ヒト幹細胞を肝細胞へと分化誘導する化合物

【課題】間葉系幹細胞から肝細胞への分化を誘導する有効な低分子化合物を選択し、間葉系幹細胞から肝細胞への分化効率に優れる安全な分化誘導法を開発する。
【解決手段】間葉系幹細胞の肝細胞への分化誘導剤であって、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を含む、分化誘導剤。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞の肝細胞への分化誘導剤、それを用いる肝細胞の生産方法、その生産方法による肝細胞、肝組織および肝臓に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓病はわが国の国民病と言われ、多数の患者が肝臓病に苦しんでいる。また、肝細胞癌による年間死亡者数は約３万４千人に上る。最近では肝細胞癌は治療法の進歩により治療成績が向上しているが、進行癌の増加に伴い、合併する肝硬変の肝機能低下による、いわゆる肝不全死が増加している。肝不全治療は、肝移植が理想的であるが、わが国では十分なドナーを得ることは困難であり、幹細胞による肝再生治療の開発が必要である。
【０００３】
肝細胞への分化する可能性のある幹細胞として、骨髄細胞、臍帯血細胞などの組織幹細胞が期待できる。そのため、多くの研究機関が、慢性肝不全患者への肝細胞移植治療による再生医療の実現のため、ヒト組織幹細胞を機能性肝細胞へ分化させる、真に臨床応用可能な効率的な分化誘導技術を開発することを目標に研究開発を行っている。
【０００４】
例えば、鳥取大学医学研究科の汐田教授の研究室では、ヒト間葉系幹細胞から肝細胞への分化誘導時にＷｎｔ／β−カテニン経路が抑制されており、この経路をＲＮＡ干渉により抑制すれば肝細胞へ分化することを報告している（非特許文献１および非特許文献３〜５）。また、他の研究機関でも同様の分野の研究が行われている（非特許文献２、特許文献１〜２）。
【０００５】
一方、最近、４，０００種類以上の大規模化合物ライブラリーのスクリーニングから、Ｗｎｔ／β−カテニン経路抑制性の低分子化合物５種類が同定されている（非特許文献６〜９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５３５０３５号公報
【特許文献２】特開２０１０−７５６３１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Atsushi Yanagitani et al., “Retinoic Acid Receptor Dominant Negative Form Causes Steatohepatitis and Liver Tumors in Transgenic Mice”, HEPATOLOGY, Vol. 40, No. 2, 2004, p. 366-375
【非特許文献２】Seoyoung Park et al., “Hexachlorophene Inhibits Wnt/β-Catenin Pathway by Promoting Siah-Mediated β-Catenin Degradation”, Mol Pharmacol Vol. 70, No. 3, 960?966, 2006
【非特許文献３】Yoko Yoshida et al., “A role of Wnt/β-catenin signals in hepatic fate specification of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells”, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 293: G1089?G1098, 2007
【非特許文献４】Shimomura T et al., “Hepatic differentiation of human bone marrow-derived UE7T-13 cells: Effects of cytokines and CCN family gene expression”, Hepatol Res., 37, 1068-79, 2007
【非特許文献５】Ishii K et al., “Hepatic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by tetracycline-regulated hepatocyte nuclear factor 3beta” Hepatology, 48, 597-606, 2008
【非特許文献６】Maina Lepourcelet et al., “Small-molecule antagonists of the oncogenic Tcf/β-catenin protein complex”, CANCER CELL, JANUARY 2004, VOL. 5, 91-102
【非特許文献７】Emami KH et al., “A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription”, Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Aug 24;101(34):12682-7.
【非特許文献８】Jufang Shan et al., “Identification of a Specific Inhibitor of the Dishevelled PDZ Domain”, Biochemistry. 2005 Nov 29; 44 (47): 15495-503
【非特許文献９】Trosset JY et al., “Inhibition of protein-protein interactions: the discovery of druglike beta-catenin inhibitors by combining virtual and biophysical screening”, Proteins. 2006 Jul 1; 64 (1): 60-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
第一に、特許文献１〜２では、非肝幹細胞から幹細胞を誘導するための蛋白質について説明されているが、分化誘導剤として蛋白製剤を用いているため、安定性・安全性などの面でさらなる改善の余地があった。
【０００９】
第二に、非特許文献１および非特許文献３〜５では、ヒト間葉系幹細胞から肝細胞への分化誘導時にＷｎｔ／β−カテニン経路が抑制されており、この経路をＲＮＡ干渉により抑制すれば肝細胞へ分化することを報告しているが、分化誘導剤としてＳｉＲＮＡを用いているため、同様に安定性・安全性などの面でさらなる改善の余地があった。
【００１０】
第三に、非特許文献２では、ヘキサクロロフェンがＷｎｔ／β−カテニン経路を抑制するか検討しているが、ヘキサクロロフェンがヒト間葉系幹細胞から肝細胞への分化を誘導するか検討していない。そのため、非特許文献２を参照しても、ヘキサクロロフェンがヒト間葉系幹細胞から肝細胞への分化を誘導するかどうかについては不明である。
【００１１】
第四に、非特許文献６〜９では、５種類の低分子化合物がＷｎｔ／β−カテニン経路を抑制するか検討しているが、５種類の低分子化合物がヒト間葉系幹細胞から肝細胞への分化を誘導するか検討していない。そのため、非特許文献６〜９を参照しても、５種類の低分子化合物がヒト間葉系幹細胞から肝細胞への分化を誘導するかどうかについては不明である。
【００１２】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、間葉系幹細胞から肝細胞への分化を誘導する有効な低分子化合物を選択し、間葉系幹細胞から肝細胞への分化効率に優れる安全な分化誘導法を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、間葉系幹細胞の肝細胞への分化誘導剤であって、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を含む、分化誘導剤が提供される。
【００１４】
この構成によれば、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を用いるので、蛋白製剤や核酸製剤に比べ安定性・安全性などの面で優れており、間葉系幹細胞から肝細胞への分化効率に優れる安全な分化誘導法を実現できる。
【００１５】
また、本発明によれば、間葉系幹細胞から肝細胞を生産する方法であって、間葉系幹細胞を上記の分化誘導剤で処理する工程を含む、生産方法が提供される。
【００１６】
この方法によれば、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を用いるので、蛋白製剤や核酸製剤に比べ安定性・安全性などの面で優れており、間葉系幹細胞から肝細胞への分化誘導を効率よく安全に行うことができる。
【００１７】
また、本発明によれば、間葉系幹細胞から分化誘導された肝細胞であって、間葉系幹細胞を上記の分化誘導剤で処理してなる、肝細胞が提供される。
【００１８】
この幹細胞は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を用いて間葉系幹細胞から分化誘導されるので、蛋白製剤や核酸製剤を用いて分化誘導される場合に比べ製造時の安定性・安全性などの面で優れている。
【００１９】
また、本発明によれば、再生医療用の肝組織または肝臓であって、上記の肝細胞を含む肝組織または肝臓が提供される。
【００２０】
この肝組織または肝臓は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を用いて間葉系幹細胞から分化誘導される幹細胞を用いるので、蛋白製剤や核酸製剤を用いて分化誘導される幹細胞を用いる場合に比べ製造時の安定性・安全性などの面で優れているため、再生医療用の肝組織または肝臓として好適に使用できる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を用いるので、蛋白製剤や核酸製剤に比べ安定性・安全性などの面で優れており、間葉系幹細胞から肝細胞への分化誘導を効率よく安全に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】β−ｃａｔｅｎｉｎ／ＴＣＦ４／ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定発現するヒト間葉系幹細胞の樹立方法について説明するための概念図である。
【図２】ヘキサクロロフェンによる細胞増殖能およびＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ活性への影響を説明するためのグラフである。
【図３】ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導について説明するための電気泳動写真である。
【図４】ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導（ｄａｙ８）について説明するための蛍光顕微鏡写真である。
【図５】ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導（ｄａｙ１６）について説明するための蛍光顕微鏡写真である。
【図６】ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導能（ＰＡＳ染色）について説明するための顕微鏡写真である。
【図７】ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導能について説明するためのグラフである。
【図８】ヘキサクロロフェンによる分化誘導サンプルの尿素合成能（ｄａｙ８）について説明するためのグラフである。
【図９】ヘキサクロロフェンによる分化誘導サンプルの尿素合成能（ｄａｙ１６）について説明するためのグラフである。
【図１０】ケルセチンによる細胞増殖能およびＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ活性への影響（ＵＥ７Ｔ−１３）について説明するためのグラフである。
【図１１】ケルセチンによる肝細胞分化誘導能（ＵＥ７Ｔ−１３）について説明するための電気泳動写真である。
【図１２】ケルセチンによる細胞増殖能およびＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ活性への影響（ＵＣＢＴＥＲＴ細胞）について説明するためのグラフである。
【図１３】ケルセチンによる肝細胞分化誘導能（ＵＣＢＴＥＲＴ細胞）について説明するための電気泳動写真である。
【図１４】ケルセチンによる肝細胞分化誘導（ＵＣＢＴＥＲＴ細胞）について説明するための電気泳動図である。
【図１５】ケルセチンによる肝細胞分化誘導（ｄａｙ２４）について説明するための蛍光顕微鏡写真である。
【図１６】ケルセチンによる肝細胞分化誘導について説明するためのグラフである。
【図１７】ケルセチンによる細胞分化：尿素合成能（ｄａｙ２４）について説明するためのグラフである。
【図１８】イオノマイシンによる細胞増殖能およびＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ活性への影響について説明するためのグラフである。
【図１９】ＰＫＦ−１１５−５８４による細胞増殖能およびＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ活性への影響（ＵＣＢＴＥＲＴ細胞）について説明するためのグラフである。
【図２０】ＰＫＦ−１１５−５８４の肝細胞分化誘導について説明するための電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜間葉系幹細胞の肝細胞への分化誘導剤＞
本実施形態に係る間葉系幹細胞の肝細胞への分化誘導剤は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を含む、分化誘導剤である。この構成によれば、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を用いるので、蛋白製剤や核酸製剤に比べ安定性・安全性などの面で優れており、間葉系幹細胞から肝細胞への分化効率に優れる安全な分化誘導法を実現できる。
【００２４】
本明細書において、「間葉系幹細胞」（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）とは、間葉に由来する体性幹細胞を含む。この間葉系幹細胞は、間葉系に属する細胞への分化能をもつ。この間葉系幹細胞は、近年の骨や血管、心筋の再構築などの再生医療への応用が期待されている。
【００２５】
