ヒト心血管前駆細胞
本発明は、ヒト心血管前駆細胞の集団、前記細胞を作製する方法、ならびに心血管コロニーの集団及び心筋細胞の集団を産生するために前記細胞を使用する方法を提供する。心筋細胞置換療法の方法をも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年３月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／０４０，０４９号の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた試験開発の記載）
本発明は、米国立衛生試験所によって授与された助成金番号第Ｒ０１ＨＬ７１８００−０１号及びＰ２０−ＧＭ０７５０１号の下で政府による後援を受けて実施された。米国政府は、本発明に関して所定の権利を有することができる。
【０００３】
（技術分野）
胚発生中、身体の組織は、３つの主要な細胞集団である外胚葉、中胚葉及び胚性内胚葉から形成される。これらの細胞集団は、原発胚細胞層としても公知であり、原腸形成として公知のプロセスを通して形成される。原腸形成後に、各原発胚細胞層は特定セットの細胞集団及び組織を生成する。中胚葉は血球、内皮細胞、心筋及び骨格筋、ならびに脂肪細胞を生じさせる。胚性内胚葉は、肝臓、膵臓及び肺を生成する。外胚葉は、神経系、皮膚及び副腎組織を生じさせる。これらの胚細胞層からの組織発達のプロセスは、複雑な分子変化を反映する複数の分化工程を含んでいる。中胚葉及びその誘導体に関して、３つの別個のステージが規定されてきた。その第１は、胚盤葉上層として公知の構造内の細胞からの中胚葉の誘導である。新生中胚葉としても公知である新規に形成された中胚葉は、初期胚内の将来の組織発達の部位となる様々な位置へ移動する。このプロセスは、パターニングとして公知であり、特定組織に向かう初期分化ステージを反映する可能性が高い一部の分子変化を必要とする。最終ステージは、特異化として公知であり、パターン化された中胚葉亜集団からの別個の組織の発生を含んでいる。
【背景技術】
【０００４】
これまでに得られた証拠は、中胚葉が別個の発生能を備える亜集団を表す連続する波のように誘導されることを示唆している。最初に形成された中胚葉は胚外領域へ移動して造血細胞及び内皮細胞を生じさせるが、次の集団は発生中の胚内で前方へ移動して心臓及び頭部の間葉となる。これらの分化系列関係は、最初は組織学的分析を通して規定され、その後は主として細胞追跡試験によって確証されてきた。造血への関与に関しては、現在ではＥＳ細胞分化モデルからの研究、及びマウス胚上での研究から、最初に同定できる前駆細胞は血管芽細胞として公知の細胞であり、血管能力もまた示す細胞であるという強力な証拠が得られている（非特許文献１、非特許文献２）。この前駆細胞についての分析は、この前駆細胞が中胚葉遺伝子ブラキュリ及び受容体チロシンキナーゼＦｌｋ−１を共発現することを明らかにしたが、これは中胚葉の亜集団が造血及び血管分化系列へ関与することを表すことを示している（非特許文献３）。分化系列追跡試験は、心臓がＦｌｋ−１＋集団から発達することを証明したが、これは心血管系のための同等の多能性細胞が存在する可能性があることを示唆している（非特許文献４）。ＥＳ細胞分化培養の分析は、心臓及び内皮潜在力を備えるＦｌｋ−１＋前駆細胞の存在についての証拠を提供した（非特許文献５）。近年の試験もまた、複数の心血管分化系列を生じさせることのできるマウス心血管前駆細胞の存在を支持している（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。ヒト心血管前駆細胞集団は、これまで同定されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：７２５−７３２
【非特許文献２】Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：６２５−３０
【非特許文献３】Ｆｅｈｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３０：４２１７−４２２７
【非特許文献４】Ｅｍａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７：１１１−１１７
【非特許文献５】Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＦＡＳＥＢ １９：１５３４−１５３６
【非特許文献６】Ｋａｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｄｅｖ． Ｃｅｌｌ １１：７２３−７３２
【非特許文献７】Ｍｏｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２７：１１５１−１１６５
【非特許文献８】Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｃｅｌｌ １２７：１１３７−１１５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヒト心血管前駆細胞の濃縮集団を提供する。ヒト心血管前駆細胞は、細胞表面マーカーであるＫＤＲの存在及び細胞表面マーカーであるＣ−ＫＩＴの非存在を特徴とする。ヒト心血管前駆細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで心筋細胞、内皮細胞、ならびに血管平滑筋細胞に分化することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
また別の実施形態では、本発明は、ヒト胚様体（ＥＢ）からヒト心血管前駆細胞を産生する方法であって、前記ＥＢをアクチビン及び骨形成因子（ＢＭＰ）及び任意で塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の存在下で培養する工程と、引き続いてヒト心血管前駆細胞を提供するためにＷｎｔ成長因子の阻害剤及び任意で血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の存在下で培養する工程と、ならびに前記細胞培養から前記細胞を収集する工程とを含む方法を提供する。
【０００８】
また別の実施形態では、本発明は、少なくとも約３０％及び好ましくは少なくとも約４０％、及びより好ましくは少なくとも約５０％のヒト心筋細胞を含有する細胞集団を発生させる方法であって、前記ヒト心血管前駆細胞をＷｎｔの阻害剤及び任意でＶＥＧＦの存在下で培養する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、細胞は、単層として培養される。また別の実施形態では、細胞は、凝集体として培養される。心筋細胞の存在は、細胞の収縮活性を評価する工程によって、または例えば心トロポニンＴ（ＣＴＮＴ）などの心筋細胞の指標となる遺伝子の発現を測定する工程によって決定できる。
【０００９】
本発明は、心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞を含有するヒト心血管コロニーを発生させる方法であって、前記ヒト心血管前駆細胞をＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程を含む方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、細胞は、メチルセルロース中で培養される。
【００１０】
ヒト心血管前駆細胞及びそれに由来する分化細胞は、心血管前駆細胞、心筋細胞、内皮細胞、血管平滑筋細胞、及び心血管組織に影響を及ぼす薬剤についてスクリーニングする方法において有用である。
【００１１】
ヒト心血管前駆細胞は、また増殖及び貯蔵のため、ならびに心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞の起源としても有用である。
【００１２】
ヒト心血管前駆細胞及びそれに由来する分化細胞は、また哺乳動物における心臓機能を改善もしくは再構成するため、及び移植のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで心血管組織を操作するための方法においても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態によってヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）から心臓分化系列への分化を方向付けるために使用されるプロトコルの略図である。
【図２】ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ及びアクチビンＡの組み合わせを用いて誘導されたＥＢ内でのＣＴＮＴ＋細胞発達の動態を示す。ＥＢを、表示時点に収集し、ＣＴＮＴを発現する細胞の頻度について細胞内フローサイトメトリーによって分析した。
【図３】異なるステージでのＷｎｔシグナル伝達経路の操作後の１４日齢ＥＢ内でのＣＴＮＴ＋細胞の頻度を示す。
【図４】誘導ステージ中のＢＭＰ４、アクチビンＡ及びｂＦＧＦの組み合わせにおける培養後の、１４日齢ＥＢ内でのＣＴＮＴ＋細胞の頻度を示す。
【図５】ＶＥＧＦ及びＤＫＫ１の表示した組み合わせを用いて処置した１４日齢ＥＢについての２４ウェルプレートの１ウェル当たりのＣＴＮＴ＋細胞の総数を示す。図１〜５については、バーは、３回の独立実験の標準誤差または平均値を表す。統計的分析は、対応のないｔ検定を用いて実施した。＊Ｐ＝０．０７、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６】異なる発達ステージでのＥＢの遺伝子発現分析を示す。
【図７】異なる日齢でのＥＢのフローサイトメトリー分析を示す。
【図８】６日齢ＥＢから単離した３つの集団の定量的ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子分析を示す。
【図９】３つの６日齢集団の心臓電位を示す。
【図１０】６日齢ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団の心臓電位を示す。
【図１１】６日齢ＥＢ由来ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ分画から発生した付着性集団の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析を示す。
【図１２】ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団の培養の１０〜１２日後のＣＴＮＴ＋、ＣＤ３１＋及びＳＭＡ＋細胞の存在についての分析を示す。
【図１３】混合ＲＦＰ／ＧＦＰ培養から単離された４日齢心血管コロニーの発現分析を示す。
【図１４】プレーティングしたＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞の数と発達する心血管コロニーの数との関係を示す細胞用量反応を示す。
【図１５】ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来心筋細胞中で自然に発現した一過性外向きＫ＋電流（Ｉｔｏ）の全細胞電位固定記録の代表的追跡を示す。
【図１６】図１５に示したように、細胞についての平均電流密度−電位関係を示す。１バッチの細胞１０個中８個はＩｔｏ電流を示し、平均値±ＳＥＭ電流密度はこれらの８個の細胞からの追跡を用いてプロットした。
【図１７】図１６におけるような細胞についてのピーク電流までの平均時間（黒い四角）及び不活性化τ（白い四角）を示す（ｎ＝８）。
【図１８】２〜３週間にわたってＭＥＡ（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）培養皿内で培養した６日齢ＥＢから単離したＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞についての電気活動を示す。細胞外電気活動は、１μＭキニジン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、または用いずに記録した。
【図１９】ｈＥＳＣ培養内での心血管前駆細胞の発達を示すモデルを示す。
【図２０】未分化ｈＥＳ２細胞、４日齢ＥＢ及び収縮性心筋細胞を備える１４日齢ＥＢの画像を示す（倍率２００倍）。
【図２１】ＥＢ内でのＣＴＮＴ＋細胞発達の動態を示す。
【図２２】図１に示したプロトコルを用いて誘導された収縮性ＥＢ発達の動態を示す。１５０〜２００個のＥＢが、収縮性ＥＢの存在について各時点でスコア付けされた。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。
【図２３】グラフの下方に示した因子の組み合わせを用いて誘導した後の１４日齢ＥＢ内での２４ウェルプレートの１ウェル当たりの細胞総数を示す。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。統計的分析は、対応のないｔ検定を用いて実施した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２４】グラフの下方に示した因子の組み合わせを用いて誘導した後の１４日齢ＥＢ内での２４ウェルプレートの１ウェル当たりのＣＴＮＴ＋細胞の総数を示す。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。統計的分析は、対応のないｔ検定を用いて実施した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２５】ＶＥＧＦ及びＤＫＫの表示した組み合わせを用いて処置した１４日齢ＥＢ由来のＣＴＮＴ＋細胞の頻度を示す。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。統計的分析は、対応のないｔ検定を用いて実施した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２６】ＶＥＧＦ及びＤＫＫの表示した組み合わせを用いて処置した１４日齢ＥＢについての２４ウェルプレートの１ウェル当たりのＣＴＮＴ＋細胞の総数を示す。
【図２７】６日齢のＥＢから単離した３つの集団の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。シクロフィニン（ｃｙｃｌｏｐｈｉｎｉｎ）に対して標準化した平均発現を示した。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。
【図２８】６日齢ＥＢから単離されたＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団の単層培養中での１０〜１４日後の相対細胞数のグラフである。９６ウェルプレートの１ウェル当たり４０，０００個の細胞は、グラフの下方に示した因子の組み合わせを用いて誘導した。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。
【図２９】Ｈ１ ｈＥＳＣから発生したＥＢ内での３つの異なるＫＤＲ／Ｃ−ＫＩＴ集団の発生を証明しているフローサイトメトリー分析を示す。
【図３０】７日間の培養後のＨ１ ｈＥＳＣ由来ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ分画からのＣＴＮＴ＋細胞の発達を示す。
【図３１】ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養されたＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来付着性集団の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析を示す。培養は規定時点に収集され、表示した遺伝子の発現について分析された。シクロフィニンに対して標準化した平均発現を示した。
【図３２】ｈＥＳ２由来ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団から発生した個々の４日齢心血管コロニーの発現分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ヒト心血管前駆細胞の集団を提供する。本発明のヒト心血管前駆細胞は、適切な条件下では、心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞へ分化することができる。ヒト心血管前駆細胞は、チロシンキナーゼ受容体ＫＤＲの発現及びチロシンキナーゼ受容体Ｃ−ＫＩＴの発現の欠如を特徴とする。
【００１５】
本発明の一実施形態では、ヒト心血管前駆細胞は、胚様体（ＥＢ）から入手される。ＥＢは、広範囲の分化系列から発達する集団を含有する三次元コロニーである。胚幹細胞（ＥＳＣ）からＥＢを形成するための条件は、当技術分野において公知である。例えば、胚フィーダー細胞上に維持されたヒトＥＳＣは、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）などの基底膜マトリックスの層上で培養し、小クラスターを形成するために解離させ、そしてＢＭＰの存在下で無血清培地中においてプレーティングすることによってフィーダーを枯渇させることができる。本発明の好ましい一実施形態では、フィーダーを枯渇させたヒトＥＳＣがＥＢを形成するために約１日間にわたりＢＭＰ４の存在下で無血清培地中にて培養される。また別の好ましい実施形態では、ＢＭＰ４の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１．０ｎｇ／ｍｌ、及びより好ましくは約０．５ｎｇ／ｍｌである。
【００１６】
ヒトＥＳＣは、市販で、または当技術分野において公知の方法によって入手できる。例えば、ヒトＥＳＣは、当技術分野において公知の方法、及び例えばＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，８４３，７８０号明細書に開示された方法、及びＲｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １８：３９９による方法によって胚盤胞から調製できる。
【００１７】
ＥＢは、当技術分野において公知の方法、及び例えばＴａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ １３１：８６１及びＭａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６：１９９８によって開示された方法によって誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）から形成することもできる。
【００１８】
本発明のヒト心血管前駆細胞は、ヒトＥＢをアクチビン及びＢＭＰの存在下で無血清培地中において培養する工程と、次に心血管前駆細胞の集団を提供するためにＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程と、及び任意で前記培養から細胞を収集する工程と、さらに任意で心血管前駆細胞のための収集された細胞集団を濃縮する工程とによって入手することができる。好ましい実施形態では、アクチビンはアクチビンＡであり、ＢＭＰはＢＭＰ４であり、Ｗｎｔの阻害剤はＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ−１）である。
