白血病関連疾患の診断、予後および／または治療のための方法および組成物を開示する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
[00001]本出願は、その全開示が本明細書に明確に援用される、２００８年２月２８日出願の米国仮出願第６１／０６７，４０６号の優先権を請求する。
【０００２】
連邦が支援する研究に関する言及
[00002]本発明は、ＮＣＩ助成金番号ＣＡ７６２５９およびＣＡ８１５３３の元で政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
本発明の技術分野および産業上の利用可能性
[00003]本発明は、一般的に、分子生物学の分野に関する。本発明の特定の側面には、白血病関連障害の診断、療法、および予後における適用が含まれる。
【背景技術】
【０００４】
[00004]本セクションに開示される背景技術が法的に先行技術を構成することは承認されない。
[00005]マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、≒１９〜２４ｎｔの短いノンコーディングＲＮＡであり、主に、しかし独占的ではなく、ターゲットｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する相補配列と不完全に塩基対形成することによって遺伝子発現を制御する。ｍｉＲＮＡは、翻訳抑圧および転写物分解を誘導することによる、真核細胞における、遺伝子の主な制御ファミリーの１つに相当する（１〜４）。ｍｉＲＮＡターゲットを同定するために、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（５）、ＰｉｃＴａｒ（６）、およびＤｉａｎａ ｍｉｃｒｏＴ（７）などの異なるアルゴリズムが開発されてきているが、実験的に検証されて、この目的に対するバイオインフォマティクスおよび生物学的戦略の組み合わせの理論的根拠を支持するのは、これらの予測のうちのわずかでしかない。２つの独立の研究によって、ヒト遺伝子の２０〜３０％がｍｉＲＮＡによって制御されうると予測された（８、９）。正常なｍｉＲＮＡ発現パターンからの逸脱が、癌を含むヒト疾患において、役割を果たしている（概説に関しては、参考文献１０〜１５を参照されたい）。
【０００５】
[00006]ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターは、染色体１３ｑ１４．３にあり、これはＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）において頻繁に欠失されるゲノム領域であり、そして該クラスターの２つのメンバーは、大部分のＣＬＬ患者において、共転写され（ｃｏｔｒａｓｃｒｉｂｅｄ）、そして下方制御されている（１６）。
【０００６】
[00007]ＣＬＬは、家族に頻繁に関連する疾患である（患者の１０〜２０％は、少なくとも１人のＣＬＬの第一度親族を有する）（１７）。以前、本発明者らは、ＣＬＬ患者の≒１５％で、いくつかのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１６−１を含む）において、生殖系列または体細胞突然変異を同定し、患者の大部分は、ＣＬＬまたは他の造血器腫瘍および固形腫瘍の既知の個人歴または家族歴を有した（１８）。本発明者らは、自然にＣＬＬを発展させるマウスのＮＺＢ株（１９）における異常なｍｉＲ−１５ａ／１６−１遺伝子座の同定とともに、これらの知見を用いて、本明細書において、このクラスターが家族性ＣＬＬにおいても役割を果たすことをここに示す。
【０００７】
[00008]ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１６のターゲットの中で、本発明者らは、ＣＬＬの悪性であり大部分が非分裂性であるＢ細胞において（２０）、そして多くの固形および血液学的悪性腫瘍において（２１）過剰発現されている、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ２を同定した。ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の回復は、急性巨核球性白血病由来の細胞株、ＭＥＧ−０１において、アポトーシスを誘導する（２２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[00009]これらの疾患を治療する療法に関して、かなりの研究がなされているにも関わらず、これらは有効に診断および治療するのが困難なままであり、そして患者において観察される死亡率は、該疾患の診断、治療および予防において改善が必要であることを示す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
[00010]第一の側面において、本明細書において、そのサイレンシングが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）において、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が誘導する表現型を特徴付ける、遺伝子シグネチャーを提供する。
【００１０】
[00011]別の側面において、本明細書において、１以上の白血病細胞モデルおよび原発性慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）において、遺伝子を調節解除するための、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中の１以上のｍｉＲの使用を提供する。
【００１１】
[00012]別の側面において、本明細書において、本明細書に記載するシグネチャーを用いて、ＣＬＬのための療法的アプローチを開発するための方法を提供する。
[00013]別の側面において、本明細書において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）における腫瘍抑制因子としてのｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１６−１クラスターの使用を提供する。
【００１２】
[00014]別の側面において、本明細書において、白血病細胞の腫瘍移植の増殖を阻害するための方法であって、こうした細胞を、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中の１以上のｍｉＲに曝露する工程を含み、腫瘍抑制因子機能がこうした細胞に対して発揮される、前記方法を提供する。
【００１３】
[00015]別の側面において、本明細書において、抗白血病効果が発揮される必要がある被験体において、抗白血病効果を発揮するための方法であって、被験体に、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中のｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上を投与することによって、ＩＧＳＦ４を直接サイレンシングする工程を含む、前記方法を提供する。
【００１４】
[00016]別の側面において、本明細書において、図１５−表１１に列挙する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬおよびｍｉＲ−１５ａ／１６−１でトランスフェクションされたＭＥＧ−０１間で共通の遺伝子のシグネチャーを提供する。
【００１５】
[00017]別の側面において、本明細書において、ＣＬＬの治療におけるｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中のｍｉＲおよびｍｉＲ−２９の１以上の使用を提供する。
[00018]別の側面において、本明細書において、Ｂ−ＣＬＬ細胞の生存に対するｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターの影響が増加しているＭＣＬ１およびｃ−ＪＵＮ転写物両方をターゲティングすることを含む、ＣＬＬの治療におけるｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中のｍｉＲおよびｍｉＲ−２９の１以上の使用を提供する。
【００１６】
[00019]別の側面において、本明細書において、ＰＤＣＤ４、ＲＡＢ２１、ＩＧＳＦ４、ＳＣＡＰ２および／またはプロテオミクスによって同定されたタンパク質（Ｂｃｌ２、Ｗｔ１）の１以上の発現を減少させるための方法であって、その必要がある細胞を、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中の１以上のｍｉＲでトランスフェクションする工程を含む、前記方法を提供する。
【００１７】
[00020]別の側面において、本明細書において、ＩＧＳＦ４を直接ターゲティングするためのｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターの使用を提供する。
[00021]別の側面において、本明細書において、ＩＧＳＦ４を発現している細胞を、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中のｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上と、細胞におけるＩＧＳＦ５の発現が阻害されるような条件下で接触させる工程を含む、細胞増殖を阻害する方法を提供する。
【００１８】
[00022]特定の態様において、細胞は癌細胞である。
[00023]特定の態様において、細胞は慢性リンパ球性白血病細胞である。
[00024]特定の態様において、細胞は生物中にある。
【００１９】
[00025]特定の態様において、生物は動物である。
[00026]特定の態様において、生物は癌と診断されている。
[00027]別の側面において、本明細書において、１以上の同定されるタンパク質の翻訳を阻害することが知られる、選択されるｍｉＲＮＡの形成を阻害する方法であって、その必要がある被験体に、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターから選択される１以上のｍｉＲを投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２０】
[00028]別の側面において、本明細書において、図７−表３に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャーを提供する。
[00029]別の側面において、本明細書において、図８−表４に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャーを提供する。
【００２１】
[00030]別の側面において、本明細書において、図１１−表７に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャーを提供する。
[00031]別の側面において、本明細書において、図１２−表８に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャーを提供する。
【００２２】
[00032]別の側面において、本明細書において、図１３−表９に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャーを提供する。
[00033]別の側面において、本明細書において、図１４−表１０に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャーを提供する。
【００２３】
[00034]別の側面において、本明細書において、図１５−表１１に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャーを提供する。
【００２４】
[00035]別の側面において、本明細書において、図１６−表１２に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャーを提供する。
【００２５】
[00036]別の側面において、本明細書において、被験体が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有するかまたは該疾患を発展させるであろうかどうかの診断を決定するための方法であって、被験体由来の試料を調べ、そしてｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターより選択されるｍｉＲの発現の正の相関があるかどうかを決定する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２６】
[00037]別の側面において、本明細書において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有するかまたは発展させうる被験体の診断、治療、または予後の決定の１以上において、本明細書記載のシグネチャーを用いる方法を提供する。
【００２７】
[00038]別の側面において、本明細書において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）に罹患した患者の転帰を予測するための方法であって：正常細胞に比較したｍｉＲＮＡ発現の特徴的なシグネチャーを決定する工程を含み、該シグネチャーが、本明細書記載のｍｉＲＮＡシグネチャーの１以上を含む、前記方法を提供する。
【００２８】
[00039]別の側面において、本明細書において：ｉ）被験体が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有するかまたは該疾患を発展させるリスクがあるかどうかを診断し、ｉｉ）こうした被験体の予後を決定し、そして／またはｉｉｉ）こうした被験体を治療する方法であって：被験体由来の試験試料において、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定する工程を含み、ここでバイオマーカーは、本明細書記載のＣＬＬシグネチャーの１以上から選択され、そして対照試料中の対応するバイオマーカーのレベルに比較して、試験試料中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルが改変されていると、被験体がＣＬＬを有するかまたはＣＬＬを発展させるリスクを有するかいずれかの指標となる、前記方法を提供する。
【００２９】
[00040]特定の態様において、試験試料中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルは、対照試料中の対応するバイオマーカーのレベル未満である。
[00041]特定の態様において、試験試料中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルは、対照試料中の対応するバイオマーカーのレベルよりも高い。
【００３０】
[00042]別の側面において、本明細書において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）におけるターゲットｍＲＮＡの転写物量および／またはタンパク質発現に影響を及ぼすための方法であって、その必要がある被験体において、１以上のマイクロＲＮＡを調節解除する工程を含む、前記方法を提供する。
【００３１】
[00043]特定の態様において、方法は、癌関連遺伝子のタンパク質発現を阻害する工程をさらに含む。
[00044]別の側面において、本明細書において、ヒト慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）で生じるマイクロＲＮＡ機能の改変を同定するための、マイクロＲＮＡおよびタンパク質をコードするＲＮＡの両方の大規模遺伝子発現プロファイリングの使用を提供する。
【００３２】
[00045]別の側面において、本明細書において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の予後を決定する方法であって、被験体由来の試験試料において、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定する工程を含み：該バイオマーカーがこうした癌における予後不良と関連しており；そして対照試料中の対応するバイオマーカーのレベルに比較して、試験試料中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルが改変されていると、予後不良の指標となる、前記方法を提供する。
【００３３】
[00046]別の側面において、本明細書において、被験体が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有するかまたは該疾患を発展させるリスクがあるかどうかを診断することを含む、ＣＬＬを有する被験体の予後を決定する方法であって：被験体から得た試験試料から、ＲＮＡを逆転写して、ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドセットを提供し；ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに、ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；そして対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロファイルと、試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを比較する工程を含み、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルの改変が、被験体がＡＭＬなどを有するかまたは発展させるリスクがあるかいずれかである指標となる、前記方法を提供する。
【００３４】
[00047]特定の態様において、対照試料から生じたシグナルに比較して、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルが下方制御されており、そして／または対照試料から生じたシグナルに比較して、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルが上方制御されている。
【００３５】
[00048]特定の態様において、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲより選択される少なくとも１つのバイオマーカーのシグナルにおける改変が、被験体が予後不良を伴うＣＬＬ癌を有するかまたは発展させるリスクがあるかいずれかである指標となる。
【００３６】
[00049]別の側面において、本明細書において、白血球細胞においてタンパク質発現を制御するための方法であって、白血病細胞において、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲの１以上の発現を調節する工程を含む、前記方法を提供する。
【００３７】
[00050]別の側面において、本明細書において、白血病細胞において１以上のタンパク質レベルの発現を調節するための組成物であって、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上を含む、前記組成物を提供する。
【００３８】
[00051]別の側面において、本明細書において、白血病細胞においてタンパク質レベルを増加させる必要がある被験体において、白血病細胞においてタンパク質レベルを増加させるのに有用な、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターの１以上のアンチセンスｍｉＲを含む、組成物を提供する。
【００３９】
[00052]別の側面において、本明細書において、少なくとも１つのバイオマーカーが、対照細胞に比較して被験体の癌細胞において下方制御されているかまたは上方制御されている、白血病を有する被験体において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を治療する方法であって：少なくとも１つのバイオマーカーが癌細胞において下方制御されている場合、被験体において癌細胞の増殖が阻害されるように、被験体に、少なくとも１つの単離されたバイオマーカー、または単離されたその変異体もしくは生物学的活性断片の有効量を投与するか；あるいは、少なくとも１つのバイオマーカーが癌細胞において上方制御されている場合、被験体において癌細胞の増殖が阻害されるように、被験体に、少なくとも１つのバイオマーカーの発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００４０】
[00053]別の側面において、本明細書において、被験体において白血病を治療する方法であって：対照細胞に比較して、白血病細胞における少なくとも１つのバイオマーカーの量を決定し；ここで、バイオマーカーは、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択され、そして：癌細胞で発現されるバイオマーカーの量が、対照細胞で発現されるバイオマーカーの量より少ない場合、被験体に、少なくとも１つの単離されたバイオマーカーの有効量を投与するか；あるいは癌細胞で発現されるバイオマーカーの量が、対照細胞で発現されるバイオマーカーの量より多い場合、被験体に、少なくとも１つのバイオマーカーの発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の有効量を投与することによって、白血病細胞で発現されるバイオマーカーの量を改変する工程を含む、前記方法を提供する。
【００４１】
[00054]別の側面において、本明細書において、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される少なくとも１つの単離されたバイオマーカー、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、白血病を治療するための薬学的組成物を提供する。
【００４２】
[00055]特定の態様において、薬学的組成物は、少なくとも１つのｍｉＲ発現阻害剤化合物および薬学的に許容されうるキャリアーを含む。
[00056]別の側面において、本明細書において、抗白血病剤を同定する方法であって、細胞に試験剤を提供し、そして白血病細胞における発現レベル減少と関連する少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定する工程を含み、バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択され、そして対照細胞に比較して、細胞におけるバイオマーカーのレベルが増加していると、試験剤が抗白血病剤である指標となる、前記方法を提供する。
【００４３】
[00057]別の側面において、本明細書において、抗白血病剤を同定する方法であって、試験剤を細胞に提供し、そして白血病細胞における発現レベル増加と関連する少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定する工程を含み、対照細胞に比較して、細胞におけるバイオマーカーのレベルが減少していると、試験剤が抗癌剤である指標となり、バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される、前記方法を提供する。
【００４４】
[00058]別の側面において、本明細書において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）関連疾患を予防し、診断し、そして／または治療するための療法の有効性を評価する方法であって：有効性を評価しようとする療法を、動物に供し、そして少なくとも１つのバイオマーカーを評価することによって、疾患を治療するかまたは予防する際、試験中の治療の有効性のレベルを決定する工程を含み、バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される、前記方法を提供する。
【００４５】
[00059]特定の態様において、候補療法剤は：薬学的組成物、栄養補助食品組成物、およびホメオパシー組成物の１以上を含む。
[00060]特定の態様において、評価している療法は、ヒト被験体で使用するためのものである。
【００４６】
[00061]別の側面において、本明細書において、少なくとも１つのバイオマーカーを含む白血病関連疾患のマーカーに結合する少なくとも１つの捕捉試薬を含む製品であって、バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される、前記製品を提供する。
【００４７】
[00062]別の側面において、本明細書において、白血病関連疾患を治療するための療法剤のための候補化合物に関してスクリーニングするためのキットであって：少なくとも１つのバイオマーカーの試薬の１以上、および少なくとも１つのバイオマーカーを発現する細胞を含み、バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される、前記キットを提供する。
【００４８】
[00063]特定の態様において、少なくとも１つのバイオマーカーと特異的に結合する抗体または抗体断片を含む試薬を用いて、バイオマーカーの存在を検出する。
[00064]別の側面において、本明細書において、個体における合併症を治療するか、予防するか、逆転させるか、またはその重症度を制限するための薬剤を製造するための、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）関連疾患反応シグナル伝達経路に干渉する剤の使用であって、剤が少なくとも１つのバイオマーカーを含み、バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される、前記使用を提供する。
【００４９】
[00065]別の側面において、本明細書において、白血病関連合併症を治療するか、予防するか、逆転させるか、またはその重症度を制限する必要がある個体において、白血病関連合併症を治療するか、予防するか、逆転させるか、またはその重症度を制限する方法であって：少なくとも白血病関連疾患反応カスケードに干渉する剤を、個体に投与する工程を含み、剤が少なくとも１つのバイオマーカーを含み、バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される、前記方法を提供する。
【００５０】
[00066]別の側面において、本明細書において、個体において、白血病関連合併症を治療するか、予防するか、逆転させるか、またはその重症度を制限するための薬剤を製造するための、少なくとも慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）関連疾患反応カスケードに干渉する剤の使用であって、剤が少なくとも１つのバイオマーカーを含み、バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される、前記使用を提供する。
【００５１】
[00067]別の側面において、本明細書において、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上のアンチセンス阻害剤を含む、組成物を提供する。
【００５２】
[00068]別の側面において、本明細書において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬＬ）を治療する必要がある被験体において、該疾患を治療する方法であって、被験体に、組成物の療法的有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００５３】
[00069]特定の態様において、組成物を予防的に投与する。
[00070]特定の態様において、組成物の投与は、ＣＬＬの１以上の症状の開始を遅延させる。
【００５４】
[00071]特定の態様において、組成物の投与はＣＬＬの発展を阻害する。
[00072]特定の態様において、組成物の投与はＣＬＬを阻害する。
[00073]別の側面において、本明細書において、生物学的試料における白血病の存在を検出するための方法であって：白血病を含有すると推測される生物学的試料を、そのバイオマーカーに曝露し；ここでバイオマーカーはｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択され、そしてあるとすれば、試料中のマーカーの存在または非存在を検出する工程を含む、前記方法を提供する。
【００５５】
[00074]特定の態様において、バイオマーカーは検出可能標識を含む。
[00075]特定の態様において、方法は、被験体由来の生物学的試料中のバイオマーカーの量を、正常被験体由来の対応する生物学的試料中のバイオマーカーの量に比較する工程をさらに含む。