「間葉系幹細胞」（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）には、例えば、骨髄間葉系細胞および臍帯血由来幹細胞が含まれる。間葉系幹細胞は間葉系組織のあるすべての組織に存在すると考えられているが、間葉系組織のなかでも骨髄間葉系幹細胞は、骨髄穿刺で容易に採取でき、培養技術も確立されている。骨髄間葉系幹細胞は骨髄間質細胞の中に含まれており、骨髄間質細胞は骨髄の中で主体となる造血細胞を支える細胞の一種である。一方、臍帯血（さいたいけつ）とは、胎児と母体を繋ぐ胎児側の組織であるへその緒（臍帯；さいたい）の中に含まれる血液を含む。この臍帯血のなかには、臍帯血由来幹細胞（造血幹細胞）が多量に含まれていることが知られている。最近、造血幹細胞以外の体性幹細胞である間葉系幹細胞（臍帯血由来の間葉性幹細胞）が臍帯血中から見出されている。これまで間葉系幹細胞は骨髄中に存在することが報告されていたが、骨髄だけでなく臍帯血も間葉系幹細胞の供給源として、骨や軟骨の組織工学的修復あるいは再生医療への臨床応用へ適用できる可能性が示されている。ここで、間葉系幹細胞は一般にライフスパンが短く、ｉｎｖｉｔｒｏでの長期培養は必ずしも容易ではないが、既にｈＴＥＲＴ遺伝子などを導入し、安定に増殖しうるヒト骨髄由来およびヒト臍帯血由来間葉系幹細胞株が樹立されている。これらの細胞は、安定に増殖するが、染色体異常がなく、コンタクトインヒビションが機能し、免疫抑制動物に移植しても腫瘍を形成しない。また、細胞分化に影響しないことから、間葉系幹細胞の分化研究に有用な細胞である。
【００２６】
また、本明細書において、「肝細胞」（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）とは、肝臓を構成する７０−８０％を構成する約２０μｍ大の細胞を含む。肝細胞はタンパク質の合成と貯蔵、炭水化物の変換、コレステロール、胆汁酸、リン脂質の合成、並びに、内生および外生物質の解毒、変性、排出に関与する。また胆汁の生成と分泌を促進する働きも持つ。
【００２７】
本明細書において、「分化」とは、多細胞生物において個々の細胞が構造機能的に変化することを含む。一般的に、多細胞生物の幹細胞から機能性細胞への分化は往々にして不可逆なケースが多い。これまでの知見では、間葉系幹細胞は、分化多能性（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を持つとされており、分化可能な細胞系列が限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力を指す。そのため、一般的に胚葉を超えた分化は行えないが、本実施形態に係る間葉系幹細胞の肝細胞への分化誘導剤は、間葉系幹細胞から肝細胞への胚葉を超えた分化を誘導する点に大きな技術的な特徴があると言える。
【００２８】
一般的に、肝再生医療の細胞ソースとして、肝幹細胞を用いるのが自然であるが、肝幹細胞は劇症肝炎などの重症肝障害時にしか出現しないことから、実際の患者からの採取は現実性が低い。そこで、肝臓以外の組織幹細胞やｉＰＳ細胞が、肝再生医療の細胞ソースとなると考えられる。近年、間葉系幹細胞はｉｎｖｉｔｒｏの条件下で、ある程度の肝機能をもつ細胞に分化しうることが報告されている。すなわち、間葉系幹細胞に種々のサイトカインを添加し、約４週間培養し肝細胞様に分化したと報告されている。間葉系幹細胞は骨髄、腰帯血などに存在し、比較的採取が容易である。骨髄は自己細胞を用いることで免疫拒絶反応を回避できる利点がある。また、臍帯血は通常廃棄されるため、倫理的問題が少ないというメリットがある。以上より、間葉系幹細胞は肝再生医療の有望な細胞ソースといえる
【００２９】
本明細書において、「Ｗｎｔ／β−カテニン経路」とは、脊椎動物および無脊椎動物の発生における細胞運命決定を調節している経路の一種を含む。Ｗｎｔリガンドは分泌性の、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合する糖タンパクであり、それによりシグナルカスケードを惹起し、結果として、ＡＰＣ／Ａｘｉｎ／ＧＳＫ−３β複合体から多機能性キナーゼ：ＧＳＫ−３βを解離させる。Ｗｎｔシグナルがない場合（オフ状態）は、転写共役因子であり、細胞間接着に必須のアダプター蛋白でもあるβ−カテニンが、ＡＰＣ／Ａｘｉｎ／ＧＳＫ−３β複合体による分解標的となる。ＣＫ１とＧＳＫ−３βの協調作用により適切にリン酸化されると、β−カテニンはユビキチン化され、β−ＴｒＣＰ／ＳＫＰ複合体を介してプロテオゾームでの分解を受ける。
【００３０】
Ｗｎｔが結合した場合（オン状態）は、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）が、一見、少なくとも部分的にはリン酸化されることで活性化し、次いで、分解誘導複合体からＧＳＫ−３βを引き離す。これが、β−カテニンレベルを安定、核内輸送、さらにはＬＥＦ／ＴＣＦのＤＮＡ結合因子へのリクルートメントを促し、そこで、β−カテニンはＧｒｉｕｃｈｏ−ＨＤＡＣ補助抑制因子と置き換わり、転写活性化因子として作用する。
【００３１】
さらには、ホメオドメイン因子であるＰｒｏｐ１との複合体において、β−カテニンは、転写抑制複合体と同様に状況依存的な活性化により作用することが示されている。重要なのは、いくつかのヒトの癌では、β−カテニンに、制御不能の安定化につながる点変異が見つかり、また、ＡＰＣとａｘｉｎにおいても同様に変異が報告され、この経路の異常な活性化とヒト腫瘍との関連性が強調されていることである。発生過程において、Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、多くの異なる細胞種や組織において、レチノイン酸、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰなどの多様な経路からのシグナルを統合する役目を担う。さらに、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の構成単位であるＧＳＫ−３βは、グリコーゲン代謝や他の主要な経路においても関連しており、それを阻害することが糖尿病や神経変性疾患には妥当な対処法とされる。
【００３２】
本明細書において、「低分子量有機化合物」（ｌｏｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｒｇａｎｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄ）とは、分子量２０００以下の有機化合物を含む。好ましくは、この分子量は１０００以下であり、特に好ましくは９００以下であり、最も好ましくは８００以下である。なぜなら、いわゆる核酸製剤、蛋白製剤を含む高分子は生体内外で分解されやすいため不安定であり、再生医療に活用する上では安全性の面でも不安が残る。これに対して、低分子量有機化合物は、生体内外で分解されにくいため安定であり、再生医療に活用する上では安全性の面でも有利である。また、分子量が小さいほど有機合成も容易であり、安定性、安全性などのフィージビリティにおいて優れている。なお、繰り返しになるが、この低分子量有機化合物からは、ペプチドおよびヌクレオチドが除かれる。なぜなら、ペプチドおよびヌクレオチドは、生体内外で分解されやすいため不安定であり、再生医療に活用する上では安全性の面でも不安が残るからである。
【００３３】
そのため、本発明者らは、（１）現在市販されている４種類のＷｎｔ／βｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制剤（ケルセチン、イオノマイシン、イマチニブ、ヘキサクロロフェン）を入手し、さらに（２）その他の５種類のＷｎｔ／βｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制性の低分子化合物ＮＳＣ６６８０３６、ＰＫＦ−１１５−５８４、ＣＰＧ０４９０９０、ＰＮＵ−７４６５４、ＩＣＧ−００１を合成して、肝細胞分化誘導作用を検討することとし、ヒト骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）、ヒト臍帯血由来細胞（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１細胞）を用いて、上記の効果を以下の点について、検討した結果、後述する実施例で実証するように、これらのうちの４種類のＷｎｔ／βｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制剤（ケルセチン、イオノマイシン、ヘキサクロロフェン、ＰＫＦ１１５−５８４）が間葉系幹細胞を幹細胞に分化誘導することを発見したものである。
１．肝特異的転写因子発現
２．肝特異的蛋白発現
３．グリコーゲン合成
４．尿素合成
５．ＴＣＦ活性によるＷｎｔ／βｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ経路のシグナル強度をルシフェラーゼ活性で評価
【００３４】
こうして見出された本実施形態に係る間葉系幹細胞の肝細胞への分化誘導剤は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物（ケルセチン、イオノマイシン、ヘキサクロロフェン、ＰＫＦ１１５−５８４）を含み、これらの低分子化合物は蛋白製剤や核酸製剤に比べ、安定性、安全性などのフィージビリティにおいて優れ、再生医療の実現に有力な方法と期待される。これまでに上記の合成された５種類と既に市販されている３種類の合計８種類のＷｎｔ／βｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制性の低分子化合物のうち４種類（ケルセチン、イオノマイシン、ヘキサクロロフェン、ＰＫＦ１１５−５８４）について、ヒト間葉系幹細胞から肝細胞への分化誘導能を、ＲＮＡ干渉と比較検討しており、いずれも優れた分化誘導能を示している。また、当然のことながら、これらの有機低分子量化合物（ケルセチン、イオノマイシン、ヘキサクロロフェン、ＰＫＦ１１５−５８４）ＲＮＡ干渉の場合に比べて安定性、安全性などのフィージビリティにおいて著しく優れている。
【００３５】
すなわち、本実施形態に係る間葉系幹細胞の肝細胞への分化誘導剤は、ヘキサクロロフェン、ケルセチン、イオノマイシン、ＰＫＦ１１５−５８４からなる群から選ばれる１種以上の化合物またはその類縁体を含む、分化誘導剤である。ここで、本明細書において「類縁体」（ａｎａｌｏｇ）とは、いわゆる「誘導体」（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を含む概念であり、類似体、類似化合物、類縁化合物などと表現されることもある。つまり、「類縁体」とは、ある化合物と受容体結合特性などの分子生物学的な性質や構造が類似しているが、ある化合物の原子または原子団が別の原子または原子団と置換された組成を持つ別の化合物のことを含む。医薬品化学においては、期待される生理活性を持つ化合物が見つかると、より高い活性を持つ化合物を求めてその化合物の誘導体の探索を行なうことがよくある。このとき、探索の出発点となった化合物をリード化合物、その誘導体をアナログと呼ぶ。もちろん、本明細書において「類縁体」とは、リード化合物に対するアナログを含む概念である。そのため、本明細書において「類縁体」とは、後述する薬理的に許容される誘導体および薬理的に許容される塩を含む。
【００３６】
本明細書において「誘導体」（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）とは、ある有機化合物を母体として考えたとき、官能基の導入、酸化、還元、または原子の置き換えもしくは原子の付加などによって、母体の構造や性質を大幅に変えない程度の改変がなされた化合物のことを意味する。なおその改変は実際の化学反応として行えることもあるが、机上のものでも構わない。本明細書において「薬理的に許容される誘導体」は、所望の効果を有する化合物であれば限定されず、本発明に係る化合物の薬理的に許容される塩、溶媒和物、異性体、またはプロドラッグ等（例えばエステル）の形態を含む。またこの薬理的に許容される誘導体は、患者に投与すると、本発明に係る化合物またはその活性代謝物もしくはその残基を（直接的または間接的に）提供される任意の他の化合物を含む。そしてこのような薬理的に許容される誘導体は、当業者であれば過度の実験を行なうことなく得ることができる。例えば、［Ｂｕｒｇｅｒ’ｓＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＡｎｄＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ１：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ］を参照できる。なお好ましくは、本発明に係る化合物の薬理的に許容される塩または溶媒和物である。また所望の効果とは、本発明に係る化合物と実質的に同等の効果を含む。
【００３７】
本明細書において「薬理的に許容される塩」は、特に限定されないが、例えば任意の酸性（例えばカルボキシル）基で形成されるアニオン塩、または任意の塩基性（例えばアミノ）基で形成されるカチオン塩である。塩類には無機塩および有機塩を含み、［Ｂｅｒｇｅ，ＢｉｇｈｌｅｙおよびＭｏｎｋｈｏｕｓｅ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９］に記載されている塩が含まれる。
【００３８】
本明細書において「溶媒和物」は、溶質および溶媒によって形成される化合物である。溶媒和物については例えば、［Ｊ．Ｈｏｎｉｇｅｔａｌ．，ＴｈｅＶａｎＮｏｓｔｒａｎｄＣｈｅｍｉｓｔ’ｓＤｉｃｔｉｏｎａｒｙＰ６５０（１９５３）］を参照できる。溶媒が水であれば形成される溶媒和物は水和物である。この溶媒は、溶質の生物活性を妨げないものが好ましい。そのような好ましい溶媒の例として、限定するものではないが、水、エタノール、および酢酸が挙げられる。最も好ましい溶媒は、水である。水和物は、大気に触れるかまたは再結晶するときに水分を吸収し、その結果、本発明化合物又はその塩は、場合によっては、吸湿水を有するか又は水和物となる。
【００３９】
本明細書において「異性体」は、分子式は同一だが構造が異なる分子を含む。鏡像異性体（エナンチオマー）、幾何（シス／トランス）異性体、または相互に鏡像ではない不斉中心を１個以上有する異性体（ジアステレオマー）を含む。
【００４０】
本明細書において「プロドラッグ」は、前駆体である化合物であって、その化合物を被験体へ投与した際に、代謝過程または種々化学反応によって化学的変化を起こし、本発明に係る化合物またはその塩もしくはその溶媒和物をもたらす化合物を含む。プロドラッグについては、例えば［Ｔ．ＨｉｇｕｃｈｉａｎｄＶ．Ｓｔｅｌｌａ， “Ｐｒｏ−ＤｒｕｇｓａｓＮｏｖｅｌＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ”，Ａ．Ｃ．Ｓ．ＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ１４］を参照できる。
【００４１】
（ｉ）ヘキサクロロフェン
本明細書において、「ヘキサクロロフェン」（ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｅ）とは、ＰｕｂＣｈｅｍから引用すると、以下の特性を有する化合物であり、化学式（１）で表される。
Compound ID 3598
IUPAC: 3,4,6-trichloro-2-[(2,3,5-trichloro-6-hydroxyphenyl)methyl]phenol
Molecular Weight 406.90354[g/mol]
Molecular Formula C13H6Cl6O2
XLogP3 7.5
H-Bond Donor 2
H-Bond Acceptor 2
【００４２】
【化１】

