ヒト皮膚外植片培養系及びその使用
本発明は、ヒト皮膚外植片培養系及びその使用を特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年８月２１日出願の、米国仮出願第６１／２３５，９２３号の優先権を主張する。上述の関連する米国特許出願の完全な開示内容を本明細書に援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ヒト皮膚外植片培養系、及び組成物の皮膚の代謝活性に対する影響を調べるためのこの系の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
インビトロモデル系は、基礎研究及び応用研究の両方において、常に重要な要素である。欧州共同体による化粧品成分の動物試験の使用を禁ずる最近の規制により、皮膚に対するこのようなモデル系開発の優先順位が高まっている。
【０００４】
培養でのヒト皮膚外植片は、主に表皮の生態、及び表皮癌の研究において、５０年以上も研究されている。しかしながら、これらのモデル系は、表皮活性を中心としており、皮膚及び脂肪層の代謝活性、並びに組織構造の再現には成功していない。
【０００５】
Ｎｅｗ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｆｏｒ Ｔｏｐｉｃａｌ Ｕｓｅ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ，Ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｈｅｌｄ ａｔ ｔｈｅ ７ｔｈ ＥＡＤＶ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ７，１９９８，Ｎｉｃｅ，Ｆｒａｎｃｅ（編集者：Ｊ．−Ｈ．Ｓａｕｒａｔ、Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ａ．Ｖａｈｌｑｕｉｓｔ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に掲載されるＳ．Ｂｏｉｓｎｉｃらによる文献「Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ＵＶＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｌａｓｔｉｃ Ｆｉｂｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｄａｍａｇｅ ｂｙ ０．０５％ Ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ Ｃｒｅａｍ ｉｎ ａｎ ｅｘ ｖｉｖｏ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌ」では、皮膚外植片培養中のコラーゲンに対するレチナールデヒドの影響について考察している。
【０００６】
最近出版された「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｆｆｅａ Ａｒａｂｉｃａ Ｌ．Ｓｅｅｄ Ｏｉｌ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎｄ Ｗａｔｅｒ−ｃｈａｎｎｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｅｘ ｖｉｖｏ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌｓ」（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２００９ Ｍａｒ；８（１）：５６〜６２，Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ Ｐｅｒｅｄａ Ｍｄｅｌ Ｃら）の著者らは、外植片培養の効果を示すことができなかった。そのため彼らは、試験薬とインキュベートし、免疫染色したヒト皮膚組織切片を用い、コラーゲン、エラスチン、及びその他細胞外基質成分の合成における刺激作用を立証した。
【０００７】
これらの文献による知見にもかかわらず、生理的複雑性、代謝活性、及び全皮膚区画の構造的完全性を最も表すヒト皮膚外植片モデル系の必要性が引き続いて存在する。
【０００８】
また、薬剤及び組成物の局所適用試験を可能にするために、培養生検材料の表面積を増加させる必要性もある。標準的な生検材料のサイズである直径４ｍｍは、これらの試験を支持しない。「Ａ Ｈｕｍａｎ Ｆｕｌｌ−Ｓｋｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ」（Ｅｐｌａｓｔ．２００９；９：ｅ５．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２００９ Ｊａｎｕａｒｙ ９，ｂｙ Ｌａｒｓ Ｓｔｅｉｎｓｔｒａｅｓｓｅｒら）は、より大きな皮膚生検材料の培養について記載しており、４週間の皮膚外植片の組織学的特徴の保持を立証している。しかしながら、この外植片系で導入遺伝子の発現パターンを調べると、ｉｎ ｖｉｖｏで観察された代謝活性を模倣していないことが判明した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生理的複雑性、代謝活性、及び全皮膚区画の構造的完全性を最も表し、試験薬及び組成物の局所処理を可能にする十分な表面積を有する、ヒト皮膚外植片モデル系の必要性が引き続いて存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、培地中における、最大約２５ｍｍの直径を有するヒト皮膚生検材料を含む、ヒト皮膚外植片培養系であって、培地が、約４０容量％〜約６０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、約４０容量％〜約６０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、約０．５重量％〜約５重量％のウシ胎児血清と、１〜２０μｇ／ｍＬのインスリンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子と、１ｘ抗生物質抗真菌物質混合液と、を含む、ヒト皮膚外植片培養系を目的とする。
【００１１】
本発明はまた、皮膚への局所適用における組成物の影響を判断する方法であって、培地中における、最大約２５ｍｍの直径を有する皮膚生検材料をインキュベートして皮膚外植片培養系を作製する工程であって、培地が、約４０容量％〜約６０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、約４０容量％〜約６０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、約０．５重量％〜約５重量％のウシ胎児血清と、１〜２０μｇ／ｍＬのインスリンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子と、１ｘ抗生物質抗真菌物質混合液と、を含む、工程と、皮膚生検材料上に組成物を局所的に適用する工程と、組成物に対する皮膚生検材料の生物学的応答を解析する工程と、を含む、方法も提供する。別の実施形態では、異なる皮膚区画に対する組成物の生物学的影響を、局所的送達の影響と区別するために、組成物又は試験薬は上記培地中に適用される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の培養系は、皮膚外植片の生存を延長させ、皮膚外植片全層の代謝活性を可能にするのに有用であり、局所的に適用される組成物の効果に対する試験を可能にする。
【００１３】
外植片が大きくなると、標準的な培養条件下において組織中央部が壊死を起こすため、一般には皮膚外植片は、直径２〜４ｍｍのサイズの皮膚生検材料として用いられる。しかしながら、そのような小さいサイズの皮膚外植片は、局所適用に適していない。局所適用される皮膚科的活性物質の評価を可能にする、より大きいヒト皮膚外植片の完全性を支持するために最適な培地が、今や確認されている。
【００１４】
培養系は、スクロース含量が高いダルベッコ変法イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）を含有する培地を含む。ダルベッコ変法イーグル培地は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）（１Ｘ），ｌｉｑｕｉｄ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）／カタログ番号：１１９６５として入手できる。
