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ヒト胚性幹細胞の分化
説明

ヒト胚性幹細胞の分化

本発明は、多能性幹細胞からのインスリン産生細胞への分化を促進させるための方法を提供する。具体的には、本発明は、動物への移植後にインスリンを産生することのできる細胞を産生するための方法を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(関連出願の相互参照)
本発明は、米国特許公開番号第61/226,936号(2009年7月20日出願)に対する優先権を請求する。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、多能性幹細胞からのインスリン産生細胞への分化を促進させるための方法を提供する。具体的には、本発明は、動物への移植後にインスリンを産生することのできる細胞を産生するための方法を提供する。
【背景技術】
【0003】
I型糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。1つの手法は、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することである。
【0004】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにより3つの胚葉(外胚葉、中胚葉、及び内胚葉)を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉(definitive endoderm)の形成である。胚体内胚葉細胞はHNF3 β、GATA4、MIXL1、CXCR4及びSOX17などの多数のマーカーを発現する。
【0005】
膵臓の形成は、胚体内胚葉が膵臓内胚葉へと分化することにより生じる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、PDX1を発現する。PDX1が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成より先に発達が進行しない。したがって、PDX1の発現は、膵臓器官形成において重要な工程として特徴付けられる。成熟した膵臓は、他の細胞型間で外分泌組織及び内分泌組織を含有する。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【0006】
島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、Lumelskyら(Science 292:1389,2001)は、膵島と同様のインスリン分泌構造へのマウスの胚性幹細胞の分化を報告している。Soriaら(Diabetes 49:157,2000)は、ストレプトゾトシン誘発糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が血糖を正常化することを報告している。
【0007】
一例において、Horiら(PNAS 99:16105,2002)は、ホスホイノシチド3−キナーゼ(LY294002)の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。
【0008】
他の例では、Blyszczukら(PNAS 100:998,2003)が、Pax4を構成的に発現しているマウス胚性幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。
【0009】
Micallefらは、レチノイン酸が、胚性幹細胞のPDX1陽性膵臓内胚葉の形成に対する関与を制御できることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に対応する期間中の、胚性幹細胞分化の4日目に培養液に添加すると、Pdx1発現の誘発に最も効果的である(Diabetes 54:301、2005年)。
【0010】
Miyazakiらは、Pdx1を過剰発現しているマウス胚性幹細胞株を報告している。Miyazakiらの研究結果は、外因性のPdx1発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン3、P48、Pax6、及びHNF6遺伝子の発現を明らかに増加させたことを示している(Diabetes 53:1030,2004)。
【0011】
Skoudyらは、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンA(TGFβスーパーファミリーのメンバー)が、膵臓外分泌遺伝子(p48及びアミラーゼ)、並びに内分泌遺伝子(Pdx1、インスリン及びグルカゴン)の発現を上方制御することを報告している。最大の効果は、1nMアクチビンAを使用した場合に認められた。Skoudyらはまた、インスリン及びPdx1 mRNAの発現レベルはレチノイン酸により影響されなかったが、3nMのFGF7による処理によりPdx1の転写レベルが増加したことも観察している(Biochem.J.379:749,2004)。
【0012】
Shirakiらは、PDX1陽性細胞への胚性幹細胞の分化を特異的に増加させる増殖因子の効果を研究した。Shirakiらは、TGF−β2によってPDX1陽性細胞がより高い比率で再現性よく得られたことを観察している(Genes Cells.2005 Jun;10(6):503〜16.)。
【0013】
Gordonらは、血清の非存在下、かつアクチビンとWntシグナル伝達阻害剤の存在下での、マウス胚性幹細胞からの短尾奇形[陽性]/HNF−3 β[陽性]内胚葉細胞への誘導を示した(米国特許第2006/0003446(A1)号)。
【0014】
Gordonら(PNAS,Vol103,p16806,2006)は、「Wnt及びTGF−β/nodal/アクチビンの同時シグナル伝達が前原始線条の形成には必要であった」と述べている。
【0015】
しかしながら、胚性幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒトなどのより高等な哺乳動物における発達プログラムを正確には模倣しない恐れがある。
【0016】
Thomsonらは、ヒト胚盤胞から胚性幹細胞を単離した(Science 282:114,1998)。同時に、Gearhart及び共同研究者は、胎児腺組織から、ヒト胚性生殖細胞(hEG)株を誘導した(Shamblottら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998)。単に白血病抑制因子(LIF)と共に培養すれば分化が阻止され得るマウス胚幹細胞とは異なり、ヒト胚幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある(米国特許第6,200,806号、国際公開第99/20741号;国際公開第01/51616号)。
【0017】
D’Amourらは、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下で、ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている(Nature Biotechnology 2005)。これらの細胞を、マウスの腎臓被膜下に移植することにより、内胚葉性器官の特徴の一部を有するより成熟した細胞への分化が得られた。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、FGF−10の添加後、PDX1陽性細胞に更に分化することができる(米国特許出願公開第2005/0266554(A1)号)。
【0018】
D’Amourら(Nature Biotechnology−24,1392〜1401(2006))は、「我々は、ヒト胚性幹細胞(hES)を、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンといった膵臓ホルモンを合成可能な内分泌細胞へと転換させる分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を介して細胞を指向させることにより、in vivoでの膵臓器官形成を模倣する。」と述べている。
【0019】
別の例において、Fiskらは、ヒト胚性幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している(米国特許出願公開第2006/0040387(A1)号)。この場合、分化経路は3つのステージに分割された。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンAの組み合わせを用いて内胚葉に分化させた。次に細胞をノギンなどのTGFβアンタゴニストとEGF又はベータセルリンの組み合わせと培養してPDX1陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘導した。
【0020】
一例において、Benvenistryらは、「我々は、PDX1の過剰発現が、膵臓に多く見られる遺伝子の発現を上昇させたことを結論付ける。インスリン発現の誘導には、in vivoでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている(Benvenistryら、Stem Cells 2006;24:1923〜1930)。
【0021】
他の例では、Grapin−Bottonらは次のように記載している:「Ngn3を初期活性化させると、ほぼ例外なくグルカゴン+細胞を誘導し、膵臓前駆細胞プールを消費した。E11.5からPDX−1前駆細胞はコンピテントになり、インスリン[陽性]でPP[陽性]の細胞へと分化した」(Johansson KAら、Developmental Cell 12,457〜465,March 2007)。
【0022】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞でNGN3が発現すると、インスリンを発現する細胞へと更に分化するための細胞能力が低下する恐れがある。これまでの研究により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞のうち、NGN3を発現している細胞は、更なる分化を受けた際に、インスリンを発現している細胞よりも、グルカゴンを発現している細胞を産生しやすいということが示されている。しかしながら、NGN3発現は、膵内分泌細胞又は膵内分泌前駆細胞(例えばグルカゴン又はインスリンを発現している細胞を形成することのできる細胞)の形成に必要とされる。したがって、膵内分泌前駆細胞の最終的な運命をインスリンを発現している細胞へと誘導するにあたり、NGN3の一時的な制御が重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0023】
したがって、インスリンを発現している細胞へと分化する可能性を維持する一方で、現在の臨床上のニーズに対処するよう拡張できる、多能性幹細胞株を確立するための条件を開発する有意な必要性が今尚存在する。本発明は、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を生成することにより、ヒト胚性幹細胞からの、インスリンを発現している細胞への分化効率を改善させるという代替アプローチを用いた。本発明の方法は、膵臓内胚葉からの膵内分泌前駆細胞への分化が開始するまで、NGN3発現を最小限に維持する。
