ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターおよび使用
本発明は、ヒトＦＡＴＰ５タンパク質のプロモーターに対応することを特徴とする単離されたヒト核酸、および、前記プロモーターの依存下に置かれたタンパク質、特にヒトＦＡＴＰ５タンパク質をコードする単離されたヒト核酸に関する。本発明はさらに、前記核酸を含むベクター、または前記核酸または前記ベクターが導入された宿主細胞に関する。最後に、本発明は前記核酸、前記ベクターまたは前記宿主細胞の、ヒトＦＡＴＰ５タンパク質の前記プロモーターの依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質を同定する方法における使用、および当該同定方法に関する。発明は、最後に、ヒトＦＡＴＰ５タンパク質の前記プロモーターの依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質、および、前記物質の、糖尿病を予防および／または処置するための、または肝臓における脂肪酸のβ酸化を誘導するための医薬の製造への使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ヒトＦＡＴＰ５タンパク質のプロモーターに対応することを特徴とする単離ヒト核酸、および前記プロモーターの依存下に置かれた、タンパク質、特にヒトＦＡＴＰ５タンパク質をコードする単離ヒト核酸に関する。
本発明はさらに、前記核酸を含むベクター、または、前記核酸もしくは前記ベクターが導入された宿主細胞に関する。最後に、本発明は、ヒトＦＡＴＰ５タンパク質の前記プロモーターの依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質を同定する方法における、前記核酸、前記ベクターまたは前記宿主細胞の使用、および前記同定方法に関する。
本発明は、最後に、ヒトＦＡＴＰ５タンパク質の前記プロモーターの依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質、および、糖尿病を予防および／または処置するための、または、肝臓における脂肪酸のβ酸化を誘導するための医薬の製造における前記物質の使用に関する。
【０００２】
ＩＩ型糖尿病は、世界中において主要な公衆衛生上の問題である。現在、およそ１億２５００万人が本症に罹患しており、このうち米国内に存在する者だけで１５００万人を占める。予測は、２０１０年に、糖尿病に罹患している患者数が２倍になることを示している。現在米国で糖尿病を患っている９０〜９５％の人々がＩＩ型糖尿病に罹患している。ＩＩ型は、インスリン耐性と高血糖症とを特徴とする代謝病であり、しばしば高血圧、脂質障害および肥満を伴う。成人において、この病的状態は一般に３０才から現れ、心臓、血管、眼、腎臓および／または神経への損傷を含む合併症を特徴とする。
【０００３】
今のところ、残念なことに、原因に対する治療的および／または予防的処置は存在せず、処置は、一般に対症療法的となる傾向がある。
したがって、糖尿病の原因を処置することが可能な物質が真に求められている。また、糖尿病の原因を処置することができる前記物質を特定するために、前記物質を特定する効果的方法も常に変わらず求められている。
本発明の目的の１つは、そのような方法を提供することである。
【０００４】
長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）は生物のための重要なエネルギー源であり、ミトコンドリアにおけるそのβ酸化を介してＡＴＰを提供する。これらはまた、多数の多様な細胞過程、例えば細胞シグナリング経路または遺伝子発現の調節のための基質でもある。例として、脂肪酸は心臓にエネルギーの恒常的で効果的な供給を提供するために不可欠である。
ＬＣＦＡは、リポタンパク質リパーゼによる脂肪分解の後で粘膜の細胞に入り、そしてその後、小胞体でトリグリセリドにエステル化される。トリグリセリドはその後、アポリポタンパク質とともに脂肪粒子（lipoparticle）複合体内に組み込まれ、極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）またはキロミクロンを形成し、そしてエキソサイトーシスによって細胞から出て行き、全身循環中に廃棄される。リポタンパク質リパーゼは、これらの粒子を血管内皮細胞の表面で非エステル型脂肪酸に変換し、これは、その後アルブミンと結合することができる。
【０００５】
ラット細胞における脂肪酸の捕獲の動態は、最初の３０秒間にわたる急速な線形段階と、それに続く、初期捕獲速度の低減を伴う移行段階、および低い蓄積速度を有する後期に分けられる。最初の捕獲速度は、脂肪酸のベクトル的に一方向の流れに対応し、インキュベーション培地に適用される脂肪酸濃度の計算された作用によって特徴づけることができる。動態、ＬＣＦＡによる競合、およびプロテアーゼでの細胞の処理による脂肪酸輸送の抑制は、輸送体に媒介された過程を支持するものである。
【０００６】
最初の脂肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴＰ）は、ラット脂肪細胞において１９９４年に同定された。２つの対応する遺伝子がその後に同定され、そして現在はＦＡＴＰ１およびアシルコエンザイムＡシンテターゼ（ＡＣＳ）と呼ばれている。マウス遺伝子ライブラリーのスクリーニングにより、ＦＡＴＰファミリーの全ての成員における高度に保存された３１１個のアミノ酸からなるサイン配列（signature sequence）によって特徴づけられるタンパク質のファミリーが、その後明らかになった。これらはすべてＡＭＰ結合部位を含む。これまでに、６種のマウスＦＡＴＰおよび６種のヒトＦＡＴＰが同定された。コエンザイムＡシンテターゼ活性は、現在ＦＡＴＰ１、２、４および５に関連している。ＬＣＦＡ捕獲におけるこれらの役割は、これらの酵素活性から推論することができる。あるいは、ＦＡＴＰの発現は、遊離脂肪酸の細胞内レベルの増加を導くことができ、したがって、ＶＬＡＣＳ（超長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ）活性を誘導することができる。実際、アシル化に関与する酵素、例えばアシルコエンザイムＡシンテターゼ（ＡＣＳ）は、ＰＰＡＲ（ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体）転写因子およびある種の長鎖脂肪酸によって正に調節されている。
【０００７】
アシル化は、脂肪酸を活性化し、アシル−ＣｏＡの活性代謝誘導体を形成し、これはいかなる代謝経路にも入ることができるようになる。小胞体において、脂肪酸はトリグリセリドの合成に関与することができる。ミトコンドリアおよびペルオキシソームにおいて、ＦＡＴＰは脂肪酸の分解を誘導することができる。
ＦＡＴＰは、そのアミノ末端に応じて異なる細胞内位置を占めている。これらのＮ末端は、脂肪酸を異なる細胞内コンパートメントに分配し、その後別々の代謝経路へのこれらの組み込みを誘導するために、様々なパートナーと相互作用することができる。
【０００８】
これらは少なくとも２つの相同サインユニットを保有しているが、異なるＦＡＴＰは別々の染色体位置、特有のプロモーターおよび遺伝子調節、特有の分布プロファイル、異なる細胞位置、および専門化された機能を有する。
従来技術において、ＦＡＴＰ５は、このタンパク質について検出可能な活性に応じて、例えば超長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ関連物（ＶＬＡＣＳＲ）、超長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼホモログ（ＶＬＣＳ−Ｈ２）、コリル−コエンザイムＡリガーゼまたは胆汁酸コエンザイムＡシンテターゼ（ＢＡＣＳ）などの異なる名称で見出される。
【０００９】
ヒトにおいて、タンパク質はもっぱら肝臓で発現される。
マウスにおいては、２．６ｋｂのメッセンジャーＲＮＡが肝臓で非常に豊富であることが知られている。より短いメッセンジャーＲＮＡのより低いレベルの発現が、脳、肺、睾丸および脾臓（２．５ｋｂ）において、そして、骨格筋（２．２ｋｂ）において検出された。転写物の存在は、ＰＣＲ技法により心臓において示されたが、腎臓においては示されなかった。
ヒトにおいて、転写物は、そのマウスホモログと対照的に、線維芽細胞、脳または心臓で検出することができなかった。
サザンブロット分析は、ＶＬＡＣＳＲ遺伝子がヒトおよびマウスの双方で単一コピーで存在することを示す。
【００１０】
例えば、ＦＡＴＰ５が長鎖脂肪酸および超長鎖脂肪酸（例えばＣ１８〜Ｃ２６）を活性化できることが報告されている。ＦＡＴＰ５は、ケノデオキシコレート、デオキシコレート、リトコレートおよびトリヒドロキシコレスタノン酸（trihydroxycholestanoic acid）を活性化することができる。
本発明者らの知る限りでは、脂肪酸分解におけるＦＡＴＰ５の関与は、これまで全く記載されたことはなかった。ＦＡＴＰ５の役割は、腸肝再循環を介した脂肪酸の再活性化だけに限定されていた。
従来技術において、国際出願WO 01/21795は、ＦＡＴＰ５が脂肪酸輸送体として役割を果たし、そうして細胞による脂肪酸捕獲の過程に関与することを示唆している。
【００１１】
さらにまた、糖尿病に罹患した者、または糖尿病を発症しやすい者は、血流中に高レベルの遊離脂肪酸を有することが知られている。血漿中の遊離脂肪酸の過剰は、インスリン感受性組織、例えば骨格筋において、エネルギーを産生するためのブドウ糖の利用に対する競合者のように作用する。脂肪酸は、異なるレベルで糖代謝に干渉する。これらは、間接的に解糖を阻害し、グリコーゲンの形態でのブドウ糖の貯蔵を減らし、間接的にグルコース輸送を阻害する。これは、遊離脂肪酸が過剰である場合におけるその優先的な利用、および、高血糖症の発症を導く、循環中のブドウ糖濃度の増加を示す傾向がある。
【００１２】
驚くべきことに、そして、予想を超えて、本発明者らは今回、ＦＡＴＰ５が肝臓における脂肪酸の分解に関与することを見出した。同様に、本発明者らは、この特性が、結果として間違いなく血漿中のブドウ糖および脂質濃度を減少させることを示すことができた。特に、本発明者らは、ＦＡＴＰ５のメッセンジャーＲＮＡの発現レベルが、糖尿病の肥満ラット（Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラット（ＺＤＦラット））において、非糖尿病ラット（Ｚｕｃｋｅｒ痩せ型ラット（ＺＬＣラット））におけるＦＡＴＰ５のメッセンジャーＲＮＡの発現レベルに比べて大幅に減少していることを示すことができた。
したがって、ＦＡＴＰ５の過剰発現が、結果として遊離脂肪酸のレベルを減らし得ることを想起することが可能となり、したがって、ＦＡＴＰ５の発現レベルを増やす能力を有する任意の物質が、糖尿病の予防的または治療的処置用の医薬の製造のための良い候補であり得ることを十分に予測することができる。
本発明は、この応用分野に含まれる。
【００１３】
本発明者らは、ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターである、添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列を少なくとも含むことを特徴とする、ヒト核酸配列を単離した。この配列は、従来技術においてＦＡＴＰ５プロモーターの配列であると考えられていた配列と、わずかにしか相同ではない。
本発明は、したがって、第一に、添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列を少なくとも含むことを特徴とする、単離されたヒト核酸配列に関する。前記配列は、ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターに対応する。
【００１４】
本発明はさらに、添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列からなることを特徴とする、単離されたヒト核酸配列に関する。
本発明の１つの特定の実施例において、配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列を少なくとも含む核酸配列は、タンパク質、特にヒトＦＡＴＰ５タンパク質をコードする。特に好ましくは、配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列を少なくとも含み、かつ、ヒトＦＡＴＰ５タンパク質をコードする前記核酸配列は、添付された配列表において配列番号２の番号で特定されるヌクレオチド配列に対応する。
【００１５】
本発明はさらに、上記と相補的なセンスまたはアンチセンス核酸配列、および、本発明による核酸配列のうちの１つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性パーセントを有する任意の核酸配列に関する。
参照配列と少なくともＸ％の同一性パーセントを有する核酸配列は、本発明において、参照配列の１００ヌクレオチドあたり１００−Ｘ個までの変更を含み得るが、前記参照配列の機能的な特性を保持している核酸配列として定義される。本発明に関して、「変更」は、参照配列における連続的または散剤的なヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む。
本発明による少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性パーセントを有する核酸配列は、アレル変異体、すなわち配列番号１または配列番号２の配列の個体変異に対応する全ての配列を含む。これらの自然な変異配列は、哺乳類、特にヒトに存在する多型に対応する。
【００１６】
本発明はさらに、上記に定義した本発明の核酸配列が挿入されたクローニングおよび／または発現ベクターに関する。好ましくは、本発明のベクターは、添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列を少なくとも含む核酸配列を含む。
本発明の１つの特定の態様において、本発明のベクターはまた、上記に定義された、ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターとして同定された核酸配列の依存下に置かれた、検出可能なタンパク質をコードする核酸配列を含む。特に、このプロモーターは、配列番号１の配列に対応する。「検出可能なタンパク質」とは、一度発現されると、当業者に知られている任意の技術によって容易に同定される任意のタンパク質を意味すると理解される。ＦＡＴＰ５自体、またはマーカーとして用いられるタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、レニラ（renilla）またはルシフェラーゼを、用いることができるタンパク質として挙げることができる。
【００１７】
かかるベクターは、宿主細胞における表現、および任意にタンパク質の分泌のために必要な要素を含むことができる。
前記ベクターは、好ましくは、翻訳開始および終止シグナル、ならびに適切な転写調節領域を含む。これらは細胞中で安定して維持することができる必要があり、そして、翻訳されたタンパク質の分泌を指示する特定のシグナルをコードする配列を任意に含むことができる。
本発明による核酸配列は、選択された宿主内の自律複製型ベクター中に、または選択された宿主の組込型ベクター中に挿入することができる。
自律複製系のなかでは、宿主細胞にしたがって、プラスミドまたはウイルス型のシステムを用いることが好ましい。
本発明によって用いることができるプラスミドベクターは、核酸配列の発現を可能にする任意の既知のプラスミドであってもよい。
【００１８】
「核酸配列の発現」とは、本発明によれば、本発明の核酸配列のＲＮＡへの転写、および任意にこれに続く前記ＲＮＡのタンパク質への翻訳を可能にする本発明のベクターの能力を意味するものと理解される。
好ましくは、本発明によるプラスミドは、上記の単離されたヒト核酸配列の発現を可能にする。特に好ましくは、本発明によるプラスミドは、添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列、特にＦＡＴＰ５をコードする核酸を少なくとも含むことを特徴とする核酸配列の発現を可能にする。
【００１９】
以下のものを、本発明によって用いることができるプラスミドの例として挙げることができる：プラスミドｐＣＭＶＴａｇ（Stratagene, La Jolla, USA）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）、ｐＳＧ５（Stratagene, La Jolla, USA）またはｐＧＬ２およびｐＧＬ３（Promega, Mannheim, Germany）。
ウイルスベクターは、特にアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルスであってもよい。当業者は、これらの系の各々のために用いることができる技術に精通している。
核酸配列を宿主細胞の染色体に組み込むことが望ましい場合は、例えば、プラスミドまたはウイルス型のシステムを用いることが可能であり、このようなウイルスは、例えばレトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
【００２０】
非ウイルスベクターの中では、好ましいのは、裸のＤＮＡまたはＲＮＡなどの裸のポリヌクレオチド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母における発現のための酵母人工染色体（ＹＡＣ）、マウス細胞における発現のためのマウス人工染色体（ＭＡＣ）、および、好ましくは、ヒト細胞における発現のためのヒト人工染色体（ＨＡＣ）である。
本発明によると、ベクターは好ましくはプラスミドまたはアデノウイルスである。
かかるベクターは、当業者によって一般に用いられている方法によって調製し、そして、得られた組換えベクターは、標準的な方法、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、熱衝撃、膜の化学的透過化処理後の形質転換、または細胞融合によって適切な宿主に導入することができる。
【００２１】
本発明はさらに、本発明による少なくとも１種の核酸配列または本発明による少なくとも１種のベクターが導入された、形質転換された宿主細胞、特に真核細胞および原核細胞に関する。
細菌細胞、酵母細胞および動物細胞、特に哺乳類細胞を、本発明に関して用いることができる細胞として挙げることができる。昆虫細胞、例えばバキュロウイルスを伴う方法を用いることができるものも挙げることができる。
【００２２】
本発明はさらに、上記の宿主細胞を、該細胞中に導入された本発明による核酸配列の、タンパク質の形態での発現を可能にする条件下で培養することを特徴とする、タンパク質を産生する方法に関する。
本発明はさらに、本発明による核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質の同定のための、上記の本発明の核酸配列、ベクターまたは宿主細胞の使用に関する。
【００２３】
本発明はさらに、上記の本発明による核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質を特定する方法であって、
ａ）上記の核酸配列、ベクターまたは宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現に適した媒体中で、上記の核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質と接触させること、および
ｂ）上記の核酸配列の依存下に置かれた前記ヌクレオチド配列の発現のレベルを測定すること、
を特徴とする方法に関する。
【００２４】
「ヌクレオチド配列の発現に適した媒体」は、本明細書中では、本発明の核酸配列からの、ＲＮＡ、特にメッセンジャーＲＮＡ、および任意にタンパク質の合成を可能にする任意の発現系を意味すると理解される。
１つの特定の態様において、本発明の方法は、ｂ）で決定された発現レベルと、同定する物質に接触させなかった対照における、上記の核酸配列の依存下に置かれた前記ヌクレオチド配列の発現のレベルとの比較のための、追加の工程を含む。
比較は、本発明の核酸配列に対する被験物質の調節能力を評価することを可能にする。
【００２５】
「調節する」または「調節能力」は、本発明によれば、本発明による核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を刺激または阻害する被験物質の能力を意味すると理解される。
