ヒトＴＮＦαに結合するヒト抗体
【課題】ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）活性を阻害する方法を提供する。
【解決手段】ヒトＴＮＦαを抗体と、ヒトＴＮＦα活性が阻害されるように接触させることを含む、ヒトＴＮＦα活性を阻害する方法であって、ここに、この抗体はヒトＴＮＦαから１×１０-8Ｍ以下のＫd及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分であり、この両者は表面プラズモン共鳴により測定されたものであり、且つ該抗体はヒトＴＮＦαの細胞障害性を、標準イン・ビトロＬ９２９アッセイで１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50で中和する。
【解決手段】ヒトＴＮＦαを抗体と、ヒトＴＮＦα活性が阻害されるように接触させることを含む、ヒトＴＮＦα活性を阻害する方法であって、ここに、この抗体はヒトＴＮＦαから１×１０-8Ｍ以下のＫd及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分であり、この両者は表面プラズモン共鳴により測定されたものであり、且つ該抗体はヒトＴＮＦαの細胞障害性を、標準イン・ビトロＬ９２９アッセイで１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50で中和する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、単球及びマクロファージを含む多くの型の細胞により産生されるサイトカインであり、それは、元々、ある種のマウスの腫瘍の壊死を誘導するその能力に基づいて同定されたものである。（例えば、非特許文献１参照）。その後、悪液質と関連するカケクチンと呼ばれる因子が、ＴＮＦαと同一分子であることが示された。ＴＮＦαは、ショックの媒介に関与してきた（例えば、非特許文献２、非特許文献３参照）。その上、ＴＮＦαは、敗血症、感染症、自己免疫疾患、移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む様々な他のヒトの病気及び障害の病態生理学に関係してきた（例えば、非特許文献４、特許文献１、特許文献２、非特許文献５、非特許文献６参照）。
【０００２】
種々のヒトの病気におけるヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）の有害な役割の故に、治療ストラテジーは、ｈＴＮＦαを阻害し又は打ち消すようにデザインされてきた。特に、ｈＴＮＦαに結合する（そして中和する）抗体が、ｈＴＮＦα活性を阻害する手段として探究されてきた。最も初期のかかる抗体の幾つかは、ｈＴＮＦαで免疫されたマウスのリンパ球から調製されたハイブリドーマにより分泌されるマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であった（例えば、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献４、特許文献１、特許文献３、特許文献４、特許文献２参照）。これらのマウスの抗ｈＴＮＦα抗体は、しばしば、ｈＴＮＦαに対する高い親和性（例えば、Ｋｄ≦１０-9Ｍ）を示し且つｈＴＮＦα活性を中和することができたが、それらのイン・ビボでの利用は、マウス抗体のヒトへの投与に関係した問題例えば短い血清の半減期、ある種のヒトのエフェクター機能の引き金を引くことができないこと及びヒトにおけるマウス抗体に対する望ましくない免疫応答（「ヒト抗マウス抗体」（ＨＡＭＡ）反応）の誘出により制限され得る。
【０００３】
ヒトにおける完全にマウスの抗体の使用に関係する問題を克服する試みにおいて、マウス抗ｈＴＮＦα抗体は、遺伝子工学的に一層「ヒト様」にされてきた。例えば、抗体鎖の可変領域がマウス由来で且つ定常領域がヒト由来であるキメラ抗体が製造されてきた（非特許文献１１、特許文献５）。更に、抗体の可変領域の超可変ドメインはマウス由来であるが、可変領域の残りと抗体の定常領域がヒト由来であるヒト化抗体も製造されてきた（特許文献６）。しかしながら、これらのキメラ抗体及びヒト化抗体は、未だ幾らかのマウス配列を保持しているので、それらは、やはり望ましくない免疫反応、ヒトの抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応を、特に、例えばリウマチ様関節炎等の慢性適応症のために長期間投与した場合に誘出し得る（例えば、非特許文献１２、非特許文献１３参照）。
【０００４】
マウスのｍＡｂ又はその誘導体（例えば、キメラ又はヒト化抗体）より好適なｈＴＮＦα阻害剤は、完全にヒトの抗ｈＴＮＦα抗体であろう。何故なら、かかる剤は、たとえ長期間使用しても、ＨＡＭＡ反応を誘出しないからである。ｈＴＮＦαに対するヒトモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマ技術を用いて製造されてきた（非特許文献１４、非特許文献１５、特許文献７）。しかしながら、これらのハイブリドーマ由来のモノクローナル自己抗体は、慣用の方法で計算するには低過ぎるｈＴＮＦαに対する親和性を有し、可溶性のｈＴＮＦαに結合することができず、且つｈＴＮＦαにより誘導される細胞障害作用を中和することができなかった（Boyle,等;前出、参照）。その上、ヒトハイブリドーマ技術の成功は、ヒトの末梢血液中の、ｈＴＮＦαに特異的な自己抗体を産生するリンパ球の自然の存在に依存している。ある研究では、ｈＴＮＦαに対する血清自己抗体がヒト患者で検出された（非特許文献１６、非特許文献１７）が、他の研究では、検出されていない（非特許文献１８）。
【０００５】
天然のヒトの抗ｈＴＮＦα抗体の代替物は、組換えｈＴＮＦα抗体であろう。ｈＴＮＦαに比較的低い親和性（即ち、Ｋd〜１０-7Ｍ）及び速い解離速度（即ち、Ｋoff〜１０-2秒-1）で結合する組換えヒト抗体は、記載されている（非特許文献１９）。しかしながら、それらの比較的速い解離動力学の故に、これらの抗体は、治療用途に適していない。更に、組換えのヒトの抗ｈＴＮＦαは、ｈＴＮＦα活性を中和せず、むしろｈＴＮＦαの細胞表面への結合を促進してｈＴＮＦαの内在化を促進すると記載されてきた（非特許文献２０、特許文献８）。
【０００６】
従って、可溶性ｈＴＮＦαと高い親和性及び遅い解離動力学で結合し、ｈＴＮＦα誘導された細胞障害性（イン・ビトロ及びイン・ビボ）及びｈＴＮＦα誘導された細胞活性を含むｈＴＮＦα活性を中和する能力を有するヒト抗体例えば組換えヒト抗体がやはり必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】Moeller等の米国特許第５，２３１，０２４号
【特許文献２】Moeller,A.等による欧州特許出願第２６０６１０Ｂ１号
【特許文献３】Wallach,D.による欧州特許公開第１８６８３３Ｂ１号