【００５６】
[00076]特定の態様において、方法は、異なる時点で、被験体から複数の生物学的試料を収集し、そして各生物学的試料中のマーカーの量を比較して、被験体において、マーカーの量が時間とともに増加しているかまたは減少しているかを決定する工程をさらに含む。
【００５７】
[00077]別の側面において、本明細書において、被験体において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を治療するための方法であって：白血病受容体アゴニストを含む、前記方法を提供する。
【００５８】
[00078]特定の態様において、受容体アゴニストは、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上のアンチセンス阻害剤である。
[00079]別の側面において、本明細書において、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体、それに由来する配列、こうしたｍｉＲ由来の相補配列、およびこうした相補配列由来の配列の中から選択される核酸分子で構成される、急性骨髄性白血病の治療のための薬剤を製造するための使用を提供する。
【００５９】
[00080]特定の態様において、薬剤は、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体、こうしたｍｉＲに由来する配列、こうしたｍｉＲ由来の相補配列、およびこうした相補配列由来の配列の1以上の中から選択される配列を提示する核酸分子を含む。
【００６０】
[00081]別の側面において、本明細書において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞の分化を誘導するのに有効な療法剤または療法剤の組み合わせを同定する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：ＣＬＬ細胞由来の細胞を培養し、細胞株の培地に少なくとも１つの化合物を添加し、工程（ｉ）および（ｉｉ）の間で少なくとも１つのｍｉＲの発現レベルの進化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を分析し、そして工程（ｉ）および（ｉｉ）の間のｍｉＲの発現レベルの変化を誘導する化合物または化合物の組み合わせを同定する工程を含む、前記方法を提供する。
【００６１】
[00082]特定の態様において、工程（ｉｉｉ）は少なくとも１つのｍｉＲの発現レベルの分析を含む。
[00083]特定の態様において、工程（ｉｖ）は少なくとも１つのｍｉＲの発現レベルを調節する化合物または化合物の組み合わせの同定を含む。
【００６２】
[00084]特定の態様において、工程（ｉｖ）は少なくとも１つのｍｉＲの発現レベルを減少させる化合物または化合物の組み合わせの同定を含む。
[00085]特定の態様において、化合物は癌の治療のための療法剤である。
【００６３】
[00086]本発明の多様な目的および利点は、付随する図を踏まえて読むと、好ましい態様の以下の詳細な説明から、当業者には明らかとなるであろう。
[00087]特許または出願ファイルは、カラーおよび／または１以上の写真で作成される１以上の図を含有してもよい。カラーの図（単数または複数）および／または写真（単数または複数）を含む本特許または特許出願刊行物のコピーは、要望があり、そして必要な料金の支払いがあれば、特許庁によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】[00088]図１Ａ〜１Ｃ： ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターは、ヌードマウスにおいて、ＭＥＧ−０１腫瘍の移植の増殖を阻害する。[00089]図１Ａ： ｐＲＳ−ＥまたはｐＲＳ１５／１６でプレトランスフェクションしたか、あるいはモックトランスフェクションしたＭＥＧ−０１細胞を注入したヌードマウスにおける、移植腫瘍の増殖曲線。[00090]図１Ｂ：ヌードマウスにおける、注入２８日後のモック、ｐＲＳ−Ｅ、およびｐＲＳ１５／１６トランスフェクションしたＭＥＧ−０１細胞の腫瘍移植サイズの比較。[00091]図１Ｃ：ヌードマウスにおける腫瘍重量±ＳＤ。
【図２】[00092]図２： ＭＥＧ−０１におけるマイクロアレイまたはプロテオミクスによって同定されるｍｉＲ−１５ａ／１６−１のターゲットのいくつかの検証。[00093]図２Ａ： ＰＤＣＤ４、ＲＡＢ２１、ＩＧＳＦ４、ＳＣＡＰ２（マイクロアレイ中で下方制御される）、ＢＣＬ２、およびＷＴ１（プロテオミクス中で下方制御される）のｑＲＴ−ＰＣＲ検証。ＩＦＧ１、ＡＣＥ、およびＥＲＢＢ２は陰性対照である。結果をｐＲＳ−Ｅトランスフェクション細胞に対して標準化した。β−チューブリンを用いて試料を標準化した。[00094]図２Ｂ： ＭＥＧ−０１細胞におけるＩＧＳＦ４のルシフェラーゼアッセイ、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターがこの遺伝子を直接ターゲティングすることを示す。
【図３】[00095]図３： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でトランスフェクションしたＭＥＧ−０１細胞の遺伝子発現プロファイル。５，６５９プローブの発現にしたがった試料のクラスターは、空のベクター（赤色）およびｍｉＲ−１５／１６発現ベクター（赤色）でトランスフェクションしたＭＥＧ０１間で、示差的に発現した。遺伝子の赤色は、すべての試料に渡る平均値より高い発現値を意味し、緑色は、より低い発現値を意味する。
【図４】[00096]図４： ＭＥＧ−０１において、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の予測されるおよび実験的（マイクロアレイ）に調節解除されるターゲットをマッチさせるベン図。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＭｉＲａｎｄａ、およびＰｉｃＴａｒによって予測されるターゲットと実験的に下方制御される転写物との間のマッチの結果。灰色の数字（４，７６９）は、マイクロアレイ中で下方制御されるが、いかなる考慮したアルゴリズムによってもターゲットとは予測されない、転写物の数を示す。
【図５】[00097]図５−表１： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスタートランスフェクション後のＭＥＧ−０１細胞において調節解除されるＡＲＥ−ｍＲＮＡのクラスター分布。
【図６】[00098]図６−表２： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスタートランスフェクション後のＭＥＧ−０１細胞における最も有意なＧＯカテゴリー。
【図７】[00099]図７−表３： ＭＥＧ−０１細胞においてプロテオミクスによって同定されるｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターによって下方制御されるタンパク質の例。
【図８】[000100]図８−表４：マイクロアレイによるｍｉＲ−１５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子のＣＬＬシグネチャーの例。
【図９−１】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−２】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−３】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−４】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−５】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−６】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−７】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−８】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−９】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１０】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１１】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１２】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１３】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１４】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１５】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１６】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１７】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１８】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１９】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−２０】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−２１】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−２２】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−２３】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−２４】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−２５】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−２６】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−２７】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−２８】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−２９】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−３０】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−３１】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−３２】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−３３】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−３４】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−３５】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−３６】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−３７】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−３８】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−３９】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−４０】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−４１】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−４２】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−４３】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−４４】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−４５】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−４６】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−４７】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−４８】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−４９】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−５０】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−５１】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−５２】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−５３】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−５４】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−５５】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−５６】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−５７】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−５８】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−５９】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−６０】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−６１】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−６２】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−６３】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−６４】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−６５】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−６６】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−６７】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−６８】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−６９】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−７０】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−７１】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−７２】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−７３】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−７４】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−７５】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−７６】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−７７】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−７８】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−７９】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−８０】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−８１】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−８２】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−８３】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−８４】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−８５】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−８６】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−８７】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−８８】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−８９】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−９０】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−９１】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−９２】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−９３】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−９４】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−９５】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−９６】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−９７】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−９８】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−９９】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１００】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１０１】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１０２】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１０３】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図９−１０４】[000101]図９−表５： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、調節解除された転写物。
【図１０−１】[000102]図１０−表６： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物、ならびにＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＰｉｃＴａｒ、およびＭｉＲａｎｄａによって予測されるターゲット。
【図１０−２】[000102]図１０−表６： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物、ならびにＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＰｉｃＴａｒ、およびＭｉＲａｎｄａによって予測されるターゲット。
【図１０−３】[000102]図１０−表６： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物、ならびにＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＰｉｃＴａｒ、およびＭｉＲａｎｄａによって予測されるターゲット。
【図１０−４】[000102]図１０−表６： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物、ならびにＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＰｉｃＴａｒ、およびＭｉＲａｎｄａによって予測されるターゲット。
【図１１−１】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−２】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−３】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−４】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−５】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−６】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−７】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−８】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−９】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−１０】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−１１】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−１２】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−１３】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−１４】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−１５】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−１６】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−１７】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−１８】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−１９】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−２０】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−２１】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−２２】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−２３】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−２４】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−２５】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−２６】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−２７】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−２８】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−２９】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−３０】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−３１】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−３２】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−３３】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−３４】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−３５】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−３６】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−３７】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１１−３８】[000103]図１１−表７： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、上方／下方制御される転写物の中のＡＲＥ−ｍＲＮＡ。赤（太字）、上方制御遺伝子；黒、下方制御遺伝子。
【図１２−１】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−２】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−３】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−４】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−５】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−６】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−７】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−８】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−９】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−１０】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−１１】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−１２】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−１３】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１２−１４】[000104]図１２−表８：空のベクターに比較した際の、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、下方制御された転写物の遺伝子オントロジー。
