ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法
【課題】 ＨＤＬ上昇、さらには動脈硬化性疾患の予防治療に有用な物質として期待される、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【解決手段】 プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを用いることを特徴とする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【解決手段】 プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを用いることを特徴とする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肝臓においてＡＢＣＡ１遺伝子の発現を制御するプロモーター・エンハンサー領域の発見に基づき、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法に関するものである。特に、プロモーター活性の増加、あるいは特定の非翻訳領域を含むｍＲＮＡの増加を指標として、肝臓におけるＡＢＣＡ１発現の増加により動脈硬化性疾患を予防または治療する作用を有する物質をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血中高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの低下は動脈硬化の危険因子である。ＨＤＬコレステロールが１０ｍｇ／ｄＬ上昇すれば冠動脈疾患のリスクが２０〜３０％低下すると予想されている。また人工ＨＤＬ粒子が動脈硬化病巣を直接退縮する治療効果を持つことが実証され、ＨＤＬ上昇薬が待望されているが、ＨＤＬを直接上昇する薬は実用化されていない（非特許文献１、Nat Rev Drug Discov. 2005 4, 193-205）。
【０００３】
ＨＤＬは、ＡＢＣ膜トランスポーターＡ１（ＡＢＣＡ１）が細胞内のリン脂質とコレステロールを、細胞外のアポリポプロティンＡ−Ｉに輸送して形成する。ＡＢＣＡ１はＨＤＬの形成に必須の役割を持ち、機能不全をもたらす遺伝子変異はＨＤＬ欠損症の原因となる（非特許文献２、Nat. Genet. 1999; 22:352）。逆に、ＡＢＣＡ１過剰発現マウスではＨＤＬが上昇する（非特許文献３、J. Biol. Chem. 2001; 276:33969）。ＡＢＣＡ１は各組織に発現するが、肝ＡＢＣＡ１が血中ＨＤＬの８割を産生することが肝特異的欠損マウスの研究により判明した（非特許文献４、J.Clin.Invest. 2005; 115, 1333）。したがって、ＨＤＬ上昇には、肝臓においてＡＢＣＡ１の発現を増加させることが極めて有力な手段と考えられる。
【０００４】
ＡＢＣＡ１の遺伝子転写制御に関しては、マクロファージなど末梢細胞のＡＢＣＡ１遺伝子の転写はエクソン１上流のプロモーター領域（末梢型プロモーター）により制御され、このプロモーターは核内受容体ＬＸＲが直接結合して活性化されることが知られている（非特許文献５、Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 274, 794）。
【０００５】
ＬＸＲアゴニストはＡＢＣＡ１発現促進を介してＨＤＬ上昇効果を示す。しかしＬＸＲ活性化は同時に、中性脂質合成のマスターレギュレーターである転写因子ＳＲＥＢＰ−１ｃの発現を促進する。その結果、脂肪酸生合成酵素系の遺伝子発現が増加し脂肪肝や血清トリグリセリド上昇が引き起こされ、このような副作用がＬＸＲアゴニストの臨床薬としての開発の障害となっている（非特許文献６、Biochem. Pharmacol., 2009; 77, 1316-1327）。
【０００６】
発明者らはラット肝臓のＡＢＣＡ１発現は、ＬＸＲ依存の末梢型プロモーターとともに、肝臓に特異的な肝型プロモーターにより二重の制御を受けることを見いだした（非特許文献７、J. Biol. Chem. 2007; 282:21090）。すなわちラット肝臓にはエクソン２から転写が開始される肝特異的なＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ（Ｌ２）が存在しており、ＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン２上流領域が肝臓に特異的なプロモーターとして機能する。肝型プロモーターにはステロール応答配列ＳＲＥが存在しており、コレステロール減少により活性型に転換されて核内移行する転写因子ＳＲＥＢＰ−２が直接結合して活性化する機構を明らかにした。このプロモーター領域は、ラット・マウス・ヒトに共通することから、この肝型プロモーターを活性化する薬物は、ＬＸＲの活性化による副作用を示さずに肝ＡＢＣＡ１発現を促進できると考えられた。そして、発明者らは、この肝型プロモーターが、ヒトに有効なＡＢＣＡ１発現促進薬のスクリーニングに使用できることを考えた（特許文献１ 特開２００７−０８２４４５号）。
【０００７】
マクロファージや繊維芽細胞などでは、コレステロール合成の律速酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害剤スタチン系薬剤がＡＢＣＡ１発現を低下させる。これは、コレステロール合成過程で生じるＬＸＲの内因性リガンドがスタチン系薬剤の作用によって減少し、ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター活性が低下することによる（非特許文献８、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2004; 24, 2365）。しかしながら、スタチン系薬剤には、血中ＬＤＬ濃度の低下に加えて、血中ＨＤＬ濃度の上昇効果も認められており、スタチン系薬剤はヒト肝がん由来細胞ＨｅｐＧ２において、ＡＢＣＡ１遺伝子の発現促進作用を示すことも知られている（非特許文献９、Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 324, 835）。発明者らは、スタチン系薬物は肝由来細胞において末梢型プロモーターの活性を低下させる一方、肝型プロモーターを活性化することによりＡＢＣＡ１発現増加をもたらす機構を明らかにしてきた（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−０８２４４５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nat Rev Drug Discov. 2005 4, 193-205
【非特許文献２】Nat. Genet. 1999; 22:352
【非特許文献３】J. Biol. Chem. 2001; 276:33969
【非特許文献４】J. Clin. Invest. 2005; 115, 1333
【非特許文献５】Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 274, 794
【非特許文献６】Biochem. Pharmacol., 2009; 77, 1316-1327
【非特許文献７】J. Biol. Chem. 2007; 282:21090
【非特許文献８】Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2004; 24, 2365
【非特許文献９】Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 324, 835
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＡＢＣＡ１は各組織に発現するが、肝ＡＢＣＡ１が血中ＨＤＬの８割を産生することが肝特異的欠損マウスの研究により判明した（非特許文献４）。また、肝特異的なＡＢＣＡ１欠損マウスでは動脈硬化が増悪することがわかった（Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol 2009; 29:548）。したがって、肝臓においてＡＢＣＡ１の発現を増加させることが、ＨＤＬ上昇、さらには動脈硬化性疾患の予防治療に極めて重要と考えられ、肝臓におけるＡＢＣＡ１遺伝子発現の制御機構の解明、さらにはそれを利用した制御薬剤のスクリーニング方法が望まれていた。
【００１１】
以上に鑑みて、本発明の課題は、ヒト肝細胞のＡＢＣＡ１の上昇作用を有し、動脈硬化に伴う疾患の予防および／または治療に有用な医薬に用いることができる物質をスクリーニングする新規な方法を提供することにある。
【００１２】
なお、本発明の方法において用いられるヒトＡＢＣＡ１遺伝子は、Gene Bankデータベース上に「ＡＴＰ結合カセット輸送体Ａ１（ATP-binding cassette transporter A1）」として公開されている。また、国際公開第00/078972号パンフレットには、「ＡＢＣ１」をコードするものとしてヒトＡＢＣＡ１遺伝子が、またそれと共に上記のエクソン１上流のプロモーターが開示されている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、本発明の一の側面によると、プロモーター活性を有するＤＮＡ、ならびにヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡを用いることを特徴とする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法が提供される。
【００１４】
前記プロモーター活性を有するＤＮＡが、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡであることが好ましい。
【００１５】
前記ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質が、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明にかかるＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法によれば、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質、特に、動脈硬化性疾患の予防および／または治療剤を試験するための新規方法を確立することができ、ＨＤＬ上昇薬の開発に有用である。また、本発明の方法は、従来のＡＢＣＡ１遺伝子発現促進物質のスクリーニング方法に比べ、ヒトＨＤＬ上昇作用に対して、より効果的な分子を検出できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１ＡはヒトＡＢＣＡ１遺伝子の模式図を示す。模式図中の数値は、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のＤＮＡにおいて、末梢型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの転写開始点を１とした塩基位置を示すものである。図１Ｂは、５’−ＲＡＣＥ法により解析したヒト肝臓で発現するＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの５’末端の模式図を示す。括弧内は、ヒト肝臓における、各ｍＲＮＡの存在比を示す。
【図２】図２Ａは、ヒト各組織（肝臓、筋肉、腎臓、膵臓、心臓、脳、胎盤および肺）で発現する総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量を示したグラフであり、図２Ｂは、ヒト各組織で発現するヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量を示したグラフである。
【図３】図３Ａは、コンパクチンで処理したヒト肝由来培養細胞ＪＨＨ５における総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの発現量変化を示すグラフであり、図３Ｂは、コンパクチンで処理したヒト肝由来培養細胞ＪＨＨ−５におけるヒト肝型（Ｌ３）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの発現量変化を示すグラフであり、図３Ｃは、コンパクチンで処理したヒト肝由来培養細胞ＪＨＨ−５における末梢型（Ｐ）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの発現量変化を示すグラフである。
【図４】図４Ａは、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの発現をｓｉＲＮＡを用いてノックダウンしたヒト肝由来培養細胞ＪＨＨ−５における、ＡＢＣＡ１蛋白の発現量をウェスタンブロットで測定した写真であり、図４ＢはアポＡ−Ｉ依存のコレステロール細胞外排出量（ＨＤＬ産生量）を示したグラフである。
【図５】図５は、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の模式図、およびヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター・エンハンサーのレポータープラスミドの構成図である。模式図中の数値は、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のＤＮＡにおいて、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの転写開始点を１とした塩基位置を示し、転写開始点の下流をプラス、上流をマイナスで表したものである。
【図６】図６は、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター・エンハンサーがコンパクチンにより活性化されることを示すグラフである。
【図７】図７は、Ｌ３型エンハンサー配列をＳＶ−４０プロモーターを導入したルシフェラーゼプラスミドに組み込んでも、コンパクチンによる活性化が認められること、しかしＳＲＥＢＰ−２の発現増加により影響されないことを示すグラフである。
【図８】図８は、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサーに含まれる配列を示す。上の行の左端が５’側であり、下の行の右端が３’側である。
【図９】図９は、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター・エンハンサーの活性が、配列ａ、配列ｂあるいは配列ｃの欠失により消失したことを示すグラフである。
【図１０】図１０は、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサーの活性が、転写調節因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａの発現ベクターを導入することにより上昇し、配列ｃの欠失により消失したことを示すグラフである。
【図１１】図１１は、コンパクチンで処理したヒト肝由来培養細胞ＪＨＨ−５における、ＨＮＦ４ａｌｐｈａ蛋白の発現量をウェスタンブロットで測定した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施の形態によって、限定されるものではない。
【００１９】
発明者らは、ヒト肝および肝由来細胞のＡＢＣＡ１発現制御をさらに詳細に解析したところ、ヒト肝には従来から知られているマウス・ラットに共通の肝型（Ｌ２型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡに加えて、さらに別の肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡが存在することを見いだした。このヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡは、ヒト肝に存在する総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの２５％に相当しており、ヒト肝由来細胞をスタチン系薬剤で処理すると発現が促進されることを見いだした。Ｌ３型の転写開始点はエクソン２の翻訳開始点より下流であるが、Ｌ３型ｍＲＮＡは機能的ＡＢＣＡ１をコードしていることは、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡを用いてノックダウンすると、ＡＢＣＡ１蛋白質の発現が減少し、ＨＤＬ形成能も低下したという事実により確認された。
【００２０】
引き続き、対応するＬ３型プロモーター・エンハンサー領域を同定したところ、スタチン系薬物による活性化を担うエンハンサー領域は、既報のＬ２型プロモーター（特許文献１、非特許文献７）とは異なりＳＲＥＢＰ−２には応答せず、新規なメカニズムでヒトＡＢＣＡ１発現を制御することを見いだした。したがって、Ｌ３型プロモーター・エンハンサー領域はヒトで肝臓のＡＢＣＡ１発現を制御し、血中ＨＤＬレベルを調節する重要な役割をもつと考えることができる。Ｌ３型プロモーター・エンハンサー領域の活性化、あるいは新規非翻訳領域を含むＬ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの発現増加を指標とする薬物スクリーニング法は、ヒトにおいて有効なＨＤＬ上昇薬の開発に極めて有用性が高いと考えられる。
【００２１】
さらには、発明者らは、Ｌ３型エンハンサーは、Ｌ３型プロモーター以外のプロモーターを用いた場合でも、ヒトＡＢＣＡ１発現を促進することを見出した。
【００２２】
上記のヒト肝臓におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現調節に新たな制御機構が存在するという発見に基づき、ＡＢＣＡ１遺伝子発現を調節する物質を選別または同定するための方法として、新規ヒト肝型（本明細書中、Ｌ３型とも表記する）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡをコードする遺伝子の、エクソン３上流（本明細書中、エクソンＬ３とも表記する）部分を用いる方法、およびイントロン２に存在する新規ヒト肝型ＡＢＣＡ１プロモーターとイントロン３に存在するエンハンサー（本明細書中、Ｌ３型ＡＢＣＡ１プロモーター等とも表記する）を用いる方法を開発し、本発明を完成させた。
【００２３】
本発明が開示する新規ヒト肝型（Ｌ３型）プロモーターは、従来から知られている、ＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン１上流のプロモーター（国際公開第00/078972号パンフレット参照）あるいはエクソン２上流のＬ２型プロモーターとは全く異なる領域に存在し、ＤＮＡ配列も異なる。このＬ３型プロモーターに関しては、ＡＢＣＡ１遺伝子転写制御、ＨＤＬ形成との関連は報告されておらず、動脈硬化性疾患の治療または予防剤の試験法としての有用性も知られていない。上記したように、ピタバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチンがヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２においてＡＢＣＡ１のｍＲＮＡを増加させることが示されている（非特許文献９）。その作用機序については、発明者らが見いだした肝型（Ｌ２）プロモーターが想定されていた。しかし、本発明にかかる新規ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１プロモーターおよび当該プロモーターによる発現制御については、従来技術文献において、記載も示唆もしていない。同様に、本発明が開示する新規肝型ＡＢＣＡ１エンハンサーについても、これらの従来技術文献において何ら報告されたものではなく、発明者らによる今般の研究によりはじめて、明らかにされたものである。
【００２４】
本発明は、一実施の形態によると、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを用いることを特徴とする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【００２５】
本発明はまた、別の実施の形態によると、このようなスクリーニング方法に用いることができる、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとに関する。
【００２６】
