ヒト羊膜由来間葉系細胞及びこれを用いた糖尿病治療薬
【課題】 血糖値低下効果の高いヒト羊膜由来間葉系細胞を提供し、糖尿病治療に有益な新規な糖尿病治療薬を提供する。
【解決手段】 外因性の不死化遺伝子（例えばＴＥＲＴ遺伝子やヒトパピローマウイルスのＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子等）を導入することで、ヒト羊膜由来間葉系細胞を不死化する。不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞は、顕著な血糖値低下作用を発現する。この不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞を糖尿病治療薬の有効成分として用いる。
【解決手段】 外因性の不死化遺伝子（例えばＴＥＲＴ遺伝子やヒトパピローマウイルスのＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子等）を導入することで、ヒト羊膜由来間葉系細胞を不死化する。不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞は、顕著な血糖値低下作用を発現する。この不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞を糖尿病治療薬の有効成分として用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不死化したヒト羊膜由来間葉系細胞に関するものであり、さらには、その血糖値低下作用を利用した糖尿病治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療の分野においては、幹細胞に関する研究が進展しており、例えばヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の樹立等に関する研究が盛んに進められている。ただし、ＥＳ細胞を樹立するには、受精卵ないしは受精卵より発生が進んだ胚盤胞までの段階の初期胚等が必要になることから、ＥＳ細胞を含めた幹細胞の使用においては、倫理的問題の解決、免疫反応の回避、ドナー細胞の確保等が大きな問題となる。
【０００３】
このような状況から、本願発明者らは、ヒトＥＳ細胞のような多能性幹細胞を含む組織に関する検討を進め、分娩後に廃棄される胎盤付着物、特に羊膜に着目し、羊膜細胞を用いた再生医療の可能性について研究を進めている。羊膜は、胚体外組織の１つであり、胎児を形成する胚盤葉上層に由来する羊膜上皮、及び胚外中胚葉の一部（羊膜間葉組織）から構成されている。羊膜上皮細胞及び羊膜間葉系細胞について、遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討したところ、羊膜由来細胞には未分化な細胞群が含まれる可能性が示唆された。また、羊膜は、免疫学的にも特殊な性質を有しており、母体免疫システムから認識され難く、種々の免疫抑制因子を産生することで、免疫反応を抑制するシステムも有している。このことから、羊膜細胞は、たとえ移植時に組織適合性抗原ＨＬＡの一致が不十分な場合にも、レシピエントの免疫が比較的穏やかであると期待される。
【０００４】
これまで、羊膜細胞の生物学的特性を検討し、再生医療に利用すべく研究を推し進め、例えば、単離培養ヒト羊膜上皮細胞がインシュリン様の物質を分泌し、糖尿モデルマウスの血糖値を優位に低下させることを報告している。そして、これをもとに、ヒト羊膜由来上皮細胞の糖尿病治療薬としての利用、及びヒト羊膜由来間葉系細胞の軟骨及び骨の代謝異常治療薬としての利用を提案している（特許文献１を参照）。
【０００５】
前記特許文献１には、ヒト羊膜由来上皮細胞を有効成分とする医薬組成物、ヒト羊膜由来上皮細胞を有効成分とする糖尿病治療剤、ヒト羊膜由来上皮細胞を糖尿病患者に投与する糖尿病治療法、ヒト羊膜由来間葉系細胞を有効成分とする医薬組成物、ヒト羊膜由来間葉系細胞を有効成分とする骨代謝異常症治療剤、ヒト羊膜由来間葉系細胞を骨代謝異常症患者に投与する骨代謝異常症治療法が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−２３１６３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、本発明者らは、羊膜上皮細胞及び羊膜間葉系細胞の膵分化誘導を試み、膵分化マーカの発現について、ＲＴ−ＰＣＲによって検討を行ったが、その中で、羊膜上皮細胞にインスリン、羊膜間葉系細胞にグルカゴンの発現が確認されるという興味深い結果が得られている。
【０００７】
このように、羊膜細胞が膵内分泌細胞へ分化し得ることが示唆されたが、羊膜上皮細胞におけるインスリンの発現に着目し、糖尿病治療への応用を提案したのが特許文献１記載の発明である。一方、羊膜間葉系細胞に関しては、前記グルカゴンの発現は確認されたものの、糖尿病治療への応用はほとんど検討されていない。
【０００８】
本発明は、前述のような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、羊膜細胞の糖尿病治療への応用に関する研究をさらに進め、糖尿病治療に有効且つ有用なヒト羊膜由来間葉系細胞を提供することを目的とし、さらには新規な糖尿病治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、前述の目的を達成するために、種々の研究を重ねてきた。その結果、不死化したヒト羊膜由来間葉系細胞が、実験動物の生命維持に関し、血糖値を下げる効果を有すること、及び延命効果を示すことが確認された。また、本発明者らがヒト羊膜由来間葉系細胞の不死化を試みたところ、前述のヒト羊膜由来間葉系細胞が本来有する分化能に加えて、ヒト羊膜由来上皮細胞が持つ分化の方向性の一部を獲得しており、単なる不死化細胞やヒト羊膜由来上皮細胞を有効成分とする特許文献１記載の医薬組成物を越えるものとなっていることを見出した。
【００１０】
本発明は、これらの知見に基づいて案出されたものである。すなわち、本発明のヒト羊膜由来間葉系細胞は、外因性の不死化遺伝子が導入され、不死化されていることを特徴とするものであり、さらには、血糖値低下作用を発現することを特徴とする。また、本発明の糖尿病治療薬は、前記不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞を有効成分として含有することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、倫理的問題や免疫反応を回避することができ、細胞の確保も容易で、血糖値低下効果の高いヒト羊膜由来間葉系細胞を提供することが可能である。また、本発明のヒト羊膜由来間葉系細胞を用いることで、糖尿病治療に有益な新規な糖尿病治療薬を提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を適用したヒト羊膜由来間葉系細胞及び糖尿病治療薬について、詳細に説明する。
【００１３】
ヒト羊膜には、上皮細胞（ヒト羊膜由来上皮細胞）と間葉系細胞（ヒト羊膜由来間葉系細胞）とが含まれるが、本発明においては、ヒト羊膜由来間葉系細胞を利用する。ヒト羊膜由来間葉系細胞は、ヒト羊膜から得ることができるが、ヒト羊膜は、例えばインフォームドコンセントを得たヒト妊婦を帝王切開し、通常の外科的手法で得ることができる。あるいは、分娩後に廃棄される胎盤付着物として得ることも可能である。
【００１４】
ヒト羊膜から間葉系細胞を分離するには、ヒト羊膜から上皮細胞を取り除いた後、残存するヒト羊膜に対して分離操作を行えばよい。上皮細胞のヒト羊膜からの分離や、間葉系細胞のヒト羊膜からの分離は、例えば特開２００３−２３１６３９号公報に記載される方法に準じて行えばよい。
【００１５】
具体的には、ヒト羊膜から上皮細胞を得るには、入手したヒト羊膜を滅菌したハサミ等を用いて断片化し、通常の動物細胞の培養に用いられる培養液に入れ、振盪する。この際、羊膜断片を個々の細胞に分散化するため、トリプシン等の蛋白質分解酵素を共存させることが望ましい。振盪後、遠心操作によって細胞を集め、上清を除去した後、蛋白質分解酵素が共存する培養液中で再度振盪する。この後、培養液を滅菌ガーゼ等のメッシュで漉し、上皮細胞を遠心操作によって分離する。
【００１６】
