ヒトＩＬ−１８を含むコンジュゲートおよびその置換変異体
【課題】水溶性ポリマーと結合したヒトインターロイキン−１８ポリペプチドの提供。
【解決手段】ヒトインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）ポリペプチドおよびその置換変異体を水溶性ポリマーとヒトＩＬ−１８タンパク質上の特定の部位で結合させた、ヒトＩＬ−１８置換変異体。これらの結合したヒトＩ１８およびその置換突然変異体は生物学的活性を保持する。これらの結合したサイトカインは、対応する未結合サイトカインと比較した場合に、向上した予想外の生物学的特性を示す。
【解決手段】ヒトインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）ポリペプチドおよびその置換変異体を水溶性ポリマーとヒトＩＬ−１８タンパク質上の特定の部位で結合させた、ヒトＩＬ−１８置換変異体。これらの結合したヒトＩ１８およびその置換突然変異体は生物学的活性を保持する。これらの結合したサイトカインは、対応する未結合サイトカインと比較した場合に、向上した予想外の生物学的特性を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、先の仮米国特許出願番号６０／４６２９４７（２００３年４月１５日提出）（その内容は全体として本発明の一部として参照される）の利点を請求する。
【０００２】
本発明は、部位特異性タンパク質結合の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、水溶性ポリマーのヒトインターロイキン−１８（本明細書においては「ＩＬ−１８」）ポリペプチドの結合、その置換突然変異体、およびそのフラグメントに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
生物学的に活性な化合物の水溶性ポリマーに対する共有結合は、これらの化合物の生体内分布、薬物動力学、そしてしばしば毒性を変更し、制御するための一方法である（非特許文献１）。例えばポリ（シアル酸）、デキストラン、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＰＨＰＭＡ）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（エチレングリコール−コープロピレングリコール）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン（ＰＡｃＭ）、およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などの多くの水溶性ポリマーがこれらの効果を達成するために用いられてきた（非特許文献２）。ＰＥＧは：非常に低い毒性（非特許文献３）、水性溶液中の優れた溶解性（非特許文献２、前出）、低い免疫原性および抗原性（非特許文献４）の理想的な組み合わせを有する。１つまたは複数のポリエチレングリコール鎖をタンパク質上に含有するＰＥＧ結合または「ＰＥＧ化」タンパク質治療薬が科学文献に記載されている（非特許文献５；非特許文献６）。非特許文献７；非特許文献８に記載されており、非特許文献９にも記載されている。
【０００４】
結合タンパク質は、その未修飾カウンターパートよりも多くの利点を有する。例えば、ＰＥＧ−修飾は、多くのタンパク質の血漿半減期を延長する（非特許文献１０）。この増大の基本は、いくつかの要因を含む。ＰＥＧ修飾結合体のサイズが増大すると、７０ｋＤ閾値を越える場合、糸球体濾過が減少する（非特許文献１１）。炭水化物レセプターおよびタンパク質レセプター相互作用により網膜内皮系によるクリアランスが減少する（非特許文献１２）。減少したタンパク質分解（非特許文献１３）も半減期の向上に寄与する。抗原性および免疫原性も減少し（非特許文献１４）、これは繰り返し投薬した後の生命を脅かす反応を軽減する。これらのファクター全ての組み合わせは、インビボでの増大した生体利用性につながり（非特許文献１５；非特許文献１６）、これはＰＥＧ−サイトカイン付加物の薬剤としての使用において潜在的に非常に重要である。用量を減少させることができ（毒性を軽減するために）、さらに好都合な投与計画を開発することができる。
【０００５】
ＩＬ−１８は、ＩＬ−１β−三葉型サブファミリーのＩＬ−１αに最も密接に関連する一次構造を有する１８Ｋｄの非グリコシル化モノマーである。ネズミおよびヒトＩＬ−１８ ｃＤＮＡはそれぞれ１９２および１９３アミノ酸からなる前駆体タンパク質をエンコードする。ヒトおよびネズミＩＬ−１８間の相同性は６５％である。生物学的活性を仲介するために、Ｐｒｏ−ＩＬ−１８はカスパーゼ、例えばＩＣＥ（カスパーゼ−１）またはカスパーゼ−４により処理して生物活性な成熟タンパク質（１５７アミノ酸）にすることを必要とする。ＩＬ−１８の活性は、ＩＬ−１８レセプター（ＩＬ−１８Ｒ）複合体（結合鎖（ＩＬ−１８Ｒα）およびシグナリング鎖（ＩＬ−１８Ｒβ）から構成される）により仲介される。その腫瘍免疫療法についての治療可能性を支持するＩＬ−１８の生物学的活性は、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦの誘発および産生、ＮＫ細胞の細胞溶解活性の向上および促進、およびナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化を包含する。ＩＬ−１８に反応して、潜在的な抗腫瘍活性を示す細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）およびメモリー細胞が産生される。他の調節機能は、ＮＫおよびＴ細胞上の機能的Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）発現の増加調節（ＩＬ−１８抗腫瘍活性が腫瘍アポトーシスを包含するＦａｓ−ＦａｓＬ相互作用により一部媒介されることを示唆する）；単球／マクロファージ、Ｂ細胞、および抗血管形成の活性化を包含する。
【０００６】
ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は、最近ＩＬ−１８の拮抗物質として記載されている天然に存在する可溶性循環タンパク質である。ＩＬ−１８ＢＰは、ＩＩ型ＩＬ−１レセプターの第三のＩｇドメインに対して非常に限定された相同性しか有さない１つの推定Ｉｇドメインを含有する点で、いずれかのＩＬ−１８レセプターに対して顕著な相同性を有さない。ＩＬ−１８ＢＰに対するさらに高い相同性がいくつかのポックスウイルス（豚痘、牛痘、天然痘、伝染性軟属腫、および欠肢症）によりエンコードされるタンパク質のファミリーにおいて見いだすことができる。ポックスウイルスは、多くのサイトカインのデコイレセプターをエンコードし、これらのレセプターは免疫応答のウイルスによる回避において役に立つ。ＩＬ−１８はＴｈ１細胞によるＩＦＮγ産生につながる初期シグナルの１つであるので、ＩＬ−１８ＢＰによるＩＬ−１８活性のブロックは、免疫応答の初期の１つの減少調節に関与する。ＩＬ−１８ＢＰの高いレベルは、組み換えＩＬ−１８療法の有効性に関して有害であり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｕｎｃａｎ、Ｒ．およびＫｏｐｅｃｅｋ、Ｊ．（１９８４）Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．５７：５３−１０１
【非特許文献２】Ｐｏｗｅｌｌ、Ｇ．Ｍ．（１９８０）Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ．Ｉｎ Ｒ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ（編）ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＷＡＴＥＲ ＳＯＬＵＢＬＥ ＧＵＭＳ ＡＮＤ ＲＥＳＩＮＳ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第１８章
【非特許文献３】Ｐａｎｇ、Ｓ．Ｎ．Ｊ．（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１２：４２９−４５６
【非特許文献４】Ｄｒｅｂｏｒｇ、Ｓ．およびＡｋｅｒｂｌｏｍ、Ｅ．Ｂ．（１９９０）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．６：３１５−３６５
【非特許文献５】Ｃｌａｒｋ、Ｒ．ら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１９６９−２１９７７
【非特許文献６】Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ、Ｍ．Ｓ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＰＥＧ−ＡＤＡ）
【非特許文献７】Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ． Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ.Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、ｐ１４５−１５４
【非特許文献８】Ｏｌｓｏｎ、Ｋ．ら（１９９７）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｙｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ
【非特許文献９】Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、ｐ１７０−１８１
【非特許文献１０】Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｇ．Ｅ．、ｅｔら（１９９２）ＰＥＧ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎ：ＳＴＡＢＩＬＩＴＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ：ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＡＴＨＷＡＹＳ ＯＦ ＤＥＧＲＡＤＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ ＦＯＲ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ（Ｔ．Ｊ．Ａｈｅｒｎおよびｄ Ｍ．Ｍａｎｎｉｎｇ編）．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
【非特許文献１１】Ｆｕｔｅｒｔｇｅｓ、Ｆ．およびＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ、Ａ．（１９９０）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１：１３９−１４８
【非特許文献１２】Ｂｅａｕｃｈａｍｐ、Ｃ．Ｏ．ら（１９８３）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５−３３
【非特許文献１３】Ｃｈｉｕ、Ｈ．Ｃ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｃｏｍｐ． Ｐｏｌｙｍ．９：３８８−４１０
【非特許文献１４】Ｎｕｃｃｉ、Ｍ．Ｌ．ら（１９９１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．６：１３３−１５１
【非特許文献１５】Ｋａｔｒｅ、Ｎ．Ｖ．ら（１９８７）ＰＮＡＳ ＵＳＡ８４：１４８７−１４９１
【非特許文献１６】Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ、Ｍ．Ｓ．ら（１９８７）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３１６：５８９−５９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
１つの薬剤として、ネズミＩＬ−１８の組み換え形態はネズミ免疫系を刺激し、その結果、腫瘍の部分的および完全な退縮および／または様々な確立された腫瘍モデルにおける免疫学的記憶の導入が起こる。臨床で通常用いられる化学療法剤、例えば、トポテカンとの組み合わせにおいて、ネズミＩＬ−１８は相乗効果を示し、その結果、様々な確立された腫瘍モデルにおいて局所および／または全身的レベルで効力が改善される。ＩＬ−１８のネズミＩＬ−１８およびヒトＩＬ−１８組み換え形の両方の広範囲の毒性および薬物動力学研究に加えて、ＩＬ−１８により媒介される免疫活性化の早期事象と相互に関連させるために、ＩＬ−１８活性の有効なバイオマーカーが発明された。これらの前臨床データは、免疫療法の新規形態、または癌ワクチンの添加物、またはそれぞれトポテカンおよびＩＬ−２などの細胞毒性剤および他の生物学的製剤に対するアジュバントとしての、異なる種類の癌にかかっている患者を治療するためのヒトＩＬ−１８の臨床的開発を支持する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において、本発明は、水溶性ポリマーと結合したＩＬ−１８ポリペプチドを含む生物学的に活性な組成物に関し、ここにおいて、前記ポリペプチドはヒトＩＬ−１８、その置換突然変異体、またはそのフラグメントである。
第二の態様において、本発明は、治療的に有効な量の、水溶性ポリマーに共有結合したＩＬ−１８ポリペプチド生物学的に活性な組成物を投与することにより、患者における癌を治療する方法に関し、ここにおいて、前記ポリペプチドはヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体である。もう一つ別の態様において、本発明は：腎臓細胞癌、黒色腫、他のＩＬ−１８反応性腫瘍タイプ（例えば、骨髄腫およびリンパ腫）、および黒色腫からなる群から選択される免疫反応性腫瘍を治療するための方法に関する。
【００１０】
第三の態様において、本発明は、生物学的に活性な組成物を調製する方法であって：
（ａ）ヒトＩＬ−１８ポリペプチドまたはその置換変異体を得る工程；および
（ｂ）前記ポリペプチドを官能化水溶性ポリマーと接触させる工程を含む方法に関する。
第四の態様において、本発明は、ヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体の薬物動力学および薬力学を改善する方法であって、ヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体を水溶性ポリマーと結合させる工程を含む方法に関する。
第五の態様において、本発明はヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体の皮下生体利用性を改善する方法であって、ヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体を水溶性ポリマーと結合させる工程を含む方法に関する。
第六の態様において、本発明はヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体の結合（相互作用）を軽減する方法であって、ヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体を水溶性ポリマーと結合させてヒトＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）にする工程を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】天然のヒトＩＬ−１８のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図２】ネズミＩＬ−１８のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】ヒトＨｉｓ Ｐｒｏ ＩＬ−１８のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図５】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｎ７８Ｃのアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図６】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｅ１２１Ｃのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図７】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｌ１４４Ｃのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図８】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｄ１５７Ｃのアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図９】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｌ１４４Ｃのアミノ酸配列（配列番号９）を示す。
【図１０】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃのアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図１１】ヒトＩＬ−１８置換突然変異体（Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃ）（配列番号１０）のＰＥＧ化後の反応混合物の典型的なＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１２】表２に示されるペプチドの標識されたピークを示す野生型ヒトＩＬ−１８のＲＰ−ＨＰＬＣトリプシンマップを示す。ペプチドは、エレクトロスプレー−イオン化ＬＣ／ＭＳにより同定した。２１５および２８０ｎｍでの検出。
【図１３】ヒト置換突然変異体Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号９）のトリプシンマッピングを示す。
【図１４】ヒトＩＬ−１８（配列番号１）および精製されたモノＰＥＧ化（２０Ｋ）生成物のトリプシンマッピングを示す。
【図１５】モノＰＥＧ２０ｋヒトＩＬ−１８置換突然変異体Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号１０）のトリプシンマッピングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ヒトＩＬ−１８ポリペプチドを含む組成物を提供し、ここにおいて、該ポリペプチドは水溶性ポリマーに結合している。本発明の結合したポリペプチドは、対応する未結合ポリペプチドと比較して予想外の生物学的性質を示す。
免疫療法は腫瘍学治療手段に、副作用が減少した抗腫瘍効果を示し、患者の生活の質を改善する可能性という有益な相加である。インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は現在、腎臓細胞癌および黒色腫の腫瘍免疫療法の新規形態として研究されている。これらの腫瘍タイプはどちらも免疫感受性であると考えられ、単一の薬剤としてＩＬ−１８に反応する。ＩＬ−１８と細胞毒性剤および他の生物学的製剤の組み合わせは、ＩＬ−１８の臨床用途を異なるタイプの血液学的および充実性腫瘍に拡大する。
【００１３】
ＰＥＧ化されたＩＬ−１８分子は、１〜５のアミノ酸置換を含有し得るＩＬ−１８の変異体である。これらの分子は、改善された薬物動力学（ＰＫ）を有するが、最も重要なことには、異なるサイトカインおよび可溶性タンパク質の誘発および発現で測定すると増大した薬物動力学的（ＰＤ）マーカーを有する。「薬物動力学」なる用語は、本明細書において用いられる場合、薬剤吸収、分散および排出（すなわち、代謝および排出）の速度を意味する。「薬力学」なる用語は本明細書において用いられる場合、作用部位（ＩＬ−１８の場合、レセプター）および薬理学的応答の部位での薬剤濃度間の関係を意味する。重要なＰＤマーカーは、変化、例えば細胞（例えばリンパ球）および細胞表面マーカーの表現型特性における向上および／または増大を包含する。ＰＥＧ化されたＩＬ−１８分子は、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）と複合体を形成する能力が低下していた。ＩＬ−１８ＢＰはＩＬ−１８活性の潜在的阻害剤であり得るので、ＩＬ−１８ＢＰとの複合体形成の防止は、臨床において有用である。Ｂｕｆｌｅｒら、ＰＮＡＳ、９９（２１）：１３７２３−１３７２８（２００２）。ＰＥＧ化されたＩＬ−１８分子は投与頻度を減らして投与することができ、このことは、他の生物学的製剤、ワクチンまたは細胞毒性剤との組み合わせ療法において非常に有用である。最も重要なことには、ＰＥＧ化は治療される患者における免疫原性を低下または排除することができる。
【００１４】
前記利点の数例を以下の実施例７、８、９および１０において示す。３つの突然変異（Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃ）（配列番号１０）およびＣ末端システム残基（Ｃ１５７位）に共有結合した１つの部位特異性２０Ｋ ＰＥＧを含有するＩＬ−１８置換突然変異体は向上したＰＫを示すが、最も重要なことには、カニクイザルにおけるＣＥＤ６４およびネオプテリンの誘発および発現、およびマウスにおけるＩＦＮγの誘発により測定されるように増大したＰＤマーカーを示す。投薬の頻度を減らして等しい抗腫瘍効果および保留された免疫学的メモリーを得る例を、ネズミＰＥＧ化ＩＬ−１８を用いることによりネズミ腫瘍モデルＭＯＰＣ−３１５において行った（データは省略）。
【００１５】
本発明において有用な他の修飾されたポリペプチドは、成熟（すなわち未修飾）ヒトＩＬ−１８タンパク質の生物学的活性を共有するこれらのタンパク質の変異体またはフラグメントである。本明細書において定義されるように、このような変異体は、タンパク質の既知アミノ酸配列における変更によっても特徴づけられる修飾されたタンパク質含む。このような変異体は、８以下のアミノ酸残基、好ましくは５以下の残基により成熟タンパク質と異なるアミノ酸配列を有することにより特徴づけられる。本発明の一実施形態において、タンパク質のアミノ酸配列における差異は、保存アミノ酸置換のみを含む。保存アミノ酸置換は、アミノ酸が置換されるアミノ酸と実質的に同じ電荷を有し、この置換がタンパク質の局所的構造またはその生物学的活性に顕著な影響を及ぼさない場合に起こる。あるいは、タンパク質の安定性を変更し得るか、または所望の宿主細胞における発現を許容する配列におけるあるアミノ酸の導入などの変化が好ましい。さらに、タンパク質構造および機能において実質的な変化がない第一アミノ酸配列におけるバリエーションは当該分野において公知である。このようなバリエーションは、当業者により用いられるアルゴリズムにより容易に検出され、予測される。例えば、周知のＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／参照）は、問題となる配列の残基での許容されるアミノ酸置換を予想し、評価するために、アミノ酸置換マトリックスを使用する。従って、当業者らは、所定のポリペプチド配列の同じ実施形態を記載するために用いられる場合の「変異体」なる用語の範囲および意味を理解する。「置換突然変異体」なる用語は、本明細書において用いられる場合、アミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されているタンパク質を意味する。ヒトＩＬ−１８「置換突然変異体」は本明細書において用いられる場合、配列番号１の配列において１〜５のアミノ酸置換を含む突然変異体を意味し、前記置換は、残基３８でのシステイン、残基６８でのシステイン、残基７６でのシステイン、残基７８でのアスパラギン、残基１２１でのグルタミン酸、残基１２７でのシステイン、残基１４４でのロイシン、残基１５７でのアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基である。
【００１６】
システインは、２０の一般的なアミノ酸のうち明らかに最も化学的に反応性である。システイン残基は、ジスルフィド架橋、活性部位化学反応、金属イオン配位、酸化窒素（ＮＯ）結合等を包含するタンパク質構造および機能において重要な役割を果たす。したがって、システインはゲノムにおいて最も強力な配列保存アミノ酸である。ヒトＩＬ−１８は、明らかな構造的または他の生物学的機能を有さない４つのシステインスルフヒドリルを含有する。システイン３８および６８は多くの実験観察により示されるようにＩＬ−１８分子の表面上で溶媒に曝されている。これらの観察は：精製中の２−メルカプトエタノールとの混合ジスルフィド付加物（もちろん、ジチオトレイトールではない）、これらの２つのシステインの高度に選択性であるビオチニル化およびＰＥＧ化、およびその空気酸化を受け、より高いＩＬ−１８濃度で分子間ジスルフィド架橋した「ダイマー」に加えて３８−６８分子内ジスルフィド架橋を形成する傾向を包含する。これらのジスルフィド架橋反応は、ピリジルジスルフィド、グルタチオン、および他のチオール−ジスルフィド交換触媒により促進することができる。一方、システイン３８および６８と比較して、システイン７６および１２７は比較的化学的に不活性である。従って、システイン７６および１２７は溶媒に暴露されないが、ＩＬ−１ベータにおける２つの埋め込まれたシステインと同様に折りたたまれたＩＬ−１８分子内に埋め込まれ、ＩＬ−１ファミリーの他のメンバーと類似した配列の位置にある（Ｋｕｍａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：１０３０８（２０００）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：１１６９−１１７５（２０００））。