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡ、およびヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡは、ヒトに由来する配列を有するものであれば、天然のものであってもよく、また人工的なものであってもよい。すなわち、本発明の別の側面によると、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の塩基配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを含んでなる組み換えＤＮＡが提供される。
【００２７】
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２は、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン２の下流かつエクソン３の上流に存在する領域であり、イントロン３はエクソン３の下流かつエクソン４の上流に存在する領域である。具体的には、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン２として、配列番号１に記載するヒトＡＢＣＡ１遺伝子のＤＮＡ配列の２４３８５位から２４５４２位の配列を有するものが、イントロン２として、配列番号１に記載の配列の２４５４３位から３８９６０位の配列を有するものが、エクソン３として、配列番号１に記載の配列の３８９６１位から３９０５４位の配列を有するものが、イントロン３として、配列番号１に記載の配列の３９０５５位から４３５８７位の配列を有するものが、およびエクソン４として、配列番号１に記載の配列の４３５８８位から４３７２９位の配列を有するものが、それぞれ見出されている。また、本明細書中、エクソンＬ３と記す領域は、配列番号１に記載の配列の３８４８１位から３８７８３位の配列を有する領域である。配列番号２にエクソンＬ３の配列を示す。なお、配列番号１は、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン１から始まる配列である。また、ヒトにおける上記イントロン２、エクソンＬ３の相同体、変異体および誘導体の配列は、当業者であれば、ヒトにおける上記イントロン２および／またはエクソン３、４の配列との相同性に基づき決定することができる。
【００２８】
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子の塩基配列の３８０５５位から３８９６０位までの塩基を含むことが好ましい。ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、特には、（ａ）配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子の塩基配列の３８０５５位から３８９６０位までの塩基（配列番号３）、配列３８０５５位から配列３９０５４位までの塩基（配列番号４）、配列３８０５５位から配列３９２２４位までの塩基（配列番号５）に記載の配列を有するＤＮＡとすることができる。
【００２９】
また、イントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、（ａ）のＤＮＡと実質的に同一の配列を有するＤＮＡとすることができる。具体的には、イントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号５のいずれかに記載の配列において、１もしくは数個（好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個）のヌクレオチドが置換、挿入または欠失された配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡの少なくとも一部とすることができる。当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、野生型プロモーターのヌクレオチド配列の部分的な置換、挿入または欠失などの改変により、野生型プロモーターと同等またはそれ以上のプロモーター活性を有するＤＮＡを調製することが可能である。
【００３０】
また、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、（ｃ）配列番号３、配列番号４、配列番号５のいずれかに記載の配列と相同性が６０％以上（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡの少なくとも一部とすることができる。このようなＤＮＡには、（ａ）のＤＮＡの、自然界に存在する変異型遺伝子もしくは人為的に改変した変異型遺伝子または異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
【００３１】
相同性の比較は、通常、容易に入手できる配列比較プログラムを用いて行うことができる。商業的に入手可能なそのようなコンピュータープログラムは２以上の配列の間の％相同性を計算することができる。ほとんどの配列比較方法においては、全体としての相同性スコアに不当にペナルティを与えることなく可能な挿入および欠失を考慮に入れて、最適な整列を生じさせるよう設計される。これは、「ギャップ」を配列の整列に挿入して、局所的な相同性を最大化するよう努めることによって達成される。このような方法では、できる限り少数のギャップにおける配列の整列が、多くのギャップにおけるものより高いスコアを達成するように、各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てて、相同性を計算する。ほとんどの整列プログラムはギャップペナルティを設定することができる。しかしながら、配列比較のためのそのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。このような配列比較を実行できるソフトウェアの例として、ＢＬＡＳＴパッケージ(Ausubel et al.,1999 ibid-Chapter18参照)、ＦＡＳＴＡ(Atschul et al.,1990,J.Mol.Biol.,403-410)およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。
【００３２】
また、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、（ｄ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、プロモーター活性を有するＤＮＡの少なくとも一部とすることができる。ここで、ＤＮＡは通常、互いに相補的な二本鎖ＤＮＡ構造を有している。このため、（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとは、（ａ）のＤＮＡのいずれかの鎖とハイブリダイズする鎖を有するＤＮＡをいうことに留意すべきである。
【００３３】
なお、ストリンジェントな条件およびハイブリダイゼーションの方法は、例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第2版, 1989に従って設定することができる。具体的には、ストリンジェントな条件は、「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」とすることができ、よりストリンジェントな条件は、「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」とすることができ、さらにストリンジェントな条件は、「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」とすることができる（１ｘＳＳＣ：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）。ただし、これらの条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記または他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３４】
なお、（ｂ）〜（ｄ）のＤＮＡのプロモーター活性は、例えば、以下に詳細に説明するように、ルシフェラーゼアッセイ法等により測定することができる。また、（ｂ）〜（ｄ）のＤＮＡは、（ａ）のＤＮＡと「同様」のプロモーター活性を有することが好ましい。ここで、「同様」のプロモーター活性を有するとは、質的に類似のプロモーター活性を有することをいい、例えば、（ｂ）〜（ｄ）のＤＮＡが、（ａ）のＤＮＡと少なくとも１つの因子について同一の制御を受ける場合が含まれる。一方で、「同様」のプロモーター活性を有するとは、量的に同程度のプロモーター活性を有することを意図するものではない。また、当業者には明らかなように、プロモーター活性を発揮するために、ＤＮＡは、配列番号３、配列番号４、配列番号５のいずれかに記載の配列（またはこれと実質的に同一の配列）の全てを有する必要はなく、その一部であってもよい。上記したように、プロモーター活性を有するのに必要な領域は、当業者であれば、ルシフェラーゼアッセイ法等により適宜決定することができる。
【００３５】
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の塩基配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡは、（ｅ）配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子において、Ｌ３型ｍＲＮＡの転写開始位置（配列番号１のヒトＡＢＣＡ１ ＤＮＡの３８４８１位）下流３１０３位から下流３３７８位までの塩基（配列番号６）を含むことが好ましく、配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子において、Ｌ３型ｍＲＮＡの転写開始位置から下流３１７２位から下流３３７８位までの塩基（配列番号７）を含むことがさらに好ましく、配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子において、Ｌ３型ｍＲＮＡの転写開始位置から下流３１７２位から下流３２５９位までの塩基（配列番号８）を含むことが最も好ましい。
【００３６】
さらには、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の塩基配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡは、配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子において、Ｌ３型ｍＲＮＡの転写開始位置から３１７２位から３３８３位までの塩基（配列番号９）と、Ｌ３型ｍＲＮＡの転写開始位置から３２３０位から３２４３位までの塩基（配列番号１０）と、Ｌ３型ｍＲＮＡの転写開始位置から３２４４位から３２５６位までの塩基（配列番号１１）をすべて有するＤＮＡであることが必要である。
【００３７】
これらの３つの配列が保持される限り、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の塩基配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡは、（ｆ）配列番号６、配列番号７、配列番号８のいずれかに記載の好ましいＤＮＡの配列において、１もしくは数個（好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個）のヌクレオチドが置換、挿入または欠失された配列であってもよい。
また、これらの３つの配列が保持される限り、（ｇ）配列番号６、配列番号７、配列番号８のいずれかに記載の配列と相同性が６０％以上（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の配列を有するものであってもよい。相同性の比較に関しては、（ｃ）のＤＮＡについて述べたのと同様にして行うことができる。
さらに、これらの３つの配列が保持される限り、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の塩基配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡは、（ｈ）配列番号６、配列番号７、配列番号８のいずれかに記載の好ましいＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンハンサー活性を有するＤＮＡの少なくとも一部とすることができる。
【００３８】
上記に配列を示したもの以外であっても、本願発明において、エンハンサー活性を有するのに必要な領域は、当業者であれば適宜決定することができる。エンハンサー活性は、例えば、以下に詳細に説明するように、ルシフェラーゼアッセイ法、ＣＡＴ法等により測定することができる。
【００３９】
次に、本発明の一実施の形態による、これらのＤＮＡを用いた、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法において用いることができる、組換えＤＮＡについて説明する。組換えＤＮＡは、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを含んでなる。
【００４０】
プロモーター活性を有するＤＮＡとしては、上記において説明した、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることができる。さらには、プロモーター活性を有するＤＮＡとしては、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子に由来する配列を有するものに限定されず、任意のプロモーターの塩基配列を有するものを用いることができる。当業者には既知のプロモーターとしては、例えば、ＳＶ−４０プロモーター、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＥＦプロモーター、ＣＡＧプロモーターが挙げられるが、これらには限定されない。
いっぽう、エンハンサー活性を有するＤＮＡとしては、上記において説明した、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡを用いることができる。
【００４１】
これらのプロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとは、組換えＤＮＡにおいては、任意の組み合わせで用いることができる。すなわち、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）のいずれかから選択されるプロモーター活性を有するＤＮＡもしくはその他の任意プロモーター活性を有するＤＮＡと、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）のいずれかから選択されるエンハンサー活性を有するＤＮＡとを、任意の組み合わせで含む組換えＤＮＡとすることができる。
【００４２】
なお、本発明にかかる組換えＤＮＡにおいて、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡを用いる場合でも、そのほかに転写最小プロモーターをさらに有することができる。最小プロモーターの例として、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明にかかるＤＮＡは、ゲノムライブラリーからの選別や、ゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により取得できる。ゲノムライブラリーからの選別は、適当なベクターに組み込んだゲノムＤＮＡと、目的のＤＮＡの一部の配列を有する標識ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって行うことができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第2版, 1989に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。また、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲは、目的のＤＮＡの一部の配列を有するプライマーを用いて行うことができる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素またはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法による改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。
【００４４】
本発明の他の側面によると、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを有する組換えベクターが提供される。組換えベクターは、当該プロモーター活性を有するＤＮＡ、及びエンハンサー活性を有するＤＮＡに作動可能に連結した構造遺伝子をさらに有してもよい。以下に詳細に説明するように、構造遺伝子は、例えば、組換えベクターをスクリーニングに用いる場合、その転写量および／または発現量を測定できるものであれば、任意の遺伝子でよい。
【００４５】
本発明にあっては、ベクターは、任意のベクター、例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどであってよい。より具体的には、本発明に用いることができるベクターの例として、動物細胞用のベクターであるｐＣＤベクター、ｃＤＭ８ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノアソシエイトウイルスベクターなどや、細菌用のベクターであるｐＵＣなどを挙げることができる。構造遺伝子をベクター内に組み込むためには、構造遺伝子が正しく転写される方向に、さらにプロモーターおよびエンハンサーが構造遺伝子に対して適正に機能する位置関係になる様に、プロモーター領域の下流であって、エンハンサー領域の上流に構造遺伝子を連結すればよい。プロモーターと構造遺伝子との連結、及びエンハンサーと構造遺伝子との連結は、制限酵素切断部位を利用して行うことができる。また、適当な制限酵素部位がなくてもリガーゼ反応を用いて行うことができる。
【００４６】
なお、「作動可能に連結」とは、一の遺伝子要素が、他の遺伝子要素に対して予測されるように機能できるように配置されていることをいう。例えば、プロモーターが、構造遺伝子の転写の開始を助ける場合には、プロモーターは構造遺伝子に作動可能に結合している。同様に、エンハンサーが構造遺伝子の転写を促進する場合には、エンハンサーが構造遺伝子に作動可能に結合している。この機能的な関係が維持される限り、プロモーターと構造遺伝子との間、あるいは構造遺伝子とエンハンサーとの間に残基が介在してもよい。
【００４７】
本発明の他の側面によると、プロモーター活性を有する外因性のＤＮＡ及びヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有する外因性のＤＮＡに作動可能に連結した構造遺伝子を有する形質転換体が提供される。本明細書において、形質転換体は、広く、外部からＤＮＡが導入された結果、新しい形質を獲得した生物をいう。形質転換体は、任意の生物であってよく、また、任意の生物に由来する任意の細胞または組織であってよい。特に、本発明にかかる形質転換体は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を含む。
【００４８】
組換えベクターにより形質転換することができる宿主の例として、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などを挙げることができる。これらの宿主への形質転換の方法の例として、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターによる遺伝子導入法、マイクロインジェクション法などを挙げることができる。
【００４９】
本発明の他の側面によると、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質をスクリーニングするためのキットが提供される。本発明にかかるキットは、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質をスクリーニングするために用いることができる。以下に詳細に説明するように、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを用いることで、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明にかかるキットは、上記組換えベクターおよび／または上記形質転換体を有する。
