ヒト癌原蛋白質に特異的な抗体を含む肝硬変症診断キット
ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２から発現された蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて、抗原‐抗体結合反応により検体試料中のＨＣＣＲ‐２蛋白質を検出する方法及びこれを用いた肝硬変症診断キットが開示される。本発明の検出方法及び診断キットは、肝硬変症に対する診断の正確度及び再現性が高いので肝硬変症の早期診断に非常に有用に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２から発現された蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて、抗原‐抗体結合反応によって血液試料中のＨＣＣＲ‐２蛋白質を検出する方法及びこれを用いた肝硬変症診断キットに関する。
【０００２】
〔背景技術〕
肝硬変症とは、肝に結節を形成する広義の繊維化症を称し、慢性肝疾患の末期病変であって持続的で反復的な弥漫性肝損傷とその結果により繊維化と肝細胞の再生結節が形成される疾患である（Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １８：４７〜５３，１９９３；Ｍｉｎａｍｉ Ｈ ａｎｄ Ｏｋａｎｏｕｅ Ｔ，Ｉｎｔ Ｍｅｄ．８０：６４６〜６４９，１９９７；Ｋｉｙｏｓａｗａ Ｋ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：Ｓ４０〜Ｓ４５, ２００２）。肝炎の主要要因としては、一般に、ウイルス、薬剤、アルコール、代謝性疾患、慢性胆汁うっ滞、肝‐静脈血流閉塞などがある。このうちＢ型ウイルス肝炎は、慢性肝炎または肝硬変症の危険を増加させるが、成人で急性肝炎を患う場合には１０％程度、父母から出生直後に垂直感染される場合には９０％以上で慢性Ｂ型肝炎保菌者となり、成人になってから４０〜５０代にその多くが慢性肝炎や肝硬変症に移行する（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ, ３７（３）：５２０〜５２７, ２００３）。一方、Ｃ型ウイルス肝炎も慢性肝炎と肝硬変症の主要要因として推定されており全体肝癌患者の１６．６％においてＣ型肝炎ウイルス抗体に陽性を示す。また、肝硬変症は、肝癌患者の６０〜９０％で認められ、肝硬変症患者の５〜２０％で肝癌が発生するということは、肝硬変症が肝癌の主要危険因子であるということを示唆する。従って、肝硬変症の早期発見及び肝硬変症を来す因子の除去が必要である（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３７（３）：５２０〜５２７, ２００３）。肝硬変を来すことができる因子としては、ウイルス性因子以外にも持続的な暴飲によるアルコール摂取、薬剤、血色素症などがある。従って、これらの疾患と危険因子の早期鑑別と除去、予防接種及び伝染の遮断が重要である。
【０００３】
肝硬変症は肝の炎症が長期間持続された結果、肝の表面が凸凹になる症状を表すが、これは臨床的には範囲が広くて、外見上正常人とほとんど差がなく何の症状もない患者から顔色が悪くやつれており腹水が溜まっている患者に至るまで症状は多様である。肝硬変症はあるが合併症を伴わず臨床的には正常である前者のような状態を代償性肝硬変症と称し、各種の合併症を伴う後者のような状態の肝硬変症を非代償性肝硬変症と称す。
【０００４】
肝硬変症に対する最も確実な検査は、腹腔鏡検査または肝組織検査を通じて成されている。腹腔鏡検査は腹に小さい穴を開けて内視鏡を入れて肝を直接観察する検査であって肝の表面が凸凹になった硬変の所見を示していればそれによって診断を下すことができる。また、組織検査で肝繊維化などの所見が観察されれば肝硬変症診断を下すことができる。しかし、このような検査は患者にとって非常に負担になるだけでなく、大体、診察所見、血液検査、超音波やＣＴ所見などを総合することによって診断することができる。肝硬変症の場合、血清アラニンアミノ転移酵素（ｓｅｒｕｍ ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＬＴ）（従来のＧＯＴ，ＧＰＴ）値、即ち、肝炎数値はあまり高くなく、大体正常であるか正常の２倍以内である場合が多いため診断に有効に適用されていない。代償性肝硬変症の場合には、固有の機能を果たすことのできる肝細胞がある程度十分であるため、アルブミン、ビリルビンなどの数値は正常から大きく外れていないが、非代償性肝硬変症の場合にはそうではないためアルブミンが減少したりビリルビンが増加する所見を示すことがある。肝硬変症または進んだ状態の慢性肝疾患を患う患者達においては機能を果たす肝細胞がどれくらい存在するかが重要であり、アルブミンやビリルビンはこれを概略的にのみ推測できるようにしてくれる指標である。また、肝細胞においては、血液疑固因子を作り出すときに機能する肝細胞が十分でなければこれらが十分作られないため血液疑固が遅延される場合がある。プロトロンビン時間（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ又はＰＴ）という検査は、血液疑固時間を直接測定する検査であり、これもやはり残余肝機能を評価する指標の一つである。肝硬変になると脾臓が大きくなり、大きくなった脾臓内に血小板が多く溜まっており一般の血液検査上、血小板数値が低く示される。原因を知らずに血小板が低下されていれば肝硬変症の可能性を疑うべきである。慢性肝炎におけるように肝炎ウイルスに対する血清学的標識子検査も重要である。韓国の肝硬変症の６０％くらいがＢ型肝炎ウイルスに起因し、２０％くらいがＣ型肝炎ウイルスに起因している。従って、Ｂ型やＣ型肝炎ウイルスの標識子が陽性であれば慢性肝疾患を有している可能性が高く、ここに肝硬変症を示唆するほかの所見があれば臨床的に肝硬変症という診断を下すのにあまり無理はない。
【０００５】
肝癌の早期発見のための選別検査のうち一つである血清アルファー‐胎児蛋白（ａｌｐｈａ‐ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＦＰ）の数値が肝硬変症においては非特異的に増加することもする（Ａｄｉｎｏｌｆｉ Ａ ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１２（２）：１３８〜１５１, １９７５； Ｌｏｋ ＡＳ ａｎｄ Ｌａｉ ＣＬ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ９（１）, １１０〜１１５, １９８９；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＰＪ．Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．５（１）：１４５〜１５９, ２００１）。ＡＦＰ数値は正常な成人の血清には存在しないが多くの肝癌患者においては増加するため肝癌診断に有用に用いられている。しかし、これは肝癌以外に、慢性肝炎、肝硬変症などの陽性疾患や絨毛膜癌腫、肝母細胞腫等の悪性疾患及び妊婦でも増加することがある（Ｃｏｌｌｉｅｒ Ｊ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ Ｍ， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２７：２７３〜２７８, １９９８；Ｏｋｕｄａ Ｋ， Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３２（１ Ｓｕｐｐｌ）：２２５〜２３７, ２０００）。即ち、肝癌を伴わない慢性肝炎と肝硬変症患者の一部においては血清ＡＦＰ数値が非特異的に上昇されることがある。このような理由でＡＦＰは慢性肝疾患患者の肝癌選別のために必ず必要な検査であるが、その数値を解釈して肝癌可否を診断する際には考慮すべき事項が多い。従って、このような研究の一環として肝硬変症患者の早期診断のためには、既存のＡＦＰ検査法などに比べて敏感度と特異度とがより高い新しい血清学的検査方法の開発が求められている。
【０００６】
そこで、本発明者らは、肝硬変症の有効な早期診断のための検査方法を開発しようと研究を重ねた結果、ヒト癌原遺伝子であるＨＣＣＲ‐２（韓国特許公開第２００２‐４１５５０号，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３１５５９８）から発現される蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて、抗原‐抗体結合反応によって肝硬変症を有効に検出できることを確認することによって本発明を完成した。
【０００７】
〔発明の詳細な説明〕
本発明の目的は、肝硬変症の有効な早期診断のために血清中のヒト癌原蛋白質を検出する方法及びこれを用いた肝硬変症診断キットを提供することである。
【０００８】
上記目的より、本発明は、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２から発現された蛋白質に特異的な抗体を含み、抗原‐抗体結合反応を通じて生体試料中のＨＣＣＲ‐２蛋白質の発現を検出する方法及びこれを用いた肝硬変症診断キットを提供する。
【０００９】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１０】
上記ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３１５５９８；韓国特許公開第２００２‐４１５５０号）は、哺乳動物において過発現され癌を誘発する発癌遺伝子であって、染色体１２番の長腕（１２ｑ）に位置し、一つの開放型読み枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を有して、これから約３６ＫＤａの大きさの蛋白質（以下、ＨＣＣＲ‐２蛋白質と称す）が類推される。
【００１１】
ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的な抗体は、ＨＣＣＲ‐２抗原蛋白質を動物に免疫させて得られた抗血清または卵から精製したものが望ましく、特にウサギに免疫させて得られた血清から精製した多重クローン（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗体が望ましい。
【００１２】
ＨＣＣＲ‐２蛋白質を特異的に認識する抗体を製造するためには、まず、ＨＣＣＲ‐２蛋白質を入手する必要がある。ＨＣＣＲ‐２蛋白質は、公知のアミノ酸配列を用いて合成したり遺伝子工学的方法によって組換え蛋白質の形態で生産することができる。例えば、ＮＩＨプログラムＧｅｎＢａｎｋ上に登録されたＨＣＣＲ‐２遺伝子の塩基配列を用いてＨＣＣＲ‐２蛋白質を組換え蛋白質の形態で発現する発現ベクターを製造する段階と、上記発現ベクターを大腸菌に形質転換させてＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質を生産する形質転換体を得る段階と、上記形質転換体を培養してヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質を分離・精製する段階とによってＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質を製造することができる。
【００１３】