以上のようにして上皮細胞を分離した後、ガーゼ等のメッシュ上に残されたヒト羊膜残渣から間葉系細胞を分離する。間葉系細胞をヒト羊膜残渣から分離するには、ガーゼ等のメッシュ上に残されたヒト羊膜残渣に蛋白質分解酵素と核酸分解酵素を加えて振盪し、消化を行う。消化されたヒト羊膜をガーゼ等のメッシュで漉し、間葉系細胞を分離する。間葉系細胞は、通常、１枚の羊膜から５×１０６個程度得ることができる。
【００１７】
得られたヒト羊膜由来間葉系細胞は、そのまま不死化に用いてもよいし、培養したものを不死化してもよい。培養は、例えば血清を含む培養液を用い、ＣＯ２インキュベータ中で行えばよい。培養温度は例えば３７℃、ＣＯ２濃度は例えば５％である。
【００１８】
以上のようなヒト羊膜由来間葉系細胞を不死化するが、ヒト羊膜由来間葉系細胞を不死化するには、外因性の不死化遺伝子を導入すればよく、例えばテロメラーゼやヒトがん遺伝子ＥＢ１のホモログであるＢｍｉ−１をヒト羊膜由来間葉系細胞に発現させる方法、ウイルス由来の不死化遺伝子を用いる方法、さらにはこれらの組み合わせ等を採用することができる。
【００１９】
テロメラーゼをヒト羊膜由来間葉系細胞に発現させるには、例えばテロメラーゼの触媒サブユニットであるテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ：Telomerase Reverse Transcriptase）遺伝子をレトロウイルスベクターに導入し、当該ベクターをヒト羊膜由来間葉系細胞に導入すればよい。Ｂｍｉ−１をヒト羊膜由来間葉系細胞に発現させるには、同様に、Ｂｍｉ−１遺伝子をレトロウイルスベクターに導入し、当該ベクターをヒト羊膜由来間葉系細胞に導入すればよい。ウイルス由来の不死化遺伝子を用いる方法では、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子を用い、これら遺伝子をレトロウイルスベクターあるいはプラスミドベクターに導入し、これらベクターをヒト羊膜由来間葉系細胞に導入すればよい。なお、前記ＴＥＲＴ遺伝子やＢｍｉ−１遺伝子、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子の導入は、ベクターを使用する方法の他、例えばエレクトロポーション法、マイクロインジェクション法等によって行うこともできる。
【００２０】
これら方法の中で、ＴＥＲＴ遺伝子とヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子を導入する方法は、確実にヒト羊膜由来間葉系細胞を不死化し得る好ましい方法である。ヒト羊膜由来間葉系細胞は、テロメア依存性の細胞老化の機構と、テロメア非依存性の早期細胞老化の機構の、２段階の老化機構を有するものと考えられる。ここで、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子を導入すれば、テロメア非依存性の早期細胞老化を防止することができ、培養早期の増殖停止を乗り越えることができるものと考えられる。また、その後にテロメア短縮による細胞老化（テロメア依存性の細胞老化）が訪れるが、ＴＥＲＴ遺伝子を導入することにより、これを乗り越えることができるものと考えられる。
【００２１】
このようにＴＥＲＴ遺伝子とヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子を導入する場合には、不死化のための最初のステップとして、非テロメア依存性の細胞老化を乗り越えるためのＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子を導入し、その後にＴＥＲＴ遺伝子を導入することが望ましい。
【００２２】
以上の方法によりゲノムＤＮＡへの遺伝子導入が行われ、同遺伝子を保持発現することにより細胞老化を乗り越えた細胞を選択し回収する。細胞の選択に際しては、導入した発現ベクター内に存在する選択マーカを利用し、薬剤に対する感受性の差による薬剤セレクション等の手段を併せ行うことができる。また、回収した細胞は、免疫組織学的染色の手法、ＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現解析方法等を用いてヒト羊膜由来間葉系細胞であることを確認することができる。
【００２３】
前述の方法により作製し選択したヒト羊膜由来間葉系細胞は、半永久的に継代培養を行うことが可能であり、非癌性の形質を維持している。そして、特筆すべきは、この不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞が顕著な血糖値低下作用を有していることである。不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞が顕著な血糖値低下作用を有することは、本発明者らの実験によって確かめられた事実である。このように不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞が血糖値低下作用を有するのは、前記不死化によって、ヒト羊膜由来上皮細胞が持つ分化の方向性の一部を獲得した結果によるものと推測される。
【００２４】
したがって、本発明のヒト羊膜由来間葉系細胞（前記不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞）は、糖尿病治療に有効であると考えられ、糖尿病治療薬の有効成分として有用であり、これを用いることで治療効果の高い糖尿病治療薬を提供することが可能である。前記ヒト羊膜由来間葉系細胞は、増殖能に優れ、不死化によって半永久的に継代培養を行うことが可能であるので、通常のヒト羊膜由来上皮細胞等を用いる場合に比べて、供給の安定性、あるいは大量生産の点で遙かに有利である。また、ヒト羊膜由来間葉系細胞の形質を備えていることから、例えば免疫反応を回避し得る可能性も高く、さらにはヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する場合に問題となるような倫理的な問題についても、これを回避することが可能である。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。
【００２６】
ヒト羊膜由来間葉系細胞の分離及び培養
予め同意を得た妊婦の帝王切開分娩で排出された胎盤を生理食塩水で洗浄し、羊膜を採取した。得られた羊膜を滅菌処理した手術用のハサミで切断して断片化し、トリプシンを０．２％含む細胞培養液（ダルベッコ変法イーグル培地）と共に容量５０ｍｌのファルコンチューブに入れ、温度３７℃に保ちながらシェーカーで８０ｒｐｍ、３０分間振盪した。溶液を滅菌ガーゼで漉し、上皮細胞懸濁液を採取した。採取した懸濁液を遠心後、上清を除去し、上皮細胞を回収した。滅菌ガーゼに残された羊膜について、同様のトリプシン消化と細胞回収の操作を繰り返し、回収される細胞が１×１０５を下回るまで行った。
【００２７】
上皮細胞を完全に取り除いた後、滅菌ガーゼに残された羊膜をコラゲナーゼ（和光純薬社製）０．７５ｍｇ／ｍｌ及びＤＮＡアーゼ（シグマ社製）０．７５ｍｇ／ｍｌと共に温度３７℃に保ちながらシェーカーで８０ｒｐｍ、３０〜５０分間振盪し、消化を行った。消化された羊膜を滅菌ガーゼで漉し、間葉系細胞（ヒト羊膜由来間葉系細胞：ＨＡＭ）を分離した。
【００２８】
分離した間葉系細胞を遠心で集め、子牛胎児血清を１０％含む細胞培養液（ダルベッコ変法イーグル培地）で１×１０４個／ｃｍ２の密度で幡種し、温度３７℃、５％ＣＯ２下、抗生物質（ペニシリンＧ １００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ ０．２５μｇ／ｍｌ）存在下で培養を行った。
【００２９】
異なる２人の患者から採取した羊膜について、それぞれ前述の操作を行ってヒト羊膜由来間葉系細胞を分離し、それぞれＨＡＭ３、及びＨＡＭ４と名付けた。
【００３０】
ヒト羊膜由来間葉系細胞の不死化
前述の操作によって得られたヒト羊膜由来間葉系細胞（ＨＡＭ３及びＨＡＭ４）について、ＨＰＶ１６Ｅ６遺伝子、ＨＰＶ１６Ｅ７遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、Ｂｍｉ−１遺伝子のいずれか、あるいはこれらを組み合わせて導入した。これら遺伝子の導入は、レトロウイルスベクターあるいはレンチウイルスベクターにてウイルス感染法により行った。使用した細胞、培地、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターは、下記の通りである。