【００５０】
本発明にかかるキットには、スクリーニングの方法に応じて、酵素、酵素基質、緩衝液等の試薬、培地、道具等を組み合せることができる。酵素基質の例として、ルシフェリン、ＡＴＰ、［14Ｃ］クロラムフェニコール、アセチルＣｏＡを挙げることができる。緩衝液として、解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液を適宜選択することができる。道具の例として、ＴＬＣ用展開シート、メンブレン等を挙げることができる。
【００５１】
本発明の他の側面によると、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質、特に、肝臓においてヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法が提供され、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質を探索するために用いることができる。本発明にかかるスクリーニング方法は、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを用いることを特徴とする。
【００５２】
具体的には、本発明にかかるスクリーニング方法は、
被検物質を供するステップと、
プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとに作動可能に連結した構造遺伝子を有するＤＮＡを有する細胞または生物の複数の群を供するステップと、
前記被検物質を前記細胞または生物の少なくとも１つの群に接触させるステップと、
前記被検物質を接触させた群と接触させなかった群とにおいて、前記遺伝子の転写量および／または発現量を測定するステップと、
前記被検物質を接触させた群と接触させなかった群の前記転写量および／または発現量を比較するステップと
を含むことが好ましい。
【００５３】
被検物質として、単一の化合物または組成物、天然または合成化合物、有機または無機化合物、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、細胞抽出物、細胞培養上清、その他の任意の物質を供することができる。
【００５４】
スクリーニングは、インビトロおよびインビボのいずれでも行うことができる。本発明にかかるスクリーニング方法において用いられる細胞または生物として、細菌等の原核生物（大腸菌等）、酵母（サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライヴェロマイセス(Kluyveromyces)属等）、昆虫、植物もしくは動物またはこれらに由来する細胞が挙げられる。動物の例として、恒温動物、特にヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等の哺乳動物を挙げることができる。本発明で用いられる細胞は、実験室で培養することのできる培養細胞であることが好ましく、初代培養肝細胞であることがさらに好ましい。細胞は、恒温動物、特にヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等の哺乳動物に由来することができ、ヒトに由来することが好ましい。また、細胞は、肝臓に由来することが好ましい。
【００５５】
本発明に用いられる細胞または生物は、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとに作動可能に連結した構造遺伝子を有するＤＮＡを有することが好ましい。当該ＤＮＡは、内因性であっても、または外因性であってもよい。外因性である場合、当該ＤＮＡは、任意の手段により細胞または生物に導入されてもよい。例えば、スクリーニングに培養細胞を用いる場合、培養細胞への当該ＤＮＡの導入方法として、本発明の属する技術分野において汎用される任意の方法を採用することができる。例えば、ＤＮＡの導入方法の例として、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス穿孔法等が挙げられるが、これらに限定されない。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて至適化されたトランスフェクション条件を用いることが好ましい。
【００５６】
構造遺伝子は、その転写量および／または発現量を測定できるものであれば、任意の遺伝子でよい。当業者に明らかなように、上記構造遺伝子は、その転写量および／または発現量の測定方法に応じて、適宜選択することができる。上記構造遺伝子の例として、ヒトＡＢＣＡ１、所定の活性を有するタンパク質（ルシフェラーゼ等）、所定の抗体が結合できるタンパク質、所定の物質が特異的に結合できるタンパク質（ＧＳＴ等）等をコードする遺伝子を挙げることができ、特に、ホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼおよび緑色蛍光蛋白質からなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子（いわゆるレポーター遺伝子）を挙げることができる。
【００５７】
被検物質を細胞または生物に接触させることは、当業者に明らかなように、任意の方法により行うことができる。例えば、培養細胞を用いる場合、被検物質を培地中に添加することで、接触させることができる。すなわち、培養細胞を用いる場合、細胞を、被検物質の存在下または非存在下で培養することが好ましい。また、動物を用いる場合は、任意の手段による投与により、例えば、任意の経路からの注射により、接触させることができる。被検物質を細胞または生物へ接触させる時間は、被験物質の効果、濃度、細胞または生物の種類および技術的考慮に応じて、適宜設定することができる。また、被験物質の濃度は、その毒性、透過性、細胞数、処理時間等に応じて、適宜設定することができ、通常１ｎＭ〜１ｍＭであることが好ましい。培養細胞を用いる場合、一般的にこのような処理は、多くの試験を同時に実施できるマルチウェルプレートで実施することが好ましい。培養細胞を用いる場合、被験化合物の処理によるレポーター遺伝子の発現が測定可能な条件は、細胞が生存してレポーター遺伝子の発現産物が生産可能な条件であれば良い。特に好ましい条件にあっては、好ましくは使用される細胞株に適した培地を使用し、４〜６％の炭酸ガス存在下、３６〜３８℃で５〜７２時間培養する。
【００５８】
被検物質を接触させた群と接触させなかった群とにおいて、上記構造遺伝子の転写量および／または発現量を測定し、これらの転写量および／または発現量を比較することで、当該被検物質を、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質の候補物質とすることができるか否か判断することができる。具体的には、ある被検物質を接触させた群で、接触させなかった群と比べて、上記遺伝子の転写量および／または発現量が変化した場合、特に増加した場合、当該被検物質を候補物質とすることができる。
【００５９】
被検物質を接触させた群と接触させなかった群とにおいて、上記構造遺伝子の転写量および／または発現量を測定するステップと、被検物質を接触させた群と接触させなかった群の転写量および／または発現量を比較するステップは、当業者に明らかなように、任意の方法により行うことができる。具体的には、ノーザンブロッティング法、ＤＮＡアレイ法等により、上記遺伝子の転写量を測定することができる。また、ルシフェラーゼアッセイ法やＣＡＴ法等により、上記遺伝子の発現量を測定することができる。さらに、上記所定の遺伝子に対する抗体が入手可能な場合は、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、ウエスタンブロッティング法により、当該遺伝子の発現量を測定することができる。また、上記所定の遺伝子として、ＧＳＴ等の所定の物質に特異的に結合するタンパク質の遺伝子を用いる場合は、当該タンパク質を沈降させ、沈降したタンパク質の量を測定することで、上記遺伝子の発現量を測定することができる。
【００６０】
［ノーザンブロッティング法］
ノーザンブロッティング法は、変性したＲＮＡを変性条件下のアガロース電気泳動で分離し、ニトロセルロースフィルターに移して、標識した特異的なプローブで検出するものである。ＲＮＡを変性させるのは、ＲＮＡは分子内に二次構造を持つため、そのままではサイズに従った正確な分離ができず、さらに、フィルターは一本鎖の核酸しか結合できないためである。
【００６１】
［ルシフェラーゼアッセイ法、ＣＡＴ法］
ルシフェラーゼアッセイ法およびＣＡＴ法は、目的とする遺伝子の転写調節領域の下流にレポーターとしてＬＵＣ（ルシフェラーゼ）またはＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を組み込んだプラスミドを作成し、そのプラスミドを導入した細胞の酵素活性を測定するものである。具体的には、ルシフェラーゼアッセイ法は、マグネシウム存在下、ルシフェラーゼがルシフェリンとＡＴＰから酸化ルシフェリンとＡＭＰを作る反応を触媒する際に発する波長５６０ｎｍの光を、ルミノメーターを使って検出するものである。ＣＡＴ法の場合、基質の［１４Ｃ］クロラムフェニコールが、ＣＡＴによりアセチル化されて、［１４Ｃ］アセチルクロラムフェニコールが産生される。このサンプルを酢酸エチルで抽出し、薄層のシリカゲルプレート上に展開後、移動度の異なるスポットの放射活性を測定する。
【００６２】
本発明の他の側面によると、上記スクリーニング方法によりスクリーニングされた、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質、特に、肝臓においてヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質が提供される。特に、上記したように、本発明にかかるスクリーニング方法によると、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を促進する物質をスクリーニングすることができる。このため、本発明の他の側面によると、上記スクリーニング方法によりスクリーニングされた、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質が提供される。
【００６３】
また、本発明のさらに他の側面によると、ヒトの新規肝型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの５’側領域をコードする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の新規エクソンＬ３中の配列に基づいて作成したプライマーを用いてヒトＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現量を測定することを特徴とする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法が提供される。
【００６４】
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の新規エクソンＬ３は、配列番号２に示すものであって、配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子の塩基配列の３８４８１位から３８７８３位までの３０３塩基に対応する。本実施形態において用いられるプライマーは、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子において、新規エクソンＬ３の上流および下流の配列の一部と実質的に相補的なプライマー対であればよく、プライマー配列の長さおよびヒトＡＢＣＡ１遺伝子のどの部位と実質的に相補的であるかなどは特に限定されない。ここで、実質的に相補的とは、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の配列とアニールできる程度に相補的であればよいことを意味する。たとえば、これらのプライマーは、５’側又は３’側、又はその両方に、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとアニールできる限り、本発明のプライマーに含まれるものとする。また、非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子と相補的でないミスマッチ配列を持つプライマーを使用することができる。また、プライマーは、検出のために標識されていてもよく、例えば、プライマーは、放射性同位体、蛍光物質、酵素、その他の化学物質等により標識されていてもよい。
【００６５】
具体的には、好ましいヒトＬ３型ＡＢＣＡ１検出用フォワードプライマーとしては、配列番号１２に記載されているものが挙げられるが、これらには限定されない。また、ヒトＬ３型ＡＢＣＡ１検出用リバースプライマーとしては、配列番号１３に記載されているものが挙げられるが、これらには限定されない。また、これらのプライマーと組み合わせて使用しうる好ましいプローブとしては、配列番号１４に記載されるものを使用することができる。ほかに、好ましいプローブ、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせとして、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７に記載されたものが、さらに別の好ましいプローブ、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせとして、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０に記載されたものが挙げられる。
【００６６】
これらのＰＣＲプライマーを用いてヒトＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現量を測定することを特徴とする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法は、
被検物質を供するステップと、
プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとに作動可能に連結した構造遺伝子を有するＤＮＡを有する細胞または生物の複数の群を供するステップと、
前記被検物質を前記細胞または生物の少なくとも１つの群に接触させるステップと、
前記被検物質を接触させた群と接触させなかった群とにおいて、前記遺伝子の転写量および／または発現量を測定するステップであって、ＰＣＲプライマーを用いてヒトＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現量を測定することを特徴とするステップと、
前記被検物質を接触させた群と接触させなかった群の前記転写量および／または発現量を比較するステップと
を含むことが好ましい。
【００６７】
具体的には、かかる方法は、既に説明したプロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを用いる、スクリーニング方法に準じて行うことができる。ＰＣＲプライマーを用いてヒトＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現量を測定するステップにおいては、好ましくは、配列番号１２、１３に記載のプライマー対を用いて、ヒト新規肝型ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現量を測定する。かかるスクリーニング方法によれば、肝臓においてヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質、さらにはヒトにおいて動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質を提供することができる。
【００６８】
また、本発明の他の側面によると、転写因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａの量あるいは活性を変化させる作用を有する物質を含有する、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写調整剤が提供される。転写因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａの量あるいは活性を変化させる作用を有する物質は、フォルスコリン、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ｃＡＭＰアナログなど、細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させることでＨＮＦ４ａｌｐｈａの転写コアクチベーターとして働くＰＧＣ−１ａｌｐｈａの発現を上昇させる物質も含む。このような、転写調整因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａの発現量や活性を増加する物質は、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡを増加することが期待される。
【００６９】
本実施の形態による、転写因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａの量あるいは活性を変化させる作用を有する物質を含有する、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写調整剤は、本発明の一実施の形態として説明した、肝臓においてヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法により、同定することができる。さらに具体的には、スクリーニング方法において、特に、エンハンサーとして、配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子のＬ３型ｍＲＮＡの転写開始位置から３２４４位から３２５６位までの塩基（配列番号１１）を含む配列を用いることにより同定することができる。かかる配列を含むものであれば、エンハンサー配列の長短は問わず、また、プロモーターも任意のものであってよい。
【００７０】
本発明は以下の実施例においてより具体的に説明される。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
【実施例１】
【００７１】
［ヒト肝臓で発現するＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの検出］
５’−ＲＡＣＥ法により、ヒト肝臓で発現しているＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの５’末端領域を解析した。プライマーはＡＢＣＡ１のｍＲＮＡエクソン４およびエクソン５の配列を基に設計した。配列番号２１に、用いた遺伝子特異的プライマーの配列を示す。これらのプライマーを用い、GeneRacerキット（Invitrogen社製）の添付プロトコールに従い、ヒト肝臓由来総ＲＮＡ（Human Liver Total RNA；クロンテック社製）を鋳型として、ｃＤＮＡを増幅した。
【００７２】
ヒト肝臓において、３種類の異なる転写開始点を持つＡＢＣＡ１のｍＲＮＡを検出した。２種類は既報の末梢型（配列番号２２）および肝型（Ｌ２型）（配列番号２３）であり、新たに見いだしたヒト肝型（Ｌ３型）のＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの最初のエクソンの配列を配列番号２に示す。また、Ｌ３型のＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの塩基配列を、配列番号２４に示す。図１Ｂは、検出したＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの５’末端の模式図である。ここで末梢型と仮称したｍＲＮＡは、これまで５’−ＲＡＣＥ法を用いてヒト繊維芽細胞やヒト単球由来ＴＨＰ−１細胞から同定されたＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ［NM_005502］であり、既報のプロモーター領域（エクソン１上流、Proc. Natl. Acad. Sci. 2000； 97, 7987）により転写制御を受けると考えられる。Ｌ２型と命名したｍＲＮＡは、ヒト、マウス、ラットに共通に発現しており、エクソン２から転写が開始されるｍＲＮＡであり、既報の肝型プロモーター領域（エクソン２上流、特許文献１：非特許文献７）により転写制御を受けると考えられる。ヒト肝型（Ｌ３型）と命名したｍＲＮＡは、イントロン３中の新たなエクソン（エクソンＬ３）から転写が開始されるｍＲＮＡである。ヒトのエクソンＬ３領域に相同な領域はマウス、ラットには存在しない。