本発明の望ましい実施例においては、ＨＣＣＲ‐２遺伝子のアミノ酸配列１１２〜３０４を含有するｐＭＡＬ‐ｐ２Ｘ／ＨＣＣＲ‐２１１２‐３０４ベクターに形質転換された大腸菌ＢＬ２１からＮ‐末端にマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）が融合された組換え蛋白質を生産した後、適切な酵素を処理してマルトースを分離・精製したＨＣＣＲ‐２１１２‐３０４蛋白質を抗原蛋白質として用いる。上記のように大腸菌形質転換体から生産された蛋白質がＨＣＣＲ‐２１１２‐３０４組換え蛋白質であることを確認するためにウェスタンブロット分析を行った結果、約６６ＫＤａの分子量（ｐＭＡＬの４５ＫＤａ＋ＨＣＣＲ‐２１１２‐３０４の１６ＫＤａ）を有するＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質が特異的に検出されることを確かめた。
【００１４】
大腸菌形質転換体から分離・精製されたＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質は、ウサギの免疫化を通じて多重クローン抗体を生産するための抗原として用いられる。
【００１５】
多重抗体の開発に必要な免疫化されたウサギは、上記から分離・精製されたＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質と同量のプロイント完全補助抗原（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を乳状化されるまでよく混合して、ウサギの皮下に注射した後、ウサギの免疫性を向上させるためにさらに抗原注入（ｂｏｏｓｔｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して得られる。このとき、完全補助抗原を用いずにＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質をプロイント不完全補助抗原（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）に乳状化させてウサギの皮下内にさらに３回以上にかけて注射することが望ましい。このようにＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質抗原が注射されて免疫化されたウサギから血清を採取して抗体の力価を測定する。
【００１６】
上記のように生産されたＨＣＣＲ‐２特異的な抗体を用いて抗原‐抗体結合反応によって癌を診断する方法は、当分野において公知の酵素結合免疫吸着分析法（ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット、免疫ブロット分析または免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）などの方法によって、対象者の生体試料（検体）中に上記蛋白質が発現されたかを確認することによって診断することができる。
【００１７】
生体試料（検体）としては、組織、血清または血漿を用いることができて、血清が最も望ましい。
【００１８】
本発明の望ましい一例として、ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的な抗体を用いた酵素結合免疫吸着分析法は、
１）検体及び対照群がコーティングされた反応器にＨＣＣＲ‐２特異的な抗体を入れて反応させる段階と、
２）上記反応を通じて生成された抗原‐抗体反応物を２次抗体‐接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）及び発色基質溶液を用いて検出する段階と、
３）検体と対照群に対する検出結果を比較する段階と、を含み得る。
【００１９】
また、ＥＬＩＳＡ方法とともに、上記ＨＣＣＲ‐２特異的な抗体を生物学的マイクロチップ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ）上に固定させた後、対象者から分離された生体試料と反応させて上記抗体蛋白質に対する抗原を検出することができる生物学的マイクロチップ及び自動化された微細配列システム（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ）を用いれば大量に試料を分析することができる。
【００２０】
また、本発明は肝硬変症を有効に早期診断するために、上記ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的に反応する抗体を構成要素として含む肝硬変症診断キットを提供する。
【００２１】
本発明の診断キットは、
１）ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的な抗体と、
２）ＨＣＣＲ‐２標準抗原を含む陽性対照群と上記抗原が注入されなかった動物の抗血清を含む陰性対照群と、
３）基質との反応により発色する標識体が接合された２次抗体接合体と、
４）上記標識体と発色反応する発色基質溶液と、
５）各反応段階に用いられる洗浄液と、
６）酵素反応停止溶液とを含むことを特徴とする。
【００２２】
上記診断キットは、抗原‐抗体結合反応を通じて抗体蛋白質に対する抗原を定量分析または定性分析することによって肝硬変症を診断することができ、上記抗原‐抗体結合反応は通常のＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、サンドイッチ測定法、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット、免疫ブロット分析または免疫組織化学染色方法で測定することができる。例えば、検体及び対照群を表面にコーティングさせた９６ウェルマイクロタイタープレートなどを用いて、上記組換え単一クローン抗体蛋白質と反応するＥＬＩＳＡを行うように上記診断キットを提供することができる。
【００２３】
上記抗原‐抗体結合反応のための反応器としては、ニトロセルローズ膜、ポリビニル（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）樹脂またはポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）及びガラスからなるスライドガラスなどが用いられ得る。
【００２４】
本発明の抗体は前述したように、ＨＣＣＲ‐２蛋白質抗原を動物に免疫させて得られた抗血清から精製することが望ましい。本発明のＨＣＣＲ‐２特異的な抗体は反応器当り１ないし１０μｇ／１００μｇに添加することが望ましい。
【００２５】
本発明の診断キットに含まれる対照群には、陽性対照群と陰性対照群とがあるが、陽性対照群はＨＣＣＲ‐２蛋白質標準抗原を含む混合物であり、陰性対照群はＨＣＣＲ‐２蛋白質抗原で感染されなかった動物の血清である。本発明の望ましい実施例においては、蛋白質濃度がそれぞれ０ｎｇ／ｍｌ（Ａ）、２０ｎｇ／ｍｌ（Ｂ）、４０ｎｇ／ｍｌ（Ｃ）、８０ｎｇ／ｍｌ（Ｄ）、１６０ｎｇ／ｍｌ（Ｅ）、３２０ｎｇ／ｍｌ（Ｆ）及び６４０ｎｇ／ｍｌ（Ｇ）であるＨＣＣＲ‐２蛋白質標準抗原溶液を用意して用いた。
【００２６】
上記２次抗体の標識体としては、発色反応をする通常の発色剤が望ましく、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、塩基性脱燐酸化酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、ＦＩＴＣ （ｐｏｌｙ Ｌ‐ｌｙｓｉｎｅ‐ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＲＩＴＣ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐Ｂ‐ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などの蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素（ｄｙｅ）などの標識体が用いられ得る。本発明においては、例えば、ヤギ由来の抗‐ウサギＩｇＧ‐ＨＲＰ接合体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ‐ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ‐ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いる。
【００２７】
上記発色を誘導する基質は発色反応をする標識体に応じて用いることが望ましく、ＴＭＢ（３,３',５,５'‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ[２,２'‐ａｚｉｎｏ‐ｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ‐６‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）]、ＯＰＤ（ｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）などを用いることができる。このとき、発色剤基質は、緩衝溶液（０.１ Ｍ ＮａＡｃ, ｐＨ５.５）に溶解された状態で提供されることがさらに望ましい。ＴＭＢのような発色基質は２次抗体接合体の標識体として用いられたＨＲＰによって分解されて発色沈積体を生成し、その発色沈積体の沈積程度を肉眼で確認することによってＨＣＣＲ‐２蛋白質抗原の存在有無を検出する。
【００２８】
上記洗浄液は、燐酸塩緩衝溶液、ＮａＣｌ及びツイン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）を含むことが望ましく、０.０２Ｍ燐酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）、０.１３Ｍ ＮａＣｌ、及び０.０５％ ツイン２０から構成された緩衝溶液がさらに望ましい。洗浄液は抗原‐抗体結合反応後、抗原‐抗体結合体に２次抗体を反応させた後、適当量を反応器に入れて３回ないし６回洗浄するものである。ブロッキング溶液としては、０.１％ ＢＳＡを含有する燐酸塩緩衝溶液が望ましく、反応停止溶液としては２Ｎの硫酸溶液が望ましい。
【００２９】
上記診断キットを用いて検体試料内のＨＣＣＲ‐２抗原を検出することによって肝硬変症を早期に診断する方法は、陽性及び陰性対照群と検体試料にＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を各々反応させ、洗浄液で洗浄した後、基質との反応によって発色する標識体が標識された２次抗体接合体を加え、洗浄液で再洗浄した後、上記基質含有溶液を添加して発色反応させ、４５０ｎｍでの吸光度を測定することを特徴とする。このとき、標準抗原溶液Ａの吸光度は平均値が０.０００以上であり０.２００以下であるべきであり、Ｆの吸光度は１.２００以上であり３.０００以下であるべきである。標準抗原溶液Ａ及びＦの吸光度の中間値を閾値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）として検体を陽性または陰性に判定する基準とする。検体の吸光度が標準抗原溶液Ｆの吸光度より大きい場合には検体を希釈した後再測定する。検体の吸光度が閾値以上である場合を陽性と判断し、以下である場合を陰性と判断する。
【００３０】
本発明によるヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２に特異的な抗体を含む肝硬変症診断キットは、患者の血液を用いる新しい免疫学的診断道具として正確度及び再現性が高いという事実が確認された。既存に肝硬変症に対する血清学的診断道具としては、肝癌で用いられているＡＦＰ肝癌診断剤が用いられていたが診断的正確度が肝硬変症においては非常に低い。
【００３１】