【００４３】
ヘキサクロロフェンの類縁体としては、特に限定するものではないが、例えばＰｕｂＣｈｅｍのＣｏｍｐｏｕｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅＳｅａｒｃｈにおいて類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）９５％以上で検索すると、以下の９種類の化合物が類縁体に含まれる。なお、類縁体に含めるｔａｎｉｍｏｔｏ係数の下限値は、特に限定されず、例えば、９０％以上でもよく、９１％以上でもよく、９２％以上でもよく、９３％以上でもよく、９４％以上でもよく、９５％以上でもよく、９６％以上でもよく、９７％以上でもよく、９８％以上でもよく、９９％以上でもよい。類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）が大きければ大きいほどリード化合物に構造・生理活性などが近似した類縁体である可能性が高くなる。なお、ｔａｎｉｍｏｔｏ係数の計算式は以下のとおりであり、ケモインフォマティクスの分野では最も頻繁に使われる権威ある化合物同士の類似係数である。
【００４４】
Tanimoto = AB / ( A + B - AB )
Where:
Tanimoto is the Tanimoto score, a fraction between 0 and 1.
AB is the count of bits set after bit-wise & of fingerprints A and B
A is the count of bits set in fingerprint A
B is the count of bits set in fingerprint B
【００４５】
ヘキサクロロフェンの類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）９５％以上の類縁体一覧
1: CID: 3598
hexachlorophene; pHisoHex; Gamophen
IUPAC: 3,4,6-trichloro-2-[(2,3,5-trichloro-6-hydroxyphenyl)methyl]phenol
MW: 406.903540 g/mol | MF: C13H6Cl6O2
Tested in BioAssays: All: 505, Active: 114
Anti-Infective Agents, Local more

2: CID: 20372044
IUPAC: 3,4,6-trichloro-2-[(3,5-dichloro-2-hydroxyphenyl)methyl]phenol
MW: 372.458480 g/mol | MF: C13H7Cl5O2

3: CID: 23669625
Isobac; Isobac 20; Caswell No. 566A
IUPAC: sodium 3,4,6-trichloro-2-[(2,3,5-trichloro-6-hydroxyphenyl)methyl]phenolate
MW: 428.885370 g/mol | MF: C13H5Cl6NaO2

4: CID: 22088194
MW: 406.903540 g/mol | MF: C13H6Cl6O2-2

5: CID: 74742
CID74742; 3,4,4’,5’,6,6’-Hexachloro-2,2’-methylenediphenol; Phenol, 3,4,4’,5’,6,6’-hexachloro-2,2’-methylenedi-
IUPAC: 2,3,4-trichloro-6-[(2,3,5-trichloro-6-hydroxyphenyl)methyl]phenol
MW: 406.903540 g/mol | MF: C13H6Cl6O2

6: CID: 22954419
MW: 406.903540 g/mol | MF: C13H6Cl6O2

7: CID: 209168
Phenol, 2,2’-methylenebis(3,5,6-trichloro-; 2,2’-Methylenebis(3,5,6-trichlorophenol); CID209168
IUPAC: 2,3,5-trichloro-6-[(3,4,6-trichloro-2-hydroxyphenyl)methyl]phenol
MW: 406.903540 g/mol | MF: C13H6Cl6O2

8: CID: 23349392
IUPAC: 3,4,6-trichloro-2-[(2-hydroxyphenyl)methyl]phenol
MW: 303.568360 g/mol | MF: C13H9Cl3O2

9: CID: 5282359
CID5282359; C14203; 2,2’,3,3’,5,5’-Hexachloro-6-biphenylol
IUPAC: 3,4,6-trichloro-2-(2,3,5-trichlorophenyl)phenol
MW: 376.877560 g/mol | MF: C12H4Cl6O
【００４６】
当業者であれば、後述の実施例の実験データを参照すれば、これらの類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）９５％以上の９種類の化合物が、当然に間葉系幹細胞の肝細胞への分化を誘導する性質を有することを理解できる。
【００４７】
（ｉｉ）ケルセチン
本明細書において、「ケルセチン」（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）とは、ＰｕｂＣｈｅｍから引用すると、以下の特性を有する化合物であり、化学式（２）で表される。
Compound ID 5280343
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one
Molecular Weight 302.2357 [g/mol]
Molecular Formula C15H10O7
XLogP3 1.5
H-Bond Donor 5
H-Bond Acceptor 7
【００４８】
【化２】

【００４９】
ケルセチンの類縁体としては、特に限定するものではないが、例えばＰｕｂＣｈｅｍのＣｏｍｐｏｕｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅＳｅａｒｃｈにおいて類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）９５％以上で検索すると、以下の２３３種類の化合物が類縁体に含まれる。なお、類縁体に含めるtanimoto係数の下限値は、特に限定されず、例えば、９０％以上でもよく、９１％以上でもよく、９２％以上でもよく、９３％以上でもよく、９４％以上でもよく、９５％以上でもよく、９６％以上でもよく、９７％以上でもよく、９８％以上でもよく、９９％以上でもよい。類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）が大きければ大きいほどリード化合物に構造・生理活性などが近似した類縁体である可能性が高くなる。なお、tanimoto係数の計算式は既述のとおりであり、ケモインフォマティクスの分野では最も頻繁に使われる権威ある化合物同士の類似係数である。
【００５０】
ケルセチンの類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）９５％以上の類縁体一覧
1: CID: 5280343
quercetin; Sophoretin; Meletin
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one
MW: 302.235700 g/mol | MF: C15H10O7
Tested in BioAssays: All: 281, Active: 55
Antioxidants more

2: CID: 20670067
IUPAC: actinium; 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one
MW: 1437.374435 g/mol | MF: C15H10Ac5O7

3: CID: 5281614
Fisetin; Cotinin; Superfustel
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,7-dihydroxychromen-4-one
MW: 286.236300 g/mol | MF: C15H10O6
Tested in BioAssays: All: 174, Active: 28

4: CID: 5281692
Robinetin; Norkanugin; 5-Deoxymyricetin
IUPAC: 3,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 302.235700 g/mol | MF: C15H10O7
Tested in BioAssays: All: 24, Active: 2

5: CID: 5284452
Quercetin dihydrate; quercetin; Quercetine dihydrate
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one dihydrate
MW: 338.266260 g/mol | MF: C15H14O9
Tested in BioAssays: All: 98, Active: 12
Antioxidants more

6: CID: 10818722
CID10818722; [2,3-dihydroxy-6-(3,5,7-trihydroxy-4-oxo-chromen-2-yl)phenyl]thallium
IUPAC: [2,3-dihydroxy-6-(3,5,7-trihydroxy-4-oxochromen-2-yl)phenyl]thallium
MW: 505.611060 g/mol | MF: C15H9O7Tl

7: CID: 16212154
Quercetin hydrate; MLS001074343; MLS002153851
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one hydrate
MW: 320.250980 g/mol | MF: C15H12O8
Tested in BioAssays: All: 132, Active: 14

8: CID: 16213065
Fisetin; 5-Deoxyquercetin; Natural Brown- 1
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,7-dihydroxychromen-4-one hydrate
MW: 304.251580 g/mol | MF: C15H12O7

9: CID: 24187083
NSC58588; 7255-55-2
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one; zirconium
MW: 393.459700 g/mol | MF: C15H10O7Zr
Tested in BioAssays: All: 1, Active: 0

10: CID: 25031947
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one; selenium
MW: 381.195700 g/mol | MF: C15H10O7Se

11: CID: 12305312
IUPAC: 6,8-dideuterio-3,5,7-trihydroxy-2-(2,3,6-trideuterio-4,5-dihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 307.266509 g/mol | MF: C15H10O7

12: CID: 21600688
IUPAC: 3,5,7-trihydroxy-2-(2,3,6-trideuterio-4,5-dihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 305.254185 g/mol | MF: C15H10O7

13: CID: 23105025
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroperoxy-7-hydroxychromen-4-one
MW: 334.234500 g/mol | MF: C15H10O9

14: CID: 5281672
myricetin; Cannabiscetin; Myricetol
IUPAC: 3,5,7-trihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 318.235100 g/mol | MF: C15H10O8
Tested in BioAssays: All: 277, Active: 48

15: CID: 12309893

IUPAC: 8-deuterio-3,7-dihydroxy-2-(2,3,6-trideuterio-4,5-dihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 290.260947 g/mol | MF: C15H10O6

16: CID: 25201643
myricetin
IUPAC: 2,6-dihydroxy-4-(3,5,7-trihydroxy-4-oxochromen-2-yl)phenolate
MW: 317.227160 g/mol | MF: C15H9O8-

17: CID: 5280445
luteolin; Luteoline; Luteolol
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxychromen-4-one
MW: 286.236300 g/mol | MF: C15H10O6
Tested in BioAssays: All: 258, Active: 41

18: CID: 5321864
5,7,2’,3’-Tetrahydroxyflavone; LMPK12110137; CID5321864
IUPAC: 2-(2,3-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxychromen-4-one
MW: 286.236300 g/mol | MF: C15H10O6

19: CID: 18471844
ZINC14644152
IUPAC: 5,7-dihydroxy-2-(2,3,4-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 302.235700 g/mol | MF: C15H10O7

20: CID: 22339062
IUPAC: 3,5-dihydroxy-2-(2,3,4-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 302.235700 g/mol | MF: C15H10O7

21: CID: 25201972
luteolin; 5734-TETRAHYDROXYFLAVONE; 3’,4’,5,7-Tetrahydroxyflavone
IUPAC: 4-(5,7-dihydroxy-4-oxochromen-2-yl)-2-hydroxyphenolate
MW: 285.228360 g/mol | MF: C15H9O6-

22: CID: 26034
5,7-Di-O-methylquercetin; BRN 0344074; CID26034
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-hydroxy-5,7-dimethoxychromen-4-one
MW: 330.288860 g/mol | MF: C17H14O7

23: CID: 5281604
Azaleatin; 5-O-Methylquercetin; Quercetin 5-methyl ether
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,7-dihydroxy-5-methoxychromen-4-one
MW: 316.262280 g/mol | MF: C16H12O7

24: CID: 5281638
6-Hydroxykaempferol; CHEBI:563476; LMPK12112860
IUPAC: 3,5,6,7-tetrahydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 302.235700 g/mol | MF: C15H10O7

25: CID: 5281691
Rhamnetin; 7-Methoxyquercetin; 7-Methylquercetin
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-methoxychromen-4-one
MW: 316.262280 g/mol | MF: C16H12O7
Tested in BioAssays: All: 117, Active: 6

26: CID: 10598612
CID10598612; 2-(3,4-dihydroxy-2-iodo-phenyl)-3,5,7-trihydroxy-chromen-4-one
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxy-2-iodophenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one
MW: 428.132230 g/mol | MF: C15H9IO7

27: CID: 15233950
LMPK12112802
IUPAC: 3,5,6,7-tetrahydroxy-2-phenylchromen-4-one
MW: 286.236300 g/mol | MF: C15H10O6

28: CID: 17840574
IUPAC: (3,5,6,7-tetrahydroxy-2-phenylchromen-4-ylidene)oxidanium
MW: 287.244240 g/mol | MF: C15H11O6+

29: CID: 24721675
IUPAC: 3,7-dihydroxy-2-(2,4,5-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 302.235700 g/mol | MF: C15H10O7

30: CID: 25205335
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one; platinum(4+); dichloride
MW: 568.219700 g/mol | MF: C15H10Cl2O7Pt+2

31: CID: 25206803
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one; platinum(4+); chloride; hydrochloride
MW: 569.227640 g/mol | MF: C15H11Cl2O7Pt+3

32: CID: 5322065
7,3’,4’-Trihydroxyflavone; 3’,4’,7-Trihydroxyflavone; BRN 0253031
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxychromen-4-one
MW: 270.236900 g/mol | MF: C15H10O5