本発明の核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現レベルは、自体公知の従来のｍＲＮＡまたはタンパク質分析技法で測定することができ、以下の技術を、非限定的な例として言及することができる：ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、および免疫細胞化学または免疫組織化学分析技術。細胞もしくは分子生物学、または免疫細胞化学もしくは免疫組織化学分析の実験プロトコルに関するすべてのことについては、本特許出願の各所において、当業者に完全に精通している多数の著作、特に「Current Protocols in Immunology; John Wiley and Sons, Teton Data System, Jackson, Wyoming (ISBN 0-471-30660-6, 2003)」を参照することができる。
前記測定は、プローブ、プライマーまたは抗体を用いて有利になされる。
【００２６】
本発明による核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質は、生体高分子、例えば、核酸、脂質、糖、タンパク質、ペプチド、タンパク質−脂質、タンパク質−糖、ペプチド−脂質もしくはペプチド−砂糖ハイブリッド化合物、または化学的分枝もしくは化学分子が付加されたタンパク質またはペプチドであってもよい。
本発明はさらに、本発明による核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質であって、本発明の方法により入手可能な前記物質に関する。
【００２７】
本発明はさらに、本発明による核酸配列と相互作用することが可能な物質を同定する方法であって、
ａ）上記の核酸配列、ベクターまたは宿主細胞を、本発明による核酸配列と相互作用することが可能な物質に接触させること、および
ｂ）前記核酸配列と前記被験物質との間の相互作用を評価すること、
を特徴とする方法に関する。
本発明を実行する１つの特定の方法では、前記同定方法の目的は、本発明による核酸配列と結合することが可能な物質を特定することであり、前記方法は、例えば、異種相互作用の場合は熱量測定であり、または、ペプチド−ペプチド相互作用の場合は、２ハイブリッド試験である。
【００２８】
最後に、本発明は、本発明による核酸配列と相互作用すること、または結合することが可能な物質であって、上記の同定方法のうちの１つによって入手できる前記物質に関する。
本発明によれば、前記核酸配列と前記被験物質との間の相互作用および／または結合は、任意の既知の技法によって評価することができる。
【００２９】
本発明者らは、ＦＡＴＰ５が肝臓における脂肪酸の分解に関与していることを示した。同様に、本発明者らは、この特性が、結果として間違いなく血漿ブドウ糖および脂質濃度を減少させることを示すことができた。特に、本発明者らは、ＦＡＴＰ５メッセンジャーＲＮＡの発現レベルが、糖尿病ラット（Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラット（ＺＤＦラット））において、非糖尿病ラット（ＺＬＣラット）におけるＦＡＴＰ５メッセンジャーＲＮＡの発現に比べて大幅に減少していることを示すことができた。
したがって、本発明はさらに、糖尿病を予防および／または処置するための医薬の製造のための、本発明による物質の使用に関する。
本発明はさらに、肝臓における脂肪酸のβ酸化を誘導するための医薬の製造のための、本発明による物質の使用に関する。
【００３０】
上記の事項に加えて、本発明はまた、本発明をいかに実行するかについての例および添付の図面を参照した以下の説明から明らかになる他の事項を含む。
以下の例は、いかなる意味においても制限を意味することなく本発明を例証する。
【００３１】
例１：脂肪酸のβ酸化におけるｈＦＡＴＰ５の関与の証明
材料および方法
Ａ）ＦＡＴＰ５発現プロファイル
ａ）ＲＮＡの調製
全ＲＮＡは、細胞および組織から、ChomczynskiおよびSacchi（Chomczynski et al., 1987）により記載された技法を用いて調製した。ＲＮＡは２６０ｎｍでの光学密度の測定によって定量し、そして、ＲＮＡの品質は２６０／２８０光学密度比の測定によってチェックした。
１μｇの各サンプルを、酵素ＭＭＬＶ−ＲＴ（Gibco BRL, Paisley, UK）を用いた逆転写（ＲＴ）反応においてテンプレートとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を、２μｌのＲＴ産物について実行した。特異的プライマー（Eurogentec, Seraing, Belgium）を、ｈＦＡＴＰ５およびｒＦＡＴＰ５について調製した。ＰＣＲ産物の特異性を確保するために、熱変性温度（Ｔｍ）は各々の特定の標的について最適化し、サイクル数は、転写産物の量に応じて、２５〜３０の間に設定した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
ＤＮＡ ＰＣＲ産物は、１％のアガロースゲル上で分析した。シグナルは、Gel Doc（登録商標）2000装置（Bio-rad, Marnes La Coquette, France）を用いて、密度測定値として定量化した。in vivo転写分析については、定量化は、特定の各標的の値の、内部対照（アクチン）の値に対する比として計算した。結果は、１に設定された対照と比較した誘導レベルとして表示した。
【００３４】
定量分析は、３２キャピラリーLight Cycler装置（Roche）にて、二本鎖ＤＮＡを標識するフルオロフォアであるサイバーグリーンを用いて、二段階ＰＣＲ（Roche, Mannheim, Germany）によって行った。縦座標の増幅曲線の微分値（ＰＣＲの最中の蛍光の増大を表す）と、横座標のサイクル数との交点として表された各標的についての結果は、対照遺伝子で正規化した。
【表２】
【００３５】
Ｂ）Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットにおける糖尿病発症の動態
Genetic Model Inc.（Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA）に由来する５週齢の雄のＺｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラット（ＺＤＦ／ＧＭＩ−ｆａ／ｆａ）および同週齢の雄のＺｕｃｋｅｒ痩せ型ラットは、無制限量のPurina 5008（PMI Nutrition International, Wellingborough, Northamptonshire, UK）で飼育した。
６週齢、１０週齢および２０週齢において、４８頭のラットを、１６頭（８頭のＺｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットおよび８頭のＺｕｃｋｅｒ痩せ型ラット）の３群に分けた。動物の重量およびその摂食量は、実験の間中モニターした。
【００３６】
血液サンプルは、日中、８時間の食餌療法期間の後、麻酔下にて眼窩採血により採取した。麻酔は、ペントバルビタールの腹腔内投与によって誘発した。動物は頚椎脱臼によって安楽死させ、肝臓を摘出し、重量を測定し、さらなる分析のために液体窒素中で直ちに凍結させた。
【表３】
【００３７】
ｂ）分析
血清グルコース、コレステロール、トリグリセリドおよび遊離脂肪酸は、酵素によるバイオアッセイを用いて決定した。
インスリンレベルは、放射免疫分析により決定した。
肝臓の一部は、組織学的研究のために保存した。
【００３８】
Ｃ）アデノウイルス中へのｈＦＡＴＰ５の完全な配列のクローニング
別途示さない限り、用いた技法は、供給者によって、または分子生物学に関する多数の古典的な著作に記載されたものである。
ｈＦＡＴＰ５の完全なコード配列（配列番号２の配列の１５７５位におけるＡＴＧから）は、Adeno-X（Clontech, Palo Alto, USA）のＰＴ３４１４−１発現系にクローニングした。
ヒト肝細胞培養物の全ＲＮＡは、Qiagen（Qiagen, Courtaboeuf, France）からの、RNeasy miniprep kitで抽出した。
【００３９】
次いで、第一ＤＮＡ鎖を以下の通りに合成した。
【表４】
【００４０】
次に、以下のプライマー：
配列ｈ５＿４Ａｓ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号１９：ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＣＴＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣ
配列ｈ５＿１Ｓ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号２０：ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＡＧ
を用い、以下の反応媒体：
センスオリゴ（１０ｐＭ）１μｌ
アンチセンスオリゴ（１０ｐＭ）１μｌ
ＴａｑプラチナＰｆｘ＋バッファー１０×＋ＭｇＳＯ４（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）
ｄＮＴＰ（Promega, Williamsburg, IA)
最終容量は２０μｌ
により、ＰＣＲを実行した。
【００４１】
次に、以下のプログラムにしたがって増幅を行った：
９４℃で５分間を１サイクル、次いで９４℃での３０秒、次に５５℃での３０秒、そして６８℃での２分を含む２５サイクル。
その後、産物を４℃で維持した。
得られたＰＣＲ断片を、QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen, Courtaboeuf, France）を用いて精製した。
精製した断片を、次に、ＸｂａＩ（NEB, Beverly, MA）で消化し、ClontechからのpAdenoXキットのベクターpShuttle中に、供給者の推奨にしたがってクローニングした。
【００４２】
得られたプラスミドを、ＤＨ５ｄ型の大腸菌に導入し、そして、クローンをこれらのカナマイシン耐性によって選択した。次に、陽性クローンのプラスミドＤＮＡを精製し、制限分析によりチェックし、配列決定した。タンパク質の発現は、Ｔ７発現系を用いて、in vitroで確認した。pShuttleの発現カセットを、ＰＩ−Ｓｃｅ／Ｉ−ＣｅｕＩを用いて切断し、Adeno-X（登録商標）ウイルスＤＮＡにライゲーションした。ライゲーション産物をＳｗａＩで消化し、そして大腸菌中に導入した。アンピシリン耐性クローンを選択した。
対象となる遺伝子を含んでいる組換えアデノウイルスＤＮＡをＰａｃＩで消化し、ヒト胎児腎細胞（２９３細胞）中に導入した。アデノウイルス組換え体を回収し、３回の増幅サイクルにより再増幅した。ウイルスはＣＩＣｓ法によって精製し、次にSephadex Ｇ５０カラムで洗浄した。ウイルス粒子は、９６穴プレートにおけるプラーク形成アッセイにより力価測定した（Ｐｆｕ）。
【００４３】
Ｄ）ラット肝細胞の調製
ラット肝細胞は、コラゲナーゼ灌流によって雄ラットの肝臓から単離した。ラットを、ペントバルビタールの腹腔内投与によって麻酔した。次に、肝臓を門脈において、まず２００ｍｌの肝臓潅流培地で、そして次に、１０ｍＭのHepes、４ｍＭのＣａＣｌ２および１４ｍｇのBlendzyme3が添加された２００ｍｌのHanksバッファーで灌流した。肝臓を切開し、肝細胞洗浄培地（Gibco BRL, Paisley, UK）中で細切し、７０μｍのフィルターで濾過した。
細胞は遠心分離し、肝細胞洗浄培地中で３回洗浄した後、細胞の生存率をトリパンブルー排除法により評価した（生存率＞８５％）。細胞は、UltroserSF（２容量％）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、遊離脂肪酸／ＢＳＡ（SIGMA, St. Louis, MO, USA）（０．２重量／容量％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、デキサメタゾン（１μＭ）、トリヨードサイロニン（Ｔ３、SIGMA, St. Louis, MO, USA）（１００ｎＭ）およびインスリン（１００ｎＭ）が添加されたWilliams培地中に接種した。４時間後に、培養培地を、UltroserまたはＢＳＡを含まない同様のウィリアムズ培地と交換した。
【００４４】
Ｅ）糖尿病を発症中のＺＤＦラットへのｈＦＡＴＰ５アデノウイルスおよびＬＡＣＺアデノウイルスの感染
Genetic Model Inc.（Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA）に由来する５週齢の雄のＺｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラット（ＺＤＦ／ＧＭＩ−ｆａ／ｆａ）および同週齢の雄のＺｕｃｋｅｒ痩せ型ラットは、無制限量のPurina 5008（PMI Nutrition International, Wellingborough, Northamptonshire, UK）で飼育した。
８週齢において、５．１０９ＰｆｕのアデノウイルスまたはＰＢＳ（対照用）を、ラットの尾静脈中に注射した。注射容量は、１ラットあたり２ｍｌ未満であった。３頭のラットをｐＡｄｈＦＡＴＰ５に、そして３頭をｐＡｄＬａｃＺに感染させた。ラットは、１０週で安楽死させた。ブドウ糖、遊離脂肪酸およびトリグリセリドレベルを、血漿中で測定した。
【００４５】
Ｆ）機能試験
ａ）脂肪酸の捕獲
ＢＳＡと複合体化した最終２０μＭの１４Ｃ標識オレイン酸（図２Ｂ）または最終７８ｎＭのトリチウム標識オレイン酸（図２Ａ）を、輸送試験に用いた。
ラット肝細胞（１０６細胞／コンパートメント）を６穴プレートのウェルに接種し、３７℃で４時間インキュベートした。３Ｔ３−Ｌ１細胞（ATCC No. CL-173、Manassas、VA、USA）（５．１０５細胞／コンパートメント）は、２％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ中でインキュベートした。感染は多重度が１であり、一晩継続した。
【００４６】
細胞はトリプシンで処理し、回収し、遠心分離し、ＰＢＳで再懸濁して５．１０５細胞／ｍｌの懸濁液を得た。２００μｌの細胞懸濁液（１０５細胞）は、５ｍｌのポリプロピレンチューブ中に置いた。ＰＢＳ中の細胞懸濁液は、水浴中３７℃で５分間、振盪しながらプレインキュベートした。脂肪酸の捕獲のために、２倍に濃縮した脂肪酸／ＢＳＡの原液を各チューブに等量加えた。所定の間隔で、０．１％のＢＳＡと２００μＭのフロレチン（SIGMA, St. Louis, MO, USA）を含むＰＢＳの冷液（０℃）（洗浄液）５ｍｌを各チューブに添加することにより捕獲を停止させた。細胞を遠心分離し、二回洗浄した。遠心分離残渣を、４００μｌの溶解緩衝液（水中の０．４％のＳＤＳ）で再懸濁した。次に４ｍｌのシンチレーター溶液を加え、取り込まれた脂肪酸をTri-Carb 2100カウンター（Packard, Meriden, CT, USA）でカウントした。結果はＬａｃＺの誘導の割合として表し、１に対して正規化した。
【００４７】
ｂ）脂肪酸のアシル化
ラット肝細胞（１０６細胞／コンパートメント）を、６穴プレートのウェルに接種し、３７℃で４時間インキュベートした。次に培地を回収し、２ｍｌの伝染性混合物（ＤＭＥＭ、２％のＦＣＳ）を各ウェルに加えた。感染は多重度が１であり、一晩継続した。細胞をトリプシンで処理し、回収し、遠心分離した。遠心残渣を、３００μｌの緩衝液Ａ（ｐＨ８．５の５００ｍＭのtris ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＡＴＰ、０．１％のTritonX 100）で再懸濁した。細胞を超音波処理し、氷中で３０分間インキュベートした。タンパク質レベルは、ブラッドフォード法により定量化した。１試験あたり、２０μｇのタンパク質を含む２０μｌの抽出物を用い、ガラスチューブ中に置いた。１８０μｌの反応混合物（ｐＨ８．５の５０ｍＭのtris ＨＣｌ、１５０μＭのコエンザイムＡ、３００μＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のTritonX 100、１４Ｃで標識された１０μＭのパルミチン酸またはリグノセリン酸）を、試験を開始するために加えた。反応は、５〜３０分後に８００μｌの１％の過塩素酸の添加により停止させた。
【００４８】
標識されたオレイル−ＣｏＡのレベルを評価するために、反応混合物を２．２５ｍｌのイソプロピル／ヘプタン／硫酸（４０／１０／１）で抽出した。抽出物を混合し、有機相を回収した。２回の連続した抽出を実行した。４ｍｌのシンチレーター溶液を１ｍｌの水相に加え、Tri-Carb 2100ＴＲカウンターでカウントした。アシルＣｏＡの量を測定するために、沸騰させたタンパク質の対照抽出物で測定した放射活性を、対応する試験値から差し引いた。
結果は、１について正規化したＬａｃＺの誘導の割合として表した。
【００４９】
ｃ）脂肪酸の酸化
ラット肝細胞（６．１０５細胞／コンパートメント）を、１２穴プレートのウェルに接種し、３７℃で４時間インキュベートした。感染は多重度が１００であり、一晩継続した。次に、培地を回収し、６４ｎＭのオレイン酸［９，１０ ３Ｈ］と２％のＢＳＡとが添加された５００μｌのＤＭＥＭを各ウェルに加えた。３７℃での１２時間のインキュベーションの後、培地をマイクロチューブへ移し、過剰なオレイン酸［３Ｈ］を、５０μｌの１０％のトリクロロ酢酸と５０μｌの２０％のＢＳＡとで沈殿させた。混合物を、１２，４００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清をマイクロチューブに移し、５００μｌの水を加えた。インキュベーションを、５０℃で１８時間継続した。４ｍｌのシンチレーター溶液の添加の後、トリチウム水を測定し、Tri-Carb 2100カウンターでカウントした。
結果は、１について正規化したＬａｃＺの誘導の割合として表した。
【００５０】
ｄ）脂肪酸のエステル化
脂肪酸の酸化は培地中で測定したが、トリグリセリドは、標識された脂肪酸とともにインキュベートした細胞から抽出した。ラット肝細胞をトリプシンで処理し、全く同一のチューブ３本中で混合した。細胞は、１８，５００ｒｐｍで２分間遠心分離した。各ウェルを重炭酸塩ベースの溶液（クレブス−リンゲル重炭酸バッファー：１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１．３ｍＭのＭｇＣｌ２、１２４ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのブドウ糖）で洗浄し、そしてこの緩衝液を、遠心分離残渣を再懸濁するのに用いた。
【００５１】
細胞を二度目の遠心分離に供し、上清を回収した。この行程を繰り返した。次に遠心分離残渣を１００μｌの水中に再懸濁し、さらなる分析のために液体窒素で凍結することができる。その後、遠心分離残渣を、室温（２５℃）に放置した。次に、５００μｌのアセトンを加え、混合物を濃縮器を用いて、真空下で乾燥させた。残渣を、基質として５μｌの５０ｎＭのトリオレインを含む、３００μｌのクロロホルム／メタノール混合物（１／１）で再懸濁した。混合後、全体を遠心分離し、上清を除去した。２回の抽出を行った。遠心分離残渣は、３０μｌのクロロホルム／メタノール混合物（１／１）で再懸濁し、Ｇ６０シリコーンゲルでプレコートされた薄層クロマトグラフィープレート上に堆積させた。移動は、２００ｍｌの緩衝液（Ｈ−ヘキサン／ジエチルエーテル／メタノール／酢酸 ９０／２０／２／３）で、１．５時間行った。
【００５２】
結果：
Ａ）ｈＦＡＴＰ５の細胞および組織分布
ＰＣＲによる研究により、ヒトＦＡＴＰ５の、肝臓、初代肝細胞およびＨｅｐＧ２ヒト細胞系の細胞における排他的な発現が確認された。
これらの結果を図１に示す。
【００５３】
Ｂ）ＦＡＴＰ５の機能的特徴化
ａ）アデノウイルスの構築
肝臓での脂肪酸の代謝におけるＦＡＴＰ５の機能を特徴化するため、ｈＦＡＴＰ５遺伝子を担持するアデノウイルス（ｐＡｄｅｎｏ−ｈＦＡＴＰ５）、対照アデノウイルスｐＡｄｅｎｏ−ＬａｃＺ、およびアデノウイルスｐＡｄｅｎｏ−ＣＤ３６を設計し、最後のものは脂肪酸輸送についての陽性対照としてのものである。
【００５４】
ｂ）脂肪酸の捕獲
オレイン酸の捕獲は、３Ｔ３−Ｌ１細胞（図２Ａ）およびアデノウイルスに感染したウィスターラットから単離したラット肝細胞（ＲＨ）（図２Ｂ）において試験した。