しかし、肝硬変症の早期診断のための血清ＨＣＣＲ‐２検査法は、既存のＡＦＰ検査法を用いた肝硬変症診断より診断的正確度が統計的に有意に高かった（９５.１％）。従って、本発明によるヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２を用いた肝硬変症検出方法及び肝硬変症診断キットは、診断の正確度及び再現性が高くて肝硬変症の早期診断に非常に有用な道具として用いることができる。
【００３２】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、ｐＭＡＬ‐ｐ２Ｘ／ＨＣＣＲ‐２ベクターに形質転換された大腸菌ＢＬ２１菌株から分離・精製されたＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質の免疫ブロットの結果を示したものであり、図２は、本発明のＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を用いた診断キットで肝硬変症患者及び正常人の血液を対象としてＨＣＣＲ‐２蛋白質の発現を検出した結果を示したものである。
【００３３】
〔発明の実施のための最良の形態〕
以下、本発明を下記実施例に基づいてより詳しく説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するだけであって、本発明の内容は下記実施例により限定されるのではない。
【００３４】
＜実施例１＞ ＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体の生産
＜１‐１＞ ＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質の生産
肝硬変診断のための腫瘍の標識物質としてのヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２に特異的な抗体を生産するために、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２の一部（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３１５５９８のアミノ酸配列１１２ないし３０４に該当）をｐＭＡＬＴＭ‐ｐ２Ｘ発現ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ, ＭＡ）の多重クローニング部位に挿入してｐＭＡＬＴＭ‐ｐ２Ｘ／ＨＣＣＲ‐２１１２‐３０４ベクターを作製した。上記ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ, ＷＩ）に形質転換した後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β‐Ｄ‐ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏ‐ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ, Ｓｉｇａｍａ）処理で発現を誘導して約４５ＫＤａのマルトース結合蛋白質が融合された６６ＫＤａのＨＣＣＲ‐２１１２‐３０４融合蛋白質を生産し、これをアミロース樹脂キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で精製した（国際出願公開第ＷＯ０２／４４３７０ Ａ１号）。精製された組換え蛋白質を免疫ブロットした結果、約６６ＫＤａの融合蛋白質が多量含有されていることを確認した（図１）。このように分離・精製されたＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質は、ウサギの免疫化及び多重クローン抗体を生産するための抗原‐抗体結合反応の抗原として用いられた。
【００３５】
＜１‐２＞ ウサギの免疫化
上記＜１‐１＞で獲得したＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質に特異的な抗体生産のための動物としては、約２.５ｋｇ重量のＮＺＷウサギを用いた。ＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質（２００μｇ／ｍｌ）とプロイント完全補助剤（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.）を各々同量混合して乳化させた。上記乳化液２ｍｌをウサギの皮下に各々０.２５ｍｌずつ８か所に筋肉注射して１次接種した。追加抗原注入（Ｂｏｏｓｔｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）は１次接種後、２週間隔で数回行い、免疫抗原をプロイント不完全補助剤（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.）で乳化して１次接種と同一の方法で施した。
【００３６】
＜１‐３＞ ウサギ血清（Ｒａｂｂｉｔ ｓｅｒｕｍ）の分離及び特異多重抗体の選別
＜１‐２＞のように免疫化されたウサギの動脈から最終接種以後５日目から２週間隔で血液を採取して血清を分離した後、−２０℃に保管して各種の実験測定に用いた。上記血清は抗体特異性を調べたところ、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２蛋白質にのみ特異的に反応した。採取した血清よりヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質抗原にのみ特異的に反応する血清を選別するために、上記＜１‐１＞の大腸菌形質転換体から分離・精製されたＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質を抗原として用いたＥＬＩＳＡを行った。
【００３７】
具体的に、非特異性免疫反応を抑制するために、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ Ｃｏ., ＵＳＡ）を１％脱脂粉乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）‐ＰＢＳを添加して室温で１時間露出させコーティングした後、ウェル当り１ｕｇの組換え蛋白質をコーティングした。上記ウェルにウサギ血清の原液を２％ ＢＳＡを含有したＰＢＳ溶液で各々１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７の濃度に希釈させた後、希釈液をウェル当り各々１００μｌずつ添加した後、３７℃で２時間抗原‐抗体結合反応を行った以後ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。以後、２％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝溶液で希釈（１：１０,０００）されたヤギ由来の抗‐ウサギＩｇＧ‐ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ., ＵＳＡ）２次抗体をウェル当り１００μｌずつ添加して３７℃で１時間反応させた。
【００３８】
以後、０.１Ｍシートレート燐酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｃｉｔｒａｔｅ, ｐＨ ５.０）１０ｍｌに、１ｍｇのＴＭＢ（３.３', ５.５'‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ, Ｓｉｇｍａ Ｃｏ., ＵＳＡ）と２０μｌの３５％過酸化水素を混合して製造した基質溶液をウェル当り１００μｌずつ添加して酵素反応を誘導した。室温で１５分間酵素反応を維持させた後、同量の２Ｎ硫酸溶液を添加して酵素反応を中断させてから発色反応の程度を４５０ｎｍで測定した。これからＨＣＣＲ‐２抗原に対する特異抗体を有している多重クローン抗体をＥＬＩＳＡで分析したとき抗体力価が陰性対照群より１０倍以上高い血清を再選別して特性分析を始めた。
【００３９】
＜実施例２＞ ＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を用いたＥＬＩＳＡ
ＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を用いたＥＬＩＳＡによって肝硬変症を診断する方法は、（１）検体試料を処理してウェルにコーティングさせる段階と、（２）ＥＬＩＳＡプレートのウェルにウサギから分離・精製したＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体をコーティングする段階と、（３）検体試料内に存在するＨＣＣＲ‐２抗原がウェルの抗体に結合されていることを検出する段階とによって行われた。
【００４０】
＜２‐１＞ ウェルに検体試料のコーティング
検体試料としては、肝硬変症患者から抽出した血液、肝炎患者から抽出した血液、正常人の血液から血清を分離して用意し、閾値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）測定のための標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）は、ＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質を各々０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ, ３２０ｎｇ／ｍｌ及び６４０ｎｇ／ｍｌの濃度で希釈した標準抗原溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを用いた。底が平らな９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに検体試料を１００μｌずつ分株した後、３７℃で４時間反応させ各ウェルを洗浄用緩衝溶液（０.０５％ ツイン２０を含んだＰＢＳ、ｐＨ ７.４）で４回洗浄した。このとき、陽性対照群としては上記で用意した標準抗原溶液を添加し、陰性対照群としては正常ウサギの血清を同量添加した。
【００４１】
＜２‐２＞ ＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体の添加
検体がコーティングされたプレートの各ウェルに上記＜１‐３＞で用意したＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を注入し蓋をした後、４℃で１６ないし１８時間放置した。このとき、多重クローン抗体は５μｇ／ｍｌ濃度で０.５Ｍ炭酸塩緩衝溶液（ｐＨ ９.６）に希釈した後１００μｌずつウェルに添加した。対照群としてＨＣＣＲ‐２蛋白質で免疫されなかったウサギの血清（正常ウサギの血清）を炭酸塩緩衝溶液に５００倍希釈して１００μｌずつウェルに分株した。
【００４２】
その後、プレートのウェルを洗浄用緩衝溶液で４回洗浄し非特異的蛋白質の結合部位を遮断するためにブロッキング溶液（２％ ＢＳＡを含んだＰＢＳ（ｐＨ ７.４）緩衝溶液）を３００μｌずつ分株した後、３７℃で２時間放置した。
【００４３】
＜２‐３＞ 抗原‐抗体結合体の検出
山葵ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｒｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識されたヤギ由来の抗‐ウサギＩｇＧ２次抗体を１：１０，０００に希釈させて上記の各ウェルに１００μｌずつ添加し、プレートを３７℃で１時間定置した後各ウェルを洗浄用緩衝溶液で４回洗浄した。続いて、基質であるＴＭＢ（３.３', ５.５'‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ, Ｓｉｇｍａ Ｃｏ., ＵＳＡ）１ｍｇを基質用緩衝溶液（クエン酸緩衝溶液、ｐＨ５.０）１０ｍｌに溶解させ、３５％過酸化水素を２μｌになるように添加して基質溶液を製造した。上記基質溶液１００μｌずつをウェルに入れ光を遮断して室温で１５分間反応させた後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４溶液を５０μｌずつ添加して反応を停止させた。基質溶液の発色反応程度は４５０ｎｍ波長での吸光度を測定することによって決定した。