【００３１】
ヒト羊膜由来間葉系細胞：ＨＡＭ３、ＨＡＭ４
培地：ダルベッコ変法イーグル培地（high glucose）＋１０％ＦＢＳ
レトロウイルスベクター：表１に示す。
レンチウイルスベクター（薬剤耐性マーカーなし）：表２に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
＜レトロウイルス調製法＞
Naviauxらの方法［Naviaux,R.K., Costanzi, E., Hass, M. and Verma, I.M.V.(1996)The pCL vector system:rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J.Virol. 70(8):5701-5］に基づき、１０Ａｌenvelopeを持つウイルスを調製した。タイターはヒーラ（Hela）細胞に対する薬事耐性コロニー形成能で調べ、１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上のものを用いた。
【００３５】
＜レンチウイルス調製法＞
三好らの方法［ Miyoshi, H.Gene delivery to hematopoietic stem cells using lentiviral vectors. Methods in Molecular Biology(HUMAN PRESS) Vol.246: 429-438 (2004)］により、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルスを作製した。
【００３６】
＜ウイルス感染法＞
８μｇ／ｍｌ polybrene（シグマ社製）の存在下に、前記各ウイルス液を加え、一晩インキュベートした。
【００３７】
＜樹立細胞の説明＞
樹立した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞は、ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４の４種類である。
【００３８】
１．ｉＨＡＭ１：HAM3/542:CSII-CMV-16E6E7(@p1)
ＨＡＭ３細胞に542:CSII-CMV-16E6E7ウイルスを継代数１で感染し、延命した細胞。
本細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１０（受領日：平成２０年７月２２日）、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ２１６５１（受領日：平成２０年８月１９日）として寄託されている。
【００３９】
２．ｉＨＡＭ２：HAM3/542:CSII-CMV-16E6E7(@p1)/344:MSCVpurohTERT(@p2)
ＨＡＭ３細胞に542:CSII-CMV-16E6E7ウイルスを継代数１で感染した後、344:MSCVpurohTERTウイルスを継代数２で感染し、puromycin１μｇ／ｍｌ存在下で薬剤選択した延命細胞（不死化細胞）。
本細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１１（受領日：平成２０年７月２２日）、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ２１６５２（受領日：平成２０年８月１９日）として寄託されている。
【００４０】
３．ｉＨＡＭ３：HAM4/136:LXSN-hbmi1(@p4)/344:MSCVpurohTERT(@p4)
ＨＡＭ４細胞に136:LXSN-hbmi1ウイルス及び344:MSCVpurohTERTウイルスを継代数４で導入し、Ｇ４１８ ８００μｇ／ｍｌ及びpuromycin１μｇ／ｍｌ存在下で薬剤選択した延命細胞(不死化細胞)。
本細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１２（受領日：平成２０年７月２２日）、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ２１６５３（受領日：平成２０年８月１９日）として寄託されている。
【００４１】
４．ｉＨＡＭ４：HAM4/344:MSCVpurohTERT(@p4)/96:LXSN-16E6E7(@p5)
ＨＡＭ４細胞に344:MSCVpurohTERTウイルスを継代数４で導入し、puromycin１μｇ／ｍｌ存在下で薬剤選択した後、96:LXSN-16E6E7ウイルスを継代数５で導入し、Ｇ４１８ ８００μｇ／ｍｌ存在下で薬剤選択した延命細胞(不死化細胞)。
本細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１３（受領日：平成２０年７月２２日）、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ２１６５４（受領日：平成２０年８月１９日）として寄託されている。
【００４２】
細胞増殖（不死化）に関する確認試験
作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４について、増殖能を調べた。結果を図１に示す。図１には、不死化ヒト羊膜由来上皮細胞ｉＨＡＥについての結果も併せて示す。不死化ヒト羊膜由来上皮細胞ｉＨＡＥは、ヒト羊膜由来上皮細胞ＨＡＥに542:CSII-CMV-16E6E7ウイルスを継代数２で感染した後、1313:CSII-CMV-cdk4R24C-PGK-hTERTウイルスを継代数３で感染し、延命（不死化）した細胞である。
【００４３】
図１から明らかな通り、作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４は、いずれも同様の増殖パターンを示し、分裂回数が１００回を越えてからも旺盛な分裂を繰り返した。したがって、作製された不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４は、細胞老化を乗り越えて著しく延命化されたことが明らかであり、このことから不死化されたものと考えられる。
【００４４】
不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞の性状解析１
免疫組織学的方法及びＲＴ−ＰＣＲによって作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４の幹細胞マーカの発現の有無を調べた。図２にＳＳＥＡ４染色結果を、図３にビメンチン（Vimentin）染色結果を、図４にＲＴ−ＰＣＲによる解析結果を示す。なお、これら図面において、ＨＡＭｆは羊膜から単離直後の間葉系細胞、ＨＡＭ２Ｐは２継代後の間葉系細胞である。
【００４５】
これら解析結果より、作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４においては、幹細胞マーカであるｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｎａｎｏｇ、ｋｌｆ４、ＳＳＥＡ４、ｃ−ｍｙｃ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｎｅｓｔｉｎについて、それぞれ発現が見られた。
【００４６】
不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞の性状解析２
作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４について、種々の抗体を用い、フローサイトメータで測定を行って表面抗原の解析を行った。結果を図５及び図６に示す。不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４では、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４４については陽性であった。一方、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４については陰性であった。
【００４７】
不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞の性状解析３