【特許文献４】Old等による欧州特許出願公開第２１８８６８Ａ１号
【特許文献５】Dassona,P.E.等によるＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９２／１６５５３
【特許文献６】Adair,J.R.等によるＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９２／１１３８３
【特許文献７】Boyle,等による欧州特許出願公開第６１４９８４Ａ２号
【特許文献８】Aston,R.等によるＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９２／０３１４５
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Old,L.(1985)Science230:630-632
【非特許文献２】Beutler,B.及びCerami,A.(1988)Annu.Rev.Biochem.57:505-518
【非特許文献３】Beutler,B.及びCerami,A.(1989)Annu.Rev.Immunol.7:625-655
【非特許文献４】Moeller,A.等(1990)Cytokine 2:162-169
【非特許文献５】Vasilli,P.(1992)Annu.Rev.Immunol.10:411-452
【非特許文献６】Tracey,K.J.及びCerami,A.(1994)Annu.Rev.Med.45:491-503
【非特許文献７】Hahn T;等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3814-3818
【非特許文献８】Liang,C-M.,等(1986)Biochem.Biophys.Res.Commun.137:847-854
【非特許文献９】Hirai,M.,等(1987)J.Immunol.Methods 96:57-62
【非特許文献１０】Fendly,B.M.,等(1987)Hybridoma 6:359-370
【非特許文献１１】Knight,D.M.等(1993)Mol.Immunol.30:1443-1453
【非特許文献１２】Elliott,M.J.,等(1994)Lancet 344:1125-1127
【非特許文献１３】Elliot,M.J.,等(1994)Lancet 344:1105-1110
【非特許文献１４】Boyle,P.,等(1993)Cell.Immunol.152:556-568
【非特許文献１５】Boyle,P.,等(1993)Cell.Immunol.152:569-581
【非特許文献１６】Fomsgaard,A.,等(1989)Scand.J.Immunol.30:219-223
【非特許文献１７】Bendtzen,K.,等(1990)Prog.Leukocyte Biol.10B:447-452
【非特許文献１８】Leusch,H-G.,等(1991)J.Immunol.Methods139:145-147
【非特許文献１９】Griffiths,A.D.,等(1993)EMBO J.12:725-734
【非特許文献２０】Lidbury,A.,等(1994)Biotechnol.Ther.5:27-45
【発明の概要】
【０００９】
発明の要約
この発明は、ヒトＴＮＦαに特異的に結合するヒト抗体好ましくは組換えヒト抗体を提供する。この発明の抗体は、ｈＴＮＦαへの高い親和性及び遅い解離動力学での結合により及び、ｈＴＮＦα誘導された細胞障害性（イン・ビトロ及びイン・ビボ）及びｈＴＮＦα誘導された細胞活性化を含むｈＴＮＦα活性を中和することにより特徴付けられる。この発明の抗体は、更に、ｈＴＮＦαには結合するがｈＴＮＦβ（リンホトキシン）には結合しないこと及びヒトＴＮＦαに加えて他の霊長類のＴＮＦα及び非霊長類ＴＮＦαに結合する能力を有することにより特徴付けられる。
【００１０】
この発明の抗体は、完全長であってもよいし（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）又は抗原結合部分のみを含んでもよい（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ')2又はｓｃＦｖ断片）。Ｄ２Ｅ７と呼ばれるこの発明の最も好適な組換え抗体は、SEQ ID NO:３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメイン及びSEQ ID NO:４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。好ましくは、Ｄ２Ｅ７抗体は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する。
【００１１】
一具体例において、この発明は、１×１０-8Ｍ以下のＫd及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数でヒトＴＮＦαから解離し（これら両定数は、表面プラズモン共鳴により測定する）、１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50の標準的イン・ビトロＬ９２９アッセイにおけるヒトＴＮＦα細胞障害性を中和する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。一層好ましくは、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は、５×１０-4ｓ-1以下のＫoffで、尚一層好ましくは、１×１０-4ｓ-1以下のＫoffでヒトＴＮＦαから解離する。一層好ましくは、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は、１×１０-8Ｍ以下のＩＣ50、尚一層好ましくは、１×１０-9Ｍ以下のＩＣ50、更に一層好ましくは、５×１０-10Ｍ以下のＩＣ50の標準的イン・ビトロＬ９２９アッセイにおけるヒトＴＮＦα細胞障害性を中和する。
【００１２】
他の具体例において、この発明は、下記の特徴を有するヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する：
ａ）表面プラズモン共鳴により測定して、１×１０-3ｓ-1以下のＫoffでヒトＴＮＦαから解離する；
ｂ）SEQ ID NO:３のアミノ酸配列又は位置１、４、５、７若しくは８の単一のアラニン置換により又は位置１、３、４、６、７、８及び／若しくは９の１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有する；
