ヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤
【課題】ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制できるヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤を提供する。
【解決手段】ビフィズス菌またはその菌体由来成分を有効成分として含有することを特徴とするヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。前記ビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびビフィドバクテリウム・ブレベからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【解決手段】ビフィズス菌またはその菌体由来成分を有効成分として含有することを特徴とするヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。前記ビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびビフィドバクテリウム・ブレベからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制するＩＬ−１７産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞は、免疫応答のコントロールにおいて重要な役割を果たしている。Ｔｈ細胞は、従来、そのサイトカイン産生パターンによって、Ｔヘルパータイプ１（Ｔｈ１）細胞，Ｔヘルパータイプ２（Ｔｈ２）細胞の２つのサブセットに分類されていたが、近年、Ｔｈ細胞の新たなサブセットとして、Ｔヘルパータイプ１７（Ｔｈ１７）細胞が注目されている（非特許文献１）。
Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ（インタローキン）−１７を産生するＴｈ細胞であり、炎症、自己免疫疾患等に深く関与していると考えられている。たとえば炎症性腸疾患患者の腸管組織では、Ｔｈ１７細胞が優位な状態にあることが確認されており、ＩＬ−１７などのＴｈ１７関連サイトカインは、炎症の形成に重要な役割を果たしていることが示唆されている。
ナイーブＴ細胞から各種Ｔｈ細胞への分化にはサイトカインの刺激が重要な役割を果たしている。マウスについては、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６の刺激により、ナイーブＴ細胞からＴｈ１７細胞への分化が誘導されることが既に明らかとなっている。しかし、ヒトの場合、ＴＧＦ−βはむしろＴｈ１７細胞への分化を抑制するなど、種差が大きいことが報告されている（非特許文献１〜２等）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】佐藤浩二郎，“Ｔｈ１７細胞と自己免疫疾患”，科学と生物，第４６巻第５号（２００８年），第３１０−３１５頁
【非特許文献２】E. V Acosta-Rodriguez，G. Napolitani，A. Lanzavecchia，F. Sallusto，“Interleukins 1beta and 6 but not transforming growth factor-beta are essential for the differentiation of interleukin 17-producing human T helper cells”，ネイチャー・イムノロジー（Nat. Immunol.），第８巻第９号（２００７年９月），第９４２−９４９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＩＬ−１７は、上記のように、炎症の形成に重要な役割を果たしていることが示唆されている。ＩＬ−１７については、さらに、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、細胞外マトリックス分解酵素群の産生を誘導することも報告されており、ＩＬ−１７産生を抑制することは、炎症や自己免疫疾患等の予防または治療に効果的であると考えられる。そのため、優れたＩＬ−１７産生抑制作用を有する薬剤が望まれる。
しかし、これまで、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生の抑制については、上述したような種差の大きさ等の問題からその評価系が確立していないこともあり、上記のような薬剤についての研究があまり進んでいないのが現状である。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制できるヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討を行った結果、特定の５種のサイトカインを用いることにより、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を効果的に誘導できるとの知見を得、かかる知見をもとにさらに検討を重ねた結果、ビフィズス菌およびその菌体由来成分が、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を強く抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
上記課題を解決する本発明は以下の態様を有する。
［１］ビフィズス菌またはその菌体由来成分を有効成分とするヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。
［２］前記ビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびビフィドバクテリウム・ブレベからなる群から選択される少なくとも１種である［１］に記載のヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。
［３］前記ビフィズス菌は、下記工程（１）〜（３）により求められるＩＬ−１７産生抑制率が８５％以上となるＩＬ−１７産生抑制能を有する、［１］または［２］に記載のヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。
工程（１）：ヒト末梢血単核球を液体培地中に１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、得られた懸濁液に対し、ＴＧＦ−βを１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−６を２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−１βを２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２１を２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２３を１２．５ｎｇ／ｍＬ、およびビフィズス菌の加熱菌体を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で７２時間培養した後、その上清を回収する。
工程（２）：ビフィズス菌の加熱菌体を添加しない以外は前記工程（１）と同様にして、上清を回収する。
工程（３）：前記工程（１）、（２）でそれぞれ回収した上清中のＩＬ−１７濃度を測定し、下記式によりＩＬ−１７産生抑制率（％）を求める。
【０００６】
【数１】
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制できるヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤（以下、ＩＬ−１７産生抑制剤ということがある。）は、ビフィズス菌またはその菌体由来成分を有効成分とする。