ＦＡＴＰ５の過剰発現は、３Ｔ３−Ｌ１細胞における脂肪酸輸送活性に影響を及ぼさなかったが（図２Ａ）、ラット肝細胞において脂肪酸輸送を有意に増大させた。
この結果は、脂肪酸輸送活性が細胞系によって別様に行われていることを示唆するものである。これは、細胞系に固有の種々のコファクターの効果的な動員による可能性がある。以前の結果は、ＦＡＴＰがＡＣＳまたはＦＡＴなどのパートナーと協働して作用し得ることを示唆している。
ここで提示された結果は、ＦＡＴＰ５が、タンパク質が発現された細胞によって別様に、脂肪酸輸送に作用することを示唆するものである。
さらにまた、前脂肪細胞系におけるＦＡＴＰ５の効果の欠如、およびラット肝細胞における脂肪酸輸送の急速な増大は、ＦＡＴＰ５が、単なるありふれた輸送体であると言うよりは、むしろ、肝細胞における脂肪酸輸送に影響する特有の機能を有することを示唆する。
【００５５】
ｃ）ＡＣＳおよびＶＬＡＣＳ活性に関する試験
ＡＣＳ試験は、パルミチン酸塩およびリグノセリン酸塩を用いて、アデノウイルスに感染した初代ラット肝細胞において行った。ｈＦＡＴＰ５の過剰発現による、リグノセリン酸塩とのインキュベーション後のＶＬＡＣＳ活性の有意な増大は、３０分のインキュベーション期間でのみ検出可能であった（図３Ａ）。ｈＦＡＴＰ５の過剰発現によるＡＣＳ活性の誘導が間接効果である可能性が示唆される。
超長鎖アシルＣｏＡシンテターゼ活性はわずかに増大したが、ＣＤ３６の過剰発現がリグノセリン酸塩のアシル化に影響を及ぼさないことから（図３Ｂ）、これはｈＦＡＴＰ５に特有のことである。
ＦＡＴＰタンパク質のＶＬＡＣＳ活性に関する先に発表された結果は、このようにして確認された。しかしながら、誘導動態には明確な差異がある。結果は、ＦＡＴＰ５が、超長鎖脂肪酸より大きな脂肪酸のクラスを代表するパルミチン酸塩などのＣ１６脂肪酸に対する有意な効果を示すことから、ＦＡＴＰ５がより幅広い範囲の活性を有することを示唆している。
【００５６】
ｄ）脂肪酸のβ酸化に対するｈＦＡＴＰ５発現の効果
ｈＦＡＴＰ５の過剰発現によって脂肪酸の分解の程度が調節されるかどうかを分析するために、トリチウム化オレイン酸の、β酸化の最終産物であるトリチウム水への変換を測定した。
ＣＤ３６対照遺伝子の過剰発現は、ＨｅｐＧ２細胞（図４Ａ）またはラット初代肝細胞（図４Ｂ）におけるβ酸化に影響を及ぼさず、これは、ＣＤ３６が脂肪酸のエステル化を導くが、その分解は導かないとする仮説に対応するものである。
対照的に、ｈＦＡＴＰ５の過剰発現は、ＨｅｐＧ２肝細胞におけるβ酸化の程度を顕著に増大させた（３倍超）（図４Ａ）。
ｈＦＡＴＰ５の過剰発現は、初代肝細胞において脂肪酸の分解を誘導する。
【００５７】
ｅ）ｈＦＡＴＰ５が脂肪酸のエステル化よりはむしろそのβ酸化に関与することの確認
ｈＦＡＴＰ５の発現が脂肪酸の分解のみを導き、そのエステル化度に影響しないことを確認するために、ＨｅｐＧ２細胞における同じ実験の中で、β酸化試験を、エステル化試験により補完した。
ｈＦＡＴＰ５の過剰発現は、エステル化度に影響を及ぼさなかった（図５）。
このことは、肝臓における脂肪酸の分解のみからなる、ｈＦＡＴＰ５の新規な機能的活性を明確に示すものであり、一方、ＦＡＴ／ＣＤ３６は、脂肪酸をエステル化過程に導く。ｈＦＡＴＰ５は、β酸化アクティベーターである。
【００５８】
ｆ）Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットにおける糖尿病発症の最中のｈＦＡＴＰ５の発現の調節
Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットにおける、このモデルでのＮＩＤＤＭの発症の最中のＦＡＴＰ５遺伝子の発現レベルの研究を行い、結果をインスリンおよびブドウ糖レベルにおける変動と相関させた。
Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットは、ヒトの場合と同様の経過で、糖尿病を自然に発症し（図６Ａおよび６Ｂ）、
−６週齢の雄のＺＤＦ（ｆａ／ｆａ）ラットについて観察される、高インスリン血症および正常血糖の状態、
−１０週齢の雄のＺＤＦ（ｆａ／ｆａ）ラットについて観察される、高インスリン血症および高血糖の状態、および、
−２０週齢の雄のＺＤＦラットについて観察される、インスリン欠乏および高血糖の状態、
を有する。
ｈＦＡＴＰ５の発現の定量的および半定量的な分析による研究（表ＩＩＩおよび図７）は、ｈＦＡＴＰ５メッセンジャーＲＮＡのレベルがＺＤＦラットにおいて１０週で低減することを示した。同じ期間にわたって、グリコーゲンレベルはＺＤＦラットの方が、ＺＬＣラットよりも明らかに高かった（表ＩＩＩ）。
【００５９】
【表５】
生化学的分析は、血漿中の遊離脂肪酸のレベルが１０週齢および２０週齢のＺＬＣラットでより高いが、ＺＤＦラットの肝臓中の遊離脂肪酸のレベルはＺＬＣラットと比較して低かったことを明らかにした（図８Ａ）。
この１０週の期間は、ＺＤＦラットおよびＺＬＣラットの体重増加曲線の乖離によって特徴づけられ、これは糖尿病の発症を示す（図８Ｂ）。
【００６０】
ｇ）脂肪酸のアシル化へのＦＡＴＰ５の過剰発現の効果
ＺＤＦおよびＺＬＣラットの初代肝細胞におけるｈＦＡＴＰ５の過剰発現の機能的効果を分析した。
ＦＡＴＰ５の過剰発現は、ＺＤＦラットの初代肝細胞において、早くには５分で、そして遅くには３０分で、脂肪酸のアシル化を極めて有意に増大させた。
これらの結果を図９に示す。
【００６１】
ｈ）糖尿病肥満型ラットの肝臓における脂肪酸分解不足の解消
脂肪酸のベータ酸化は、ＺＤＦラットの肝臓において、ＺＬＣ対照ラットの肝臓において生じるものと比べて不足している。ＦＡＴＰ５の過剰発現は、この不足を解消する。ＦＡＴＰ５の過剰発現は、対照ラットには影響を及ぼさない。これらの結果を図１０に示す。
【００６２】
ｉ）ＦＡＴＰ５の過剰発現は、ＺＤＦラットの血中のブドウ糖および脂質のレベルを低減する
ブドウ糖レベルは、ＦＡＴＰ５を担持しているアデノウイルスに感染したＺＤＦラットにおいて、１０週齢で、ＬａｃＺ対照アデノウイルスに感染したラットと比較して、有意に低減した（図１１Ｃ）。この低下は、遊離脂肪酸レベルの低下（図１１Ａ）、および血漿トリグリセリドレベルの大幅かつ急速な低下（図１１Ｂ）と相関している。
これは、ＦＡＴＰ５の発現が糖代謝に影響を及ぼし、in vivoで高血糖症を軽減することの証明である。
【００６３】
例２：ヒトＦＡＴＰ５遺伝子の推定プロモーター領域の特徴化およびプロモーター活性の証明
ＦＡＴＰ５遺伝子産物（AF064255またはNM_012254）は、脂質合成に関与するタンパク質のファミリーに属する。
ＦＡＴＰ５遺伝子産物は、複合脂質の合成、そして特に脂肪酸の伸長に関与している。ＦＡＴＰ５遺伝子は、第１９染色体に位置している。
ＦＡＴＰ５をコードする配列に関する一般的な情報は、以下の通りである（表ＩＶ）。
【表６】
【００６４】
ａ）予測によるＦＡＴＰ５の転写開始点（ＴＳＳ）の位置、および相補ＤＮＡ末端の迅速増幅技術（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅、ＲＡＣＥ）による同定
ＦＡＴＰ５遺伝子は、第１９染色体に位置し、１４ｋｂにわたって分配された１０個のエクソンで構成されている。ＦＡＴＰ５遺伝子を含むコンティグNT_011104は、２００２年８月に公開された。
ｍＲＮＡおよびＥＳＴからマッピングした５’ＵＴＲ領域は、３４ｂｐのサイズを示す（５’ＵＴＲ１）。したがって、ｍＲＮＡおよびGenBankによって公開されているＥＳＴ、およびＤＢＴＳＳ（ヒト転写開始点データベース）に由来する情報に関連して決定される、最も確からしい「生物学的」転写開始部位は、図１２Ｂで示したとおりに位置している。
ｂ）予測によるＦＡＴＰ５プロモーターの位置
材料および方法
ＨｅｐＧ２細胞のＲＮＡの調製：
ＲＮＡは、Qiagen RNeasy mini kit protocol（Qiagen, Courtaboeuf, France)に従って、１００万個のＨｅｐＧ２細胞から精製した。
５’ＲＡＣＥ：
ＴＳＳは、供給者の推奨に従って、GeneRacerキット、カタログ番号L1500-01、L1500-02、L1502-01、L1502-02バージョンJ05300225-0355を用いて同定した。
結果：
上記のようにして決定した開始点の上流の１０，０００ｂｐの領域をコンティグNT_011104から選択した。分析した領域は、１００２３位のコード領域の上流、すなわちＡＴＧの上流でちょうど終止する。
予測は、推定プロモーター領域同定用のソフトウェアを用いて行った。これらのソフトウェア、Promoter Inspector、First EFなどの各々は、ＰｏｌＩＩ真核生物プロモーターの特徴（ＴＡＴＡシグナル、ＧＣ組成の偏り、階層的組織など）に基づいて構築された数理モデルを用いたものである。異なるアプローチ（二次判別分析、マルコフ連鎖など）を特徴とし、異なる特徴に基づくソフトウェアは、同じ位置に見出された予測を立証することを可能にする。
最も適切な予測の結果を、下表Ｖにまとめた。
【００６５】
【表７】
【００６６】
これらの予測は、ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターを、種々のソフトウェアによって同定された両極端の位置により決定された、７４００〜１０，０００ｂｐの間の領域内に位置づけることを可能にするものである（図１２Ａ）。
プロモーター領域は、別な遺伝子が８５００位に終止し、そして１０，０００位がＡＴＰコドンの位置であることから、塩基８５００と１０，０００との間であるはずである。実際、８５００ｂｐの位置から上流の領域は、機能が知られていないNM_032792遺伝子に対応し、そして１０，０００ｂｐの位置から下流の領域は、ＦＡＴＰ５遺伝子に対応する。この情報は、７４００〜９１００ｂｐの間の領域内にプロモーターを位置づけた、生物情報ソフトウェアでなされたプロモーターの予測に匹敵するはずである。
【００６７】
ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のエクソン１の上流に位置するこの領域は、この遺伝子の調節にとって重要な推定プロモーターまたは調節エレメントを含むと推測される。Transfac（転写因子データベース）のテンプレートで分析され、中程度に保存されていることが示された領域は、境界７４００〜１０，０２３の間に広がる。ＥＳＴおよび全長型のｍＲＮＡの生物学的データは、転写開始点（ＴＳＳ）を９９９０位に位置付けることを可能にした。
したがって、図１３に記載された配列は、ヒトＦＡＴＰ５遺伝子の推定プロモーターに対応する。この配列は、添付された配列表中、配列番号１の番号で特定される。
９９９０位以外のＴＳＳは、９９２８位において確認することができた。しかしながら、細胞種によって、別のＴＳＳを代替物として用いることができる。
【００６８】
ｃ）ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモータ配列の、国際出願WO 0121795の先行技術との比較分析
本発明の対象となるヒトＦＡＴＰ５遺伝子の推定プロモーター配列と、種々のアクセス可能な配列バンク、例えば「Htgs」（終止していない（non-terminated）配列）、「Chromosome」（完全なゲノム、染色体および終止している（terminated）コンティグ）、および最後にnr（全ての公表された配列）などに含まれる配列との類似性について、一連の検索を行った。
ヒトＦＡＴＰ５遺伝子（コンティグNT_011104）のゲノム環境と、国際出願WO 01/21785に公開されているプロモーター領域との間の類似性の検索は、配列類似性がないことを示した。
GenBankの「Chromosome」部門に対する類似性検索は、このデータベースで参照されているヒトまたは他の種（酵母、ショウジョウバエなど）との有意な類似性を見出すことができなかった。
【００６９】
Htgsデータベースに含まれる配列中での類似性検索は、国際出願WO 01/21785のプロモータ配列に対応し得るヒトコンティグを特徴づけることができなかった。
国際出願WO 01/21785のプロモータ配列がヒトＦＡＴＰ５遺伝子のゲノム環境との類似性を示さないことを確認するために、これらの２つの配列をアラインメントした。有意な類似性は見出されなかった。
国際出願WO 01/21785に公開されているＦＡＴＰ５遺伝子のプロモータ配列の分析は、この配列が、本発明の対象となるヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターには対応しないが、マウスＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターに対応することを示した。
結論として、種々の検索により、本発明の対象となるヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターの配列は、いかなる既知の配列とも有意な類似性を有しないと結論付けることができる。
【００７０】
ｄ）本発明の対象となるヌクレオチド配列のプロモーター活性の確認
材料および方法
ＦＡＴＰ５の推定プロモータ配列の増幅：
テンプレート：ヒト胎盤のゲノムＤＮＡ（Sigma, St. Louis, MO）、
センスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号３：ＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＣＡＧＴＧＣＧＴＧＣＣ、
アンチセンスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号４：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＡＧＧ、
ＴａｑプラチナＰｆｘ＋バッファー１０×＋ＭｇＳＯ４（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）、
ｄＮＴＰ（Promega, Williamsburg, IA）。
ｈＦＡＴＰ５プロモーターに対応するインサートの精製：インサートのサイズ＝１５７３塩基。
増幅プログラム：
９４℃で５分間のインキュベーションサイクルを１回、
その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で２分間のインキュベーションサイクルを２５回。
【００７１】
得られた物質は、QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen, Courtaboeuf, France）で精製し、４℃に保った。
ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターを、ルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターｐＧＬ３にクローニングするための制限：
【表８】
２時間、３７℃でのインキュベーション。
Quick ligation kit（NEB, Beverly, MA）、cat#M2200Sの標準的プロトコルによるライゲーション。
３０秒間、４２℃の熱衝撃の標準的プロトコルによる形質転換。
細菌：ＤＨ５アルファ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）のディッシュへのプレーティング。
３７℃での一晩のインキュベーション。
スクリーニング：
各クローンを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天上に継代し、２０μｌの水中で再懸濁した。
懸濁液を、９５℃で１０分間加熱した。
【００７２】
ｐＧＬ３クローン／ｈＦＡＴＰ５プロモーターの選択のためのＰＣＲ条件
テンプレート：細菌溶解物
センスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号５：ＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ、
アンチセンスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号６：ＴＡＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣ、
Goldstar＋バッファー１０×＋ＭｇＣｌ２（Eurogentec, Seraing, Belgium）、５０μｇ／ｍｌ。
増幅プログラム：
９４℃で５分間のインキュベーションサイクルを１回、
その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間のインキュベーションサイクルを２５回、
その後、７２℃で７分間のサイクルを１回。
得られた物質は、４℃に保った。
プラスミドの作製は、EndoFree Plasmid maxi kit（Qiagen, Courtaboeuf, France, cat#12362）の標準的プロトコルに従った。
配列決定は、BigDye terminator V2.0 cycle sequencing kit（Applied Biosystems, Foster City, CA, cat#4314415)の標準的プロトコルに従った。
【００７３】
結果：
ヒトＦＡＴＰ５プロモーターの１５７３塩基の断片をｐＧＬ３にクローニングし、配列決定した。断片の連続した欠失による構築物は、ＦＡＴＰ５の肝での発現に特異的なプロモーター領域を同定することを可能にする。
ＨＥＰ２、ＨＥＬＡおよびＨＥＫ２９３肝細胞の一過性トランスフェクション：
スクリーニングのための最小可能なプロモーター断片を特定するために、一過性にトランスフェクトした細胞を用いた。トランスフェクションは、jetPEIプロトコル（Polytransfection, Illkirch, France）により、供給者の推奨に従って行った。
第３日：照度計による測定：
トランスフェクション混合物を含む培地を除去した。
プレートを、２５０μｌのＰＢＳで２回洗浄し、そして、１／５に希釈した１００μｌの溶解バッファーを加えた。プレートを、振盪させながら室温で３０分間インキュベートした。
各ウェルからの１０μｌの溶解液を、Greiner ９６穴白色プレート（Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany）に分配した。
【００７４】
ルシフェラーゼ活性は、Dual Luciferase kit（Promega, Madison, WI, USA）を用いて測定した。測定値は、TR717マイクロプレートルミノメーター（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）で取得した。
ルシフェラーゼ発光の結果はレニラに対して正規化し、プロモーターを含む構築物の、空ベクターｐＧＬ３と比較した誘導として表した。
結果：
ＦＡＴＰ５プロモーターの断片全体のプロモーター活性が確認された。図１４に示したこれらの結果は、本核酸配列が実際にＦＡＴＰ５プロモーターであり、かつそれが機能的であることを確認するものである。ルシフェラーゼ活性の最も高い値は、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞で観察された。
【００７５】
例３：安定してヒトＦＡＴＰ５プロモーターを発現している細胞でのスクリーニング試験
ａ）ヒトＦＡＴＰ５遺伝子の推定プロモーターの、ハイグロマイシン耐性を有するベクターｐＧＬ３ハイグロマイシンへのクローニング
ベクターｐＧＬ３ハイグロマイシンの作製：
Ｔｋプロモーターの制御下にあるハイグロマイシンをコードする遺伝子（サイズ：１６７１塩基）を、ベクターｐＲＥＰ４（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）から、以下のプライマーを用いて増幅した。
材料と方法：
センスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号７：ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣ、
オリゴアンチセンス（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号８：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＣＣＡＣＧＣＡＡＣＧＣ、
Goldstar＋バッファー１０×＋ＭｇＣｌ２（Eurogentec, Seraing, Belgium）。
増幅プログラムおよび得られた物質の精製は、ｈＦＡＴＰ５プロモーターに対応するインサートの増幅および精製のために先に用いたのと同じプロトコルに従って行った。