【００１９】
本発明のまた別の実施形態は、ヒト心血管前駆細胞を産出するための方法であって、ヒトＥＢを約１〜約４日間にわたりアクチビンＡ及びＢＭＰ４及び任意のｂＦＧＦの存在下で無血清培地中において培養する工程と、及び引き続き前記細胞を約１〜２日間にわたりＤＫＫ−１及び任意のＶＥＧＦの存在下で無血清培地中において培養する工程と、細胞集団を収集する工程と、ならびに任意でヒト心血管前駆細胞について前記集団を濃縮する工程とを含む方法を提供する。
【００２０】
好ましい実施形態では、ＥＢは、アクチビンＡ及びＢＭＰ４及び任意のｂＦＧＦの存在下で約４日間にわたり培養される。アクチビンＡ、ＢＭＰ４及び任意のｂＦＧＦの濃度は、Ｔ及びＷＮＴ３Ａの発現のアップレギュレーションを特徴とする細胞の原始線条様集団を誘導するために十分である。その後の工程では、ＤＫＫ−１及び任意のＶＥＧＦの濃度は、心血管前駆細胞の集団を提供するために十分である。
【００２１】
好ましい実施形態では、アクチビンＡの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌ、及びより好ましくは約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５．０ｎｇ／ｍｌである。最も好ましい実施形態では、アクチビンＡの濃度は、約３．０ｎｇ／ｍｌである。
【００２２】
好ましい実施形態では、ＢＭＰ４の濃度は、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約２０．０ｎｇ／ｍｌ、及びより好ましくは約５．０ｎｇ／ｍｌ〜約１５ｎｇ／ｍｌである。最も好ましい実施形態では、ＢＭＰ４の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌである。
【００２３】
好ましい実施形態では、ｂＦＧＦの濃度は、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約１０．０ｎｇ／ｍｌ、及びより好ましくは約３．０ｎｇ／ｍｌ〜約６．０ｎｇ／ｍｌである。最も好ましい実施形態では、ｂＦＧＦの濃度は、約５．０ｎｇ／ｍｌである。
【００２４】
好ましい実施形態では、ＤＫＫ１の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌ、及びより好ましくは約１２５ｎｇ／ｍｌ〜約１７５ｎｇ／ｍｌである。最も好ましい実施形態では、ＤＫＫ１の濃度は、約１５０ｎｇ／ｍｌである。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、ＶＥＧＦの濃度は、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５０．０ｎｇ／ｍｌ、及びより好ましくは約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約２５．０ｎｇ／ｍｌである。最も好ましい実施形態では、ＶＥＧＦの濃度は、約１０．０ｎｇ／ｍｌである。
【００２６】
本発明のまた別の好ましい実施形態では、ヒトＥＢは、約４日間にわたり無血清培地中、約３．０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、約１０．０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び約５．０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの存在下で培養されるが、その時点に約１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１及び約１０．０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦが加えられ、細胞は心血管前駆細胞を産生するために約１〜２日間にわたり培養される。また別の好ましい実施形態では、前記集団は、例えばＫＤＲを発現するがＣ−ＫＩＴを発現しない細胞を選別することによって、心血管前駆細胞に濃縮される。好ましい実施形態では、この選別は、免疫選択によって、例えばフローサイトメトリーによって行われる。
【００２７】
また別の実施形態では、本発明は、ヒト心筋細胞の集団を発生させる方法であって、前記ヒト心血管前駆細胞を約７〜約１０日間にわたりＷｎｔの阻害剤及び任意にＶＥＧＦの存在下で培養する工程と、及び培養からヒト心筋細胞の集団を収集する工程とを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、Ｗｎｔの阻害剤はＤＫＫ１であり、ＤＫＫ１及びＶＥＧＦの好ましい濃度は、上記に記載したとおりである。１つの好ましい実施形態では、細胞は、ゼラチンコーティングウェル内の単層としてプレーティングされる。また別の実施形態では、細胞は、凝集体として低クラスター培養皿内で培養される。ヒト心筋細胞の集団は、少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、及びより好ましくは少なくとも約５０％の心筋細胞を含有している。他の実施形態では、ヒト心筋細胞の集団は、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、及び１００％までの心筋細胞を含有している。心筋細胞は、細胞の収縮活性を評価する工程によって、または例えばＣＴＮＴなどの心筋細胞の指標となる遺伝子の発現を測定する工程によって同定できる。
【００２８】
本発明のヒト心血管前駆細胞はさらにまた、当業者には公知の分化条件を用いて、例えば心房、心室、及びペースメーカー細胞を含む心筋細胞の亜集団を発生させるために有用である。
【００２９】
また別の実施形態では、本発明は、心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞を含有する心血管コロニーを発生させる方法であって、前記ヒト心血管前駆細胞を約３〜約７日間にわたりＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＷｎｔの阻害剤、好ましくはＤＫＫ１の存在下で培養する工程を含む方法を提供する。好ましい実施形態では、細胞は、メチルセルロース中にプレーティングされる。ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＤＫＫの好ましい濃度は、上記に記載したとおりである。心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞の存在は、例えばＣＴＮＴなどの心筋細胞の指標となる遺伝子、及び例えばＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンなどの内皮細胞の指標となる遺伝子ならびに例えばＳＭＡ及びカルポニンなどの血管平滑筋細胞の指標となる遺伝子の発現を測定する工程によって決定できる。
【００３０】
本発明は、ヒト心血管前駆細胞、心血管コロニー、心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞に作用を及ぼす薬剤についてスクリーニングするための方法をさらに提供する。本方法は、上記に記載した細胞集団の１つに由来する細胞を候補薬と接触させる工程と、及び前記薬剤が前記細胞集団に作用を及ぼすかどうかを決定する工程とを含んでいる。試験対象の薬剤は、天然もしくは合成、１つの化合物もしくは混合物、低分子またはポリペプチド、多糖類、ポリヌクレオチドなどを含むポリマー、抗体もしくはそのフラグメント、１ライブラリーの天然もしくは合成化合物からの化合物、理論的薬物設計から得られた化合物、例えば細胞培養条件などの条件、または細胞集団に及ぼす作用を当技術分野において公知のアッセイを用いて評価できる任意の薬剤であってよい。細胞集団に及ぼす作用は、例えば、マーカー発現、受容体結合、収縮能力、電気生理学、細胞生存能力、生存率、形態、またはＤＮＡ合成もしくは修復についてのアッセイを含む、表現型もしくは活性についての任意の標準アッセイによって決定することができる。標準増殖及び分化アッセイは、米国特許第６，１１０，７３９号明細書に記載されている。そのような薬剤は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞成長、分化及び生存率の制御、ならびに組織の維持、再生及び修復のために有用である。
【００３１】
本発明は、ヒト心血管前駆細胞の集団を含む組成物及びヒト心血管コロニーの集団を含む組成物をさらに提供する。本組成物は、薬学的に許容される担体及び希釈剤を含むことができる。本組成物は、移植を促進する成分をさらに含むことができる。これらの集団を含む組成物は、細胞及び組織の置換及び修復のため、ならびに心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞の集団をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで発生させるために有用である。ヒト心血管前駆細胞を含む組成物は、前駆細胞集団を拡張させるために有用である。本組成物は、心臓の状態を治療するための医薬品または送達装置として調製できる。
【００３２】
また別の実施形態では、本発明は、例えば、先天性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋症、心内膜炎及びうっ血性心不全を含む不十分な心臓機能を特徴とする障害を治療するために有用な細胞置換方法及び組織置換方法を提供する。分化細胞及び心血管前駆細胞はどちらも置換療法のために有用であるが、それは前駆細胞集団が心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞分化系列へｉｎ ｖｉｖｏで分化できるためである。これらの細胞はさらにｉｎ ｖｉｔｒｏで心血管細胞を発生させるためにも有用である。心臓組織を操作するための方法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｂｉｒｌａによって“Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｐａｉｒ” Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ２００６で概説されている。
【００３３】
したがって、一実施形態では、本発明は、心筋細胞置換療法のための方法であって、当該治療を必要とする被験者に本発明によって得られたヒト心血管前駆細胞が濃縮された細胞集団から単離された心筋細胞を含む組成物を投与する工程を含む方法を提供する。また別の実施形態では、本発明は、不十分な心臓機能を特徴とする障害を治療する方法であって、当該治療を必要とする被験者にヒト心血管前駆細胞を含む組成物を投与する工程を含む方法を提供する。好ましい実施形態では、被験者は、ヒトである。本組成物は、心臓組織への送達もしくは遊走を生じさせる、例えば注射もしくは移植を含む経路によって、そして少なくとも１つの有害作用もしくは症状または障害の減少を生じさせる条件下で投与することができる。
【００３４】
本明細書に引用した全参考文献は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例は、本発明をさらに具体的に説明するために役立つ。
【００３６】
（実施例１）
材料及び方法
ヒトＥＳ細胞の維持
ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ウィスコンシン州マディソン）からのＨ１（ＮＩＨコード番号ＷＡ０１）及びＥＳＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（シンガポール国）からのｈＥＳ２（ＮＩＨコード番号ＥＳ０２）を、６ウェル組織培養プレート内で２０％ノックアウト血清代替物（ＳＲ）、１００μＭ非必須アミノ酸、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ニューヨーク州グランドアイランド）、１０−４Ｍ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）及び２０ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）が補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（５０：５０；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、バージニア州ハーンドン）からなるｈＥＳＣ培地中にて、照射マウス胚フィーダー細胞上で維持した。ＡＡＶＳ１標的化ｈＥＳ２細胞系は、親ｈＥＳ２細胞のＡＡＶ２−ＴＲＵＦ１１（ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＴＫ−ｎｅｏ）及び野生型ＡＡＶ２両方の１０６ウイルス粒子との共感染によって発生させた。Ｇ４１８選択後、ＧＦＰ陽性細胞を選別し、サブクローンを単離した。トランス遺伝子の標的化組込みは、ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ ＰＣＲ）によって確認された。野生型ＡＡＶ配列は、ＧＦＰ陽性クローン中では検出されなかった。ＲＦＰ発現ｈＥＳ細胞は、Ｉｒｉｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：１４７７−１４８２によって記載されたようなｈＥＳ２細胞のＲｏｓａ２６遺伝子座へＲＦＰ ｃＤＮＡを標的化する工程によって生成した。
【００３７】
ヒトＥＳ細胞の分化
ＥＢを発生させる前に、ｈＥＳＣは、フィーダーを枯渇させるためにＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）の層上で４８時間にわたり培養した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）培養からの細胞はコラゲナーゼＢ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を用いた２０分間の処理、その後のトリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％）を用いた２分間の処理によって小クラスターに解離させた。第０〜１日から、ＥＢは２ｍｌ塩基性培地（ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのグルタミン、４×１０−４Ｍのモノチオグリセロール（ＭＴＧ）、及び５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）＋０．５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中にプレーティングした。以下の濃度の因子をＥＢ形成、中胚葉誘導及び心臓特異化のために使用した。ＢＭＰ４−１０ｎｇ／ｍｌ、ｈｂＦＧＦ−５ｎｇ／ｍｌ、アクチビンＡ−３ｎｇ／ｍｌ、ｈＤＫＫ１−１５０ｎｇ／ｍｌ、ｈＶＥＧＦ−１０ｎｇ／ｍｌ。これらの因子は、以下の順序で加えた。第１〜４日には、ＢＭＰ４、ｈｂＦＧＦ及びアクチビンＡ、第４〜８日には、ＶＥＧＦ及びＤＫＫ１、第８日以降には、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、及びｂＦＧＦ。培地は、第８日以降には４日毎に取り替えた。全ヒト因子及び阻害剤は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。培養は、培養の初期１０〜１２日間は５％ＣＯ２、５％Ｏ２、及び９０％Ｎ２環境内で維持し、その後は５％ＣＯ２／気体環境内で維持した。
【００３８】
フローサイトメトリーによる選別及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）上での管形成
ＥＢを収集し、トリプシン（０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ）を用いて単一の細胞に解離させた。トリプシン処理後、Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析を実施した。細胞は、ＭｏＦｌｏ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、コロラド州フォートコリンズ）セルソーターを用いて選別した。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、カリフォルニア州サンカルロス）ソフトウエアプログラムを用いて分析した。抗ＫＤＲ−ＰＥ、抗−Ｃ−ＫＩＴ−ＡＰＣは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。選別したＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団は、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）を補充したＳｔｅｍｐｒｏ３４培地中で分化させた。管状構造は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティングガラス製カバースリップへ移してから２４時間以内に形成された。
【００３９】
免疫蛍光
解離した細胞は、２日間にわたりガラス製カバースリップ上で培養した。この時点で、細胞を４％ＰＦＡで固定し、次に染色した。以下の抗体を免疫染色のために使用した。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの抗ヒトＣＤ３１、抗ヒトＶＥ−カドヘリン、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ（カリフォルニア州フリーモント）からの抗マウストロポニンＴ及び抗ヒト平滑筋アクチン、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（カリフォルニア州テメキュラ）からの抗ヒトＡＮＰ、コネキシン４３及び抗ヒトα／β ＭＨＣ抗体、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）からの抗ヒトα−アクチニン。抗ヒト平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭＨＣ）、カルデスモン、フォン・ヴィレブランド因子抗体は、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（カリフォルニア州カーピンテリア）から購入した。Ｃｙ２、Ｃｙ３及びＣｙ５共役二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（ペンシルベニア州ウェストグローブ）から入手した。蛍光は、Ｌｅｉｃａ ＤＭＲＡ２蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ドイツ国ウェッツラー）を用いて視認し、画像はデジタル式Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＣＣＤカメラ（日本国浜松市）を使用して記録した。
【００４０】
コロニーアッセイ