ｃ）SEQ ID NO:４のアミノ酸配列又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１の単一のアラニン置換により又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／若しくは１２の１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
【００１３】
一層好ましくは、抗体又はその抗原結合部分は、５×１０-4ｓ-1以下のＫoffでヒトＴＮＦαから解離する。更に一層好ましくは、この抗体又はその抗原結合部分は、１×１０-4ｓ-1以下のＫoffでヒトＴＮＦαから解離する。
【００１４】
更に別の具体例において、この発明は、SEQ ID NO:３のアミノ酸配列又は位置１、４、５、７若しくは８の単一アラニン置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有するＬＣＶＲ及びSEQ ID NO:４のアミノ酸配列又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１の単一アラニン置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有するＨＣＶＲを有するヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。一層好ましくは、ＬＣＶＲは、更に、SEQ ID NO:５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインを有し且つＨＣＶＲは、更に、SEQ ID NO:６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインを有する。更に一層好ましくは、ＬＣＶＲは、更に、SEQ ID NO:７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを有し且つＨＣＶＲは、SEQ ID NO:８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを有する。
【００１５】
更に別の具体例において、この発明は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。ある具体例において、この抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域を有する。更に別の具体例において、この抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ')2断片又は単一鎖のＦｖ断片である。
【００１６】
更に別の具体例において、この発明は、SEQ ID NO:３、SEQ ID NO:１１、SEQID NO:１２、SEQ ID NO:１３、SEQ ID NO:１４、SEQ ID NO:１５、SEQ ID NO:１６、SEQ ID NO:１７、SEQ ID NO:１８、SEQ ID NO:１９、SEQ ID NO:２０、SEQID NO:２１、SEQ ID NO:２２、SEQ ID NO:２３、SEQ ID NO:２４、SEQ ID NO:２５、SEQ ID NO:２６よりなる群から選択するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有するＬＣＶＲ又はSEQ ID NO:４、SEQ ID NO:２７、SEQ ID NO:２８、SEQID NO:２９、SEQ ID NO:３０、SEQ ID NO:３１、SEQ ID NO:３２、SEQ ID NO:３３、SEQ ID NO:３４及びSEQ ID NO:３５よりなる群から選択するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有するＨＣＶＲを有する抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００１７】
更に別の具体例において、この発明は、ヒトＴＮＦαの活性を中和するがヒトＴＮＦβ（リンホトキシン）の活性を中和しない単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。好適具体例において、ヒト抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＴＮＦα、チンパンジーＴＮＦα及び、ヒヒＴＮＦα、キヌザルＴＮＦα、カニクイザルＴＮＦα及びアカゲザルＴＮＦαよりなる群から選択する少なくとも一種の霊長類ＴＮＦαの活性を中和する。好ましくは、この抗体は又、少なくとも一種の非霊長類ＴＮＦαの活性をも中和する。例えば、一つのサブ具体例において、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は又、イヌＴＮＦαの活性をも中和する。他のサブ具体例において、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は又、ブタＴＮＦαの活性をも中和する。更に別のサブ具体例においては、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は又、マウスＴＮＦαの活性をも中和する。
【００１８】
この発明の他の面は、この発明の抗体又は抗原結合部分をコードする核酸分子に関係する。Ｄ２Ｅ７ＬＣＶＲをコードするこの発明の好適な核酸は、図７及びSEQ ID NO:３６に示したヌクレオチド配列を有する。Ｄ２Ｅ７ＨＣＶＲをコードするこの発明の他の好適な核酸は、図８及びSEQ ID NO:３７に示したヌクレオチド配列を有する。この発明の抗体をコードする核酸を有する組換え発現ベクター及びかかるベクターが導入された宿主細胞も又、この発明に包含され、それは、この発明の宿主細胞を培養することによるこの発明の抗体の製造方法である。
【００１９】
この発明の更に別の面は、この発明の抗体又はその抗原結合部分を用いてヒトＴＮＦα活性を阻害する方法に関係する。一具体例において、この方法は、ヒトＴＮＦαをこの発明の抗体又はその抗原結合部分と、ヒトＴＮＦα活性が阻害されるように接触させることを含む。他の具体例において、この方法は、この発明の抗体又はその抗原結合部分を、ＴＮＦα活性が有害な病気を患っているヒト患者に、そのヒト患者におけるヒトＴＮＦα活性が阻害されるように投与することを含む。この病気は、例えば、敗血症、自己免疫疾患（例えば、リウマチ様関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎及びネフローゼ症候群）、感染性疾患、悪性疾患、移植の拒絶又は移植片宿主病、肺病、骨の病気、腸疾患又は心臓病であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】Ｄ２Ｅ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（Ｄ２Ｅ７ＶＬ；SEQ ID NO:１にも示されている）、Ｄ２Ｅ７ＶＬのアラニンスキャン変異物（ＬＤ２Ｅ７*．