ヒト抗体及びタンパク質
【課題】低免疫原性を示す抗体を含む合成タンパク質を提供する。
【解決手段】ヒト用複合抗体を提供し、具体的には、一又はそれ以上のＴ細胞エピトープを除去するように修飾された抗体を提供する。修飾抗体又は前記修飾抗体の抗原結合フラグメントにおいて、前記修飾抗体又は抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖可変領域が、各々１又はそれ以上の他の抗体又は抗原結合フラグメントからのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントから成り、前記セグメントが全てＣＤＲｓでもなくフレームワーク領域でもないことを特徴とする修飾抗体又は前記修飾抗体の抗原結合フラグメント。このようなタンパク質を生成する方法。
【解決手段】ヒト用複合抗体を提供し、具体的には、一又はそれ以上のＴ細胞エピトープを除去するように修飾された抗体を提供する。修飾抗体又は前記修飾抗体の抗原結合フラグメントにおいて、前記修飾抗体又は抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖可変領域が、各々１又はそれ以上の他の抗体又は抗原結合フラグメントからのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントから成り、前記セグメントが全てＣＤＲｓでもなくフレームワーク領域でもないことを特徴とする修飾抗体又は前記修飾抗体の抗原結合フラグメント。このようなタンパク質を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最終抗体又はタンパク質分子内で、ヒト抗体又はタンパク質からのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントを結合する抗体及びタンパク質の生成に関する。具体的には、本発明は、配列セグメントのこのような結合を提供して、最終抗体又はタンパク質分子中のＴ細胞エピトープの数を低減又は回避するようにする。本発明は、特に、ヒトの医薬品又はインビボ診断剤として用いる抗体及びタンパク質の生成に関する。
【０００２】
ここ２０年で、ヒトの潜在的医薬品として用いる組み換え型モノクローナル抗体の生成に大幅な進歩が見られている。ファージ提示法又は遺伝子導入マウスによる、キメラ化技術、ヒト型化技術及びヒト抗体クローニング技術は、非ヒトモノクローナル抗体よりも低い免疫原性を有するヒトに投与される場合に一般的に良好な耐容性を有する抗体を提供している。しかしながら、これらの技術によって生成したいくつかの抗体は、このような抗体の遺伝子起源がヒトである場合でさえ、患者の免疫原性を誘発することを示している。例えば、ヒト抗体Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）は、１２％の関節リウマチ患者に免疫原性を誘発し、ヒト化抗体ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）は、約５０％の患者に免疫原性を誘発する。このような免疫原性の誘発は、抗体可変領域内での非アミノ酸配列の一部の存在に起因しているようである。この非アミノ酸配列の一部は、いくつかの場合に、免疫原性をもたらすＴ細胞反応を誘発するＴ細胞エピトープを作ることができる。従って、高いヒト起源を有するが、改善した技術と、Ｔ細胞反応を誘発する配列の作成をできるだけ避ける抗体組成物が求められている。
【０００３】
本発明は、方法と、それによって、治療用に、このような抗体（ここでは、「複合抗体」という）が、最終抗体分子内でヒト抗体からのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントを結合するような結果物としての抗体組成を提供する。
【０００４】
従って、第１の態様では、本発明は修飾抗体、又はこれの抗原結合フラグメントを提供しており、これは修飾抗体又は抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖可変領域が、１又はそれ以上の別の抗体又は抗原結合フラグメントからのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントから成り、これらのセグメントが、全ＣＤＲでもフレームワーク領域でもない。
【０００５】
本発明のコンテキストでは、用語「セグメント」は、抗体分子内で見つけられる隣接アミノ酸配列をいい、このようなセグメントは、２から１２５アミノ酸長サイズの範囲であり、好ましくは、２から３１アミノ酸長の範囲であり、このようなセグメントは、全ＣＤＲでも全フレームワーク領域でもない。治療に用いる場合、本発明の複合抗体は、一般的に、複合抗体の可変領域内で、様々なヒト抗体からのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントを結合する。具体的には、本発明は、複合抗体重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ、ＶＨ及びＶＬという）に関し、ＶＨとＶＬは各々、完全に２又はそれ以上のヒト抗体可変領域からの配列のセグメントから成り、一般的に、各合成ＶＨ及びＶＬは、源ヒト抗体ＶＨ及びＶＬ中の位置に相当するヒト可変領域配列位のセグメントを含み、例えば、合成ＶＨ配列中のアミノ酸１から１０は、ヒト抗体のアミノ酸１から１０から導出する。代替的に、複合抗体中のヒトＶＨ又はＶＬ配列のセグメントは、源ヒト抗体ＶＨ又はＶＬ中の配列位に関わりなく、どの配列位に位置してもいてもよい。この源ヒト抗体ＶＨ及びＶＬは、例えば、ヒトモノクローナル抗体Ｖ領域配列のデータベースに提供されているような、現存のヒト抗体可変（Ｖ）領域アミノ酸配列であり、Ｖ領域体細胞変異体、及び生殖細胞系とは異なるその他の変異体を有する親和性成熟抗体からの配列、生殖細胞系Ｖ領域からの配列、固定Ｖ領域フレームワークセットを有するが可変ＣＤＲを有する抗体等といった種の抗体からの配列のセグメントから作られた人工的に構成された抗体Ｖ領域からの配列、ファージ表示ライブラリ等のヒト抗体ライブラリから選択された配列、及びヒト抗体又は抗体フラグメントをコードするトランスジェニック動物発現遺伝子から導出したヒト抗体の配列を含んでもよい。
【０００６】
本発明の好ましい実施例では、治療用の本発明の複合抗体は、最終複合抗体Ｖ領域のヒトＴ細胞エピトープを制限又は回避する組み合わせで多重ヒトＶＨ及びＶＬ配列セグメントを結合することによって構成される。
【０００７】
これに関して、ヒトＴ細胞エピトープは、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができるアミノ酸配列であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞への提示によって、ヘルパーＴ細胞反応を誘発する。最終複合抗体中のＴ細胞エピトープを制限、又は回避するヒトＶＨ及びＶＬ配列セグメント及びセグメントの組み合わせを選択できる。これは、ヒト生殖細胞系配列から等のＴ細胞エピトープを含まないセグメントの使用によって、及び隣接するセグメントを結合して、例えば、２つのセグメントの接合点における非ＭＨＣ結合配列の生成によって、別のヒト生殖細胞系配列の生成によって、又は非生殖細胞系配列にも関わらず、ヘルパーＴ細胞反応を誘発しない配列の生成によって、Ｔ細胞エピトープを含まない新しい配列を作ることによって達成することができる。
【０００８】
本発明の別の好ましい実施例では、更なるアミノ酸配列を加える、又は、１又はそれ以上の制御性Ｔ細胞エピトープ（「Ｔｒエピトープ」）を規定する複合抗体分子内で作ることができる。本発明の目的のために、Ｔｒエピトープは、接触依存性メカニズムと同様に、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β等の阻害性サイトカインの分泌によって免疫反応を調整する能力を有するＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞エピトープを刺激するＭＨＣ結合ペプチドである。このように、本発明の範囲内では、制御性Ｔ細胞エピトープは、ある条件下で、免疫反応の制御に寄与する１又はそれ以上のインビトロ又はインビボ活性を誘発するように示されるペプチドを含むことができる。例えば、制御性Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を誘発する又は活性化する作用、ＩＬ−１０及び／又はＴＧＦ−β等の阻害性サイトカインの放出を誘発する作用、又はその他の測定可能な免疫抑制関連インビトロ又はインビボ活性を有するペプチドを含む。これらの全ての場合において、これらの作用は、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の作用に関連する。従って、このようなＴｒエピトープは、複合抗体の免疫原性を制限又は回避する更なる基準を追加するものである。Ｔｒエピトープは、これらのエピトープを含むヒトＶＨ及びＶＬのセグメントを組み込むことによって、又は２又はそれ以上のヒト配列セグメントの結合を介してこのようなエピトープを生成することによって、又は、例えば、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の誘発又は活性化のために、例えば、ＩＬ−１０及び／又はＴＧＦ−β等の阻害性サイトカインの放出の測定によって、ヒト抗体又はタンパク質配列のセグメントに相当するペプチドからの新しいＴｒエピトープをスクリーニングすることによって、複合抗体ＶＨ又はＶＬ内に導入することができる（例えば、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１００（２００２）ｐ４５２９−３６）。代替的に、公知のＴｒエピトープは、複合抗体の結合又は機能又は発現を阻害しないＶＨ及び／又はＶＬ内の位置で複合抗体Ｖ領域内に組み込むことができ、又は、例えば、ＶＨのＮ末端に合成ＶＨ又はＶＬ配列の一端で組み込むことができる。代替的に、Ｔｒエピトープは、複合抗体の機能に干渉しない位置に（例えば、ヒンジ領域内で）、又は、発現の欠如等のいくつかの他の悪影響を引き起こさない位置に、複合抗体の一方又は双方の定常領域内に組み込むことができる。代替的に、抗体融合タンパク質内の合成ＶＨ及びＶＬの一方又は双方について、抗体は、Ｆａｂ及びＦｖ−タイプ形状（ＶＨ及びＶＬに結合した単鎖抗体（ＳＣＡｓ）を含む）、単一ドメイン抗体、又はホモ二量体型抗体を接合して、Ｔｒエピトープを、複合抗体の機能に干渉しない位置に、又は発現の欠如等のいくつかの他の悪影響を引き起こさない位置に組み込むことができる。例えば、ＳＣＡｓでは、Ｔｒエピトープ用に特に好ましい位置は、ＶＨとＶＬを結合するリンカ領域内である。最も良いのは、Ｔｒエピトープが、適切な配列によって側面に位置し、例えば、エンドサイトーシスプロテアーゼの作用に反応する配列を有するエピトープの側面に位置することによって、ＭＨＣクラスＩＩ分子上の制御性Ｔ細胞エピトープの放出及び表示を最適化する。一般的に、抗原の処理中のプロテアーゼの作用を標的にするＰ−２０からＰ３０（Ｐ１からＰ９のように規定されているコアノノメータを有する）を範囲とする位置で側面にある残渣は、必要ならば、ヒト抗体配列の追加のセグメントを用いて導入される。
【０００９】
ここで議論されているように、本発明は、修飾抗体又は複合抗体の生成方法も提供している。従って、別の態様では、本発明は；
（１）その他の抗体可変領域の範囲からアミノ酸配列のセグメントを結合することによって抗体可変領域遺伝子を準備して、様々な可変領域遺伝子のライブラリを生成するステップと、
（２）抗体可変領域遺伝子のライブラリを発現ベクタ内へクローニングするステップと、
（３）抗体可変領域のライブラリをスクリーニングして、所望の特性を有するライブラリの員を回復するステップと、
を具える修飾抗体の生成方法を提供する。
【００１０】
本発明の第１の好ましい方法「Ａ」では、合成ヒト抗体のライブラリが生成され、特異的抗原に結合する等、所望の特性を有する抗体にスクリーニングされる。この方法は、次の６ステップ；
（１）合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子を設計するステップと、
（２）合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子をクローニングするステップと、
（３）合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子を発現するステップと、
（４）所望の特性を有する複合抗体をスクリーニングして選択するステップと、
（５）リード複合抗体を最適化するステップと、
（６）（選択的に）Ｔ細胞エピトープを回避するステップと、
を含む。
【００１１】
ステップ（１）については、合成ＶＨ及びＶＬ配列のライブラリは、Ｋａｂａｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｉｍｋａｂ．ｈｔｍｌ）、ＮＣＢＩ ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で入手可能なもの等の公知のヒトＶ領域配列から、及び、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）及びＰＲＦ／ＳＥＱＤＢ（ｗｗｗ．ｐｒｆ．ｏｒ．ｊｐ）等のタンパク質データベースから、ＶＨ及びＶＬ配列のセグメントを選択することによって構成されている。加えて、これらは、１又はそれ以上の個人のドナーから増幅したＶＨ及びＶＬｍＲＮＡの直接配列によるヒトＶＨ及びＶＬ配列の収集によって補充される。配列セグメントの様々な結合は、ＶＨ及びＶＬ遺伝子の設計であると考えられる。用いられる１つの方法は、合成ＶＨ及びＶＬ配列の長さを固定して、様々なヒトＶ領域の相当するＫａｂａｔナンバリング位置からの固定長配列セグメントを用いて、これらを設計することである。
【００１２】
例えば、このライブラリは、１２１及び１０７アミノ酸ＶＨ及びＶＬ領域をそれぞれ具え、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングを用いて、ＶＨアミノ酸１−２７について様々なセグメントの組み合わせを含む。ＫａｂａｔナンバリングＣＤＲ１：３０−３５、ＣＤＲ２：５０−６６、及びＣＤＲ：９５−１０６に相当するＣＤＲを有するＶＨについては、次のＫａｂａｔ位についての配列セグメントが、１つの選択枝：１−２７、２８−３１、３２−３６、３７−４２、４３−５０、５１−５６、５７−６０、６１−６３、６４−６９、７０−８２ａ、８２ｂ−９６、９７−９８、９９−１０１、１０２−１１７として用いられている。ＫａｂａｔナンバリングＣＤＲ１：２４−３４、ＣＤＲ２：５０−５６、ＣＤＲ３：８９−９７に相当するＣＤＲを有するＶＬについて、次のＫａｂａｔ位についての配列セグメントが、１つの選択枝：１−２２、２３−２７、２８−３０、３１−３３、３４−３５、３６−４７、４８−５２、５３−５５、５６−５９、６０−８７、８８−９２、９３−９４、９５−１０７として用いられている。従って、この例では、合成ＶＨは、１４ヒトセグメントから成り、合成ＶＬは、１３のヒトセグメントから成る。実際には、コンピュータプログラムを用いて、これらのセグメントの組み合わせを生成する。好ましくは、このプログラムは、例えば、ＣＤＲのある種のカノニカル構造を回避する、或いは、ＶＨ及び／又はＶＬ折り畳み、又はＶＨ／ＶＬ相互作用を分離するあるセグメントの好ましくない組み合わせを回避するアルゴリズムを含む。選択的な追加として、このプログラムは、配列セグメントの組み合わせによって形成したＴ細胞エピトープの数を制限するアルゴリズムを含んでいてもよい（以下に述べるステップ（６）のコンピュータを利用した方法参照）。
【００１３】
ステップ（２）については、合成ヒト配列のライブラリを設計して、好ましくは合成オリゴヌクレオチドを用いて、合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子が生成される。一般的に、Ｖ領域配列のより長いセグメントをコードする合成オリゴヌクレオチドは、Ｖ領域配列の２又はそれ以上の連続したセグメントをコードするオリゴヌクレオチドの混合物に結紮される。代替的に、合成Ｖ領域は、現存のヒトＶＨ及びＶＬ遺伝子をテンプレートとして用いて、ＰＣＲのオーバーラップ又はその他の増幅技術等の他の方法によって結合することができる。例えば、ＰＣＲを用いて、Ｖ領域の小さなセグメントを個別に増幅し、次いで、ＰＣＲ反応をオーバーラップさせることによって結合する。
【００１４】
その他の方法では、混合合成オリゴヌクレオチドを生成して、好ましくは特異的Ｖ領域セグメントをコードする配列を濃縮するドーピング方法を用いて、一連の配列セグメントを作ることができる。大きく変動するヒトＶ領域セグメント表示を有する合成ヒトＶＨ及びＶＬ遺伝子は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；３ｒｄ Ｅｄ．，ｖｏｌｓ．１−３（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されているもの等の当業者に知られている技術を用いて、及びＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，８６（１９８９）３８３３−３８３７に記載されているもの等の免疫グロブリンについての標準ＰＣＲ法を用いて、多くの方法で結合させることができる。
【００１５】
ステップ（３）については、合成ヒトＶＨ及びＶＬ遺伝子が生成されると、これらは、完全抗体分子又はＦｖ’ｓ、Ｆａｂ’ｓ、Ｆａｂ２、ＳＣＡ等の抗原結合フラグメント、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨのみを具える）、及びこれらの各々の多重誘導体の生成用の様々な発現ベクタ内にクローンすることができる。代替的に、ＶＨ及びＶＬ遺伝子は、その他の分子をコードする遺伝子に融合させて、融合プロテインを生成することができる。また、Ｆｖ又はＦａｂの１つの鎖のＣ末端で、ポリヒスチジンタグ等の検出可能なマーカをコードする配列を含んでいてもよい。発現ベクタは、ほ乳類細胞、細菌細胞、バクテリオファージ、イースト、真菌、及びその他の微生物における発現用ベクタを含む。このようなベクタには、また、トランスジェニック動物からのインビボ発現用ベクタや、リボソーム調製を用いるインビトロ翻訳等のインビトロ系を用いた発現用ベクタも含まれる。
【００１６】
ステップ（４）については、合成ヒト抗体のライブラリのスクリーニングは、通常、対象の１又はそれ以上の特異的抗原への結合用である。多くのスクリーニング方法が当業者に知られており、これらの方法の選択は、完全ヒト抗体の発現形状と、抗体分子、即ち、完全ヒト抗体、又はＦａｂ、Ｆｖ、ＳＣＡ、単一ドメイン抗体等の組成に依存する。対象の抗原に結合する現存の抗体が入手可能である場合に、この抗体からのＶＨ又はＶＬは、合成ヒトＶＬ又はＶＨとそれぞれ組み合わせて、結合を試験することができる。
【００１７】
スクリーニング法は、固相上のこのような員のライブラリ又はプールの個々の員を固定することから、個別に又はプール中の対象の抗原を固定することにまで及ぶ。抗体が固定される場合、対象の抗原が追加され、１又はそれ以上の追加試薬の添加によって、直接的、又は間接的に検出することができる。例えば、抗原が融合タンパク質であるか、又はアルカリホスファターゼ等の酵素と結合する場合に、色、蛍光又は化学発光シグナルを生成する幅広い基質から順次添加することによって検出することができる。抗体プールが、１つのロケーション（例えば、マイクロタイター皿）に固定され、シグナルが、抗原の添加に起因する場合、このプールを、このプール又はより小さいプールの個々の員の再スクリーニングに先立って脱複製する（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ）ことができる。対象の抗原が固定される場合、合成抗原ライブラリは、個々の抗体の添加から、特異的ロケーションに固定された対象の抗原まで、抗体のプールの添加まで、全合成ライブラリの添加及び対象の抗原に結合した抗体の次の回復までに及ぶいくつかの方法でスクリーニングすることができる。最後のケースでは、一般的な戦略は、カラム内、又はビード上等の固相上に抗原を固定してライブラリを加え、次いで、例えば、低塩濃度緩衝液でこの固相を洗浄して（ライブラリに緩やかに結びついた員を分離するために）、次いで、例えば高塩濃度緩衝液を用いて抗原に結合する抗体を溶離することである。この目的のためのライブラリの員の発現用の一般的な形式は、ファージ表示、イースト表示、リボソーム表示、及びビード表示である各場合において、合成ＶＨ及びＶＬ鎖をコードする核酸が、抗原に結合する合成Ｖ領域に付着し続ける。
【００１８】
また、スクリーニング方法は、直接抗原結合試験に代わる機能性又は生物学的試験も含み、細胞増殖、細胞増殖阻害、細胞分化、又は細胞移動を含むインビトロ試験、又は、全有機体のレベルでの抗原への反応、例えば、マウスの血球数の変化や移植した腫瘍の増殖阻害を測定するステップを含む、代替的なインビボ試験等で機能性又は生物学的活性が測定される。
【００１９】
ステップ（５）については、対象の抗原への結合等の所望の特性を有する１又はそれ以上の「リード」合成ヒト抗体の選択の後、例えば、この抗原の結合親和性を増加させる、又はこの抗体を追加成分に融合させることによって、リード抗体の特性が、選択的に改善されることがある。親和性の増加は、合成可変領域配列の突然変異によって達成され、所望の方法の結合を増加させる又は変更する選択した合成Ｖ領域配列の突然変異を選択する。本発明は、リード抗体からの１又はそれ以上の個々のＶ領域配列セグメントを、１又はそれ以上のヒト抗体配列からの相当する配列セグメントで置換することによる、可変領域配列の突然変異のための新規な方法を含む。具体的には、ＣＤＲ領域と、又はＣＤＲ領域内でオーバーラップするセグメントを、様々な長さのセグメントを含むその他のヒト抗体からの１又はそれ以上の代替セグメントによって置換することができる。本発明の範囲内は、特異的セグメントは、関連する特性を有するヒト抗体から、例えば、同じ抗原に結合する抗体から、又は、関連する特性を有する非ヒト抗体から、又は、関連する配列を有する非ヒト抗体の機能にとって重要である、ある種のキーアミノ酸を保持する配列セグメントを有するヒト抗体から、といった選択したリード抗体まで含む。このような突然変異の影響を受ける１又はそれ以上の合成ヒト抗体をスクリーニングして、特性を改善する。
【００２０】
選択的ステップ（６）については、リード合成ヒト抗体の選択後、必要であれば、Ｔ細胞エピトープを回避する代替セグメントでＴ細胞エピトープに寄与、又はＴ細胞エピトープをコードするＶ領域セグメントを交換することによって、Ｔ細胞エピトープが制限又は回避される。このようなＴ細胞エピトープは、ある範囲の方法によって検出することができる。例えば、合成Ｖ領域配列の１又はそれ以上の座に相当するペプチドを合成して、Ｔ細胞アッセイ試験をして、Ｔ細胞エピトープの存在を決定することができる。一般的に、このようなペプチドは、長さが１５アミノ酸であり、接触領域がより長い配列を試験することが望ましく、１２アミノ酸オーバーラップを有する１５マー等の配列からオーバーラップペプチドを用いる。Ｔ細胞エピトープの検出については、様々なＴ細胞アッセイの範囲を、サイトカイン放出、増殖（例えば、３Ｈ−チミジンの摂取によって）、Ｃａ２＋フラックス、表面マーカ発現、遺伝子転写等のＣＤ４＋Ｔ細胞の活性又は増殖の測定に用いることができる。
【００２１】
代替的に、合成Ｖ領域配列に相当するオーバーラップペプチドは、インビトロ法又はインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法を用いて分析し、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するいずれの場合も、潜在的なＴ細胞エピトープ、即ち、Ｔ細胞反応を誘発するＭＨＣ結合ペプチドを決定する。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法は、ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ結合相互作用のモデリングを含む方法と、ＭＨＣクラスＩＩに結合する一般的なモチーフの同定を含む方法と、ペプチド又は公知のインビトロＭＨＣ結合特性を有するペプチド内での特異的アミノ酸のデータベースを用いる方法とを含む。合成Ｖ領域配列からのより長いペプチドの生成、又は合成Ｖ領域配列を含む全抗体を生成して、例えば、ＭＨＣ−ペプチドテトラマによって、又は公知のヒトＴ細胞エピトープのデータベースに提案されている又は構成された配列を調べることによって、Ｔ細胞アッセイ中又はＭＨＣ結合アッセイ中の合成Ｖ領域配列を試験するステップ等のその他の方法を用いることができる。合成ヒトＶ領域のＴ細胞エピトープの回避は、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの回避、又はＭＨＣクラスＩＩへのペプチドの結合を固定する特定のアミノ酸の回避によっても補助することができる。１又はそれ以上のリード合成ヒト抗体からのＴ細胞エピトープの回避のための好ましい方法では、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法を最初に適用して、潜在的なＴ細胞エピトープについての合成ヒト抗体Ｖ領域を分析し、これらが同定される場合、ヒトＶＨ又はＶＬ配列の新しいセグメントを導入して、これらのエピトープを回避し、新しいＴ細胞エピトープの導入を回避する。
【００２２】
新しいヒトＶ領域セグメントのこのような導入と、所望の特性について、このように修飾したリード合成ヒト抗体の再スクリーニングの後に、１又はそれ以上の最終リード合成ヒトＶ領域を、一般的に、１５から４５アミノ酸の長さのオーバーラップペプチド、例えば、合成ヒト領域配列（全Ｖ領域又はこれらの一部分）からの１２アミノ酸オーバーラップしている１５マーペプチドを試験するステップによって、又は、ヒトＴ細胞アッセイで、直接的に全合成ヒト抗体を試験するステップによって、ヒトＴ細胞アッセイで更に試験することができる。全抗体に対してＴ細胞活性を直接試験できるようにする全合成ヒト抗体を試験するＴ細胞アッセイを用いた最終分析が好ましい。
【００２３】
本発明の第２の好ましい方法「Ｂ」では、合成ヒト抗体のライブラリを、所望の特性を有する１又はそれ以上の参照抗体からの所望のアミノ酸を含むように生成する。この方法は、次の７ステップ；
（１）１又はそれ以上の参照抗体の配列を分析するステップと、
（２）合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子を設計するステップと、
（３）（選択的に）Ｔ細胞エピトープを回避するステップと、
（４）合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子をクローニングするステップと、
（５）合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子を発現するステップと、
（６）所望の特性を有する複合抗体をスクリーニングして選択するステップと、
（７）Ｔ細胞エピトープの最適な回避を含むリード複合抗体を最適化するステップと、
を含む。
【００２４】
ステップ（１）では、典型的な参照抗体は、ヒト型の抗体中の所望の特性及び／又は結合特異性を有する齧歯類、特にマウスである。１又はそれ以上の参照抗体Ｖ領域配列が入手できる場合、これらの配列を分析してＣＤＲの配列を決定し、結合特性等の抗体の所望の特性に重要であるアミノ酸を同定する。参照抗体については、例えば、参照Ｖ領域配列の同種のその他の配列とのアラインメントによってこのような分析を実施する。また、参照抗体が非ヒト、ヒトＶ領域配列である場合も、このような分析を行う。例えば、プログラムＣＬＵＳＴＡＬ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１９９４）ｐ４６７３−８０）を用いて、このようなアラインメントを実施する。このようなアラインメントは、参照抗体のＶ領域及び相同性ｖ領域ファミリィ中の異常又は微量アミノ酸を同定することができる。加えて、ＣＤＲのカノニカル構造等の保存Ｖ領域構造を、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．：Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（２０００）２３５−２４２）を用いて同定することができる。加えて、構造が知られていない場合、ＭＯＤＥＬＬＥＲ（Ｓａｌｉ ａｎｄ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４（１９９３）ｐ７７９−８１５）等のモデリングソフトウエアを用いて、参照抗体可変領域をモデリングし、いくつかの場合では、抗体−抗原相互作用のモデルを生成することができる。参照抗体Ｖ領域のこのような分析は、合成ヒト抗体についてのヒトＶ領域配列のセグメントの選択を導くのに用いる。
【００２５】
ステップ（２）については、合成ヒト抗体の所望の特性に重要であるアミノ酸を決定して、これらのアミノ酸のいくつか又は全てを含むように、ヒトＶ領域配列のセグメントを選択する。合成ヒト抗体の特性についてのこのようなセグメントの効果が不明確である特定の座に一般的な１又はそれ以上の代替ヒトＶ領域セグメントを有する選択されたセグメントを含む合成ヒトＶ領域配列のライブラリがこれによって設計される。このような合成ヒト抗体配列は、その他のヒト抗体配列と保存構造とのアラインメントによって参照抗体で更に分析することができ、加えて、合成ヒト抗体Ｖ領域のこの構造の更なるモデリングを行って、合成ヒト抗体に用いられるヒトＶ領域セグメントの組み合わせを、所望のように精製し、合成Ｖ領域内でのタンパク質構造、分子間及び分子内相互作用における欠陥、及び重要なアミノ酸の不正確な構造配向を回避する。
【００２６】
選択的ステップ（３）については、セグメント選択の付加的基準として、最終合成ヒトＶ領域のＴ細胞エピトープを制限又は回避するこれらのセグメント又はセグメントの組み合わせが選択される。Ｔ細胞エピトープをインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）又はインビトロ法を用いて、好ましくは、合成ヒトＶ領域配列を設計する段階でインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法を用いて、上述した方法Ａ、ステップ（６）に記載した方法によって分析する。
【００２７】
ステップ（４）については、合成ヒト配列のライブラリを設計して、次いで、合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子を、好ましくは合成オリゴヌクレオチドを用いて生成する。典型的には、Ｖ領域配列のより長いセグメントをコードする合成オリゴヌクレオチドが、配列の代替セグメントをコードするオリゴヌクレオチドの混合物に結紮して、合成ヒトＶ領域のライブラリの様々な員を生成する。代替として、合成ヒトＶ領域のライブラリの各員は、特異的ヒトＶ領域の配列をコードするオリゴヌクレオチドを部分的に用いて個別に生成する。代替として、合成Ｖ領域は、既存のヒトＶＨ及びＶＬ遺伝子をテンプレートとして用いて、又は、テンプレートとして１又はそれ以上の参照抗体Ｖ領域遺伝子を用いて、オーバーラップＰＣＲ、又は他の増幅技術等のその他の方法によってアセンブルされる。
【００２８】
方法Ｂについてのステップ（５）及び（６）は、方法Ａ、ステップ（４）及び（５）に記載されているのと同様である。
【００２９】
選択的なステップ（７）は、方法Ａ、ステップ（６）と同様に用いられ、リード合成ヒト抗体でＴ細胞エピトープの更なる回避が要求される。全抗体からのＴ細胞活性について直接試験することを可能にする全合成ヒト抗体を試験するＴ細胞アッセイを用いた最終分析が好ましい。
【００３０】