【００１７】
ＩＬ−１８における４つのシステインの性質および反応性は、β−三葉型サイトカイン、塩基性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）における４つのシステインに対して顕著な類似性を有する。ＦＧＦは、広く研究され、傷の治癒および他の治療適応症のために開発されたホモローガスなヘパリン結合タンパク質マイトジェンのファミリーである（Ｏｒｔｅｇａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：５８４２−５８４６（１９９１）；Ｔｓａｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１０：６４９−６５９（１９９３））。ｈＩＬ−１８およびｈＦＧＦ−２はどちらもβ三葉型タンパク質であり；両タンパク質は２つの溶媒に暴露されたシステインと２つの埋め込まれたシステインを含有し；どちらも多くのβ三葉型に特徴的な生理学的温度よりちょっと高い低融点を有し（Ｔｍ＝４０〜５０℃）、どちらのタンパク質も活性の急速なＰＤ／ＰＫクリアランスを示す。一人の発明者らにより指摘されるように（ＥｓｔａｐｅらＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３３５：３４３−３４９（１９９８）、「ｈＦＧＦ−２は周知のように不安定なタンパク質であることが知られている。」ＦＧＦ−１のインビボ半減期は、ポリアニオン性硫酸化多糖類であるヘパリンに対する特異的結合により１０倍も増大する。ＦＧＦの安定化に加えて、ヘパリンはＦＧＦのＦＧＦレセプターに対する結合において重要な役割を果たす（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、４０７：１０２９−１０３４ （２０００））。他のβ三葉型サイトカインが類似した「安定化リガンド」を有するかどうかはわからないが、Ｋｏｂａｔａおよび共同研究者らは最近、ＩＬ−１ベータの硫酸化多糖類との特異的結合相互作用に関して報告している（Ｔａｎｄａｉ−Ｈｉｒｕｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：４５９−４４６６（１９９９））。
【００１８】
ＦＧＦにおけるシステインは、天然のＦＧＦおよびシステイン−セリンムテインの両方に関する結晶学および生物物理学的技術によりよく研究されている。ｈＦＧＦ−２における２つの溶媒に暴露されたシステインの化学的修飾、または部位指向性突然変異誘発によるこれらのシステインの置換は、分子内および分子間ジスルフィド架橋を排除し、ＦＧＦマイトジェン活性の安定性を大きく増大させる（Ｓｅｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１５１：７０１−７０８（１９８８））。最近、研究者らは、ジスルフィド架橋を形成し、これにより不可逆的にタンパク質を不活化し、これらの有効なサイトカインのインビボ寿命を制限するために、ＦＧＦにおけるシステインは配列において正確に保存されることを提案している（Ｃｕｌａｊａｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９：７１５３−７１５８（２０００））。Ｃｕｌａｊａｙら（前出）は、システインスルフヒドリル化学反応を含むＩＬ−１８の同様のビルトイン調節メカニズムを示唆する予備インビトロデータを記載している。
【００１９】
緩衝化ｈＩＬ−１８溶液（０．１０Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）は、ＩＬ−１８の３８−６８分子内ジスルフィド架橋形態がまず蓄積し、その後、室温および５℃で一夜静置した後に３８−６８、７６−１２７二重架橋形態が出現する。データは、ＩＬ−１８の３８−６８分子内ジスルフィド架橋がまず蓄積し、続いて３８−６８、７６−１２７二重架橋形態が出現することを示す。これらの空気酸化反応の初期時間経過はその後のＡ→Ｂ→Ｃ型の連続反応、すなわち、３８−６８架橋したＩＬ−１８の蓄積とその後の３８−６８、７６−１２７二重架橋したＩＬ−１８への変換と一致する。反応生成物におけるジスルフィド対合は、トリプシンマッピングおよび単離されたピークの質量分析により決定した。初期３８−６８形態が室温よりも５℃でより安定であることは興味深い。この中間生成物の蓄積は５℃でずっと大きいが、ＩＬ−１８出発物質の還元速度は、２種の温度でほぼ等しい。これらの２種の温度で溶解した酸素の周囲濃度の起こり得る影響を排除すると、データは、３８−６８架橋形態は二重架橋生成物の点に関して熱的に不安定であることを示す。生成物はジチオトレイトール（ＤＴＴ）還元により出発物質に戻すことができる。
【００２０】
本発明のポリペプチドは、本発明において有用な成熟および／または修飾タンパク質のマルチマー形態、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーまたは他の凝集形態として存在することもできる。このようなマルチマー形態は、物理的会合、化学的合成または組み換え発現により調製することができ、以下に詳細に記載する合成技術および組み換え技術の組み合わせにより産生されるサイトカインを含有することができる。マルチマーは発現により自然に形成されるか、または以下に詳細に記載するような組み換え技術により形成される。マルチマーサイトカインは、同じ修飾されたサイトカインのマルチマーを含み得る。別のマルチマーは、異なる修飾タンパク質の凝集により形成することができる。さらに別のマルチマーは、本発明の修飾サイトカインおよび公知成熟サイトカインの凝集により形成することができる。好ましくは、本発明において有用なダイマーまたはマルチマーは少なくとも１つのデスアミノサイトカインタンパク質および少なくとも１つの他のサイトカインまたは同じ種類の生物学的活性を有することにより特徴づけられる他のタンパク質を含有する。この他のタンパク質はさらなるデスアミノサイトカインまたは別の公知タンパク質であってもよい。
【００２１】
本発明において有用な修飾サイトカインは、ヒトＩＬ−１８タンパク質（配列番号１）、その置換突然変異体、またはそのフラグメントである。本発明は従って、ヒトＩＬ−１８の生物学的活性を向上させる方法を提供する。本発明は自然にまたは組み換えにより産生されるヒトＩＬ−１８または本明細書に記載されるようなＩＬ−１８置換突然変異体を修飾し、水溶性ポリマーと共有結合するようにすることを含む。あるいは、サイトカイン分子のマルチマーを水溶性ポリマーと結合させることができる。これらの結合体は、結果として得られる組成物の生物学的活性をさらに向上させる。
【００２２】
本発明において有用なヒトＩＬ−１８、ヒトＩＬ−１８置換突然変異体、およびヒトＩＬ−１８フラグメントは、以下に記載されるいくつかの方法の任意のものにより調製することができる。これらのポリペプチド部分は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（（１９６４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９）の固相ペプチド合成技術により調製することができる。あるいは、当該分野において公知のペプチド合成の溶液法を成功裏に用いることができる。本発明のペプチドを産生するために、一般に、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ（１９８４）またはＭ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ、Ｙ．Ａ．Ｋｌａｕｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９７６）において記載されるペプチド合成の方法を用いることができる。
【００２３】
修飾されたヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、成熟ＩＬ−１８の適当な酵素での酵素消化により成熟ＩＬ−１８から誘導することができる（例えば、Ｏｒａｖｅｃｚ、Ｔ．ら、（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１８６５；Ｐｒｏｏｓｔ、Ｐ．ら、（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４３２：７３；Ｓｈｉｏｄａ、Ｔ．ら、（１９９８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ９５：６３３１；およびＷａｌｔｅｒ、Ｒ．ら、（１９８０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１１１参照）。さらに、ペプチド合成の間に修飾されたアミノ酸を成長するポリペプチド鎖中に組み入れることができる（Ｍ．Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ、Ｍ．ら、（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７１８５−７１８９；Ｆｅｌｉｘ、Ａ．Ｍ．（１９９７）Ｉｎ Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、ｐ２１８−２３８）。これらの修飾されたアミノ酸残基は、水溶性ポリマーの共有結合を促進するように選択することができる。また、変異体ポリペプチドを合成することができ、ここにおいて、アミノ酸付加、置換、または欠失がその後のポリマー結合を促進するために選択される。このような変異体ポリペプチドは、化学合成または組み換え発現により調製することができる。例えば、追加のシステイン残基を組み入れること（存在するシステインでない残基の置換あるいは一端または両端への付加のいずれかによる）は、スルフヒドリル基によるポリマーカップリングを促進するために望ましい（例えば、Ｋｕａｎ、Ｃ．Ｔ．ら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７６１０−７６１６；Ｃｈｉｌｋｏｔｉ、Ａ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：５０４−５０７）。
【００２４】
好ましくは、本発明において有用なヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、当業者に公知の他の技術、例えば遺伝子組み換え技術により産生することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｉｎ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）参照。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、哺乳動物、昆虫、および酵母細胞をはじめとする所望の微生物または細胞における選択されたタンパク質のクローニングおよび発現系は公知であり、私立および公立ライブラリーおよび預託機関および商業的供給元から入手可能である。
【００２５】
本発明の一実施形態において、本発明のヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、ＩＬ−１８の直接組み換え発現から産生される。例えば、ヒトＩＬ−１８タンパク質は、そのＤＮＡコーディング配列を通常のプラスミド発現ベクター中に、選択された宿主においてタンパク質の複製および発現を行うことができ調節配列の制御下で挿入することにより組み換え発現することができる。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｈ．、Ｇｅｎｅ ５６、１２５−１３５（１９８７）。
【００２６】
組み換え産生に関して、宿主細胞を遺伝子操作して、本発明において有用なＩＬ−１８ポリペプチドの発現系またはその一部を組み入れることができる。ヒトＩＬ−１８をエンコードするポリンクレオチドの宿主細胞中への導入は、多くの標準的実験室用マニュアル、例えば、Ｄａｖｉｓら、ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、ｉｎ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されている方法により行うことができる。このような方法としては、これらに限定されないが：リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質で仲介されたトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレイプローディング、バリスティックイントロダクションまたは感染が挙げられる。
【００２７】
適当な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属細胞；昆虫細胞、例えば、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ ２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；および植物細胞が挙げられる。
【００２８】
様々な発現系、例えば染色体、エピソームおよびウイルスに誘導系、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス、例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスから誘導されるベクター、ならびにその組み合わせ由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメントから由来のものを使用することができる。発現系は、発現の制御ならびに発生を調節する制御領域を含有することができる。一般に、宿主においてポリペプチドを産生するためにポリヌクレオチドを維持、増殖または発現することができる任意の系またはベクターを使用することができる。適切なヌクレオチド配列は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されているものなどの様々な周知で慣習的な技術により発現系中に挿入することができる。適切な分泌シグナルを所望のポリペプチド中に組み入れて、翻訳されたタンパク質を小胞体内腔、細胞周辺腔または細胞外環境の管腔中に分泌させることができる。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってもよいし、あるいは異種シグナルであってもよい。
【００２９】
ポリペプチドが媒体中に分泌されるならば、前記媒体はポリペプチドを回収し、精製するために回収することができる。細胞内で産生される場合、細胞はまずポリペプチドが回収される前に溶解されなければならない。
本発明において有用なポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレシチンクロマトグラフィーをはじめとする周知の方法により組み換え細胞培養物から回収し、精製することができる。最も好ましくは、精製するために高性能液体クロマトグラフィーを用いることができる。単離および精製中にポリペプチドが変性する場合、活性構造を再生するためにタンパク質のリホールディングのための周知の技術を用いることができる。
【００３０】
本発明において有用な水溶性ポリマーは、本発明の組成物に対する望ましくない免疫反応性を回避するために実質的に非抗原性である。このような水溶性ポリマーとしては、これらに限定されないが：ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリエチレングリコールコポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレングリコール−コープロピレングリコール）、ポリ（Ｎ−２−（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ（シアル酸）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、およびデキストランが挙げられる。好適なポリマーは、任意の分子量を有するものである。本発明の一実施形態において、ポリマーは約１０００ダルトン〜約１０００００ダルトンの平均分子量を有する。本発明の別の実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリマーは約４０００ダルトン〜約４００００ダルトンの平均分子量を有する。本発明のさらに別の実施形態において、前記官能化ポリマーの分子量は：約２００００ダルトン〜約３００００ダルトンからなる群から選択される。本発明のさらに別の実施形態において、前記官能化ポリマーは約２００００ダルトンの分子量を有する。
【００３１】
これらのポリマーは、置換されていないかまたは一端でアルキル基で置換されている。例えば、
本発明の組成物は、水溶性ポリマーがポリエチレングリコールホモポリマーであるものである。本発明における使用に好適なポリマーは、分岐鎖、非分岐鎖、星状または直鎖である。本発明の一実施形態において、このような組成物は直鎖ポリエチレングリコールホモポリマーを含む。本発明の別の実施形態において、このような組成物は、分岐鎖ポリエチレングリコールホモポリマーを含む。本発明における使用に好適なポリマーは、次の特許、特許出願および刊行物に開示されている：米国特許第４，０９７，４７０号、第４，８４７，３２５号、第５，０３７，８８３号、第５，２５２，７１４号、第５，５８０，８５３号、第５，６４３，５７５号、第５，６７２，６６２号、第５，７３９，２０８号、第５，７４７，４４６号、第５，８２４，７８４号、第５，８４６，９５１号、第５，８８０，２５５号、第５，９１９，４５５号、第５，９１９，７５８号、第５，９３２，４６２号、第５，９８５，２６３号、第５，９５１，９７４号、第５，９９０，２３７号、第６，０４２，８２２号、第６，０４６，３０号、第６，１０７，２７２号および第６，１１３，９０６号；国際特許公開番号ＷＯ９２／１６５５５；欧州特許公開番号ＥＰ７２７，４３７、ＥＰ７２７，４３８、ＥＰ４３９，５０８およびＥＰ７１４，４０２；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ６：１５０−１６５；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｇ．ら、（１９９９） Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９：６１−６６（それぞれは本発明の一部として参照される）。さらに、ポリペプチドおよび他の生物学的物質との結合を促進するために修飾された誘導化または官能化されたポリマーが本発明における使用に好適である。例えば、遊離アミノ基（例えばリシン残基でのイプシロンアミノ基またはＮ末端での遊離アミノ基）、システイン残基上の遊離スルフヒドリル基、または炭水化物部分による結合を促進するためのポリマーの修飾が望ましい。有用なポリマーは、ポリエチレングリコールのモノメトキシ誘導体（ｍＰＥＧ）も含む。本発明において用いることができる官能化ポリマーとしては、これらに限定されないが：メトキシポリエチレングリコールスクシニミジルプロピオネート；メトキシポリエチレングリコールスクシニミジルブタノエート；カルボキシメチル化メトキシポリエチレングリコールのスクシニミジルエステル；メトキシポリエチレングリコールアルデヒド；メトキシポリエチレングリコールヒドラジド、メトキシポリエチレングリコールヨードアセトアミド；メトキシポリエチレングリコールマレイミド；およびメトキシポリエチレングリコールトレシレートが挙げられる。
【００３２】
前記のヒトＩＬ−１８タンパク質は：天然に存在するか、または遺伝子操作によりサイトカイン分子中に導入されリホールディング後も遊離のままである（１）遊離アミン基、例えば生物学的活性の喪失を最小限に抑えるための１または２個、（２）遊離カルボキシル基、例えば生物学的活性の喪失を最小限に抑えるための１または２個；（３）遊離ヒスチジン基、（４）遊離スルフヒドリル基または（５）遊離チオエーテル基のいずれかによりポリマーに結合させることができる。タンパク質に結合されたポリマー分子の数は、例えば、適当な分子マーカーを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたはサイズ排除クロマトグラフィー、マトリックスにより補助されたレーザー脱離およびイオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）（Ｂｕｌｌｏｃｋ、Ｊ．ら、（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：３２５８−３２６４）、キャピラリー電気泳動（Ｋｅｍｐ、Ｇ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：９−１７；Ｒｏｂｅｒｔ、Ｍ．Ｊ．およびＨａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．（１９９８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１４４０−１４４５）をはじめとする様々な方法により決定することができる。ポリマー結合の部位は、タンパク質を酵素（例えば、トリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ）により消化して小さなフラグメントにし、逆相液体クロマトグラフィーにより分離することにより決定できる。ポリマー修飾の前後のペプチドマップを比較し、溶出時間が変わったフラグメントを配列化して、ポリマー結合の位置が決定される。別法として、ポリマーは、タンパク質１モルあたり何モルの標識されたポリマーが結合するかを決定するためにカップリング前に蛍光または放射性標識の何れかをすることができる。
【００３３】
結合される残基は：通常存在するか、または遺伝子操作によりタンパク質中に導入される（１）システイン残基上の遊離スルフヒドリル基；（２）任意の遊離アミン基（例えば、リシン残基のイプシロンアミン基またはＮ末端での遊離アミン基）；（３）遊離カルボキシル基（例えば、アルパルテートおよびグルタメート残基上の遊離カルボキシル基）；（４）ヒスチジン上の遊離イミダゾール基、および（５）メチオニン上の遊離チオエーテル基である。
結合を行うための反応条件は、タンパク質の反応基がシステイン上の遊離チオール基またはメチオニン上のチオエーテル基であるならば、ｐＨ約６〜９、さらに好ましくはｐＨ６〜７で前記結合反応を行うことをさらに含む。前記方法を用いて、タンパク質をポリマーに添加された少なくとも１つの末端チオール反応性基により結合させる。これらのチオール反応性基としては、これらに限定されないが：ハロアセチル、マレイミド、ピリジルジスルフィド誘導体、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤が挙げられる。用いられる未反応活性化ポリマーの量は、通常、モノマーまたはマルチマー（好ましくはダイマー）形態であるタンパク質よりも１〜１０倍過剰の活性化ポリマーである。一般に、反応プロセスは、活性化ポリマーをタンパク質と２：１（ポリマー：ポリマー）の比で反応させることを含む。典型的には、反応はリン酸塩緩衝液ｐＨ６．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ中、４℃で約１時間〜約１０時間行われる。結合後、所望の結合タンパク質を液体クロマトグラフィーなどにより回収し、精製する。
【００３４】
結合を行うための反応条件は、タンパク質の反応性基が遊離アミン基であるならば、そしてアスパラギンおよびグルタミン残基でアルカリ性ｐＨ（７より大）で起こることが知られている脱アミド化反応を減少させるために、Ｈ約６〜９、さらに好ましくはｐＨ６．５〜７．５で前記結合反応を行うことをさらに含む。前記方法を用いて、タンパク質をポリマーに添加された少なくとも１つの末端アミン反応性基により結合させる。これらのアミン反応性基としては、これらに限定されないが：イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ベンゾトリアゾール、イミダゾール、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、ヨードアセトアミド、トレシレートおよび無水物が挙げられる。用いられる未反応活性化ポリマーの量は、一般にモノマーまたはマルチマー（好ましくはダイマー）のいずれかの形態であるタンパク質より１〜１０倍過剰である。一般に、反応プロセスは、活性化ポリマーをタンパク質と２：１（ポリマー：タンパク質）の比で反応させることを含む。典型的には、反応は、リン酸塩緩衝液ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ中、４℃で約１時間から約４時間行われる。結合後、所望の結合タンパク質を液体クロマトグラフィー等により回収し、精製する。
【００３５】
結合を行うための反応条件は、タンパク質の反応性基が遊離カルボキシレート基であるならば、前記結合反応をｐＨ約３〜９、さらに好ましくはｐＨ４〜５で行うことをさらに含む。タンパク質上のカルボキシル基は、アシル化剤、例えばカルボジイミド（例えば、ＤＣＣまたはＥＤＣ）あるいはカルボニルジイミダゾール（例えば、ＣＤＩ）により活性化される。前記方法を用いて、タンパク質をポリマーに添加された少なくとも１つの求核性官能基により結合させる。これらの求核性官能基としては、これらに限定されないが：アミンまたはヒドラジドが挙げられる。前記タンパク質に関して、好ましい反応条件は、アスパラギンおよびグルタミン残基で、アルカリ性ｐＨ（７より大）で起こることが知られている脱アミド化副反応を軽減するために４℃で弱酸性ｐＨである。用いられる未反応活性化ポリマーの量は、一般にカルボキシル化活性化タンパク質より１〜１０倍過剰の活性化ポリマーである。一般に、反応プロセスは、活性化ポリマーをタンパク質と２；１（ポリマー：タンパク質）の比で反応させることを含む。典型的には、反応はＭＥＡ緩衝液ｐＨ４．５中、４℃で約１時間から約８時間行われる。結合後、所望の結合タンパク質を液体クロマトグラフィーなどにより回収し、精製する。