心血管コロニーを発生させるために、６日齢ＥＢから単離したＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞は、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２〜３日間にわたり凝集させた。このステージに、凝集体を解離させ、細胞は５％ＣＯ２、５％Ｏ２、及び９０％Ｎ２環境内においてＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）を含有するメチルセルロース中で培養した。コロニーは、コロニー頻度分析のために４〜６日間の培養後にスコア付けした。
【００４１】
ＲＴ−ＰＣＲ
発現試験のためには、個々のコロニーをメチルセルロース培養から単離し、Ｂｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２５：６１１−６２３によって以前に記載されたプロトコルの修正版を用いて分析した。増幅ｃＤＮＡを次に標準ＰＣＲにかけた。リアルタイム定量的ＰＣＲは、ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ ＥＰ ＲｅａｌＰｌｅｘ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ）上で実施した。実験は白金ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＥＲ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３回ずつ実施した。全プライマーは、表１に記載した。全アニーリング反応は、６０℃で実施した。
【００４２】
【表１−１】
【００４３】
【表１−２】
【００４４】
【表１−３】
【００４５】
ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来集団のｉｎ ｖｉｖｏ分析
ｈＥＳＣを発現するＧＦＰ由来のＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞を移植前５〜１０日間にわたって、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウスに麻酔をかけ、気管挿管し、１００，０００個のドナー細胞を開胸手術において左心室壁内へ直接注射した。手術の２〜１１週後に心臓を収集し、カコジル酸バッファー中の１％パラホルムアルデヒド中で固定し、３００μｍでビブラトーム（Ｖｉｂｒｏｔｏｍｅ）にて切片化を行った。移植領域を同定し、１０μｍで凍結切片化を行った。免疫組織化学検査は、ＧＦＰ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＡＢ３０８０、１：１００；Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ及びＤＡＢキット）、α−アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ７８１１、１：５００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＱ３００Ｒ二次抗体、１：２０）、ＣＤ３１抗体（Ｄａｋｏ、Ｍ０８２３、１：５０；Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ及びＤＡＢキット）、ならびに平滑筋ＭＨＣ抗体（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＢＴ−５６２、１：３００；Ａｌｅｘａ ５５５二次抗体、１：２００）について実施した。共焦点像は、ＩｍａｇｅＪ ａｎｄ Ｐｉｅｒｒｅ Ｂｏｕｒｄｏｎｃｌｅのプラグインをデフォルト設定で使用して共局在化について分析した。マウス梗塞モデルにおける評価のためには、心筋梗塞はＲｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２５：９９３−９９４によって記載された技術を使用して、直接的な冠状動脈結紮によってＳＣＩＤベージュマウスにおいて誘導した。１０〜２０分後に、マウスに５００，０００個のＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞（ｎ＝９）または同等量の無血清培地（ｎ＝１２）を注射した。全注射は、梗塞の境界帯で試みた。２週間後、心室機能の評価は、９．４テスラの磁気共鳴イメージングを用いて実施した。
【００４６】
パッチクランプ
全細胞パッチクランプ記録は、ＩＸ５０倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ａ増幅器、Ｄｉｇｉｄａｔａ １３００アナログ／デジタル変換器及びｐＣｌａｍｐ９．１ソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を備えるＰＣを用いて室温で実施した。浴溶液（単位：ｍＭ）は、ＮａＣｌ １３６、ＫＣｌ ４、ＣａＣｌ２ １、ＭｇＣｌ２ ２、ＣｏＣｌ２ ５、ＨＥＰＥＳ １０、グルコース１０、及びテトロドトキシン（ＴＴＸ）０．０２（ｐＨ７．４）であった。ピペット（単位：ｍＭ）は、ＫＣｌ １３５、ＥＧＴＡ １０、ＨＥＰＥＳ １０、及びグルコース５（ｐＨ７．２）を含有する細胞内溶液を充填すると３〜５ＭΩ抵抗のピペットであった。細胞を、−３０ｍＶのテールパルス（図４におけるような持続期間）前には、−８０ｍＶから＋４０ｍＶへの電位を２０ｍＶ増分で試験するために−８０ｍＶの保持電位から段階付けた。データは、ｐＣｌａｍｐ９．１ソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて分析した。電流振幅は、細胞サイズに標準化した（全細胞膜容量）。不活性化τ値は、電流減衰の指数関数的適合を用いて計算した。
【００４７】
電場電位の記録
６日齢ＥＢから単離したＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞は、２〜４週間にわたりＳｔｅｍＰｒｏ−３４＋１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１を備えるＭＥＡ（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）培養皿内で培養した。記録の２日前に、細胞は１５％ＦＢＳを備えるＤＭＥＭ（細胞増殖用）へ切り換えた。細胞外電気活動は、６０チャンネルから同時に記録し、ソフトウエアＭＣ Ｒａｃｋ（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。
【００４８】
（実施例２）
ｈＥＳＣ分化培養中での心臓発達の調節
ｈＥＳＣから心臓分化系列への分化を方向付けるために、原始線条様集団の誘導、心臓中胚葉のパターニング及び心血管分化系列の特異化を含む段階的プロトコルは、様々なモデル系において中胚葉誘導及び心臓特異化で役割を果たすことが公知である因子のＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＤＫＫ１の組み合わせを用いて設計した。プロトコルの概略は、図１に示した。本明細書に例示したプロトコルを用いると、ｈＥＳＣは、ＥＢの形成を可能にするために２４時間にわたりＢＭＰ４の存在下で最初に分化された。第１ステージでのアクチビンとＢＭＰ４との組み合わせは、マウスにおけるこれらの集団内で発現することが公知の遺伝子であるＴ（ブラキュリ）及びＷＮＴ３ａのアップレギュレーション及び一過性発現によって証明されるように、原始線条様集団及び中胚葉を誘導した（図６）。第２ステージでは、ＶＥＧＦ及びＷｎｔ阻害剤であるＤＫＫ１が中胚葉を更にパターン化し、ＫＤＲ＋前駆細胞集団の拡張及び成熟を促進した。分化の第８日には、発達中の心血管分化系列の持続的拡張を支援するためにｂＦＧＦが再び加えられた。このプロトコルは、収縮細胞ならびに心臓トロポニンＴ（ＣＴＮＴ）（図２）、α−アクチニン、α／βミオシン重鎖、ＡＮＰ及びコネキシン４３（図２０、２１）を発現した細胞の出現によって証明されたように、ＥＢ内の心臓発達を支援する。ＣＴＮＴ＋細胞の最高頻度は培養の第１４〜１６日に定期的に観察されたが（図２、２１）、この集団はＥＢ内で２カ月間の期間にわたって維持することができた。収縮性ＥＢの発達の動態は、ＣＴＮＴ＋集団の出現と平行していた（図２２）。
【００４９】
（実施例３）
ヒトＥＳ細胞由来の心臓分化系列の発生にＷｎｔシグナル伝達が果たす役割
Ｗｎｔシグナル伝達経路がヒトＥＳ細胞由来の心臓分化系列の出現に果たす役割を、原始線条誘導を越える段階（第２ステージ）に特に焦点を当てて調査した。ＥＢは、プロトコルに略説したように、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ及びアクチビンＡの存在下で誘導した。Ｗｎｔ３ＡまたはＤＫＫ１のいずれかを図３に示した日に培養へ加えた。これらの因子は、１４日間を通して培養中で維持された。ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦは、指示した時点に加えた。第１４日に、ＥＢを収集し、上述したように分析した。対照は、ＷＮＴまたはＤＫＫ１を受容しなかった培養であった。分化第４日におけるＥＢへのＤＫＫ１の添加は、培養第１４日のＣＴＮＴ＋細胞の頻度の２倍を超える（４０％までの）増加をもたらした（図３）。ＤＫＫ１の作用は、第６または８日に加えられた場合はこれほど顕著ではなく、添加が分化第１０日に添加された場合はＣＴＮＴ＋細胞の頻度の増強は見られなかった。Ｗｎｔ３Ａは反対の作用を有しており、第４または６日に培養に加えられた場合はＣＴＮＴ＋細胞の発達を完全に抑制した。これらの所見は、古典的Ｗｎｔ経路のステージ特異的阻害がＢＭＰ４／アクチビン誘導性ＰＳ集団の心臓特異化を促進するために不可欠であることを示している。
【００５０】
（実施例４）
心臓分化系列の誘導においてＢＭＰ４、アクチビンＡ及びｂＦＧＦが果たす役割
ｈＥＳＣ分化培養中での心臓分化系列の誘導においてＢＭＰ４、アクチビンＡ及びｂＦＧＦが果たす役割を評価するために、誘導ステージ（第１〜４日）中に単一因子ならびに様々な組み合わせを試験した。第４日には、図１に略説したように、因子を除去し、ＥＢを処理した。第４〜１４日に、ＥＢは図５、２５、及び２６に示したようにＶＥＧＦ及びＤＫＫ１の組み合わせを用いて処理し、第８日以降にはｂＦＧＦを添加した。ＥＢは第１４日に収集し、各組み合わせについてのＣＴＮＴ＋細胞の頻度及び２４ウェルプレートの１ウェル当たりのＣＴＮＴ＋細胞の総数について分析した。ＢＭＰ４、ｂＦＧＦもしくはアクチビンＡ単独またはＢＭＰ４及びＦＧＦまたはアクチビンＡ及びｂＦＧＦの組み合わせは、低頻度（図４）及び生成されたＣＴＮＴ＋細胞の総数（図２３、２４）によって証明されたように心臓発達の貧弱な誘導因子であった。ＢＭＰ４及びアクチビンＡは有意な数のＣＴＮＴ＋細胞を誘導するが、これら３つの因子の組み合わせは最も強力であり、心臓細胞の最高の頻度及び総数を発生し、４０％〜５０％のＣＴＮＴ＋細胞からなる培養を常に生産した。ＶＥＧＦは心臓発達のために必須ではなかったが、１０ｎｇ／ｍｌのこの因子の添加は発達したＣＴＮＴ＋細胞の総数を増加させた。この濃度を超えてＶＥＧＦの濃度が増加すると培養中の細胞数を減少させ、これは発生したＣＴＮＴ＋細胞の総数を有意に減少させた（図５、２５及び２６）。
【００５１】
発達中のＥＢの分子分析は、原始線条様集団の確立後に発現パターンにおける動的変化を明らかにした。Ｔ及びＷＮＴ３Ａと一緒に、ＤＫＫ１の発現は早期にアップレギュレートされ、１８日間の経過を通して持続した（図６）。分化の第２〜４日の内因性ＤＫＫ１の発現は、心臓中胚葉を特異化するように機能することができ、外因性阻害剤の添加の不在下で心臓分化系列を確立させる（図３）。ＫＤＲは、未分化ＥＳ細胞内で発現した。この発現レベルは、第４〜６日に増加すると思われ、その後１２日間にわたって持続された。初期胚中の２次心臓形成領域の前駆細胞をマークする遺伝子であるＩＳＬ１は、分化第８日に最初に検出された心臓転写因子Ｎｋｘ２．５の発現に先行して第６〜８日にＥＢ中で発現した。適正な心臓発達に必要とされる２つのＴＢＸ転写因子であるＴＢＸ５及びＴＢＸ２０、ならびに収縮性タンパク質ＭＬＣ２Ａ及びＣＴＮＴの発現は、分化の第８〜１０日にアップレギュレートされ、これは心臓発達の開始を反映していた。
【００５２】
（実施例５）
心血管電位を用いたＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ ＥＢ集団の同定
発達中のＥＢをＫＤＲ及びＣ−ＫＩＴの発現について分析した。Ｃ−ＫＩＴを別個の集団を規定するための電位マーカーとして使用したが、それはマウスＥＢ内でのＣ−ＫＩＴの発現が最初期血球血管芽細胞由来造血前駆細胞及び血管前駆細胞ならびに前原始線条及び発達中の内胚葉を同定するからである。図７は、異なる日齢のＥＢのフローサイトメトリー分析を示す。図７に示すように、３つの別個の集団であるＫＤＲｈｉｇｈ／Ｃ−ＫＩＴ＋、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ及びＫＤＲｎｅｇ／Ｃ−ＫＩＴ＋は、６日齢ＥＢ内で分解される可能性がある。３つの集団の発達は、ＢＭＰ４及びアクチビンＡの両方を用いた誘導に依存した（図示しない）。３つの集団を細胞選別によって単離し、遺伝子発現パターン及び心臓電位について分析した。図８は、６日齢のＥＢから単離した３つの集団の定量的ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現分析を示す。平均発現をシクロフィニンへ標準化した。ＫＤＲｈｉｇｈ／Ｃ−ＫＩＴ＋集団は、血管発達に関連する遺伝子であるＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリン及びＳＭＡ、ならびに造血に関与することの指標となる遺伝子であるＧＡＴＡ−１を発現した（図８、２７）。心臓発達に関係する、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１及びＴＢＸ５を含む遺伝子は、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ分画内では最高レベルで発現した。この分画はＳＭＡ、極めて低レベルのＧＡＴＡ−１もまた発現したが、ＶＥ−カドヘリンもしくはＣＤ３１は検出しなかった。ＳＭＡは早期に心臓分化系列ならびにＶＳＭ分化系列内で発現するので、この発現は心臓発達の開始を反映できた。ＫＤＲｎｅｇ／Ｃ−ＫＩＴ＋細胞は最高レベルの３分画のＯＣＴ４及びＴを発現したが、これは残留未分化ＥＳ細胞ならびに原始線条様細胞の存在を示す。この分画内の比較的高レベルのＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７は、それが内胚葉分化系列に関与する細胞もまた含有していることを示唆している。ＳＯＸ１及びＰＡＸ６は極めて低レベルでしか検出されず、これはこの発達ステージではＥＢ内で神経外胚葉分化系列への分化があったとしてもほんのわずかに過ぎないことを示唆している（図２７）。これらをまとめると、これらの発現パターンは、ＫＤＲｈｉｇｈ／Ｃ−ＫＩＴ＋集団が造血及び血管前駆細胞を含有する、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団が心臓前駆細胞を含有する、そしてＫＤＲｎｅｇ／Ｃ−ＫＩＴ＋集団が未分化ＥＳ細胞、原始線条細胞及び内胚葉細胞の混合物からなることを示している。
【００５３】
心臓電位をモニターするために、細胞はゼラチンコーティングウェル上の単層としてプレーティングするか、または低クラスター培養皿内で再凝集させ、凝集体として培養した。詳細には、細胞は６日齢ＥＢから単離し、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に単層としてゼラチンコーティングウェル上で培養した。ＣＴＮＴ＋細胞は、１０日間の培養後に分析した。結果を図９に示す。６日齢ＥＢからのＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞を選別し、単層として、またはＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）とともに低クラスターウェル内の凝集体として培養した。培養を収集し、７〜１０日間にわたる分化後にＣＴＮＴ＋細胞の存在について分析した。結果を図１０に示す。数（％）は、３回の独立実験の平均値±標準誤差を表す。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。統計的分析は、対応のないｔ検定を用いて実施した。＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団は最大の心筋細胞電位（図９）を提示しており、懸濁培養中の凝集体内ならびに付着性単層内の両方において容易にＣＴＮＴ＋細胞及び収縮性細胞の集団を発生した（図１０）。凝集体内のおよそ４０％の細胞がＣＴＮＴ＋であったが、単層培養の５０％超は一貫してこのマーカーを発現した。単層培養内の心筋細胞の高頻度は、同調塊（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｍａｓｓ）として収縮する細胞層の発達を常にもたらした。単離されたＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞は、凝集体としてはおよそ１．５倍（データは示していない）、及び単層培養内では３倍に拡張した（図２８）。略説した誘導プロトコル及び選別ストラテジーを用いると、４インプットのｈＥＳＣに付き１の心筋細胞のアウトプットが予測された。典型的な実験では、２×１０６個のｈＥＳＣは、１×１０６個の６日齢ＥＢ細胞を発生したが、そのうちの３０％（３．０×９ ０５細胞）はＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ分画を提示した。この集団は、単層培養フォーマット内で３倍（１×１０６細胞）に拡張し、およそ５０％の心筋細胞（５×１０５）からなる集団を産出した。２次ｈＥＳＣ系であるＨ１から発生したＥＢの動態分析は、分化第６日ではなく第５日に３ＫＤＲ／Ｃ−ＫＩＴ集団の発達を証明した。５日齢ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団の分析は、それが心臓電位もまた示すことを示した（図２９、３０）。
【００５４】
（実施例６）
ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来分化系列の特性解析
ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）とともにプレーティングした６日齢ＥＢ由来ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ分画から発生した付着性集団についての定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析を実施した。培養は図１１に示した日に収集し、細胞を発現について分析した（Ｄ７はプレーティングの１日後の集団を表す）。シクロフィニンに対して標準化した平均発現を示した。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。
【００５５】