【００４４】
各検体試料の吸光度から、陽性対照群であるＨＣＣＲ‐２融合蛋白質のみがコーティングされたウェルの吸光度と陰性対照群であるＰＢＳのみを入れたウェルの吸光度とを引いた残りをＨＣＣＲ‐２抗原による吸光度として推定した。また、同一方法で標準液の吸光度を計算した後、標準液ＡとＦの吸光度の中間値を閾値と定め、吸光度が閾値以上である検体は陽性に判定し、以下である検体は陰性に判定した。このとき、標準液Ａの吸光度は平均値が０.０００以上であり０.２００以下であるべきであり、標準液Ｆの吸光度は平均値が１.２００以上であり３.０００以下であるべきである。
【００４５】
ＨＣＣＲ‐２標準抗原溶液を用いて作成した標準曲線から閾値を１０μｇ／ｍｌに決め、これを基準として各検体の吸光度を比較して陽／陰性を判定した。肝硬変症患者及び正常人においてＥＬＩＳＡ方法によりＨＣＣＲ‐２蛋白質の血中濃度を測定した結果は図３に示した。
【００４６】
＜実施例３＞ ＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を用いたＥＬＩＳＡによる肝硬変症診断の効率性確認
＜３‐１＞ 肝硬変症患者群におけるＡＦＰとＨＣＣＲ‐２キットの診断正確度の比較
本発明によるＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を用いたＥＬＩＳＡ診断キット及び検出方法による肝硬変症診断の効率性を確認するために、実施例２に記載されたＨＣＣＲ‐２特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡ方法と既存に肝癌または肝硬変症診断のために用いられてきた血清アルファー‐胎児蛋白（ａｌｐｈａ‐ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ, ＡＦＰ）の数値測定方法を比較した。このとき、ＡＦＰ数値は市販されているＥＬＳＡ２‐ＡＦＰ測定キット（ＣＩＳ Ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ, Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定した。
【００４７】
診断結果の陽／陰性は、ＡＦＰの場合には２０ｎｇ／ｍｌを、ＨＣＣＲ‐２の場合には標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）から得られた１０μｇ／ｍｌを各々の閾値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）として決定した。肝硬変症群と正常群との各集団内におけるＡＦＰとＨＣＣＲ‐２との陽性反応率の差はマクネマー（ＭｃＮｅｍａｒ）検定で比較し、肝硬変症群と正常群からＨＣＣＲ‐２の敏感度、特異度、偽陽／陰性率と各々の９５％信頼区間を推定した。ＨＣＣＲ‐２の集団間の陽性反応率の差はフィッシャーの正確度テスト（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）で、各集団内におけるＡＦＰとＨＣＣＲ‐２間の陽性反応率の差はマクネマー検定で比較した。全ての統計的分析にはＳＡＳ分散６.１２（ＳＡＳ．ＳＡＳ／ＳＴＡＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅ： Ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｒｅｌｅａｓｅ ６.１２．Ｃａｒｙ, ＮＣ： ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ, １９９７）が用いられ、検定の有意水準は０.０５とした。
【００４８】
下記表１に６２人の肝硬変症患者群よりＡＦＰ数値が確認できなかった１人の肝硬変症患者を除いた６１人におけるＨＣＣＲ‐２とＡＦＰキットとの診断正確度を比較した。その結果、ＨＣＣＲ‐２の診断正確度は９５.１％で、ＡＦＰの１８.０％に比べて有意に高く示された（
【００４９】
【数１】
【００５０】
ｄｆ＝１, Ｐ＝０.０００１, マクネマーテスト）。
【００５１】
【表１】
【００５２】
＜３‐２＞ ＨＣＣＲ‐２キットの肝硬変症診断道具としての有用性確認
下記表２及び表３からわかるように、６２人の肝硬変症患者と１３８人の正常人とを対象として実施例２のＨＣＣＲ‐２特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ方法で肝硬変症を診断したとき、本発明のＨＣＣＲ‐２キットの敏感度は９５.２％、特異度は９１.３％であり、偽陽性率と偽陰性率は各々１６.９％と２.３％で示された。また、全体診断の正確度は９２.５％に示されて、診断道具としての有用性が非常に高いことを確かめた。
【００５３】
【表２】
【００５４】
【表３】
【００５５】
〔産業上の利用可能性〕
上述したように、本発明によるヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２に特異的な抗体を含む肝硬変症診断キットは、患者の血液を用いる新しい免疫学的肝硬変症診断道具であって、肝硬変症に対する診断的正確度及び再現性が高く肝硬変症の早期診断に有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ｐＭＡＬ‐ｐ２Ｘ／ＨＣＣＲ‐２ベクターに形質転換された大腸菌ＢＬ２１菌株から分離・精製されたＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質の免疫ブロットの結果を示したものである。
【図２】本発明のＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を用いた診断キットで肝硬変症患者及び正常人の血液を対象としてＨＣＣＲ‐２蛋白質の発現を検出した結果を示したものである。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２から発現された蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて、抗原‐抗体結合反応によって血液試料中のＨＣＣＲ‐２蛋白質を検出する方法及びこれを用いた肝硬変症診断キットに関する。
【０００２】
〔背景技術〕
肝硬変症とは、肝に結節を形成する広義の繊維化症を称し、慢性肝疾患の末期病変であって持続的で反復的な弥漫性肝損傷とその結果により繊維化と肝細胞の再生結節が形成される疾患である（Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １８：４７〜５３，１９９３；Ｍｉｎａｍｉ Ｈ ａｎｄ Ｏｋａｎｏｕｅ Ｔ，Ｉｎｔ Ｍｅｄ．８０：６４６〜６４９，１９９７；Ｋｉｙｏｓａｗａ Ｋ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：Ｓ４０〜Ｓ４５, ２００２）。肝炎の主要要因としては、一般に、ウイルス、薬剤、アルコール、代謝性疾患、慢性胆汁うっ滞、肝‐静脈血流閉塞などがある。このうちＢ型ウイルス肝炎は、慢性肝炎または肝硬変症の危険を増加させるが、成人で急性肝炎を患う場合には１０％程度、父母から出生直後に垂直感染される場合には９０％以上で慢性Ｂ型肝炎保菌者となり、成人になってから４０〜５０代にその多くが慢性肝炎や肝硬変症に移行する（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ, ３７（３）：５２０〜５２７, ２００３）。一方、Ｃ型ウイルス肝炎も慢性肝炎と肝硬変症の主要要因として推定されており全体肝癌患者の１６．６％においてＣ型肝炎ウイルス抗体に陽性を示す。また、肝硬変症は、肝癌患者の６０〜９０％で認められ、肝硬変症患者の５〜２０％で肝癌が発生するということは、肝硬変症が肝癌の主要危険因子であるということを示唆する。従って、肝硬変症の早期発見及び肝硬変症を来す因子の除去が必要である（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３７（３）：５２０〜５２７, ２００３）。肝硬変を来すことができる因子としては、ウイルス性因子以外にも持続的な暴飲によるアルコール摂取、薬剤、血色素症などがある。従って、これらの疾患と危険因子の早期鑑別と除去、予防接種及び伝染の遮断が重要である。
【０００３】
肝硬変症は肝の炎症が長期間持続された結果、肝の表面が凸凹になる症状を表すが、これは臨床的には範囲が広くて、外見上正常人とほとんど差がなく何の症状もない患者から顔色が悪くやつれており腹水が溜まっている患者に至るまで症状は多様である。肝硬変症はあるが合併症を伴わず臨床的には正常である前者のような状態を代償性肝硬変症と称し、各種の合併症を伴う後者のような状態の肝硬変症を非代償性肝硬変症と称す。
【０００４】
肝硬変症に対する最も確実な検査は、腹腔鏡検査または肝組織検査を通じて成されている。腹腔鏡検査は腹に小さい穴を開けて内視鏡を入れて肝を直接観察する検査であって肝の表面が凸凹になった硬変の所見を示していればそれによって診断を下すことができる。また、組織検査で肝繊維化などの所見が観察されれば肝硬変症診断を下すことができる。しかし、このような検査は患者にとって非常に負担になるだけでなく、大体、診察所見、血液検査、超音波やＣＴ所見などを総合することによって診断することができる。肝硬変症の場合、血清アラニンアミノ転移酵素（ｓｅｒｕｍ ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＬＴ）（従来のＧＯＴ，ＧＰＴ）値、即ち、肝炎数値はあまり高くなく、大体正常であるか正常の２倍以内である場合が多いため診断に有効に適用されていない。代償性肝硬変症の場合には、固有の機能を果たすことのできる肝細胞がある程度十分であるため、アルブミン、ビリルビンなどの数値は正常から大きく外れていないが、非代償性肝硬変症の場合にはそうではないためアルブミンが減少したりビリルビンが増加する所見を示すことがある。肝硬変症または進んだ状態の慢性肝疾患を患う患者達においては機能を果たす肝細胞がどれくらい存在するかが重要であり、アルブミンやビリルビンはこれを概略的にのみ推測できるようにしてくれる指標である。また、肝細胞においては、血液疑固因子を作り出すときに機能する肝細胞が十分でなければこれらが十分作られないため血液疑固が遅延される場合がある。プロトロンビン時間（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ又はＰＴ）という検査は、血液疑固時間を直接測定する検査であり、これもやはり残余肝機能を評価する指標の一つである。肝硬変になると脾臓が大きくなり、大きくなった脾臓内に血小板が多く溜まっており一般の血液検査上、血小板数値が低く示される。原因を知らずに血小板が低下されていれば肝硬変症の可能性を疑うべきである。慢性肝炎におけるように肝炎ウイルスに対する血清学的標識子検査も重要である。韓国の肝硬変症の６０％くらいがＢ型肝炎ウイルスに起因し、２０％くらいがＣ型肝炎ウイルスに起因している。従って、Ｂ型やＣ型肝炎ウイルスの標識子が陽性であれば慢性肝疾患を有している可能性が高く、ここに肝硬変症を示唆するほかの所見があれば臨床的に肝硬変症という診断を下すのにあまり無理はない。