【図１３】[000105]図１３−表９： ＭＥＧ−０１細胞においてプロテオミクスによって同定された、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターによって下方制御されるタンパク質。
【図１４−１】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−２】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−３】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−４】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−５】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−６】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−７】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−８】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−９】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−１０】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−１１】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−１２】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−１３】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−１４】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−１５】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−１６】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−１７】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−１８】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−１９】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−２０】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−２１】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１４−２２】[000106]図１４−表１０：高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルを持つ８つのＣＬＬの間の比較。有意に示差的に発現される６７８転写物結果。
【図１５−１】[000107]図１５−表１１： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子のＣＬＬシグネチャー。
【図１５−２】[000107]図１５−表１１： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子のＣＬＬシグネチャー。
【図１６−１】[000108]図１６−表１２： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、（空ベクターに比較して）下方制御され、そしてｍｉＲ−１５ａ／１６−１の高発現を伴うＣＬＬ患者で下方制御される転写物の遺伝子オントロジー。
【図１６−２】[000108]図１６−表１２： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、（空ベクターに比較して）下方制御され、そしてｍｉＲ−１５ａ／１６−１の高発現を伴うＣＬＬ患者で下方制御される転写物の遺伝子オントロジー。
【図１６−３】[000108]図１６−表１２： ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でＭＥＧ−０１細胞をトランスフェクションした後、（空ベクターに比較して）下方制御され、そしてｍｉＲ−１５ａ／１６−１の高発現を伴うＣＬＬ患者で下方制御される転写物の遺伝子オントロジー。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
[000109]本開示全体で、同定する引用によって、多様な刊行物、特許および公開特許明細書に言及する。これらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、本発明が属する技術分野の到達水準をより詳細に記載するため、本開示内に援用される。
【００６６】
[000110]本明細書に記載するのは、ＣＬＬにおける、およびおそらくこれらの遺伝子が失われているかまたは下方制御されている他の悪性腫瘍における、腫瘍抑制因子遺伝子（ＴＳＧ）としてのｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１６−１の役割である。
【００６７】
[000111]本明細書にやはり開示するのは、白血病における腫瘍抑制因子としてのｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１６−１の作用機構である。本発明者らは、ＭＥＧ−０１白血病細胞におけるトランスクリプトームおよびプロテオームに対するｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１６−１の影響を分析した。このアプローチによって、多くのターゲット遺伝子を検証することが可能になり、これらの発現をＣＬＬの場合にも調べた。
【００６８】
[000112]本発明は、以下の実施例においてさらに説明され、ここで、別に言及しない限り、すべての部分および割合は重量であり、そして度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示目的のためのみに提供されることを理解しなければならない。上記議論およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認可能であり、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多様な変化および修飾を作製して、多様な使用および条件に適応させることが可能である。本明細書において言及される特許および非特許文献を含むすべての刊行物は、本明細書に完全に援用される。
【実施例】
【００６９】
[000113]実施例Ｉ
[000114]ＭＥＧ−０１白血病細胞へのｍｉＲ−１５ａ／ｍｉＲ−１６−１トランスフェクションのｉｎ ｖｉｖｏ効果
[000115]本発明者らは、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターが、ＡＰＡＦ−１−カスパーゼ９−ＰＡＲＰ経路の活性化によって同定されるような生得的なアポトーシス経路を活性化することによって、ＭＥＧ−０１細胞のアポトーシスを誘導することを報告した（２２）。
【００７０】
[000116]これらのｍｉＲＮＡの効果をさらに調べるため、本発明者らは、その腫瘍抑制機能をｉｎ ｖｉｖｏで試験した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでｐＲＳ１５／１６、ｐＲＳ−Ｅでトランスフェクションするか、またはモックトランスフェクションした、１０００万の生存ＭＥＧ−０１細胞を、免疫無防備状態の「ヌード」マウス（群あたり５匹）の脇腹にｓ．ｃ．接種した。
【００７１】
[000117]図１Ａに示すように、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターは、ＭＥＧ−０１腫瘍移植の増殖を阻害する。２８日後、腫瘍増殖は、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１トランスフェクションＭＥＧ−０１を接種した５匹のマウスのうち３匹（６０％）で完全に抑制された（図１Ｂ）。
【００７２】
[000118]第２８日、未処置および空ベクター処置マウスに関する平均腫瘍重量は、それぞれ、０．９５±０．５ｇおよび０．５８±０．３９ｇであり； ｍｉＲ−１５ａ／１６−１処置細胞を接種したマウスにおいて、平均は、０．０２０±０．０１ｇ（Ｐ＜０．００３）であった（図１Ｃ）。
【００７３】
[000119]したがって、これらの実験の結果は、ＭＥＧ−０１白血病細胞におけるｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターの腫瘍抑制因子機能を立証する。
[000120]ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉｒＲ−１６−１の外因性発現の転写効果。
【００７４】
[000121]白血病におけるｍｉＲ−１５ａ／１６−１腫瘍抑制の分子的基礎を性質決定するため、本発明者らは、まず、タンパク質コード遺伝子のゲノム全体の転写に対するｍｉＲＮＡの影響を調べた。本発明者らは、ｐＲＳ１５／１６ベクターをＭＥＧ−０１細胞内に一過性にトランスフェクションした。このベクターは、記載されるように、両方のｍｉＲＮＡをコードするゲノム領域を含有する（２２）。空ベクター（ｐＲＳ−Ｅ）でのトランスフェクションを対照として用いた。参考文献１８に記載されるように、定量的（ｑ）ＲＴ−ＰＣＲによって、ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ１６−１の発現レベルを測定することによって、トランスフェクションの成功を評価した（データ未提示）。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイを用いることによって、ゲノム全体のトランスクリプトームを調べた。マイクロアレイ分析は、ｐＲＳ１５／１６およびｐＲＳ−Ｅトランスフェクション細胞の間の異なるパターンの遺伝子発現を明らかに示す（図３）。
【００７５】
[000122]ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターでのトランスフェクション後、３５５プローブ（２６５遺伝子）は、有意に上方制御され、そして５，３０４プローブ（３，３０７遺伝子）は下方制御された（図９−表Ｓ５）。
【００７６】
[000123]示差的に発現された遺伝子で行ったクラスター分析によって、ｐＲＳ１５／１６およびｐＲＳ−Ｅトランスフェクション細胞間の明らかに区別される遺伝子発現プロファイルが示される（図３）。
【００７７】
[000124]下方制御されたプローブの中で、１４０（８５遺伝子）は、最も用いられる３つのソフトウェアアルゴリズム（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＰｉｃＴａｒ、およびＭｉＲａｎｄａ）によって、ｍｉＲ−１５／１６のターゲットと予測され、これらのアルゴリズムは異なる予測基準に基づいて構築されており、そしてしたがって、組み合わせて用いると、ターゲット同定の最高の可能性を生じる。１つの予測プログラムのみを考慮した場合、それぞれ、３７０、３３２、および３１２の転写物が、これらのｍｉＲＮＡの直接ターゲットと予測されることが見出された（図３、図１０−表６）。
【００７８】
[000125]上方制御される遺伝子の中で、共通して予測されるターゲットはなかった。したがって、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターは、ヒトゲノムにおける総数２５，０００の予測される遺伝子の≒１４％（上方制御される２６５、および下方制御される３，３０７の遺伝子）を、直接または間接的に、制御するようである（２３）（図４）。
【００７９】
[000126]ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）は、ＭＥＧ−０１において、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の間に、より頻繁に見られる
[000127]ｍｉＲ−１６−１に関して、ターゲットｍＲＮＡの「シード」領域における直接の相互作用（２２）およびＡＲＥが仲介するｍＲＮＡ不安定性（２４）の両方が報告されてきているため、本発明者らは、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が調節解除する転写物の間での、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡの頻度を調べた。
【００８０】
[000128]図１１−表７に示すように、３’ＵＴＲにおいて、ＡＲＥを含有する遺伝子の数は、２６５の上方制御遺伝子のうち３６（１３．６％）であり、そして下方制御される遺伝子３，３０７のうち６６６（２０．１％）であった。この相違は統計的に有意であり、χ^２値は６．６７４であった（Ｐ＝０．００９８）。ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の予測されるターゲットである８５の遺伝子の中で、２８（３２．９％）がＡＲＥを含有し、一方、共通して予測されるターゲットではない、残りの３，２２２の下方制御される遺伝子のうち、６３８（１９．８％）のｍＲＮＡがＡＲＥを含有する（χ^２値＝８．８９、Ｐ＝０．００３）。ＡＲＥストレッチ中のモチーフの数にしたがって、ＡＲＥ−ｍＲＮＡは、５つの群にクラスター化され、５つ（クラスターＩ）、４つ（クラスターＩＩ）、３つ（クラスターＩＩＩ）、および２つ（クラスターＩＶ）の５量体反復を含有し、一方、クラスターＶは、記載されるように、１３ｂｐ ＡＲＥパターン内に１つの５量体のみを含有する（２５）。
【００８１】
[000129]ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が調節解除する遺伝子のＡＲＥクラスター分布を図４−表１に示す。これらの結果は、ＡＲＥが、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の下方制御ターゲット、特に共通して予測されるターゲットの間でより頻繁に見られることを示し、ｍｉＲ−１６ターゲティングにおけるＡＲＥの影響をさらに裏付ける。
【００８２】
[000130]ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターによって調節解除される遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）
[000131]ｐＲＳ−Ｅに対してｐＲＳ１５／１６でトランスフェクションした後のＭＥＧ−０１細胞において示差的に発現されることが見出された遺伝子を、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ遺伝子オントロジーブラウザツールで分析して、下方制御される遺伝子において最も提示される遺伝子オントロジーカテゴリーを同定した（図６、表２、図４−表８）。これらの結果は、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターが、多くの細胞周期関連遺伝子の発現に直接または間接的に影響を及ぼすことを示す。
【００８３】
[000132]特に、細胞周期の異なる移行チェックポイントに関与する多くの遺伝子が、ｍｉＲＮＡによってターゲットとされる。ＢＣＬ２がｍｉＲ−１５ａ／１６−１のターゲットであるという本発明者らの先の知見と一致して、このＧＯオントロジー分析において、カテゴリー「抗アポトーシス」（ＧＯ：６９１６）が、下方制御される転写物の間で有意に提示される。
【００８４】
[000133]ＭＥＧ−０１プロテオームに対するｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１６−１の影響
[000134]転写および翻訳レベルの両方のｍｉＲＮＡ依存性遺伝子制御が記載されてきている（２６）ことから、タンパク質レベルでのＭＥＧ−０１細胞に対するｍｉＲ−１５ａ／１６−１の影響を調べるために、本発明者らは、トランスフェクション４８時間後、ｐＳＲ１５／１６またはｐＲＳ−ＥベクターでトランスフェクションしたＭＥＧ−０１細胞間で示差的に発現されるタンパク質を分析した。プロテオミクス分析によって、ｐＲＳ−Ｅ群に対して、ｐＲＳ１５／１６群で、強度が４倍以上減少したタンパク質を同定した。本発明者らは２７の異なるタンパク質を単離した（図７−表３、図１３−表９）。
【００８５】
[000135]興味深いことに、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１のターゲットであることを本発明者らがすでに示しているＢＣＬ２（２２）、およびこれらのｍｉＲＮＡの別の予測されるターゲットであるＷＴ１が同定された。ターゲットとされるタンパク質は、多様な生物学的機能を有し、そして４つの群にグループ分けされうる。
【００８６】
[000136]第一の群には、細胞増殖および細胞周期の制御に役割を果たすタンパク質（Ｒｕｖｂ１１、Ａｎｘａ２、Ｒｃｎ１、Ｃｃｔ７、Ｓｕｇｔ１、Ｃｄｃ２、Ｐｓｆ１）が含まれ、別のカテゴリーは、抗アポトーシスタンパク質（Ｇｒｐ７８、Ｂｃｌ２、Ｐｄｉａ２）によって、そして癌遺伝子としてまたは腫瘍抑制因子遺伝子としてのいずれかでヒト腫瘍形成に関与するタンパク質（Ｗｔ１、ＭａｇｅＢ３、Ｒａｂ９Ｂ）によって形成される。残りの１４タンパク質は、異なる生物学的機能を有し、そして本発明者らはこれらを「その他」と同定した。２７の実験的に同定された下方制御されるタンパク質のうち、８つ（２９．６％）が、予測アルゴリズムの少なくとも１つによって予測される、ｍｉＲ−１５ａ／１６のターゲットである。最後に、この８つのタンパク質の群のうち、２つ（Ｂｃｌ２、およびＣｆｌ２）は、下方制御されるｍＲＮＡ群にも存在した。
【００８７】
[000137]ＭＥＧ−０１細胞株における結果の検証
[000138]トランスクリプトームまたはプロテオーム分析によって得た結果を検証するため、９つの遺伝子（４つはＥＳＴマイクロアレイによって同定され、２つはプロテオミクスによって同定され、そして３つはどちらの技術によっても同定されず、そしてしたがって陰性対照と見なされる）の発現を、ｐＲＳ１５／１６またはｐＲＳ−Ｅ（対照）でトランスフェクションしたＭＥＧ−０１細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。図２Ａに示すように、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１でのトランスフェクションは、マイクロアレイで同定されたｍＲＮＡ（ＰＤＣＤ４、ＲＡＢ２１、ＩＧＳＦ４、ＳＣＡＰ２）およびプロテオミクスで同定されたタンパク質（Ｂｃｌ２、Ｗｔ１）両方の発現を減少させる。ｍｉＲ−１５ａ／１６−１トランスフェクションは、対照遺伝子（ＩＧＦ１、ＡＣＥ、およびＥＲＢＢ２）のいずれの発現にも影響を及ぼさない。
【００８８】
[000139]本発明者らは、検証された遺伝子の１つ（ＩＧＳＦ４）に対してルシフェラーゼアッセイを実行し、そしてｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターがＩＧＳＦ４を直接ターゲティングすることを立証した（図２Ｂ）。
【００８９】
[000140]ＢＣＬ２およびＤＭＴＦ１との直接相互作用が、本発明者らおよび他の研究者らによって立証された（７、２２）。したがって、本発明者らは、下方制御された遺伝子のＭＥＧ−０１プロファイルを一貫して確認可能であり、そしてこの白血病モデルにおいて、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の別の直接ターゲットを同定した。
【００９０】
[000141]原発性ＣＬＬにおけるｍｉＲ−１５ａ／ｍｉｒ１６−１ターゲットの発現の変動
[000142]ＭＥＧ−０１は、異常な１３ｑ１４を持ち、そしてｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターが欠損している白血病細胞モデルである（ＣＬＬに類似）が、巨核球性の樹立された白血病細胞株であるため、本発明者らは、原発性ＣＬＬにおいてもまたｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターの異なる発現の影響を調べた。
【００９１】
[000143]したがって、ＭＥＧ−０１細胞で同定されたｍｉＲ−１５ａ／１６−１のターゲットのいくつかが、ＣＬＬ患者において、これらの２つのｍｉＲＮＡの発現と逆相関するかどうかを検証するため、本発明者らは、本発明者らの以前の研究におけるｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析によって、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の発現がすでに決定されている１６のＣＬＬ試料群を選択した。
【００９２】
[000144]本発明者らは、１３のｍｉＲＮＡのシグネチャーが、緩徐進行性および侵襲性ＣＬＬの間で区別され、そしてｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターの欠損が緩徐進行性ＣＬＬの特徴であることを示した（１８）。まず、本発明者らは、ｑＲＴ−ＰＣＲによってｍｉＲ−１５ａ／１６−１の発現を検証し、そしてｑＲＴ−ＰＣＲによるマイクロアレイデータを確認した（データ未提示）。考慮する１６人の患者のうち、８人は、他の８人の患者に比較して、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１のより高い発現を有した（マイクロアレイ分析で、Ｐ＝７．７ｘ１０^−６、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析でＰ＝０．０１９）。ＥＳＴオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析による、高いおよび低いｍｉＲ−１５ａ／１６−１発現を持つ８つのＣＬＬの間の比較によって、６７８のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ（５３９遺伝子）が、２群の中で、有意に示差的に発現されることが示された（図１４−表１０）。総合すると、５３９遺伝子のうち８２（１５．２％）がＡＲＥ ｍＲＮＡであり、そして４つが３つのバイオインフォマティクスアルゴリズムすべてによってターゲットと予測される。
【００９３】
[000145]ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が下方制御する転写物のシグネチャー
[000146]本発明者らは、ｍｉＲ−１５／１６高発現ＣＬＬにおいて低く、そしてｍｉＲ−１５／１６低発現ＣＬＬにおいて高い遺伝子を選択し、これらは、ｐＲＳ１５／１６でのトランスフェクション後、ＭＥＧ−０１細胞において下方制御される遺伝子と交差した。
【００９４】
[000147]６０遺伝子（７０プローブ）のシグネチャーが出現した（図８−表４、図１５−表１１）。これらの遺伝子のうち１３（２１．７％）がＡＲＥ−ｍＲＮＡであり、クラスターＩＩＩ（７．８％）、ＩＶ（７．８％）、およびＶ（８４．６％）に分布した。ＭＥＧ−０１において下方制御されるｍＲＮＡすべて（Ｐ＝０．７６）、およびｍｉＲ−１５ａ／１６−１の高発現を伴う患者において抑制される転写物すべて（Ｐ＝０．１４）の両方に関して、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの統計的に有意な濃縮は、このシグネチャーにおいては観察されなかった。本発明者らは、これらの７０の転写物のＧＯ分析を行い、そして有意に提示されるカテゴリーの中で、いくつかが、トランスフェクションされたＭＥＧ−０１で以前同定され、そして細胞周期およびアポトーシスの制御に関与するもの、例えば「抗アポトーシス」（ＧＯ：６９１６）、「アポトーシスの負の制御」（ＧＯ：４３０６６）、および「プログラム細胞死の負の制御」（ＧＯ：４３０６９）であることを見出した（図１６−表１２）。ＭＥＧ−０１における、およびＣＬＬ患者における結果が一貫していることから、本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの妥当性が確認され、そして発現がクラスターによって一貫して調節されている、ＧＯカテゴリーおよびタンパク質コード遺伝子パネルが同定される。
【００９５】
[000148]考察
[000149]本発明者らは、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が、ヌードマウスにおいて、白血病細胞の腫瘍移植の増殖を阻害することによって、腫瘍抑制因子機能を発揮することを示す。
【００９６】
[000150]ｍｉＲ−１５ａ／１６−１腫瘍抑制因子機能の分子基礎を研究するため、本発明者らは、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１を発現するベクターであるｐＲＳ１５／１６でＭＥＧ−０１をトランスフェクションし、そして同じ空ベクターを対照として用いた後、調節解除される遺伝子の広範囲なマイクロアレイ分析を行った。
【００９７】
[000151]本発明者らは、異なるモデルにおいて、他のグループによって観察されたターゲットのいくつか、例えば、固形腫瘍細胞株におけるＣＤＫ６、ＣＤＣ２７、およびＲＡＢ１１ＦＩＰ２（２８）、ならびにアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）におけるＡＣＶＲ２Ａ（２９）を確認した。本発明者らは、実験的に同定された下方制御される遺伝子を、ｍｉＲＮＡターゲットの同定のための最も広く用いられるアルゴリズム３つ（ＰｉｃＴａｒ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＭｉＲａｎｄａ）によって共通して予測されるｍｉＲ−１５ａ／１６−１のターゲットとマッチさせ、そして８５遺伝子（２．６％）が共通であることを見出した。
【００９８】
[000152]興味深いことに、ｍｉＲＮＡ制御モジュール（ＭＲＭ）、または転写後遺伝子制御において共同して関与すると考えられるｍｉＲＮＡおよびターゲット遺伝子の群を予測することによって、ｍｉＲＮＡターゲットを同定する計算法（３０）と本発明者らの結果をマッチさせることによって、本発明者らは、本発明者らの示差発現遺伝子の中で、１３のｍｉＲ−１５／１６ ＭＲＭ予測遺伝子のうち５つ（３８．５％）（ＡＴＰ２Ｂ１、ＦＢＸＷ７、ＰＰＭＩＤ、ＳＯＮ、およびＷＴ１）を見出した。この割合は、考慮する予測アルゴリズムすべての中の最高に相当する。
【００９９】
[000153]２６５の実験的に上方制御されたｍＲＮＡの中で、ｍｉＲ−１５ａ／１６のターゲットとして予測されたものはない。この知見は、間接的な効果によって、例えばこれらの２つのｍｉＲＮＡによってターゲットとされる転写因子（単数または複数）の制御によって説明可能である。トランスフェクション４８時間後のプロテオミクスによって、ＭＥＧ−０１細胞におけるｍｉＲ−１５ａ／１６−１の外因性発現の影響もまた調べた。本発明者らはまた、トランスフェクションからの異なる時間間隔も調べ、転写（２４時間）または翻訳（４８時間）レベルでのｍｉＲ−１５ａ／１６−１の影響も分析したが、これは２４時間後、ｍＲＮＡサイレンシングが最大であるが、タンパク質枯渇による、二次的な転写効果が最小限であるためである（３１）。
【０１００】
[000154]本発明者らのプロテオミクスアプローチは、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の２７のターゲットを検出可能であり、このうちおよそ１／３は、予測されたターゲットでもある。興味深いことに、２５％（８つのうち２つ）の予測されるターゲットが、トランスクリプトーム中およびプロテオーム中の両方で下方制御された。ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子のうち、本発明者らは、ＩＧＳＦ４がクラスターの直接ターゲットであることを立証した。
【０１０１】
