ヒトＣＤ１５４−結合性の合成ペプチドおよびその使用
本発明は、７残基長のアミノ酸配列を含み、好ましくは両端に２個のシステイン残基が側面にあり、ヒトＣＤ１５４を特異的に認識することができ、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を阻止でき、それにより該相互作用に依存する生物学的作用を阻害することができる合成ペプチドに関する。本発明のペプチドは、好ましくは環状であり、診断応用および治療応用に、特に腫瘍、炎症性疾患および移植による拒絶反応の診断および治療に、使用するのに適している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０ＬまたはＣＤ１５４）に結合できる合成ペプチドに関する。特に、本発明は、ＣＤ１５４の活性部位と特異的に結合でき、それにより、ＣＤ１５４とその天然リガンドであるＣＤ４０との相互作用を阻害し、同様に該相互作用に依存する生物学的作用も阻害するアミノ酸配列を有する、合成ペプチドに関する。本発明はまた、炎症性、免疫性または血液学的起源を有する疾患の診断および治療における該ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４０は、Ｂ細胞表面で構成的に発現される分子であり、そこでＣＤ４０は成熟過程の間に決定的に重要な役割を果たす。ＣＤ４０は、多くのさらなる細胞型、例えば単球、繊維芽細胞、樹状細胞、内皮細胞、平滑筋細胞および上皮細胞の表面でも発現される（van Kooten et al, J. Leukoc. Biol. 2000）。そのリガンドであるＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌとも称される）は、Ｔ細胞、マクロファージ、血小板、単球、ＮＫ細胞および内皮細胞の表面で活性化に伴って一過的に発現される。特に、Ｂ細胞の表面で発現されるＣＤ４０と活性型Ｔ細胞の表面で発現されるＣＤ１５４との間の相互作用は、Ｂ細胞のクローン増殖およびアイソタイプスイッチを引き起こし、結果としてそれらの形質転換を導き形質細胞となる。
【０００３】
有効な免疫応答の発達におけるＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用の重要性は、ＣＤ１５４のコード遺伝子における突然変異が、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを欠くがＩｇＭの過剰産生により特徴づけられ、そして重篤な反復性感染を伴う重篤なヒト型の免疫不全、高ＩｇＭ症候群（ＨＩＭ）の原因となるという事実によって示される（Aruffo A. et al, Cell 1993）。
【０００４】
ここ数年、多くの研究によりＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用が炎症性病因（inflammatory etiogenesis）を伴う多くの過程、例えばアテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、移植後の拒絶反応、移植片対宿主病などに関与することが実証された（Schonbeck U. et al, Circ. Res. 2001；Henn V. et al, Nature 1998；Biancone L. et al, Int. J. Mol. Med. 1999；Buchner K. et al, J. Pathol. 2003）。ＣＤ４０の発現もしくはそのリガンドＣＤ１５４の発現または両方の分子の共発現が、多くの腫瘍においても実際に示され、これはこのシグナル伝達経路が腫瘍発生に関与することを示唆するものである（Bussolati B. et al, Int. J. Cancer 2002；Biancone L. et al, J. Immunol. 1999；Cantaluppi V. et al, Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 2006；Hill S.C. et al, J. Immunol. 2005；Melichar B. et al, Gynecol. Oncol. 2007；Eliopoulos A.G. et al, Curr. Opin. Pharmacol. 2004）。特に、ＣＤ４０：ＣＤ１５４シグナル伝達経路が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の進行に関与すると考えられているのは、腫瘍細胞の生存と内皮細胞の血管新生誘導性の特徴の両方を促進することが示されたからである（Dicker F. et al, Blood 2006）。
【０００５】
ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を阻害すること目的とした多くのアプローチが、新規の治療機会を提供するために開発された。特に、有望な結果が、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症および移植による拒絶反応の異なる実験モデルで得られた。抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体に基づくアプローチによるＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用の阻害は、自己免疫疾患の多くのモデル、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬およびクローン病において臨床改善をもたらした（Boumpas D.T. et al, Arthritis Rheum. 2003; Liossis S.N. et al, Bio Drugs 2004; Daoussis D. et al, Clin. Diagn. Lab. Immun. 2004）。抗ＣＤ１５４抗体は、特許文献においても開示されている。国際公開第ＷＯ２００５／００３１７５号は、アグリコシル（aglycosyl）抗ＣＤ１５４抗体を開示する；国際公開第ＷＯ２００６／０３３７０２号は、抗ＣＤ１５４抗体およびペプチド、特に抗体軽鎖および重鎖の可変領域を開示する。さらに、多数の書籍により、膵島、皮膚、骨髄、心臓および腎臓移植後のマウスにおけるモノクローナル抗体の使用が、その移植された臓器の延長された存続をもたらすことが実際に示された（Molano R.D. et al, Diabetes 2001; Quezada S.A. et al, Blood 2003; Elster E.A. et al, Transpl. Immunol. 2004; Xu H. et al, J. Clin. Investig. 2006; Snanoudj R. et al, Transpl. Int. 2006; Nanji S.A. et al, Diabetes 2006）。補助刺激の阻止は、補助刺激分子に対するモノクローナル抗体、Ｆａｂ断片または融合タンパク質を用いて達成しうる。しかしながら、これらのアプローチの結果は、Ｆｃ部分の認識に拠る免疫原性作用および血栓形成促進性の副作用の危険性によって（Henn V. et al, Nature 1998）および脆弱な組織浸透性や免疫抑制により、しばしば損なわれる。内在する免疫原性を低下させるために、ヒト化抗体およびミニ抗体が開発されたが、残念ながら親和性が犠牲にされた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００５／００３１７５号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００６／０３３７０２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】van Kooten et al, J. Leukoc. Biol. 2000
【非特許文献２】Aruffo A. et al, Cell 1993
【非特許文献３】Schonbeck U. et al, Circ. Res. 2001
【非特許文献４】Henn V. et al, Nature 1998
【非特許文献５】Biancone L. et al, Int. J. Mol. Med. 1999
【非特許文献６】Buchner K. et al, J. Pathol. 2003
【非特許文献７】Bussolati B. et al, Int. J. Cancer 2002
【非特許文献８】Biancone L. et al, J. Immunol. 1999
【非特許文献９】Cantaluppi V. et al, Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 2006
【非特許文献１０】Hill S.C. et al, J. Immunol. 2005
【非特許文献１１】Melichar B. et al, Gynecol. Oncol. 2007
【非特許文献１２】Eliopoulos A.G. et al, Curr. Opin. Pharmacol. 2004
【非特許文献１３】Dicker F. et al, Blood 2006
【非特許文献１４】Boumpas D.T. et al, Arthritis Rheum. 2003
【非特許文献１５】Liossis S.N. et al, Bio Drugs 2004
【非特許文献１６】Daoussis D. et al, Clin. Diagn. Lab. Immun. 2004
【非特許文献１７】Molano R.D. et al, Diabetes 2001
【非特許文献１８】Quezada S.A. et al, Blood 2003
【非特許文献１９】Elster E.A. et al, Transpl. Immunol. 2004
【非特許文献２０】Xu H. et al, J. Clin. Investig. 2006
【非特許文献２１】Snanoudj R. et al, Transpl. Int. 2006
【非特許文献２２】Nanji S.A. et al, Diabetes 2006
【非特許文献２３】Henn V. et al, Nature 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の１つの目的は、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を阻害でき、該相互作用に依存する生物学的作用を阻止でき、および先行技術、特にモノクローナル抗ＣＤ１５４抗体の使用に関する技術の限界および欠点を克服する試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、合成ペプチドによって達成され、それは好ましくは環状であり、ヒトＣＤ１５４（ヒトＣＤ４０Ｌとも称される）の活性部位と特異的に結合できる。
【００１０】
本発明のペプチドは、配列表中の配列番号：１３で示されるエプタ（epta）−アミノ酸のＣＤ１５４−結合性配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１のヒストグラムは、細胞表面上でのヒトＣＤ１５４発現のためにトランスフェクトされたネズミ骨髄腫細胞系のＪ５５８Ｌ細胞に対する、選択されたファージクローンの結合性を示す。
【図２】図２は、ヒトＣＤ１５４結合性クローンから得られ６個のヒスチジン・テイル（−Ｈｉｓ６）がタグ付けされた７個のペプチドの、Ｊ５５８Ｌ ＣＤ１５４＋細胞に対する結合性を示す。
【図３】図３Ａは、抗ＣＤ１５４ペプチドとＣＤ１５４の活性部位に特異的な抗ヒトＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体との間の競合を示す。図３Ｂは、ペプチド４．１０と、対照として用いられるペプチド４．１０−ａｌａ（配列番号：８）との比較を示す。
【図４】４Ａのヒストグラムは、可溶性の組み換えヒトＣＤ１５４分子（ｒｈｓＣＤ１５４）を用いた刺激により誘導された活性Ｂ化細胞に対する抗ＣＤ１５４ペプチドおよび対照ペプチド４．１０−ａｌａの効果を示す。
【図５】図５Ａは、刺激しない基底条件下での、ＩＬ４およびＣＤ１５４を用いた７２時間の刺激後、ブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と組み合わせたＩＬ４およびＣＤ１５４を用いる７２時間の刺激後、またはペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせたＩＬ４およびＣＤ１５４を用いる７２時間の刺激後の、アイソタイプスイッチを受けてＩｇＧを発現するナイーブＢ細胞の存在をそれぞれ示す。
【図６】図６は、ペプチド４．１０（配列番号：６）の、対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）の、またはブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体の非存在下または存在下での、ＨＵＶＥＣ（ＨＵＶＥＣ＝ヒト臍静脈内皮細胞）の運動性に対するＣＤ１５４誘導性の刺激効果を示す。
【図７】図７Ａは、刺激なしの基底条件下での或いはブロッキング抗ＣＤ１５４抗体またはペプチド４．１０（配列番号：６）または対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）のいずれかの存在／非存在下での、ｒｈｓＣＤ１５４による刺激後に血管様の細胞コードを形成するマトリゲルに撒かれたＨＵＶＥＣの能力を示す。図７Ｂ〜Ｆは、上記の様々な実験条件下、マトリゲル上での細胞コード形成能についての代表的な画像を示す。
【図８】図８は、２５０μｌのマトリゲルと組み合わせ、ＳＣＩＤマウスの臀部に皮下接種した内皮ＨＵＶＥＣ細胞に対する、ペプチド４．１０の存在／非存在下でのｒｈｓＣＤ１５４誘導刺激のインビボ効果を示す。
【図９】図９は、ＩＬ−４刺激により誘導されるＣＬＬ細胞の生存を阻害する、本発明のペプチド４．１０（配列番号：６）の能力を示す。
【図１０】図１０は、０．５μＭのＡＤＰを単独で用いて刺激することによる、あるいはｒｈｓＣＤ１５４を用いて又はペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせたｒｈｓＣＤ１５４を用いて又はｒｈｓＣＤ１５４および抗ヒトＣＤ１５４抗体からなる免疫複合体と組み合わせたｒｈｓＣＤ１５４を用いて３７℃で１０分間刺激した後に０．５μＭのＡＤＰを用いて刺激することによる、ヒト血小板凝集を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドは、７アミノ酸長から３０アミノ酸長である。
【００１３】
さらにより好ましい実施形態に関して、本発明のペプチドは、配列番号：１３で示されるエプタ−アミノ酸のＣＤ１５４結合性配列の両端の側面にシステイン残基を付加することにより結果として生じる配列表中の配列番号：６で示される、ノナ−アミノ酸配列からなる。この実施形態は、配列番号：６がその末端の２個のシステイン間でジスルフィド結合を形成することによる環化を受けることができる点で特に有利である。
【００１４】
本発明のペプチドは、それが投与される患者に望ましくない免疫応答を誘導することがないという利点を有する。
【００１５】
さらなる態様に関して、本発明のペプチドは、複数のペプチドコピーを有する多量体ペプチド構造物の形式で提供され、該ペプチドコピーの各々は直鎖もしくは環状のいずれかである。多量体ペプチド構造物は、四量体構造物であることが好ましい。この多量体ペプチド構造物は、複数のペプチドコピーから成り、その各コピーは少なくとも１個のアミノ酸スペーサー、好ましくはＧ（Ｇｌｙ）残基により少なくとも１個の他のコピーと結合しており、各ペプチドコピーは好ましくは３個のＫ（Ｌｙｓ）残基からなるアミノ酸コアと直接もしくは間接的に結合している。