【課題を解決するための手段】
【0024】
一実施形態では、本発明は、PDX1とNKX6.1を共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を提供する。一実施形態では、細胞集団は、動物への移植後にCペプチドを産生する能力を有する。
【0025】
一実施形態では、本発明は、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと、多能性幹細胞集団を分化させる方法を提供し、この方法は以下の工程a、b及びcを包含する:
a.多能性幹細胞を培養する工程、
b.多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程、及び
c.胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、FGF7を添加した第1培地で処理し、次いで細胞を、FGF7、BMP阻害能を持つ因子、TGF−β受容体アゴニスト、レチノイン酸、及びヘッジホッグ(hedgehog)シグナル経路阻害剤を添加した第2培地で培養することにより、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】実施例1に記載の方法に従って処理した、ステージ3の4日目の細胞のNKX6.1、NGN3、PDX1、PTF1 α及びARX発現に対する、アクチビンAの効果を示す。リアルタイムPCR解析用に二つ組サンプルを回収した。プロットは、各遺伝子についての誘導倍率(fold induction)を、対照群と比較して表わす(薄い灰色のバー)。濃い灰色のバーは、FGF7、シクロパミン−KAAD、レチノイン酸、20ng/mLアクチビンA及びノギンで処理した細胞を表す。黒色のバーは、FGF7、シクロパミン−KAAD、レチノイン酸、50ng/mLアクチビンA及びノギンで処理した細胞を表す。
【図2】FGF7+ノギン+レチノイン酸+KAAD−シクロパミンで処理した細胞(パネルa及びb)、又はFGF7+ノギン+レチノイン酸+KAAD−シクロパミン+20ng/mLのアクチビンAで処理した細胞(パネルc及びd)、及びFGF7+ノギン+レチノイン酸+KAAD−シクロパミン+Alk5阻害剤IIで処理した細胞のNKX6.1(パネルa、c及びe)及びNGN3(パネルb、d及びf)の発現を示す、免疫蛍光顕微鏡画像を示す。
【図3】1%のB27+FGF7+ノギン+レチノイン酸+KAAD−シクロパミン+20ng/mLのアクチビンAを添加したDMEM(高グルコース)で処理した細胞(パネルa及びb)、及び1%のB27+FGF7+ノギン+レチノイン酸+KAAD−シクロパミン+20ng/mLのアクチビンAを添加したDMEM/F12(パネルc及びd)で処理した細胞の、PDX1(パネルa及びc)及びCDX2(パネルb及びd)の発現を示す、免疫蛍光顕微鏡画像を示す。
【図4】実施例1に記載の方法に従って処理した、ステージ3の4日目の細胞のNKX6.1、NGN3及びPDX1発現に対する、アクチビンA、アクチビンB、TGFβ2、GDF11及びGDF8の効果を示す。リアルタイムPCR解析用に二つ組サンプルを回収した。プロットは、各遺伝子の誘導倍率を、FGF7+シクロパミン−KAAD+レチノイン酸+ノギンで処理した群と比較して表す。
【図5】実施例2に記載の方法に従って処理した、ステージ4の3日目の細胞のNGN3、NEUROD、NKX2.2及びPAX6(パネルa)、並びにNKX6.1、PDX1及びPTF1α(パネルb)発現に対する、ノギン及びAlk5阻害剤II処理の効果を示す。リアルタイムPCR解析用に二つ組サンプルを回収した。プロットは、各遺伝子の誘導倍率を、基本培地(DMEM(高グルコース)+1% B27)のみで処理した群(薄い灰色のバー)と比較して表す。濃い灰色のバーは、ノギン及びAlk5阻害剤IIで処理した細胞を表す。
【図6】実施例2に記載のように、FGF7+ノギン+レチノイン酸+KAAD−シクロパミン+アクチビンAで4日、次いでノギン及びAlk5阻害剤IIで3日処理した細胞の、免疫蛍光顕微鏡画像を示す。パネルaは、NKX6.1及びNGN3の発現、並びにNKX6.1及びNGN3の発現のオーバーレイを示す。パネルbは、PDX1及びNGN3の発現、並びにPDX1及びNGN3の発現のオーバーレイを示す。
【図7】実施例3に記載の処理プロトコルの、ステージ4の3日目の細胞(薄い灰色のバー)、又はステージ5の3日目の細胞(濃い灰色のバー)、又はステージ5の7日目の細胞(黒色のバー)の、NGN3、PAX4、PDX1、NKX6.1、NEUROD、インスリン及びグルカゴンの発現を示す。リアルタイムPCR解析用に二つ組サンプルを回収した。プロットは、各遺伝子の誘導倍率を、ステージ4の1日目で検出された発現と比較して表わす。
【図8】実施例3に記載の処理プロトコルの、ステージ5の7日目の細胞でのインスリン、グルカゴン及びNKX6.1の発現を示す、免疫蛍光顕微鏡画像を示す。インスリン及びグルカゴンの発現のオーバーレイ、並びにインスリン及びNKX6.1の発現のオーバーレイも示す。
【図9】腎臓皮膜下に本発明の細胞を移植した、STZ誘導型糖尿病モデルSCID−beigeマウスで循環している、ヒトCペプチド(パネルa)及び非空腹時血糖値(パネルb)を示す。Cペプチドレベル及び血糖値は記載の時点で検出した。
【発明を実施するための形態】
【0027】
開示を明確にするために、本発明の「発明を実施するための形態」を、限定を目的とすることなく、本発明の特定の特徴、実施形態又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。
【0028】
定義
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞としては、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が挙げられる。幹細胞はまた、in vitroで複数の胚葉(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしてもほとんどの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【0029】
幹細胞は、発生上の能力によって、(1)全ての胚性及び胚体外細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化全能性、(2)全ての胚性細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化万能性、(3)細胞系のサブセットを生ずる能力を有するが、それらが全て特定の組織、臓器、又は生理学的システムのものであるような、分化多能性(例えば、造血幹細胞(HSC)は、HSC(自己再生性)、血球限定的寡能性前駆細胞、及び血液の通常の成分である全ての細胞種及び要素(例えば、血小板)を生じ得る)、(4)多能性幹細胞よりも限定された細胞系のサブセットを生ずる能力を有することを意味する、分化寡能性、及び(5)単一の細胞系(例えば、精原幹細胞)を生ずる能力を有することを意味する、分化単能性に分類される。
【0030】
分化は、特殊化していない(「中立の」)又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化を誘導された細胞は、細胞系内でより特殊化した(「傾倒した」)状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて(又は傾倒して)いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用することができる。
【0031】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」、又は「ステージ1細胞」、又は「ステージ1」とは、以下のマーカー、すなわち、SOX17、GATA4、HNF−3 β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix様ホメオボックスタンパク質、FGF4 CD48、eomesodermin(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C−Kit、CD99又はOTX2のうちの少なくとも1つを発現している細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。
【0032】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、PDX1、HNF1 β、PTF1 α、HNF6、NKX6.1、又はHB9のうちの少なくとも1つを発現している細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。
【0033】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー:HNF3 β、GATA4、SOX17、ケルベロス、OTX2、グースコイド、C−Kit、CD99、及びMIXL1を発現する。
【0034】
本明細書で使用するとき、「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーの発現レベルの上昇、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【0035】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを発現することが可能な細胞を指す。
【0036】
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原(SSEA)3及び4、並びにTra−1−60及びTra−1−81と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの1つ以上を発現している(Thomsonら、Science 282:1145,1998)。in vitroで多能性幹細胞を分化させると、SSEA−4、Tra−1−60、及びTra−1−81の発現が減少し(存在する場合)、SSEA−1の発現が上昇する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者(Vector Laboratories(Burlingame Calif.))によって記載されるようにVectorRedを基質として現像することによって検出することができる。未分化の多能性幹細胞はまた、RT−PCRにより検出されるように、一般にOCT4及びTERTも発現する。
【0037】