得られた断片は、ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Promega, Williamsburg, IA）のＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。クローニングのための制限、ライゲーションおよび形質転換は、ｈＦＡＴＰ５プロモーターに対応するインサートの増幅および精製のために先に用いたのと同一のプロトコルに従って行った。
Ｔｋハイグロマイシン断片を有するプラスミドｐＧＬ３が組み込まれたクローンは、ｐＧＬ３クローン／ｈＦＡＴＰ５プロモーターの選択に用いたのと同じプロトコルによるＰＣＲにより、テンプレートとして細菌溶解物を、および：
センスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号９：ＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣ、
アンチセンスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号１０：ＡＣＣＡＧＡＣＣＣＣＡＣＧＣＡＡＣＧＣ、
Goldstar＋バッファー１０×＋ＭｇＣｌ２（Eurogentec, Seraing, Belgium）、
を用いて選択した。
ｈＦＡＴＰ５プロモーターを含むｐＧＬ３ハイグロマイシンクローンの選択、プラスミドの作製および配列決定は、ｐＧＬ３クローン／ｈＦＡＴＰ５プロモーターの選択のために用いたのと同じプロトコルに従って行った。
【００７６】
ｂ）ＨｅｐＧ２肝細胞の安定したトランスフェクション
用いた培地を下表に記載する。
【表９】
【００７７】
ｃ）細胞のプレーティング
ＨｅｐＧ２細胞の培養物を調製した。細胞は、８０％コンフルエントに達したときに剥離し、６穴プレート中の培地に、１ウェルあたり３２０，０００細胞の割合で再接種した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間インキュベートした。
【００７８】
ｄ）トランスフェクションおよび活性化
トランスフェクションは、ａ）で調製した５００ｎｇのプラスミドを用いて、jetPEIプロトコル（Polytransfection, Illkirch, France）により、供給者の推奨に従って行った。
６穴プレートで培養した細胞の培地を吸引した。１ｍｌの無血清ＤＭＥＭと８０μｌのトランスフェクション混合物とを各ウェルに入れた。次に、細胞を、５％のＣＯ２を含む雰囲気下、３７℃で２時間放置した。この２時間が経過したときに、ＦＣＳを含まない培地１ｍｌと、２％の終濃度のUltroser SF（USF, BioSepra, Cergy Pontoise, France）とを加えた。
【００７９】
ｅ）トランスフェクション細胞の選択
４８時間の培養後に、各ウェルの培地を吸引した。１０％のＦＣＳと終濃度０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンとを含む２ｍｌの培養培地を加えた。細胞は、８０％コンフルエントに達したときに剥離した。
次に、２個のウェルからの細胞を混合し、１５０ｍｍのペトリ皿中の同じ選択培地に接種した。選択培養は、細胞クローンが現れるまで維持した。
【００８０】
ｆ）クローンの単離
クローンが明確に区別されるようになったら、これらを、シリンダーを用いて残りの培養物から単離した。次に、シリンダーに含まれた細胞をＰＢＳで洗浄し、培地の吸引後に取り出した。
細胞を９６穴プレートに配置し、そして１０％のＦＣＳと終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンとを含む２５０μｌのＤＭＥＭを加えた。培養は、８０％コンフルエントになるまで継続した。
【００８１】
ｇ）安定してヒトＦＡＴＰ５プロモーターを発現するＨｅｐＧ２細胞のスクリーニング
ストックを用意するために、クローンを増幅した。
各クローンに由来する細胞は、２４穴プレートにて、１０％のＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン混合物（０．１２５％）および０．２５ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＤＭＥＭ中、８０％コンフルエントまで培養した。
被験化合物による処置は、２４時間の期間適用した。この２４時間が経過したときに、ルシフェラーゼ活性を、細胞溶解物において、Applied Biosystems TR717発光リーダー（California, CA）を用いて測定した。
ルシフェラーゼ活性を示している細胞は、この活性が、これらの細胞が受け取ったプラスミドに含まれる推定プロモーターによって誘導されたことを示す。
この結果は、本発明の核酸が、実際に、その依存下に置かれた遺伝子の発現を導くことができるプロモーターであることを示すものである。
【００８２】
例４：糖尿病表現型の解消およびインスリン増感剤によるＺＤＦラットにおけるＦＡＴＰ５遺伝子の発現の調節
レキシノイド（rexinoid）と呼ばれるＲＸＲ核受容器のアゴニストは、インスリン増感剤であり、糖尿病肥満型動物モデル（２型糖尿病）において有益な効果を有する。ベキサロテンであるタルグレチン（登録商標）（CAS 1543559-49-0）は、核受容体ヘテロダイマー、ＲＸＲ−ＰＰＡＲ（ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体）またはＲＸＲ−ＬＸＲ（肝臓Ｘ受容体）を選択的に活性化する。
雄の糖尿病肥満型ラット（Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラット（ＺＤＦラット））は、食物と水に自由にアクセスできる動物ケージ内に維持し、夜昼リズム（nyctohemeral rhythm）が観察された。
【００８３】
化合物LGD 1069を、０．３、１．０、３．０、１０または３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で食餌に加え、７週齢より５０日間投与した。４頭の動物は、LGD 1069の添加なしで給餌した：ＺＤＦ２頭とＺＬＣ２頭。動物を絶食させ、その翌日に安楽死させた。組織を回収し、液体窒素中で直ちに凍結した。
肝ＲＮＡは、ChomczynskiおよびSacchiに由来する従来の技法で抽出した。発現は、ＦＡＴＰ５に特異的な放射性ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションによるノーザンブロッティングによって分析した。
結果を図１５に示す。
ＺＤＦラットの肝臓におけるＦＡＴＰ５の発現の、ＺＬＣラットに比した負の調節は、ＲＸＲアゴニストによる処置によって打ち消され、これは糖尿病の進行を逆転させた。
【００８４】
例５：真核細胞（ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣細胞）におけるＦＡＴＰ５受容体を介した脂肪酸の能動輸送を測定するための試験
蛍光標識された脂肪酸模倣分子の使用は、ＦＡＴＰ受容体を過剰発現した細胞における脂肪酸の細胞内蓄積の、マイクロタイタープレート形式での迅速な測定を提供する。
試験の説明
【表１０】
必要な専門器材
−ＣＯ２インキュベーター、
−顕微鏡、
−マルチドロップ、
−マイクロプレートウォッシャー、
−フルオレセイン用フィルターを有するマイクロプレート用蛍光計。
【００８５】
プロトコル
第１日
９６穴マイクロプレートへの細胞の分配
ＦＡＴＰ受容体を過剰発現するＣＨＯ真核細胞を、９６穴培養プレートに、１ウェルあたり約１０，０００細胞の密度で、以下の手順に従って分配する。
−層流フード下で、４ｍｌの細胞剥離溶液を２２５ｃｍ３の培養フラスコに３７℃で加える。
−溶液を、細胞単層上、手動による軌道回転運動で１０〜１５秒間振盪し、その後、１０ｍｌの血清用ピペットで吸引する。
−４ｍｌの細胞剥離溶液を加え、フラスコを（最長で）１０分間インキュベーター中に戻す。１０分後に、細胞の剥離を顕微鏡下でチェックする。細胞がすべて剥離するまで操作を続ける。
−８ｍｌの培地をフラスコに加え、細胞塊をほぐすために、内容物を何度か上から下へ混合する。この細胞混合物を、３７℃に予熱した８８ｍｌの培地に加える。
【００８６】
マルチドロップの準備
−マルチドロップを層流フードに配置する。マルチドロップのヘッドおよびチューブを、２０〜３０ｍｌの７０％エタノール、次いで２０〜３０ｍｌの無菌水、そして最後に２０〜３０ｍｌの培地をポンプ吸引することにより洗浄する。
−マルチドロップのチューブを細胞を含むフラスコに配置し、およそ５〜１０ｍｌの培地を除去する。１ウェルあたり１００μｌの細胞を加える（１０，０００細胞）。
−マイクロプレートを、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間、インキュベーター内に置く。
【００８７】
第２日：被験分子の添加
被験分子を、以下のプレートレイアウトに従って添加する：
【表１１】
−マルチドロップを用いて、９５μｌのＤＭＥＭ（フェノールレッド不含）を、９６穴マイクロプレートの各ウェルに分配する。
−被験分子を、Ｔと表示されたウェルに終濃度５ｍｇ／ｍｌ（１％のＤＭＳＯ）で同時に分配する。
−２００ｍＭのラウリン酸を、陰性対照ウェル（ＮＣ）に分配する。
−５μｌのＰＢＳを、陽性対照ウェル（ＰＣ）に分配する。
【００８８】
第３日
−細胞を、ＰＢＳで２回洗浄する。
−細胞を、ＰＢＳ中に０．１ｍＭのBODIPY-FAと、脂肪酸を含まない０．１％のＢＳＡとを含む脂肪酸模倣溶液中、２分間、３７℃でインキュベートする。
−２分後に、細胞を事前に氷中に配置しておいたＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ混合物で４回洗浄する。
−プレートを、蛍光マイクロプレートリーダーにて、励起波長として４８５ｎｍを、放出波長として５３０ｎｍを用いて読み込む。
結果を、プローブなし（ＰＣ）の対照細胞のパーセンテージとして、任意の蛍光単位で表す。
この試験は、真核細胞内へのＦＡＴＰ５受容体を介した脂肪酸の能動輸送を測定することを可能にする。これはまた、ＦＡＴＰ５受容体を介した脂肪酸の能動輸送に対する所定の分子の影響を測定することを可能にし、それによってヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターの活性を刺激または阻害するその能力を決定することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ＰＣＲによって分析された、ヒトＦＡＴＰ５遺伝子の発現の細胞および組織分布を示した図である。ＮＣＩ−Ｈ２９５：副腎細胞系、ＴＨＰ−１：単球、ＴＨＰ１Ｄ：ＴＨＰ−１単球の分化したマクロファージ、ＪｕｒｋａｔおよびＪｕｒｋａｔ ＪＲ：Ｔ細胞、ＣＥＭ：急性リンパ芽球性白血病細胞系の細胞、ＨＨ：ヒト初代肝細胞、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７：ヒト肝細胞、ＣａＣｏ２：結腸細胞、ＣａＣｏ２Ｄ：分化したＣａＣｏ２細胞、ＣＡＳＭＣ：冠状動脈平滑筋細胞、ＡＳＭＣ：大動脈平滑筋細胞。
【図２Ａ】３Ｔ３−Ｌ１細胞での脂肪酸捕獲試験で得られた結果を示した図である。結果は、各条件についての、時間の関数としての脂肪酸捕獲の誘導を表す。対照条件は、発現が細胞による脂肪酸捕獲に影響を及ぼさない遺伝子を担持するアデノウイルスに感染した細胞による捕獲の測定値を表す。
【図２Ｂ】ラット肝細胞（ＲＨ）での脂肪酸捕獲試験で得られた結果を示した図である（時間：１分）。結果は、各条件についての、時間の関数としての脂肪酸捕獲の誘導を表す。対照条件は、発現が細胞による脂肪酸捕獲に影響を及ぼさない遺伝子を担持するアデノウイルスに感染した細胞による捕獲の測定値を表す。
【図３Ａ】ｈＦＡＴＰ５遺伝子を担持するアデノウイルスへの感染後における、ＡＣＳ活性を決定するための試験において得られた結果を示した図である。結果は、誘導係数として表す。
【図３Ｂ】ｈＦＡＴＰ５遺伝子を担持するアデノウイルスへの感染後における、ＶＬＡＣＳ活性を決定するための試験において得られた結果を示した図である。結果は、誘導係数として表す。
【００９０】
【図４Ａ】ｈＦＡＴＰ５の発現の、脂肪酸のβ酸化への影響を決定するための試験において得られた結果を示した図である。４Ａ：４８時間におけるＨｅｐＧ２、４Ｂ：１２時間におけるＲＨ。結果は、誘導係数として表す。
【図４Ｂ】ｈＦＡＴＰ５の発現の、脂肪酸のβ酸化への影響を決定するための試験において得られた結果を示した図である。４Ａ：４８時間におけるＨｅｐＧ２、４Ｂ：１２時間におけるＲＨ。結果は、誘導係数として表す。
【図５】ｈＦＡＴＰ５の発現の、４８時間におけるＨｅｐＧ２細胞での脂肪酸のエステル化度への影響を決定するための試験において得られた結果を示した図である。結果は、３Ｈ２Ｏ／３ＴＧ比として表す。
【図６Ａ】ｈＦＡＴＰ５の発現の、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットでの糖尿病の発症の最中におけるｈＦＡＴＰ５の発現の調節への影響を決定するための試験において得られた結果を示した図である。Ａ：ブドウ糖レベルの測定値、Ｂ：インスリンレベルの測定値、−■−：雄のＺＤＦラット（ｆａ／ｆａ）、−□−：雄のＺＬＣラット（ｆａ／＋）。
【図６Ｂ】ｈＦＡＴＰ５の発現の、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットでの糖尿病の発症の最中におけるｈＦＡＴＰ５の発現の調節への影響を決定するための試験において得られた結果を示した図である。Ａ：ブドウ糖レベルの測定値、Ｂ：インスリンレベルの測定値、−■−：雄のＺＤＦラット（ｆａ／ｆａ）、−□−：雄のＺＬＣラット（ｆａ／＋）。
【図７】Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラット（ＺＤＦ：−●−）およびＺＬＣラット（−○−）におけるｈＦＡＴＰ５メッセンジャーＲＮＡのレベルを測定するための試験において得られた結果を示した図である。
【図８Ａ】生化学分析の結果を示した図である。Ａ：肝臓における遊離脂肪酸レベルの測定値（−θ−：ＺＤＦラット（ｆａ／ｆａ）、−○−：ＺＬＣラット（ｆａ／＋））、Ｂ：体重増加曲線（−●−：ＺＤＦラット（ｆａ／ｆａ）、−□−：ＺＬＣラット（ｆａ／＋））。
【図８Ｂ】生化学分析の結果を示した図である。Ａ：肝臓における遊離脂肪酸レベルの測定値（−θ−：ＺＤＦラット（ｆａ／ｆａ）、−○−：ＺＬＣラット（ｆａ／＋））、Ｂ：体重増加曲線（−●−：ＺＤＦラット（ｆａ／ｆａ）、−□−：ＺＬＣラット（ｆａ／＋））。
【００９１】
【図９】８週齢のＺＤＦおよびＺＬＣラットにおける、各条件につき５および３０分でのオレイン酸のアシル化の程度を示した図である。Ａ：ＺＤＦラット、Ｂ：ＺＬＣラット。
【図１０】ＺＤＦラットの初代肝細胞における、ＺＬＣ対照ラットと比較したβ酸化の程度の抑制の解消を示した図である。Ａ：８週齢のラット、Ｂ：１０週齢のラット。（Ｃ＝対照、Ｚ＝ＬａｃＺ、ｈ５＝ｈＦＡＴＰ５）。
【図１１】ＬａｃＺ対照アデノウイルスに感染したラットと比較した、ＦＡＴＰ５を担時するアデノウイルスに感染したＺＤＦラットにおける生化学パラメータの測定値を示した図である（遊離脂肪酸（Ａ）、トリグリセリド（Ｂ）およびブドウ糖（Ｃ））。
【図１２】ＦＡＴＰ５遺伝子の転写開始点（ＴＳＳ）の位置を示した図である。Ａ：バイオインフォマティクスによる予測的な方法論、Ｂ：ＲＡＣＥによる実験的な方法論。
【図１３】ヒトＦＡＴＰ５遺伝子の推定プロモーターの配列を示した図である。この配列は、添付された配列表において配列番号１の番号で特定される。
【図１４】ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモータ配列の、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａおよびＨｅｋ２９３細胞における活性を示した図である。結果は、空プラスミドｐＧＬ３で形質転換した細胞で測定した対照と比較した誘導として表示してある。
【図１５】ＺＤＦラット（Ａ）またはＺＬＣラット（Ｂ）をインスリン増感剤として知られる化合物で処置した後の、ＦＡＴＰ５メッセンジャーＲＮＡのレベルの変動を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ヒトＦＡＴＰ５タンパク質のプロモーターに対応することを特徴とする単離ヒト核酸、および前記プロモーターの依存下に置かれた、タンパク質、特にヒトＦＡＴＰ５タンパク質をコードする単離ヒト核酸に関する。
本発明はさらに、前記核酸を含むベクター、または、前記核酸もしくは前記ベクターが導入された宿主細胞に関する。最後に、本発明は、ヒトＦＡＴＰ５タンパク質の前記プロモーターの依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質を同定する方法における、前記核酸、前記ベクターまたは前記宿主細胞の使用、および前記同定方法に関する。
本発明は、最後に、ヒトＦＡＴＰ５タンパク質の前記プロモーターの依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質、および、糖尿病を予防および／または処置するための、または、肝臓における脂肪酸のβ酸化を誘導するための医薬の製造における前記物質の使用に関する。
【０００２】
ＩＩ型糖尿病は、世界中において主要な公衆衛生上の問題である。現在、およそ１億２５００万人が本症に罹患しており、このうち米国内に存在する者だけで１５００万人を占める。予測は、２０１０年に、糖尿病に罹患している患者数が２倍になることを示している。現在米国で糖尿病を患っている９０〜９５％の人々がＩＩ型糖尿病に罹患している。ＩＩ型は、インスリン耐性と高血糖症とを特徴とする代謝病であり、しばしば高血圧、脂質障害および肥満を伴う。成人において、この病的状態は一般に３０才から現れ、心臓、血管、眼、腎臓および／または神経への損傷を含む合併症を特徴とする。
【０００３】
今のところ、残念なことに、原因に対する治療的および／または予防的処置は存在せず、処置は、一般に対症療法的となる傾向がある。
したがって、糖尿病の原因を処置することが可能な物質が真に求められている。また、糖尿病の原因を処置することができる前記物質を特定するために、前記物質を特定する効果的方法も常に変わらず求められている。
本発明の目的の１つは、そのような方法を提供することである。
【０００４】
長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）は生物のための重要なエネルギー源であり、ミトコンドリアにおけるそのβ酸化を介してＡＴＰを提供する。これらはまた、多数の多様な細胞過程、例えば細胞シグナリング経路または遺伝子発現の調節のための基質でもある。例として、脂肪酸は心臓にエネルギーの恒常的で効果的な供給を提供するために不可欠である。
ＬＣＦＡは、リポタンパク質リパーゼによる脂肪分解の後で粘膜の細胞に入り、そしてその後、小胞体でトリグリセリドにエステル化される。トリグリセリドはその後、アポリポタンパク質とともに脂肪粒子（lipoparticle）複合体内に組み込まれ、極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）またはキロミクロンを形成し、そしてエキソサイトーシスによって細胞から出て行き、全身循環中に廃棄される。リポタンパク質リパーゼは、これらの粒子を血管内皮細胞の表面で非エステル型脂肪酸に変換し、これは、その後アルブミンと結合することができる。
【０００５】
ラット細胞における脂肪酸の捕獲の動態は、最初の３０秒間にわたる急速な線形段階と、それに続く、初期捕獲速度の低減を伴う移行段階、および低い蓄積速度を有する後期に分けられる。最初の捕獲速度は、脂肪酸のベクトル的に一方向の流れに対応し、インキュベーション培地に適用される脂肪酸濃度の計算された作用によって特徴づけることができる。動態、ＬＣＦＡによる競合、およびプロテアーゼでの細胞の処理による脂肪酸輸送の抑制は、輸送体に媒介された過程を支持するものである。
【０００６】