[000155]ＩＧＳＦ４は、肺癌における腫瘍抑制因子遺伝子として最初に同定され、そして細胞接着に関与する（３２、３３）。Ｓａｓａｋｉら（３４）は、ＴＳＬＣ１／ＩＧＳＦ４が、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）の発展および進行に関与する腫瘍性タンパク質として作用することを立証した。本発明者らはここで、ＩＧＳＦ４を直接サイレンシングすることによって、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１がより一般的な抗白血病効果を発揮するのに有用であると考えている。
【０１０２】
[000156]本発明者らはまた、マイクロアレイによって、８人の高レベルのｍｉＲ−１５ａ／１６−１を持つＣＬＬ患者において、低レベルのこれらの２つのｍｉＲＮＡを持つＣＬＬ患者に比較して下方制御されているｍＲＮＡを調べ、そしてＣＬＬおよびｍｉＲ−１５ａ／１６−１でトランスフェクションされたＭＥＧ−０１の間で共通な６０遺伝子のシグネチャーを同定した。
【０１０３】
[000157]このシグネチャー（ＭＥＧ−０１において下方制御される遺伝子の≒２％を含み、そして患者で提示されるものの≒１１％を含む）は、ＭＣＬ１、ＪＵＮ、ＳＣＡＰ２、ＴＲＡ１、ＰＤＣＤ６１Ｐ、ＲＡＤ５１Ｃ、およびＨＳＰＡ１Ａ／１Ｂなどの癌遺伝子を含有し、これを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（２２）、そしてここで本明細書において示すようにｉｎ ｖｉｖｏの両方で、ＭＥＧ−０１において観察されるｍｉＲ−１５ａ／１６−１の癌抑制因子効果を説明可能である。
【０１０４】
[000158]ＭＣＬ１は、ＣＬＬにおいてＢ細胞生存に寄与する抗アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーのメンバーであり、そして化学療法に対する耐性と関連づけられてきている（３５、３６）。ＭＣＬ−１発現は、ＺＡＰ７０陽性（侵襲性）対ＺＡＰ−７０陰性（緩徐進行性）Ｂ−ＣＬＬ細胞で異ならない（３７）という事実にも関わらず、ＭＣＬ１は急性および慢性リンパ性悪性疾患の両方において、適切な療法ターゲットに相当し、これはそのサイレンシングが、ＡＬＬおよびＣＬＬ細胞においてアポトーシスを促進し、そしてリツキシマブが仲介するアポトーシスに対する感受性を増加させるのに十分であるためである。興味深いことに、ｍｉＲ−２９ｂもまた、胆管細胞癌モデルにおいて、Ｍｃｌ１をターゲティングすることが同定されてきており（３９）、そして固形（４０）および血液学的悪性腫瘍（４１）の両方において、ｍｉＲ−２９ファミリーのＴＳＧとしての役割を定義する際、多くの証拠が収束してきている。
【０１０５】
[000159]これらの知見は、ＣＬＬの治療において、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１およびｍｉＲ−２９の関連に対して理論的根拠を提供する。
[000160]さらに、Ｂ細胞受容体を通じた持続するシグナル伝達は、ＭＣＬ１の誘導によって、そしてより低い度合いで、ｃ−ＪＵＮ ＮＨ_２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化によっての両方で、Ｂ−ＣＬＬ細胞の生存を促進する（４２）。
【０１０６】
[000161]したがって、ＭＣＬ１、およびｃ−ＪＵＮ転写物の両方をターゲティングすることによる、Ｂ−ＣＬＬ細胞の生存に対するｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターの影響は、さらにより頑強でありうる。プロテオミクスリストにＢＣＬ２が存在することから、本発明者らが以前言及したこのターゲットの転写後制御が裏付けられる（２２）。
【０１０７】
[000162]さらに、ＲＡＲＳ（アルギニル−ｔＲＮＡシンテターゼ）と同じ経路に関与するＬＡＲＳ（ロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼ）が抑制され、そしてＭＥＧ−０１において下方制御される遺伝子の中にＲＡＲＳが存在することから、この経路がｍｉＲ−１５ａ／１６−１によってターゲティングされうるという本発明者らの以前の仮説が裏付けられる（１６）。
【０１０８】
[000163]興味深いことに、シグネチャーにはまた、多くの重要な腫瘍抑制因子遺伝子（ＲＮＡＳＥＬ、ＨＡＣＥ１、ＣＥＰ６３、ＣＲＥＢＬ２、ＭＳＨ２、ＴＩＡ１、およびＰＭＳ１）が含まれ、そしてｍｉＲ−１５ａ／１６−１発現およびＣＬＬ予後の間の関連に関する説明を明らかにする。
【０１０９】
[000164]本発明者らは、非突然変異ＩｇＶ_Ｈ、および高発現ＺＡＰ−７０（劣った予後）を伴うＣＬＬ患者において、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルが、優れた予後のＣＬＬ患者より高いことを記載した（１８）。ｍｉＲ−１５ａ／１６−１ ＣＬＬシグネチャーにおいて癌遺伝子およびＴＳＧが同時に存在することが観察されるため、高レベルのこれらの２つのｍｉＲＮＡがより悪い予後のＣＬＬと関連するのがなぜなのかの分子的説明が得られる（１８）。高いｍｉＲ−１５ａ／１６−１レベルは、多くのＴＳＧを下方制御し、そしてその結果、多くの癌抑制因子経路に負に影響を及ぼし、したがって、より多くの発癌表現型を導くことも可能である。
【０１１０】
[000165]最近、ｍｉＲ−１６が、ＡＲＥが仲介するｍＲＮＡ不安定性に、決定的に関与することが立証された（２４）。ＭＥＧ−０１細胞において、本発明者らは、ＡＲＥ−ｍＲＮＡが、上方制御される遺伝子の間（１３．６％）よりも、下方制御される遺伝子の間で有意により多く提示される（２０．１％、Ｐ＝０．００９８）ことを見出した。同定されるシグネチャーでは、ＡＲＥ−ｍＲＮＡは濃縮されていないが、シグネチャーには、クラスターＶ ＡＲＥ−ｍＲＮＡが優性である（ＭＥＧ−０１および患者の両方で、このクラスターのメンバーがより多数であることを反映する）（８４．６％）ことが示され、より多数の５量体ＡＵ反復が、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１によるより高いサイレンシング効果に対応しないことが示された。
【０１１１】
[000166]最後に、調節解除された遺伝子のＧＯ分析は、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が代謝経路、核酸結合経路、および翻訳因子の活性に強く影響を及ぼすことを示す。固形腫瘍細胞株において、ｍｉＲ−１６が下方制御する転写物には、そのサイレンシングが、Ｇ_０／Ｇ_１にある細胞の集積を引き起こし、そしてその機能がＡＵリッチ要素に依存しない遺伝子が濃縮されている（２８）。
【０１１２】
[000167]本発明者らは、現在、その破壊がＧ_０／Ｇ_１細胞集積を誘発する、記載されるｍｉＲ−１６ターゲットのいくつかが、本発明者らの細胞モデルにおいてもまた下方制御され（ＣＤＫ６、ＣＤＣ２７、ＲＡＢ１１ＦＩＰ２）、そして以前記載されたＧＯカテゴリー［すなわち「有糸分裂細胞周期」（ＧＯ：２７８）および「細胞周期」（ＧＯ：７０４９）］のいくつかもまた、本発明者らのデータ中に提示されることを見出した。
【０１１３】
[000168]以前の報告と対照的に、本発明者らは、上方制御されるものに対して、下方制御されるターゲットの中で、統計的に有意により多い数のＡＲＥ−ｍＲＮＡを見出した。これらの相違は、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の細胞特異的機能を反映する可能性もあり、一方、固形腫瘍および血液学的腫瘍モデルの両方で、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が「細胞周期」に関与する遺伝子をターゲティングするという一般的な知見は、この遺伝子群に対するクラスターのより一般的でそして頑強な効果を示唆する。
【０１１４】
[000169]本発明者らは、ここで、白血病細胞モデルおよび原発性ＣＬＬの両方において、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が調節解除する遺伝子を示し、そしてＣＬＬにおいて、そのサイレンシングがｍｉＲ−１５ａ／１６−１が誘導する表現型を特徴付ける、一般的な遺伝子のシグネチャーを同定する。
【０１１５】
[000170]これらの知見は、ＣＬＬの療法的アプローチの開発に重要な意義を有しうる。
[000171]材料および方法
[000172]細胞培養および患者試料
[000173]ヒト巨核球性ＭＥＧ−０１細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入し、そして１ｘ非必須アミノ酸および１ｍｍｏｌのピルビン酸ナトリウムを補った１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ培地１６４０中、３７℃および５％ＣＯ_２で増殖させた。患者研究のため、本発明者らは、ＣＬＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ施設でＣＬＬと診断された患者からインフォームドコンセントを得た後に得た、１６のＣＬＬ試料を用いた。簡潔には、ＣＬＬ患者から血液を得て、そしてＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を通じて単核細胞を単離し、そして記載されるプロトコル（１８）にしたがってＲＮＡ抽出のためにプロセシングした。試料すべてに関して、参考文献１８に報告されるようなマイクロアレイ発現データが知られ、そして本発明者らはさらに、ｑＲＴ−ＰＣＲで確認を行った。
【０１１６】
[000174]ｉｎ ｖｉｖｏ研究
[000175]施設指針にしたがって動物研究を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＭＥＧ−０１細胞株を、ｍｉＲ−１５ａ／ｍｉＲ−１６−１を発現しているｐ−Ｒｅｔｒｏｓｕｐｅｒベクター（４３）（ｐＲＳ１５／１６）でトランスフェクションした。非トランスフェクション（モック）または同じ空プラスミド（ｐＲＳ−Ｅ）でトランスフェクションした細胞は腫瘍形成対照として働いた。トランスフェクション２４時間後、１０^７の生存細胞を、トランスフェクションまたは対照細胞株あたり５匹の、５週齢の雌ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏａｒｔｏｒｉｅｓ）の左脇腹内にｓ．ｃ．注射した。第７日、第１５日、第２１日、および第２８日に、腫瘍直径を測定した。２８日後、マウスを屠殺し、剖検を行い、そして腫瘍の重量を測定した。等式Ｖ（ｍｍ^３）＝ＡｘＢ^２／２、式中、Ａは最大直径であり、そしてＢは垂直直径である、を用いることによって、腫瘍体積を計算した。
【０１１７】
[000176]ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション
[000177]製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって、ＭＥＧ−０１細胞を１μｇ／ｍｌ（最終濃度）のｐＲＳ−１５／１６またはｐＲＳ−Ｅベクターで一過性にトランスフェクションした。２４時間後、製造者の指示にしたがって、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって、総ＲＮＡを抽出した。
【０１１８】
[000178]マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ分析
[000179]各々３つ組である、ｐＲＳ−１５／１６およびｐＲＳ−ＥベクターでトランスフェクションしたＭＥＧ０１細胞株から得た２つの試料、ならびに１６のＣＬＬ試料を、ヒトゲノムＵ１３３Ａ Ｐｌｕｓ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いたマイクロアレイによって分析した。ＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナによって生成したＣＥＬファイルをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に取り込み、そしてさらにプロセシングした。マイクロアレイ実験に関する詳細は、本明細書の実施例ＩＩに記載される。
【０１１９】
[000180]ｍｉＲＮＡターゲット予測
[000181]アルゴリズムＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ／）、ＰｉｃＴａｒ（ｐｉｃｔａｒ．ｂｉｏ．ｎｙｕ．ｅｄｕ／）、およびｍｉＲａｎｄａ（ｃｂｉｏ．ｍｓｋｃｃ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｉｒｎａｖｉｅｗｅｒ／ｍｉｒｎａｖｉｅｗｅｒ．ｐｌ）を用いることによって、ｍｉＲＮＡの予測されるターゲットの分析を決定した。
【０１２０】
[000182]アデニル酸ウリジル酸リッチ要素（ＡＲＥ）を含有する遺伝子の同定
[000183]記載されるような（４４）、ＡＲＥ−ｍＲＮＡデータベースバージョン３．０（ＡＲＥＤ； ｒｃ．ｋｆｓｈｒｃ．ｅｄｕ．ｓａ／ａｒｅｄ／）を用いた（実施例ＩＩを参照されたい）。
【０１２１】
[000184]二次元ＰＡＧＥ、ならびにマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）および質量分析（ＭＳ）によるタンパク質同定。
[000185]製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって、ＭＥＧ−０１細胞を１μｇ／ｍｌ（最終濃度）のｐＲＳ１５／１６またはｐＲＳ−Ｅベクターで４８時間、一過性にトランスフェクションし、そして二次元ＰＡＧＥ、ならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＭＳによるタンパク質同定の詳細を実施例ＩＩに記載する。
【０１２２】
[000186]ｑＲＴ−ＰＣＲ
[000187]製造者の指示にしたがって、そして記載されるように（４５）、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、３つ組で、ｍｉＲＮＡに関するｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。標準化のため、１８Ｓ ＲＮＡを用いた；製造者の指示にしたがって、遺伝子特異的プライマーおよびＩＱ ＳＹＢＲグリーンＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することによって、目的の他の遺伝子に関するｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。β−チューブリンを標準化のために用いた。
【０１２３】
[000188]ルシフェラーゼレポーターアッセイ
[000189]ルシフェラーゼレポーター実験のため、２３７ｂｐのＩＧＳＦ４ ３’ＵＴＲセグメントを、ヒトｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、そしてルシフェラーゼの停止コドンからすぐ下流のＸｂａＩ部位を用いることによって、ＳＶ４０プロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含むｐＧＬ３−対照ベクター内に挿入した。マイクロアレイ実験に関する詳細を、実施例ＩＩに記載する。実験を３つ組で行った。
【０１２４】
[000190]実施例ＩＩ
[000191]マイクロアレイハイブリダイゼーション
[000192]各々３つ組である、ｐＲＳ−１５／１６およびｐＲＳ−ＥベクターでトランスフェクションしたＭＥＧ０１細胞株から得た２つの試料、ならびに１６のＣＬＬ試料を、マイクロアレイによって分析した。オハイオ州立大学マイクロアレイ施設で実験を行った。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることによって、抽出ＲＮＡの量を定量化し、そしてＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることによって、ＲＮＡの性質を評価した。総ＲＮＡ（１．２μｇ）を用いて、Ｅｎｚｏ ＢｉｏＡｒｒａｙ ＨｉｇｈＹｉｅｌｄ ＲＮＡ転写物標識キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって、ビオチン標識ｃＲＮＡを生じた。断片化後、ヒトゲノムＵ１３３Ａ Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）上でのハイブリダイゼーションに標識ｃＲＮＡを用いた。ハイブリダイゼーション、洗浄、および染色を、製造者の指示にしたがって行った。ハイブリダイゼーションしたアレイをＧｅｎｅｃｈｉｐ ７Ｇでスキャンした。
【０１２５】
[000193]マイクロアレイデータ分析
[000194]ＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナによって生成されたＣＥＬファイルをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に取り込んだ。ＧＣ頑強マルチアレイ平均（ＧＣ Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉａｒｒａｙ Ａｖｅｒａｇｅ）（ＧＣＲＭＡ）法、その後、データ変換を用いることによって、生データを標準化し、負の値を０．０１にセットした。次いで、各測定値を試料中のすべての測定の５０パーセンタイルで割り、そして各遺伝子をすべての試料中の測定中央値によって割った。ｍｉＲ−１５／１６トランスフェクション後のＭＥＧ０１において、そして２つのＣＬＬ群の中で示差的に発現される遺伝子は、比較する群の幾何平均発現の間で２倍の相違、ならびにＡＮＯＶＡ、その後、偽陽性減少のためのＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｅｃｈｂｅｒｇ修正を適用すると、統計的に有意なＰ値（＜０．０５）を有するとして選択された。類似性の尺度として標準的な相関を用いて、試料のクラスター分析のため、示差的に発現される遺伝子を用いた。推定上のｍｉＲ−１５／１６ターゲットのリストを、遺伝子記号を用いて、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ中に取り込み、そしてベン図ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇツールを用いることによって、目的のリストとの交差を行った。統計的に濃縮されたＧＯカテゴリーを見出すため、Ｐ＜０．０５を用いて、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェアで、示差的に発現される遺伝子に対する遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を行った。
【０１２６】
[000195]アデニル酸ウリジル酸リッチ要素（ＡＲＥ）含有遺伝子の同定
[000196]ｐＲＳ１５／１６でトランスフェクションした後、ＥＳＴオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析によって同定されたすべての調節解除された（上方および下方制御された）遺伝子を、ヒトゲノムにコンピュータ・マッピングされた＞４，０００ ＡＲＥ−ｍＲＮＡを含有するＡＲＥ−ｍＲＮＡデータベースバージョン３．０（ＡＲＥＤ； ｒｃ．ｋｆｓｈｒｃ．ｅｄｕ．ｓａ／ａｒｅｄ／）を用いることによって、３’−ＵＴＲ中のＡＲＥの存在に関して精査した。ｐＲＳ−ＥでトランスフェクションしたＭＥＧ−０１細胞に対して、ｐＲＳ１５／１６でトランスフェクションしたものにおいて、上方制御された遺伝子群に比較して、下方制御された群で、より多くのＡＲＥ含有ｍＲＮＡが存在する可能性を、χ^２検定で計算した（α＝０．０５）。
【０１２７】
[000197]二次元ＰＡＧＥ、ならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＭＳによるタンパク質同定
[000198]製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって、ＥＧ−０１細胞を１μｇ／ｍｌ（最終濃度）のｐＲＳ−１５／１６またはｐＲＳ−Ｅベクターで一過性にトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、７ｍｏｌ／リットルの尿素、２ｍｏｌ／リットルのトリオ尿素（ｔｒｉｏｕｒｅａ）、４％ＣＨＡＰＳ、２ｍｍｏｌ／リットルのトリブチルホスフィン、および０．２％ＢｉｏＬｙｔｅ ３／１０両性電解質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含有する試料緩衝液中で細胞を溶解した。未精製細胞ホモジネートを超音波処理し、そして１０，０００ｘで１０分間遠心分離した。ｐＨ範囲３〜１０の固定ｐＨ勾配ストリップ（１１ｃｍ）を、２００μｇの総タンパク質を含有する試料緩衝液中で、一晩、水和させた。Ｐｒｏｔｅａｎ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた等電点電気泳動後、タンパク質を、２００Ｖで１時間の８〜１６％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、第二次元で分離した。すべてのゲルを３回泳動し、コロイド性クーマシーブルー（Ｐｉｅｒｃｅ）で染色し、そしてＶｅｒｓａｄｏｃ ３０００画像系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でスキャンした。８００ＧＳスキャナ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でゲル画像を捕捉し、そしてゲル画像各々における総タンパク質密度により、ＰＤＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いることによって分析した。ゲル上の総タンパク質に関して標準化した後、タンパク質スポットを定量化した。統計分析のため、３つ組の平均結果を計算し、そして生じた値を統計分析における独立のデータポイントとして用いた（スチューデントのｔ検定）。
【０１２８】
[000199]オハイオ州立大学Ｄａｖｉｓ Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙでＭＳを行った。本発明者らは、すべての匹敵するゲルにおいて、少なくとも４倍一貫して減少するかまたは誘導されるスポット由来のタンパク質のみを同定するよう試みた。ＷｉｎＰＲＥＰ Ｍｉｌｔｉｐｒｏｂｅ ＩＩソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に含まれるプロトコルにしたがって、自動化ゲル内タンパク質消化のため、タンパク質スポットをＭａｓｓＰｒｅｐステーション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にトランスファーした。簡潔には、ゲル片を脱染色し、そして次いでＤＴＴで還元した。ヨードアセトアミドとインキュベーションした後、ゲルを洗浄し、そしてアセトニトリルで脱水した。５０ｍｍｏｌ／リットルの重炭酸アンモニウム中、６μｇ／ｍｌのトリプシンを用いて、抽出タンパク質のゲル内消化を実行した。１％ギ酸／２％アセトニトリルの混合物を用いて、消化されたペプチドを抽出し、そしてステンレススチールＭＡＬＤＩプレート（Ｗａｔｅｒｓ）上に適用した。生じたペプチドのＭＳをリフレクトロン・モードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光計（Ｗａｔｅｒｓ）上に記録した。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎデータベース（ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を検索することによって、ＰｒｏＦｏｕｎｄ（ｐｒｏｗｌ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｐｒｏｆｏｕｎｄ＿ｂｉｎ／ＷｅｂＰｒｏＦｏｕｎｄ．ｅｘｅ？Ｆｏｒｍ＝ｌ／）を用いて、生じたペプチドを対応するタンパク質とマッチングさせた。
【０１２９】
[000200]ルシフェラーゼレポーターアッセイ
[000201]ルシフェラーゼレポーター実験のため、２３７ｂｐのＩＧＳＦ４ ３’ＵＴＲセグメントを、ヒトｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、そしてルシフェラーゼの停止コドンのすぐ下流のＸｂａＩ部位を用いて、ＳＶ４０プロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含むｐＧＬ３−対照ベクター内に挿入した。以下のプライマーセットを用いて、特異的断片を生成した：
[000202]ＩＧＳＦ４−ＵＴＲ Ｆｗ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣ−３’［配列番号１］、および
[000203]ＩＧＳＦ４−ＵＴＲ Ｒｖ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡ−３’［配列番号２］。
【０１３０】
[000204]下線のヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ制限部位に相当する。製造者のプロトコルにしたがって、０．４μｇのホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼレポートベクター、および０．０８μｇのレニラ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼを含有する対照ベクターｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって、ＭＥＧ−０１細胞を１２ウェルプレート中で同時トランスフェクションした。各ウェルに関して、１μｇ／ｍｌ（最終濃度）のｐＲＳ１５／１６またはｐＲＳ−Ｅベクターを用いた。トランスフェクション２４時間後、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることによって、ホタルおよびレニラ属ルシフェラーゼ活性を連続して測定した。３つ組で実験を行った。
【０１３１】
[000205]使用例およびその定義
[000206]本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の技術範囲内の薬理学、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の慣用的方法を使用するであろう。こうした技術は、文献に完全に説明される。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ監修， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）； Ａ．Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， 現行版）； Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版， １９８９）； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ． ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ． Ｋａｐｌａｎ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）を参照されたい。
【０１３２】
[000207]こうしたものとして、本明細書の定義は、さらなる説明のために提供され、そして限定と見なされないものとする。
[000208]冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、１つまたは１より多い（すなわち少なくとも１つの）その冠詞の文法的対象を指す。例えば、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１より多い要素を意味する。
【０１３３】
[000209]「マーカー」および「バイオマーカー」は、遺伝子および／またはタンパク質および／またはその機能的変異体であって、正常のまたは健康な組織または細胞における発現レベルから改変された組織または細胞中の発現レベルが、障害および／または疾患状態と関連している、前記遺伝子および／またはタンパク質および／またはその機能的変異体である。
【０１３４】
[000210]マーカー発現の「正常」レベルは、障害および／または疾患状態に罹患していないヒト被験体または患者の細胞におけるマーカーの発現レベルである。