【００１５】
ＤＭＥＭの量は、約４０〜約６０容量パーセントであってよく、例えば培地の約５０容量パーセントである。
【００１６】
また、培地はＦ−１２栄養素混合物（「Ｆ−１２」）も含む。Ｆ−１２栄養素混合物は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からＦ−１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）（１Ｘ），ｌｉｑｕｉｄ １２／カタログ番号：１１７６５として入手できる。
【００１７】
Ｆ−１２栄養素混合物の量は、約４０〜約６０容量パーセントであってよく、例えば培地の約５０容量パーセントである。
【００１８】
培地は、ウシ血清、例えばウシ胎児血清を更に含む。ウシ血清は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ，Ｈｅａｔ−Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ／カタログ番号：１００８２−１３９として入手できる。
【００１９】
ウシ血清の量は、約０．５〜約５重量パーセントであってよく、例えば、培地の約２重量パーセントである。
【００２０】
培地には、インスリン、ヒドロコルチゾン、上皮成長因子（「ＥＧＦ」）、及び抗生物質抗真菌物質混合液（「ＡＢＡＭ」）が追加される。
【００２１】
インスリンの量は１〜２０μｇ／ｍＬであってよく、例えば１０μｇ／ｍＬである。インスリンは、例えばＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）からｉｎｓｕｌｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｈｕｍａｎ／カタログ番号：Ｉ９２７８として入手できる。
【００２２】
ヒドロコルチゾンの量は１〜２０ｎｇ／ｍＬであってよく、例えば１０ｎｇ／ｍＬである。ヒドロコルチゾンは、例えばＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）からｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ｐｏｗｄｅｒ，γ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ／カタログ番号：Ｈ０１３５）として入手できる。
【００２３】
上皮成長因子の量は１〜２０ｎｇ／ｍＬであってよく、例えば１０ｎｇ／ｍＬである。上皮成長因子は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）／カタログ番号：ＰＨＧ０３１１として入手できる。
【００２４】
抗生物質抗真菌物質混合液の量は１ｘである。抗生物質抗真菌物質混合液は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００Ｘ），ｌｉｑｕｉｄ／カタログ番号１５２４０−０６２として入手できる。
【００２５】
直径が最大約２５ｍｍ、例えば約２〜約２５ｍｍ、又は約４〜約２５ｍｍ、又は特定の実施形態では直径約１２ｍｍのヒト皮膚外植片を、培地中に置く。培地は、外植片の高さと同じ高さにしなくてはならない。
【００２６】
一実施形態では、外植片を約３２℃〜約３７℃、例えば約３２℃でインキュベートする。予想外にも、培養温度を３７℃（標準的温度）から約３２℃に下げると、より長く生存でき、外植片の完全性及び代謝活性が向上できることが判明している。予想外にも、培養開始後２４時間の培養温度を３７℃（標準的温度）から約３２℃に下げ、その後外植片を３７℃でインキュベートしても、より長く生存でき、外植片の完全性及び代謝活性が向上できることも判明している。
【００２７】
別の実施形態では、ウシ胎児血清の量を５％から２％に低下させる。これによっても、より長く生存でき、培養外植片の組織完全性及び代謝活性が向上できる。
【００２８】
別の実施形態では、標準的な５容量％ ＣＯ２を含有する加湿環境内で外植片をインキュベートする。
【００２９】
培地は毎日新しくする。つまり、培地及び栄養素を除去し交換する。
【００３０】
本発明で用いられる培地は、組織の生存を可能にする。本明細書で用いるとき、「組織の生存を可能にする」とは、培養中の組織生存、及び、細胞及び組織の死亡につながる組織損傷の予防、例えば組織の壊死の予防を可能にすることを意味する。
【００３１】
組織生存率は、組織学的に染色された組織切片の組織学的解析、及び無傷かつ正常な組織構造の実証により、示すことができる。
【００３２】
組織生存率は、細胞生存に必須であるとわかっている遺伝子の遺伝子発現の解析により測定することもできる。このような遺伝子として、「ハウスキーピング遺伝子」として定義される遺伝子群が挙げられるが、これらに限定されない。ハウスキーピング遺伝子は、典型的に、多くの又は全ての既知の条件において比較的一定のレベルで転写される構成遺伝子である。ハウスキーピング遺伝子の産物は、典型的に細胞の維持に必須である。一般には、ハウスキーピング遺伝子の発現は、非毒性剤の局所的処理による影響を受けないと考えられる。ハウスキーピング遺伝子の例として、アクチン、ＧＡＰＤＨ、１８Ｓ ＲＮＡ、及びユビキチンが挙げられるが、これらに限定されない。組織生存率は、当業者に周知の任意の手段によっても測定できる。
【００３３】
本発明の培養系は、皮膚に局所適用する組成物の影響を試験できる。調べた組成物に対する皮膚外植片の分子応答、細胞応答、及び／又は生理応答を測定できる。皮膚外植片は、組織学的に、分子解析、バイオマーカー解析などにより解析できる。
【００３４】
具体的には、本発明は、皮膚外植片の全区画において、皮膚のｉｎ ｖｉｖｏ代謝活性をより高いレベルで可能にし、この代謝活性に更に類似する。皮膚の３つの区画の代謝活性を、本発明にしたがって培養された外植片を用いて測定できる。本明細書で用いるとき、「代謝活性」とは、活性遺伝子発現、又は遺伝子産物の合成、又は酵素などのタンパク質の活性、及び、組織区画に特化しており、単に組織生存率又は生存に必須ではない最終産物の産生を意味する。
【００３５】
一実施形態では、本発明にしたがって培養された外植片の代謝活性は、組織特異的遺伝子の遺伝子発現により解析される。
【００３６】
皮膚の表皮区画では、そのような遺伝子として、ケラチノサイト発現遺伝子、例えば、ケラチン５、１４、１及び１０などの特定のケラチン、ＰＡＲ−２、又はＫＧＦＲ、並びにメラノサイト特異的遺伝子、例えば、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２、及びその他メラニン形成遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
皮膚の真皮区画では、そのような遺伝子として、エラスチン、エラスチンアクセサリータンパク質、例えばフィブリリン１及びフィビュリン５、並びにコラーゲン、例えば、コラーゲン１α１及びコラーゲン４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
皮膚の脂肪層では、そのような遺伝子として、脂質生成遺伝子、例えばＰＰＡＲ−γ、レプチン、ＧＬＵＴ４、ＦＡＢＰ４、ＡｄＰＬＡ２、及びＰｒｅｆ−１、並びに脂肪分解性遺伝子、例えばＰＰＡＲ−α、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ホスホジエステラーゼ、ＣＰＴカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（carnitylpalmitoyltransferase）及びＧＰＲ８１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、皮膚真皮層の代謝活性は、本発明にしたがって培養された外植片の組織切片の組織学的又は免疫組織化学的染色により解析される。このような染色例として、増強したエラスチン繊維ネットワークを示すＬｕｎａエラスチン染色、又は新たなコラーゲン合成を示すプレコラーゲン免疫組織化学的染色が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
更に別の実施形態では、本発明による外植片の脂肪層の代謝活性は、これら外植片の培地内に分泌される、脂質代謝に関与する分子の分析により測定される。このような分子の例として、レプチンなどの分泌タンパク質、並びに、グリセロール及び非エステル化脂肪酸などの脂質分子の分泌物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