ここで、本発明における「有効成分」とは、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制する作用（ＩＬ−１７産生抑制能）を有する成分を意味する。
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤に用いられる有効成分が有するＩＬ−１７産生抑制能は、ヒト細胞を、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３の５種のサイトカインで刺激してＩＬ−１７産生を誘導する系を利用することで評価できる。
すなわち、本発明者らは、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制できる抑制剤を見出すべく鋭意検討を行うなかで、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３の５種のサイトカインを用いることにより、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を効果的に誘導できるとの知見を得ている。そこで、ヒト細胞を、上記５種のサイトカインで刺激してＩＬ−１７産生を誘導する系を利用することで、ＩＬ−１７産生抑制能を評価できる。
上記評価は、より具体的には、以下の手順で実施できる。
ヒト細胞を上記５種のサイトカインの存在下で培養してヒト細胞からのＩＬ−１７産生を誘導する。このとき、培養を、有効成分の存在下または不在下で行う。培養後、両者のＩＬ−１７産生量を比較することにより、当該有効成分が有するＩＬ−１７産生抑制能を評価できる。
かかる評価方法は、有効成分の不在下で産生されるＩＬ−１７量が多いため、有効成分の添加によってＩＬ−１７産生がどの程度抑制されたのかを判別しやすい。
該評価方法に用いられるヒト細胞としては、ヒト末梢血単核球が好ましい。
上記評価方法の好ましい態様として、後述する工程（１）〜（３）を行い、ＩＬ−１７産生抑制率を求める方法が挙げられる。
【０００９】
「ビフィズス菌」は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する細菌を意味する。
ビフィズス菌として、具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B. pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）等が挙げられる。
これらの中でも、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生の抑制効果に優れること、工業的に加工しやすいこと等から、ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびビフィドバクテリウム・ブレベからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００１０】
ビフィズス菌としては、特に、下記工程（１）〜（３）により求められるＩＬ−１７産生抑制率が８５％以上となるＩＬ−１７産生抑制能を有するものが好ましい。該ＩＬ−１７産生抑制率は９５％以上がより好ましい。
工程（１）：ヒト末梢血単核球を液体培地中に１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、得られた懸濁液に対し、ＴＧＦ−βを１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−６を２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−１βを２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２１を２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２３を１２．５ｎｇ／ｍＬ、およびビフィズス菌の加熱菌体を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で７２時間培養した後、その上清を回収する。
工程（２）：ビフィズス菌の加熱菌体を添加しない以外は前記工程（１）と同様にして、上清を回収する。
工程（３）：前記工程（１）、（２）でそれぞれ回収した上清中のＩＬ−１７濃度を測定し、下記式によりＩＬ−１７産生抑制率（％）を求める。
【００１１】
【数２】
【００１２】
液体培地としては、ヒト末梢血単核球を培養可能なものであればよく、公知の液体培地のなかから適宜選択できる。具体的には、１０％ヒトＡＢ型血清、３ｍＭグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、２０μＭ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）；ＡＩＭ−Ｖ培地（ＧＩＢＣＯ社製）等が挙げられる。
ビフィズス菌の加熱菌体は、加熱による殺菌処理を施した菌体である。加熱菌体は、たとえばビフィズス菌の生菌を公知の方法により培養し、得られた培養物に対し、６０〜１２１℃で５〜３０分間程度の加熱処理を行うことにより調製できる。
上清中のＩＬ−１７濃度は、従来、血清等についてのサイトカインアッセイに用いられている方法により測定できる。たとえば、ＢｉｏＰｌｅｘサスペンジョンアレイシステム（ＢｉｏＲａｄ社）等の、市販の測定システムを使用して測定できる。
【００１３】
上記ＩＬ−１７産生抑制率が８５％以上となるＩＬ−１７産生抑制能を有するビフィズス菌の菌株としては、たとえば、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９（製品名：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＢＢ５３６、森永乳業社製。）、ビフィドバクテリウム・ブレベ ＬＭＧ ２３７２９（製品名：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ Ｍ−１６Ｖ、森永乳業社製。）等が挙げられる。
ただし本発明はこれに限定されるものではなく、公知の種々のビフィズス菌の菌株について上記工程（１）〜（３）を実施し、所望のＩＬ−１７産生抑制能を有するものを適宜選択して利用できる。
【００１４】
有効成分としてビフィズス菌を用いる場合、該ビフィズス菌は、生菌であってもよく、死菌であってもよい。いずれを用いても、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制することができる。特に、性質が安定している点から、前記加熱菌体が好ましい。
有効成分としてビフィズス菌の菌体由来成分を用いる場合、該菌体由来成分としては、細胞破砕物、ビフィズス菌の菌体の一部を構成する成分等が挙げられる。
ビフィズス菌の菌体の一部を構成する成分としては、たとえば、ペプチドグリカンやリポテイコ酸などの細胞壁成分、ＤＮＡなどの核酸成分、細胞外多糖、細胞質成分等が挙げられる。
上記菌体由来成分は、それぞれ、公知の方法により調製できる。具体的には、たとえば細胞破砕物は、超音波処理、フレンチプレスによる物理的破壊等により調製できる。
【００１５】
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤が有効成分として含有するビフィズス菌またはその菌体由来成分は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。
また、本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、前記有効成分のみからなるものであってもよく、前記有効成分と、有効成分以外の任意成分とを配合した組成物であってもよい。該任意成分としては、薬理学的に許容し得るものであれば特に限定されず、従来、医薬組成物に配合されている添加剤（たとえば後述する製剤担体等）を配合できる。