【０００５】
肝癌の早期発見のための選別検査のうち一つである血清アルファー‐胎児蛋白（ａｌｐｈａ‐ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＦＰ）の数値が肝硬変症においては非特異的に増加することもする（Ａｄｉｎｏｌｆｉ Ａ ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１２（２）：１３８〜１５１, １９７５； Ｌｏｋ ＡＳ ａｎｄ Ｌａｉ ＣＬ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ９（１）, １１０〜１１５, １９８９；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＰＪ．Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．５（１）：１４５〜１５９, ２００１）。ＡＦＰ数値は正常な成人の血清には存在しないが多くの肝癌患者においては増加するため肝癌診断に有用に用いられている。しかし、これは肝癌以外に、慢性肝炎、肝硬変症などの陽性疾患や絨毛膜癌腫、肝母細胞腫等の悪性疾患及び妊婦でも増加することがある（Ｃｏｌｌｉｅｒ Ｊ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ Ｍ， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２７：２７３〜２７８, １９９８；Ｏｋｕｄａ Ｋ， Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３２（１ Ｓｕｐｐｌ）：２２５〜２３７, ２０００）。即ち、肝癌を伴わない慢性肝炎と肝硬変症患者の一部においては血清ＡＦＰ数値が非特異的に上昇されることがある。このような理由でＡＦＰは慢性肝疾患患者の肝癌選別のために必ず必要な検査であるが、その数値を解釈して肝癌可否を診断する際には考慮すべき事項が多い。従って、このような研究の一環として肝硬変症患者の早期診断のためには、既存のＡＦＰ検査法などに比べて敏感度と特異度とがより高い新しい血清学的検査方法の開発が求められている。
【０００６】
そこで、本発明者らは、肝硬変症の有効な早期診断のための検査方法を開発しようと研究を重ねた結果、ヒト癌原遺伝子であるＨＣＣＲ‐２（韓国特許公開第２００２‐４１５５０号，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３１５５９８）から発現される蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて、抗原‐抗体結合反応によって肝硬変症を有効に検出できることを確認することによって本発明を完成した。
【０００７】
〔発明の詳細な説明〕
本発明の目的は、肝硬変症の有効な早期診断のために血清中のヒト癌原蛋白質を検出する方法及びこれを用いた肝硬変症診断キットを提供することである。
【０００８】
上記目的より、本発明は、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２から発現された蛋白質に特異的な抗体を含み、抗原‐抗体結合反応を通じて生体試料中のＨＣＣＲ‐２蛋白質の発現を検出する方法及びこれを用いた肝硬変症診断キットを提供する。
【０００９】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１０】
上記ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３１５５９８；韓国特許公開第２００２‐４１５５０号）は、哺乳動物において過発現され癌を誘発する発癌遺伝子であって、染色体１２番の長腕（１２ｑ）に位置し、一つの開放型読み枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を有して、これから約３６ＫＤａの大きさの蛋白質（以下、ＨＣＣＲ‐２蛋白質と称す）が類推される。
【００１１】
ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的な抗体は、ＨＣＣＲ‐２抗原蛋白質を動物に免疫させて得られた抗血清または卵から精製したものが望ましく、特にウサギに免疫させて得られた血清から精製した多重クローン（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗体が望ましい。
【００１２】
ＨＣＣＲ‐２蛋白質を特異的に認識する抗体を製造するためには、まず、ＨＣＣＲ‐２蛋白質を入手する必要がある。ＨＣＣＲ‐２蛋白質は、公知のアミノ酸配列を用いて合成したり遺伝子工学的方法によって組換え蛋白質の形態で生産することができる。例えば、ＮＩＨプログラムＧｅｎＢａｎｋ上に登録されたＨＣＣＲ‐２遺伝子の塩基配列を用いてＨＣＣＲ‐２蛋白質を組換え蛋白質の形態で発現する発現ベクターを製造する段階と、上記発現ベクターを大腸菌に形質転換させてＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質を生産する形質転換体を得る段階と、上記形質転換体を培養してヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質を分離・精製する段階とによってＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質を製造することができる。
【００１３】
本発明の望ましい実施例においては、ＨＣＣＲ‐２遺伝子のアミノ酸配列１１２〜３０４を含有するｐＭＡＬ‐ｐ２Ｘ／ＨＣＣＲ‐２１１２‐３０４ベクターに形質転換された大腸菌ＢＬ２１からＮ‐末端にマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）が融合された組換え蛋白質を生産した後、適切な酵素を処理してマルトースを分離・精製したＨＣＣＲ‐２１１２‐３０４蛋白質を抗原蛋白質として用いる。上記のように大腸菌形質転換体から生産された蛋白質がＨＣＣＲ‐２１１２‐３０４組換え蛋白質であることを確認するためにウェスタンブロット分析を行った結果、約６６ＫＤａの分子量（ｐＭＡＬの４５ＫＤａ＋ＨＣＣＲ‐２１１２‐３０４の１６ＫＤａ）を有するＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質が特異的に検出されることを確かめた。
【００１４】
大腸菌形質転換体から分離・精製されたＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質は、ウサギの免疫化を通じて多重クローン抗体を生産するための抗原として用いられる。
【００１５】
多重抗体の開発に必要な免疫化されたウサギは、上記から分離・精製されたＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質と同量のプロイント完全補助抗原（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を乳状化されるまでよく混合して、ウサギの皮下に注射した後、ウサギの免疫性を向上させるためにさらに抗原注入（ｂｏｏｓｔｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して得られる。このとき、完全補助抗原を用いずにＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質をプロイント不完全補助抗原（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）に乳状化させてウサギの皮下内にさらに３回以上にかけて注射することが望ましい。このようにＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質抗原が注射されて免疫化されたウサギから血清を採取して抗体の力価を測定する。
【００１６】
上記のように生産されたＨＣＣＲ‐２特異的な抗体を用いて抗原‐抗体結合反応によって癌を診断する方法は、当分野において公知の酵素結合免疫吸着分析法（ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット、免疫ブロット分析または免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）などの方法によって、対象者の生体試料（検体）中に上記蛋白質が発現されたかを確認することによって診断することができる。
【００１７】
生体試料（検体）としては、組織、血清または血漿を用いることができて、血清が最も望ましい。
【００１８】
本発明の望ましい一例として、ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的な抗体を用いた酵素結合免疫吸着分析法は、
１）検体及び対照群がコーティングされた反応器にＨＣＣＲ‐２特異的な抗体を入れて反応させる段階と、
２）上記反応を通じて生成された抗原‐抗体反応物を２次抗体‐接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）及び発色基質溶液を用いて検出する段階と、
３）検体と対照群に対する検出結果を比較する段階と、を含み得る。
【００１９】
また、ＥＬＩＳＡ方法とともに、上記ＨＣＣＲ‐２特異的な抗体を生物学的マイクロチップ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ）上に固定させた後、対象者から分離された生体試料と反応させて上記抗体蛋白質に対する抗原を検出することができる生物学的マイクロチップ及び自動化された微細配列システム（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ）を用いれば大量に試料を分析することができる。
【００２０】
また、本発明は肝硬変症を有効に早期診断するために、上記ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的に反応する抗体を構成要素として含む肝硬変症診断キットを提供する。
【００２１】
本発明の診断キットは、
１）ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的な抗体と、
２）ＨＣＣＲ‐２標準抗原を含む陽性対照群と上記抗原が注入されなかった動物の抗血清を含む陰性対照群と、
３）基質との反応により発色する標識体が接合された２次抗体接合体と、
４）上記標識体と発色反応する発色基質溶液と、
５）各反応段階に用いられる洗浄液と、
６）酵素反応停止溶液とを含むことを特徴とする。
【００２２】
上記診断キットは、抗原‐抗体結合反応を通じて抗体蛋白質に対する抗原を定量分析または定性分析することによって肝硬変症を診断することができ、上記抗原‐抗体結合反応は通常のＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、サンドイッチ測定法、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット、免疫ブロット分析または免疫組織化学染色方法で測定することができる。例えば、検体及び対照群を表面にコーティングさせた９６ウェルマイクロタイタープレートなどを用いて、上記組換え単一クローン抗体蛋白質と反応するＥＬＩＳＡを行うように上記診断キットを提供することができる。
【００２３】
上記抗原‐抗体結合反応のための反応器としては、ニトロセルローズ膜、ポリビニル（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）樹脂またはポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）及びガラスからなるスライドガラスなどが用いられ得る。