【００１６】
特に好ましい本発明の多量体ペプチド構造物は、以下の式で表される：
【化１】
［式中、ＬはＬｅｕであり、ＰはＰｒｏであり、ＴはＴｈｒであり、ＲはＡｒｇであり、ＨはＨｉｓであり、ＭはＭｅｔであり、ＡはＡｌａであり、ＧはＧｌｙであり、およびＫはＬｙｓである］。
【００１７】
以上で示される多量体構造物は、ＣＤ１５４−結合性の配列である配列番号：１３を直鎖で含む場合でさえ、組み換え体の可溶性ＣＤ１５４によるＣＤ４０刺激に対して、６０μＭの濃度で、ペプチド４．１０と同じ阻害活性を発揮することが示された。さらに、四量体構造物は、ペプチド４．１０のように、サブリミナル用量（subliminar dose）（０．３Ｕ／ｍｌ）のトロンビンによるヒト血小板凝集を活性化することを結果として不活性にした。これらの結果は、ＣＤ１５４−結合性の配列（配列番号：１３）は結果として環状および直鎖のいずれの場合でもＣＤ１５４に結合することができ、生物学的機能を発揮することができることを示す。環状ペプチドはそのアミノ酸配列をタンパク質分解（例えば、血漿中での）から保護しうるという利点を有すると同時に、ペプチドの多量体型を設計しうるということは、分子サイズ、クリアランス速度および結果としての半減期を調節することを可能にする。
【００１８】
これまでに言及したように、本発明の範囲には、診断および治療応用における本発明に関するペプチドまたは多量体構造物の使用もまた含まれる。
【００１９】
さらに、本発明の範囲には、本発明のペプチドまたは多量体ペプチド構造物が診断剤（例えば、インビボもしくはインビトロ・アッセイのための検出可能な分子）または治療剤（例えば、活性化内皮細胞、腫瘍細胞または活性化の際に細胞表面にＣＤ１５４を発現できる他のいずれかの細胞に対して、細胞傷害効果を発揮することができる抗炎症剤、抗腫瘍剤または細胞傷害剤）と連結され、インビボもしくはインビトロでの検出を可能にするコンジュゲート、ならびにＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用に関係する多くの疾患もしくは障害の処置のための医薬を製造するためのコンジュゲートが含まれる。そのような疾患または状態の例としては、炎症性疾患（例えばアテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、移植による拒絶反応、関節炎を伴う炎症、接触皮膚炎、高ＩｇＥ症候群、炎症性腸疾患、アレルギー性喘息を含むアレルギー、特発性炎症性疾患）、腫瘍性疾患（例えば慢性リンパ性白血病）、移植片対宿主病が含まれる。自己免疫疾患の例としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、クローン病、乾癬がある。本発明のペプチドまたは多量体構造物あるいはコンジュゲートは、免疫寛容の誘導のための使用にも適している。
【００２０】
合成ペプチドは、分子間の相互作用を阻害するための、ｍＡｂの代替的アプローチを示す。合成ペプチドの使用を下支えする理論は、タンパク質はただ外部の狭い領域だけを介してその生物学的作用を発揮するのであり、そのわずか２個、３個のアミノ酸だけが特有の受容体機能に重要であるというものである。従って、必須のアミノ酸残基を保持するより短い立体構造的に正しい形式で、その領域に対応した配列を合成することができる。このように、標的とする受容体の活性部位を特異的に認識するが、生物学的に不活性であり立体的な障害を与え、それにより受容体とその天然タンパク質との間の相互作用を妨害する短いペプチドを得ることが可能である。アゴニストと受容体との間の相互作用を模倣することができる、そのようなペプチドの主な理論的な利点は、その限られた大きさであり、それは該ペプチドを水中で容易に可溶化させ、非免疫原性とさせ、該ペプチドが長期間投与されることを可能にする（Allen S.D. et al, J. Peptide Res. 2005; Ladner R.C. et al, DDT 2004）。
【００２１】
しかしながら、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を効果的に阻害することができるアミノ酸配列を同定することは、自明な結果ではない。以下でさらに詳細に例示されるように、本発明のペプチド配列（配列番号：１３または配列番号：１６）の単一アミノ酸残基のモディファイでさえ、事実上、ヒトＣＤ１５４の活性部位に対する結合能を失わせることとなり、結果としてペプチドの阻害能が無くなることとなる。
【００２２】
上述のように、本発明に関するペプチドは、配列表中の配列番号：１３で示されるアミノ酸配列または配列番号：１６で示されるペプチド配列を含む。該ペプチドは、ヒトＣＤ１５４の活性部位に対して非常に高い結合特異性を示す。該ペプチドは、ＣＤ１５４の活性部位を認識し結合することができ、結果としてインビボおよびインビトロの両方でその受容体を効果的に阻止でき、該相互作用に起因する生物学的作用を阻害することとなる。以下の説明において、配列番号：６からなる本発明のペプチドは、「ペプチド４．１０」で示される。
【００２３】
以下の実験の項で例示される結果は、本発明のペプチド４．１０が、組み換え体の可溶型のヒトＣＤ１５４（組み換えヒト可溶性ＣＤ１５４、またはｒｈｓＣＤ１５４）による刺激によってＢ細胞上のＣＤ４０の活性化を妨害できることを示す。ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用に対して発揮される干渉作用は、Ｂ細胞の活性化および結果として生じる免疫応答の両方を妨げる。本発明者らは、ペプチド４．１０が、Ｂ細胞に対する他の補助刺激分子、例えばＣＤ８０およびＣＤ８６の誘導を阻害し、同様に免疫グロブリンのアイソタイプスイッチの誘導も阻害できることを実際に示した。さらに、ペプチド４．１０は、遊走するおよび血管様構造物を形成する細胞の能力として評価される内皮細胞のｒｈｓＣＤ１５４誘導型の活性化を、インビトロで阻止することができる。ペプチド４．１０のそのような抗血管形成活性は、ＳＣＩＤマウスでのネズミ血管形成マトリゲル・モデルにおいて、インビボでさらにはっきりと確認でき、そのことを以下でより詳細に記載する。最後に、本発明者らにより得られた予備的なデータは、ペプチド４．１０がＣＬＬ患者由来のＢ細胞に劇的なアポトーシスを誘導することができることを示す。
【００２４】
短いペプチドを含むコンジュゲートおよび医薬組成物の調製および投与技術のさらなる詳細は、先行技術において知られており；それは本発明の理解に本質的なものではないため、その詳述は本明細書には必要ない。
【００２５】
以下の実験の項で説明するように、本明細書は、ヒトＣＤ１５４に特異的に向けられる７個のアミノ酸配列の同定を説明する。特に、ヒトＣＤ１５４に結合することができる７個の環状エプタ−ペプチドが選択され、特徴づけられた。ヒトＣＤ１５４のＮ末端ドメインを含む融合タンパク質を、ペプチドを選択するために用いた。７個の選択された及び特徴づけられたエプタ−ペプチドの中で、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を阻害できることが実際に確認された唯一のものが、本発明のペプチド４．１０である。さらに、ペプチド４．１０のアミノ酸配列を、ペプチド４．１０の有用な代替形態を選りすぐる試みの中で、１個もしくは２個のアミノ酸残基を変異によりモディファイした。しかしながら、その代替形態はいずれも、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を阻害する能力を維持せず、その相互作用に関係する生物学的作用も維持しなかった。
【００２６】
以下で示される添付図および表を含み、以下の詳細な記載は、単なる例示として提供される。
【実施例１】
【００２７】
図１のヒストグラムは、細胞表面上でのヒトＣＤ１５４発現のためにトランスフェクトされたネズミ骨髄腫細胞系のＪ５５８Ｌ細胞に対する、選択されたファージクローンの結合性を示す。この細胞に対して選択されたファージの結合性は、Ｊ５５８Ｌ細胞をファージとインキュベートさせ、次いで抗Ｍ１３モノクローナル抗体とインキュベートさせて、フローサイトメトリーにより実際に示された。各実験条件について１０，０００事象を分析し、その値は３回の別個の実験の平均値および標準偏差である。１２個の選択したクローンはすべてＪ５５８Ｌ細胞と結合する。
【００２８】
表１は、ヒトＣＤ１５４結合性クローンから得られたペプチド挿入体の７個のアミノ酸配列を示す。４．１、４．５および４．９と称するクローンの挿入体は組み換えにより失われ、一方で４．２および４．３と称するクローンの挿入体ならびに４．７および４．１２と称するクローンの挿入体は同一であることが確認された。
【００２９】
図２は、ヒトＣＤ１５４結合性クローンから得られ６個のヒスチジン・テイル（−Ｈｉｓ６）がタグ付けされた７個のペプチドの、Ｊ５５８Ｌ ＣＤ１５４＋細胞に対する結合性を示す。この細胞へのペプチドの結合性は、フローサイトメトリーにより実際に示された。この細胞を、−Ｈｉｓ６タグ付きペプチドの各々とインキュベートし、次いで−Ｈｉｓ６テイルに特異的なフィコエリトリン複合体化（conjugated）二次抗体とインキュベートした。点線のヒストグラムは、アイソトープ対照（isotopic control）であり、一方、黒線はＣＤ１５４特異的ペプチドの結合強度である［４．２＝４．３＝ＣＰＳＧＨＴＫＡＣ（配列番号：１）、４．４＝ＣＧＴＨＳＳＲＩＣ（配列番号：２）、４．６＝ＣＬＧＴＱＮＫＥＣ（配列番号：３）、４．７＝４．１２＝ＣＴＰＧＫＰＨＳＣ（配列番号：４）、４．８＝ＣＫＡＡＳＡＮＩＣ（配列番号：５）、４．１０＝ＣＬＰＴＲＨＭＡＣ（配列番号：６）および４．１１＝ＣＬＳＡＶＨＮＭＣ（配列番号：７）］。各実験条件について１０，０００事象を分析し、その値は３回の別個の実験の平均値および標準偏差である。ペプチドはすべてＪ５５８Ｌ ＣＤ１５４＋細胞上のＣＤ１５４と特異的に結合することができ、対照体のＪ５５８細胞と結合できない。
【００３０】
図３Ａは、抗ＣＤ１５４ペプチドとＣＤ１５４の活性部位に特異的な抗ヒトＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体との間の競合を示す。ヒトＣＤ１５４をトランスフェクトしたネズミ骨髄腫細胞であるＪ５５８Ｌを、６個のヒスチジン・テイル（−Ｈｉｓ６）タグ付きの７個の抗ＣＤ１５４ペプチドと一緒にインキュベートし、次いで抗ＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体と一緒にインキュベートした。Ｊ５５８Ｌ細胞表面に発現されたＣＤ１５４との結合に関して抗ＣＤ１５４抗体と競合するペプチドの能力は、フローサイトメトリーにより、抗ヒトＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体を単独で用いてインキュベートした細胞により示される陽性対照と比較した蛍光強度の低下として評価した。ペプチド４．１０（配列番号：６）が、抗ヒトＣＤ１５４抗体と競合でき、その結合性を有意に示すことができた唯一のものであることは、図から明らかである。図３Ｂは、ペプチド４．１０と、対照として用いられるペプチド４．１０−ａｌａ（配列番号：８）との比較を示す。対照ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチド４．１０のアミノ酸配列とは、５番目のアミノ酸であるアルギニン残基がアラニン残基に置換されている点で異なっている。図３Ｂで明らかに示されるように、このアルギニン残基を欠くことで、ヒトＣＤ１５４に対して抗ＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体と競合する該ペプチドの能力が完全に不活化する結果となるため、そのアルギニン残基が必須であることは明らかである。
【００３１】
４Ａのヒストグラムは、可溶性の組み換えヒトＣＤ１５４分子（ｒｈｓＣＤ１５４）を用いた刺激により誘導された活性Ｂ化細胞に対する抗ＣＤ１５４ペプチドおよび対照ペプチド４．１０−ａｌａの効果を示す。ブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体または７個の選択されたペプチドのいずれか１個の非存在下もしくは存在下で、Ｂ細胞をｒｈｓＣＤ１５４を用いて４８時間刺激した。末梢Ｂ細胞の活性化は、フローサイトメトリーにより、補助刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６の膜発現で評価した。図４Ａで明らかに示されるように、ヒト可溶性ＣＤ１５４（ｒｈｓＣＤ１５４）を用いた４８時間のＢ細胞の刺激は、細胞表面でのＣＤ８０およびＣＤ８６の強い発現を誘導する。対照的に、ｒｈｓＣＤ１５４をブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と又はペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせて用いた場合、その活性化は抑制される。残りのペプチドはいずれも、ｒｈｓＣＤ１５４誘導型のＢ細胞の活性化を有意に阻害することはできない。図４Ｂは、サイトメトリー分析の詳細を示す。
【００３２】
図５Ａは、刺激しない基底条件下での、ＩＬ４およびＣＤ１５４を用いた７２時間の刺激後、ブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と組み合わせたＩＬ４およびＣＤ１５４を用いる７２時間の刺激後、またはペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせたＩＬ４およびＣＤ１５４を用いる７２時間の刺激後の、アイソタイプスイッチを受けてＩｇＧを発現するナイーブＢ細胞の存在をそれぞれ示す。ペプチド４．１０（配列番号：６）は、ちょうど抗ＣＤ１５４抗体のように、ｒｈｓＣＤ１５４およびＩＬ４による刺激によって誘導される免疫グロブリンのアイソタイプスイッチを強力に阻害することができる。図５Ｂは、サイトメトリー分析の詳細を示す。
【００３３】
図６は、ペプチド４．１０（配列番号：６）の、対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）の、またはブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体の非存在下または存在下での、ＨＵＶＥＣ（ＨＵＶＥＣ＝ヒト臍静脈内皮細胞）の運動性に対するＣＤ１５４誘導性の刺激効果を示す。特に、図６Ａは、様々な実験条件下で４時間の期間にわたり、細胞遊走のタイムラプス・キネティクスを示し；図６Ｂは、上記の実験条件下で刺激後３０分間で細胞の遊走速度に観察された差異を示し；図６Ｃは、タイムラプス分析の代表的な画像を示す。対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）とは反対に、ペプチド４．１０（配列番号：６）は、内皮細胞のｒｈｓＣＤ１５４誘導性の運動性を阻害する。
【００３４】
図７Ａは、刺激なしの基底条件下での或いはブロッキング抗ＣＤ１５４抗体またはペプチド４．１０（配列番号：６）または対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）のいずれかの存在／非存在下での、ｒｈｓＣＤ１５４による刺激後に血管様の細胞コードを形成するマトリゲルに撒かれたＨＵＶＥＣの能力を示す。図７Ｂ〜Ｆは、上記の様々な実験条件下、マトリゲル上での細胞コード形成能についての代表的な画像を示す（Ｂ＝刺激なしの対照；Ｃ＝ｒｈｓＣＤ１５４；Ｄ＝ｒｈｓＣＤ１５４＋４．１０ペプチド；Ｅ＝ｒｈｓＣＤ１５４＋４．１０−ａｌａペプチド；Ｆ＝ｒｈｓＣＤ１５４＋ブロッキング抗ＣＤ１５４抗体）。本発明のペプチド４．１０（配列番号：６）は、ペプチド４．１０−ａｌａ（配列番号：８）と対照的に、細胞コードを形成する内皮細胞のｒｈｓＣＤ１５４誘導性の能力を阻害する。