別段の規定がない限り、本明細書及び「特許請求の範囲」で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。別段の指定がない限り、使用する際、全てのパーセンテージは重量パーセント（ｗ／ｗ）である。
【００４２】
本発明の実施例を以下に記載する。本発明は、その詳細に限定されると解釈されてはならない。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
形成手術を受ける健康人から、インフォームドコンセントを得てヒト腹部皮膚を入手した。ＵＳ ＨＩＰＡＡ規則に従い、機密情報を保持するために患者の身元は開示されなかった。切り取った生検材料（直径４及び１２ｍｍ）をまず、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）から入手した、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（２００ユニット／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、ファンギゾン（５μｇ／ｍＬ）、及びゲンタマイシン（２０μｇ／ｍＬ）を追加したＤＭＥＭで、３０分間室温で殺菌した。この外植片を表１に示す異なる培地（表２に示す抗生物質及び成長因子混合物を追加）内に入れ、５％ ＣＯ２雰囲気下３７℃の加湿チャンバに置いた。培地を毎日新しくした。
【００４４】
培地Ａ〜Ｇは比較例とした。培地１は本発明によるものであった。
【表１】
【表２】
【００４５】
指定の時間後に皮膚外植片を回収し、１０％ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ））中で一晩固定し、続いて７０％エタノール中で保存した。次に、このサンプルをパラフィンブロックに包埋して薄切し（５μｍ）、標準的手順を用いてヘマトキシリン及びイオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。Ｌｅｉｃａ顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ ＤＭ１Ｌ，Ｌｅｉｃａ（Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ））及びＱｉＣＡＭカメラ（ＱＩＭＡＧＩＮＧ（Ｓｕｒｒｅｙ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ））を用いて染色切片の画像を得た。各試験条件の少なくとも１２枚の画像について、表皮細胞の完全性、及び真皮コラーゲン分解に焦点を当てて、専門の評価者が組織完全性について評価した。
【００４６】
４ｍｍ（標準的サイズ）又は１２ｍｍ（大きいサイズ）の外植片のいずれについても、培地１で培養した外植片は、最大１２日間壊死が確認されなかった。表皮では僅かな空胞化細胞が観察されたか、又は空胞化細胞は観察されず、真皮において、培養１２日目まで細胞外マトリックスの分解は検出されなかった。対照的に、壊死、真皮マトリックス分解、及び空胞化表皮細胞が、培地Ａ〜Ｇを用いた培養１２日目、又はより早い時期で観察された。
【００４７】
表３は、培地１と培地Ａを比較する、代表的実験から得たデータを示す。表１に示す他の比較培地、及び表２に示す補足物質を用いて同様の試験を行い、培地１の有意性を確認した。表３に示す各データポイントは、３つの大きな生検材料（１２ｍｍ）を表す。これらの試験における評価スケールは１〜５の範囲とし、５が最高の組織完全性を有するとした。各試験において、培養直前（ここでは「培養前」とする）の組織完全性を５と定義した。
【表３】
＊１２日間の試験は別の実験で行った。
【００４８】
表３のデータは、生存可能な皮膚器官培養をより長い生存期間で維持するという点で、本発明による培地１（５％ ＦＢＳ含有）が比較培地Ａより優れていることを表す。
【００４９】
（実施例２）
ヒト皮膚外植片培養（１２ｍｍ）を、実施例１に記載される２％ ＦＢＳを含有する培地１で樹立した。外植片培養を、５％ ＣＯ２雰囲気で、３７℃又は３２℃のいずれかでインキュベートした。培地を毎日新しくした。実験開始から所定の期間後、皮膚外植片を組織学的染色のために回収し、実施例１に記載するように評価した。表４は、３７℃と３２℃を比較する、代表的実験から得たデータを示す。各データポイントは、３つの生検材料を表す。
【表４】
【００５０】
表４のデータは、低温（３２℃）で１２日間インキュベートした皮膚外植片培養が、標準的温度（３７℃）でインキュベートした同じ提供者の皮膚外植片と比較して優れた代謝活性を有することを示す。更に、低濃度の血清（２％）を含む本発明の培地（表３に示すような５％ ＦＢＳを含む培地１、表４のような２％血清を含む培地１）を用いて、皮膚外植片培養のより長期の生存が達成される。その上、最初の２４時間を低温（３２℃）でインキュベートし、次に標準的温度（３７℃）に変更した皮膚外植片は、３７℃で継続的にインキュベートした外植片よりも長期間生存する。
【００５１】
（実施例３）
生存可能な組織外植片は、代謝的に活性であることができるか、又は低い代謝活性を有することができるのみであるか、又は活動停止状態であり得るため、そして、皮膚科用剤の評価には代謝的に活性な皮膚器官培養の使用が望ましいため、培養中の代謝活性の支持能について、本発明の最適化された培養条件下での培養の試験を行った。
【００５２】
皮膚外植片培養を、実施例１に記載されるように培地１を用いて樹立した。外植片を、５％ ＣＯ２雰囲気内、３７℃でインキュベートした。培地１中で、皮膚外植片を未処理のままにするか、又はＴＧＦ−β（エラスチン産生を増加すると知られている剤）で処理した。培地を毎日新しくした。所定の期間後、皮膚外植片を回収し、以下のように組織学的、免疫組織化学的、及び遺伝子発現的に評価を行った。
１．Ｋｌｉｇｍａｎ、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３（２）：１９９〜２０１，１９８１に記載されるように、ＬＵＮＡ染色を用いてエラスチン繊維を組織学的に実証した。エラスチン繊維の品質評価は１〜５の範囲とし、５のときに繊維品質が最高であるとした。
２．Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から購入したＫｉ６７に対するウサギモノクローナル抗体による免疫組織化学的手技を用いて、細胞増殖のマーカーとしてＫｉ６７を用いた。メーカーの説明書にしたがって、免疫組織化学的染色を実施した。Ｋｉ６７の評価は１〜５の範囲とし、５のときに培養前の皮膚サンプル中のＫｉ６７濃度が正常であることを示す。
３．エラスチン遺伝子発現レベル（ｍＲＮＡレベル）をＱＰＣＲにより評価した。メーカーの説明書にしたがって、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ））を用いて皮膚外植片から総ＲＮＡを抽出した。続いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに転換し、７３００ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））を用いてＱＰＣＲ分析を行った。
エラスチンプライマー：フォワード：ＧＧＴＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＣＣＣＣ リバース：ＴＴＴＣＣＣＴＧＴＧＧＴＧＴＡＧＧＧＣＡ。ＱＰＣＲ反応、２０μＬ容量中に、１０μＬのＱＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））、１．５μＬのフォワード又はリバースプライマーのいずれか（５μＭ）、５μＬのｃＤＮＡ、及び２μＬのＨ２Ｏ）を含有した。未処理対照を１００％に正規化した。
【００５３】
表５は代表的実験から得たデータを示す。
【表５】
【００５４】
表５のデータは、本発明にしたがって培養された皮膚外植片の真皮区画の代謝活性を示す。エラスチンは最適化された培養条件でＴＧＦ−βに応答して誘導されるため、ＴＧＦ−βに対する組織の肯定応答により、代謝活性が更に確認される。
【００５５】
（実施例４）
ＰＰＡＲ−γ活性化は、脂肪細胞の増殖、分化、維持、及び生存の必須制御因子である（Ａｎｇｈｅｌら、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２（４１），２９９４６〜５７，２００７）。ＰＰＡＲ−γアゴニストであるロシグリタゾンは、脂肪細胞の分化を誘導する（Ｐａｔｅｌら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５２（１）：４３〜５０，２００３）。一方、共役リノール酸は、脂質生成を減弱し、脂肪酸酸化を誘導する（Ｅｖａｎｓら、Ｊ Ｎｕｔｒ．；１３２（３）：４５０〜５，２００２；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ Ｎｕｔｒ．；１３１（９）：２３１６〜２１，２００１）。