Ａ１、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ３、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ４、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ５、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ７及びＬＤ２Ｅ７*．Ａ８）、Ｄ２Ｅ７関連抗体２ＳＤ４の軽鎖可変領域（２ＳＤ４ＶＬ；SEQ ID NO:９にも示されている）及び他のＤ２Ｅ７関連軽鎖可変領域（ＥＰＢ１２、ＶＬ１０Ｅ４、ＶＬ１００Ａ９、ＶＬ１００Ｄ２、ＶＬ１０Ｆ４、ＬＯＥ５、ＶＬＬＯＦ９、ＶＬＬ０Ｆ１０、ＶＬＬＯＧ７、ＶＬＬＯＧ９、ＶＬＬＯＨ１、ＶＬＬＯＨ１０、ＶＬ１Ｂ７、ＶＬ１Ｃ１、ＶＬ１Ｃ７、ＶＬ０．１Ｆ４、ＶＬ０．１Ｈ８、ＬＯＥ７、ＬＯＥ７．Ａ及びＬＯＥ７．Ｔ）のアミノ酸配列を示す図である。図１Ａは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２及びＣＤＲ２ドメインを示す。軽鎖のＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）及びＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）ドメインを、四角で囲んである。
【図１Ｂ】Ｄ２Ｅ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（Ｄ２Ｅ７ＶＬ；SEQ ID NO:１にも示されている）、Ｄ２Ｅ７ＶＬのアラニンスキャン変異物（ＬＤ２Ｅ７*．Ａ１、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ３、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ４、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ５、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ７及びＬＤ２Ｅ７*．Ａ８）、Ｄ２Ｅ７関連抗体２ＳＤ４の軽鎖可変領域（２ＳＤ４ＶＬ；SEQ ID NO:９にも示されている）及び他のＤ２Ｅ７関連軽鎖可変領域（ＥＰＢ１２、ＶＬ１０Ｅ４、ＶＬ１００Ａ９、ＶＬ１００Ｄ２、ＶＬ１０Ｆ４、ＬＯＥ５、ＶＬＬＯＦ９、ＶＬＬ０Ｆ１０、ＶＬＬＯＧ７、ＶＬＬＯＧ９、ＶＬＬＯＨ１、ＶＬＬＯＨ１０、ＶＬ１Ｂ７、ＶＬ１Ｃ１、ＶＬ１Ｃ７、ＶＬ０．１Ｆ４、ＶＬ０．１Ｈ８、ＬＯＥ７、ＬＯＥ７．Ａ及びＬＯＥ７．Ｔ）のアミノ酸配列を示す図である。図１Ｂは、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４ドメインを示す。軽鎖のＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）及びＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）ドメインを、四角で囲んである。
【図２Ａ】Ｄ２Ｅ７の重鎖可変領域（Ｄ２Ｅ７ＶＨ；SEQ ID NO:２にも示されている）、Ｄ２Ｅ７ＶＨのアラニンスキャン変異物（ＨＤ２Ｅ７*．Ａ１、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ２、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ３、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ４、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ５、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ６、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ７、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ８及びＨＤ２Ｅ７*．Ａ９）、Ｄ２Ｅ７関連抗体２ＳＤ４の重鎖可変領域（２ＳＤ４ＶＨ；SEQ ID NO:１０にも示されている）及び他のＤ２Ｅ７関連重鎖可変領域（ＶＨ１Ｂ１１、ＶＨ１Ｄ８、ＶＨ１Ａ１１、ＶＨ１Ｂ１２、ＶＨ１−Ｄ２、ＶＨ１Ｅ４、ＶＨ１Ｆ６、ＶＨ１Ｇ１、３Ｃ−Ｈ２、ＶＨ１−Ｄ２．Ｎ及びＶＨ１−Ｄ２．Ｙ）のアミノ酸配列を示す図である。図２Ａは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２及びＣＤＲ２ドメインを示す。重鎖のＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）及びＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）を四角で囲んである。
【図２Ｂ】Ｄ２Ｅ７の重鎖可変領域（Ｄ２Ｅ７ＶＨ；SEQ ID NO:２にも示されている）、Ｄ２Ｅ７ＶＨのアラニンスキャン変異物（ＨＤ２Ｅ７*．Ａ１、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ２、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ３、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ４、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ５、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ６、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ７、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ８及びＨＤ２Ｅ７*．Ａ９）、Ｄ２Ｅ７関連抗体２ＳＤ４の重鎖可変領域（２ＳＤ４ＶＨ；SEQ ID NO:１０にも示されている）及び他のＤ２Ｅ７関連重鎖可変領域（ＶＨ１Ｂ１１、ＶＨ１Ｄ８、ＶＨ１Ａ１１、ＶＨ１Ｂ１２、ＶＨ１−Ｄ２、ＶＨ１Ｅ４、ＶＨ１Ｆ６、ＶＨ１Ｇ１、３Ｃ−Ｈ２、ＶＨ１−Ｄ２．Ｎ及びＶＨ１−Ｄ２．Ｙ）のアミノ酸配列を示す図である。図２Ｂは、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４ドメインを示す。重鎖のＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）及びＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）を四角で囲んである。