[000211]マーカーの「過剰発現」または「発現の有意により高いレベル」は、発現を評価するのに使用されるアッセイの標準誤差より大きい試験試料中の発現レベルを指し、そして特定の態様において、対照試料（例えばマーカーに関連する障害および／または疾患状態を持たない健康な被験体由来の試料）中のマーカーの発現レベル、そして特定の態様において、いくつかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルの少なくとも２倍、そして他の態様において、３倍、４倍、５倍または１０倍である。
【０１３５】
[000212]マーカーの「発現の有意により低いレベル」は、対照試料（例えばマーカーに関連する障害および／または疾患状態を持たない健康な被験体由来の試料）中のマーカーの発現レベル、そして特定の態様において、いくつかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルの少なくとも２倍、そして特定の態様において、３倍、４倍、５倍または１０倍低い試験試料中の発現レベルを指す。
【０１３６】
[000213]キットは、マーカーの発現を特異的に検出するための少なくとも１つの試薬、例えばプローブを含む、任意の製品（例えばパッケージまたは容器）である。キットを、本発明の方法を実行するための単位として、販売促進し、流通させ、または販売してもよい。
【０１３７】
[000214]「タンパク質」は、マーカータンパク質およびその断片；変異体マーカータンパク質およびその断片；マーカーまたは変異体マーカータンパク質の少なくとも１５のアミノ酸セグメントを含むペプチドおよびポリペプチド；ならびにマーカーまたは変異体マーカータンパク質、あるいはマーカーまたは変異体マーカータンパク質の少なくとも１５のアミノ酸セグメントを含む融合タンパク質を含む。
【０１３８】
[000215]本明細書記載の組成物、キットおよび方法は、以下の限定されない使用、とりわけ：
被験体が障害および／または疾患状態に罹患しているかどうかの評価；
被験体における障害および／または疾患状態の病期の評価；
被験体における障害および／または疾患状態の悪性度の評価；
被験体における障害および／または疾患状態の性質の評価；
被験体において障害および／または疾患状態を発展させる潜在的可能性の評価；
被験体における障害および／または疾患状態と関連する細胞の組織学的タイプの評価；
被験体における障害および／または疾患状態を治療するのに有用な、抗体、抗体断片、または抗体誘導体の作製；
被験体の細胞における障害および／または疾患状態の存在の評価；
被験体における障害および／または疾患状態を阻害するための１以上の試験化合物の有効性の評価；
被験体における障害および／または疾患状態を阻害するための療法の有効性の評価；
被験体における障害および／または疾患状態の進行の監視；
被験体における障害および／または疾患状態を阻害するための組成物または療法の選択；
障害および／または疾患状態に罹患した被験体の治療；
被験体における障害および／または疾患状態の阻害；
試験化合物の潜在的有害性の評価；ならびに
リスクがある被験体における障害および／または疾患状態の開始の予防
を有する。
【０１３９】
[000216]スクリーニング法
[000217]動物モデルを生成して、被験体における障害および／または疾患状態を治療するかまたは予防するのに有用な療法剤のスクリーニングを可能にしてもよい。したがって、方法は、被験体において、障害および／または疾患状態を治療するかまたは予防するための療法剤を同定するのに有用である。方法は、本明細書記載の方法によって作製された動物モデルに候補剤を投与し、そして候補剤を投与していない対照動物モデルに比較した際の、動物モデルにおける少なくとも１つの反応を評価する工程を含む。少なくとも１つの反応の症状が減少しているか、またはその開始が遅延している場合、候補剤は、疾患を治療するかまたは予防するための剤である。
【０１４０】
[000218]候補剤は、当該技術分野にすでに知られている薬理学的剤であってもよいし、またはいかなる薬理学的活性を有することも以前は知られていなかった剤であってもよい。剤は、天然に生じてもよいし、または実験室で設計されてもよい。剤を微生物、動物または植物から単離してもよいし、あるいは組換え的に産生してもよいし、あるいは任意の適切な化学的方法によって合成してもよい。剤は、小分子、核酸、タンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣体であってもよい。特定の態様において、候補剤は、５０ダルトンより大きく、そして約２，５００ダルトン未満の分子量を有する、小有機化合物である。候補剤は、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基を含む。候補剤はまた、限定されるわけではないが：ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体またはその組み合わせを含む生体分子の中にも見出される。
【０１４１】
[000219]候補剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む非常に多様な供給源から得られる。例えば、非常に多様な有機化合物および生体分子のランダムおよび有向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成のために利用可能な多くの手段があり、これには、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現が含まれる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形の天然化合物ライブラリーが入手可能であるか、または容易に産生される。さらに、天然のまたは合成的に産生されるライブラリーおよび化合物は、慣用的な化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾され、そしてこれを用いてコンビナトリアルライブラリーを産生することも可能である。特定の態様において、コンビナトリアルライブラリー法の技術分野における多くのアプローチのいずれを用いて候補剤を得てもよく、限定されない例として：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィ選択を用いる合成ライブラリー法が含まれる。
【０１４２】
[000220]特定のさらなる態様において、特定の薬理学的剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等の、有向またランダム化学修飾に供して、構造的類似体を産生してもよい。
【０１４３】
[000221]また、被験体における障害および／または疾患状態を治療するための療法剤を同定するのと同じ方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究から生じたリード化合物／剤を検証してもよい。
【０１４４】
[000222]候補剤は、被験体反応経路において、１以上の障害および／または疾患状態を上方制御するかまたは下方制御する剤であってもよい。特定の態様において、候補剤は、こうした経路に影響を及ぼすアンタゴニストであってもよい。
【０１４５】
[000223]障害および／または疾患状態を治療するための方法
[000224]本明細書において、障害および／または疾患状態反応を治療するか、阻害するか、軽減させるかまたは逆転させるための方法を提供する。本明細書記載の方法において、シグナル伝達カスケードに干渉する剤を、限定されるわけではないが、こうした合併症がまだ明らかでない被験体、および少なくとも１つのこうした反応をすでに有する被験体などの、必要がある個体に投与する。
【０１４６】
[000225]前者の場合、こうした治療は、こうした反応の発生を予防し、そして／またはそれらが起こる度合いを減少させるのに有用である。後者の場合、こうした治療は、こうした反応が起こる度合いを減少させるか、反応のさらなる発展を予防するか、または反応を逆転させるのに有用である。
【０１４７】
[000226]特定の態様において、反応カスケードに干渉する剤は、こうした反応に特異的な抗体であってもよい。
[000227]バイオマーカー（単数または複数）の発現
[000228]マーカーの発現を多くの方式で阻害してもよく、限定されるわけではないが、例えば、マーカー（単数または複数）の転写、翻訳、または両方を阻害するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを疾患細胞に提供してもよい。あるいは、タンパク質の機能または活性を阻害するであろう細胞内抗体を生成するために、マーカータンパク質に特異的に結合し、そして適切なプロモーター／制御因子領域に機能可能であるように連結された、抗体、抗体誘導体、または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを、細胞に提供してもよい。また、マーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体または抗体断片で疾患細胞を治療することによって、マーカーの発現および／または機能を阻害してもよい。本明細書記載の方法を用いて、マーカーの発現を阻害するか、またはマーカータンパク質の機能を阻害する分子を同定するため、多様な分子、特に細胞膜を横断可能なほど十分に小さい分子を含む分子をスクリーニングしてもよい。被験体の疾患細胞を阻害するために、こうして同定された化合物を被験体に提供してもよい。
【０１４８】
[000229]任意のマーカーまたはマーカーの組み合わせ、ならびにマーカーと組み合わせた任意の特定のマーカーを、本明細書に記載する組成物、キットおよび方法で用いてもよい。一般的に、疾患細胞中のマーカーの発現レベルおよび正常結腸系細胞における同じマーカーの発現レベルの間の相違が可能な限り大きいマーカーを使用することが望ましい。この相違は、マーカーの発現を評価するための方法の検出限界と同程度に小さくてもよいが、少なくとも、評価法の標準誤差より大きいことが望ましく、そして特定の態様において、正常組織中の同じマーカーの発現レベルより、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、１００、５００、１０００倍またはそれより大きい相違が望ましい。
【０１４９】
[000230]特定のマーカータンパク質は、細胞を取り巻く細胞外空間に分泌されることが認識されている。組織生検試料よりもヒト被験体からより容易に収集されうる体液試料中で、こうしたマーカータンパク質が検出可能であるという事実から、これらのマーカーを組成物、キットおよび方法の特定の態様で用いる。さらに、マーカータンパク質の検出のためのｉｎ ｖｉｖｏ技術には、該タンパク質に対して向けられる標識抗体を被験体内に導入する工程が含まれる。例えば、被験体における存在および位置を標準的画像技術によって検出可能である放射性マーカーで、抗体を標識してもよい。
【０１５０】
[000231]任意の特定のマーカータンパク質が分泌タンパク質であるかどうかを決定するため、マーカータンパク質を、例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞株で発現し、細胞外液を収集し、そして細胞外液中のタンパク質の存在または非存在を評価する（例えばタンパク質に特異的に結合する標識抗体を用いる）。
【０１５１】
[000232]こうした細胞を含有する被験体試料を本明細書記載の方法で用いてもよいことが認識されるであろう。これらの態様において、試料中のマーカーの量（例えば絶対量または濃度）を評価することによって、マーカーの発現レベルを評価してもよい。細胞試料は、もちろん、試料中のマーカー量を評価する前に、多様な収集後調製および保存技術（例えば核酸および／またはタンパク質抽出、固定、保存、凍結、限外ろ過、濃度、蒸発、遠心分離等）に供してもよい。
【０１５２】
[000233]マーカーが細胞から、例えば呼吸器系、消化器系、血流および／または間質空間内に脱落してもよいこともまた認識されるであろう。脱落したマーカーを、例えば、痰、ＢＡＬ、血清、血漿、尿、糞便等を調べることによって、試験してもよい。
【０１５３】
[000234]組成物、キットおよび方法を用いて、発現される細胞表面上にディスプレイされる少なくとも１つの部分を有するマーカータンパク質の発現を検出してもよい。例えば、免疫学的方法を用いて、細胞全体の上のこうしたタンパク質を検出してもよいし、またはコンピュータに基づく配列分析法を用いて、少なくとも１つの細胞外ドメインの存在を予測してもよい（すなわち、分泌タンパク質および少なくとも１つの細胞表面ドメインを有するタンパク質の両方を含む）。必ずしも細胞を溶解することなく（例えばタンパク質の細胞表面ドメインと特異的に結合する標識抗体を用いて）、発現される細胞の表面上にディスプレイされる少なくとも１つの部分を有するマーカータンパク質の発現を検出することも可能である。
【０１５４】
[000235]転写された核酸またはタンパク質の発現を検出するための非常に多様な方法のいずれによって、マーカー発現を評価してもよい。こうした方法の限定されない例には、分泌、細胞表面、細胞質または核タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法および核酸増幅法が含まれる。
【０１５５】
[000236]特定の態様において、通常の翻訳後修飾のすべてまたは一部を経たマーカータンパク質を含むマーカータンパク質またはその断片と特異的に結合する、抗体（例えば放射標識、発色団標識、蛍光体標識または酵素標識抗体）、抗体誘導体（例えば基質と、あるいはタンパク質−リガンド対のタンパク質またはリガンドとコンジュゲート化された抗体）、または抗体断片（例えば一本鎖抗体、単離抗体超可変ドメインなど）を用いて、マーカーの発現を評価する。
【０１５６】
[000237]別の特定の態様において、被験体試料中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち転写されたポリヌクレオチド）を調製することによって、そしてマーカー核酸の相補体またはその断片である参照ポリヌクレオチドとｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをハイブリダイズさせることによって、マーカーの発現を評価する。場合によって、参照ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション前に、多様なポリメラーゼ連鎖反応法のいずれかを用いて、ｃＤＮＡを増幅させてもよく；好ましくは増幅されない。定量的ＰＣＲを用いて、１以上のマーカーの発現を同様に検出して、マーカー（単数または複数）の発現レベルを評価してもよい。あるいは、マーカーの突然変異または変異体（例えば一塩基多型、欠失等）を検出する多くの方法のいずれを用いて、被験体におけるマーカーの存在を検出してもよい。
【０１５７】
[000238]関連する態様において、試料から得られる転写ポリヌクレオチドの混合物を、マーカー核酸の少なくとも部分（例えば、少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、５００、またはそれより多いヌクレオチド残基）と相補的なまたは相同なポリヌクレオチドが固定された支持体と接触させる。相補的なまたは相同なポリヌクレオチドが、支持体上で示差的に検出可能であれば（例えば、異なる発色団または蛍光体を用いて検出可能であるか、あるいは選択された異なる位置に固定されている）、単一の支持体（例えば選択された位置で固定されたポリヌクレオチドの「遺伝子チップ」マイクロアレイ）を用いて、複数のマーカーの発現レベルを同時に評価することも可能である。１つの核酸と別の核酸のハイブリダイゼーションを伴うマーカー発現を評価する方法を用いる場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションを行うことが望ましい。
【０１５８】
[000239]特定の態様において、質量分析または表面プラスモン共鳴を用いて、バイオマーカーアッセイを行ってもよい。多様な態様において、被験体における障害および／または疾患状態に対して活性である剤を同定する方法には：ａ）１以上のマーカーまたはその誘導体を含有する細胞の試料を提供する工程；ｂ）こうした細胞から抽出物を調製する工程；ｃ）抽出物を、マーカー結合部位を含有する標識核酸プローブと混合する工程；およびｄ）試験剤の存在下または非存在下で、マーカーおよび核酸プローブ間の複合体の形成を決定する工程の１以上が含まれてもよい。決定工程には、前記抽出物／核酸プローブ混合物を、電気泳動移動度シフトアッセイに供する工程が含まれてもよい。
【０１５９】
[000240]特定の態様において、決定工程は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光に基づくアッセイおよび超ハイスループットアッセイ、例えば表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）または蛍光相関分光法（ＦＣＳ）アッセイから選択されるアッセイを含む。こうした態様において、ＳＰＲは、金属誘電体表面でわずかな屈折率の変化に感受性であるため、ＳＰＲセンサーは、生体分子相互作用の直接リアルタイム観察に有用である。ＳＰＲは、およそ２００ｎｍのＳＰＲセンサー／試料界面内で、１０^５〜１０^−６の屈折率（ＲＩ）単位の変化に感受性である、表面技術である。したがって、ＳＰＲ分光法は、センシング層に沈着する薄い有機フィルムの増殖を監視するのに有用である。
【０１６０】
[000241]組成物、キット、および方法は、１以上のマーカーの発現レベルの相違の検出に頼るため、マーカーの発現レベルが、正常細胞および結腸癌罹患細胞の少なくとも１つにおいて、発現を評価するのに用いる方法の最小検出限界より有意により大きいことが望ましい。
【０１６１】
[000242]１以上のマーカーを用いた、さらなる被験体試料のルーチンのスクリーニングによって、特定のマーカーが、被験体において、特定の障害および／または疾患状態を含む、多様なタイプの細胞において過剰発現されることが認識されるであろうことが理解される。
【０１６２】
[000243]さらに、より多くの被験体試料を、マーカーの発現に関して評価し、そして試料を得た個々の被験体の転帰を相関させるにつれて、特定のマーカーの改変された発現が、被験体における障害および／または疾患状態に強く相関し、そして他のマーカーの改変された発現が、他の疾患と強く相関することもまた確認されるであろう。したがって、組成物、キット、および方法は、被験体における障害および／または疾患状態の病期、悪性度、組織学的タイプ、および性質の１以上を特徴付けるのに有用である。
【０１６３】
[000244]被験体における障害および／または疾患状態の病期、悪性度、組織学的タイプ、および性質の１以上を特徴付けるために組成物、キットおよび方法を用いる場合、対応する病期、悪性度、組織学的タイプ、または性質の障害および／または疾患状態に罹患した被験体の少なくとも約２０％で、そして特定の態様において、少なくとも約４０％、６０％、または８０％で、そして実質的にすべてで、陽性結果が得られるように、マーカーまたは一団のマーカーを選択することが望ましい。約１０％より大きい陽性の予測値が一般集団で得られるように、本発明のマーカーまたは一団のマーカーを選択してもよい（限定されない例において、８０％を越えるアッセイ特異性と組み合わされる）。
【０１６４】
[000245]複数のマーカーを、組成物、キットおよび方法で用いる場合、被験体試料中の各マーカーの発現レベルを、単一反応混合物（すなわち各マーカーに関する異なる蛍光プローブなどの試薬を用いて）または１以上のマーカーに対応する個々の反応混合物中のいずれかで、同じ種類の非障害および／または非疾患試料中の複数のマーカー各々の発現の正常レベルと比較してもよい。１つの態様において、対応する正常レベルと比較した、試料中の複数のマーカーの１より多くの発現レベルが有意に増加していると、被験体が障害および／または疾患状態に罹患している指標となる。複数のマーカーを用いる場合、２、３、４、５、８、１０、１２、１５、２０、３０、または５０またはそれより多い個々のマーカーを用いてもよく；特定の態様において、より少ないマーカーの使用が望ましい可能性もある。
【０１６５】
[000246]組成物、キット、および方法の感受性を最大にするため（すなわち被験体細胞中の系起源の細胞に起因しうる干渉による）、そこで用いるマーカーが、限定された組織分布を有する、例えば非系組織で通常は発現されないことが望ましい。
【０１６６】
[000247]組成物、キットおよび方法が、被験体において障害および／または疾患状態を発展させるリスクが増進している被験体、およびその医学的アドバイザーに特に有用であろうことが認識される。障害および／または疾患を発展させるリスクが増進していると認識される被験体には、例えば、こうした障害または疾患の家族歴を有する被験体が含まれる。
【０１６７】
[000248]正常ヒト系組織におけるマーカー発現レベルを多様な方式で評価してもよい。１つの態様において、正常であるように見える系細胞部分におけるマーカーの発現レベルを評価し、そして異常であると推測される系細胞部分における発現レベルと、この正常発現レベルを比較することによって、この正常発現レベルを評価する。あるいは、そして特に、本明細書に記載する方法のルーチンの実行の結果として、さらなる情報が入手可能になるにつれて、マーカーの正常発現に関する集団平均値を用いてもよい。他の態様において、マーカーの「正常」発現レベルは、非罹患被験体から、被験体における障害および／または疾患状態の開始が推測される前の被験体から得た被験体試料から、保存された被験体試料から得た被験体試料などの中のマーカーの発現を評価することによって、決定してもよい。
【０１６８】
[000249]本明細書において、試料（例えば保存された組織試料または被験体から得た試料）中の障害および／または疾患状態細胞の存在を評価するための組成物、キット、および方法も提供する。これらの組成物、キット、および方法は、必要な場合、組成物、キット、および方法を、被験体試料以外の試料で使用するために適応させることを除いて、上述のものと実質的に同じである。例えば、用いようとする試料がパラフィン包埋された保存ヒト組織試料である場合、試料中のマーカー発現のレベルを評価するのに用いる組成物、キット、または方法において、組成物中の化合物の比を調整することが必要でありうる。
【０１６９】
[000250]キットおよび試薬
[000251]キットは、疾患細胞の存在を評価するのに有用である（例えば被験体試料などの試料中）。キットは、複数の試薬を含み、その各々がマーカー核酸またはタンパク質と特異的に結合可能である。マーカータンパク質に結合するのに適した試薬には、抗体、抗体誘導体、抗体断片等が含まれる。マーカー核酸（例えばゲノムＤＮＡ、ＭＲＮＡ、スプライシングＭＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）に結合するのに適した試薬には、相補核酸が含まれる。例えば、核酸試薬には、支持体に固定されたオリゴヌクレオチド（標識または非標識）、支持体に結合していない標識オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー対、分子ビーコンプローブ等が含まれてもよい。
【０１７０】
[000252]キットは、場合によって、本明細書記載の方法を実行するのに有用なさらなる構成要素を含んでもよい。例えば、キットは、相補核酸がアニーリングするのに、または抗体に特異的に結合するタンパク質と抗体が結合するのに適した液体（例えばＳＳＣ緩衝液）、１以上の試料区画、方法の実行を記載する取扱説明資料、正常結腸系細胞の試料、結腸癌関連疾患細胞の試料等を含んでもよい。
【０１７１】
[000253]抗体を産生する方法
[000254]本明細書において、被験体が障害および／または疾患状態に罹患しているかどうかを評価するのに有用な抗体を産生する単離ハイブリドーマを作製する方法もまた提供する。この方法において、マーカータンパク質の全体またはセグメントを含むタンパク質またはペプチドを合成するかまたは単離する（例えば発現される細胞からの精製によって、あるいはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質またはペプチドをコードする核酸の転写または翻訳によって）。タンパク質またはペプチドを用いて、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、またはヒツジを、免疫する。場合によって（そして好ましくは）、脊椎動物を、該タンパク質またはペプチドで少なくともさらに１回免疫して、こうして脊椎動物が該タンパク質またはペプチドに頑強な免疫反応を示すようにしてもよい。多様な方法のいずれかを用いて、免疫した脊椎動物から脾臓細胞を単離し、そして不死化細胞株と融合させてハイブリドーマを形成する。次いで、この方式で形成されたハイブリドーマを、標準法を用いてスクリーニングして、マーカータンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体を産生する、１以上のハイブリドーマを同定する。この方法によって作製されるハイブリドーマおよびこうしたハイブリドーマを用いて作製される抗体もまた、本明細書に提供する。
【０１７２】
[000255]有効性を評価する方法
[000256]疾患細胞を阻害するための試験化合物の有効性を評価する方法もまた、本明細書に提供する。上述のように、マーカーの発現レベルの相違は、被験体細胞の異常な状態と相関する。特定のマーカーの発現レベルの変化は、おそらく、こうした細胞の異常な状態を生じるようであることが認識されるが、他のマーカーの発現レベルの変化が、これらの細胞の異常な状態を誘導し、維持し、そして促進することが同様に認識される。したがって、被験体において、障害および／または疾患状態を阻害する化合物は、１以上のマーカーの発現レベルを、そのマーカーの発現の正常レベル（すなわち正常細胞におけるマーカーの発現レベル）により近いレベルに変化させるであろう。
【０１７３】
[000257]本方法は、したがって、第一の細胞試料中にあり、そして試験化合物の存在下で維持されるマーカーの発現、および第二の結腸細胞試料中にあり、そして試験化合物の非存在下で維持されるマーカーの発現を比較する工程を含む。試験化合物の存在下で、マーカーの発現が有意に減少していると、試験化合物が関連疾患を阻害する指標となる。細胞試料は、例えば、被験体から得られる正常細胞の単一試料のアリコット、被験体から得られる正常細胞のプールした試料、正常細胞株の細胞、被験体から得られる関連疾患細胞の単一試料のアリコット、被験体から得られる関連疾患細胞のプールした試料、関連疾患細胞株の細胞等であってもよい。
【０１７４】
[000258]１つの態様において、試料は、被験体から得られる癌関連疾患細胞であり、そして被験体において癌関連疾患を最適に阻害するようである化合物を同定するために、多様な癌関連疾患を阻害するのに有効であると考えられる複数の化合物を試験する。
【０１７５】
[000259]本方法を同様に用いて、被験体における関連疾患を阻害するための療法の有効性を評価してもよい。本方法において、試料対（一方は療法に供し、他方は療法に供さない）中の１以上のマーカーの発現レベルを評価する。試験化合物の有効性を評価する方法と同様、療法がマーカー発現の有意により低いレベルを誘導する場合、療法は、癌関連疾患を阻害するのに有効である。上述のように、選択した被験体由来の試料を本方法で用いる場合、被験体において、癌関連疾患を阻害するのに有効である可能性が最も高い療法を選択するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで代替療法を評価してもよい。
【０１７６】
[000260]本明細書に記載するように、ヒト細胞の異常な状態は、マーカーの発現レベルの変化に相関する。試験化合物の有害な潜在能力を評価するための方法もまた提供する。この方法は、試験化合物の存在下および非存在下で、ヒト細胞の別個のアリコットを維持する工程を含む。各アリコット中のマーカーの発現を比較する。試験化合物の存在下で維持されるアリコット中のマーカーの発現レベルが有意により高い場合（試験化合物の非存在下で維持されるアリコットに比較して）、試験化合物が有害な潜在能力を所持する指標となる。適切なマーカーの発現レベルの増進または阻害の度合いを比較することによって、発現レベルが増進しているかまたは阻害されているマーカーの数を比較することによって、または両方を比較することによって、多様な試験化合物の相対的な有害な潜在能力を評価してもよい。以下のサブセクション中に、さらに詳細に、多様な側面を記載する。
【０１７７】
[000261]単離タンパク質および抗体