【００５６】
皮下脂肪層の代謝活性を調べるために、実施例１に記載されるように、５％血清を含む最適化培地を用いて外植片培養を樹立した。一晩のインキュベーション後、皮下脂肪層の脂質生成及び脂肪分解に対する影響を評価するため、皮膚外植片を未処理のままにするか、又は培地中の２０μＭのロシグリタゾン、若しくは５０μＭの共役リノール酸で処理した。外植片を、５％ ＣＯ２雰囲気内、３７℃でインキュベートした。
【００５７】
脂質生成の評価のために、皮膚外植片を、２０μＭのロシグリタゾン及びＣ−１４標識したアセテートを含有する培地で、２４時間培養した。続いて皮下脂肪を回収し、トリグリセリド濃度を（Ｐａｐｐａｓら、ＪＩＤ １１８（１）１６４〜１７１，２００２）に記載されるようにＨＰＴＬＣにより決定した。
【００５８】
脂肪分解の評価のために、皮膚外植片を５０μＭの共役リノール酸を含有する培地で培養し、培地を指定の時間に回収した。遊離グリセロール試薬及びキット（Ｓｉｇｍａ）をメーカーの説明書にしたがって用い、培地内に放出されたグリセロール濃度を測定した。
【００５９】
代表的実験の結果を表６に示す。
【表６】
【００６０】
表６のデータは、本発明にしたがって培養された皮膚外植片の脂肪層の代謝活性を示す。ロシグリタゾン（トリグリセリドの増加）及び共役リノール酸（グリセロール放出の増加）の両方に対する皮膚外植片の肯定応答は、培養した皮膚外植片の代謝的に活性な脂肪層を表す。
【００６１】
〔実施の態様〕
（１） 培地中における、最大約２５ｍｍの直径を有するヒト皮膚生検材料を含む、ヒト皮膚外植片培養系であって、前記培地が、
約４０容量％〜約６０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、
約４０容量％〜約６０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、
約０．５重量％〜約５重量％のウシ胎児血清と、
１〜２０μｇ／ｍＬのインスリンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子と、１ｘ抗生物質抗真菌物質混合液（1x antibiotic antimycotic）と、を含む、ヒト皮膚外植片培養系。
（２） 約５０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、約５０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、約２重量％のウシ胎児血清と、を含む、実施態様１に記載の培養系。
（３） 約１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を含む、実施態様１に記載の培養系。
（４） 約３２℃〜約３７℃でインキュベートされる、実施態様１に記載の培養系。
（５） 約３２℃でインキュベートされる、実施態様１に記載の培養系。
（６） 約３２℃で２４時間インキュベートされ、その後約３７℃でインキュベートされる、実施態様１に記載の培養系。
（７） 皮膚への局所適用における組成物の影響を判定する方法であって、
培地中における、最大約２５ｍｍの直径を有する皮膚生検材料をインキュベートして皮膚外植片培養系を作製する工程であって、前記培地が、
約４０容量％〜約６０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、
約４０容量％〜約６０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、
約０．５重量％〜約５重量％のウシ胎児血清と、
１〜２０μｇ／ｍＬのインスリンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子と、１ｘ抗生物質抗真菌物質混合液と、を含む、工程と、
前記皮膚生検材料上に前記組成物を局所的に適用する工程と、
前記組成物に対する前記皮膚生検材料の生物学的応答を解析する工程と、を含む、方法。
（８） 前記培養系が約１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を含む、実施態様７に記載の方法。
（９） 前記培養系が約３２℃でインキュベートされる、実施態様７に記載の方法。
（１０） 前記培養系が約３２℃〜約３７℃でインキュベートされる、実施態様７に記載の方法。
【００６２】
（１１） 前記培養系が約３２℃で２４時間インキュベートされ、その後約３７℃でインキュベートされる、実施態様７に記載の方法。
（１２） 前記解析工程が、ＬＵＮＡ染色、エラスチン又はエラスチンアクセサリー遺伝子のＱＰＣＲ又は転写解析、エラスチン又はエラスチンアクセサリー遺伝子のタンパク質検出、組織学的染色、及び免疫組織化学的染色からなる群から選択される方法によりエラスチン繊維産生を観察することを含む真皮解析である、実施態様７に記載の方法。
（１３） 前記解析工程が、様々なコラーゲン遺伝子の転写、様々なコラーゲンタンパク質のタンパク質検出、組織学的染色、及び免疫組織化学的染色からなる群から選択される方法によりコラーゲン合成を観察することを含む真皮解析である、実施態様７に記載の方法。
（１４） 前記解析工程が、脂質生成を観察するための脂肪細胞分化誘導剤処理後のトリグリセリド濃度の生化学的分析を含む、皮膚脂肪層の解析である、実施態様７に記載の方法。
（１５） 前記解析工程が、脂肪分解を実証するための脂質生成剤使用後の遊離グリセロール放出の検出を含む、皮膚脂肪層の解析である、実施態様７に記載の方法。
（１６） 前記解析工程が、レプチン遺伝子の転写、分泌されたレプチンのタンパク質検出、及び免疫組織化学的染色からなる群から選択される方法によりレプチン代謝を観察することを含む、皮膚脂肪層の解析である、実施態様７に記載の方法。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年８月２１日出願の、米国仮出願第６１／２３５，９２３号の優先権を主張する。上述の関連する米国特許出願の完全な開示内容を本明細書に援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ヒト皮膚外植片培養系、及び組成物の皮膚の代謝活性に対する影響を調べるためのこの系の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
インビトロモデル系は、基礎研究及び応用研究の両方において、常に重要な要素である。欧州共同体による化粧品成分の動物試験の使用を禁ずる最近の規制により、皮膚に対するこのようなモデル系開発の優先順位が高まっている。
【０００４】
培養でのヒト皮膚外植片は、主に表皮の生態、及び表皮癌の研究において、５０年以上も研究されている。しかしながら、これらのモデル系は、表皮活性を中心としており、皮膚及び脂肪層の代謝活性、並びに組織構造の再現には成功していない。
【０００５】
Ｎｅｗ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｆｏｒ Ｔｏｐｉｃａｌ Ｕｓｅ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ，Ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｈｅｌｄ ａｔ ｔｈｅ ７ｔｈ ＥＡＤＶ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ７，１９９８，Ｎｉｃｅ，Ｆｒａｎｃｅ（編集者：Ｊ．−Ｈ．Ｓａｕｒａｔ、Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ａ．Ｖａｈｌｑｕｉｓｔ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に掲載されるＳ．Ｂｏｉｓｎｉｃらによる文献「Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ＵＶＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｌａｓｔｉｃ Ｆｉｂｅｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｄａｍａｇｅ ｂｙ ０．０５％ Ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ Ｃｒｅａｍ ｉｎ ａｎ ｅｘ ｖｉｖｏ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌ」では、皮膚外植片培養中のコラーゲンに対するレチナールデヒドの影響について考察している。