作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４について、Oil Red O、Alizarin Red S、Alkaline phosphatese activity (vector red)、Toluidine blueによる染色、及びＲＴ−ＰＣＲを行い、脂肪細胞への分化能、骨分化能、軟骨分化能が維持されているか否かを調べた。
【００４８】
図７（ａ）はOil Red Oによる染色結果、図７（ｂ）はＰＰＡＲ２及びβ−アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果である。図８（ａ）はAlizarin Red Sによる染色結果、図８（ｂ）はAlkaline phosphatese activity (vector red)による染色結果、図８（ｃ）はＡＬＰ（Alkaline phosphatese）、Osteopontin、β−アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果である。図９（ａ）はToluidine blueによる染色結果、図９（ｂ）はCol2A1、Sox9、β−アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果である。いずれも分化誘導後（Induced）とコントロール（Uninduced）についての結果を示している。これらの解析結果から、作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞においては、脂肪細胞への分化能、骨分化能、軟骨分化能のいずれもが維持されていることがわかった。
【００４９】
血糖値低下作用に関する検討
生後７週の雄のマウスに、ストレプトゾトシンを２５０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内投与し、Ｉ型糖尿病モデル動物を作製した。投与後、５日経過してから、尾静脈より採取した全血の血糖値を小型血糖測定器（アークレイファクトリー社製：商品名グルコカードダイアメータ）で測定した。
【００５０】
マウスを無処置群（control）と処置群に分け、処置群には作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ２を１×１０６個、脾臓内に投与した。その後、２日目に血糖値を測定し、経過観測した。結果を図１０に示す。図１０を見ると明らかなように、処置群、すなわち不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ２を投与したマウス群において、血糖値の低下が見られた。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】不死化したヒト羊膜由来間葉系細胞及びヒト羊膜由来上皮細胞について、培養日数（経過日数）と分裂回数の関係を示す特性図である。
【図２】ＳＳＥＡ４染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図３】ビメンチン（Vimentin）染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図４】各種細胞のＲＴ−ＰＣＲによる解析結果を示す図である。
【図５】フローサイトメータでの測定による表面抗原の解析結果を示す図であり、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４４に関する解析結果を示すものである。
【図６】フローサイトメータでの測定による表面抗原の解析結果を示す図であり、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４に関する解析結果を示すものである。
【図７】（ａ）はOil Red Oによる染色結果、（ｂ）はＰＰＡＲ２及びβ−アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果である。
【図８】（ａ）はAlizarin Red Sによる染色結果、（ｂ）はAlkaline phosphatese activity (vector red)による染色結果、（ｃ）はＡＬＰ、Osteopontin、β−アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果である。
【図９】（ａ）はToluidine blueによる染色結果、（ｂ）はCol2A1、Sox9、β−アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果である。
【図１０】不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞の投与の有無による血糖値変化の相違を示す特性図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不死化したヒト羊膜由来間葉系細胞に関するものであり、さらには、その血糖値低下作用を利用した糖尿病治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療の分野においては、幹細胞に関する研究が進展しており、例えばヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の樹立等に関する研究が盛んに進められている。ただし、ＥＳ細胞を樹立するには、受精卵ないしは受精卵より発生が進んだ胚盤胞までの段階の初期胚等が必要になることから、ＥＳ細胞を含めた幹細胞の使用においては、倫理的問題の解決、免疫反応の回避、ドナー細胞の確保等が大きな問題となる。
【０００３】
このような状況から、本願発明者らは、ヒトＥＳ細胞のような多能性幹細胞を含む組織に関する検討を進め、分娩後に廃棄される胎盤付着物、特に羊膜に着目し、羊膜細胞を用いた再生医療の可能性について研究を進めている。羊膜は、胚体外組織の１つであり、胎児を形成する胚盤葉上層に由来する羊膜上皮、及び胚外中胚葉の一部（羊膜間葉組織）から構成されている。羊膜上皮細胞及び羊膜間葉系細胞について、遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討したところ、羊膜由来細胞には未分化な細胞群が含まれる可能性が示唆された。また、羊膜は、免疫学的にも特殊な性質を有しており、母体免疫システムから認識され難く、種々の免疫抑制因子を産生することで、免疫反応を抑制するシステムも有している。このことから、羊膜細胞は、たとえ移植時に組織適合性抗原ＨＬＡの一致が不十分な場合にも、レシピエントの免疫が比較的穏やかであると期待される。
【０００４】
これまで、羊膜細胞の生物学的特性を検討し、再生医療に利用すべく研究を推し進め、例えば、単離培養ヒト羊膜上皮細胞がインシュリン様の物質を分泌し、糖尿モデルマウスの血糖値を優位に低下させることを報告している。そして、これをもとに、ヒト羊膜由来上皮細胞の糖尿病治療薬としての利用、及びヒト羊膜由来間葉系細胞の軟骨及び骨の代謝異常治療薬としての利用を提案している（特許文献１を参照）。
【０００５】
前記特許文献１には、ヒト羊膜由来上皮細胞を有効成分とする医薬組成物、ヒト羊膜由来上皮細胞を有効成分とする糖尿病治療剤、ヒト羊膜由来上皮細胞を糖尿病患者に投与する糖尿病治療法、ヒト羊膜由来間葉系細胞を有効成分とする医薬組成物、ヒト羊膜由来間葉系細胞を有効成分とする骨代謝異常症治療剤、ヒト羊膜由来間葉系細胞を骨代謝異常症患者に投与する骨代謝異常症治療法が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−２３１６３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、本発明者らは、羊膜上皮細胞及び羊膜間葉系細胞の膵分化誘導を試み、膵分化マーカの発現について、ＲＴ−ＰＣＲによって検討を行ったが、その中で、羊膜上皮細胞にインスリン、羊膜間葉系細胞にグルカゴンの発現が確認されるという興味深い結果が得られている。
【０００７】
このように、羊膜細胞が膵内分泌細胞へ分化し得ることが示唆されたが、羊膜上皮細胞におけるインスリンの発現に着目し、糖尿病治療への応用を提案したのが特許文献１記載の発明である。一方、羊膜間葉系細胞に関しては、前記グルカゴンの発現は確認されたものの、糖尿病治療への応用はほとんど検討されていない。
【０００８】
