図２）をリポフェクトアミン（インビトロジェン社製）によりＣＯＳ７細胞に導入し、１０％ ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養することで（３７℃、３日間）、一過的に細胞外へヒト型ＦｃγＲＩを発現させ、培養後、培養液を回収した。回収した培養上清の抗体結合活性を以下の方法でＥＬＩＳＡ法により評価した。
（１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に１００μｇ／ｍＬから段階的に希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置することによりガンマグロブリンを固相に固定化した。
（２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を行なった。
（３）ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、調製した培養上清を１００μＬ添加し、（１）で固定化したヒトガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。
（４）（３）の反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（５）（４）の反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２１】
評価結果を図３に示す。図３の通り、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒにより形質転換されたＣＯＳ細胞の培養上清に抗体結合活性が検出された。すなわち、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒに挿入された可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列により、細胞膜貫通領域が欠失したヒト型ＦｃγＲＩを得ることができ、かつ、当該ＦｃγＲＩはヒト抗体に結合活性を保持していることを示している。
【００２２】
実施例４ 可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを発現するＣＨＯ細胞の作製
ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒ（図２）をＣｈｅｎらの方法（非特許文献６）により、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞株ＤＢＸ−１１（非特許文献７）に導入することで可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを発現するＣＨＯ細胞を作製し、ＭＴＸ（メソトレキセート）を用いて前記細胞のスクリーニングを行なった。
（１）上記発現プラスミドが導入されたＤＢＸ−１１株を５ｎＭのＭＴＸを含む培地で培養し、増殖した細胞株をモノクローナル化し実施例３と同様な方法で活性を評価した。
（２）最も活性の強い株について、さらに、５０ｎＭ ＭＴＸを含む培地で培養し、耐性を獲得した増殖株の活性を評価した。
（３）（２）の操作を繰り返すことにより、最終的に初期のＭＴＸ濃度に対して１０００倍となる５μＭ ＭＴＸ存在下においても増殖する細胞宿主、すなわち、ＭＴＸ耐性を獲得することと連動してＦｃγＲＩ遺伝子が高度に集積された細胞株を分離した。
【００２３】
最終スクリーニング結果を図４に示す。図４の通り、モノクローナル化された任意のＣＨＯ細胞株の培養上清中から可溶性ヒト型ＦｃγＲＩが検出された。
【００２４】
実施例５ 可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現細胞を用いたＦｃγＲＩ生産
実施例４の細胞のうち、ヒト型ＦｃγＲＩ発現量が最も多いＭ５ｕ−１２Ｄ株を用いて、以下の方法でヒト型ＦｃγＲＩ生産を行なった。
（１）Ｍ５ｕ−１２Ｄ株を高密度培養システムＢｅｌｌｏＣｅｌｌ（ＣＥＳＣＯ社製）を用いて、５％ 透析牛胎児血清入りＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）で細胞が密な状態まで培養した。
（２）培養後、培地を除き、５％ 透析牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）／ＥｘＣｅｌｌ３０２（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）の１対１混合培地で培養した。（３）栄養源が枯渇する前に培養上清を回収し、新たな培地と交換した。
（４）（２）から（３）の操作を繰り返して合計１０Ｌの可溶性ＦｃγＲＩ含有培養上清を得た。
【００２５】
実施例６ 可溶性ＦｃγＲＩの分離精製
実施例５で得られた可溶性ＦｃγＲＩ培養上清を、以下の方法で分離精製した。
（１）実施例５で得られた可溶性ＦｃγＲＩ培養上清１０Ｌを、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で透析し脱塩処理を施した。
（２）２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化した３００ｍＬのＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＳＰゲル（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を備えた吸着流動床システム（ＧＥヘルスケバイオサイエンス社製）に添加し、同緩衝液で洗浄後、１０％グリセロール、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）により溶出し、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ濃縮画分を調製した。
（３）（２）で得られた可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ濃縮画分を、２０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に透析し、同緩衝液で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＳカラム（ＧＥヘルスケバイオサイエンス社製）に添加し、洗浄後、５００ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出することで、可溶性ＦｃγＲＩ精製標品を１０ｍｇ得た。なお、タンパク質濃度の定量は、イムノグロブリンを標準タンパク質としてブラッドフォード法に基づくプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行なった。
【００２６】
図５にＨｉｓＴｒａｐ ＨＳカラムのクロマトパターンを、図６に精製標品のＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷのクロマトパターンを示す。図６の通り、培養上清からの不純物が除かれ、高純度に精製された可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの構造を示す図。ＳＳはシグナルペプチド、ＥＣは細胞外部分、ＴＭは膜貫通領域部分、Ｃは細胞内部分をそれぞれコードする領域を示す。図の上部の数字は、それぞれの領域のＤＮＡがコードするアミノ酸数を示す。
【図２】発現プラスミドｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒの構造を示す図。
【図３】発現プラスミドｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒを導入したＣＯＳ細胞培養上清中の抗体結合活性を示す図。横軸は固定化抗体濃度、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度である。