【００３６】
結合を行うための反応条件は、タンパク質の反応性基が遊離ヒスチジンであるならば、前記結合反応をｐＨ約３〜６、さらに好ましくはｐＨ４〜５で行うことをさらに含む。前記方法を用いて、タンパク質をポリマーに添加された少なくとも１つの末端イミダゾール反応性基により結合させる。これらのイミダゾール反応性基としては、これらに限定されないが：Ｎ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルおよび無水物が挙げられる。用いられる未反応活性化ポリマーの量は、一般にモノマーまたはマルチマーの何れかであるタンパク質よりも１〜１０倍過剰の活性化ポリマーである。一般に、反応プロセスは、活性化ポリマーをタンパク質と２；１（ポリマー：タンパク質）の比で反応させることを含む。典型的には、反応は酢酸塩緩衝液ｐＨ４〜５、１００ｍＭ ＮａＣｌ中、４℃で約２時間から約６時間行われる。結合後、所望の結合タンパク質を液体クロマトグラフィーなどにより回収し、精製する。
【００３７】
水溶性ポリマーの治療的ポリペプチドとの有効な結合は、既に米国特許第４，４８７，３２５号、米国特許第５，８２４，７８４号および米国特許第５，９５１，９７４号（全体として本発明の一部として参照される）に記載されている。
さらに別の態様において、本発明は、治療的に有効な量の本発明の組成物を、治療的に許容される担体または賦形剤との組み合わせにおいて含む医薬組成物を提供する。このような担体としては、これらに限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが挙げられる。本発明はさらに、本発明の前記組成の１以上の成分を充填された１以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。本発明の組成物は、単独または他の化合物、例えば治療化合物との組み合わせにおいて用いることができる。
【００３８】
医薬組成物は、例えば全身性または経口経路による投与経路に適用される。全身性投与の形態は、注射、典型的には静脈内注射を包含する。皮下、筋肉内、または腹腔内等の他の注射経路も使用できる。全身性投与の代替手段としては、浸透剤、例えば胆汁塩またはフシジン酸または他の界面活性剤を用いた経粘膜および経皮投与が挙げられる。加えて、本発明の組成物が腸溶性またはカプセル化処方に処方できるならば、経口投与も可能である。これらの組成物の投与は、軟膏、ペースト、ゲルなどの形態において、局所および／または局所化することができる。他の投与経路は、溶液または乾燥粉末処方の何れかを用いた肺または鼻送達を包含し得る。
【００３９】
必要とされる投与量範囲は、本発明の組成物、投与経路、処方の性質、対象の状態の性質、および診察する医師の判断に依存する。しかしながら、好適な用量は、対象の体重１ｋｇあたり０．１〜１０００μｇの範囲である。しかしながら、入手可能な様々な組成物および様々な投与経路の異なる有効性の観点から、必要な用量は広範囲に変化することが予想される。例えば、経口投与は静脈内注射による投与よりも高い投与量を必要すると予想される。これらの投与量レベルにおける変動は、当該分野において良く理解されるように、最適化のための標準的経験的手順を用いて調節することができる。
【００４０】
本発明は、その精神または本質的特性から逸脱することなく他の特定の形態において具体化することができ、従って本発明の範囲を表示する前記明細書または以下の実施例よりも添付の請求の範囲を参照すべきである。
これらに限定されないが、本明細書において言及し、または本出願が優先権を主張する特許および特許出願を包含する全ての刊行物は、個々の出版物が具体的かつ個別にあたかも完全に表示されているように出典明示により本発明の一部として参照される。
【００４１】
実施例
実施例１：ヒトおよびネズミＩＬ−１８結晶構造に基づくＰＥＧ化部位の予想：
Ｃｙｓ３８およびＣｙｓ６８（２つの天然の表面が露出したシステイン）でのヒトＩＬ−１８（配列番号１）のＰＥＧ化により、低活性を有する分子が産生された。従って、本発明者らは所望の生物学的活性と緩衝することなくＣｙｓと突然変異形成し、その後ＰＥＧ化するためのヒトＩＬ−１８における部位を同定することを試みた。
マウスＩＬ−１８の結晶構造は解明されている（米国特許出願番号１０／６４０，５２４、２００３年８月１３日提出）。ＩＬ−１８およびＩＬ−１βはそのコア構造が非常に類似しているが、その表面ループは異なることなることが明らかである。ヒトＩＬ−１８の構造は、高い配列相同性（６５％同一）のためにネズミＩＬ−１８構造と非常に類似している。ネズミＩＬ−１８の結晶構造を用いて、表面およびループ残基をヒトＩＬ−１８上にマップすることができる。
【００４２】
本発明者らはＩＬ−１８レセプターとの相互作用に関与しないＩＬ−１８の柔軟な表面ループの先端での残基のＰＥＧ化を目的とする。本発明者らは、ＩＬ−１８はそのレセプターと、ＩＬ−１β：ＩＬ−１βレセプター相互作用と類似した方法で相互作用すると仮定する。マウスＩＬ−１８配位を、三次元オーバーレイで、ヒトＩＬ−１βのＩＬ−１βレセプターとの複合体からのヒトＩＬ−１βの配位上に重ね合わせた（Ｖｉｇｅｒｓら、ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ３８６：１９０、１９９７；ＰＤＢ ｃｏｄｅ １ＩＴＢ）。ヒトＩＬ−１βレセプターのＩＬ−１βレセプター拮抗物質との複合体の配位（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒら、ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ３８６：１９４、１９９７；ＰＤＢ ｃｏｄｅ １ＩＲＡ）を、ＩＬ−１８のそのレセプターとの結合様式をモデル化するためにも使用した。これらのオーバーレイから、本発明者らは、Ａｓｎ７８、Ｇｌｕ１２１、Ｌｅｕ１４４、およびＣ末端を少なくとも起こりそうなレセプターとの相互作用として、従ってシステインと突然変異形成し、その後ポリエチレングリコールを結合してＰＥＧ化ＩＬ−１８を形成するための良好な部位として選択した。ヒトＩＬ−１８のＣ末端アミノ酸（Ｄ１５７）およびＬｅｕ１４４は、別々にＣｙｓと突然変異形成し、次いでＰＥＧ化された。結果として得られる２つの修飾ＩＬ−１８分子は活性を示した。
【００４３】
実施例２：置換突然変異設計：
ネズミＩＬ−１８結晶構造に基づいて（米国特許出願番号１０／６４０，５２４、２００３年８月１３日提出）、また後に天然のヒトＩＬ−１８結晶構造により確認されるように（ＰＣＴ出願番号ＷＯ０３／０８９６５３、２００３年１０月３０日提出）、生物学的活性に対する負の効果を最小限に抑えるためにモノＰＥＧを予想されるレセプター結合領域から離れた遊離システインと結合させるＰＥＧ化法を考案した。天然のヒトＩＬ−１８は、図１（配列番号１）に示される成熟ヒトＩＬ−１８のアミノ酸配列において下線で示される４つのシステイン、Ｃ３８、Ｃ６８、Ｃ７６、およびＣ１２７を含有する。これらの内の２つ、Ｃ３８およびＣ６８は、結晶構造により予想されるようにＰＥＧ化に利用可能である。ＰＥＧ化された天然のヒトＩＬ−１８は、Ｃ３８およびＣ６８の両方で二重ＰＥＧ化されており、減少したインビトロ生物学的活性を示す（表１）。モノＰＥＧ化は、天然のシステインの１つを非反応性アミノ酸で置換し、残りの反応性システインをＰＥＧ化するか、または両方の天然のシステインを置換し、分子中の他の場所の遊離システインを置換することにより達成される。
【００４４】
一連のヒトＩＬ−１８置換突然変異体は、部位指向性突然変異誘発により生成された（Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２）。これらの全てはイー・コリにおいて、Ｎ末端の６のヒスチジン精製タグを有するｐｒｏ形態において発現された（図３）（配列番号３）。別に精製されたカスパーゼ５を用いてＰｒｏＩＬ−１８を次に活性化してインビトロで成熟形態にした。全てのＩＬ−１８突然変異は、この方法を用いて有効に発現され、等しい収率で精製された。カスパーゼ１、４、および５、およびユビキチン特異性プロテアーゼを用いてインビトロまたは細胞内で活性ＩＬ−１８を産生する代替法は、ＰＣＴ ＷＯ０１／０９８４５５（２００１年１２月２７日公開）において詳細に記載されている。これらの方法はすべて本出願において開示されているＩＬ−１８突然変異体デザインの任意のものを産生するために好適である。
【００４５】
置換突然変異体デザインを、これらの内部の対応するモノＰＥＧ化部位、およびＰＥＧ化および非ＰＥＧ化形態のインビトロ活性とともに以下の表１に記載する。天然のＩＬ−１８のモノＰＥＧ化は、システイン３８またはシステイン６８（図１、最初の２つの下線部分）（配列番号１）で達成される。天然のＩＬ−１８分子内のモノＰＥＧ化により、ＰＥＧ化されていない天然のＩＬ−１８と比較して、ＫＧ−１ ＩＦＮ分泌分析において生物学的有効性が約５倍低下する。一方、遊離天然のシステイン６８でのモノＰＥＧ化は、Ｃ３８をセリン（図４、下線）（配列番号４）で置換することにより達成される。この分子内のシステイン６８でのモノＰＥＧ化により、ＰＥＧ化されていない天然のＩＬ−１８と比較してＫＧ−１ ＩＦＮ分泌分析において生物学的能力が約２倍減少する。対照的に、この置換の非ＰＥＧ化形態の活性は、天然のＩＬ−１８から有意に減少しなかった（表１Ａ）。
【００４６】
予想されるレセプター結合相互作用部位から離れた三葉型構造の露出したループに関するＰＥＧ化についてヒトＩＬ−１８の結晶モデルに基づいてさらなる置換デザインを調製した。４つの部位、Ｎ７８、Ｅ１２１、Ｌ１４４、およびＤ１５７をシステイン置換のために選択した。ｈＩＬ−１８タンパク質に沿って置換当然変異に好適な他の残基があるが、これらの４つの残基がまず選択される。これらの部位でのモノＰＥＧ化を達成するために、システイン３８をセリンで置換し、システイン６８をセリンまたはアスパラギン酸のいずれかで置換した。セリンはシステインと比較して中性の性質および小さな寸法のために使用した。アスパラギン酸は、ヒトにおけるシステインに関する位置に他の種のＩＬ−１８においてアスパラギン酸が存在するために選択した。図５〜１０はこれらの理論的デザインのそれぞれのアミノ酸配列（それぞれ配列番号５〜１０）を示す。置換突然変異に下線を施した。ＰＥＧ化後の全てのムテインについての生物学的効力において活性の減少が観察された。ＰＥＧ化およびモノＰＥＧ化形態の相対的活性に基づいて、２つのＰＥＧ化部位、Ｌ１４４およびＤ１５７を選択し、その後のインビトロおよびインビボ検定において試験した。さらに、この残基置換の中性的性質のためにＣ６８ＤよりもＣ６８Ｓ置換を選択した。従って、突然変異デザインＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｌ１４４Ｃ、およびＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７ＣをそれぞれＣ１４４およびＣ１５７（図９および図１０）（表１Ａおよび１Ｂ）（それぞれ配列番号９および１０）でのモノＰＥＧ化に使用した。
【表１】
【表２】
【００４７】
実施例３：精製法：
ａ．ＩＬ−１８のシステイン置換突然変異体の精製
実施例２において前述した突然変異体の全ては、イー・コリにおいて、発現レベルの検出と精製の便宜のためのＮ末端ヘキサヒス標識を有する可溶性代用形として発現された。ヘキサヒス／ｐｒｏＩＬ−１８（配列番号３）を発現するイー・コリ細胞を、１０ｍｌ／ｇ細胞で溶解緩衝液中に懸濁させた。溶液緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓｌ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール（緩衝液Ａ）、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡおよび０．４ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有していた。細胞を溶解緩衝液中に均質化させ、ミクロフルイダイザー（Ｍ１１０−Ｙ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）に１２０００ｐｓｉで２回通すことにより溶解させた。細胞溶解物を３００００ｇで３０分間遠心分離して、細胞片を分離し、上清をＮｉＮＴＡアガロースカラムにかけ、これを３カラム体積の緩衝液Ａで洗浄した。カラムをさらに３カラム体積の、３０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液Ａで洗浄して非特異性結合不純物を除去し、ヘキサヒス／ｐｒｏＩＬ−１８を緩衝液Ａ中３００ｍＭイミダゾールで溶出した。プールを１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含有する２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５（緩衝液Ｂ）に対して透析した。緩衝液Ｂはカスパーゼ反応について最適の緩衝液であった。緩衝液Ｂ中のプールにカスパーゼ５を１：１００ｗ／ｗ（カスパーゼ５対ｐｒｏＩＬ−１８）を添加し、一夜室温でインキュベートして、開裂反応を完了させた。反応混合物を０．５Ｍ ＮａＣｌに調節し、これをＮｉＮＴＡアガロースカラムにかけた。成熟ＩＬ−１８をカラムに通し、その間、ヘキサヒス／プロドメイン結合をカラムに戻した。第一ＮｉＮＴＡアガロースカラムに結合し、溶出される、あるイー・コリタンパク質（不純物）をカラムに再結合させ、さらに純度の高い成熟ＩＬ−１８を得た。未結合タンパク質を２５ｍＭ ＤＴＴに調節し、１時間インキュベートして、還元状態で全てのシステインを回復し、精製中に形成されたＢＭＥ付加物およびジスルフィド結合を還元した。システイン酸化を回避するために２Ｍリン酸を添加することにより還元された成熟ＩＬ−１８溶液をｐＨ６．０に調節し、ＹＭ１０膜で濃縮した。緩衝液を交換するために、濃縮されたサンプルを、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにかけて、凝集物を除去し、インビボ研究に適したエンドトキシンを除去した。成熟ＩＬ−１８をモノマーとしてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムから溶出させ、ＬＣ／ＭＳ分析による分子量は、ｃＤＮＡから計算されたモノマー形態から予想されるとおりであった。ＤＴＮＢ滴定により、４つのシステインすべてが還元形態であることが示された。
【００４８】
ｂ．ＰＥＧ化ＩＬ−１８の精製
ＰＥＧ化ＩＬ−１８、遊離ＰＥＧ、および未修飾ＩＬ−１８を含有するＰＥＧ化反応混合物を、反応直後に、等体積の２５ｍＭ ＭＥＳ中２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４（ｐＨ６．２）（緩衝液Ｃ）で希釈した。希釈された反応混合物をＳｏｕｒｃｅ１５フェニル（Ｐｈａｒｍｎａｃｉａ）カラムにかけ、これを１．５カラム体積の緩衝液Ｃ中１Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４で洗浄した。カラムを５カラム体積の緩衝液Ｃ中０．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４への直線的勾配で溶出させた。遊離ＩＬ−１８がまず溶出され、続いて遊離ＰＥＧおよびＰＥＧ化ＩＬ−１８が最後に溶出される。ＰＥＧ化ＩＬ−１８を含有するフラクションをプールし、ＹＭ１０膜で濃縮し、あらかじめ平衡化させた寸法排除カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００調製等級（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、緩衝液Ｂで溶出させた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００は任意の残存する遊離ＩＬ−１８、遊離ＰＥＧ、任意の凝集物、およびエンドトキシンを除去する。ＰＥＧ化ＩＬ−１８を含有するフラクションをプールし、〜５−６ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【００４９】
実施例４：ＰＥＧ化ＩＬ−１８の調製
ＰＥＧ化ＩＬ−１８の調製の一般的手順を以下に記載する。適当な量の平均分子量２００００、３００００または４００００ダルトンを有するメトキシポリエチレングリコールマレイミド（ＭＡＬ ＭＰＥＧ）を、リン酸塩緩液ｐＨ６．０〜６．５中ＩＬ−１８の２．５ｍｇ／ｍＬ溶液に添加した（固体またはあらかじめ水性または有機溶媒中に溶解させるかのいずれかとして）。ＭＡＬ ＭＰＥＧを、過剰モル量のＭＡＬ ＭＰＥＧでタンパク質溶液に添加した。反応を５℃で１〜１２時間進行させた。反応の最後に、過剰量（例えば２０倍）のシステイン（０．５Ｍ）を添加して反応を停止した。この段階で、野生型ヒトＩＬ−１８をＰＥＧ化に使用する場合、反応混合物は主にモノ、ジおよび非ＰＥＧ化ＩＬ−１８からなることが判明した。ヒトＩＬ−１８置換突然変異体を使用する場合（前章において議論するように）、反応混合物は主にモノ−ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８タンパク質からなることが判明した（図１１参照）。
【００５０】
ａ．物理化学的キャラクタライゼーション
各サンプルを特徴づけるために４種の分析：（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（２）逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、（３）分子量測定（ＬＣ／ＭＳ）および（４）ペプチドマッピングを行った。
ｂ．ＰＥＧ化度
ＰＥＧ化の程度（すなわち、１つのタンパク質に結合するＰＥＧ分子の数）を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。ヒトＩＬ−１８またはネズミＩＬ−１８ＰＥＧ化反応混合物のサンプルを還元条件下、レーンあたり１０．０μｇのロードで、４〜１２％ビス−トリスポリアクリルアミド勾配プレキャストゲル上にかけた。タンパク質を検出し、クーマシーＲ−２５０で染色した後に定量化した。定量化はレーザーデンシトメトリーにより行った。
ＰＥＧ化の程度をさらに、ＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いて分析した。反応混合物のサンプルを１ｍＬ／分の流速で、８．６％／分の移動相Ｂ（移動相Ａ：０．１％水中トリフルオロ酢酸、移動相Ｂ：８０％アセトニトリル／水中０．１％ＴＦＡ）の勾配で、ＰＯＲＯＳ Ｒ２／Ｈカラム（カラム温度４０℃）で流した。
【００５１】
ｃ．ＰＥＧ化の部位−トリプシンペプチドマップ法の開発
タンパク質上の正確な位置に対するＰＥＧの結合の位置を証明するために、精製ＰＥＧ化ＩＬ−１８サンプルをペプチドマッピングにより分析した。ＩＬ−１８のトリプシンマッピングは従来法を変更し（Ｊ．Ｂｏｎｇｅｒｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ．、２１：１０９９−１１２８（２０００））、ＩＬ−１８におけるシステイン（遊離スルフヒトリル）の直接Ｓ−カルボキシメチル化を用いる：サンプル（２．５ｍｇ）を真空下で蒸発乾固させ、６Ｍのグアニジン・ＨＣｌ中０．５ｍＬの新たに調製された２０ｍＭヨード酢酸ナトリウム中に溶解させ、室温で暗所に４０分間置き、その後直ちにＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６ＤＧゲルカラム（ＢｉｏＲａｄ Ｅｃｏｎ−Ｐａｃ１０ＤＧ）上で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ８．１）消化緩衝液中に緩衝液交換した。トリプシン（ＴＰＣＫ−処理Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、Ｌｙｓ−Ｃ（Ｗａｋｏ）、およびＧｌｕ−Ｃ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）でのタンパク質分解的消化は全て２ｍｇ／ｍＬ ＣＭ−ＣｙｓＩＬ−１８基質について１００／１ｗｔ：ｗｔＳ／Ｅ、３７℃で２時間であった。ＲＰ−ＨＰＬＣマッピング：Ｖｙｄａｃ ２１８ＭＳ５２ Ｃ１８カラム（２．１ｘ２５０ｍｍ）；５５℃；０〜３２％ ＣＨ３ＣＮ（０．０５％ＴＦＡ）６０分；０．２ｍＬ／分、２１５／２８０ｎｍｗ／ダイオード−アレイおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｇ１９４６Ａ ＭＳ検出器（ＭＳＤ）ｗ／ｓｏｕｒｃｅで検出。より小さなサンプル（５０−３００μｇ）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６ＤＧゲルカラムを用いて前記手順のセミミクロバージョンにより行った。
【００５２】
現行のペプチドマッピング法は、典型的にはシステインジスルフィド架橋のＤＴＴ還元、続いて結果として得られるシステインのＳ−カルボキシメチル化（還元／アルキル化）を利用する。このアンホールディング（変性）工程は、タンパク分解（消化）を成功させるためにしばしば必要とされる。しかしながら、ほとんどのタンパク質における酸化「半システイン」（架橋）と対照的に、ｈＩＬ−１８における４つのシステイン残基はすでに還元されている。従って、本発明者らは、より一般的な還元／アルキル化手順と置換するために、我々のペプチドマッピング法において直接Ｓ−カルボキシメチル化を行った。Ｓ−カルボキシメチル化ＩＬ−１８（４×ＣＭ−Ｃｙｓ）の定量的収率は、エレクトロスプレーイオン化ＬＣ／ＭＳにより判明した（ＭＷ１４４９Ｄａ（理論値）、１８４５３Ｄａ（測定値））。これは、直接アルキル化の有効性の良好な証拠であり、４モル当量の未反応システインチオールの存在を裏付ける。直接アルキル化の利点は、通常の還元／アルキル化法により失われるＩＬ−１８におけるシステインの「化学的一体性」についての情報を保存することである。例えば、システインの直接カルボキシメチル化を含むこのペプチドマッピング法により、システイン残基でのＰＥＧ化だけでなく、システインジスルフィドを形成する少量のシステインの空気酸化も検出することができる。
【００５３】
トリプシン消化の結果、２０の予想されるペプチドフラグメントが生成され（以下の表２参照）、各ペプチドフラグメントは、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳにより分離し、同定することができる（図１２）。ペプチドマップ法は、ＰＥＧ化の部位、すなわち、ポリエチレングリコール分子が結合しているアミノ酸を同定するために使用される。図１２は、モノＰＥＧ（２０Ｋ）ヒト野生型ＩＬ−８対未修飾ヒト野生型ＩＬ−１８対照のトリプシンマッピングの「ミラープロット」比較を示す。それぞれシステイン３８、６８、７６、および１２７に対応する４つのシステイン含有トリプシンペプチド、（１４−３９）、（６８−７０）、（７１−７９）、および（１１３−１２９）を対照について標識する。モノＰＥＧヒトＩＬ−１８のトリプシンマップにおける（１４−３９）ピークの対照に対してピーク面積における大幅な減少は、システイン３８での大きなＰＥＧ化を示す（約９０％）。「ＰＥＧ−Ｃｙｓ３８（１４−３９）」と表示される後に溶出するピークを単離し、Ｎ末端配列決定により９０％ＰＥＧ−Ｃｙｓ３８（１４−３９）および１０％ＰＥＧ−Ｃｙｓ６８（６８−７０）を含有することが判明した（図１２）。２１５ｎｍで検出を行った。この結果、モノＰＥＧ化ヒトＩＬ−１８はシステイン３８位により主にＰＥＧ化されたことがわかる。このタンパク質においてはほかに利用可能な３つの遊離システインが存在する事実から、この結果は驚くべきことであり、予想外である。
【表３】
【００５４】
ｄ．精製されたモノＰＥＧ化野生型ヒトＩＬ−１８のトリプシンマッピング
モノＰＥＧ化野生型ｈＩＬ−１８産物の図１４におけるトリプシンマップデータは、５６分に溶出する１４−３９ペプチドピークについて相対的ピーク面積対対照における減少に基づいて、それぞれほぼ６５および３５±５モル％の程度までの排他的に溶媒の影響を受けやすいシステイン３８および６８でのＰＥＧ化を示す。マップにおける７１−７９および１１３−１２９トリプシンペプチドの定量的回収により証明されるように、埋め込まれたシステイン７６および１２７で検出可能なＰＥＧ化は起こらなかった。これらの結果は、後に溶出する疎水性ピーク含有ＰＥＧ化ペプチドプールが同時に出現する、モノＰＥＧ化ｈＩＬ−１８マップ対非ＰＥＧ化ｈＩＬ−１８対照マップにおけるシステイン含有トリプシンペプチドの相対的ピーク面積において観察される減少、またはその喪失に基づく。システイン３８および６８上のＰＥＧの約６５〜３５モル％分布は、さらにＬＣ／ＭＣ／ＭＳ−ＭＳデータからの抽出されたイオン電流トレースにより確認した。
【００５５】
ｅ．精製されたモノＰＥＧ化ヒトＩＬ−１８Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号７）およびＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号８）ムテインから得られるＰＥＧ化トリプシンペプチドのＮ−末端配列
ＲＰ−ＨＰＬＣトリプシンマップにおける非ＰＥＧ化ペプチドのピーク面積における対照に対する差によりＰＥＧ化の部位および程度を決定することに加えて、本発明者らはタンパク質から放出されるＰＥＧ化ペプチドフラグメントの直接分析も行った。ＰＥＧ化ペプチドに関するこのような直接的データは、非ＰＥＧ化ペプチドについてのピーク面積における差から得られる相補的間接的証拠に対する「質量バランス」により関連づけられる。先に記載したように、これらの異なるＰＥＧ化ペプチドはすべてＲＰ−ＨＰＬＣトリプシンマップにおいて、ＰＥＧ化ペプチド種の未分割のプールを含有する単一の後で溶出するピークとして同時に溶出する。ＰＥＧ化ペプチドはイオントラップまたは四極子質量分析器でのオンラインエレクトロスプレー質量分析の影響を受けにくいので、本発明者らはＲＰ−ＨＰＬＣトリプシンマップから集められたＰＥＧ化ペプチドのプールを分析するためにミクロ化学ＥｄｍａｎＮ末端シーケンシングを利用した。