【００３５】
図８は、２５０μｌのマトリゲルと組み合わせ、ＳＣＩＤマウスの臀部に皮下接種した内皮ＨＵＶＥＣ細胞に対するペプチド４．１０の存在／非存在下でのｒｈｓＣＤ１５４誘導刺激のインビボ効果を示す。接種の７日後に、マウスを屠殺し、移植片を取り出し、１０％ホルマリン溶液中で固定化し、パラフィンに包埋し、組織分析のために調製した。図８Ａは、ヘマトキシリン−エオシン染色した組織切片において、基底条件下およびそれ以外の上記実験条件下での血管形成領域の量子化（quantization）を示す。図８Ｂおよび８Ｃは、ｒｈｓＣＤ１５４を単独で用いた及びペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせてｒｈｓＣＤ１５４を用いた内皮細胞の刺激により得られた血管形成の代表的な２枚の画像をそれぞれ示す。各実験条件に対して、６匹のＳＣＩＤマウスを用いた。ペプチド４．１０は、インビボでのｒｈｓＣＤ１５４誘導性の血管形成を完全に阻害する。
【００３６】
図９は、ＩＬ−４刺激により誘導されるＣＬＬ細胞の生存を阻害する、本発明のペプチド４．１０（配列番号：６）の能力を示す。
【００３７】
図１０は、０．５μＭのＡＤＰを単独で用いて刺激することによる、あるいはｒｈｓＣＤ１５４を用いて又はペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせたｒｈｓＣＤ１５４を用いて又はｒｈｓＣＤ１５４および抗ヒトＣＤ１５４抗体からなる免疫複合体と組み合わせたｒｈｓＣＤ１５４を用いて３７℃で１０分間刺激した後に０．５μＭのＡＤＰを用いて刺激することによる、ヒト血小板凝集を示す。血小板凝集は、血小板凝集計を用い、対照と比較した光透過性の増加として測定した。ｒｈｓＣＤ１５４と組み合わせたヒトＣＤ１５４抗体によるヒト血小板のプライミングは、０．５μＭのＡＤＰを用いた刺激により血小板凝集を増大させる。反対に、単独のｒｈｓＣＤ１５４またはペプチド４．１０と組み合わせたｒｈｓＣＤ１５４は、０．５μＭのＡＤＰを用いた刺激により誘導される血小板凝集レベルに影響を及ぼさない。これらの結果は、本発明のペプチド４．１０（配列番号：６）とＣＤ１５４分子との相互作用は、血小板凝集を誘導することはないが、これとは対照的に、抗ＣＤ１５４抗体との相互作用では血小板凝集が誘導される。
【００３８】
以下の実験の項は、単なる例示として提供され、添付する特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定することは意図しない。
【００３９】
実験の項
この研究を通して、７個のアミノ酸残基とジスルフィド結合による環化を可能にする両端で側面に位置する２個のシステインを含むペプチド配列パネルから成り、Ｍ１３ファージで発現され、キャプシドｐＩＩＩファージタンパク質と遺伝子工学的に融合され、そのファージ表面に無作為に発現される、ペプチドライブラリー（ペプチドの多様性＜１０９）を用いた。このファージライブラリーを、既知のモデル（Hetian L. et al, J. Biol. Chem. 2002）から本発明者らにより発展されたバイオパニング・インビトロ・モデルによってスクリーニングした。ファージ（２００μｌのＴＢＳ中、１×１０１１ＣＦＵ）を、ヒト組み換えＣＤ１５４と一緒に室温で１時間インキュベートして、その後プレートに撒いた。このファージをＴＢＳ−Ｔを用いて数回洗浄してＣＤ１５４と結合していない非特異的なファージを取り除き、ＣＤ１５４と結合したファージを、１００μｌの０．２Ｍ グリシン、ｐＨ２．２を用いて溶出することにより回収し、１５μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．１を用いて１０分間中和した。ファージ数は、溶出液の段階希釈物をＬＢ寒天培地（アガロース７ｇ／リッター、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ １ｇ；Sigma）上の宿主のテトラサイクリン耐性の大腸菌ＥＲ２７３８細胞（New England Biolabs, Hitchin, U.K.）に加え、テトラサイクリン（Kramel Biotech, Cramlington, U.K.）存在下のＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ ＬＢ寒天培地に撒いて、滴定することにより評価した。
【００４０】
３７℃で１２時間のインキュベーション後に、青プラークとしてプレート上で目視できるファージコロニーの数を計数した。評価したファージを、テトラサイクリン存在下のＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ ＬＢ寒天培地のプレート上でファージを培養することにより増幅し、３．３％のポリエチレングリコール８，０００／０．４ ＮａＣｌ（Sigma）中で遠心分離することにより沈殿させた。次いで、そのファージを上記のように滴定し、ヒト組み換えＣＤ１５４で被覆した新しいプレート上で再度インキュベートした。スクリーニング過程および増幅過程を４回繰返して、ヒトＣＤ１５４特異的なファージクローンのライブラリーを豊富化した。４回目の増幅ラウンドの後に、１２個のファージクローンを無作為に選び出し、個々に増幅し、細胞表面で発現するＣＤ１５４を認識するその能力を試験した。選択された個々のクローンの特異的な結合性は、参照細胞系としてＪ５５８Ｌと称されるヒトＣＤ１５４の発現のためにトランスフェクトされたネズミ骨髄腫細胞系を用いたフローサイトメトリーにより、インビトロで実際に示した。室温で３０分間のインキュベーション後のファージ（１０１１ｃｆｕ）のＪ５５８Ｌ細胞に対する結合性は、その細胞をファージタンパク質Ｍ１３に対するモノクローナル抗体（Pharmacia, Uppsala, Sweden）と一緒にインキュベートし、続いて抗マウス・フィコエリトリン複合体化抗体（Sigma）と一緒にインキュベートする間接免疫蛍光法によるフローサイトメトリーによって検出した。図１で示されるように、１２個のファージクローンはすべて、ヒトＣＤ１５４発現細胞（Ｊ５５８Ｌ）と特異的に結合できたが、その対照体であるＣＤ１５４−陰性（Ｊ５５８）細胞とは結合しなかった。
【００４１】
この１２個のファージクローンのペプチド挿入体の配列決定により、表Ｉに列記される７個の異なる配列が得られた。ペプチドを合成し、インビトロおよびインビボでの局在を容易にするためにビオチン（−ｂｉｏ）または６−ヒスチジン・テイル（−ｈｉｓ６）と複合体化させた。同様に、このペプチドのＪ５５８Ｌ細胞に対する結合性は、細胞をｈｉｓ６タグ付きペプチド（６０μＭの−ｈｉｓ６ペプチド）と一緒に室温で３０分間インキュベートし、次いで抗ポリヒスチジン−フィコエリトリン複合体化抗体（Sigma）と一緒に４℃で３０分間インキュベートして、フローサイトメトリーにより実際に示した。７個の選択されたペプチドはすべて、Ｊ５５８Ｌ ＣＤ１５４＋細胞に対して良好な親和性を示した。さらに、該ペプチドと、ＣＤ１５４の活性部位を特異的に認識する抗ヒトＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体（Serotec）との競合アッセイを行った。Ｊ５５８Ｌ細胞を、ｈｉｓ６−ペプチドと一緒に室温で３０分間インキュベートし、次いで、抗ヒトＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体と一緒にさらに３０分間室温でインキュベートした。図３Ａは、ペプチド４．１０が、抗ヒトＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体とＪ５５８Ｌ細胞との相互作用を有意に阻害できる唯一のものであることを示す。ペプチド４．１０のアミノ酸配列中の、ＣＤ１５４との結合に必須のアミノ酸残基を特定するために、３種の異なるペプチドを合成し、その各々は、点突然変異を有しており、それらは４番目、５番目、６番目のアミノ酸配列がそれぞれアラニン残基に置換されることによりペプチド４．１０のアミノ酸配列とは異なっている。
【００４２】
変異ペプチドは、Ｊ５５８Ｌ細胞表面に発現されたヒトＣＤ１５４を認識することができなかった（データは示さない）。最も低い反応性のペプチド、４．１０−ａｌａと称するアミノ酸配列ＣＬＰＴＡＨＭＡＣ（配列番号：８）を有するペプチドを、対照ペプチドとして選んだ（図３Ｂ）。
【００４３】
同様の結果が、表ＩＩで列記されるアミノ酸配列を有する４個の改変されたペプチド４．１０１、４．１０２、４．１０３および４．１０４を用いて得られた。これらのペプチドはいずれも、ＣＤ１５４＋ Ｊ５５８Ｌの細胞表面に発現されたヒトＣＤ１５４と結合しないことが示された（データは示さない）。
【００４４】
Ｂ細胞は、その細胞膜上でＣＤ４０分子を構成的に発現することが知られている（van Kooten C. et al, J. Leukoc. Biol. 2000）。ＣＤ１５４を発現する活性化Ｔ細胞によるＣＤ４０の刺激は、結果としてＢ細胞の活性化、増殖およびアイソタイプスイッチを引き起こす。本発明者らは、フィコール・グラジエント遠心分離法および免疫磁気分離法（ＭＡＣＳシステム−Milteniy）により、健常ドナーの末梢全血から分離したＢ細胞を用いた。次いで、それにより得られた休止期のＢ細胞を、可溶型のヒト組み換えＣＤ１５４（ｒｈｓＣＤ１５４）を用いて刺激し、細胞膜上での補助刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）の活性化および発現を誘導した。ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）による４８時間の刺激後に、末梢Ｂ細胞の細胞表面上にＣＤ８０およびＣＤ８６の膜発現において劇的な増加が観察された。この発現は、それぞれ、基底レベルと比較して３００％および２７４％にまで増加した。対照的に、リンパ球刺激の前にペプチド４．１０（配列番号：６）と一緒にｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）で３７℃にて１５分間あらかじめインキュベートすることで、Ｂ細胞刺激およびその関連するＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を阻止した。ペプチド４．１０（配列番号：６）の阻害作用は、６０μＭの濃度でピークに達し、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現はそれぞれ１０７％および１３０％にまで低下した（図４Ａおよび４Ｂ）。その効果はより低い濃度（３０μＭ）の場合でさえ観察することが可能であった。
【００４５】
反対に、同じ濃度（６０μＭ）の他のペプチドと一緒にｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いてあらかじめインキュベートしても、ｒｈｓＣＤ１５４による刺激によって誘導されるＣＤ８０およびＣＤ８６の発現に有意な影響はなかった。より高い濃度（２５０μＭ）では、ペプチド４．６（配列番号：３）および４．１１（配列番号：７）はまた、Ｂ細胞活性化の阻害を示した：特に、ペプチド４．６（配列番号：３）は、ＣＤ８０の発現を１１７％に及びＣＤ８６の発現を１２２％に低下させたが、一方で、ペプチド４．１１（配列番号：７）の効果は安定した再現性はなかった。反対に、対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）は、２５０μＭの濃度でさえｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）と一緒にあらかじめインキュベートしても、ｒｈｓＣＤ１５４による刺激によって誘導されるＣＤ８０およびＣＤ８６の発現には影響せず、またＢ細胞の活性化を有意に低下させることもなく、さらにＣＤ８０およびＣＤ８６の発現レベルを低下させることもなかった（図４Ａ）。ブロッキング対照として、実施した全ての実験でＢ細胞の刺激前に、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）をブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体（Alexis）と一緒に３７℃で１５分間あらかじめインキュベートすることで、ＣＤ４０媒介型のＢ細胞の活性化を完全に阻害し、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を基底レベルにまで低下させた（図４Ａおよび４Ｂ）。この結果は、５回の別個の実験の平均値±標準偏差である。
【００４６】
同様の結果はまた、ヒト脾臓フラグメントから単離されたＢ細胞を用いて得られた。さらに、ナイーブＢ細胞集団で行われた別の実験でも、ペプチド４．１０がＣＤ４０媒介型のＢ細胞Ｉｇのアイソタイプスイッチを効果的に阻害することが示された。これらの実験は、免疫磁気分離法（ＭＡＣＳシステム Milteniy）によりＢ細胞プールから成熟リンパ球を失わせることによる陰性選択によって末梢血から得られたＣＤ２７−ナイーブＢ細胞で行った。本発明者らは、ナイーブＢ細胞を、ＩＬ−４（０．４ｎｇ／ｍｌ）およびｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下の低グルコースＤＭＥＭ（Sigma）中で９６時間培養した場合に、膜ＩｇＧを発現するＢ細胞の数に有意な増加（２５％）が誘導されたことを実際に示した。対照的に、ペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせたＩＬ４（０．４ｎｇ／ｍｌ）およびｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激されたＢ細胞は非常に低い割合でアイソタイプスイッチを受けた（図５Ａおよび５Ｂ）。同様に、ブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と組み合わせたＩＬ４（０．４ｎｇ／ｍｌ）およびｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）によるナイーブＢ細胞の刺激では、アイソタイプスイッチは誘導されなかった（図５Ａおよび５Ｂ）。
【００４７】
炎症過程は、ひとたび誘発されると特定の受容体またはリンパ球補助刺激分子、例えばＣＤ４０およびそのリガンドＣＤ１５４を発現する免疫系以外の細胞、例えば血管壁の内皮細胞により保存されうることが知られている。かくして、本発明者らは、ペプチド４．１０（配列番号：６）が、リンパ球刺激および／または成熟を阻害することに加えて、内皮細胞の細胞表面に発現されるＣＤ４０分子の刺激を阻止して、炎症を制限できることを実際に示した。本発明者らは、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）の投与による内皮ＣＤ４０刺激によって誘導される血管新生誘導効果は、単一細胞の遊走および基底マトリクス（マトリゲル）上で血管様の細胞コードを形成する細胞の能力の両方のようにインビトロ評価され、本発明の抗ＣＤ１５４ペプチド４．１０（配列番号：６）を用いてｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）を３７℃で１５分間あらかじめインキュベートすることにより阻害されたことが実際に示された。特に、細胞遊走実験は、２０％血清存在下の完全内皮細胞培養液中４×１０３細胞密度でゼラチン上に撒かれたＨＵＶＥＣ細胞を用いて実施した。後日、その内皮培地は、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下もしくは非存在下の減少した血清濃度（５％）を含む低グルコースＤＭＥＭ（Sigma）に交換した。