プレーティングから異なる日数後でのＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来付着性集団についての発現分析（ｑＰＣＲ）は、内皮（ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリン）、ＶＳＭ（カルポニン、ＳＭＡ）、心臓発達（ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＴＢＸ５、ＴＢＸ２０）及び心臓成熟（ＣＴＮＴ、ＭＬＣ２Ａ）に関連する遺伝子のアップレギュレーションを証明した（図１１、３１）。ＮＦＡＴＣ及びニューレグリン １（ＮＲＧｌ）の発現は、培養中の心内膜の存在を示唆している。低レベルのＮＥＵＤ、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７及びＭＥＯＸ１の発現は、これらの培養が神経外胚葉、内胚葉または体中胚葉で汚染されていないことを示している（図１１、３１）。
【００５６】
ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞を６日齢ＥＢから単離し、図１２のグラフの下方に指した因子の様々な組み合わせを用いて単層として培養した。細胞を収集し、１０〜１２日間にわたる培養後にＣＴＮＴ＋、ＣＤ３１＋及びＳＭＡ＋細胞の存在について分析した。ＳＭＡ抗体は、心筋細胞及び平滑筋細胞の両方を染色することができる。数（％）は、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。
【００５７】
ＶＥＧＦ及びＤＫＫ１中で１０〜１２日間培養したＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来付着性細胞のフローサイトメトリー分析は、ほぼ９０％がＳＭＡを発現し、５０％がＣＴＮＴを発現し、４％がＣＤ３１を発現することを明らかにした（図１２）。培養へのｂＦＧＦの添加は、ＣＴＮＴ＋細胞の比率を３０％へ減少させ、ＣＤ３１＋集団を３０％へ増加させた。ＳＭＡ＋細胞の比率は、ｂＦＧＦの存在下で平均８０％へ穏やかに減少した。ｂＦＧＦの添加は、単層培養中で細胞数に有意には影響を及ぼさなかった（図２８）。これらの所見は、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来集団内の細胞の大多数が心血管分化系列の細胞であることを明らかに示している。それらはさらに、ｂＦＧＦがこの集団内で発達する心筋細胞及び内皮細胞の比率に影響を及ぼすことができることもまた示している。
【００５８】
ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１及びｂＦＧＦ中で培養したＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来集団の免疫染色分析は、ＣＤ３１＋、ＶＥ−カドヘリン＋及びフォン・ヴィレブランド因子＋内皮細胞の存在、ＣＴＮＴ＋心筋細胞の存在ならびにＶＳＭ発達の指標となるＳＭＡ＋、ＳＭＨＣ＋及びカルデスモン＋細胞の存在を証明した。集団内の未成熟心筋細胞はＣＴＮＴ及びＳＭＡの両方を発現したが、他方ＶＳＭ細胞はＳＭＡしか発現しなかった。ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来内皮細胞についてさらに特性解析するために、この集団をＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの存在下で拡張させ、次にＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティングカバースリップ上で培養した。これらの条件下では、細胞は管状構造への内皮細胞の組織化の指標である格子を形成した。これらの構造内の細胞はＣＤ３１を発現し、Ｄｉｌ−ＡＣ−ＬＤＬを取り込む能力を示して、それらの内皮細胞表現型を確証した。免疫染色試験からの所見は、フローサイトメトリー分析所見と一致しており、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来集団が心臓、内皮及び血管平滑筋分化系列の細胞からなることを証明している。
【００５９】
ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの発達可能性を証明するために、それらをさらにＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの心臓内へ移植した。これらの試験のためには、ｈＥＳ２細胞系のＧＦＰ発現バージョンを使用した。組織学的分析は、移植後に心臓内のＧＦＰ＋細胞の存在を明らかにした。抗体を用いたＧＦＰの検出は、落射蛍光によって視認された集団と同一集団を同定したが、これはＧＦＰシグナルがドナー細胞の存在を表し、バックグラウンド蛍光の結果としては生じないことを示している。α−アクチン、ＣＤ３１もしくはＳＭＨＣのいずれかを共発現するＧＦＰ＋集団が移植片内で検出されたが、これは心臓、内皮及び血管平滑筋分化系列へのｉｎ ｖｉｖｏでの分化を示している。移植された動物のいずれにおいても奇形腫は検出されなかった（Ｎ＞１０）。この集団のｉｎ ｖｉｖｏでの潜在性をさらに評価するために、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞をＳＣＩＤベージュマウスの梗塞心臓内へ直接的に移植した。２週間後に分析すると、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来心血管集団が移植された動物は、培地単独が注射された集団より３１％高い駆出率を有していた（５６％±３．６％対３９％±４．８％、ｐ＝０．００８）。これらの所見は、以前の報告書と一致しており、ｈＥＳＣ由来心筋細胞の移植が心筋梗塞の齧歯類モデルにおける心臓機能の改善をもたらすことを証明している。
【００６０】
（実施例７）
心血管コロニー形成細胞の同定及び特性解析
ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＤＫＫ１の存在下においてメチルセルロース中でプレーティングすると、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞は培養４日間以内に小さな小型コロニーを生成した。個々の４日齢コロニーのＰＣＲ分析は、心臓（ＣＴＮＴ）、血管（ＣＤ３１及び／またはＶＥ−カドヘリン）及びＶＳＭ（ＳＭＡ及び／またはカルポニン）の発達の指標となるマーカーの共発現を示した（図１３、３２）。さらに６日間にわたり培養中で維持すると、これらのコロニーの一部分が収縮細胞を発生し、それらが心筋細胞を含有することを確証した。ＩＳＬ１及びＴＢＸ５は、典型的には同一コロニーでは発現しなかったので、これはそれらの発現が異なる心臓形成領域から心臓細胞を発達する別個の亜集団を含有するコロニーを規定できることを示唆している。カバースリップ上で増殖した個々のコロニー由来の付着性集団の免疫染色は、ＳＭＡ＋、ＣＴＮＴ＋及びＶＥ−ＣＡＤ＋細胞の存在を明らかにし、これらのコロニーが心臓、内皮及びＶＳＭ潜在性を有することを確証した。
【００６１】
２つの異なるアプローチを使用して、心血管コロニーがクローン性であるかどうかを決定した。最初に、ｈＥＳＣを発現するＧＦＰ由来のＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞を、メチセルロースコロニーアッセイにおいて赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するように組換えられたｈＥＳＣ由来のＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞とメチセルロースアッセイにおいて混合した。４日後に分析されたコロニーは、ＧＦＰもしくはＲＦＰのいずれかを発現するが両方は発現しないことが見出されたが（図１３）、この所見はそれらが単細胞から発生するのであり、細胞凝集の結果として形成されるものではないという解釈と一致する所見である。第２のアプローチとして、様々な数のＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞を心臓メチルセルロース培養中でプレーティングする細胞用量応答実験を実施した。発達するコロニーの数とプレーティングされた細胞数との関係は、１に近い勾配を持つ線形であり、これはこれらのコロニーが単細胞に由来するという意見をさらに支持している（図１４）。これらをまとめると、これらの所見は、これらのコロニーが心血管コロニー形成細胞（ｈＣＶ−ＣＦＣ）に由来する心血管細胞のクローンを表すことを示している。
【００６２】
ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来心筋細胞の機能的電位は、全細胞電流及び電場電位測定値を用いて評価した。全細胞電圧固定分析では、試験した細胞の８０％が優勢な電位依存性の一過性の外向きカリウム電流を発現した（図１５、１６）。この電流の電位依存性、密度及びゲーティング動態（図１６、１７）は、ヒト心房及び心室心筋において見出されるＩｔｏカリウム電流のものと似ていた。微小電極を使用して培養細胞から記録した電場電位は、ヒト心血管前駆細胞由来心臓細胞が電気的に相互に共役していることを明らかにした。さらに、予想されたように、Ｖａｕｇｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓクラス１ａ薬剤であるキニジンは、測定Ｔ波振幅を減少させ、ＱＴ間隔を増加させた（図１９）。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年３月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／０４０，０４９号の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた試験開発の記載）
本発明は、米国立衛生試験所によって授与された助成金番号第Ｒ０１ＨＬ７１８００−０１号及びＰ２０−ＧＭ０７５０１号の下で政府による後援を受けて実施された。米国政府は、本発明に関して所定の権利を有することができる。
【０００３】
（技術分野）
胚発生中、身体の組織は、３つの主要な細胞集団である外胚葉、中胚葉及び胚性内胚葉から形成される。これらの細胞集団は、原発胚細胞層としても公知であり、原腸形成として公知のプロセスを通して形成される。原腸形成後に、各原発胚細胞層は特定セットの細胞集団及び組織を生成する。中胚葉は血球、内皮細胞、心筋及び骨格筋、ならびに脂肪細胞を生じさせる。胚性内胚葉は、肝臓、膵臓及び肺を生成する。外胚葉は、神経系、皮膚及び副腎組織を生じさせる。これらの胚細胞層からの組織発達のプロセスは、複雑な分子変化を反映する複数の分化工程を含んでいる。中胚葉及びその誘導体に関して、３つの別個のステージが規定されてきた。その第１は、胚盤葉上層として公知の構造内の細胞からの中胚葉の誘導である。新生中胚葉としても公知である新規に形成された中胚葉は、初期胚内の将来の組織発達の部位となる様々な位置へ移動する。このプロセスは、パターニングとして公知であり、特定組織に向かう初期分化ステージを反映する可能性が高い一部の分子変化を必要とする。最終ステージは、特異化として公知であり、パターン化された中胚葉亜集団からの別個の組織の発生を含んでいる。
【背景技術】
【０００４】
これまでに得られた証拠は、中胚葉が別個の発生能を備える亜集団を表す連続する波のように誘導されることを示唆している。最初に形成された中胚葉は胚外領域へ移動して造血細胞及び内皮細胞を生じさせるが、次の集団は発生中の胚内で前方へ移動して心臓及び頭部の間葉となる。これらの分化系列関係は、最初は組織学的分析を通して規定され、その後は主として細胞追跡試験によって確証されてきた。造血への関与に関しては、現在ではＥＳ細胞分化モデルからの研究、及びマウス胚上での研究から、最初に同定できる前駆細胞は血管芽細胞として公知の細胞であり、血管能力もまた示す細胞であるという強力な証拠が得られている（非特許文献１、非特許文献２）。この前駆細胞についての分析は、この前駆細胞が中胚葉遺伝子ブラキュリ及び受容体チロシンキナーゼＦｌｋ−１を共発現することを明らかにしたが、これは中胚葉の亜集団が造血及び血管分化系列へ関与することを表すことを示している（非特許文献３）。分化系列追跡試験は、心臓がＦｌｋ−１＋集団から発達することを証明したが、これは心血管系のための同等の多能性細胞が存在する可能性があることを示唆している（非特許文献４）。ＥＳ細胞分化培養の分析は、心臓及び内皮潜在力を備えるＦｌｋ−１＋前駆細胞の存在についての証拠を提供した（非特許文献５）。近年の試験もまた、複数の心血管分化系列を生じさせることのできるマウス心血管前駆細胞の存在を支持している（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。ヒト心血管前駆細胞集団は、これまで同定されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：７２５−７３２
【非特許文献２】Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：６２５−３０
【非特許文献３】Ｆｅｈｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３０：４２１７−４２２７
【非特許文献４】Ｅｍａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７：１１１−１１７
【非特許文献５】Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＦＡＳＥＢ １９：１５３４−１５３６
【非特許文献６】Ｋａｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｄｅｖ． Ｃｅｌｌ １１：７２３−７３２
【非特許文献７】Ｍｏｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２７：１１５１−１１６５
【非特許文献８】Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｃｅｌｌ １２７：１１３７−１１５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヒト心血管前駆細胞の濃縮集団を提供する。ヒト心血管前駆細胞は、細胞表面マーカーであるＫＤＲの存在及び細胞表面マーカーであるＣ−ＫＩＴの非存在を特徴とする。ヒト心血管前駆細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで心筋細胞、内皮細胞、ならびに血管平滑筋細胞に分化することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
また別の実施形態では、本発明は、ヒト胚様体（ＥＢ）からヒト心血管前駆細胞を産生する方法であって、前記ＥＢをアクチビン及び骨形成因子（ＢＭＰ）及び任意で塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の存在下で培養する工程と、引き続いてヒト心血管前駆細胞を提供するためにＷｎｔ成長因子の阻害剤及び任意で血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の存在下で培養する工程と、ならびに前記細胞培養から前記細胞を収集する工程とを含む方法を提供する。
【０００８】
また別の実施形態では、本発明は、少なくとも約３０％及び好ましくは少なくとも約４０％、及びより好ましくは少なくとも約５０％のヒト心筋細胞を含有する細胞集団を発生させる方法であって、前記ヒト心血管前駆細胞をＷｎｔの阻害剤及び任意でＶＥＧＦの存在下で培養する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、細胞は、単層として培養される。また別の実施形態では、細胞は、凝集体として培養される。心筋細胞の存在は、細胞の収縮活性を評価する工程によって、または例えば心トロポニンＴ（ＣＴＮＴ）などの心筋細胞の指標となる遺伝子の発現を測定する工程によって決定できる。
【０００９】
本発明は、心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞を含有するヒト心血管コロニーを発生させる方法であって、前記ヒト心血管前駆細胞をＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程を含む方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、細胞は、メチルセルロース中で培養される。
【００１０】
ヒト心血管前駆細胞及びそれに由来する分化細胞は、心血管前駆細胞、心筋細胞、内皮細胞、血管平滑筋細胞、及び心血管組織に影響を及ぼす薬剤についてスクリーニングする方法において有用である。
【００１１】
ヒト心血管前駆細胞は、また増殖及び貯蔵のため、ならびに心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞の起源としても有用である。
【００１２】
ヒト心血管前駆細胞及びそれに由来する分化細胞は、また哺乳動物における心臓機能を改善もしくは再構成するため、及び移植のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで心血管組織を操作するための方法においても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態によってヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）から心臓分化系列への分化を方向付けるために使用されるプロトコルの略図である。
【図２】ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ及びアクチビンＡの組み合わせを用いて誘導されたＥＢ内でのＣＴＮＴ＋細胞発達の動態を示す。ＥＢを、表示時点に収集し、ＣＴＮＴを発現する細胞の頻度について細胞内フローサイトメトリーによって分析した。
【図３】異なるステージでのＷｎｔシグナル伝達経路の操作後の１４日齢ＥＢ内でのＣＴＮＴ＋細胞の頻度を示す。
【図４】誘導ステージ中のＢＭＰ４、アクチビンＡ及びｂＦＧＦの組み合わせにおける培養後の、１４日齢ＥＢ内でのＣＴＮＴ＋細胞の頻度を示す。
【図５】ＶＥＧＦ及びＤＫＫ１の表示した組み合わせを用いて処置した１４日齢ＥＢについての２４ウェルプレートの１ウェル当たりのＣＴＮＴ＋細胞の総数を示す。図１〜５については、バーは、３回の独立実験の標準誤差または平均値を表す。統計的分析は、対応のないｔ検定を用いて実施した。＊Ｐ＝０．０７、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６】異なる発達ステージでのＥＢの遺伝子発現分析を示す。
【図７】異なる日齢でのＥＢのフローサイトメトリー分析を示す。
【図８】６日齢ＥＢから単離した３つの集団の定量的ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子分析を示す。
【図９】３つの６日齢集団の心臓電位を示す。