【００５６】
モノＰＥＧ２０ｋｈＩＬ−１８Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号７）についての単離されたＲＰ−ＨＰＬＣの後で溶出するピーク（ＰＥＧ化ペプチドプール）のＥｄｍａｎＮ末端シーケンシングデータは、表面ループシステイン１４４で９８．３モル％ＰＥＧ、部分的に埋め込まれたシステイン１２７で１．３モル％ＰＥＧを示した。モノＰＥＧ２０ｋｈＩＬ−１８Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号８）ＰＥＧ化トリプシンプールのＥｄｍａｎシーケンシングはＣ末端溶媒暴露システイン１５７で＞９９．５モル％ＰＥＧを示し、部分的に埋め込まれたシステイン１２７または他のさらなる部位で検出可能なＰＥＧはなかった。
【００５７】
従って、ＰＥＧ２０ｋｈＩＬ−１８Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号７）について、シーケンシングデータにより、システイン１４４での所望のＰＥＧ化に加えて、部分的に埋め込まれたシステイン１２７での約１〜２％の競合するＰＥＧ化が明らかになる。一方、システイン１２７、または他のどのような部位でも、このような競合ＰＥＧ化はモノＰＥＧ２０ｋｈＩＬ−１８Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号８）で検出可能でない。これらのシーケンシングデータは、残基１４４に対して残基１５７での若干求核性（反応性）の高いシステインと一致する。内部ループシステイン１４４に対する折りたたまれたタンパク質におけるＣ末端システイン１５７のＰＥＧ化に対する若干有利な反応性は、おそらくはこの残基の若干高い溶媒の影響を受けやすさ、および／または熱易動性、異なる局所静電環境、およびチオールの高い酸性の組み合わせを反映するであろう。
【００５８】
ｆ．ヒトＩＬ−１８置換突然変異体（Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号９）およびＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号１０）置換突然変異体）および精製されたモノＰＥＧ化置換突然変異体のトリプシンマッピング
トリプシンマッピングデータ（図１３および１５）は、ヒトＩＬ−１８置換突然変異体Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号９）およびＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号１０）およびそれぞれの精製されたモノＰＥＧ化結合体の予想される化学構造を裏付ける。ＲＰ−ＨＰＬＣデータは、それぞれ残基１４４および１５７での操作された表面システインでの＞９５％部位特異性定量的ＰＥＧ化と一致する。そして、残基７６および１２７での埋め込まれたシステインを含有するカルボキシメチル化トリプシンペプチドは、野生型ヒトＩＬ−１８標準の対照トリプシンマップに対してほぼ定量的収率で回収され、事実上他の顕著な化学的修飾（副反応）は最終生成物において観察されなかった。
【００５９】
実施例５：アフィニティー測定（ＩＬ−１８Ｒα鎖およびＩＬ−１８ＢＰに対するＩＬ−１８結合の速度分析）
ヒトＩＬ−１８の生物学的効果は、その細胞表面レセプターとの結合に関連し、おそらくは天然の拮抗物質、ＩＬ−１８ＢＰに対するその結合による。ＩＬ−１８の結合検定およびレセプターのアルファ鎖、またはＩＬ−１８ＢＰの何れかは、ＢＩＡｃｏｒｅ装置、表面プラスモン共鳴ベースのバイオセンサーを用いて開発された。この技術は、センサーチップ上の１つの生体分子を固定化し、リアルタイムで溶液中の第二の成分とのその相互作用をモニターすることを含む。
【００６０】
ＩＬ−１８置換突然変異体は、レセプターについて親和性が減少した（６〜１６倍）。しかしながら、ＩＬ−１８ＢＰに対する結合親和力は影響を受けなかった。対照的に、レセプター（１３−１１４倍）およびＩＬ−１８ＢＰ（１０−１７６倍）の両方に関して親和力が著しく減少した（表３）。
【表４】
【００６１】
実施例６：ＮＦ−κＢシグナリング
ＩＬ−１８の効果は、αおよびβ鎖からなるヘテロダイマー表面レセプターとの結合により媒介される。α鎖は単独でＩＬ−１８と結合するが、両サブユニットは、細胞内シグナリング経路を活性化し、標的細胞上のＩＬ−１８の生物学的効果を媒介することができる機能的高親和性ＩＬ−１８レセプターを形成するために必要である。転写因子ＮＦ−κＢはＩＬ−１８の免疫調節効果の重要なメディエーターである。ＩＬ−１８レセプターシグナリングは、ＩＫＫタンパク質キナーゼの活性化を誘発し、これは次にＮＦ−κＢ阻害剤ＩκＢαをリン酸化する。リン酸化ＩκＢαは分解し、核へ転位し、遺伝子転写を活性化する遊離ＮＦ−κＢを放出させる。多ＩＬ−１８ムテインをこの検定において評価した。これらの研究から、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号７）、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ Ｌ１４４Ｃ（配列番号９）、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号８）、およびＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号１０）を含有するＩＬ−１８ムテインが最も有効であると確認された。
【００６２】
表４におけるデータは、いくつかの異なる分子に関するＮＦ−κＢ生物検定からの結果をまとめたものである。天然のＩＬ−１８（配列番号１）に対して、ＩＬ−１８置換突然変異体、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号７）およびＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号８）は効力がおよそ１０倍減少していた。効力におけるさらなる減少がＰＥＧ化分子において見られた。一般に、２０Ｋおよび３０Ｋ ＰＥＧムテインは４０ＰＥＧバージョンよりもさらに有効であった。
【表５】
【００６３】
実施例７：ヒトＰＥＧ ＩＬ−１８のネズミ薬力学（ＰＤ）データ（ＩＦＮγ誘発）
ＢＡＬＢ／ｃをネズミＩＬ−１８を１回注射することにより治療すると、サイトカイン産生が増大した。最大の増加は、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦに関して見いだされた。ＩＦＮγ応答は非常に迅速で大規模であるので、このバイオマーカーはＰＥＧ化ＩＬ−１８の効力を天然のＩＬ−１８分子と比較するために使用した。ヒトＩＬ−１８（配列番号１）およびＰＥＧ化ヒトＩＬ−１８（配列番号１）をＳＣ注射により１０または１００μｇの投与量で投与した。治療後２、４、６、８、１２および１６時間に血清を集め、ＩＦＮγ産生に関して分析した。等モル量のＰＥＧ化ＩＬ−１８は非ＰＥＧ化ＩＬ−１８よりも高いＩＦＮγの循環レベルを誘発した。ＰＥＧ化ＩＬ−１８のＩＦＮγのピークレベルは、４〜１６時間の間に見いだされるが、非ＰＥＧ化ＩＬ−１８は２〜４時間の間にピークを生じさせた。ＩＬ−１８α鎖レセプターについての親和性の減少（表３に示すとおり）、
またはＮＦ−κＢ細胞ベースの検定における活性の低下（表４に示すとおり）にもかかわらず、ＰＥＧ化ヒトＩＬ−１８（配列番号１）は、ＩＬ−１８分子の重要なＰＤマーカーであるＩＦＮγにおいて増大を示した（表５）。
【表６】
【００６４】
実施例８：ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８（配列番号１）のＮＫ細胞毒性（エクスビボネズミ系）
ＩＬ−１８は、ＮＫ細胞を活性化するＴｈ１−優性サイトカインである。この研究において、本発明者らはヒトＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８（配列番号１）に反応するＮＫ細胞毒性を測定することを目的とした。この検定は、抗腫瘍活性の直接滴尺度である。
ネズミＹＡＣ−１細胞（ＮＫ感受性Ｔ細胞リンパ腫）を標的として、また処置された動物からのＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞をエフェクターとして用いるヨーロピウム放出検定によりＮＫ細胞活性を測定した。マウスにヒトＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８（等モル）濃度を１回注射した。マウスを処置後１８〜２４時間に屠殺した。処置された動物（および対照）からの脾臓細胞をヨーロピウム標識されたＹＡＣ−１標的細胞と組み合わせ、ヨーロピウム放出について測定した。
【００６５】
ＰＥＧ化ＩＬ−１８はマウスにおいてＮＫ細胞毒性を誘発した（表６）。全てのヒトＰＥＧ化ＩＬ−１８形はＮＫ細胞毒性を誘発する能力を示した（データは省略）。２０Ｋ ＰＥＧ化ＩＬ−１８は、試験した全てのエフェクター：標的比で非ＰＥＧ化ＩＬ−１８よりも良好な活性を示した（表６）。ここでも、ＩＬ−１８−α鎖レセプターについての親和性の減少（表３に示すとおり）またはＮＦ−κＢ細胞ベースの検定における活性の減少（表４に示すとおり）にもかかわらず、ＰＥＧ化はＩＬ−１８依存性インビボＮＫ活性化を軽減も、排除もしなかった。
【表７】
【００６６】
実施例９：ＩＬ−１８結合タンパク質との複合体形成
ＩＧＥＮ系を用いてＩＬ−１８（配列番号１）とＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）間の複合体を検出するためのイムノアッセイを開発した。この検定は、ヒトＩＬ−１８に対して非中和ｍＡｂ（１６Ｄ１０ｍＡｂ、ルテニウム結合）およびヒトＩＬ−１８ＢＰに対して非ブロッキングｍＡｂ（ｍＡｂ３６、ビオチニル化）を使用する。１２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１８ＢＰを１２５ｎｇ／ｍｌの非ＰＥＧ化ＩＬ−１８またはＰＥＧ化ＩＬ−１８と組み合わせた。
ＰＥＧ化ＩＬ−１８分子はＩＬ−１８ＢＰと複合体形成する能力が低下し（表７）、これは複合体を形成する非ＰＥＧ化ＩＬ−１８と対照的である。
【表８】
【００６７】
実施例１０：ＰＥＧ ＩＬ−１８およびその置換突然変異体についてのサルの薬力学（ＰＤ）および薬物動力学（ＰＫ）データ
ＰＥＧ化ＩＬ−１８および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８に応答して、ＰＤマーカーをカニクイザルにおいて評価した。カニクイザル（１群あたり３匹のオス）に、１ｍｇ／ｋｇの非ＰＥＧ化ＩＬ−１８またはＰＥＧ化ＩＬ−１８のいずれかを静脈内注射を１回した。投薬前、および投薬後１０日期間にわたって複数の時点で血液サンプルを集めた。血漿を薬剤およびネオプテリン濃度について分析し；白血球を次いでＣＤ６４マーカーの発現についてフローサイトメトリーにより分析した。
【００６８】
ａ．サル薬力学（ＰＤ）
カニクイザル白血球をＣＤ６４平均蛍光強度（ＭＦＩ）における変化について評価した。ＰＥＧ化ＩＬ−１８および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８は投薬後１から３日の間にＣＤ６４発現を増大させた。全白血球上の高いＣＤ６４発現は３日に極大になり、１０日まで存続した。白血球ＣＤ６４ＭＦＩは、投薬後のどの時点でも非ＰＥＧ化ＩＬ−１８と比較してＰＥＧ化ＩＬ−１８に対する応答が高かった（２倍まで）。全白血球において、ＣＤ６４ＭＦＩは非ＰＥＧ化ＩＬ−１８よりもＰＥＧ化ＩＬ−１８について統計的に有意に高かった。
ＰＥＧ化ＩＬ−１８および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８は、投薬後１から４日の間にネオプテリン産生を誘発し、ピーク反応は２４または４８時間であった。折りたたみの誘発およびネオプテリンの群平均濃度は、一般に、非ＰＥＧ化ＩＬ−１８に対してよりも（２日に１３μ／ｍｌ）ＰＥＧ化ＩＬ−１８に対して（２日に１５〜２１μｇ／ｍｌ）の方が高かった（表９）。しかしながら、差は統計的有意に達しなかった。
【００６９】
白血球上のＣＤ６４マーカーは非ＰＥＧ化ＩＬ−１８と比較して、ＰＥＧ化ＩＬ−１８に対する発現において著しく増大した。このマーカーは、骨髄系、単球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、および好中球の細胞上で発現される。これらの細胞は、ＩＬ−１８誘発免疫応答において重要な役割を果たし、従ってＰＥＧ化ＩＬ−１８活性の関連する尺度である。ネオプテリンの誘発は統計的に有意でないが、発現における増大は、ＰＥＧ化ＩＬ−１８が非ＰＥＧ化ＩＬ−１８よりもインビボで有利であることを支持する。
【表９】
【表１０】
【００７０】
ｇ：サル薬物動力学（ＰＫ）
カニクイザルにおけるＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ヒトＩＬ−１８についてのＰＫデータを表１０に示す。０〜８時間の間のＰＥＧ化ＩＬ−１８についてのグラフ下の面積（ＡＵＣ）は、全３３６時間の非ＰＥＧ化ＩＬ−１８のＡＵＣよりも約７倍大きかった。ＰＥＧ化ＩＬ−１８について、０〜８時間の見かけのｔ１／２は約０．５時間であるが、非ＰＥＧ化ＩＬ−１８初期相（全ＡＵＳの約４３％）のｔ１／２は約７分であった。ＰＥＧ化ＩＬ−１８のＣｍａｘ値は、非ＰＥＧ化ＩＬ−１８のＣｍａｘ値よりも約４倍高く、血漿区画中へまず分布する薬剤と一致した。
【表１１】
【００７１】
本明細書において言及される、これらに限定されないが特許および特許出願をはじめとする全ての開示は、個々の開示が具体的かつ個別に記載されているかのように本発明の一部として参照される。
先の記載事項は、その別の実施形態を含む本発明を完全に開示する。本明細書において具体的に開示されている実施形態の変更および改善は以下の請求の範囲内に含まれる。さらに努力することなく、当業者は前記載事項を用いて本発明を最大限利用することができる。従って、本明細書において記載されている実施例は単に例示的であって、本発明の範囲を何ら制限するものではないと解釈されるべきである。本発明の排他的特性または優先権が主張されている実施形態は次のように定義される。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、先の仮米国特許出願番号６０／４６２９４７（２００３年４月１５日提出）（その内容は全体として本発明の一部として参照される）の利点を請求する。
【０００２】
本発明は、部位特異性タンパク質結合の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、水溶性ポリマーのヒトインターロイキン−１８（本明細書においては「ＩＬ−１８」）ポリペプチドの結合、その置換突然変異体、およびそのフラグメントに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
生物学的に活性な化合物の水溶性ポリマーに対する共有結合は、これらの化合物の生体内分布、薬物動力学、そしてしばしば毒性を変更し、制御するための一方法である（非特許文献１）。例えばポリ（シアル酸）、デキストラン、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＰＨＰＭＡ）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（エチレングリコール−コープロピレングリコール）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン（ＰＡｃＭ）、およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などの多くの水溶性ポリマーがこれらの効果を達成するために用いられてきた（非特許文献２）。ＰＥＧは：非常に低い毒性（非特許文献３）、水性溶液中の優れた溶解性（非特許文献２、前出）、低い免疫原性および抗原性（非特許文献４）の理想的な組み合わせを有する。１つまたは複数のポリエチレングリコール鎖をタンパク質上に含有するＰＥＧ結合または「ＰＥＧ化」タンパク質治療薬が科学文献に記載されている（非特許文献５；非特許文献６）。非特許文献７；非特許文献８に記載されており、非特許文献９にも記載されている。
【０００４】
結合タンパク質は、その未修飾カウンターパートよりも多くの利点を有する。例えば、ＰＥＧ−修飾は、多くのタンパク質の血漿半減期を延長する（非特許文献１０）。この増大の基本は、いくつかの要因を含む。ＰＥＧ修飾結合体のサイズが増大すると、７０ｋＤ閾値を越える場合、糸球体濾過が減少する（非特許文献１１）。炭水化物レセプターおよびタンパク質レセプター相互作用により網膜内皮系によるクリアランスが減少する（非特許文献１２）。減少したタンパク質分解（非特許文献１３）も半減期の向上に寄与する。抗原性および免疫原性も減少し（非特許文献１４）、これは繰り返し投薬した後の生命を脅かす反応を軽減する。これらのファクター全ての組み合わせは、インビボでの増大した生体利用性につながり（非特許文献１５；非特許文献１６）、これはＰＥＧ−サイトカイン付加物の薬剤としての使用において潜在的に非常に重要である。用量を減少させることができ（毒性を軽減するために）、さらに好都合な投与計画を開発することができる。
【０００５】
ＩＬ−１８は、ＩＬ−１β−三葉型サブファミリーのＩＬ−１αに最も密接に関連する一次構造を有する１８Ｋｄの非グリコシル化モノマーである。ネズミおよびヒトＩＬ−１８ ｃＤＮＡはそれぞれ１９２および１９３アミノ酸からなる前駆体タンパク質をエンコードする。ヒトおよびネズミＩＬ−１８間の相同性は６５％である。生物学的活性を仲介するために、Ｐｒｏ−ＩＬ−１８はカスパーゼ、例えばＩＣＥ（カスパーゼ−１）またはカスパーゼ−４により処理して生物活性な成熟タンパク質（１５７アミノ酸）にすることを必要とする。ＩＬ−１８の活性は、ＩＬ−１８レセプター（ＩＬ−１８Ｒ）複合体（結合鎖（ＩＬ−１８Ｒα）およびシグナリング鎖（ＩＬ−１８Ｒβ）から構成される）により仲介される。その腫瘍免疫療法についての治療可能性を支持するＩＬ−１８の生物学的活性は、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦの誘発および産生、ＮＫ細胞の細胞溶解活性の向上および促進、およびナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化を包含する。ＩＬ−１８に反応して、潜在的な抗腫瘍活性を示す細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）およびメモリー細胞が産生される。他の調節機能は、ＮＫおよびＴ細胞上の機能的Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）発現の増加調節（ＩＬ−１８抗腫瘍活性が腫瘍アポトーシスを包含するＦａｓ−ＦａｓＬ相互作用により一部媒介されることを示唆する）；単球／マクロファージ、Ｂ細胞、および抗血管形成の活性化を包含する。
【０００６】
ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は、最近ＩＬ−１８の拮抗物質として記載されている天然に存在する可溶性循環タンパク質である。ＩＬ−１８ＢＰは、ＩＩ型ＩＬ−１レセプターの第三のＩｇドメインに対して非常に限定された相同性しか有さない１つの推定Ｉｇドメインを含有する点で、いずれかのＩＬ−１８レセプターに対して顕著な相同性を有さない。ＩＬ−１８ＢＰに対するさらに高い相同性がいくつかのポックスウイルス（豚痘、牛痘、天然痘、伝染性軟属腫、および欠肢症）によりエンコードされるタンパク質のファミリーにおいて見いだすことができる。ポックスウイルスは、多くのサイトカインのデコイレセプターをエンコードし、これらのレセプターは免疫応答のウイルスによる回避において役に立つ。ＩＬ−１８はＴｈ１細胞によるＩＦＮγ産生につながる初期シグナルの１つであるので、ＩＬ−１８ＢＰによるＩＬ−１８活性のブロックは、免疫応答の初期の１つの減少調節に関与する。ＩＬ−１８ＢＰの高いレベルは、組み換えＩＬ−１８療法の有効性に関して有害であり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｕｎｃａｎ、Ｒ．およびＫｏｐｅｃｅｋ、Ｊ．（１９８４）Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．５７：５３−１０１
【非特許文献２】Ｐｏｗｅｌｌ、Ｇ．Ｍ．（１９８０）Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ．Ｉｎ Ｒ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ（編）ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＷＡＴＥＲ ＳＯＬＵＢＬＥ ＧＵＭＳ ＡＮＤ ＲＥＳＩＮＳ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第１８章
【非特許文献３】Ｐａｎｇ、Ｓ．Ｎ．Ｊ．（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１２：４２９−４５６
【非特許文献４】Ｄｒｅｂｏｒｇ、Ｓ．およびＡｋｅｒｂｌｏｍ、Ｅ．Ｂ．（１９９０）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．６：３１５−３６５
【非特許文献５】Ｃｌａｒｋ、Ｒ．ら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１９６９−２１９７７
【非特許文献６】Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ、Ｍ．Ｓ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＰＥＧ−ＡＤＡ）
【非特許文献７】Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ． Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ.Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、ｐ１４５−１５４
【非特許文献８】Ｏｌｓｏｎ、Ｋ．ら（１９９７）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｙｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ
【非特許文献９】Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、ｐ１７０−１８１
【非特許文献１０】Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｇ．Ｅ．、ｅｔら（１９９２）ＰＥＧ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎ：ＳＴＡＢＩＬＩＴＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ：ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＡＴＨＷＡＹＳ ＯＦ ＤＥＧＲＡＤＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ ＦＯＲ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ（Ｔ．Ｊ．Ａｈｅｒｎおよびｄ Ｍ．Ｍａｎｎｉｎｇ編）．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
【非特許文献１１】Ｆｕｔｅｒｔｇｅｓ、Ｆ．およびＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ、Ａ．（１９９０）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１：１３９−１４８
【非特許文献１２】Ｂｅａｕｃｈａｍｐ、Ｃ．Ｏ．ら（１９８３）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５−３３
【非特許文献１３】Ｃｈｉｕ、Ｈ．Ｃ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｃｏｍｐ． Ｐｏｌｙｍ．９：３８８−４１０
【非特許文献１４】Ｎｕｃｃｉ、Ｍ．Ｌ．ら（１９９１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．６：１３３−１５１
【非特許文献１５】Ｋａｔｒｅ、Ｎ．Ｖ．ら（１９８７）ＰＮＡＳ ＵＳＡ８４：１４８７−１４９１
【非特許文献１６】Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ、Ｍ．Ｓ．ら（１９８７）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３１６：５８９−５９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