【０００６】
最近出版された「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｆｆｅａ Ａｒａｂｉｃａ Ｌ．Ｓｅｅｄ Ｏｉｌ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎｄ Ｗａｔｅｒ−ｃｈａｎｎｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｅｘ ｖｉｖｏ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌｓ」（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２００９ Ｍａｒ；８（１）：５６〜６２，Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ Ｐｅｒｅｄａ Ｍｄｅｌ Ｃら）の著者らは、外植片培養の効果を示すことができなかった。そのため彼らは、試験薬とインキュベートし、免疫染色したヒト皮膚組織切片を用い、コラーゲン、エラスチン、及びその他細胞外基質成分の合成における刺激作用を立証した。
【０００７】
これらの文献による知見にもかかわらず、生理的複雑性、代謝活性、及び全皮膚区画の構造的完全性を最も表すヒト皮膚外植片モデル系の必要性が引き続いて存在する。
【０００８】
また、薬剤及び組成物の局所適用試験を可能にするために、培養生検材料の表面積を増加させる必要性もある。標準的な生検材料のサイズである直径４ｍｍは、これらの試験を支持しない。「Ａ Ｈｕｍａｎ Ｆｕｌｌ−Ｓｋｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ」（Ｅｐｌａｓｔ．２００９；９：ｅ５．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２００９ Ｊａｎｕａｒｙ ９，ｂｙ Ｌａｒｓ Ｓｔｅｉｎｓｔｒａｅｓｓｅｒら）は、より大きな皮膚生検材料の培養について記載しており、４週間の皮膚外植片の組織学的特徴の保持を立証している。しかしながら、この外植片系で導入遺伝子の発現パターンを調べると、ｉｎ ｖｉｖｏで観察された代謝活性を模倣していないことが判明した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生理的複雑性、代謝活性、及び全皮膚区画の構造的完全性を最も表し、試験薬及び組成物の局所処理を可能にする十分な表面積を有する、ヒト皮膚外植片モデル系の必要性が引き続いて存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、培地中における、最大約２５ｍｍの直径を有するヒト皮膚生検材料を含む、ヒト皮膚外植片培養系であって、培地が、約４０容量％〜約６０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、約４０容量％〜約６０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、約０．５重量％〜約５重量％のウシ胎児血清と、１〜２０μｇ／ｍＬのインスリンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子と、１ｘ抗生物質抗真菌物質混合液と、を含む、ヒト皮膚外植片培養系を目的とする。
【００１１】
本発明はまた、皮膚への局所適用における組成物の影響を判断する方法であって、培地中における、最大約２５ｍｍの直径を有する皮膚生検材料をインキュベートして皮膚外植片培養系を作製する工程であって、培地が、約４０容量％〜約６０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、約４０容量％〜約６０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、約０．５重量％〜約５重量％のウシ胎児血清と、１〜２０μｇ／ｍＬのインスリンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子と、１ｘ抗生物質抗真菌物質混合液と、を含む、工程と、皮膚生検材料上に組成物を局所的に適用する工程と、組成物に対する皮膚生検材料の生物学的応答を解析する工程と、を含む、方法も提供する。別の実施形態では、異なる皮膚区画に対する組成物の生物学的影響を、局所的送達の影響と区別するために、組成物又は試験薬は上記培地中に適用される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の培養系は、皮膚外植片の生存を延長させ、皮膚外植片全層の代謝活性を可能にするのに有用であり、局所的に適用される組成物の効果に対する試験を可能にする。
【００１３】
外植片が大きくなると、標準的な培養条件下において組織中央部が壊死を起こすため、一般には皮膚外植片は、直径２〜４ｍｍのサイズの皮膚生検材料として用いられる。しかしながら、そのような小さいサイズの皮膚外植片は、局所適用に適していない。局所適用される皮膚科的活性物質の評価を可能にする、より大きいヒト皮膚外植片の完全性を支持するために最適な培地が、今や確認されている。
【００１４】
培養系は、スクロース含量が高いダルベッコ変法イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）を含有する培地を含む。ダルベッコ変法イーグル培地は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）（１Ｘ），ｌｉｑｕｉｄ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）／カタログ番号：１１９６５として入手できる。
【００１５】
ＤＭＥＭの量は、約４０〜約６０容量パーセントであってよく、例えば培地の約５０容量パーセントである。
【００１６】
また、培地はＦ−１２栄養素混合物（「Ｆ−１２」）も含む。Ｆ−１２栄養素混合物は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からＦ−１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）（１Ｘ），ｌｉｑｕｉｄ １２／カタログ番号：１１７６５として入手できる。
【００１７】
Ｆ−１２栄養素混合物の量は、約４０〜約６０容量パーセントであってよく、例えば培地の約５０容量パーセントである。
【００１８】
培地は、ウシ血清、例えばウシ胎児血清を更に含む。ウシ血清は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ，Ｈｅａｔ−Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ／カタログ番号：１００８２−１３９として入手できる。
【００１９】
ウシ血清の量は、約０．５〜約５重量パーセントであってよく、例えば、培地の約２重量パーセントである。
【００２０】
培地には、インスリン、ヒドロコルチゾン、上皮成長因子（「ＥＧＦ」）、及び抗生物質抗真菌物質混合液（「ＡＢＡＭ」）が追加される。
【００２１】
インスリンの量は１〜２０μｇ／ｍＬであってよく、例えば１０μｇ／ｍＬである。インスリンは、例えばＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）からｉｎｓｕｌｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｈｕｍａｎ／カタログ番号：Ｉ９２７８として入手できる。
【００２２】
ヒドロコルチゾンの量は１〜２０ｎｇ／ｍＬであってよく、例えば１０ｎｇ／ｍＬである。ヒドロコルチゾンは、例えばＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）からｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ｐｏｗｄｅｒ，γ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ／カタログ番号：Ｈ０１３５）として入手できる。
【００２３】
上皮成長因子の量は１〜２０ｎｇ／ｍＬであってよく、例えば１０ｎｇ／ｍＬである。上皮成長因子は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）／カタログ番号：ＰＨＧ０３１１として入手できる。