【図１０】６日齢ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団の心臓電位を示す。
【図１１】６日齢ＥＢ由来ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ分画から発生した付着性集団の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析を示す。
【図１２】ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団の培養の１０〜１２日後のＣＴＮＴ＋、ＣＤ３１＋及びＳＭＡ＋細胞の存在についての分析を示す。
【図１３】混合ＲＦＰ／ＧＦＰ培養から単離された４日齢心血管コロニーの発現分析を示す。
【図１４】プレーティングしたＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞の数と発達する心血管コロニーの数との関係を示す細胞用量反応を示す。
【図１５】ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来心筋細胞中で自然に発現した一過性外向きＫ＋電流（Ｉｔｏ）の全細胞電位固定記録の代表的追跡を示す。
【図１６】図１５に示したように、細胞についての平均電流密度−電位関係を示す。１バッチの細胞１０個中８個はＩｔｏ電流を示し、平均値±ＳＥＭ電流密度はこれらの８個の細胞からの追跡を用いてプロットした。
【図１７】図１６におけるような細胞についてのピーク電流までの平均時間（黒い四角）及び不活性化τ（白い四角）を示す（ｎ＝８）。
【図１８】２〜３週間にわたってＭＥＡ（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）培養皿内で培養した６日齢ＥＢから単離したＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞についての電気活動を示す。細胞外電気活動は、１μＭキニジン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、または用いずに記録した。
【図１９】ｈＥＳＣ培養内での心血管前駆細胞の発達を示すモデルを示す。
【図２０】未分化ｈＥＳ２細胞、４日齢ＥＢ及び収縮性心筋細胞を備える１４日齢ＥＢの画像を示す（倍率２００倍）。
【図２１】ＥＢ内でのＣＴＮＴ＋細胞発達の動態を示す。
【図２２】図１に示したプロトコルを用いて誘導された収縮性ＥＢ発達の動態を示す。１５０〜２００個のＥＢが、収縮性ＥＢの存在について各時点でスコア付けされた。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。
【図２３】グラフの下方に示した因子の組み合わせを用いて誘導した後の１４日齢ＥＢ内での２４ウェルプレートの１ウェル当たりの細胞総数を示す。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。統計的分析は、対応のないｔ検定を用いて実施した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２４】グラフの下方に示した因子の組み合わせを用いて誘導した後の１４日齢ＥＢ内での２４ウェルプレートの１ウェル当たりのＣＴＮＴ＋細胞の総数を示す。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。統計的分析は、対応のないｔ検定を用いて実施した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２５】ＶＥＧＦ及びＤＫＫの表示した組み合わせを用いて処置した１４日齢ＥＢ由来のＣＴＮＴ＋細胞の頻度を示す。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。統計的分析は、対応のないｔ検定を用いて実施した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２６】ＶＥＧＦ及びＤＫＫの表示した組み合わせを用いて処置した１４日齢ＥＢについての２４ウェルプレートの１ウェル当たりのＣＴＮＴ＋細胞の総数を示す。
【図２７】６日齢のＥＢから単離した３つの集団の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。シクロフィニン（ｃｙｃｌｏｐｈｉｎｉｎ）に対して標準化した平均発現を示した。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。
【図２８】６日齢ＥＢから単離されたＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団の単層培養中での１０〜１４日後の相対細胞数のグラフである。９６ウェルプレートの１ウェル当たり４０，０００個の細胞は、グラフの下方に示した因子の組み合わせを用いて誘導した。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。
【図２９】Ｈ１ ｈＥＳＣから発生したＥＢ内での３つの異なるＫＤＲ／Ｃ−ＫＩＴ集団の発生を証明しているフローサイトメトリー分析を示す。
【図３０】７日間の培養後のＨ１ ｈＥＳＣ由来ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ分画からのＣＴＮＴ＋細胞の発達を示す。
【図３１】ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養されたＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来付着性集団の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析を示す。培養は規定時点に収集され、表示した遺伝子の発現について分析された。シクロフィニンに対して標準化した平均発現を示した。
【図３２】ｈＥＳ２由来ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団から発生した個々の４日齢心血管コロニーの発現分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ヒト心血管前駆細胞の集団を提供する。本発明のヒト心血管前駆細胞は、適切な条件下では、心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞へ分化することができる。ヒト心血管前駆細胞は、チロシンキナーゼ受容体ＫＤＲの発現及びチロシンキナーゼ受容体Ｃ−ＫＩＴの発現の欠如を特徴とする。
【００１５】
本発明の一実施形態では、ヒト心血管前駆細胞は、胚様体（ＥＢ）から入手される。ＥＢは、広範囲の分化系列から発達する集団を含有する三次元コロニーである。胚幹細胞（ＥＳＣ）からＥＢを形成するための条件は、当技術分野において公知である。例えば、胚フィーダー細胞上に維持されたヒトＥＳＣは、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）などの基底膜マトリックスの層上で培養し、小クラスターを形成するために解離させ、そしてＢＭＰの存在下で無血清培地中においてプレーティングすることによってフィーダーを枯渇させることができる。本発明の好ましい一実施形態では、フィーダーを枯渇させたヒトＥＳＣがＥＢを形成するために約１日間にわたりＢＭＰ４の存在下で無血清培地中にて培養される。また別の好ましい実施形態では、ＢＭＰ４の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１．０ｎｇ／ｍｌ、及びより好ましくは約０．５ｎｇ／ｍｌである。
【００１６】
ヒトＥＳＣは、市販で、または当技術分野において公知の方法によって入手できる。例えば、ヒトＥＳＣは、当技術分野において公知の方法、及び例えばＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，８４３，７８０号明細書に開示された方法、及びＲｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １８：３９９による方法によって胚盤胞から調製できる。
【００１７】
ＥＢは、当技術分野において公知の方法、及び例えばＴａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ １３１：８６１及びＭａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６：１９９８によって開示された方法によって誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）から形成することもできる。
【００１８】
本発明のヒト心血管前駆細胞は、ヒトＥＢをアクチビン及びＢＭＰの存在下で無血清培地中において培養する工程と、次に心血管前駆細胞の集団を提供するためにＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程と、及び任意で前記培養から細胞を収集する工程と、さらに任意で心血管前駆細胞のための収集された細胞集団を濃縮する工程とによって入手することができる。好ましい実施形態では、アクチビンはアクチビンＡであり、ＢＭＰはＢＭＰ４であり、Ｗｎｔの阻害剤はＤｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ−１）である。
【００１９】
本発明のまた別の実施形態は、ヒト心血管前駆細胞を産出するための方法であって、ヒトＥＢを約１〜約４日間にわたりアクチビンＡ及びＢＭＰ４及び任意のｂＦＧＦの存在下で無血清培地中において培養する工程と、及び引き続き前記細胞を約１〜２日間にわたりＤＫＫ−１及び任意のＶＥＧＦの存在下で無血清培地中において培養する工程と、細胞集団を収集する工程と、ならびに任意でヒト心血管前駆細胞について前記集団を濃縮する工程とを含む方法を提供する。
【００２０】
好ましい実施形態では、ＥＢは、アクチビンＡ及びＢＭＰ４及び任意のｂＦＧＦの存在下で約４日間にわたり培養される。アクチビンＡ、ＢＭＰ４及び任意のｂＦＧＦの濃度は、Ｔ及びＷＮＴ３Ａの発現のアップレギュレーションを特徴とする細胞の原始線条様集団を誘導するために十分である。その後の工程では、ＤＫＫ−１及び任意のＶＥＧＦの濃度は、心血管前駆細胞の集団を提供するために十分である。
【００２１】
好ましい実施形態では、アクチビンＡの濃度は、約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌ、及びより好ましくは約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５．０ｎｇ／ｍｌである。最も好ましい実施形態では、アクチビンＡの濃度は、約３．０ｎｇ／ｍｌである。
【００２２】
好ましい実施形態では、ＢＭＰ４の濃度は、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約２０．０ｎｇ／ｍｌ、及びより好ましくは約５．０ｎｇ／ｍｌ〜約１５ｎｇ／ｍｌである。最も好ましい実施形態では、ＢＭＰ４の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌである。
【００２３】
好ましい実施形態では、ｂＦＧＦの濃度は、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約１０．０ｎｇ／ｍｌ、及びより好ましくは約３．０ｎｇ／ｍｌ〜約６．０ｎｇ／ｍｌである。最も好ましい実施形態では、ｂＦＧＦの濃度は、約５．０ｎｇ／ｍｌである。
【００２４】
好ましい実施形態では、ＤＫＫ１の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌ、及びより好ましくは約１２５ｎｇ／ｍｌ〜約１７５ｎｇ／ｍｌである。最も好ましい実施形態では、ＤＫＫ１の濃度は、約１５０ｎｇ／ｍｌである。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、ＶＥＧＦの濃度は、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５０．０ｎｇ／ｍｌ、及びより好ましくは約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約２５．０ｎｇ／ｍｌである。最も好ましい実施形態では、ＶＥＧＦの濃度は、約１０．０ｎｇ／ｍｌである。
【００２６】
本発明のまた別の好ましい実施形態では、ヒトＥＢは、約４日間にわたり無血清培地中、約３．０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、約１０．０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び約５．０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの存在下で培養されるが、その時点に約１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１及び約１０．０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦが加えられ、細胞は心血管前駆細胞を産生するために約１〜２日間にわたり培養される。また別の好ましい実施形態では、前記集団は、例えばＫＤＲを発現するがＣ−ＫＩＴを発現しない細胞を選別することによって、心血管前駆細胞に濃縮される。好ましい実施形態では、この選別は、免疫選択によって、例えばフローサイトメトリーによって行われる。
【００２７】
また別の実施形態では、本発明は、ヒト心筋細胞の集団を発生させる方法であって、前記ヒト心血管前駆細胞を約７〜約１０日間にわたりＷｎｔの阻害剤及び任意にＶＥＧＦの存在下で培養する工程と、及び培養からヒト心筋細胞の集団を収集する工程とを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、Ｗｎｔの阻害剤はＤＫＫ１であり、ＤＫＫ１及びＶＥＧＦの好ましい濃度は、上記に記載したとおりである。１つの好ましい実施形態では、細胞は、ゼラチンコーティングウェル内の単層としてプレーティングされる。また別の実施形態では、細胞は、凝集体として低クラスター培養皿内で培養される。ヒト心筋細胞の集団は、少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、及びより好ましくは少なくとも約５０％の心筋細胞を含有している。他の実施形態では、ヒト心筋細胞の集団は、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、及び１００％までの心筋細胞を含有している。心筋細胞は、細胞の収縮活性を評価する工程によって、または例えばＣＴＮＴなどの心筋細胞の指標となる遺伝子の発現を測定する工程によって同定できる。
【００２８】
本発明のヒト心血管前駆細胞はさらにまた、当業者には公知の分化条件を用いて、例えば心房、心室、及びペースメーカー細胞を含む心筋細胞の亜集団を発生させるために有用である。
【００２９】
また別の実施形態では、本発明は、心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞を含有する心血管コロニーを発生させる方法であって、前記ヒト心血管前駆細胞を約３〜約７日間にわたりＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＷｎｔの阻害剤、好ましくはＤＫＫ１の存在下で培養する工程を含む方法を提供する。好ましい実施形態では、細胞は、メチルセルロース中にプレーティングされる。ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＤＫＫの好ましい濃度は、上記に記載したとおりである。心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞の存在は、例えばＣＴＮＴなどの心筋細胞の指標となる遺伝子、及び例えばＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリンなどの内皮細胞の指標となる遺伝子ならびに例えばＳＭＡ及びカルポニンなどの血管平滑筋細胞の指標となる遺伝子の発現を測定する工程によって決定できる。
【００３０】
本発明は、ヒト心血管前駆細胞、心血管コロニー、心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞に作用を及ぼす薬剤についてスクリーニングするための方法をさらに提供する。本方法は、上記に記載した細胞集団の１つに由来する細胞を候補薬と接触させる工程と、及び前記薬剤が前記細胞集団に作用を及ぼすかどうかを決定する工程とを含んでいる。試験対象の薬剤は、天然もしくは合成、１つの化合物もしくは混合物、低分子またはポリペプチド、多糖類、ポリヌクレオチドなどを含むポリマー、抗体もしくはそのフラグメント、１ライブラリーの天然もしくは合成化合物からの化合物、理論的薬物設計から得られた化合物、例えば細胞培養条件などの条件、または細胞集団に及ぼす作用を当技術分野において公知のアッセイを用いて評価できる任意の薬剤であってよい。細胞集団に及ぼす作用は、例えば、マーカー発現、受容体結合、収縮能力、電気生理学、細胞生存能力、生存率、形態、またはＤＮＡ合成もしくは修復についてのアッセイを含む、表現型もしくは活性についての任意の標準アッセイによって決定することができる。標準増殖及び分化アッセイは、米国特許第６，１１０，７３９号明細書に記載されている。そのような薬剤は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞成長、分化及び生存率の制御、ならびに組織の維持、再生及び修復のために有用である。
【００３１】
本発明は、ヒト心血管前駆細胞の集団を含む組成物及びヒト心血管コロニーの集団を含む組成物をさらに提供する。本組成物は、薬学的に許容される担体及び希釈剤を含むことができる。本組成物は、移植を促進する成分をさらに含むことができる。これらの集団を含む組成物は、細胞及び組織の置換及び修復のため、ならびに心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞の集団をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで発生させるために有用である。ヒト心血管前駆細胞を含む組成物は、前駆細胞集団を拡張させるために有用である。本組成物は、心臓の状態を治療するための医薬品または送達装置として調製できる。
【００３２】
また別の実施形態では、本発明は、例えば、先天性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋症、心内膜炎及びうっ血性心不全を含む不十分な心臓機能を特徴とする障害を治療するために有用な細胞置換方法及び組織置換方法を提供する。分化細胞及び心血管前駆細胞はどちらも置換療法のために有用であるが、それは前駆細胞集団が心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞分化系列へｉｎ ｖｉｖｏで分化できるためである。これらの細胞はさらにｉｎ ｖｉｔｒｏで心血管細胞を発生させるためにも有用である。心臓組織を操作するための方法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｂｉｒｌａによって“Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｐａｉｒ” Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ２００６で概説されている。