【００１６】
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤の投与経路は、経口、非経口のいずれでもよく、好ましくは経口である。非経口の投与経路としては、経直腸、経皮等が挙げられる。
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤の投与量は、特に限定されず、期待するＩＬ−１７産生抑制効果に応じ、使用するビフィズス菌またはその菌体由来成分が有するＩＬ−１７産生抑制能や投与経路等を考慮して適宜設定すればよい。
たとえばビフィズス菌を有効成分とし、経口にて投与する場合、１日投与量は、通常、体重１ｋｇあたりの細胞数（ｃｅｌｌｓ／ｋｇ体重）に換算して、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ体重以上であることが好ましく、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ体重以上がより好ましい。
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、１日投与量の全量を１回で投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。
【００１７】
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、投与方法に応じ、適宜所定の剤形に製剤化することができる。
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤の剤形としては、たとえば経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤などの液剤；等が挙げられる。また、非経口投与の場合、座剤、軟膏剤、貼付剤、噴霧剤等が挙げられる。
製剤化は、剤形に応じ、適宜公知の方法により実施できる。
製剤化に際しては、有効成分のみを製剤化してもよく、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
製剤担体を配合する場合、本発明のＩＬ−１７産生抑制剤中の有効成分の配合量は、特に制限はなく、剤形に合わせて適宜決定すればよい。
【００１８】
前記製剤担体としては、剤形に応じ、慣用の各種有機または無機の担体を用いることができる。
たとえば固形製剤の場合の担体としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
賦形剤としては、たとえば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マグロゴール等が挙げられる。
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸類塩；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
経口投与用の液剤の場合の担体としては、水などの溶剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００１９】
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤の有効成分であるビフィズス菌またはその菌体由来成分は、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制する作用を有している。そのため、本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、これを投与することにより、投与しない場合に比べて、ヒトの生体内におけるＩＬ−１７の産生を抑制する効果を奏する。
したがって、本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、ＩＬ−１７産生が亢進したヒト疾患の予防または治療薬として有用である。かかる疾患としては、たとえば関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、喘息などのアレルギー疾患等が挙げられる。
また、本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、ビフィズス菌またはその菌体由来成分を有効成分としているため、経口投与した場合の安全性が高く、副作用が生じるおそれも少ない。
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、各種医薬品、食品、栄養剤等に添加して用いることができる。
【実施例】
【００２０】
次に、試験例および実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［試験例１］
目的：マウス脾細胞およびヒト末梢血単核球におけるＩＬ−１７産生の誘導および各系におけるＩＬ−１７産生抑制効果の評価。
使用菌株：表１に示す、ビフィズス菌の２菌株および乳酸菌の１菌株。表中、上付文字Ｔは基準株であることを示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
上記各菌株の加熱菌体を下記に示す手順で調製した。
ビフィズス菌：ＭＲＳ（de Man Rogasa Sharpe）培地（Ｄｉｆｃｏ（登録商標）製品、ベクトン・ディッキンソン社製）で１６時間培養したものを、ＰＢＳ（phosphate-buffer saline）で２回洗浄し、さらに蒸留水で２回洗浄した後に、ＰＢＳで懸濁し、８０℃で３０分間加熱処理（殺菌処理）を行った。
乳酸菌：Ｍ１７培地（Ｄｉｆｃｏ（登録商標）製品、ベクトン・ディッキンソン社製）で１６時間培養したものを、ＰＢＳで２回洗浄し、さらに蒸留水で２回洗浄した後に、ＰＢＳで懸濁し、８０℃で３０分間加熱処理（殺菌処理）を行った。
【００２３】
試験方法Ｉ（マウス脾細胞におけるＩＬ−１７産生誘導、およびビフィズス菌・乳酸菌によるＩＬ−１７産生抑制効果の評価）：
まず、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を採取し、細胞数が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように下記の基本培地に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
マウス脾細胞培養用の基本培地：１０％の非働化ウシ血清（ＧＩＢＣＯ社製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０ｍＭの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含むＲＰＩＭ１６４０培地（インビトロジェン社製）。
【００２４】
次に、上記細胞懸濁液を、１００μｌずつ９６穴プレート（ＢＤ社製）に入れ、各穴に、ＩＬ−１７産生を誘導するため、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６を、それぞれ、最終濃度が２ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。また、それと同時に、上記加熱菌体のいずれか１種を、最終濃度が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（マウス脾細胞の濃度の×１倍）となるように添加した。これを３７℃で７２時間培養した後、培養液を回収し、遠心分離（２５００ｒｐｍ、５分間）により細胞残渣を除去し、上清を回収した。
回収した上清中のＩＬ−１７濃度（ｐｇ／ｍｌ）を、ＢｉｏＰｌｅｘサスペンジョンアレイシステム（ＢｉｏＲａｄ）により測定した。