【００２４】
抗生物質抗真菌物質混合液の量は１ｘである。抗生物質抗真菌物質混合液は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００Ｘ），ｌｉｑｕｉｄ／カタログ番号１５２４０−０６２として入手できる。
【００２５】
直径が最大約２５ｍｍ、例えば約２〜約２５ｍｍ、又は約４〜約２５ｍｍ、又は特定の実施形態では直径約１２ｍｍのヒト皮膚外植片を、培地中に置く。培地は、外植片の高さと同じ高さにしなくてはならない。
【００２６】
一実施形態では、外植片を約３２℃〜約３７℃、例えば約３２℃でインキュベートする。予想外にも、培養温度を３７℃（標準的温度）から約３２℃に下げると、より長く生存でき、外植片の完全性及び代謝活性が向上できることが判明している。予想外にも、培養開始後２４時間の培養温度を３７℃（標準的温度）から約３２℃に下げ、その後外植片を３７℃でインキュベートしても、より長く生存でき、外植片の完全性及び代謝活性が向上できることも判明している。
【００２７】
別の実施形態では、ウシ胎児血清の量を５％から２％に低下させる。これによっても、より長く生存でき、培養外植片の組織完全性及び代謝活性が向上できる。
【００２８】
別の実施形態では、標準的な５容量％ ＣＯ２を含有する加湿環境内で外植片をインキュベートする。
【００２９】
培地は毎日新しくする。つまり、培地及び栄養素を除去し交換する。
【００３０】
本発明で用いられる培地は、組織の生存を可能にする。本明細書で用いるとき、「組織の生存を可能にする」とは、培養中の組織生存、及び、細胞及び組織の死亡につながる組織損傷の予防、例えば組織の壊死の予防を可能にすることを意味する。
【００３１】
組織生存率は、組織学的に染色された組織切片の組織学的解析、及び無傷かつ正常な組織構造の実証により、示すことができる。
【００３２】
組織生存率は、細胞生存に必須であるとわかっている遺伝子の遺伝子発現の解析により測定することもできる。このような遺伝子として、「ハウスキーピング遺伝子」として定義される遺伝子群が挙げられるが、これらに限定されない。ハウスキーピング遺伝子は、典型的に、多くの又は全ての既知の条件において比較的一定のレベルで転写される構成遺伝子である。ハウスキーピング遺伝子の産物は、典型的に細胞の維持に必須である。一般には、ハウスキーピング遺伝子の発現は、非毒性剤の局所的処理による影響を受けないと考えられる。ハウスキーピング遺伝子の例として、アクチン、ＧＡＰＤＨ、１８Ｓ ＲＮＡ、及びユビキチンが挙げられるが、これらに限定されない。組織生存率は、当業者に周知の任意の手段によっても測定できる。
【００３３】
本発明の培養系は、皮膚に局所適用する組成物の影響を試験できる。調べた組成物に対する皮膚外植片の分子応答、細胞応答、及び／又は生理応答を測定できる。皮膚外植片は、組織学的に、分子解析、バイオマーカー解析などにより解析できる。
【００３４】
具体的には、本発明は、皮膚外植片の全区画において、皮膚のｉｎ ｖｉｖｏ代謝活性をより高いレベルで可能にし、この代謝活性に更に類似する。皮膚の３つの区画の代謝活性を、本発明にしたがって培養された外植片を用いて測定できる。本明細書で用いるとき、「代謝活性」とは、活性遺伝子発現、又は遺伝子産物の合成、又は酵素などのタンパク質の活性、及び、組織区画に特化しており、単に組織生存率又は生存に必須ではない最終産物の産生を意味する。
【００３５】
一実施形態では、本発明にしたがって培養された外植片の代謝活性は、組織特異的遺伝子の遺伝子発現により解析される。
【００３６】
皮膚の表皮区画では、そのような遺伝子として、ケラチノサイト発現遺伝子、例えば、ケラチン５、１４、１及び１０などの特定のケラチン、ＰＡＲ−２、又はＫＧＦＲ、並びにメラノサイト特異的遺伝子、例えば、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２、及びその他メラニン形成遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
皮膚の真皮区画では、そのような遺伝子として、エラスチン、エラスチンアクセサリータンパク質、例えばフィブリリン１及びフィビュリン５、並びにコラーゲン、例えば、コラーゲン１α１及びコラーゲン４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
皮膚の脂肪層では、そのような遺伝子として、脂質生成遺伝子、例えばＰＰＡＲ−γ、レプチン、ＧＬＵＴ４、ＦＡＢＰ４、ＡｄＰＬＡ２、及びＰｒｅｆ−１、並びに脂肪分解性遺伝子、例えばＰＰＡＲ−α、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ホスホジエステラーゼ、ＣＰＴカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（carnitylpalmitoyltransferase）及びＧＰＲ８１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、皮膚真皮層の代謝活性は、本発明にしたがって培養された外植片の組織切片の組織学的又は免疫組織化学的染色により解析される。このような染色例として、増強したエラスチン繊維ネットワークを示すＬｕｎａエラスチン染色、又は新たなコラーゲン合成を示すプレコラーゲン免疫組織化学的染色が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
更に別の実施形態では、本発明による外植片の脂肪層の代謝活性は、これら外植片の培地内に分泌される、脂質代謝に関与する分子の分析により測定される。このような分子の例として、レプチンなどの分泌タンパク質、並びに、グリセロール及び非エステル化脂肪酸などの脂質分子の分泌物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
別段の規定がない限り、本明細書及び「特許請求の範囲」で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。別段の指定がない限り、使用する際、全てのパーセンテージは重量パーセント（ｗ／ｗ）である。
【００４２】
本発明の実施例を以下に記載する。本発明は、その詳細に限定されると解釈されてはならない。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
形成手術を受ける健康人から、インフォームドコンセントを得てヒト腹部皮膚を入手した。ＵＳ ＨＩＰＡＡ規則に従い、機密情報を保持するために患者の身元は開示されなかった。切り取った生検材料（直径４及び１２ｍｍ）をまず、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）から入手した、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（２００ユニット／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、ファンギゾン（５μｇ／ｍＬ）、及びゲンタマイシン（２０μｇ／ｍＬ）を追加したＤＭＥＭで、３０分間室温で殺菌した。この外植片を表１に示す異なる培地（表２に示す抗生物質及び成長因子混合物を追加）内に入れ、５％ ＣＯ２雰囲気下３７℃の加湿チャンバに置いた。培地を毎日新しくした。
【００４４】
培地Ａ〜Ｇは比較例とした。培地１は本発明によるものであった。
【表１】
【表２】
【００４５】
指定の時間後に皮膚外植片を回収し、１０％ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ））中で一晩固定し、続いて７０％エタノール中で保存した。次に、このサンプルをパラフィンブロックに包埋して薄切し（５μｍ）、標準的手順を用いてヘマトキシリン及びイオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。Ｌｅｉｃａ顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ ＤＭ１Ｌ，Ｌｅｉｃａ（Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ））及びＱｉＣＡＭカメラ（ＱＩＭＡＧＩＮＧ（Ｓｕｒｒｅｙ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ））を用いて染色切片の画像を得た。各試験条件の少なくとも１２枚の画像について、表皮細胞の完全性、及び真皮コラーゲン分解に焦点を当てて、専門の評価者が組織完全性について評価した。
【００４６】