別の望ましい表現型の、増殖させた多能性幹細胞は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の3胚葉の全ての細胞に分化し得る。多能性幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症(SCID)マウスに注入し、形成される奇形腫を4%パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを3つの胚細胞層由来の細胞種の根拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成させ、この胚様体を3つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【0038】
増殖した多能性幹細胞株は、標準的なGバンド法を使用して核型を決定することができ、確立された対応する霊長類種の核型と比較される。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、「正常な核型」とは細胞が正倍数体であり、全ヒト染色体が存在し、かつ著しく変更されてはいないことを意味する。
【0039】
多能性幹細胞源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期(必ずしもではないが、通常は妊娠約10〜12週よりも前)に採取した前胚性組織(例えば胚盤胞など)、胚性組織、胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株化細胞系が挙げられる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株H1、H7、及びH9(WiCell)などのヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、供給源となる細胞は、供給源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、BG01v(BresaGen、Athens、GA)などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。
【0040】
一実施形態では、ヒト胚性幹細胞はThomsonらにより説明されているように調製される(米国特許第5,843,780号;Science 282:1145,1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133 ff.,1998;Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:7844,1995)。
【0041】
多能性幹細胞の培養
一実施形態では、多能性幹細胞は、典型的にはフィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を本質的に含まないにも関わらず、細胞を実質的に分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持するような培養システム中で培養する。フィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の、分化を伴わない増殖は、あらかじめ他の細胞種を培養することにより馴化培地を使用して支持される。あるいはフィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の分化を伴わない増殖は、合成培地を使用して支持される。
【0042】
例えば、Reubinoffら(Nature Biotechnology 18:399〜404(2000))及びThompsonら(Science 6 November 1998:Vol.282.no.5391,pp.1145〜1147)は、マウス胚線維芽細胞層(フィーダー細胞層)を用いる、ヒト線維芽細胞由来多能性幹細胞株の培養法を開示している。
【0043】
Richardsら(Stem Cells 21:546〜556,2003)は、11種類の異なるヒト成人、胎児、及び新生児フィーダー細胞層についてヒト多能性幹細胞の培養を支持する能力の評価を行っている。Richardsらは、「成人の皮膚線維芽フィーダー細胞上で培養したヒト胚性幹細胞系は、ヒト胚性幹細胞の形態を有し、多能性を維持する」と述べている。
【0044】
米国特許出願公開第20020072117号は、フィーダー不含細胞培養中に霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞系を開示している。使用される細胞系は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ線維芽細胞様の細胞系である。米国特許出願公開第20020072117号はまた、この細胞系の1次フィーダー細胞層としての使用を開示している。
【0045】
別の例として、Wangら(Stem Cells 23:1221〜1227,2005)は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上でヒト多能性幹細胞を長期にわたって増殖させるための方法を開示している。
【0046】
別の例として、Stojkovicら(Stem Cells 2005 23:306〜314,2005)は、ヒト胚性幹細胞の自然分化により誘導されたフィーダー細胞システムを開示している。
【0047】
更なる別の例として、Miyamotoら(Stem Cells 22:433〜440,2004)は、ヒトの胎盤から得られたフィーダー細胞の供給源を開示している。
【0048】
Amitら(Biol.Reprod 68:2150〜2156、2003年)は、ヒト包皮に由来するフィーダー細胞層を開示している。
【0049】
別の例として、Inzunzaら(Stem Cells 23:544〜549,2005)は、ヒトの出生直後産児の包皮線維芽細胞から得られたフィーダー細胞層を開示している。
【0050】
米国特許第6642048号は、フィーダー不含細胞培養中での霊長類の多能性幹(pPS)細胞の増殖を支持する培地、及びこうした培地の製造に有用な細胞系を開示している。米国特許第6642048号は、「本発明は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ線維芽細胞様の細胞系を含む。本開示では、こうした細胞系を誘導し、培地を調整し、この馴化培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を説明及び図示する」と述べている。
【0051】
別の例として、国際公開第2005014799号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための馴化培地を開示している。国際公開特許第2005014799号は、「本発明に基づいて製造される培地は、マウス細胞、特にMMH(Metマウス肝細胞)と称される分化及び不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって馴化される」と述べている。
【0052】
別の例として、Xuら(Stem Cells 22:972〜980,2004)は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細胞から得られた馴化培地を開示している。
【0053】
別の例において、米国特許出願公開第20070010011号は、多能性幹細胞を維持するための合成培地を開示している。
【0054】
代替的な培養システムでは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を添加した無血清培地を使用している。例えば、Cheonら(BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870,October 19,2005)は、胚性幹細胞の自己再生を誘導することが可能な異なる増殖因子を添加した非馴化血清補充(SR)培地中に胚性幹細胞が維持された、フィーダー細胞不含でかつ無血清の培養システムを開示している。
【0055】
別の例において、Levensteinら(Stem Cells 24:568〜574,2006)は、線維芽細胞又は馴化培地の非存在下で、bFGFを添加した培地を使用して、胚幹細胞を長期間培養する方法を開示している。
【0056】
別の例において、米国特許出願公開第20050148070号は、無血清でかつ線維芽細胞フィーダー細胞不含の合成培地でのヒト胚幹細胞の培養方法を開示する。この方法は、幹細胞を、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、無機物、少なくとも1つのトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、少なくとも1つのインスリン又はインスリン代替物を含有し、哺乳動物胎児血清は本質的に不含であり、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化できる少なくとも約100ng/mLの線維芽細胞増殖因子を含有している培地中で培養することを含み、この方法において、増殖因子は線維芽細胞フィーダー層のみだけでなく他の供給源からも供給され、培地は、フィーダー細胞又は馴化培地を用いられずとも、未分化状態の幹細胞の増殖を支持した。
【0057】
別の例において、米国特許出願公開第20050233446号は、未分化の霊長類始原幹細胞などの幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液において、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。所定の培養において、特定の培地は、基本培地と、実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な、ある量のbFGF、インスリン、及びアスコルビン酸の各々とを含有する。
【0058】
別の例として、米国特許第6800480号は、「一実施形態では、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持する上で効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基本培地を含む細胞培地を提供する。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持する上で効果的な栄養素血清、並びにフィーダー細胞及びフィーダー細胞から誘導される細胞外支持体成分からなる群から選択される支持体と組み合わされる。培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びにヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第1の増殖因子を含む。」と述べている。
【0059】
別の例では、米国特許出願公開第20050244962号は、「一態様では、本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する」と記述している。1つの方法は、哺乳動物の胎児血清を本質的に含まない(好ましくはあらゆる動物の血清をも本質的に含まない)培地中で、線維芽フィーダー細胞層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で、幹細胞を培養する。好ましい形態では、十分な量の線維芽増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた線維芽フィーダー細胞層の必要性がなくなる。