また、対照として、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６および加熱菌体の添加を行わない以外は上記と同様の処理を行い、これを無刺激群とした。また、加熱菌体の添加を行わない以外は上記と同様の処理を行い、これを菌無添加群とした。
【００２５】
各菌株を添加した群、無刺激群および菌無添加群のＩＬ−１７濃度の測定結果を表２に示す。
また、該測定結果から、下記の式により、ＩＬ−１７産生の抑制率（％）を求めた。その結果を表２に示す。
式：抑制率（％）＝（１−［各菌株を添加した群のＩＬ−１７濃度］／［菌無添加群のＩＬ−１７濃度］）×１００
【００２６】
試験方法ＩＩ（ヒト末梢血単核球におけるＩＬ−１７産生誘導、およびビフィズス菌・乳酸菌によるＩＬ−１７産生抑制効果の評価）：
まず、健常ボランティア４名から全血を約１０ｍｌ得て、ただちに、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（Ｓｈｉｇｍａ社製）により末梢血単核球画分を調製した。これを、細胞数が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように下記の基本培地に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
ヒト末梢血単核球培養用の基本培地：１０％のヒトＡＢ型血清（タカラバイオ社製）、３ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むＲＰＩＭ１６４０培地（インビトロジェン社製）。
【００２７】
次に、上記細胞懸濁液を、１００μｌずつ９６穴プレート（ＢＤ社製）に入れ、各穴に、ＩＬ−１７産生を誘導するため、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３を、それぞれ、最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。また、それと同時に、上記加熱菌体のいずれか１種を、最終濃度が１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（ヒト末梢血単核球の濃度の１０倍）となるように添加した。これを３７℃で７２時間培養した後、培養液を回収し、遠心分離（２５００ｒｐｍ、５分間）により細胞残渣を除去し、上清を回収した。
回収した上清中のＩＬ−１７濃度（ｐｇ／ｍｌ）を、ＢｉｏＰｌｅｘサスペンジョンアレイシステム（ＢｉｏＲａｄ）により測定した。
また、対照として、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６および加熱菌体の添加を行わない以外は上記と同様の処理を行い、これを無刺激群とした。また、加熱菌体の添加を行わない以外は上記と同様の処理を行い、これを菌無添加群とした。
【００２８】
各菌株を添加した群、無刺激群および菌無添加群のＩＬ−１７濃度の測定結果を表２に示す。
また、該測定結果から、前記試験方法Ｉと同様にして、ＩＬ−１７産生の抑制率（％）を求めた。その結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
上記結果に示すように、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３の５種のサイトカインによる刺激を行うことにより、ヒト末梢血単核球におけるＩＬ−１７産生を効果的に誘導できた。なお、本発明者らの検討によれば、これら５種のサイトカインのいずれかを抜いた場合、ＩＬ−産生を誘導する効果は、５種全てを用いた場合に比べて小さかった。
また、Ｂ．ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株およびＢ．ブレベＬＭＧ ２３７２９株は、それぞれ、前記５種のサイトカインによる刺激で誘導されたヒト末梢血単核球からのＩＬ−１７産生の抑制効果が高く、抑制率がいずれも８５％を超えていた。これらの菌株は、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６による刺激で誘導されたマウス脾細胞からのＩＬ−１７産生も抑制したが、その効果は、ヒト末梢血単核球の場合に比べて小さかった。
一方、乳酸菌のＳ．サーモフィラスＡＴＣＣ １９２５８Ｔ株は、マウス脾細胞からのＩＬ−１７産生を強く抑制したが、ヒト末梢血単核球からのＩＬ−１７産生に対する抑制は弱かった。
これらの結果から、Ｂ．ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株およびＢ．ブレベＬＭＧ ２３７２９株が、ヒト細胞からのＩＬ−１７産生に対し、強い抑制作用を有することが確認できた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制するＩＬ−１７産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞は、免疫応答のコントロールにおいて重要な役割を果たしている。Ｔｈ細胞は、従来、そのサイトカイン産生パターンによって、Ｔヘルパータイプ１（Ｔｈ１）細胞，Ｔヘルパータイプ２（Ｔｈ２）細胞の２つのサブセットに分類されていたが、近年、Ｔｈ細胞の新たなサブセットとして、Ｔヘルパータイプ１７（Ｔｈ１７）細胞が注目されている（非特許文献１）。
Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ（インタローキン）−１７を産生するＴｈ細胞であり、炎症、自己免疫疾患等に深く関与していると考えられている。たとえば炎症性腸疾患患者の腸管組織では、Ｔｈ１７細胞が優位な状態にあることが確認されており、ＩＬ−１７などのＴｈ１７関連サイトカインは、炎症の形成に重要な役割を果たしていることが示唆されている。
ナイーブＴ細胞から各種Ｔｈ細胞への分化にはサイトカインの刺激が重要な役割を果たしている。マウスについては、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６の刺激により、ナイーブＴ細胞からＴｈ１７細胞への分化が誘導されることが既に明らかとなっている。しかし、ヒトの場合、ＴＧＦ−βはむしろＴｈ１７細胞への分化を抑制するなど、種差が大きいことが報告されている（非特許文献１〜２等）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】佐藤浩二郎，“Ｔｈ１７細胞と自己免疫疾患”，科学と生物，第４６巻第５号（２００８年），第３１０−３１５頁
【非特許文献２】E. V Acosta-Rodriguez，G. Napolitani，A. Lanzavecchia，F. Sallusto，“Interleukins 1beta and 6 but not transforming growth factor-beta are essential for the differentiation of interleukin 17-producing human T helper cells”，ネイチャー・イムノロジー（Nat. Immunol.），第８巻第９号（２００７年９月），第９４２−９４９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＩＬ−１７は、上記のように、炎症の形成に重要な役割を果たしていることが示唆されている。ＩＬ−１７については、さらに、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、細胞外マトリックス分解酵素群の産生を誘導することも報告されており、ＩＬ−１７産生を抑制することは、炎症や自己免疫疾患等の予防または治療に効果的であると考えられる。そのため、優れたＩＬ−１７産生抑制作用を有する薬剤が望まれる。