本発明は、前述のような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、羊膜細胞の糖尿病治療への応用に関する研究をさらに進め、糖尿病治療に有効且つ有用なヒト羊膜由来間葉系細胞を提供することを目的とし、さらには新規な糖尿病治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、前述の目的を達成するために、種々の研究を重ねてきた。その結果、不死化したヒト羊膜由来間葉系細胞が、実験動物の生命維持に関し、血糖値を下げる効果を有すること、及び延命効果を示すことが確認された。また、本発明者らがヒト羊膜由来間葉系細胞の不死化を試みたところ、前述のヒト羊膜由来間葉系細胞が本来有する分化能に加えて、ヒト羊膜由来上皮細胞が持つ分化の方向性の一部を獲得しており、単なる不死化細胞やヒト羊膜由来上皮細胞を有効成分とする特許文献１記載の医薬組成物を越えるものとなっていることを見出した。
【００１０】
本発明は、これらの知見に基づいて案出されたものである。すなわち、本発明のヒト羊膜由来間葉系細胞は、外因性の不死化遺伝子が導入され、不死化されていることを特徴とするものであり、さらには、血糖値低下作用を発現することを特徴とする。また、本発明の糖尿病治療薬は、前記不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞を有効成分として含有することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、倫理的問題や免疫反応を回避することができ、細胞の確保も容易で、血糖値低下効果の高いヒト羊膜由来間葉系細胞を提供することが可能である。また、本発明のヒト羊膜由来間葉系細胞を用いることで、糖尿病治療に有益な新規な糖尿病治療薬を提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を適用したヒト羊膜由来間葉系細胞及び糖尿病治療薬について、詳細に説明する。
【００１３】
ヒト羊膜には、上皮細胞（ヒト羊膜由来上皮細胞）と間葉系細胞（ヒト羊膜由来間葉系細胞）とが含まれるが、本発明においては、ヒト羊膜由来間葉系細胞を利用する。ヒト羊膜由来間葉系細胞は、ヒト羊膜から得ることができるが、ヒト羊膜は、例えばインフォームドコンセントを得たヒト妊婦を帝王切開し、通常の外科的手法で得ることができる。あるいは、分娩後に廃棄される胎盤付着物として得ることも可能である。
【００１４】
ヒト羊膜から間葉系細胞を分離するには、ヒト羊膜から上皮細胞を取り除いた後、残存するヒト羊膜に対して分離操作を行えばよい。上皮細胞のヒト羊膜からの分離や、間葉系細胞のヒト羊膜からの分離は、例えば特開２００３−２３１６３９号公報に記載される方法に準じて行えばよい。
【００１５】
具体的には、ヒト羊膜から上皮細胞を得るには、入手したヒト羊膜を滅菌したハサミ等を用いて断片化し、通常の動物細胞の培養に用いられる培養液に入れ、振盪する。この際、羊膜断片を個々の細胞に分散化するため、トリプシン等の蛋白質分解酵素を共存させることが望ましい。振盪後、遠心操作によって細胞を集め、上清を除去した後、蛋白質分解酵素が共存する培養液中で再度振盪する。この後、培養液を滅菌ガーゼ等のメッシュで漉し、上皮細胞を遠心操作によって分離する。
【００１６】
以上のようにして上皮細胞を分離した後、ガーゼ等のメッシュ上に残されたヒト羊膜残渣から間葉系細胞を分離する。間葉系細胞をヒト羊膜残渣から分離するには、ガーゼ等のメッシュ上に残されたヒト羊膜残渣に蛋白質分解酵素と核酸分解酵素を加えて振盪し、消化を行う。消化されたヒト羊膜をガーゼ等のメッシュで漉し、間葉系細胞を分離する。間葉系細胞は、通常、１枚の羊膜から５×１０６個程度得ることができる。
【００１７】
得られたヒト羊膜由来間葉系細胞は、そのまま不死化に用いてもよいし、培養したものを不死化してもよい。培養は、例えば血清を含む培養液を用い、ＣＯ２インキュベータ中で行えばよい。培養温度は例えば３７℃、ＣＯ２濃度は例えば５％である。
【００１８】
以上のようなヒト羊膜由来間葉系細胞を不死化するが、ヒト羊膜由来間葉系細胞を不死化するには、外因性の不死化遺伝子を導入すればよく、例えばテロメラーゼやヒトがん遺伝子ＥＢ１のホモログであるＢｍｉ−１をヒト羊膜由来間葉系細胞に発現させる方法、ウイルス由来の不死化遺伝子を用いる方法、さらにはこれらの組み合わせ等を採用することができる。
【００１９】
テロメラーゼをヒト羊膜由来間葉系細胞に発現させるには、例えばテロメラーゼの触媒サブユニットであるテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ：Telomerase Reverse Transcriptase）遺伝子をレトロウイルスベクターに導入し、当該ベクターをヒト羊膜由来間葉系細胞に導入すればよい。Ｂｍｉ−１をヒト羊膜由来間葉系細胞に発現させるには、同様に、Ｂｍｉ−１遺伝子をレトロウイルスベクターに導入し、当該ベクターをヒト羊膜由来間葉系細胞に導入すればよい。ウイルス由来の不死化遺伝子を用いる方法では、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子を用い、これら遺伝子をレトロウイルスベクターあるいはプラスミドベクターに導入し、これらベクターをヒト羊膜由来間葉系細胞に導入すればよい。なお、前記ＴＥＲＴ遺伝子やＢｍｉ−１遺伝子、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子の導入は、ベクターを使用する方法の他、例えばエレクトロポーション法、マイクロインジェクション法等によって行うこともできる。
【００２０】
これら方法の中で、ＴＥＲＴ遺伝子とヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子を導入する方法は、確実にヒト羊膜由来間葉系細胞を不死化し得る好ましい方法である。ヒト羊膜由来間葉系細胞は、テロメア依存性の細胞老化の機構と、テロメア非依存性の早期細胞老化の機構の、２段階の老化機構を有するものと考えられる。ここで、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子を導入すれば、テロメア非依存性の早期細胞老化を防止することができ、培養早期の増殖停止を乗り越えることができるものと考えられる。また、その後にテロメア短縮による細胞老化（テロメア依存性の細胞老化）が訪れるが、ＴＥＲＴ遺伝子を導入することにより、これを乗り越えることができるものと考えられる。
【００２１】
このようにＴＥＲＴ遺伝子とヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子を導入する場合には、不死化のための最初のステップとして、非テロメア依存性の細胞老化を乗り越えるためのＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子を導入し、その後にＴＥＲＴ遺伝子を導入することが望ましい。
【００２２】
以上の方法によりゲノムＤＮＡへの遺伝子導入が行われ、同遺伝子を保持発現することにより細胞老化を乗り越えた細胞を選択し回収する。細胞の選択に際しては、導入した発現ベクター内に存在する選択マーカを利用し、薬剤に対する感受性の差による薬剤セレクション等の手段を併せ行うことができる。また、回収した細胞は、免疫組織学的染色の手法、ＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現解析方法等を用いてヒト羊膜由来間葉系細胞であることを確認することができる。
【００２３】
前述の方法により作製し選択したヒト羊膜由来間葉系細胞は、半永久的に継代培養を行うことが可能であり、非癌性の形質を維持している。そして、特筆すべきは、この不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞が顕著な血糖値低下作用を有していることである。不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞が顕著な血糖値低下作用を有することは、本発明者らの実験によって確かめられた事実である。このように不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞が血糖値低下作用を有するのは、前記不死化によって、ヒト羊膜由来上皮細胞が持つ分化の方向性の一部を獲得した結果によるものと推測される。
【００２４】