１つの薬剤として、ネズミＩＬ−１８の組み換え形態はネズミ免疫系を刺激し、その結果、腫瘍の部分的および完全な退縮および／または様々な確立された腫瘍モデルにおける免疫学的記憶の導入が起こる。臨床で通常用いられる化学療法剤、例えば、トポテカンとの組み合わせにおいて、ネズミＩＬ−１８は相乗効果を示し、その結果、様々な確立された腫瘍モデルにおいて局所および／または全身的レベルで効力が改善される。ＩＬ−１８のネズミＩＬ−１８およびヒトＩＬ−１８組み換え形の両方の広範囲の毒性および薬物動力学研究に加えて、ＩＬ−１８により媒介される免疫活性化の早期事象と相互に関連させるために、ＩＬ−１８活性の有効なバイオマーカーが発明された。これらの前臨床データは、免疫療法の新規形態、または癌ワクチンの添加物、またはそれぞれトポテカンおよびＩＬ−２などの細胞毒性剤および他の生物学的製剤に対するアジュバントとしての、異なる種類の癌にかかっている患者を治療するためのヒトＩＬ−１８の臨床的開発を支持する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において、本発明は、水溶性ポリマーと結合したＩＬ−１８ポリペプチドを含む生物学的に活性な組成物に関し、ここにおいて、前記ポリペプチドはヒトＩＬ−１８、その置換突然変異体、またはそのフラグメントである。
第二の態様において、本発明は、治療的に有効な量の、水溶性ポリマーに共有結合したＩＬ−１８ポリペプチド生物学的に活性な組成物を投与することにより、患者における癌を治療する方法に関し、ここにおいて、前記ポリペプチドはヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体である。もう一つ別の態様において、本発明は：腎臓細胞癌、黒色腫、他のＩＬ−１８反応性腫瘍タイプ（例えば、骨髄腫およびリンパ腫）、および黒色腫からなる群から選択される免疫反応性腫瘍を治療するための方法に関する。
【００１０】
第三の態様において、本発明は、生物学的に活性な組成物を調製する方法であって：
（ａ）ヒトＩＬ−１８ポリペプチドまたはその置換変異体を得る工程；および
（ｂ）前記ポリペプチドを官能化水溶性ポリマーと接触させる工程を含む方法に関する。
第四の態様において、本発明は、ヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体の薬物動力学および薬力学を改善する方法であって、ヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体を水溶性ポリマーと結合させる工程を含む方法に関する。
第五の態様において、本発明はヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体の皮下生体利用性を改善する方法であって、ヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体を水溶性ポリマーと結合させる工程を含む方法に関する。
第六の態様において、本発明はヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体の結合（相互作用）を軽減する方法であって、ヒトＩＬ−１８またはその置換突然変異体を水溶性ポリマーと結合させてヒトＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）にする工程を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】天然のヒトＩＬ−１８のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図２】ネズミＩＬ−１８のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】ヒトＨｉｓ Ｐｒｏ ＩＬ−１８のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図５】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｎ７８Ｃのアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図６】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｅ１２１Ｃのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図７】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｌ１４４Ｃのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図８】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｄ１５７Ｃのアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図９】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｌ１４４Ｃのアミノ酸配列（配列番号９）を示す。
【図１０】置換突然変異体、ヒトＩＬ−１８ Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃのアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図１１】ヒトＩＬ−１８置換突然変異体（Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃ）（配列番号１０）のＰＥＧ化後の反応混合物の典型的なＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１２】表２に示されるペプチドの標識されたピークを示す野生型ヒトＩＬ−１８のＲＰ−ＨＰＬＣトリプシンマップを示す。ペプチドは、エレクトロスプレー−イオン化ＬＣ／ＭＳにより同定した。２１５および２８０ｎｍでの検出。
【図１３】ヒト置換突然変異体Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号９）のトリプシンマッピングを示す。
【図１４】ヒトＩＬ−１８（配列番号１）および精製されたモノＰＥＧ化（２０Ｋ）生成物のトリプシンマッピングを示す。
【図１５】モノＰＥＧ２０ｋヒトＩＬ−１８置換突然変異体Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号１０）のトリプシンマッピングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ヒトＩＬ−１８ポリペプチドを含む組成物を提供し、ここにおいて、該ポリペプチドは水溶性ポリマーに結合している。本発明の結合したポリペプチドは、対応する未結合ポリペプチドと比較して予想外の生物学的性質を示す。
免疫療法は腫瘍学治療手段に、副作用が減少した抗腫瘍効果を示し、患者の生活の質を改善する可能性という有益な相加である。インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は現在、腎臓細胞癌および黒色腫の腫瘍免疫療法の新規形態として研究されている。これらの腫瘍タイプはどちらも免疫感受性であると考えられ、単一の薬剤としてＩＬ−１８に反応する。ＩＬ−１８と細胞毒性剤および他の生物学的製剤の組み合わせは、ＩＬ−１８の臨床用途を異なるタイプの血液学的および充実性腫瘍に拡大する。
【００１３】
ＰＥＧ化されたＩＬ−１８分子は、１〜５のアミノ酸置換を含有し得るＩＬ−１８の変異体である。これらの分子は、改善された薬物動力学（ＰＫ）を有するが、最も重要なことには、異なるサイトカインおよび可溶性タンパク質の誘発および発現で測定すると増大した薬物動力学的（ＰＤ）マーカーを有する。「薬物動力学」なる用語は、本明細書において用いられる場合、薬剤吸収、分散および排出（すなわち、代謝および排出）の速度を意味する。「薬力学」なる用語は本明細書において用いられる場合、作用部位（ＩＬ−１８の場合、レセプター）および薬理学的応答の部位での薬剤濃度間の関係を意味する。重要なＰＤマーカーは、変化、例えば細胞（例えばリンパ球）および細胞表面マーカーの表現型特性における向上および／または増大を包含する。ＰＥＧ化されたＩＬ−１８分子は、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）と複合体を形成する能力が低下していた。ＩＬ−１８ＢＰはＩＬ−１８活性の潜在的阻害剤であり得るので、ＩＬ−１８ＢＰとの複合体形成の防止は、臨床において有用である。Ｂｕｆｌｅｒら、ＰＮＡＳ、９９（２１）：１３７２３−１３７２８（２００２）。ＰＥＧ化されたＩＬ−１８分子は投与頻度を減らして投与することができ、このことは、他の生物学的製剤、ワクチンまたは細胞毒性剤との組み合わせ療法において非常に有用である。最も重要なことには、ＰＥＧ化は治療される患者における免疫原性を低下または排除することができる。
【００１４】
前記利点の数例を以下の実施例７、８、９および１０において示す。３つの突然変異（Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃ）（配列番号１０）およびＣ末端システム残基（Ｃ１５７位）に共有結合した１つの部位特異性２０Ｋ ＰＥＧを含有するＩＬ−１８置換突然変異体は向上したＰＫを示すが、最も重要なことには、カニクイザルにおけるＣＥＤ６４およびネオプテリンの誘発および発現、およびマウスにおけるＩＦＮγの誘発により測定されるように増大したＰＤマーカーを示す。投薬の頻度を減らして等しい抗腫瘍効果および保留された免疫学的メモリーを得る例を、ネズミＰＥＧ化ＩＬ−１８を用いることによりネズミ腫瘍モデルＭＯＰＣ−３１５において行った（データは省略）。
【００１５】
本発明において有用な他の修飾されたポリペプチドは、成熟（すなわち未修飾）ヒトＩＬ−１８タンパク質の生物学的活性を共有するこれらのタンパク質の変異体またはフラグメントである。本明細書において定義されるように、このような変異体は、タンパク質の既知アミノ酸配列における変更によっても特徴づけられる修飾されたタンパク質含む。このような変異体は、８以下のアミノ酸残基、好ましくは５以下の残基により成熟タンパク質と異なるアミノ酸配列を有することにより特徴づけられる。本発明の一実施形態において、タンパク質のアミノ酸配列における差異は、保存アミノ酸置換のみを含む。保存アミノ酸置換は、アミノ酸が置換されるアミノ酸と実質的に同じ電荷を有し、この置換がタンパク質の局所的構造またはその生物学的活性に顕著な影響を及ぼさない場合に起こる。あるいは、タンパク質の安定性を変更し得るか、または所望の宿主細胞における発現を許容する配列におけるあるアミノ酸の導入などの変化が好ましい。さらに、タンパク質構造および機能において実質的な変化がない第一アミノ酸配列におけるバリエーションは当該分野において公知である。このようなバリエーションは、当業者により用いられるアルゴリズムにより容易に検出され、予測される。例えば、周知のＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／参照）は、問題となる配列の残基での許容されるアミノ酸置換を予想し、評価するために、アミノ酸置換マトリックスを使用する。従って、当業者らは、所定のポリペプチド配列の同じ実施形態を記載するために用いられる場合の「変異体」なる用語の範囲および意味を理解する。「置換突然変異体」なる用語は、本明細書において用いられる場合、アミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されているタンパク質を意味する。ヒトＩＬ−１８「置換突然変異体」は本明細書において用いられる場合、配列番号１の配列において１〜５のアミノ酸置換を含む突然変異体を意味し、前記置換は、残基３８でのシステイン、残基６８でのシステイン、残基７６でのシステイン、残基７８でのアスパラギン、残基１２１でのグルタミン酸、残基１２７でのシステイン、残基１４４でのロイシン、残基１５７でのアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基である。
【００１６】
システインは、２０の一般的なアミノ酸のうち明らかに最も化学的に反応性である。システイン残基は、ジスルフィド架橋、活性部位化学反応、金属イオン配位、酸化窒素（ＮＯ）結合等を包含するタンパク質構造および機能において重要な役割を果たす。したがって、システインはゲノムにおいて最も強力な配列保存アミノ酸である。ヒトＩＬ−１８は、明らかな構造的または他の生物学的機能を有さない４つのシステインスルフヒドリルを含有する。システイン３８および６８は多くの実験観察により示されるようにＩＬ−１８分子の表面上で溶媒に曝されている。これらの観察は：精製中の２−メルカプトエタノールとの混合ジスルフィド付加物（もちろん、ジチオトレイトールではない）、これらの２つのシステインの高度に選択性であるビオチニル化およびＰＥＧ化、およびその空気酸化を受け、より高いＩＬ−１８濃度で分子間ジスルフィド架橋した「ダイマー」に加えて３８−６８分子内ジスルフィド架橋を形成する傾向を包含する。これらのジスルフィド架橋反応は、ピリジルジスルフィド、グルタチオン、および他のチオール−ジスルフィド交換触媒により促進することができる。一方、システイン３８および６８と比較して、システイン７６および１２７は比較的化学的に不活性である。従って、システイン７６および１２７は溶媒に暴露されないが、ＩＬ−１ベータにおける２つの埋め込まれたシステインと同様に折りたたまれたＩＬ−１８分子内に埋め込まれ、ＩＬ−１ファミリーの他のメンバーと類似した配列の位置にある（Ｋｕｍａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：１０３０８（２０００）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：１１６９−１１７５（２０００））。
【００１７】
ＩＬ−１８における４つのシステインの性質および反応性は、β−三葉型サイトカイン、塩基性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）における４つのシステインに対して顕著な類似性を有する。ＦＧＦは、広く研究され、傷の治癒および他の治療適応症のために開発されたホモローガスなヘパリン結合タンパク質マイトジェンのファミリーである（Ｏｒｔｅｇａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：５８４２−５８４６（１９９１）；Ｔｓａｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１０：６４９−６５９（１９９３））。ｈＩＬ−１８およびｈＦＧＦ−２はどちらもβ三葉型タンパク質であり；両タンパク質は２つの溶媒に暴露されたシステインと２つの埋め込まれたシステインを含有し；どちらも多くのβ三葉型に特徴的な生理学的温度よりちょっと高い低融点を有し（Ｔｍ＝４０〜５０℃）、どちらのタンパク質も活性の急速なＰＤ／ＰＫクリアランスを示す。一人の発明者らにより指摘されるように（ＥｓｔａｐｅらＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３３５：３４３−３４９（１９９８）、「ｈＦＧＦ−２は周知のように不安定なタンパク質であることが知られている。」ＦＧＦ−１のインビボ半減期は、ポリアニオン性硫酸化多糖類であるヘパリンに対する特異的結合により１０倍も増大する。ＦＧＦの安定化に加えて、ヘパリンはＦＧＦのＦＧＦレセプターに対する結合において重要な役割を果たす（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、４０７：１０２９−１０３４ （２０００））。他のβ三葉型サイトカインが類似した「安定化リガンド」を有するかどうかはわからないが、Ｋｏｂａｔａおよび共同研究者らは最近、ＩＬ−１ベータの硫酸化多糖類との特異的結合相互作用に関して報告している（Ｔａｎｄａｉ−Ｈｉｒｕｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：４５９−４４６６（１９９９））。
【００１８】
ＦＧＦにおけるシステインは、天然のＦＧＦおよびシステイン−セリンムテインの両方に関する結晶学および生物物理学的技術によりよく研究されている。ｈＦＧＦ−２における２つの溶媒に暴露されたシステインの化学的修飾、または部位指向性突然変異誘発によるこれらのシステインの置換は、分子内および分子間ジスルフィド架橋を排除し、ＦＧＦマイトジェン活性の安定性を大きく増大させる（Ｓｅｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１５１：７０１−７０８（１９８８））。最近、研究者らは、ジスルフィド架橋を形成し、これにより不可逆的にタンパク質を不活化し、これらの有効なサイトカインのインビボ寿命を制限するために、ＦＧＦにおけるシステインは配列において正確に保存されることを提案している（Ｃｕｌａｊａｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９：７１５３−７１５８（２０００））。Ｃｕｌａｊａｙら（前出）は、システインスルフヒドリル化学反応を含むＩＬ−１８の同様のビルトイン調節メカニズムを示唆する予備インビトロデータを記載している。
【００１９】
緩衝化ｈＩＬ−１８溶液（０．１０Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）は、ＩＬ−１８の３８−６８分子内ジスルフィド架橋形態がまず蓄積し、その後、室温および５℃で一夜静置した後に３８−６８、７６−１２７二重架橋形態が出現する。データは、ＩＬ−１８の３８−６８分子内ジスルフィド架橋がまず蓄積し、続いて３８−６８、７６−１２７二重架橋形態が出現することを示す。これらの空気酸化反応の初期時間経過はその後のＡ→Ｂ→Ｃ型の連続反応、すなわち、３８−６８架橋したＩＬ−１８の蓄積とその後の３８−６８、７６−１２７二重架橋したＩＬ−１８への変換と一致する。反応生成物におけるジスルフィド対合は、トリプシンマッピングおよび単離されたピークの質量分析により決定した。初期３８−６８形態が室温よりも５℃でより安定であることは興味深い。この中間生成物の蓄積は５℃でずっと大きいが、ＩＬ−１８出発物質の還元速度は、２種の温度でほぼ等しい。これらの２種の温度で溶解した酸素の周囲濃度の起こり得る影響を排除すると、データは、３８−６８架橋形態は二重架橋生成物の点に関して熱的に不安定であることを示す。生成物はジチオトレイトール（ＤＴＴ）還元により出発物質に戻すことができる。
【００２０】
本発明のポリペプチドは、本発明において有用な成熟および／または修飾タンパク質のマルチマー形態、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーまたは他の凝集形態として存在することもできる。このようなマルチマー形態は、物理的会合、化学的合成または組み換え発現により調製することができ、以下に詳細に記載する合成技術および組み換え技術の組み合わせにより産生されるサイトカインを含有することができる。マルチマーは発現により自然に形成されるか、または以下に詳細に記載するような組み換え技術により形成される。マルチマーサイトカインは、同じ修飾されたサイトカインのマルチマーを含み得る。別のマルチマーは、異なる修飾タンパク質の凝集により形成することができる。さらに別のマルチマーは、本発明の修飾サイトカインおよび公知成熟サイトカインの凝集により形成することができる。好ましくは、本発明において有用なダイマーまたはマルチマーは少なくとも１つのデスアミノサイトカインタンパク質および少なくとも１つの他のサイトカインまたは同じ種類の生物学的活性を有することにより特徴づけられる他のタンパク質を含有する。この他のタンパク質はさらなるデスアミノサイトカインまたは別の公知タンパク質であってもよい。
【００２１】
本発明において有用な修飾サイトカインは、ヒトＩＬ−１８タンパク質（配列番号１）、その置換突然変異体、またはそのフラグメントである。本発明は従って、ヒトＩＬ−１８の生物学的活性を向上させる方法を提供する。本発明は自然にまたは組み換えにより産生されるヒトＩＬ−１８または本明細書に記載されるようなＩＬ−１８置換突然変異体を修飾し、水溶性ポリマーと共有結合するようにすることを含む。あるいは、サイトカイン分子のマルチマーを水溶性ポリマーと結合させることができる。これらの結合体は、結果として得られる組成物の生物学的活性をさらに向上させる。
【００２２】
本発明において有用なヒトＩＬ−１８、ヒトＩＬ−１８置換突然変異体、およびヒトＩＬ−１８フラグメントは、以下に記載されるいくつかの方法の任意のものにより調製することができる。これらのポリペプチド部分は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（（１９６４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９）の固相ペプチド合成技術により調製することができる。あるいは、当該分野において公知のペプチド合成の溶液法を成功裏に用いることができる。本発明のペプチドを産生するために、一般に、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ（１９８４）またはＭ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ、Ｙ．Ａ．Ｋｌａｕｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９７６）において記載されるペプチド合成の方法を用いることができる。
【００２３】
修飾されたヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、成熟ＩＬ−１８の適当な酵素での酵素消化により成熟ＩＬ−１８から誘導することができる（例えば、Ｏｒａｖｅｃｚ、Ｔ．ら、（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１８６５；Ｐｒｏｏｓｔ、Ｐ．ら、（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４３２：７３；Ｓｈｉｏｄａ、Ｔ．ら、（１９９８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ９５：６３３１；およびＷａｌｔｅｒ、Ｒ．ら、（１９８０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１１１参照）。さらに、ペプチド合成の間に修飾されたアミノ酸を成長するポリペプチド鎖中に組み入れることができる（Ｍ．Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ、Ｍ．ら、（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７１８５−７１８９；Ｆｅｌｉｘ、Ａ．Ｍ．（１９９７）Ｉｎ Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、ｐ２１８−２３８）。これらの修飾されたアミノ酸残基は、水溶性ポリマーの共有結合を促進するように選択することができる。また、変異体ポリペプチドを合成することができ、ここにおいて、アミノ酸付加、置換、または欠失がその後のポリマー結合を促進するために選択される。このような変異体ポリペプチドは、化学合成または組み換え発現により調製することができる。例えば、追加のシステイン残基を組み入れること（存在するシステインでない残基の置換あるいは一端または両端への付加のいずれかによる）は、スルフヒドリル基によるポリマーカップリングを促進するために望ましい（例えば、Ｋｕａｎ、Ｃ．Ｔ．ら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７６１０−７６１６；Ｃｈｉｌｋｏｔｉ、Ａ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：５０４−５０７）。
【００２４】
好ましくは、本発明において有用なヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、当業者に公知の他の技術、例えば遺伝子組み換え技術により産生することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｉｎ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）参照。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、哺乳動物、昆虫、および酵母細胞をはじめとする所望の微生物または細胞における選択されたタンパク質のクローニングおよび発現系は公知であり、私立および公立ライブラリーおよび預託機関および商業的供給元から入手可能である。
【００２５】
本発明の一実施形態において、本発明のヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、ＩＬ−１８の直接組み換え発現から産生される。例えば、ヒトＩＬ−１８タンパク質は、そのＤＮＡコーディング配列を通常のプラスミド発現ベクター中に、選択された宿主においてタンパク質の複製および発現を行うことができ調節配列の制御下で挿入することにより組み換え発現することができる。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｈ．、Ｇｅｎｅ ５６、１２５−１３５（１９８７）。
【００２６】
組み換え産生に関して、宿主細胞を遺伝子操作して、本発明において有用なＩＬ−１８ポリペプチドの発現系またはその一部を組み入れることができる。ヒトＩＬ−１８をエンコードするポリンクレオチドの宿主細胞中への導入は、多くの標準的実験室用マニュアル、例えば、Ｄａｖｉｓら、ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、ｉｎ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されている方法により行うことができる。このような方法としては、これらに限定されないが：リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質で仲介されたトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレイプローディング、バリスティックイントロダクションまたは感染が挙げられる。
【００２７】