しかし、これまで、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生の抑制については、上述したような種差の大きさ等の問題からその評価系が確立していないこともあり、上記のような薬剤についての研究があまり進んでいないのが現状である。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制できるヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討を行った結果、特定の５種のサイトカインを用いることにより、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を効果的に誘導できるとの知見を得、かかる知見をもとにさらに検討を重ねた結果、ビフィズス菌およびその菌体由来成分が、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を強く抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
上記課題を解決する本発明は以下の態様を有する。
［１］ビフィズス菌またはその菌体由来成分を有効成分とするヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。
［２］前記ビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびビフィドバクテリウム・ブレベからなる群から選択される少なくとも１種である［１］に記載のヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。
［３］前記ビフィズス菌は、下記工程（１）〜（３）により求められるＩＬ−１７産生抑制率が８５％以上となるＩＬ−１７産生抑制能を有する、［１］または［２］に記載のヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。
工程（１）：ヒト末梢血単核球を液体培地中に１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、得られた懸濁液に対し、ＴＧＦ−βを１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−６を２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−１βを２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２１を２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２３を１２．５ｎｇ／ｍＬ、およびビフィズス菌の加熱菌体を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で７２時間培養した後、その上清を回収する。
工程（２）：ビフィズス菌の加熱菌体を添加しない以外は前記工程（１）と同様にして、上清を回収する。
工程（３）：前記工程（１）、（２）でそれぞれ回収した上清中のＩＬ−１７濃度を測定し、下記式によりＩＬ−１７産生抑制率（％）を求める。
【０００６】
【数１】
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制できるヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤（以下、ＩＬ−１７産生抑制剤ということがある。）は、ビフィズス菌またはその菌体由来成分を有効成分とする。
ここで、本発明における「有効成分」とは、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制する作用（ＩＬ−１７産生抑制能）を有する成分を意味する。
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤に用いられる有効成分が有するＩＬ−１７産生抑制能は、ヒト細胞を、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３の５種のサイトカインで刺激してＩＬ−１７産生を誘導する系を利用することで評価できる。
すなわち、本発明者らは、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制できる抑制剤を見出すべく鋭意検討を行うなかで、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３の５種のサイトカインを用いることにより、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を効果的に誘導できるとの知見を得ている。そこで、ヒト細胞を、上記５種のサイトカインで刺激してＩＬ−１７産生を誘導する系を利用することで、ＩＬ−１７産生抑制能を評価できる。
上記評価は、より具体的には、以下の手順で実施できる。
ヒト細胞を上記５種のサイトカインの存在下で培養してヒト細胞からのＩＬ−１７産生を誘導する。このとき、培養を、有効成分の存在下または不在下で行う。培養後、両者のＩＬ−１７産生量を比較することにより、当該有効成分が有するＩＬ−１７産生抑制能を評価できる。
かかる評価方法は、有効成分の不在下で産生されるＩＬ−１７量が多いため、有効成分の添加によってＩＬ−１７産生がどの程度抑制されたのかを判別しやすい。
該評価方法に用いられるヒト細胞としては、ヒト末梢血単核球が好ましい。
上記評価方法の好ましい態様として、後述する工程（１）〜（３）を行い、ＩＬ−１７産生抑制率を求める方法が挙げられる。
【０００９】
「ビフィズス菌」は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する細菌を意味する。
ビフィズス菌として、具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B. pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）等が挙げられる。
これらの中でも、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生の抑制効果に優れること、工業的に加工しやすいこと等から、ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびビフィドバクテリウム・ブレベからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００１０】
ビフィズス菌としては、特に、下記工程（１）〜（３）により求められるＩＬ−１７産生抑制率が８５％以上となるＩＬ−１７産生抑制能を有するものが好ましい。該ＩＬ−１７産生抑制率は９５％以上がより好ましい。
工程（１）：ヒト末梢血単核球を液体培地中に１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、得られた懸濁液に対し、ＴＧＦ−βを１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−６を２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−１βを２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２１を２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２３を１２．５ｎｇ／ｍＬ、およびビフィズス菌の加熱菌体を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で７２時間培養した後、その上清を回収する。
工程（２）：ビフィズス菌の加熱菌体を添加しない以外は前記工程（１）と同様にして、上清を回収する。