【００３３】
したがって、一実施形態では、本発明は、心筋細胞置換療法のための方法であって、当該治療を必要とする被験者に本発明によって得られたヒト心血管前駆細胞が濃縮された細胞集団から単離された心筋細胞を含む組成物を投与する工程を含む方法を提供する。また別の実施形態では、本発明は、不十分な心臓機能を特徴とする障害を治療する方法であって、当該治療を必要とする被験者にヒト心血管前駆細胞を含む組成物を投与する工程を含む方法を提供する。好ましい実施形態では、被験者は、ヒトである。本組成物は、心臓組織への送達もしくは遊走を生じさせる、例えば注射もしくは移植を含む経路によって、そして少なくとも１つの有害作用もしくは症状または障害の減少を生じさせる条件下で投与することができる。
【００３４】
本明細書に引用した全参考文献は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例は、本発明をさらに具体的に説明するために役立つ。
【００３６】
（実施例１）
材料及び方法
ヒトＥＳ細胞の維持
ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ウィスコンシン州マディソン）からのＨ１（ＮＩＨコード番号ＷＡ０１）及びＥＳＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（シンガポール国）からのｈＥＳ２（ＮＩＨコード番号ＥＳ０２）を、６ウェル組織培養プレート内で２０％ノックアウト血清代替物（ＳＲ）、１００μＭ非必須アミノ酸、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ニューヨーク州グランドアイランド）、１０−４Ｍ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）及び２０ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）が補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（５０：５０；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、バージニア州ハーンドン）からなるｈＥＳＣ培地中にて、照射マウス胚フィーダー細胞上で維持した。ＡＡＶＳ１標的化ｈＥＳ２細胞系は、親ｈＥＳ２細胞のＡＡＶ２−ＴＲＵＦ１１（ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＴＫ−ｎｅｏ）及び野生型ＡＡＶ２両方の１０６ウイルス粒子との共感染によって発生させた。Ｇ４１８選択後、ＧＦＰ陽性細胞を選別し、サブクローンを単離した。トランス遺伝子の標的化組込みは、ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ ＰＣＲ）によって確認された。野生型ＡＡＶ配列は、ＧＦＰ陽性クローン中では検出されなかった。ＲＦＰ発現ｈＥＳ細胞は、Ｉｒｉｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：１４７７−１４８２によって記載されたようなｈＥＳ２細胞のＲｏｓａ２６遺伝子座へＲＦＰ ｃＤＮＡを標的化する工程によって生成した。
【００３７】
ヒトＥＳ細胞の分化
ＥＢを発生させる前に、ｈＥＳＣは、フィーダーを枯渇させるためにＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）の層上で４８時間にわたり培養した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）培養からの細胞はコラゲナーゼＢ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を用いた２０分間の処理、その後のトリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％）を用いた２分間の処理によって小クラスターに解離させた。第０〜１日から、ＥＢは２ｍｌ塩基性培地（ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのグルタミン、４×１０−４Ｍのモノチオグリセロール（ＭＴＧ）、及び５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）＋０．５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中にプレーティングした。以下の濃度の因子をＥＢ形成、中胚葉誘導及び心臓特異化のために使用した。ＢＭＰ４−１０ｎｇ／ｍｌ、ｈｂＦＧＦ−５ｎｇ／ｍｌ、アクチビンＡ−３ｎｇ／ｍｌ、ｈＤＫＫ１−１５０ｎｇ／ｍｌ、ｈＶＥＧＦ−１０ｎｇ／ｍｌ。これらの因子は、以下の順序で加えた。第１〜４日には、ＢＭＰ４、ｈｂＦＧＦ及びアクチビンＡ、第４〜８日には、ＶＥＧＦ及びＤＫＫ１、第８日以降には、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、及びｂＦＧＦ。培地は、第８日以降には４日毎に取り替えた。全ヒト因子及び阻害剤は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。培養は、培養の初期１０〜１２日間は５％ＣＯ２、５％Ｏ２、及び９０％Ｎ２環境内で維持し、その後は５％ＣＯ２／気体環境内で維持した。
【００３８】
フローサイトメトリーによる選別及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）上での管形成
ＥＢを収集し、トリプシン（０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ）を用いて単一の細胞に解離させた。トリプシン処理後、Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析を実施した。細胞は、ＭｏＦｌｏ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、コロラド州フォートコリンズ）セルソーターを用いて選別した。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、カリフォルニア州サンカルロス）ソフトウエアプログラムを用いて分析した。抗ＫＤＲ−ＰＥ、抗−Ｃ−ＫＩＴ−ＡＰＣは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。選別したＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団は、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）を補充したＳｔｅｍｐｒｏ３４培地中で分化させた。管状構造は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティングガラス製カバースリップへ移してから２４時間以内に形成された。
【００３９】
免疫蛍光
解離した細胞は、２日間にわたりガラス製カバースリップ上で培養した。この時点で、細胞を４％ＰＦＡで固定し、次に染色した。以下の抗体を免疫染色のために使用した。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの抗ヒトＣＤ３１、抗ヒトＶＥ−カドヘリン、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ（カリフォルニア州フリーモント）からの抗マウストロポニンＴ及び抗ヒト平滑筋アクチン、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（カリフォルニア州テメキュラ）からの抗ヒトＡＮＰ、コネキシン４３及び抗ヒトα／β ＭＨＣ抗体、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）からの抗ヒトα−アクチニン。抗ヒト平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭＨＣ）、カルデスモン、フォン・ヴィレブランド因子抗体は、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（カリフォルニア州カーピンテリア）から購入した。Ｃｙ２、Ｃｙ３及びＣｙ５共役二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（ペンシルベニア州ウェストグローブ）から入手した。蛍光は、Ｌｅｉｃａ ＤＭＲＡ２蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ドイツ国ウェッツラー）を用いて視認し、画像はデジタル式Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＣＣＤカメラ（日本国浜松市）を使用して記録した。
【００４０】
コロニーアッセイ
心血管コロニーを発生させるために、６日齢ＥＢから単離したＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞は、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２〜３日間にわたり凝集させた。このステージに、凝集体を解離させ、細胞は５％ＣＯ２、５％Ｏ２、及び９０％Ｎ２環境内においてＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）を含有するメチルセルロース中で培養した。コロニーは、コロニー頻度分析のために４〜６日間の培養後にスコア付けした。
【００４１】
ＲＴ−ＰＣＲ
発現試験のためには、個々のコロニーをメチルセルロース培養から単離し、Ｂｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２５：６１１−６２３によって以前に記載されたプロトコルの修正版を用いて分析した。増幅ｃＤＮＡを次に標準ＰＣＲにかけた。リアルタイム定量的ＰＣＲは、ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ ＥＰ ＲｅａｌＰｌｅｘ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ）上で実施した。実験は白金ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＥＲ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３回ずつ実施した。全プライマーは、表１に記載した。全アニーリング反応は、６０℃で実施した。
【００４２】
【表１−１】
【００４３】
【表１−２】
【００４４】
【表１−３】
【００４５】
ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来集団のｉｎ ｖｉｖｏ分析
ｈＥＳＣを発現するＧＦＰ由来のＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞を移植前５〜１０日間にわたって、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウスに麻酔をかけ、気管挿管し、１００，０００個のドナー細胞を開胸手術において左心室壁内へ直接注射した。手術の２〜１１週後に心臓を収集し、カコジル酸バッファー中の１％パラホルムアルデヒド中で固定し、３００μｍでビブラトーム（Ｖｉｂｒｏｔｏｍｅ）にて切片化を行った。移植領域を同定し、１０μｍで凍結切片化を行った。免疫組織化学検査は、ＧＦＰ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＡＢ３０８０、１：１００；Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ及びＤＡＢキット）、α−アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ７８１１、１：５００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＱ３００Ｒ二次抗体、１：２０）、ＣＤ３１抗体（Ｄａｋｏ、Ｍ０８２３、１：５０；Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ及びＤＡＢキット）、ならびに平滑筋ＭＨＣ抗体（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＢＴ−５６２、１：３００；Ａｌｅｘａ ５５５二次抗体、１：２００）について実施した。共焦点像は、ＩｍａｇｅＪ ａｎｄ Ｐｉｅｒｒｅ Ｂｏｕｒｄｏｎｃｌｅのプラグインをデフォルト設定で使用して共局在化について分析した。マウス梗塞モデルにおける評価のためには、心筋梗塞はＲｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２５：９９３−９９４によって記載された技術を使用して、直接的な冠状動脈結紮によってＳＣＩＤベージュマウスにおいて誘導した。１０〜２０分後に、マウスに５００，０００個のＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞（ｎ＝９）または同等量の無血清培地（ｎ＝１２）を注射した。全注射は、梗塞の境界帯で試みた。２週間後、心室機能の評価は、９．４テスラの磁気共鳴イメージングを用いて実施した。
【００４６】
パッチクランプ
全細胞パッチクランプ記録は、ＩＸ５０倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ａ増幅器、Ｄｉｇｉｄａｔａ １３００アナログ／デジタル変換器及びｐＣｌａｍｐ９．１ソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を備えるＰＣを用いて室温で実施した。浴溶液（単位：ｍＭ）は、ＮａＣｌ １３６、ＫＣｌ ４、ＣａＣｌ２ １、ＭｇＣｌ２ ２、ＣｏＣｌ２ ５、ＨＥＰＥＳ １０、グルコース１０、及びテトロドトキシン（ＴＴＸ）０．０２（ｐＨ７．４）であった。ピペット（単位：ｍＭ）は、ＫＣｌ １３５、ＥＧＴＡ １０、ＨＥＰＥＳ １０、及びグルコース５（ｐＨ７．２）を含有する細胞内溶液を充填すると３〜５ＭΩ抵抗のピペットであった。細胞を、−３０ｍＶのテールパルス（図４におけるような持続期間）前には、−８０ｍＶから＋４０ｍＶへの電位を２０ｍＶ増分で試験するために−８０ｍＶの保持電位から段階付けた。データは、ｐＣｌａｍｐ９．１ソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて分析した。電流振幅は、細胞サイズに標準化した（全細胞膜容量）。不活性化τ値は、電流減衰の指数関数的適合を用いて計算した。
【００４７】
電場電位の記録
６日齢ＥＢから単離したＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞は、２〜４週間にわたりＳｔｅｍＰｒｏ−３４＋１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１を備えるＭＥＡ（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）培養皿内で培養した。記録の２日前に、細胞は１５％ＦＢＳを備えるＤＭＥＭ（細胞増殖用）へ切り換えた。細胞外電気活動は、６０チャンネルから同時に記録し、ソフトウエアＭＣ Ｒａｃｋ（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。
【００４８】
（実施例２）
ｈＥＳＣ分化培養中での心臓発達の調節
ｈＥＳＣから心臓分化系列への分化を方向付けるために、原始線条様集団の誘導、心臓中胚葉のパターニング及び心血管分化系列の特異化を含む段階的プロトコルは、様々なモデル系において中胚葉誘導及び心臓特異化で役割を果たすことが公知である因子のＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＤＫＫ１の組み合わせを用いて設計した。プロトコルの概略は、図１に示した。本明細書に例示したプロトコルを用いると、ｈＥＳＣは、ＥＢの形成を可能にするために２４時間にわたりＢＭＰ４の存在下で最初に分化された。第１ステージでのアクチビンとＢＭＰ４との組み合わせは、マウスにおけるこれらの集団内で発現することが公知の遺伝子であるＴ（ブラキュリ）及びＷＮＴ３ａのアップレギュレーション及び一過性発現によって証明されるように、原始線条様集団及び中胚葉を誘導した（図６）。第２ステージでは、ＶＥＧＦ及びＷｎｔ阻害剤であるＤＫＫ１が中胚葉を更にパターン化し、ＫＤＲ＋前駆細胞集団の拡張及び成熟を促進した。分化の第８日には、発達中の心血管分化系列の持続的拡張を支援するためにｂＦＧＦが再び加えられた。このプロトコルは、収縮細胞ならびに心臓トロポニンＴ（ＣＴＮＴ）（図２）、α−アクチニン、α／βミオシン重鎖、ＡＮＰ及びコネキシン４３（図２０、２１）を発現した細胞の出現によって証明されたように、ＥＢ内の心臓発達を支援する。ＣＴＮＴ＋細胞の最高頻度は培養の第１４〜１６日に定期的に観察されたが（図２、２１）、この集団はＥＢ内で２カ月間の期間にわたって維持することができた。収縮性ＥＢの発達の動態は、ＣＴＮＴ＋集団の出現と平行していた（図２２）。
【００４９】
（実施例３）
ヒトＥＳ細胞由来の心臓分化系列の発生にＷｎｔシグナル伝達が果たす役割
Ｗｎｔシグナル伝達経路がヒトＥＳ細胞由来の心臓分化系列の出現に果たす役割を、原始線条誘導を越える段階（第２ステージ）に特に焦点を当てて調査した。ＥＢは、プロトコルに略説したように、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ及びアクチビンＡの存在下で誘導した。Ｗｎｔ３ＡまたはＤＫＫ１のいずれかを図３に示した日に培養へ加えた。これらの因子は、１４日間を通して培養中で維持された。ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦは、指示した時点に加えた。第１４日に、ＥＢを収集し、上述したように分析した。対照は、ＷＮＴまたはＤＫＫ１を受容しなかった培養であった。分化第４日におけるＥＢへのＤＫＫ１の添加は、培養第１４日のＣＴＮＴ＋細胞の頻度の２倍を超える（４０％までの）増加をもたらした（図３）。ＤＫＫ１の作用は、第６または８日に加えられた場合はこれほど顕著ではなく、添加が分化第１０日に添加された場合はＣＴＮＴ＋細胞の頻度の増強は見られなかった。Ｗｎｔ３Ａは反対の作用を有しており、第４または６日に培養に加えられた場合はＣＴＮＴ＋細胞の発達を完全に抑制した。これらの所見は、古典的Ｗｎｔ経路のステージ特異的阻害がＢＭＰ４／アクチビン誘導性ＰＳ集団の心臓特異化を促進するために不可欠であることを示している。
【００５０】
（実施例４）
心臓分化系列の誘導においてＢＭＰ４、アクチビンＡ及びｂＦＧＦが果たす役割