【0060】
更なる例として、国際特許出願公開第2005065354号は、本質的にフィーダー不含細胞でかつ無血清の合成等張培地であって、a.基本培地、b.実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持する上で十分な量のbFGF、c.実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持する上で十分な量のインスリン、及びd.実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持する上で十分な量のアスコルビン酸、を含む培地を開示している。
【0061】
別の例として、国際公開第2005086845号は、幹細胞を、細胞を未分化な状態に維持するのに十分な量の、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)ファミリータンパク質のメンバー、線維芽細胞増殖因子(FGF)ファミリータンパク質のメンバー、又はニコチンアミド(NIC)に、所望の結果を得るのに十分な時間曝露することを含む、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示している。
【0062】
多能性幹細胞は、好適な培養基材上に播くことができる。一実施形態では、好適な培養基材は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るものなどの細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、好適な培養培地は、MATRIGEL(登録商標)(Becton Dickenson)である。MATRIGEL(登録商標)は、Engelbreth−Holm Swarm腫瘍細胞由来の可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【0063】
他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、代替基材はラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【0064】
多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下で、基材上に好適に分布させることで播いてもよい。これら全ての特徴は、播種分布に細心の注意を払うことから効果が得られ、かつこれら全ての特徴は当業者により容易に決定することができる。
【0065】
好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、Gibco # 11965−092;ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地(KO DMEM)、Gibco #10829−018;ハムF12/50% DMEM基本培地、200mM L−グルタミン、Gibco # 15039−027;非不可欠アミノ酸溶液、Gibco 11140−050;β−メルカプトエタノール、Sigma# 7522;ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、Gibco # 13256−029などから調製することができる。
【0066】
多能性幹細胞からの、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を産生するための方法を提供し、この方法は以下の工程a、b及びcを包含する:
a.多能性幹細胞を培養する工程、
b.多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程、及び
c.胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程。
【0067】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX−2及びNGN3は発現しない。
【0068】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞への多能性幹細胞の分化
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性幹細胞は、一般にこのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
【0069】
多能性幹細胞は、当該技術分野のいかなる方法、又は本発明で提案されるいかなる方法によって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させてもよい。
【0070】
例えば、多能性幹細胞は、D’Amourら、Nature Biotechnology 23,1534〜1541(2005)に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【0071】
例えば、多能性幹細胞は、Shinozakiら、Development 131,1651〜1662(2004)により開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【0072】
例えば、多能性幹細胞は、McLeanら、Stem Cells 25,29〜38(2007)により開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【0073】
例えば、多能性幹細胞は、D’Amourら、Nature Biotechnology 24,1392〜1401(2006)に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【0074】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンAを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンA及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンA及び異なる濃度の血清と培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。この方法の一例は、Nature Biotechnology 23,1534〜1541(2005)に開示されている。
【0075】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンAを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンAと、別の濃度の血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。この方法の例は、D Amourら、Nature Biotechnology(2005)に開示されている。
【0076】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンA及びWntリガンドを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでWntリガンドを除去し、細胞をアクチビンAと、血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。この方法の例は、Nature Biotechnology 24,1392〜1401(2006)に開示されている。
【0077】
例えば、多能性幹細胞は、LifeScan,Inc.に譲渡された米国特許出願第11/736,908号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【0078】
例えば、多能性幹細胞は、LifeScan,Inc.に譲渡された米国特許出願第11/779,311号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【0079】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第60/990,529号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【0080】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第61/076,889号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【0081】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第61/076,900号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【0082】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第61/076,908号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【0083】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第61/076,915号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【0084】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞への、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の分化
一実施形態では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、FGF7を添加した第1培地で培養し、次いで細胞を、FGF7、BMP阻害能を持つ因子、TGFβ受容体アゴニスト、レチノイン酸、及びヘッジホッグ(hedgehog)シグナル経路阻害剤を添加した第2培地で培養することにより、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる。
【0085】
一実施形態では、FGF−7は、約50pg/mL〜約50μg/mLの濃度で使用することができる。一実施形態では、FGF−7は、50μg/mLの濃度で使用することができる。
【0086】
一実施形態では、BMP阻害能を持つ因子はノギンである。ノギンは、約500ng/mL〜約500μg/mLの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは100ng/mLの濃度で使用される。
【0087】
一実施形態では、TGFβ受容体アゴニストは、アクチビンA、アクチビンB、TGFβ−I、TGFβ−II、GDF−8及びGDF−11からなる群から選択される。