【図３】ＴＮＦα誘導されたＬ９２９細胞障害性の、ヒトの抗ｈＴＮＦα抗体Ｄ２Ｅ７による阻害を、マウスの抗ｈＴＮＦα抗体ＭＡＫ１９５と比較して描いたグラフである。
【図４】Ｕ−９３７細胞上のｈＴＮＦαレセプターへのｒｈＴＮＦαの結合の、ヒトの抗ｈＴＮＦα抗体Ｄ２Ｅ７による阻害を、マウスの抗ｈＴＮＦα抗体ＭＡＫ１９５と比較して描いたグラフである。
【図５】ＴＮＦα誘導されたＥＬＡＭ−１のＨＵＶＥＣにおける発現の、ヒト抗ｈＴＮＦα抗体Ｄ２Ｅ７による阻害を、マウスの抗ｈＴＮＦα抗体ＭＡＫ１９５と比較して描いたグラフである。
【図６】ヒト抗ｈＴＮＦα抗体Ｄ２Ｅ７（黒い棒）の投与による、Ｄ−ガラクトサミン感作されたマウスにおけるＴＮＦα誘導される致死性からの防護を、マウスの抗ｈＴＮＦα抗体ＭＡＫ１９５（斜線を引いた棒）と比較して描いた棒グラフである。
【図７】Ｄ２Ｅ７の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の下に予想されるアミノ酸配列と共に示す図である。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３領域に下線を引いてある。
【図８】Ｄ２Ｅ７の重鎖可変領域のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の下に予想されるアミノ酸配列と共に示す図である。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に下線を引いてある。
【図９】多発性関節炎モデルとしてのＴｇ１９７トランスジェニックマウスの平均関節サイズに対するに対するＤ２Ｅ７抗体処理の効果を描いたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
この発明は、ＴＮＦαに、高い親和性、低い解離速度及び高い中和能力をもって結合する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分に関係する。この発明の種々の面は、抗体及び抗体断片、及びそれらの製薬組成物、並びに、かかる抗体及び断片を製造するための核酸、組換え発現ベクター及び宿主細胞に関係する。ヒトＴＮＦαを検出し又はヒトＴＮＦα活性を阻害するためのこの発明の抗体の利用方法（イン・ビトロ又はイン・ビボ）も又、この発明に包含される。
【００２２】
本発明が一層容易に理解され得るように、若干の用語を先ず定義する。用語「ヒトＴＮＦα」（ここでは、ｈＴＮＦα又は単にｈＴＮＦと略記する）は、ここでは、１７ｋＤの分泌型及び２６ｋＤの膜結合型として存在し、生物学的に活性な型が非共有結合により結合された１７ｋＤ分子の３量体よりなるヒトのサイトカインをいうことを意図している。ｈＴＮＦαの構造は、例えば、Pennica,D.,等(1984)Nature 312:724-729;Davis,J.M.,等(1987)Biochemistry 26:1322-1326;及びJones,E.Y.,等(1989)Nature 338:225-228に、更に説明されている。用語ヒトＴＮＦαは、標準的組換え発現方法により製造され得る又は市販の組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）（ミネソタ、Minneapolis在、R&D Systems,カタログ番号210-TA）を包含することを意図している。
【００２３】
用語「抗体」は、ここで用いる場合、ジスルフィド結合により相互に結合された４つのポリペプチド鎖｛２つの重（Ｌ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖｝よりなる免疫グロブリン分子をいうことを意図している。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨと略す）及び重鎖定常領域よりなる。この重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３よりなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ又はＶＬと略す）及び軽鎖定常領域よりなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬよりなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、更に、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる一層保存されている領域に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分割され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲよりなり、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００２４】
用語抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）は、ここで用いる場合、抗原（例えば、ｈＴＮＦα）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片をいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により遂行され得ることが示されている。用語抗体の「抗原結合部分」に包含される結合性断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインよりなる一価断片；（ii）Ｆ(ab')2断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋により架橋された２つのＦａｂ断片よりなる二価断片；（iii)ＶＨ及びＣＨ１ドメインよりなるＦｄ断片；（iv）抗体の一本のアームのＶＬ及びＶＨドメインよりなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインよりなるｄＡｂ断片（Ward等(1989)Nature 341:544-546）；及び（vi）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によりコードされているにもかかわらず、組換え技術を用いて、それらを単一の蛋白質鎖（ＶＬ及びＶＨ領域が対をなして一価分子を形成する）として作ることのできる合成リンカーにより、それらを連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Bird等(1988)Science 242:423-426;及びHuston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883参照）。かかる一本鎖抗体も又、用語抗体の「抗原結合部分」に包含されることを意図している。他の形態の一本鎖抗体例えばディアボディー（diabody）も包含される。ディアボディーは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現され（同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を与えるには短過ぎるリンカーは用いない）、それにより、これらのドメインを他の鎖の相補性ドメインと対にさせて２抗原結合部位を造る二価の二特異性抗体である（例えば、Holliger,P.,等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak,R.J.,等(1994)Structure 2:1121-1123参照）。