適当な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属細胞；昆虫細胞、例えば、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ ２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；および植物細胞が挙げられる。
【００２８】
様々な発現系、例えば染色体、エピソームおよびウイルスに誘導系、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス、例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスから誘導されるベクター、ならびにその組み合わせ由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメントから由来のものを使用することができる。発現系は、発現の制御ならびに発生を調節する制御領域を含有することができる。一般に、宿主においてポリペプチドを産生するためにポリヌクレオチドを維持、増殖または発現することができる任意の系またはベクターを使用することができる。適切なヌクレオチド配列は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されているものなどの様々な周知で慣習的な技術により発現系中に挿入することができる。適切な分泌シグナルを所望のポリペプチド中に組み入れて、翻訳されたタンパク質を小胞体内腔、細胞周辺腔または細胞外環境の管腔中に分泌させることができる。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってもよいし、あるいは異種シグナルであってもよい。
【００２９】
ポリペプチドが媒体中に分泌されるならば、前記媒体はポリペプチドを回収し、精製するために回収することができる。細胞内で産生される場合、細胞はまずポリペプチドが回収される前に溶解されなければならない。
本発明において有用なポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレシチンクロマトグラフィーをはじめとする周知の方法により組み換え細胞培養物から回収し、精製することができる。最も好ましくは、精製するために高性能液体クロマトグラフィーを用いることができる。単離および精製中にポリペプチドが変性する場合、活性構造を再生するためにタンパク質のリホールディングのための周知の技術を用いることができる。
【００３０】
本発明において有用な水溶性ポリマーは、本発明の組成物に対する望ましくない免疫反応性を回避するために実質的に非抗原性である。このような水溶性ポリマーとしては、これらに限定されないが：ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリエチレングリコールコポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレングリコール−コープロピレングリコール）、ポリ（Ｎ−２−（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ（シアル酸）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、およびデキストランが挙げられる。好適なポリマーは、任意の分子量を有するものである。本発明の一実施形態において、ポリマーは約１０００ダルトン〜約１０００００ダルトンの平均分子量を有する。本発明の別の実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリマーは約４０００ダルトン〜約４００００ダルトンの平均分子量を有する。本発明のさらに別の実施形態において、前記官能化ポリマーの分子量は：約２００００ダルトン〜約３００００ダルトンからなる群から選択される。本発明のさらに別の実施形態において、前記官能化ポリマーは約２００００ダルトンの分子量を有する。
【００３１】
これらのポリマーは、置換されていないかまたは一端でアルキル基で置換されている。例えば、
本発明の組成物は、水溶性ポリマーがポリエチレングリコールホモポリマーであるものである。本発明における使用に好適なポリマーは、分岐鎖、非分岐鎖、星状または直鎖である。本発明の一実施形態において、このような組成物は直鎖ポリエチレングリコールホモポリマーを含む。本発明の別の実施形態において、このような組成物は、分岐鎖ポリエチレングリコールホモポリマーを含む。本発明における使用に好適なポリマーは、次の特許、特許出願および刊行物に開示されている：米国特許第４，０９７，４７０号、第４，８４７，３２５号、第５，０３７，８８３号、第５，２５２，７１４号、第５，５８０，８５３号、第５，６４３，５７５号、第５，６７２，６６２号、第５，７３９，２０８号、第５，７４７，４４６号、第５，８２４，７８４号、第５，８４６，９５１号、第５，８８０，２５５号、第５，９１９，４５５号、第５，９１９，７５８号、第５，９３２，４６２号、第５，９８５，２６３号、第５，９５１，９７４号、第５，９９０，２３７号、第６，０４２，８２２号、第６，０４６，３０号、第６，１０７，２７２号および第６，１１３，９０６号；国際特許公開番号ＷＯ９２／１６５５５；欧州特許公開番号ＥＰ７２７，４３７、ＥＰ７２７，４３８、ＥＰ４３９，５０８およびＥＰ７１４，４０２；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ６：１５０−１６５；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｇ．ら、（１９９９） Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９：６１−６６（それぞれは本発明の一部として参照される）。さらに、ポリペプチドおよび他の生物学的物質との結合を促進するために修飾された誘導化または官能化されたポリマーが本発明における使用に好適である。例えば、遊離アミノ基（例えばリシン残基でのイプシロンアミノ基またはＮ末端での遊離アミノ基）、システイン残基上の遊離スルフヒドリル基、または炭水化物部分による結合を促進するためのポリマーの修飾が望ましい。有用なポリマーは、ポリエチレングリコールのモノメトキシ誘導体（ｍＰＥＧ）も含む。本発明において用いることができる官能化ポリマーとしては、これらに限定されないが：メトキシポリエチレングリコールスクシニミジルプロピオネート；メトキシポリエチレングリコールスクシニミジルブタノエート；カルボキシメチル化メトキシポリエチレングリコールのスクシニミジルエステル；メトキシポリエチレングリコールアルデヒド；メトキシポリエチレングリコールヒドラジド、メトキシポリエチレングリコールヨードアセトアミド；メトキシポリエチレングリコールマレイミド；およびメトキシポリエチレングリコールトレシレートが挙げられる。
【００３２】
前記のヒトＩＬ−１８タンパク質は：天然に存在するか、または遺伝子操作によりサイトカイン分子中に導入されリホールディング後も遊離のままである（１）遊離アミン基、例えば生物学的活性の喪失を最小限に抑えるための１または２個、（２）遊離カルボキシル基、例えば生物学的活性の喪失を最小限に抑えるための１または２個；（３）遊離ヒスチジン基、（４）遊離スルフヒドリル基または（５）遊離チオエーテル基のいずれかによりポリマーに結合させることができる。タンパク質に結合されたポリマー分子の数は、例えば、適当な分子マーカーを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたはサイズ排除クロマトグラフィー、マトリックスにより補助されたレーザー脱離およびイオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）（Ｂｕｌｌｏｃｋ、Ｊ．ら、（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：３２５８−３２６４）、キャピラリー電気泳動（Ｋｅｍｐ、Ｇ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：９−１７；Ｒｏｂｅｒｔ、Ｍ．Ｊ．およびＨａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．（１９９８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１４４０−１４４５）をはじめとする様々な方法により決定することができる。ポリマー結合の部位は、タンパク質を酵素（例えば、トリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ）により消化して小さなフラグメントにし、逆相液体クロマトグラフィーにより分離することにより決定できる。ポリマー修飾の前後のペプチドマップを比較し、溶出時間が変わったフラグメントを配列化して、ポリマー結合の位置が決定される。別法として、ポリマーは、タンパク質１モルあたり何モルの標識されたポリマーが結合するかを決定するためにカップリング前に蛍光または放射性標識の何れかをすることができる。
【００３３】
結合される残基は：通常存在するか、または遺伝子操作によりタンパク質中に導入される（１）システイン残基上の遊離スルフヒドリル基；（２）任意の遊離アミン基（例えば、リシン残基のイプシロンアミン基またはＮ末端での遊離アミン基）；（３）遊離カルボキシル基（例えば、アルパルテートおよびグルタメート残基上の遊離カルボキシル基）；（４）ヒスチジン上の遊離イミダゾール基、および（５）メチオニン上の遊離チオエーテル基である。
結合を行うための反応条件は、タンパク質の反応基がシステイン上の遊離チオール基またはメチオニン上のチオエーテル基であるならば、ｐＨ約６〜９、さらに好ましくはｐＨ６〜７で前記結合反応を行うことをさらに含む。前記方法を用いて、タンパク質をポリマーに添加された少なくとも１つの末端チオール反応性基により結合させる。これらのチオール反応性基としては、これらに限定されないが：ハロアセチル、マレイミド、ピリジルジスルフィド誘導体、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤が挙げられる。用いられる未反応活性化ポリマーの量は、通常、モノマーまたはマルチマー（好ましくはダイマー）形態であるタンパク質よりも１〜１０倍過剰の活性化ポリマーである。一般に、反応プロセスは、活性化ポリマーをタンパク質と２：１（ポリマー：ポリマー）の比で反応させることを含む。典型的には、反応はリン酸塩緩衝液ｐＨ６．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ中、４℃で約１時間〜約１０時間行われる。結合後、所望の結合タンパク質を液体クロマトグラフィーなどにより回収し、精製する。
【００３４】
結合を行うための反応条件は、タンパク質の反応性基が遊離アミン基であるならば、そしてアスパラギンおよびグルタミン残基でアルカリ性ｐＨ（７より大）で起こることが知られている脱アミド化反応を減少させるために、Ｈ約６〜９、さらに好ましくはｐＨ６．５〜７．５で前記結合反応を行うことをさらに含む。前記方法を用いて、タンパク質をポリマーに添加された少なくとも１つの末端アミン反応性基により結合させる。これらのアミン反応性基としては、これらに限定されないが：イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ベンゾトリアゾール、イミダゾール、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、ヨードアセトアミド、トレシレートおよび無水物が挙げられる。用いられる未反応活性化ポリマーの量は、一般にモノマーまたはマルチマー（好ましくはダイマー）のいずれかの形態であるタンパク質より１〜１０倍過剰である。一般に、反応プロセスは、活性化ポリマーをタンパク質と２：１（ポリマー：タンパク質）の比で反応させることを含む。典型的には、反応は、リン酸塩緩衝液ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ中、４℃で約１時間から約４時間行われる。結合後、所望の結合タンパク質を液体クロマトグラフィー等により回収し、精製する。
【００３５】
結合を行うための反応条件は、タンパク質の反応性基が遊離カルボキシレート基であるならば、前記結合反応をｐＨ約３〜９、さらに好ましくはｐＨ４〜５で行うことをさらに含む。タンパク質上のカルボキシル基は、アシル化剤、例えばカルボジイミド（例えば、ＤＣＣまたはＥＤＣ）あるいはカルボニルジイミダゾール（例えば、ＣＤＩ）により活性化される。前記方法を用いて、タンパク質をポリマーに添加された少なくとも１つの求核性官能基により結合させる。これらの求核性官能基としては、これらに限定されないが：アミンまたはヒドラジドが挙げられる。前記タンパク質に関して、好ましい反応条件は、アスパラギンおよびグルタミン残基で、アルカリ性ｐＨ（７より大）で起こることが知られている脱アミド化副反応を軽減するために４℃で弱酸性ｐＨである。用いられる未反応活性化ポリマーの量は、一般にカルボキシル化活性化タンパク質より１〜１０倍過剰の活性化ポリマーである。一般に、反応プロセスは、活性化ポリマーをタンパク質と２；１（ポリマー：タンパク質）の比で反応させることを含む。典型的には、反応はＭＥＡ緩衝液ｐＨ４．５中、４℃で約１時間から約８時間行われる。結合後、所望の結合タンパク質を液体クロマトグラフィーなどにより回収し、精製する。
【００３６】
結合を行うための反応条件は、タンパク質の反応性基が遊離ヒスチジンであるならば、前記結合反応をｐＨ約３〜６、さらに好ましくはｐＨ４〜５で行うことをさらに含む。前記方法を用いて、タンパク質をポリマーに添加された少なくとも１つの末端イミダゾール反応性基により結合させる。これらのイミダゾール反応性基としては、これらに限定されないが：Ｎ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルおよび無水物が挙げられる。用いられる未反応活性化ポリマーの量は、一般にモノマーまたはマルチマーの何れかであるタンパク質よりも１〜１０倍過剰の活性化ポリマーである。一般に、反応プロセスは、活性化ポリマーをタンパク質と２；１（ポリマー：タンパク質）の比で反応させることを含む。典型的には、反応は酢酸塩緩衝液ｐＨ４〜５、１００ｍＭ ＮａＣｌ中、４℃で約２時間から約６時間行われる。結合後、所望の結合タンパク質を液体クロマトグラフィーなどにより回収し、精製する。
【００３７】
水溶性ポリマーの治療的ポリペプチドとの有効な結合は、既に米国特許第４，４８７，３２５号、米国特許第５，８２４，７８４号および米国特許第５，９５１，９７４号（全体として本発明の一部として参照される）に記載されている。
さらに別の態様において、本発明は、治療的に有効な量の本発明の組成物を、治療的に許容される担体または賦形剤との組み合わせにおいて含む医薬組成物を提供する。このような担体としては、これらに限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが挙げられる。本発明はさらに、本発明の前記組成の１以上の成分を充填された１以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。本発明の組成物は、単独または他の化合物、例えば治療化合物との組み合わせにおいて用いることができる。
【００３８】
医薬組成物は、例えば全身性または経口経路による投与経路に適用される。全身性投与の形態は、注射、典型的には静脈内注射を包含する。皮下、筋肉内、または腹腔内等の他の注射経路も使用できる。全身性投与の代替手段としては、浸透剤、例えば胆汁塩またはフシジン酸または他の界面活性剤を用いた経粘膜および経皮投与が挙げられる。加えて、本発明の組成物が腸溶性またはカプセル化処方に処方できるならば、経口投与も可能である。これらの組成物の投与は、軟膏、ペースト、ゲルなどの形態において、局所および／または局所化することができる。他の投与経路は、溶液または乾燥粉末処方の何れかを用いた肺または鼻送達を包含し得る。
【００３９】
必要とされる投与量範囲は、本発明の組成物、投与経路、処方の性質、対象の状態の性質、および診察する医師の判断に依存する。しかしながら、好適な用量は、対象の体重１ｋｇあたり０．１〜１０００μｇの範囲である。しかしながら、入手可能な様々な組成物および様々な投与経路の異なる有効性の観点から、必要な用量は広範囲に変化することが予想される。例えば、経口投与は静脈内注射による投与よりも高い投与量を必要すると予想される。これらの投与量レベルにおける変動は、当該分野において良く理解されるように、最適化のための標準的経験的手順を用いて調節することができる。
【００４０】
本発明は、その精神または本質的特性から逸脱することなく他の特定の形態において具体化することができ、従って本発明の範囲を表示する前記明細書または以下の実施例よりも添付の請求の範囲を参照すべきである。
これらに限定されないが、本明細書において言及し、または本出願が優先権を主張する特許および特許出願を包含する全ての刊行物は、個々の出版物が具体的かつ個別にあたかも完全に表示されているように出典明示により本発明の一部として参照される。
【００４１】
実施例
実施例１：ヒトおよびネズミＩＬ−１８結晶構造に基づくＰＥＧ化部位の予想：
Ｃｙｓ３８およびＣｙｓ６８（２つの天然の表面が露出したシステイン）でのヒトＩＬ−１８（配列番号１）のＰＥＧ化により、低活性を有する分子が産生された。従って、本発明者らは所望の生物学的活性と緩衝することなくＣｙｓと突然変異形成し、その後ＰＥＧ化するためのヒトＩＬ−１８における部位を同定することを試みた。
マウスＩＬ−１８の結晶構造は解明されている（米国特許出願番号１０／６４０，５２４、２００３年８月１３日提出）。ＩＬ−１８およびＩＬ−１βはそのコア構造が非常に類似しているが、その表面ループは異なることなることが明らかである。ヒトＩＬ−１８の構造は、高い配列相同性（６５％同一）のためにネズミＩＬ−１８構造と非常に類似している。ネズミＩＬ−１８の結晶構造を用いて、表面およびループ残基をヒトＩＬ−１８上にマップすることができる。
【００４２】
本発明者らはＩＬ−１８レセプターとの相互作用に関与しないＩＬ−１８の柔軟な表面ループの先端での残基のＰＥＧ化を目的とする。本発明者らは、ＩＬ−１８はそのレセプターと、ＩＬ−１β：ＩＬ−１βレセプター相互作用と類似した方法で相互作用すると仮定する。マウスＩＬ−１８配位を、三次元オーバーレイで、ヒトＩＬ−１βのＩＬ−１βレセプターとの複合体からのヒトＩＬ−１βの配位上に重ね合わせた（Ｖｉｇｅｒｓら、ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ３８６：１９０、１９９７；ＰＤＢ ｃｏｄｅ １ＩＴＢ）。ヒトＩＬ−１βレセプターのＩＬ−１βレセプター拮抗物質との複合体の配位（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒら、ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ３８６：１９４、１９９７；ＰＤＢ ｃｏｄｅ １ＩＲＡ）を、ＩＬ−１８のそのレセプターとの結合様式をモデル化するためにも使用した。これらのオーバーレイから、本発明者らは、Ａｓｎ７８、Ｇｌｕ１２１、Ｌｅｕ１４４、およびＣ末端を少なくとも起こりそうなレセプターとの相互作用として、従ってシステインと突然変異形成し、その後ポリエチレングリコールを結合してＰＥＧ化ＩＬ−１８を形成するための良好な部位として選択した。ヒトＩＬ−１８のＣ末端アミノ酸（Ｄ１５７）およびＬｅｕ１４４は、別々にＣｙｓと突然変異形成し、次いでＰＥＧ化された。結果として得られる２つの修飾ＩＬ−１８分子は活性を示した。
【００４３】
実施例２：置換突然変異設計：
ネズミＩＬ−１８結晶構造に基づいて（米国特許出願番号１０／６４０，５２４、２００３年８月１３日提出）、また後に天然のヒトＩＬ−１８結晶構造により確認されるように（ＰＣＴ出願番号ＷＯ０３／０８９６５３、２００３年１０月３０日提出）、生物学的活性に対する負の効果を最小限に抑えるためにモノＰＥＧを予想されるレセプター結合領域から離れた遊離システインと結合させるＰＥＧ化法を考案した。天然のヒトＩＬ−１８は、図１（配列番号１）に示される成熟ヒトＩＬ−１８のアミノ酸配列において下線で示される４つのシステイン、Ｃ３８、Ｃ６８、Ｃ７６、およびＣ１２７を含有する。これらの内の２つ、Ｃ３８およびＣ６８は、結晶構造により予想されるようにＰＥＧ化に利用可能である。ＰＥＧ化された天然のヒトＩＬ−１８は、Ｃ３８およびＣ６８の両方で二重ＰＥＧ化されており、減少したインビトロ生物学的活性を示す（表１）。モノＰＥＧ化は、天然のシステインの１つを非反応性アミノ酸で置換し、残りの反応性システインをＰＥＧ化するか、または両方の天然のシステインを置換し、分子中の他の場所の遊離システインを置換することにより達成される。
【００４４】
一連のヒトＩＬ−１８置換突然変異体は、部位指向性突然変異誘発により生成された（Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２）。これらの全てはイー・コリにおいて、Ｎ末端の６のヒスチジン精製タグを有するｐｒｏ形態において発現された（図３）（配列番号３）。別に精製されたカスパーゼ５を用いてＰｒｏＩＬ−１８を次に活性化してインビトロで成熟形態にした。全てのＩＬ−１８突然変異は、この方法を用いて有効に発現され、等しい収率で精製された。カスパーゼ１、４、および５、およびユビキチン特異性プロテアーゼを用いてインビトロまたは細胞内で活性ＩＬ−１８を産生する代替法は、ＰＣＴ ＷＯ０１／０９８４５５（２００１年１２月２７日公開）において詳細に記載されている。これらの方法はすべて本出願において開示されているＩＬ−１８突然変異体デザインの任意のものを産生するために好適である。
【００４５】
置換突然変異体デザインを、これらの内部の対応するモノＰＥＧ化部位、およびＰＥＧ化および非ＰＥＧ化形態のインビトロ活性とともに以下の表１に記載する。天然のＩＬ−１８のモノＰＥＧ化は、システイン３８またはシステイン６８（図１、最初の２つの下線部分）（配列番号１）で達成される。天然のＩＬ−１８分子内のモノＰＥＧ化により、ＰＥＧ化されていない天然のＩＬ−１８と比較して、ＫＧ−１ ＩＦＮ分泌分析において生物学的有効性が約５倍低下する。一方、遊離天然のシステイン６８でのモノＰＥＧ化は、Ｃ３８をセリン（図４、下線）（配列番号４）で置換することにより達成される。この分子内のシステイン６８でのモノＰＥＧ化により、ＰＥＧ化されていない天然のＩＬ−１８と比較してＫＧ−１ ＩＦＮ分泌分析において生物学的能力が約２倍減少する。対照的に、この置換の非ＰＥＧ化形態の活性は、天然のＩＬ−１８から有意に減少しなかった（表１Ａ）。
【００４６】
予想されるレセプター結合相互作用部位から離れた三葉型構造の露出したループに関するＰＥＧ化についてヒトＩＬ−１８の結晶モデルに基づいてさらなる置換デザインを調製した。４つの部位、Ｎ７８、Ｅ１２１、Ｌ１４４、およびＤ１５７をシステイン置換のために選択した。ｈＩＬ−１８タンパク質に沿って置換当然変異に好適な他の残基があるが、これらの４つの残基がまず選択される。これらの部位でのモノＰＥＧ化を達成するために、システイン３８をセリンで置換し、システイン６８をセリンまたはアスパラギン酸のいずれかで置換した。セリンはシステインと比較して中性の性質および小さな寸法のために使用した。アスパラギン酸は、ヒトにおけるシステインに関する位置に他の種のＩＬ−１８においてアスパラギン酸が存在するために選択した。図５〜１０はこれらの理論的デザインのそれぞれのアミノ酸配列（それぞれ配列番号５〜１０）を示す。置換突然変異に下線を施した。ＰＥＧ化後の全てのムテインについての生物学的効力において活性の減少が観察された。ＰＥＧ化およびモノＰＥＧ化形態の相対的活性に基づいて、２つのＰＥＧ化部位、Ｌ１４４およびＤ１５７を選択し、その後のインビトロおよびインビボ検定において試験した。さらに、この残基置換の中性的性質のためにＣ６８ＤよりもＣ６８Ｓ置換を選択した。従って、突然変異デザインＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｌ１４４Ｃ、およびＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７ＣをそれぞれＣ１４４およびＣ１５７（図９および図１０）（表１Ａおよび１Ｂ）（それぞれ配列番号９および１０）でのモノＰＥＧ化に使用した。
【表１】
【表２】
【００４７】
実施例３：精製法：
ａ．ＩＬ−１８のシステイン置換突然変異体の精製
実施例２において前述した突然変異体の全ては、イー・コリにおいて、発現レベルの検出と精製の便宜のためのＮ末端ヘキサヒス標識を有する可溶性代用形として発現された。ヘキサヒス／ｐｒｏＩＬ−１８（配列番号３）を発現するイー・コリ細胞を、１０ｍｌ／ｇ細胞で溶解緩衝液中に懸濁させた。溶液緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓｌ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール（緩衝液Ａ）、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡおよび０．４ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有していた。細胞を溶解緩衝液中に均質化させ、ミクロフルイダイザー（Ｍ１１０−Ｙ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）に１２０００ｐｓｉで２回通すことにより溶解させた。細胞溶解物を３００００ｇで３０分間遠心分離して、細胞片を分離し、上清をＮｉＮＴＡアガロースカラムにかけ、これを３カラム体積の緩衝液Ａで洗浄した。カラムをさらに３カラム体積の、３０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液Ａで洗浄して非特異性結合不純物を除去し、ヘキサヒス／ｐｒｏＩＬ−１８を緩衝液Ａ中３００ｍＭイミダゾールで溶出した。プールを１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含有する２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５（緩衝液Ｂ）に対して透析した。緩衝液Ｂはカスパーゼ反応について最適の緩衝液であった。緩衝液Ｂ中のプールにカスパーゼ５を１：１００ｗ／ｗ（カスパーゼ５対ｐｒｏＩＬ−１８）を添加し、一夜室温でインキュベートして、開裂反応を完了させた。反応混合物を０．５Ｍ ＮａＣｌに調節し、これをＮｉＮＴＡアガロースカラムにかけた。成熟ＩＬ−１８をカラムに通し、その間、ヘキサヒス／プロドメイン結合をカラムに戻した。第一ＮｉＮＴＡアガロースカラムに結合し、溶出される、あるイー・コリタンパク質（不純物）をカラムに再結合させ、さらに純度の高い成熟ＩＬ−１８を得た。未結合タンパク質を２５ｍＭ ＤＴＴに調節し、１時間インキュベートして、還元状態で全てのシステインを回復し、精製中に形成されたＢＭＥ付加物およびジスルフィド結合を還元した。システイン酸化を回避するために２Ｍリン酸を添加することにより還元された成熟ＩＬ−１８溶液をｐＨ６．０に調節し、ＹＭ１０膜で濃縮した。緩衝液を交換するために、濃縮されたサンプルを、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにかけて、凝集物を除去し、インビボ研究に適したエンドトキシンを除去した。成熟ＩＬ−１８をモノマーとしてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムから溶出させ、ＬＣ／ＭＳ分析による分子量は、ｃＤＮＡから計算されたモノマー形態から予想されるとおりであった。ＤＴＮＢ滴定により、４つのシステインすべてが還元形態であることが示された。