【0088】
アクチビンAは、約2ng/mL〜100ng/mLの濃度で使用することができる。一実施形態では、アクチビンAは20ng/mLの濃度で使用される。別の実施形態では、アクチビンAは50ng/mLの濃度で使用される。
【0089】
アクチビンBは、約2ng/mL〜100ng/mLの濃度で使用することができる。一実施形態では、アクチビンBは20ng/mLの濃度で使用される。別の実施形態では、アクチビンBは50ng/mLの濃度で使用される。
【0090】
TGFβ−Iは、約2ng/mL〜100ng/mLの濃度で使用することができる。一実施形態では、TGFβ−Iは20ng/mLの濃度で使用される。別の実施形態では、TGFβ−Iは50ng/mLの濃度で使用される。
【0091】
TGFβ−IIは、約2ng/mL〜100μg/nLの濃度で使用することができる。一実施形態では、TGFβ−IIは20ng/mLの濃度で使用される。別の実施形態では、TGFβ−IIは50ng/mLの濃度で使用される。
【0092】
GDF−8は、約2ng/mL〜100ng/mLの濃度で使用することができる。一実施形態では、GDF−8は20ng/mLの濃度で使用される。別の実施形態では、GDF−8は50ng/mLの濃度で使用される。
【0093】
GDF−11は、約2ng/mL〜100ng/mLの濃度で使用することができる。一実施形態では、GDF−11は20ng/mLの濃度で使用される。別の実施形態では、GDF−11は50ng/mLの濃度で使用される。
【0094】
レチノイン酸は、約1nM〜約1mMの濃度で使用することができる。一実施形態では、レチノイン酸は1μMの濃度で使用される。
【0095】
一実施形態では、ヘッジホッグ(hedgehog)シグナル経路阻害剤はシクロパミン−KAADである。シクロパミン−KAADは約0.025μM〜約2.5μMの濃度で使用することができる。一実施形態では、シクロパミン−KAADは0.25μMの濃度で使用される。
【0096】
分化効率は、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤(抗体など)に曝露することにより測定することができる。
【0097】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。こうした方法には、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーション(例えば、「Current Protocols in Molecular Biology」Ausubelら編、2001年度版補遺、を参照)、並びに材料切片の免疫組織化学的分析、ウエスタンブロット、及び無傷細胞中のアクセシブルなマーカーに対する免疫アッセイ、フローサイトメトリー分析(FACS)などの免疫アッセイが含まれる(例えば、Harlow and Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998)を参照)。
【0098】
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。例えば多能性幹細胞マーカーとしては、以下のもののうちの一つ以上の発現が含まれる:ABCG2、CRIPTO、FOXD3、コネキシン43、コネキシン45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA−3、SSEA−4、Tra 1−60、又はTra 1−81。
【0099】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現される、例えばCXCR4などのタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤(抗体など)に曝露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【0100】
本発明での使用に好適な多能性幹細胞としては、例えばヒト胚性幹細胞株H9(NIH code:WA09)、ヒト胚性幹細胞株H1(NIH code:WA01)、ヒト胚性幹細胞株H7(NIH code:WA07)、及びヒト胚性幹細胞株SA002(Cellartis,Sweden)が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマ−カー、すなわち、ABCG2、CRIPTO、CD9、FOXD3、コネキシン43、コネキシン45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF−1、ZFP42、SSEA−3、SSEA−4、Tra 1−60及びTra 1−81のうちの少なくとも1つを発現する細胞も本発明での使用に適している。
【0101】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、SOX17、GATA4、HNF3 β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、短尾奇形、Mix−様ホメオボックスタンパク質、FGF4 CD48、エオメソダーミン(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C−Kit、CD99、及びOTX2からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも1つを発現している細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【0102】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、PDX1、HNF1 β、PTF1 α、HNF6、HB9及びPROX1からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、膵臓内胚葉系の特徴を示す少なくとも1つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【0103】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
一実施形態では、本発明の方法により産生される、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化し得る。
【0104】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化し得る。
【0105】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン4を含有している培地で培養し、次にエキセンディン4を含有している培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン1、IGF−1及びHGFを含有している培地で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、D’Amourら、Nature Biotechnology,2006に開示されている。
【0106】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、DAPT(Sigma−Aldrich,MO)及びエキセンディン4を含有している培地で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、D’Amourら、Nature Biotechnology,2006に開示されている。
【0107】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン4を含有している培地で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、D’Amourら、Nature Biotechnology,2006に開示されている。
【0108】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第11/736,908号(LifeScan,Inc.に譲渡)に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【0109】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第11/779,311号(LifeScan,Inc.に譲渡)に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【0110】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第60/953,178号(LifeScan,Inc.に譲渡)に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【0111】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第60/990,529号(LifeScan,Inc.に譲渡)に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【0112】
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、NGN3、及びPTF−1 αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも1つを発現することができる。本発明で使用するのに好適なものは、膵内分泌系に特徴的なマーカーを少なくとも1つ発現している細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってよい。
【0113】
本発明の一態様では、膵内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、PDX1と、以下の転写因子、すなわち、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF3 β、MAFA、PAX4、及びPAX6のうちの少なくとも1つを発現している。本発明の一態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【0114】
治療
一態様では、本発明は、I型糖尿病に罹患しているかあるいはI型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、多能性幹細胞を培養することと、多能性幹細胞をin vitroでβ細胞系に分化させることと、β細胞系の細胞を患者に移植することと、を包含する。別の実施形態では、本方法は、多能性幹細胞を培養することと、多能性幹細胞を、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へとin vitroで分化させることと、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない膵臓内胚葉系細胞を患者に移植することと、を包含する。
【0115】