【００２４】
本発明の抗体は前述したように、ＨＣＣＲ‐２蛋白質抗原を動物に免疫させて得られた抗血清から精製することが望ましい。本発明のＨＣＣＲ‐２特異的な抗体は反応器当り１ないし１０μｇ／１００μｇに添加することが望ましい。
【００２５】
本発明の診断キットに含まれる対照群には、陽性対照群と陰性対照群とがあるが、陽性対照群はＨＣＣＲ‐２蛋白質標準抗原を含む混合物であり、陰性対照群はＨＣＣＲ‐２蛋白質抗原で感染されなかった動物の血清である。本発明の望ましい実施例においては、蛋白質濃度がそれぞれ０ｎｇ／ｍｌ（Ａ）、２０ｎｇ／ｍｌ（Ｂ）、４０ｎｇ／ｍｌ（Ｃ）、８０ｎｇ／ｍｌ（Ｄ）、１６０ｎｇ／ｍｌ（Ｅ）、３２０ｎｇ／ｍｌ（Ｆ）及び６４０ｎｇ／ｍｌ（Ｇ）であるＨＣＣＲ‐２蛋白質標準抗原溶液を用意して用いた。
【００２６】
上記２次抗体の標識体としては、発色反応をする通常の発色剤が望ましく、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、塩基性脱燐酸化酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、ＦＩＴＣ （ｐｏｌｙ Ｌ‐ｌｙｓｉｎｅ‐ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＲＩＴＣ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐Ｂ‐ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などの蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素（ｄｙｅ）などの標識体が用いられ得る。本発明においては、例えば、ヤギ由来の抗‐ウサギＩｇＧ‐ＨＲＰ接合体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ‐ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ‐ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いる。
【００２７】
上記発色を誘導する基質は発色反応をする標識体に応じて用いることが望ましく、ＴＭＢ（３,３',５,５'‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ[２,２'‐ａｚｉｎｏ‐ｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ‐６‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）]、ＯＰＤ（ｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）などを用いることができる。このとき、発色剤基質は、緩衝溶液（０.１ Ｍ ＮａＡｃ, ｐＨ５.５）に溶解された状態で提供されることがさらに望ましい。ＴＭＢのような発色基質は２次抗体接合体の標識体として用いられたＨＲＰによって分解されて発色沈積体を生成し、その発色沈積体の沈積程度を肉眼で確認することによってＨＣＣＲ‐２蛋白質抗原の存在有無を検出する。
【００２８】
上記洗浄液は、燐酸塩緩衝溶液、ＮａＣｌ及びツイン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）を含むことが望ましく、０.０２Ｍ燐酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）、０.１３Ｍ ＮａＣｌ、及び０.０５％ ツイン２０から構成された緩衝溶液がさらに望ましい。洗浄液は抗原‐抗体結合反応後、抗原‐抗体結合体に２次抗体を反応させた後、適当量を反応器に入れて３回ないし６回洗浄するものである。ブロッキング溶液としては、０.１％ ＢＳＡを含有する燐酸塩緩衝溶液が望ましく、反応停止溶液としては２Ｎの硫酸溶液が望ましい。
【００２９】
上記診断キットを用いて検体試料内のＨＣＣＲ‐２抗原を検出することによって肝硬変症を早期に診断する方法は、陽性及び陰性対照群と検体試料にＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を各々反応させ、洗浄液で洗浄した後、基質との反応によって発色する標識体が標識された２次抗体接合体を加え、洗浄液で再洗浄した後、上記基質含有溶液を添加して発色反応させ、４５０ｎｍでの吸光度を測定することを特徴とする。このとき、標準抗原溶液Ａの吸光度は平均値が０.０００以上であり０.２００以下であるべきであり、Ｆの吸光度は１.２００以上であり３.０００以下であるべきである。標準抗原溶液Ａ及びＦの吸光度の中間値を閾値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）として検体を陽性または陰性に判定する基準とする。検体の吸光度が標準抗原溶液Ｆの吸光度より大きい場合には検体を希釈した後再測定する。検体の吸光度が閾値以上である場合を陽性と判断し、以下である場合を陰性と判断する。
【００３０】
本発明によるヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２に特異的な抗体を含む肝硬変症診断キットは、患者の血液を用いる新しい免疫学的診断道具として正確度及び再現性が高いという事実が確認された。既存に肝硬変症に対する血清学的診断道具としては、肝癌で用いられているＡＦＰ肝癌診断剤が用いられていたが診断的正確度が肝硬変症においては非常に低い。
【００３１】
しかし、肝硬変症の早期診断のための血清ＨＣＣＲ‐２検査法は、既存のＡＦＰ検査法を用いた肝硬変症診断より診断的正確度が統計的に有意に高かった（９５.１％）。従って、本発明によるヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２を用いた肝硬変症検出方法及び肝硬変症診断キットは、診断の正確度及び再現性が高くて肝硬変症の早期診断に非常に有用な道具として用いることができる。
【００３２】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、ｐＭＡＬ‐ｐ２Ｘ／ＨＣＣＲ‐２ベクターに形質転換された大腸菌ＢＬ２１菌株から分離・精製されたＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質の免疫ブロットの結果を示したものであり、図２は、本発明のＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を用いた診断キットで肝硬変症患者及び正常人の血液を対象としてＨＣＣＲ‐２蛋白質の発現を検出した結果を示したものである。
【００３３】
〔発明の実施のための最良の形態〕
以下、本発明を下記実施例に基づいてより詳しく説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するだけであって、本発明の内容は下記実施例により限定されるのではない。
【００３４】
＜実施例１＞ ＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体の生産
＜１‐１＞ ＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質の生産
肝硬変診断のための腫瘍の標識物質としてのヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２に特異的な抗体を生産するために、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２の一部（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３１５５９８のアミノ酸配列１１２ないし３０４に該当）をｐＭＡＬＴＭ‐ｐ２Ｘ発現ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ, ＭＡ）の多重クローニング部位に挿入してｐＭＡＬＴＭ‐ｐ２Ｘ／ＨＣＣＲ‐２１１２‐３０４ベクターを作製した。上記ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ, ＷＩ）に形質転換した後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β‐Ｄ‐ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏ‐ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ, Ｓｉｇａｍａ）処理で発現を誘導して約４５ＫＤａのマルトース結合蛋白質が融合された６６ＫＤａのＨＣＣＲ‐２１１２‐３０４融合蛋白質を生産し、これをアミロース樹脂キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で精製した（国際出願公開第ＷＯ０２／４４３７０ Ａ１号）。精製された組換え蛋白質を免疫ブロットした結果、約６６ＫＤａの融合蛋白質が多量含有されていることを確認した（図１）。このように分離・精製されたＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質は、ウサギの免疫化及び多重クローン抗体を生産するための抗原‐抗体結合反応の抗原として用いられた。
【００３５】
＜１‐２＞ ウサギの免疫化
上記＜１‐１＞で獲得したＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質に特異的な抗体生産のための動物としては、約２.５ｋｇ重量のＮＺＷウサギを用いた。ＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質（２００μｇ／ｍｌ）とプロイント完全補助剤（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.）を各々同量混合して乳化させた。上記乳化液２ｍｌをウサギの皮下に各々０.２５ｍｌずつ８か所に筋肉注射して１次接種した。追加抗原注入（Ｂｏｏｓｔｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）は１次接種後、２週間隔で数回行い、免疫抗原をプロイント不完全補助剤（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.）で乳化して１次接種と同一の方法で施した。
【００３６】
＜１‐３＞ ウサギ血清（Ｒａｂｂｉｔ ｓｅｒｕｍ）の分離及び特異多重抗体の選別
＜１‐２＞のように免疫化されたウサギの動脈から最終接種以後５日目から２週間隔で血液を採取して血清を分離した後、−２０℃に保管して各種の実験測定に用いた。上記血清は抗体特異性を調べたところ、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２蛋白質にのみ特異的に反応した。採取した血清よりヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質抗原にのみ特異的に反応する血清を選別するために、上記＜１‐１＞の大腸菌形質転換体から分離・精製されたＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質を抗原として用いたＥＬＩＳＡを行った。
【００３７】