方法Ａ及びＢに加えて、合成ヒト抗体を作成して試験し、このような抗体の特性を最適化するその他の方法があることは、当業者に理解されよう。本発明の合成ヒト抗体は新規であり、Ｖ領域の全ヒト起源の結果として、非ヒト配列を含むその他の抗体よりもヒトの免疫原性が低くなくてはならない。また、合成ヒト抗体の追加の選択的特徴、即ち、Ｔ細胞エピトープの回避及び／又はＴｒエピトープの付加は、より低い免疫原性に寄与する。より低い免疫原性の目的は、例えば、源ヒト抗体中の配列位置と異なる複合抗体の配列位置にセグメントを含む合成ヒト抗体、ヒトＶ領域配列のセグメントの部分的組み込みのみを有する複合抗体、非ヒト配列のセグメントを有する複合抗体、又は、例えば、抗体に対する結合親和性を増加する、又はＴ細胞エピトープを避けるように突然変異したヒト配列を有する複合抗体等の全ヒト配列セグメントの無いＶ領域を含む、より好ましくない複合抗体を用いて達成することができることは、当業者に理解されるであろう。
【００３１】
合成ヒト抗体内でのＶ領域配列セグメント及びこれらの組み合わせを選択して、上記のようなＴ細胞エピトープの選択的回避を含む基準範囲を満たすことが理解されよう。例えば、ヒトＶ領域配列のセグメント及びこれらの組み合わせは、Ｂ細胞エピトープ及びＭＨＣクラスＩ−制限エピトープ等のその他のエピトープの回避、複合抗体の発現に有害であるアミノ酸配列の回避、Ｎ−グリコシル化等の複合抗体の不適切な修飾を導く配列の回避、ヘルパーＴ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープ（例えば、ワクチンの使用）の包含等のある種の機能の包含、１又はそれ以上の表面リシン残渣等のその他の部分への連続した結合、及びその他の基準範囲用に選択することができる。
【００３２】
また、ヒトに加えて、その他の種由来のＶ領域セグメント全体又は一部を有する複合抗体を生成することができ、これも本発明の範囲内であると考えるべきであることは、当業者に理解されよう。例えば、マウスの研究用に、マウス起源のＶ領域配列セグメントの全体又は一部を具える合成マウス抗体を生成することができる。
【００３３】
また、本発明は、抗体以外のタンパク質に適用し、治療用途には、このようなタンパク質（ここでは、「合成タンパク質」という）は、最終タンパク質分子内で、ヒトタンパク質からのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントを結合する。
【００３４】
従って、更なる態様では、本発明は、アミノ酸配列の１又はそれ以上のセグメントの挿入によって改善した免疫原性を有する修飾タンパク質を提供する。
【００３５】
タンパク質に関して、用語「セグメント」は、タンパク質分子内で見出される隣接するアミノ酸配列をいい、このようなセグメントは、２から２５０アミノ酸長のサイズの範囲である。治療用には、本発明の合成タンパク質は、通常、合成タンパク質内で様々なヒトタンパク質からのアミノ酸配列の２又はそれ以上を結合する。特に、本発明は、全体が２又はそれ以上のヒトタンパク質からの配列のセグメントからなる挿入を有する合成タンパク質に関する。ヒトタンパク質が合成タンパク質に対して相同で、又は合成タンパク質の領域に対して相同な領域で存在する場合、源ヒトタンパク質の配列位置に相当する合成タンパク質配列のセグメントを用いることができる。例えば、合成タンパク質配列のアミノ酸１から１０は、源ヒトタンパク質のアミノ酸１から１０に由来する。代替として、ヒトタンパク質配列中の配列位置にあるヒトタンパク質配列のセグメントは、源ヒトタンパク質の配列位置に関わりない合成タンパク質中のあらゆる配列位置にある合成タンパク質に配置されていてもよい。源ヒトタンパク質は、例えば、ヒトタンパク質配列のデータベースで提供されるようなあらゆる現存のヒトタンパク質アミノ酸配列であり、ヒトタンパク質の天然の突然変異形又は転位形、及び生殖細胞系と異なるその他の変異、人工的に構成されたヒト由来タンパク質からの配列、及び相当するタンパク質が発現するか、或いは発現しないヒト遺伝子又はＲＮＡ由来の配列が含まれる。
【００３６】
本発明のこの態様の好ましい実施例では、治療用合成タンパク質は、最終合成タンパク質中のヒトＴ細胞エピトープを制限又は回避する組み合わせのヒトタンパク質配列セグメントを結合又は挿入することによって構成される。合成タンパク質に適用される本発明の好ましい態様は、ヒトタンパク質配列セグメントの挿入によって非ヒトタンパク質等の現存の参照タンパク質を修飾して、最終合成タンパク質のＴ細胞エピトープを制限又は回避することである。
【００３７】
合成タンパク質を生成する本発明の好ましい方法では、合成ヒトタンパク質のライブラリを生成して、Ｔ細胞エピトープ不在等の所望の特性を有する１又はそれ以上の参照タンパク質からの所望のアミノ酸を含めるようにしている。この方法は、次の７ステップを含む；
（１）Ｔ細胞エピトープの選択的分析を含む１又はそれ以上の参照タンパク質の配列分析をするステップと、
（２）合成タンパク質遺伝子を設計するステップと、
（３）Ｔ細胞エピトープを（選択的に）回避するステップと、
（４）合成タンパク質遺伝子をクローニングするステップと、
（５）合成タンパク質遺伝子を発現させるステップと、
（６）スクリーニングを行い、所望の特性を有する合成タンパク質を選択するステップと、
（７）Ｔ細胞エピトープの選択的回避を含むリード合成タンパク質を最適化するステップ。
【００３８】
ステップ（１）では、典型的な参照タンパク質は、合成タンパク質で所望される特性を有する非ヒトである。治療用途には、典型的に、合成タンパク質の免疫原性の低減又は除去が目的となる。１又はそれ以上の参照タンパク質配列が入手可能である場合、これらはタンパク質の所望の特性に重要であるアミノ酸を同定するために分析される。加えて、参照タンパク質のあらゆる公知の構造を分析することができ、又は、代替的に、モデル化ソフトウエアを用いて、構造をモデル化することができる。種間又は種内のどちらかの参照タンパク質の相同体が入手できる場合、時に、これらを用いて、配列差の関係と相同体間の特性の差の関係を決定することができる。タンパク質が別の分子と相互作用する場合、この相互作用のモデルを、生成し、相互作用に重要なアミノ酸を決定することができる。ステップ１への選択的付加として、特に、上記の合成ヒト抗体について詳細に述べているようなインビトロヒトＴ細胞アッセイを用いて、参照タンパク質中のＴ細胞エピトープの配列ロケーションが決定される。代替として、Ｔ細胞エピトープを分析するためのインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法を用いることができる。参照タンパク質のこのような分析を用いて、合成タンパク質用に選択されたヒトタンパク質配列のセグメントに導く。参照タンパク質、特に非ヒトと比較して免疫原性の低減又は除去が目的である合成タンパク質については、一般的に、Ｔ細胞エピトープのロケーションに相当する１又はそれ以上のヒト配列セグメントが、Ｔ細胞エピトープ無しの他のロケーションからの参照タンパク質からの配列のセグメントと組み合わせて合成タンパク質中に用いられる。
【００３９】
ステップ（２）については、合成タンパク質の所望の特性に重要であるアミノ酸を決定して、次いで、これらのアミノ酸のいくつか又は全てを含むように、タンパク質配列のセグメントが選択される。これによって、典型的に、特定の座で、１又はそれ以上の代替ヒトタンパク質セグメントを有する選択されたセグメントを含む合成ヒトタンパク質配列のライブラリが設計される。合成タンパク質の特性のこのようなセグメントの効果は、不明である。このような合成タンパク質配列は、基準タンパク質を伴っていれば、任意の相同体と整列させることによって、又は合成タンパク質の構造のモデル化によって、又は、タンパク質構造の欠陥や重要なアミノ酸の不正確な構造配向を回避するために合成ヒトタンパク質に用いられるヒトタンパク質セグメントの組み合わせを、必要に応じて精製するためにその他の分析を行うことによって、更に分析することができる。
【００４０】
選択的ステップ（３）について、セグメントの選択用の追加基準又は基準のみとして、最終合成タンパク質中のＴ細胞エピトープを制限又は回避するこれらのセグメント、又はセグメントの組み合わせが選択される。Ｔ細胞エピトープを、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）又はインビトロ法を用いて上記の合成ヒト抗体用に記載された方法によって分析する。
【００４１】
ステップ（４）については、合成タンパク質のライブラリを設計して、次いで、合成タンパク質遺伝子を、好ましくは、合成オリゴヌクレオチドを用いて生成する。典型的には、タンパク質配列のより長いセグメントをコードする合成オリゴヌクレオチドが、配列の代替セグメントをコードして合成タンパク質のライブラリの様々な員を生成するオリゴヌクレオチドの混合物に結紮する。代替的に、合成タンパク質のライブラリの各員が、特異的合成タンパク質の配列をコードするオリゴヌクレオチドを用いて部分的に生成される。代替として、合成タンパク質は、オーバーラップしているＰＣＲ、又は、現存のヒトタンパク質遺伝子をテンプレートとして用いた、又は、１又はそれ以上の参照タンパク質遺伝子をテンプレートとして用いたその他の増幅技術等の他の方法によってアセンブルすることができる。
【００４２】
ステップ（５）では、合成タンパク質のライブラリのスクリーニングは、通常、１又はそれ以上の合成タンパク質の所望の特性用である。多くのスクリーニング方法が当業者に知られており、これらの方法の選択は、合成タンパク質及びタンパク質機能の発現の形に依存する。スクリーニング方法は、固相上のこのような員のライブラリ又はプールの個別の員を固定するステップから、溶液相中のライブラリの員をスクリーニングして、もう１つの分子を同定し、これで合成タンパク質を設計して、個別に、又はプールで結合することによって相互作用させる範囲にまで及ぶ。また、スクリーニング方法は、機能的又は生物学的試験を含み、ここでは、細胞増殖、細胞増殖阻害、細胞分化、又は細胞遊走を含むインビトロ試験、又は全有機体のレベルでの合成タンパク質に対する反応、例えば、マウスの血球数又は移植した腫瘍の増殖阻害の変化を測定するステップを含む代替インビボ試験等の、機能的又は生物学的活性を測定する。
【００４３】
ステップ（６）では、所望の特性を有する１又はそれ以上の「リード」合成タンパク質の選択に続いて、選択的に、例えば、酵素の特異的活性を増やすことによって、又はレセプタに対するタンパク質リガンドの結合を増やすことによって、このリードタンパク質の特性を強化することができる。特性の強化は、合成タンパク質配列の突然変異生成によって達成されて、所望の方法で、合成タンパク質の特性を変化させる突然変異が選択される。本発明は、このタンパク質からの１又はそれ以上の個々のタンパク質配列セグメントを１又はそれ以上のヒトタンパク質配列からの配列セグメントで置換することによって、タンパク質配列の突然変異を生成する新規な方法を含む。次いで、このような突然変異生成を行う１又はそれ以上の合成タンパク質をスクリーニングして、特性を強化することができる。
【００４４】
選択的ステップ（７）では、リード合成タンパク質の選択に続いて、所望の場合に、Ｔ細胞エピトープに寄与する、又はこれをコードするタンパク質配列セグメントをＴ細胞エピトープを回避する代替セグメントと交換することによって、Ｔ細胞エピトープを制限又は回避する。このようなＴ細胞エピトープは、ある範囲の方法によって検出される。例えば、合成タンパク質中の１又はそれ以上の座に相当するペプチドを合成し、Ｔ細胞アッセイで試験してＴ細胞エピトープの存在を決定することができる。典型的には、このようなペプチドは、長さ１５アミノ酸であり、１２アミノ酸オーバーラップを有する１５マー等の配列からのオーバーラップペプチドを用いてより長い隣接した配列を試験することが望ましい。代替として、潜在的Ｔ細胞エピトープ、即ち、Ｔ細胞反応を誘発するＭＨＣ結合ペプチドを決定する各場合に、合成タンパク質配列に相当するオーバーラップペプチドを、インビトロ法かインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法のどちらかを用いて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子への結合について分析する。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法は、ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ結合相互作用をモデル化するステップを含む方法と、ＭＨＣクラスＩＩへの結合に一般的なモチーフを同定するステップを含む方法と、公知のインビトロＭＨＣ結合特性を有するペプチド内のペプチド又は特異的アミノ酸のデータベースを用いる方法を含む。合成タンパク質配列又は全合成タンパク質からより長いペプチドを生成する方法、及び、抗原提示細胞上のＴ細胞アッセイ、又はＭＨＣ結合アッセイでこれらを試験する方法等の他の方法を用いることができる。また、合成タンパク質のＴ細胞エピトープの回避は、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの回避によって、又はＭＨＣクラスＩＩへのペプチドの結合をアンカする特異的アミノ酸の回避によって援助される。１又はそれ以上のリード合成タンパク質からＴ細胞エピトープの回避のための好ましい方法では、先ずインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法を適用して、潜在的Ｔ細胞エピトープについての合成タンパク質を分析し、これらが決定されると、ヒトタンパク質配列の新しいセグメントを導入して、これらのエピトープを回避して、新しいＴ細胞エピトープの導入を回避する。所望であれば、Ｔ細胞エピトープを回避する新しいヒトセグメントのこのような導入と、所望の特性についての修飾リード合成タンパク質の再スクリーニングに続いて、１又はそれ以上の最終リード合成タンパク質を、典型的に１５から４５アミノ酸長のオーバーラップペプチド、例えば、合成タンパク質配列（全タンパク質又はこれらの一部分）からの１２アミノ酸オーバーラップした１５マーペプチドを試験することによって、或いは、ヒトＴ細胞アッセイで、直接的に、全合成タンパク質を試験することによって、ヒトＴ細胞アッセイで選択的に試験することができる。全タンパク質からのＴ細胞活性について直接試験することができる全合成タンパク質を試験するＴ細胞アッセイを用いた最終分析が好ましい。
【００４５】
合成タンパク質を作成して試験し、このようなタンパク質の特性を最適化する他の方法があることは、当業者には理解されよう。本発明の合成タンパク質は新規で、治療目的で用いられる場合は、ヒト起源のいくつかの、又は全てのタンパク質配列セグメントは、その他の比較可能な、又は非ヒト配列を含む非ヒト参照タンパク質より、ヒトの免疫原性が少ない峰性タンパク質を提供するべきである。また、合成タンパク質の付加的な選択的特徴、即ち、Ｔ細胞エピトープの回避及び／又はＴｒエピトープの付加も、より低い免疫原性に寄与する。より低い免疫原性の目的は、全ヒト配列の無い合成タンパク質を用いて達成され、また、突然変異して、参照タンパク質に相同する非ヒトタンパク質のＴ細胞エピトープ又はセグメントを除去するヒト配列セグメントを有する合成タンパク質を含むことが、当業者には理解される。Ｔ細胞エピトープの最適な回避を含む基準の範囲を満足するように合成タンパク質内のタンパク質セグメント及びその組み合わせを選択することが理解されよう。例えば、ヒトタンパク質配列のセグメント及びこれらの組み合わせを、Ｂ細胞エピトープ及びＭＨＣクラスＩ−制限エピトープ等のその他のエピトープの回避と、合成タンパク質の発現に有害であるアミノ酸配列の回避と、Ｎ−グリコシル化等の合成タンパク質の不適切な修飾を導く配列の回避と、ヘルパーＴ細胞エピトープ、及び／又はＢ細胞エピトープ（例えば、ワクチン適用）の包含等のある種の機能の包含と、その他の部分への連続した結合と、その他の基準の範囲用に選択することができる。
【００４６】
また、ヒトに加えて、他の種に由来する配列セグメントの全体又は一部分を有する合成タンパク質を生成することができ、これは、本発明の範囲内であると考えるべきである。例えば、マウスの研究では、マウスタンパク質配列セグメントを含む合成タンパク質を生成することができる。また、合成タンパク質が、同種内の相同タンパク質からのその他のタンパク質配列セグメントと結合した１つの種からのタンパク質配列セグメントを含むことができることが理解される。例えば、本発明は、植物型Ｉ ＲＩＰ（リボソーム阻害タンパク質）の構造を含む。ここでＲＩＰは、入手可能な多数の植物型Ｉ ＲＩＰ配列からの配列セグメントを用いてアセンブルされる。このような合成ＲＩＰは、ＲＩＰ活性を保持するであろう配列セグメントの組み合わせを導入することによってアセンブルされ、ヒトに用いる場合には、最終合成配列中のヒトＴ細胞エピトープの回避を含むであろう。
【００４７】
抗体の場合、本発明は、最終タンパク質の１又はそれ以上のその他の特性に更なる改良を行う合成タンパク質のランダムな、セミランダムな、又は直接的な突然変異生成によって、合成タンパク質配列への更なる修飾の選択枝を含む。本発明は、ヒトに用いられるとき、又は薬学的な用途のタンパク質、又は、アレルギィ反応が本発明の組成物の使用によって制限又は除去される食料、合成洗剤、化粧品、及び他の消費者商品の用途のタンパク質等のヒトによって用いられるときに、低い免疫原性を有するタンパク質生成に特に好適である。本発明は、特に非アレルギィ関連エピトープ（例えば、ＴＨ１ Ｔ細胞−誘発エピトープ用のＴＨ２）によって、及び／又はアレルギィ患者の免疫反応を抑制するＴｒエピトープの付加によって除去又は置換されたアレルギィ関連Ｔ細胞エピトープを有するタンパク質を生成することによって、ヒト内での低いアレルギィ性を有するタンパク質の生成に特に好適であることが理解されよう。本発明は、特に、非炎症関連エピトープ（例えば、ＴＨ２ Ｔ細胞誘発エピトープ用のＴＨ１）及び／又は炎症反応を抑制するためのＴｒエピトープの添加によって除去又は置換された炎症関連Ｔ細胞エピトープを有するタンパク質を生成することによって、ヒトの炎症特性を低減するタンパク質を生成するのに特に好適であることが理解されよう。
【００４８】
ここで議論されているように、本発明の修飾／合成タンパク質及び抗体は、病気の治療に有益であり、低い免疫原性を示す。従って、更なる態様で、本発明は、選択的に、１又はそれ以上の薬学的に許容できる賦形剤、担体、又は希釈剤と共に、請求項１から１８のいずれか１項に記載の修飾抗体、抗体結合性フラグメント、又はタンパク質を具える薬学的調製を提供する。
【００４９】
本発明の組成物は、１投与当たり所定量の各活性成分を含む単位投与形で存在する。このような単位は、５−１００ｍｇ／１日の化合物、好ましくは、５−１５ｍｇ／１日、１０−３０ｍｇ／１日、２５−５０ｍｇ／１日、４０−８０ｍｇ／１日、又は６０−１００ｍｇ／１日のいずれかを提供するように構成されている。式Ｉの化合物については、１００−１０００ｍｇ／１日、好ましくは、１００−４００ｍｇ／１日、３００−６００ｍｇ／１日、５００−１０００ｍｇ／１日のいずれかの範囲の投与を提供する。このような投与は、単回投与又は複数回の分散投与で提供することができる。最終的な投与は、もちろん、治療の状態、投与経路、及び患者の年齢、体重、及び状態に依存しており、医師の裁量である。
【００５０】
本発明の組成物は、あらゆる適切な経路、例えば、経口（口腔又は舌下を含む）、直腸、鼻腔、局所（口腔、舌下又は経皮を含む）、経腟、又は非経口（皮下、筋内、静脈、又は皮内）を含む経路による投与用に構成されている。このような調製は、医薬の分野で知られているあらゆる方法、例えば、担体や賦形剤と活性成分を関連させることによって調製することができる。
【００５１】
経口投与に適した医薬調製物は、カプセル又はタブレット；パウダ又は顆粒；水性又は非水性の液体の溶液又は懸濁液；可食発泡体又はホイップ；又は水中油型液体エマルジョン又は油中水型液体エマルジョン等の分散単位として存在している。
【００５２】
経皮投与に適した医薬調製物は、長期間、レシピエントの表皮と密着し続けるように意図した分散パッチとして存在する。例えば、有効成分は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３（６），３１８（１９８６）に一般的に記載されているような、イオントフォレシスによって、パッチから送り込まれる。
【００５３】
局所投与に適した医薬調製物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、パウダ、溶液、ペースト、ジェル、スプレィ、エアロゾル、又はオイルとして調製される。
【００５４】
眼、又はその他の外部組織である、例えば、口及び皮膚への塗布には、この調製物は、局所軟膏又はクリームとして塗布するのが好ましい。軟膏に調製する場合、有効成分を、パラフィン、又は水混和性軟膏ベースのどちらかと共に用いることができる。代替として、有効成分を、水中油型クリームベース又は油中水型ベースのクリームと共に調製するようにしてもよい。
【００５５】
眼への局所投与に適した医薬調製物は、点眼薬を含み、この有効成分を好適な担体、特に水性溶媒に溶解又は懸濁させる。
【００５６】
口内局所投与に適した医薬調製物は、薬用キャンディ、トローチ剤、及び洗口液を含む。
【００５７】
直腸投与に適した医薬調製物は、座薬又は寛腸剤として存在する。
【００５８】
経鼻投与に適合した医薬調製物であって、担体が固体である医薬調製物は、例えば、スナッフで摂取する方法、即ち、鼻腔に近づけたパウダの容器から鼻道を通る素早い吸入によって投与される２０から５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含む。スプレィ式点鼻薬として、又は点鼻薬としての投与に好適な調製物であって、担体が液体である調製物は、水性又は油性溶液の有効成分を含む。
【００５９】
吸入による投与に適した医薬調製物は、様々なタイプの定量加圧エアロゾル、噴霧器、又は吸入器の手段によって生成する細粒粉末又は噴霧を含む。
【００６０】
経腟投与に適した医薬調製物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、発泡体又はスプレィ調製物として存在する。
【００６１】
非経口投与に適した医薬調製物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及び溶質を含む水性及び非水性滅菌注射液；及び、懸濁剤及び増粘剤を含む対象とするレシピエントの血液を用いる等張の調製を行う水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。調製物は、単位投与及び複数投与容器である、例えば、密封アンプル及びバイアルで存在し、また、使用直前に例えば注入用の水といった滅菌液体担体の添加を必要とするのみのフリーズ−ドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵されているものでもよい。即時調合の注射液及び懸濁液は、滅菌パウダ、顆粒、及びタブレットから調製される。
【００６２】
好ましい単位投与調製物は、上記のような有効成分の日用量、又はサブドーズ（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、又はこれらの適切な画分を含むものである。
【００６３】
特に上記した成分に加えて、調製物は、問題の調製物のタイプを考慮したこの分野では従来のものである他の薬剤を含んでいてもよい。例えば、経口投与に好適なものは、香料添加剤を含んでいてもよい。
【００６４】
次の例は、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。図及び表は、以下に述べる例に、次のように関連している；
【００６５】
表１から表３は、１８６×９残渣長ＶＨ ＣＤＲ３（表１）、７７×８残渣長ＶＬ ＣＤＲ３（表２）、及び１５３×１０残渣長ＶＬ ＣＤＲ３（表３）を具える合成ヒト抗体ｓｃＦｖライブラリに用いられるＣＤＲである。
【００６６】
表４は、一次合成ヒト抗ＴＮＦαＶＨ及びＶＬ変異株に用いるヒト配列セグメントである。
【００６７】
表５は、合成ヒト抗ＴＮＦα変異株の活性である。
【００６８】
表６は、ブーガニン変異株のブーガニン及び置換ヒトセグメントの免疫原性ペプチド配列である。
【００６９】
例１−合成ヒト抗−ＨＥＲ２抗体の構造
【００７０】
ヒト可変領域配列セグメントライブラリの作成用に、ある範囲のヒト免疫グロブリンの範囲からのアミノ酸配列を重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）可変領域配列を含むインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）ヒト可変領域配列ライブラリを具える単一データベース内に集めた。配列の源としては、ＮＣＢＩ Ｉｇｂｌａｓｔデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、Ｋａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，５ｔｈ ｅｄ．（１９９１）（後にアップデートされた）），Ｖｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ．ｄｏｃ），Ｇｅｎｂａｎｋ（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１９９７）ｐｌ−６、又はｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓを介した）データベースが挙げられる。用いられた参照抗体可変領域配列は、ハーセプチン（登録商標）として知られているヒト化抗−ＨＥＲ２抗体であった（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ ８９（１９９２）ｐ４２８５，ＵＳ５８２１３３７）。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）ヒト可変領域配列ライブラリからのセグメントを、ハーセプチン（登録商標）可変領域配列の相当するアミノ酸に対する同定用に選択し、結合させて、図１及び図２にそれぞれ示されているような合成ヒトＶＨ及びＶＬ配列を生成した。
【００７１】
組み換えＤＮＡ技術を、この分野で公知の方法と、必要に応じて、これらの方法で用いられる酵素を用いるための供給者の指示を用いて実施した。一般的な方法の源としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌｓ １−３，ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓが挙げられる。また、詳細な実験室方法は、以下の例７に記載されている。ハーセプチン（登録商標）に相当する合成ヒトＶＨ及びＶＬ配列を、各鎖について、完全合成ヒトＶＨ及びＶＬ配列をコードする長さ３０−６０アミノ酸の８つの合成ヌクレオチドを用いて作成した。また、同時に、対照試薬として、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５（Ｈｕｄｚｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９８９年３月）ｐ１１６５−１１７２））のキメラ形を、鎖毎に８つの合成オリゴヌクレオチドを用いて作成した。分離ＶＨ及びＶＬオリゴヌクレオチドを、先ずリン酸化して、等モル比で混合して、サーマルサイクラ内で５分間、９４℃に加熱し、次いで６５℃に冷却して、６５℃で２分間インキュベートした。次いで、４５℃で２分間、３５℃で２分間、２５℃で２分間、４℃で３０分間インキュベートを継続した。更に、オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（英国ペイズリィ所在のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、１４℃で１８時間、結紮した。
【００７２】
Ｋｏｚａｋ配列、リーダーシグナルペプチド（ｌｅａｄｅｒ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）配列及びリーダーイントロン（ｌｅａｄｅｒ ｉｎｔｒｏｎ）を含む５’フランキング配列、及びスプライス座及びイントロン配列（ｉｎｔｒｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む３’フランキング配列をコードする追加のオリゴヌクレオチドを、ＶＨ及びＶＬオリゴヌクレオチド混合物に上記のように加えて、アニールした。合成ヒトＶＨ及びＶＫと、生成した４Ｄ５発現カセットを、プラスミドベクタｐＵＣ１９へＢａｍＨＩフラグメントに対するＨｉｎｄＩＩＩとしてクローニングし、完全なＤＮＡ配列を確認した。これらは、ヒトＩｇＧ１（ＶＨ）又はＫａｐｐａ（ＶＫ）定常領域をそれぞれと、ほ乳類細胞の選択用マーカを含む発現ベクタｐＳＶｇｐｔ及びｐＳＶｈｙｇに転写された。ＤＮＡ配列を確認して、合成ヒトＶＨ及びＶＫと、発現ベクタ中の４Ｄ５ＶＨ及びＶＫを補正した。
【００７３】
抗体発現用主宿細胞株は、ＮＳ０である非免疫グロブリン生成マウス骨髄腫であり、英国ポートン所在のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ８５１１０５０３）から得た。重鎖及び軽鎖発現ベクタをエレクトロポレーションによって、ＮＳ０細胞内に同時遺伝子導入した。ｇｐｔ遺伝子を発現するコロニィは、１０％ウシ胎仔血清、０．８μｇ／ｍｌミコフェノール酸、及び２５０μｇ／ｍｌキサンチンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で選択した。遺伝子導入した細胞クローンは、ヒトＩｇＧについてＥＬＩＳＡによってヒト抗体を生成用にスクリーニングした。細胞株分泌抗体を拡張し、最も高い生成株を選択し、液体窒素中に凝固させた。修飾抗体をＰｒｏｓｅｐ（登録商標）−Ａ（英国ノースアンバーランド所在のＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｌｔｄ社）を用いて精製した。ヒトＩｇＧκ抗体についてＥＬＩＳＡによって、濃度を決定した。
【００７４】
合成ヒト抗体及びキメラ４Ｄ５抗体を、Ｈｕｄｚｉａｋ ｅｔ ａｌ．（同書）によって正確に記載されているように、陰性対照非−Ｈｅｒ−２結合ヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ抗体と共に、ＨＥＲ２＋ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３の増殖の阻害について試験した。この結果（図３）は、合成ヒト抗体及びキメラ４Ｄ５抗体が、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖を阻害において等価な効果を有することを示す。また、図３は、以下のように生成した代替「エピトープ回避」複合抗体についてのデータを示す。
【００７５】
本発明のエピトープ回避オプションを試験するために、合成ヒト重鎖及び軽鎖可変領域の配列を、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ（ｗｗｗ．ｃｓｄ．ａｂｄｎ．ａｃ．ｕｋ／〜ｇｊｌｋ／ＭＨＣ−ｔｈｒｅａｄ）を用いて非自己ヒトＭＨＣクラスＩＩバインダについて分析した。このソフトウエアは、ペプチドのアミノ酸側鎖と、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝内の特定の結合ポケットの間の好適な相互作用を予測する。合成ヒト重鎖及び軽鎖可変配列からの全オーバーラップ１３マーは、ＭＨＣクラスＩＩアロタイプのデータベースを通り、ＭＨＣクラスＩＩ分子との結合、及び、相互作用に基づいて得た。ＭＨＣクラスＩＩを結合すると予想されるペプチドは、ＶＨの残渣１６及び６７、及びＶＬの９及び４４で始まる１３２マーであった。結果として、ヒト可変領域配列ライブラリの新しいセグメントが、図１の合成ヒト配列で用いられるセグメントの代わりに選択され、アミノ酸交換ＶＨ１８Ｌ−Ａ／６９Ｉ−Ｇ；ＶＬ１１Ｌ−Ａ、４６Ｌ−Ａを導入した。相当する「エピトープ回避」合成ヒト抗体（「ＥＡＣＨＡＢ」＝Ｅｐｉｔｏｐｅ Ａｖｏｉｄｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ ＡｎｔｉＢｏｄｙ）は、図１の配列に相当する抗体を作るのに用いられるいくつかのオリゴヌクレオチドを置換することによって作られ、ＥＡＣＨＡＢは上記の方法で作られ、標準合成ヒト抗体と同等であるＳＫ−ＢＲ−５の増殖の阻害を示すために試験した（図３）。このデータは、合成ヒト抗体が、対照キメラ抗−ＨＥＲ−２抗体と等しい効果をもって成功裏に構成されて、ＥＡＣＨＡＢバージョンの合成ヒト抗体が、効果の損失すること無く生成され得ることを示している。