最初の脂肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴＰ）は、ラット脂肪細胞において１９９４年に同定された。２つの対応する遺伝子がその後に同定され、そして現在はＦＡＴＰ１およびアシルコエンザイムＡシンテターゼ（ＡＣＳ）と呼ばれている。マウス遺伝子ライブラリーのスクリーニングにより、ＦＡＴＰファミリーの全ての成員における高度に保存された３１１個のアミノ酸からなるサイン配列（signature sequence）によって特徴づけられるタンパク質のファミリーが、その後明らかになった。これらはすべてＡＭＰ結合部位を含む。これまでに、６種のマウスＦＡＴＰおよび６種のヒトＦＡＴＰが同定された。コエンザイムＡシンテターゼ活性は、現在ＦＡＴＰ１、２、４および５に関連している。ＬＣＦＡ捕獲におけるこれらの役割は、これらの酵素活性から推論することができる。あるいは、ＦＡＴＰの発現は、遊離脂肪酸の細胞内レベルの増加を導くことができ、したがって、ＶＬＡＣＳ（超長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ）活性を誘導することができる。実際、アシル化に関与する酵素、例えばアシルコエンザイムＡシンテターゼ（ＡＣＳ）は、ＰＰＡＲ（ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体）転写因子およびある種の長鎖脂肪酸によって正に調節されている。
【０００７】
アシル化は、脂肪酸を活性化し、アシル−ＣｏＡの活性代謝誘導体を形成し、これはいかなる代謝経路にも入ることができるようになる。小胞体において、脂肪酸はトリグリセリドの合成に関与することができる。ミトコンドリアおよびペルオキシソームにおいて、ＦＡＴＰは脂肪酸の分解を誘導することができる。
ＦＡＴＰは、そのアミノ末端に応じて異なる細胞内位置を占めている。これらのＮ末端は、脂肪酸を異なる細胞内コンパートメントに分配し、その後別々の代謝経路へのこれらの組み込みを誘導するために、様々なパートナーと相互作用することができる。
【０００８】
これらは少なくとも２つの相同サインユニットを保有しているが、異なるＦＡＴＰは別々の染色体位置、特有のプロモーターおよび遺伝子調節、特有の分布プロファイル、異なる細胞位置、および専門化された機能を有する。
従来技術において、ＦＡＴＰ５は、このタンパク質について検出可能な活性に応じて、例えば超長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ関連物（ＶＬＡＣＳＲ）、超長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼホモログ（ＶＬＣＳ−Ｈ２）、コリル−コエンザイムＡリガーゼまたは胆汁酸コエンザイムＡシンテターゼ（ＢＡＣＳ）などの異なる名称で見出される。
【０００９】
ヒトにおいて、タンパク質はもっぱら肝臓で発現される。
マウスにおいては、２．６ｋｂのメッセンジャーＲＮＡが肝臓で非常に豊富であることが知られている。より短いメッセンジャーＲＮＡのより低いレベルの発現が、脳、肺、睾丸および脾臓（２．５ｋｂ）において、そして、骨格筋（２．２ｋｂ）において検出された。転写物の存在は、ＰＣＲ技法により心臓において示されたが、腎臓においては示されなかった。
ヒトにおいて、転写物は、そのマウスホモログと対照的に、線維芽細胞、脳または心臓で検出することができなかった。
サザンブロット分析は、ＶＬＡＣＳＲ遺伝子がヒトおよびマウスの双方で単一コピーで存在することを示す。
【００１０】
例えば、ＦＡＴＰ５が長鎖脂肪酸および超長鎖脂肪酸（例えばＣ１８〜Ｃ２６）を活性化できることが報告されている。ＦＡＴＰ５は、ケノデオキシコレート、デオキシコレート、リトコレートおよびトリヒドロキシコレスタノン酸（trihydroxycholestanoic acid）を活性化することができる。
本発明者らの知る限りでは、脂肪酸分解におけるＦＡＴＰ５の関与は、これまで全く記載されたことはなかった。ＦＡＴＰ５の役割は、腸肝再循環を介した脂肪酸の再活性化だけに限定されていた。
従来技術において、国際出願WO 01/21795は、ＦＡＴＰ５が脂肪酸輸送体として役割を果たし、そうして細胞による脂肪酸捕獲の過程に関与することを示唆している。
【００１１】
さらにまた、糖尿病に罹患した者、または糖尿病を発症しやすい者は、血流中に高レベルの遊離脂肪酸を有することが知られている。血漿中の遊離脂肪酸の過剰は、インスリン感受性組織、例えば骨格筋において、エネルギーを産生するためのブドウ糖の利用に対する競合者のように作用する。脂肪酸は、異なるレベルで糖代謝に干渉する。これらは、間接的に解糖を阻害し、グリコーゲンの形態でのブドウ糖の貯蔵を減らし、間接的にグルコース輸送を阻害する。これは、遊離脂肪酸が過剰である場合におけるその優先的な利用、および、高血糖症の発症を導く、循環中のブドウ糖濃度の増加を示す傾向がある。
【００１２】
驚くべきことに、そして、予想を超えて、本発明者らは今回、ＦＡＴＰ５が肝臓における脂肪酸の分解に関与することを見出した。同様に、本発明者らは、この特性が、結果として間違いなく血漿中のブドウ糖および脂質濃度を減少させることを示すことができた。特に、本発明者らは、ＦＡＴＰ５のメッセンジャーＲＮＡの発現レベルが、糖尿病の肥満ラット（Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラット（ＺＤＦラット））において、非糖尿病ラット（Ｚｕｃｋｅｒ痩せ型ラット（ＺＬＣラット））におけるＦＡＴＰ５のメッセンジャーＲＮＡの発現レベルに比べて大幅に減少していることを示すことができた。
したがって、ＦＡＴＰ５の過剰発現が、結果として遊離脂肪酸のレベルを減らし得ることを想起することが可能となり、したがって、ＦＡＴＰ５の発現レベルを増やす能力を有する任意の物質が、糖尿病の予防的または治療的処置用の医薬の製造のための良い候補であり得ることを十分に予測することができる。
本発明は、この応用分野に含まれる。
【００１３】
本発明者らは、ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターである、添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列を少なくとも含むことを特徴とする、ヒト核酸配列を単離した。この配列は、従来技術においてＦＡＴＰ５プロモーターの配列であると考えられていた配列と、わずかにしか相同ではない。
本発明は、したがって、第一に、添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列を少なくとも含むことを特徴とする、単離されたヒト核酸配列に関する。前記配列は、ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターに対応する。
【００１４】
本発明はさらに、添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列からなることを特徴とする、単離されたヒト核酸配列に関する。
本発明の１つの特定の実施例において、配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列を少なくとも含む核酸配列は、タンパク質、特にヒトＦＡＴＰ５タンパク質をコードする。特に好ましくは、配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列を少なくとも含み、かつ、ヒトＦＡＴＰ５タンパク質をコードする前記核酸配列は、添付された配列表において配列番号２の番号で特定されるヌクレオチド配列に対応する。
【００１５】
本発明はさらに、上記と相補的なセンスまたはアンチセンス核酸配列、および、本発明による核酸配列のうちの１つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性パーセントを有する任意の核酸配列に関する。
参照配列と少なくともＸ％の同一性パーセントを有する核酸配列は、本発明において、参照配列の１００ヌクレオチドあたり１００−Ｘ個までの変更を含み得るが、前記参照配列の機能的な特性を保持している核酸配列として定義される。本発明に関して、「変更」は、参照配列における連続的または散剤的なヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む。
本発明による少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性パーセントを有する核酸配列は、アレル変異体、すなわち配列番号１または配列番号２の配列の個体変異に対応する全ての配列を含む。これらの自然な変異配列は、哺乳類、特にヒトに存在する多型に対応する。
【００１６】
本発明はさらに、上記に定義した本発明の核酸配列が挿入されたクローニングおよび／または発現ベクターに関する。好ましくは、本発明のベクターは、添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列を少なくとも含む核酸配列を含む。
本発明の１つの特定の態様において、本発明のベクターはまた、上記に定義された、ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターとして同定された核酸配列の依存下に置かれた、検出可能なタンパク質をコードする核酸配列を含む。特に、このプロモーターは、配列番号１の配列に対応する。「検出可能なタンパク質」とは、一度発現されると、当業者に知られている任意の技術によって容易に同定される任意のタンパク質を意味すると理解される。ＦＡＴＰ５自体、またはマーカーとして用いられるタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、レニラ（renilla）またはルシフェラーゼを、用いることができるタンパク質として挙げることができる。
【００１７】
かかるベクターは、宿主細胞における表現、および任意にタンパク質の分泌のために必要な要素を含むことができる。
前記ベクターは、好ましくは、翻訳開始および終止シグナル、ならびに適切な転写調節領域を含む。これらは細胞中で安定して維持することができる必要があり、そして、翻訳されたタンパク質の分泌を指示する特定のシグナルをコードする配列を任意に含むことができる。
本発明による核酸配列は、選択された宿主内の自律複製型ベクター中に、または選択された宿主の組込型ベクター中に挿入することができる。
自律複製系のなかでは、宿主細胞にしたがって、プラスミドまたはウイルス型のシステムを用いることが好ましい。
本発明によって用いることができるプラスミドベクターは、核酸配列の発現を可能にする任意の既知のプラスミドであってもよい。
【００１８】
「核酸配列の発現」とは、本発明によれば、本発明の核酸配列のＲＮＡへの転写、および任意にこれに続く前記ＲＮＡのタンパク質への翻訳を可能にする本発明のベクターの能力を意味するものと理解される。
好ましくは、本発明によるプラスミドは、上記の単離されたヒト核酸配列の発現を可能にする。特に好ましくは、本発明によるプラスミドは、添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列、特にＦＡＴＰ５をコードする核酸を少なくとも含むことを特徴とする核酸配列の発現を可能にする。
【００１９】
以下のものを、本発明によって用いることができるプラスミドの例として挙げることができる：プラスミドｐＣＭＶＴａｇ（Stratagene, La Jolla, USA）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）、ｐＳＧ５（Stratagene, La Jolla, USA）またはｐＧＬ２およびｐＧＬ３（Promega, Mannheim, Germany）。
ウイルスベクターは、特にアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルスであってもよい。当業者は、これらの系の各々のために用いることができる技術に精通している。
核酸配列を宿主細胞の染色体に組み込むことが望ましい場合は、例えば、プラスミドまたはウイルス型のシステムを用いることが可能であり、このようなウイルスは、例えばレトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
【００２０】
非ウイルスベクターの中では、好ましいのは、裸のＤＮＡまたはＲＮＡなどの裸のポリヌクレオチド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母における発現のための酵母人工染色体（ＹＡＣ）、マウス細胞における発現のためのマウス人工染色体（ＭＡＣ）、および、好ましくは、ヒト細胞における発現のためのヒト人工染色体（ＨＡＣ）である。
本発明によると、ベクターは好ましくはプラスミドまたはアデノウイルスである。
かかるベクターは、当業者によって一般に用いられている方法によって調製し、そして、得られた組換えベクターは、標準的な方法、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、熱衝撃、膜の化学的透過化処理後の形質転換、または細胞融合によって適切な宿主に導入することができる。
【００２１】
本発明はさらに、本発明による少なくとも１種の核酸配列または本発明による少なくとも１種のベクターが導入された、形質転換された宿主細胞、特に真核細胞および原核細胞に関する。
細菌細胞、酵母細胞および動物細胞、特に哺乳類細胞を、本発明に関して用いることができる細胞として挙げることができる。昆虫細胞、例えばバキュロウイルスを伴う方法を用いることができるものも挙げることができる。
【００２２】
本発明はさらに、上記の宿主細胞を、該細胞中に導入された本発明による核酸配列の、タンパク質の形態での発現を可能にする条件下で培養することを特徴とする、タンパク質を産生する方法に関する。
本発明はさらに、本発明による核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質の同定のための、上記の本発明の核酸配列、ベクターまたは宿主細胞の使用に関する。
【００２３】
本発明はさらに、上記の本発明による核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質を特定する方法であって、
ａ）上記の核酸配列、ベクターまたは宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現に適した媒体中で、上記の核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質と接触させること、および
ｂ）上記の核酸配列の依存下に置かれた前記ヌクレオチド配列の発現のレベルを測定すること、
を特徴とする方法に関する。
【００２４】
「ヌクレオチド配列の発現に適した媒体」は、本明細書中では、本発明の核酸配列からの、ＲＮＡ、特にメッセンジャーＲＮＡ、および任意にタンパク質の合成を可能にする任意の発現系を意味すると理解される。
１つの特定の態様において、本発明の方法は、ｂ）で決定された発現レベルと、同定する物質に接触させなかった対照における、上記の核酸配列の依存下に置かれた前記ヌクレオチド配列の発現のレベルとの比較のための、追加の工程を含む。
比較は、本発明の核酸配列に対する被験物質の調節能力を評価することを可能にする。
【００２５】
「調節する」または「調節能力」は、本発明によれば、本発明による核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を刺激または阻害する被験物質の能力を意味すると理解される。
本発明の核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現レベルは、自体公知の従来のｍＲＮＡまたはタンパク質分析技法で測定することができ、以下の技術を、非限定的な例として言及することができる：ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、および免疫細胞化学または免疫組織化学分析技術。細胞もしくは分子生物学、または免疫細胞化学もしくは免疫組織化学分析の実験プロトコルに関するすべてのことについては、本特許出願の各所において、当業者に完全に精通している多数の著作、特に「Current Protocols in Immunology; John Wiley and Sons, Teton Data System, Jackson, Wyoming (ISBN 0-471-30660-6, 2003)」を参照することができる。
前記測定は、プローブ、プライマーまたは抗体を用いて有利になされる。
【００２６】
本発明による核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質は、生体高分子、例えば、核酸、脂質、糖、タンパク質、ペプチド、タンパク質−脂質、タンパク質−糖、ペプチド−脂質もしくはペプチド−砂糖ハイブリッド化合物、または化学的分枝もしくは化学分子が付加されたタンパク質またはペプチドであってもよい。
本発明はさらに、本発明による核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質であって、本発明の方法により入手可能な前記物質に関する。
【００２７】
本発明はさらに、本発明による核酸配列と相互作用することが可能な物質を同定する方法であって、
ａ）上記の核酸配列、ベクターまたは宿主細胞を、本発明による核酸配列と相互作用することが可能な物質に接触させること、および
ｂ）前記核酸配列と前記被験物質との間の相互作用を評価すること、
を特徴とする方法に関する。
本発明を実行する１つの特定の方法では、前記同定方法の目的は、本発明による核酸配列と結合することが可能な物質を特定することであり、前記方法は、例えば、異種相互作用の場合は熱量測定であり、または、ペプチド−ペプチド相互作用の場合は、２ハイブリッド試験である。
【００２８】
最後に、本発明は、本発明による核酸配列と相互作用すること、または結合することが可能な物質であって、上記の同定方法のうちの１つによって入手できる前記物質に関する。
本発明によれば、前記核酸配列と前記被験物質との間の相互作用および／または結合は、任意の既知の技法によって評価することができる。
【００２９】
本発明者らは、ＦＡＴＰ５が肝臓における脂肪酸の分解に関与していることを示した。同様に、本発明者らは、この特性が、結果として間違いなく血漿ブドウ糖および脂質濃度を減少させることを示すことができた。特に、本発明者らは、ＦＡＴＰ５メッセンジャーＲＮＡの発現レベルが、糖尿病ラット（Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラット（ＺＤＦラット））において、非糖尿病ラット（ＺＬＣラット）におけるＦＡＴＰ５メッセンジャーＲＮＡの発現に比べて大幅に減少していることを示すことができた。
したがって、本発明はさらに、糖尿病を予防および／または処置するための医薬の製造のための、本発明による物質の使用に関する。
本発明はさらに、肝臓における脂肪酸のβ酸化を誘導するための医薬の製造のための、本発明による物質の使用に関する。
【００３０】
上記の事項に加えて、本発明はまた、本発明をいかに実行するかについての例および添付の図面を参照した以下の説明から明らかになる他の事項を含む。
以下の例は、いかなる意味においても制限を意味することなく本発明を例証する。
【００３１】
例１：脂肪酸のβ酸化におけるｈＦＡＴＰ５の関与の証明
材料および方法
Ａ）ＦＡＴＰ５発現プロファイル
ａ）ＲＮＡの調製
全ＲＮＡは、細胞および組織から、ChomczynskiおよびSacchi（Chomczynski et al., 1987）により記載された技法を用いて調製した。ＲＮＡは２６０ｎｍでの光学密度の測定によって定量し、そして、ＲＮＡの品質は２６０／２８０光学密度比の測定によってチェックした。
１μｇの各サンプルを、酵素ＭＭＬＶ−ＲＴ（Gibco BRL, Paisley, UK）を用いた逆転写（ＲＴ）反応においてテンプレートとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を、２μｌのＲＴ産物について実行した。特異的プライマー（Eurogentec, Seraing, Belgium）を、ｈＦＡＴＰ５およびｒＦＡＴＰ５について調製した。ＰＣＲ産物の特異性を確保するために、熱変性温度（Ｔｍ）は各々の特定の標的について最適化し、サイクル数は、転写産物の量に応じて、２５〜３０の間に設定した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
ＤＮＡ ＰＣＲ産物は、１％のアガロースゲル上で分析した。シグナルは、Gel Doc（登録商標）2000装置（Bio-rad, Marnes La Coquette, France）を用いて、密度測定値として定量化した。in vivo転写分析については、定量化は、特定の各標的の値の、内部対照（アクチン）の値に対する比として計算した。結果は、１に設定された対照と比較した誘導レベルとして表示した。
【００３４】