工程（３）：前記工程（１）、（２）でそれぞれ回収した上清中のＩＬ−１７濃度を測定し、下記式によりＩＬ−１７産生抑制率（％）を求める。
【００１１】
【数２】
【００１２】
液体培地としては、ヒト末梢血単核球を培養可能なものであればよく、公知の液体培地のなかから適宜選択できる。具体的には、１０％ヒトＡＢ型血清、３ｍＭグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、２０μＭ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）；ＡＩＭ−Ｖ培地（ＧＩＢＣＯ社製）等が挙げられる。
ビフィズス菌の加熱菌体は、加熱による殺菌処理を施した菌体である。加熱菌体は、たとえばビフィズス菌の生菌を公知の方法により培養し、得られた培養物に対し、６０〜１２１℃で５〜３０分間程度の加熱処理を行うことにより調製できる。
上清中のＩＬ−１７濃度は、従来、血清等についてのサイトカインアッセイに用いられている方法により測定できる。たとえば、ＢｉｏＰｌｅｘサスペンジョンアレイシステム（ＢｉｏＲａｄ社）等の、市販の測定システムを使用して測定できる。
【００１３】
上記ＩＬ−１７産生抑制率が８５％以上となるＩＬ−１７産生抑制能を有するビフィズス菌の菌株としては、たとえば、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９（製品名：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＢＢ５３６、森永乳業社製。）、ビフィドバクテリウム・ブレベ ＬＭＧ ２３７２９（製品名：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ Ｍ−１６Ｖ、森永乳業社製。）等が挙げられる。
ただし本発明はこれに限定されるものではなく、公知の種々のビフィズス菌の菌株について上記工程（１）〜（３）を実施し、所望のＩＬ−１７産生抑制能を有するものを適宜選択して利用できる。
【００１４】
有効成分としてビフィズス菌を用いる場合、該ビフィズス菌は、生菌であってもよく、死菌であってもよい。いずれを用いても、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制することができる。特に、性質が安定している点から、前記加熱菌体が好ましい。
有効成分としてビフィズス菌の菌体由来成分を用いる場合、該菌体由来成分としては、細胞破砕物、ビフィズス菌の菌体の一部を構成する成分等が挙げられる。
ビフィズス菌の菌体の一部を構成する成分としては、たとえば、ペプチドグリカンやリポテイコ酸などの細胞壁成分、ＤＮＡなどの核酸成分、細胞外多糖、細胞質成分等が挙げられる。
上記菌体由来成分は、それぞれ、公知の方法により調製できる。具体的には、たとえば細胞破砕物は、超音波処理、フレンチプレスによる物理的破壊等により調製できる。
【００１５】
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤が有効成分として含有するビフィズス菌またはその菌体由来成分は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。
また、本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、前記有効成分のみからなるものであってもよく、前記有効成分と、有効成分以外の任意成分とを配合した組成物であってもよい。該任意成分としては、薬理学的に許容し得るものであれば特に限定されず、従来、医薬組成物に配合されている添加剤（たとえば後述する製剤担体等）を配合できる。
【００１６】
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤の投与経路は、経口、非経口のいずれでもよく、好ましくは経口である。非経口の投与経路としては、経直腸、経皮等が挙げられる。
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤の投与量は、特に限定されず、期待するＩＬ−１７産生抑制効果に応じ、使用するビフィズス菌またはその菌体由来成分が有するＩＬ−１７産生抑制能や投与経路等を考慮して適宜設定すればよい。
たとえばビフィズス菌を有効成分とし、経口にて投与する場合、１日投与量は、通常、体重１ｋｇあたりの細胞数（ｃｅｌｌｓ／ｋｇ体重）に換算して、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ体重以上であることが好ましく、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ体重以上がより好ましい。
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、１日投与量の全量を１回で投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。
【００１７】
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、投与方法に応じ、適宜所定の剤形に製剤化することができる。
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤の剤形としては、たとえば経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤などの液剤；等が挙げられる。また、非経口投与の場合、座剤、軟膏剤、貼付剤、噴霧剤等が挙げられる。
製剤化は、剤形に応じ、適宜公知の方法により実施できる。
製剤化に際しては、有効成分のみを製剤化してもよく、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
製剤担体を配合する場合、本発明のＩＬ−１７産生抑制剤中の有効成分の配合量は、特に制限はなく、剤形に合わせて適宜決定すればよい。
【００１８】
前記製剤担体としては、剤形に応じ、慣用の各種有機または無機の担体を用いることができる。
たとえば固形製剤の場合の担体としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
賦形剤としては、たとえば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マグロゴール等が挙げられる。
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸類塩；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
経口投与用の液剤の場合の担体としては、水などの溶剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００１９】
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤の有効成分であるビフィズス菌またはその菌体由来成分は、ヒト細胞におけるＩＬ−１７産生を抑制する作用を有している。そのため、本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、これを投与することにより、投与しない場合に比べて、ヒトの生体内におけるＩＬ−１７の産生を抑制する効果を奏する。
したがって、本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、ＩＬ−１７産生が亢進したヒト疾患の予防または治療薬として有用である。かかる疾患としては、たとえば関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、喘息などのアレルギー疾患等が挙げられる。