【００７６】
例２−合成ヒト抗−ＨＥＲ２抗体の免疫原性
【００７７】
Ｔ細胞増殖アッセイを実施して、合成ヒト抗−ＨＥＲ２抗体、ＥＡＣＨＡＢ変異株及びキメラ４Ｄ５抗体の免疫原性を比較した（例１参照）。これらの抗体は、血清の入っていない、動物由来成分の入っていない、タンパク質の入っていない培地、ＨｙＱ（登録商標）ＬＳ１０００脂質補給（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃａｔ Ｎｏ：ＳＨ３０５５４）及びピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ Ｎｏ：１１３６０−０３９）を補充したＨｙＣｌｏｎｅ ＨｙＱ（登録商標）ＡＤＣＦ−Ｍａｂ（商標）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃａｔ Ｎｏ：Ｃａｔ ｎｏ：ＳＨ３０３４９）中で増殖したＮＳ０細胞から調製された。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（ＰＤｌＯカラム）上の緩衝液を５０ｍＭのＭＥＳｐＨ６に交換後、抗体は、陽イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ−Ｓ １０／１０）をそれぞれ通り、塩化ナトリウム勾配（０から０．５Ｍ）で溶出した。次いで、抗体含有画分を、ＰＢＳのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００保存カラム（ＸＫ１６／６０）ランに塗布した。ピーク画分を貯留して、４℃で保存した。抗体濃度は、ヒトＩｇＧについてのＥＬＩＳＡによって決定した。
【００７８】
健康なヒトのドナー血液から単離し、液体窒素で凍結保存したＰＢＭＣ（末梢血単核球）を用いて、免疫原性分析を実施した。各ドナーは、Ａｌｌｓｅｔ（商標）ＰＣＲベース組織分類キット（英国Ｗｉｒｒａｌ所在のＤｙｎａｌ社）を用いて組織分類を行い、２０人の健康なドナーを、個人ＭＨＣハプロタイプに従って選択した。ＡＩＭ Ｖ（英国ペイズリィ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の４×１０６ＰＢＭＣを含有する２ｍｌバルク培地を試験ペプチド（５μＭ最終濃度）を有する２４ウエル組織培養プレートでインキュベートし、バルク培地を緩やかに再懸濁し、ＰＢＭＣの３倍の１００μｌのサンプルをＵ−底９６ウエルプレートに移すことによって、５日、６日、７日、及び８日目に増殖を評価した。Ｔｏｍｔｅｃ Ｍａｃｈ ＩＩＩプレートハーベスタ（英国所在のＲｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、培地をグラスファイバフィルタマット上に採取し、カウント毎分（ｃｐｍ）値を、Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ ＴｒｉＬｕｘプレートリーダ（パララックス高効率計数プロトコルを用いて）を用いてシンチレーション計数によって決定した。各試験抗体について、刺激インデックス（ＳＩ）を、試験抗体のカウント毎分（ｃｐｍ）：顕著なＴ細胞エピトープ反応と考えられるＳＩ＞２を有する陰性対照のｃｐｍの率として計算した。この結果は、顕著な増殖性反応キメラ（ｃｈｉｍａｅｒｉｃ）４Ｄ５抗体が、試験された２０人の健康的なドナーのうちの５人（２５％）の試験された４日間の増殖（２より大きいＳＩ）の少なくとも１日に顕著な増殖性反応を誘発し、合成ヒト抗−ＨＥＲ２抗体が、２０人のドナーのうち３人（１５％）にＳＩ＞２を誘発するが、ＥＡＣＨＡＢ抗−ＨＥＲ２抗体は、２０人のドナーのうちの誰にもＳＩ＞２を誘発しない（０％）ことを示した。これらの結果は、キメラ４Ｄ５＞合成ヒト抗−ＨＥＲ２抗体＞ＥＡＣＨＡＢ抗−ＨＥＲ２の順番を示し、後者が試験されたいずれのドナー血液サンプルに免疫原性の証拠がないことを示している。
【００７９】
例３−合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体の構造
【００８０】
シアル化Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原に特異的な合成ヒト抗体を、参照抗体可変領域配列として、ヒト化３Ｓ１９３抗体を用いて、例１で記載されているように構成した（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０（２０００）ｐ３２５４−３２６１，ＵＳ５８７４０６０）。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）ヒト可変領域配列ライブラリからのセグメントを、ヒト化３Ｓ１９３可変領域配列中の相当するアミノ酸に対する同定用に選択し、結合して図４及び５それぞれに示されているような合成ヒトＶＨ及びＶＬ配列を生成した。同時に、参照キメラ抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を、参照Ｖ領域配列から作った。ヒトＩｇＧ１（ＶＨ）及びＫａｐｐａ（ＶＫ）定常領域を、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体と、キメラ参照抗体の双方に用いて、抗体を、ＵＳ５８７４０６０に記載されているような合成Ｌｅｗｉｓ Ｙ−ＨＳＡ複合体に対するＥＬＩＳＡによって試験した。このデータは、ＵＳ５８７４０６０のデータと一致する０．１５μｇ／ｍｌ合成ヒト抗体と比較したアッセイの結合シグナルを与えるための０．１μｇ／ｍｌキメラ抗体の最小濃度を示した。
【００８１】
例４−合成ヒト抗−ＩｇＥ抗体の構造
【００８２】
合成ヒト抗−ＩｇＥ抗体を、参照抗体可変領域配列として、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１（５）（１９９３）ｐ２６２３−２６３２）として知られているヒト化抗−ＩｇＥ抗体を用いて、例１に記載されているように構成した。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）ヒト可変配列ライブラリからのセグメントを、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）可変領域配列の相当する相当するアミノ酸に対する同定用に選択し、結合して図６及び７各々に示されているような合成ヒトＶＨ及びＶＬ配列を生成した。同時に、参照キメラ抗−ＩｇＥ抗体を、参照Ｖ領域配列から作った。ヒトＩｇＧ１（ＶＨ）及びＫａｐｐａ（ＶＫ）定常領域を、合成ヒト抗−ＩｇＥ抗体とキメラ参照抗体の双方に用いた。
【００８３】
Ｆａｂの特異性を、表面プラズモン共鳴によって更に特徴付けた（瑞国Ｕｐｐｓａｌａ所在のＢｉａｃｏｒｅ ＡＢ社製ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００）。組み換えヒトＩｇＥ Ｆａｂを、Ｆｌｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５（２０００）ｐ３８４９−３８５９によって記載されている通り生成した。試験抗体を精製し、ＮＨＳ／ＥＤＣ ｋｉｔ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いてＣＭチップのフロー電池に固定して、キメラ抗−ＩｇＥ用の２０１０ＲＵ、及び合成ヒト抗−ＩｇＥ用の２０２９ＲＵを得た。Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中の１０及び２５ｎＭ組み換えヒトＩｇＥ Ｆａｂを、１０分間５μｌ／ｍｉｎの流量で試験抗体を除いた。この結果は、１０及び２５ｎＭのＩｇＥ Ｆａｂの双方について、等価ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）曲線が、キメラ抗−ＩｇＥについて検出され、合成ヒト抗−ＩｇＥ抗体は、後者が、参照抗−ＩｇＥ抗体と等価な結合効果を成功裏に達成することを示した。
【００８４】
例５−合成ヒトｓｃＦｖライブラリの生成及びスクリーニング
【００８５】
ヒトｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）の初期構造についての戦略は、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，２９６（２０００）５７−８６に詳細に記載されているように、７人分のヒトＶＨと、４人分のヒトＶＬ（ｋａｐｐａ）遺伝子を構成することであり、ヒト可変領域のデータベースから多数のＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ３セグメントにクローニングすることであった。このＣＤＲ３のリストは、ＶＨ ＣＤＲ３については表１に、８つのアミノ酸のＶＬ ＣＤＲ３については表２に、１０のアミノ酸のＶＬ ＣＤＲ３については表３に示されている。マスターＶＨ及びＶＬ構造については、フレームワーク３の端までのＶＨ及びＶＬをコードする６つのオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドが、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，同書に詳細に記載されているように合成され、繰り返しＰＣＲ（Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ ａｎｄ Ｐｅａｒｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５（１９９２）８２７−８２９）を行った。これらは、ＥｃｏＲＶ消化ｐＺｅｒｏ−１ベクタ（英国ペイズリィ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に結紮された。双方ともが開始時に４Ｄ５ ＣＤＲ３を有するＣＨ１及びＣ Ｋａｐｐａを添加するため（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０（１９９２）１６３−１６７）、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，同書のプロトコルを、ＶＨ−ＣＨ１ＳａｐＩ−ＥｃｏＲＩと、ＶＬ−ｋａｐｐａ Ｎｓｉ−ＳｈＩフラグメントが、ＥｃｏＲＶ消化ｐＺｅｒｏ−１にクローニングされた平滑末端であることを除いて行った。
【００８６】
表１
【００８７】
表２
【００８８】
表３
【００８９】
ＣＤＲ３の挿入について、プラス鎖から表Ｈの各ＣＤＲ３をコードする単一オリゴヌクレオチドを、コンセンサスＶＨ及びＶＬ遺伝子にアニーリングするために各端に加えられた１２つの相同性ヌクレオチドで合成した。これらのＣＤＲ配列に加えて、抗体Ｅ２５からのＣＤＲ（例４参照）が含まれていた。これらのプライマを拡張し、二次プライマを加えて、ＶＨについて５’ＮｏｔＩ−３’ＸｂａＩ座、ＶＬについて５’ＳｐｅＩ−３’ＢａｍＨＩを、ＶＨ及びＶＬ遺伝子（Ｃ領域のない）のＮ及びＣ末端のすぐ隣に導入した。クローニングに先立って、更なる相補プライマ対を用いて、ＶＨとＶＬの間にリンカ配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を挿入し、一方、ＸｂａＩ及びＳｐｅＩ座は維持した。フルサイズのＶＨ−リンカ−ＶＬフラグメントは、ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで消化され、ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋／−）（蘭国アムステルダム所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にクローニングした。
【００９０】
個々のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローンを採取し、国際公開番号第ＷＯ９９／１１７７７号に記載されているように、プラスミドＤＮＡを精製して９６ウエルプレート内にロボット制御で分注した。次いで、国際公開番号第ＷＯ９９／１１７７７号に記載されているように、ＤＮＡを、ｔＲＮＡ−ビオチニル−リシンを含有するＩＶＴＴにさらし、ストレプトアビジン表面に更にロボット制御で配置した。次いで、１０，０００の独立したクローンの固定開始ｓｃＦｖライブラリを組み換えヒトＩｇＥ Ｆａｂでインキュベートすることによってスクリーニングした（例４参照）。ウエルを室温で１時間、ＰＢＳ／３％ＢＳＡでブロックし、ＰＢＳで３回洗浄して、ＰＢＳ／３％ＢＳＡの５μｇ／ｍｌヒトＩｇＥ Ｆａｂで１時間、処理した。次いで、ウエルを、ＰＢＳで更に３回洗浄し、ＰＢＳ／３％ＢＳＡの５μｇ／ｍｌアルカリ性ホスフォターゼ同定キメラ抗−ＩｇＥ（例４）で１時間半、処理した。ウエルを、ＰＢＳで５回、更に洗浄し、可視化用に基質５−ブロモ−１−クロロ−３−インドリルホスファート及びニトロブルーテトラゾリウム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いて染色現像した。９６００ウエルに１つの頻度で観察される強いシグナルは、Ｅ２５ ＣＤＲ３’ｓを含有するＶＨとＶＬの対双方から誘導されることを示した。
【００９１】
例６−合成マウス抗−ＴＮＦα抗体の構造
【００９２】
マウス可変領域配列ライブラリを、ＮＣＢＩ Ｉｇｂｌａｓｔ、Ｋａｂａｔ及びＧｅｎｂａｎｋデータベースを用いてヒトライブラリについて、例１に記載されているように作成した。用いた参照抗体可変領域配列は、マウスｃＡ２抗体の可変領域を用いるＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（Ｌｅ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ６２７７９６９）として知られているキメラ抗−ＴＮＦα抗体であった。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）マウス可変領域配列ライブラリからのセグメントは、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）可変領域の部分的に相当するアミノ酸から選択されるが、例１で測定される非−自己ヒトＭＨＣクラスＩＩバインダの形の配列のヒトＴ細胞エピトープを回避するように設計された変異体を含んでいた。キメラ抗体に用いた配列と比較した合成マウスＶＨ及びＶＬ配列を図８に示し、これは、合成マウス抗体のエピトープ回避のためのセグメント選択の結果として、２つの抗体間のＶＨとＶＬそれぞれの９及び１６アミノ酸の差を示す。
【００９３】
合成マウス及びキメラ抗−ＴＮＦα抗体を、例１に記載されているように生成した。標準ＥＬＩＳＡの固定ヒトＴＮＦαに結合する精製抗体の比較（国際公開番号第ＷＯ０３／０４２２４７Ａ２号に記載されている）は、合成マウス抗体が、キメラ抗−ＴＮＦα抗体の完全な結合能力を保持することを示した（図９）。次いで、これらの抗体の免疫原性を、Ｔ細胞アッセイ用の２４ＨＬＡ−ＤＲ型ヒト血液サンプルを用いて、例２で記載されているように比較した。この結果は、２４人のドナーの誰もＳＩ＞２を誘発しない（０％）合成マウス抗−ＴＮＦα抗体と比較して、キメラ抗−ＴＮＦα抗体が、試験した２４人の健康なドナーのうち９人（３７．５％）に顕著な増殖反応（ＳＩが２より大きい）を誘発することを示した。これらの結果は、ヒトＴ細胞エピトープを回避するためのこのようなセグメントの選択でマウスＶ領域から完全に取り出される可変領域配列のセグメントを具える合成マウス抗体が、なんらエピトープ回避方法を用いることなく、相当するキメラ抗体によって表示されるヒトＴ細胞アッセイの免疫原性を除去することができることを示した。
【００９４】
例７：合成ヒト抗−ＴＮＦα抗体の構造
【００９５】
ヒトＴＮＦαに対する抗体Ａ２の参照マウス可変領域重鎖及び軽鎖配列を、米国特許第５６５６２７２号から得た（図１０、各ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ１及びＮｏ．２）。構造モデルを、マウス参照可変領域から作成し、ＣＤＲ確認に欠かせないアミノ酸とＣＤＲに近いパッキングを、ＣＤＲ（＜３Å）からの距離に基づいて同定した。重要ではあるが、余り気にかけなくてもよい残渣中、ＣＤＲ（＞３Å ＜６Å）からの距離と、ＣＤＲに近いより重要な残渣のパッキングの影響に基づいて同定した。更なる残渣セットを、マウス抗体配列、即ち、１％より少ない頻度で特定の座で見出されるアミノ酸の生成頻度に基づいて同定した。
【００９６】
これらの残渣のできるだけ多くに含まれるヒトＶ領域配列セグメントを選択して（表４）、完全な長さのＶＨ及びＶＬ配列を作成した。同定された構造上重要な全ての残渣を含むようにこれらの配列に代替を作成し、エピトープ回避及び合成ヒト抗体設計用のテンプレートとしての機能する配列を作成した。各合成ＶＨ及びＶＬについての好ましい配列を、参照マウス抗体からの重要な残渣を含むように設計した。これらの可変重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を、図１１及び図１２のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３及びＮｏ．４にそれぞれ示す。
【００９７】
表４
（ａ）重鎖
【００９８】
（ｂ）軽鎖
【００９９】
合成重鎖及び軽鎖可変領域配列を、様々なインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法（例えば、Ｐｒｏｐｒｅｄ［ｈｔｔｐ：／／ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ［ｗｗｗ．ｃｓｄ．ａｂｄｎ．ａｃ．ｕｋ／〜ｇｊｌｋ／ＭＨＣ−ｔｈｒｅａｄ］、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）、ＭＨＣｐｒｅｄ（ｗｗｗ．ｊｅｎｎｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ＭＨＣＰｒｅｄ／）を用いてスキャンして、潜在的Ｔ細胞エピトープの存在を探し、参照マウスＣＤＲに関連して同種ヒト生殖細胞フレームワーク領域配列と比較した。
【０１００】
次の重鎖可変領域変異体を作成した（図１１参照）：
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３に対して、次の変化を含む：
Ｔ８２ａＮ＋Ｒ８３Ｋ
【０１０１】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．６は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３に対して、次の変化を含む：
Ｔ８２ａＮ＋Ｒ８３Ｋ＋Ｄ８２ｂＳ
【０１０２】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３に対して、次の変化を含む：
Ｔ８２ａＮ＋Ｒ８３Ｋ＋Ｄ８２ｂＳ＋Ｖ３２Ａ
【０１０３】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．８は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３に対して、次の変化を含む：
Ｔ８２ａＮ＋Ｒ８３Ｋ＋Ｄ８２ｂＳ＋Ｖ３２Ａ＋Ｖ７８Ａ
【０１０４】
次の軽鎖可変領域変異体を作成した（図１２参照）：
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４に対して、次の変化を含む：
Ｉ１０Ｔ＋Ｎ１０３Ｒ
【０１０５】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４に対して、次の変化を含む：
Ｉ１０Ｔ＋Ｎ１０３Ｒ＋Ｓ８０Ａ
【０１０６】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１１は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４に対して、次の変化を含む：
Ｉ１０Ｔ＋Ｎ１０３Ｒ＋Ｓ８０ＡＮ４１Ｄ
【０１０７】
対照キメラ抗体の構造について、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１及びＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、一連のオーバーラップ４０マー合成オリゴヌクレオチドを用いて構成した。Ｖ領域配列の側面には、追加の５’及び３’配列が位置し、ほ乳類発現ベクタへのクローニングを容易にしている。オリゴヌクレオチドの配列を図１３及び図１４に示す。
【０１０８】
オリゴヌクレオチドを、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社（英国プール所在）から購入し、１００μＭの濃度で再懸濁した。ほとんどの５’オリゴヌクレオチドを除く、１μｌの各重鎖有意ＤＮＡオリゴヌクレオチドを共に混合して、１．５μｌ（ほぼ、１μｇ）の混合物を：２μｌ １０× ＰＮＫ緩衝液、２μｌ １０ｍＭのＡＴＰ、１４μｌ Ｈ２Ｏ、０．５μｌ（５単位）ＰＮＫを更に含む２０μｌの反応液中でポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ、英国ペイズリー所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて処理した。この反応液を３７℃で３０分間インキュベートし、７０℃で２０分間加熱することによって、酵素を不活化した。重鎖アンチセンス、軽鎖センス、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを、同様にリン酸化した。各セットからの５’オリゴヌクレオチドを、Ｈ２Ｏで９倍に希釈し、適切な反応混合物に１．５μｌを添加した。次いで、各反応液を０．５ｍｌに希釈して、体積が最高で４４μｌになるまで、８０００ｒｐｍで９０分間、Ａｍｉｃｏｎ ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ３濃縮器で回転透析した。
【０１０９】
重鎖についてのセンス及びアンチセンス混合物と、軽鎖についてのセンス及びアンチセンス混合物を混合して、Ｈ２Ｏで８８μｌにした。１０μｌの１０× リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）緩衝液、及び２μｌのＰｆｕ リガーゼ（８単位、英国ケンブリッジ所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を、各反応液に添加し、プログラム可能な加熱ブロック（ｈｅａｔｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）中で、次のようにインキュベートした：９４℃で４分間、次いで、１サイクルにつき６０℃で３分間、その後、９４℃で３９秒間、次いで６０℃で３分間を２０サイクル。最後に反応液を、６０℃で５分間インキュベートした。各ＬＣＲ１０μｌを、臭化エチジウムで染色した１％のアガロースゲルに通し、１Ｋｂラダーマーカ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と比較した。ほぼ４００ｂｐの微かな特異的バンド（ｆａｉｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｎｄ）の周囲に、結紮ＤＮＡの塗抹標本を各レーンで観察した。
【０１１０】
重鎖についてＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１２が、２２、及び軽鎖についてＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３３及び４３をプライマとして用いて、重鎖及び軽鎖ＬＣＲをＰＣＲを介して増幅した。各反応液には、次のものが含まれていた：５μｌのＬＣＲ、５μｌの１０× エクスパンドＨｉＦｉ緩衝液（英国ルイス所在のＲｏｃｈｅ社）、ｌμｌの１０ｍＭ ＮＴＰ混合物、０．２５μｌの各プライマ（ｌ００μＭのストックから）、０．５μｌのエクスパンドＨｉＦｉポリメラーゼ（３単位、Ｒｏｃｈｅ社）、及び３８μｌのＨ２Ｏ。この反応液を次のように循環させた：９４℃で２分間、次いで９４℃で３０秒間を２０サイクル、６０℃で３０分間、及び７２℃で３０秒間。最後に、反応液を７２℃で５分間インキュベートした。反応液の収量及び特性を、上記のようなアガロースゲル電解質によって確認した。ほぼ４００ｂｐで特異的でシャープなバンドが、各反応液について観察された。
【０１１１】
Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、反応生成物を精製し、各々を３０μｌのＨ２Ｏで溶離した。重鎖生成物を、制限酵素Ｍｌｕ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて標準反応で消化させ、軽鎖生成物を、ＢｓｓＨ ＩＩ及びＢａｍＨ Ｉを用いて消化させた。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、反応生成物を再び精製し、各々を３０μｌのＨ２Ｏで溶離した。
【０１１２】
軽鎖発現ベクタｐＡＮＴ０８は、ｐＡＴ１５３バックボーンに基づいており：ＣＭＶ即時／アーリーエンハンサプロモータ−５９０から＋７、高発現マウス抗体軽鎖ＲＮＡ由来の３０ｎｔ ５’ＵＴＲ、可変領域開始コドン付近のＢｓｓＨ ＩＩ制限座を組み込むマウスコンセンサス軽鎖シグナル配列、可変領域スプライス座からＢａｍＨ Ｉ制限座への３３ｎｔを含むヒト合成イントロンに対するショートリンカ（可変領域の代用）、次いで、ヒト定常Ｋａｐｐａ（ＣＫ）領域遺伝子に先立つ３４３ｎｔのイントロンを含むヒト遺伝子ＤＮＡのフラグメント、ＣＫ遺伝子及びＣＫポリＡをこの順に含む。
【０１１３】
重鎖発現ベクタｐＡＮＴ０９は、プロモータ領域を通るｐＡＮＴ０８と類似しており、この後に：上記の重鎖発現ベクタ由来の６２ｎｔ５’ＵＴＲと、可変領域開始コドン付近のＭｌｕ Ｉ座を組み込むマウス重鎖コンセンサスシグナル配列と、可変領域スプライス座に対するショートリンカ（可変領域の代用）、その直後にＣＨ領域ポリＡ座の端に対するＣＨ１遺伝子のイントロン２１１ｎｔの上流に位置したＨｉｎｄ ＩＩＩ制限座からのヒトゲノムＤＮＡと、が続く。このフラグメントは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３イントロン、及びヒトＩｇＧ１のエクソンが含まれる。また、このベクタも、メトトレキサートに対する耐性について、ＳＶ４０プロモータとポリＡシグナルによって制御される、ジヒドロ葉酸還元酵素用の遺伝子を含んでいた。
【０１１４】
各ベクタ２μｇを、全体積３０μｇの標準的反応液中で関連制限酵素で消化させた。各反応液は、上記のような１％アガロースゲルを通り、ベクタ特異バンド（６．０Ｋｂｐ重鎖及び４．２Ｋｂｐ軽鎖）をゲルから切り取り、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製し、３０μｌＨ２Ｏ中で溶離した。
【０１１５】
各消化ベクタ１μｌを、Ｌｉｇａｆａｓｔキット（英国サウサンプトン所在のＰｒｏｍｅｇａ社）を用いて、３μｇの相当する消化可変遺伝子ＰＣＲ生成物に結紮した。各結紮反応液２．５μｌを、製造者によって指示されているように、サブクローニング効率適格（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＸＬｌ−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガープレート上に置き、３７℃で夜通しインキュベートした。各結紮からの１０の細菌コロニィを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する１０ｍｌの２× ＹＴ培養液内に植菌し、振盪しながら３７℃で夜通し培養した。プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎプラスミド調製キットを用いて、１．５ｍｌの各一夜培養物から精製し、各々を５０μｌのＨ２Ｏで溶離した。プラスミドを、契約しているシークエンシング施設に送り、正確なＶ領域遺伝子配列を同定する標準ＣＭＶプロモータプライマ及びクローンで配列した。
【０１１６】
合成ヒト抗体の構造について、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３及びＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、一連のオーバーラップ４０マー合成オリゴヌクレオチドを用いて構成した。オリゴヌクレオチドの配列を、図１５及び図１６に示す。ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、オリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９４及び９５（図１７）を、オリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び６３とプライマリ合成ヒト抗体重鎖変異体のプラスミドＤＮＡと共にテンプレートとして用いて、オーバーラップＰＣＲを介して構成した。２つのＰＣＲ反応を、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び９５、又はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９４及び６３のプライマ対として用いて実施した。各反応液中には、次のものが含まれていた：１μｌ（１００ｎｇ）のプラスミドテンプレート、５μｌの１０× エクスパンドＨｉＦｉ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ社）、１μｌの１０ｍＭ ＮＴＰ混合物、０．２５μｌの各プライマ（１００μＭストックから）、０．５μｌのエクスパンドＨｉＦｉポリメラーゼ（３単位、Ｒｏｃｈｅ社）、及び４２μｌのＨ２Ｏ。これらの反応液を次のように循環させた：９４℃で２分間、次いで、９４℃で３０秒間を２０サイクル、６０℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間。最後に、この反応液を７２℃で５分間インキュベートした。全反応液を１％のアガロースゲルによって電気泳動させ、２９５ｂｐ及び１２６ｂｐの特異的バンドを除去し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製した。ＤＮＡを３０μｌのＨ２Ｏで溶離した。
【０１１７】
テンプレートとして、１μｌの２９５ｂｐ生成物及び１μｌの１２６ｂｐ生成物を用いたことを除いて、２つの精製フラグメントを、上述のＰＣＲ条件でオリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び６３を用いて、ＰＣＲ反応液中で結合した。従って、Ｈ２Ｏの量は、４１μｌに減少した。３９６ｂｐの結合したＰＣＲ生成物を、ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットを用いて精製し、３０μｌのＨ２Ｏで溶離した。
【０１１８】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．６を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、オリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９６及び９７（図１７）を、オリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び６３とプライマリ合成ヒト抗体重鎖変異体のプラスミドＤＮＡと共にテンプレートとして用いて、オーバーラップＰＣＲを介して構成した。２つのＰＣＲ反応を、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び９７、又はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９６及び６３のプライマ対として用いて実施した。第１段階のＰＣＲを上記のように実施して、２９５ｂｐ及び１２６ｂｐのフラグメントを得た。これらのフラグメントを、上記のように精製し、共に結合させて、再精製した。