[000262]１つの側面は、単離マーカータンパク質およびその生物学的活性部分、ならびにマーカータンパク質またはその断片に対して向けられる抗体を作製するための免疫原として使用するのに適したポリペプチド断片に関する。１つの態様において、標準的タンパク質精製技術を用いた、適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から、天然マーカータンパク質を単離してもよい。別の態様において、組換えＤＮＡ技術によって、マーカータンパク質の全体またはセグメントを含むタンパク質またはペプチドを産生する。組換え発現の代替法として、標準的ペプチド合成技術を用いて、こうしたタンパク質またはペプチドを化学的に合成してもよい。
【０１７８】
[000263]「単離」または「精製」タンパク質またはその生物学的活性部分は、タンパク質が由来する細胞または組織供給源由来の細胞成分または他の混入タンパク質を実質的に含まず、あるいは化学的に合成した場合、化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まない。用語「細胞成分を実質的に含まない」には、タンパク質が単離されるかまたは組換え的に産生された細胞の細胞構成要素からタンパク質が分離されている、タンパク質調製物が含まれる。したがって、細胞成分を実質的に含まないタンパク質には、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量）の異種タンパク質（本明細書において、「混入タンパク質」とも称される）を有するタンパク質調製物が含まれる。
【０１７９】
[000264]タンパク質またはその生物学的活性部分を組換え的に産生する場合、該タンパク質は、好ましくは、培地を実質的に含まず、すなわち培地は、タンパク質調製物体積の約２０％、１０％、または５％未満に相当する。タンパク質を化学的合成によって産生する場合、タンパク質は、好ましくは、化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まず、すなわち、化学的前駆体またはタンパク質合成に関与する他の化学薬品から分離されている。したがって、タンパク質のこうした調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の目的のポリペプチド以外の化学的前駆体または化合物を有する。
【０１８０】
[000265]マーカータンパク質の生物学的活性部分には、マーカータンパク質のアミノ酸配列に十分に同一であるか、またはこうした配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれ、全長タンパク質より少ないアミノ酸を含み、そして対応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的には、生物学的活性部分は、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を持つドメインまたはモチーフを含む。マーカータンパク質の生物学的活性部分は、例えば、長さ１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸であるポリペプチドであってもよい。さらに、組換え技術によって、マーカータンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的活性部分を調製して、そしてマーカータンパク質の天然型の機能的活性の１以上に関して評価してもよい。特定の態様において、有用なタンパク質は、これらの配列の１つに実質的に同一（例えば少なくとも約４０％、そして特定の態様において、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％）であり、そして対応する天然存在マーカータンパク質の機能的活性を保持しながらも、天然アレル変動または突然変異誘発のため、アミノ酸配列が異なる。
【０１８１】
[000266]さらに、マーカータンパク質セグメントのライブラリーを用いて、変異体マーカータンパク質またはそのセグメントのスクリーニングおよびそれに続く選択のため、ポリペプチドの変化に富んだ集団を生成してもよい。
【０１８２】
[000267]予測医学
[000268]本明細書において、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および監視臨床試験を、予後（予測）目的のために用いて、それによって個体を予防的に治療する、予測医学の分野における、動物モデルおよびマーカーの使用も提供する。したがって、本明細書において、個体が特定の障害および／または疾患を発展させるリスクがあるかどうかを決定するため、１以上のマーカータンパク質または核酸の発現レベルを決定するための診断アッセイも提供する。こうしたアッセイを、予後または予測目的のために用いて、それによって、障害および／または疾患の開始前に個体を予防的に治療してもよい。
【０１８３】
[000269]別の側面において、同じ個体を少なくとも定期的にスクリーニングして、個体がその発現パターンを変化させる化学薬品または毒素に曝露されたかどうかを見る方法が有用である。
【０１８４】
[000270]さらに別の側面は、障害および／または疾患を阻害するか、あるいは任意の他の障害を治療するかまたは防止するために（例えばこうした治療が有しうるいかなる系の影響も理解するために）投与した剤（例えば薬剤または他の化合物）が、臨床試験においてマーカーの発現または活性に対して及ぼす影響を監視することに関する。
【０１８５】
[000271]薬学的組成物
[000272]化合物は、適切な薬学的キャリアー中の、局所、局部または全身投与するための配合物中にあってもよい。Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９７５）によるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１５版は、典型的なキャリアーおよび調製法を開示する。細胞をターゲティングするための生物分解性または非生物分解性ポリマーまたはタンパク質またはリポソームで形成された、適切な生物適合微小カプセル、微小粒子または微小球体中に、化合物を被包してもよい。こうした系は、当業者に周知であり、そして適切な核酸とともに使用するために最適化してもよい。
【０１８６】
[000273]核酸送達のための多様な方法が、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ニューヨーク；およびＡｕｓｕｂｅｌら， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨークに記載される。こうした核酸送達系は、例えば、そして限定ではなく、「裸の」核酸としての「裸の」型であるか、または送達に適したビヒクル中、例えば陽イオン性分子またはリポソーム形成脂質を含む複合体中で配合されるか、あるいはベクターの構成要素、または薬学的組成物の構成要素として、所望の核酸を含む。核酸送達系を細胞に、直接、例えば細胞と系を接触させることによって、または間接的に、例えば任意の生物学的プロセスの作用を通じて、提供してもよい。
【０１８７】
[000274]局所投与の配合物には、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、ドロップ、座薬、スプレー、液体および粉末が含まれてもよい。慣用的な薬学的キャリアー、水性、粉末または油性基剤、あるいは増粘剤を望ましいように用いてもよい。
【０１８８】
[000275]例えば、関節内（関節中）、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、および皮下経路による、非経口投与に適した配合物には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および意図されるレシピエントの血液と配合物を等張にする溶質を含有してもよい、水性および非水性の等調性無菌注射溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、分散剤、安定化剤、および保存剤を含んでもよい、水性および非水性無菌懸濁物、溶液またはエマルジョンが含まれる。注射用配合物を単位投薬型で、例えば保存剤を添加したアンプル中または多用量容器中で、提示してもよい。当業者は、過剰な実験に頼ることなく、組成物を調製しそして配合するための多様なパラメーターを容易に決定可能である。化合物を単独で、または他の適切な構成要素と組み合わせて用いてもよい。
【０１８９】
[000276]一般的に、核酸を含む化合物を投与する方法は、当該技術分野に周知である。特に、現在使用されている配合物を伴う、核酸療法のためにすでに使用されている投与経路は、投与の好ましい経路を提供し、そして選択される核酸の配合物は、もちろん、特定の配合物、治療される被験体の状態の重症度、および療法的有効性に必要な投薬量に応じるであろう。本明細書に一般的に用いられるように、「有効量」は、化合物を投与されていないマッチした被験体に比較した際、配合物を投与された被験体において、障害の１以上の症状を治療するか、障害の１以上の症状の進行を逆転させるか、障害の１以上の症状の進行を停止するか、または障害の１以上の症状の発生を防止することが可能な量である。化合物の実際の有効量は、利用する特定の化合物またはその組み合わせ、配合される特定の組成物、投与様式、および個体の年齢、体重、状態、ならびに治療中の症状または状態の重症度によって多様でありうる。
【０１９０】
[000277]一般の当業者に知られる任意の許容されうる方法を用いて、被験体に配合物を投与してもよい。投与は、治療する状態に応じて、局在化していても（すなわち、特定の領域、生理学的系、組織、臓器、または細胞種に）、または全身性でもよい。
【０１９１】
[000278]薬理ゲノミクス
[000279]マーカーはまた、薬理ゲノミクスマーカーとしても有用である。本明細書において、「薬理ゲノミクスマーカー」は、その発現レベルが被験体において特定の臨床薬剤反応または感受性と相関する、客観的な生化学的マーカーである。薬理ゲノミクスマーカー発現の存在または量は、特定の薬剤または薬剤クラスでの療法に対する、被験体の予期される反応、そしてより詳細には、被験体の腫瘍の反応に関連する。被験体における１以上の薬理ゲノミクスマーカーの発現の存在または量を評価することによって、被験体に最も適しているか、またはより大きい度合いの成功を有すると予測される薬剤療法を選択可能である。
【０１９２】
[000280]臨床試験の監視
[000281]マーカーの発現レベルに対する剤（例えば薬剤化合物）の影響の監視は、基本的薬剤スクリーニングにおいてだけでなく、臨床試験においても適用可能である。例えば、剤がマーカー発現に影響を及ぼす有効性を、結腸癌関連疾患のための治療を受けている被験体の臨床試験において監視してもよい。
【０１９３】
[000282]１つの限定されない態様において、本発明は、以下の工程を含む、剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬剤候補）での被験体の治療の有効性を監視するための方法を提供する：
[000283]剤の投与前に、被験体から投与前試料を得て；
[000284]投与前試料における１以上の選択されるマーカーの発現レベルを検出し；
[000285]被験体から１以上の投与後試料を得て；
[000286]投与後試料におけるマーカー（単数または複数）の発現レベルを検出し；
[000287]単数または複数の投与後試料におけるマーカー（単数または複数）の発現レベルと、投与前試料におけるマーカー（単数または複数）の発現レベルを比較し；そして
[000288]被験体への剤の投与を適宜、改変する
工程。
【０１９４】
[000289]例えば、治療経過中のマーカー遺伝子（単数または複数）の発現が増加していれば、投薬量が無効であり、そして投薬量を増加させることが望ましいことが示されうる。逆に、マーカー遺伝子（単数または複数）の発現が減少していれば、治療が有効であり、そして投薬量を変化させる必要がないことが示されうる。
【０１９５】
[000290]電子装置読み取り可能媒体、系、アレイ、およびこれらを用いる方法
[000291]本明細書において、「電子装置読み取り可能媒体」は、電子装置によって直接読み取り、そしてアクセスすることも可能である、データまたは情報を記憶するか、保持するかまたは含有する、任意の適切な媒体を指す。こうした媒体には、限定されるわけではないが：磁気記憶媒体、例えばフロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ；光学記憶媒体、例えばコンパクトディスク；電子記憶媒体、例えばＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ等；ならびに一般的なハードディスクおよび磁気／光学記憶媒体などのこれらのカテゴリーのハイブリッドが含まれうる。本明細書に記載するようなマーカーを記録するように、媒体を適応させ、または構成してもよい。
【０１９６】
[000292]本明細書において、用語「電子装置」は、任意の適切な計算またはプロセシング装置、あるいはデータまたは情報を記憶するよう構成されるかまたは適応された他のデバイスを含むよう意図される。本発明で使用するのに適した電子装置の例には、独立型計算装置；ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）インターネット、イントラネット、およびエクストラネットを含むネットワーク；携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯電話、ポケットベル等などの電子アプライアンス；ならびに局所および分布したプロセシング系が含まれる。
【０１９７】
[000293]本明細書において、「記録」は、電子装置読み取り可能媒体上に情報を記憶させるかまたはコード化するためのプロセスを指す。当業者は、媒体上に情報を記録するための任意の方法を容易に採用して、本明細書に記載するマーカーを含む資料を生成することも可能である。
【０１９８】
[000294]多様なソフトウェアプログラムおよびフォーマットを用いて、本発明のマーカー情報を電子装置読み取り可能媒体上に記憶させてもよい。マーカーを記録した媒体を得るかまたは生成するために、任意の数のデータプロセッサ構造フォーマット（例えばテキストファイルまたはデータベース）を使用してもよい。マーカーを読み取り可能形式で提供することによって、多様な目的のため、ルーチンにマーカー配列情報にアクセス可能である。例えば、当業者は、読み取り可能形式にあるヌクレオチドまたはアミノ酸配列を用いて、ターゲット配列またはターゲット構造モチーフを、データ記憶手段内に記憶された配列情報と比較することも可能である。検索手段を用いて、特定のターゲット配列またはターゲットモチーフとマッチする配列の断片または領域を同定する。
【０１９９】
[000295]したがって、被験体が癌関連疾患または癌関連疾患の傾向を有するかどうかを決定するための方法であって、マーカーの存在または非存在を決定し、そしてマーカーの存在または非存在に基づいて、被験体が癌関連疾患または癌関連疾患の傾向を有するかどうかを決定し、そして／または癌関連疾患または前癌関連疾患状態のための特定の治療を推奨する工程を含む、前記方法を実行するための指示を保持するための媒体もまた提供する。
【０２００】
[000296]本明細書において、電子系および／またはネットワークにおいて、被験体がマーカーと関連した癌関連疾患または癌関連疾患の傾向を有するかどうかを決定するための方法であって、マーカーの存在または非存在を決定し、そしてマーカーの存在または非存在に基づいて、被験体が特定の障害および／または疾患あるいはこうした障害および／または疾患の傾向を有するかどうかを決定し、そして／またはこうした疾患または障害および／またはこうした前癌関連疾患状態のための特定の治療を推奨する工程を含む、前記方法もまた提供する。方法はさらに、被験体に関連する表現型情報を受け取り、そして／またはネットワークから被験体に関連する表現型情報を獲得する工程を含んでもよい。
【０２０１】
[000297]本明細書にやはり提供するのは、ネットワークにおいて、被験体が、マーカーに関連する障害および／または疾患、あるいは障害および／または疾患の傾向を有するかどうかを決定するための方法であって、マーカーに関連する情報を受け取り、被験体に関連する表現型情報を受け取り、マーカーおよび／または障害および／または疾患に対応する情報をネットワークから獲得し、そして表現型情報、マーカー、および獲得した情報の１以上に基づいて、被験体が障害および／または疾患あるいはその傾向を有するかどうかを決定する工程を含む、前記方法である。該方法は、障害および／または疾患あるいはその傾向のために特定の治療を推奨する工程をさらに含んでもよい。
【０２０２】
[000298]被験体が障害および／または疾患あるいはその傾向を有するかどうかを決定するためのビジネス方法であって、マーカーと関連する情報を受け取り、被験体に関連する表現型情報を受け取り、マーカーおよび／または障害および／または疾患に対応する情報をネットワークから獲得し、そして表現型情報、マーカー、および獲得した情報の１以上に基づいて、被験体が障害および／または疾患あるいはその傾向を有するかどうかを決定する工程を含む、前記方法もまた本明細書に提供する。該方法は、そのために特定の治療を推奨する工程をさらに含んでもよい。
【０２０３】
[000299]アレイ中の１以上の遺伝子の発現をアッセイするのに使用可能なアレイもまた本明細書に提供する。１つの態様において、アレイを用いて、組織における遺伝子発現をアッセイして、アレイ中の遺伝子の組織特異性を解明してもよい。この方式で、最大約７０００以上の遺伝子を、発現に関して同時にアッセイすることも可能である。これによって、１以上の組織中で特異的に発現される一連の遺伝子を示すプロファイルを発展させることが可能になる。
【０２０４】
[000300]こうした定性的決定に加えて、本明細書において、遺伝子発現の定量化を提供する。したがって、組織特異性だけでなく、組織中の一連の遺伝子の発現レベルが解明可能である。したがって、それ自体の組織発現およびその組織における発現レベルに基づいて、遺伝子をグループ分け可能である。これは、例えば、組織間または組織中の遺伝子発現の関連を解明する際に有用である。したがって、１つの組織を攪乱し、そして第二の組織中の遺伝子発現に対する影響を決定してもよい。これに関連して、生物学的刺激に反応した、別の細胞種に対する１つの細胞種の影響を決定可能である。
【０２０５】
[000301]こうした決定は例えば、遺伝子発現のレベルでの細胞−細胞相互作用の影響を知るのに有用である。１つの細胞種を治療するために剤を療法的に投与するが、別の細胞種に対して望ましくない影響がある場合、該方法は、望ましくない影響の分子的基礎を決定するアッセイを提供し、そしてしたがって、相殺する剤を同時投与するかまたは別の方式で望ましくない影響を治療する機会を提供する。同様に、単一細胞種内であっても、望ましくない生物学的影響を分子レベルで決定可能である。したがって、ターゲット遺伝子以外の発現に対する剤の影響を解明しそして相殺することも可能である。
【０２０６】
[000302]別の態様において、アレイを用いて、アレイ中の１以上の遺伝子の発現の時間経過を監視してもよい。これは、本明細書に開示するように、多様な生物学的背景、例えば障害および／または疾患の発展、その進行、ならびにプロセス、例えばそれに関連する細胞性トランスフォーメーションで起こりうる。
【０２０７】
[000303]アレイはまた、同じ細胞または異なる細胞において、遺伝子の発現または他の遺伝子の発現の影響を解明するためにも有用である。これは、例えば、最終的なまたは下流のターゲットが制御不能である場合、療法的介入のための代替分子ターゲットの選択を提供する。
【０２０８】
[000304]アレイはまた、正常細胞および異常な細胞における１以上の遺伝子の示差発現パターンを解明するのにも有用である。これは、診断または療法的介入のための分子ターゲットとして働きうる一連の遺伝子を提供する。
【０２０９】
[000305]代理マーカー
[000306]マーカーは、１以上の障害または疾患状態、あるいはそれにつながる状態のための代理マーカーとして働きうる。本明細書において、「代理マーカー」は、疾患または障害の非存在または存在と、あるいは疾患または障害の進行と相関する客観的生化学的マーカーである。こうしたマーカーの存在または量は、疾患とは独立である。したがって、これらのマーカーは、特定の治療経過が、疾患状態または障害を和らげるのに有効であるかどうかを示すように働きうる。代理マーカーは、疾患状態または障害の存在または度合いを、標準的な方法論を通じて評価するのが困難である場合、あるいは潜在的に危険な臨床的終点に達する前に、疾患進行を評価することが望ましい場合に、特に有用である。
【０２１０】
[000307]マーカーはまた、薬理ダイナミクスマーカーとしても有用である。本明細書において、「薬理ダイナミクスマーカー」は、薬剤効果と特異的に相関する客観的生化学的マーカーである。薬理ダイナミクスマーカーの存在または量は、薬剤が投与されている疾患状態または障害に関連せず；したがって、マーカーの存在または量は、被験体における薬剤の存在または活性の指標である。例えば、薬理ダイナミクスマーカーは、生物学的組織中の薬剤濃度の指標であってもよく、ここでマーカーは、薬剤レベルに関連して、その組織中で発現されるかまたは転写されるか、あるいは発現されないかまたは転写されないかいずれかである。この方式で、薬理ダイナミクスマーカーによって、薬剤の分布または取り込みを監視してもよい。同様に、薬理ダイナミクスマーカーの存在または量は、マーカーの存在または量が、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬剤の相対的分解速度の指標となるように、薬剤の代謝産物の存在または量に関連する可能性もある。
【０２１１】
[000308]薬理ダイナミクスマーカーは、薬剤効果の検出感度を増加させる際、特に、薬剤を低用量で投与する際に特に有用である。少量の薬剤であっても、多数周期のマーカー転写または発現を活性化するのに十分でありうるため、増幅されるマーカーは、薬剤自体よりもより容易に検出されうる量でありうる。また、マーカーは、マーカー自体の性質のため、より容易に検出されうる；例えば、本明細書記載の方法を用いて、タンパク質マーカーに関する免疫に基づく検出系で抗体を使用してもよいし、またはマーカー特異的放射標識プローブを用いて、ｍＲＮＡマーカーを検出してもよい。さらに、薬理ダイナミクスマーカーの使用は、ありうる直接観察の範囲を超えて、薬剤治療によるリスクの、機構に基づく予測を提供しうる。
【０２１２】
[000309]試験のためのプロトコル
[000310]障害および／または疾患に関する試験法は、例えば、長期に渡って、被験体由来の生物学的試料中の各マーカー遺伝子の発現レベルを測定し、そしてそのレベルを、対照生物学的試料中のマーカー遺伝子のものと比較する工程を含んでもよい。
【０２１３】
[000311]マーカー遺伝子が、本明細書記載の遺伝子の１つであり、そして発現レベルが示差的に発現されている場合（例えば対照のものよりより高いかまたはより低い）、被験体は障害および／または疾患に罹患していると判断される。マーカー遺伝子の発現レベルが、許容されうる範囲内にある場合、被験体がこれに罹患している可能性は低い。
【０２１４】
[000312]発現レベルを比較するために、対照におけるマーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって、対照に関する標準値をあらかじめ決定してもよい。例えば、対照中の上述のマーカー遺伝子の発現レベルに基づいて、標準値を決定してもよい。例えば、特定の態様において、許容されうる範囲は、標準値に基づいて、±２Ｓ．Ｄ．と解釈される。標準値を決定したら、被験体由来の生物学的試料中の発現レベルのみを測定し、そして対照に関して決定した標準値と値を比較することによって、試験法を実行してもよい。
【０２１５】
[000313]マーカー遺伝子の発現レベルには、ｍＲＮＡへのマーカー遺伝子の転写、およびタンパク質への翻訳が含まれる。したがって、マーカー遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現強度、またはマーカー遺伝子にコードされるタンパク質の発現レベルの比較に基づいて、障害および／または疾患に関して試験する１つの方法を行う。
【０２１６】
[000314]障害および／または疾患に関して試験する際のマーカー遺伝子の発現レベルの測定は、多様な遺伝子分析法にしたがって実行可能である。特に、例えば、これらの遺伝子にプローブとしてハイブリダイズする核酸を用いたハイブリダイゼーション技術、またはマーカー遺伝子にプライマーとしてハイブリダイズするＤＮＡを用いた遺伝子増幅技術を使用してもよい。
【０２１７】
[000315]マーカー遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて、試験に用いるプローブまたはプライマーを設計してもよい。それぞれのマーカー遺伝子のヌクレオチド配列に関する同定番号を本明細書に記載する。
【０２１８】
[000316]さらに、より高次の動物の遺伝子は、一般的に、高頻度で多型を伴うことが理解されるものとする。スプライシングプロセス中に、相互に異なるアミノ酸配列を含むアイソフォームを生じる多くの分子もまたある。マーカー遺伝子のものと類似の活性を有する、結腸癌関連疾患と関連する任意の遺伝子は、多型であるかまたはアイソフォームであるためにヌクレオチド配列相違を有する場合であってさえ、マーカー遺伝子中に含まれる。
【０２１９】
[000317]マーカー遺伝子には、ヒトに加えて他の種の相同体が含まれてもよいこともまた理解されるものとする。したがって、別に明記しない限り、表現「マーカー遺伝子」は、種にユニークなマーカー遺伝子の相同体、または個体に導入されている外来の（ｆｏｒｅｉｇｎ）マーカー遺伝子を指す。
【０２２０】
[000318]また、「マーカー遺伝子の相同体」は、ストリンジェントな条件下で、プローブとしてのヒトマーカー遺伝子にハイブリダイズ可能な、ヒト以外の種に由来する遺伝子を指す。こうしたストリンジェントな条件は当業者に知られ、当業者は、実験的または経験的に、適切な条件を選択して、同等のストリンジェンシーを生じることも可能である。
【０２２１】
[000319]マーカー遺伝子のヌクレオチド配列、またはマーカー遺伝子のヌクレオチド配列の相補鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを、プライマーまたはプローブとして用いてもよい。したがって、「相補鎖」は、他方の鎖に関して二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を意味し、そしてＡ：Ｔ（ＲＮＡではＵ）およびＧ：Ｃ塩基対で構成される。
【０２２２】
[000320]さらに、「相補的」は、少なくとも１５の連続ヌクレオチドの領域に完全に相補的なものだけでなく、特定の例では少なくとも４０％、特定の例では５０％、特定の例では６０％、特定の例では７０％、特定の例では８０％、特定の例では９０％、そして特定の例では９５％またはそれより高い、ヌクレオチド配列相同性を有するものも意味する。ヌクレオチド配列間の相同性の度合いを、アルゴリズム、ＢＬＡＳＴなどによって、決定してもよい。
【０２２３】
[000321]こうしたポリヌクレオチドは、マーカー遺伝子を検出するプローブとして、またはマーカー遺伝子を増幅するプライマーとして有用である。プライマーとして用いる場合、ポリヌクレオチドは、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、そして特定の態様において、ヌクレオチドの１５ｂｐ〜３５ｂｐである。プローブとして用いる場合、ＤＮＡは、マーカー遺伝子の全ヌクレオチド配列（またはその相補鎖）、または少なくとも１５ｂｐヌクレオチドを有する部分的配列を含む。プライマーとして用いる場合、３’領域は、マーカー遺伝子に相補的でなければならず、一方、５’領域は、制限酵素認識配列またはタグに連結されていてもよい。
【０２２４】
[000322]「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。これらのポリヌクレオチドは、合成または天然存在のいずれであってもよい。また、ハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いるＤＮＡは、通常標識されている。当業者は、こうした標識法を容易に理解する。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、比較的低い度合いの重合を伴うポリヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドに含まれる。
【０２２５】