【実施例２】
【００７３】
［ヒト組織におけるＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現分布］
ヒト肝臓から得られたｍＲＮＡ（Human Liver Total RNA；クロンテック社製）を用い、ヒト末梢型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡおよびヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの存在比を調べた。ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量はエクソンＬ３領域（ヒトＬ３型特有の非翻訳領域）を認識するプライマー・プローブ、ヒト末梢型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量はエクソン１領域（末梢型特有の非翻訳領域）を認識するプライマー・プローブ、また総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量はタンパク質をコードするエクソン１２領域の配列を基に作成したプライマー・プローブを用いて、ヒト肝型ＡＢＣＡ１ ｃＤＮＡを標準品とした検量線を作成し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量した。各試料中のｍＲＮＡ量は、それぞれ１８ＳＲＮＡまたはＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対して正規化を行った。以下に、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１検出用プローブおよび総ＡＢＣＡ１検出用プローブの配列を示す。
【００７４】
・ヒトＬ３型ＡＢＣＡ１検出用標識プローブ（配列番号１４）
FAM-TGCCTGCTTTCAGAGTGCTCAATGTGC -TAMRA
・ヒトＬ３型ＡＢＣＡ１検出用フォワードプライマー（配列番号１２）
GCACTATGCTAAGGCTGGGAAT
・ヒトＬ３型ＡＢＣＡ１検出用リバースプライマー（配列番号１３）
TCGTGCTTTATCTGGTTCACTTCT
・ヒト末梢型ＡＢＣＡ１検出用標識プローブ（配列番号２５）
FAM- TTCCCCGGTTCTGTTTTCTCCCCTT -TAMRA
・ヒト末梢型ＡＢＣＡ１検出用フォワードプライマー（配列番号２６）
GGCGCTTTGCTCCTTGTTT
・ヒト末梢型ＡＢＣＡ１検出用リバースプライマー（配列番号２７）
TCTCTTTCTCCTACCCCTTGACA
・ヒト総ＡＢＣＡ１検出用標識プローブ（配列番号２８）
FAM-ACACCTGGAGAGAAGCTTTCAACGAGACTAACC -TAMRA
・ヒト総ＡＢＣＡ１検出用フォワードプライマー（配列番号２９）
TGTCCAGTCCAGTAATGGTTCTGT
・ヒト総ＡＢＣＡ１検出用リバースプライマー（配列番号３０）
AAGCGAGATATGGTCCGGATT
【００７５】
ヒト各組織（肝臓、筋肉、腎臓、膵臓、心臓、脳、胎盤および肺）から得られたｍＲＮＡ（ヒトＭＴＣパネルＩ；クロンテック社製）を用い、各組織における総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡおよびヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの分布をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量し、骨格筋の存在量に対する相対比で示した（図２）。総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡも肝臓は骨格筋の２倍程度発現していたが、Ｌ３型は、ほぼ肝臓に特異的に発現しており、ヒト肝型（Ｌ３型）と呼ぶことにした。
【実施例３】
【００７６】
［ヒト肝臓における肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの存在比］
ヒト肝臓から得られたｍＲＮＡ（クロンテック社製）４例について、ヒト末梢型およびＬ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡを定量して、総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量と比較したところ、末梢型は３３．４±５．５％存在するのに対し、Ｌ３型は２６．３±９．４％存在していた。
【実施例４】
【００７７】
［ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ発現のスタチン系薬剤による誘導］
ヒト肝ガン由来細胞ＪＨＨ−５は１０％のＦＣＳを含むＷｉｌｌｉａｍｓ培地で培養し、被験化合物を含む無血清培地（０．２％ＢＳＡ）で２４時間処理した。被験化合物として、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤・スタチンの一種であるコンパクチン（最終濃度５０μＭ）を添加し、溶剤のみを添加したものを対照とした。細胞からＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを調製した。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより、調製したＲＮＡ中における総ＡＢＣＡ１およびＬ３型のＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量を測定した。各試料中のｍＲＮＡ量は、それぞれ１８ＳＲＮＡまたはＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対して正規化を行った。
【００７８】
ヒト肝ガン由来細胞ＪＨＨ−５細胞を５０μＭのコンパクチンで処理すると、総ＡＢＣＡ１ｍＲＮＡ量が増加した（図３Ａ）。コンパクチン処理した細胞では、末梢型のＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡは低下していたが（図３Ｃ）、Ｌ３型のＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量が増加していた（図３Ｂ）。したがって、Ｌ３型のＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量を指標に、肝臓でのＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ発現を調整する作用を有する物質をスクリーニングすることの有用性が示された。
【実施例５】
【００７９】
［ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの機能］
ヒト肝ガン由来細胞ＪＨＨ−５細胞を、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡで３２時間処理し、次いで５０μＭのコンパクチンを含む無血清培地（０．２％ＢＳＡ）で１６時間処理した。対照としてＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｈｉｇｈ ＧＣ（インビトロゲン社製）を用いた。細胞を可溶化してＡＢＣＡ１蛋白質の発現量をウェスタンブロットで測定した。あるいはＲＮＡｉ処理後に、細胞の培地に［３Ｈ］コレステロールを添加して２４時間培養し、洗浄した後に５０μＭのコンパクチンで１６時間処理した。次いでアポリポタンパクＡ−Ｉを添加あるいは非添加の培地で６時間培養し、アポリポタンパクＡ−Ｉに依存した培地へのコレステロール排出量を測定した。以下に、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１に対するｓｉＲＮＡの配列を示す。
【００８０】
・ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１に対するｓｉＲＮＡ センス１（配列番号３１）
AACCCAGGCACACUCCUCCUGUAGC
・ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１に対するｓｉＲＮＡ アンチセンス１（配列番号３２）
GCUACAGGAGGAGUGUGCCUGGGUU
【００８１】
ＪＨＨ−５細胞のＬ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡを用いてノックダウンすると、ＡＢＣＡ１蛋白発現は図４Ａに示すように低下した。またアポリポタンパクＡ−Ｉに依存した培地へのコレステロール排出（ＨＤＬ産生）は、約５０％低下した（図４）。したがって、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡは、機能的でＨＤＬ産生に寄与しているＡＢＣＡ１蛋白をコードすることが判明した。
【実施例６】
【００８２】
［コンパクチンによる新規なヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター・エンハンサーの活性化］
ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの発現調節領域の解析を行った。ヒトゲノムＤＮＡから、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの転写開始点（配列番号１のヒトＡＢＣＡ１ ＤＮＡの３８４８１位）の上流４２６塩基から下流４８０塩基まで（配列番号３）をクローニングし、得られた領域を、ホタルルシフェラーゼベクターｐＧＬ３（プロメガ社製）に組み込み、プロモーターのレポータープラスミドを構築した。プラスミドの構築の模式図を図５に、レポータープラスミドの構成を図６（ｂ）に示す。以降の図面において、図中の数字は、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの転写開始点からの塩基の位置を示し、プラスは転写開始点から下流、マイナスは転写開始点から上流を示す。また、イントロン３に属する部分配列であるＬ３型ｍＲＮＡの転写開始点の下流３１０３塩基から３３７８塩基まで（配列番号６）をクローニングし、上記プロモーターのレポータープラスミドのルシフェラーゼ遺伝子下流に組み込み、プロモーター・エンハンサーのレポータープラスミドを構築した。プロモーター・エンハンサーのレポータープラスミドの構成を図６（ｃ）に示す。図６（ａ）は、コントロールとして用いた、プロモーターもエンハンサーも組み込まないプラスミドの構成である。
【００８３】
また、上記Ｌ３型転写開始点の下流３１０３塩基から３３７８塩基（配列番号６）をＳＶ−４０プロモーターを有するホタルルシフェラーゼベクター（プロメガ社製）に組み込み、エンハンサーレポータープラスミドを構築した。レポータープラスミドの構成を図７（ｂ）に示す。図７（ａ）は、コントロールとして用いた、ＳＶ−４０プロモーターを有するが、エンハンサーを組み込まないプラスミドの構成である。
【００８４】
ＪＨＨ−５細胞への一過性トランスフェクションにより、レポータープラスミドおよび遺伝子導入効率補正用のウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミドｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社製）を形質導入し、５０μＭのコンパクチンを含む５％の脱脂血清培地で１６時間処理した。対照として、同様に溶剤（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））で処理した。その後、細胞を回収し、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社製）により細胞内ルシフェラーゼ活性を測定した。なお、転写活性は次のように定義して評価した。
（転写活性）＝（ホタルルシフェラーゼ活性測定値）／（ウミシイタケルシフェラーゼ活性測定値）
【００８５】
さらに、スタチン系薬剤で処理する代わりに、活性型ＳＲＥＢＰ２を過剰発現させた際の転写活性も測定した。活性型ＳＲＥＢＰ２は、エンハンサーレポータープラスミドに加えて、ｐＭＥ−ＳＲＥＢＰ２（１−４８０）（J. Biol. Chem. 2003; 278, 36176）を導入し、過剰発現した。ｐＭＥ−ＳＲＥＢＰ２（１−４８０）プラスミドは、活性型ＳＲＥＢＰ２であるＳＲＥＢＰ２のアミノ酸残基１〜４８０を発現することができるベクターである。対照として空ベクターｐＭＥ−１８Ｓプラスミドを共導入した（図７中のｍｏｃｋ）。
【００８６】
ＪＨＨ−５細胞をコンパクチン処理することにより、ヒト肝型（Ｌ３型）転写開始点上流領域を組み込んだレポータープラスミドの転写活性はわずかに上昇した（図６（ｂ））。さらに転写開始点下流領域を組み込んだレポータープラスミドの転写活性は、コンパクチン処理により大きく増大した（図６（ｃ））。この結果は、スタチン系薬剤によるＬ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの応答（実施例４、図３Ｃ）とよく一致した。Ｌ３型下流領域（エンハンサー領域）は人工のＳＶ−４０プロモーターを有するレポータープラスミドに組み込んだ場合でも、コンパクチン処理により活性を大きく増大させるエンハンサー活性を示した（図７（ｂ））。しかしながら、エンハンサー活性はＳＲＥＢＰ２の過剰発現により影響されなかった。したがって、該肝臓型転写開始点上流領域（プロモーター領域）および下流領域（エンハンサー領域）が肝臓でのＡＢＣＡ１遺伝子発現を制御していることが示された。また、スタチン系薬物による活性化は、ＳＲＥＢＰ２が直接活性化するＬ２プロモーターとは異なるメカニズムによることが示された。
【実施例７】
【００８７】
［ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサー活性を調節する配列］
実施例６で得られたＬ３型ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサーの配列について、５’側ならびに３’側を短縮したレポータープラスミド、ならびにエンハンサー配列を部分的に欠失したプラスミドを作成した（図９）。図９（ａ）はエンハンサー配列を組み込まなかったプラスミドであり、図９（ｂ）は図６（ｃ）と同様に配列番号６に示すエンハンサー配列を組み込んだプラスミドである。図９（ｃ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３３７８塩基（配列番号７に示す）を、図９（ｄ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１８４塩基から３３７８塩基を、図９（ｅ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３２５９塩基（配列番号８）を、図９（ｆ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３２４６塩基を、図９（ｇ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３２２８塩基、及び３２４２塩基から３２５９塩基を、それぞれ組み込んだプラスミドである。実施例６に記載した方法で、これらのプラスミドをＪＨＨ−５細胞に形質導入し、５０μＭコンパクチンで処理し、転写活性を測定した。
【００８８】
実施例６で得られたＬ３型ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサーの短縮（図９（ｃ）〜（ｇ）により、Ｌ３転写開始点下流３１７２塩基から３２５９塩基まで（配列番号８）がコンパクチン処理による活性化を担うことが判明した（図９（ｅ））。さらに、図８に示す、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子中の配列ａ（配列番号９）、配列ｂ（配列番号１０）、あるいは配列ｃ（配列番号１１）を欠失すると、コンパクチンによる活性化が著しく低下することがわかった（図９（ｄ）、（ｆ）、（ｇ））。したがって、エンハンサー内に存在するこの三つの配列がヒトのＡＢＣＡ１遺伝子の転写調節に機能していると考えられる。
【実施例８】
【００８９】
［転写調節因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａによるヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサー活性の調節］
実施例６で得られたＬ３型ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサーの配列について、エンハンサー配列を部分的に欠失したプラスミドを作成した（図１０）。プロモーターとしては、ＳＶ４０を用いた。図１０（ａ）はエンハンサー配列を組み込まなかったプラスミドであり、図１０（ｂ）はＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３２５９塩基（配列番号８）を組み込んだプラスミドである。図１０（ｃ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３２４６塩基を、図１０（ｄ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１８４塩基から３２５９塩基を、図１０（ｅ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３２２９塩基及び３２４４塩基から３２５９塩基を、それぞれ組み込んだプラスミドである。実施例６に記載した方法で、これらのプラスミドをＨｅｐＧ２細胞に形質導入し、エンハンサーレポータープラスミドに加えて、転写調節因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａの発現ベクターを導入し、転写活性を測定した。ｍｏｃｋとして、空ベクターｐＣＭＶ５プラスミドを共導入した。図１１は、５０μＭのコンパクチンで処理したＪＨＨ−５細胞において、転写調節因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａ蛋白質の発現量が増加していることを示すウエスタンブロットである。コントロールでは、溶剤（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））で処理した。５０μＭコンパクチンが、ＨＮＦ４ａｌｐｈａ蛋白発現を増加させ、Ｌ３型ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター・エンハンサーを活性化し、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡを増加させることが明らかになった。また、図１０のグラフに示すように、転写調節因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａは、配列ｃに依存して、レポーター遺伝子の転写を増加することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明に係るスクリーニング方法によれば、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質を発見することができ、ＨＤＬ上昇や動脈硬化性疾患の予防治療に極めて有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肝臓においてＡＢＣＡ１遺伝子の発現を制御するプロモーター・エンハンサー領域の発見に基づき、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法に関するものである。特に、プロモーター活性の増加、あるいは特定の非翻訳領域を含むｍＲＮＡの増加を指標として、肝臓におけるＡＢＣＡ１発現の増加により動脈硬化性疾患を予防または治療する作用を有する物質をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血中高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの低下は動脈硬化の危険因子である。ＨＤＬコレステロールが１０ｍｇ／ｄＬ上昇すれば冠動脈疾患のリスクが２０〜３０％低下すると予想されている。また人工ＨＤＬ粒子が動脈硬化病巣を直接退縮する治療効果を持つことが実証され、ＨＤＬ上昇薬が待望されているが、ＨＤＬを直接上昇する薬は実用化されていない（非特許文献１、Nat Rev Drug Discov. 2005 4, 193-205）。