【０１１９】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、オリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９８及び９９（図１７）を、オリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び６３とＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．６についてのＰＣＲ生成物と共にテンプレートとして用いて、オーバーラップＰＣＲを介して構成した。２つのＰＣＲ反応を、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び９９又はオリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９８及び６３のプライマ対のいずれかを用いて実施した第１段階のＰＣＲを上記のように実施して、９８ｂｐ及び３１８ｂｐのフラグメントを得た。これらのフラグメントを、上記のように精製し、共に結合させて、再精製した。
【０１２０】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．８を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、オリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１００及び１０１（図１７）を、オリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び６３とＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７についてのＰＣＲ生成物と共にテンプレートとして用いて、オーバーラップＰＣＲを介して構成した。２つのＰＣＲ反応をＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び１０１、又はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１００及び６３のどちらかをプライマ対として用いて実施した。第１段階ＰＣＲを上記のように実施して、２７０ｂｐ及び１５５ｂｐのフラグメントを得た。これらのフラグメントを、上記のように精製し、共に結合させて、再精製した。
【０１２１】
上記のＰＣＲ生成物のそれぞれを、Ｍｌｕ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化させ、同様に消化させたｐＡＮＴ０９内に結紮した。この結紮を、形質転換して配置し、コロニィを選定し、プラスミドを調製して、全て配列した。
【０１２２】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、テンプレートとして、オリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０２及び１０３（図１７）と、プライマリ合成ヒト抗体軽鎖変異体のプラスミドＤＮＡとを用いて、ＰＣＲを介して構成した。重鎖変異体について記載されているように、ＰＣＲ単反応を実施し、３８３ｂｐの生成物を得た。完全な反応液を１％アガロースゲルによって電気泳動し、特異的なバンドを除去し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製した。ＤＮＡを３０μｌのＨ２Ｏで溶離した。
【０１２３】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、テンプレートとして、オリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７４及び８４と共にオリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０４及び１０５（図１７）と、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９についてのＰＣＲ生成物とを用いて、オーバーラップＰＣＲを介して構成した。２つのＰＣＲ反応を、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７４及び１０５、又はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０４及び８４のプライマ対として用いて実施した。第１段階のＰＣＲを重鎖変異体についての上記のように実施して、２６５ｂｐ及び１３９ｂｐのフラグメントを得た。これらのフラグメントを、重鎖変異体についての上記のように精製し、共に結合させて３８３ｂｐの生成物を作成し、再精製した。
【０１２４】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１１を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、テンプレートとして、オリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７４及び８４と共にオリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０６及び１０７（図１７）と、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０についてのＰＣＲ生成物とを用いて、オーバーラップＰＣＲを介して構成した。２つのＰＣＲ反応を、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７４及び１０７、又はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０６及び８４のプライマ対として用いて実施した。第１段階のＰＣＲを重鎖変異体についての上記のように実施して、１４８ｂｐ及び２５６ｂｐのフラグメントを得た。これらのフラグメントを、重鎖変異体についての上記のように精製し、共に結合させて３８３ｂｐの生成物を作成し、再精製した。
【０１２５】
上記のＰＣＲ生成物のそれぞれは、ＢｓｓＨ ＩＩ及びＢａｍＨ Ｉで消化され、同様に消化されたｐＡＮＴ０８内に結紮される。この結紮を上記のように、形質転換して配置し、コロニィを選定し、プラスミドを調製して、上述した通り全て配列した。
【０１２６】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）を、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、及びＬ−プロリンを含む高グルコースＤＭＥＭ中で増殖させた。近融合性培地を、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって指示されているように、リポフェクトアミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）を用いてトランスフェクション用に採取した。トランスフェクションは、０．３μｇの重鎖作成物及び０．２μｇの軽鎖作成物を具える０．５μｇのプラスミドＤＮＡの全てを用いて、３×１０５セル／ｍｌで２００μｌの細胞を播種した４８ウエルプレート中で実施した。
【０１２７】
上澄みを採取する前に、トランスフェクションを、３７℃／５％ＣＯ２で４８から７２時間インキュベートした。抗体発現は：マウスモノクローナル抗−ヒトＩｇＧキャプチャ抗体と、ヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａスタンダードと、ＨＲＰ複合ヤギ抗−ヒトＫａｐｐａ軽鎖と、を検出抗体として用いてＥＬＩＳＡによって定量化した（全ての試薬はＳｉｇｍａ製）。
【０１２８】
重鎖及び軽鎖の全ての組み合わせを遺伝子導入した（即ち、６重鎖×５軽鎖＝３０トランスフェクション）。抗体発現レベルは一般的に、０．５から２．０μｇ／ｍｌの範囲内であるが、重鎖ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．８では、発現は観察されなかった。
【０１２９】
発現抗体を、ＴＮＦ−感受性ＷＥＨＩ−１６４細胞を用いて、ヒトＴＮＦαの活性を無毒化する能力について試験した（Ｅｓｐｅｖｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８６，９５，９９−１０５）。細胞を、３−４時間、９６−ウエルマイクロタイタープレートに、１ウエル当たり５×１０４個の細胞で、１μｇ／ｍｌのアクチノミシンＤに置いた。細胞を４０ｐＭヒトＴＮＦα、及び様々な濃度のキメラ抗体（１ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌの範囲）に曝露させて、検量線を作成した。重鎖及び軽鎖の様々な組み合わせを、２５ｎｇ／ｍｌの単一濃度点で試験した。この濃度は、キメラ抗体のＥＤ５０として既に決定してある。ＥＤ５０のキメラ抗体として以前決定した全アッセイを３回実施した。
【０１３０】
混合物を３７℃で夜通しインキュベートした。最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌに、３−［４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド染料（ＭＴＴ）を添加し、３７℃で４時間、インキュベートし、０．１ＭのＨＣｌ、０．１％ ＳＤＳ中で細胞を溶解し、５５０ｎｍの波長で吸光度を測定して、細胞生存率を決定した。
【０１３１】
重鎖及び軽鎖の組み合わせからの吸光度を用いて、検量線から見掛けの抗体の濃度を計算した。キメラの見掛けの濃度は、変異体の各組み合わせの濃度によって分けられて、倍の差分値を与えた。キメラの値よりも低い値は、これらの組み合わせが、ＴＮＦα細胞毒性から細胞を保護する点でより効果的であることを示すが、より高い値は、これらの効果がより低いことを示した。全ての組み合わせについての値を表５に示す。
【０１３２】
表５
キメラ抗体と比較した合成ヒト抗体変異体の活性率
【０１３３】
次の合成ヒト抗体重鎖及び軽鎖の組み合わせは、１．０に近い倍の差分値を与えた：ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５／１０、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７／４、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７／９、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７／１０。これらの組み合わせを更なる研究用に選択した。
【０１３４】
上記で選択された配列を運搬する発現プラスミドをＮＳ０細胞内に遺伝子導入した（ＥＣＡＣＣ番号第８５１１０５０３号）。これらの細胞を、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、５％超低ＩｇＧ ＦＣＳ及びペン／ストレプ（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を含む高グルコースＤＭＥＭで培養した。細胞を、対数増殖期中に採取し、遠沈して新しい増殖培地内で５×１０６セル／ｍｌで再懸濁した。７５０μｌの細胞を全量３０μｇの各プラスミド対で混合し、これを、５０μｌのＨ２Ｏ内でＳｓｐ Ｉで線形化した。細胞／プラスミド混合物を４ｍｍギャップのキュベットに移し、２５０Ｖ、１５００μＦ、無限抵抗で、Ｅｑｕｉｂｉｏ Ｅａｓｙｊｅｃｔ Ｐｌｕｓを用いてエレクトロポレートした。このエレクトロポレートは、２５ｍｌの予熱した増殖培地に即時移し、１００μｌ／ウエルで、５×９６ウエル平底プレートに置かれた。このプレートを３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。４８時間の後エレクトロポレーションを行い、３００ｎＭメトトレキサートを含有する５０μｌ培地を、各ウエルに加えて、１００ｎＭの最終濃度を与えた。７日間の後エレクトロポレーションを行い、１００ｎＭメトトレキサートを含有する更なる５０μｌの培地を、各ウエルに加えた。
【０１３５】
ほぼ２週間後のエレクトロポレーションを行うと、いくつかのウエルの培地は、黄色になり始め、遺伝子導入されたコロニィ増殖を示した。これらのウエルからの培地を、抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃキャプチャ／抗−ヒトＩｇ Ｋａｐｐａ軽鎖ＨＲＰ複合検出ＥＬＩＳＡを用いて、抗体発現について試験した。試験サンプルを、ヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ標準及び確立されている抗体発現レベルと比較した。抗体のコロニィ発現有効量を、２００ｎＭメトトレキサートを含む培地で増やした。
【０１３６】
抗体をタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを介して５００ｍｌ培養培地から精製し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００を用いて、サイズ排除クロマトグラフィを実施した。精製した抗体を、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって定量化し、ＯＤ２８０１＝１．４ｍｇ／ｍｌを仮定した。
【０１３７】
精製キメラ及び複合抗体を、上記の例４に記載されているＷＥＨＩ−１６４保護アッセイを介して活性について試験した。各抗体を、検量線を作成するのに先に用いた全濃度範囲に渡って試験した（図１８参照）。合成ヒト抗体７／１０（即ち、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７及び１０を含む）は、最も活性な変異体であり、キメラ抗体と同じ活性を有することが分かった。合成ヒト抗体７／９及び５／１０は、キメラと比較して僅かに少ない同様の活性を有し、合成ヒト抗体７／４は、最も活性がなかった。
【０１３８】
従って、合成ヒト抗体７／１０が、最も好ましいＭＨＣクラスＩＩ結合プロファイルを有すると予測され、最も活性な変異体であるので、これを、経時変化Ｔ細胞増殖アッセイでの試験用に選択した。ヒトＰＢＭＣを、２回のＦｉｃｏｌｌ密度遠心分離を介して、ヒト血由来の軟膜から調製した。調製ＰＢＭＣを、９０％ヒトＡＢ血清／１０％ＤＭＳＯ中の１ｍｌアリコートで３×１０７セル／ｍｌの密度で再懸濁し、液体窒素化で貯蔵した。ＰＢＭＣをＤｙｎａｌ Ａｌｌｓｅｔ（登録商標）ＰＣＲタイピングキットを用いて組織分類した。
【０１３９】
リード合成ヒト抗体を、２０人の健康なドナーからのヒトＰＢＭＣを用いて、全タンパク質Ｔ細胞アッセイ中のキメラ抗体と比較した。各ドナーからのＰＢＭＣを解凍し、洗浄して、ＡＩＭ Ｖ血清フリーリンパ球増殖培地で再懸濁した。第１日目に、５０μｇのタンパク質を、２４ウエルプレートの４×１０６のＰＢＭＣ２ｍｌのバルク培地に加え、第６日目から第９日目に、３重に１００μｌアリコートを除去して、９６ウエルプレートに移した。採取して放射能の取り込みを測定する前に、各アリコートを、１μＣｉトリチウム化チミジンを含有する７５μｌ培地で２４時間パルスした。結果を刺激インデックス（ＳＩ）の計算によって標準化した。広範囲のＨＬＡ ＤＲアロタイプのガレージは、個々のＭＨＣハプロタイプによってドナーを選択することによって達成される。
【０１４０】
経時アッセイの結果を、図１９で示す。これらの結果は、キメラ抗体（図１９（ａ））が、２０人のドナー中１０人に少なくとも１日で、Ｔ細胞反応（ＳＩ＞＝２）を導くことを示す。逆に、合成ヒト抗体（図１９（ｂ））は、あらゆる時点であらゆるドナーの反応も誘導することができなかった。従って、非免疫原性合成ヒト抗体は、マウス抗−ＴＮＦα抗体（Ａ２）を参照として用いて、ヒト抗体のセグメントから成功裏に構成された。
【０１４１】
例８：合成タイプＩリボソーム阻害タンパク質の構造
【０１４２】
プラントタイプＩリボソーム阻害タンパク質（ＲＩＰ）ブーガニン（ブーゲンビレアスペクタビリス（Ｂｏｕｇａｉｎｖｉｌｌｅａ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ）に由来する）の合成変異体を、国際公開番号第ＷＯ２００５０９０５７９号で記載されている方法を用いて生成した。ブーガニン中のＴ細胞エピトープのロケーションを、国際公開番号第ＷＯ２００５０９０５７９号に記載のようにオーバーラップ１５マーペプチドの分析によって試験し、表６のＳＥＱ ＩＤ１１−１３のペプチド（残渣１２１−１３５、１３０−１４４、及び１４８−１６２に相当する）をエピトープとして同定した。ブーガニンを、ブーゲンビレアスペクタビリス（Ｂｏｕｇａｉｎｖｉｌｌｅａ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ）植物の葉の組織からクローニングした。製造業者によって指示されているように１００ｍｇ組織からポリＡ Ｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ １０００キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてｍＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを、以下のプライマ：ＡＴＧＴＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＧＴＣＡＴＴＴＡＡＣ及びＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＧＧＡＴＡＣＣを有するＡｃｃｅｓｓＱｕｉｃｋ ＲＴ−ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ｍＲＮＡテンプレートから合成した。第１のプライマは、ＡＴＧ開始コドンを更に含み、第２のプライマは、ＴＡＡ停止コドンを更に含む。ＰＣＲ生成物を、Ｔ／Ａクローニングシステム（ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてクローニングし、いくつかのクローンをベクタ内に含まれるＴ７プロモータの転写方向に配向する修正クローンを同定するように配列した。
【０１４３】
表６
ブーガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）の免疫原性ペプチド配列及び置換ヒト配列セグメント
【０１４４】
表６に示されるように同定されたヒト配列セグメントを含む一連の変異体を作成した。これらは、高品質ポリメラーゼ（エクスパンドＨｉＦｉ、Ｒｏｃｈｅ社）を有するオーバーラップＰＣＲを用いて構成した。５’及び３’プライマは上述のものであり、ＰＣＲ生成物を上述の通りＴ／Ａクローニングベクタにクローニングし、Ｔ７プロモータの転写方向に配向した修正クローンを同定した。クローンを、発光酵素遺伝子を発現する対照ＤＮＡ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｔ７ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含む共役転写及び転写反応中の活性について分析した。ブーガニンはリボソーム不活化タンパク質であるので、発光酵素遺伝子の転写のレベルを著しく下げる。この減少は、従来Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等の発光酵素検出システムを用いて分析されている。精製野生型又は突然変異体ブーニガンプラスミドを、Ｎｏｔ Ｉで線形化し、１０ｎｇ／ｍｌに希釈した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｔ７ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡを１２５ｎｇ／μｌに希釈した。１μｌの各ＤＮＡを、１０μｌのＴｎＴ混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と、０．２５μｌのメチオニンと、０．２５μｌのヌクレアーゼ自由水と混合した（ＴｎＴキットで供給される）。対照は、野生型（ｗｔ）ブーニガンとＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｔ７ Ｃｏｎｔｒｏｌのみであった。反応を３回実施し、３０℃で１時間インキュベートした。５μｌの各反応液を、黒い壁付の９６ウエル照度計プレートに移し、４５μｌの水と、５０μｌのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬を混合した。Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ照度計で発光を読んだ。活性は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｔ７ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡのみで観察された蛍光の割合として表した。
【０１４５】
図２０は、多数の異なる変異体の活性プロファイルを示す。これは、最も活性な変異体が：ペプチド４１中のＶ１２３Ｔ；ペプチド４４中のＶ１３２Ｐ／Ｙ１３３Ｑ；ペプチド４４中のＩ１５２Ｑ；であることを示す。これらの４つの突然変異を含む複合変異体を作成し、活性アッセイで再試験した。この変異体の活性は、図２０のＣＯＭＢによって示され、ｗｔタンパク質の活性のほぼ７５％を維持する。
【０１４６】
残渣１２１−１３５、１３０−１４４、及び１４８−１６２に相当する活性ＣＯＭＢ変異体内のヒト配列セグメントを含むペプチドを合成し、例７に記載したように、２０人の健康なドナーからのヒトＰＢＭＣを有する経時Ｔ細胞アッセイ中の相当する野生型ペプチドと比較した。この結果は、ヒト配列セグメントを含むペプチドが、どの時点でも、どのドナーのＴ細胞増殖も誘発しないが、各野生型ペプチドは、少なくとも１の時点で全ドナーの＞１０％のＳＩ＞２を有する増殖を誘発することを示した。
【０１４７】
例９：合成ヒルジンの構造
【０１４８】
トロンビン阻害ヒルジン（医用蛭（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）に由来する）の合成変異体を野生型として表７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １４を有するタンパク質を用いて、国際公開番号第ＷＯ２００４１１３３８６号に記載されている方法で生成した。ヒルジンのＴ細胞エピトープのロケーションを、国際公開番号第ＷＯ２００４１１３３８６号に記載されているように、オーバーラップ１５マーペプチドの分析によって試験し、ペプチド２７−４１ＣＩＬＧＳＤＧＥＫＮＱＣＶＴＧが、２０人の健康なドナーからのヒトＰＢＭＣで有意なＴ細胞反応を与えることが示された。ヒトメラノーマ関連抗原（ＡＡＮ４０５０５．１）からのヒト配列セグメントＫＣＲＨを、例８のオーバーラップＰＣＲを用いて、２６−２９でヒルジン残渣を置換するのに使用し、国際公開番号第ＷＯ２００４１１３３８６号に記載されているアッセイを用いる野生型ヒルジンの完全活性化を維持した２８／２９ＲＨに変わる２８／２９ＩＬを有する変異体ヒルジン分子を得た。修飾ペプチド２７−４１ＣＲＨＧＳＤＧＥＫＮＱＣＶＴＧを、この修飾ペプチド中のＴ細胞エピトープ活性の損失を示す例８に示すようなＴ細胞アッセイ中の野生型ペプチド２７−４１ＣＩＬＧＳＤＧＥＫＮＱＣＶＴＧと共に試験した。
【０１４９】
例１０：Ｔｒエピトープを有する合成ヒト抗−ＩｇＥ抗体の構造
【０１５０】
例４の合成ヒト抗−ＩｇＥ抗体からのＶＨ及びＶＬ遺伝子を、同書内のＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．からの標準ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって、オリゴヌクレオチドプライマ対を、ＶＬ−及びＶＨ−特異ＰＣＲ用のテンプレートとして用いて、分離プラスミドベクタにクローニングした。オーバーラップする相補配列を、続く融合ＰＣＲ中に結合したＰＣＲ生成物内に導入し、２０アミノ酸（Ｇ４Ｓ１）４リンカ、又は代替的に、２つのアスパラギン残渣及びＧＧＳトリプレットによって各側に並んだＣ型肝炎コアタンパク質（Ｐ１９，ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１８５（２００２）ｐ７２０−７２７）からの１０アミノ酸Ｔｒエピトープを含む２０アミノ酸配列ＧＧＳＮＮＬＳＣＬＴＩＰＡＳＡＮＮＧＧＳのどちらかのコード配列を形成した。この最終増幅ステップを、制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＢｓｐＥ１を有する続く開裂用のプライマ対で実施し、ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にクローニングした。次いで、合成ヒト抗−ＩｇＥ単鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）の二量体形を、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，９２（１９９５）ｐ７０２１−７０２５の方法によって構成した。二量体ＶＬ−リンカ−ＶＨ−ＶＬ−リンカ−ＶＨフラグメントを、発現ベクタｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，同書）のＥｃｏＲ１／Ｓａｌ１座にサブクローニングし、エレクトロポレーションによって、ＤＨＦＲ−欠損中国ハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞に遺伝子導入した。選択、遺伝子増幅、タンパク質生成を、Ｍａｃｈ ｅｔ ａｌ．，同書によって記載されているように実施した。二量体ｓｃＦｖを、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）カラム（Ｑｉａｇｅｎ社）上の親和性クロマトグラフィよってＣ−末端ヒスチジンテールを介して精製して、ＣＨＡＢＩｇＥＧ４Ｓ １×４（（ＶＬとＶＨの間のＧ４ＳＯ４リンカ）とＣＨＡＢＩｇＥＨＣＶＰ１９（ＶＬとＶＨの間のＨＣＶ Ｔｒエピトープ）を指定した二量体Ｆｖｓを与えた。
【０１５１】
二量体ｓｃＦｖｓを、２０人の健康なドナーからのＰＢＭＣを用いてＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １００（２００２）ｐ４５２９−４５３６に記載された通りに正確に５０μｇ／ｍｌのヒトＴ細胞アッセイで順次試験した。これらの結果は、ＣＨＡＢＩｇＥＧ４Ｓ １×４、又はＣＨＡＢＩｇＥＨＣＶＰ１９のどちらかについてＴ細胞の有意な増殖を示していないが、ＣＨＡＢＩｇＥＧ４Ｓ １×４ではなくＣＨＡＢＩｇＥＨＣＶＰ１９で刺激した２０人のドナーのうちの４人からのＩＬ−１０生成の有意なレベル（ＳＩ＞２）を示した（２０人のドナー中０人のＳＩ＞２）。これは、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０の誘発についての抗体分子内に含まれるＴｒエピトープの効果を示している。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１−１】図１は、合成ヒト抗ＨＥＲ−２抗体に用いられるＶＨ遺伝子の配列である。
【図１−２】図１は、合成ヒト抗ＨＥＲ−２抗体に用いられるＶＨ遺伝子の配列である。
【図１−３】図１は、合成ヒト抗ＨＥＲ−２抗体に用いられるＶＨ遺伝子の配列である。
【図２−１】図２は、合成ヒト抗ＨＥＲ−２抗体に用いられるＶＬ遺伝子の配列である。
【図２−２】図２は、合成ヒト抗ＨＥＲ−２抗体に用いられるＶＬ遺伝子の配列である。
【図２−３】図２は、合成ヒト抗ＨＥＲ−２抗体に用いられるＶＬ遺伝子の配列である。
【図３】図３は、キメラ４Ｄ５ＩｇＧ１／ｋａｐｐａで８日間、インキュベーションした後のヒトＳＫ−ＢＲ−３細胞と、合成ヒト抗−ＨＥＲ２抗体と、キメラ抗−ＩｇＥ対照で抗−ＨＥＲ２「ＥＡＣＨＡＢ」を回避したエピトープの増殖の阻害を示す（例４参照）。
【図４−１】図４は、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を用いたＶＨ遺伝子の配列である。
【図４−２】図４は、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を用いたＶＨ遺伝子の配列である。
【図４−３】図４は、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を用いたＶＨ遺伝子の配列である。
【図５−１】図５は、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を用いたＶＬ遺伝子の配列である。
【図５−２】図５は、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を用いたＶＬ遺伝子の配列である。
【図５−３】図５は、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を用いたＶＬ遺伝子の配列である。
【図６−１】図６は、合成ヒト抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたＶＨ遺伝子の配列である。
【図６−２】図６は、合成ヒト抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたＶＨ遺伝子の配列である。
【図６−３】図６は、合成ヒト抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたＶＨ遺伝子の配列である。
【図７−１】図７は、合成ヒト抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたＶＬ遺伝子の配列である。
【図７−２】図７は、合成ヒト抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたＶＬ遺伝子の配列である。
【図７−３】図７は、合成ヒト抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたＶＬ遺伝子の配列である。
【図８】図８は、ヒトＴ細胞エピトープの回避を含む合成マウス抗ヒトＴＮＦα抗体を用いたＶＨ及びＶＬ遺伝子の配列である。
【図９】図９は、合成マウス及びキメラ抗ヒトＴＮＦα抗体によるヒトＴＮＦαへの結合用ＥＬＩＳＡである。
【図１０】図１０は、抗ＴＮＦα抗体Ａ２のＶ領域配列である。
【図１１】図１１は、合成ヒト抗ＴＮＦαＶＨ変異株の配列である。
【図１２】図１２は、合成ヒト抗ＴＮＦαＶＬ変異株の配列である。
【図１３】図１３は、キメラマウス：ヒト抗ＴＮＦαＶＨの構成用オリゴヌクレオチドである。
【図１４】図１４は、キメラマウス：ヒト抗ＴＮＦαＶＬの構成用オリゴヌクレオチドである。
【図１５】図１５は、一次合成ヒト抗ＴＮＦαＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３ 図１１に相当する）の構成用オリゴヌクレオチドである。
【図１６】図１６は、一次合成ヒト抗ＴＮＦαＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４ 図１２に相当する）の構成用オリゴヌクレオチドである。
【図１７】図１７は、二次合成ヒト抗ＴＮＦαＶＨ及びＶＬ変異株の構成用オリゴヌクレオチドである。
【図１８】図１８は、合成ヒト抗ＴＮＦα抗体用ＷＥＨＩ−１６４保護アッセイである。
【図１９】図１９は、リード合成ヒト抗ＴＮＦαの経時ヒトＴ細胞アッセイである。
【図２０】図２０は、挿入されたヒト配列セグメントを有する合成ブーガニン分子の活性である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最終抗体又はタンパク質分子内で、ヒト抗体又はタンパク質からのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントを結合する抗体及びタンパク質の生成に関する。具体的には、本発明は、配列セグメントのこのような結合を提供して、最終抗体又はタンパク質分子中のＴ細胞エピトープの数を低減又は回避するようにする。本発明は、特に、ヒトの医薬品又はインビボ診断剤として用いる抗体及びタンパク質の生成に関する。