[000323]例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、またはＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて、ハイブリダイゼーション技術を用いた障害および／または疾患に関する試験を行ってもよい。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ法などの遺伝子増幅技術を用いてもよい。ＲＴ−ＰＣＲにおける遺伝子増幅工程中に、ＰＣＲ増幅監視法を用いることによって、マーカー遺伝子発現のより定量的な分析を達成することも可能である。
【０２２６】
[000324]ＰＣＲ遺伝子増幅監視法において、検出ターゲット（ＤＮＡ、またはＲＮＡの逆転写物）を、蛍光色素、および蛍光を吸収する消光剤で標識されたプローブにハイブリダイズさせる。ＰＣＲが進行し、そしてＴａｑポリメラーゼが５’−３’エキソヌクレアーゼ活性でプローブを分解すると、蛍光色素および消光剤が互いに引き離され、そして蛍光が検出される。蛍光はリアルタイムで検出される。ターゲットのコピー数が知られている標準試料を同時に測定することによって、ＰＣＲ増幅が線形であるサイクル数で、被験体試料中のターゲットのコピー数を決定することが可能である。また、当業者は、ＰＣＲ増幅監視法が任意の適切な方法で実行可能であることを認識する。
【０２２７】
[000325]また、マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質を検出することによって、結腸癌関連疾患に関して試験する方法を実行してもよい。以下、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質を「マーカータンパク質」として記載する。こうした試験法に関して、各マーカータンパク質に結合する抗体を用いる、例えば、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、およびＥＬＩＳＡ法を使用してもよい。
【０２２８】
[000326]マーカータンパク質に結合する、検出で用いる抗体は、任意の適切な技術によって産生可能である。また、マーカータンパク質を検出するため、こうした抗体を適切に標識してもよい。あるいは、抗体を標識する代わりに、抗体に特異的に結合する物質、例えばプロテインＡまたはプロテインＧを標識して、マーカータンパク質を間接的に検出してもよい。より具体的には、こうした検出法には、ＥＬＩＳＡ法が含まれてもよい。
【０２２９】
[000327]例えば、マーカー遺伝子またはその一部を発現ベクター内に挿入し、構築物を適切な宿主細胞内に導入して、形質転換体を産生し、形質転換体を培養して、組換えタンパク質を発現させ、そして発現された組換えタンパク質を、培養または培養上清から精製する工程によって、抗原として用いるタンパク質または部分的ペプチドを得てもよい。あるいは、遺伝子にコードされるアミノ酸配列、または全長ｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列の一部を含むオリゴペプチドを化学的に合成して、免疫原として用いる。
【０２３０】
[000328]さらに、生物学的試料中のマーカー遺伝子の発現レベルだけでなく、マーカータンパク質の活性を、指標として用いて、結腸癌関連疾患に関する試験を行ってもよい。マーカータンパク質の活性は、タンパク質に生得的な生物学的活性を意味する。各タンパク質の活性を測定するため、多様な方法を用いてもよい。
【０２３１】
[000329]これらの疾患を示唆する症状があるにもかかわらず、ルーチンの試験では、被験体が障害および／または疾患に罹患しているとは診断されない場合であっても、本明細書記載の方法にしたがって試験を実行することによって、こうした被験体が障害および／または疾患に罹患しているかどうかを容易に決定可能である。
【０２３２】
[000330]より具体的には、特定の態様において、マーカー遺伝子が本明細書記載の遺伝子の１つである場合、症状が、障害および／または疾患に対する感受性を少なくとも示唆する被験体において、マーカー遺伝子の発現レベルの増加または減少は、症状がそれによって一次的に引き起こされている指標となる。
【０２３３】
[000331]さらに、障害および／または疾患が被験体において改善されているかどうかを決定する試験が有用である。言い換えると、本明細書に記載する方法を用いて、治療の療法的効果を判断することも可能である。さらに、マーカー遺伝子が本明細書記載の遺伝子の１つである場合、罹患していると診断されている被験体において、マーカー遺伝子の発現レベルの増加または減少は、疾患がより進行していることを暗示する。
【０２３４】
[000332]障害および／または疾患の重症度および／またはこれに対する感受性もまた、発現レベルの相違に基づいて決定可能である。例えば、マーカー遺伝子が本明細書記載の遺伝子の１つである場合、マーカー遺伝子の発現レベルの増加の度合いは、障害および／または疾患の存在および／または重症度と相関する。
【０２３５】
[000333]動物モデル
[000334]１以上のマーカー遺伝子またはマーカー遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルが動物モデルにおいて上昇しているような、障害および／または疾患のための動物モデルもまた作製してもよい。「機能的に同等な遺伝子」は、本明細書において、一般的に、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質の既知の活性と類似の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的な例には、動物に生得的な、被験体動物のマーカー遺伝子の対応物が含まれる。
【０２３６】
[000335]動物モデルは、障害および／または疾患による生理学的変化を検出するのに有用である。特定の態様において、動物モデルは、マーカー遺伝子のさらなる機能を明らかにし、そしてそのターゲットがマーカー遺伝子である薬剤を評価するのに有用である。
【０２３７】
[000336]対応物遺伝子の発現レベルを調節するかまたは対応物遺伝子を投与することによって、動物モデルを生成することも可能である。該方法には、本明細書記載の遺伝子群より選択される遺伝子の発現レベルを調節することによって、動物モデルを生成する工程が含まれてもよい。別の態様において、該方法には、本明細書記載の遺伝子によってコードされるタンパク質を投与するか、または該タンパク質に対する抗体を投与することによって、動物モデルを生成する工程が含まれてもよい。特定の他の態様において、マーカーが次いで、適切な方法を用いて測定可能であるように、マーカーを過剰発現させてもよいこともまた理解されるものとする。別の態様において、こうした遺伝子群から選択される遺伝子を導入することによって、またはこうした遺伝子によってコードされるタンパク質を投与することによって、動物モデルを生成してもよい。別の態様において、こうした遺伝子群から選択される遺伝子の発現またはこうした遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を抑制することによって、障害および／または疾患を誘導してもよい。アンチセンス核酸、リボザイム、またはＲＮＡｉを用いて、発現を抑制してもよい。活性を阻害する物質、例えば抗体を投与することによって、タンパク質活性を有効に調節することも可能である。
【０２３８】
[000337]動物モデルは、障害および／または疾患の根底にある機構を解明し、そしてまたスクリーニングによって得られた化合物の安全性を試験するのに有用である。例えば、動物モデルが、特定の障害および／または疾患の症状を発展させる場合、あるいは特定の障害および／または疾患に関与する測定値が動物において変化している場合、スクリーニング系を構築して、疾患を軽減させる活性を有する化合物を探索してもよい。
【０２３９】
[000338]本明細書において、表現「発現レベルの増加」は、以下のいずれか１つを指す：外来遺伝子として導入されたマーカー遺伝子が、人工的に発現される場合；被験体動物に生得的なマーカー遺伝子の転写、およびタンパク質へのその翻訳が増進している場合；または翻訳産物であるタンパク質の加水分解が抑制されている場合。
【０２４０】
[000339]本明細書において、表現「発現レベルの減少」は、被験体動物のマーカー遺伝子の転写、およびタンパク質へのその翻訳が阻害されている状態、または翻訳産物であるタンパク質の加水分解が増進している状態のいずれかを指す。例えばＤＮＡチップ上のシグナル強度の相違によって、遺伝子の発現レベルを決定してもよい。さらに、正常状態のものと比較することによって、翻訳産物−−タンパク質−−の活性を決定してもよい。
【０２４１】
[000340]動物モデルには、例えばマーカー遺伝子が導入され、そして人工的に発現されている動物；マーカー遺伝子ノックアウト動物；および別の遺伝子がマーカー遺伝子を置換しているノックイン動物を含む、トランスジェニック動物が含まれてもよい。マーカー遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ効果を有するポリヌクレオチド、またはデコイ核酸として機能するＤＮＡなどが導入されているトランスジェニック動物を、トランスジェニック動物として用いてもよい。こうしたトランスジェニック動物にはまた、例えば、遺伝子のコード領域内に突然変異（単数または複数）を導入することによって、マーカータンパク質の活性が増進しているかまたは抑制されている動物、あるいは加水分解に耐性または感受性になるようにアミノ酸配列が修飾されている動物もまた含まれる。アミノ酸配列中の突然変異には、置換、欠失、挿入、および付加が含まれる。
【０２４２】
[000341]発現例
[000342]さらに、遺伝子の転写制御領域内に突然変異（単数または複数）を導入することによって、マーカー遺伝子の発現自体を調節してもよい。当業者は、こうしたアミノ酸置換を理解する。また、活性が維持される限り、突然変異されるアミノ酸の数は、特に制限されない。通常、これは５０アミノ酸以内であり、特定の限定されない態様において、３０アミノ酸以内、１０アミノ酸以内、または３アミノ酸以内である。活性が維持される限り、突然変異の部位は、任意の部位であってもよい。
【０２４３】
[000343]さらに別の側面において、本明細書において、特定の障害および／または疾患を治療する療法剤のための候補化合物に関するスクリーニング法を提供する。１以上のマーカー遺伝子を本明細書記載の遺伝子群から選択する。マーカー遺伝子（単数または複数）の発現レベルを増加させるかまたは減少させることが可能な化合物を選択することによって、結腸癌関連疾患のための療法剤を得てもよい。
【０２４４】
[000344]表現「遺伝子の発現レベルを増加させる化合物」は、遺伝子転写、遺伝子翻訳、またはタンパク質活性の発現の工程のいずれか１つを促進する化合物を指す。一方、表現「遺伝子の発現レベルを減少させる化合物」は、本明細書において、これらの工程のいずれか１つを阻害する化合物を指す。
【０２４５】
[000345]特定の側面において、障害および／または疾患のための療法剤に関してスクリーニングする方法を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれで行ってもよい。このスクリーニング法は、例えば、以下の工程によって実行可能である：
[000346]動物被験体に候補化合物を投与する工程；
[000347]動物被験体由来の生物学的試料において、マーカー遺伝子（単数または複数）の発現レベルを測定する工程；あるいは
[000348]候補化合物が接触していない対照におけるものと比較した際、マーカー遺伝子（単数または複数）の発現レベルを増加させるかまたは減少させる化合物を選択する工程。
【０２４６】
[000349]さらに別の側面において、動物被験体を候補化合物と接触させ、そして動物被験体由来の生物学的試料中のマーカー遺伝子（単数または複数）の発現レベルに対する化合物の効果を監視することによって、マーカー遺伝子（単数または複数）の発現レベルに対する薬学的剤のための候補化合物の有効性を評価する方法を提供する。上述の試験法において使用するのと同じ技術を用いて、動物被験体由来の生物学的試料中のマーカー遺伝子（単数または複数）の発現レベルにおける変動を監視してもよい。さらに、評価に基づいて、スクリーニングによって、薬学的剤のための候補化合物を選択してもよい。
【０２４７】
[000350]本明細書に引用するすべての特許、特許出願および参考文献は、本明細書に完全に援用される。本発明は、本発明を作製し、そして使用する当業者のために十分に詳細に記載されそして例示されているが、本発明の精神および範囲から逸脱しない、多様な代替法、修飾および改善が、当業者には明らかであろう。当業者は、目的を実行するために、そして言及するものとともに本明細書に生得的な目標および利点を得るために、本発明がよく適応することを容易に認識する。
【０２４８】
[000351]特定の核酸塩基配列
[000352]本明細書記載の成熟ｍｉＲＮＡおよびその対応するステム−ループ配列の核酸塩基配列は、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／に見られるｍｉＲＮＡ配列および注釈のオンライン検索可能データベースであるｍｉＲＢａｓｅに見られる配列である。ｍｉＲＢａｓｅ配列データベース中のエントリーは、成熟ｍｉＲＮＡ配列の位置および配列に関する情報を含む、ｍｉＲＮＡ転写物（ステム−ループ）の予測されるヘアピン部分に相当する。データベース中のｍｉＲＮＡステム−ループ配列は、厳密には前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）ではなく、そしていくつかの場合、プレｍｉＲＮＡおよび推測される一次転写物由来のいくつかの隣接配列を含んでもよい。本明細書記載のｍｉＲＮＡ核酸塩基配列は、任意のバージョンのｍｉＲＮＡを含み、ｍｉＲＢａｓｅ配列データベースのＲｅｌｅａｓｅ １０．０に記載される配列およびｍｉＲＢａｓｅ配列データベースの任意の以前のＲｅｌｅａｓｅに記載される配列が含まれる。配列データベースリリースは特定のｍｉＲＮＡの改名を生じうる。配列データベースリリースは、成熟ｍｉＲＮＡ配列の変動を生じうる。こうした修飾オリゴヌクレオチドを含んでもよい化合物は、本明細書記載のｍｉＲＮＡの任意の核酸塩基配列型に相補的であってもよい。
【０２４９】
[000353]本明細書に示す任意の核酸塩基配列は、糖部分、ヌクレオシド間連結、または核酸塩基に対するいかなる修飾からも独立である。Ｕを含む核酸塩基配列はまた、「Ｕ」を有する１以上の位で、「Ｕ」が「Ｔ」に交換されている同じ核酸塩基配列も含むことがさらに理解される。逆に、Ｔを含む核酸塩基配列もまた、「Ｔ」を有する１以上の位で、「Ｔ」が「Ｕ」に交換されている同じ核酸塩基配列も含むことが理解される。
【０２５０】
[000354]特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体に相補的な核酸塩基配列を有し、すなわち、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれより多い核酸塩基の領域に渡って、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の相補体に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるか、あるいは２つの配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。したがって、特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、そのターゲットｍｉＲＮＡまたはターゲットｍｉＲＮＡ前駆体配列に関して、１以上のミスマッチ塩基対を有することも可能であるし、そしてターゲット配列にハイブリダイズ可能である。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体に１００％相補的である核酸塩基配列を有する。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、ｍｉＲＮＡに全長相補的である。
【０２５１】
[000355]ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）療法
[000356]いくつかの態様において、本発明は、被験体における１以上の遺伝子の発現を阻害するマイクロＲＮＡを提供する。マイクロＲＮＡ発現プロファイルは、新規クラスの癌バイオマーカーとして働きうる。
【０２５２】
[000357]１以上のＭｉＲを用いて遺伝子発現および／または活性を阻害する方法が本明細書に含まれる。いくつかの態様において、ｍｉＲ（単数または複数）は、タンパク質発現を阻害する。他の態様において、ｍｉＲＮＡ（単数または複数）は、遺伝子活性（例えば細胞侵襲活性）を阻害する。
【０２５３】
[000358]一般の当業者に周知の多様な技術によって、ｍｉＲＮＡを、細胞または組織から単離するか、組換え的に産生するか、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成してもよい。１つの態様において、ｍｉＲＮＡを細胞または組織から単離する。細胞または組織からｍｉＲＮＡを単離するための技術は、一般の当業者に周知である。例えば、Ａｍｂｉｏｎ， Ｉｎｃ．のｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ単離キットを用いて、総ＲＮＡからｍｉＲＮＡを単離してもよい。別の技術は、小核酸のＰＡＧＥ精製のため、ｆｌａｓｈＩＰＡＧＥ^ＴＭ分画系（Ａｍｂｉｏｎ， Ｉｎｃ．）を利用する。
【０２５４】
[000359]ｍｉＲＮＡ療法剤の使用のため、一般の当業者は、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される核酸が細胞および組織に取り込まれ、そして分配されることを理解する。
[000360]剤および／または核酸送達系の組織特異的な取り込みを可能にするのに適した方式で、核酸を送達してもよい。本明細書記載の配合物は、限定されるわけではないが、抗体投与、ワクチン投与、細胞傷害剤、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、および生物学的反応修飾剤の投与を含む、任意の既知の慣用的療法によって、治療条件を補うことも可能である。２以上の組み合わせた化合物を一緒にまたは連続して用いてもよい。
【０２５５】
[000361]本発明の特定の態様は、（ａ）１以上の核酸または小分子化合物および（ｂ）１以上の他の化学療法剤を含有する薬学的組成物を提供する。
[000362]さらなる有用な定義
[000363]「被験体」は、治療または療法のために選択されるヒトまたは非ヒト動物を意味する。「有すると推測される被験体」は、障害、疾患または状態の１以上の臨床的指標を示す被験体を意味する。
【０２５６】
[000364]「予防すること」または「予防」は、週、月、または年を含む期間で、状態または疾患の開始、発展または進行を、遅延させるかまたは未然に防ぐことを指す。「治療」または「治療する」は、障害および／または疾患の治癒または軽減のために用いる１以上の特異的方法の適用を意味する。特定の態様において、特定の方法は、１以上の薬学的剤の投与である。
【０２５７】
[000365]「軽減」は、状態または疾患の少なくとも１つの指標の重症度の減少を意味する。特定の態様において、軽減には、状態または疾患の１以上の指標の進行の遅延または遅滞が含まれる。当業者に知られる主観的または客観的測定値によって、指標の重症度を決定してもよい。
【０２５８】
[000366]「必要な被験体」は、療法または治療を必要とすると同定される被験体を意味する。
[000367]「投与すること」は、被験体に薬学的剤または組成物を提供することを意味し、そして限定されるわけではないが、医学的専門家による投与および自己投与が含まれる。
【０２５９】
[000368]「非経口投与」は、注射または注入を通じた投与を意味する。非経口投与には、限定されるわけではないが、皮下投与、静脈内投与、筋内投与、動脈内投与、および頭蓋内投与が含まれる。「皮下投与」は、皮膚のすぐ下への投与を意味する。
【０２６０】
[000369]「機能を改善する」は、正常なパラメーターに向けて機能を変化させることを意味する。特定の態様において、被験体の体液中に見られる分子を測定することによって、機能を評価する。「薬学的組成物」は、個体に投与するのに適した、薬学的剤を含む物質混合物を意味する。例えば、薬学的組成物は、修飾オリゴヌクレオチドおよび無菌水性溶液を含んでもよい。
【０２６１】
[000370]「ターゲット核酸」、「ターゲットＲＮＡ」、「ターゲットＲＮＡ転写物」および「核酸ターゲット」はすべて、アンチセンス化合物によってターゲティングされることが可能な核酸を意味する。「ターゲティング」は、ターゲット核酸にハイブリダイズして、そして所望の効果を誘導するであろう核酸塩基配列の設計および選択のプロセスを意味する。「ターゲティングされる」は、ターゲット核酸へのハイブリダイゼーションを可能にして、所望の効果を誘導する核酸塩基配列を有することを意味する。特定の態様において、所望の効果は、ターゲット核酸の減少である。
【０２６２】
[000371]「調節」は、機能または活性の攪乱を意味する。特定の態様において、調節は、遺伝子発現の増加を意味する。特定の態様において、調節は、遺伝子発現の減少を意味する。
【０２６３】
[000372]「発現」は、遺伝子のコードされる情報が、細胞に存在し、そして機能する構造に変換される、任意の機能および工程を意味する。
[000373]「領域」は、核酸内の連結されたヌクレオシドの部分を意味する。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸の領域に相補的な核酸塩基配列を有する。例えば、特定のこうした態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡステム−ループ配列の領域に相補的である。特定のこうした態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ配列の領域に１００％同一である。
【０２６４】
[000374]「セグメント」は、領域のより小さいまたは下位部分を意味する。
[000375]「核酸塩基配列」は、任意の糖、連結、および／または核酸塩基修飾とは独立に、５’から３’方向の連続した核酸塩基の順序を意味する。
【０２６５】
[000376]「連続する核酸塩基」は、核酸において、互いに直接隣接する核酸塩基を意味する。
[000377]「核酸塩基相補性」は、２つの核酸塩基が、水素結合によって非共有的に対形成する能力を意味する。「相補的」は、第一の核酸塩基配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれより多い核酸塩基の領域に渡って、第二の核酸塩基配列の相補体に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一であるか、あるいは２つの配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。特定の態様において、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体に１００％相補的である核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの全長に渡って、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体に１００％相補的でなくてもよい。
【０２６６】
[000378]「相補性」は、第一の核酸および第二の核酸の間の核酸塩基対形成能を意味する。「全長相補性」は、第一の核酸の各核酸塩基が第二の核酸中の対応する位で各核酸塩基と対形成が可能であることを意味する。例えば、特定の態様において、各核酸塩基がｍｉＲＮＡ中の核酸塩基に相補性を有する修飾オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡに全長相補性を有する。
【０２６７】
[000379]「相補パーセント」は、核酸の長さで割った核酸中の相補核酸塩基の数を意味する。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドの相補性パーセントは、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基数で割った、ターゲット核酸に相補的である核酸塩基の数を意味する。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドの相補性パーセントは、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基数で割った、ｍｉＲＮＡに相補的な核酸塩基数を意味する。
【０２６８】
[000380]「結合領域パーセント」は、オリゴヌクレオチド領域に相補的な領域のパーセントを意味する。結合する領域パーセントは、ターゲット領域の長さで、オリゴヌクレオチドに相補的なターゲット領域の核酸塩基数を割ることによって計算される。特定の態様において、結合領域パーセントは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％である。
【０２６９】
[000381]「同一性パーセント」は、第二の核酸中の対応する位の核酸塩基に同一である、第一の核酸中の核酸塩基数を、第一の核酸中の核酸塩基総数で割った値を意味する。
[000382]本明細書において、「実質的に同一である」は、第一および第二の核酸塩基配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれより多い核酸塩基の領域に渡って、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるか、あるいは１００％同一であることを意味する。
【０２７０】
[000383]「ハイブリダイズする」は、核酸塩基相補性を通じて生じる、相補核酸のアニーリングを意味する。
[000384]「ミスマッチ」は、第二の核酸の対応する位の核酸塩基との対形成が不可能である、第一の核酸の核酸塩基を意味する。
【０２７１】
[000385]「非相補核酸塩基」は、水素結合を通じて対形成することが不可能である、２つの核酸塩基を意味する。
[000386]「同一」は、同じ核酸塩基配列を有することを意味する。
【０２７２】
[000387]「ｍｉＲＮＡ」または「ｍｉＲ」は、コーディングＲＮＡにハイブリダイズし、そしてその発現を制御する、長さ１８〜２５核酸塩基の間のノンコーディングＲＮＡを意味する。特定の態様において、ｍｉＲＮＡは、酵素ダイサーによるプレｍｉＲＮＡの切断産物である。ｍｉＲＮＡの例は、ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）として知られるｍｉＲＮＡデータベース中で見られる。
【０２７３】
[000388]「プレｍｉＲＮＡ」または「プレｍｉＲ」は、ｍｉＲＮＡを含有するヘアピン構造を有するノンコーディングＲＮＡを意味する。特定の態様において、プレｍｉＲＮＡは、ドローシャとして知られる二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼによる、プリｍｉＲの切断産物である。
【０２７４】
[000389]「ステム−ループ配列」は、ヘアピン構造を有し、そして成熟ｍｉＲＮＡ配列を含有するＲＮＡを意味する。プレｍｉＲＮＡ配列およびステム−ループ配列は、重複していてもよい。ステム−ループ配列の例は、ｍｉＲＢａｓｅ（ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）として知られるｍｉＲＮＡデータベース中で見られる。
【０２７５】
[000390]「ｍｉＲＮＡ前駆体」は、ゲノムＤＮＡから生じ、そして1以上のｍｉＲＮＡ配列を含むノンコーディング構造化ＲＮＡを含む、転写物を意味する。例えば、特定の態様において、ｍｉＲＮＡ前駆体はプレｍｉＲＮＡである。特定の態様において、ｍｉＲＮＡ前駆体はプリｍｉＲＮＡである。
【０２７６】
[000391]「アンチセンス化合物」は、ターゲット核酸へのハイブリダイゼーションを可能にするであろう核酸塩基配列を有する化合物を意味する。特定の態様において、アンチセンス化合物は、ターゲット核酸に相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０２７７】
