本発明は、多能性幹細胞の分化を促進する方法を提供する。より詳細には、本発明は、膵臓内胚葉、膵臓ホルモン発現細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞の形成のための改良された方法を提供する。本発明は、フィーダー細胞層を使用することなく、多能性幹細胞の分化を促進する方法も提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法であって：
ａ．前記多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞をＢ２７で補充された培地を含む合成培地中で培養し、前記多能性幹細胞をアクチビンＡで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、γセクレターゼ阻害剤で処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｂ２７が濃度約１％で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が：
ａ．前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、を含む方法により達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｂ２７が濃度約１％で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％で使用される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｂ２７が濃度約１％で使用される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が：
ａ．前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと共に第一の培地中で培養する工程と、
ｃ．前記多能性幹細胞を、第二の培地中でアクチビンＡと共に培養する工程と、を含む方法により達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性幹細胞が、Ｂ２７、Ｗｎｔリガンド及びアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む合成培地中で培養される、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記多能性幹細胞が、Ｂ２７、Ｗｎｔリガンド及びアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ−ＬＧを含む合成培地中で培養される、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法であって：
ａ．前記多能性幹細胞を、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、
ｂ．前記多能性細胞をアクチビンＡで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
【請求項１４】
前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％で使用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｂ２７が濃度約１％で使用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法であって：
ａ．前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、Ｂ２７で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、を含む、方法。
【請求項１８】
前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％で使用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｂ２７が濃度約１％で使用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記多能性幹細胞が、Ｂ２７、Ｗｎｔリガンド及びアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む合成培地中で培養される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｂ２７が濃度約１％である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記多能性幹細胞が、Ｂ２７、Ｗｎｔリガンド及びアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ−ＬＧを含む合成培地中で培養される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｂ２７が濃度約１％である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記多能性幹細胞が、Ｂ２７及びアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む合成培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｂ２７が濃度約１％である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記多能性幹細胞が、Ｂ２７及びアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む合成培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｂ２７が濃度約０．５％〜約１％である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｂ２７が濃度約１％である、請求項３０に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１−１】

【図４１−２】

【図４１−３】

【図４１−４】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３−１】

【図５３−２】

【図５３−３】

【公表番号】特表２０１０−５３３５００（Ｐ２０１０−５３３５００Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１７１７６（Ｐ２０１０−５１７１７６）
【出願日】平成２０年７月１８日（２００８．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７０４１８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１２４２８
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５９６１５９５００）ライフスキャン・インコーポレイテッド (100)
【氏名又は名称原語表記】Ｌｉｆｅｓｃａｎ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】１０００　Ｇｉｂｒａｌｔａｒ　Ｄｒｉｖｅ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　９５０３５，Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】