【０００２】
ここ２０年で、ヒトの潜在的医薬品として用いる組み換え型モノクローナル抗体の生成に大幅な進歩が見られている。ファージ提示法又は遺伝子導入マウスによる、キメラ化技術、ヒト型化技術及びヒト抗体クローニング技術は、非ヒトモノクローナル抗体よりも低い免疫原性を有するヒトに投与される場合に一般的に良好な耐容性を有する抗体を提供している。しかしながら、これらの技術によって生成したいくつかの抗体は、このような抗体の遺伝子起源がヒトである場合でさえ、患者の免疫原性を誘発することを示している。例えば、ヒト抗体Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）は、１２％の関節リウマチ患者に免疫原性を誘発し、ヒト化抗体ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）は、約５０％の患者に免疫原性を誘発する。このような免疫原性の誘発は、抗体可変領域内での非アミノ酸配列の一部の存在に起因しているようである。この非アミノ酸配列の一部は、いくつかの場合に、免疫原性をもたらすＴ細胞反応を誘発するＴ細胞エピトープを作ることができる。従って、高いヒト起源を有するが、改善した技術と、Ｔ細胞反応を誘発する配列の作成をできるだけ避ける抗体組成物が求められている。
【０００３】
本発明は、方法と、それによって、治療用に、このような抗体（ここでは、「複合抗体」という）が、最終抗体分子内でヒト抗体からのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントを結合するような結果物としての抗体組成を提供する。
【０００４】
従って、第１の態様では、本発明は修飾抗体、又はこれの抗原結合フラグメントを提供しており、これは修飾抗体又は抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖可変領域が、１又はそれ以上の別の抗体又は抗原結合フラグメントからのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントから成り、これらのセグメントが、全ＣＤＲでもフレームワーク領域でもない。
【０００５】
本発明のコンテキストでは、用語「セグメント」は、抗体分子内で見つけられる隣接アミノ酸配列をいい、このようなセグメントは、２から１２５アミノ酸長サイズの範囲であり、好ましくは、２から３１アミノ酸長の範囲であり、このようなセグメントは、全ＣＤＲでも全フレームワーク領域でもない。治療に用いる場合、本発明の複合抗体は、一般的に、複合抗体の可変領域内で、様々なヒト抗体からのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントを結合する。具体的には、本発明は、複合抗体重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれ、ＶＨ及びＶＬという）に関し、ＶＨとＶＬは各々、完全に２又はそれ以上のヒト抗体可変領域からの配列のセグメントから成り、一般的に、各合成ＶＨ及びＶＬは、源ヒト抗体ＶＨ及びＶＬ中の位置に相当するヒト可変領域配列位のセグメントを含み、例えば、合成ＶＨ配列中のアミノ酸１から１０は、ヒト抗体のアミノ酸１から１０から導出する。代替的に、複合抗体中のヒトＶＨ又はＶＬ配列のセグメントは、源ヒト抗体ＶＨ又はＶＬ中の配列位に関わりなく、どの配列位に位置してもいてもよい。この源ヒト抗体ＶＨ及びＶＬは、例えば、ヒトモノクローナル抗体Ｖ領域配列のデータベースに提供されているような、現存のヒト抗体可変（Ｖ）領域アミノ酸配列であり、Ｖ領域体細胞変異体、及び生殖細胞系とは異なるその他の変異体を有する親和性成熟抗体からの配列、生殖細胞系Ｖ領域からの配列、固定Ｖ領域フレームワークセットを有するが可変ＣＤＲを有する抗体等といった種の抗体からの配列のセグメントから作られた人工的に構成された抗体Ｖ領域からの配列、ファージ表示ライブラリ等のヒト抗体ライブラリから選択された配列、及びヒト抗体又は抗体フラグメントをコードするトランスジェニック動物発現遺伝子から導出したヒト抗体の配列を含んでもよい。
【０００６】
本発明の好ましい実施例では、治療用の本発明の複合抗体は、最終複合抗体Ｖ領域のヒトＴ細胞エピトープを制限又は回避する組み合わせで多重ヒトＶＨ及びＶＬ配列セグメントを結合することによって構成される。
【０００７】
これに関して、ヒトＴ細胞エピトープは、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができるアミノ酸配列であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞への提示によって、ヘルパーＴ細胞反応を誘発する。最終複合抗体中のＴ細胞エピトープを制限、又は回避するヒトＶＨ及びＶＬ配列セグメント及びセグメントの組み合わせを選択できる。これは、ヒト生殖細胞系配列から等のＴ細胞エピトープを含まないセグメントの使用によって、及び隣接するセグメントを結合して、例えば、２つのセグメントの接合点における非ＭＨＣ結合配列の生成によって、別のヒト生殖細胞系配列の生成によって、又は非生殖細胞系配列にも関わらず、ヘルパーＴ細胞反応を誘発しない配列の生成によって、Ｔ細胞エピトープを含まない新しい配列を作ることによって達成することができる。
【０００８】
本発明の別の好ましい実施例では、更なるアミノ酸配列を加える、又は、１又はそれ以上の制御性Ｔ細胞エピトープ（「Ｔｒエピトープ」）を規定する複合抗体分子内で作ることができる。本発明の目的のために、Ｔｒエピトープは、接触依存性メカニズムと同様に、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β等の阻害性サイトカインの分泌によって免疫反応を調整する能力を有するＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞エピトープを刺激するＭＨＣ結合ペプチドである。このように、本発明の範囲内では、制御性Ｔ細胞エピトープは、ある条件下で、免疫反応の制御に寄与する１又はそれ以上のインビトロ又はインビボ活性を誘発するように示されるペプチドを含むことができる。例えば、制御性Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を誘発する又は活性化する作用、ＩＬ−１０及び／又はＴＧＦ−β等の阻害性サイトカインの放出を誘発する作用、又はその他の測定可能な免疫抑制関連インビトロ又はインビボ活性を有するペプチドを含む。これらの全ての場合において、これらの作用は、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の作用に関連する。従って、このようなＴｒエピトープは、複合抗体の免疫原性を制限又は回避する更なる基準を追加するものである。Ｔｒエピトープは、これらのエピトープを含むヒトＶＨ及びＶＬのセグメントを組み込むことによって、又は２又はそれ以上のヒト配列セグメントの結合を介してこのようなエピトープを生成することによって、又は、例えば、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の誘発又は活性化のために、例えば、ＩＬ−１０及び／又はＴＧＦ−β等の阻害性サイトカインの放出の測定によって、ヒト抗体又はタンパク質配列のセグメントに相当するペプチドからの新しいＴｒエピトープをスクリーニングすることによって、複合抗体ＶＨ又はＶＬ内に導入することができる（例えば、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１００（２００２）ｐ４５２９−３６）。代替的に、公知のＴｒエピトープは、複合抗体の結合又は機能又は発現を阻害しないＶＨ及び／又はＶＬ内の位置で複合抗体Ｖ領域内に組み込むことができ、又は、例えば、ＶＨのＮ末端に合成ＶＨ又はＶＬ配列の一端で組み込むことができる。代替的に、Ｔｒエピトープは、複合抗体の機能に干渉しない位置に（例えば、ヒンジ領域内で）、又は、発現の欠如等のいくつかの他の悪影響を引き起こさない位置に、複合抗体の一方又は双方の定常領域内に組み込むことができる。代替的に、抗体融合タンパク質内の合成ＶＨ及びＶＬの一方又は双方について、抗体は、Ｆａｂ及びＦｖ−タイプ形状（ＶＨ及びＶＬに結合した単鎖抗体（ＳＣＡｓ）を含む）、単一ドメイン抗体、又はホモ二量体型抗体を接合して、Ｔｒエピトープを、複合抗体の機能に干渉しない位置に、又は発現の欠如等のいくつかの他の悪影響を引き起こさない位置に組み込むことができる。例えば、ＳＣＡｓでは、Ｔｒエピトープ用に特に好ましい位置は、ＶＨとＶＬを結合するリンカ領域内である。最も良いのは、Ｔｒエピトープが、適切な配列によって側面に位置し、例えば、エンドサイトーシスプロテアーゼの作用に反応する配列を有するエピトープの側面に位置することによって、ＭＨＣクラスＩＩ分子上の制御性Ｔ細胞エピトープの放出及び表示を最適化する。一般的に、抗原の処理中のプロテアーゼの作用を標的にするＰ−２０からＰ３０（Ｐ１からＰ９のように規定されているコアノノメータを有する）を範囲とする位置で側面にある残渣は、必要ならば、ヒト抗体配列の追加のセグメントを用いて導入される。
【０００９】
ここで議論されているように、本発明は、修飾抗体又は複合抗体の生成方法も提供している。従って、別の態様では、本発明は；
（１）その他の抗体可変領域の範囲からアミノ酸配列のセグメントを結合することによって抗体可変領域遺伝子を準備して、様々な可変領域遺伝子のライブラリを生成するステップと、
（２）抗体可変領域遺伝子のライブラリを発現ベクタ内へクローニングするステップと、
（３）抗体可変領域のライブラリをスクリーニングして、所望の特性を有するライブラリの員を回復するステップと、
を具える修飾抗体の生成方法を提供する。
【００１０】
本発明の第１の好ましい方法「Ａ」では、合成ヒト抗体のライブラリが生成され、特異的抗原に結合する等、所望の特性を有する抗体にスクリーニングされる。この方法は、次の６ステップ；
（１）合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子を設計するステップと、
（２）合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子をクローニングするステップと、
（３）合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子を発現するステップと、
（４）所望の特性を有する複合抗体をスクリーニングして選択するステップと、
（５）リード複合抗体を最適化するステップと、
（６）（選択的に）Ｔ細胞エピトープを回避するステップと、
を含む。
【００１１】
ステップ（１）については、合成ＶＨ及びＶＬ配列のライブラリは、Ｋａｂａｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｉｍｋａｂ．ｈｔｍｌ）、ＮＣＢＩ ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で入手可能なもの等の公知のヒトＶ領域配列から、及び、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）及びＰＲＦ／ＳＥＱＤＢ（ｗｗｗ．ｐｒｆ．ｏｒ．ｊｐ）等のタンパク質データベースから、ＶＨ及びＶＬ配列のセグメントを選択することによって構成されている。加えて、これらは、１又はそれ以上の個人のドナーから増幅したＶＨ及びＶＬｍＲＮＡの直接配列によるヒトＶＨ及びＶＬ配列の収集によって補充される。配列セグメントの様々な結合は、ＶＨ及びＶＬ遺伝子の設計であると考えられる。用いられる１つの方法は、合成ＶＨ及びＶＬ配列の長さを固定して、様々なヒトＶ領域の相当するＫａｂａｔナンバリング位置からの固定長配列セグメントを用いて、これらを設計することである。
【００１２】
例えば、このライブラリは、１２１及び１０７アミノ酸ＶＨ及びＶＬ領域をそれぞれ具え、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングを用いて、ＶＨアミノ酸１−２７について様々なセグメントの組み合わせを含む。ＫａｂａｔナンバリングＣＤＲ１：３０−３５、ＣＤＲ２：５０−６６、及びＣＤＲ：９５−１０６に相当するＣＤＲを有するＶＨについては、次のＫａｂａｔ位についての配列セグメントが、１つの選択枝：１−２７、２８−３１、３２−３６、３７−４２、４３−５０、５１−５６、５７−６０、６１−６３、６４−６９、７０−８２ａ、８２ｂ−９６、９７−９８、９９−１０１、１０２−１１７として用いられている。ＫａｂａｔナンバリングＣＤＲ１：２４−３４、ＣＤＲ２：５０−５６、ＣＤＲ３：８９−９７に相当するＣＤＲを有するＶＬについて、次のＫａｂａｔ位についての配列セグメントが、１つの選択枝：１−２２、２３−２７、２８−３０、３１−３３、３４−３５、３６−４７、４８−５２、５３−５５、５６−５９、６０−８７、８８−９２、９３−９４、９５−１０７として用いられている。従って、この例では、合成ＶＨは、１４ヒトセグメントから成り、合成ＶＬは、１３のヒトセグメントから成る。実際には、コンピュータプログラムを用いて、これらのセグメントの組み合わせを生成する。好ましくは、このプログラムは、例えば、ＣＤＲのある種のカノニカル構造を回避する、或いは、ＶＨ及び／又はＶＬ折り畳み、又はＶＨ／ＶＬ相互作用を分離するあるセグメントの好ましくない組み合わせを回避するアルゴリズムを含む。選択的な追加として、このプログラムは、配列セグメントの組み合わせによって形成したＴ細胞エピトープの数を制限するアルゴリズムを含んでいてもよい（以下に述べるステップ（６）のコンピュータを利用した方法参照）。
【００１３】
ステップ（２）については、合成ヒト配列のライブラリを設計して、好ましくは合成オリゴヌクレオチドを用いて、合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子が生成される。一般的に、Ｖ領域配列のより長いセグメントをコードする合成オリゴヌクレオチドは、Ｖ領域配列の２又はそれ以上の連続したセグメントをコードするオリゴヌクレオチドの混合物に結紮される。代替的に、合成Ｖ領域は、現存のヒトＶＨ及びＶＬ遺伝子をテンプレートとして用いて、ＰＣＲのオーバーラップ又はその他の増幅技術等の他の方法によって結合することができる。例えば、ＰＣＲを用いて、Ｖ領域の小さなセグメントを個別に増幅し、次いで、ＰＣＲ反応をオーバーラップさせることによって結合する。
【００１４】
その他の方法では、混合合成オリゴヌクレオチドを生成して、好ましくは特異的Ｖ領域セグメントをコードする配列を濃縮するドーピング方法を用いて、一連の配列セグメントを作ることができる。大きく変動するヒトＶ領域セグメント表示を有する合成ヒトＶＨ及びＶＬ遺伝子は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；３ｒｄ Ｅｄ．，ｖｏｌｓ．１−３（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されているもの等の当業者に知られている技術を用いて、及びＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，８６（１９８９）３８３３−３８３７に記載されているもの等の免疫グロブリンについての標準ＰＣＲ法を用いて、多くの方法で結合させることができる。
【００１５】
ステップ（３）については、合成ヒトＶＨ及びＶＬ遺伝子が生成されると、これらは、完全抗体分子又はＦｖ’ｓ、Ｆａｂ’ｓ、Ｆａｂ２、ＳＣＡ等の抗原結合フラグメント、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨのみを具える）、及びこれらの各々の多重誘導体の生成用の様々な発現ベクタ内にクローンすることができる。代替的に、ＶＨ及びＶＬ遺伝子は、その他の分子をコードする遺伝子に融合させて、融合プロテインを生成することができる。また、Ｆｖ又はＦａｂの１つの鎖のＣ末端で、ポリヒスチジンタグ等の検出可能なマーカをコードする配列を含んでいてもよい。発現ベクタは、ほ乳類細胞、細菌細胞、バクテリオファージ、イースト、真菌、及びその他の微生物における発現用ベクタを含む。このようなベクタには、また、トランスジェニック動物からのインビボ発現用ベクタや、リボソーム調製を用いるインビトロ翻訳等のインビトロ系を用いた発現用ベクタも含まれる。
【００１６】
ステップ（４）については、合成ヒト抗体のライブラリのスクリーニングは、通常、対象の１又はそれ以上の特異的抗原への結合用である。多くのスクリーニング方法が当業者に知られており、これらの方法の選択は、完全ヒト抗体の発現形状と、抗体分子、即ち、完全ヒト抗体、又はＦａｂ、Ｆｖ、ＳＣＡ、単一ドメイン抗体等の組成に依存する。対象の抗原に結合する現存の抗体が入手可能である場合に、この抗体からのＶＨ又はＶＬは、合成ヒトＶＬ又はＶＨとそれぞれ組み合わせて、結合を試験することができる。
【００１７】
スクリーニング法は、固相上のこのような員のライブラリ又はプールの個々の員を固定することから、個別に又はプール中の対象の抗原を固定することにまで及ぶ。抗体が固定される場合、対象の抗原が追加され、１又はそれ以上の追加試薬の添加によって、直接的、又は間接的に検出することができる。例えば、抗原が融合タンパク質であるか、又はアルカリホスファターゼ等の酵素と結合する場合に、色、蛍光又は化学発光シグナルを生成する幅広い基質から順次添加することによって検出することができる。抗体プールが、１つのロケーション（例えば、マイクロタイター皿）に固定され、シグナルが、抗原の添加に起因する場合、このプールを、このプール又はより小さいプールの個々の員の再スクリーニングに先立って脱複製する（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ）ことができる。対象の抗原が固定される場合、合成抗原ライブラリは、個々の抗体の添加から、特異的ロケーションに固定された対象の抗原まで、抗体のプールの添加まで、全合成ライブラリの添加及び対象の抗原に結合した抗体の次の回復までに及ぶいくつかの方法でスクリーニングすることができる。最後のケースでは、一般的な戦略は、カラム内、又はビード上等の固相上に抗原を固定してライブラリを加え、次いで、例えば、低塩濃度緩衝液でこの固相を洗浄して（ライブラリに緩やかに結びついた員を分離するために）、次いで、例えば高塩濃度緩衝液を用いて抗原に結合する抗体を溶離することである。この目的のためのライブラリの員の発現用の一般的な形式は、ファージ表示、イースト表示、リボソーム表示、及びビード表示である各場合において、合成ＶＨ及びＶＬ鎖をコードする核酸が、抗原に結合する合成Ｖ領域に付着し続ける。
【００１８】
また、スクリーニング方法は、直接抗原結合試験に代わる機能性又は生物学的試験も含み、細胞増殖、細胞増殖阻害、細胞分化、又は細胞移動を含むインビトロ試験、又は、全有機体のレベルでの抗原への反応、例えば、マウスの血球数の変化や移植した腫瘍の増殖阻害を測定するステップを含む、代替的なインビボ試験等で機能性又は生物学的活性が測定される。
【００１９】
ステップ（５）については、対象の抗原への結合等の所望の特性を有する１又はそれ以上の「リード」合成ヒト抗体の選択の後、例えば、この抗原の結合親和性を増加させる、又はこの抗体を追加成分に融合させることによって、リード抗体の特性が、選択的に改善されることがある。親和性の増加は、合成可変領域配列の突然変異によって達成され、所望の方法の結合を増加させる又は変更する選択した合成Ｖ領域配列の突然変異を選択する。本発明は、リード抗体からの１又はそれ以上の個々のＶ領域配列セグメントを、１又はそれ以上のヒト抗体配列からの相当する配列セグメントで置換することによる、可変領域配列の突然変異のための新規な方法を含む。具体的には、ＣＤＲ領域と、又はＣＤＲ領域内でオーバーラップするセグメントを、様々な長さのセグメントを含むその他のヒト抗体からの１又はそれ以上の代替セグメントによって置換することができる。本発明の範囲内は、特異的セグメントは、関連する特性を有するヒト抗体から、例えば、同じ抗原に結合する抗体から、又は、関連する特性を有する非ヒト抗体から、又は、関連する配列を有する非ヒト抗体の機能にとって重要である、ある種のキーアミノ酸を保持する配列セグメントを有するヒト抗体から、といった選択したリード抗体まで含む。このような突然変異の影響を受ける１又はそれ以上の合成ヒト抗体をスクリーニングして、特性を改善する。
【００２０】
選択的ステップ（６）については、リード合成ヒト抗体の選択後、必要であれば、Ｔ細胞エピトープを回避する代替セグメントでＴ細胞エピトープに寄与、又はＴ細胞エピトープをコードするＶ領域セグメントを交換することによって、Ｔ細胞エピトープが制限又は回避される。このようなＴ細胞エピトープは、ある範囲の方法によって検出することができる。例えば、合成Ｖ領域配列の１又はそれ以上の座に相当するペプチドを合成して、Ｔ細胞アッセイ試験をして、Ｔ細胞エピトープの存在を決定することができる。一般的に、このようなペプチドは、長さが１５アミノ酸であり、接触領域がより長い配列を試験することが望ましく、１２アミノ酸オーバーラップを有する１５マー等の配列からオーバーラップペプチドを用いる。Ｔ細胞エピトープの検出については、様々なＴ細胞アッセイの範囲を、サイトカイン放出、増殖（例えば、３Ｈ−チミジンの摂取によって）、Ｃａ２＋フラックス、表面マーカ発現、遺伝子転写等のＣＤ４＋Ｔ細胞の活性又は増殖の測定に用いることができる。
【００２１】
代替的に、合成Ｖ領域配列に相当するオーバーラップペプチドは、インビトロ法又はインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法を用いて分析し、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するいずれの場合も、潜在的なＴ細胞エピトープ、即ち、Ｔ細胞反応を誘発するＭＨＣ結合ペプチドを決定する。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法は、ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ結合相互作用のモデリングを含む方法と、ＭＨＣクラスＩＩに結合する一般的なモチーフの同定を含む方法と、ペプチド又は公知のインビトロＭＨＣ結合特性を有するペプチド内での特異的アミノ酸のデータベースを用いる方法とを含む。合成Ｖ領域配列からのより長いペプチドの生成、又は合成Ｖ領域配列を含む全抗体を生成して、例えば、ＭＨＣ−ペプチドテトラマによって、又は公知のヒトＴ細胞エピトープのデータベースに提案されている又は構成された配列を調べることによって、Ｔ細胞アッセイ中又はＭＨＣ結合アッセイ中の合成Ｖ領域配列を試験するステップ等のその他の方法を用いることができる。合成ヒトＶ領域のＴ細胞エピトープの回避は、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの回避、又はＭＨＣクラスＩＩへのペプチドの結合を固定する特定のアミノ酸の回避によっても補助することができる。１又はそれ以上のリード合成ヒト抗体からのＴ細胞エピトープの回避のための好ましい方法では、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法を最初に適用して、潜在的なＴ細胞エピトープについての合成ヒト抗体Ｖ領域を分析し、これらが同定される場合、ヒトＶＨ又はＶＬ配列の新しいセグメントを導入して、これらのエピトープを回避し、新しいＴ細胞エピトープの導入を回避する。
【００２２】
新しいヒトＶ領域セグメントのこのような導入と、所望の特性について、このように修飾したリード合成ヒト抗体の再スクリーニングの後に、１又はそれ以上の最終リード合成ヒトＶ領域を、一般的に、１５から４５アミノ酸の長さのオーバーラップペプチド、例えば、合成ヒト領域配列（全Ｖ領域又はこれらの一部分）からの１２アミノ酸オーバーラップしている１５マーペプチドを試験するステップによって、又は、ヒトＴ細胞アッセイで、直接的に全合成ヒト抗体を試験するステップによって、ヒトＴ細胞アッセイで更に試験することができる。全抗体に対してＴ細胞活性を直接試験できるようにする全合成ヒト抗体を試験するＴ細胞アッセイを用いた最終分析が好ましい。
【００２３】
本発明の第２の好ましい方法「Ｂ」では、合成ヒト抗体のライブラリを、所望の特性を有する１又はそれ以上の参照抗体からの所望のアミノ酸を含むように生成する。この方法は、次の７ステップ；
（１）１又はそれ以上の参照抗体の配列を分析するステップと、
（２）合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子を設計するステップと、
（３）（選択的に）Ｔ細胞エピトープを回避するステップと、
（４）合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子をクローニングするステップと、
（５）合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子を発現するステップと、
（６）所望の特性を有する複合抗体をスクリーニングして選択するステップと、
（７）Ｔ細胞エピトープの最適な回避を含むリード複合抗体を最適化するステップと、
を含む。
【００２４】
ステップ（１）では、典型的な参照抗体は、ヒト型の抗体中の所望の特性及び／又は結合特異性を有する齧歯類、特にマウスである。１又はそれ以上の参照抗体Ｖ領域配列が入手できる場合、これらの配列を分析してＣＤＲの配列を決定し、結合特性等の抗体の所望の特性に重要であるアミノ酸を同定する。参照抗体については、例えば、参照Ｖ領域配列の同種のその他の配列とのアラインメントによってこのような分析を実施する。また、参照抗体が非ヒト、ヒトＶ領域配列である場合も、このような分析を行う。例えば、プログラムＣＬＵＳＴＡＬ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１９９４）ｐ４６７３−８０）を用いて、このようなアラインメントを実施する。このようなアラインメントは、参照抗体のＶ領域及び相同性ｖ領域ファミリィ中の異常又は微量アミノ酸を同定することができる。加えて、ＣＤＲのカノニカル構造等の保存Ｖ領域構造を、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．：Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（２０００）２３５−２４２）を用いて同定することができる。加えて、構造が知られていない場合、ＭＯＤＥＬＬＥＲ（Ｓａｌｉ ａｎｄ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４（１９９３）ｐ７７９−８１５）等のモデリングソフトウエアを用いて、参照抗体可変領域をモデリングし、いくつかの場合では、抗体−抗原相互作用のモデルを生成することができる。参照抗体Ｖ領域のこのような分析は、合成ヒト抗体についてのヒトＶ領域配列のセグメントの選択を導くのに用いる。
【００２５】
ステップ（２）については、合成ヒト抗体の所望の特性に重要であるアミノ酸を決定して、これらのアミノ酸のいくつか又は全てを含むように、ヒトＶ領域配列のセグメントを選択する。合成ヒト抗体の特性についてのこのようなセグメントの効果が不明確である特定の座に一般的な１又はそれ以上の代替ヒトＶ領域セグメントを有する選択されたセグメントを含む合成ヒトＶ領域配列のライブラリがこれによって設計される。このような合成ヒト抗体配列は、その他のヒト抗体配列と保存構造とのアラインメントによって参照抗体で更に分析することができ、加えて、合成ヒト抗体Ｖ領域のこの構造の更なるモデリングを行って、合成ヒト抗体に用いられるヒトＶ領域セグメントの組み合わせを、所望のように精製し、合成Ｖ領域内でのタンパク質構造、分子間及び分子内相互作用における欠陥、及び重要なアミノ酸の不正確な構造配向を回避する。
【００２６】
選択的ステップ（３）については、セグメント選択の付加的基準として、最終合成ヒトＶ領域のＴ細胞エピトープを制限又は回避するこれらのセグメント又はセグメントの組み合わせが選択される。Ｔ細胞エピトープをインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）又はインビトロ法を用いて、好ましくは、合成ヒトＶ領域配列を設計する段階でインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法を用いて、上述した方法Ａ、ステップ（６）に記載した方法によって分析する。
【００２７】
ステップ（４）については、合成ヒト配列のライブラリを設計して、次いで、合成ＶＨ及びＶＬ遺伝子を、好ましくは合成オリゴヌクレオチドを用いて生成する。典型的には、Ｖ領域配列のより長いセグメントをコードする合成オリゴヌクレオチドが、配列の代替セグメントをコードするオリゴヌクレオチドの混合物に結紮して、合成ヒトＶ領域のライブラリの様々な員を生成する。代替として、合成ヒトＶ領域のライブラリの各員は、特異的ヒトＶ領域の配列をコードするオリゴヌクレオチドを部分的に用いて個別に生成する。代替として、合成Ｖ領域は、既存のヒトＶＨ及びＶＬ遺伝子をテンプレートとして用いて、又は、テンプレートとして１又はそれ以上の参照抗体Ｖ領域遺伝子を用いて、オーバーラップＰＣＲ、又は他の増幅技術等のその他の方法によってアセンブルされる。
【００２８】
方法Ｂについてのステップ（５）及び（６）は、方法Ａ、ステップ（４）及び（５）に記載されているのと同様である。
【００２９】
選択的なステップ（７）は、方法Ａ、ステップ（６）と同様に用いられ、リード合成ヒト抗体でＴ細胞エピトープの更なる回避が要求される。全抗体からのＴ細胞活性について直接試験することを可能にする全合成ヒト抗体を試験するＴ細胞アッセイを用いた最終分析が好ましい。
【００３０】
方法Ａ及びＢに加えて、合成ヒト抗体を作成して試験し、このような抗体の特性を最適化するその他の方法があることは、当業者に理解されよう。本発明の合成ヒト抗体は新規であり、Ｖ領域の全ヒト起源の結果として、非ヒト配列を含むその他の抗体よりもヒトの免疫原性が低くなくてはならない。また、合成ヒト抗体の追加の選択的特徴、即ち、Ｔ細胞エピトープの回避及び／又はＴｒエピトープの付加は、より低い免疫原性に寄与する。より低い免疫原性の目的は、例えば、源ヒト抗体中の配列位置と異なる複合抗体の配列位置にセグメントを含む合成ヒト抗体、ヒトＶ領域配列のセグメントの部分的組み込みのみを有する複合抗体、非ヒト配列のセグメントを有する複合抗体、又は、例えば、抗体に対する結合親和性を増加する、又はＴ細胞エピトープを避けるように突然変異したヒト配列を有する複合抗体等の全ヒト配列セグメントの無いＶ領域を含む、より好ましくない複合抗体を用いて達成することができることは、当業者に理解されるであろう。
【００３１】
合成ヒト抗体内でのＶ領域配列セグメント及びこれらの組み合わせを選択して、上記のようなＴ細胞エピトープの選択的回避を含む基準範囲を満たすことが理解されよう。例えば、ヒトＶ領域配列のセグメント及びこれらの組み合わせは、Ｂ細胞エピトープ及びＭＨＣクラスＩ−制限エピトープ等のその他のエピトープの回避、複合抗体の発現に有害であるアミノ酸配列の回避、Ｎ−グリコシル化等の複合抗体の不適切な修飾を導く配列の回避、ヘルパーＴ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープ（例えば、ワクチンの使用）の包含等のある種の機能の包含、１又はそれ以上の表面リシン残渣等のその他の部分への連続した結合、及びその他の基準範囲用に選択することができる。
【００３２】
また、ヒトに加えて、その他の種由来のＶ領域セグメント全体又は一部を有する複合抗体を生成することができ、これも本発明の範囲内であると考えるべきであることは、当業者に理解されよう。例えば、マウスの研究用に、マウス起源のＶ領域配列セグメントの全体又は一部を具える合成マウス抗体を生成することができる。
【００３３】
また、本発明は、抗体以外のタンパク質に適用し、治療用途には、このようなタンパク質（ここでは、「合成タンパク質」という）は、最終タンパク質分子内で、ヒトタンパク質からのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントを結合する。
【００３４】
従って、更なる態様では、本発明は、アミノ酸配列の１又はそれ以上のセグメントの挿入によって改善した免疫原性を有する修飾タンパク質を提供する。