【００４８】
さらに、阻害効果を評価するために、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）を、ペプチド４．１０（配列番号：６）と又は対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）と又はブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と一緒に３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、フラスコを、恒温チャンバー（約３７℃）を備えた位相差倒立顕微鏡下で４時間、１０×倍率で観察した。細胞を、顕微鏡に繋がれたカメラを用いて規則的に１５分間隔で４時間の全期間にわたって撮影した。各細胞の遊走速度は、画像分析ソフトウェアを用いて、各単一フレームにおいて各単独細胞それぞれの核の位置に基づいて計算し、結果として、平均の細胞遊走速度（±標準偏差）を各実験条件ごとに計算した。図６Ａおよび６Ｂで示されるように、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）による内皮ＣＤ４０の刺激は、細胞の基底の運動性（１時間あたり常に１２μｍ未満）において約３５０％（１時間あたり４２μｍ）の増加を誘導し、一方でｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）をペプチド４．１０（配列番号：６）と共に３７℃で１５分間あらかじめインキュベートすることで、ならびにブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と一緒にあらかじめインキュベートすることで、細胞の運動性は基底レベルまで顕著に低下した。反対に、対照ペプチド４．１０−ａｌａ（配列番号：８）は、内皮ＣＤ４０の刺激に影響を及ぼさなかった（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ）。
【００４９】
ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）によるヒト内皮ＣＤ４０刺激を妨げるペプチド４．１０の能力のさらなる確認として、ＨＵＶＥＣ（３．５×１０４）をインビトロ血管新生アッセイにかけた。ＨＵＶＥＣを、５％血清が補充された基底ＲＰＭＩ培地中、巨大な細胞の組織体の形成を促進することができる腫瘍マトリックス（tumor matrix）（マトリゲル、ＢＤ）上に撒いた。３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベーションして、細胞を位相差倒立顕微鏡下で観察した。図７Ａおよび７Ｂは、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）による刺激が、４時間後にすでに複雑な内皮ネットワークの形成を誘導したが、一方でｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）をペプチド４．１０（配列番号：６）と一緒に、ならびにブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と一緒に３７℃で１５分間あらかじめインキュベートすることで、刺激を完全に無効にした（図７Ａ、７Ｄおよび７Ｆ）。反対に、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）を対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）と一緒に３７℃で１５分間あらかじめインキュベートすることでは、血管様の細胞コードを形成する細胞の能力に影響を及ぼさなかった（図７Ｅ）。他の抗ヒトＣＤ１５４ペプチド、例えば活性部位と特異的に結合しない４．６（配列番号：３）および４．１１（配列番号：７）は、内皮のＣＤ４０刺激を有意に低下させることはできなかった（データは示さない）。
【００５０】
最後に、ペプチド４．１０の抗血管形成作用を、インビボ血管形成アッセイで試験した。２００μｌのＨＡＮＫ溶液中に再懸濁した内皮ＨＵＶＥＣ細胞（２×１０６）を、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む液状の５００μｌのマトリゲルと混合し、ペプチド４．１０（配列番号：６）の存在下および非存在下でＳＣＩＤマウスの右側の臀部および左側の臀部にそれぞれ皮下接種した。６日後に、マウスを屠殺し、マトリゲルプラグを回収し、１０％ホルマリン溶液中で少なくとも２４時間固定化し、次いで免疫組織分析のために処理した。ＨＵＶＥＣおよびｒｈｓＣＤ１５４移植片のヘマトキシリン−エオシン染色した組織切片は、強い血管形成を示し（図８Ａおよび８Ｂ）、ｓＣＤ１５４をペプチド４．１０（配列番号：６）であらかじめインキュベートした接種では著しく阻害されたか又は完全に見られず、そこでは大部分の細胞がアポトーシスを受けていた（図８Ａおよび８Ｃ）。
【００５１】
ペプチド４．１０（配列番号：６）は、インビボで得られたＣＬＬ腫瘍細胞のＩＬ−４存在下での培養による生存を阻害できることもはっきり示した。ＣＬＬ細胞のアポトーシスに対する耐性および増強された生存は、慢性リンパ性白血病患者におけるインビボでのこれらの腫瘍細胞の伸展（expansion）によるものと考えられる。これらの結果は、ＣＤ４０とそのリガンドであるＣＤ１５４との相互作用が、ＣＬＬ細胞の生存を刺激するのに重要であること、およびＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用のＣＤ１５４の活性部位を認識することができるペプチドによる阻害が、これらの細胞の生存を阻害しうることを示す（図９）。
【００５２】
最後に、ペプチド４．１０の主な利点の１つは、ヒト血小板に対する反応性を欠いていることである。これまで、有望な抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体を試験するために実施された多くの臨床試験が、劇的な血栓形成促進性の副作用により突然中断されたことが知られている（Kelsoe G. et al, J. Clin. Invest. 2003）。仮説は、抗ＣＤ１５４抗体が、免疫グロブリンＦｃ部分に対する受容体（ＦｃＲ）を発現するヒト血小板表面において交差反応を誘発し、活性化後にＣＤ１５４分子を誘発する、というものである。したがって、本発明者らは、血小板凝集アッセイにより、ペプチド４．１０の血小板に対する作用を試験した。このような実験は、磁気攪拌器およびリアルタイム光学密度計を備えた恒温凝集計を使用して行った。血小板の凝集は、参照試料（ブランク）に対する光学密度の変化として評価した。この実験は、５Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む試験管に収集された健常ドナーの末梢全血から抽出された血小板で行った。特に、多血小板血漿（platelet enriched plasma：ＰＲＰ）は９００ｒｐｍで２０分間の全血の遠心分離により得られ、一方で参照試料として用いられる少血小板血漿（platelet poor plasma：ＰＰＰ）は３０００ｒｐｍで１０分間の別の遠心分離後の上清を回収することにより得られた。Langer（Langer F. et al, Thromb. Haemost. 2005）により既に示されたように、血小板を組み換えヒト可溶性ＣＤ１５４および抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体からなる免疫複合体と一緒に３７℃で１０分間インキュベートすることによるプライミングは、０．５μＭのＡＤＰによる次の刺激により誘導される血小板の凝集を増強した（図１０）。対照的に、ＣＤ１５４単独による又はペプチド４．１０（６０μＭ）との組み合わせによるプライミングは、０．５μＭのＡＤＰによる刺激により誘導される血小板の凝集を増強しなかった（図１０）。同様の結果が、０．３Ｕ／ｍｌのトロンビンを用いて血小板凝集を誘導することで得られた。
【００５３】
内皮細胞は、特に炎症部位で、その表面に高頻度でＣＤ４０を発現するため、および血管形成は幾つかの炎症過程および炎症性疾患の発症において主要な役割を果たしうるため、本発明の４．１０ペプチドの上記特性により、該ペプチドは見込みのある抗炎症アプローチの開発に関する非常に有望な分子である。さらに、４．１０ペプチド（配列番号：６）により発揮されるリンパ球活性化における阻害作用は、移植または腫瘍細胞増殖がＣＤ４０による刺激に起因する抗アポトーシス作用によって支援される腫瘍性疾患、例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）に対する免疫抑制治療として、この分子の見込みのある使用を提供する。
【００５４】
【表１】
（＊）本発明に関するペプチド
【００５５】
【表２】
【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０ＬまたはＣＤ１５４）に結合できる合成ペプチドに関する。特に、本発明は、ＣＤ１５４の活性部位と特異的に結合でき、それにより、ＣＤ１５４とその天然リガンドであるＣＤ４０との相互作用を阻害し、同様に該相互作用に依存する生物学的作用も阻害するアミノ酸配列を有する、合成ペプチドに関する。本発明はまた、炎症性、免疫性または血液学的起源を有する疾患の診断および治療における該ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４０は、Ｂ細胞表面で構成的に発現される分子であり、そこでＣＤ４０は成熟過程の間に決定的に重要な役割を果たす。ＣＤ４０は、多くのさらなる細胞型、例えば単球、繊維芽細胞、樹状細胞、内皮細胞、平滑筋細胞および上皮細胞の表面でも発現される（van Kooten et al, J. Leukoc. Biol. 2000）。そのリガンドであるＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌとも称される）は、Ｔ細胞、マクロファージ、血小板、単球、ＮＫ細胞および内皮細胞の表面で活性化に伴って一過的に発現される。特に、Ｂ細胞の表面で発現されるＣＤ４０と活性型Ｔ細胞の表面で発現されるＣＤ１５４との間の相互作用は、Ｂ細胞のクローン増殖およびアイソタイプスイッチを引き起こし、結果としてそれらの形質転換を導き形質細胞となる。
【０００３】
有効な免疫応答の発達におけるＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用の重要性は、ＣＤ１５４のコード遺伝子における突然変異が、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを欠くがＩｇＭの過剰産生により特徴づけられ、そして重篤な反復性感染を伴う重篤なヒト型の免疫不全、高ＩｇＭ症候群（ＨＩＭ）の原因となるという事実によって示される（Aruffo A. et al, Cell 1993）。
【０００４】
ここ数年、多くの研究によりＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用が炎症性病因（inflammatory etiogenesis）を伴う多くの過程、例えばアテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、移植後の拒絶反応、移植片対宿主病などに関与することが実証された（Schonbeck U. et al, Circ. Res. 2001；Henn V. et al, Nature 1998；Biancone L. et al, Int. J. Mol. Med. 1999；Buchner K. et al, J. Pathol. 2003）。ＣＤ４０の発現もしくはそのリガンドＣＤ１５４の発現または両方の分子の共発現が、多くの腫瘍においても実際に示され、これはこのシグナル伝達経路が腫瘍発生に関与することを示唆するものである（Bussolati B. et al, Int. J. Cancer 2002；Biancone L. et al, J. Immunol. 1999；Cantaluppi V. et al, Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 2006；Hill S.C. et al, J. Immunol. 2005；Melichar B. et al, Gynecol. Oncol. 2007；Eliopoulos A.G. et al, Curr. Opin. Pharmacol. 2004）。特に、ＣＤ４０：ＣＤ１５４シグナル伝達経路が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の進行に関与すると考えられているのは、腫瘍細胞の生存と内皮細胞の血管新生誘導性の特徴の両方を促進することが示されたからである（Dicker F. et al, Blood 2006）。
【０００５】
ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を阻害すること目的とした多くのアプローチが、新規の治療機会を提供するために開発された。特に、有望な結果が、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症および移植による拒絶反応の異なる実験モデルで得られた。抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体に基づくアプローチによるＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用の阻害は、自己免疫疾患の多くのモデル、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬およびクローン病において臨床改善をもたらした（Boumpas D.T. et al, Arthritis Rheum. 2003; Liossis S.N. et al, Bio Drugs 2004; Daoussis D. et al, Clin. Diagn. Lab. Immun. 2004）。抗ＣＤ１５４抗体は、特許文献においても開示されている。国際公開第ＷＯ２００５／００３１７５号は、アグリコシル（aglycosyl）抗ＣＤ１５４抗体を開示する；国際公開第ＷＯ２００６／０３３７０２号は、抗ＣＤ１５４抗体およびペプチド、特に抗体軽鎖および重鎖の可変領域を開示する。さらに、多数の書籍により、膵島、皮膚、骨髄、心臓および腎臓移植後のマウスにおけるモノクローナル抗体の使用が、その移植された臓器の延長された存続をもたらすことが実際に示された（Molano R.D. et al, Diabetes 2001; Quezada S.A. et al, Blood 2003; Elster E.A. et al, Transpl. Immunol. 2004; Xu H. et al, J. Clin. Investig. 2006; Snanoudj R. et al, Transpl. Int. 2006; Nanji S.A. et al, Diabetes 2006）。補助刺激の阻止は、補助刺激分子に対するモノクローナル抗体、Ｆａｂ断片または融合タンパク質を用いて達成しうる。しかしながら、これらのアプローチの結果は、Ｆｃ部分の認識に拠る免疫原性作用および血栓形成促進性の副作用の危険性によって（Henn V. et al, Nature 1998）および脆弱な組織浸透性や免疫抑制により、しばしば損なわれる。内在する免疫原性を低下させるために、ヒト化抗体およびミニ抗体が開発されたが、残念ながら親和性が犠牲にされた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００５／００３１７５号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００６／０３３７０２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】van Kooten et al, J. Leukoc. Biol. 2000