【００２５】
尚、更に、抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体の部分の他の１つ以上の蛋白質又はペプチドとの共有又は非共有結合により形成される一層大きい免疫接着分子の部分であってよい。かかる免疫接着分子の例には、二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を造るための４量体のｓｃＦｖ分子を造るストレプトアビジンコア領域の利用（Kipriyanov,S.M.,等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101）及びシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの利用（Kipriyanov,S.M.,等(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058）が含まれる。Ｆａｂ及びＦ(ab')2断片等の抗体部分は、慣用の技術例えば、それぞれ、全抗体のパパイン又はペプシン消化を用いて、全抗体から調製することができる。その上、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を、ここに記載のように、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。
【００２６】
用語「ヒト抗体」は、ここで用いる場合、ヒトの生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。この発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、イン・ビトロでランダム若しくは位置指定突然変異誘発により又はイン・ビボで体細胞突然変異により誘導された突然変異）を、例えばＣＤＲ中に（特に、ＣＤＲ３中に）含んでよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、ここで用いる場合、他の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図していない。
【００２７】
用語「組換えヒト抗体」は、ここで用いる場合、組換え手段により調製され、発現され、造られ又は単離されたすべてのヒト抗体例えば宿主細胞内にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体（下記の第ＩＩ節で更に説明する）、組換え組合せヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（下記の第III節で更に説明する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Taylor,L.D.,等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295参照）又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製され、発現され、造られ又は単離された抗体を含むことを意図している。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する。しかしながら、ある具体例においては、かかる組換えヒト抗体をイン・ビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックな動物を用いる場合には、イン・ビボ体細胞突然変異誘発）にかけ、従って、これらの組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ及びＶＬ配列に由来し関係するにもかかわらず、天然にはイン・ビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に存在し得ない配列である。
【００２８】
「単離された抗体」は、ここで用いる場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいうことを意図している（例えば、ｈＴＮＦαに特異的に結合する単離された抗体は、ｈＴＮＦα以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ｈＴＮＦαに特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原例えば他の種からのＴＮＦα分子に対する交差反応性を有する（下記に、一層詳細に論じる）。その上、単離された抗体は、他の細胞性物質及び／又は化学物質を実質的に含まない。
【００２９】
「中和抗体」は、ここで用いる場合（又は、「ｈＴＮＦα活性を中和した抗体」）、そのｈＴＮＦαへの結合がｈＴＮＦαの生物学的活性の阻害を生じる抗体をいうことを意図している。このｈＴＮＦαの生物学的活性の阻害は、ｈＴＮＦαの生物学的活性の一種以上の指標例えばｈＴＮＦα誘導された細胞障害性（イン・ビトロ又はイン・ビボ）、ｈＴＮＦα誘導された細胞活性化及びｈＴＮＦαレセプターに対するｈＴＮＦαの結合を測定することにより評価することができる。これらのｈＴＮＦαの生物学的活性の指標は、当分野で公知の幾つかの標準的イン・ビトロ又はイン・ビボアッセイの１つ以上により評価することができる（実施例４参照）。好ましくは、ｈＴＮＦα活性を中和する抗体の能力を、Ｌ９２９細胞のｈＴＮＦα誘導された細胞障害性の阻害により評価する。ｈＴＮＦα活性の更なる又は別のパラメーターとして、ＨＵＶＥＣ上でのＥＬＡＭ−１のｈＴＮＦα誘導された発現を阻止する抗体の能力を、ｈＴＮＦα誘導された細胞活性化の尺度として、評価することができる。
【００３０】