【０００３】
ＨＤＬは、ＡＢＣ膜トランスポーターＡ１（ＡＢＣＡ１）が細胞内のリン脂質とコレステロールを、細胞外のアポリポプロティンＡ−Ｉに輸送して形成する。ＡＢＣＡ１はＨＤＬの形成に必須の役割を持ち、機能不全をもたらす遺伝子変異はＨＤＬ欠損症の原因となる（非特許文献２、Nat. Genet. 1999; 22:352）。逆に、ＡＢＣＡ１過剰発現マウスではＨＤＬが上昇する（非特許文献３、J. Biol. Chem. 2001; 276:33969）。ＡＢＣＡ１は各組織に発現するが、肝ＡＢＣＡ１が血中ＨＤＬの８割を産生することが肝特異的欠損マウスの研究により判明した（非特許文献４、J.Clin.Invest. 2005; 115, 1333）。したがって、ＨＤＬ上昇には、肝臓においてＡＢＣＡ１の発現を増加させることが極めて有力な手段と考えられる。
【０００４】
ＡＢＣＡ１の遺伝子転写制御に関しては、マクロファージなど末梢細胞のＡＢＣＡ１遺伝子の転写はエクソン１上流のプロモーター領域（末梢型プロモーター）により制御され、このプロモーターは核内受容体ＬＸＲが直接結合して活性化されることが知られている（非特許文献５、Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 274, 794）。
【０００５】
ＬＸＲアゴニストはＡＢＣＡ１発現促進を介してＨＤＬ上昇効果を示す。しかしＬＸＲ活性化は同時に、中性脂質合成のマスターレギュレーターである転写因子ＳＲＥＢＰ−１ｃの発現を促進する。その結果、脂肪酸生合成酵素系の遺伝子発現が増加し脂肪肝や血清トリグリセリド上昇が引き起こされ、このような副作用がＬＸＲアゴニストの臨床薬としての開発の障害となっている（非特許文献６、Biochem. Pharmacol., 2009; 77, 1316-1327）。
【０００６】
発明者らはラット肝臓のＡＢＣＡ１発現は、ＬＸＲ依存の末梢型プロモーターとともに、肝臓に特異的な肝型プロモーターにより二重の制御を受けることを見いだした（非特許文献７、J. Biol. Chem. 2007; 282:21090）。すなわちラット肝臓にはエクソン２から転写が開始される肝特異的なＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ（Ｌ２）が存在しており、ＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン２上流領域が肝臓に特異的なプロモーターとして機能する。肝型プロモーターにはステロール応答配列ＳＲＥが存在しており、コレステロール減少により活性型に転換されて核内移行する転写因子ＳＲＥＢＰ−２が直接結合して活性化する機構を明らかにした。このプロモーター領域は、ラット・マウス・ヒトに共通することから、この肝型プロモーターを活性化する薬物は、ＬＸＲの活性化による副作用を示さずに肝ＡＢＣＡ１発現を促進できると考えられた。そして、発明者らは、この肝型プロモーターが、ヒトに有効なＡＢＣＡ１発現促進薬のスクリーニングに使用できることを考えた（特許文献１ 特開２００７−０８２４４５号）。
【０００７】
マクロファージや繊維芽細胞などでは、コレステロール合成の律速酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害剤スタチン系薬剤がＡＢＣＡ１発現を低下させる。これは、コレステロール合成過程で生じるＬＸＲの内因性リガンドがスタチン系薬剤の作用によって減少し、ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター活性が低下することによる（非特許文献８、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2004; 24, 2365）。しかしながら、スタチン系薬剤には、血中ＬＤＬ濃度の低下に加えて、血中ＨＤＬ濃度の上昇効果も認められており、スタチン系薬剤はヒト肝がん由来細胞ＨｅｐＧ２において、ＡＢＣＡ１遺伝子の発現促進作用を示すことも知られている（非特許文献９、Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 324, 835）。発明者らは、スタチン系薬物は肝由来細胞において末梢型プロモーターの活性を低下させる一方、肝型プロモーターを活性化することによりＡＢＣＡ１発現増加をもたらす機構を明らかにしてきた（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−０８２４４５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nat Rev Drug Discov. 2005 4, 193-205
【非特許文献２】Nat. Genet. 1999; 22:352
【非特許文献３】J. Biol. Chem. 2001; 276:33969
【非特許文献４】J. Clin. Invest. 2005; 115, 1333
【非特許文献５】Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 274, 794
【非特許文献６】Biochem. Pharmacol., 2009; 77, 1316-1327
【非特許文献７】J. Biol. Chem. 2007; 282:21090
【非特許文献８】Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2004; 24, 2365
【非特許文献９】Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 324, 835
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＡＢＣＡ１は各組織に発現するが、肝ＡＢＣＡ１が血中ＨＤＬの８割を産生することが肝特異的欠損マウスの研究により判明した（非特許文献４）。また、肝特異的なＡＢＣＡ１欠損マウスでは動脈硬化が増悪することがわかった（Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol 2009; 29:548）。したがって、肝臓においてＡＢＣＡ１の発現を増加させることが、ＨＤＬ上昇、さらには動脈硬化性疾患の予防治療に極めて重要と考えられ、肝臓におけるＡＢＣＡ１遺伝子発現の制御機構の解明、さらにはそれを利用した制御薬剤のスクリーニング方法が望まれていた。
【００１１】
以上に鑑みて、本発明の課題は、ヒト肝細胞のＡＢＣＡ１の上昇作用を有し、動脈硬化に伴う疾患の予防および／または治療に有用な医薬に用いることができる物質をスクリーニングする新規な方法を提供することにある。
【００１２】
なお、本発明の方法において用いられるヒトＡＢＣＡ１遺伝子は、Gene Bankデータベース上に「ＡＴＰ結合カセット輸送体Ａ１（ATP-binding cassette transporter A1）」として公開されている。また、国際公開第00/078972号パンフレットには、「ＡＢＣ１」をコードするものとしてヒトＡＢＣＡ１遺伝子が、またそれと共に上記のエクソン１上流のプロモーターが開示されている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、本発明の一の側面によると、プロモーター活性を有するＤＮＡ、ならびにヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡを用いることを特徴とする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法が提供される。
【００１４】
前記プロモーター活性を有するＤＮＡが、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡであることが好ましい。
【００１５】
前記ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質が、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明にかかるＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法によれば、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質、特に、動脈硬化性疾患の予防および／または治療剤を試験するための新規方法を確立することができ、ＨＤＬ上昇薬の開発に有用である。また、本発明の方法は、従来のＡＢＣＡ１遺伝子発現促進物質のスクリーニング方法に比べ、ヒトＨＤＬ上昇作用に対して、より効果的な分子を検出できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１ＡはヒトＡＢＣＡ１遺伝子の模式図を示す。模式図中の数値は、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のＤＮＡにおいて、末梢型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの転写開始点を１とした塩基位置を示すものである。図１Ｂは、５’−ＲＡＣＥ法により解析したヒト肝臓で発現するＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの５’末端の模式図を示す。括弧内は、ヒト肝臓における、各ｍＲＮＡの存在比を示す。
【図２】図２Ａは、ヒト各組織（肝臓、筋肉、腎臓、膵臓、心臓、脳、胎盤および肺）で発現する総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量を示したグラフであり、図２Ｂは、ヒト各組織で発現するヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量を示したグラフである。
【図３】図３Ａは、コンパクチンで処理したヒト肝由来培養細胞ＪＨＨ５における総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの発現量変化を示すグラフであり、図３Ｂは、コンパクチンで処理したヒト肝由来培養細胞ＪＨＨ−５におけるヒト肝型（Ｌ３）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの発現量変化を示すグラフであり、図３Ｃは、コンパクチンで処理したヒト肝由来培養細胞ＪＨＨ−５における末梢型（Ｐ）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの発現量変化を示すグラフである。
【図４】図４Ａは、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの発現をｓｉＲＮＡを用いてノックダウンしたヒト肝由来培養細胞ＪＨＨ−５における、ＡＢＣＡ１蛋白の発現量をウェスタンブロットで測定した写真であり、図４ＢはアポＡ−Ｉ依存のコレステロール細胞外排出量（ＨＤＬ産生量）を示したグラフである。
【図５】図５は、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の模式図、およびヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター・エンハンサーのレポータープラスミドの構成図である。模式図中の数値は、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のＤＮＡにおいて、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの転写開始点を１とした塩基位置を示し、転写開始点の下流をプラス、上流をマイナスで表したものである。
【図６】図６は、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター・エンハンサーがコンパクチンにより活性化されることを示すグラフである。
【図７】図７は、Ｌ３型エンハンサー配列をＳＶ−４０プロモーターを導入したルシフェラーゼプラスミドに組み込んでも、コンパクチンによる活性化が認められること、しかしＳＲＥＢＰ−２の発現増加により影響されないことを示すグラフである。
【図８】図８は、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサーに含まれる配列を示す。上の行の左端が５’側であり、下の行の右端が３’側である。
【図９】図９は、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター・エンハンサーの活性が、配列ａ、配列ｂあるいは配列ｃの欠失により消失したことを示すグラフである。
【図１０】図１０は、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサーの活性が、転写調節因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａの発現ベクターを導入することにより上昇し、配列ｃの欠失により消失したことを示すグラフである。
【図１１】図１１は、コンパクチンで処理したヒト肝由来培養細胞ＪＨＨ−５における、ＨＮＦ４ａｌｐｈａ蛋白の発現量をウェスタンブロットで測定した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施の形態によって、限定されるものではない。
【００１９】
発明者らは、ヒト肝および肝由来細胞のＡＢＣＡ１発現制御をさらに詳細に解析したところ、ヒト肝には従来から知られているマウス・ラットに共通の肝型（Ｌ２型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡに加えて、さらに別の肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡが存在することを見いだした。このヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡは、ヒト肝に存在する総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの２５％に相当しており、ヒト肝由来細胞をスタチン系薬剤で処理すると発現が促進されることを見いだした。Ｌ３型の転写開始点はエクソン２の翻訳開始点より下流であるが、Ｌ３型ｍＲＮＡは機能的ＡＢＣＡ１をコードしていることは、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡを用いてノックダウンすると、ＡＢＣＡ１蛋白質の発現が減少し、ＨＤＬ形成能も低下したという事実により確認された。
【００２０】
引き続き、対応するＬ３型プロモーター・エンハンサー領域を同定したところ、スタチン系薬物による活性化を担うエンハンサー領域は、既報のＬ２型プロモーター（特許文献１、非特許文献７）とは異なりＳＲＥＢＰ−２には応答せず、新規なメカニズムでヒトＡＢＣＡ１発現を制御することを見いだした。したがって、Ｌ３型プロモーター・エンハンサー領域はヒトで肝臓のＡＢＣＡ１発現を制御し、血中ＨＤＬレベルを調節する重要な役割をもつと考えることができる。Ｌ３型プロモーター・エンハンサー領域の活性化、あるいは新規非翻訳領域を含むＬ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの発現増加を指標とする薬物スクリーニング法は、ヒトにおいて有効なＨＤＬ上昇薬の開発に極めて有用性が高いと考えられる。
【００２１】
さらには、発明者らは、Ｌ３型エンハンサーは、Ｌ３型プロモーター以外のプロモーターを用いた場合でも、ヒトＡＢＣＡ１発現を促進することを見出した。
【００２２】
上記のヒト肝臓におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現調節に新たな制御機構が存在するという発見に基づき、ＡＢＣＡ１遺伝子発現を調節する物質を選別または同定するための方法として、新規ヒト肝型（本明細書中、Ｌ３型とも表記する）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡをコードする遺伝子の、エクソン３上流（本明細書中、エクソンＬ３とも表記する）部分を用いる方法、およびイントロン２に存在する新規ヒト肝型ＡＢＣＡ１プロモーターとイントロン３に存在するエンハンサー（本明細書中、Ｌ３型ＡＢＣＡ１プロモーター等とも表記する）を用いる方法を開発し、本発明を完成させた。
【００２３】
本発明が開示する新規ヒト肝型（Ｌ３型）プロモーターは、従来から知られている、ＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン１上流のプロモーター（国際公開第00/078972号パンフレット参照）あるいはエクソン２上流のＬ２型プロモーターとは全く異なる領域に存在し、ＤＮＡ配列も異なる。このＬ３型プロモーターに関しては、ＡＢＣＡ１遺伝子転写制御、ＨＤＬ形成との関連は報告されておらず、動脈硬化性疾患の治療または予防剤の試験法としての有用性も知られていない。上記したように、ピタバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチンがヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２においてＡＢＣＡ１のｍＲＮＡを増加させることが示されている（非特許文献９）。その作用機序については、発明者らが見いだした肝型（Ｌ２）プロモーターが想定されていた。しかし、本発明にかかる新規ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１プロモーターおよび当該プロモーターによる発現制御については、従来技術文献において、記載も示唆もしていない。同様に、本発明が開示する新規肝型ＡＢＣＡ１エンハンサーについても、これらの従来技術文献において何ら報告されたものではなく、発明者らによる今般の研究によりはじめて、明らかにされたものである。
【００２４】
本発明は、一実施の形態によると、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを用いることを特徴とする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【００２５】
本発明はまた、別の実施の形態によると、このようなスクリーニング方法に用いることができる、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとに関する。
【００２６】
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡ、およびヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡは、ヒトに由来する配列を有するものであれば、天然のものであってもよく、また人工的なものであってもよい。すなわち、本発明の別の側面によると、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の塩基配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを含んでなる組み換えＤＮＡが提供される。
【００２７】