定量分析は、３２キャピラリーLight Cycler装置（Roche）にて、二本鎖ＤＮＡを標識するフルオロフォアであるサイバーグリーンを用いて、二段階ＰＣＲ（Roche, Mannheim, Germany）によって行った。縦座標の増幅曲線の微分値（ＰＣＲの最中の蛍光の増大を表す）と、横座標のサイクル数との交点として表された各標的についての結果は、対照遺伝子で正規化した。
【表２】
【００３５】
Ｂ）Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットにおける糖尿病発症の動態
Genetic Model Inc.（Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA）に由来する５週齢の雄のＺｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラット（ＺＤＦ／ＧＭＩ−ｆａ／ｆａ）および同週齢の雄のＺｕｃｋｅｒ痩せ型ラットは、無制限量のPurina 5008（PMI Nutrition International, Wellingborough, Northamptonshire, UK）で飼育した。
６週齢、１０週齢および２０週齢において、４８頭のラットを、１６頭（８頭のＺｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットおよび８頭のＺｕｃｋｅｒ痩せ型ラット）の３群に分けた。動物の重量およびその摂食量は、実験の間中モニターした。
【００３６】
血液サンプルは、日中、８時間の食餌療法期間の後、麻酔下にて眼窩採血により採取した。麻酔は、ペントバルビタールの腹腔内投与によって誘発した。動物は頚椎脱臼によって安楽死させ、肝臓を摘出し、重量を測定し、さらなる分析のために液体窒素中で直ちに凍結させた。
【表３】
【００３７】
ｂ）分析
血清グルコース、コレステロール、トリグリセリドおよび遊離脂肪酸は、酵素によるバイオアッセイを用いて決定した。
インスリンレベルは、放射免疫分析により決定した。
肝臓の一部は、組織学的研究のために保存した。
【００３８】
Ｃ）アデノウイルス中へのｈＦＡＴＰ５の完全な配列のクローニング
別途示さない限り、用いた技法は、供給者によって、または分子生物学に関する多数の古典的な著作に記載されたものである。
ｈＦＡＴＰ５の完全なコード配列（配列番号２の配列の１５７５位におけるＡＴＧから）は、Adeno-X（Clontech, Palo Alto, USA）のＰＴ３４１４−１発現系にクローニングした。
ヒト肝細胞培養物の全ＲＮＡは、Qiagen（Qiagen, Courtaboeuf, France）からの、RNeasy miniprep kitで抽出した。
【００３９】
次いで、第一ＤＮＡ鎖を以下の通りに合成した。
【表４】
【００４０】
次に、以下のプライマー：
配列ｈ５＿４Ａｓ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号１９：ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＣＴＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣ
配列ｈ５＿１Ｓ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号２０：ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＡＧ
を用い、以下の反応媒体：
センスオリゴ（１０ｐＭ）１μｌ
アンチセンスオリゴ（１０ｐＭ）１μｌ
ＴａｑプラチナＰｆｘ＋バッファー１０×＋ＭｇＳＯ４（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）
ｄＮＴＰ（Promega, Williamsburg, IA)
最終容量は２０μｌ
により、ＰＣＲを実行した。
【００４１】
次に、以下のプログラムにしたがって増幅を行った：
９４℃で５分間を１サイクル、次いで９４℃での３０秒、次に５５℃での３０秒、そして６８℃での２分を含む２５サイクル。
その後、産物を４℃で維持した。
得られたＰＣＲ断片を、QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen, Courtaboeuf, France）を用いて精製した。
精製した断片を、次に、ＸｂａＩ（NEB, Beverly, MA）で消化し、ClontechからのpAdenoXキットのベクターpShuttle中に、供給者の推奨にしたがってクローニングした。
【００４２】
得られたプラスミドを、ＤＨ５ｄ型の大腸菌に導入し、そして、クローンをこれらのカナマイシン耐性によって選択した。次に、陽性クローンのプラスミドＤＮＡを精製し、制限分析によりチェックし、配列決定した。タンパク質の発現は、Ｔ７発現系を用いて、in vitroで確認した。pShuttleの発現カセットを、ＰＩ−Ｓｃｅ／Ｉ−ＣｅｕＩを用いて切断し、Adeno-X（登録商標）ウイルスＤＮＡにライゲーションした。ライゲーション産物をＳｗａＩで消化し、そして大腸菌中に導入した。アンピシリン耐性クローンを選択した。
対象となる遺伝子を含んでいる組換えアデノウイルスＤＮＡをＰａｃＩで消化し、ヒト胎児腎細胞（２９３細胞）中に導入した。アデノウイルス組換え体を回収し、３回の増幅サイクルにより再増幅した。ウイルスはＣＩＣｓ法によって精製し、次にSephadex Ｇ５０カラムで洗浄した。ウイルス粒子は、９６穴プレートにおけるプラーク形成アッセイにより力価測定した（Ｐｆｕ）。
【００４３】
Ｄ）ラット肝細胞の調製
ラット肝細胞は、コラゲナーゼ灌流によって雄ラットの肝臓から単離した。ラットを、ペントバルビタールの腹腔内投与によって麻酔した。次に、肝臓を門脈において、まず２００ｍｌの肝臓潅流培地で、そして次に、１０ｍＭのHepes、４ｍＭのＣａＣｌ２および１４ｍｇのBlendzyme3が添加された２００ｍｌのHanksバッファーで灌流した。肝臓を切開し、肝細胞洗浄培地（Gibco BRL, Paisley, UK）中で細切し、７０μｍのフィルターで濾過した。
細胞は遠心分離し、肝細胞洗浄培地中で３回洗浄した後、細胞の生存率をトリパンブルー排除法により評価した（生存率＞８５％）。細胞は、UltroserSF（２容量％）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、遊離脂肪酸／ＢＳＡ（SIGMA, St. Louis, MO, USA）（０．２重量／容量％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、デキサメタゾン（１μＭ）、トリヨードサイロニン（Ｔ３、SIGMA, St. Louis, MO, USA）（１００ｎＭ）およびインスリン（１００ｎＭ）が添加されたWilliams培地中に接種した。４時間後に、培養培地を、UltroserまたはＢＳＡを含まない同様のウィリアムズ培地と交換した。
【００４４】
Ｅ）糖尿病を発症中のＺＤＦラットへのｈＦＡＴＰ５アデノウイルスおよびＬＡＣＺアデノウイルスの感染
Genetic Model Inc.（Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA）に由来する５週齢の雄のＺｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラット（ＺＤＦ／ＧＭＩ−ｆａ／ｆａ）および同週齢の雄のＺｕｃｋｅｒ痩せ型ラットは、無制限量のPurina 5008（PMI Nutrition International, Wellingborough, Northamptonshire, UK）で飼育した。
８週齢において、５．１０９ＰｆｕのアデノウイルスまたはＰＢＳ（対照用）を、ラットの尾静脈中に注射した。注射容量は、１ラットあたり２ｍｌ未満であった。３頭のラットをｐＡｄｈＦＡＴＰ５に、そして３頭をｐＡｄＬａｃＺに感染させた。ラットは、１０週で安楽死させた。ブドウ糖、遊離脂肪酸およびトリグリセリドレベルを、血漿中で測定した。
【００４５】
Ｆ）機能試験
ａ）脂肪酸の捕獲
ＢＳＡと複合体化した最終２０μＭの１４Ｃ標識オレイン酸（図２Ｂ）または最終７８ｎＭのトリチウム標識オレイン酸（図２Ａ）を、輸送試験に用いた。
ラット肝細胞（１０６細胞／コンパートメント）を６穴プレートのウェルに接種し、３７℃で４時間インキュベートした。３Ｔ３−Ｌ１細胞（ATCC No. CL-173、Manassas、VA、USA）（５．１０５細胞／コンパートメント）は、２％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ中でインキュベートした。感染は多重度が１であり、一晩継続した。
【００４６】
細胞はトリプシンで処理し、回収し、遠心分離し、ＰＢＳで再懸濁して５．１０５細胞／ｍｌの懸濁液を得た。２００μｌの細胞懸濁液（１０５細胞）は、５ｍｌのポリプロピレンチューブ中に置いた。ＰＢＳ中の細胞懸濁液は、水浴中３７℃で５分間、振盪しながらプレインキュベートした。脂肪酸の捕獲のために、２倍に濃縮した脂肪酸／ＢＳＡの原液を各チューブに等量加えた。所定の間隔で、０．１％のＢＳＡと２００μＭのフロレチン（SIGMA, St. Louis, MO, USA）を含むＰＢＳの冷液（０℃）（洗浄液）５ｍｌを各チューブに添加することにより捕獲を停止させた。細胞を遠心分離し、二回洗浄した。遠心分離残渣を、４００μｌの溶解緩衝液（水中の０．４％のＳＤＳ）で再懸濁した。次に４ｍｌのシンチレーター溶液を加え、取り込まれた脂肪酸をTri-Carb 2100カウンター（Packard, Meriden, CT, USA）でカウントした。結果はＬａｃＺの誘導の割合として表し、１に対して正規化した。
【００４７】
ｂ）脂肪酸のアシル化
ラット肝細胞（１０６細胞／コンパートメント）を、６穴プレートのウェルに接種し、３７℃で４時間インキュベートした。次に培地を回収し、２ｍｌの伝染性混合物（ＤＭＥＭ、２％のＦＣＳ）を各ウェルに加えた。感染は多重度が１であり、一晩継続した。細胞をトリプシンで処理し、回収し、遠心分離した。遠心残渣を、３００μｌの緩衝液Ａ（ｐＨ８．５の５００ｍＭのtris ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＡＴＰ、０．１％のTritonX 100）で再懸濁した。細胞を超音波処理し、氷中で３０分間インキュベートした。タンパク質レベルは、ブラッドフォード法により定量化した。１試験あたり、２０μｇのタンパク質を含む２０μｌの抽出物を用い、ガラスチューブ中に置いた。１８０μｌの反応混合物（ｐＨ８．５の５０ｍＭのtris ＨＣｌ、１５０μＭのコエンザイムＡ、３００μＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のTritonX 100、１４Ｃで標識された１０μＭのパルミチン酸またはリグノセリン酸）を、試験を開始するために加えた。反応は、５〜３０分後に８００μｌの１％の過塩素酸の添加により停止させた。
【００４８】
標識されたオレイル−ＣｏＡのレベルを評価するために、反応混合物を２．２５ｍｌのイソプロピル／ヘプタン／硫酸（４０／１０／１）で抽出した。抽出物を混合し、有機相を回収した。２回の連続した抽出を実行した。４ｍｌのシンチレーター溶液を１ｍｌの水相に加え、Tri-Carb 2100ＴＲカウンターでカウントした。アシルＣｏＡの量を測定するために、沸騰させたタンパク質の対照抽出物で測定した放射活性を、対応する試験値から差し引いた。
結果は、１について正規化したＬａｃＺの誘導の割合として表した。
【００４９】
ｃ）脂肪酸の酸化
ラット肝細胞（６．１０５細胞／コンパートメント）を、１２穴プレートのウェルに接種し、３７℃で４時間インキュベートした。感染は多重度が１００であり、一晩継続した。次に、培地を回収し、６４ｎＭのオレイン酸［９，１０ ３Ｈ］と２％のＢＳＡとが添加された５００μｌのＤＭＥＭを各ウェルに加えた。３７℃での１２時間のインキュベーションの後、培地をマイクロチューブへ移し、過剰なオレイン酸［３Ｈ］を、５０μｌの１０％のトリクロロ酢酸と５０μｌの２０％のＢＳＡとで沈殿させた。混合物を、１２，４００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清をマイクロチューブに移し、５００μｌの水を加えた。インキュベーションを、５０℃で１８時間継続した。４ｍｌのシンチレーター溶液の添加の後、トリチウム水を測定し、Tri-Carb 2100カウンターでカウントした。
結果は、１について正規化したＬａｃＺの誘導の割合として表した。
【００５０】
ｄ）脂肪酸のエステル化
脂肪酸の酸化は培地中で測定したが、トリグリセリドは、標識された脂肪酸とともにインキュベートした細胞から抽出した。ラット肝細胞をトリプシンで処理し、全く同一のチューブ３本中で混合した。細胞は、１８，５００ｒｐｍで２分間遠心分離した。各ウェルを重炭酸塩ベースの溶液（クレブス−リンゲル重炭酸バッファー：１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１．３ｍＭのＭｇＣｌ２、１２４ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのブドウ糖）で洗浄し、そしてこの緩衝液を、遠心分離残渣を再懸濁するのに用いた。
【００５１】
細胞を二度目の遠心分離に供し、上清を回収した。この行程を繰り返した。次に遠心分離残渣を１００μｌの水中に再懸濁し、さらなる分析のために液体窒素で凍結することができる。その後、遠心分離残渣を、室温（２５℃）に放置した。次に、５００μｌのアセトンを加え、混合物を濃縮器を用いて、真空下で乾燥させた。残渣を、基質として５μｌの５０ｎＭのトリオレインを含む、３００μｌのクロロホルム／メタノール混合物（１／１）で再懸濁した。混合後、全体を遠心分離し、上清を除去した。２回の抽出を行った。遠心分離残渣は、３０μｌのクロロホルム／メタノール混合物（１／１）で再懸濁し、Ｇ６０シリコーンゲルでプレコートされた薄層クロマトグラフィープレート上に堆積させた。移動は、２００ｍｌの緩衝液（Ｈ−ヘキサン／ジエチルエーテル／メタノール／酢酸 ９０／２０／２／３）で、１．５時間行った。
【００５２】
結果：
Ａ）ｈＦＡＴＰ５の細胞および組織分布
ＰＣＲによる研究により、ヒトＦＡＴＰ５の、肝臓、初代肝細胞およびＨｅｐＧ２ヒト細胞系の細胞における排他的な発現が確認された。
これらの結果を図１に示す。
【００５３】
Ｂ）ＦＡＴＰ５の機能的特徴化
ａ）アデノウイルスの構築
肝臓での脂肪酸の代謝におけるＦＡＴＰ５の機能を特徴化するため、ｈＦＡＴＰ５遺伝子を担持するアデノウイルス（ｐＡｄｅｎｏ−ｈＦＡＴＰ５）、対照アデノウイルスｐＡｄｅｎｏ−ＬａｃＺ、およびアデノウイルスｐＡｄｅｎｏ−ＣＤ３６を設計し、最後のものは脂肪酸輸送についての陽性対照としてのものである。
【００５４】
ｂ）脂肪酸の捕獲
オレイン酸の捕獲は、３Ｔ３−Ｌ１細胞（図２Ａ）およびアデノウイルスに感染したウィスターラットから単離したラット肝細胞（ＲＨ）（図２Ｂ）において試験した。
ＦＡＴＰ５の過剰発現は、３Ｔ３−Ｌ１細胞における脂肪酸輸送活性に影響を及ぼさなかったが（図２Ａ）、ラット肝細胞において脂肪酸輸送を有意に増大させた。
この結果は、脂肪酸輸送活性が細胞系によって別様に行われていることを示唆するものである。これは、細胞系に固有の種々のコファクターの効果的な動員による可能性がある。以前の結果は、ＦＡＴＰがＡＣＳまたはＦＡＴなどのパートナーと協働して作用し得ることを示唆している。
ここで提示された結果は、ＦＡＴＰ５が、タンパク質が発現された細胞によって別様に、脂肪酸輸送に作用することを示唆するものである。
さらにまた、前脂肪細胞系におけるＦＡＴＰ５の効果の欠如、およびラット肝細胞における脂肪酸輸送の急速な増大は、ＦＡＴＰ５が、単なるありふれた輸送体であると言うよりは、むしろ、肝細胞における脂肪酸輸送に影響する特有の機能を有することを示唆する。
【００５５】
ｃ）ＡＣＳおよびＶＬＡＣＳ活性に関する試験
ＡＣＳ試験は、パルミチン酸塩およびリグノセリン酸塩を用いて、アデノウイルスに感染した初代ラット肝細胞において行った。ｈＦＡＴＰ５の過剰発現による、リグノセリン酸塩とのインキュベーション後のＶＬＡＣＳ活性の有意な増大は、３０分のインキュベーション期間でのみ検出可能であった（図３Ａ）。ｈＦＡＴＰ５の過剰発現によるＡＣＳ活性の誘導が間接効果である可能性が示唆される。
超長鎖アシルＣｏＡシンテターゼ活性はわずかに増大したが、ＣＤ３６の過剰発現がリグノセリン酸塩のアシル化に影響を及ぼさないことから（図３Ｂ）、これはｈＦＡＴＰ５に特有のことである。
ＦＡＴＰタンパク質のＶＬＡＣＳ活性に関する先に発表された結果は、このようにして確認された。しかしながら、誘導動態には明確な差異がある。結果は、ＦＡＴＰ５が、超長鎖脂肪酸より大きな脂肪酸のクラスを代表するパルミチン酸塩などのＣ１６脂肪酸に対する有意な効果を示すことから、ＦＡＴＰ５がより幅広い範囲の活性を有することを示唆している。
【００５６】
ｄ）脂肪酸のβ酸化に対するｈＦＡＴＰ５発現の効果
ｈＦＡＴＰ５の過剰発現によって脂肪酸の分解の程度が調節されるかどうかを分析するために、トリチウム化オレイン酸の、β酸化の最終産物であるトリチウム水への変換を測定した。
ＣＤ３６対照遺伝子の過剰発現は、ＨｅｐＧ２細胞（図４Ａ）またはラット初代肝細胞（図４Ｂ）におけるβ酸化に影響を及ぼさず、これは、ＣＤ３６が脂肪酸のエステル化を導くが、その分解は導かないとする仮説に対応するものである。
対照的に、ｈＦＡＴＰ５の過剰発現は、ＨｅｐＧ２肝細胞におけるβ酸化の程度を顕著に増大させた（３倍超）（図４Ａ）。
ｈＦＡＴＰ５の過剰発現は、初代肝細胞において脂肪酸の分解を誘導する。
【００５７】
ｅ）ｈＦＡＴＰ５が脂肪酸のエステル化よりはむしろそのβ酸化に関与することの確認
ｈＦＡＴＰ５の発現が脂肪酸の分解のみを導き、そのエステル化度に影響しないことを確認するために、ＨｅｐＧ２細胞における同じ実験の中で、β酸化試験を、エステル化試験により補完した。
ｈＦＡＴＰ５の過剰発現は、エステル化度に影響を及ぼさなかった（図５）。
このことは、肝臓における脂肪酸の分解のみからなる、ｈＦＡＴＰ５の新規な機能的活性を明確に示すものであり、一方、ＦＡＴ／ＣＤ３６は、脂肪酸をエステル化過程に導く。ｈＦＡＴＰ５は、β酸化アクティベーターである。
【００５８】
ｆ）Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットにおける糖尿病発症の最中のｈＦＡＴＰ５の発現の調節
Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットにおける、このモデルでのＮＩＤＤＭの発症の最中のＦＡＴＰ５遺伝子の発現レベルの研究を行い、結果をインスリンおよびブドウ糖レベルにおける変動と相関させた。
Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットは、ヒトの場合と同様の経過で、糖尿病を自然に発症し（図６Ａおよび６Ｂ）、
−６週齢の雄のＺＤＦ（ｆａ／ｆａ）ラットについて観察される、高インスリン血症および正常血糖の状態、
−１０週齢の雄のＺＤＦ（ｆａ／ｆａ）ラットについて観察される、高インスリン血症および高血糖の状態、および、
−２０週齢の雄のＺＤＦラットについて観察される、インスリン欠乏および高血糖の状態、
を有する。
ｈＦＡＴＰ５の発現の定量的および半定量的な分析による研究（表ＩＩＩおよび図７）は、ｈＦＡＴＰ５メッセンジャーＲＮＡのレベルがＺＤＦラットにおいて１０週で低減することを示した。同じ期間にわたって、グリコーゲンレベルはＺＤＦラットの方が、ＺＬＣラットよりも明らかに高かった（表ＩＩＩ）。
【００５９】
【表５】
生化学的分析は、血漿中の遊離脂肪酸のレベルが１０週齢および２０週齢のＺＬＣラットでより高いが、ＺＤＦラットの肝臓中の遊離脂肪酸のレベルはＺＬＣラットと比較して低かったことを明らかにした（図８Ａ）。
この１０週の期間は、ＺＤＦラットおよびＺＬＣラットの体重増加曲線の乖離によって特徴づけられ、これは糖尿病の発症を示す（図８Ｂ）。
【００６０】
ｇ）脂肪酸のアシル化へのＦＡＴＰ５の過剰発現の効果
ＺＤＦおよびＺＬＣラットの初代肝細胞におけるｈＦＡＴＰ５の過剰発現の機能的効果を分析した。
ＦＡＴＰ５の過剰発現は、ＺＤＦラットの初代肝細胞において、早くには５分で、そして遅くには３０分で、脂肪酸のアシル化を極めて有意に増大させた。
これらの結果を図９に示す。
【００６１】
ｈ）糖尿病肥満型ラットの肝臓における脂肪酸分解不足の解消