したがって、本発明のヒト羊膜由来間葉系細胞（前記不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞）は、糖尿病治療に有効であると考えられ、糖尿病治療薬の有効成分として有用であり、これを用いることで治療効果の高い糖尿病治療薬を提供することが可能である。前記ヒト羊膜由来間葉系細胞は、増殖能に優れ、不死化によって半永久的に継代培養を行うことが可能であるので、通常のヒト羊膜由来上皮細胞等を用いる場合に比べて、供給の安定性、あるいは大量生産の点で遙かに有利である。また、ヒト羊膜由来間葉系細胞の形質を備えていることから、例えば免疫反応を回避し得る可能性も高く、さらにはヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する場合に問題となるような倫理的な問題についても、これを回避することが可能である。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。
【００２６】
ヒト羊膜由来間葉系細胞の分離及び培養
予め同意を得た妊婦の帝王切開分娩で排出された胎盤を生理食塩水で洗浄し、羊膜を採取した。得られた羊膜を滅菌処理した手術用のハサミで切断して断片化し、トリプシンを０．２％含む細胞培養液（ダルベッコ変法イーグル培地）と共に容量５０ｍｌのファルコンチューブに入れ、温度３７℃に保ちながらシェーカーで８０ｒｐｍ、３０分間振盪した。溶液を滅菌ガーゼで漉し、上皮細胞懸濁液を採取した。採取した懸濁液を遠心後、上清を除去し、上皮細胞を回収した。滅菌ガーゼに残された羊膜について、同様のトリプシン消化と細胞回収の操作を繰り返し、回収される細胞が１×１０５を下回るまで行った。
【００２７】
上皮細胞を完全に取り除いた後、滅菌ガーゼに残された羊膜をコラゲナーゼ（和光純薬社製）０．７５ｍｇ／ｍｌ及びＤＮＡアーゼ（シグマ社製）０．７５ｍｇ／ｍｌと共に温度３７℃に保ちながらシェーカーで８０ｒｐｍ、３０〜５０分間振盪し、消化を行った。消化された羊膜を滅菌ガーゼで漉し、間葉系細胞（ヒト羊膜由来間葉系細胞：ＨＡＭ）を分離した。
【００２８】
分離した間葉系細胞を遠心で集め、子牛胎児血清を１０％含む細胞培養液（ダルベッコ変法イーグル培地）で１×１０４個／ｃｍ２の密度で幡種し、温度３７℃、５％ＣＯ２下、抗生物質（ペニシリンＧ １００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ ０．２５μｇ／ｍｌ）存在下で培養を行った。
【００２９】
異なる２人の患者から採取した羊膜について、それぞれ前述の操作を行ってヒト羊膜由来間葉系細胞を分離し、それぞれＨＡＭ３、及びＨＡＭ４と名付けた。
【００３０】
ヒト羊膜由来間葉系細胞の不死化
前述の操作によって得られたヒト羊膜由来間葉系細胞（ＨＡＭ３及びＨＡＭ４）について、ＨＰＶ１６Ｅ６遺伝子、ＨＰＶ１６Ｅ７遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、Ｂｍｉ−１遺伝子のいずれか、あるいはこれらを組み合わせて導入した。これら遺伝子の導入は、レトロウイルスベクターあるいはレンチウイルスベクターにてウイルス感染法により行った。使用した細胞、培地、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターは、下記の通りである。
【００３１】
ヒト羊膜由来間葉系細胞：ＨＡＭ３、ＨＡＭ４
培地：ダルベッコ変法イーグル培地（high glucose）＋１０％ＦＢＳ
レトロウイルスベクター：表１に示す。
レンチウイルスベクター（薬剤耐性マーカーなし）：表２に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
＜レトロウイルス調製法＞
Naviauxらの方法［Naviaux,R.K., Costanzi, E., Hass, M. and Verma, I.M.V.(1996)The pCL vector system:rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J.Virol. 70(8):5701-5］に基づき、１０Ａｌenvelopeを持つウイルスを調製した。タイターはヒーラ（Hela）細胞に対する薬事耐性コロニー形成能で調べ、１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上のものを用いた。
【００３５】
＜レンチウイルス調製法＞
三好らの方法［ Miyoshi, H.Gene delivery to hematopoietic stem cells using lentiviral vectors. Methods in Molecular Biology(HUMAN PRESS) Vol.246: 429-438 (2004)］により、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルスを作製した。
【００３６】
＜ウイルス感染法＞
８μｇ／ｍｌ polybrene（シグマ社製）の存在下に、前記各ウイルス液を加え、一晩インキュベートした。
【００３７】
＜樹立細胞の説明＞
樹立した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞は、ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４の４種類である。
【００３８】
１．ｉＨＡＭ１：HAM3/542:CSII-CMV-16E6E7(@p1)
ＨＡＭ３細胞に542:CSII-CMV-16E6E7ウイルスを継代数１で感染し、延命した細胞。
本細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１０（受領日：平成２０年７月２２日）、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ２１６５１（受領日：平成２０年８月１９日）として寄託されている。
【００３９】
２．ｉＨＡＭ２：HAM3/542:CSII-CMV-16E6E7(@p1)/344:MSCVpurohTERT(@p2)
ＨＡＭ３細胞に542:CSII-CMV-16E6E7ウイルスを継代数１で感染した後、344:MSCVpurohTERTウイルスを継代数２で感染し、puromycin１μｇ／ｍｌ存在下で薬剤選択した延命細胞（不死化細胞）。
本細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１１（受領日：平成２０年７月２２日）、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ２１６５２（受領日：平成２０年８月１９日）として寄託されている。
【００４０】
３．ｉＨＡＭ３：HAM4/136:LXSN-hbmi1(@p4)/344:MSCVpurohTERT(@p4)
ＨＡＭ４細胞に136:LXSN-hbmi1ウイルス及び344:MSCVpurohTERTウイルスを継代数４で導入し、Ｇ４１８ ８００μｇ／ｍｌ及びpuromycin１μｇ／ｍｌ存在下で薬剤選択した延命細胞(不死化細胞)。
本細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１２（受領日：平成２０年７月２２日）、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ２１６５３（受領日：平成２０年８月１９日）として寄託されている。
【００４１】
４．ｉＨＡＭ４：HAM4/344:MSCVpurohTERT(@p4)/96:LXSN-16E6E7(@p5)
ＨＡＭ４細胞に344:MSCVpurohTERTウイルスを継代数４で導入し、puromycin１μｇ／ｍｌ存在下で薬剤選択した後、96:LXSN-16E6E7ウイルスを継代数５で導入し、Ｇ４１８ ８００μｇ／ｍｌ存在下で薬剤選択した延命細胞(不死化細胞)。
本細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１３（受領日：平成２０年７月２２日）、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ２１６５４（受領日：平成２０年８月１９日）として寄託されている。
【００４２】
細胞増殖（不死化）に関する確認試験