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２は、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン２の下流かつエクソン３の上流に存在する領域であり、イントロン３はエクソン３の下流かつエクソン４の上流に存在する領域である。具体的には、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン２として、配列番号１に記載するヒトＡＢＣＡ１遺伝子のＤＮＡ配列の２４３８５位から２４５４２位の配列を有するものが、イントロン２として、配列番号１に記載の配列の２４５４３位から３８９６０位の配列を有するものが、エクソン３として、配列番号１に記載の配列の３８９６１位から３９０５４位の配列を有するものが、イントロン３として、配列番号１に記載の配列の３９０５５位から４３５８７位の配列を有するものが、およびエクソン４として、配列番号１に記載の配列の４３５８８位から４３７２９位の配列を有するものが、それぞれ見出されている。また、本明細書中、エクソンＬ３と記す領域は、配列番号１に記載の配列の３８４８１位から３８７８３位の配列を有する領域である。配列番号２にエクソンＬ３の配列を示す。なお、配列番号１は、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン１から始まる配列である。また、ヒトにおける上記イントロン２、エクソンＬ３の相同体、変異体および誘導体の配列は、当業者であれば、ヒトにおける上記イントロン２および／またはエクソン３、４の配列との相同性に基づき決定することができる。
【００２８】
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子の塩基配列の３８０５５位から３８９６０位までの塩基を含むことが好ましい。ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、特には、（ａ）配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子の塩基配列の３８０５５位から３８９６０位までの塩基（配列番号３）、配列３８０５５位から配列３９０５４位までの塩基（配列番号４）、配列３８０５５位から配列３９２２４位までの塩基（配列番号５）に記載の配列を有するＤＮＡとすることができる。
【００２９】
また、イントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、（ａ）のＤＮＡと実質的に同一の配列を有するＤＮＡとすることができる。具体的には、イントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号５のいずれかに記載の配列において、１もしくは数個（好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個）のヌクレオチドが置換、挿入または欠失された配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡの少なくとも一部とすることができる。当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、野生型プロモーターのヌクレオチド配列の部分的な置換、挿入または欠失などの改変により、野生型プロモーターと同等またはそれ以上のプロモーター活性を有するＤＮＡを調製することが可能である。
【００３０】
また、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、（ｃ）配列番号３、配列番号４、配列番号５のいずれかに記載の配列と相同性が６０％以上（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡの少なくとも一部とすることができる。このようなＤＮＡには、（ａ）のＤＮＡの、自然界に存在する変異型遺伝子もしくは人為的に改変した変異型遺伝子または異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
【００３１】
相同性の比較は、通常、容易に入手できる配列比較プログラムを用いて行うことができる。商業的に入手可能なそのようなコンピュータープログラムは２以上の配列の間の％相同性を計算することができる。ほとんどの配列比較方法においては、全体としての相同性スコアに不当にペナルティを与えることなく可能な挿入および欠失を考慮に入れて、最適な整列を生じさせるよう設計される。これは、「ギャップ」を配列の整列に挿入して、局所的な相同性を最大化するよう努めることによって達成される。このような方法では、できる限り少数のギャップにおける配列の整列が、多くのギャップにおけるものより高いスコアを達成するように、各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てて、相同性を計算する。ほとんどの整列プログラムはギャップペナルティを設定することができる。しかしながら、配列比較のためのそのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。このような配列比較を実行できるソフトウェアの例として、ＢＬＡＳＴパッケージ(Ausubel et al.,1999 ibid-Chapter18参照)、ＦＡＳＴＡ(Atschul et al.,1990,J.Mol.Biol.,403-410)およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。
【００３２】
また、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、（ｄ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、プロモーター活性を有するＤＮＡの少なくとも一部とすることができる。ここで、ＤＮＡは通常、互いに相補的な二本鎖ＤＮＡ構造を有している。このため、（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとは、（ａ）のＤＮＡのいずれかの鎖とハイブリダイズする鎖を有するＤＮＡをいうことに留意すべきである。
【００３３】
なお、ストリンジェントな条件およびハイブリダイゼーションの方法は、例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第2版, 1989に従って設定することができる。具体的には、ストリンジェントな条件は、「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」とすることができ、よりストリンジェントな条件は、「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」とすることができ、さらにストリンジェントな条件は、「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」とすることができる（１ｘＳＳＣ：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）。ただし、これらの条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記または他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３４】
なお、（ｂ）〜（ｄ）のＤＮＡのプロモーター活性は、例えば、以下に詳細に説明するように、ルシフェラーゼアッセイ法等により測定することができる。また、（ｂ）〜（ｄ）のＤＮＡは、（ａ）のＤＮＡと「同様」のプロモーター活性を有することが好ましい。ここで、「同様」のプロモーター活性を有するとは、質的に類似のプロモーター活性を有することをいい、例えば、（ｂ）〜（ｄ）のＤＮＡが、（ａ）のＤＮＡと少なくとも１つの因子について同一の制御を受ける場合が含まれる。一方で、「同様」のプロモーター活性を有するとは、量的に同程度のプロモーター活性を有することを意図するものではない。また、当業者には明らかなように、プロモーター活性を発揮するために、ＤＮＡは、配列番号３、配列番号４、配列番号５のいずれかに記載の配列（またはこれと実質的に同一の配列）の全てを有する必要はなく、その一部であってもよい。上記したように、プロモーター活性を有するのに必要な領域は、当業者であれば、ルシフェラーゼアッセイ法等により適宜決定することができる。
【００３５】
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の塩基配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡは、（ｅ）配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子において、Ｌ３型ｍＲＮＡの転写開始位置（配列番号１のヒトＡＢＣＡ１ ＤＮＡの３８４８１位）下流３１０３位から下流３３７８位までの塩基（配列番号６）を含むことが好ましく、配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子において、Ｌ３型ｍＲＮＡの転写開始位置から下流３１７２位から下流３３７８位までの塩基（配列番号７）を含むことがさらに好ましく、配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子において、Ｌ３型ｍＲＮＡの転写開始位置から下流３１７２位から下流３２５９位までの塩基（配列番号８）を含むことが最も好ましい。
【００３６】
さらには、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の塩基配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡは、配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子において、Ｌ３型ｍＲＮＡの転写開始位置から３１７２位から３３８３位までの塩基（配列番号９）と、Ｌ３型ｍＲＮＡの転写開始位置から３２３０位から３２４３位までの塩基（配列番号１０）と、Ｌ３型ｍＲＮＡの転写開始位置から３２４４位から３２５６位までの塩基（配列番号１１）をすべて有するＤＮＡであることが必要である。
【００３７】
これらの３つの配列が保持される限り、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の塩基配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡは、（ｆ）配列番号６、配列番号７、配列番号８のいずれかに記載の好ましいＤＮＡの配列において、１もしくは数個（好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個）のヌクレオチドが置換、挿入または欠失された配列であってもよい。
また、これらの３つの配列が保持される限り、（ｇ）配列番号６、配列番号７、配列番号８のいずれかに記載の配列と相同性が６０％以上（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の配列を有するものであってもよい。相同性の比較に関しては、（ｃ）のＤＮＡについて述べたのと同様にして行うことができる。
さらに、これらの３つの配列が保持される限り、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の塩基配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡは、（ｈ）配列番号６、配列番号７、配列番号８のいずれかに記載の好ましいＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンハンサー活性を有するＤＮＡの少なくとも一部とすることができる。
【００３８】
上記に配列を示したもの以外であっても、本願発明において、エンハンサー活性を有するのに必要な領域は、当業者であれば適宜決定することができる。エンハンサー活性は、例えば、以下に詳細に説明するように、ルシフェラーゼアッセイ法、ＣＡＴ法等により測定することができる。
【００３９】
次に、本発明の一実施の形態による、これらのＤＮＡを用いた、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法において用いることができる、組換えＤＮＡについて説明する。組換えＤＮＡは、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを含んでなる。
【００４０】
プロモーター活性を有するＤＮＡとしては、上記において説明した、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることができる。さらには、プロモーター活性を有するＤＮＡとしては、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子に由来する配列を有するものに限定されず、任意のプロモーターの塩基配列を有するものを用いることができる。当業者には既知のプロモーターとしては、例えば、ＳＶ−４０プロモーター、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＥＦプロモーター、ＣＡＧプロモーターが挙げられるが、これらには限定されない。
いっぽう、エンハンサー活性を有するＤＮＡとしては、上記において説明した、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡを用いることができる。
【００４１】
これらのプロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとは、組換えＤＮＡにおいては、任意の組み合わせで用いることができる。すなわち、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）のいずれかから選択されるプロモーター活性を有するＤＮＡもしくはその他の任意プロモーター活性を有するＤＮＡと、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）のいずれかから選択されるエンハンサー活性を有するＤＮＡとを、任意の組み合わせで含む組換えＤＮＡとすることができる。
【００４２】
なお、本発明にかかる組換えＤＮＡにおいて、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡを用いる場合でも、そのほかに転写最小プロモーターをさらに有することができる。最小プロモーターの例として、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明にかかるＤＮＡは、ゲノムライブラリーからの選別や、ゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により取得できる。ゲノムライブラリーからの選別は、適当なベクターに組み込んだゲノムＤＮＡと、目的のＤＮＡの一部の配列を有する標識ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって行うことができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第2版, 1989に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。また、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲは、目的のＤＮＡの一部の配列を有するプライマーを用いて行うことができる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素またはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法による改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。
【００４４】
本発明の他の側面によると、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを有する組換えベクターが提供される。組換えベクターは、当該プロモーター活性を有するＤＮＡ、及びエンハンサー活性を有するＤＮＡに作動可能に連結した構造遺伝子をさらに有してもよい。以下に詳細に説明するように、構造遺伝子は、例えば、組換えベクターをスクリーニングに用いる場合、その転写量および／または発現量を測定できるものであれば、任意の遺伝子でよい。
【００４５】
本発明にあっては、ベクターは、任意のベクター、例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどであってよい。より具体的には、本発明に用いることができるベクターの例として、動物細胞用のベクターであるｐＣＤベクター、ｃＤＭ８ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノアソシエイトウイルスベクターなどや、細菌用のベクターであるｐＵＣなどを挙げることができる。構造遺伝子をベクター内に組み込むためには、構造遺伝子が正しく転写される方向に、さらにプロモーターおよびエンハンサーが構造遺伝子に対して適正に機能する位置関係になる様に、プロモーター領域の下流であって、エンハンサー領域の上流に構造遺伝子を連結すればよい。プロモーターと構造遺伝子との連結、及びエンハンサーと構造遺伝子との連結は、制限酵素切断部位を利用して行うことができる。また、適当な制限酵素部位がなくてもリガーゼ反応を用いて行うことができる。
【００４６】
なお、「作動可能に連結」とは、一の遺伝子要素が、他の遺伝子要素に対して予測されるように機能できるように配置されていることをいう。例えば、プロモーターが、構造遺伝子の転写の開始を助ける場合には、プロモーターは構造遺伝子に作動可能に結合している。同様に、エンハンサーが構造遺伝子の転写を促進する場合には、エンハンサーが構造遺伝子に作動可能に結合している。この機能的な関係が維持される限り、プロモーターと構造遺伝子との間、あるいは構造遺伝子とエンハンサーとの間に残基が介在してもよい。
【００４７】
本発明の他の側面によると、プロモーター活性を有する外因性のＤＮＡ及びヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有する外因性のＤＮＡに作動可能に連結した構造遺伝子を有する形質転換体が提供される。本明細書において、形質転換体は、広く、外部からＤＮＡが導入された結果、新しい形質を獲得した生物をいう。形質転換体は、任意の生物であってよく、また、任意の生物に由来する任意の細胞または組織であってよい。特に、本発明にかかる形質転換体は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を含む。
【００４８】
組換えベクターにより形質転換することができる宿主の例として、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などを挙げることができる。これらの宿主への形質転換の方法の例として、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターによる遺伝子導入法、マイクロインジェクション法などを挙げることができる。
【００４９】
本発明の他の側面によると、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質をスクリーニングするためのキットが提供される。本発明にかかるキットは、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質をスクリーニングするために用いることができる。以下に詳細に説明するように、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを用いることで、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明にかかるキットは、上記組換えベクターおよび／または上記形質転換体を有する。
【００５０】
本発明にかかるキットには、スクリーニングの方法に応じて、酵素、酵素基質、緩衝液等の試薬、培地、道具等を組み合せることができる。酵素基質の例として、ルシフェリン、ＡＴＰ、［14Ｃ］クロラムフェニコール、アセチルＣｏＡを挙げることができる。緩衝液として、解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液を適宜選択することができる。道具の例として、ＴＬＣ用展開シート、メンブレン等を挙げることができる。
【００５１】
本発明の他の側面によると、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質、特に、肝臓においてヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法が提供され、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質を探索するために用いることができる。本発明にかかるスクリーニング方法は、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを用いることを特徴とする。