また、本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、ビフィズス菌またはその菌体由来成分を有効成分としているため、経口投与した場合の安全性が高く、副作用が生じるおそれも少ない。
本発明のＩＬ−１７産生抑制剤は、各種医薬品、食品、栄養剤等に添加して用いることができる。
【実施例】
【００２０】
次に、試験例および実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［試験例１］
目的：マウス脾細胞およびヒト末梢血単核球におけるＩＬ−１７産生の誘導および各系におけるＩＬ−１７産生抑制効果の評価。
使用菌株：表１に示す、ビフィズス菌の２菌株および乳酸菌の１菌株。表中、上付文字Ｔは基準株であることを示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
上記各菌株の加熱菌体を下記に示す手順で調製した。
ビフィズス菌：ＭＲＳ（de Man Rogasa Sharpe）培地（Ｄｉｆｃｏ（登録商標）製品、ベクトン・ディッキンソン社製）で１６時間培養したものを、ＰＢＳ（phosphate-buffer saline）で２回洗浄し、さらに蒸留水で２回洗浄した後に、ＰＢＳで懸濁し、８０℃で３０分間加熱処理（殺菌処理）を行った。
乳酸菌：Ｍ１７培地（Ｄｉｆｃｏ（登録商標）製品、ベクトン・ディッキンソン社製）で１６時間培養したものを、ＰＢＳで２回洗浄し、さらに蒸留水で２回洗浄した後に、ＰＢＳで懸濁し、８０℃で３０分間加熱処理（殺菌処理）を行った。
【００２３】
試験方法Ｉ（マウス脾細胞におけるＩＬ−１７産生誘導、およびビフィズス菌・乳酸菌によるＩＬ−１７産生抑制効果の評価）：
まず、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を採取し、細胞数が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように下記の基本培地に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
マウス脾細胞培養用の基本培地：１０％の非働化ウシ血清（ＧＩＢＣＯ社製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０ｍＭの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含むＲＰＩＭ１６４０培地（インビトロジェン社製）。
【００２４】
次に、上記細胞懸濁液を、１００μｌずつ９６穴プレート（ＢＤ社製）に入れ、各穴に、ＩＬ−１７産生を誘導するため、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６を、それぞれ、最終濃度が２ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。また、それと同時に、上記加熱菌体のいずれか１種を、最終濃度が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（マウス脾細胞の濃度の×１倍）となるように添加した。これを３７℃で７２時間培養した後、培養液を回収し、遠心分離（２５００ｒｐｍ、５分間）により細胞残渣を除去し、上清を回収した。
回収した上清中のＩＬ−１７濃度（ｐｇ／ｍｌ）を、ＢｉｏＰｌｅｘサスペンジョンアレイシステム（ＢｉｏＲａｄ）により測定した。
また、対照として、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６および加熱菌体の添加を行わない以外は上記と同様の処理を行い、これを無刺激群とした。また、加熱菌体の添加を行わない以外は上記と同様の処理を行い、これを菌無添加群とした。
【００２５】
各菌株を添加した群、無刺激群および菌無添加群のＩＬ−１７濃度の測定結果を表２に示す。
また、該測定結果から、下記の式により、ＩＬ−１７産生の抑制率（％）を求めた。その結果を表２に示す。
式：抑制率（％）＝（１−［各菌株を添加した群のＩＬ−１７濃度］／［菌無添加群のＩＬ−１７濃度］）×１００
【００２６】
試験方法ＩＩ（ヒト末梢血単核球におけるＩＬ−１７産生誘導、およびビフィズス菌・乳酸菌によるＩＬ−１７産生抑制効果の評価）：
まず、健常ボランティア４名から全血を約１０ｍｌ得て、ただちに、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（Ｓｈｉｇｍａ社製）により末梢血単核球画分を調製した。これを、細胞数が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように下記の基本培地に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
ヒト末梢血単核球培養用の基本培地：１０％のヒトＡＢ型血清（タカラバイオ社製）、３ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むＲＰＩＭ１６４０培地（インビトロジェン社製）。
【００２７】
次に、上記細胞懸濁液を、１００μｌずつ９６穴プレート（ＢＤ社製）に入れ、各穴に、ＩＬ−１７産生を誘導するため、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３を、それぞれ、最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。また、それと同時に、上記加熱菌体のいずれか１種を、最終濃度が１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（ヒト末梢血単核球の濃度の１０倍）となるように添加した。これを３７℃で７２時間培養した後、培養液を回収し、遠心分離（２５００ｒｐｍ、５分間）により細胞残渣を除去し、上清を回収した。
回収した上清中のＩＬ−１７濃度（ｐｇ／ｍｌ）を、ＢｉｏＰｌｅｘサスペンジョンアレイシステム（ＢｉｏＲａｄ）により測定した。
また、対照として、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６および加熱菌体の添加を行わない以外は上記と同様の処理を行い、これを無刺激群とした。また、加熱菌体の添加を行わない以外は上記と同様の処理を行い、これを菌無添加群とした。
【００２８】
各菌株を添加した群、無刺激群および菌無添加群のＩＬ−１７濃度の測定結果を表２に示す。
また、該測定結果から、前記試験方法Ｉと同様にして、ＩＬ−１７産生の抑制率（％）を求めた。その結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
上記結果に示すように、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３の５種のサイトカインによる刺激を行うことにより、ヒト末梢血単核球におけるＩＬ−１７産生を効果的に誘導できた。なお、本発明者らの検討によれば、これら５種のサイトカインのいずれかを抜いた場合、ＩＬ−産生を誘導する効果は、５種全てを用いた場合に比べて小さかった。
また、Ｂ．ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株およびＢ．ブレベＬＭＧ ２３７２９株は、それぞれ、前記５種のサイトカインによる刺激で誘導されたヒト末梢血単核球からのＩＬ−１７産生の抑制効果が高く、抑制率がいずれも８５％を超えていた。これらの菌株は、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６による刺激で誘導されたマウス脾細胞からのＩＬ−１７産生も抑制したが、その効果は、ヒト末梢血単核球の場合に比べて小さかった。
一方、乳酸菌のＳ．サーモフィラスＡＴＣＣ １９２５８Ｔ株は、マウス脾細胞からのＩＬ−１７産生を強く抑制したが、ヒト末梢血単核球からのＩＬ−１７産生に対する抑制は弱かった。