更に別の態様では、本発明は、II型糖尿病に罹患しているかあるいはII型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、多能性幹細胞を培養することと、多能性幹細胞をin vitroでβ細胞系に分化させることと、β細胞系の細胞を患者に移植することと、を包含する。別の実施形態では、本方法は、多能性幹細胞を培養することと、多能性幹細胞を、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へとin vitroで分化させることと、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない膵臓内胚葉系細胞を患者に移植することと、を包含する。
【0116】
適切であるならば、移植した細胞の生存及び機能を亢進する医薬品又は生理活性物質で患者を更に処置してもよい。それらの薬剤は、例えば特に、インスリン、TGF−β1、2、及び3を含むTGF−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質(BMP−2、−3、−4、−5、−6、−7、−11、−12、及び−13)、線維芽細胞増殖因子−1及び−2、血小板由来増殖因子−AA及び−BB、多血小板血漿、インスリン増殖因子(IGF−I、II)、増殖分化因子(GDF−5、−6、−7、−8、−10、−15)、血管内皮由来増殖因子(VEGF)、プレイオトロフィン、エンドセリンを含んでもよい。他の医薬化合物としては例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−I(GLP−1)及びII、GLP−1及び2模倣体(mimetibody)、エキセンディン−4、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、例えば米国特許出願公開第2004/0209901号及び同第2004/0132729号に開示される化合物のようなMAPK阻害剤などが挙げられる。
【0117】
多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にインスリン産生細胞へと分化させてもよい。具体的な実施形態では、多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にβ細胞へと完全に分化させる。あるいは多能性幹細胞は、未分化又は一部が分化した状態でレシピエントに移植してもよい。更なる分化はレシピエント内で行われ得る。
【0118】
胚体内胚葉細胞、又は代替的には膵臓内胚葉細胞、又は代替的にはβ細胞を、分散した細胞として移植してもよく、又は肝門静脈内に注入され得るクラスターとして編成してもよい。あるいは細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の適切な部位内に移植されてもよい。移植部位としては、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。
【0119】
移植された細胞の更なる分化、生存又は活性を向上するために、増殖因子、抗酸化剤又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前に、投与と同時に、又は投与後に投与してもよい。所定の実施形態において、増殖因子は、in vivoで、投与された細胞を分化させるよう使用される。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にin situで曝露されてもよい。移植された細胞には、当該技術分野で既知の内因性の及び外因性の増殖因子の任意の組み合わせにより、分化を誘導することもできる。
【0120】
移植に使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、多数の様々な要因に基づいて当業者により決定され得る。
【0121】
一態様では、本発明は糖尿病に罹患しているかあるいは糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をin vitroでβ細胞系に分化させ、この細胞を3次元支持体に埋め込むことを含む。細胞は、患者に移植する前に、in vitroでこの支持体上に維持してもよい。あるいは細胞を含む支持体を、in vitroで更に培養することなく直接患者に移植してもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を亢進する少なくとも1つの医薬品を組み込んでもよい。
【0122】
本発明の目的のために使用するのに好適な支持体材料には、組織修復に有用な組織鋳型、導管、バリア及びリザーバが挙げられる。より詳細には、発泡体、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、及び不織構造の形態を有する合成及び天然材料であって、in vitro及びin vivoで使用されて、生物組織を再構築又は再生し、また走化性薬剤を送達して組織増殖を誘発する材料が、本発明の方法の実施における使用に適切である。例えば、米国特許第5,770,417号、同第6,022,743号、同第5,567,612号、同第5,759,830号、同第6,626,950号、同第6,534,084号、同第6,306,424号、同第6,365,149号、同第6,599,323号、同第6,656,488号、米国特許出願公開第2004/0062753 A1号、米国特許第4,557,264号及び同第6,333,029号に開示されている材料を参照されたい。
【0123】
医薬品が組み込まれた支持体を形成するために、支持体を形成するのに先立ち、薬剤をポリマー溶液と混合することもできる。あるいは加工された支持体上に、医薬品を好ましくは医薬担体の存在下で被覆してもよい。医薬品は、液体、超微粒子状固体、又は任意の他の適切な物理的形態として存在し得る。あるいは医薬品の放出速度を変更するために、支持体に賦形剤を加えてもよい。別の実施形態では、抗炎症性化合物である少なくとも1種の医薬化合物(例えば米国特許第6,509,369号に開示される化合物)を支持体に組み込む。
【0124】
支持体には、抗アポトーシス化合物である少なくとも1種の医薬化合物、例えば米国特許第6,793,945号に開示されている化合物を組み込んでもよい。
【0125】
支持体には、線維症阻害剤である少なくとも1種の医薬化合物、例えば米国特許第6,331,298号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【0126】
支持体には、血管新生を促進させることができる少なくとも1種の医薬化合物、例えば米国特許出願公開第2004/0220393号及び同第2004/0209901号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【0127】
支持体には、免疫抑制化合物である少なくとも1種の医薬化合物、例えば、米国特許出願公開第2004/0171623号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【0128】
例えば支持体には、特に、TGF−β1、2、及び3を含むTGF−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質(BMP−2、−3、−4、−5、−6、−7、−11、−12、及び−13)、線維芽細胞増殖因子−1及び−2、血小板由来増殖因子−AA及び−BB、多血小板血漿、インスリン増殖因子(IGF−I、II)、増殖分化因子(GDF−5、−6、−8、−10、−15)、血管内皮増殖因子(VEGF)、プレイオトロフィン、エンドセリンなどの増殖因子である、少なくとも1種の医薬化合物も組み込まれ得る。他の医薬化合物としては、例えばニコチンアミド、低酸素誘導因子1−α、グルカゴン様ペプチド−I(GLP−I)、GLP−1及びGLP−2疑似体、並びにII、エキセンディン4、nodal、ノギン、NGF、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン−C、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、デフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチンなどの接着性細胞外マトリックスタンパク質の細胞−及びヘパリン−結合ドメインを含む生物ペプチド、例えば米国特許出願公開第2004/0209901号及び同第2004/0132729号に開示されている化合物などのMAPK阻害剤を挙げることができる。
【0129】
スキャフォールド内への本発明の細胞の組み込みは、細胞をスキャフォールド上に単に沈着させることにより達成できる。細胞は、単純拡散によりスキャフォールドに入り込ませることができる(J.Pediatr.Surg.23(1 Pt 2):3〜9(1988))。細胞播種の効率を向上させるために、いくつかの他の手法が開発されている。例えば、軟骨細胞をポリグリコール酸スキャフォールド上に播種する際に、スピナーフラスコが使用されている(Biotechnol.Prog.14(2):193〜202(1998))。細胞播種のための他の手法は遠心法の使用であり、これは播種する細胞に与えるストレスを最小にし、かつ播種効率を高める。例えば、Yangらは、遠心分離細胞固定法(Centrifugational Cell Immobilization;CCI)と呼ばれる細胞播種方法を開発した(J.Biomed.Mater.Res.55(3):379〜86(2001))。
【0130】
以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【0131】
(実施例1)
PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へのヒト多能性幹細胞の分化
本実施例は、アクチビンAをノギン及びレチノイン酸と組み合わせて使用することで、NKX6.1発現の上方制御を促進できることを示す。簡潔に述べると、ヒト胚性幹細胞株H1細胞を、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)をコートしたディッシュと、2%のBSA、100ng/mLのアクチビンA、20ng/mLのWNT−3a、8ng/mLのbFGFを添加したRPMI培地により1日培養した後で、2%のBSA、100ng/mLのアクチビンA、8ng/mLのbFGFを添加したRPMI培地で更に2日間処理し(ステージ1)、次いで
a.2%のBSA及び50ng/mLのFGF7を添加したDMEM/F12で3日間にわたって培養し(ステージ2)、次いで
b.1%のB27、50ng/mLのFGF7、0.25μMのシクロパミン−KAAD、2μMのレチノイン酸(RA)、100ng/mLのノギン、及び20ng/mLのアクチビンA若しくは50ng/mLのアクチビンAを添加したDMEM(高グルコース)で4日間にわたって培養した(ステージ3)。
【0132】
対照として、別の細胞集団を1%のB27、50ng/mLのFGF7、0.25μMのシクロパミン−KAAD、2μMのレチノイン酸(RA)及び100ng/mLのノギンを添加したDMEM(高グルコース)で処理した。