脂肪酸のベータ酸化は、ＺＤＦラットの肝臓において、ＺＬＣ対照ラットの肝臓において生じるものと比べて不足している。ＦＡＴＰ５の過剰発現は、この不足を解消する。ＦＡＴＰ５の過剰発現は、対照ラットには影響を及ぼさない。これらの結果を図１０に示す。
【００６２】
ｉ）ＦＡＴＰ５の過剰発現は、ＺＤＦラットの血中のブドウ糖および脂質のレベルを低減する
ブドウ糖レベルは、ＦＡＴＰ５を担持しているアデノウイルスに感染したＺＤＦラットにおいて、１０週齢で、ＬａｃＺ対照アデノウイルスに感染したラットと比較して、有意に低減した（図１１Ｃ）。この低下は、遊離脂肪酸レベルの低下（図１１Ａ）、および血漿トリグリセリドレベルの大幅かつ急速な低下（図１１Ｂ）と相関している。
これは、ＦＡＴＰ５の発現が糖代謝に影響を及ぼし、in vivoで高血糖症を軽減することの証明である。
【００６３】
例２：ヒトＦＡＴＰ５遺伝子の推定プロモーター領域の特徴化およびプロモーター活性の証明
ＦＡＴＰ５遺伝子産物（AF064255またはNM_012254）は、脂質合成に関与するタンパク質のファミリーに属する。
ＦＡＴＰ５遺伝子産物は、複合脂質の合成、そして特に脂肪酸の伸長に関与している。ＦＡＴＰ５遺伝子は、第１９染色体に位置している。
ＦＡＴＰ５をコードする配列に関する一般的な情報は、以下の通りである（表ＩＶ）。
【表６】
【００６４】
ａ）予測によるＦＡＴＰ５の転写開始点（ＴＳＳ）の位置、および相補ＤＮＡ末端の迅速増幅技術（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅、ＲＡＣＥ）による同定
ＦＡＴＰ５遺伝子は、第１９染色体に位置し、１４ｋｂにわたって分配された１０個のエクソンで構成されている。ＦＡＴＰ５遺伝子を含むコンティグNT_011104は、２００２年８月に公開された。
ｍＲＮＡおよびＥＳＴからマッピングした５’ＵＴＲ領域は、３４ｂｐのサイズを示す（５’ＵＴＲ１）。したがって、ｍＲＮＡおよびGenBankによって公開されているＥＳＴ、およびＤＢＴＳＳ（ヒト転写開始点データベース）に由来する情報に関連して決定される、最も確からしい「生物学的」転写開始部位は、図１２Ｂで示したとおりに位置している。
ｂ）予測によるＦＡＴＰ５プロモーターの位置
材料および方法
ＨｅｐＧ２細胞のＲＮＡの調製：
ＲＮＡは、Qiagen RNeasy mini kit protocol（Qiagen, Courtaboeuf, France)に従って、１００万個のＨｅｐＧ２細胞から精製した。
５’ＲＡＣＥ：
ＴＳＳは、供給者の推奨に従って、GeneRacerキット、カタログ番号L1500-01、L1500-02、L1502-01、L1502-02バージョンJ05300225-0355を用いて同定した。
結果：
上記のようにして決定した開始点の上流の１０，０００ｂｐの領域をコンティグNT_011104から選択した。分析した領域は、１００２３位のコード領域の上流、すなわちＡＴＧの上流でちょうど終止する。
予測は、推定プロモーター領域同定用のソフトウェアを用いて行った。これらのソフトウェア、Promoter Inspector、First EFなどの各々は、ＰｏｌＩＩ真核生物プロモーターの特徴（ＴＡＴＡシグナル、ＧＣ組成の偏り、階層的組織など）に基づいて構築された数理モデルを用いたものである。異なるアプローチ（二次判別分析、マルコフ連鎖など）を特徴とし、異なる特徴に基づくソフトウェアは、同じ位置に見出された予測を立証することを可能にする。
最も適切な予測の結果を、下表Ｖにまとめた。
【００６５】
【表７】
【００６６】
これらの予測は、ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターを、種々のソフトウェアによって同定された両極端の位置により決定された、７４００〜１０，０００ｂｐの間の領域内に位置づけることを可能にするものである（図１２Ａ）。
プロモーター領域は、別な遺伝子が８５００位に終止し、そして１０，０００位がＡＴＰコドンの位置であることから、塩基８５００と１０，０００との間であるはずである。実際、８５００ｂｐの位置から上流の領域は、機能が知られていないNM_032792遺伝子に対応し、そして１０，０００ｂｐの位置から下流の領域は、ＦＡＴＰ５遺伝子に対応する。この情報は、７４００〜９１００ｂｐの間の領域内にプロモーターを位置づけた、生物情報ソフトウェアでなされたプロモーターの予測に匹敵するはずである。
【００６７】
ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のエクソン１の上流に位置するこの領域は、この遺伝子の調節にとって重要な推定プロモーターまたは調節エレメントを含むと推測される。Transfac（転写因子データベース）のテンプレートで分析され、中程度に保存されていることが示された領域は、境界７４００〜１０，０２３の間に広がる。ＥＳＴおよび全長型のｍＲＮＡの生物学的データは、転写開始点（ＴＳＳ）を９９９０位に位置付けることを可能にした。
したがって、図１３に記載された配列は、ヒトＦＡＴＰ５遺伝子の推定プロモーターに対応する。この配列は、添付された配列表中、配列番号１の番号で特定される。
９９９０位以外のＴＳＳは、９９２８位において確認することができた。しかしながら、細胞種によって、別のＴＳＳを代替物として用いることができる。
【００６８】
ｃ）ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモータ配列の、国際出願WO 0121795の先行技術との比較分析
本発明の対象となるヒトＦＡＴＰ５遺伝子の推定プロモーター配列と、種々のアクセス可能な配列バンク、例えば「Htgs」（終止していない（non-terminated）配列）、「Chromosome」（完全なゲノム、染色体および終止している（terminated）コンティグ）、および最後にnr（全ての公表された配列）などに含まれる配列との類似性について、一連の検索を行った。
ヒトＦＡＴＰ５遺伝子（コンティグNT_011104）のゲノム環境と、国際出願WO 01/21785に公開されているプロモーター領域との間の類似性の検索は、配列類似性がないことを示した。
GenBankの「Chromosome」部門に対する類似性検索は、このデータベースで参照されているヒトまたは他の種（酵母、ショウジョウバエなど）との有意な類似性を見出すことができなかった。
【００６９】
Htgsデータベースに含まれる配列中での類似性検索は、国際出願WO 01/21785のプロモータ配列に対応し得るヒトコンティグを特徴づけることができなかった。
国際出願WO 01/21785のプロモータ配列がヒトＦＡＴＰ５遺伝子のゲノム環境との類似性を示さないことを確認するために、これらの２つの配列をアラインメントした。有意な類似性は見出されなかった。
国際出願WO 01/21785に公開されているＦＡＴＰ５遺伝子のプロモータ配列の分析は、この配列が、本発明の対象となるヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターには対応しないが、マウスＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターに対応することを示した。
結論として、種々の検索により、本発明の対象となるヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターの配列は、いかなる既知の配列とも有意な類似性を有しないと結論付けることができる。
【００７０】
ｄ）本発明の対象となるヌクレオチド配列のプロモーター活性の確認
材料および方法
ＦＡＴＰ５の推定プロモータ配列の増幅：
テンプレート：ヒト胎盤のゲノムＤＮＡ（Sigma, St. Louis, MO）、
センスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号３：ＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＣＡＧＴＧＣＧＴＧＣＣ、
アンチセンスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号４：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＡＧＧ、
ＴａｑプラチナＰｆｘ＋バッファー１０×＋ＭｇＳＯ４（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）、
ｄＮＴＰ（Promega, Williamsburg, IA）。
ｈＦＡＴＰ５プロモーターに対応するインサートの精製：インサートのサイズ＝１５７３塩基。
増幅プログラム：
９４℃で５分間のインキュベーションサイクルを１回、
その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で２分間のインキュベーションサイクルを２５回。
【００７１】
得られた物質は、QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen, Courtaboeuf, France）で精製し、４℃に保った。
ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターを、ルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターｐＧＬ３にクローニングするための制限：
【表８】
２時間、３７℃でのインキュベーション。
Quick ligation kit（NEB, Beverly, MA）、cat#M2200Sの標準的プロトコルによるライゲーション。
３０秒間、４２℃の熱衝撃の標準的プロトコルによる形質転換。
細菌：ＤＨ５アルファ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）のディッシュへのプレーティング。
３７℃での一晩のインキュベーション。
スクリーニング：
各クローンを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天上に継代し、２０μｌの水中で再懸濁した。
懸濁液を、９５℃で１０分間加熱した。
【００７２】
ｐＧＬ３クローン／ｈＦＡＴＰ５プロモーターの選択のためのＰＣＲ条件
テンプレート：細菌溶解物
センスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号５：ＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ、
アンチセンスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号６：ＴＡＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣ、
Goldstar＋バッファー１０×＋ＭｇＣｌ２（Eurogentec, Seraing, Belgium）、５０μｇ／ｍｌ。
増幅プログラム：
９４℃で５分間のインキュベーションサイクルを１回、
その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間のインキュベーションサイクルを２５回、
その後、７２℃で７分間のサイクルを１回。
得られた物質は、４℃に保った。
プラスミドの作製は、EndoFree Plasmid maxi kit（Qiagen, Courtaboeuf, France, cat#12362）の標準的プロトコルに従った。
配列決定は、BigDye terminator V2.0 cycle sequencing kit（Applied Biosystems, Foster City, CA, cat#4314415)の標準的プロトコルに従った。
【００７３】
結果：
ヒトＦＡＴＰ５プロモーターの１５７３塩基の断片をｐＧＬ３にクローニングし、配列決定した。断片の連続した欠失による構築物は、ＦＡＴＰ５の肝での発現に特異的なプロモーター領域を同定することを可能にする。
ＨＥＰ２、ＨＥＬＡおよびＨＥＫ２９３肝細胞の一過性トランスフェクション：
スクリーニングのための最小可能なプロモーター断片を特定するために、一過性にトランスフェクトした細胞を用いた。トランスフェクションは、jetPEIプロトコル（Polytransfection, Illkirch, France）により、供給者の推奨に従って行った。
第３日：照度計による測定：
トランスフェクション混合物を含む培地を除去した。
プレートを、２５０μｌのＰＢＳで２回洗浄し、そして、１／５に希釈した１００μｌの溶解バッファーを加えた。プレートを、振盪させながら室温で３０分間インキュベートした。
各ウェルからの１０μｌの溶解液を、Greiner ９６穴白色プレート（Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany）に分配した。
【００７４】
ルシフェラーゼ活性は、Dual Luciferase kit（Promega, Madison, WI, USA）を用いて測定した。測定値は、TR717マイクロプレートルミノメーター（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）で取得した。
ルシフェラーゼ発光の結果はレニラに対して正規化し、プロモーターを含む構築物の、空ベクターｐＧＬ３と比較した誘導として表した。
結果：
ＦＡＴＰ５プロモーターの断片全体のプロモーター活性が確認された。図１４に示したこれらの結果は、本核酸配列が実際にＦＡＴＰ５プロモーターであり、かつそれが機能的であることを確認するものである。ルシフェラーゼ活性の最も高い値は、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞で観察された。
【００７５】
例３：安定してヒトＦＡＴＰ５プロモーターを発現している細胞でのスクリーニング試験
ａ）ヒトＦＡＴＰ５遺伝子の推定プロモーターの、ハイグロマイシン耐性を有するベクターｐＧＬ３ハイグロマイシンへのクローニング
ベクターｐＧＬ３ハイグロマイシンの作製：
Ｔｋプロモーターの制御下にあるハイグロマイシンをコードする遺伝子（サイズ：１６７１塩基）を、ベクターｐＲＥＰ４（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）から、以下のプライマーを用いて増幅した。
材料と方法：
センスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号７：ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣ、
オリゴアンチセンス（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号８：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＣＣＡＣＧＣＡＡＣＧＣ、
Goldstar＋バッファー１０×＋ＭｇＣｌ２（Eurogentec, Seraing, Belgium）。
増幅プログラムおよび得られた物質の精製は、ｈＦＡＴＰ５プロモーターに対応するインサートの増幅および精製のために先に用いたのと同じプロトコルに従って行った。
得られた断片は、ベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Promega, Williamsburg, IA）のＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。クローニングのための制限、ライゲーションおよび形質転換は、ｈＦＡＴＰ５プロモーターに対応するインサートの増幅および精製のために先に用いたのと同一のプロトコルに従って行った。
Ｔｋハイグロマイシン断片を有するプラスミドｐＧＬ３が組み込まれたクローンは、ｐＧＬ３クローン／ｈＦＡＴＰ５プロモーターの選択に用いたのと同じプロトコルによるＰＣＲにより、テンプレートとして細菌溶解物を、および：
センスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号９：ＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣ、
アンチセンスオリゴ（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）：配列番号１０：ＡＣＣＡＧＡＣＣＣＣＡＣＧＣＡＡＣＧＣ、
Goldstar＋バッファー１０×＋ＭｇＣｌ２（Eurogentec, Seraing, Belgium）、
を用いて選択した。
ｈＦＡＴＰ５プロモーターを含むｐＧＬ３ハイグロマイシンクローンの選択、プラスミドの作製および配列決定は、ｐＧＬ３クローン／ｈＦＡＴＰ５プロモーターの選択のために用いたのと同じプロトコルに従って行った。
【００７６】
ｂ）ＨｅｐＧ２肝細胞の安定したトランスフェクション
用いた培地を下表に記載する。
【表９】
【００７７】
ｃ）細胞のプレーティング
ＨｅｐＧ２細胞の培養物を調製した。細胞は、８０％コンフルエントに達したときに剥離し、６穴プレート中の培地に、１ウェルあたり３２０，０００細胞の割合で再接種した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間インキュベートした。
【００７８】
ｄ）トランスフェクションおよび活性化
トランスフェクションは、ａ）で調製した５００ｎｇのプラスミドを用いて、jetPEIプロトコル（Polytransfection, Illkirch, France）により、供給者の推奨に従って行った。
６穴プレートで培養した細胞の培地を吸引した。１ｍｌの無血清ＤＭＥＭと８０μｌのトランスフェクション混合物とを各ウェルに入れた。次に、細胞を、５％のＣＯ２を含む雰囲気下、３７℃で２時間放置した。この２時間が経過したときに、ＦＣＳを含まない培地１ｍｌと、２％の終濃度のUltroser SF（USF, BioSepra, Cergy Pontoise, France）とを加えた。
【００７９】
ｅ）トランスフェクション細胞の選択
４８時間の培養後に、各ウェルの培地を吸引した。１０％のＦＣＳと終濃度０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンとを含む２ｍｌの培養培地を加えた。細胞は、８０％コンフルエントに達したときに剥離した。
次に、２個のウェルからの細胞を混合し、１５０ｍｍのペトリ皿中の同じ選択培地に接種した。選択培養は、細胞クローンが現れるまで維持した。
【００８０】
ｆ）クローンの単離
クローンが明確に区別されるようになったら、これらを、シリンダーを用いて残りの培養物から単離した。次に、シリンダーに含まれた細胞をＰＢＳで洗浄し、培地の吸引後に取り出した。
細胞を９６穴プレートに配置し、そして１０％のＦＣＳと終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンとを含む２５０μｌのＤＭＥＭを加えた。培養は、８０％コンフルエントになるまで継続した。
【００８１】
ｇ）安定してヒトＦＡＴＰ５プロモーターを発現するＨｅｐＧ２細胞のスクリーニング
ストックを用意するために、クローンを増幅した。
各クローンに由来する細胞は、２４穴プレートにて、１０％のＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン混合物（０．１２５％）および０．２５ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＤＭＥＭ中、８０％コンフルエントまで培養した。
被験化合物による処置は、２４時間の期間適用した。この２４時間が経過したときに、ルシフェラーゼ活性を、細胞溶解物において、Applied Biosystems TR717発光リーダー（California, CA）を用いて測定した。
ルシフェラーゼ活性を示している細胞は、この活性が、これらの細胞が受け取ったプラスミドに含まれる推定プロモーターによって誘導されたことを示す。
この結果は、本発明の核酸が、実際に、その依存下に置かれた遺伝子の発現を導くことができるプロモーターであることを示すものである。
【００８２】
例４：糖尿病表現型の解消およびインスリン増感剤によるＺＤＦラットにおけるＦＡＴＰ５遺伝子の発現の調節
レキシノイド（rexinoid）と呼ばれるＲＸＲ核受容器のアゴニストは、インスリン増感剤であり、糖尿病肥満型動物モデル（２型糖尿病）において有益な効果を有する。ベキサロテンであるタルグレチン（登録商標）（CAS 1543559-49-0）は、核受容体ヘテロダイマー、ＲＸＲ−ＰＰＡＲ（ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体）またはＲＸＲ−ＬＸＲ（肝臓Ｘ受容体）を選択的に活性化する。