４ｍｍ（標準的サイズ）又は１２ｍｍ（大きいサイズ）の外植片のいずれについても、培地１で培養した外植片は、最大１２日間壊死が確認されなかった。表皮では僅かな空胞化細胞が観察されたか、又は空胞化細胞は観察されず、真皮において、培養１２日目まで細胞外マトリックスの分解は検出されなかった。対照的に、壊死、真皮マトリックス分解、及び空胞化表皮細胞が、培地Ａ〜Ｇを用いた培養１２日目、又はより早い時期で観察された。
【００４７】
表３は、培地１と培地Ａを比較する、代表的実験から得たデータを示す。表１に示す他の比較培地、及び表２に示す補足物質を用いて同様の試験を行い、培地１の有意性を確認した。表３に示す各データポイントは、３つの大きな生検材料（１２ｍｍ）を表す。これらの試験における評価スケールは１〜５の範囲とし、５が最高の組織完全性を有するとした。各試験において、培養直前（ここでは「培養前」とする）の組織完全性を５と定義した。
【表３】
＊１２日間の試験は別の実験で行った。
【００４８】
表３のデータは、生存可能な皮膚器官培養をより長い生存期間で維持するという点で、本発明による培地１（５％ ＦＢＳ含有）が比較培地Ａより優れていることを表す。
【００４９】
（実施例２）
ヒト皮膚外植片培養（１２ｍｍ）を、実施例１に記載される２％ ＦＢＳを含有する培地１で樹立した。外植片培養を、５％ ＣＯ２雰囲気で、３７℃又は３２℃のいずれかでインキュベートした。培地を毎日新しくした。実験開始から所定の期間後、皮膚外植片を組織学的染色のために回収し、実施例１に記載するように評価した。表４は、３７℃と３２℃を比較する、代表的実験から得たデータを示す。各データポイントは、３つの生検材料を表す。
【表４】
【００５０】
表４のデータは、低温（３２℃）で１２日間インキュベートした皮膚外植片培養が、標準的温度（３７℃）でインキュベートした同じ提供者の皮膚外植片と比較して優れた代謝活性を有することを示す。更に、低濃度の血清（２％）を含む本発明の培地（表３に示すような５％ ＦＢＳを含む培地１、表４のような２％血清を含む培地１）を用いて、皮膚外植片培養のより長期の生存が達成される。その上、最初の２４時間を低温（３２℃）でインキュベートし、次に標準的温度（３７℃）に変更した皮膚外植片は、３７℃で継続的にインキュベートした外植片よりも長期間生存する。
【００５１】
（実施例３）
生存可能な組織外植片は、代謝的に活性であることができるか、又は低い代謝活性を有することができるのみであるか、又は活動停止状態であり得るため、そして、皮膚科用剤の評価には代謝的に活性な皮膚器官培養の使用が望ましいため、培養中の代謝活性の支持能について、本発明の最適化された培養条件下での培養の試験を行った。
【００５２】
皮膚外植片培養を、実施例１に記載されるように培地１を用いて樹立した。外植片を、５％ ＣＯ２雰囲気内、３７℃でインキュベートした。培地１中で、皮膚外植片を未処理のままにするか、又はＴＧＦ−β（エラスチン産生を増加すると知られている剤）で処理した。培地を毎日新しくした。所定の期間後、皮膚外植片を回収し、以下のように組織学的、免疫組織化学的、及び遺伝子発現的に評価を行った。
１．Ｋｌｉｇｍａｎ、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３（２）：１９９〜２０１，１９８１に記載されるように、ＬＵＮＡ染色を用いてエラスチン繊維を組織学的に実証した。エラスチン繊維の品質評価は１〜５の範囲とし、５のときに繊維品質が最高であるとした。
２．Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から購入したＫｉ６７に対するウサギモノクローナル抗体による免疫組織化学的手技を用いて、細胞増殖のマーカーとしてＫｉ６７を用いた。メーカーの説明書にしたがって、免疫組織化学的染色を実施した。Ｋｉ６７の評価は１〜５の範囲とし、５のときに培養前の皮膚サンプル中のＫｉ６７濃度が正常であることを示す。
３．エラスチン遺伝子発現レベル（ｍＲＮＡレベル）をＱＰＣＲにより評価した。メーカーの説明書にしたがって、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ））を用いて皮膚外植片から総ＲＮＡを抽出した。続いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに転換し、７３００ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））を用いてＱＰＣＲ分析を行った。
エラスチンプライマー：フォワード：ＧＧＴＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＣＣＣＣ リバース：ＴＴＴＣＣＣＴＧＴＧＧＴＧＴＡＧＧＧＣＡ。ＱＰＣＲ反応、２０μＬ容量中に、１０μＬのＱＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））、１．５μＬのフォワード又はリバースプライマーのいずれか（５μＭ）、５μＬのｃＤＮＡ、及び２μＬのＨ２Ｏ）を含有した。未処理対照を１００％に正規化した。
【００５３】
表５は代表的実験から得たデータを示す。
【表５】
【００５４】
表５のデータは、本発明にしたがって培養された皮膚外植片の真皮区画の代謝活性を示す。エラスチンは最適化された培養条件でＴＧＦ−βに応答して誘導されるため、ＴＧＦ−βに対する組織の肯定応答により、代謝活性が更に確認される。
【００５５】
（実施例４）
ＰＰＡＲ−γ活性化は、脂肪細胞の増殖、分化、維持、及び生存の必須制御因子である（Ａｎｇｈｅｌら、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２（４１），２９９４６〜５７，２００７）。ＰＰＡＲ−γアゴニストであるロシグリタゾンは、脂肪細胞の分化を誘導する（Ｐａｔｅｌら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５２（１）：４３〜５０，２００３）。一方、共役リノール酸は、脂質生成を減弱し、脂肪酸酸化を誘導する（Ｅｖａｎｓら、Ｊ Ｎｕｔｒ．；１３２（３）：４５０〜５，２００２；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ Ｎｕｔｒ．；１３１（９）：２３１６〜２１，２００１）。
【００５６】
皮下脂肪層の代謝活性を調べるために、実施例１に記載されるように、５％血清を含む最適化培地を用いて外植片培養を樹立した。一晩のインキュベーション後、皮下脂肪層の脂質生成及び脂肪分解に対する影響を評価するため、皮膚外植片を未処理のままにするか、又は培地中の２０μＭのロシグリタゾン、若しくは５０μＭの共役リノール酸で処理した。外植片を、５％ ＣＯ２雰囲気内、３７℃でインキュベートした。
【００５７】
脂質生成の評価のために、皮膚外植片を、２０μＭのロシグリタゾン及びＣ−１４標識したアセテートを含有する培地で、２４時間培養した。続いて皮下脂肪を回収し、トリグリセリド濃度を（Ｐａｐｐａｓら、ＪＩＤ １１８（１）１６４〜１７１，２００２）に記載されるようにＨＰＴＬＣにより決定した。
【００５８】
脂肪分解の評価のために、皮膚外植片を５０μＭの共役リノール酸を含有する培地で培養し、培地を指定の時間に回収した。遊離グリセロール試薬及びキット（Ｓｉｇｍａ）をメーカーの説明書にしたがって用い、培地内に放出されたグリセロール濃度を測定した。
【００５９】
代表的実験の結果を表６に示す。
【表６】
【００６０】
表６のデータは、本発明にしたがって培養された皮膚外植片の脂肪層の代謝活性を示す。ロシグリタゾン（トリグリセリドの増加）及び共役リノール酸（グリセロール放出の増加）の両方に対する皮膚外植片の肯定応答は、培養した皮膚外植片の代謝的に活性な脂肪層を表す。
【００６１】
〔実施の態様〕
（１） 培地中における、最大約２５ｍｍの直径を有するヒト皮膚生検材料を含む、ヒト皮膚外植片培養系であって、前記培地が、
約４０容量％〜約６０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、
約４０容量％〜約６０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、
約０．５重量％〜約５重量％のウシ胎児血清と、
１〜２０μｇ／ｍＬのインスリンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子と、１ｘ抗生物質抗真菌物質混合液（1x antibiotic antimycotic）と、を含む、ヒト皮膚外植片培養系。
（２） 約５０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、約５０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、約２重量％のウシ胎児血清と、を含む、実施態様１に記載の培養系。