【図４】可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現ＣＨＯ細胞のスクリーニング結果を示す図。横軸はスクリーニング対象のＣＨＯ細胞株、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を表す。
【図５】精製クロマトパターンを示す図。横軸はニッケルキレートクロマトの溶出時間、縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度である。図中、矢印の位置が可溶性ＦｃγＲＩ溶出フラクションに対応する。
【図６】可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの精製標品のゲルろ過法による純度検定結果を示す図。横軸はゲルろ過クロマトの溶出時間、縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度である。図中、矢印が可溶性ヒト型ＦｃγＲＩである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工学的手法により得られた、ヒト型Ｆｃレセプターを発現する細胞、および前記細胞を用いたヒト型Ｆｃレセプターの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターとは免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、あるいは、同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の結合ドメインによって認識する。これによって一定の免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる（非特許文献１）。Ｆｃレセプターは、さらに、サブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。なかでも、ＦｃγＲＩとＩｇＧの結合親和性は高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩはＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであり、単球とマクロファージ上に構成的に発現され、好中球および好酸球上においては誘導的に発現される。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域の境界にあるアミノ酸システインを介した共有結合によりホモダイマーを形成している（非特許文献１）。
【０００３】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に、自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。
【０００４】
ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列は非特許文献３により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）あるいは動物細胞を利用した発現が報告されている（非特許文献４）。
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の大腸菌を利用した発現系ではＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量が極めて低く、また、発現したタンパク質は菌体内発現のため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化等の操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、非特許文献４に記載の動物細胞を用いた系では、ＦｃγＲＩの菌体外ドメイン遺伝子をｐＭＳベクターに導入し、それをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に形質転換させることで細胞外にＦｃγＲＩを発現させているが、一過性の発現のため、ＦｃγＲＩの工業的な生産には不向きであった。
【０００６】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９
【非特許文献４】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【非特許文献５】Ｙａｓｕｋａｗａ Ｋ．等、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０８，６７３，１９９０
【非特許文献６】Ｃ．Ｃｈｅｎ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，２７４５，１９８７
【非特許文献７】Ｇ．Ｕｒｌａｎｄ等，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７７，４２１６，１９８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本発明は、前記問題点を解決し、遺伝子工学手法を用いてヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを安定的に発現可能な細胞、およびそれを用いたヒト型ＦｃγＲＩの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
（１）可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを形質転換することにより得られる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを安定的に発現するＣＨＯ細胞。
（２）可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全ＤＮＡ配列のうち膜貫通領域を除去した配列であることを特徴とする、（１）に記載の細胞。
（３）可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全ＤＮＡ配列のうち膜貫通領域を除去した配列中の少なくとも１塩基が他のヌクレオチドに置換、および／または欠失、および／または付加されている配列であることを特徴とする、（１）に記載の細胞。
（４）発現プラスミドがＳＶ４０プロモーター系に由来するＤＮＡ配列を含んでいることを特徴とする、（１）から（３）に記載の細胞。
（５）発現プラスミドがさらにジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含んでいることを特徴とする、（４）に記載の細胞。
（６）（１）から（５）に記載の細胞を用いることを特徴とする、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列
本発明の細胞を取得する際に用いる、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列は、報告されているヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列に適当な修飾を加えることで、本来なら膜タンパク質であるＦｃγＲＩを細胞外に分泌させることが可能なＤＮＡ配列である。前記適当な修飾法としては、終止コドンを細胞外領域あるいは膜貫通領域に挿入する方法、膜貫通領域を除去する方法が例示できるが、膜貫通領域を除去する方法が好ましい。配列番号１にはヒト型ＦｃγＲＩの全アミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が示されており、このアミノ酸中、細胞外領域はアミノ酸番号１から２７７番のアミノ酸配列に相当し、膜貫通領域は２７８番から２９９番目のアミノ酸配列に相当する（略図を図１に示す）。前記細胞外領域あるいは膜貫通領域に終止コドンを挿入することは、インビトロミュータジェネシス（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような、ＤＮＡに突然変異を挿入するための市販のキットを用いて行なうことができ、前記膜貫通領域を除去することも、前記市販のキットを用いて行なうことができる。また、適当なオリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲ法により、前記細胞外領域あるいは膜貫通領域に終止コドンを挿入したもの、または前記膜貫通領域を除去したものを調製してもよい。