雄の糖尿病肥満型ラット（Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラット（ＺＤＦラット））は、食物と水に自由にアクセスできる動物ケージ内に維持し、夜昼リズム（nyctohemeral rhythm）が観察された。
【００８３】
化合物LGD 1069を、０．３、１．０、３．０、１０または３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で食餌に加え、７週齢より５０日間投与した。４頭の動物は、LGD 1069の添加なしで給餌した：ＺＤＦ２頭とＺＬＣ２頭。動物を絶食させ、その翌日に安楽死させた。組織を回収し、液体窒素中で直ちに凍結した。
肝ＲＮＡは、ChomczynskiおよびSacchiに由来する従来の技法で抽出した。発現は、ＦＡＴＰ５に特異的な放射性ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションによるノーザンブロッティングによって分析した。
結果を図１５に示す。
ＺＤＦラットの肝臓におけるＦＡＴＰ５の発現の、ＺＬＣラットに比した負の調節は、ＲＸＲアゴニストによる処置によって打ち消され、これは糖尿病の進行を逆転させた。
【００８４】
例５：真核細胞（ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣細胞）におけるＦＡＴＰ５受容体を介した脂肪酸の能動輸送を測定するための試験
蛍光標識された脂肪酸模倣分子の使用は、ＦＡＴＰ受容体を過剰発現した細胞における脂肪酸の細胞内蓄積の、マイクロタイタープレート形式での迅速な測定を提供する。
試験の説明
【表１０】
必要な専門器材
−ＣＯ２インキュベーター、
−顕微鏡、
−マルチドロップ、
−マイクロプレートウォッシャー、
−フルオレセイン用フィルターを有するマイクロプレート用蛍光計。
【００８５】
プロトコル
第１日
９６穴マイクロプレートへの細胞の分配
ＦＡＴＰ受容体を過剰発現するＣＨＯ真核細胞を、９６穴培養プレートに、１ウェルあたり約１０，０００細胞の密度で、以下の手順に従って分配する。
−層流フード下で、４ｍｌの細胞剥離溶液を２２５ｃｍ３の培養フラスコに３７℃で加える。
−溶液を、細胞単層上、手動による軌道回転運動で１０〜１５秒間振盪し、その後、１０ｍｌの血清用ピペットで吸引する。
−４ｍｌの細胞剥離溶液を加え、フラスコを（最長で）１０分間インキュベーター中に戻す。１０分後に、細胞の剥離を顕微鏡下でチェックする。細胞がすべて剥離するまで操作を続ける。
−８ｍｌの培地をフラスコに加え、細胞塊をほぐすために、内容物を何度か上から下へ混合する。この細胞混合物を、３７℃に予熱した８８ｍｌの培地に加える。
【００８６】
マルチドロップの準備
−マルチドロップを層流フードに配置する。マルチドロップのヘッドおよびチューブを、２０〜３０ｍｌの７０％エタノール、次いで２０〜３０ｍｌの無菌水、そして最後に２０〜３０ｍｌの培地をポンプ吸引することにより洗浄する。
−マルチドロップのチューブを細胞を含むフラスコに配置し、およそ５〜１０ｍｌの培地を除去する。１ウェルあたり１００μｌの細胞を加える（１０，０００細胞）。
−マイクロプレートを、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間、インキュベーター内に置く。
【００８７】
第２日：被験分子の添加
被験分子を、以下のプレートレイアウトに従って添加する：
【表１１】
−マルチドロップを用いて、９５μｌのＤＭＥＭ（フェノールレッド不含）を、９６穴マイクロプレートの各ウェルに分配する。
−被験分子を、Ｔと表示されたウェルに終濃度５ｍｇ／ｍｌ（１％のＤＭＳＯ）で同時に分配する。
−２００ｍＭのラウリン酸を、陰性対照ウェル（ＮＣ）に分配する。
−５μｌのＰＢＳを、陽性対照ウェル（ＰＣ）に分配する。
【００８８】
第３日
−細胞を、ＰＢＳで２回洗浄する。
−細胞を、ＰＢＳ中に０．１ｍＭのBODIPY-FAと、脂肪酸を含まない０．１％のＢＳＡとを含む脂肪酸模倣溶液中、２分間、３７℃でインキュベートする。
−２分後に、細胞を事前に氷中に配置しておいたＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ混合物で４回洗浄する。
−プレートを、蛍光マイクロプレートリーダーにて、励起波長として４８５ｎｍを、放出波長として５３０ｎｍを用いて読み込む。
結果を、プローブなし（ＰＣ）の対照細胞のパーセンテージとして、任意の蛍光単位で表す。
この試験は、真核細胞内へのＦＡＴＰ５受容体を介した脂肪酸の能動輸送を測定することを可能にする。これはまた、ＦＡＴＰ５受容体を介した脂肪酸の能動輸送に対する所定の分子の影響を測定することを可能にし、それによってヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモーターの活性を刺激または阻害するその能力を決定することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ＰＣＲによって分析された、ヒトＦＡＴＰ５遺伝子の発現の細胞および組織分布を示した図である。ＮＣＩ−Ｈ２９５：副腎細胞系、ＴＨＰ−１：単球、ＴＨＰ１Ｄ：ＴＨＰ−１単球の分化したマクロファージ、ＪｕｒｋａｔおよびＪｕｒｋａｔ ＪＲ：Ｔ細胞、ＣＥＭ：急性リンパ芽球性白血病細胞系の細胞、ＨＨ：ヒト初代肝細胞、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７：ヒト肝細胞、ＣａＣｏ２：結腸細胞、ＣａＣｏ２Ｄ：分化したＣａＣｏ２細胞、ＣＡＳＭＣ：冠状動脈平滑筋細胞、ＡＳＭＣ：大動脈平滑筋細胞。
【図２Ａ】３Ｔ３−Ｌ１細胞での脂肪酸捕獲試験で得られた結果を示した図である。結果は、各条件についての、時間の関数としての脂肪酸捕獲の誘導を表す。対照条件は、発現が細胞による脂肪酸捕獲に影響を及ぼさない遺伝子を担持するアデノウイルスに感染した細胞による捕獲の測定値を表す。
【図２Ｂ】ラット肝細胞（ＲＨ）での脂肪酸捕獲試験で得られた結果を示した図である（時間：１分）。結果は、各条件についての、時間の関数としての脂肪酸捕獲の誘導を表す。対照条件は、発現が細胞による脂肪酸捕獲に影響を及ぼさない遺伝子を担持するアデノウイルスに感染した細胞による捕獲の測定値を表す。
【図３Ａ】ｈＦＡＴＰ５遺伝子を担持するアデノウイルスへの感染後における、ＡＣＳ活性を決定するための試験において得られた結果を示した図である。結果は、誘導係数として表す。
【図３Ｂ】ｈＦＡＴＰ５遺伝子を担持するアデノウイルスへの感染後における、ＶＬＡＣＳ活性を決定するための試験において得られた結果を示した図である。結果は、誘導係数として表す。
【００９０】
【図４Ａ】ｈＦＡＴＰ５の発現の、脂肪酸のβ酸化への影響を決定するための試験において得られた結果を示した図である。４Ａ：４８時間におけるＨｅｐＧ２、４Ｂ：１２時間におけるＲＨ。結果は、誘導係数として表す。
【図４Ｂ】ｈＦＡＴＰ５の発現の、脂肪酸のβ酸化への影響を決定するための試験において得られた結果を示した図である。４Ａ：４８時間におけるＨｅｐＧ２、４Ｂ：１２時間におけるＲＨ。結果は、誘導係数として表す。
【図５】ｈＦＡＴＰ５の発現の、４８時間におけるＨｅｐＧ２細胞での脂肪酸のエステル化度への影響を決定するための試験において得られた結果を示した図である。結果は、３Ｈ２Ｏ／３ＴＧ比として表す。
【図６Ａ】ｈＦＡＴＰ５の発現の、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットでの糖尿病の発症の最中におけるｈＦＡＴＰ５の発現の調節への影響を決定するための試験において得られた結果を示した図である。Ａ：ブドウ糖レベルの測定値、Ｂ：インスリンレベルの測定値、−■−：雄のＺＤＦラット（ｆａ／ｆａ）、−□−：雄のＺＬＣラット（ｆａ／＋）。
【図６Ｂ】ｈＦＡＴＰ５の発現の、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラットでの糖尿病の発症の最中におけるｈＦＡＴＰ５の発現の調節への影響を決定するための試験において得られた結果を示した図である。Ａ：ブドウ糖レベルの測定値、Ｂ：インスリンレベルの測定値、−■−：雄のＺＤＦラット（ｆａ／ｆａ）、−□−：雄のＺＬＣラット（ｆａ／＋）。
【図７】Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満型ラット（ＺＤＦ：−●−）およびＺＬＣラット（−○−）におけるｈＦＡＴＰ５メッセンジャーＲＮＡのレベルを測定するための試験において得られた結果を示した図である。
【図８Ａ】生化学分析の結果を示した図である。Ａ：肝臓における遊離脂肪酸レベルの測定値（−θ−：ＺＤＦラット（ｆａ／ｆａ）、−○−：ＺＬＣラット（ｆａ／＋））、Ｂ：体重増加曲線（−●−：ＺＤＦラット（ｆａ／ｆａ）、−□−：ＺＬＣラット（ｆａ／＋））。
【図８Ｂ】生化学分析の結果を示した図である。Ａ：肝臓における遊離脂肪酸レベルの測定値（−θ−：ＺＤＦラット（ｆａ／ｆａ）、−○−：ＺＬＣラット（ｆａ／＋））、Ｂ：体重増加曲線（−●−：ＺＤＦラット（ｆａ／ｆａ）、−□−：ＺＬＣラット（ｆａ／＋））。
【００９１】
【図９】８週齢のＺＤＦおよびＺＬＣラットにおける、各条件につき５および３０分でのオレイン酸のアシル化の程度を示した図である。Ａ：ＺＤＦラット、Ｂ：ＺＬＣラット。
【図１０】ＺＤＦラットの初代肝細胞における、ＺＬＣ対照ラットと比較したβ酸化の程度の抑制の解消を示した図である。Ａ：８週齢のラット、Ｂ：１０週齢のラット。（Ｃ＝対照、Ｚ＝ＬａｃＺ、ｈ５＝ｈＦＡＴＰ５）。
【図１１】ＬａｃＺ対照アデノウイルスに感染したラットと比較した、ＦＡＴＰ５を担時するアデノウイルスに感染したＺＤＦラットにおける生化学パラメータの測定値を示した図である（遊離脂肪酸（Ａ）、トリグリセリド（Ｂ）およびブドウ糖（Ｃ））。
【図１２】ＦＡＴＰ５遺伝子の転写開始点（ＴＳＳ）の位置を示した図である。Ａ：バイオインフォマティクスによる予測的な方法論、Ｂ：ＲＡＣＥによる実験的な方法論。
【図１３】ヒトＦＡＴＰ５遺伝子の推定プロモーターの配列を示した図である。この配列は、添付された配列表において配列番号１の番号で特定される。
【図１４】ヒトＦＡＴＰ５遺伝子のプロモータ配列の、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａおよびＨｅｋ２９３細胞における活性を示した図である。結果は、空プラスミドｐＧＬ３で形質転換した細胞で測定した対照と比較した誘導として表示してある。
【図１５】ＺＤＦラット（Ａ）またはＺＬＣラット（Ｂ）をインスリン増感剤として知られる化合物で処置した後の、ＦＡＴＰ５メッセンジャーＲＮＡのレベルの変動を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列を少なくとも含むことを特徴とする、単離されたヒト核酸配列。
【請求項２】
添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列からなることを特徴とする、単離されたヒト核酸配列。
【請求項３】
ヒトＦＡＴＰ５タンパク質をコードすることを特徴とする、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項４】
添付された配列表において配列番号２の番号で特定されるヌクレオチド配列と対応することを特徴とする、請求項３に記載の核酸配列。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸配列の依存下に置かれた検出可能なタンパク質をコードする核酸配列をも含むことを特徴とする、請求項５または６に記載のベクター。
【請求項８】
検出可能なタンパク質が、ＦＡＴＰ５、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、レニラおよびルシフェラーゼから選択されるタンパク質であることを特徴とする、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
プラスミドであることを特徴とする、請求項５〜８のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列または請求項５〜９のいずれかに記載のベクターが導入された宿主細胞。
【請求項１１】
原核生物または真核生物細胞であることを特徴とする、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
細菌であることを特徴とする、請求項１１に記載の原核細胞。
【請求項１３】
タンパク質を製造する方法であって、請求項１０〜１２のいずれかに記載の宿主細胞を、前記細胞に導入されたヌクレオチド配列のタンパク質の形態での発現を可能にする条件下で培養することを特徴とする、前記方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列、請求項５〜９のいずれかに記載のベクターまたは請求項１０〜１２のいずれかに記載の宿主細胞の、請求項１に記載の核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質の同定のための使用。
【請求項１５】
請求項１に記載の核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質の同定方法であって、
ａ）請求項２〜４のいずれかに記載の核酸配列、請求項５〜９のいずれかに記載のベクターまたは請求項１０〜１２のいずれかに記載の宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現に適した媒体中で、請求項１に記載の核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質と接触させること、および、
ｂ）請求項１に記載の核酸配列の依存下に置かれた前記ヌクレオチド配列の発現のレベルを、任意の適切な手段により測定すること、
を特徴とする前記方法。
【請求項１６】
ｂ）で決定された発現レベルと、同定される物質に接触させなかった対照における、請求項１に記載の核酸配列の依存下に置かれた前記ヌクレオチド配列の発現のレベルとの比較のための追加の工程を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の核酸配列と相互作用することが可能な物質の同定方法であって、
ａ）請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列、請求項５〜９のいずれかに記載のベクターまたは請求項１０〜１２のいずれかに記載の宿主細胞を、請求項１に記載の核酸配列と相互作用することが可能な物質に接触させること、および、
ｂ）請求項１に記載の核酸配列と被験物質との間の相互作用を評価すること、
を特徴とする前記方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の核酸配列に結合することが可能な物質を同定することを目的とする、請求項１７に記載の同定方法。
【請求項１】
添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列を少なくとも含むことを特徴とする、単離されたヒト核酸配列。
【請求項２】
添付された配列表において配列番号１の番号で特定されるヌクレオチド配列からなることを特徴とする、単離されたヒト核酸配列。
【請求項３】
ヒトＦＡＴＰ５タンパク質をコードすることを特徴とする、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項４】
添付された配列表において配列番号２の番号で特定されるヌクレオチド配列と対応することを特徴とする、請求項３に記載の核酸配列。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸配列の依存下に置かれた検出可能なタンパク質をコードする核酸配列をも含むことを特徴とする、請求項５または６に記載のベクター。
【請求項８】
検出可能なタンパク質が、ＦＡＴＰ５、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、レニラおよびルシフェラーゼから選択されるタンパク質であることを特徴とする、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
プラスミドであることを特徴とする、請求項５〜８のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列または請求項５〜９のいずれかに記載のベクターが導入された宿主細胞。
【請求項１１】
原核生物または真核生物細胞であることを特徴とする、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
細菌であることを特徴とする、請求項１１に記載の原核細胞。
【請求項１３】
タンパク質を製造する方法であって、請求項１０〜１２のいずれかに記載の宿主細胞を、前記細胞に導入されたヌクレオチド配列のタンパク質の形態での発現を可能にする条件下で培養することを特徴とする、前記方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列、請求項５〜９のいずれかに記載のベクターまたは請求項１０〜１２のいずれかに記載の宿主細胞の、請求項１に記載の核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質の同定のための使用。
【請求項１５】
請求項１に記載の核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質の同定方法であって、
ａ）請求項２〜４のいずれかに記載の核酸配列、請求項５〜９のいずれかに記載のベクターまたは請求項１０〜１２のいずれかに記載の宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現に適した媒体中で、請求項１に記載の核酸配列の依存下に置かれたヌクレオチド配列の発現を調節することが可能な物質と接触させること、および、
ｂ）請求項１に記載の核酸配列の依存下に置かれた前記ヌクレオチド配列の発現のレベルを、任意の適切な手段により測定すること、
を特徴とする前記方法。
【請求項１６】
ｂ）で決定された発現レベルと、同定される物質に接触させなかった対照における、請求項１に記載の核酸配列の依存下に置かれた前記ヌクレオチド配列の発現のレベルとの比較のための追加の工程を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の核酸配列と相互作用することが可能な物質の同定方法であって、
ａ）請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列、請求項５〜９のいずれかに記載のベクターまたは請求項１０〜１２のいずれかに記載の宿主細胞を、請求項１に記載の核酸配列と相互作用することが可能な物質に接触させること、および、
ｂ）請求項１に記載の核酸配列と被験物質との間の相互作用を評価すること、
を特徴とする前記方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の核酸配列に結合することが可能な物質を同定することを目的とする、請求項１７に記載の同定方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００７−５３３２９３（Ｐ２００７−５３３２９３Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２４２６１（Ｐ２００６−５２４２６１）
【出願日】平成１６年８月４日（２００４．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００８７４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１５９０
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月４日（２００４．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００８７４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１５９０
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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