【非特許文献２】Aruffo A. et al, Cell 1993
【非特許文献３】Schonbeck U. et al, Circ. Res. 2001
【非特許文献４】Henn V. et al, Nature 1998
【非特許文献５】Biancone L. et al, Int. J. Mol. Med. 1999
【非特許文献６】Buchner K. et al, J. Pathol. 2003
【非特許文献７】Bussolati B. et al, Int. J. Cancer 2002
【非特許文献８】Biancone L. et al, J. Immunol. 1999
【非特許文献９】Cantaluppi V. et al, Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 2006
【非特許文献１０】Hill S.C. et al, J. Immunol. 2005
【非特許文献１１】Melichar B. et al, Gynecol. Oncol. 2007
【非特許文献１２】Eliopoulos A.G. et al, Curr. Opin. Pharmacol. 2004
【非特許文献１３】Dicker F. et al, Blood 2006
【非特許文献１４】Boumpas D.T. et al, Arthritis Rheum. 2003
【非特許文献１５】Liossis S.N. et al, Bio Drugs 2004
【非特許文献１６】Daoussis D. et al, Clin. Diagn. Lab. Immun. 2004
【非特許文献１７】Molano R.D. et al, Diabetes 2001
【非特許文献１８】Quezada S.A. et al, Blood 2003
【非特許文献１９】Elster E.A. et al, Transpl. Immunol. 2004
【非特許文献２０】Xu H. et al, J. Clin. Investig. 2006
【非特許文献２１】Snanoudj R. et al, Transpl. Int. 2006
【非特許文献２２】Nanji S.A. et al, Diabetes 2006
【非特許文献２３】Henn V. et al, Nature 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の１つの目的は、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を阻害でき、該相互作用に依存する生物学的作用を阻止でき、および先行技術、特にモノクローナル抗ＣＤ１５４抗体の使用に関する技術の限界および欠点を克服する試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、合成ペプチドによって達成され、それは好ましくは環状であり、ヒトＣＤ１５４（ヒトＣＤ４０Ｌとも称される）の活性部位と特異的に結合できる。
【００１０】
本発明のペプチドは、配列表中の配列番号：１３で示されるエプタ（epta）−アミノ酸のＣＤ１５４−結合性配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１のヒストグラムは、細胞表面上でのヒトＣＤ１５４発現のためにトランスフェクトされたネズミ骨髄腫細胞系のＪ５５８Ｌ細胞に対する、選択されたファージクローンの結合性を示す。
【図２】図２は、ヒトＣＤ１５４結合性クローンから得られ６個のヒスチジン・テイル（−Ｈｉｓ６）がタグ付けされた７個のペプチドの、Ｊ５５８Ｌ ＣＤ１５４＋細胞に対する結合性を示す。
【図３】図３Ａは、抗ＣＤ１５４ペプチドとＣＤ１５４の活性部位に特異的な抗ヒトＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体との間の競合を示す。図３Ｂは、ペプチド４．１０と、対照として用いられるペプチド４．１０−ａｌａ（配列番号：８）との比較を示す。
【図４】４Ａのヒストグラムは、可溶性の組み換えヒトＣＤ１５４分子（ｒｈｓＣＤ１５４）を用いた刺激により誘導された活性Ｂ化細胞に対する抗ＣＤ１５４ペプチドおよび対照ペプチド４．１０−ａｌａの効果を示す。
【図５】図５Ａは、刺激しない基底条件下での、ＩＬ４およびＣＤ１５４を用いた７２時間の刺激後、ブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と組み合わせたＩＬ４およびＣＤ１５４を用いる７２時間の刺激後、またはペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせたＩＬ４およびＣＤ１５４を用いる７２時間の刺激後の、アイソタイプスイッチを受けてＩｇＧを発現するナイーブＢ細胞の存在をそれぞれ示す。
【図６】図６は、ペプチド４．１０（配列番号：６）の、対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）の、またはブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体の非存在下または存在下での、ＨＵＶＥＣ（ＨＵＶＥＣ＝ヒト臍静脈内皮細胞）の運動性に対するＣＤ１５４誘導性の刺激効果を示す。
【図７】図７Ａは、刺激なしの基底条件下での或いはブロッキング抗ＣＤ１５４抗体またはペプチド４．１０（配列番号：６）または対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）のいずれかの存在／非存在下での、ｒｈｓＣＤ１５４による刺激後に血管様の細胞コードを形成するマトリゲルに撒かれたＨＵＶＥＣの能力を示す。図７Ｂ〜Ｆは、上記の様々な実験条件下、マトリゲル上での細胞コード形成能についての代表的な画像を示す。
【図８】図８は、２５０μｌのマトリゲルと組み合わせ、ＳＣＩＤマウスの臀部に皮下接種した内皮ＨＵＶＥＣ細胞に対する、ペプチド４．１０の存在／非存在下でのｒｈｓＣＤ１５４誘導刺激のインビボ効果を示す。
【図９】図９は、ＩＬ−４刺激により誘導されるＣＬＬ細胞の生存を阻害する、本発明のペプチド４．１０（配列番号：６）の能力を示す。
【図１０】図１０は、０．５μＭのＡＤＰを単独で用いて刺激することによる、あるいはｒｈｓＣＤ１５４を用いて又はペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせたｒｈｓＣＤ１５４を用いて又はｒｈｓＣＤ１５４および抗ヒトＣＤ１５４抗体からなる免疫複合体と組み合わせたｒｈｓＣＤ１５４を用いて３７℃で１０分間刺激した後に０．５μＭのＡＤＰを用いて刺激することによる、ヒト血小板凝集を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドは、７アミノ酸長から３０アミノ酸長である。
【００１３】
さらにより好ましい実施形態に関して、本発明のペプチドは、配列番号：１３で示されるエプタ−アミノ酸のＣＤ１５４結合性配列の両端の側面にシステイン残基を付加することにより結果として生じる配列表中の配列番号：６で示される、ノナ−アミノ酸配列からなる。この実施形態は、配列番号：６がその末端の２個のシステイン間でジスルフィド結合を形成することによる環化を受けることができる点で特に有利である。
【００１４】
本発明のペプチドは、それが投与される患者に望ましくない免疫応答を誘導することがないという利点を有する。
【００１５】
さらなる態様に関して、本発明のペプチドは、複数のペプチドコピーを有する多量体ペプチド構造物の形式で提供され、該ペプチドコピーの各々は直鎖もしくは環状のいずれかである。多量体ペプチド構造物は、四量体構造物であることが好ましい。この多量体ペプチド構造物は、複数のペプチドコピーから成り、その各コピーは少なくとも１個のアミノ酸スペーサー、好ましくはＧ（Ｇｌｙ）残基により少なくとも１個の他のコピーと結合しており、各ペプチドコピーは好ましくは３個のＫ（Ｌｙｓ）残基からなるアミノ酸コアと直接もしくは間接的に結合している。
【００１６】
特に好ましい本発明の多量体ペプチド構造物は、以下の式で表される：
【化１】
［式中、ＬはＬｅｕであり、ＰはＰｒｏであり、ＴはＴｈｒであり、ＲはＡｒｇであり、ＨはＨｉｓであり、ＭはＭｅｔであり、ＡはＡｌａであり、ＧはＧｌｙであり、およびＫはＬｙｓである］。
【００１７】
以上で示される多量体構造物は、ＣＤ１５４−結合性の配列である配列番号：１３を直鎖で含む場合でさえ、組み換え体の可溶性ＣＤ１５４によるＣＤ４０刺激に対して、６０μＭの濃度で、ペプチド４．１０と同じ阻害活性を発揮することが示された。さらに、四量体構造物は、ペプチド４．１０のように、サブリミナル用量（subliminar dose）（０．３Ｕ／ｍｌ）のトロンビンによるヒト血小板凝集を活性化することを結果として不活性にした。これらの結果は、ＣＤ１５４−結合性の配列（配列番号：１３）は結果として環状および直鎖のいずれの場合でもＣＤ１５４に結合することができ、生物学的機能を発揮することができることを示す。環状ペプチドはそのアミノ酸配列をタンパク質分解（例えば、血漿中での）から保護しうるという利点を有すると同時に、ペプチドの多量体型を設計しうるということは、分子サイズ、クリアランス速度および結果としての半減期を調節することを可能にする。
【００１８】
これまでに言及したように、本発明の範囲には、診断および治療応用における本発明に関するペプチドまたは多量体構造物の使用もまた含まれる。
【００１９】
さらに、本発明の範囲には、本発明のペプチドまたは多量体ペプチド構造物が診断剤（例えば、インビボもしくはインビトロ・アッセイのための検出可能な分子）または治療剤（例えば、活性化内皮細胞、腫瘍細胞または活性化の際に細胞表面にＣＤ１５４を発現できる他のいずれかの細胞に対して、細胞傷害効果を発揮することができる抗炎症剤、抗腫瘍剤または細胞傷害剤）と連結され、インビボもしくはインビトロでの検出を可能にするコンジュゲート、ならびにＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用に関係する多くの疾患もしくは障害の処置のための医薬を製造するためのコンジュゲートが含まれる。そのような疾患または状態の例としては、炎症性疾患（例えばアテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、移植による拒絶反応、関節炎を伴う炎症、接触皮膚炎、高ＩｇＥ症候群、炎症性腸疾患、アレルギー性喘息を含むアレルギー、特発性炎症性疾患）、腫瘍性疾患（例えば慢性リンパ性白血病）、移植片対宿主病が含まれる。自己免疫疾患の例としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、クローン病、乾癬がある。本発明のペプチドまたは多量体構造物あるいはコンジュゲートは、免疫寛容の誘導のための使用にも適している。
【００２０】
合成ペプチドは、分子間の相互作用を阻害するための、ｍＡｂの代替的アプローチを示す。合成ペプチドの使用を下支えする理論は、タンパク質はただ外部の狭い領域だけを介してその生物学的作用を発揮するのであり、そのわずか２個、３個のアミノ酸だけが特有の受容体機能に重要であるというものである。従って、必須のアミノ酸残基を保持するより短い立体構造的に正しい形式で、その領域に対応した配列を合成することができる。このように、標的とする受容体の活性部位を特異的に認識するが、生物学的に不活性であり立体的な障害を与え、それにより受容体とその天然タンパク質との間の相互作用を妨害する短いペプチドを得ることが可能である。アゴニストと受容体との間の相互作用を模倣することができる、そのようなペプチドの主な理論的な利点は、その限られた大きさであり、それは該ペプチドを水中で容易に可溶化させ、非免疫原性とさせ、該ペプチドが長期間投与されることを可能にする（Allen S.D. et al, J. Peptide Res. 2005; Ladner R.C. et al, DDT 2004）。
【００２１】
しかしながら、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を効果的に阻害することができるアミノ酸配列を同定することは、自明な結果ではない。以下でさらに詳細に例示されるように、本発明のペプチド配列（配列番号：１３または配列番号：１６）の単一アミノ酸残基のモディファイでさえ、事実上、ヒトＣＤ１５４の活性部位に対する結合能を失わせることとなり、結果としてペプチドの阻害能が無くなることとなる。
【００２２】
上述のように、本発明に関するペプチドは、配列表中の配列番号：１３で示されるアミノ酸配列または配列番号：１６で示されるペプチド配列を含む。該ペプチドは、ヒトＣＤ１５４の活性部位に対して非常に高い結合特異性を示す。該ペプチドは、ＣＤ１５４の活性部位を認識し結合することができ、結果としてインビボおよびインビトロの両方でその受容体を効果的に阻止でき、該相互作用に起因する生物学的作用を阻害することとなる。以下の説明において、配列番号：６からなる本発明のペプチドは、「ペプチド４．１０」で示される。
【００２３】
以下の実験の項で例示される結果は、本発明のペプチド４．１０が、組み換え体の可溶型のヒトＣＤ１５４（組み換えヒト可溶性ＣＤ１５４、またはｒｈｓＣＤ１５４）による刺激によってＢ細胞上のＣＤ４０の活性化を妨害できることを示す。ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用に対して発揮される干渉作用は、Ｂ細胞の活性化および結果として生じる免疫応答の両方を妨げる。本発明者らは、ペプチド４．１０が、Ｂ細胞に対する他の補助刺激分子、例えばＣＤ８０およびＣＤ８６の誘導を阻害し、同様に免疫グロブリンのアイソタイプスイッチの誘導も阻害できることを実際に示した。さらに、ペプチド４．１０は、遊走するおよび血管様構造物を形成する細胞の能力として評価される内皮細胞のｒｈｓＣＤ１５４誘導型の活性化を、インビトロで阻止することができる。ペプチド４．１０のそのような抗血管形成活性は、ＳＣＩＤマウスでのネズミ血管形成マトリゲル・モデルにおいて、インビボでさらにはっきりと確認でき、そのことを以下でより詳細に記載する。最後に、本発明者らにより得られた予備的なデータは、ペプチド４．１０がＣＬＬ患者由来のＢ細胞に劇的なアポトーシスを誘導することができることを示す。
【００２４】
短いペプチドを含むコンジュゲートおよび医薬組成物の調製および投与技術のさらなる詳細は、先行技術において知られており；それは本発明の理解に本質的なものではないため、その詳述は本明細書には必要ない。
【００２５】