【００５２】
具体的には、本発明にかかるスクリーニング方法は、
被検物質を供するステップと、
プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとに作動可能に連結した構造遺伝子を有するＤＮＡを有する細胞または生物の複数の群を供するステップと、
前記被検物質を前記細胞または生物の少なくとも１つの群に接触させるステップと、
前記被検物質を接触させた群と接触させなかった群とにおいて、前記遺伝子の転写量および／または発現量を測定するステップと、
前記被検物質を接触させた群と接触させなかった群の前記転写量および／または発現量を比較するステップと
を含むことが好ましい。
【００５３】
被検物質として、単一の化合物または組成物、天然または合成化合物、有機または無機化合物、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、細胞抽出物、細胞培養上清、その他の任意の物質を供することができる。
【００５４】
スクリーニングは、インビトロおよびインビボのいずれでも行うことができる。本発明にかかるスクリーニング方法において用いられる細胞または生物として、細菌等の原核生物（大腸菌等）、酵母（サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライヴェロマイセス(Kluyveromyces)属等）、昆虫、植物もしくは動物またはこれらに由来する細胞が挙げられる。動物の例として、恒温動物、特にヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等の哺乳動物を挙げることができる。本発明で用いられる細胞は、実験室で培養することのできる培養細胞であることが好ましく、初代培養肝細胞であることがさらに好ましい。細胞は、恒温動物、特にヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等の哺乳動物に由来することができ、ヒトに由来することが好ましい。また、細胞は、肝臓に由来することが好ましい。
【００５５】
本発明に用いられる細胞または生物は、プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとに作動可能に連結した構造遺伝子を有するＤＮＡを有することが好ましい。当該ＤＮＡは、内因性であっても、または外因性であってもよい。外因性である場合、当該ＤＮＡは、任意の手段により細胞または生物に導入されてもよい。例えば、スクリーニングに培養細胞を用いる場合、培養細胞への当該ＤＮＡの導入方法として、本発明の属する技術分野において汎用される任意の方法を採用することができる。例えば、ＤＮＡの導入方法の例として、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス穿孔法等が挙げられるが、これらに限定されない。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて至適化されたトランスフェクション条件を用いることが好ましい。
【００５６】
構造遺伝子は、その転写量および／または発現量を測定できるものであれば、任意の遺伝子でよい。当業者に明らかなように、上記構造遺伝子は、その転写量および／または発現量の測定方法に応じて、適宜選択することができる。上記構造遺伝子の例として、ヒトＡＢＣＡ１、所定の活性を有するタンパク質（ルシフェラーゼ等）、所定の抗体が結合できるタンパク質、所定の物質が特異的に結合できるタンパク質（ＧＳＴ等）等をコードする遺伝子を挙げることができ、特に、ホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼおよび緑色蛍光蛋白質からなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子（いわゆるレポーター遺伝子）を挙げることができる。
【００５７】
被検物質を細胞または生物に接触させることは、当業者に明らかなように、任意の方法により行うことができる。例えば、培養細胞を用いる場合、被検物質を培地中に添加することで、接触させることができる。すなわち、培養細胞を用いる場合、細胞を、被検物質の存在下または非存在下で培養することが好ましい。また、動物を用いる場合は、任意の手段による投与により、例えば、任意の経路からの注射により、接触させることができる。被検物質を細胞または生物へ接触させる時間は、被験物質の効果、濃度、細胞または生物の種類および技術的考慮に応じて、適宜設定することができる。また、被験物質の濃度は、その毒性、透過性、細胞数、処理時間等に応じて、適宜設定することができ、通常１ｎＭ〜１ｍＭであることが好ましい。培養細胞を用いる場合、一般的にこのような処理は、多くの試験を同時に実施できるマルチウェルプレートで実施することが好ましい。培養細胞を用いる場合、被験化合物の処理によるレポーター遺伝子の発現が測定可能な条件は、細胞が生存してレポーター遺伝子の発現産物が生産可能な条件であれば良い。特に好ましい条件にあっては、好ましくは使用される細胞株に適した培地を使用し、４〜６％の炭酸ガス存在下、３６〜３８℃で５〜７２時間培養する。
【００５８】
被検物質を接触させた群と接触させなかった群とにおいて、上記構造遺伝子の転写量および／または発現量を測定し、これらの転写量および／または発現量を比較することで、当該被検物質を、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質の候補物質とすることができるか否か判断することができる。具体的には、ある被検物質を接触させた群で、接触させなかった群と比べて、上記遺伝子の転写量および／または発現量が変化した場合、特に増加した場合、当該被検物質を候補物質とすることができる。
【００５９】
被検物質を接触させた群と接触させなかった群とにおいて、上記構造遺伝子の転写量および／または発現量を測定するステップと、被検物質を接触させた群と接触させなかった群の転写量および／または発現量を比較するステップは、当業者に明らかなように、任意の方法により行うことができる。具体的には、ノーザンブロッティング法、ＤＮＡアレイ法等により、上記遺伝子の転写量を測定することができる。また、ルシフェラーゼアッセイ法やＣＡＴ法等により、上記遺伝子の発現量を測定することができる。さらに、上記所定の遺伝子に対する抗体が入手可能な場合は、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、ウエスタンブロッティング法により、当該遺伝子の発現量を測定することができる。また、上記所定の遺伝子として、ＧＳＴ等の所定の物質に特異的に結合するタンパク質の遺伝子を用いる場合は、当該タンパク質を沈降させ、沈降したタンパク質の量を測定することで、上記遺伝子の発現量を測定することができる。
【００６０】
［ノーザンブロッティング法］
ノーザンブロッティング法は、変性したＲＮＡを変性条件下のアガロース電気泳動で分離し、ニトロセルロースフィルターに移して、標識した特異的なプローブで検出するものである。ＲＮＡを変性させるのは、ＲＮＡは分子内に二次構造を持つため、そのままではサイズに従った正確な分離ができず、さらに、フィルターは一本鎖の核酸しか結合できないためである。
【００６１】
［ルシフェラーゼアッセイ法、ＣＡＴ法］
ルシフェラーゼアッセイ法およびＣＡＴ法は、目的とする遺伝子の転写調節領域の下流にレポーターとしてＬＵＣ（ルシフェラーゼ）またはＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を組み込んだプラスミドを作成し、そのプラスミドを導入した細胞の酵素活性を測定するものである。具体的には、ルシフェラーゼアッセイ法は、マグネシウム存在下、ルシフェラーゼがルシフェリンとＡＴＰから酸化ルシフェリンとＡＭＰを作る反応を触媒する際に発する波長５６０ｎｍの光を、ルミノメーターを使って検出するものである。ＣＡＴ法の場合、基質の［１４Ｃ］クロラムフェニコールが、ＣＡＴによりアセチル化されて、［１４Ｃ］アセチルクロラムフェニコールが産生される。このサンプルを酢酸エチルで抽出し、薄層のシリカゲルプレート上に展開後、移動度の異なるスポットの放射活性を測定する。
【００６２】
本発明の他の側面によると、上記スクリーニング方法によりスクリーニングされた、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質、特に、肝臓においてヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質が提供される。特に、上記したように、本発明にかかるスクリーニング方法によると、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を促進する物質をスクリーニングすることができる。このため、本発明の他の側面によると、上記スクリーニング方法によりスクリーニングされた、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質が提供される。
【００６３】
また、本発明のさらに他の側面によると、ヒトの新規肝型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの５’側領域をコードする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の新規エクソンＬ３中の配列に基づいて作成したプライマーを用いてヒトＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現量を測定することを特徴とする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法が提供される。
【００６４】
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の新規エクソンＬ３は、配列番号２に示すものであって、配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子の塩基配列の３８４８１位から３８７８３位までの３０３塩基に対応する。本実施形態において用いられるプライマーは、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子において、新規エクソンＬ３の上流および下流の配列の一部と実質的に相補的なプライマー対であればよく、プライマー配列の長さおよびヒトＡＢＣＡ１遺伝子のどの部位と実質的に相補的であるかなどは特に限定されない。ここで、実質的に相補的とは、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の配列とアニールできる程度に相補的であればよいことを意味する。たとえば、これらのプライマーは、５’側又は３’側、又はその両方に、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとアニールできる限り、本発明のプライマーに含まれるものとする。また、非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子と相補的でないミスマッチ配列を持つプライマーを使用することができる。また、プライマーは、検出のために標識されていてもよく、例えば、プライマーは、放射性同位体、蛍光物質、酵素、その他の化学物質等により標識されていてもよい。
【００６５】
具体的には、好ましいヒトＬ３型ＡＢＣＡ１検出用フォワードプライマーとしては、配列番号１２に記載されているものが挙げられるが、これらには限定されない。また、ヒトＬ３型ＡＢＣＡ１検出用リバースプライマーとしては、配列番号１３に記載されているものが挙げられるが、これらには限定されない。また、これらのプライマーと組み合わせて使用しうる好ましいプローブとしては、配列番号１４に記載されるものを使用することができる。ほかに、好ましいプローブ、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせとして、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７に記載されたものが、さらに別の好ましいプローブ、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせとして、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０に記載されたものが挙げられる。
【００６６】
これらのＰＣＲプライマーを用いてヒトＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現量を測定することを特徴とする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法は、
被検物質を供するステップと、
プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとに作動可能に連結した構造遺伝子を有するＤＮＡを有する細胞または生物の複数の群を供するステップと、
前記被検物質を前記細胞または生物の少なくとも１つの群に接触させるステップと、
前記被検物質を接触させた群と接触させなかった群とにおいて、前記遺伝子の転写量および／または発現量を測定するステップであって、ＰＣＲプライマーを用いてヒトＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現量を測定することを特徴とするステップと、
前記被検物質を接触させた群と接触させなかった群の前記転写量および／または発現量を比較するステップと
を含むことが好ましい。
【００６７】
具体的には、かかる方法は、既に説明したプロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを用いる、スクリーニング方法に準じて行うことができる。ＰＣＲプライマーを用いてヒトＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現量を測定するステップにおいては、好ましくは、配列番号１２、１３に記載のプライマー対を用いて、ヒト新規肝型ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現量を測定する。かかるスクリーニング方法によれば、肝臓においてヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質、さらにはヒトにおいて動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質を提供することができる。
【００６８】
また、本発明の他の側面によると、転写因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａの量あるいは活性を変化させる作用を有する物質を含有する、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写調整剤が提供される。転写因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａの量あるいは活性を変化させる作用を有する物質は、フォルスコリン、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ｃＡＭＰアナログなど、細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させることでＨＮＦ４ａｌｐｈａの転写コアクチベーターとして働くＰＧＣ−１ａｌｐｈａの発現を上昇させる物質も含む。このような、転写調整因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａの発現量や活性を増加する物質は、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡを増加することが期待される。
【００６９】
本実施の形態による、転写因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａの量あるいは活性を変化させる作用を有する物質を含有する、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写調整剤は、本発明の一実施の形態として説明した、肝臓においてヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法により、同定することができる。さらに具体的には、スクリーニング方法において、特に、エンハンサーとして、配列番号１に示すヒトＡＢＣＡ１遺伝子のＬ３型ｍＲＮＡの転写開始位置から３２４４位から３２５６位までの塩基（配列番号１１）を含む配列を用いることにより同定することができる。かかる配列を含むものであれば、エンハンサー配列の長短は問わず、また、プロモーターも任意のものであってよい。
【００７０】
本発明は以下の実施例においてより具体的に説明される。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
【実施例１】
【００７１】
［ヒト肝臓で発現するＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの検出］
５’−ＲＡＣＥ法により、ヒト肝臓で発現しているＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの５’末端領域を解析した。プライマーはＡＢＣＡ１のｍＲＮＡエクソン４およびエクソン５の配列を基に設計した。配列番号２１に、用いた遺伝子特異的プライマーの配列を示す。これらのプライマーを用い、GeneRacerキット（Invitrogen社製）の添付プロトコールに従い、ヒト肝臓由来総ＲＮＡ（Human Liver Total RNA；クロンテック社製）を鋳型として、ｃＤＮＡを増幅した。
【００７２】
ヒト肝臓において、３種類の異なる転写開始点を持つＡＢＣＡ１のｍＲＮＡを検出した。２種類は既報の末梢型（配列番号２２）および肝型（Ｌ２型）（配列番号２３）であり、新たに見いだしたヒト肝型（Ｌ３型）のＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの最初のエクソンの配列を配列番号２に示す。また、Ｌ３型のＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの塩基配列を、配列番号２４に示す。図１Ｂは、検出したＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの５’末端の模式図である。ここで末梢型と仮称したｍＲＮＡは、これまで５’−ＲＡＣＥ法を用いてヒト繊維芽細胞やヒト単球由来ＴＨＰ−１細胞から同定されたＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ［NM_005502］であり、既報のプロモーター領域（エクソン１上流、Proc. Natl. Acad. Sci. 2000； 97, 7987）により転写制御を受けると考えられる。Ｌ２型と命名したｍＲＮＡは、ヒト、マウス、ラットに共通に発現しており、エクソン２から転写が開始されるｍＲＮＡであり、既報の肝型プロモーター領域（エクソン２上流、特許文献１：非特許文献７）により転写制御を受けると考えられる。ヒト肝型（Ｌ３型）と命名したｍＲＮＡは、イントロン３中の新たなエクソン（エクソンＬ３）から転写が開始されるｍＲＮＡである。ヒトのエクソンＬ３領域に相同な領域はマウス、ラットには存在しない。
【実施例２】
【００７３】
［ヒト組織におけるＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現分布］