【００３５】
タンパク質に関して、用語「セグメント」は、タンパク質分子内で見出される隣接するアミノ酸配列をいい、このようなセグメントは、２から２５０アミノ酸長のサイズの範囲である。治療用には、本発明の合成タンパク質は、通常、合成タンパク質内で様々なヒトタンパク質からのアミノ酸配列の２又はそれ以上を結合する。特に、本発明は、全体が２又はそれ以上のヒトタンパク質からの配列のセグメントからなる挿入を有する合成タンパク質に関する。ヒトタンパク質が合成タンパク質に対して相同で、又は合成タンパク質の領域に対して相同な領域で存在する場合、源ヒトタンパク質の配列位置に相当する合成タンパク質配列のセグメントを用いることができる。例えば、合成タンパク質配列のアミノ酸１から１０は、源ヒトタンパク質のアミノ酸１から１０に由来する。代替として、ヒトタンパク質配列中の配列位置にあるヒトタンパク質配列のセグメントは、源ヒトタンパク質の配列位置に関わりない合成タンパク質中のあらゆる配列位置にある合成タンパク質に配置されていてもよい。源ヒトタンパク質は、例えば、ヒトタンパク質配列のデータベースで提供されるようなあらゆる現存のヒトタンパク質アミノ酸配列であり、ヒトタンパク質の天然の突然変異形又は転位形、及び生殖細胞系と異なるその他の変異、人工的に構成されたヒト由来タンパク質からの配列、及び相当するタンパク質が発現するか、或いは発現しないヒト遺伝子又はＲＮＡ由来の配列が含まれる。
【００３６】
本発明のこの態様の好ましい実施例では、治療用合成タンパク質は、最終合成タンパク質中のヒトＴ細胞エピトープを制限又は回避する組み合わせのヒトタンパク質配列セグメントを結合又は挿入することによって構成される。合成タンパク質に適用される本発明の好ましい態様は、ヒトタンパク質配列セグメントの挿入によって非ヒトタンパク質等の現存の参照タンパク質を修飾して、最終合成タンパク質のＴ細胞エピトープを制限又は回避することである。
【００３７】
合成タンパク質を生成する本発明の好ましい方法では、合成ヒトタンパク質のライブラリを生成して、Ｔ細胞エピトープ不在等の所望の特性を有する１又はそれ以上の参照タンパク質からの所望のアミノ酸を含めるようにしている。この方法は、次の７ステップを含む；
（１）Ｔ細胞エピトープの選択的分析を含む１又はそれ以上の参照タンパク質の配列分析をするステップと、
（２）合成タンパク質遺伝子を設計するステップと、
（３）Ｔ細胞エピトープを（選択的に）回避するステップと、
（４）合成タンパク質遺伝子をクローニングするステップと、
（５）合成タンパク質遺伝子を発現させるステップと、
（６）スクリーニングを行い、所望の特性を有する合成タンパク質を選択するステップと、
（７）Ｔ細胞エピトープの選択的回避を含むリード合成タンパク質を最適化するステップ。
【００３８】
ステップ（１）では、典型的な参照タンパク質は、合成タンパク質で所望される特性を有する非ヒトである。治療用途には、典型的に、合成タンパク質の免疫原性の低減又は除去が目的となる。１又はそれ以上の参照タンパク質配列が入手可能である場合、これらはタンパク質の所望の特性に重要であるアミノ酸を同定するために分析される。加えて、参照タンパク質のあらゆる公知の構造を分析することができ、又は、代替的に、モデル化ソフトウエアを用いて、構造をモデル化することができる。種間又は種内のどちらかの参照タンパク質の相同体が入手できる場合、時に、これらを用いて、配列差の関係と相同体間の特性の差の関係を決定することができる。タンパク質が別の分子と相互作用する場合、この相互作用のモデルを、生成し、相互作用に重要なアミノ酸を決定することができる。ステップ１への選択的付加として、特に、上記の合成ヒト抗体について詳細に述べているようなインビトロヒトＴ細胞アッセイを用いて、参照タンパク質中のＴ細胞エピトープの配列ロケーションが決定される。代替として、Ｔ細胞エピトープを分析するためのインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法を用いることができる。参照タンパク質のこのような分析を用いて、合成タンパク質用に選択されたヒトタンパク質配列のセグメントに導く。参照タンパク質、特に非ヒトと比較して免疫原性の低減又は除去が目的である合成タンパク質については、一般的に、Ｔ細胞エピトープのロケーションに相当する１又はそれ以上のヒト配列セグメントが、Ｔ細胞エピトープ無しの他のロケーションからの参照タンパク質からの配列のセグメントと組み合わせて合成タンパク質中に用いられる。
【００３９】
ステップ（２）については、合成タンパク質の所望の特性に重要であるアミノ酸を決定して、次いで、これらのアミノ酸のいくつか又は全てを含むように、タンパク質配列のセグメントが選択される。これによって、典型的に、特定の座で、１又はそれ以上の代替ヒトタンパク質セグメントを有する選択されたセグメントを含む合成ヒトタンパク質配列のライブラリが設計される。合成タンパク質の特性のこのようなセグメントの効果は、不明である。このような合成タンパク質配列は、基準タンパク質を伴っていれば、任意の相同体と整列させることによって、又は合成タンパク質の構造のモデル化によって、又は、タンパク質構造の欠陥や重要なアミノ酸の不正確な構造配向を回避するために合成ヒトタンパク質に用いられるヒトタンパク質セグメントの組み合わせを、必要に応じて精製するためにその他の分析を行うことによって、更に分析することができる。
【００４０】
選択的ステップ（３）について、セグメントの選択用の追加基準又は基準のみとして、最終合成タンパク質中のＴ細胞エピトープを制限又は回避するこれらのセグメント、又はセグメントの組み合わせが選択される。Ｔ細胞エピトープを、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）又はインビトロ法を用いて上記の合成ヒト抗体用に記載された方法によって分析する。
【００４１】
ステップ（４）については、合成タンパク質のライブラリを設計して、次いで、合成タンパク質遺伝子を、好ましくは、合成オリゴヌクレオチドを用いて生成する。典型的には、タンパク質配列のより長いセグメントをコードする合成オリゴヌクレオチドが、配列の代替セグメントをコードして合成タンパク質のライブラリの様々な員を生成するオリゴヌクレオチドの混合物に結紮する。代替的に、合成タンパク質のライブラリの各員が、特異的合成タンパク質の配列をコードするオリゴヌクレオチドを用いて部分的に生成される。代替として、合成タンパク質は、オーバーラップしているＰＣＲ、又は、現存のヒトタンパク質遺伝子をテンプレートとして用いた、又は、１又はそれ以上の参照タンパク質遺伝子をテンプレートとして用いたその他の増幅技術等の他の方法によってアセンブルすることができる。
【００４２】
ステップ（５）では、合成タンパク質のライブラリのスクリーニングは、通常、１又はそれ以上の合成タンパク質の所望の特性用である。多くのスクリーニング方法が当業者に知られており、これらの方法の選択は、合成タンパク質及びタンパク質機能の発現の形に依存する。スクリーニング方法は、固相上のこのような員のライブラリ又はプールの個別の員を固定するステップから、溶液相中のライブラリの員をスクリーニングして、もう１つの分子を同定し、これで合成タンパク質を設計して、個別に、又はプールで結合することによって相互作用させる範囲にまで及ぶ。また、スクリーニング方法は、機能的又は生物学的試験を含み、ここでは、細胞増殖、細胞増殖阻害、細胞分化、又は細胞遊走を含むインビトロ試験、又は全有機体のレベルでの合成タンパク質に対する反応、例えば、マウスの血球数又は移植した腫瘍の増殖阻害の変化を測定するステップを含む代替インビボ試験等の、機能的又は生物学的活性を測定する。
【００４３】
ステップ（６）では、所望の特性を有する１又はそれ以上の「リード」合成タンパク質の選択に続いて、選択的に、例えば、酵素の特異的活性を増やすことによって、又はレセプタに対するタンパク質リガンドの結合を増やすことによって、このリードタンパク質の特性を強化することができる。特性の強化は、合成タンパク質配列の突然変異生成によって達成されて、所望の方法で、合成タンパク質の特性を変化させる突然変異が選択される。本発明は、このタンパク質からの１又はそれ以上の個々のタンパク質配列セグメントを１又はそれ以上のヒトタンパク質配列からの配列セグメントで置換することによって、タンパク質配列の突然変異を生成する新規な方法を含む。次いで、このような突然変異生成を行う１又はそれ以上の合成タンパク質をスクリーニングして、特性を強化することができる。
【００４４】
選択的ステップ（７）では、リード合成タンパク質の選択に続いて、所望の場合に、Ｔ細胞エピトープに寄与する、又はこれをコードするタンパク質配列セグメントをＴ細胞エピトープを回避する代替セグメントと交換することによって、Ｔ細胞エピトープを制限又は回避する。このようなＴ細胞エピトープは、ある範囲の方法によって検出される。例えば、合成タンパク質中の１又はそれ以上の座に相当するペプチドを合成し、Ｔ細胞アッセイで試験してＴ細胞エピトープの存在を決定することができる。典型的には、このようなペプチドは、長さ１５アミノ酸であり、１２アミノ酸オーバーラップを有する１５マー等の配列からのオーバーラップペプチドを用いてより長い隣接した配列を試験することが望ましい。代替として、潜在的Ｔ細胞エピトープ、即ち、Ｔ細胞反応を誘発するＭＨＣ結合ペプチドを決定する各場合に、合成タンパク質配列に相当するオーバーラップペプチドを、インビトロ法かインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法のどちらかを用いて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子への結合について分析する。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法は、ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ結合相互作用をモデル化するステップを含む方法と、ＭＨＣクラスＩＩへの結合に一般的なモチーフを同定するステップを含む方法と、公知のインビトロＭＨＣ結合特性を有するペプチド内のペプチド又は特異的アミノ酸のデータベースを用いる方法を含む。合成タンパク質配列又は全合成タンパク質からより長いペプチドを生成する方法、及び、抗原提示細胞上のＴ細胞アッセイ、又はＭＨＣ結合アッセイでこれらを試験する方法等の他の方法を用いることができる。また、合成タンパク質のＴ細胞エピトープの回避は、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの回避によって、又はＭＨＣクラスＩＩへのペプチドの結合をアンカする特異的アミノ酸の回避によって援助される。１又はそれ以上のリード合成タンパク質からＴ細胞エピトープの回避のための好ましい方法では、先ずインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法を適用して、潜在的Ｔ細胞エピトープについての合成タンパク質を分析し、これらが決定されると、ヒトタンパク質配列の新しいセグメントを導入して、これらのエピトープを回避して、新しいＴ細胞エピトープの導入を回避する。所望であれば、Ｔ細胞エピトープを回避する新しいヒトセグメントのこのような導入と、所望の特性についての修飾リード合成タンパク質の再スクリーニングに続いて、１又はそれ以上の最終リード合成タンパク質を、典型的に１５から４５アミノ酸長のオーバーラップペプチド、例えば、合成タンパク質配列（全タンパク質又はこれらの一部分）からの１２アミノ酸オーバーラップした１５マーペプチドを試験することによって、或いは、ヒトＴ細胞アッセイで、直接的に、全合成タンパク質を試験することによって、ヒトＴ細胞アッセイで選択的に試験することができる。全タンパク質からのＴ細胞活性について直接試験することができる全合成タンパク質を試験するＴ細胞アッセイを用いた最終分析が好ましい。
【００４５】
合成タンパク質を作成して試験し、このようなタンパク質の特性を最適化する他の方法があることは、当業者には理解されよう。本発明の合成タンパク質は新規で、治療目的で用いられる場合は、ヒト起源のいくつかの、又は全てのタンパク質配列セグメントは、その他の比較可能な、又は非ヒト配列を含む非ヒト参照タンパク質より、ヒトの免疫原性が少ない峰性タンパク質を提供するべきである。また、合成タンパク質の付加的な選択的特徴、即ち、Ｔ細胞エピトープの回避及び／又はＴｒエピトープの付加も、より低い免疫原性に寄与する。より低い免疫原性の目的は、全ヒト配列の無い合成タンパク質を用いて達成され、また、突然変異して、参照タンパク質に相同する非ヒトタンパク質のＴ細胞エピトープ又はセグメントを除去するヒト配列セグメントを有する合成タンパク質を含むことが、当業者には理解される。Ｔ細胞エピトープの最適な回避を含む基準の範囲を満足するように合成タンパク質内のタンパク質セグメント及びその組み合わせを選択することが理解されよう。例えば、ヒトタンパク質配列のセグメント及びこれらの組み合わせを、Ｂ細胞エピトープ及びＭＨＣクラスＩ−制限エピトープ等のその他のエピトープの回避と、合成タンパク質の発現に有害であるアミノ酸配列の回避と、Ｎ−グリコシル化等の合成タンパク質の不適切な修飾を導く配列の回避と、ヘルパーＴ細胞エピトープ、及び／又はＢ細胞エピトープ（例えば、ワクチン適用）の包含等のある種の機能の包含と、その他の部分への連続した結合と、その他の基準の範囲用に選択することができる。
【００４６】
また、ヒトに加えて、他の種に由来する配列セグメントの全体又は一部分を有する合成タンパク質を生成することができ、これは、本発明の範囲内であると考えるべきである。例えば、マウスの研究では、マウスタンパク質配列セグメントを含む合成タンパク質を生成することができる。また、合成タンパク質が、同種内の相同タンパク質からのその他のタンパク質配列セグメントと結合した１つの種からのタンパク質配列セグメントを含むことができることが理解される。例えば、本発明は、植物型Ｉ ＲＩＰ（リボソーム阻害タンパク質）の構造を含む。ここでＲＩＰは、入手可能な多数の植物型Ｉ ＲＩＰ配列からの配列セグメントを用いてアセンブルされる。このような合成ＲＩＰは、ＲＩＰ活性を保持するであろう配列セグメントの組み合わせを導入することによってアセンブルされ、ヒトに用いる場合には、最終合成配列中のヒトＴ細胞エピトープの回避を含むであろう。
【００４７】
抗体の場合、本発明は、最終タンパク質の１又はそれ以上のその他の特性に更なる改良を行う合成タンパク質のランダムな、セミランダムな、又は直接的な突然変異生成によって、合成タンパク質配列への更なる修飾の選択枝を含む。本発明は、ヒトに用いられるとき、又は薬学的な用途のタンパク質、又は、アレルギィ反応が本発明の組成物の使用によって制限又は除去される食料、合成洗剤、化粧品、及び他の消費者商品の用途のタンパク質等のヒトによって用いられるときに、低い免疫原性を有するタンパク質生成に特に好適である。本発明は、特に非アレルギィ関連エピトープ（例えば、ＴＨ１ Ｔ細胞−誘発エピトープ用のＴＨ２）によって、及び／又はアレルギィ患者の免疫反応を抑制するＴｒエピトープの付加によって除去又は置換されたアレルギィ関連Ｔ細胞エピトープを有するタンパク質を生成することによって、ヒト内での低いアレルギィ性を有するタンパク質の生成に特に好適であることが理解されよう。本発明は、特に、非炎症関連エピトープ（例えば、ＴＨ２ Ｔ細胞誘発エピトープ用のＴＨ１）及び／又は炎症反応を抑制するためのＴｒエピトープの添加によって除去又は置換された炎症関連Ｔ細胞エピトープを有するタンパク質を生成することによって、ヒトの炎症特性を低減するタンパク質を生成するのに特に好適であることが理解されよう。
【００４８】
ここで議論されているように、本発明の修飾／合成タンパク質及び抗体は、病気の治療に有益であり、低い免疫原性を示す。従って、更なる態様で、本発明は、選択的に、１又はそれ以上の薬学的に許容できる賦形剤、担体、又は希釈剤と共に、請求項１から１８のいずれか１項に記載の修飾抗体、抗体結合性フラグメント、又はタンパク質を具える薬学的調製を提供する。
【００４９】
本発明の組成物は、１投与当たり所定量の各活性成分を含む単位投与形で存在する。このような単位は、５−１００ｍｇ／１日の化合物、好ましくは、５−１５ｍｇ／１日、１０−３０ｍｇ／１日、２５−５０ｍｇ／１日、４０−８０ｍｇ／１日、又は６０−１００ｍｇ／１日のいずれかを提供するように構成されている。式Ｉの化合物については、１００−１０００ｍｇ／１日、好ましくは、１００−４００ｍｇ／１日、３００−６００ｍｇ／１日、５００−１０００ｍｇ／１日のいずれかの範囲の投与を提供する。このような投与は、単回投与又は複数回の分散投与で提供することができる。最終的な投与は、もちろん、治療の状態、投与経路、及び患者の年齢、体重、及び状態に依存しており、医師の裁量である。
【００５０】
本発明の組成物は、あらゆる適切な経路、例えば、経口（口腔又は舌下を含む）、直腸、鼻腔、局所（口腔、舌下又は経皮を含む）、経腟、又は非経口（皮下、筋内、静脈、又は皮内）を含む経路による投与用に構成されている。このような調製は、医薬の分野で知られているあらゆる方法、例えば、担体や賦形剤と活性成分を関連させることによって調製することができる。
【００５１】
経口投与に適した医薬調製物は、カプセル又はタブレット；パウダ又は顆粒；水性又は非水性の液体の溶液又は懸濁液；可食発泡体又はホイップ；又は水中油型液体エマルジョン又は油中水型液体エマルジョン等の分散単位として存在している。
【００５２】
経皮投与に適した医薬調製物は、長期間、レシピエントの表皮と密着し続けるように意図した分散パッチとして存在する。例えば、有効成分は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３（６），３１８（１９８６）に一般的に記載されているような、イオントフォレシスによって、パッチから送り込まれる。
【００５３】
局所投与に適した医薬調製物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、パウダ、溶液、ペースト、ジェル、スプレィ、エアロゾル、又はオイルとして調製される。
【００５４】
眼、又はその他の外部組織である、例えば、口及び皮膚への塗布には、この調製物は、局所軟膏又はクリームとして塗布するのが好ましい。軟膏に調製する場合、有効成分を、パラフィン、又は水混和性軟膏ベースのどちらかと共に用いることができる。代替として、有効成分を、水中油型クリームベース又は油中水型ベースのクリームと共に調製するようにしてもよい。
【００５５】
眼への局所投与に適した医薬調製物は、点眼薬を含み、この有効成分を好適な担体、特に水性溶媒に溶解又は懸濁させる。
【００５６】
口内局所投与に適した医薬調製物は、薬用キャンディ、トローチ剤、及び洗口液を含む。
【００５７】
直腸投与に適した医薬調製物は、座薬又は寛腸剤として存在する。
【００５８】
経鼻投与に適合した医薬調製物であって、担体が固体である医薬調製物は、例えば、スナッフで摂取する方法、即ち、鼻腔に近づけたパウダの容器から鼻道を通る素早い吸入によって投与される２０から５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含む。スプレィ式点鼻薬として、又は点鼻薬としての投与に好適な調製物であって、担体が液体である調製物は、水性又は油性溶液の有効成分を含む。
【００５９】
吸入による投与に適した医薬調製物は、様々なタイプの定量加圧エアロゾル、噴霧器、又は吸入器の手段によって生成する細粒粉末又は噴霧を含む。
【００６０】
経腟投与に適した医薬調製物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、発泡体又はスプレィ調製物として存在する。
【００６１】
非経口投与に適した医薬調製物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及び溶質を含む水性及び非水性滅菌注射液；及び、懸濁剤及び増粘剤を含む対象とするレシピエントの血液を用いる等張の調製を行う水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。調製物は、単位投与及び複数投与容器である、例えば、密封アンプル及びバイアルで存在し、また、使用直前に例えば注入用の水といった滅菌液体担体の添加を必要とするのみのフリーズ−ドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵されているものでもよい。即時調合の注射液及び懸濁液は、滅菌パウダ、顆粒、及びタブレットから調製される。
【００６２】
好ましい単位投与調製物は、上記のような有効成分の日用量、又はサブドーズ（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、又はこれらの適切な画分を含むものである。
【００６３】
特に上記した成分に加えて、調製物は、問題の調製物のタイプを考慮したこの分野では従来のものである他の薬剤を含んでいてもよい。例えば、経口投与に好適なものは、香料添加剤を含んでいてもよい。
【００６４】
次の例は、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。図及び表は、以下に述べる例に、次のように関連している；
【００６５】
表１から表３は、１８６×９残渣長ＶＨ ＣＤＲ３（表１）、７７×８残渣長ＶＬ ＣＤＲ３（表２）、及び１５３×１０残渣長ＶＬ ＣＤＲ３（表３）を具える合成ヒト抗体ｓｃＦｖライブラリに用いられるＣＤＲである。
【００６６】
表４は、一次合成ヒト抗ＴＮＦαＶＨ及びＶＬ変異株に用いるヒト配列セグメントである。
【００６７】
表５は、合成ヒト抗ＴＮＦα変異株の活性である。
【００６８】
表６は、ブーガニン変異株のブーガニン及び置換ヒトセグメントの免疫原性ペプチド配列である。
【００６９】
例１−合成ヒト抗−ＨＥＲ２抗体の構造
【００７０】
ヒト可変領域配列セグメントライブラリの作成用に、ある範囲のヒト免疫グロブリンの範囲からのアミノ酸配列を重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）可変領域配列を含むインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）ヒト可変領域配列ライブラリを具える単一データベース内に集めた。配列の源としては、ＮＣＢＩ Ｉｇｂｌａｓｔデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、Ｋａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，５ｔｈ ｅｄ．（１９９１）（後にアップデートされた）），Ｖｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ．ｄｏｃ），Ｇｅｎｂａｎｋ（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１９９７）ｐｌ−６、又はｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓを介した）データベースが挙げられる。用いられた参照抗体可変領域配列は、ハーセプチン（登録商標）として知られているヒト化抗−ＨＥＲ２抗体であった（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ ８９（１９９２）ｐ４２８５，ＵＳ５８２１３３７）。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）ヒト可変領域配列ライブラリからのセグメントを、ハーセプチン（登録商標）可変領域配列の相当するアミノ酸に対する同定用に選択し、結合させて、図１及び図２にそれぞれ示されているような合成ヒトＶＨ及びＶＬ配列を生成した。
【００７１】
組み換えＤＮＡ技術を、この分野で公知の方法と、必要に応じて、これらの方法で用いられる酵素を用いるための供給者の指示を用いて実施した。一般的な方法の源としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌｓ １−３，ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓが挙げられる。また、詳細な実験室方法は、以下の例７に記載されている。ハーセプチン（登録商標）に相当する合成ヒトＶＨ及びＶＬ配列を、各鎖について、完全合成ヒトＶＨ及びＶＬ配列をコードする長さ３０−６０アミノ酸の８つの合成ヌクレオチドを用いて作成した。また、同時に、対照試薬として、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５（Ｈｕｄｚｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９８９年３月）ｐ１１６５−１１７２））のキメラ形を、鎖毎に８つの合成オリゴヌクレオチドを用いて作成した。分離ＶＨ及びＶＬオリゴヌクレオチドを、先ずリン酸化して、等モル比で混合して、サーマルサイクラ内で５分間、９４℃に加熱し、次いで６５℃に冷却して、６５℃で２分間インキュベートした。次いで、４５℃で２分間、３５℃で２分間、２５℃で２分間、４℃で３０分間インキュベートを継続した。更に、オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（英国ペイズリィ所在のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、１４℃で１８時間、結紮した。
【００７２】
Ｋｏｚａｋ配列、リーダーシグナルペプチド（ｌｅａｄｅｒ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）配列及びリーダーイントロン（ｌｅａｄｅｒ ｉｎｔｒｏｎ）を含む５’フランキング配列、及びスプライス座及びイントロン配列（ｉｎｔｒｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む３’フランキング配列をコードする追加のオリゴヌクレオチドを、ＶＨ及びＶＬオリゴヌクレオチド混合物に上記のように加えて、アニールした。合成ヒトＶＨ及びＶＫと、生成した４Ｄ５発現カセットを、プラスミドベクタｐＵＣ１９へＢａｍＨＩフラグメントに対するＨｉｎｄＩＩＩとしてクローニングし、完全なＤＮＡ配列を確認した。これらは、ヒトＩｇＧ１（ＶＨ）又はＫａｐｐａ（ＶＫ）定常領域をそれぞれと、ほ乳類細胞の選択用マーカを含む発現ベクタｐＳＶｇｐｔ及びｐＳＶｈｙｇに転写された。ＤＮＡ配列を確認して、合成ヒトＶＨ及びＶＫと、発現ベクタ中の４Ｄ５ＶＨ及びＶＫを補正した。
【００７３】
抗体発現用主宿細胞株は、ＮＳ０である非免疫グロブリン生成マウス骨髄腫であり、英国ポートン所在のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ８５１１０５０３）から得た。重鎖及び軽鎖発現ベクタをエレクトロポレーションによって、ＮＳ０細胞内に同時遺伝子導入した。ｇｐｔ遺伝子を発現するコロニィは、１０％ウシ胎仔血清、０．８μｇ／ｍｌミコフェノール酸、及び２５０μｇ／ｍｌキサンチンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で選択した。遺伝子導入した細胞クローンは、ヒトＩｇＧについてＥＬＩＳＡによってヒト抗体を生成用にスクリーニングした。細胞株分泌抗体を拡張し、最も高い生成株を選択し、液体窒素中に凝固させた。修飾抗体をＰｒｏｓｅｐ（登録商標）−Ａ（英国ノースアンバーランド所在のＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｌｔｄ社）を用いて精製した。ヒトＩｇＧκ抗体についてＥＬＩＳＡによって、濃度を決定した。
【００７４】
合成ヒト抗体及びキメラ４Ｄ５抗体を、Ｈｕｄｚｉａｋ ｅｔ ａｌ．（同書）によって正確に記載されているように、陰性対照非−Ｈｅｒ−２結合ヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ抗体と共に、ＨＥＲ２＋ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３の増殖の阻害について試験した。この結果（図３）は、合成ヒト抗体及びキメラ４Ｄ５抗体が、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖を阻害において等価な効果を有することを示す。また、図３は、以下のように生成した代替「エピトープ回避」複合抗体についてのデータを示す。
【００７５】
本発明のエピトープ回避オプションを試験するために、合成ヒト重鎖及び軽鎖可変領域の配列を、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ（ｗｗｗ．ｃｓｄ．ａｂｄｎ．ａｃ．ｕｋ／〜ｇｊｌｋ／ＭＨＣ−ｔｈｒｅａｄ）を用いて非自己ヒトＭＨＣクラスＩＩバインダについて分析した。このソフトウエアは、ペプチドのアミノ酸側鎖と、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝内の特定の結合ポケットの間の好適な相互作用を予測する。合成ヒト重鎖及び軽鎖可変配列からの全オーバーラップ１３マーは、ＭＨＣクラスＩＩアロタイプのデータベースを通り、ＭＨＣクラスＩＩ分子との結合、及び、相互作用に基づいて得た。ＭＨＣクラスＩＩを結合すると予想されるペプチドは、ＶＨの残渣１６及び６７、及びＶＬの９及び４４で始まる１３２マーであった。結果として、ヒト可変領域配列ライブラリの新しいセグメントが、図１の合成ヒト配列で用いられるセグメントの代わりに選択され、アミノ酸交換ＶＨ１８Ｌ−Ａ／６９Ｉ−Ｇ；ＶＬ１１Ｌ−Ａ、４６Ｌ−Ａを導入した。相当する「エピトープ回避」合成ヒト抗体（「ＥＡＣＨＡＢ」＝Ｅｐｉｔｏｐｅ Ａｖｏｉｄｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ ＡｎｔｉＢｏｄｙ）は、図１の配列に相当する抗体を作るのに用いられるいくつかのオリゴヌクレオチドを置換することによって作られ、ＥＡＣＨＡＢは上記の方法で作られ、標準合成ヒト抗体と同等であるＳＫ−ＢＲ−５の増殖の阻害を示すために試験した（図３）。このデータは、合成ヒト抗体が、対照キメラ抗−ＨＥＲ−２抗体と等しい効果をもって成功裏に構成されて、ＥＡＣＨＡＢバージョンの合成ヒト抗体が、効果の損失すること無く生成され得ることを示している。
【００７６】
例２−合成ヒト抗−ＨＥＲ２抗体の免疫原性
【００７７】
Ｔ細胞増殖アッセイを実施して、合成ヒト抗−ＨＥＲ２抗体、ＥＡＣＨＡＢ変異株及びキメラ４Ｄ５抗体の免疫原性を比較した（例１参照）。これらの抗体は、血清の入っていない、動物由来成分の入っていない、タンパク質の入っていない培地、ＨｙＱ（登録商標）ＬＳ１０００脂質補給（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃａｔ Ｎｏ：ＳＨ３０５５４）及びピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ Ｎｏ：１１３６０−０３９）を補充したＨｙＣｌｏｎｅ ＨｙＱ（登録商標）ＡＤＣＦ−Ｍａｂ（商標）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃａｔ Ｎｏ：Ｃａｔ ｎｏ：ＳＨ３０３４９）中で増殖したＮＳ０細胞から調製された。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（ＰＤｌＯカラム）上の緩衝液を５０ｍＭのＭＥＳｐＨ６に交換後、抗体は、陽イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ−Ｓ １０／１０）をそれぞれ通り、塩化ナトリウム勾配（０から０．５Ｍ）で溶出した。次いで、抗体含有画分を、ＰＢＳのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００保存カラム（ＸＫ１６／６０）ランに塗布した。ピーク画分を貯留して、４℃で保存した。抗体濃度は、ヒトＩｇＧについてのＥＬＩＳＡによって決定した。
【００７８】