以下の実験の項で説明するように、本明細書は、ヒトＣＤ１５４に特異的に向けられる７個のアミノ酸配列の同定を説明する。特に、ヒトＣＤ１５４に結合することができる７個の環状エプタ−ペプチドが選択され、特徴づけられた。ヒトＣＤ１５４のＮ末端ドメインを含む融合タンパク質を、ペプチドを選択するために用いた。７個の選択された及び特徴づけられたエプタ−ペプチドの中で、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を阻害できることが実際に確認された唯一のものが、本発明のペプチド４．１０である。さらに、ペプチド４．１０のアミノ酸配列を、ペプチド４．１０の有用な代替形態を選りすぐる試みの中で、１個もしくは２個のアミノ酸残基を変異によりモディファイした。しかしながら、その代替形態はいずれも、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を阻害する能力を維持せず、その相互作用に関係する生物学的作用も維持しなかった。
【００２６】
以下で示される添付図および表を含み、以下の詳細な記載は、単なる例示として提供される。
【実施例１】
【００２７】
図１のヒストグラムは、細胞表面上でのヒトＣＤ１５４発現のためにトランスフェクトされたネズミ骨髄腫細胞系のＪ５５８Ｌ細胞に対する、選択されたファージクローンの結合性を示す。この細胞に対して選択されたファージの結合性は、Ｊ５５８Ｌ細胞をファージとインキュベートさせ、次いで抗Ｍ１３モノクローナル抗体とインキュベートさせて、フローサイトメトリーにより実際に示された。各実験条件について１０，０００事象を分析し、その値は３回の別個の実験の平均値および標準偏差である。１２個の選択したクローンはすべてＪ５５８Ｌ細胞と結合する。
【００２８】
表１は、ヒトＣＤ１５４結合性クローンから得られたペプチド挿入体の７個のアミノ酸配列を示す。４．１、４．５および４．９と称するクローンの挿入体は組み換えにより失われ、一方で４．２および４．３と称するクローンの挿入体ならびに４．７および４．１２と称するクローンの挿入体は同一であることが確認された。
【００２９】
図２は、ヒトＣＤ１５４結合性クローンから得られ６個のヒスチジン・テイル（−Ｈｉｓ６）がタグ付けされた７個のペプチドの、Ｊ５５８Ｌ ＣＤ１５４＋細胞に対する結合性を示す。この細胞へのペプチドの結合性は、フローサイトメトリーにより実際に示された。この細胞を、−Ｈｉｓ６タグ付きペプチドの各々とインキュベートし、次いで−Ｈｉｓ６テイルに特異的なフィコエリトリン複合体化（conjugated）二次抗体とインキュベートした。点線のヒストグラムは、アイソトープ対照（isotopic control）であり、一方、黒線はＣＤ１５４特異的ペプチドの結合強度である［４．２＝４．３＝ＣＰＳＧＨＴＫＡＣ（配列番号：１）、４．４＝ＣＧＴＨＳＳＲＩＣ（配列番号：２）、４．６＝ＣＬＧＴＱＮＫＥＣ（配列番号：３）、４．７＝４．１２＝ＣＴＰＧＫＰＨＳＣ（配列番号：４）、４．８＝ＣＫＡＡＳＡＮＩＣ（配列番号：５）、４．１０＝ＣＬＰＴＲＨＭＡＣ（配列番号：６）および４．１１＝ＣＬＳＡＶＨＮＭＣ（配列番号：７）］。各実験条件について１０，０００事象を分析し、その値は３回の別個の実験の平均値および標準偏差である。ペプチドはすべてＪ５５８Ｌ ＣＤ１５４＋細胞上のＣＤ１５４と特異的に結合することができ、対照体のＪ５５８細胞と結合できない。
【００３０】
図３Ａは、抗ＣＤ１５４ペプチドとＣＤ１５４の活性部位に特異的な抗ヒトＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体との間の競合を示す。ヒトＣＤ１５４をトランスフェクトしたネズミ骨髄腫細胞であるＪ５５８Ｌを、６個のヒスチジン・テイル（−Ｈｉｓ６）タグ付きの７個の抗ＣＤ１５４ペプチドと一緒にインキュベートし、次いで抗ＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体と一緒にインキュベートした。Ｊ５５８Ｌ細胞表面に発現されたＣＤ１５４との結合に関して抗ＣＤ１５４抗体と競合するペプチドの能力は、フローサイトメトリーにより、抗ヒトＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体を単独で用いてインキュベートした細胞により示される陽性対照と比較した蛍光強度の低下として評価した。ペプチド４．１０（配列番号：６）が、抗ヒトＣＤ１５４抗体と競合でき、その結合性を有意に示すことができた唯一のものであることは、図から明らかである。図３Ｂは、ペプチド４．１０と、対照として用いられるペプチド４．１０−ａｌａ（配列番号：８）との比較を示す。対照ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチド４．１０のアミノ酸配列とは、５番目のアミノ酸であるアルギニン残基がアラニン残基に置換されている点で異なっている。図３Ｂで明らかに示されるように、このアルギニン残基を欠くことで、ヒトＣＤ１５４に対して抗ＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体と競合する該ペプチドの能力が完全に不活化する結果となるため、そのアルギニン残基が必須であることは明らかである。
【００３１】
４Ａのヒストグラムは、可溶性の組み換えヒトＣＤ１５４分子（ｒｈｓＣＤ１５４）を用いた刺激により誘導された活性Ｂ化細胞に対する抗ＣＤ１５４ペプチドおよび対照ペプチド４．１０−ａｌａの効果を示す。ブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体または７個の選択されたペプチドのいずれか１個の非存在下もしくは存在下で、Ｂ細胞をｒｈｓＣＤ１５４を用いて４８時間刺激した。末梢Ｂ細胞の活性化は、フローサイトメトリーにより、補助刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６の膜発現で評価した。図４Ａで明らかに示されるように、ヒト可溶性ＣＤ１５４（ｒｈｓＣＤ１５４）を用いた４８時間のＢ細胞の刺激は、細胞表面でのＣＤ８０およびＣＤ８６の強い発現を誘導する。対照的に、ｒｈｓＣＤ１５４をブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と又はペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせて用いた場合、その活性化は抑制される。残りのペプチドはいずれも、ｒｈｓＣＤ１５４誘導型のＢ細胞の活性化を有意に阻害することはできない。図４Ｂは、サイトメトリー分析の詳細を示す。
【００３２】
図５Ａは、刺激しない基底条件下での、ＩＬ４およびＣＤ１５４を用いた７２時間の刺激後、ブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と組み合わせたＩＬ４およびＣＤ１５４を用いる７２時間の刺激後、またはペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせたＩＬ４およびＣＤ１５４を用いる７２時間の刺激後の、アイソタイプスイッチを受けてＩｇＧを発現するナイーブＢ細胞の存在をそれぞれ示す。ペプチド４．１０（配列番号：６）は、ちょうど抗ＣＤ１５４抗体のように、ｒｈｓＣＤ１５４およびＩＬ４による刺激によって誘導される免疫グロブリンのアイソタイプスイッチを強力に阻害することができる。図５Ｂは、サイトメトリー分析の詳細を示す。
【００３３】
図６は、ペプチド４．１０（配列番号：６）の、対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）の、またはブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体の非存在下または存在下での、ＨＵＶＥＣ（ＨＵＶＥＣ＝ヒト臍静脈内皮細胞）の運動性に対するＣＤ１５４誘導性の刺激効果を示す。特に、図６Ａは、様々な実験条件下で４時間の期間にわたり、細胞遊走のタイムラプス・キネティクスを示し；図６Ｂは、上記の実験条件下で刺激後３０分間で細胞の遊走速度に観察された差異を示し；図６Ｃは、タイムラプス分析の代表的な画像を示す。対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）とは反対に、ペプチド４．１０（配列番号：６）は、内皮細胞のｒｈｓＣＤ１５４誘導性の運動性を阻害する。
【００３４】
図７Ａは、刺激なしの基底条件下での或いはブロッキング抗ＣＤ１５４抗体またはペプチド４．１０（配列番号：６）または対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）のいずれかの存在／非存在下での、ｒｈｓＣＤ１５４による刺激後に血管様の細胞コードを形成するマトリゲルに撒かれたＨＵＶＥＣの能力を示す。図７Ｂ〜Ｆは、上記の様々な実験条件下、マトリゲル上での細胞コード形成能についての代表的な画像を示す（Ｂ＝刺激なしの対照；Ｃ＝ｒｈｓＣＤ１５４；Ｄ＝ｒｈｓＣＤ１５４＋４．１０ペプチド；Ｅ＝ｒｈｓＣＤ１５４＋４．１０−ａｌａペプチド；Ｆ＝ｒｈｓＣＤ１５４＋ブロッキング抗ＣＤ１５４抗体）。本発明のペプチド４．１０（配列番号：６）は、ペプチド４．１０−ａｌａ（配列番号：８）と対照的に、細胞コードを形成する内皮細胞のｒｈｓＣＤ１５４誘導性の能力を阻害する。
【００３５】
図８は、２５０μｌのマトリゲルと組み合わせ、ＳＣＩＤマウスの臀部に皮下接種した内皮ＨＵＶＥＣ細胞に対するペプチド４．１０の存在／非存在下でのｒｈｓＣＤ１５４誘導刺激のインビボ効果を示す。接種の７日後に、マウスを屠殺し、移植片を取り出し、１０％ホルマリン溶液中で固定化し、パラフィンに包埋し、組織分析のために調製した。図８Ａは、ヘマトキシリン−エオシン染色した組織切片において、基底条件下およびそれ以外の上記実験条件下での血管形成領域の量子化（quantization）を示す。図８Ｂおよび８Ｃは、ｒｈｓＣＤ１５４を単独で用いた及びペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせてｒｈｓＣＤ１５４を用いた内皮細胞の刺激により得られた血管形成の代表的な２枚の画像をそれぞれ示す。各実験条件に対して、６匹のＳＣＩＤマウスを用いた。ペプチド４．１０は、インビボでのｒｈｓＣＤ１５４誘導性の血管形成を完全に阻害する。
【００３６】
図９は、ＩＬ−４刺激により誘導されるＣＬＬ細胞の生存を阻害する、本発明のペプチド４．１０（配列番号：６）の能力を示す。
【００３７】
図１０は、０．５μＭのＡＤＰを単独で用いて刺激することによる、あるいはｒｈｓＣＤ１５４を用いて又はペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせたｒｈｓＣＤ１５４を用いて又はｒｈｓＣＤ１５４および抗ヒトＣＤ１５４抗体からなる免疫複合体と組み合わせたｒｈｓＣＤ１５４を用いて３７℃で１０分間刺激した後に０．５μＭのＡＤＰを用いて刺激することによる、ヒト血小板凝集を示す。血小板凝集は、血小板凝集計を用い、対照と比較した光透過性の増加として測定した。ｒｈｓＣＤ１５４と組み合わせたヒトＣＤ１５４抗体によるヒト血小板のプライミングは、０．５μＭのＡＤＰを用いた刺激により血小板凝集を増大させる。反対に、単独のｒｈｓＣＤ１５４またはペプチド４．１０と組み合わせたｒｈｓＣＤ１５４は、０．５μＭのＡＤＰを用いた刺激により誘導される血小板凝集レベルに影響を及ぼさない。これらの結果は、本発明のペプチド４．１０（配列番号：６）とＣＤ１５４分子との相互作用は、血小板凝集を誘導することはないが、これとは対照的に、抗ＣＤ１５４抗体との相互作用では血小板凝集が誘導される。
【００３８】
以下の実験の項は、単なる例示として提供され、添付する特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定することは意図しない。
【００３９】
実験の項
この研究を通して、７個のアミノ酸残基とジスルフィド結合による環化を可能にする両端で側面に位置する２個のシステインを含むペプチド配列パネルから成り、Ｍ１３ファージで発現され、キャプシドｐＩＩＩファージタンパク質と遺伝子工学的に融合され、そのファージ表面に無作為に発現される、ペプチドライブラリー（ペプチドの多様性＜１０９）を用いた。このファージライブラリーを、既知のモデル（Hetian L. et al, J. Biol. Chem. 2002）から本発明者らにより発展されたバイオパニング・インビトロ・モデルによってスクリーニングした。ファージ（２００μｌのＴＢＳ中、１×１０１１ＣＦＵ）を、ヒト組み換えＣＤ１５４と一緒に室温で１時間インキュベートして、その後プレートに撒いた。このファージをＴＢＳ−Ｔを用いて数回洗浄してＣＤ１５４と結合していない非特異的なファージを取り除き、ＣＤ１５４と結合したファージを、１００μｌの０．２Ｍ グリシン、ｐＨ２．２を用いて溶出することにより回収し、１５μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．１を用いて１０分間中和した。ファージ数は、溶出液の段階希釈物をＬＢ寒天培地（アガロース７ｇ／リッター、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ １ｇ；Sigma）上の宿主のテトラサイクリン耐性の大腸菌ＥＲ２７３８細胞（New England Biolabs, Hitchin, U.K.）に加え、テトラサイクリン（Kramel Biotech, Cramlington, U.K.）存在下のＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ ＬＢ寒天培地に撒いて、滴定することにより評価した。
【００４０】
３７℃で１２時間のインキュベーション後に、青プラークとしてプレート上で目視できるファージコロニーの数を計数した。評価したファージを、テトラサイクリン存在下のＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ ＬＢ寒天培地のプレート上でファージを培養することにより増幅し、３．３％のポリエチレングリコール８，０００／０．４ ＮａＣｌ（Sigma）中で遠心分離することにより沈殿させた。次いで、そのファージを上記のように滴定し、ヒト組み換えＣＤ１５４で被覆した新しいプレート上で再度インキュベートした。スクリーニング過程および増幅過程を４回繰返して、ヒトＣＤ１５４特異的なファージクローンのライブラリーを豊富化した。４回目の増幅ラウンドの後に、１２個のファージクローンを無作為に選び出し、個々に増幅し、細胞表面で発現するＣＤ１５４を認識するその能力を試験した。選択された個々のクローンの特異的な結合性は、参照細胞系としてＪ５５８Ｌと称されるヒトＣＤ１５４の発現のためにトランスフェクトされたネズミ骨髄腫細胞系を用いたフローサイトメトリーにより、インビトロで実際に示した。室温で３０分間のインキュベーション後のファージ（１０１１ｃｆｕ）のＪ５５８Ｌ細胞に対する結合性は、その細胞をファージタンパク質Ｍ１３に対するモノクローナル抗体（Pharmacia, Uppsala, Sweden）と一緒にインキュベートし、続いて抗マウス・フィコエリトリン複合体化抗体（Sigma）と一緒にインキュベートする間接免疫蛍光法によるフローサイトメトリーによって検出した。図１で示されるように、１２個のファージクローンはすべて、ヒトＣＤ１５４発現細胞（Ｊ５５８Ｌ）と特異的に結合できたが、その対照体であるＣＤ１５４−陰性（Ｊ５５８）細胞とは結合しなかった。
【００４１】