用語「表面プラズモン共鳴」は、ここで用いる場合、リアルタイムの生体特異的相互作用の分析を、バイオセンサーマトリックス内の蛋白質濃度の変化を例えばＢＩＡコアシステム（スゥエーデン国、Uppsala及びニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia Biosensor AB）を用いて検出することにより可能にする光学的現象をいう。更なる説明は、実施例１及びJonsson,U.,等(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26;Jonsson,U.,等(1991)Biotechniques 11:620-627;Johnsson,B.,等(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131;及びJohnnson,B.,等(1991)Anal.Biochem.198:268-277を参照されたい。
【００３１】
用語「Ｋoff」は、ここで用いる場合、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数をいうことを意図している。
【００３２】
用語「Ｋd」は、ここで用いる場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数をいうことを意図している。
【００３３】
用語「核酸分子」は、ここで用いる場合、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図している。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【００３４】
用語「単離された核酸分子」は、ｈＴＮＦαに結合する抗体又は抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関してここで用いる場合、抗体又は抗体部分をコードするヌクレオチド配列がｈＴＮＦα以外の抗原と結合する抗体又は抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸分子をいうことを意図しており、この他の配列は、天然において、ヒトのゲノムＤＮＡ中でこの核酸と隣接していてよい。従って、例えば、抗ＴＮＦα抗体のＶＨ領域をコードするこの発明の単離された核酸は、ＴＮＦα以外の抗原に結合する他のＶＨ領域をコードする他の配列を含まない。
【００３５】
用語「ベクター」は、ここで用いる場合、それに結合された他の核酸を輸送することのできる核酸分子をいうことを意図している。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、それは、追加のＤＮＡセグメントを連結することのできる環状二本鎖ＤＮＡループである。他の型のベクターは、ウイルスベクターであり、そこでは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に連結することができる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律的に複製することができる（例えば、細菌の複製オリジンを有する細菌ベクター及びエピソーム性の哺乳動物用ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物用ベクター）は、宿主細胞中に導入した際に宿主細胞のゲノム中にインテグレートされ得て、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。その上、ある種のベクターは、それらが機能的に結合された遺伝子の発現を指図することができる。かかるベクターは、ここでは、「組換え発現ベクター」（又は単に、「発現ベクター」）として言及する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミド型である。プラスミドは最も普通に用いられるベクターの型であるので、本願明細書においては、「プラスミド」及び「ベクター」を、交換可能に用いることができる。しかしながら、この発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）等の他の型の発現ベクターを包含することを意図している。
【００３６】
用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は、ここで用いる場合、組換え発現ベクターが導入された細胞をいうことを意図している。かかる用語が特定の主題の細胞のみならずかかる細胞の子孫をもいうことを意図していることは、理解されるべきである。突然変異又は環境の影響のために、ある種の変化が続く世代に生じ得るので、かかる子孫が、実際、親細胞と同一でないことはあり得るが、やはり、ここで用いる用語「宿主細胞」の範囲に含まれる。
【００３７】
この発明の種々の面を、下記の小区分で更に詳細に説明する。
Ｉ．ヒトＴＮＦαに結合するヒト抗体
この発明は、ヒトＴＮＦαに高い親和性、低い解離速度及び高い中和能力で結合する、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。好ましくは、この発明のヒト抗体は、組換えの中和ヒト抗ｈＴＮＦα抗体である。最も好適なこの発明の組換えの中和抗体は、ここでは、Ｄ２Ｅ７といい、図１Ａ、１Ｂ及び図２Ａ、２Ｂに、それぞれ示したＶＬ及びＶＨ配列を有する（Ｄ２Ｅ７ＶＬ領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:１にも示されており；Ｄ２Ｅ７ＶＨ領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:２にも示されている）。高い親和性及び遅い解離動力学を示すマウス抗ｈＴＮＦαＭＡＫ１９５ｍＡｂ及びＤ２Ｅ７、２ＳＤ４と配列において関連する他のヒト抗ｈＴＮＦα抗体と比較したＤ２Ｅ７の結合特性を下記にまとめる：
【００３８】
【表１】
【００３９】
Ｄ２Ｅ７抗体及び関連抗体は又、幾つかのイン・ビトロ及びイン・ビボアッセイにより評価したとき、強力なｈＴＮＦα活性中和能力を示す（実施例４参照）。例えば、これらの抗体は、Ｌ９２９細胞のｈＴＮＦα誘導された細胞障害性を、約１０-7〜１０-10Ｍの範囲のＩＣ50で中和する。Ｄ２Ｅ７は、完全長ＩｇＧ１抗体として発現された場合、Ｌ９２９細胞のｈＴＮＦα誘導された細胞障害性を、約１．２５×１０-10ＭのＩＣ50で中和する。その上、このＤ２Ｅ７の中和能力は、抗体がＦａｂ、Ｆ(ab')2又はｓｃＦｖ断片として発現されるときに維持される。Ｄ２Ｅ７は又、ＨＵＶＥＣ上のｈＴＮＦα誘導されたＥＬＡＭ−１発現により測定したとき、ＴＮＦα誘導された細胞活性化をも阻害し（ＩＣ50＝約１．８５×１０-10Ｍ）且つＵ−９３７細胞上のｈＴＮＦαレセプターへのｈＴＮＦαの結合をも阻害する（ＩＣ50＝約１．５６×１０-10Ｍ）。後者に関して、Ｄ２Ｅ７は、ｐ５５及びｐ７５ｈＴＮＦαレセプターの両者へのｈＴＮＦαの結合を阻害する。更にその上、この抗体は、マウスにおいて、イン・ビボで、ｈＴＮＦα誘導される致死性を阻害する（ＥＤ50＝１〜２．５μｇ／マウス）。