[000392]「オリゴヌクレオチド」は、連結されたヌクレオシドのポリマーであって、各々が、互いに独立に、修飾されていてもまたは修飾されていなくてもよい。「天然存在ヌクレオシド間連結」は、ヌクレオシド間の３’から５’のホスホジエステル連結を意味する。「天然核酸塩基」は、天然存在型に比較して修飾されていない核酸塩基を意味する。「ｍｉＲアンタゴニスト」は、ｍｉＲＮＡの活性に干渉するかまたはこれを阻害するよう設計された剤を意味する。特定の態様において、ｍｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡをターゲットとするアンチセンス化合物を含む。特定の態様において、ｍｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡの核酸塩基配列またはその前駆体に相補的な核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、ｍｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡの活性に干渉するかまたはこれを阻害する小分子等を含む。
【０２７８】
[000393]本明細書記載の方法および試薬は、好ましい態様の代表であり、例示であり、そして本発明の範囲に対する限定としては意図されない。これらの修飾および他の使用が当業者には思い浮かぶであろう。これらの修飾は、本発明の精神内に含まれ、そして請求項の範囲によって定義される。また、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示する本発明に、多様な置換および修飾を行ってもよいことが、当業者には容易に明らかであろう。
【０２７９】
[000394]本発明は、好ましい態様および場合による特徴によって具体的に開示されてきているが、当業者が本明細書に開示する概念の修飾および変動に頼ることも可能であり、そしてこうした修飾および変動は、付随する請求項によって定義されるような本発明の範囲内であると見なされることが理解されるものとする。
【０２８０】
[000395]本発明は、多様なそして好ましい態様に言及して記載されてきているが、本発明の本質的な範囲を逸脱することなく、多様な変化を行ってもよく、そしてその要素を同等物で置換してもよいことが、当業者には理解されなければならない。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、本発明の解説に対して、特定の状況または物質を適応させるよう、多くの修飾を行ってもよい。
【０２８１】
[000396]参考文献
[000397]本発明を明らかにするかまたは本発明の実施に関するさらなる詳細を提供する、本明細書で用いる刊行物および他の資料は、本明細書に援用され、そして便宜上、以下の文献目録中に提供される。
【０２８２】
[000398]本明細書に列挙するいかなる文書の引用も、前述のいずれもが適切な先行技術であることの承認であるとは意図されない。日付に関するすべての言及、またはこれらの文書の内容に関する表明は、出願者が入手可能な情報に基づき、そしてこれらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
【０２８３】
【化１−１】

【０２８４】
【化１−２】

【０２８５】
【化１−３】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのサイレンシングが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）において、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１が誘導する表現型を特徴付ける、遺伝子シグネチャー。
【請求項２】
１以上の白血病細胞モデルおよび原発性慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）において、遺伝子を調節解除するための、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中の１以上のｍｉＲの使用。
【請求項３】
請求項１のシグネチャーを用いて、ＣＬＬのための療法的アプローチを開発するための方法。
【請求項４】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）における腫瘍抑制因子としてのｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１６−１クラスターの使用。
【請求項５】
白血病細胞の腫瘍移植の増殖を阻害するための方法であって、こうした細胞を、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中の１以上のｍｉＲに曝露する工程を含み、腫瘍抑制因子機能がこうした細胞に対して発揮される、前記方法。
【請求項６】
抗白血病効果が発揮される必要がある被験体において、抗白血病効果を発揮するための方法であって、被験体に、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中のｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上を投与することによって、ＩＧＳＦ４を直接サイレンシングする工程を含む、前記方法。
【請求項７】
図１５−表１１に列挙する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬおよびｍｉＲ−１５ａ／１６−１でトランスフェクションされたＭＥＧ−０１間で共通の遺伝子のシグネチャー。
【請求項８】
ＣＬＬの治療におけるｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中のｍｉＲおよびｍｉＲ−２９の１以上の使用。
【請求項９】
Ｂ−ＣＬＬ細胞の生存に対するｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターの影響が増加しているＭＣＬ１およびｃ−ＪＵＮ転写物両方をターゲティングすることを含む、ＣＬＬの治療におけるｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中のｍｉＲおよびｍｉＲ−２９の１以上の使用。
【請求項１０】
ＰＤＣＤ４、ＲＡＢ２１、ＩＧＳＦ４、ＳＣＡＰ２および／またはプロテオミクスによって同定されたタンパク質（Ｂｃｌ２、Ｗｔ１）の１以上の発現を減少させるための方法であって、その必要がある細胞を、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中の１以上のｍｉＲでトランスフェクションする工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
ＩＧＳＦ４を直接ターゲティングするためのｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターの使用。
【請求項１２】
ＩＧＳＦ４を発現している細胞を、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスター中の１以上のｍｉＲまたはその機能的変異体と、細胞におけるＩＧＳＦ５の発現が阻害されるような条件下で接触させる工程を含む、細胞増殖を阻害する方法。
【請求項１３】
細胞が癌細胞である、先行する請求項の方法。
【請求項１４】
細胞が慢性リンパ球性白血病細胞である、先行する請求項の方法。
【請求項１５】
細胞が生物中にある、先行する請求項の方法。
【請求項１６】
生物が動物である、先行する請求項の方法。
【請求項１７】
生物が癌と診断されている、先行する請求項の方法。
【請求項１８】
１以上の同定されるタンパク質の翻訳を阻害することが知られる、選択されるｍｉＲＮＡの形成を阻害する方法であって、その必要がある被験体に、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１クラスターから選択される１以上のｍｉＲを投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
図７−表３に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャー。
【請求項２０】
図８−表４に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャー。
【請求項２１】
図１１−表７に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャー。
【請求項２２】
図１２−表８に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャー。
【請求項２３】
図１３−表９に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャー。
【請求項２４】
図１４−表１０に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャー。
【請求項２５】
図１５−表１１に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャー。
【請求項２６】
図１６−表１２に列挙する、ｍｉＲ １５ａ／１６−１が下方制御する遺伝子の１以上を含む、ＣＬＬシグネチャー。
【請求項２７】
被験体が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有するかまたは該疾患を発展させるであろうかどうかの診断を決定するための方法であって、被験体由来の試料を調べ、そしてｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターより選択されるｍｉＲの発現の正の相関があるかどうかを決定する工程を含む、前記方法。
【請求項２８】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有するかまたは発展させうる被験体の診断、治療、または予後の決定の１以上において、先行する請求項いずれかのシグネチャーを用いる方法。
【請求項２９】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）に罹患した患者の転帰を予測するための方法であって：正常細胞に比較したｍｉＲＮＡ発現の特徴的なシグネチャーを決定する工程を含み、該シグネチャーが、先行する請求項いずれかのｍｉＲＮＡシグネチャーの１以上を含む、前記方法。
【請求項３０】
ｉ）被験体が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有するかまたは該疾患を発展させるリスクがあるかどうかを診断し、ｉｉ）こうした被験体の予後を決定し、そして／またはｉｉｉ）こうした被験体を治療する方法であって：被験体由来の試験試料において、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定する工程を含み、ここでバイオマーカーは、先行する請求項のＣＬＬシグネチャーの１以上から選択され、そして対照試料中の対応するバイオマーカーのレベルに比較して、試験試料中のバイオマーカーのレベルが改変されていると、被験体がＣＬＬを有するかまたはＣＬＬを発展させるリスクを有するかいずれかの指標となる、前記方法。
【請求項３１】
試験試料中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルが、対照試料中の対応するバイオマーカーのレベル未満である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
試験試料中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルが、対照試料中の対応するバイオマーカーのレベルよりも高い、請求項３０の方法。
【請求項３３】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）におけるターゲットｍＲＮＡの転写物量および／またはタンパク質発現に影響を及ぼすための方法であって、その必要がある被験体において、１以上のマイクロＲＮＡを調節解除する工程を含む、前記方法。
【請求項３４】
癌関連遺伝子のタンパク質発現を阻害する工程を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
ヒト慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）で生じるマイクロＲＮＡ機能の改変を同定するための、マイクロＲＮＡおよびタンパク質をコードするＲＮＡの両方の大規模遺伝子発現プロファイリングの使用。
【請求項３６】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有する被験体の予後を決定する方法であって、被験体由来の試験試料において、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定する工程を含み：
該バイオマーカーがこうした癌における予後不良と関連しており；そして
対照試料中の対応するバイオマーカーのレベルに比較して、試験試料中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルが改変されていると、予後不良の指標となる
前記方法。
【請求項３７】
被験体が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有するかまたは該疾患を発展させるリスクがあるかどうかを診断することを含む、ＣＬＬを有する被験体の予後を決定する方法であって：
被験体から得た試験試料から、ＲＮＡを逆転写して、ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドセットを提供し；
ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに、ターゲットオリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；そして
対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロファイルと、試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを比較する
工程を含み、
少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルの改変が、被験体がＡＭＬなどを有するかまたは発展させるリスクがあるかいずれかである指標となる
前記方法。
【請求項３８】
対照試料から生じたシグナルに比較して、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルが下方制御されており、そして／または対照試料から生じたシグナルに比較して、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルが上方制御されている、請求項３１の方法。
【請求項３９】
ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲより選択される少なくとも１つのバイオマーカーのシグナルにおける改変が、被験体が予後不良を伴うＣＬＬ癌を有するかまたは発展させるリスクがあるかいずれかである指標となる、請求項３８の方法。
【請求項４０】
白血球細胞においてタンパク質発現を制御するための方法であって、白血病細胞において、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲの１以上の発現を調節する工程を含む、前記方法。
【請求項４１】
白血病細胞において１以上のタンパク質レベルの発現を調節するための組成物であって、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上を含む、前記組成物。
【請求項４２】
白血病細胞においてタンパク質レベルを増加させる必要がある被験体において、白血病細胞においてタンパク質レベルを増加させるのに有用な、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターの１以上のアンチセンスｍｉＲを含む、組成物。
【請求項４３】
少なくとも１つのバイオマーカーが、対照細胞に比較して被験体の癌細胞において下方制御されているかまたは上方制御されている、白血病を有する被験体において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を治療する方法であって：
少なくとも１つのバイオマーカーが癌細胞において下方制御されている場合、被験体において癌細胞の増殖が阻害されるように、被験体に、少なくとも１つの単離されたバイオマーカー、または単離されたその変異体もしくは生物学的活性断片の有効量を投与するか；
あるいは、少なくとも１つのバイオマーカーが癌細胞において上方制御されている場合、被験体において癌細胞の増殖が阻害されるように、被験体に、少なくとも１つのバイオマーカーの発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の有効量を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項４４】
被験体において白血病を治療する方法であって：対照細胞に比較して、白血病細胞における少なくとも１つのバイオマーカーの量を決定し；ここで、バイオマーカーは、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択され、そして：
癌細胞で発現されるバイオマーカーの量が、対照細胞で発現されるバイオマーカーの量より少ない場合、被験体に、少なくとも１つの単離されたバイオマーカーの有効量を投与するか；あるいは
癌細胞で発現されるバイオマーカーの量が、対照細胞で発現されるバイオマーカーの量より多い場合、被験体に、少なくとも１つのバイオマーカーの発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の有効量を投与する
ことによって、白血病細胞で発現されるバイオマーカーの量を改変する工程を含む、前記方法。
【請求項４５】
ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される少なくとも１つの単離されたバイオマーカー、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、白血病を治療するための薬学的組成物。
【請求項４６】
少なくとも１つのｍｉＲ発現阻害剤化合物および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、先行する請求項の薬学的組成物。
【請求項４７】
抗白血病剤を同定する方法であって、細胞に試験剤を提供し、そして白血病細胞における発現レベル減少と関連する少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定する工程を含み、
バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択され、そして
対照細胞に比較して、細胞におけるバイオマーカーのレベルが増加していると、試験剤が抗白血病剤である指標となる
前記方法。
【請求項４８】
抗白血病剤を同定する方法であって、試験剤を細胞に提供し、そして白血病細胞における発現レベル増加と関連する少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定する工程を含み、対照細胞に比較して、細胞におけるバイオマーカーのレベルが減少していると、試験剤が抗癌剤である指標となり、
バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される
前記方法。
【請求項４９】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）関連疾患を予防し、診断し、そして／または治療するための療法の有効性を評価する方法であって：
有効性を評価しようとする療法を、動物に供し、そして
少なくとも１つのバイオマーカーを評価することによって、疾患を治療するかまたは予防する際、試験中の治療の有効性のレベルを決定する工程を含み、
バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される
前記方法。
【請求項５０】
候補療法剤が：薬学的組成物、栄養補助食品組成物、およびホメオパシー組成物の１以上を含む、先行する請求項の方法。
【請求項５１】
評価している療法が、ヒト被験体で使用するためのものである、先行する請求項の方法。
【請求項５２】
少なくとも１つのバイオマーカーを含む白血病関連疾患のマーカーに結合する少なくとも１つの捕捉試薬を含む製品であって、
バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される
前記製品。
【請求項５３】
白血病関連疾患を治療するための療法剤のための候補化合物に関してスクリーニングするためのキットであって：少なくとも１つのバイオマーカーの試薬の１以上、および少なくとも１つのバイオマーカーを発現する細胞を含み、
バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される
前記キット。
【請求項５４】
少なくとも１つのバイオマーカーと特異的に結合する抗体または抗体断片を含む試薬を用いて、バイオマーカーの存在を検出する、先行する請求項のキット。
【請求項５５】
個体における合併症を治療するか、予防するか、逆転させるか、またはその重症度を制限するための薬剤を製造するための、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）関連疾患反応シグナル伝達経路に干渉する剤の使用であって、
剤が少なくとも１つのバイオマーカーを含み、バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される
前記使用。
【請求項５６】
白血病関連合併症を治療するか、予防するか、逆転させるか、またはその重症度を制限する必要がある個体において、白血病関連合併症を治療するか、予防するか、逆転させるか、またはその重症度を制限する方法であって：
少なくとも白血病関連疾患反応カスケードに干渉する剤を、個体に投与する工程を含み、剤が少なくとも１つのバイオマーカーを含み、
バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される
前記方法。
【請求項５７】
個体において、白血病関連合併症を治療するか、予防するか、逆転させるか、またはその重症度を制限するための薬剤を製造するための、少なくとも慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）関連疾患反応カスケードに干渉する剤の使用であって、剤が少なくとも１つのバイオマーカーを含み、
バイオマーカーがｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択される
前記使用。
【請求項５８】
ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上のアンチセンス阻害剤を含む、組成物。
【請求項５９】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬＬ）を治療する必要がある被験体において、該疾患を治療する方法であって、被験体に、先行する請求項の組成物の療法的有効量を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項６０】
組成物を予防的に投与する、先行する請求項の方法。
【請求項６１】
組成物の投与が、ＣＬＬの１以上の症状の開始を遅延させる、先行する請求項の方法。
【請求項６２】
組成物の投与がＣＬＬの発展を阻害する、先行する請求項の方法。
【請求項６３】
組成物の投与がＣＬＬを阻害する、先行する請求項の方法。
【請求項６４】
生物学的試料における白血病の存在を検出するための方法であって：
白血病を含有すると推測される生物学的試料を、そのバイオマーカーに曝露し；
ここでバイオマーカーはｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上より選択され、そして
あるとすれば、試料中のマーカーの存在または非存在を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項６５】
バイオマーカーが検出可能標識を含む、先行する請求項の方法。
【請求項６６】
被験体由来の生物学的試料中のバイオマーカーの量を、正常被験体由来の対応する生物学的試料中のバイオマーカーの量に比較する工程をさらに含む、先行する請求項の方法。
【請求項６７】
異なる時点で、被験体から複数の生物学的試料を収集し、そして各生物学的試料中のマーカーの量を比較して、被験体において、マーカーの量が時間とともに増加しているかまたは減少しているかを決定する工程をさらに含む、先行する請求項の方法。
【請求項６８】
被験体において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を治療するための方法であって：白血病受容体アゴニストを含む、前記方法。
【請求項６９】
受容体アゴニストが：ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体の１以上のアンチセンス阻害剤である、先行する請求項の方法。
【請求項７０】
ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体、それに由来する配列、こうしたｍｉＲ由来の相補配列、およびこうした相補配列由来の配列の中から選択される核酸分子で構成される、急性骨髄性白血病の治療のための薬剤を製造するための使用。
【請求項７１】
薬剤が、ｍｉＲ１５ａ／１６−１クラスターのｍｉＲまたはその機能的変異体、こうしたｍｉＲに由来する配列、こうしたｍｉＲの相補配列、およびこうした相補配列由来の配列の１以上の中から選択される配列を提示する核酸分子を含む、先行する請求項記載の使用。
【請求項７２】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞の分化を誘導するのに有効な療法剤または療法剤の組み合わせを同定する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって：
ＣＬＬ細胞由来の細胞を培養し、
細胞株の培地に少なくとも１つの化合物を添加し、
工程（ｉ）および（ｉｉ）の間で少なくとも１つのｍｉＲの発現レベルの進化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を分析し、そして
工程（ｉ）および（ｉｉ）の間のｍｉＲの発現レベルの変化を誘導する化合物または化合物の組み合わせを同定する
工程を含む、前記方法。
【請求項７３】
工程（ｉｉｉ）が少なくとも１つのｍｉＲの発現レベルの分析を含む、先行する請求項の方法。
【請求項７４】
工程（ｉｖ）が少なくとも１つのｍｉＲの発現レベルを調節する化合物または化合物の組み合わせの同定を含む、先行する請求項の方法。
【請求項７５】
工程（ｉｖ）が少なくとも１つのｍｉＲの発現レベルを減少させる化合物または化合物の組み合わせの同定を含む、先行する請求項の方法。
【請求項７６】
化合物が癌の治療のための療法剤である、先行する請求項の方法。

【図５】

【図６】

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【図８】

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【図１４−２１】

【図１４−２２】

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【図１６−２】

【図１６−３】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【公表番号】特表２０１１−５１７９３２（Ｐ２０１１−５１７９３２Ａ）
【公表日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４８９０１（Ｐ２０１０−５４８９０１）
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３５４６３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０８８５６
【国際公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
【出願人】（５１０１４９４６０）ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション (10)
【Ｆターム（参考）】