【００４８】
ｂ．ＰＥＧ化ＩＬ−１８の精製
ＰＥＧ化ＩＬ−１８、遊離ＰＥＧ、および未修飾ＩＬ−１８を含有するＰＥＧ化反応混合物を、反応直後に、等体積の２５ｍＭ ＭＥＳ中２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４（ｐＨ６．２）（緩衝液Ｃ）で希釈した。希釈された反応混合物をＳｏｕｒｃｅ１５フェニル（Ｐｈａｒｍｎａｃｉａ）カラムにかけ、これを１．５カラム体積の緩衝液Ｃ中１Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４で洗浄した。カラムを５カラム体積の緩衝液Ｃ中０．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４への直線的勾配で溶出させた。遊離ＩＬ−１８がまず溶出され、続いて遊離ＰＥＧおよびＰＥＧ化ＩＬ−１８が最後に溶出される。ＰＥＧ化ＩＬ−１８を含有するフラクションをプールし、ＹＭ１０膜で濃縮し、あらかじめ平衡化させた寸法排除カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００調製等級（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、緩衝液Ｂで溶出させた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００は任意の残存する遊離ＩＬ−１８、遊離ＰＥＧ、任意の凝集物、およびエンドトキシンを除去する。ＰＥＧ化ＩＬ−１８を含有するフラクションをプールし、〜５−６ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【００４９】
実施例４：ＰＥＧ化ＩＬ−１８の調製
ＰＥＧ化ＩＬ−１８の調製の一般的手順を以下に記載する。適当な量の平均分子量２００００、３００００または４００００ダルトンを有するメトキシポリエチレングリコールマレイミド（ＭＡＬ ＭＰＥＧ）を、リン酸塩緩液ｐＨ６．０〜６．５中ＩＬ−１８の２．５ｍｇ／ｍＬ溶液に添加した（固体またはあらかじめ水性または有機溶媒中に溶解させるかのいずれかとして）。ＭＡＬ ＭＰＥＧを、過剰モル量のＭＡＬ ＭＰＥＧでタンパク質溶液に添加した。反応を５℃で１〜１２時間進行させた。反応の最後に、過剰量（例えば２０倍）のシステイン（０．５Ｍ）を添加して反応を停止した。この段階で、野生型ヒトＩＬ−１８をＰＥＧ化に使用する場合、反応混合物は主にモノ、ジおよび非ＰＥＧ化ＩＬ−１８からなることが判明した。ヒトＩＬ−１８置換突然変異体を使用する場合（前章において議論するように）、反応混合物は主にモノ−ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８タンパク質からなることが判明した（図１１参照）。
【００５０】
ａ．物理化学的キャラクタライゼーション
各サンプルを特徴づけるために４種の分析：（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（２）逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、（３）分子量測定（ＬＣ／ＭＳ）および（４）ペプチドマッピングを行った。
ｂ．ＰＥＧ化度
ＰＥＧ化の程度（すなわち、１つのタンパク質に結合するＰＥＧ分子の数）を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。ヒトＩＬ−１８またはネズミＩＬ−１８ＰＥＧ化反応混合物のサンプルを還元条件下、レーンあたり１０．０μｇのロードで、４〜１２％ビス−トリスポリアクリルアミド勾配プレキャストゲル上にかけた。タンパク質を検出し、クーマシーＲ−２５０で染色した後に定量化した。定量化はレーザーデンシトメトリーにより行った。
ＰＥＧ化の程度をさらに、ＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いて分析した。反応混合物のサンプルを１ｍＬ／分の流速で、８．６％／分の移動相Ｂ（移動相Ａ：０．１％水中トリフルオロ酢酸、移動相Ｂ：８０％アセトニトリル／水中０．１％ＴＦＡ）の勾配で、ＰＯＲＯＳ Ｒ２／Ｈカラム（カラム温度４０℃）で流した。
【００５１】
ｃ．ＰＥＧ化の部位−トリプシンペプチドマップ法の開発
タンパク質上の正確な位置に対するＰＥＧの結合の位置を証明するために、精製ＰＥＧ化ＩＬ−１８サンプルをペプチドマッピングにより分析した。ＩＬ−１８のトリプシンマッピングは従来法を変更し（Ｊ．Ｂｏｎｇｅｒｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ．、２１：１０９９−１１２８（２０００））、ＩＬ−１８におけるシステイン（遊離スルフヒトリル）の直接Ｓ−カルボキシメチル化を用いる：サンプル（２．５ｍｇ）を真空下で蒸発乾固させ、６Ｍのグアニジン・ＨＣｌ中０．５ｍＬの新たに調製された２０ｍＭヨード酢酸ナトリウム中に溶解させ、室温で暗所に４０分間置き、その後直ちにＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６ＤＧゲルカラム（ＢｉｏＲａｄ Ｅｃｏｎ−Ｐａｃ１０ＤＧ）上で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ８．１）消化緩衝液中に緩衝液交換した。トリプシン（ＴＰＣＫ−処理Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、Ｌｙｓ−Ｃ（Ｗａｋｏ）、およびＧｌｕ−Ｃ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）でのタンパク質分解的消化は全て２ｍｇ／ｍＬ ＣＭ−ＣｙｓＩＬ−１８基質について１００／１ｗｔ：ｗｔＳ／Ｅ、３７℃で２時間であった。ＲＰ−ＨＰＬＣマッピング：Ｖｙｄａｃ ２１８ＭＳ５２ Ｃ１８カラム（２．１ｘ２５０ｍｍ）；５５℃；０〜３２％ ＣＨ３ＣＮ（０．０５％ＴＦＡ）６０分；０．２ｍＬ／分、２１５／２８０ｎｍｗ／ダイオード−アレイおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｇ１９４６Ａ ＭＳ検出器（ＭＳＤ）ｗ／ｓｏｕｒｃｅで検出。より小さなサンプル（５０−３００μｇ）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６ＤＧゲルカラムを用いて前記手順のセミミクロバージョンにより行った。
【００５２】
現行のペプチドマッピング法は、典型的にはシステインジスルフィド架橋のＤＴＴ還元、続いて結果として得られるシステインのＳ−カルボキシメチル化（還元／アルキル化）を利用する。このアンホールディング（変性）工程は、タンパク分解（消化）を成功させるためにしばしば必要とされる。しかしながら、ほとんどのタンパク質における酸化「半システイン」（架橋）と対照的に、ｈＩＬ−１８における４つのシステイン残基はすでに還元されている。従って、本発明者らは、より一般的な還元／アルキル化手順と置換するために、我々のペプチドマッピング法において直接Ｓ−カルボキシメチル化を行った。Ｓ−カルボキシメチル化ＩＬ−１８（４×ＣＭ−Ｃｙｓ）の定量的収率は、エレクトロスプレーイオン化ＬＣ／ＭＳにより判明した（ＭＷ１４４９Ｄａ（理論値）、１８４５３Ｄａ（測定値））。これは、直接アルキル化の有効性の良好な証拠であり、４モル当量の未反応システインチオールの存在を裏付ける。直接アルキル化の利点は、通常の還元／アルキル化法により失われるＩＬ−１８におけるシステインの「化学的一体性」についての情報を保存することである。例えば、システインの直接カルボキシメチル化を含むこのペプチドマッピング法により、システイン残基でのＰＥＧ化だけでなく、システインジスルフィドを形成する少量のシステインの空気酸化も検出することができる。
【００５３】
トリプシン消化の結果、２０の予想されるペプチドフラグメントが生成され（以下の表２参照）、各ペプチドフラグメントは、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳにより分離し、同定することができる（図１２）。ペプチドマップ法は、ＰＥＧ化の部位、すなわち、ポリエチレングリコール分子が結合しているアミノ酸を同定するために使用される。図１２は、モノＰＥＧ（２０Ｋ）ヒト野生型ＩＬ−８対未修飾ヒト野生型ＩＬ−１８対照のトリプシンマッピングの「ミラープロット」比較を示す。それぞれシステイン３８、６８、７６、および１２７に対応する４つのシステイン含有トリプシンペプチド、（１４−３９）、（６８−７０）、（７１−７９）、および（１１３−１２９）を対照について標識する。モノＰＥＧヒトＩＬ−１８のトリプシンマップにおける（１４−３９）ピークの対照に対してピーク面積における大幅な減少は、システイン３８での大きなＰＥＧ化を示す（約９０％）。「ＰＥＧ−Ｃｙｓ３８（１４−３９）」と表示される後に溶出するピークを単離し、Ｎ末端配列決定により９０％ＰＥＧ−Ｃｙｓ３８（１４−３９）および１０％ＰＥＧ−Ｃｙｓ６８（６８−７０）を含有することが判明した（図１２）。２１５ｎｍで検出を行った。この結果、モノＰＥＧ化ヒトＩＬ−１８はシステイン３８位により主にＰＥＧ化されたことがわかる。このタンパク質においてはほかに利用可能な３つの遊離システインが存在する事実から、この結果は驚くべきことであり、予想外である。
【表３】
【００５４】
ｄ．精製されたモノＰＥＧ化野生型ヒトＩＬ−１８のトリプシンマッピング
モノＰＥＧ化野生型ｈＩＬ−１８産物の図１４におけるトリプシンマップデータは、５６分に溶出する１４−３９ペプチドピークについて相対的ピーク面積対対照における減少に基づいて、それぞれほぼ６５および３５±５モル％の程度までの排他的に溶媒の影響を受けやすいシステイン３８および６８でのＰＥＧ化を示す。マップにおける７１−７９および１１３−１２９トリプシンペプチドの定量的回収により証明されるように、埋め込まれたシステイン７６および１２７で検出可能なＰＥＧ化は起こらなかった。これらの結果は、後に溶出する疎水性ピーク含有ＰＥＧ化ペプチドプールが同時に出現する、モノＰＥＧ化ｈＩＬ−１８マップ対非ＰＥＧ化ｈＩＬ−１８対照マップにおけるシステイン含有トリプシンペプチドの相対的ピーク面積において観察される減少、またはその喪失に基づく。システイン３８および６８上のＰＥＧの約６５〜３５モル％分布は、さらにＬＣ／ＭＣ／ＭＳ−ＭＳデータからの抽出されたイオン電流トレースにより確認した。
【００５５】
ｅ．精製されたモノＰＥＧ化ヒトＩＬ−１８Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号７）およびＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号８）ムテインから得られるＰＥＧ化トリプシンペプチドのＮ−末端配列
ＲＰ−ＨＰＬＣトリプシンマップにおける非ＰＥＧ化ペプチドのピーク面積における対照に対する差によりＰＥＧ化の部位および程度を決定することに加えて、本発明者らはタンパク質から放出されるＰＥＧ化ペプチドフラグメントの直接分析も行った。ＰＥＧ化ペプチドに関するこのような直接的データは、非ＰＥＧ化ペプチドについてのピーク面積における差から得られる相補的間接的証拠に対する「質量バランス」により関連づけられる。先に記載したように、これらの異なるＰＥＧ化ペプチドはすべてＲＰ−ＨＰＬＣトリプシンマップにおいて、ＰＥＧ化ペプチド種の未分割のプールを含有する単一の後で溶出するピークとして同時に溶出する。ＰＥＧ化ペプチドはイオントラップまたは四極子質量分析器でのオンラインエレクトロスプレー質量分析の影響を受けにくいので、本発明者らはＲＰ−ＨＰＬＣトリプシンマップから集められたＰＥＧ化ペプチドのプールを分析するためにミクロ化学ＥｄｍａｎＮ末端シーケンシングを利用した。
【００５６】
モノＰＥＧ２０ｋｈＩＬ−１８Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号７）についての単離されたＲＰ−ＨＰＬＣの後で溶出するピーク（ＰＥＧ化ペプチドプール）のＥｄｍａｎＮ末端シーケンシングデータは、表面ループシステイン１４４で９８．３モル％ＰＥＧ、部分的に埋め込まれたシステイン１２７で１．３モル％ＰＥＧを示した。モノＰＥＧ２０ｋｈＩＬ−１８Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号８）ＰＥＧ化トリプシンプールのＥｄｍａｎシーケンシングはＣ末端溶媒暴露システイン１５７で＞９９．５モル％ＰＥＧを示し、部分的に埋め込まれたシステイン１２７または他のさらなる部位で検出可能なＰＥＧはなかった。
【００５７】
従って、ＰＥＧ２０ｋｈＩＬ−１８Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号７）について、シーケンシングデータにより、システイン１４４での所望のＰＥＧ化に加えて、部分的に埋め込まれたシステイン１２７での約１〜２％の競合するＰＥＧ化が明らかになる。一方、システイン１２７、または他のどのような部位でも、このような競合ＰＥＧ化はモノＰＥＧ２０ｋｈＩＬ−１８Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号８）で検出可能でない。これらのシーケンシングデータは、残基１４４に対して残基１５７での若干求核性（反応性）の高いシステインと一致する。内部ループシステイン１４４に対する折りたたまれたタンパク質におけるＣ末端システイン１５７のＰＥＧ化に対する若干有利な反応性は、おそらくはこの残基の若干高い溶媒の影響を受けやすさ、および／または熱易動性、異なる局所静電環境、およびチオールの高い酸性の組み合わせを反映するであろう。
【００５８】
ｆ．ヒトＩＬ−１８置換突然変異体（Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号９）およびＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号１０）置換突然変異体）および精製されたモノＰＥＧ化置換突然変異体のトリプシンマッピング
トリプシンマッピングデータ（図１３および１５）は、ヒトＩＬ−１８置換突然変異体Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号９）およびＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号１０）およびそれぞれの精製されたモノＰＥＧ化結合体の予想される化学構造を裏付ける。ＲＰ−ＨＰＬＣデータは、それぞれ残基１４４および１５７での操作された表面システインでの＞９５％部位特異性定量的ＰＥＧ化と一致する。そして、残基７６および１２７での埋め込まれたシステインを含有するカルボキシメチル化トリプシンペプチドは、野生型ヒトＩＬ−１８標準の対照トリプシンマップに対してほぼ定量的収率で回収され、事実上他の顕著な化学的修飾（副反応）は最終生成物において観察されなかった。
【００５９】
実施例５：アフィニティー測定（ＩＬ−１８Ｒα鎖およびＩＬ−１８ＢＰに対するＩＬ−１８結合の速度分析）
ヒトＩＬ−１８の生物学的効果は、その細胞表面レセプターとの結合に関連し、おそらくは天然の拮抗物質、ＩＬ−１８ＢＰに対するその結合による。ＩＬ−１８の結合検定およびレセプターのアルファ鎖、またはＩＬ−１８ＢＰの何れかは、ＢＩＡｃｏｒｅ装置、表面プラスモン共鳴ベースのバイオセンサーを用いて開発された。この技術は、センサーチップ上の１つの生体分子を固定化し、リアルタイムで溶液中の第二の成分とのその相互作用をモニターすることを含む。
【００６０】
ＩＬ−１８置換突然変異体は、レセプターについて親和性が減少した（６〜１６倍）。しかしながら、ＩＬ−１８ＢＰに対する結合親和力は影響を受けなかった。対照的に、レセプター（１３−１１４倍）およびＩＬ−１８ＢＰ（１０−１７６倍）の両方に関して親和力が著しく減少した（表３）。
【表４】
【００６１】
実施例６：ＮＦ−κＢシグナリング
ＩＬ−１８の効果は、αおよびβ鎖からなるヘテロダイマー表面レセプターとの結合により媒介される。α鎖は単独でＩＬ−１８と結合するが、両サブユニットは、細胞内シグナリング経路を活性化し、標的細胞上のＩＬ−１８の生物学的効果を媒介することができる機能的高親和性ＩＬ−１８レセプターを形成するために必要である。転写因子ＮＦ−κＢはＩＬ−１８の免疫調節効果の重要なメディエーターである。ＩＬ−１８レセプターシグナリングは、ＩＫＫタンパク質キナーゼの活性化を誘発し、これは次にＮＦ−κＢ阻害剤ＩκＢαをリン酸化する。リン酸化ＩκＢαは分解し、核へ転位し、遺伝子転写を活性化する遊離ＮＦ−κＢを放出させる。多ＩＬ−１８ムテインをこの検定において評価した。これらの研究から、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号７）、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ Ｌ１４４Ｃ（配列番号９）、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号８）、およびＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号１０）を含有するＩＬ−１８ムテインが最も有効であると確認された。
【００６２】
表４におけるデータは、いくつかの異なる分子に関するＮＦ−κＢ生物検定からの結果をまとめたものである。天然のＩＬ−１８（配列番号１）に対して、ＩＬ−１８置換突然変異体、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｌ１４４Ｃ（配列番号７）およびＣ３８Ｓ、Ｃ６８Ｄ、Ｄ１５７Ｃ（配列番号８）は効力がおよそ１０倍減少していた。効力におけるさらなる減少がＰＥＧ化分子において見られた。一般に、２０Ｋおよび３０Ｋ ＰＥＧムテインは４０ＰＥＧバージョンよりもさらに有効であった。
【表５】
【００６３】
実施例７：ヒトＰＥＧ ＩＬ−１８のネズミ薬力学（ＰＤ）データ（ＩＦＮγ誘発）
ＢＡＬＢ／ｃをネズミＩＬ−１８を１回注射することにより治療すると、サイトカイン産生が増大した。最大の増加は、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦに関して見いだされた。ＩＦＮγ応答は非常に迅速で大規模であるので、このバイオマーカーはＰＥＧ化ＩＬ−１８の効力を天然のＩＬ−１８分子と比較するために使用した。ヒトＩＬ−１８（配列番号１）およびＰＥＧ化ヒトＩＬ−１８（配列番号１）をＳＣ注射により１０または１００μｇの投与量で投与した。治療後２、４、６、８、１２および１６時間に血清を集め、ＩＦＮγ産生に関して分析した。等モル量のＰＥＧ化ＩＬ−１８は非ＰＥＧ化ＩＬ−１８よりも高いＩＦＮγの循環レベルを誘発した。ＰＥＧ化ＩＬ−１８のＩＦＮγのピークレベルは、４〜１６時間の間に見いだされるが、非ＰＥＧ化ＩＬ−１８は２〜４時間の間にピークを生じさせた。ＩＬ−１８α鎖レセプターについての親和性の減少（表３に示すとおり）、
またはＮＦ−κＢ細胞ベースの検定における活性の低下（表４に示すとおり）にもかかわらず、ＰＥＧ化ヒトＩＬ−１８（配列番号１）は、ＩＬ−１８分子の重要なＰＤマーカーであるＩＦＮγにおいて増大を示した（表５）。
【表６】
【００６４】
実施例８：ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８（配列番号１）のＮＫ細胞毒性（エクスビボネズミ系）
ＩＬ−１８は、ＮＫ細胞を活性化するＴｈ１−優性サイトカインである。この研究において、本発明者らはヒトＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８（配列番号１）に反応するＮＫ細胞毒性を測定することを目的とした。この検定は、抗腫瘍活性の直接滴尺度である。
ネズミＹＡＣ−１細胞（ＮＫ感受性Ｔ細胞リンパ腫）を標的として、また処置された動物からのＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞をエフェクターとして用いるヨーロピウム放出検定によりＮＫ細胞活性を測定した。マウスにヒトＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８（等モル）濃度を１回注射した。マウスを処置後１８〜２４時間に屠殺した。処置された動物（および対照）からの脾臓細胞をヨーロピウム標識されたＹＡＣ−１標的細胞と組み合わせ、ヨーロピウム放出について測定した。
【００６５】
ＰＥＧ化ＩＬ−１８はマウスにおいてＮＫ細胞毒性を誘発した（表６）。全てのヒトＰＥＧ化ＩＬ−１８形はＮＫ細胞毒性を誘発する能力を示した（データは省略）。２０Ｋ ＰＥＧ化ＩＬ−１８は、試験した全てのエフェクター：標的比で非ＰＥＧ化ＩＬ−１８よりも良好な活性を示した（表６）。ここでも、ＩＬ−１８−α鎖レセプターについての親和性の減少（表３に示すとおり）またはＮＦ−κＢ細胞ベースの検定における活性の減少（表４に示すとおり）にもかかわらず、ＰＥＧ化はＩＬ−１８依存性インビボＮＫ活性化を軽減も、排除もしなかった。
【表７】
【００６６】
実施例９：ＩＬ−１８結合タンパク質との複合体形成
ＩＧＥＮ系を用いてＩＬ−１８（配列番号１）とＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）間の複合体を検出するためのイムノアッセイを開発した。この検定は、ヒトＩＬ−１８に対して非中和ｍＡｂ（１６Ｄ１０ｍＡｂ、ルテニウム結合）およびヒトＩＬ−１８ＢＰに対して非ブロッキングｍＡｂ（ｍＡｂ３６、ビオチニル化）を使用する。１２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１８ＢＰを１２５ｎｇ／ｍｌの非ＰＥＧ化ＩＬ−１８またはＰＥＧ化ＩＬ−１８と組み合わせた。
ＰＥＧ化ＩＬ−１８分子はＩＬ−１８ＢＰと複合体形成する能力が低下し（表７）、これは複合体を形成する非ＰＥＧ化ＩＬ−１８と対照的である。
【表８】
【００６７】
実施例１０：ＰＥＧ ＩＬ−１８およびその置換突然変異体についてのサルの薬力学（ＰＤ）および薬物動力学（ＰＫ）データ
ＰＥＧ化ＩＬ−１８および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８に応答して、ＰＤマーカーをカニクイザルにおいて評価した。カニクイザル（１群あたり３匹のオス）に、１ｍｇ／ｋｇの非ＰＥＧ化ＩＬ−１８またはＰＥＧ化ＩＬ−１８のいずれかを静脈内注射を１回した。投薬前、および投薬後１０日期間にわたって複数の時点で血液サンプルを集めた。血漿を薬剤およびネオプテリン濃度について分析し；白血球を次いでＣＤ６４マーカーの発現についてフローサイトメトリーにより分析した。
【００６８】
ａ．サル薬力学（ＰＤ）
カニクイザル白血球をＣＤ６４平均蛍光強度（ＭＦＩ）における変化について評価した。ＰＥＧ化ＩＬ−１８および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８は投薬後１から３日の間にＣＤ６４発現を増大させた。全白血球上の高いＣＤ６４発現は３日に極大になり、１０日まで存続した。白血球ＣＤ６４ＭＦＩは、投薬後のどの時点でも非ＰＥＧ化ＩＬ−１８と比較してＰＥＧ化ＩＬ−１８に対する応答が高かった（２倍まで）。全白血球において、ＣＤ６４ＭＦＩは非ＰＥＧ化ＩＬ−１８よりもＰＥＧ化ＩＬ−１８について統計的に有意に高かった。
ＰＥＧ化ＩＬ−１８および非ＰＥＧ化ＩＬ−１８は、投薬後１から４日の間にネオプテリン産生を誘発し、ピーク反応は２４または４８時間であった。折りたたみの誘発およびネオプテリンの群平均濃度は、一般に、非ＰＥＧ化ＩＬ−１８に対してよりも（２日に１３μ／ｍｌ）ＰＥＧ化ＩＬ−１８に対して（２日に１５〜２１μｇ／ｍｌ）の方が高かった（表９）。しかしながら、差は統計的有意に達しなかった。
【００６９】
白血球上のＣＤ６４マーカーは非ＰＥＧ化ＩＬ−１８と比較して、ＰＥＧ化ＩＬ−１８に対する発現において著しく増大した。このマーカーは、骨髄系、単球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、および好中球の細胞上で発現される。これらの細胞は、ＩＬ−１８誘発免疫応答において重要な役割を果たし、従ってＰＥＧ化ＩＬ−１８活性の関連する尺度である。ネオプテリンの誘発は統計的に有意でないが、発現における増大は、ＰＥＧ化ＩＬ−１８が非ＰＥＧ化ＩＬ−１８よりもインビボで有利であることを支持する。
【表９】
【表１０】
【００７０】
ｇ：サル薬物動力学（ＰＫ）
カニクイザルにおけるＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ヒトＩＬ−１８についてのＰＫデータを表１０に示す。０〜８時間の間のＰＥＧ化ＩＬ−１８についてのグラフ下の面積（ＡＵＣ）は、全３３６時間の非ＰＥＧ化ＩＬ−１８のＡＵＣよりも約７倍大きかった。ＰＥＧ化ＩＬ−１８について、０〜８時間の見かけのｔ１／２は約０．５時間であるが、非ＰＥＧ化ＩＬ−１８初期相（全ＡＵＳの約４３％）のｔ１／２は約７分であった。ＰＥＧ化ＩＬ−１８のＣｍａｘ値は、非ＰＥＧ化ＩＬ−１８のＣｍａｘ値よりも約４倍高く、血漿区画中へまず分布する薬剤と一致した。
【表１１】
【００７１】
本明細書において言及される、これらに限定されないが特許および特許出願をはじめとする全ての開示は、個々の開示が具体的かつ個別に記載されているかのように本発明の一部として参照される。
先の記載事項は、その別の実施形態を含む本発明を完全に開示する。本明細書において具体的に開示されている実施形態の変更および改善は以下の請求の範囲内に含まれる。さらに努力することなく、当業者は前記載事項を用いて本発明を最大限利用することができる。従って、本明細書において記載されている実施例は単に例示的であって、本発明の範囲を何ら制限するものではないと解釈されるべきである。本発明の排他的特性または優先権が主張されている実施形態は次のように定義される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列において１〜５のアミノ酸置換を含み、該置換が、残基３８でのシステイン、残基６８でのシステイン、残基７６でのシステイン、残基７８でのアスパラギン、残基１２１でのグルタミン酸、残基１２７でのシステイン、残基１４４でのロイシン、および残基１５７でのアスパラギン酸からなる群から選択される１〜５のアミノ酸残基での置換である、ヒトＩＬ−１８置換変異体。
【請求項２】
変異体が残基３８のシステインの代わりにセリンを含むヒトＩＬ−１８置換変異体（配列番号４）。
【請求項３】
変異体が、残基３８のシステインの代わりにセリン、残基６８のシステインの代わりにアスパラギン酸、そして残基７８のアスパラギンの代わりにシステインを含有する請求項１記載のヒトＩＬ−１８置換変異体（配列番号５）。
【請求項４】
変異体が、残基３８のシステインの代わりにセリン、残基６８のシステインの代わりにアスパラギン酸、そして残基１２１のグルタミン酸の代わりにシステインを含有する請求項１記載のヒトＩＬ−１８置換変異体（配列番号６）。
【請求項５】
変異体が、残基３８のシステインの代わりにセリン、残基６８のシステインの代わりにアスパラギン酸、そして残基１４４のロイシンの代わりにシステインを含有する請求項３記載のヒトＩＬ−１８置換変異体（配列番号７）。
【請求項６】
変異体が、残基３８のシステインの代わりにセリン、残基６８のシステインの代わりにアスパラギン酸、そして残基１５７のアスパラギン酸の代わりにシステインを含有する請求項１記載のヒトＩＬ−１８置換変異体（配列番号８）。
【請求項７】
水溶性ポリマーとコンジュゲートしたポリペプチドを含み、そのポリペプチドがヒトＩＬ−１８（配列番号１）である生物学的に活性な組成物。
【請求項８】
ポリペプチドとポリマー間の結合が共有結合である請求項７記載の組成物。
【請求項９】
水溶性ポリマーとコンジュゲートしたポリペプチドを含み、そのポリペプチドが、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるヒトＩＬ−１８置換変異体である生物学的に活性な組成物。
【請求項１０】
ポリペプチドとポリマー間の結合が共有結合である請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
水溶性ポリマーが：ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリエチレングリコールコポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレングリコール−コ−プロピレングリコール）、ポリ（Ｎ−２−（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ（シアル酸）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、およびデキストランからなる群から選択されるものである請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
水溶性ポリマーが置換されていない請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
水溶性ポリマーが一端でアルキル基で置換されている請求項１１記載の組成物。
【請求項１４】
水溶性ポリマーがポリエチレングリコールホモポリマーである請求項１１記載の組成物。
【請求項１５】
ポリエチレングリコールホモポリマーがモノメトキシ−ポリエチレングリコールである請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
モノメトキシ−ポリエチレングリコールが、直鎖モノメトキシ−ポリエチレングリコールおよび分岐モノメトキシ−ポリエチレングリコールからなる群から選択される請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
ポリエチレングリコールホモポリマーが約２００００〜約４００００ダルトンの分子量を有する請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
ポリエチレングリコールホモポリマーが約２００００ダルトンの分子量を有する請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
ポリエチレングリコールホモポリマーが約３００００ダルトンの分子量を有する請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
ポリエチレングリコールホモポリマーが約４００００ダルトンの分子量を有する請求項１７記載の組成物。
【請求項２１】
組成物がＰＥＧ化された天然のヒトＩＬ−１８（配列番号１）である請求項１７記載の組成物。
【請求項２２】
天然のヒトＩＬ−１８（配列番号１）が残基３８のシステインおよび残基６８のシステインでＰＥＧ化されている請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
治療的に有効量の請求項１８記載の組成物を投与することにより患者における癌を治療する方法。
【請求項２４】
癌が、腎臓細胞癌、骨髄腫、リンパ腫、および黒色腫からなる群から選択される免疫感受性腫瘍を含む請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、変異体が残基３８のシステインで水溶性ポリマーにコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項２６】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、変異体が残基７８のシステインで水溶性ポリマーにコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項２７】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し、残基１２１のシステインで水溶性ポリマーにコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項２８】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、残基１４４のシステインで水溶性ポリマーにコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項２９】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、残基１５７のシステインで水溶性ポリマーにコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項３０】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、残基１４４のシステインで水溶性ポリマーにコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項３１】
水溶性ポリマーが：約２００００〜約４００００ダルトンの分子量を有する直鎖ポリエチレングリコールホモポリマーおよび約２００００〜約４００００ダルトンの分子量を有する分岐鎖ポリエチレングリコールホモポリマーからなる群から選択される請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
直鎖ポリエチレングリコールホモポリマーが約２００００ダルトンの分子量を有する請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、変異体が残基１５７でのシステインで水溶性ポリマーとコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項３４】
水溶性ポリマーが：約２００００〜約４００００ダルトンの分子量を有する直鎖ポリエチレングリコールホモポリマーである請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
直鎖ポリエチレングリコールホモポリマーが：約２００００ダルトンの分子量を有する請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
生物学的に活性な組成物を調製する方法であって：
（ａ）ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を得る工程；および
（ｂ）ポリペプチドを官能化水溶性ポリマーと接触させる工程を含む方法。
【請求項３７】
生物学的に活性な組成物を調製する方法であって：
（ａ）配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択されるヒトＩＬ−１８置換変異ポリペプチドを得る工程；および
（ｂ）ポリペプチドを官能化水溶性ポリマーと接触させる工程を含む方法。
【請求項３８】
官能化水溶性ポリマーが：メトキシポリエチレングリコールスクシニミジルプロピオネート、ＭＷ２０，０００；メトキシポリエチレングリコールスクシニミジルプロピオネート、ＭＷ３０，０００；メトキシポリエチレングリコールスクシニミジルブタノエート、ＭＷ２０，０００；カルボキシメチル化メトキシポリエチレングリコールのスクシニミジルエステル、ＭＷ２０，０００；メトキシポリエチレングリコールアルデヒド、ＭＷ２０，０００；メトキシポリエチレングリコールアルデヒド、ＭＷ３０，０００；メトキシポリエチレングリコールヒドラジド、ＭＷ２０，０００；メトキシポリエチレングリコールマレイミド、ＭＷ２０，０００；メトキシポリエチレングリコールマレイミド、ＭＷ３０，０００；メトキシポリエチレングリコールオルトピリジルジスルフィド、ＭＷ２０，０００；メトキシポリエチレングリコールオルトピリジルジスルフィド、ＭＷ３０，０００；メトキシポリエチレングリコールヨードアセトアミド、ＭＷ２０，０００；およびメトキシポリエチレングリコールヨードアセトアミド、ＭＷ３０，０００からなる群から選択されるメンバーである請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
請求項３６記載の方法により製造される生成物。
【請求項４０】
請求項３７記載の方法により製造される生成物。
【請求項４１】
ヒトＩＬ−１８（配列番号１）を水溶性ポリマーにコンジュゲートさせる工程を含むヒトＩＬ−１８（配列番号１）の薬物動態特性および薬力学的作用を改善する方法。
【請求項４２】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択されるヒトＩＬ−１８置換変異体の薬物動態特性および薬力学的作用を改善する方法であって、ヒトＩＬ−１８置換変異体を水溶性ポリマーにコンジュゲートさせる工程を含む方法。
【請求項４３】
水溶性ポリマーがポリエチレングリコールホモポリマーである請求項３３記載の方法。
【請求項４４】
皮下生体利用性が改善されている請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
皮下生体利用性が改善されている請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
皮下生体利用性が改善され、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）との結合を減少させる請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
皮下生体利用性が改善され、ＩＬ−１８ＢＰとの結合を減少させる請求項４２記載の方法。
【請求項１】
配列番号１の配列において１〜５のアミノ酸置換を含み、該置換が、残基３８でのシステイン、残基６８でのシステイン、残基７６でのシステイン、残基７８でのアスパラギン、残基１２１でのグルタミン酸、残基１２７でのシステイン、残基１４４でのロイシン、および残基１５７でのアスパラギン酸からなる群から選択される１〜５のアミノ酸残基での置換である、ヒトＩＬ−１８置換変異体。
【請求項２】
変異体が残基３８のシステインの代わりにセリンを含むヒトＩＬ−１８置換変異体（配列番号４）。
【請求項３】
変異体が、残基３８のシステインの代わりにセリン、残基６８のシステインの代わりにアスパラギン酸、そして残基７８のアスパラギンの代わりにシステインを含有する請求項１記載のヒトＩＬ−１８置換変異体（配列番号５）。
【請求項４】
変異体が、残基３８のシステインの代わりにセリン、残基６８のシステインの代わりにアスパラギン酸、そして残基１２１のグルタミン酸の代わりにシステインを含有する請求項１記載のヒトＩＬ−１８置換変異体（配列番号６）。
【請求項５】
変異体が、残基３８のシステインの代わりにセリン、残基６８のシステインの代わりにアスパラギン酸、そして残基１４４のロイシンの代わりにシステインを含有する請求項３記載のヒトＩＬ−１８置換変異体（配列番号７）。
【請求項６】
変異体が、残基３８のシステインの代わりにセリン、残基６８のシステインの代わりにアスパラギン酸、そして残基１５７のアスパラギン酸の代わりにシステインを含有する請求項１記載のヒトＩＬ−１８置換変異体（配列番号８）。
【請求項７】
水溶性ポリマーとコンジュゲートしたポリペプチドを含み、そのポリペプチドがヒトＩＬ−１８（配列番号１）である生物学的に活性な組成物。
【請求項８】
ポリペプチドとポリマー間の結合が共有結合である請求項７記載の組成物。
【請求項９】
水溶性ポリマーとコンジュゲートしたポリペプチドを含み、そのポリペプチドが、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるヒトＩＬ−１８置換変異体である生物学的に活性な組成物。
【請求項１０】
ポリペプチドとポリマー間の結合が共有結合である請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
水溶性ポリマーが：ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリエチレングリコールコポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレングリコール−コ−プロピレングリコール）、ポリ（Ｎ−２−（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ（シアル酸）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、およびデキストランからなる群から選択されるものである請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
水溶性ポリマーが置換されていない請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
水溶性ポリマーが一端でアルキル基で置換されている請求項１１記載の組成物。
【請求項１４】
水溶性ポリマーがポリエチレングリコールホモポリマーである請求項１１記載の組成物。
【請求項１５】
ポリエチレングリコールホモポリマーがモノメトキシ−ポリエチレングリコールである請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
モノメトキシ−ポリエチレングリコールが、直鎖モノメトキシ−ポリエチレングリコールおよび分岐モノメトキシ−ポリエチレングリコールからなる群から選択される請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
ポリエチレングリコールホモポリマーが約２００００〜約４００００ダルトンの分子量を有する請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
ポリエチレングリコールホモポリマーが約２００００ダルトンの分子量を有する請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
ポリエチレングリコールホモポリマーが約３００００ダルトンの分子量を有する請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
ポリエチレングリコールホモポリマーが約４００００ダルトンの分子量を有する請求項１７記載の組成物。
【請求項２１】
組成物がＰＥＧ化された天然のヒトＩＬ−１８（配列番号１）である請求項１７記載の組成物。
【請求項２２】
天然のヒトＩＬ−１８（配列番号１）が残基３８のシステインおよび残基６８のシステインでＰＥＧ化されている請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
治療的に有効量の請求項１８記載の組成物を投与することにより患者における癌を治療する方法。
【請求項２４】
癌が、腎臓細胞癌、骨髄腫、リンパ腫、および黒色腫からなる群から選択される免疫感受性腫瘍を含む請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、変異体が残基３８のシステインで水溶性ポリマーにコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項２６】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、変異体が残基７８のシステインで水溶性ポリマーにコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項２７】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し、残基１２１のシステインで水溶性ポリマーにコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項２８】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、残基１４４のシステインで水溶性ポリマーにコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項２９】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、残基１５７のシステインで水溶性ポリマーにコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項３０】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、残基１４４のシステインで水溶性ポリマーにコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項３１】
水溶性ポリマーが：約２００００〜約４００００ダルトンの分子量を有する直鎖ポリエチレングリコールホモポリマーおよび約２００００〜約４００００ダルトンの分子量を有する分岐鎖ポリエチレングリコールホモポリマーからなる群から選択される請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
直鎖ポリエチレングリコールホモポリマーが約２００００ダルトンの分子量を有する請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
ヒトＩＬ−１８置換変異体が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、変異体が残基１５７でのシステインで水溶性ポリマーとコンジュゲートしている請求項１９記載の組成物。
【請求項３４】
水溶性ポリマーが：約２００００〜約４００００ダルトンの分子量を有する直鎖ポリエチレングリコールホモポリマーである請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
直鎖ポリエチレングリコールホモポリマーが：約２００００ダルトンの分子量を有する請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
生物学的に活性な組成物を調製する方法であって：
（ａ）ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を得る工程；および
（ｂ）ポリペプチドを官能化水溶性ポリマーと接触させる工程を含む方法。
【請求項３７】
生物学的に活性な組成物を調製する方法であって：
（ａ）配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択されるヒトＩＬ−１８置換変異ポリペプチドを得る工程；および
（ｂ）ポリペプチドを官能化水溶性ポリマーと接触させる工程を含む方法。
【請求項３８】
官能化水溶性ポリマーが：メトキシポリエチレングリコールスクシニミジルプロピオネート、ＭＷ２０，０００；メトキシポリエチレングリコールスクシニミジルプロピオネート、ＭＷ３０，０００；メトキシポリエチレングリコールスクシニミジルブタノエート、ＭＷ２０，０００；カルボキシメチル化メトキシポリエチレングリコールのスクシニミジルエステル、ＭＷ２０，０００；メトキシポリエチレングリコールアルデヒド、ＭＷ２０，０００；メトキシポリエチレングリコールアルデヒド、ＭＷ３０，０００；メトキシポリエチレングリコールヒドラジド、ＭＷ２０，０００；メトキシポリエチレングリコールマレイミド、ＭＷ２０，０００；メトキシポリエチレングリコールマレイミド、ＭＷ３０，０００；メトキシポリエチレングリコールオルトピリジルジスルフィド、ＭＷ２０，０００；メトキシポリエチレングリコールオルトピリジルジスルフィド、ＭＷ３０，０００；メトキシポリエチレングリコールヨードアセトアミド、ＭＷ２０，０００；およびメトキシポリエチレングリコールヨードアセトアミド、ＭＷ３０，０００からなる群から選択されるメンバーである請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
請求項３６記載の方法により製造される生成物。
【請求項４０】
請求項３７記載の方法により製造される生成物。
【請求項４１】
ヒトＩＬ−１８（配列番号１）を水溶性ポリマーにコンジュゲートさせる工程を含むヒトＩＬ−１８（配列番号１）の薬物動態特性および薬力学的作用を改善する方法。
【請求項４２】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択されるヒトＩＬ−１８置換変異体の薬物動態特性および薬力学的作用を改善する方法であって、ヒトＩＬ−１８置換変異体を水溶性ポリマーにコンジュゲートさせる工程を含む方法。
【請求項４３】
水溶性ポリマーがポリエチレングリコールホモポリマーである請求項３３記載の方法。
【請求項４４】
皮下生体利用性が改善されている請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
皮下生体利用性が改善されている請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
皮下生体利用性が改善され、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）との結合を減少させる請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
皮下生体利用性が改善され、ＩＬ−１８ＢＰとの結合を減少させる請求項４２記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１１−１０５７３７（Ｐ２０１１−１０５７３７Ａ）
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１０９８４（Ｐ２０１１−１０９８４）
【出願日】平成２３年１月２１日（２０１１．１．２１）
【分割の表示】特願２００６−５０９９５６（Ｐ２００６−５０９９５６）の分割
【原出願日】平成１６年４月１３日（２００４．４．１３）
【出願人】（５９１００２９５７）グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (341)
【氏名又は名称原語表記】ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０９８４（Ｐ２０１１−１０９８４）
【出願日】平成２３年１月２１日（２０１１．１．２１）
【分割の表示】特願２００６−５０９９５６（Ｐ２００６−５０９９５６）の分割
【原出願日】平成１６年４月１３日（２００４．４．１３）
【出願人】（５９１００２９５７）グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (341)
【氏名又は名称原語表記】ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
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