具体的に、非特異性免疫反応を抑制するために、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ Ｃｏ., ＵＳＡ）を１％脱脂粉乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）‐ＰＢＳを添加して室温で１時間露出させコーティングした後、ウェル当り１ｕｇの組換え蛋白質をコーティングした。上記ウェルにウサギ血清の原液を２％ ＢＳＡを含有したＰＢＳ溶液で各々１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７の濃度に希釈させた後、希釈液をウェル当り各々１００μｌずつ添加した後、３７℃で２時間抗原‐抗体結合反応を行った以後ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。以後、２％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝溶液で希釈（１：１０,０００）されたヤギ由来の抗‐ウサギＩｇＧ‐ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ., ＵＳＡ）２次抗体をウェル当り１００μｌずつ添加して３７℃で１時間反応させた。
【００３８】
以後、０.１Ｍシートレート燐酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｃｉｔｒａｔｅ, ｐＨ ５.０）１０ｍｌに、１ｍｇのＴＭＢ（３.３', ５.５'‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ, Ｓｉｇｍａ Ｃｏ., ＵＳＡ）と２０μｌの３５％過酸化水素を混合して製造した基質溶液をウェル当り１００μｌずつ添加して酵素反応を誘導した。室温で１５分間酵素反応を維持させた後、同量の２Ｎ硫酸溶液を添加して酵素反応を中断させてから発色反応の程度を４５０ｎｍで測定した。これからＨＣＣＲ‐２抗原に対する特異抗体を有している多重クローン抗体をＥＬＩＳＡで分析したとき抗体力価が陰性対照群より１０倍以上高い血清を再選別して特性分析を始めた。
【００３９】
＜実施例２＞ ＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を用いたＥＬＩＳＡ
ＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を用いたＥＬＩＳＡによって肝硬変症を診断する方法は、（１）検体試料を処理してウェルにコーティングさせる段階と、（２）ＥＬＩＳＡプレートのウェルにウサギから分離・精製したＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体をコーティングする段階と、（３）検体試料内に存在するＨＣＣＲ‐２抗原がウェルの抗体に結合されていることを検出する段階とによって行われた。
【００４０】
＜２‐１＞ ウェルに検体試料のコーティング
検体試料としては、肝硬変症患者から抽出した血液、肝炎患者から抽出した血液、正常人の血液から血清を分離して用意し、閾値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）測定のための標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）は、ＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質を各々０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ, ３２０ｎｇ／ｍｌ及び６４０ｎｇ／ｍｌの濃度で希釈した標準抗原溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを用いた。底が平らな９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに検体試料を１００μｌずつ分株した後、３７℃で４時間反応させ各ウェルを洗浄用緩衝溶液（０.０５％ ツイン２０を含んだＰＢＳ、ｐＨ ７.４）で４回洗浄した。このとき、陽性対照群としては上記で用意した標準抗原溶液を添加し、陰性対照群としては正常ウサギの血清を同量添加した。
【００４１】
＜２‐２＞ ＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体の添加
検体がコーティングされたプレートの各ウェルに上記＜１‐３＞で用意したＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を注入し蓋をした後、４℃で１６ないし１８時間放置した。このとき、多重クローン抗体は５μｇ／ｍｌ濃度で０.５Ｍ炭酸塩緩衝溶液（ｐＨ ９.６）に希釈した後１００μｌずつウェルに添加した。対照群としてＨＣＣＲ‐２蛋白質で免疫されなかったウサギの血清（正常ウサギの血清）を炭酸塩緩衝溶液に５００倍希釈して１００μｌずつウェルに分株した。
【００４２】
その後、プレートのウェルを洗浄用緩衝溶液で４回洗浄し非特異的蛋白質の結合部位を遮断するためにブロッキング溶液（２％ ＢＳＡを含んだＰＢＳ（ｐＨ ７.４）緩衝溶液）を３００μｌずつ分株した後、３７℃で２時間放置した。
【００４３】
＜２‐３＞ 抗原‐抗体結合体の検出
山葵ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｒｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識されたヤギ由来の抗‐ウサギＩｇＧ２次抗体を１：１０，０００に希釈させて上記の各ウェルに１００μｌずつ添加し、プレートを３７℃で１時間定置した後各ウェルを洗浄用緩衝溶液で４回洗浄した。続いて、基質であるＴＭＢ（３.３', ５.５'‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ, Ｓｉｇｍａ Ｃｏ., ＵＳＡ）１ｍｇを基質用緩衝溶液（クエン酸緩衝溶液、ｐＨ５.０）１０ｍｌに溶解させ、３５％過酸化水素を２μｌになるように添加して基質溶液を製造した。上記基質溶液１００μｌずつをウェルに入れ光を遮断して室温で１５分間反応させた後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４溶液を５０μｌずつ添加して反応を停止させた。基質溶液の発色反応程度は４５０ｎｍ波長での吸光度を測定することによって決定した。
【００４４】
各検体試料の吸光度から、陽性対照群であるＨＣＣＲ‐２融合蛋白質のみがコーティングされたウェルの吸光度と陰性対照群であるＰＢＳのみを入れたウェルの吸光度とを引いた残りをＨＣＣＲ‐２抗原による吸光度として推定した。また、同一方法で標準液の吸光度を計算した後、標準液ＡとＦの吸光度の中間値を閾値と定め、吸光度が閾値以上である検体は陽性に判定し、以下である検体は陰性に判定した。このとき、標準液Ａの吸光度は平均値が０.０００以上であり０.２００以下であるべきであり、標準液Ｆの吸光度は平均値が１.２００以上であり３.０００以下であるべきである。
【００４５】
ＨＣＣＲ‐２標準抗原溶液を用いて作成した標準曲線から閾値を１０μｇ／ｍｌに決め、これを基準として各検体の吸光度を比較して陽／陰性を判定した。肝硬変症患者及び正常人においてＥＬＩＳＡ方法によりＨＣＣＲ‐２蛋白質の血中濃度を測定した結果は図３に示した。
【００４６】
＜実施例３＞ ＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を用いたＥＬＩＳＡによる肝硬変症診断の効率性確認
＜３‐１＞ 肝硬変症患者群におけるＡＦＰとＨＣＣＲ‐２キットの診断正確度の比較
本発明によるＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を用いたＥＬＩＳＡ診断キット及び検出方法による肝硬変症診断の効率性を確認するために、実施例２に記載されたＨＣＣＲ‐２特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡ方法と既存に肝癌または肝硬変症診断のために用いられてきた血清アルファー‐胎児蛋白（ａｌｐｈａ‐ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ, ＡＦＰ）の数値測定方法を比較した。このとき、ＡＦＰ数値は市販されているＥＬＳＡ２‐ＡＦＰ測定キット（ＣＩＳ Ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ, Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定した。
【００４７】
診断結果の陽／陰性は、ＡＦＰの場合には２０ｎｇ／ｍｌを、ＨＣＣＲ‐２の場合には標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）から得られた１０μｇ／ｍｌを各々の閾値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）として決定した。肝硬変症群と正常群との各集団内におけるＡＦＰとＨＣＣＲ‐２との陽性反応率の差はマクネマー（ＭｃＮｅｍａｒ）検定で比較し、肝硬変症群と正常群からＨＣＣＲ‐２の敏感度、特異度、偽陽／陰性率と各々の９５％信頼区間を推定した。ＨＣＣＲ‐２の集団間の陽性反応率の差はフィッシャーの正確度テスト（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）で、各集団内におけるＡＦＰとＨＣＣＲ‐２間の陽性反応率の差はマクネマー検定で比較した。全ての統計的分析にはＳＡＳ分散６.１２（ＳＡＳ．ＳＡＳ／ＳＴＡＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅ： Ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｒｅｌｅａｓｅ ６.１２．Ｃａｒｙ, ＮＣ： ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ, １９９７）が用いられ、検定の有意水準は０.０５とした。
【００４８】
下記表１に６２人の肝硬変症患者群よりＡＦＰ数値が確認できなかった１人の肝硬変症患者を除いた６１人におけるＨＣＣＲ‐２とＡＦＰキットとの診断正確度を比較した。その結果、ＨＣＣＲ‐２の診断正確度は９５.１％で、ＡＦＰの１８.０％に比べて有意に高く示された（
【００４９】
【数１】
【００５０】
ｄｆ＝１, Ｐ＝０.０００１, マクネマーテスト）。
【００５１】
【表１】
【００５２】
＜３‐２＞ ＨＣＣＲ‐２キットの肝硬変症診断道具としての有用性確認
下記表２及び表３からわかるように、６２人の肝硬変症患者と１３８人の正常人とを対象として実施例２のＨＣＣＲ‐２特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ方法で肝硬変症を診断したとき、本発明のＨＣＣＲ‐２キットの敏感度は９５.２％、特異度は９１.３％であり、偽陽性率と偽陰性率は各々１６.９％と２.３％で示された。また、全体診断の正確度は９２.５％に示されて、診断道具としての有用性が非常に高いことを確かめた。
【００５３】
【表２】
【００５４】
【表３】
【００５５】
〔産業上の利用可能性〕
上述したように、本発明によるヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ‐２に特異的な抗体を含む肝硬変症診断キットは、患者の血液を用いる新しい免疫学的肝硬変症診断道具であって、肝硬変症に対する診断的正確度及び再現性が高く肝硬変症の早期診断に有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ｐＭＡＬ‐ｐ２Ｘ／ＨＣＣＲ‐２ベクターに形質転換された大腸菌ＢＬ２１菌株から分離・精製されたＨＣＣＲ‐２組換え蛋白質の免疫ブロットの結果を示したものである。