この１２個のファージクローンのペプチド挿入体の配列決定により、表Ｉに列記される７個の異なる配列が得られた。ペプチドを合成し、インビトロおよびインビボでの局在を容易にするためにビオチン（−ｂｉｏ）または６−ヒスチジン・テイル（−ｈｉｓ６）と複合体化させた。同様に、このペプチドのＪ５５８Ｌ細胞に対する結合性は、細胞をｈｉｓ６タグ付きペプチド（６０μＭの−ｈｉｓ６ペプチド）と一緒に室温で３０分間インキュベートし、次いで抗ポリヒスチジン−フィコエリトリン複合体化抗体（Sigma）と一緒に４℃で３０分間インキュベートして、フローサイトメトリーにより実際に示した。７個の選択されたペプチドはすべて、Ｊ５５８Ｌ ＣＤ１５４＋細胞に対して良好な親和性を示した。さらに、該ペプチドと、ＣＤ１５４の活性部位を特異的に認識する抗ヒトＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体（Serotec）との競合アッセイを行った。Ｊ５５８Ｌ細胞を、ｈｉｓ６−ペプチドと一緒に室温で３０分間インキュベートし、次いで、抗ヒトＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体と一緒にさらに３０分間室温でインキュベートした。図３Ａは、ペプチド４．１０が、抗ヒトＣＤ１５４フルオレセイン複合体化抗体とＪ５５８Ｌ細胞との相互作用を有意に阻害できる唯一のものであることを示す。ペプチド４．１０のアミノ酸配列中の、ＣＤ１５４との結合に必須のアミノ酸残基を特定するために、３種の異なるペプチドを合成し、その各々は、点突然変異を有しており、それらは４番目、５番目、６番目のアミノ酸配列がそれぞれアラニン残基に置換されることによりペプチド４．１０のアミノ酸配列とは異なっている。
【００４２】
変異ペプチドは、Ｊ５５８Ｌ細胞表面に発現されたヒトＣＤ１５４を認識することができなかった（データは示さない）。最も低い反応性のペプチド、４．１０−ａｌａと称するアミノ酸配列ＣＬＰＴＡＨＭＡＣ（配列番号：８）を有するペプチドを、対照ペプチドとして選んだ（図３Ｂ）。
【００４３】
同様の結果が、表ＩＩで列記されるアミノ酸配列を有する４個の改変されたペプチド４．１０１、４．１０２、４．１０３および４．１０４を用いて得られた。これらのペプチドはいずれも、ＣＤ１５４＋ Ｊ５５８Ｌの細胞表面に発現されたヒトＣＤ１５４と結合しないことが示された（データは示さない）。
【００４４】
Ｂ細胞は、その細胞膜上でＣＤ４０分子を構成的に発現することが知られている（van Kooten C. et al, J. Leukoc. Biol. 2000）。ＣＤ１５４を発現する活性化Ｔ細胞によるＣＤ４０の刺激は、結果としてＢ細胞の活性化、増殖およびアイソタイプスイッチを引き起こす。本発明者らは、フィコール・グラジエント遠心分離法および免疫磁気分離法（ＭＡＣＳシステム−Milteniy）により、健常ドナーの末梢全血から分離したＢ細胞を用いた。次いで、それにより得られた休止期のＢ細胞を、可溶型のヒト組み換えＣＤ１５４（ｒｈｓＣＤ１５４）を用いて刺激し、細胞膜上での補助刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）の活性化および発現を誘導した。ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）による４８時間の刺激後に、末梢Ｂ細胞の細胞表面上にＣＤ８０およびＣＤ８６の膜発現において劇的な増加が観察された。この発現は、それぞれ、基底レベルと比較して３００％および２７４％にまで増加した。対照的に、リンパ球刺激の前にペプチド４．１０（配列番号：６）と一緒にｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）で３７℃にて１５分間あらかじめインキュベートすることで、Ｂ細胞刺激およびその関連するＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を阻止した。ペプチド４．１０（配列番号：６）の阻害作用は、６０μＭの濃度でピークに達し、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現はそれぞれ１０７％および１３０％にまで低下した（図４Ａおよび４Ｂ）。その効果はより低い濃度（３０μＭ）の場合でさえ観察することが可能であった。
【００４５】
反対に、同じ濃度（６０μＭ）の他のペプチドと一緒にｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いてあらかじめインキュベートしても、ｒｈｓＣＤ１５４による刺激によって誘導されるＣＤ８０およびＣＤ８６の発現に有意な影響はなかった。より高い濃度（２５０μＭ）では、ペプチド４．６（配列番号：３）および４．１１（配列番号：７）はまた、Ｂ細胞活性化の阻害を示した：特に、ペプチド４．６（配列番号：３）は、ＣＤ８０の発現を１１７％に及びＣＤ８６の発現を１２２％に低下させたが、一方で、ペプチド４．１１（配列番号：７）の効果は安定した再現性はなかった。反対に、対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）は、２５０μＭの濃度でさえｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）と一緒にあらかじめインキュベートしても、ｒｈｓＣＤ１５４による刺激によって誘導されるＣＤ８０およびＣＤ８６の発現には影響せず、またＢ細胞の活性化を有意に低下させることもなく、さらにＣＤ８０およびＣＤ８６の発現レベルを低下させることもなかった（図４Ａ）。ブロッキング対照として、実施した全ての実験でＢ細胞の刺激前に、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）をブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体（Alexis）と一緒に３７℃で１５分間あらかじめインキュベートすることで、ＣＤ４０媒介型のＢ細胞の活性化を完全に阻害し、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を基底レベルにまで低下させた（図４Ａおよび４Ｂ）。この結果は、５回の別個の実験の平均値±標準偏差である。
【００４６】
同様の結果はまた、ヒト脾臓フラグメントから単離されたＢ細胞を用いて得られた。さらに、ナイーブＢ細胞集団で行われた別の実験でも、ペプチド４．１０がＣＤ４０媒介型のＢ細胞Ｉｇのアイソタイプスイッチを効果的に阻害することが示された。これらの実験は、免疫磁気分離法（ＭＡＣＳシステム Milteniy）によりＢ細胞プールから成熟リンパ球を失わせることによる陰性選択によって末梢血から得られたＣＤ２７−ナイーブＢ細胞で行った。本発明者らは、ナイーブＢ細胞を、ＩＬ−４（０．４ｎｇ／ｍｌ）およびｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下の低グルコースＤＭＥＭ（Sigma）中で９６時間培養した場合に、膜ＩｇＧを発現するＢ細胞の数に有意な増加（２５％）が誘導されたことを実際に示した。対照的に、ペプチド４．１０（配列番号：６）と組み合わせたＩＬ４（０．４ｎｇ／ｍｌ）およびｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激されたＢ細胞は非常に低い割合でアイソタイプスイッチを受けた（図５Ａおよび５Ｂ）。同様に、ブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と組み合わせたＩＬ４（０．４ｎｇ／ｍｌ）およびｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）によるナイーブＢ細胞の刺激では、アイソタイプスイッチは誘導されなかった（図５Ａおよび５Ｂ）。
【００４７】
炎症過程は、ひとたび誘発されると特定の受容体またはリンパ球補助刺激分子、例えばＣＤ４０およびそのリガンドＣＤ１５４を発現する免疫系以外の細胞、例えば血管壁の内皮細胞により保存されうることが知られている。かくして、本発明者らは、ペプチド４．１０（配列番号：６）が、リンパ球刺激および／または成熟を阻害することに加えて、内皮細胞の細胞表面に発現されるＣＤ４０分子の刺激を阻止して、炎症を制限できることを実際に示した。本発明者らは、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）の投与による内皮ＣＤ４０刺激によって誘導される血管新生誘導効果は、単一細胞の遊走および基底マトリクス（マトリゲル）上で血管様の細胞コードを形成する細胞の能力の両方のようにインビトロ評価され、本発明の抗ＣＤ１５４ペプチド４．１０（配列番号：６）を用いてｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）を３７℃で１５分間あらかじめインキュベートすることにより阻害されたことが実際に示された。特に、細胞遊走実験は、２０％血清存在下の完全内皮細胞培養液中４×１０３細胞密度でゼラチン上に撒かれたＨＵＶＥＣ細胞を用いて実施した。後日、その内皮培地は、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下もしくは非存在下の減少した血清濃度（５％）を含む低グルコースＤＭＥＭ（Sigma）に交換した。
【００４８】
さらに、阻害効果を評価するために、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）を、ペプチド４．１０（配列番号：６）と又は対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）と又はブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と一緒に３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、フラスコを、恒温チャンバー（約３７℃）を備えた位相差倒立顕微鏡下で４時間、１０×倍率で観察した。細胞を、顕微鏡に繋がれたカメラを用いて規則的に１５分間隔で４時間の全期間にわたって撮影した。各細胞の遊走速度は、画像分析ソフトウェアを用いて、各単一フレームにおいて各単独細胞それぞれの核の位置に基づいて計算し、結果として、平均の細胞遊走速度（±標準偏差）を各実験条件ごとに計算した。図６Ａおよび６Ｂで示されるように、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）による内皮ＣＤ４０の刺激は、細胞の基底の運動性（１時間あたり常に１２μｍ未満）において約３５０％（１時間あたり４２μｍ）の増加を誘導し、一方でｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）をペプチド４．１０（配列番号：６）と共に３７℃で１５分間あらかじめインキュベートすることで、ならびにブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と一緒にあらかじめインキュベートすることで、細胞の運動性は基底レベルまで顕著に低下した。反対に、対照ペプチド４．１０−ａｌａ（配列番号：８）は、内皮ＣＤ４０の刺激に影響を及ぼさなかった（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ）。
【００４９】
ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）によるヒト内皮ＣＤ４０刺激を妨げるペプチド４．１０の能力のさらなる確認として、ＨＵＶＥＣ（３．５×１０４）をインビトロ血管新生アッセイにかけた。ＨＵＶＥＣを、５％血清が補充された基底ＲＰＭＩ培地中、巨大な細胞の組織体の形成を促進することができる腫瘍マトリックス（tumor matrix）（マトリゲル、ＢＤ）上に撒いた。３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベーションして、細胞を位相差倒立顕微鏡下で観察した。図７Ａおよび７Ｂは、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）による刺激が、４時間後にすでに複雑な内皮ネットワークの形成を誘導したが、一方でｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）をペプチド４．１０（配列番号：６）と一緒に、ならびにブロッキング抗ヒトＣＤ１５４抗体と一緒に３７℃で１５分間あらかじめインキュベートすることで、刺激を完全に無効にした（図７Ａ、７Ｄおよび７Ｆ）。反対に、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）を対照ペプチドの４．１０−ａｌａ（配列番号：８）と一緒に３７℃で１５分間あらかじめインキュベートすることでは、血管様の細胞コードを形成する細胞の能力に影響を及ぼさなかった（図７Ｅ）。他の抗ヒトＣＤ１５４ペプチド、例えば活性部位と特異的に結合しない４．６（配列番号：３）および４．１１（配列番号：７）は、内皮のＣＤ４０刺激を有意に低下させることはできなかった（データは示さない）。
【００５０】
最後に、ペプチド４．１０の抗血管形成作用を、インビボ血管形成アッセイで試験した。２００μｌのＨＡＮＫ溶液中に再懸濁した内皮ＨＵＶＥＣ細胞（２×１０６）を、ｒｈｓＣＤ１５４（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む液状の５００μｌのマトリゲルと混合し、ペプチド４．１０（配列番号：６）の存在下および非存在下でＳＣＩＤマウスの右側の臀部および左側の臀部にそれぞれ皮下接種した。６日後に、マウスを屠殺し、マトリゲルプラグを回収し、１０％ホルマリン溶液中で少なくとも２４時間固定化し、次いで免疫組織分析のために処理した。ＨＵＶＥＣおよびｒｈｓＣＤ１５４移植片のヘマトキシリン−エオシン染色した組織切片は、強い血管形成を示し（図８Ａおよび８Ｂ）、ｓＣＤ１５４をペプチド４．１０（配列番号：６）であらかじめインキュベートした接種では著しく阻害されたか又は完全に見られず、そこでは大部分の細胞がアポトーシスを受けていた（図８Ａおよび８Ｃ）。
【００５１】
ペプチド４．１０（配列番号：６）は、インビボで得られたＣＬＬ腫瘍細胞のＩＬ−４存在下での培養による生存を阻害できることもはっきり示した。ＣＬＬ細胞のアポトーシスに対する耐性および増強された生存は、慢性リンパ性白血病患者におけるインビボでのこれらの腫瘍細胞の伸展（expansion）によるものと考えられる。これらの結果は、ＣＤ４０とそのリガンドであるＣＤ１５４との相互作用が、ＣＬＬ細胞の生存を刺激するのに重要であること、およびＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用のＣＤ１５４の活性部位を認識することができるペプチドによる阻害が、これらの細胞の生存を阻害しうることを示す（図９）。
【００５２】
最後に、ペプチド４．１０の主な利点の１つは、ヒト血小板に対する反応性を欠いていることである。これまで、有望な抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体を試験するために実施された多くの臨床試験が、劇的な血栓形成促進性の副作用により突然中断されたことが知られている（Kelsoe G. et al, J. Clin. Invest. 2003）。仮説は、抗ＣＤ１５４抗体が、免疫グロブリンＦｃ部分に対する受容体（ＦｃＲ）を発現するヒト血小板表面において交差反応を誘発し、活性化後にＣＤ１５４分子を誘発する、というものである。したがって、本発明者らは、血小板凝集アッセイにより、ペプチド４．１０の血小板に対する作用を試験した。このような実験は、磁気攪拌器およびリアルタイム光学密度計を備えた恒温凝集計を使用して行った。血小板の凝集は、参照試料（ブランク）に対する光学密度の変化として評価した。この実験は、５Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む試験管に収集された健常ドナーの末梢全血から抽出された血小板で行った。特に、多血小板血漿（platelet enriched plasma：ＰＲＰ）は９００ｒｐｍで２０分間の全血の遠心分離により得られ、一方で参照試料として用いられる少血小板血漿（platelet poor plasma：ＰＰＰ）は３０００ｒｐｍで１０分間の別の遠心分離後の上清を回収することにより得られた。Langer（Langer F. et al, Thromb. Haemost. 2005）により既に示されたように、血小板を組み換えヒト可溶性ＣＤ１５４および抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体からなる免疫複合体と一緒に３７℃で１０分間インキュベートすることによるプライミングは、０．５μＭのＡＤＰによる次の刺激により誘導される血小板の凝集を増強した（図１０）。対照的に、ＣＤ１５４単独による又はペプチド４．１０（６０μＭ）との組み合わせによるプライミングは、０．５μＭのＡＤＰによる刺激により誘導される血小板の凝集を増強しなかった（図１０）。同様の結果が、０．３Ｕ／ｍｌのトロンビンを用いて血小板凝集を誘導することで得られた。