33: CID: 5393164
7,3,4,5-tetrahydroxyflavone; CHEBI:519698; LMPK12110051
IUPAC: 7-hydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 286.236300 g/mol | MF: C15H10O6

34: CID: 10517292
CID10517292; 3-hydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
IUPAC: 3-hydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 286.236300 g/mol | MF: C15H10O6

35: CID: 16662883
IUPAC: 2-(2,3-dihydroxyphenyl)-7-hydroxychromen-4-one
MW: 270.236900 g/mol | MF: C15H10O5

36: CID: 21158518
IUPAC: 7-hydroxy-2-(2,3,4-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 286.236300 g/mol | MF: C15H10O6

37: CID: 5281701
Tricetin; Spectrum_001591; SpecPlus_000826
IUPAC: 5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 302.235700 g/mol | MF: C15H10O7
Tested in BioAssays: All: 63, Active: 9

38: CID: 12359024
IUPAC: 3,6,8-trideuterio-5,7-dihydroxy-2-(2,3,6-trideuterio-4,5-dihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 292.273271 g/mol | MF: C15H10O6

39: CID: 12359025
IUPAC: 3-deuterio-5,7-dihydroxy-2-(2,3,6-trideuterio-4,5-dihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 290.260947 g/mol | MF: C15H10O6

40: CID: 627207
CHEBI:347700; CID627207; 3-Hydroxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-methoxy-4H-chromen-4-one
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-hydroxy-7-methoxychromen-4-one
MW: 300.262880 g/mol | MF: C16H12O6

41: CID: 5280417
3,7-Di-O-methylquercetin; CHEBI:18010; MolPort-001-742-139
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxy-3,7-dimethoxychromen-4-one
MW: 330.288860 g/mol | MF: C17H14O7

42: CID: 5280681
3-O-Methylquercetin; 3-Methoxy quercetin; Quercetin-3-methylether
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-methoxychromen-4-one
MW: 316.262280 g/mol | MF: C16H12O7
Tested in BioAssays: All: 234, Active: 11

43: CID: 5281680
Quercetagetin; 6-Hydroxyquercetin; CHEBI:202888
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,6,7-tetrahydroxychromen-4-one
MW: 318.235100 g/mol | MF: C15H10O8

44: CID: 5319492
Flavone der.; AIDS071769; CHEBI:219000
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,6,7-trihydroxychromen-4-one
MW: 302.235700 g/mol | MF: C15H10O7

45: CID: 5489501
3,5-Di-O-methylquercetin; LMPK12112730; CID5489501
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-3,5-dimethoxychromen-4-one
MW: 330.288860 g/mol | MF: C17H14O7

46: CID: 10516160
CID10516160; 3,7,8-trihydroxy-2-phenyl-chromen-4-one
IUPAC: 3,7,8-trihydroxy-2-phenylchromen-4-one
MW: 270.236900 g/mol | MF: C15H10O5

47: CID: 15560442
LMPK12111605
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,7,8-trihydroxychromen-4-one
MW: 302.235700 g/mol | MF: C15H10O7

48: CID: 21676161
IUPAC: [2-hydroxy-5-(3,5,7-trihydroxy-4-oxochromen-2-yl)phenyl] sulfate
MW: 381.290960 g/mol | MF: C15H9O10S-

49: CID: 21676163
IUPAC: [2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-4-oxochromen-7-yl] sulfate
MW: 381.290960 g/mol | MF: C15H9O10S-

50: CID: 21676164
IUPAC: [2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxochromen-3-yl] sulfate
MW: 381.290960 g/mol | MF: C15H9O10S-

51: CID: 22239065
LMPK12111601; ZINC12359395
IUPAC: 3,7,8-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 286.236300 g/mol | MF: C15H10O6

52: CID: 24721178
IUPAC: 3,7,8-trihydroxy-2-(2-hydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 286.236300 g/mol | MF: C15H10O6

53: CID: 25202270
3-methoxyluteolin; 3-O-Methylquercetin; 3’,4’,5,7-Tetrahydroxy-3-methoxyflavone
IUPAC: 4-(5,7-dihydroxy-3-methoxy-4-oxochromen-2-yl)-2-hydroxyphenolate
MW: 315.254340 g/mol | MF: C16H11O7-

54: CID: 25203115
Quercetin 3-sulfate; CPD-1822
IUPAC: [5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-oxidophenyl)-4-oxochromen-3-yl] sulfate
MW: 380.283020 g/mol | MF: C15H8O10S-2

55: CID: 25206804
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one; platinum(4+); tetrachloride
MW: 639.125700 g/mol | MF: C15H10Cl4O7Pt

56: CID: 16113029
LMPK12112522
IUPAC: 3,5,7-trihydroxy-2-(2,4,5-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 318.235100 g/mol | MF: C15H10O8

57: CID: 15661823
ZINC04349582
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-methylchromen-4-one
MW: 300.262880 g/mol | MF: C16H12O6

58: CID: 6477685
AIDS154808; CHEBI:480357; AIDS-154808
IUPAC: 2-[(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethenyl]-5,7-dihydroxychromen-4-one
MW: 312.273580 g/mol | MF: C17H12O6

59: CID: 88281
5,3’,4’-Trihydroxyflavone; TNP00056; CHEBI:490257
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxychromen-4-one
MW: 270.236900 g/mol | MF: C15H10O5
Tested in BioAssays: All: 81, Active: 10

60: CID: 17851159
IUPAC: 5-hydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 286.236300 g/mol | MF: C15H10O6

61: CID: 147651
Quercetin trimethyl ether; ZINC00338058; CID147651
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trimethoxychromen-4-one
MW: 344.315440 g/mol | MF: C18H16O7

62: CID: 5280362
Quercetin 3-sulfate; quercetin 3-(hydrogen sulfate); CHEBI:17730
IUPAC: [2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxochromen-3-yl] hydrogen sulfate
MW: 382.298900 g/mol | MF: C15H10O10S

63: CID: 5280544
Herbacetin; 8-Hydroxykaempferol; LMPK12113149
IUPAC: 3,5,7,8-tetrahydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 302.235700 g/mol | MF: C15H10O7

64: CID: 5281654
Isorhamnetin; 3-Methylquercetin; Isorhamnetol
IUPAC: 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)chromen-4-one
MW: 316.262280 g/mol | MF: C16H12O7
Tested in BioAssays: All: 18, Active: 2

65: CID: 5281679
Pinoquercetin; 6-C-Methylquercetin; LMPK12112292
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-6-methylchromen-4-one
MW: 316.262280 g/mol | MF: C16H12O7

66: CID: 5281699
Tamarixetin; 4’-O-Methylquercetin; Quercetin 4’-methyl ether
IUPAC: 3,5,7-trihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chromen-4-one
MW: 316.262280 g/mol | MF: C16H12O7

67: CID: 5320287
Ombuin; 4’,7-Dimethylquercetin; 7,4’-Di-O-methylquercetin
IUPAC: 3,5-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-7-methoxychromen-4-one
MW: 330.288860 g/mol | MF: C17H14O7

68: CID: 5320945
Rhamnazin; 3’,7-Dimethylquercetin; 7,3’-Di-O-methylquercetin
IUPAC: 3,5-dihydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-methoxychromen-4-one
MW: 330.288860 g/mol | MF: C17H14O7
Tested in BioAssays: All: 61, Active: 1

69: CID: 5362017
8-Hydroxygalangin; 3,5,7,8-Tetrahydroxyflavone; BRN 0295943
IUPAC: 3,5,7,8-tetrahydroxy-2-phenylchromen-4-one
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CID628780; 3-Hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-7-methoxy-4H-chromen-4-one
IUPAC: 3-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-7-methoxychromen-4-one
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CID4125009; 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-6,8-bis(3-methylbut-2-enyl)chromen-4-one
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-6,8-bis(3-methylbut-2-enyl)chromen-4-one
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Tested in BioAssays: All: 54, Active: 8

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CID10050405; 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-dodecoxy-3,5-dihydroxy-chromen-4-one
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-dodecoxy-3,5-dihydroxychromen-4-one
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CID10556475; 2-(3,4-dihydroxy-2-iodo-phenyl)-3,5,7-trihydroxy-6,8-diiodo-chromen-4-one
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150: CID: 25030204
IUPAC: 7-hydroxy-5-methoxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
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CID9860659; 3,5,7-trihydroxy-2-(3-hydroxyphenyl)chromen-4-one
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Ayanin; 3,7,4’-Tri-O-methylquercetin; 3,7,4’-trimethylquercetin
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Tested in BioAssays: All: 59, Active: 0

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IUPAC: 5-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3,7-dimethoxychromen-4-one
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CID5320848; 5-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-sulfinatooxy-phenyl)-7-methoxy-4-oxo-3-sulfinatooxy-chromene
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IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-3-(2-hydroxyethoxy)chromen-4-one
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CID10473561; [2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxo-chromen-3-yl] Propanoate
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LMPK12111610
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LMPK12112723
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-methoxy-8-methylchromen-4-one
MW: 330.288860 g/mol | MF: C17H14O7

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184: CID: 5281953
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189: CID: 10365850
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190: CID: 12314325
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IUPAC: 3,5,7-trihydroxy-6-methyl-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
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191: CID: 15559735
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192: CID: 21676176
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193: CID: 21676177
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MW: 539.401480 g/mol | MF: C15H7O16S3-3

194: CID: 22507435
IUPAC: 3,5,7-trimethoxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chromen-4-one
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IUPAC: 5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4-oxochromen-3-olate
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196: CID: 25203006
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197: CID: 44259511
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Tested in BioAssays: All: 182, Active: 17

200: CID: 797370
Oprea1_264669; Oprea1_552685; MolPort-001-831-555
IUPAC: 2-phenoxy-1-(2,3,4-trihydroxyphenyl)ethanone
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201: CID: 5280666
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Tested in BioAssays: All: 261, Active: 6

202: CID: 5281612
Diosmetin; 4’-Methylluteolin; Luteolin 4’-methyl ether
IUPAC: 5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chromen-4-one
MW: 300.262880 g/mol | MF: C16H12O6
Tested in BioAssays: All: 24, Active: 2

203: CID: 5281648
Hypolaetin; 8-Hydroxyluteolin; CHEBI:5837
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204: CID: 5281665
Isoscutellarein; 8-Hydroxyapigenin; LMPK12111361
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205: CID: 5281674
Norwogonin; nor-wogonin; 5,7,8-Trihydroxyflavone
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Tested in BioAssays: All: 5, Active: 1

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207: CID: 5464381
Velutin; Flavonoid; Luteolin 7,3’-dimethyl ether
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sec-Butyl benzoate; 3’,4’-Dimethoxyquercetin; LMPK12112411
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CID10357421; 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-methyl-chromen-4-one
IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-methylchromen-4-one
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CID11474580; 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-(3-methylbut-2-enoxymethyl)chromen-4-one
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IUPAC: 7-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-5-methoxychromen-4-one
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212: CID: 13964549
Chrysoeriol 5-methyl ether; LMPK12110967
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LMPK12110734
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IUPAC: 7-butoxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxychromen-4-one
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IUPAC: 5-butoxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxychromen-4-one
MW: 342.342620 g/mol | MF: C19H18O6

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7,8-dihydroxyflavone; FLAVONE; 7,8-Dihydroxy-flavone
IUPAC: 7,8-dihydroxy-2-phenylchromen-4-one
MW: 254.237500 g/mol | MF: C15H10O4
Tested in BioAssays: All: 92, Active: 8

225: CID: 676309
TNP00055; CHEBI:490243; CID676309
IUPAC: 7,8-dihydroxy-2-(2-hydroxyphenyl)chromen-4-one
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Tested in BioAssays: All: 80, Active: 18

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IUPAC: 7,8-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 270.236900 g/mol | MF: C15H10O5

227: CID: 9814421
CID9814421; 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-7,8-dihydroxy-chromen-4-one
IUPAC: 2-(2,4-dihydroxyphenyl)-7,8-dihydroxychromen-4-one
MW: 286.236300 g/mol | MF: C15H10O6

228: CID: 18778789
IUPAC: (2E)-2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methylidene]-7-hydroxychromen-4-one
MW: 284.263480 g/mol | MF: C16H12O5