ヒト肝臓から得られたｍＲＮＡ（Human Liver Total RNA；クロンテック社製）を用い、ヒト末梢型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡおよびヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの存在比を調べた。ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量はエクソンＬ３領域（ヒトＬ３型特有の非翻訳領域）を認識するプライマー・プローブ、ヒト末梢型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量はエクソン１領域（末梢型特有の非翻訳領域）を認識するプライマー・プローブ、また総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量はタンパク質をコードするエクソン１２領域の配列を基に作成したプライマー・プローブを用いて、ヒト肝型ＡＢＣＡ１ ｃＤＮＡを標準品とした検量線を作成し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量した。各試料中のｍＲＮＡ量は、それぞれ１８ＳＲＮＡまたはＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対して正規化を行った。以下に、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１検出用プローブおよび総ＡＢＣＡ１検出用プローブの配列を示す。
【００７４】
・ヒトＬ３型ＡＢＣＡ１検出用標識プローブ（配列番号１４）
FAM-TGCCTGCTTTCAGAGTGCTCAATGTGC -TAMRA
・ヒトＬ３型ＡＢＣＡ１検出用フォワードプライマー（配列番号１２）
GCACTATGCTAAGGCTGGGAAT
・ヒトＬ３型ＡＢＣＡ１検出用リバースプライマー（配列番号１３）
TCGTGCTTTATCTGGTTCACTTCT
・ヒト末梢型ＡＢＣＡ１検出用標識プローブ（配列番号２５）
FAM- TTCCCCGGTTCTGTTTTCTCCCCTT -TAMRA
・ヒト末梢型ＡＢＣＡ１検出用フォワードプライマー（配列番号２６）
GGCGCTTTGCTCCTTGTTT
・ヒト末梢型ＡＢＣＡ１検出用リバースプライマー（配列番号２７）
TCTCTTTCTCCTACCCCTTGACA
・ヒト総ＡＢＣＡ１検出用標識プローブ（配列番号２８）
FAM-ACACCTGGAGAGAAGCTTTCAACGAGACTAACC -TAMRA
・ヒト総ＡＢＣＡ１検出用フォワードプライマー（配列番号２９）
TGTCCAGTCCAGTAATGGTTCTGT
・ヒト総ＡＢＣＡ１検出用リバースプライマー（配列番号３０）
AAGCGAGATATGGTCCGGATT
【００７５】
ヒト各組織（肝臓、筋肉、腎臓、膵臓、心臓、脳、胎盤および肺）から得られたｍＲＮＡ（ヒトＭＴＣパネルＩ；クロンテック社製）を用い、各組織における総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡおよびヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの分布をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量し、骨格筋の存在量に対する相対比で示した（図２）。総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡも肝臓は骨格筋の２倍程度発現していたが、Ｌ３型は、ほぼ肝臓に特異的に発現しており、ヒト肝型（Ｌ３型）と呼ぶことにした。
【実施例３】
【００７６】
［ヒト肝臓における肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの存在比］
ヒト肝臓から得られたｍＲＮＡ（クロンテック社製）４例について、ヒト末梢型およびＬ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡを定量して、総ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量と比較したところ、末梢型は３３．４±５．５％存在するのに対し、Ｌ３型は２６．３±９．４％存在していた。
【実施例４】
【００７７】
［ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ発現のスタチン系薬剤による誘導］
ヒト肝ガン由来細胞ＪＨＨ−５は１０％のＦＣＳを含むＷｉｌｌｉａｍｓ培地で培養し、被験化合物を含む無血清培地（０．２％ＢＳＡ）で２４時間処理した。被験化合物として、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤・スタチンの一種であるコンパクチン（最終濃度５０μＭ）を添加し、溶剤のみを添加したものを対照とした。細胞からＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを調製した。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより、調製したＲＮＡ中における総ＡＢＣＡ１およびＬ３型のＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量を測定した。各試料中のｍＲＮＡ量は、それぞれ１８ＳＲＮＡまたはＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対して正規化を行った。
【００７８】
ヒト肝ガン由来細胞ＪＨＨ−５細胞を５０μＭのコンパクチンで処理すると、総ＡＢＣＡ１ｍＲＮＡ量が増加した（図３Ａ）。コンパクチン処理した細胞では、末梢型のＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡは低下していたが（図３Ｃ）、Ｌ３型のＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量が増加していた（図３Ｂ）。したがって、Ｌ３型のＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ量を指標に、肝臓でのＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡ発現を調整する作用を有する物質をスクリーニングすることの有用性が示された。
【実施例５】
【００７９】
［ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの機能］
ヒト肝ガン由来細胞ＪＨＨ−５細胞を、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡで３２時間処理し、次いで５０μＭのコンパクチンを含む無血清培地（０．２％ＢＳＡ）で１６時間処理した。対照としてＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｈｉｇｈ ＧＣ（インビトロゲン社製）を用いた。細胞を可溶化してＡＢＣＡ１蛋白質の発現量をウェスタンブロットで測定した。あるいはＲＮＡｉ処理後に、細胞の培地に［３Ｈ］コレステロールを添加して２４時間培養し、洗浄した後に５０μＭのコンパクチンで１６時間処理した。次いでアポリポタンパクＡ−Ｉを添加あるいは非添加の培地で６時間培養し、アポリポタンパクＡ−Ｉに依存した培地へのコレステロール排出量を測定した。以下に、ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１に対するｓｉＲＮＡの配列を示す。
【００８０】
・ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１に対するｓｉＲＮＡ センス１（配列番号３１）
AACCCAGGCACACUCCUCCUGUAGC
・ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１に対するｓｉＲＮＡ アンチセンス１（配列番号３２）
GCUACAGGAGGAGUGUGCCUGGGUU
【００８１】
ＪＨＨ−５細胞のＬ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡを用いてノックダウンすると、ＡＢＣＡ１蛋白発現は図４Ａに示すように低下した。またアポリポタンパクＡ−Ｉに依存した培地へのコレステロール排出（ＨＤＬ産生）は、約５０％低下した（図４）。したがって、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡは、機能的でＨＤＬ産生に寄与しているＡＢＣＡ１蛋白をコードすることが判明した。
【実施例６】
【００８２】
［コンパクチンによる新規なヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター・エンハンサーの活性化］
ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの発現調節領域の解析を行った。ヒトゲノムＤＮＡから、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの転写開始点（配列番号１のヒトＡＢＣＡ１ ＤＮＡの３８４８１位）の上流４２６塩基から下流４８０塩基まで（配列番号３）をクローニングし、得られた領域を、ホタルルシフェラーゼベクターｐＧＬ３（プロメガ社製）に組み込み、プロモーターのレポータープラスミドを構築した。プラスミドの構築の模式図を図５に、レポータープラスミドの構成を図６（ｂ）に示す。以降の図面において、図中の数字は、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの転写開始点からの塩基の位置を示し、プラスは転写開始点から下流、マイナスは転写開始点から上流を示す。また、イントロン３に属する部分配列であるＬ３型ｍＲＮＡの転写開始点の下流３１０３塩基から３３７８塩基まで（配列番号６）をクローニングし、上記プロモーターのレポータープラスミドのルシフェラーゼ遺伝子下流に組み込み、プロモーター・エンハンサーのレポータープラスミドを構築した。プロモーター・エンハンサーのレポータープラスミドの構成を図６（ｃ）に示す。図６（ａ）は、コントロールとして用いた、プロモーターもエンハンサーも組み込まないプラスミドの構成である。
【００８３】
また、上記Ｌ３型転写開始点の下流３１０３塩基から３３７８塩基（配列番号６）をＳＶ−４０プロモーターを有するホタルルシフェラーゼベクター（プロメガ社製）に組み込み、エンハンサーレポータープラスミドを構築した。レポータープラスミドの構成を図７（ｂ）に示す。図７（ａ）は、コントロールとして用いた、ＳＶ−４０プロモーターを有するが、エンハンサーを組み込まないプラスミドの構成である。
【００８４】
ＪＨＨ−５細胞への一過性トランスフェクションにより、レポータープラスミドおよび遺伝子導入効率補正用のウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミドｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社製）を形質導入し、５０μＭのコンパクチンを含む５％の脱脂血清培地で１６時間処理した。対照として、同様に溶剤（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））で処理した。その後、細胞を回収し、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社製）により細胞内ルシフェラーゼ活性を測定した。なお、転写活性は次のように定義して評価した。
（転写活性）＝（ホタルルシフェラーゼ活性測定値）／（ウミシイタケルシフェラーゼ活性測定値）
【００８５】
さらに、スタチン系薬剤で処理する代わりに、活性型ＳＲＥＢＰ２を過剰発現させた際の転写活性も測定した。活性型ＳＲＥＢＰ２は、エンハンサーレポータープラスミドに加えて、ｐＭＥ−ＳＲＥＢＰ２（１−４８０）（J. Biol. Chem. 2003; 278, 36176）を導入し、過剰発現した。ｐＭＥ−ＳＲＥＢＰ２（１−４８０）プラスミドは、活性型ＳＲＥＢＰ２であるＳＲＥＢＰ２のアミノ酸残基１〜４８０を発現することができるベクターである。対照として空ベクターｐＭＥ−１８Ｓプラスミドを共導入した（図７中のｍｏｃｋ）。
【００８６】
ＪＨＨ−５細胞をコンパクチン処理することにより、ヒト肝型（Ｌ３型）転写開始点上流領域を組み込んだレポータープラスミドの転写活性はわずかに上昇した（図６（ｂ））。さらに転写開始点下流領域を組み込んだレポータープラスミドの転写活性は、コンパクチン処理により大きく増大した（図６（ｃ））。この結果は、スタチン系薬剤によるＬ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡの応答（実施例４、図３Ｃ）とよく一致した。Ｌ３型下流領域（エンハンサー領域）は人工のＳＶ−４０プロモーターを有するレポータープラスミドに組み込んだ場合でも、コンパクチン処理により活性を大きく増大させるエンハンサー活性を示した（図７（ｂ））。しかしながら、エンハンサー活性はＳＲＥＢＰ２の過剰発現により影響されなかった。したがって、該肝臓型転写開始点上流領域（プロモーター領域）および下流領域（エンハンサー領域）が肝臓でのＡＢＣＡ１遺伝子発現を制御していることが示された。また、スタチン系薬物による活性化は、ＳＲＥＢＰ２が直接活性化するＬ２プロモーターとは異なるメカニズムによることが示された。
【実施例７】
【００８７】
［ヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサー活性を調節する配列］
実施例６で得られたＬ３型ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサーの配列について、５’側ならびに３’側を短縮したレポータープラスミド、ならびにエンハンサー配列を部分的に欠失したプラスミドを作成した（図９）。図９（ａ）はエンハンサー配列を組み込まなかったプラスミドであり、図９（ｂ）は図６（ｃ）と同様に配列番号６に示すエンハンサー配列を組み込んだプラスミドである。図９（ｃ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３３７８塩基（配列番号７に示す）を、図９（ｄ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１８４塩基から３３７８塩基を、図９（ｅ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３２５９塩基（配列番号８）を、図９（ｆ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３２４６塩基を、図９（ｇ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３２２８塩基、及び３２４２塩基から３２５９塩基を、それぞれ組み込んだプラスミドである。実施例６に記載した方法で、これらのプラスミドをＪＨＨ−５細胞に形質導入し、５０μＭコンパクチンで処理し、転写活性を測定した。
【００８８】
実施例６で得られたＬ３型ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサーの短縮（図９（ｃ）〜（ｇ）により、Ｌ３転写開始点下流３１７２塩基から３２５９塩基まで（配列番号８）がコンパクチン処理による活性化を担うことが判明した（図９（ｅ））。さらに、図８に示す、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子中の配列ａ（配列番号９）、配列ｂ（配列番号１０）、あるいは配列ｃ（配列番号１１）を欠失すると、コンパクチンによる活性化が著しく低下することがわかった（図９（ｄ）、（ｆ）、（ｇ））。したがって、エンハンサー内に存在するこの三つの配列がヒトのＡＢＣＡ１遺伝子の転写調節に機能していると考えられる。
【実施例８】
【００８９】
［転写調節因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａによるヒト肝型（Ｌ３型）ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサー活性の調節］
実施例６で得られたＬ３型ＡＢＣＡ１遺伝子エンハンサーの配列について、エンハンサー配列を部分的に欠失したプラスミドを作成した（図１０）。プロモーターとしては、ＳＶ４０を用いた。図１０（ａ）はエンハンサー配列を組み込まなかったプラスミドであり、図１０（ｂ）はＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３２５９塩基（配列番号８）を組み込んだプラスミドである。図１０（ｃ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３２４６塩基を、図１０（ｄ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１８４塩基から３２５９塩基を、図１０（ｅ）はエンハンサー配列としてＬ３型転写開始点の下流３１７２塩基から３２２９塩基及び３２４４塩基から３２５９塩基を、それぞれ組み込んだプラスミドである。実施例６に記載した方法で、これらのプラスミドをＨｅｐＧ２細胞に形質導入し、エンハンサーレポータープラスミドに加えて、転写調節因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａの発現ベクターを導入し、転写活性を測定した。ｍｏｃｋとして、空ベクターｐＣＭＶ５プラスミドを共導入した。図１１は、５０μＭのコンパクチンで処理したＪＨＨ−５細胞において、転写調節因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａ蛋白質の発現量が増加していることを示すウエスタンブロットである。コントロールでは、溶剤（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））で処理した。５０μＭコンパクチンが、ＨＮＦ４ａｌｐｈａ蛋白発現を増加させ、Ｌ３型ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター・エンハンサーを活性化し、Ｌ３型ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡを増加させることが明らかになった。また、図１０のグラフに示すように、転写調節因子ＨＮＦ４ａｌｐｈａは、配列ｃに依存して、レポーター遺伝子の転写を増加することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明に係るスクリーニング方法によれば、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質を発見することができ、ＨＤＬ上昇や動脈硬化性疾患の予防治療に極めて有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを用いることを特徴とする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記プロモーター活性を有するＤＮＡが、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質が、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１】
プロモーター活性を有するＤＮＡと、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン３中の配列を含み、エンハンサー活性を有するＤＮＡとを用いることを特徴とする、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記プロモーター活性を有するＤＮＡが、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン２中の塩基配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質が、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質である、請求項１または２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−１９７２８（Ｐ２０１２−１９７２８Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５９６７４（Ｐ２０１０−１５９６７４）
【出願日】平成２２年７月１４日（２０１０．７．１４）
【出願人】（５９７１２８００４）国立医薬品食品衛生研究所長 (22)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１４日（２０１０．７．１４）
【出願人】（５９７１２８００４）国立医薬品食品衛生研究所長 (22)
【Ｆターム（参考）】
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