【００５３】
内皮細胞は、特に炎症部位で、その表面に高頻度でＣＤ４０を発現するため、および血管形成は幾つかの炎症過程および炎症性疾患の発症において主要な役割を果たしうるため、本発明の４．１０ペプチドの上記特性により、該ペプチドは見込みのある抗炎症アプローチの開発に関する非常に有望な分子である。さらに、４．１０ペプチド（配列番号：６）により発揮されるリンパ球活性化における阻害作用は、移植または腫瘍細胞増殖がＣＤ４０による刺激に起因する抗アポトーシス作用によって支援される腫瘍性疾患、例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）に対する免疫抑制治療として、この分子の見込みのある使用を提供する。
【００５４】
【表１】
（＊）本発明に関するペプチド
【００５５】
【表２】
【００５６】
参考文献
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【００５７】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１５４受容体の活性部位に選択的に結合することができ、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を阻害することができるペプチドであって、配列番号：１３で示されるＣＤ１５４結合性のエプタ−アミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項２】
７アミノ酸長から３０アミノ酸長である、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号：１３で示されるＣＤ１５４結合性のアミノ酸配列が、該配列の両端の側面に２個のシステインをさらに含み、それにより配列番号：６で示されるノナ−アミノ酸配列を提供することとなる、請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号：６で示されるアミノ酸配列からなる、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
環状である、請求項３または４記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドの複数のコピーを含む、多量体構造物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドの各コピーが、直鎖または環状のいずれかである、請求項６記載の多量体構造物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドの各コピーが、少なくとも１つの他のコピーと少なくとも1つのアミノ酸スペーサーにより連結されている、請求項６または７記載の多量体構造物。
【請求項９】
アミノ酸スペーサーが、Ｇｌｙ（Ｇ）残基である、請求項８記載の多量体構造物。
【請求項１０】
ペプチドの各コピーが、直接または間接的に連結されるアミノ酸コアを含む、請求項８または９記載の多量体構造物。
【請求項１１】
アミノ酸コアが、複数のＬｙｓ（Ｋ）残基からなる、請求項１０記載の多量体構造物。
【請求項１２】
ペプチドが、配列番号：１３で示される直鎖のエプタ−アミノ酸配列からなる、請求項６〜１１のいずれか一項記載の多量体構造物。
【請求項１３】
以下の構造
【化１】
［式中、ＬはＬｅｕであり、ＰはＰｒｏであり、ＴはＴｈｒであり、ＲはＡｒｇであり、ＨはＨｉｓであり、ＭはＭｅｔであり、ＡはＡｌａであり、ＧはＧｌｙであり、およびＫはＬｙｓである］
からなる、請求項１２記載の多量体構造物。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項記載の少なくとも１つのペプチド、または請求項６〜１３のいずれか一項記載の少なくとも１つの多量体構造物を含み、生体分子、診断剤および治療剤からなる群より選択される分子と複合体化された、コンジュゲート。
【請求項１５】
治療剤が、抗炎症性剤、免疫抑制剤、免疫調節剤または抗腫瘍剤である、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
治療剤が、活性化内皮細胞、腫瘍細胞または活性化によりその表面にＣＤ１５４を発現する細胞に対して細胞傷害効果を発揮することができる、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
診断剤が、インビボで検出可能な分子である、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
診断剤が、インビトロアッセイのための検出可能な分子である、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
医薬としての、請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチド、または請求項６〜１３のいずれか一項記載の多量体構造物。
【請求項２０】
ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用に関係する疾患または障害の処置のための医薬を製造するための、請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項６〜１３のいずれか一項記載の多量体構造物の使用。
【請求項２１】
疾患または障害が、炎症である、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
炎症が、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患または移植による拒絶反応から選択される炎症性疾患である、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、クローン病または乾癬である、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
炎症が、関節炎を伴う炎症、接触皮膚炎、高ＩｇＥ症候群、炎症性腸疾患、アレルギー性喘息を含むアレルギーおよび特発性炎症性疾患からなる群より選択される、請求項２１記載の使用。
【請求項２５】
移植による拒絶反応が、移植された膵臓の膵島細胞、皮膚、骨髄、肝臓、心臓および腎臓を含む、請求項２２記載の使用。
【請求項２６】
疾患が、腫瘍性疾患である、請求項２０記載の使用。
【請求項２７】
腫瘍性疾患が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
疾患が、移植片対宿主病である、請求項２０記載の使用。
【請求項２９】
請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項６〜１３のいずれか一項記載の多量体構造物の有効量、および医薬上許容されるビヒクルおよび／または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１】
ＣＤ１５４受容体の活性部位に選択的に結合することができ、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を阻害することができるペプチドであって、配列番号：１３で示されるＣＤ１５４結合性のエプタ−アミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項２】
７アミノ酸長から３０アミノ酸長である、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号：１３で示されるＣＤ１５４結合性のアミノ酸配列が、該配列の両端の側面に２個のシステインをさらに含み、それにより配列番号：６で示されるノナ−アミノ酸配列を提供することとなる、請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号：６で示されるアミノ酸配列からなる、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
環状である、請求項３または４記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドの複数のコピーを含む、多量体構造物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドの各コピーが、直鎖または環状のいずれかである、請求項６記載の多量体構造物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドの各コピーが、少なくとも１つの他のコピーと少なくとも1つのアミノ酸スペーサーにより連結されている、請求項６または７記載の多量体構造物。
【請求項９】
アミノ酸スペーサーが、Ｇｌｙ（Ｇ）残基である、請求項８記載の多量体構造物。
【請求項１０】
ペプチドの各コピーが、直接または間接的に連結されるアミノ酸コアを含む、請求項８または９記載の多量体構造物。
【請求項１１】
アミノ酸コアが、複数のＬｙｓ（Ｋ）残基からなる、請求項１０記載の多量体構造物。
【請求項１２】
ペプチドが、配列番号：１３で示される直鎖のエプタ−アミノ酸配列からなる、請求項６〜１１のいずれか一項記載の多量体構造物。
【請求項１３】
以下の構造
【化１】
［式中、ＬはＬｅｕであり、ＰはＰｒｏであり、ＴはＴｈｒであり、ＲはＡｒｇであり、ＨはＨｉｓであり、ＭはＭｅｔであり、ＡはＡｌａであり、ＧはＧｌｙであり、およびＫはＬｙｓである］
からなる、請求項１２記載の多量体構造物。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項記載の少なくとも１つのペプチド、または請求項６〜１３のいずれか一項記載の少なくとも１つの多量体構造物を含み、生体分子、診断剤および治療剤からなる群より選択される分子と複合体化された、コンジュゲート。
【請求項１５】
治療剤が、抗炎症性剤、免疫抑制剤、免疫調節剤または抗腫瘍剤である、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
治療剤が、活性化内皮細胞、腫瘍細胞または活性化によりその表面にＣＤ１５４を発現する細胞に対して細胞傷害効果を発揮することができる、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
診断剤が、インビボで検出可能な分子である、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
診断剤が、インビトロアッセイのための検出可能な分子である、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
医薬としての、請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチド、または請求項６〜１３のいずれか一項記載の多量体構造物。
【請求項２０】
ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用に関係する疾患または障害の処置のための医薬を製造するための、請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項６〜１３のいずれか一項記載の多量体構造物の使用。
【請求項２１】
疾患または障害が、炎症である、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
炎症が、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患または移植による拒絶反応から選択される炎症性疾患である、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、クローン病または乾癬である、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
炎症が、関節炎を伴う炎症、接触皮膚炎、高ＩｇＥ症候群、炎症性腸疾患、アレルギー性喘息を含むアレルギーおよび特発性炎症性疾患からなる群より選択される、請求項２１記載の使用。
【請求項２５】
移植による拒絶反応が、移植された膵臓の膵島細胞、皮膚、骨髄、肝臓、心臓および腎臓を含む、請求項２２記載の使用。
【請求項２６】
疾患が、腫瘍性疾患である、請求項２０記載の使用。
【請求項２７】
腫瘍性疾患が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
疾患が、移植片対宿主病である、請求項２０記載の使用。
【請求項２９】
請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項６〜１３のいずれか一項記載の多量体構造物の有効量、および医薬上許容されるビヒクルおよび／または賦形剤を含む、医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５０５４０４（Ｐ２０１１−５０５４０４Ａ）
【公表日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３６４１３（Ｐ２０１０−５３６４１３）
【出願日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６６３４９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７１４８６
【国際公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【出願人】（５９７０７５９０４）フレゼニウス メディカル ケア ドイッチェランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (55)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６６３４９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７１４８６
【国際公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【出願人】（５９７０７５９０４）フレゼニウス メディカル ケア ドイッチェランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (55)
【Ｆターム（参考）】
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