229: CID: 17840570
IUPAC: (3,5,6-trihydroxy-2-phenylchromen-4-ylidene)oxidanium
MW: 271.244840 g/mol | MF: C15H11O5+

230: CID: 17840571
IUPAC: 3,5,6-trihydroxy-2-phenylchromen-4-one
MW: 270.236900 g/mol | MF: C15H10O5

231: CID: 23064865
IUPAC: 2-(2,3,4,6-tetrahydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 286.236300 g/mol | MF: C15H10O6

232: CID: 5393165
ZINC00057845; CID5393165
IUPAC: 3,7-dihydroxy-2-(3-hydroxyphenyl)chromen-4-one
MW: 270.236900 g/mol | MF: C15H10O5

233: CID: 20977459
IUPAC: [3,5,7-trihydroxy-2-(3-hydroxyphenyl)chromen-4-ylidene]oxidanium chloride
MW: 322.697240 g/mol | MF: C15H11ClO6
【００５１】
当業者であれば、後述の実施例の実験データを参照すれば、これらの類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）９５％以上の２３３種類の化合物が、当然に間葉系幹細胞の肝細胞への分化を誘導する性質を有することを理解できる。
【００５２】
（ｉｉｉ）イオノマイシン
本明細書において、「イオノマイシン」（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）とは、ＰｕｂＣｈｅｍから引用すると、以下の特性を有する化合物であり、化学式（３）で表される。
Compound ID 44134784
IUPAC: calcium 19,21-dihydroxy-22-[5-[5-(1-hydroxyethyl)-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-11-oxido-9-oxodocosa-10,16-dienoate
Molecular Weight 747.0671 [g/mol]
Molecular Formula C41H70CaO9
H-Bond Donor 3
H-Bond Acceptor 9
【００５３】
【化３】

【００５４】
イオノマイシンの類縁体としては、特に限定するものではないが、例えばＰｕｂＣｈｅｍのＣｏｍｐｏｕｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅＳｅａｒｃｈにおいて類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）９５％以上で検索すると、以下の２０種類の化合物が類縁体に含まれる。なお、類縁体に含めるｔａｎｉｍｏｔｏ係数の下限値は、特に限定されず、例えば、９０％以上でもよく、９１％以上でもよく、９２％以上でもよく、９３％以上でもよく、９４％以上でもよく、９５％以上でもよく、９６％以上でもよく、９７％以上でもよく、９８％以上でもよく、９９％以上でもよい。類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）が大きければ大きいほどリード化合物に構造・生理活性などが近似した類縁体である可能性が高くなる。なお、ｔａｎｉｍｏｔｏ係数の計算式は既述のとおりであり、ケモインフォマティクスの分野では最も頻繁に使われる権威ある化合物同士の類似係数である。
【００５５】
イオノマイシンの類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）９５％以上の類縁体一覧
1: CID: 6446270
Ionomycin, calcium salt; MolPort-003-983-599; CID6446270
IUPAC: calcium (4R,6S,8S,10Z,12R,14R,16E,18R,19R,20S,21S)-19,21-dihydroxy-22-[(2S,5S)-5-[(2R,5S)-5-[(1R)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-11-oxido-9-oxodocosa-10,16-dienoate
MW: 747.067100 g/mol | MF: C41H70CaO9

2: CID: 24839624
LS-84163
IUPAC: calcium; (4R,6S,8S,10Z,12R,14R,16E,18R,19R,20S,21S)-11,19,21-trihydroxy-22-[(2S,5S)-5-[(2R,5S)-5-[(1R)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 749.082980 g/mol | MF: C41H72CaO9

3: CID: 42602091
IUPAC: calcium (4R,6S,8S,10Z,12R,14R,16E,18R,19R,20S,21S)-11,19,21-trihydroxy-22-[(2R,5R)-5-[(2S,5R)-5-[(1S)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 749.082980 g/mol | MF: C41H72CaO9+2

4: CID: 44120021
BII0123
IUPAC: calcium (4S,6R,8R,10Z,12S,14S,16E,18S,19S,20R,21S)-19,21-dihydroxy-22-[(2R,5S)-5-[(2S,5S)-5-[(1R)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-11-oxido-9-oxodocosa-10,16-dienoate
MW: 747.067100 g/mol | MF: C41H70CaO9

5: CID: 44134784
ionomycin; 56092-82-1
IUPAC: calcium 19,21-dihydroxy-22-[5-[5-(1-hydroxyethyl)-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-11-oxido-9-oxodocosa-10,16-dienoate
MW: 747.067100 g/mol | MF: C41H70CaO9
Ionophores more

6: CID: 3733
ionomycin; CID3733; 56092-81-0
IUPAC: 11,19,21-trihydroxy-22-[5-[5-(1-hydroxyethyl)-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 709.004980 g/mol | MF: C41H72O9
Ionophores more

7: CID: 3611369
CID3611369; CID 3611369
IUPAC: 19,21-dihydroxy-22-[5-[5-(1-hydroxyethyl)-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-11-oxido-9-oxodocosa-10,16-dienoate
MW: 706.989100 g/mol | MF: C41H70O9-2

8: CID: 6434517
ionomycin; CID6434517; LS-84162
IUPAC: (4R,6S,8S,10Z,12R,14R,16E,18R,19R,20S,21S)-11,19,21-trihydroxy-22-[(5S)-5-[(5S)-5-[(1R)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 709.004980 g/mol | MF: C41H72O9
Ionophores more

9: CID: 6711156
ionomycin; MolMap_000033; CID6711156
IUPAC: (4R,6S,8S,12R,14R,18R,19R,20S,21S)-11,19,21-trihydroxy-22-[(2R,5R)-5-[(2R,5S)-5-[(1R)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 709.004980 g/mol | MF: C41H72O9
Ionophores more

10: CID: 6912226
ionomycin; CHEBI:566812; HSCI1_000207
IUPAC: (4R,6S,8S,10Z,12R,14R,16E,18R,19R,20S,21S)-11,19,21-trihydroxy-22-[(2S,5S)-5-[(2R,5S)-5-[(1R)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 709.004980 g/mol | MF: C41H72O9
Ionophores more

11: CID: 9831149
CID9831149; CID 9831149
IUPAC: (10Z,16E)-11,19-dihydroxy-20-[5-[5-(1-hydroxyethyl)-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-2,4,6,8,12,14,18-heptamethyl-9-oxoicosa-10,16-dienoic acid
MW: 664.952420 g/mol | MF: C39H68O8

12: CID: 10372625
ionomycin; CID10372625
IUPAC: (4R,6S,8S,10Z,12R,14R,16E,18R,19R,20S,21S)-11,19,21-trihydroxy-22-[(2R,5R)-5-[(2S,5R)-5-[(1S)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 709.004980 g/mol | MF: C41H72O9
Ionophores more

13: CID: 12967103
NCGC00162460-01
IUPAC: (4R,6S,8S,10Z,12R,14R,16E,18R,19R,20S,21S)-11,19,21-trihydroxy-22-[(2S,5S)-5-[(5S)-5-[(1R)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 709.004980 g/mol | MF: C41H72O9
Tested in BioAssays: All: 34, Active: 1

14: CID: 16219538
I9657_SIGMA; Ionomycin from Streptomyces conglobatus
IUPAC: (4S,6R,8R,10Z,12S,14S,16E,18S,19S,20R,21S)-11,19,21-trihydroxy-22-[(5S)-5-[(5S)-5-[(1S)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 709.004980 g/mol | MF: C41H72O9

15: CID: 16759612
NCGC00162463-01
IUPAC: (4R,6S,8S,10Z,12R,14R,16E,18R,19R,20S,21S)-19,21-dihydroxy-22-[(2S,5S)-5-[(2R,5S)-5-[(1R)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-11-oxido-9-oxodocosa-10,16-dienoate
MW: 706.989100 g/mol | MF: C41H70O9-2
Tested in BioAssays: All: 34, Active: 0

16: CID: 24742080
nchembio.79-comp37; 4R,6S,8S,10Z,12R,14R,16E,18R,19R,20S,21S)-11,19,21-Trihydroxy-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-22-[(2S,2’R,5S,5’S)-octahydro-5’-[(1R)-1-hydroxyethyl]-2,5’-dimethyl[2,2’-bifuran]-5-yl]-9-oxo-10,16-docosadienoic acid calcium salt
IUPAC: (4S,6R,8R,10Z,12S,14S,16E,18S,19S,20R,21S)-19,21-dihydroxy-22-[(5S)-5-[(5S)-5-[(1S)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-11-oxido-9-oxodocosa-10,16-dienoate
MW: 706.989100 g/mol | MF: C41H70O9-2

17: CID: 25134244
ionomycin; nchembio.146-comp9
IUPAC: (4R,6S,8S,10Z,12R,14R,16E,18R,19R,20S,21S)-11,19,21-trihydroxy-22-[(5S)-5-[(5S)-5-(1-hydroxyethyl)-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 709.004980 g/mol | MF: C41H72O9
Ionophores more

18: CID: 44120022
IUPAC: (4S,6R,8R,10Z,12S,14S,16E,18S,19S,20R,21S)-11,19,21-trihydroxy-22-[(2R,5S)-5-[(2S,5S)-5-[(1R)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 709.004980 g/mol | MF: C41H72O9

19: CID: 44120023
BII0421
IUPAC: (4R,6S,8S,10Z,12R,14R,16E,18S,19S,20R,21S)-11,19,21-trihydroxy-22-[(2S,5S)-5-[(2S,5R)-5-[(1S)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 709.004980 g/mol | MF: C41H72O9

20: CID: 44560066
CHEBI:546782; (3R,5S,7S,9Z,11R,13R,15E,17R,18R,19S,20S)-1-carboxy-18,20-dihydroxy-21-((2S,5S)-5-((2R,5S)-5-((S)-1-hydroxyethyl)-5-methyl-tetrahydrofuran-2-yl)-5-methyl-tetrahydrofuran-2-yl)-3,5,7,11,13,17,19-heptamethyl-8-oxohenicosa-9,15-dien-10-olate
IUPAC: (4R,6S,8S,10Z,12R,14R,16E,18R,19R,20S,21S)-11,19,21-trihydroxy-22-[(2S,5S)-5-[(2R,5S)-5-[(1S)-1-hydroxyethyl]-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid
MW: 709.004980 g/mol | MF: C41H72O9
【００５６】
当業者であれば、後述の実施例の実験データを参照すれば、これらの類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）９５％以上の２０種類の化合物が、当然に間葉系幹細胞の肝細胞への分化を誘導する性質を有することを理解できる。
【００５７】
（ｉｖ）ＰＫＦ１１５−５８４
本明細書において、「ＰＫＦ１１５−５８４」とは、非特許文献６（Maina Lepourcelet et al., “Small-molecule antagonists of the oncogenic Tcf/β-catenin protein complex”, CANCER CELL, JANUARY 2004, VOL. 5, 91-102）から引用すると、以下の特性を有する化合物であり、化学式（４）で表される。
【化４】