健康なヒトのドナー血液から単離し、液体窒素で凍結保存したＰＢＭＣ（末梢血単核球）を用いて、免疫原性分析を実施した。各ドナーは、Ａｌｌｓｅｔ（商標）ＰＣＲベース組織分類キット（英国Ｗｉｒｒａｌ所在のＤｙｎａｌ社）を用いて組織分類を行い、２０人の健康なドナーを、個人ＭＨＣハプロタイプに従って選択した。ＡＩＭ Ｖ（英国ペイズリィ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の４×１０６ＰＢＭＣを含有する２ｍｌバルク培地を試験ペプチド（５μＭ最終濃度）を有する２４ウエル組織培養プレートでインキュベートし、バルク培地を緩やかに再懸濁し、ＰＢＭＣの３倍の１００μｌのサンプルをＵ−底９６ウエルプレートに移すことによって、５日、６日、７日、及び８日目に増殖を評価した。Ｔｏｍｔｅｃ Ｍａｃｈ ＩＩＩプレートハーベスタ（英国所在のＲｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、培地をグラスファイバフィルタマット上に採取し、カウント毎分（ｃｐｍ）値を、Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ ＴｒｉＬｕｘプレートリーダ（パララックス高効率計数プロトコルを用いて）を用いてシンチレーション計数によって決定した。各試験抗体について、刺激インデックス（ＳＩ）を、試験抗体のカウント毎分（ｃｐｍ）：顕著なＴ細胞エピトープ反応と考えられるＳＩ＞２を有する陰性対照のｃｐｍの率として計算した。この結果は、顕著な増殖性反応キメラ（ｃｈｉｍａｅｒｉｃ）４Ｄ５抗体が、試験された２０人の健康的なドナーのうちの５人（２５％）の試験された４日間の増殖（２より大きいＳＩ）の少なくとも１日に顕著な増殖性反応を誘発し、合成ヒト抗−ＨＥＲ２抗体が、２０人のドナーのうち３人（１５％）にＳＩ＞２を誘発するが、ＥＡＣＨＡＢ抗−ＨＥＲ２抗体は、２０人のドナーのうちの誰にもＳＩ＞２を誘発しない（０％）ことを示した。これらの結果は、キメラ４Ｄ５＞合成ヒト抗−ＨＥＲ２抗体＞ＥＡＣＨＡＢ抗−ＨＥＲ２の順番を示し、後者が試験されたいずれのドナー血液サンプルに免疫原性の証拠がないことを示している。
【００７９】
例３−合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体の構造
【００８０】
シアル化Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原に特異的な合成ヒト抗体を、参照抗体可変領域配列として、ヒト化３Ｓ１９３抗体を用いて、例１で記載されているように構成した（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０（２０００）ｐ３２５４−３２６１，ＵＳ５８７４０６０）。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）ヒト可変領域配列ライブラリからのセグメントを、ヒト化３Ｓ１９３可変領域配列中の相当するアミノ酸に対する同定用に選択し、結合して図４及び５それぞれに示されているような合成ヒトＶＨ及びＶＬ配列を生成した。同時に、参照キメラ抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を、参照Ｖ領域配列から作った。ヒトＩｇＧ１（ＶＨ）及びＫａｐｐａ（ＶＫ）定常領域を、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体と、キメラ参照抗体の双方に用いて、抗体を、ＵＳ５８７４０６０に記載されているような合成Ｌｅｗｉｓ Ｙ−ＨＳＡ複合体に対するＥＬＩＳＡによって試験した。このデータは、ＵＳ５８７４０６０のデータと一致する０．１５μｇ／ｍｌ合成ヒト抗体と比較したアッセイの結合シグナルを与えるための０．１μｇ／ｍｌキメラ抗体の最小濃度を示した。
【００８１】
例４−合成ヒト抗−ＩｇＥ抗体の構造
【００８２】
合成ヒト抗−ＩｇＥ抗体を、参照抗体可変領域配列として、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１（５）（１９９３）ｐ２６２３−２６３２）として知られているヒト化抗−ＩｇＥ抗体を用いて、例１に記載されているように構成した。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）ヒト可変配列ライブラリからのセグメントを、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）可変領域配列の相当する相当するアミノ酸に対する同定用に選択し、結合して図６及び７各々に示されているような合成ヒトＶＨ及びＶＬ配列を生成した。同時に、参照キメラ抗−ＩｇＥ抗体を、参照Ｖ領域配列から作った。ヒトＩｇＧ１（ＶＨ）及びＫａｐｐａ（ＶＫ）定常領域を、合成ヒト抗−ＩｇＥ抗体とキメラ参照抗体の双方に用いた。
【００８３】
Ｆａｂの特異性を、表面プラズモン共鳴によって更に特徴付けた（瑞国Ｕｐｐｓａｌａ所在のＢｉａｃｏｒｅ ＡＢ社製ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００）。組み換えヒトＩｇＥ Ｆａｂを、Ｆｌｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５（２０００）ｐ３８４９−３８５９によって記載されている通り生成した。試験抗体を精製し、ＮＨＳ／ＥＤＣ ｋｉｔ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いてＣＭチップのフロー電池に固定して、キメラ抗−ＩｇＥ用の２０１０ＲＵ、及び合成ヒト抗−ＩｇＥ用の２０２９ＲＵを得た。Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中の１０及び２５ｎＭ組み換えヒトＩｇＥ Ｆａｂを、１０分間５μｌ／ｍｉｎの流量で試験抗体を除いた。この結果は、１０及び２５ｎＭのＩｇＥ Ｆａｂの双方について、等価ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）曲線が、キメラ抗−ＩｇＥについて検出され、合成ヒト抗−ＩｇＥ抗体は、後者が、参照抗−ＩｇＥ抗体と等価な結合効果を成功裏に達成することを示した。
【００８４】
例５−合成ヒトｓｃＦｖライブラリの生成及びスクリーニング
【００８５】
ヒトｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）の初期構造についての戦略は、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，２９６（２０００）５７−８６に詳細に記載されているように、７人分のヒトＶＨと、４人分のヒトＶＬ（ｋａｐｐａ）遺伝子を構成することであり、ヒト可変領域のデータベースから多数のＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ３セグメントにクローニングすることであった。このＣＤＲ３のリストは、ＶＨ ＣＤＲ３については表１に、８つのアミノ酸のＶＬ ＣＤＲ３については表２に、１０のアミノ酸のＶＬ ＣＤＲ３については表３に示されている。マスターＶＨ及びＶＬ構造については、フレームワーク３の端までのＶＨ及びＶＬをコードする６つのオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドが、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，同書に詳細に記載されているように合成され、繰り返しＰＣＲ（Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ ａｎｄ Ｐｅａｒｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５（１９９２）８２７−８２９）を行った。これらは、ＥｃｏＲＶ消化ｐＺｅｒｏ−１ベクタ（英国ペイズリィ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に結紮された。双方ともが開始時に４Ｄ５ ＣＤＲ３を有するＣＨ１及びＣ Ｋａｐｐａを添加するため（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０（１９９２）１６３−１６７）、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，同書のプロトコルを、ＶＨ−ＣＨ１ＳａｐＩ−ＥｃｏＲＩと、ＶＬ−ｋａｐｐａ Ｎｓｉ−ＳｈＩフラグメントが、ＥｃｏＲＶ消化ｐＺｅｒｏ−１にクローニングされた平滑末端であることを除いて行った。
【００８６】
表１
【００８７】
表２
【００８８】
表３
【００８９】
ＣＤＲ３の挿入について、プラス鎖から表Ｈの各ＣＤＲ３をコードする単一オリゴヌクレオチドを、コンセンサスＶＨ及びＶＬ遺伝子にアニーリングするために各端に加えられた１２つの相同性ヌクレオチドで合成した。これらのＣＤＲ配列に加えて、抗体Ｅ２５からのＣＤＲ（例４参照）が含まれていた。これらのプライマを拡張し、二次プライマを加えて、ＶＨについて５’ＮｏｔＩ−３’ＸｂａＩ座、ＶＬについて５’ＳｐｅＩ−３’ＢａｍＨＩを、ＶＨ及びＶＬ遺伝子（Ｃ領域のない）のＮ及びＣ末端のすぐ隣に導入した。クローニングに先立って、更なる相補プライマ対を用いて、ＶＨとＶＬの間にリンカ配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を挿入し、一方、ＸｂａＩ及びＳｐｅＩ座は維持した。フルサイズのＶＨ−リンカ−ＶＬフラグメントは、ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで消化され、ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋／−）（蘭国アムステルダム所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にクローニングした。
【００９０】
個々のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローンを採取し、国際公開番号第ＷＯ９９／１１７７７号に記載されているように、プラスミドＤＮＡを精製して９６ウエルプレート内にロボット制御で分注した。次いで、国際公開番号第ＷＯ９９／１１７７７号に記載されているように、ＤＮＡを、ｔＲＮＡ−ビオチニル−リシンを含有するＩＶＴＴにさらし、ストレプトアビジン表面に更にロボット制御で配置した。次いで、１０，０００の独立したクローンの固定開始ｓｃＦｖライブラリを組み換えヒトＩｇＥ Ｆａｂでインキュベートすることによってスクリーニングした（例４参照）。ウエルを室温で１時間、ＰＢＳ／３％ＢＳＡでブロックし、ＰＢＳで３回洗浄して、ＰＢＳ／３％ＢＳＡの５μｇ／ｍｌヒトＩｇＥ Ｆａｂで１時間、処理した。次いで、ウエルを、ＰＢＳで更に３回洗浄し、ＰＢＳ／３％ＢＳＡの５μｇ／ｍｌアルカリ性ホスフォターゼ同定キメラ抗−ＩｇＥ（例４）で１時間半、処理した。ウエルを、ＰＢＳで５回、更に洗浄し、可視化用に基質５−ブロモ−１−クロロ−３−インドリルホスファート及びニトロブルーテトラゾリウム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いて染色現像した。９６００ウエルに１つの頻度で観察される強いシグナルは、Ｅ２５ ＣＤＲ３’ｓを含有するＶＨとＶＬの対双方から誘導されることを示した。
【００９１】
例６−合成マウス抗−ＴＮＦα抗体の構造
【００９２】
マウス可変領域配列ライブラリを、ＮＣＢＩ Ｉｇｂｌａｓｔ、Ｋａｂａｔ及びＧｅｎｂａｎｋデータベースを用いてヒトライブラリについて、例１に記載されているように作成した。用いた参照抗体可変領域配列は、マウスｃＡ２抗体の可変領域を用いるＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（Ｌｅ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ６２７７９６９）として知られているキメラ抗−ＴＮＦα抗体であった。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）マウス可変領域配列ライブラリからのセグメントは、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）可変領域の部分的に相当するアミノ酸から選択されるが、例１で測定される非−自己ヒトＭＨＣクラスＩＩバインダの形の配列のヒトＴ細胞エピトープを回避するように設計された変異体を含んでいた。キメラ抗体に用いた配列と比較した合成マウスＶＨ及びＶＬ配列を図８に示し、これは、合成マウス抗体のエピトープ回避のためのセグメント選択の結果として、２つの抗体間のＶＨとＶＬそれぞれの９及び１６アミノ酸の差を示す。
【００９３】
合成マウス及びキメラ抗−ＴＮＦα抗体を、例１に記載されているように生成した。標準ＥＬＩＳＡの固定ヒトＴＮＦαに結合する精製抗体の比較（国際公開番号第ＷＯ０３／０４２２４７Ａ２号に記載されている）は、合成マウス抗体が、キメラ抗−ＴＮＦα抗体の完全な結合能力を保持することを示した（図９）。次いで、これらの抗体の免疫原性を、Ｔ細胞アッセイ用の２４ＨＬＡ−ＤＲ型ヒト血液サンプルを用いて、例２で記載されているように比較した。この結果は、２４人のドナーの誰もＳＩ＞２を誘発しない（０％）合成マウス抗−ＴＮＦα抗体と比較して、キメラ抗−ＴＮＦα抗体が、試験した２４人の健康なドナーのうち９人（３７．５％）に顕著な増殖反応（ＳＩが２より大きい）を誘発することを示した。これらの結果は、ヒトＴ細胞エピトープを回避するためのこのようなセグメントの選択でマウスＶ領域から完全に取り出される可変領域配列のセグメントを具える合成マウス抗体が、なんらエピトープ回避方法を用いることなく、相当するキメラ抗体によって表示されるヒトＴ細胞アッセイの免疫原性を除去することができることを示した。
【００９４】
例７：合成ヒト抗−ＴＮＦα抗体の構造
【００９５】
ヒトＴＮＦαに対する抗体Ａ２の参照マウス可変領域重鎖及び軽鎖配列を、米国特許第５６５６２７２号から得た（図１０、各ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ１及びＮｏ．２）。構造モデルを、マウス参照可変領域から作成し、ＣＤＲ確認に欠かせないアミノ酸とＣＤＲに近いパッキングを、ＣＤＲ（＜３Å）からの距離に基づいて同定した。重要ではあるが、余り気にかけなくてもよい残渣中、ＣＤＲ（＞３Å ＜６Å）からの距離と、ＣＤＲに近いより重要な残渣のパッキングの影響に基づいて同定した。更なる残渣セットを、マウス抗体配列、即ち、１％より少ない頻度で特定の座で見出されるアミノ酸の生成頻度に基づいて同定した。
【００９６】
これらの残渣のできるだけ多くに含まれるヒトＶ領域配列セグメントを選択して（表４）、完全な長さのＶＨ及びＶＬ配列を作成した。同定された構造上重要な全ての残渣を含むようにこれらの配列に代替を作成し、エピトープ回避及び合成ヒト抗体設計用のテンプレートとしての機能する配列を作成した。各合成ＶＨ及びＶＬについての好ましい配列を、参照マウス抗体からの重要な残渣を含むように設計した。これらの可変重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を、図１１及び図１２のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３及びＮｏ．４にそれぞれ示す。
【００９７】
表４
（ａ）重鎖
【００９８】
（ｂ）軽鎖
【００９９】
合成重鎖及び軽鎖可変領域配列を、様々なインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）法（例えば、Ｐｒｏｐｒｅｄ［ｈｔｔｐ：／／ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ［ｗｗｗ．ｃｓｄ．ａｂｄｎ．ａｃ．ｕｋ／〜ｇｊｌｋ／ＭＨＣ−ｔｈｒｅａｄ］、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）、ＭＨＣｐｒｅｄ（ｗｗｗ．ｊｅｎｎｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ＭＨＣＰｒｅｄ／）を用いてスキャンして、潜在的Ｔ細胞エピトープの存在を探し、参照マウスＣＤＲに関連して同種ヒト生殖細胞フレームワーク領域配列と比較した。
【０１００】
次の重鎖可変領域変異体を作成した（図１１参照）：
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３に対して、次の変化を含む：
Ｔ８２ａＮ＋Ｒ８３Ｋ
【０１０１】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．６は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３に対して、次の変化を含む：
Ｔ８２ａＮ＋Ｒ８３Ｋ＋Ｄ８２ｂＳ
【０１０２】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３に対して、次の変化を含む：
Ｔ８２ａＮ＋Ｒ８３Ｋ＋Ｄ８２ｂＳ＋Ｖ３２Ａ
【０１０３】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．８は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３に対して、次の変化を含む：
Ｔ８２ａＮ＋Ｒ８３Ｋ＋Ｄ８２ｂＳ＋Ｖ３２Ａ＋Ｖ７８Ａ
【０１０４】
次の軽鎖可変領域変異体を作成した（図１２参照）：
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４に対して、次の変化を含む：
Ｉ１０Ｔ＋Ｎ１０３Ｒ
【０１０５】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４に対して、次の変化を含む：
Ｉ１０Ｔ＋Ｎ１０３Ｒ＋Ｓ８０Ａ
【０１０６】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１１は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４に対して、次の変化を含む：
Ｉ１０Ｔ＋Ｎ１０３Ｒ＋Ｓ８０ＡＮ４１Ｄ
【０１０７】
対照キメラ抗体の構造について、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１及びＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、一連のオーバーラップ４０マー合成オリゴヌクレオチドを用いて構成した。Ｖ領域配列の側面には、追加の５’及び３’配列が位置し、ほ乳類発現ベクタへのクローニングを容易にしている。オリゴヌクレオチドの配列を図１３及び図１４に示す。
【０１０８】
オリゴヌクレオチドを、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社（英国プール所在）から購入し、１００μＭの濃度で再懸濁した。ほとんどの５’オリゴヌクレオチドを除く、１μｌの各重鎖有意ＤＮＡオリゴヌクレオチドを共に混合して、１．５μｌ（ほぼ、１μｇ）の混合物を：２μｌ １０× ＰＮＫ緩衝液、２μｌ １０ｍＭのＡＴＰ、１４μｌ Ｈ２Ｏ、０．５μｌ（５単位）ＰＮＫを更に含む２０μｌの反応液中でポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ、英国ペイズリー所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて処理した。この反応液を３７℃で３０分間インキュベートし、７０℃で２０分間加熱することによって、酵素を不活化した。重鎖アンチセンス、軽鎖センス、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを、同様にリン酸化した。各セットからの５’オリゴヌクレオチドを、Ｈ２Ｏで９倍に希釈し、適切な反応混合物に１．５μｌを添加した。次いで、各反応液を０．５ｍｌに希釈して、体積が最高で４４μｌになるまで、８０００ｒｐｍで９０分間、Ａｍｉｃｏｎ ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ３濃縮器で回転透析した。
【０１０９】
重鎖についてのセンス及びアンチセンス混合物と、軽鎖についてのセンス及びアンチセンス混合物を混合して、Ｈ２Ｏで８８μｌにした。１０μｌの１０× リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）緩衝液、及び２μｌのＰｆｕ リガーゼ（８単位、英国ケンブリッジ所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を、各反応液に添加し、プログラム可能な加熱ブロック（ｈｅａｔｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）中で、次のようにインキュベートした：９４℃で４分間、次いで、１サイクルにつき６０℃で３分間、その後、９４℃で３９秒間、次いで６０℃で３分間を２０サイクル。最後に反応液を、６０℃で５分間インキュベートした。各ＬＣＲ１０μｌを、臭化エチジウムで染色した１％のアガロースゲルに通し、１Ｋｂラダーマーカ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と比較した。ほぼ４００ｂｐの微かな特異的バンド（ｆａｉｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｎｄ）の周囲に、結紮ＤＮＡの塗抹標本を各レーンで観察した。
【０１１０】
重鎖についてＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１２が、２２、及び軽鎖についてＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３３及び４３をプライマとして用いて、重鎖及び軽鎖ＬＣＲをＰＣＲを介して増幅した。各反応液には、次のものが含まれていた：５μｌのＬＣＲ、５μｌの１０× エクスパンドＨｉＦｉ緩衝液（英国ルイス所在のＲｏｃｈｅ社）、ｌμｌの１０ｍＭ ＮＴＰ混合物、０．２５μｌの各プライマ（ｌ００μＭのストックから）、０．５μｌのエクスパンドＨｉＦｉポリメラーゼ（３単位、Ｒｏｃｈｅ社）、及び３８μｌのＨ２Ｏ。この反応液を次のように循環させた：９４℃で２分間、次いで９４℃で３０秒間を２０サイクル、６０℃で３０分間、及び７２℃で３０秒間。最後に、反応液を７２℃で５分間インキュベートした。反応液の収量及び特性を、上記のようなアガロースゲル電解質によって確認した。ほぼ４００ｂｐで特異的でシャープなバンドが、各反応液について観察された。
【０１１１】
Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、反応生成物を精製し、各々を３０μｌのＨ２Ｏで溶離した。重鎖生成物を、制限酵素Ｍｌｕ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて標準反応で消化させ、軽鎖生成物を、ＢｓｓＨ ＩＩ及びＢａｍＨ Ｉを用いて消化させた。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて、反応生成物を再び精製し、各々を３０μｌのＨ２Ｏで溶離した。
【０１１２】
軽鎖発現ベクタｐＡＮＴ０８は、ｐＡＴ１５３バックボーンに基づいており：ＣＭＶ即時／アーリーエンハンサプロモータ−５９０から＋７、高発現マウス抗体軽鎖ＲＮＡ由来の３０ｎｔ ５’ＵＴＲ、可変領域開始コドン付近のＢｓｓＨ ＩＩ制限座を組み込むマウスコンセンサス軽鎖シグナル配列、可変領域スプライス座からＢａｍＨ Ｉ制限座への３３ｎｔを含むヒト合成イントロンに対するショートリンカ（可変領域の代用）、次いで、ヒト定常Ｋａｐｐａ（ＣＫ）領域遺伝子に先立つ３４３ｎｔのイントロンを含むヒト遺伝子ＤＮＡのフラグメント、ＣＫ遺伝子及びＣＫポリＡをこの順に含む。
【０１１３】
重鎖発現ベクタｐＡＮＴ０９は、プロモータ領域を通るｐＡＮＴ０８と類似しており、この後に：上記の重鎖発現ベクタ由来の６２ｎｔ５’ＵＴＲと、可変領域開始コドン付近のＭｌｕ Ｉ座を組み込むマウス重鎖コンセンサスシグナル配列と、可変領域スプライス座に対するショートリンカ（可変領域の代用）、その直後にＣＨ領域ポリＡ座の端に対するＣＨ１遺伝子のイントロン２１１ｎｔの上流に位置したＨｉｎｄ ＩＩＩ制限座からのヒトゲノムＤＮＡと、が続く。このフラグメントは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３イントロン、及びヒトＩｇＧ１のエクソンが含まれる。また、このベクタも、メトトレキサートに対する耐性について、ＳＶ４０プロモータとポリＡシグナルによって制御される、ジヒドロ葉酸還元酵素用の遺伝子を含んでいた。
【０１１４】
各ベクタ２μｇを、全体積３０μｇの標準的反応液中で関連制限酵素で消化させた。各反応液は、上記のような１％アガロースゲルを通り、ベクタ特異バンド（６．０Ｋｂｐ重鎖及び４．２Ｋｂｐ軽鎖）をゲルから切り取り、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製し、３０μｌＨ２Ｏ中で溶離した。
【０１１５】
各消化ベクタ１μｌを、Ｌｉｇａｆａｓｔキット（英国サウサンプトン所在のＰｒｏｍｅｇａ社）を用いて、３μｇの相当する消化可変遺伝子ＰＣＲ生成物に結紮した。各結紮反応液２．５μｌを、製造者によって指示されているように、サブクローニング効率適格（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＸＬｌ−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガープレート上に置き、３７℃で夜通しインキュベートした。各結紮からの１０の細菌コロニィを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する１０ｍｌの２× ＹＴ培養液内に植菌し、振盪しながら３７℃で夜通し培養した。プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎプラスミド調製キットを用いて、１．５ｍｌの各一夜培養物から精製し、各々を５０μｌのＨ２Ｏで溶離した。プラスミドを、契約しているシークエンシング施設に送り、正確なＶ領域遺伝子配列を同定する標準ＣＭＶプロモータプライマ及びクローンで配列した。
【０１１６】
合成ヒト抗体の構造について、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３及びＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、一連のオーバーラップ４０マー合成オリゴヌクレオチドを用いて構成した。オリゴヌクレオチドの配列を、図１５及び図１６に示す。ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、オリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９４及び９５（図１７）を、オリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び６３とプライマリ合成ヒト抗体重鎖変異体のプラスミドＤＮＡと共にテンプレートとして用いて、オーバーラップＰＣＲを介して構成した。２つのＰＣＲ反応を、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び９５、又はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９４及び６３のプライマ対として用いて実施した。各反応液中には、次のものが含まれていた：１μｌ（１００ｎｇ）のプラスミドテンプレート、５μｌの１０× エクスパンドＨｉＦｉ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ社）、１μｌの１０ｍＭ ＮＴＰ混合物、０．２５μｌの各プライマ（１００μＭストックから）、０．５μｌのエクスパンドＨｉＦｉポリメラーゼ（３単位、Ｒｏｃｈｅ社）、及び４２μｌのＨ２Ｏ。これらの反応液を次のように循環させた：９４℃で２分間、次いで、９４℃で３０秒間を２０サイクル、６０℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間。最後に、この反応液を７２℃で５分間インキュベートした。全反応液を１％のアガロースゲルによって電気泳動させ、２９５ｂｐ及び１２６ｂｐの特異的バンドを除去し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製した。ＤＮＡを３０μｌのＨ２Ｏで溶離した。
【０１１７】
テンプレートとして、１μｌの２９５ｂｐ生成物及び１μｌの１２６ｂｐ生成物を用いたことを除いて、２つの精製フラグメントを、上述のＰＣＲ条件でオリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び６３を用いて、ＰＣＲ反応液中で結合した。従って、Ｈ２Ｏの量は、４１μｌに減少した。３９６ｂｐの結合したＰＣＲ生成物を、ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットを用いて精製し、３０μｌのＨ２Ｏで溶離した。
【０１１８】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．６を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、オリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９６及び９７（図１７）を、オリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び６３とプライマリ合成ヒト抗体重鎖変異体のプラスミドＤＮＡと共にテンプレートとして用いて、オーバーラップＰＣＲを介して構成した。２つのＰＣＲ反応を、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び９７、又はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９６及び６３のプライマ対として用いて実施した。第１段階のＰＣＲを上記のように実施して、２９５ｂｐ及び１２６ｂｐのフラグメントを得た。これらのフラグメントを、上記のように精製し、共に結合させて、再精製した。
【０１１９】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、オリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９８及び９９（図１７）を、オリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び６３とＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．６についてのＰＣＲ生成物と共にテンプレートとして用いて、オーバーラップＰＣＲを介して構成した。２つのＰＣＲ反応を、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び９９又はオリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９８及び６３のプライマ対のいずれかを用いて実施した第１段階のＰＣＲを上記のように実施して、９８ｂｐ及び３１８ｂｐのフラグメントを得た。これらのフラグメントを、上記のように精製し、共に結合させて、再精製した。
【０１２０】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．８を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、オリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１００及び１０１（図１７）を、オリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び６３とＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７についてのＰＣＲ生成物と共にテンプレートとして用いて、オーバーラップＰＣＲを介して構成した。２つのＰＣＲ反応をＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５３及び１０１、又はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１００及び６３のどちらかをプライマ対として用いて実施した。第１段階ＰＣＲを上記のように実施して、２７０ｂｐ及び１５５ｂｐのフラグメントを得た。これらのフラグメントを、上記のように精製し、共に結合させて、再精製した。