【００１０】
また、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全塩基配列のうち膜貫通領域を除去した配列中の少なくとも１塩基が他のヌクレオチドに置換、および／または欠失、および／または付加されている配列であっても、宿主細胞から分泌され、かつ、ヒト型ＦｃγＲＩの活性を保持するものは前記ＤＮＡ配列を有しているものとみなすことができる。ヌクレオチド配列の置換としては、あるアミノ酸をコードするヌクレオチドから別のアミノ酸をコードするヌクレオチドへの変換を例示することができる。なお、前記ＤＮＡ配列はヒト型ＦｃγＲＩのｃＤＮＡ等を出発材料として作製してもよいし、人工的に合成してもよい。
【００１１】
さらに、前記ＤＮＡ配列中には、発現した可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの簡便な精製を目的に、タグ配列を付加させてもよい。タグ配列とはヒトＦｃγＲＩに限らず、遺伝子工学に多用されるオリゴアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ポリヒスチジンタグ、Ｃ−ｍｙｃタグを例示することができる。タグ配列の付加は前記ＤＮＡ配列の５’末端側、３’末端側いずれもよい。
２．発現プラスミド
本発明の細胞を取得する際に用いる可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡを発現させる、すなわち可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを発現し得る複製可能な発現プラスミドは、前項で説明した可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列を発現させるためのＤＮＡ配列および宿主中でプラスミドＤＮＡを複製するための複製起点を有し、かつ、選定された宿主を形質転換できるものであれば、適宜選定し使用できる。前記ＤＮＡ配列を発現させるためのＤＮＡ配列としては、乳糖プロモータ系、トリプトファンプロモータ系、ＧＡＬ４プロモータ系、ＳＶ４０プロモータ系、アデノウイルスプロモータ系に由来する配列が例示でき、宿主との関係において適宜選定すればよいが、本発明の細胞株を取得する際に用いるプロモータ系としては、ＳＶ４０プロモータ系に由来する配列が好ましい。また、これらのプラスミドを用いて形質転換する操作にあたり、プラスミドが導入されなかった宿主と導入された宿主との選別を可能にするために、発現プラスミド中にアンピシリンといった薬剤に対する耐性を宿主に付与するためのＤＮＡ配列を含んでいるのが好ましい。
３．宿主
本発明の宿主としては、安定的にタンパク質を発現可能なＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣細胞）が好ましい。
【００１２】
また、前記宿主に、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含んだ発現プラスミドを導入し、さらに特定の薬剤に対する耐性も付与した細胞について、薬剤に対する耐性の強さから前記細胞のスクリーニングを行なうことで、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを高発現する細胞を得ることができる。前記スクリーニングにおいて、薬剤としてはメソトレキセート（ＭＴＸ）、耐性濃度としては数μＭ以上がそれぞれ好ましい。ＭＴＸに対する耐性の付与方法は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）を可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列と同一の発現プラスミドに挿入すればよい。
４．可溶性ＦｃγＲＩの精製
本発明の細胞を用いて提供される、遺伝子工学的方法により生産された可溶性ヒト型ＦｃγＲＩは、生産に用いた培養液、あるいは培養上清中から、通常の生理活性タンパク回収法によって分離精製することができる。分離回収方法としては、市販のＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィーを例示することできる。また、培養液中から前記タンパクを生産する際に、培養液中の他のタンパク質の減少、例えば、培養細胞を無血清培地で培養して前記タンパクを発現させることにより分離回収の効率を高めることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明で提供される、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを形質転換して得られた、安定的にＦｃγＲＩを発現可能なＣＨＯ細胞を用いて、ヒト型ＦｃγＲＩの生産を行ない、該タンパクを分離回収することにより、自然状態では極めて微量にしか生産されないＦｃγＲＩと同等のものである可溶性ＦｃγＲＩを工業的に製造することが可能である。本発明の細胞を用いて製造されたヒト型ＦｃγＲＩは、個体発生および免疫機構の研究、さらにはそれらの成果に基づく治療診断薬等の開発に大きな意義を持つ。また、抗ＦｃγＲＩ抗体を作製するための免疫源、さらにはＦｃγＲＩの免疫化学測定方法の標準物質として用いることもできる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実施例１ 可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドの作製
可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドの作製は、以下の方法で行なった。
（１）可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡを以下の方法で調製した。
（１−１）Ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ＳＣ１１９８４１プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）をテンプレートとし、配列番号２（５’−ＧＡ［ＡＧＡＴＣＴ］ＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＣ−３’：角かっこ部分は制限酵素ＢｇｌＩＩサイト）と配列番号３（５’−ＣＧ［ＴＣＴＡＧＡ］ＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣ−３’：角かっこ部分は制限酵素ＸｂａＩサイト）のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した。なお、ＦｃγＲＩタンパク質の調製および定量を行なうために、発現タンパク質のＣ末端側にポリヒスチジンタグが付加されるようにＰＣＲプライマーを作製した。
（１−２）ＰＣＲ反応を、９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６５℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に、７２℃・７分の条件で行なった。反応液組成を表１に示す。
【００１６】
【表１】
（１−３）ＰＣＲ反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動にて、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認した。
（１−４）目的産物に相当するＤＮＡバンドをアガロースゲルから抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社製）し、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡを調製した。