【００５８】
ＰＫＦ１１５−５８４の類縁体としては、特に限定するものではないが、例えば類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）９５％以上の化合物が類縁体に含まれる。なお、類縁体に含めるｔａｎｉｍｏｔｏ係数の下限値は、特に限定されず、例えば、９０％以上でもよく、９１％以上でもよく、９２％以上でもよく、９３％以上でもよく、９４％以上でもよく、９５％以上でもよく、９６％以上でもよく、９７％以上でもよく、９８％以上でもよく、９９％以上でもよい。類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）が大きければ大きいほどリード化合物に構造・生理活性などが近似した類縁体である可能性が高くなる。なお、ｔａｎｉｍｏｔｏ係数の計算式は既述のとおりであり、ケモインフォマティクスの分野では最も頻繁に使われる権威ある化合物同士の類似係数である。
【００５９】
当業者であれば、後述の実施例の実験データを参照すれば、これらの類似度（ｔａｎｉｍｏｔｏ係数）９５％以上の化合物が、当然に間葉系幹細胞の肝細胞への分化を誘導する性質を有することを理解できる。
【００６０】
なお、本実施形態において、分化誘導剤の候補物質である有機低分子量化合物が、間葉系幹細胞を肝細胞に分化誘導する性質を有するかどうか判断するには、間葉系幹細胞におけるアルブミン、Ｃ／ＥＢＰα、ＣＹＰＡ１／Ａ２およびＡＦＰからなる群から選ばれる１種以上の蛋白質の発現を誘導するかどうかが重要な指標となる。なぜなら、一般的には、肝細胞ではこれらのアルブミン、Ｃ／ＥＢＰα、ＣＹＰＡ１／Ａ２およびＡＦＰからなる群から選ばれる１種以上の蛋白質が多量に発現しているのに対して、間葉系幹細胞ではこれらのアルブミン、Ｃ／ＥＢＰα、ＣＹＰＡ１／Ａ２およびＡＦＰからなる群から選ばれる１種以上の蛋白質が少量しか発現していないからである。
【００６１】
この場合、どの程度多量にこれらのアルブミン、Ｃ／ＥＢＰα、ＣＹＰＡ１／Ａ２およびＡＦＰからなる群から選ばれる１種以上の蛋白質が発現していれば間葉系幹細胞を肝細胞に分化誘導すると判断すべきかが問題になるが、例えば、これらの発現量が候補物質による処理後の間葉系幹細胞で所定の閾値を超えていれば、候補物質が間葉系幹細胞を肝細胞に分化誘導すると判定することができる。一方、これらの発現量が所定の閾値を下回れば、候補物質が間葉系幹細胞を肝細胞に分化誘導する性質を有さないと判定することができる。この閾値は、例えば処理前の間葉系幹細胞の発現量のアルブミン、Ｃ／ＥＢＰα、ＣＹＰＡ１／Ａ２およびＡＦＰのそれぞれの平均値の１．５倍以上に設定してもよく、２倍以上に設定してもよく、５倍以上に設定してもよく、１０倍以上に設定してもよい。また、この閾値は、例えば処理前の間葉系幹細胞の発現量のアルブミン、Ｃ／ＥＢＰα、ＣＹＰＡ１／Ａ２およびＡＦＰのそれぞれの平均値よりも標準偏差の２倍以上大きい場合に設定してもよく、標準偏差の５倍以上大きい場合に設定してもよく、標準偏差の１０倍以上大きい場合に設定してもよい。
【００６２】
あるいは、候補物質で処理された間葉系幹細胞におけるアルブミン、Ｃ／ＥＢＰα、ＣＹＰＡ１／Ａ２およびＡＦＰのいずれかの発現量が、例えば処理前の間葉系幹細胞の発現量に比べて有意差が認められるほど大きいかどうかで判定してもよい。有意差があるかどうかの判定としては、例えば母集団が正規分布に従うと仮定できる場合にはパラメトリック検定であるスチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔ）において有意差があれば好ましい。すなわち、スチューデントのｔ検定において片側検定でｐ＜０．０５となればよく、より好ましくは片側検定でｐ＜０．０３となればよく、最も好ましくは片側検定でｐ＜０．０１となればよい。なお、スチューデントのｔ検定は特に片側検定に限定するわけではなく、両側検定で行っても良い。さらに、母集団が正規分布に従うと仮定できない場合には、ノンパラメトリック検定として、マン・ホイットニーのＵ検定などを行って有意差の有無を検定してもよい。
【００６３】
また、本実施形態において、分化誘導剤の候補物質である有機低分子量化合物が、間葉系幹細胞を肝細胞に分化誘導する性質を有するかどうか判断するには、間葉系幹細胞におけるグリコーゲン生産能または尿素合成能を増強するかどうかが別の重要な指標となる。なぜなら、一般的には、肝細胞ではこれらのグリコーゲン生産能または尿素合成能が増強yされているのに対して、間葉系幹細胞ではこれらのグリコーゲン生産能または尿素合成能が増強されていないからである。この場合、どの程度これらのグリコーゲン生産能または尿素合成能が増強されていれば間葉系幹細胞を肝細胞に分化誘導すると判断すべきかが問題になるが、例えば、上記のアルブミン、Ｃ／ＥＢＰα、ＣＹＰＡ１／Ａ２およびＡＦＰのいずれかの発現量による判断の場合と同様の方法を用いて閾値または有意差によって判断することができる。
【００６４】
＜間葉系幹細胞から肝細胞を生産する方法＞
本実施形態に係るから肝細胞を生産する方法は、間葉系幹細胞を上記の分化誘導剤で処理する工程を含む、生産方法である。この方法によれば、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を用いるので、蛋白製剤や核酸製剤に比べ安定性・安全性などの面で優れており、間葉系幹細胞から肝細胞への分化誘導を効率よく安全に行うことができる。
【００６５】
この場合、どのような条件で処理すればよいかが問題になるが、処理時間については、後述する実施例で実証されているように、間葉系幹細胞を分化誘導剤で８日以上処理する工程を含むことが好ましい。なぜなら、間葉系幹細胞から肝細胞への分化は生物的なプロセスであるため、細胞内での各種分子生物学的変化が進行するのにその程度の期間がかかってしまうからである。このとき、本実施形態にかかる分化誘導剤は有機低分子量化合物であるため安定性に優れているので、８日以上という長期にわたる処理において分解されてしまう可能性は低い。しかしながら、間葉系幹細胞の生存・増殖・変化に必要な栄養素を供給するためには培地を適宜交換することが好ましく、その際には新しく交換される培地にも交換前の培地と同程度の有機低分子量化合物を添加しておくことが好ましい。また、処理温度についても、本実施形態にかかる分化誘導剤は有機低分子量化合物であるため安定性に優れているので、温度の高低によって分解されてしまう可能性は低い。しかしながら、間葉系幹細胞の生存・増殖・変化に必要な環境を維持するためには培地を哺乳動物細胞の生存に適した温度にすることが好ましく、具体的には２０〜４５℃の範囲内にしておくことがよく、特に３０〜４０℃の間に維持することが好ましく、３６〜３８℃前後に設定することが最も好ましい。
【００６６】
この場合、間葉系幹細胞の培養方法は特に限定されないが、例えば温度感受性細胞シートなどの上で哺乳動物細胞の生存に適した培地中で有機低分子量化合物に接触されることが好ましい。例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｍｏｄｅｉｕｍ；ＤＭＥＭ）やヒト間葉系幹細胞専用培地（ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍ；ＭＳＣＢＭ）などの培地を好適に用いることができる。
【００６７】
その際、温度感受性細胞シートとしては、温度応答性ポリマー（ＰＩＰＡＡｍなど）やメチルセルロースを表面に重合させた培養皿などを用いることが好ましい。なぜなら、温度を低下させるのみで細胞に損傷を与えることなく、かつ細胞間の接着を保ったまま回収することが可能だからである。
【００６８】
＜再生医療上の用途＞
このようにして分化誘導された肝細胞は、肝細胞移植などの移植医療、薬の薬効や副作用を評価する創薬などの用途に好適に用いることができる。また、この肝細胞は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を用いて間葉系幹細胞から分化誘導されるので、蛋白製剤や核酸製剤を用いて分化誘導される場合に比べ製造時の安定性・安全性などの面で優れている。
【００６９】
また、このようにして分化誘導された肝細胞は、温度感受性培養皿やポリ−乳酸（ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール酸（ＰＧＡ）などの生分解性合成ポリマーを使用した合成ポリマースキャフォールドなどの基材を用いて所望の形態に成長させて再生医療用の肝組織または肝臓としても用いることができる。このようにして立体構造を形成された再生医療用の肝組織または肝臓は、肝細胞移植などの移植医療、薬の薬効や副作用を評価する創薬などの用途に好適に用いることができる。また、この肝組織または肝臓は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を用いて間葉系幹細胞から分化誘導されるので、蛋白製剤や核酸製剤を用いて分化誘導される場合に比べ製造時の安定性・安全性などの面で優れている。
【００７０】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７２】
本実施例では、Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制性低分子化合物のヒト間葉系幹細胞へ及ぼす効果について、２種類の細胞（骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）、臍帯血由来細胞（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１細胞））をヘキサクロロフェン、ケルセチン、イオノマイシン、ＰＫＦ−１１５−５８４の４種類の低分子化合物で処理した場合について（１）増殖能（毒性）の検討、（２）Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制能の検討、（３）肝細胞分化能の検討を検討項目とした。
【００７３】
＜実施例１＞
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現ベクター安定導入株の構築（ＵＥ７Ｔ−１３）
図１は、β−ｃａｔｅｎｉｎ／ＴＣＦ４／ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定発現するヒト間葉系幹細胞の樹立方法について説明するための概念図である。図１に示すように、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現ベクターを用いてｐＴＣＦ４−ＣＭＶｐｒｏ−ＧＬ４．２０プラスミドを構築した。ＴＣＦ４−ＣＭＶｐｒｏ−ＧＬ４．２０プラスミドは、３回繰り返しのＴＣＦ４配列ＣＣＴＴＴＧＡＴＣをＣＭＶプロモーターの上流に含み、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現する。また、ｐＣＭＶｐｒｏ−ＧＬ４．２０プラスミドをコントロールとして構築した。得られたプラスミドをそれぞれ線状化し、ＵＥ７Ｔ−１３にエレクトロポレーションによって導入し、培地中に加えたＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（０．２５μｇ／ｍｌ）によって選別した。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性の細胞はクローン化し、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイに用いることにした。
【００７４】
＜実施例２＞
ヘキサクロロフェンによる分化誘導
本発明者らは、骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）をヘキサクロロフェンで処理した場合について（１）増殖能（毒性）の検討、（２）Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制能の検討、（３）肝細胞分化能の検討を検討項目とした。
【００７５】
（１）増殖能（毒性）の検討（ＭＴＴアッセイ（ＵＥ７Ｔ−１３））
ヒト間葉系幹細胞株ＵＥ７Ｔ−１３を細胞密度が９．０ｘ１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるように９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（底面積：０．３ｃｍ^２）に播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩＮＣ）、１００Ｕ／ｍｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００ｕｇ／ｍｌｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，ニッスイ）にて培養した。この時点をｄａｙ０とする。翌日（ｄａｙ１）、ヘキサクロロフェンなどの低分子化合物を含むＤＭＥＭにメディウムチェンジした。以降、ｄａｙ２、ｄａｙ４、ｄａｙ８にＴｅｔｒａＣｏｌｏｒｏｎｅ（生化学工業）を用いて測定を行い、ＵＥ７Ｔ−１３の細胞増殖への影響を検討した。培養液に含まれるＤＭＳＯは、終濃度が０．１％となるようにした。
【００７６】
骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）をヘキサクロロフェンで処理した場合の結果を図２に示す。図２は、ヘキサクロロフェンによるＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ活性への影響を説明するためのグラフである。ヘキサクロロフェンで処理した場合には骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）の増殖が有意に抑制されたが、増殖能自体は抑制された状態ではあるが維持されていた。すなわち、ヘキサクロロフェンによる骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）への細胞毒性は十分に低く、分化誘導剤として使用可能な水準であることが判明した。特に、２μＭでのヘキサクロロフェンによる骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）への細胞毒性は非常に低いことが判明した。
【００７７】
（２）Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制能の検討（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ（ＵＥ７Ｔ−１３））
２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現ベクター安定導入株を播種し、３７℃で培養した。翌日、ＭＴＴアッセイの結果から細胞増殖に影響の無い濃度のヘキサクロロフェンなどの低分子化合物を含むメディウムに交換し、３７℃で培養した。その後、１，４，８日後にｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、５５６ｎｍの波長を蛍光プレートリーダー（ＡＲＶＩＯ）で測定した。
【００７８】
骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）をヘキサクロロフェンで処理した場合の結果を図２に示す。その結果、ｐＴＣＦ４−ＣＭＶルシフェラーゼプラスミドによるレポーターアッセイにより、０．８μＭでのヘキサクロロフェンによる骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）を処理すると、ヘキサクロロフェン処理８日後にはＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナルは有意に抑制されていることを確認した。
【００７９】
（３）肝細胞分化能の検討
（３−１）分化誘導（ＵＥ７Ｔ−１３）
６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに細胞密度が９．０ｘ１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるように播種し、３７℃で２４時間培養した。２４時間後に、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイにより検討した濃度のヘキサクロロフェンなどの低分子化合物を含むメディウムに交換した。以降、週に２回培地交換し、週に１回継代して細胞数を９．０ｘ１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２に調整した。誘導開始から８、１６、２４日目にＴｏｔａｌＲＮＡを回収した。
【００８０】
（３−２）ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（ＵＥ７Ｔ−１３）
ＴｏｔａｌＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬で抽出した。抽出後、ＤＮＡを完全に除くため、Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅを加えて３７℃で１時間インキュベートした。逆転写反応には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＦｉｒｓｔ−ＳｔａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、１μｇのＲＮＡをＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒにてｃＤＮＡへ変換した。ＰＣＲには、ｃＤＮＡを５倍希釈し、そのうち１μｌを使用した。ＰＣＲ反応には、ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ヒトアルブミンのプライマーは、５’−ＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴ−３’（配列番号：１）と５’−ＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＣ−３’（配列番号：２）を用いた。ＰＣＲ反応は、９５℃２分で１サイクル、９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒で３５サイクル施行した。内部対照としてヒトｇｌｙｃｅｒａｄｅｈｙｄｅ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）を用いた。ＧＡＰＤＨプライマーは、５’−ＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴ−３’（配列番号：３）と５’−ＣＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡ−３’（配列番号：４）を用いた。ＰＣＲ反応は、９５℃２分で１サイクル、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒で２０サイクル施行した。ＰＣＲ産物は、エチジウムブロマイドの入った２％アガロースゲルで３０分間電気泳動し、トランスイルミネ―ターを用いて写真を撮った。
【００８１】
図３は、ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導について説明するための電気泳動写真である。ヘキサクロロフェンによる処理の結果、肝細胞への分化誘導の代表的なマーカーであるアルブミン、ＡＦＰ、ＧＳ、ＣＹＰ１Ａ１、ＴＤＯ２などのマーカーの発現量がいずれもコントロールにくらべて明らかに増大していた。
【００８２】
（３−３）Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＵＥ７Ｔ−１３）
６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに７０％ＥｔＯＨで滅菌したカバーガラス（２２ｘ２２ｍｍ，ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）を入れ、その上に細胞を播種し、ヘキサクロロフェンなどの低分子化合物を含む培地で培養した。培養開始から８，１６，２４日後にＰＢＳで２回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで細胞を２０分間処理してカバーガラスに固定した。その後、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間透過処理した。３％ＢＳＡ／ＰＢＳで３０分間処理してブロッキングした。一次抗体としてａｎｔｉ−ａｌｂｕｍｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｔｉ−Ｃ／ＥＢＰａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｔｉ−ＡＦＰａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｔｉ−ＣＹＰ１Ａ１ａｎｔｉｂｏｄｙを用い、４℃で一晩インキュベートした。次に、二次抗体としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ４８８ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅａｎｔｉｂｏｄｙ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ５９４ｇｏａｔａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔａｎｔｉｂｏｄｙを用い、室温で１時間インキュベートした。核染色にＤＡＰＩを用いた。カバーガラスをＰＢＳで希釈した５０％ｇｌｙｃｅｒｏｌで封入し、共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。０．１％ＤＭＳＯで培養した細胞をコントロールとした。
【００８３】
図４は、ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導（ｄａｙ８）について説明するための蛍光顕微鏡写真である。ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導を行った結果、ヘキサクロロフェンによる処理８日後には、肝細胞への分化誘導の代表的なマーカーであるアルブミン、Ｃ／ＥＢＰα、ＡＦＰ、ＣＹＰ１Ａ１、ＴＤＯ２などのマーカーの発現量がいずれもネガティブコントロール（０．１％ＤＭＳＯ）にくらべて明らかに増大して、ポジティブコントロール（肝癌細胞のＨｕＨ７）に近い量になっていた。図５は、ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導（ｄａｙ１６）について説明するための蛍光顕微鏡写真である。ヘキサクロロフェンによる処理１６日後についても、同様の結果を得た。
【００８４】
（３−４）ＰｅｒｉｏｄｉｃＡｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）染色（ＵＥ７Ｔ−１３）
６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに７０％ＥｔＯＨで滅菌したカバーガラス（２２ｘ２２ｍｍ，ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）を入れ、その上に細胞を播種し、ヘキサクロロフェンなどの低分子化合物を含む培地で培養した。培養開始から８，１６，２４日後にＰＢＳで２回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで細胞を２０分間処理してカバーガラスに固定した。陰性対照として、１０ｍｇ／ｍｌのα−アミラーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ，０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ６．８）で１時間、３７℃でインキュベートしてグリコーゲンを消化した。１％過ヨウ素酸水溶液で１０分間酸化処理した後、Ｓｃｈｉｆｆ試薬で１５分間処理してグリコーゲンを染色し、亜硫酸水溶液で３回、蒸留水で３回洗浄した。Ｍａｙｅｒ’ｓｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで核染色した後、カバーガラスをＰＢＳで希釈した５０％ｇｌｙｃｅｒｏｌで封入し、光学顕微鏡下で観察した。０．１％ＤＭＳＯで培養した細胞をコントロールとした。
【００８５】
図６は、ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導能（ＰＡＳ染色）について説明するための顕微鏡写真である。ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導能（ＰＡＳ染色）を行った結果、細胞内のグリコーゲンの蓄積量がいずれもネガティブコントロール（０．１％ＤＭＳＯ）にくらべて明らかに増大して、ポジティブコントロール（肝癌細胞のＨｕＨ７）と同等になっていた。
【００８６】
図７は、ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導能について説明するためのグラフである。図４、図５、図６の結果を定量化したうえで図７にまとめて示すが、ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導能（ＰＡＳ染色）を行った結果、肝細胞への分化誘導の代表的なマーカーであるアルブミン、Ｃ／ＥＢＰα、ＣＹＰ１Ａ１などのマーカーの発現量がいずれもネガティブコントロール（０．１％ＤＭＳＯ）にくらべて明らかに増大して、ポジティブコントロール（肝癌細胞のＨｕＨ７）と同等になっていることにくわえて、ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導能（ＰＡＳ染色）を行った結果、細胞内のグリコーゲンの蓄積量がいずれもネガティブコントロール（０．１％ＤＭＳＯ）にくらべて明らかに増大して、ポジティブコントロール（肝癌細胞のＨｕＨ７）と同等になっていることがわかる。これは、単に肝細胞マーカーを有するのみでなく、機能性肝機能としての能力をもつことを示している。
【００８７】
（３−５）Ｕｒｅａアッセイ（ＵＥ７Ｔ−１３）
細胞を２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅに播種し、ヘキサクロロフェンなどの低分子化合物を含む培地で培養した。メディウムに塩化アンモニウム（終濃度５ｍＭ）を加え、４８，７２，９６時間培養後にメディウム中の尿素量をＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍＵｒｅａＡｓｓａｙＫｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍｓ）を使用し、５２０ｎｍの波長を蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いて測定した。
【００８８】
図８は、ヘキサクロロフェンによる分化誘導サンプルの尿素合成能（ｄａｙ８）について説明するためのグラフである。ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導能（尿素合成能測定）を８日間行った結果、細胞の尿素合成能がいずれもネガティブコントロール（０．１％ＤＭＳＯ）にくらべて明らかに増大して、ポジティブコントロール（肝癌細胞のＨｅｐＧ２）と同等になっていることがわかる。図９は、ヘキサクロロフェンによる分化誘導サンプルの尿素合成能（ｄａｙ１６）について説明するためのグラフである。ヘキサクロロフェンによる肝細胞分化誘導能（尿素合成能測定）を１６日間行った場合にも同様の結果が得られている。これは、単に肝細胞マーカーを有するのみでなく、機能性肝機能としての能力をもつことを示している。
【００８９】
＜実施例３＞
ケルセチンによる分化誘導
本発明者らは、２種類の細胞（骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）、臍帯血由来細胞（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１細胞））をケルセチンで処理した場合について（１）増殖能（毒性）の検討、（２）Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制能の検討、（３）肝細胞分化能の検討を検討項目とした。なお、実施例２のヘキサクロロフェンでの実験と同様の点については説明の煩雑を避けるために省略している。
【００９０】
増殖能（毒性）の検討
（１−１）骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）の場合
図１０は、ケルセチンによるＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ活性への影響（ＵＥ７Ｔ−１３）について説明するためのグラフである。なお、実験方法は実施例２で既に説明したので繰り返さず結果のみ説明する。ケルセチンで処理した場合にも骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）の増殖が有意に抑制されたが、増殖能自体は抑制された状態ではあるが維持されていた。すなわち、ケルセチンによる骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）への細胞毒性は十分に低く、分化誘導剤として使用可能な水準であることが判明した。特に、５μＭでのケルセチンによる骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）への細胞毒性は非常に低いことが判明した。
【００９１】
（１−２）ＭＴＴアッセイ（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１）
ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞株ＵＣＢＴＥＲＴ−２１を細胞密度が２．０ｘ１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるように９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（底面積：０．３ｃｍ^２）に播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩＮＣ）を含むＭＳＣＧＭ（三光純薬）にて培養した。この時点をｄａｙ０とする。翌日（ｄａｙ１）、ケルセチンなどの低分子化合物を含むＤＭＥＭにメディウムチェンジした。以降、ｄａｙ２、ｄａｙ４、ｄａｙ８にＴｅｔｒａＣｏｌｏｒｏｎｅ（生化学工業）を用いて測定を行い、ＵＣＢＴＥＲＴ−２１の細胞増殖への影響を検討した。培養液に含まれるＤＭＳＯは、終濃度が０．１％となるようにした。
【００９２】
図１２は、ケルセチンによる細胞増殖能への影響（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１）について説明するためのグラフである。ケルセチンで処理した場合にも臍帯血由来細胞（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１細胞）の増殖が有意に抑制されたが、増殖能自体は抑制された状態ではあるが維持されていた。すなわち、ケルセチンによる臍帯血由来細胞（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１細胞）への細胞毒性は十分に低く、分化誘導剤として使用可能な水準であることが判明した。特に、６μＭでのケルセチンによる臍帯血由来細胞（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１細胞）への細胞毒性は非常に低いことが判明した。
【００９３】
（２）Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制能の検討
（２−１）骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）の場合
図１０は、ケルセチンによるＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ活性への影響（ＵＥ７Ｔ−１３）について説明するためのグラフである。なお、実験方法は実施例２で既に説明したので繰り返さず結果のみ説明する。ＴＣＦ４−ＣＭＶルシフェラーゼプラスミドによるレポーターアッセイにより、１μＭでのケルセチンによる骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）を処理するとケルセチン処理８日後にはＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナルは有意に抑制されていることを確認した。
【００９４】
（２−２）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１）
２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅにＵＣＢＴＥＲＴ−２１を細胞密度が２．０ｘ１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるように播種し、３７℃で２４時間培養した。翌日、ＭＴＴアッセイの結果から細胞増殖に影響の無い濃度のケルセチンなどの低分子化合物を含むメディウムに交換し、３７℃で培養した。その後、１，４，８日後にレポーター遺伝子をトランスフェクションした。トランスフェクションにはＦｕｇｅｎｅ６ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。さらに２４時間後に、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性をＤｕａｌＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。
【００９５】