作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４について、増殖能を調べた。結果を図１に示す。図１には、不死化ヒト羊膜由来上皮細胞ｉＨＡＥについての結果も併せて示す。不死化ヒト羊膜由来上皮細胞ｉＨＡＥは、ヒト羊膜由来上皮細胞ＨＡＥに542:CSII-CMV-16E6E7ウイルスを継代数２で感染した後、1313:CSII-CMV-cdk4R24C-PGK-hTERTウイルスを継代数３で感染し、延命（不死化）した細胞である。
【００４３】
図１から明らかな通り、作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４は、いずれも同様の増殖パターンを示し、分裂回数が１００回を越えてからも旺盛な分裂を繰り返した。したがって、作製された不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４は、細胞老化を乗り越えて著しく延命化されたことが明らかであり、このことから不死化されたものと考えられる。
【００４４】
不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞の性状解析１
免疫組織学的方法及びＲＴ−ＰＣＲによって作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４の幹細胞マーカの発現の有無を調べた。図２にＳＳＥＡ４染色結果を、図３にビメンチン（Vimentin）染色結果を、図４にＲＴ−ＰＣＲによる解析結果を示す。なお、これら図面において、ＨＡＭｆは羊膜から単離直後の間葉系細胞、ＨＡＭ２Ｐは２継代後の間葉系細胞である。
【００４５】
これら解析結果より、作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４においては、幹細胞マーカであるｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｎａｎｏｇ、ｋｌｆ４、ＳＳＥＡ４、ｃ−ｍｙｃ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｎｅｓｔｉｎについて、それぞれ発現が見られた。
【００４６】
不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞の性状解析２
作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４について、種々の抗体を用い、フローサイトメータで測定を行って表面抗原の解析を行った。結果を図５及び図６に示す。不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４では、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４４については陽性であった。一方、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４については陰性であった。
【００４７】
不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞の性状解析３
作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ１〜ｉＨＡＭ４について、Oil Red O、Alizarin Red S、Alkaline phosphatese activity (vector red)、Toluidine blueによる染色、及びＲＴ−ＰＣＲを行い、脂肪細胞への分化能、骨分化能、軟骨分化能が維持されているか否かを調べた。
【００４８】
図７（ａ）はOil Red Oによる染色結果、図７（ｂ）はＰＰＡＲ２及びβ−アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果である。図８（ａ）はAlizarin Red Sによる染色結果、図８（ｂ）はAlkaline phosphatese activity (vector red)による染色結果、図８（ｃ）はＡＬＰ（Alkaline phosphatese）、Osteopontin、β−アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果である。図９（ａ）はToluidine blueによる染色結果、図９（ｂ）はCol2A1、Sox9、β−アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果である。いずれも分化誘導後（Induced）とコントロール（Uninduced）についての結果を示している。これらの解析結果から、作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞においては、脂肪細胞への分化能、骨分化能、軟骨分化能のいずれもが維持されていることがわかった。
【００４９】
血糖値低下作用に関する検討
生後７週の雄のマウスに、ストレプトゾトシンを２５０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内投与し、Ｉ型糖尿病モデル動物を作製した。投与後、５日経過してから、尾静脈より採取した全血の血糖値を小型血糖測定器（アークレイファクトリー社製：商品名グルコカードダイアメータ）で測定した。
【００５０】
マウスを無処置群（control）と処置群に分け、処置群には作製した不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ２を１×１０６個、脾臓内に投与した。その後、２日目に血糖値を測定し、経過観測した。結果を図１０に示す。図１０を見ると明らかなように、処置群、すなわち不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞ｉＨＡＭ２を投与したマウス群において、血糖値の低下が見られた。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】不死化したヒト羊膜由来間葉系細胞及びヒト羊膜由来上皮細胞について、培養日数（経過日数）と分裂回数の関係を示す特性図である。
【図２】ＳＳＥＡ４染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図３】ビメンチン（Vimentin）染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図４】各種細胞のＲＴ−ＰＣＲによる解析結果を示す図である。
【図５】フローサイトメータでの測定による表面抗原の解析結果を示す図であり、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４４に関する解析結果を示すものである。
【図６】フローサイトメータでの測定による表面抗原の解析結果を示す図であり、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４に関する解析結果を示すものである。
【図７】（ａ）はOil Red Oによる染色結果、（ｂ）はＰＰＡＲ２及びβ−アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果である。
【図８】（ａ）はAlizarin Red Sによる染色結果、（ｂ）はAlkaline phosphatese activity (vector red)による染色結果、（ｃ）はＡＬＰ、Osteopontin、β−アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果である。
【図９】（ａ）はToluidine blueによる染色結果、（ｂ）はCol2A1、Sox9、β−アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果である。
【図１０】不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞の投与の有無による血糖値変化の相違を示す特性図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性の不死化遺伝子が導入され、不死化されていることを特徴とするヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項２】