【0133】
ステージ3の4日目に培養物から2つ組でサンプルを調製し、リアルタイムPCRを用いて膵臓マーカーの発現について解析した。
【0134】
図1に示すように、アクチビンAで処理しなかった細胞から得られたサンプルと比較し、NKX6.1発現はステージ3の4日目で劇的に上昇した。アクチビンAにより介在される、NKX6.1の発現上昇は、アクチビンA投与に比例して増加した。ステージ3の4日目の細胞ではNGN3発現の下方制御も観察された。TGF−β経路が、PDX1及びNKX−6.1を共発現している膵臓内胚葉細胞の形成を促進させるよう関与するのか否かを判定するために、細胞を以下のように処理した:
ヒト胚性幹細胞株H1細胞を、MATRIGEL(1:30希釈)をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用して膵内分泌前駆細胞へと分化させた:
a.2%のBSA(カタログ# 152401,MP Biomedical,Ohio)、100ng/mLのアクチビンA(R&D Systems,MN)、20ng/mLのWNT−3a(カタログ# 1324−WN−002,R&D Systems,MN)及び8ng/mLのbFGF(カタログ# 100−18B,PeproTech,NJ)を添加したRPMI培地(カタログ#22400,Invitrogen,Ca)で1日培養した後に、2%のBSA、100ng/mLのアクチビンA、8ng/mLのbFGFを添加したRPMI培地で更に2日間にわたって処理し(ステージ1)、次いで
b.2%のBSA及び50ng/mLのFGF7を添加したDMEM/F12(カタログ#11330,Invitrogen,Ca)で3日間にわたって培養し(ステージ2)、次いで
c.処理1:1%のB27(Invitrogen,CA)、50ng/mLのFGF7、0.25μMのシクロパミン−KAAD、2μMのレチノイン酸(RA)及び100ng/mLのノギンを添加したDMEM(高グルコース)で4日間にわたって処理するか(ステージ3)、又は
d.処理2:1%のB27(Invitrogen,CA)、50ng/mLのFGF7、0.25μMのシクロパミン−KAAD、2μMのレチノイン酸(RA)、100ng/mLのノギン及び20ng/mLのアクチビンAを添加したDMEM(高グルコース)で4日間にわたって処理するか(ステージ3)、又は
e.処理3:1%のB27(Invitrogen,CA)、50ng/mLのFGF7、0.25μMのシクロパミン−KAAD、2μMのレチノイン酸(RA)、100ng/mLのノギン及び1μMのALK5阻害剤IIを添加したDMEM(高グルコース)で4日間にわたって処理した(ステージ3)。
【0135】
ステージ3の4日目に培養物から2つ組でサンプルを調製し、リアルタイムPCRを用いて膵臓マーカーの発現について解析した。並行して免疫蛍光解析を行うために、培養物を固定した。
【0136】
表1は、この実験の最小条件(処理1)について標準化した場合の、ステージ3の4日目のNKX6.1、NGN3及びPDX1の相対発現量を示す。
【0137】
【表1】

【0138】
処理1(FGF7、レチノイン酸及びノギン)は、NKX6.1及びNGN3の発現を誘導した。図2のパネルa及びbを参照されたい。しかしながら、アクチビンAを添加すると(処理2)、NGN3の発現はブロックされ、NKX6.1を発現している細胞の数が有意に増加した。図2のパネルc及びdを参照されたい。これらのデータは、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団形成時に、TGFβ受容体経路を活性化すると、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは発現しているがNGN3は発現しない細胞集団が生じることを示す。
【0139】
細胞を、TGFβ受容体阻害剤であるAlk5阻害剤IIと共にインキュベートすることで、この仮説を確認した(処理3を参照のこと)。1%のB27(Invitrogen,CA)、50ng/mLのFGF7、0.25μMのシクロパミン−KAAD、2μMのレチノイン酸(RA)、100ng/mLのノギン及び1μMのALK5阻害剤IIを添加したDMEM(高グルコース)により細胞を処理すると、NKX6.1の発現のレベルの減少が生じた。観察された発現レベルは、処理1を行った細胞で観察されたものよりも低かった。表1及び図2のパネルeを参照のこと。それに対し、NGN3を発現している細胞の数は有意に増加した。表1及び図2のパネルfを参照のこと。PDX1発現に対しては有意な影響は観察されなかった。これらの結果は、ノギン、レチノイド酸及びアクチビンAの組み合わせは、NKN6.1及びPDX1の発現が陽性であるがNGN3の発現が陰性である特定の膵臓前駆細胞集団に対して相乗作用することを示す。
【0140】
図3のパネルa及びbに示されるように、DMEM(1%のB27(Invitrogen,CA)、50ng/mLのFGF7、0.25μMのシクロパミン−KAAD、2μMのレチノイン酸(RA)、100ng/mLのノギン及び20ng/mLのアクチビンAを添加したDMEM(高グルコース)(処理2))を用いて生成された、PDX1を発現している細胞のほとんどは、ステージ3の4日目ではCDX2を発現していなかった。このことは、1%のB27(Invitrogen,CA)、50ng/mLのFGF7、0.25μMのシクロパミン−KAAD、2μMのレチノイン酸(RA)、100ng/mLのノギン及び20ng/mLのアクチビンAを添加したDMEM/F12を用いて生成された、PDX1を発現している細胞とは対照的であり、この処理では、PDX1を発現している細胞のほとんどはCDX2も発現していた。図3のパネルc及びdを参照されたい。
【0141】
多数のTGFβ受容体アゴニストを試験した。処理2において、アクチビンAをGDF−8、GDF−11、アクチビンB又はTGFβ2のいずれかに替えたところ、全てで同様の結果が得られた。すなわち、GDF−8、GDF−11、アクチビンB又はTGFβ2のいずれかにより4日間にわたって処理したところ、NKX6.1発現の上昇と、NGN3の下方制御が得られた。図4のパネルa及びcを参照されたい。PDX1発現に対しては有意な影響は観察されなかった。図4のパネルbを参照されたい。
【0142】
(実施例2)
PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵内分泌前駆細胞への、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の分化
これまでの研究により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、更なる分化を受けた際に、インスリンを発現している細胞よりも、グルカゴンを発現している細胞を産生しやすいということが示されている。この示唆の一部は、膵臓内胚葉細胞でのNGN3発現に起因するものであり得る。本発明の方法は、NGN3を発現しない、膵臓内胚葉細胞集団を産生することから、これらの細胞集団はインスリンを発現している細胞へとより分化しやすいものと考えられる。しかしながら、NGN3発現は、膵内分泌細胞又は膵内分泌前駆細胞(例えばグルカゴン又はインスリンを発現している細胞を形成することのできる細胞)の形成に必要とされる。したがって、膵内分泌前駆細胞の最終的な運命を誘導するにあたり、NGN3の一時的な制御が重要である。
【0143】
本発明は、膵内分泌前駆細胞への膵臓内胚葉の分化が開始するまで、NGN3の発現は最小限に維持されるべきであると仮説している。
【0144】
簡潔に述べると、ヒト胚性幹細胞株H1細胞を、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)をコートしたディッシュと、2%のBSA、100ng/mLのアクチビンA、20ng/mLのWNT−3a及び8ng/mLのbFGFを添加したRPMI培地により1日培養した後で、2%のBSA、100ng/mLのアクチビンA、8ng/mLのbFGFを添加したRPMI培地で更に2日間にわたって処理し(ステージ1)、次いで
a.2%のBSA及び50ng/mLのFGF7を添加したDMEM/F12で3日間にわたって培養し(ステージ2)、次いで
b.1%のB27、50ng/mLのFGF7、0.25μMのシクロパミン−KAAD、2μMのレチノイン酸(RA)、100ng/mLのノギン及び20ng/mLのアクチビンAを添加したDMEM(高グルコース)で4日間にわたって処理し(ステージ3)、次いで
c.1%のB27、100ng/mLのノギン及び1μMのALK5阻害剤IIを添加したDMEM(高グルコース)で3日間にわたって培養するか(ステージ4)、又は
d.1%のB27のみを添加したDMEM(高グルコース)で3日間にわたって培養した(ステージ4)。
【0145】
上記の分化プロトコルは、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現していない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞が、膵内分泌前駆細胞へと更に分化するための能力について試験することを目的に設計された。膵内分泌前駆細胞はNGN3を発現する。
【0146】
PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、単に基本培地(DMEM(高グルコース)+1%のB27)で培養しただけでは、NGN3発現の誘導は得られなかった。図5のパネルaの薄い灰色のバーを参照のこと。同様にして、NEUROD、NKX2.2及びPAX6の発現も観察されなかった。
【0147】
対照的に、Alk5阻害剤IIの存在下でインキュベートした細胞では、NGN3発現の有意な増加が観察された。図5のパネルaの濃い灰色のバーを参照のこと。NEUROD、NKX2.2、PAX4及びPAX6の発現の上方制御も観察され、同様にPTF1 αの発現の上昇も観察された。図5のパネルa及びbを参照されたい。Alk5阻害剤IIの存在がPDX1又はNKX6.1の発現に影響を与えるかどうかは明白には示されなかった。図5のパネルbを参照されたい。
【0148】
PCRにより検出された、Alk5阻害剤IIの存在下でのNGN3発現の上昇は、免疫細胞化学により検出された、NGN3タンパク質の存在が陽性である細胞数が増加していたことにも反映された。図6を参照されたい。画像解析は、NGN3を発現している細胞の大多数がPDX1も共発現し、かつNKX6.1は発現していなかったことを明らかにした。これに加え、NKX6.1発現細胞の大多数はPDX1も共発現していた。このステージでは、例えばインスリン及びグルカゴンの発現により証明されるような、内分泌細胞としての発現レベルは最小であった。我々の結果は、TGF−β経路の活性化はPDX1及びNKX6.1を共発現する細胞集団の形成を促進し得、続いてTGF−β経路を阻害は内胚葉の内分泌前駆細胞への分化を更に誘導し得ることを示唆した。
【0149】
(実施例3)
膵内分泌細胞への、PDX1とNKX6.1を共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の分化