図１２は、ケルセチンによるＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ活性への影響について説明するためのグラフである。ケルセチンで処理した場合にも臍帯血由来細胞（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１細胞）の増殖が有意に抑制されたが、増殖能自体は抑制された状態ではあるが維持されていた。すなわち、ケルセチンによる臍帯血由来細胞（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１細胞）への細胞毒性は十分に低く、分化誘導剤として使用可能な水準であることが判明した。特に、５μＭでのケルセチンによる臍帯血由来細胞（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１細胞）への細胞毒性は非常に低いことが判明した。また、ｐＴＣＦ４−ＣＭＶルシフェラーゼプラスミドによるレポーターアッセイにより、１μＭでのケルセチンによる臍帯血由来細胞（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１細胞）を処理するとケルセチン処理８日後にはＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナルは有意に抑制されていることを確認した。
【００９６】
（３）肝細胞分化能の検討
（３−１）骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）の場合
図１１は、ケルセチンによる肝細胞分化誘導能（ＵＥ７Ｔ−１３）について説明するための電気泳動写真である。なお、実験方法は実施例２で既に説明したので繰り返さず結果のみ説明する。ケルセチンによる処理の結果、肝細胞への分化誘導の代表的なマーカーであるアルブミンの発現量がいずれもコントロールにくらべて明らかに増大していた。
（３−２）分化誘導（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１）
６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに細胞密度が２．０ｘ１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるように播種し、３７℃で２４時間培養した。２４時間後に、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイにより検討した濃度のケルセチンなどの低分子化合物を含むメディウムに交換した。以降、週に２回培地交換し、週に１回継代して細胞数を２．０ｘ１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２に調整した。誘導開始から８、１６、２４日目にＴｏｔａｌＲＮＡを回収した。
【００９７】
（３−３）ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１）
ＴｏｔａｌＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙＭｉｃｒｏＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。逆転写反応には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＦｉｒｓｔ−ＳｔａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、０．５μｇのＲＮＡをＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒにてｃＤＮＡへ変換した。ＰＣＲには、ｃＤＮＡを５倍希釈し、そのうち１μｌを使用した。ＰＣＲ反応には、ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ヒトアルブミンのプライマーは、５’−ＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴ−３’（配列番号：５）と５’−ＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＣ−３’（配列番号：６）を用いた。ＰＣＲ反応は、９５℃２分で１サイクル、９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒で３５サイクル施行した。内部対照としてヒトｇｌｙｃｅｒａｄｅｈｙｄｅ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）を用いた。ＧＡＰＤＨプライマーは、５’−ＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴ−３’（配列番号：７）と５’−ＣＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡ−３’（配列番号：８）を用いた。ＰＣＲ反応は、９５℃２分で１サイクル、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒で２０サイクル施行した。ＰＣＲ産物は、エチジウムブロマイドの入った２％アガロースゲルで３０分間電気泳動し、トランスイルミネ―ターを用いて写真を撮った。
【００９８】
図１３は、ケルセチンによる肝細胞分化誘導能（ＵＣＢＴＥＲＴ細胞）について説明するための電気泳動写真である。ケルセチンによる処理の結果、肝細胞への分化誘導の代表的なマーカーであるアルブミン、ＡＦＰ、ＧＳ、ＣＹＰ１Ａ１、ＴＤＯ２などのマーカーの発現量がいずれもコントロールにくらべて明らかに増大していた。図１４は、ケルセチンによる肝細胞分化誘導能（ＵＣＢＴＥＲＴ細胞）について説明するための電気泳動写真である。ケルセチンによる処理の結果、肝細胞への分化誘導の代表的なマーカーであるアルブミン、ＥｐＣＡＭの発現量がコントロールにくらべて明らかに増大していた。
【００９９】
（３−４）Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１）
図１５は、ケルセチンによる肝細胞分化誘導（ｄａｙ２４）について説明するための蛍光顕微鏡写真である。なお、実験方法はＵＥ７Ｔ−１３およびＵＣＢＴＥＲＴ−２１で共通であり、実施例２で既に説明したので繰り返さず結果のみ説明する。ケルセチンによる肝細胞分化誘導を行った結果、ケルセチンによる処理２４日後には、肝細胞への分化誘導の代表的なマーカーであるアルブミン、Ｃ／ＥＢＰαなどのマーカーの発現量がいずれもネガティブコントロール（０．１％ＤＭＳＯ）にくらべて明らかに増大して、ポジティブコントロール（肝癌細胞のＨｕＨ７）に近い量になっていた。図１６は、ケルセチンによる肝細胞分化誘導について説明するためのグラフである。図１５の結果を定量化して示すと、ケルセチンによる処理２４日後には、肝細胞への分化誘導の代表的なマーカーであるアルブミン、Ｃ／ＥＢＰαなどのマーカーの発現量がいずれもネガティブコントロール（０．１％ＤＭＳＯ）にくらべて明らかに増大していた。
【０１００】
（３−５）Ｕｒｅａアッセイ（ＵＣＢＴＥＲＴ−２１）
図１７は、ケロセチンによる分化誘導サンプルの尿素合成能（ｄａｙ２４）について説明するためのグラフである。なお、実験方法はＵＥ７Ｔ−１３およびＵＣＢＴＥＲＴ−２１で共通であり、実施例２で既に説明したので繰り返さず結果のみ説明する。ケロセチンによる肝細胞分化誘導能（尿素合成能測定）を２４日間行った結果、尿素合成時間が４８時間、ケロセチン投与量が５μＭの条件では、細胞の尿素合成能がネガティブコントロール（０．１％ＤＭＳＯ）にくらべて有意に増大して、ポジティブコントロール（肝癌細胞のＨｅｐＧ２）と同等になっていることがわかる。これは、単に肝細胞マーカーを有するのみでなく、機能性肝機能としての能力をもつことを示している。
【０１０１】
＜実施例４＞
イオノマイシンによる分化誘導
本発明者らは、骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）をイオノマイシンで処理した場合について（１）増殖能（毒性）の検討、（２）Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制能の検討、（３）肝細胞分化能の検討を検討項目とした。なお、実施例２のヘキサクロロフェンまたは実施例３のケルセチンでの実験と同様の点については説明の煩雑を避けるために省略している。
【０１０２】
（１）増殖能（毒性）の検討
図１８は、イオノマイシンによる細胞増殖能への影響（ＵＥ７Ｔ−１３）について説明するためのグラフである。なお、実験方法は実施例２で既に説明したので繰り返さず結果のみ説明する。イオノマイシンで処理した場合にも骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）の増殖が有意に抑制されたが、増殖能自体は抑制された状態ではあるが維持されていた。すなわち、イオノマイシンによる骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）への細胞毒性は十分に低く、分化誘導剤として使用可能な水準であることが判明した。特に、０．１μＭでのイオノマイシンによる骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）への細胞毒性は非常に低いことが判明した。
【０１０３】
（２）Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制能の検討
図１８は、イオノマイシンによるＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ活性への影響（ＵＥ７Ｔ−１３）について説明するためのグラフである。なお、実験方法は実施例２で既に説明したので繰り返さず結果のみ説明する。ＴＣＦ４−ＣＭＶルシフェラーゼプラスミドによるレポーターアッセイにより、０．０１μＭでのイオノマイシンによる骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）を処理するとイオノマイシン処理８日後にはＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナルは有意に抑制されていることを確認した。
【０１０４】
（３）肝細胞分化能の検討
図１１は、イオノマイシンによる肝細胞分化誘導能（ＵＥ７Ｔ−１３）について説明するための電気泳動写真である。なお、実験方法は実施例２で既に説明したので繰り返さず結果のみ説明する。イオノマイシンによる処理の結果、肝細胞への分化誘導の代表的なマーカーであるアルブミンの発現量がいずれもコントロールにくらべて明らかに増大していた。
【０１０５】
＜実施例５＞
ＰＫＦ−１１５−５８４による分化誘導
本発明者らは、骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）をＰＫＦ−１１５−５８４で処理した場合について（１）増殖能（毒性）の検討、（２）Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制能の検討、（３）肝細胞分化能の検討を検討項目とした。なお、実施例２のヘキサクロロフェン、実施例３のケルセチンまたは実施例４のイオノマイシンでの実験と同様の点については説明の煩雑を避けるために省略している。
【０１０６】
（１）増殖能（毒性）の検討
図１９は、ＰＫＦ−１１５−５８４による増殖能への影響（ＵＥ７Ｔ−１３）について説明するためのグラフである。なお、実験方法は実施例２で既に説明したので繰り返さず結果のみ説明する。ＰＫＦ−１１５−５８４で処理した場合にも骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）の増殖が有意に抑制されたが、増殖能自体は抑制された状態ではあるが維持されていた。すなわち、ＰＫＦ−１１５−５８４による骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）への細胞毒性は十分に低く、分化誘導剤として使用可能な水準であることが判明した。特に、５ｎＭでのＰＫＦ−１１５−５８４による骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）への細胞毒性は非常に低いことが判明した。
【０１０７】
（２）Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路抑制能の検討
図１９は、ＰＫＦ−１１５−５８４によるＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ活性への影響（ＵＥ７Ｔ−１３）について説明するためのグラフである。なお、実験方法は実施例２で既に説明したので繰り返さず結果のみ説明する。ＴＣＦ４−ＣＭＶルシフェラーゼプラスミドによるレポーターアッセイにより、３ｎＭでのＰＫＦ−１１５−５８４による骨髄由来細胞（ＵＥ７Ｔ−１３細胞）を処理するとＰＫＦ−１１５−５８４処理８日後にはＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナルは有意に抑制されていることを確認した。
【０１０８】
（３）肝細胞分化能の検討
図２０は、ＰＫＦ−１１５−５８４による肝細胞分化誘導能（ＵＥ７Ｔ−１３）について説明するための電気泳動写真である。なお、実験方法は実施例２で既に説明したので繰り返さず結果のみ説明する。ＰＫＦ−１１５−５８４による処理の結果、肝細胞への分化誘導の代表的なマーカーであるアルブミン、ＡＦＰの発現量がいずれもコントロールにくらべて明らかに増大していた。
【０１０９】
＜結果の考察＞
上記の実施例の実験結果から、本発明者らは、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を用いてヒト間葉系幹細胞を機能性肝細胞へ分化誘導可能であることを明らかにした。つまり、肝再生医療の実現化に向けて、間葉系幹細胞は肝再生医療の細胞ソースとして有用であり、さらに分化誘導時に有機低分子量化合物によるＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナルの抑制が有効であることを明らかにした。これらは、真に臨床応用可能な肝再生医療の開発をしていく上で重要な知見であり、今後さらなる研究の進展が必要である。
【０１１０】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０１１１】
たとえば、上記実施例では、４種類の有機低分子化合物に限定して説明したが、その他のＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナルの抑制能を有する有機低分子化合物を用いてもよい。この場合にも、既に４種類の有機低分子化合物によって間葉系幹細胞を幹細胞に分化誘導できることが示されているので、当業者であればその他のＷｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナルの抑制能を有する有機低分子化合物でも同様に間葉系幹細胞を幹細胞に分化誘導できることを理解できる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の肝細胞への分化誘導剤であって、
Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制する有機低分子量化合物を含む、分化誘導剤。
【請求項２】
請求項１記載の分化誘導剤において、
前記有機低分子量化合物の分子量が１０００以下である、分化誘導剤。
【請求項３】
請求項１または２記載の分化誘導剤において、
前記有機低分子量化合物が、ペプチドおよびヌクレオチドを除く、分化誘導剤。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれかに記載の分化誘導剤において、
前記有機低分子量化合物が、ヘキサクロロフェン、ケルセチン、イオノマイシン、ＰＫＦ１１５−５８４からなる群から選ばれる１種以上の化合物またはその類縁体である、分化誘導剤。
【請求項５】
請求項４記載の分化誘導剤において、
前記有機低分子量化合物が、式（１）〜式（４）に示す化合物群から選ばれる１種以上の有機低分子量化合物またはその類縁体である、分化誘導剤。
【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載の分化誘導剤において、
前記間葉系幹細胞が、骨髄由来細胞または臍帯血由来細胞である、分化誘導剤。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれかに記載の分化誘導剤において、
前記間葉系幹細胞におけるアルブミン、Ｃ／ＥＢＰα、ＣＹＰＡ１／Ａ２およびＡＦＰからなる群から選ばれる１種以上の蛋白質の発現を誘導する、分化誘導剤。
【請求項８】
請求項１乃至７いずれかに記載の分化誘導剤において、
前記間葉系幹細胞におけるグリコーゲン生産能または尿素合成能を増強する、分化誘導剤。
【請求項９】
間葉系幹細胞から肝細胞を生産する方法であって、
間葉系幹細胞を請求項１乃至８いずれかに記載の分化誘導剤で処理する工程を含む、生産方法。
【請求項１０】
請求項９記載の生産方法において、
前記分化誘導剤で処理する工程が、前記間葉系幹細胞を前記分化誘導剤で８日以上処理する工程を含む、生産方法。
【請求項１１】
間葉系幹細胞から分化誘導された肝細胞であって、
間葉系幹細胞を請求項１乃至８いずれかに記載の分化誘導剤で処理してなる、肝細胞。
【請求項１２】
再生医療用の肝組織であって、
請求項１１記載の肝細胞を含む、肝組織。
【請求項１３】
再生医療用の肝臓であって、
請求項１１記載の肝細胞を含む、肝臓。

【図１】