【図２】本発明のＨＣＣＲ‐２多重クローン抗体を用いた診断キットで肝硬変症患者及び正常人の血液を対象としてＨＣＣＲ‐２蛋白質の発現を検出した結果を示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）検体及び対照群がコーティングされた反応器にヒトＨＣＣＲ‐２蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３１５５９８）に特異的な抗体を入れて反応させる段階と、
２）上記反応を通じて生成された抗原‐抗体反応物を２次抗体‐標識体接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）及び標識体の発色基質溶液を用いて検出する段階と、
３）検体と対照群に対する検出結果を比較して検体試料中のＨＣＣＲ‐２蛋白質の発現程度を測定する段階とを含む、検体内ＨＣＣＲ‐２蛋白質の測定方法。
【請求項２】
上記抗原‐抗体結合反応を酵素結合免疫吸着分析法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット、免疫ブロット分析法または免疫組織化学染色方法で測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ＨＣＣＲ‐２特異的な抗体が、ヒトＨＣＣＲ‐２蛋白質を動物に免疫させて得られた抗血清または卵から精製して得られたものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記検体が、組織、血清または血漿であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記反応器が、ニトロセルローズ膜、ポリビニル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）またはポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート及びグラスからなるスライドガラスからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的な抗体が反応器当り１ないし１０μｌ／１００μｌで添加されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ヒトＨＣＣＲ‐２蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３１５５９８）に特異的な抗体を含んで抗原‐抗体結合反応を通じて検体試料中のＨＣＣＲ‐２蛋白質の発現程度を測定して肝硬変症を診断するための診断キット。
【請求項８】
上記キットは、
１）ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的な抗体と、
２）ＨＣＣＲ‐２標準抗原を含む陽性対照群と上記抗原が注入されなかった動物の抗血清を含む陰性対照群とを含むことを特徴とする請求項７に記載の診断キット。
【請求項９】
上記キットは、
ａ）基質との反応によって発色する標識体が接合された２次抗体接合体と、
ｂ）上記標識体と発色反応する発色基質溶液と、
ｃ）各反応段階に用いる洗浄液と、
ｄ）酵素反応停止溶液とをさらに含むことを特徴とする請求項７または請求項８に記載の診断キット。
【請求項１０】
上記２次抗体接合体の標識体が、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、塩基性脱燐酸化酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素（ｄｙｅ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項９に記載の診断キット。
【請求項１１】
上記発色基質が、ＴＭＢ（３,３',５,５'‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ [２,２'‐ａｚｉｎｏ‐ｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ‐６‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）]及びＯＰＤ（ｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項９に記載の診断キット。
【請求項１２】
上記抗原‐抗体結合反応を、酵素結合免疫吸着分析法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ； ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット、免疫ブロット分析法または免疫組織化学染色方法で測定することを特徴とする請求項７に記載の診断キット。
【請求項１３】
上記ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的な抗体がヒトＨＣＣＲ‐２蛋白質を動物に免疫させて得られた抗血清または卵から精製して得られたものであることを特徴とする請求項７に記載の診断キット。
【請求項１４】
上記検体が、組織、血清または血漿であることを特徴とする請求項７に記載の診断キット。
【請求項１】
１）検体及び対照群がコーティングされた反応器にヒトＨＣＣＲ‐２蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３１５５９８）に特異的な抗体を入れて反応させる段階と、
２）上記反応を通じて生成された抗原‐抗体反応物を２次抗体‐標識体接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）及び標識体の発色基質溶液を用いて検出する段階と、
３）検体と対照群に対する検出結果を比較して検体試料中のＨＣＣＲ‐２蛋白質の発現程度を測定する段階とを含む、検体内ＨＣＣＲ‐２蛋白質の測定方法。
【請求項２】
上記抗原‐抗体結合反応を酵素結合免疫吸着分析法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット、免疫ブロット分析法または免疫組織化学染色方法で測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ＨＣＣＲ‐２特異的な抗体が、ヒトＨＣＣＲ‐２蛋白質を動物に免疫させて得られた抗血清または卵から精製して得られたものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記検体が、組織、血清または血漿であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記反応器が、ニトロセルローズ膜、ポリビニル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）またはポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート及びグラスからなるスライドガラスからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的な抗体が反応器当り１ないし１０μｌ／１００μｌで添加されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ヒトＨＣＣＲ‐２蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３１５５９８）に特異的な抗体を含んで抗原‐抗体結合反応を通じて検体試料中のＨＣＣＲ‐２蛋白質の発現程度を測定して肝硬変症を診断するための診断キット。
【請求項８】
上記キットは、
１）ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的な抗体と、
２）ＨＣＣＲ‐２標準抗原を含む陽性対照群と上記抗原が注入されなかった動物の抗血清を含む陰性対照群とを含むことを特徴とする請求項７に記載の診断キット。
【請求項９】
上記キットは、
ａ）基質との反応によって発色する標識体が接合された２次抗体接合体と、
ｂ）上記標識体と発色反応する発色基質溶液と、
ｃ）各反応段階に用いる洗浄液と、
ｄ）酵素反応停止溶液とをさらに含むことを特徴とする請求項７または請求項８に記載の診断キット。
【請求項１０】
上記２次抗体接合体の標識体が、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、塩基性脱燐酸化酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素（ｄｙｅ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項９に記載の診断キット。
【請求項１１】
上記発色基質が、ＴＭＢ（３,３',５,５'‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ [２,２'‐ａｚｉｎｏ‐ｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ‐６‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）]及びＯＰＤ（ｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項９に記載の診断キット。
【請求項１２】
上記抗原‐抗体結合反応を、酵素結合免疫吸着分析法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ； ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット、免疫ブロット分析法または免疫組織化学染色方法で測定することを特徴とする請求項７に記載の診断キット。
【請求項１３】
上記ＨＣＣＲ‐２蛋白質に特異的な抗体がヒトＨＣＣＲ‐２蛋白質を動物に免疫させて得られた抗血清または卵から精製して得られたものであることを特徴とする請求項７に記載の診断キット。
【請求項１４】
上記検体が、組織、血清または血漿であることを特徴とする請求項７に記載の診断キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５０２４２７（Ｐ２００７−５０２４２７Ａ）
【公表日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３２０６１（Ｐ２００６−５３２０６１）
【出願日】平成１６年５月２５日（２００４．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１２４２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４５９８
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（５０１２４１８１８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月２５日（２００４．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１２４２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４５９８
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（５０１２４１８１８）
【Ｆターム（参考）】
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