（３） 約１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を含む、実施態様１に記載の培養系。
（４） 約３２℃〜約３７℃でインキュベートされる、実施態様１に記載の培養系。
（５） 約３２℃でインキュベートされる、実施態様１に記載の培養系。
（６） 約３２℃で２４時間インキュベートされ、その後約３７℃でインキュベートされる、実施態様１に記載の培養系。
（７） 皮膚への局所適用における組成物の影響を判定する方法であって、
培地中における、最大約２５ｍｍの直径を有する皮膚生検材料をインキュベートして皮膚外植片培養系を作製する工程であって、前記培地が、
約４０容量％〜約６０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、
約４０容量％〜約６０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、
約０．５重量％〜約５重量％のウシ胎児血清と、
１〜２０μｇ／ｍＬのインスリンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子と、１ｘ抗生物質抗真菌物質混合液と、を含む、工程と、
前記皮膚生検材料上に前記組成物を局所的に適用する工程と、
前記組成物に対する前記皮膚生検材料の生物学的応答を解析する工程と、を含む、方法。
（８） 前記培養系が約１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を含む、実施態様７に記載の方法。
（９） 前記培養系が約３２℃でインキュベートされる、実施態様７に記載の方法。
（１０） 前記培養系が約３２℃〜約３７℃でインキュベートされる、実施態様７に記載の方法。
【００６２】
（１１） 前記培養系が約３２℃で２４時間インキュベートされ、その後約３７℃でインキュベートされる、実施態様７に記載の方法。
（１２） 前記解析工程が、ＬＵＮＡ染色、エラスチン又はエラスチンアクセサリー遺伝子のＱＰＣＲ又は転写解析、エラスチン又はエラスチンアクセサリー遺伝子のタンパク質検出、組織学的染色、及び免疫組織化学的染色からなる群から選択される方法によりエラスチン繊維産生を観察することを含む真皮解析である、実施態様７に記載の方法。
（１３） 前記解析工程が、様々なコラーゲン遺伝子の転写、様々なコラーゲンタンパク質のタンパク質検出、組織学的染色、及び免疫組織化学的染色からなる群から選択される方法によりコラーゲン合成を観察することを含む真皮解析である、実施態様７に記載の方法。
（１４） 前記解析工程が、脂質生成を観察するための脂肪細胞分化誘導剤処理後のトリグリセリド濃度の生化学的分析を含む、皮膚脂肪層の解析である、実施態様７に記載の方法。
（１５） 前記解析工程が、脂肪分解を実証するための脂質生成剤使用後の遊離グリセロール放出の検出を含む、皮膚脂肪層の解析である、実施態様７に記載の方法。
（１６） 前記解析工程が、レプチン遺伝子の転写、分泌されたレプチンのタンパク質検出、及び免疫組織化学的染色からなる群から選択される方法によりレプチン代謝を観察することを含む、皮膚脂肪層の解析である、実施態様７に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中における、最大約２５ｍｍの直径を有するヒト皮膚生検材料を含む、ヒト皮膚外植片培養系であって、前記培地が、
約４０容量％〜約６０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、
約４０容量％〜約６０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、
約０．５重量％〜約５重量％のウシ胎児血清と、
１〜２０μｇ／ｍＬのインスリンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子と、１ｘ抗生物質抗真菌物質混合液と、を含む、ヒト皮膚外植片培養系。
【請求項２】
約５０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、約５０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、約２重量％のウシ胎児血清と、を含む、請求項１に記載の培養系。
【請求項３】
約１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を含む、請求項１に記載の培養系。
【請求項４】
約３２℃〜約３７℃でインキュベートされる、請求項１に記載の培養系。
【請求項５】
約３２℃でインキュベートされる、請求項１に記載の培養系。
【請求項６】
約３２℃で２４時間インキュベートされ、その後約３７℃でインキュベートされる、請求項１に記載の培養系。
【請求項１】
培地中における、最大約２５ｍｍの直径を有するヒト皮膚生検材料を含む、ヒト皮膚外植片培養系であって、前記培地が、
約４０容量％〜約６０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、
約４０容量％〜約６０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、
約０．５重量％〜約５重量％のウシ胎児血清と、
１〜２０μｇ／ｍＬのインスリンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンと、１〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子と、１ｘ抗生物質抗真菌物質混合液と、を含む、ヒト皮膚外植片培養系。
【請求項２】
約５０容量％のダルベッコ変法イーグル培地と、約５０容量％のＦ−１２栄養素混合物と、約２重量％のウシ胎児血清と、を含む、請求項１に記載の培養系。
【請求項３】
約１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を含む、請求項１に記載の培養系。
【請求項４】
約３２℃〜約３７℃でインキュベートされる、請求項１に記載の培養系。
【請求項５】
約３２℃でインキュベートされる、請求項１に記載の培養系。
【請求項６】
約３２℃で２４時間インキュベートされ、その後約３７℃でインキュベートされる、請求項１に記載の培養系。
【公表番号】特表２０１３−５０２２１９（Ｐ２０１３−５０２２１９Ａ）
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２５６５７（Ｐ２０１２−５２５６５７）
【出願日】平成２２年８月１８日（２０１０．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４５８３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２２４５１
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５０２１１２３８２）ジョンソン・アンド・ジョンソン・コンシューマー・カンパニーズ・インコーポレイテッド (27)
【氏名又は名称原語表記】ＪＯＨＮＳＯＮ ＆ ＪＯＨＮＳＯＮ，ＣＯＮＳＵＭＥＲ，ＣＯＭＰＡＮＩＥＳ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１９９ Ｇｒａｎｄｖｉｅｗ Ｒｏａｄ，Ｓｋｉｌｌｍａｎ，ＮＪ ０８５５８，ＵＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１８日（２０１０．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４５８３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２２４５１
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５０２１１２３８２）ジョンソン・アンド・ジョンソン・コンシューマー・カンパニーズ・インコーポレイテッド (27)
【氏名又は名称原語表記】ＪＯＨＮＳＯＮ ＆ ＪＯＨＮＳＯＮ，ＣＯＮＳＵＭＥＲ，ＣＯＭＰＡＮＩＥＳ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１９９ Ｇｒａｎｄｖｉｅｗ Ｒｏａｄ，Ｓｋｉｌｌｍａｎ，ＮＪ ０８５５８，ＵＳ
【Ｆターム（参考）】
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