（２）（１）で調製したＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化し、これらの制限酵素により事前に消化したプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献５）とライゲーションし（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、タカラバイオ社製）、５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを添加したＬＢ寒天培地を用いて大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。
（３）（２）の形質転換体を５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを含むＬＢ培地により培養（３７℃、１８時間）し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）によりプラスミドを抽出した。
（４）抽出プラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化し、０．９％のアガロース電気泳動に供した。
【００１７】
結果、インサートサイズから設計通りであることを確認し、これをｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒとした。図２にｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒの構造概略を示す。
【００１８】
実施例２ 可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドの配列確認
実施例１で作製したｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒプラスミド（図２）に挿入されている、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）において解析した。なお、配列番号４（５’−ＡＧＣＴＧＴＡＴＧＧＧＧＴＣＡＣＴＴＣＧ−３’）と配列番号５（５’−ＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＣ−３’）と配列番号６（５’−ＡＧＴＧＧＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＴＧＣ−３’）と配列番号７（５’−ＡＧＧＡＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣ−３’）に示すオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００１９】
解析の結果、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒに挿入されている可溶性ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡの塩基配列は設計通りであることを確認した。
【００２０】
実施例３ 可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの抗体結合活性の確認
ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒプラスミド（図２）をリポフェクトアミン（インビトロジェン社製）によりＣＯＳ７細胞に導入し、１０％ ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養することで（３７℃、３日間）、一過的に細胞外へヒト型ＦｃγＲＩを発現させ、培養後、培養液を回収した。回収した培養上清の抗体結合活性を以下の方法でＥＬＩＳＡ法により評価した。
（１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に１００μｇ／ｍＬから段階的に希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置することによりガンマグロブリンを固相に固定化した。
（２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を行なった。
（３）ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、調製した培養上清を１００μＬ添加し、（１）で固定化したヒトガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。
（４）（３）の反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（５）（４）の反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２１】
評価結果を図３に示す。図３の通り、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒにより形質転換されたＣＯＳ細胞の培養上清に抗体結合活性が検出された。すなわち、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒに挿入された可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列により、細胞膜貫通領域が欠失したヒト型ＦｃγＲＩを得ることができ、かつ、当該ＦｃγＲＩはヒト抗体に結合活性を保持していることを示している。
【００２２】
実施例４ 可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを発現するＣＨＯ細胞の作製
ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒ（図２）をＣｈｅｎらの方法（非特許文献６）により、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞株ＤＢＸ−１１（非特許文献７）に導入することで可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを発現するＣＨＯ細胞を作製し、ＭＴＸ（メソトレキセート）を用いて前記細胞のスクリーニングを行なった。
（１）上記発現プラスミドが導入されたＤＢＸ−１１株を５ｎＭのＭＴＸを含む培地で培養し、増殖した細胞株をモノクローナル化し実施例３と同様な方法で活性を評価した。
（２）最も活性の強い株について、さらに、５０ｎＭ ＭＴＸを含む培地で培養し、耐性を獲得した増殖株の活性を評価した。
（３）（２）の操作を繰り返すことにより、最終的に初期のＭＴＸ濃度に対して１０００倍となる５μＭ ＭＴＸ存在下においても増殖する細胞宿主、すなわち、ＭＴＸ耐性を獲得することと連動してＦｃγＲＩ遺伝子が高度に集積された細胞株を分離した。
【００２３】
最終スクリーニング結果を図４に示す。図４の通り、モノクローナル化された任意のＣＨＯ細胞株の培養上清中から可溶性ヒト型ＦｃγＲＩが検出された。
【００２４】
実施例５ 可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現細胞を用いたＦｃγＲＩ生産
実施例４の細胞のうち、ヒト型ＦｃγＲＩ発現量が最も多いＭ５ｕ−１２Ｄ株を用いて、以下の方法でヒト型ＦｃγＲＩ生産を行なった。
（１）Ｍ５ｕ−１２Ｄ株を高密度培養システムＢｅｌｌｏＣｅｌｌ（ＣＥＳＣＯ社製）を用いて、５％ 透析牛胎児血清入りＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）で細胞が密な状態まで培養した。
（２）培養後、培地を除き、５％ 透析牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）／ＥｘＣｅｌｌ３０２（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）の１対１混合培地で培養した。（３）栄養源が枯渇する前に培養上清を回収し、新たな培地と交換した。