外因性の不死化遺伝子が、テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子、Ｂｍｉ−１遺伝子、ヒトパピローマウイルスのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子を組み合わせたものである請求項１記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項３】
外因性の不死化遺伝子が、ヒトパピローマウイルスのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子である請求項２記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項４】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１０、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６５１として寄託されている請求項３に記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項５】
外因性の不死化遺伝子が、ヒトパピローマウイルスのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子並びにテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子である請求項２記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項６】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１１、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１３、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６５２、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６５４として寄託されている請求項５記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項７】
外因性の不死化遺伝子が、テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子及びＢｍｉ−１遺伝子である請求項２記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項８】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１２、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６５３として寄託されている請求項６に記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項９】
血糖値低下作用を発現することを特徴とする請求項１〜７記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項１０】
外因性の不死化遺伝子が導入され不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞を含有することを特徴とする糖尿病治療薬。
【請求項１】
外因性の不死化遺伝子が導入され、不死化されていることを特徴とするヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項２】
外因性の不死化遺伝子が、テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子、Ｂｍｉ−１遺伝子、ヒトパピローマウイルスのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子を組み合わせたものである請求項１記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項３】
外因性の不死化遺伝子が、ヒトパピローマウイルスのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子である請求項２記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項４】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１０、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６５１として寄託されている請求項３に記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項５】
外因性の不死化遺伝子が、ヒトパピローマウイルスのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子並びにテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子である請求項２記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項６】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１１、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１３、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６５２、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６５４として寄託されている請求項５記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項７】
外因性の不死化遺伝子が、テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子及びＢｍｉ−１遺伝子である請求項２記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項８】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６１２、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６５３として寄託されている請求項６に記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項９】
血糖値低下作用を発現することを特徴とする請求項１〜７記載のヒト羊膜由来間葉系細胞。
【請求項１０】
外因性の不死化遺伝子が導入され不死化されたヒト羊膜由来間葉系細胞を含有することを特徴とする糖尿病治療薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１０−４６０１９（Ｐ２０１０−４６０１９Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１３３０１（Ｐ２００８−２１３３０１）
【出願日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年２月２２日 日本再生医療学会発行の「再生医療 第７巻、増刊号、２００８年」に発表。［刊行物等］ 平成２０年３月１３日〜１４日 日本再生医療学会主催の「第７回日本再生医療学会総会」において口頭発表（スライド使用）。
【出願人】（３０５０６０５６７）国立大学法人富山大学 (194)
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年２月２２日 日本再生医療学会発行の「再生医療 第７巻、増刊号、２００８年」に発表。［刊行物等］ 平成２０年３月１３日〜１４日 日本再生医療学会主催の「第７回日本再生医療学会総会」において口頭発表（スライド使用）。
【出願人】（３０５０６０５６７）国立大学法人富山大学 (194)
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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