本実施例は、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞が、膵内分泌前駆細胞から、膵内分泌細胞へと更に分化するための能力について試験することを目的に設計された。
【0150】
簡潔に述べると、ヒト胚性幹細胞株H1細胞を、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)をコートしたディッシュと、2%のBSA、100ng/mLのアクチビンA、20ng/mLのWNT−3a及び8ng/mLのbFGFを添加したRPMI培地により1日培養した後で、2%のBSA、100ng/mLのアクチビンA、8ng/mLのbFGFを添加したRPMI培地で更に2日間にわたって処理し(ステージ1)、次いで
a.2%のBSA及び50ng/mLのFGF7を添加したDMEM/F12で3日間にわたって培養し(ステージ2)、次いで
b.1%のB27、50ng/mLのFGF7、0.25μMのシクロパミン−KAAD、2μMのレチノイン酸(RA)、100ng/mLのノギン及び20ng/mLのアクチビンAを添加したDMEM(高グルコース)で4日間にわたって処理するか(ステージ3)、又は
c.1%のB27、50ng/mLのFGF7、0.25μMのシクロパミン−KAAD、2μMのレチノイン酸(RA)、100ng/mLのノギン及び20ng/mLのアクチビンAを添加したDMEM(高グルコース)で4日間にわたって処理し(ステージ3)、次いで
d.1%のB27、100ng/mLのノギン及び1μMのALK5阻害剤IIを添加したDMEM(高グルコース)で3日間にわたって培養し(ステージ4)、
e.1%のB27、100ng/mLのノギン、1μMのALK5阻害剤II及び20ng/mLのベータセルリンを添加したDMEM(高グルコース)で5〜7日間にわたって培養した(ステージ5)。
【0151】
NGN3及びPAX4の発現は、ステージ4の3日目にそれぞれの最高レベルに達した後に減少し、ステージ5の7日目には発現レベルは更に低くなった。この期間、内分泌腺マーカーの、例えばインスリン及びグルカゴンの発現は上昇した。図7を参照されたい。これらのデータは、本発明の細胞が、内分泌前駆細胞から膵内分泌細胞を形成できたことを示唆する。
【0152】
インスリンのみ、又はグルカゴンのみ、あるいはインスリンとグルカゴンの両方のいずれかを発現している細胞が観察された。図8及び表2を参照されたい。ステージ5の7日目の培養物のFACS解析によると(表2)、PDX1及びNKX6.1を共発現する分化した膵臓内胚葉前駆細胞のおよそ60%が、膵内分泌腺マーカーであるシナプトフィジンを発現している。インスリン単独を発現している細胞の百分率は10.4%であり、グルカゴン単独を発現している細胞の百分率は5.1%であった。加えて、20%の細胞はインスリンとグルカゴンを共発現していた。インスリンは発現するが、他の膵臓ホルモンは発現しない細胞のうち、60%はNKX6.1(成熟β細胞のマーカー)を共発現していた。これらのデータは、インスリンを発現する、より成熟した細胞が、本発明の方法により形成されたことを示唆する。
【0153】
【表2】

【0154】
(実施例4)
STZ誘導型糖尿病の重症複合免疫不全(SCID)−beige(Bg)マウスへの、本発明の細胞の移植
ヒト胚性幹細胞株H1細胞を、MATRIGEL(登録商標)をコートしたディッシュ(1:30希釈)と、0.2%のFBS、100ng/mLのアクチビンA、20ng/mLのWNT−3aを添加したRPMI培地で1日培養し、次いで0.5%のFBS及び100ng/mLのアクチビンAを添加したRPMI培地により更に2日間にわたって処理し(ステージ1)、次いで
a.2%のFBS及び50ng/mLのFGF7を添加したDMEM/F12で3日間にわたって処理し(ステージ2)、次いで
b.1%のB27、0.25μMのシクロパミン−KAAD、2μMのレチノイン酸(RA)、100ng/mLのノギン、50ng/mLのFGF7及び20ng/mLのアクチビンAを添加したDMEM(高グルコース)で4日間にわたって処理し(ステージ3)、次いで
c.1%のB27、100ng/mLのノギン及び1μMのALK5阻害剤IIを添加したDMEM(高グルコース)で4日間にわたって処理した(ステージ4)。
【0155】
5〜6週齢のオスのscid−beigeマウス(C.B−Igh−1b/GbmsTac−Prkdcscid−LystbgN7)をTaconic Farmsより購入した。滅菌した餌と水を自由に利用できるような状態で、マウスをmicroisolatorケージ内に収容した。外科手術の準備に、マウスをイヤータグで同定し、体重を測定し、手持ち式glucometer(LifeScan;OneTouch)を用いて血糖を測定した。
【0156】
移植の2週間前にマウスを計量し、酢酸緩衝液に溶解させた80mg/kgのストレプトゾトシン(Sigma)(pH4.5)を5日間連続投与して、糖尿病を誘導した。血糖をモニターし、血糖が>300mg/dLのマウスのみを移植レシピエントとして使用した。
【0157】
マウスにイソフルランと酸素の混合物で麻酔をかけ、手術部位を小動物用はさみで剪毛した。マウスには手術前に皮下に0.1mg.kgのBuprenexを投与した。70%のイソプロピルアルコール及び10%のポビドンヨウ素で連続的に洗浄することで手術部位を調製した。
【0158】
ステージ4の終了時に、細胞を1mg/mLのディスパーゼで5分間にわたって簡単に処理し、1mLのガラス製ピペットを用いて機械的に回収し、続いて非接着性プレートに移し一晩培養した。マウスの手術前準備の間に、細胞を1.5mL遠心管で遠心し、次いで細胞ペレットを回収するのに十分な量の培地を残しつつほとんどの上清を除去した。細胞をRainin製Pos−Dポジティブディスプレイスメント式ピペットに回収し、ピペットを反転させて重力により細胞を沈降させた。移植用に充填した細胞調製物を残して過剰な培地を除去した。
【0159】
移植用に24G×1.9cm(3/4”)のI.V.カテーテルを用い、腎臓皮膜を貫通させ、針を除去した。次いで腎臓被膜下でカテーテルを腎臓の遠位極まで前進させた。Pos−Dピペットチップをカテーテルのハブにしっかりと取り付け、腎臓皮膜下でカテーテルを通してピペットから5百万個の細胞を分配し、腎臓の遠位極に供給した。腎臓皮膜を低温焼灼でシールし、腎臓を解剖学的な元の位置に戻した。並行して、Post−Dピペットチップを用い、5百万個の細胞を含有している細胞凝集物を50μLデバイスに充填した。50μLデバイスはTheraCyte,Inc(Irvine,CA)から購入した。細胞充填後にデバイスを医療用接着剤silicone type A(Dow Corning,カタログ#129109)によりシールし、SICD/Bgマウス(動物番号3及び4)の皮下に移植した。5−0 VICRYLを用いて連続縫合することで筋を縫合し、皮膚を創傷クリップにより閉じた。マウスには手術後に1.0mg.kg Metacamを皮下投与した。マウスを麻酔から覚めさせ、完全に回復させた。
【0160】
移植後に、マウスを週に1回秤量し、週に2回血糖を測定した。移植後、後眼窩洞から、少量のヘパリンを含有している遠心管に様々な間隔で血液を採取した。血液を遠心分離し、2本目の遠心管中に血漿を配置し、ドライアイス上で凍結させ、その後、ヒトCペプチドアッセイを実施するまでの間−80℃で保管した。製造者による取扱説明書に従い、Mercodia/ALPCO Diagnotics Ultrasensitive C−peptide ELISA(Cat No.80−CPTHU−E01,Alpco Diagnostics,NH)を用いてヒトCペプチドレベルを測定した。
【0161】
移植後、腎臓皮膜処理群では4週目程の早期に動物血清中にヒトCペプチドを検出した。ヒトCペプチドは経時的に増加した(図9のパネルa)。2カ月の終わりに、有意な量(1.1±0.5ng/mL)の循環ヒトCペプチドを検出することができた(図9,パネルa)。移植の2カ月後まで、空腹時血糖値は400ng/dL以上で持続した。この実験では、インスリン投与は行わないことが必須であった。移植片由来のインスリンの血清レベルが1ng/mL以上に上昇することで、高血糖症が徐々に減少する結果が得られる。3カ月で、我々はSTZ誘導型糖尿病マウスの90%に有意な量の循環ヒトCペプチドを検出することができた。平均的な循環ヒトCペプチド濃度は2±0.96ng/mL(n=8)であった(図9のパネルa)。hES細胞から誘導された内分泌前駆細胞を移植した、糖尿病マウスの90%で血糖値が200mg/dL以下であった。この値は持続した。移植片を外科的に除去した後、血糖値は移植片除去後直ちに高血糖レベルにまで上昇したことから、移植されたヒト細胞はSTZ処理マウスの正常血糖の維持に単独で関与していたことが示唆された(図9のパネルb)。
【0162】
この例は、PDX1及びNKX6.1を共発現している細胞集団、並びにPDX−1及びNKX6.1を共発現している細胞集団由来の内分泌前駆細胞集団は、in vivoでインスリン分泌細胞へと更に分化するための能力を有するということを実証する。
【0163】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
PDX−1及びNKX−6.1は共発現するが、CDX−2及びNGN−3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと、多能性幹細胞集団を分化させる方法であって、以下の工程a、b及びcを包含する方法:
a.前記多能性幹細胞を培養する工程、
b.前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程、及び
c.前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、FGF7を添加した第1培地で処理し、次いで前記細胞を、FGF7、BMP阻害能を持つ因子、TGF−β受容体アゴニスト、レチノイン酸、及びヘッジホッグ(hedgehog)シグナル経路阻害剤を添加した第2培地で培養することにより、PDX1及びNKX6.1は共発現するが、CDX2及びNGN3は発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9a】
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【図9b】
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【公表番号】特表2012−533321(P2012−533321A)
【公表日】平成24年12月27日(2012.12.27)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−521699(P2012−521699)
【出願日】平成22年7月19日(2010.7.19)
【国際出願番号】PCT/US2010/042393
【国際公開番号】WO2011/011302
【国際公開日】平成23年1月27日(2011.1.27)
【出願人】(509087759)ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド (77)
【Fターム(参考)】