（４）（２）から（３）の操作を繰り返して合計１０Ｌの可溶性ＦｃγＲＩ含有培養上清を得た。
【００２５】
実施例６ 可溶性ＦｃγＲＩの分離精製
実施例５で得られた可溶性ＦｃγＲＩ培養上清を、以下の方法で分離精製した。
（１）実施例５で得られた可溶性ＦｃγＲＩ培養上清１０Ｌを、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で透析し脱塩処理を施した。
（２）２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化した３００ｍＬのＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＳＰゲル（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を備えた吸着流動床システム（ＧＥヘルスケバイオサイエンス社製）に添加し、同緩衝液で洗浄後、１０％グリセロール、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）により溶出し、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ濃縮画分を調製した。
（３）（２）で得られた可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ濃縮画分を、２０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に透析し、同緩衝液で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＳカラム（ＧＥヘルスケバイオサイエンス社製）に添加し、洗浄後、５００ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出することで、可溶性ＦｃγＲＩ精製標品を１０ｍｇ得た。なお、タンパク質濃度の定量は、イムノグロブリンを標準タンパク質としてブラッドフォード法に基づくプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行なった。
【００２６】
図５にＨｉｓＴｒａｐ ＨＳカラムのクロマトパターンを、図６に精製標品のＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷのクロマトパターンを示す。図６の通り、培養上清からの不純物が除かれ、高純度に精製された可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの構造を示す図。ＳＳはシグナルペプチド、ＥＣは細胞外部分、ＴＭは膜貫通領域部分、Ｃは細胞内部分をそれぞれコードする領域を示す。図の上部の数字は、それぞれの領域のＤＮＡがコードするアミノ酸数を示す。
【図２】発現プラスミドｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒの構造を示す図。
【図３】発現プラスミドｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒを導入したＣＯＳ細胞培養上清中の抗体結合活性を示す図。横軸は固定化抗体濃度、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度である。
【図４】可溶性ヒト型ＦｃγＲＩ発現ＣＨＯ細胞のスクリーニング結果を示す図。横軸はスクリーニング対象のＣＨＯ細胞株、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を表す。
【図５】精製クロマトパターンを示す図。横軸はニッケルキレートクロマトの溶出時間、縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度である。図中、矢印の位置が可溶性ＦｃγＲＩ溶出フラクションに対応する。
【図６】可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの精製標品のゲルろ過法による純度検定結果を示す図。横軸はゲルろ過クロマトの溶出時間、縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度である。図中、矢印が可溶性ヒト型ＦｃγＲＩである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを形質転換することにより得られる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを安定的に発現するＣＨＯ細胞。
【請求項２】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全ＤＮＡ配列のうち膜貫通領域を除去した配列であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全ＤＮＡ配列のうち膜貫通領域を除去した配列中の少なくとも１塩基が他のヌクレオチドに置換、および／または欠失、および／または付加されている配列であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
発現プラスミドがＳＶ４０プロモーター系に由来するＤＮＡ配列を含んでいることを特徴とする、請求項１から３に記載の細胞。
【請求項５】
発現プラスミドがさらにジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含んでいることを特徴とする、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
請求項１から５に記載の細胞を用いることを特徴とする、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【請求項１】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを形質転換することにより得られる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを安定的に発現するＣＨＯ細胞。
【請求項２】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全ＤＮＡ配列のうち膜貫通領域を除去した配列であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするＤＮＡ配列が、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの全ＤＮＡ配列のうち膜貫通領域を除去した配列中の少なくとも１塩基が他のヌクレオチドに置換、および／または欠失、および／または付加されている配列であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
発現プラスミドがＳＶ４０プロモーター系に由来するＤＮＡ配列を含んでいることを特徴とする、請求項１から３に記載の細胞。
【請求項５】
発現プラスミドがさらにジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含んでいることを特徴とする、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
請求項１から５に記載の細胞を用いることを特徴とする、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−２７８９４８（Ｐ２００９−２７８９４８Ａ）
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３６３８１（Ｐ２００８−１３６３８１）
【出願日】平成２０年５月２６日（２００８．５．２６）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２６日（２００８．５．２６）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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