【０１２１】
上記のＰＣＲ生成物のそれぞれを、Ｍｌｕ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化させ、同様に消化させたｐＡＮＴ０９内に結紮した。この結紮を、形質転換して配置し、コロニィを選定し、プラスミドを調製して、全て配列した。
【０１２２】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、テンプレートとして、オリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０２及び１０３（図１７）と、プライマリ合成ヒト抗体軽鎖変異体のプラスミドＤＮＡとを用いて、ＰＣＲを介して構成した。重鎖変異体について記載されているように、ＰＣＲ単反応を実施し、３８３ｂｐの生成物を得た。完全な反応液を１％アガロースゲルによって電気泳動し、特異的なバンドを除去し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製した。ＤＮＡを３０μｌのＨ２Ｏで溶離した。
【０１２３】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、テンプレートとして、オリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７４及び８４と共にオリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０４及び１０５（図１７）と、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９についてのＰＣＲ生成物とを用いて、オーバーラップＰＣＲを介して構成した。２つのＰＣＲ反応を、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７４及び１０５、又はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０４及び８４のプライマ対として用いて実施した。第１段階のＰＣＲを重鎖変異体についての上記のように実施して、２６５ｂｐ及び１３９ｂｐのフラグメントを得た。これらのフラグメントを、重鎖変異体についての上記のように精製し、共に結合させて３８３ｂｐの生成物を作成し、再精製した。
【０１２４】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１１を与えるように翻訳するヌクレオチド配列を、テンプレートとして、オリゴヌクレオチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７４及び８４と共にオリゴヌクレオチドプライマＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０６及び１０７（図１７）と、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０についてのＰＣＲ生成物とを用いて、オーバーラップＰＣＲを介して構成した。２つのＰＣＲ反応を、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７４及び１０７、又はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０６及び８４のプライマ対として用いて実施した。第１段階のＰＣＲを重鎖変異体についての上記のように実施して、１４８ｂｐ及び２５６ｂｐのフラグメントを得た。これらのフラグメントを、重鎖変異体についての上記のように精製し、共に結合させて３８３ｂｐの生成物を作成し、再精製した。
【０１２５】
上記のＰＣＲ生成物のそれぞれは、ＢｓｓＨ ＩＩ及びＢａｍＨ Ｉで消化され、同様に消化されたｐＡＮＴ０８内に結紮される。この結紮を上記のように、形質転換して配置し、コロニィを選定し、プラスミドを調製して、上述した通り全て配列した。
【０１２６】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）を、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、及びＬ−プロリンを含む高グルコースＤＭＥＭ中で増殖させた。近融合性培地を、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって指示されているように、リポフェクトアミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）を用いてトランスフェクション用に採取した。トランスフェクションは、０．３μｇの重鎖作成物及び０．２μｇの軽鎖作成物を具える０．５μｇのプラスミドＤＮＡの全てを用いて、３×１０５セル／ｍｌで２００μｌの細胞を播種した４８ウエルプレート中で実施した。
【０１２７】
上澄みを採取する前に、トランスフェクションを、３７℃／５％ＣＯ２で４８から７２時間インキュベートした。抗体発現は：マウスモノクローナル抗−ヒトＩｇＧキャプチャ抗体と、ヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａスタンダードと、ＨＲＰ複合ヤギ抗−ヒトＫａｐｐａ軽鎖と、を検出抗体として用いてＥＬＩＳＡによって定量化した（全ての試薬はＳｉｇｍａ製）。
【０１２８】
重鎖及び軽鎖の全ての組み合わせを遺伝子導入した（即ち、６重鎖×５軽鎖＝３０トランスフェクション）。抗体発現レベルは一般的に、０．５から２．０μｇ／ｍｌの範囲内であるが、重鎖ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．８では、発現は観察されなかった。
【０１２９】
発現抗体を、ＴＮＦ−感受性ＷＥＨＩ−１６４細胞を用いて、ヒトＴＮＦαの活性を無毒化する能力について試験した（Ｅｓｐｅｖｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８６，９５，９９−１０５）。細胞を、３−４時間、９６−ウエルマイクロタイタープレートに、１ウエル当たり５×１０４個の細胞で、１μｇ／ｍｌのアクチノミシンＤに置いた。細胞を４０ｐＭヒトＴＮＦα、及び様々な濃度のキメラ抗体（１ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌの範囲）に曝露させて、検量線を作成した。重鎖及び軽鎖の様々な組み合わせを、２５ｎｇ／ｍｌの単一濃度点で試験した。この濃度は、キメラ抗体のＥＤ５０として既に決定してある。ＥＤ５０のキメラ抗体として以前決定した全アッセイを３回実施した。
【０１３０】
混合物を３７℃で夜通しインキュベートした。最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌに、３−［４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド染料（ＭＴＴ）を添加し、３７℃で４時間、インキュベートし、０．１ＭのＨＣｌ、０．１％ ＳＤＳ中で細胞を溶解し、５５０ｎｍの波長で吸光度を測定して、細胞生存率を決定した。
【０１３１】
重鎖及び軽鎖の組み合わせからの吸光度を用いて、検量線から見掛けの抗体の濃度を計算した。キメラの見掛けの濃度は、変異体の各組み合わせの濃度によって分けられて、倍の差分値を与えた。キメラの値よりも低い値は、これらの組み合わせが、ＴＮＦα細胞毒性から細胞を保護する点でより効果的であることを示すが、より高い値は、これらの効果がより低いことを示した。全ての組み合わせについての値を表５に示す。
【０１３２】
表５
キメラ抗体と比較した合成ヒト抗体変異体の活性率
【０１３３】
次の合成ヒト抗体重鎖及び軽鎖の組み合わせは、１．０に近い倍の差分値を与えた：ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５／１０、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７／４、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７／９、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７／１０。これらの組み合わせを更なる研究用に選択した。
【０１３４】
上記で選択された配列を運搬する発現プラスミドをＮＳ０細胞内に遺伝子導入した（ＥＣＡＣＣ番号第８５１１０５０３号）。これらの細胞を、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、５％超低ＩｇＧ ＦＣＳ及びペン／ストレプ（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を含む高グルコースＤＭＥＭで培養した。細胞を、対数増殖期中に採取し、遠沈して新しい増殖培地内で５×１０６セル／ｍｌで再懸濁した。７５０μｌの細胞を全量３０μｇの各プラスミド対で混合し、これを、５０μｌのＨ２Ｏ内でＳｓｐ Ｉで線形化した。細胞／プラスミド混合物を４ｍｍギャップのキュベットに移し、２５０Ｖ、１５００μＦ、無限抵抗で、Ｅｑｕｉｂｉｏ Ｅａｓｙｊｅｃｔ Ｐｌｕｓを用いてエレクトロポレートした。このエレクトロポレートは、２５ｍｌの予熱した増殖培地に即時移し、１００μｌ／ウエルで、５×９６ウエル平底プレートに置かれた。このプレートを３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。４８時間の後エレクトロポレーションを行い、３００ｎＭメトトレキサートを含有する５０μｌ培地を、各ウエルに加えて、１００ｎＭの最終濃度を与えた。７日間の後エレクトロポレーションを行い、１００ｎＭメトトレキサートを含有する更なる５０μｌの培地を、各ウエルに加えた。
【０１３５】
ほぼ２週間後のエレクトロポレーションを行うと、いくつかのウエルの培地は、黄色になり始め、遺伝子導入されたコロニィ増殖を示した。これらのウエルからの培地を、抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃキャプチャ／抗−ヒトＩｇ Ｋａｐｐａ軽鎖ＨＲＰ複合検出ＥＬＩＳＡを用いて、抗体発現について試験した。試験サンプルを、ヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ標準及び確立されている抗体発現レベルと比較した。抗体のコロニィ発現有効量を、２００ｎＭメトトレキサートを含む培地で増やした。
【０１３６】
抗体をタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを介して５００ｍｌ培養培地から精製し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００を用いて、サイズ排除クロマトグラフィを実施した。精製した抗体を、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって定量化し、ＯＤ２８０１＝１．４ｍｇ／ｍｌを仮定した。
【０１３７】
精製キメラ及び複合抗体を、上記の例４に記載されているＷＥＨＩ−１６４保護アッセイを介して活性について試験した。各抗体を、検量線を作成するのに先に用いた全濃度範囲に渡って試験した（図１８参照）。合成ヒト抗体７／１０（即ち、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７及び１０を含む）は、最も活性な変異体であり、キメラ抗体と同じ活性を有することが分かった。合成ヒト抗体７／９及び５／１０は、キメラと比較して僅かに少ない同様の活性を有し、合成ヒト抗体７／４は、最も活性がなかった。
【０１３８】
従って、合成ヒト抗体７／１０が、最も好ましいＭＨＣクラスＩＩ結合プロファイルを有すると予測され、最も活性な変異体であるので、これを、経時変化Ｔ細胞増殖アッセイでの試験用に選択した。ヒトＰＢＭＣを、２回のＦｉｃｏｌｌ密度遠心分離を介して、ヒト血由来の軟膜から調製した。調製ＰＢＭＣを、９０％ヒトＡＢ血清／１０％ＤＭＳＯ中の１ｍｌアリコートで３×１０７セル／ｍｌの密度で再懸濁し、液体窒素化で貯蔵した。ＰＢＭＣをＤｙｎａｌ Ａｌｌｓｅｔ（登録商標）ＰＣＲタイピングキットを用いて組織分類した。
【０１３９】
リード合成ヒト抗体を、２０人の健康なドナーからのヒトＰＢＭＣを用いて、全タンパク質Ｔ細胞アッセイ中のキメラ抗体と比較した。各ドナーからのＰＢＭＣを解凍し、洗浄して、ＡＩＭ Ｖ血清フリーリンパ球増殖培地で再懸濁した。第１日目に、５０μｇのタンパク質を、２４ウエルプレートの４×１０６のＰＢＭＣ２ｍｌのバルク培地に加え、第６日目から第９日目に、３重に１００μｌアリコートを除去して、９６ウエルプレートに移した。採取して放射能の取り込みを測定する前に、各アリコートを、１μＣｉトリチウム化チミジンを含有する７５μｌ培地で２４時間パルスした。結果を刺激インデックス（ＳＩ）の計算によって標準化した。広範囲のＨＬＡ ＤＲアロタイプのガレージは、個々のＭＨＣハプロタイプによってドナーを選択することによって達成される。
【０１４０】
経時アッセイの結果を、図１９で示す。これらの結果は、キメラ抗体（図１９（ａ））が、２０人のドナー中１０人に少なくとも１日で、Ｔ細胞反応（ＳＩ＞＝２）を導くことを示す。逆に、合成ヒト抗体（図１９（ｂ））は、あらゆる時点であらゆるドナーの反応も誘導することができなかった。従って、非免疫原性合成ヒト抗体は、マウス抗−ＴＮＦα抗体（Ａ２）を参照として用いて、ヒト抗体のセグメントから成功裏に構成された。
【０１４１】
例８：合成タイプＩリボソーム阻害タンパク質の構造
【０１４２】
プラントタイプＩリボソーム阻害タンパク質（ＲＩＰ）ブーガニン（ブーゲンビレアスペクタビリス（Ｂｏｕｇａｉｎｖｉｌｌｅａ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ）に由来する）の合成変異体を、国際公開番号第ＷＯ２００５０９０５７９号で記載されている方法を用いて生成した。ブーガニン中のＴ細胞エピトープのロケーションを、国際公開番号第ＷＯ２００５０９０５７９号に記載のようにオーバーラップ１５マーペプチドの分析によって試験し、表６のＳＥＱ ＩＤ１１−１３のペプチド（残渣１２１−１３５、１３０−１４４、及び１４８−１６２に相当する）をエピトープとして同定した。ブーガニンを、ブーゲンビレアスペクタビリス（Ｂｏｕｇａｉｎｖｉｌｌｅａ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ）植物の葉の組織からクローニングした。製造業者によって指示されているように１００ｍｇ組織からポリＡ Ｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ １０００キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてｍＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを、以下のプライマ：ＡＴＧＴＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＧＴＣＡＴＴＴＡＡＣ及びＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＧＧＡＴＡＣＣを有するＡｃｃｅｓｓＱｕｉｃｋ ＲＴ−ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ｍＲＮＡテンプレートから合成した。第１のプライマは、ＡＴＧ開始コドンを更に含み、第２のプライマは、ＴＡＡ停止コドンを更に含む。ＰＣＲ生成物を、Ｔ／Ａクローニングシステム（ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてクローニングし、いくつかのクローンをベクタ内に含まれるＴ７プロモータの転写方向に配向する修正クローンを同定するように配列した。
【０１４３】
表６
ブーガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）の免疫原性ペプチド配列及び置換ヒト配列セグメント
【０１４４】
表６に示されるように同定されたヒト配列セグメントを含む一連の変異体を作成した。これらは、高品質ポリメラーゼ（エクスパンドＨｉＦｉ、Ｒｏｃｈｅ社）を有するオーバーラップＰＣＲを用いて構成した。５’及び３’プライマは上述のものであり、ＰＣＲ生成物を上述の通りＴ／Ａクローニングベクタにクローニングし、Ｔ７プロモータの転写方向に配向した修正クローンを同定した。クローンを、発光酵素遺伝子を発現する対照ＤＮＡ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｔ７ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含む共役転写及び転写反応中の活性について分析した。ブーガニンはリボソーム不活化タンパク質であるので、発光酵素遺伝子の転写のレベルを著しく下げる。この減少は、従来Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等の発光酵素検出システムを用いて分析されている。精製野生型又は突然変異体ブーニガンプラスミドを、Ｎｏｔ Ｉで線形化し、１０ｎｇ／ｍｌに希釈した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｔ７ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡを１２５ｎｇ／μｌに希釈した。１μｌの各ＤＮＡを、１０μｌのＴｎＴ混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と、０．２５μｌのメチオニンと、０．２５μｌのヌクレアーゼ自由水と混合した（ＴｎＴキットで供給される）。対照は、野生型（ｗｔ）ブーニガンとＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｔ７ Ｃｏｎｔｒｏｌのみであった。反応を３回実施し、３０℃で１時間インキュベートした。５μｌの各反応液を、黒い壁付の９６ウエル照度計プレートに移し、４５μｌの水と、５０μｌのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬を混合した。Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ照度計で発光を読んだ。活性は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｔ７ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡのみで観察された蛍光の割合として表した。
【０１４５】
図２０は、多数の異なる変異体の活性プロファイルを示す。これは、最も活性な変異体が：ペプチド４１中のＶ１２３Ｔ；ペプチド４４中のＶ１３２Ｐ／Ｙ１３３Ｑ；ペプチド４４中のＩ１５２Ｑ；であることを示す。これらの４つの突然変異を含む複合変異体を作成し、活性アッセイで再試験した。この変異体の活性は、図２０のＣＯＭＢによって示され、ｗｔタンパク質の活性のほぼ７５％を維持する。
【０１４６】
残渣１２１−１３５、１３０−１４４、及び１４８−１６２に相当する活性ＣＯＭＢ変異体内のヒト配列セグメントを含むペプチドを合成し、例７に記載したように、２０人の健康なドナーからのヒトＰＢＭＣを有する経時Ｔ細胞アッセイ中の相当する野生型ペプチドと比較した。この結果は、ヒト配列セグメントを含むペプチドが、どの時点でも、どのドナーのＴ細胞増殖も誘発しないが、各野生型ペプチドは、少なくとも１の時点で全ドナーの＞１０％のＳＩ＞２を有する増殖を誘発することを示した。
【０１４７】
例９：合成ヒルジンの構造
【０１４８】
トロンビン阻害ヒルジン（医用蛭（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）に由来する）の合成変異体を野生型として表７のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １４を有するタンパク質を用いて、国際公開番号第ＷＯ２００４１１３３８６号に記載されている方法で生成した。ヒルジンのＴ細胞エピトープのロケーションを、国際公開番号第ＷＯ２００４１１３３８６号に記載されているように、オーバーラップ１５マーペプチドの分析によって試験し、ペプチド２７−４１ＣＩＬＧＳＤＧＥＫＮＱＣＶＴＧが、２０人の健康なドナーからのヒトＰＢＭＣで有意なＴ細胞反応を与えることが示された。ヒトメラノーマ関連抗原（ＡＡＮ４０５０５．１）からのヒト配列セグメントＫＣＲＨを、例８のオーバーラップＰＣＲを用いて、２６−２９でヒルジン残渣を置換するのに使用し、国際公開番号第ＷＯ２００４１１３３８６号に記載されているアッセイを用いる野生型ヒルジンの完全活性化を維持した２８／２９ＲＨに変わる２８／２９ＩＬを有する変異体ヒルジン分子を得た。修飾ペプチド２７−４１ＣＲＨＧＳＤＧＥＫＮＱＣＶＴＧを、この修飾ペプチド中のＴ細胞エピトープ活性の損失を示す例８に示すようなＴ細胞アッセイ中の野生型ペプチド２７−４１ＣＩＬＧＳＤＧＥＫＮＱＣＶＴＧと共に試験した。
【０１４９】
例１０：Ｔｒエピトープを有する合成ヒト抗−ＩｇＥ抗体の構造
【０１５０】
例４の合成ヒト抗−ＩｇＥ抗体からのＶＨ及びＶＬ遺伝子を、同書内のＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．からの標準ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって、オリゴヌクレオチドプライマ対を、ＶＬ−及びＶＨ−特異ＰＣＲ用のテンプレートとして用いて、分離プラスミドベクタにクローニングした。オーバーラップする相補配列を、続く融合ＰＣＲ中に結合したＰＣＲ生成物内に導入し、２０アミノ酸（Ｇ４Ｓ１）４リンカ、又は代替的に、２つのアスパラギン残渣及びＧＧＳトリプレットによって各側に並んだＣ型肝炎コアタンパク質（Ｐ１９，ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１８５（２００２）ｐ７２０−７２７）からの１０アミノ酸Ｔｒエピトープを含む２０アミノ酸配列ＧＧＳＮＮＬＳＣＬＴＩＰＡＳＡＮＮＧＧＳのどちらかのコード配列を形成した。この最終増幅ステップを、制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＢｓｐＥ１を有する続く開裂用のプライマ対で実施し、ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にクローニングした。次いで、合成ヒト抗−ＩｇＥ単鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）の二量体形を、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，９２（１９９５）ｐ７０２１−７０２５の方法によって構成した。二量体ＶＬ−リンカ−ＶＨ−ＶＬ−リンカ−ＶＨフラグメントを、発現ベクタｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，同書）のＥｃｏＲ１／Ｓａｌ１座にサブクローニングし、エレクトロポレーションによって、ＤＨＦＲ−欠損中国ハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞に遺伝子導入した。選択、遺伝子増幅、タンパク質生成を、Ｍａｃｈ ｅｔ ａｌ．，同書によって記載されているように実施した。二量体ｓｃＦｖを、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）カラム（Ｑｉａｇｅｎ社）上の親和性クロマトグラフィよってＣ−末端ヒスチジンテールを介して精製して、ＣＨＡＢＩｇＥＧ４Ｓ １×４（（ＶＬとＶＨの間のＧ４ＳＯ４リンカ）とＣＨＡＢＩｇＥＨＣＶＰ１９（ＶＬとＶＨの間のＨＣＶ Ｔｒエピトープ）を指定した二量体Ｆｖｓを与えた。
【０１５１】
二量体ｓｃＦｖｓを、２０人の健康なドナーからのＰＢＭＣを用いてＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １００（２００２）ｐ４５２９−４５３６に記載された通りに正確に５０μｇ／ｍｌのヒトＴ細胞アッセイで順次試験した。これらの結果は、ＣＨＡＢＩｇＥＧ４Ｓ １×４、又はＣＨＡＢＩｇＥＨＣＶＰ１９のどちらかについてＴ細胞の有意な増殖を示していないが、ＣＨＡＢＩｇＥＧ４Ｓ １×４ではなくＣＨＡＢＩｇＥＨＣＶＰ１９で刺激した２０人のドナーのうちの４人からのＩＬ−１０生成の有意なレベル（ＳＩ＞２）を示した（２０人のドナー中０人のＳＩ＞２）。これは、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０の誘発についての抗体分子内に含まれるＴｒエピトープの効果を示している。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１−１】図１は、合成ヒト抗ＨＥＲ−２抗体に用いられるＶＨ遺伝子の配列である。
【図１−２】図１は、合成ヒト抗ＨＥＲ−２抗体に用いられるＶＨ遺伝子の配列である。
【図１−３】図１は、合成ヒト抗ＨＥＲ−２抗体に用いられるＶＨ遺伝子の配列である。
【図２−１】図２は、合成ヒト抗ＨＥＲ−２抗体に用いられるＶＬ遺伝子の配列である。
【図２−２】図２は、合成ヒト抗ＨＥＲ−２抗体に用いられるＶＬ遺伝子の配列である。
【図２−３】図２は、合成ヒト抗ＨＥＲ−２抗体に用いられるＶＬ遺伝子の配列である。
【図３】図３は、キメラ４Ｄ５ＩｇＧ１／ｋａｐｐａで８日間、インキュベーションした後のヒトＳＫ−ＢＲ−３細胞と、合成ヒト抗−ＨＥＲ２抗体と、キメラ抗−ＩｇＥ対照で抗−ＨＥＲ２「ＥＡＣＨＡＢ」を回避したエピトープの増殖の阻害を示す（例４参照）。
【図４−１】図４は、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を用いたＶＨ遺伝子の配列である。
【図４−２】図４は、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を用いたＶＨ遺伝子の配列である。
【図４−３】図４は、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を用いたＶＨ遺伝子の配列である。
【図５−１】図５は、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を用いたＶＬ遺伝子の配列である。
【図５−２】図５は、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を用いたＶＬ遺伝子の配列である。
【図５−３】図５は、合成ヒト抗−Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体を用いたＶＬ遺伝子の配列である。
【図６−１】図６は、合成ヒト抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたＶＨ遺伝子の配列である。
【図６−２】図６は、合成ヒト抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたＶＨ遺伝子の配列である。
【図６−３】図６は、合成ヒト抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたＶＨ遺伝子の配列である。
【図７−１】図７は、合成ヒト抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたＶＬ遺伝子の配列である。
【図７−２】図７は、合成ヒト抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたＶＬ遺伝子の配列である。
【図７−３】図７は、合成ヒト抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたＶＬ遺伝子の配列である。
【図８】図８は、ヒトＴ細胞エピトープの回避を含む合成マウス抗ヒトＴＮＦα抗体を用いたＶＨ及びＶＬ遺伝子の配列である。
【図９】図９は、合成マウス及びキメラ抗ヒトＴＮＦα抗体によるヒトＴＮＦαへの結合用ＥＬＩＳＡである。
【図１０】図１０は、抗ＴＮＦα抗体Ａ２のＶ領域配列である。
【図１１】図１１は、合成ヒト抗ＴＮＦαＶＨ変異株の配列である。
【図１２】図１２は、合成ヒト抗ＴＮＦαＶＬ変異株の配列である。
【図１３】図１３は、キメラマウス：ヒト抗ＴＮＦαＶＨの構成用オリゴヌクレオチドである。
【図１４】図１４は、キメラマウス：ヒト抗ＴＮＦαＶＬの構成用オリゴヌクレオチドである。
【図１５】図１５は、一次合成ヒト抗ＴＮＦαＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３ 図１１に相当する）の構成用オリゴヌクレオチドである。
【図１６】図１６は、一次合成ヒト抗ＴＮＦαＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４ 図１２に相当する）の構成用オリゴヌクレオチドである。
【図１７】図１７は、二次合成ヒト抗ＴＮＦαＶＨ及びＶＬ変異株の構成用オリゴヌクレオチドである。
【図１８】図１８は、合成ヒト抗ＴＮＦα抗体用ＷＥＨＩ−１６４保護アッセイである。
【図１９】図１９は、リード合成ヒト抗ＴＮＦαの経時ヒトＴ細胞アッセイである。
【図２０】図２０は、挿入されたヒト配列セグメントを有する合成ブーガニン分子の活性である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾抗体又は前記修飾抗体の抗原結合フラグメントにおいて、前記修飾抗体又は抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖可変領域が、各々１又はそれ以上の他の抗体又は抗原結合フラグメントからのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントから成り、前記セグメントが全てＣＤＲｓでもなくフレームワーク領域でもないことを特徴とする修飾抗体又は前記修飾抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１】
修飾抗体又は前記修飾抗体の抗原結合フラグメントにおいて、前記修飾抗体又は抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖可変領域が、各々１又はそれ以上の他の抗体又は抗原結合フラグメントからのアミノ酸配列の２又はそれ以上のセグメントから成り、前記セグメントが全てＣＤＲｓでもなくフレームワーク領域でもないことを特徴とする修飾抗体又は前記修飾抗体の抗原結合フラグメント。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２０１３−２８６１６（Ｐ２０１３−２８６１６Ａ）
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１９８４３３（Ｐ２０１２−１９８４３３）
【出願日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【分割の表示】特願２００７−５５３６９３（Ｐ２００７−５５３６９３）の分割
【原出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【出願人】（５０７１６５４８６）アンチトープ リミテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【分割の表示】特願２００７−５５３６９３（Ｐ２００７−５５３６９３）の分割
【原出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【出願人】（５０７１６５４８６）アンチトープ リミテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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