ｈＥＳＣ分化培養中での心臓分化系列の誘導においてＢＭＰ４、アクチビンＡ及びｂＦＧＦが果たす役割を評価するために、誘導ステージ（第１〜４日）中に単一因子ならびに様々な組み合わせを試験した。第４日には、図１に略説したように、因子を除去し、ＥＢを処理した。第４〜１４日に、ＥＢは図５、２５、及び２６に示したようにＶＥＧＦ及びＤＫＫ１の組み合わせを用いて処理し、第８日以降にはｂＦＧＦを添加した。ＥＢは第１４日に収集し、各組み合わせについてのＣＴＮＴ＋細胞の頻度及び２４ウェルプレートの１ウェル当たりのＣＴＮＴ＋細胞の総数について分析した。ＢＭＰ４、ｂＦＧＦもしくはアクチビンＡ単独またはＢＭＰ４及びＦＧＦまたはアクチビンＡ及びｂＦＧＦの組み合わせは、低頻度（図４）及び生成されたＣＴＮＴ＋細胞の総数（図２３、２４）によって証明されたように心臓発達の貧弱な誘導因子であった。ＢＭＰ４及びアクチビンＡは有意な数のＣＴＮＴ＋細胞を誘導するが、これら３つの因子の組み合わせは最も強力であり、心臓細胞の最高の頻度及び総数を発生し、４０％〜５０％のＣＴＮＴ＋細胞からなる培養を常に生産した。ＶＥＧＦは心臓発達のために必須ではなかったが、１０ｎｇ／ｍｌのこの因子の添加は発達したＣＴＮＴ＋細胞の総数を増加させた。この濃度を超えてＶＥＧＦの濃度が増加すると培養中の細胞数を減少させ、これは発生したＣＴＮＴ＋細胞の総数を有意に減少させた（図５、２５及び２６）。
【００５１】
発達中のＥＢの分子分析は、原始線条様集団の確立後に発現パターンにおける動的変化を明らかにした。Ｔ及びＷＮＴ３Ａと一緒に、ＤＫＫ１の発現は早期にアップレギュレートされ、１８日間の経過を通して持続した（図６）。分化の第２〜４日の内因性ＤＫＫ１の発現は、心臓中胚葉を特異化するように機能することができ、外因性阻害剤の添加の不在下で心臓分化系列を確立させる（図３）。ＫＤＲは、未分化ＥＳ細胞内で発現した。この発現レベルは、第４〜６日に増加すると思われ、その後１２日間にわたって持続された。初期胚中の２次心臓形成領域の前駆細胞をマークする遺伝子であるＩＳＬ１は、分化第８日に最初に検出された心臓転写因子Ｎｋｘ２．５の発現に先行して第６〜８日にＥＢ中で発現した。適正な心臓発達に必要とされる２つのＴＢＸ転写因子であるＴＢＸ５及びＴＢＸ２０、ならびに収縮性タンパク質ＭＬＣ２Ａ及びＣＴＮＴの発現は、分化の第８〜１０日にアップレギュレートされ、これは心臓発達の開始を反映していた。
【００５２】
（実施例５）
心血管電位を用いたＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ ＥＢ集団の同定
発達中のＥＢをＫＤＲ及びＣ−ＫＩＴの発現について分析した。Ｃ−ＫＩＴを別個の集団を規定するための電位マーカーとして使用したが、それはマウスＥＢ内でのＣ−ＫＩＴの発現が最初期血球血管芽細胞由来造血前駆細胞及び血管前駆細胞ならびに前原始線条及び発達中の内胚葉を同定するからである。図７は、異なる日齢のＥＢのフローサイトメトリー分析を示す。図７に示すように、３つの別個の集団であるＫＤＲｈｉｇｈ／Ｃ−ＫＩＴ＋、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ及びＫＤＲｎｅｇ／Ｃ−ＫＩＴ＋は、６日齢ＥＢ内で分解される可能性がある。３つの集団の発達は、ＢＭＰ４及びアクチビンＡの両方を用いた誘導に依存した（図示しない）。３つの集団を細胞選別によって単離し、遺伝子発現パターン及び心臓電位について分析した。図８は、６日齢のＥＢから単離した３つの集団の定量的ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現分析を示す。平均発現をシクロフィニンへ標準化した。ＫＤＲｈｉｇｈ／Ｃ−ＫＩＴ＋集団は、血管発達に関連する遺伝子であるＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリン及びＳＭＡ、ならびに造血に関与することの指標となる遺伝子であるＧＡＴＡ−１を発現した（図８、２７）。心臓発達に関係する、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１及びＴＢＸ５を含む遺伝子は、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ分画内では最高レベルで発現した。この分画はＳＭＡ、極めて低レベルのＧＡＴＡ−１もまた発現したが、ＶＥ−カドヘリンもしくはＣＤ３１は検出しなかった。ＳＭＡは早期に心臓分化系列ならびにＶＳＭ分化系列内で発現するので、この発現は心臓発達の開始を反映できた。ＫＤＲｎｅｇ／Ｃ−ＫＩＴ＋細胞は最高レベルの３分画のＯＣＴ４及びＴを発現したが、これは残留未分化ＥＳ細胞ならびに原始線条様細胞の存在を示す。この分画内の比較的高レベルのＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７は、それが内胚葉分化系列に関与する細胞もまた含有していることを示唆している。ＳＯＸ１及びＰＡＸ６は極めて低レベルでしか検出されず、これはこの発達ステージではＥＢ内で神経外胚葉分化系列への分化があったとしてもほんのわずかに過ぎないことを示唆している（図２７）。これらをまとめると、これらの発現パターンは、ＫＤＲｈｉｇｈ／Ｃ−ＫＩＴ＋集団が造血及び血管前駆細胞を含有する、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団が心臓前駆細胞を含有する、そしてＫＤＲｎｅｇ／Ｃ−ＫＩＴ＋集団が未分化ＥＳ細胞、原始線条細胞及び内胚葉細胞の混合物からなることを示している。
【００５３】
心臓電位をモニターするために、細胞はゼラチンコーティングウェル上の単層としてプレーティングするか、または低クラスター培養皿内で再凝集させ、凝集体として培養した。詳細には、細胞は６日齢ＥＢから単離し、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に単層としてゼラチンコーティングウェル上で培養した。ＣＴＮＴ＋細胞は、１０日間の培養後に分析した。結果を図９に示す。６日齢ＥＢからのＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞を選別し、単層として、またはＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）とともに低クラスターウェル内の凝集体として培養した。培養を収集し、７〜１０日間にわたる分化後にＣＴＮＴ＋細胞の存在について分析した。結果を図１０に示す。数（％）は、３回の独立実験の平均値±標準誤差を表す。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。統計的分析は、対応のないｔ検定を用いて実施した。＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団は最大の心筋細胞電位（図９）を提示しており、懸濁培養中の凝集体内ならびに付着性単層内の両方において容易にＣＴＮＴ＋細胞及び収縮性細胞の集団を発生した（図１０）。凝集体内のおよそ４０％の細胞がＣＴＮＴ＋であったが、単層培養の５０％超は一貫してこのマーカーを発現した。単層培養内の心筋細胞の高頻度は、同調塊（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｍａｓｓ）として収縮する細胞層の発達を常にもたらした。単離されたＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞は、凝集体としてはおよそ１．５倍（データは示していない）、及び単層培養内では３倍に拡張した（図２８）。略説した誘導プロトコル及び選別ストラテジーを用いると、４インプットのｈＥＳＣに付き１の心筋細胞のアウトプットが予測された。典型的な実験では、２×１０６個のｈＥＳＣは、１×１０６個の６日齢ＥＢ細胞を発生したが、そのうちの３０％（３．０×９ ０５細胞）はＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ分画を提示した。この集団は、単層培養フォーマット内で３倍（１×１０６細胞）に拡張し、およそ５０％の心筋細胞（５×１０５）からなる集団を産出した。２次ｈＥＳＣ系であるＨ１から発生したＥＢの動態分析は、分化第６日ではなく第５日に３ＫＤＲ／Ｃ−ＫＩＴ集団の発達を証明した。５日齢ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ集団の分析は、それが心臓電位もまた示すことを示した（図２９、３０）。
【００５４】
（実施例６）
ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来分化系列の特性解析
ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）とともにプレーティングした６日齢ＥＢ由来ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ分画から発生した付着性集団についての定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析を実施した。培養は図１１に示した日に収集し、細胞を発現について分析した（Ｄ７はプレーティングの１日後の集団を表す）。シクロフィニンに対して標準化した平均発現を示した。バーは、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。
【００５５】
プレーティングから異なる日数後でのＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来付着性集団についての発現分析（ｑＰＣＲ）は、内皮（ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリン）、ＶＳＭ（カルポニン、ＳＭＡ）、心臓発達（ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＴＢＸ５、ＴＢＸ２０）及び心臓成熟（ＣＴＮＴ、ＭＬＣ２Ａ）に関連する遺伝子のアップレギュレーションを証明した（図１１、３１）。ＮＦＡＴＣ及びニューレグリン １（ＮＲＧｌ）の発現は、培養中の心内膜の存在を示唆している。低レベルのＮＥＵＤ、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＳＯＸ１７及びＭＥＯＸ１の発現は、これらの培養が神経外胚葉、内胚葉または体中胚葉で汚染されていないことを示している（図１１、３１）。
【００５６】
ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ細胞を６日齢ＥＢから単離し、図１２のグラフの下方に指した因子の様々な組み合わせを用いて単層として培養した。細胞を収集し、１０〜１２日間にわたる培養後にＣＴＮＴ＋、ＣＤ３１＋及びＳＭＡ＋細胞の存在について分析した。ＳＭＡ抗体は、心筋細胞及び平滑筋細胞の両方を染色することができる。数（％）は、３回の独立実験の平均値の標準誤差を表す。
【００５７】
ＶＥＧＦ及びＤＫＫ１中で１０〜１２日間培養したＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来付着性細胞のフローサイトメトリー分析は、ほぼ９０％がＳＭＡを発現し、５０％がＣＴＮＴを発現し、４％がＣＤ３１を発現することを明らかにした（図１２）。培養へのｂＦＧＦの添加は、ＣＴＮＴ＋細胞の比率を３０％へ減少させ、ＣＤ３１＋集団を３０％へ増加させた。ＳＭＡ＋細胞の比率は、ｂＦＧＦの存在下で平均８０％へ穏やかに減少した。ｂＦＧＦの添加は、単層培養中で細胞数に有意には影響を及ぼさなかった（図２８）。これらの所見は、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来集団内の細胞の大多数が心血管分化系列の細胞であることを明らかに示している。それらはさらに、ｂＦＧＦがこの集団内で発達する心筋細胞及び内皮細胞の比率に影響を及ぼすことができることもまた示している。
【００５８】
ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１及びｂＦＧＦ中で培養したＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来集団の免疫染色分析は、ＣＤ３１＋、ＶＥ−カドヘリン＋及びフォン・ヴィレブランド因子＋内皮細胞の存在、ＣＴＮＴ＋心筋細胞の存在ならびにＶＳＭ発達の指標となるＳＭＡ＋、ＳＭＨＣ＋及びカルデスモン＋細胞の存在を証明した。集団内の未成熟心筋細胞はＣＴＮＴ及びＳＭＡの両方を発現したが、他方ＶＳＭ細胞はＳＭＡしか発現しなかった。ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来内皮細胞についてさらに特性解析するために、この集団をＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの存在下で拡張させ、次にＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティングカバースリップ上で培養した。これらの条件下では、細胞は管状構造への内皮細胞の組織化の指標である格子を形成した。これらの構造内の細胞はＣＤ３１を発現し、Ｄｉｌ−ＡＣ−ＬＤＬを取り込む能力を示して、それらの内皮細胞表現型を確証した。免疫染色試験からの所見は、フローサイトメトリー分析所見と一致しており、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来集団が心臓、内皮及び血管平滑筋分化系列の細胞からなることを証明している。
【００５９】
ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの発達可能性を証明するために、それらをさらにＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの心臓内へ移植した。これらの試験のためには、ｈＥＳ２細胞系のＧＦＰ発現バージョンを使用した。組織学的分析は、移植後に心臓内のＧＦＰ＋細胞の存在を明らかにした。抗体を用いたＧＦＰの検出は、落射蛍光によって視認された集団と同一集団を同定したが、これはＧＦＰシグナルがドナー細胞の存在を表し、バックグラウンド蛍光の結果としては生じないことを示している。α−アクチン、ＣＤ３１もしくはＳＭＨＣのいずれかを共発現するＧＦＰ＋集団が移植片内で検出されたが、これは心臓、内皮及び血管平滑筋分化系列へのｉｎ ｖｉｖｏでの分化を示している。移植された動物のいずれにおいても奇形腫は検出されなかった（Ｎ＞１０）。この集団のｉｎ ｖｉｖｏでの潜在性をさらに評価するために、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞をＳＣＩＤベージュマウスの梗塞心臓内へ直接的に移植した。２週間後に分析すると、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来心血管集団が移植された動物は、培地単独が注射された集団より３１％高い駆出率を有していた（５６％±３．６％対３９％±４．８％、ｐ＝０．００８）。これらの所見は、以前の報告書と一致しており、ｈＥＳＣ由来心筋細胞の移植が心筋梗塞の齧歯類モデルにおける心臓機能の改善をもたらすことを証明している。
【００６０】
（実施例７）
心血管コロニー形成細胞の同定及び特性解析
ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＤＫＫ１の存在下においてメチルセルロース中でプレーティングすると、ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞は培養４日間以内に小さな小型コロニーを生成した。個々の４日齢コロニーのＰＣＲ分析は、心臓（ＣＴＮＴ）、血管（ＣＤ３１及び／またはＶＥ−カドヘリン）及びＶＳＭ（ＳＭＡ及び／またはカルポニン）の発達の指標となるマーカーの共発現を示した（図１３、３２）。さらに６日間にわたり培養中で維持すると、これらのコロニーの一部分が収縮細胞を発生し、それらが心筋細胞を含有することを確証した。ＩＳＬ１及びＴＢＸ５は、典型的には同一コロニーでは発現しなかったので、これはそれらの発現が異なる心臓形成領域から心臓細胞を発達する別個の亜集団を含有するコロニーを規定できることを示唆している。カバースリップ上で増殖した個々のコロニー由来の付着性集団の免疫染色は、ＳＭＡ＋、ＣＴＮＴ＋及びＶＥ−ＣＡＤ＋細胞の存在を明らかにし、これらのコロニーが心臓、内皮及びＶＳＭ潜在性を有することを確証した。
【００６１】
２つの異なるアプローチを使用して、心血管コロニーがクローン性であるかどうかを決定した。最初に、ｈＥＳＣを発現するＧＦＰ由来のＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞を、メチセルロースコロニーアッセイにおいて赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するように組換えられたｈＥＳＣ由来のＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞とメチセルロースアッセイにおいて混合した。４日後に分析されたコロニーは、ＧＦＰもしくはＲＦＰのいずれかを発現するが両方は発現しないことが見出されたが（図１３）、この所見はそれらが単細胞から発生するのであり、細胞凝集の結果として形成されるものではないという解釈と一致する所見である。第２のアプローチとして、様々な数のＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来細胞を心臓メチルセルロース培養中でプレーティングする細胞用量応答実験を実施した。発達するコロニーの数とプレーティングされた細胞数との関係は、１に近い勾配を持つ線形であり、これはこれらのコロニーが単細胞に由来するという意見をさらに支持している（図１４）。これらをまとめると、これらの所見は、これらのコロニーが心血管コロニー形成細胞（ｈＣＶ−ＣＦＣ）に由来する心血管細胞のクローンを表すことを示している。
【００６２】
ＫＤＲｌｏｗ／Ｃ−ＫＩＴｎｅｇ由来心筋細胞の機能的電位は、全細胞電流及び電場電位測定値を用いて評価した。全細胞電圧固定分析では、試験した細胞の８０％が優勢な電位依存性の一過性の外向きカリウム電流を発現した（図１５、１６）。この電流の電位依存性、密度及びゲーティング動態（図１６、１７）は、ヒト心房及び心室心筋において見出されるＩｔｏカリウム電流のものと似ていた。微小電極を使用して培養細胞から記録した電場電位は、ヒト心血管前駆細胞由来心臓細胞が電気的に相互に共役していることを明らかにした。さらに、予想されたように、Ｖａｕｇｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓクラス１ａ薬剤であるキニジンは、測定Ｔ波振幅を減少させ、ＱＴ間隔を増加させた（図１９）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト心血管前駆細胞の集団であって、前記前駆細胞はＫＤＲを発現するがＣ−ＫＩＴを発現しないヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項２】
前記前駆細胞が、心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞の前駆細胞である、請求項１に記載のヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項３】