これらの結果から、Ｂ．ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９株およびＢ．ブレベＬＭＧ ２３７２９株が、ヒト細胞からのＩＬ−１７産生に対し、強い抑制作用を有することが確認できた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィズス菌またはその菌体由来成分を有効成分として含有することを特徴とするヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。
【請求項２】
前記ビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびビフィドバクテリウム・ブレベからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１に記載のヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。
【請求項３】
前記ビフィズス菌は、下記工程（１）〜（３）により求められるＩＬ−１７産生抑制率が８５％以上となるＩＬ−１７産生抑制能を有する、請求項１または２に記載のヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。
工程（１）：ヒト末梢血単核球を液体培地中に１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、得られた懸濁液に対し、ＴＧＦ−βを１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−６を２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−１βを２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２１を２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２３を１２．５ｎｇ／ｍＬ、およびビフィズス菌の加熱菌体を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で７２時間培養した後、その上清を回収する。
工程（２）：ビフィズス菌の加熱菌体を添加しない以外は前記工程（１）と同様にして、上清を回収する。
工程（３）：前記工程（１）、（２）でそれぞれ回収した上清中のＩＬ−１７濃度を測定し、下記式によりＩＬ−１７産生抑制率（％）を求める。
【数１】
【請求項１】
ビフィズス菌またはその菌体由来成分を有効成分として含有することを特徴とするヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。
【請求項２】
前記ビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびビフィドバクテリウム・ブレベからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１に記載のヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。
【請求項３】
前記ビフィズス菌は、下記工程（１）〜（３）により求められるＩＬ−１７産生抑制率が８５％以上となるＩＬ−１７産生抑制能を有する、請求項１または２に記載のヒト細胞ＩＬ−１７産生抑制剤。
工程（１）：ヒト末梢血単核球を液体培地中に１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、得られた懸濁液に対し、ＴＧＦ−βを１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−６を２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−１βを２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２１を２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２３を１２．５ｎｇ／ｍＬ、およびビフィズス菌の加熱菌体を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で７２時間培養した後、その上清を回収する。
工程（２）：ビフィズス菌の加熱菌体を添加しない以外は前記工程（１）と同様にして、上清を回収する。
工程（３）：前記工程（１）、（２）でそれぞれ回収した上清中のＩＬ−１７濃度を測定し、下記式によりＩＬ−１７産生抑制率（％）を求める。
【数１】
【公開番号】特開２０１１−３２１７０（Ｐ２０１１−３２１７０Ａ）
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７６７４３（Ｐ２００９−１７６７４３）
【出願日】平成２１年７月２９日（２００９．７．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者：第６３回日本栄養・食糧学会大会事務局、第６３回日本栄養・食糧学会大会プログラム、第４９頁、発行日：平成２１年３月２４日 発行者：社団法人 日本栄養・食糧学会 会長 矢ヶ崎 一三、第６３回日本栄養・食糧学会大会講演要旨集、第２２１頁、発行日：平成２１年５月１日 掲載日：平成２１年５月２０日、ｈｔｔｐ：／／ｒｅｌｅａｓｅ．ｎｉｋｋｅｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｄｅｔａｉｌ．ｃｆｍ？ｒｅｌＩＤ＝２２０５９４＆ｌｉｎｄＩＤ＝４ 掲載日：平成２１年５月２０日、ｈｔｔｐ：／／ｙａｋｋｅｉ．ｊｐ／ｎｅｗｓ／ｌｆｘ−ｙａｋｋｅｉ＿ｎｅｗｓ＿ｄｅｔａｉｌ−ｉｄ−５１４．ｈｔｍ 掲載日：平成２１年５月２１日、ｈｔｔｐ：／／ｎｅｗｓ．ｌｉｖｅｄｏｏｒ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｄｅｔａｉｌ／４１６４４８６／ 第６３回日本栄養・食糧学会大会、主催：社団法人日本栄養・食糧学会、開催日：平成２１年５月２２日 発行者：化学工業日報社、化学工業日報、第９面、発行日：平成２１年５月２７日
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２９日（２００９．７．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者：第６３回日本栄養・食糧学会大会事務局、第６３回日本栄養・食糧学会大会プログラム、第４９頁、発行日：平成２１年３月２４日 発行者：社団法人 日本栄養・食糧学会 会長 矢ヶ崎 一三、第６３回日本栄養・食糧学会大会講演要旨集、第２２１頁、発行日：平成２１年５月１日 掲載日：平成２１年５月２０日、ｈｔｔｐ：／／ｒｅｌｅａｓｅ．ｎｉｋｋｅｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｄｅｔａｉｌ．ｃｆｍ？ｒｅｌＩＤ＝２２０５９４＆ｌｉｎｄＩＤ＝４ 掲載日：平成２１年５月２０日、ｈｔｔｐ：／／ｙａｋｋｅｉ．ｊｐ／ｎｅｗｓ／ｌｆｘ−ｙａｋｋｅｉ＿ｎｅｗｓ＿ｄｅｔａｉｌ−ｉｄ−５１４．ｈｔｍ 掲載日：平成２１年５月２１日、ｈｔｔｐ：／／ｎｅｗｓ．ｌｉｖｅｄｏｏｒ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｄｅｔａｉｌ／４１６４４８６／ 第６３回日本栄養・食糧学会大会、主催：社団法人日本栄養・食糧学会、開催日：平成２１年５月２２日 発行者：化学工業日報社、化学工業日報、第９面、発行日：平成２１年５月２７日
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
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