ヒト胚様体をアクチビン及びＢＭＰの存在下で無血清培地中において培養する工程と、その後に前記培養にＷｎｔの阻害剤を加える工程とによって得られる、請求項１に記載のヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項４】
前記アクチビンが、アクチビンＡである請求項３に記載のヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項５】
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ４である請求項３に記載のヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項６】
前記Ｗｎｔの阻害剤が、ＤＫＫ−１である請求項３に記載のヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項７】
ヒト心血管前駆細胞を産生するための方法であって、
（ａ）ヒト胚様体をアクチビン及びＢＭＰの存在下で無血清培地中において培養する工程、及び
（ｂ）前記培地へＷｎｔの阻害剤を加え、ヒト心血管前駆細胞の集団を提供するために培養する工程を含む方法。
【請求項８】
（ｃ）収集した細胞集団を提供するために前記ヒト心血管前駆細胞を培養から収集する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ｄ）前記収集した細胞集団を心血管前駆細胞に濃縮する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アクチビンが、アクチビンＡである請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ４である請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｗｎｔの阻害剤が、ＤＫＫ１である請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ａ）が、ｂＦＧＦの存在をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ｂ）が、ＶＥＧＦを加える工程をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト心血管前駆細胞を産生するための方法であって、
（ａ）ヒト胚様体を約１〜４日間にわたりアクチビンＡ及びＢＭＰ４の存在下で無血清培地中において培養する工程、
（ｂ）ＤＫＫ１を前記無血清培地へ加え、約１〜２日間にわたり培養する工程、及び、
（ｃ）ヒト心血管前駆細胞の集団を収集する工程を含む方法。
【請求項１６】
前記工程（ａ）が、ｂＦＧＦの存在をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ｂ）が、ＶＥＧＦを加える工程をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アクチビンＡの濃度が、約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＢＭＰ４の濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ｂＦＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＫＫ１の濃度が、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＶＥＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５０．０ｎｇ／ｍｌである請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ヒト心血管前駆細胞を産生するための方法であって、
（ａ）ヒト胚様体を約４日間にわたり約３．０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、約１０．０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び約５．０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの存在下にて無血清培地中で培養する工程、及び
（ｂ）約１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１及び約１０．０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを無血清培地へ加え、心血管前駆細胞を生成するために約１〜２日間にわたり培養する工程を含む方法。
【請求項２４】
（ｃ）ＫＤＲを発現するがＣ−ＫＩＴを発現しない細胞を選別する工程をさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記選別が、免疫選択による請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記選別が、フローサイトメトリーによる請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト心筋細胞の集団を発生する方法であって、ＫＤＲを発現するがＣ−ＫＩＴを発現しないヒト心血管前駆細胞の集団を約７〜約１０日間にわたりＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程と、ヒト心筋細胞の集団を収集する工程とを含む方法。
【請求項２８】
前記ヒト心血管前駆細胞をＶＥＧＦ及びＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｗｎｔの阻害剤が、ＤＫＫ１である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＶＥＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５０．０ｎｇ／ｍｌである請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＤＫＫ２の濃度が、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌである請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒト心血管前駆細胞が、単層として培養される請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒト心血管前駆細胞が、凝集体として培養される請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞を含有する心血管コロニーを発生する方法であって、ヒト心血管前駆細胞を約３〜約７日間にわたりＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程を含む方法。
【請求項３５】
前記Ｗｎｔの阻害剤が、ＤＫＫ１である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＤＫＫ１の濃度が、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌである請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＶＥＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５０．０ｎｇ／ｍｌである請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｂＦＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約１０．０ｎｇ／ｍｌである請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ヒト心血管前駆細胞の集団を含む組成物。
【請求項４０】
請求項３４の方法によって産出されたヒト心血管コロニーの集団を含む組成物。
【請求項４１】
心筋細胞を置換する方法であって、当該置換を必要とする被験者に請求項２７に記載の方法によって産生されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項４２】
心機能不全を特徴とする障害を治療する方法であって、前記治療を必要とする被験者にヒト心血管前駆細胞を含む組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項１】
ヒト心血管前駆細胞の集団であって、前記前駆細胞はＫＤＲを発現するがＣ−ＫＩＴを発現しないヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項２】
前記前駆細胞が、心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞の前駆細胞である、請求項１に記載のヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項３】
ヒト胚様体をアクチビン及びＢＭＰの存在下で無血清培地中において培養する工程と、その後に前記培養にＷｎｔの阻害剤を加える工程とによって得られる、請求項１に記載のヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項４】
前記アクチビンが、アクチビンＡである請求項３に記載のヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項５】
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ４である請求項３に記載のヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項６】
前記Ｗｎｔの阻害剤が、ＤＫＫ−１である請求項３に記載のヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項７】
ヒト心血管前駆細胞を産生するための方法であって、
（ａ）ヒト胚様体をアクチビン及びＢＭＰの存在下で無血清培地中において培養する工程、及び
（ｂ）前記培地へＷｎｔの阻害剤を加え、ヒト心血管前駆細胞の集団を提供するために培養する工程を含む方法。
【請求項８】
（ｃ）収集した細胞集団を提供するために前記ヒト心血管前駆細胞を培養から収集する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ｄ）前記収集した細胞集団を心血管前駆細胞に濃縮する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アクチビンが、アクチビンＡである請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ４である請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｗｎｔの阻害剤が、ＤＫＫ１である請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ａ）が、ｂＦＧＦの存在をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ｂ）が、ＶＥＧＦを加える工程をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト心血管前駆細胞を産生するための方法であって、
（ａ）ヒト胚様体を約１〜４日間にわたりアクチビンＡ及びＢＭＰ４の存在下で無血清培地中において培養する工程、
（ｂ）ＤＫＫ１を前記無血清培地へ加え、約１〜２日間にわたり培養する工程、及び、
（ｃ）ヒト心血管前駆細胞の集団を収集する工程を含む方法。
【請求項１６】
前記工程（ａ）が、ｂＦＧＦの存在をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ｂ）が、ＶＥＧＦを加える工程をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アクチビンＡの濃度が、約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＢＭＰ４の濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ｂＦＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＫＫ１の濃度が、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＶＥＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５０．０ｎｇ／ｍｌである請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ヒト心血管前駆細胞を産生するための方法であって、
（ａ）ヒト胚様体を約４日間にわたり約３．０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、約１０．０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び約５．０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの存在下にて無血清培地中で培養する工程、及び
（ｂ）約１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１及び約１０．０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを無血清培地へ加え、心血管前駆細胞を生成するために約１〜２日間にわたり培養する工程を含む方法。
【請求項２４】
（ｃ）ＫＤＲを発現するがＣ−ＫＩＴを発現しない細胞を選別する工程をさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記選別が、免疫選択による請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記選別が、フローサイトメトリーによる請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト心筋細胞の集団を発生する方法であって、ＫＤＲを発現するがＣ−ＫＩＴを発現しないヒト心血管前駆細胞の集団を約７〜約１０日間にわたりＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程と、ヒト心筋細胞の集団を収集する工程とを含む方法。
【請求項２８】
前記ヒト心血管前駆細胞をＶＥＧＦ及びＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｗｎｔの阻害剤が、ＤＫＫ１である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＶＥＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５０．０ｎｇ／ｍｌである請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＤＫＫ２の濃度が、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌである請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒト心血管前駆細胞が、単層として培養される請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒト心血管前駆細胞が、凝集体として培養される請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞を含有する心血管コロニーを発生する方法であって、ヒト心血管前駆細胞を約３〜約７日間にわたりＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程を含む方法。
【請求項３５】
前記Ｗｎｔの阻害剤が、ＤＫＫ１である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＤＫＫ１の濃度が、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌである請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＶＥＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５０．０ｎｇ／ｍｌである請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｂＦＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約１０．０ｎｇ／ｍｌである請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ヒト心血管前駆細胞の集団を含む組成物。
【請求項４０】
請求項３４の方法によって産出されたヒト心血管コロニーの集団を含む組成物。
【請求項４１】
心筋細胞を置換する方法であって、当該置換を必要とする被験者に請求項２７に記載の方法によって産生されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項４２】
心機能不全を特徴とする障害を治療する方法であって、前記治療を必要とする被験者にヒト心血管前駆細胞を含む組成物を投与する工程を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【公表番号】特表２０１１−５１７５６３（Ｐ２０１１−５１７５６３Ａ）
【公表日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０２０１４（Ｐ２０１１−５０２０１４）
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３８２２０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０７６２
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５０２３７５４３７）マウント シナイ スクール オブ メディスン オブ ニューヨーク ユニバーシティー (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３８２２０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０７６２
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５０２３７５４３７）マウント シナイ スクール オブ メディスン オブ ニューヨーク ユニバーシティー (11)
【Ｆターム（参考）】
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