【００４０】
Ｄ２Ｅ７の結合特異性に関して、この抗体は、可溶性ｈＴＮＦα、膜貫通型ｈＴＮＦα及び細胞のレセプターに結合したｈＴＮＦαを含む種々の型のヒトＴＮＦαに結合する。Ｄ２Ｅ７は、他のサイトカイン例えばリンホトキシン（ＴＮＦβ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮγ及びＴＧＦβには、特異的に結合しない。しかしながら、Ｄ２Ｅ７は、他の種に由来する腫瘍壊死因子に対する交差反応性を示す。例えば、この抗体は、少なくとも５種類の霊長類ＴＮＦα（チンパンジー、ヒヒ、キヌザル、カニクイザル及びアカゲザル）の活性を、ｈＴＮＦαの中和とほぼ等しいＩＣ50値で中和する（実施例４、小区分Ｅ参照）。Ｄ２Ｅ７は又、ヒトＴＮＦαより約１０００倍弱いが、マウスＴＮＦαの活性をも中和する（実施例４、小区分Ｅ参照）。Ｄ２Ｅ７は又、イヌ及びブタのＴＮＦαにも結合する。
【００４１】
一面において、この発明は、Ｄ２Ｅ７抗体及び抗体部分、Ｄ２Ｅ７関連の抗体及び抗体部分、並びにＤ２Ｅ７と同等の特性例えばｈＴＮＦαに対して高い親和性と低い解離動力学で結合すること及び高い中和能力を有する他のヒトの抗体及び抗体部分に関係する。一具体例において、この発明は、ヒトＴＮＦαから、１×１０-8Ｍ以下のＫd及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数（これら両者は、表面プラズモン共鳴により測定する）で解離し、且つ標準的なイン・ビトロＬ９２９アッセイにおけるヒトＴＮＦα細胞障害性を１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50で中和する、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。一層好ましくは、この単離された抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＴＮＦαから、５×１０-4ｓ-1以下のＫoffで、尚一層好ましくは、１×１０-4ｓ-1以下のＫoffで解離する。一層好ましくは、この単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は、標準的なイン・ビトロのＬ９２９アッセイにおけるヒトＴＮＦα細胞障害性を、１×１０-8Ｍ以下のＩＣ50で、更に一層好ましくは、１×１０-9Ｍ以下のＩＣ50で、そして尚一層好ましくは、５×１０-10Ｍ以下のＩＣ50で中和する。好適具体例において、この抗体は、単離されたヒト組換え抗体又はその抗原結合部分である。他の好適具体例において、この抗体は又、ＴＮＦα誘導された細胞活性化をも、ヒトの臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＴＮＦα誘導されたＥＬＡＭ−１発現についての標準的イン・ビトロアッセイを用いて評価したときに中和する。
【００４２】
Ｋd及びＫoffを測定するための表面プラズモン共鳴は、実施例１に記載のようにして行なうことができる。ＩＣ50値を測定するための標準的なイン・ビトロＬ９２９アッセイを、実施例４、小区分Ａに記載する。ヒトの臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＴＮＦα誘導されたＥＬＡＭ−１発現についての標準的イン・ビトロアッセイを、実施例４、小区分Ｃに記載する。前記の動力学及び中和基準を満たすか又は満たすと予想される組換えヒト抗体の例には、下記の［ＶＨ／ＶＬ］対を有する抗体が含まれ、これらの配列を、図１Ａ、１Ｂ、２Ａ及び２Ｂに示す（動力学及び中和分析については、実施例２、３及び４も参照されたい）：［Ｄ２Ｅ７ＶＨ／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］；［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ１／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ２／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ３／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ４／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ５／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ６／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ７／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ８／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ９／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［Ｄ２Ｅ７ＶＨ／ＬＤ２Ｅ７*.Ａ１］、［Ｄ２Ｅ７ＶＨ／ＬＤ２Ｅ７*.Ａ４］、［Ｄ２Ｅ７ＶＨ／ＬＤ２Ｅ７*.Ａ５］、［Ｄ２Ｅ７ＶＨ／ＬＤ２Ｅ７*.Ａ７］、［Ｄ２Ｅ７ＶＨ／ＬＤ２Ｅ７*.Ａ８］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ９／ＬＤ２Ｅ７*.Ａ１］、［ＶＨ１−Ｄ２／ＬＯＥ７］、［ＶＨ１−Ｄ２．Ｎ／ＬＯＥ７．Ｔ］、［ＶＨ１−Ｄ２．Ｙ／ＬＯＥ７．Ａ］、［ＶＨ１−Ｄ２．Ｎ／ＬＯＥ７．Ａ］、［ＶＨ１−Ｄ２／ＥＰＢ１２］及び［３Ｃ−Ｈ２／ＬＯＥ７］。
【００４３】
抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３ドメインが抗原に対する抗体の結合特異性／親和性に重要な役割を演じていることは、当分野で周知である。従って、他の面において、この発明は、ｈＴＮＦαとの会合に関する遅い解離動力学を有し且つＤ２Ｅ７のものと構造的に同じか又は関連した軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３ドメインを有するヒト抗体に関係する。実施例３で示すように、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３の位置９を、実質的にＫoffに影響を与えずにＡｌａ又はＴｈｒで占めることができる。従って、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３のコンセンサスモチーフは、アミノ酸配列：Ｑ−Ｒ−Ｙ−Ｎ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｙ−（Ｔ／Ａ）（SEQ ID NO:３）を含む。更に、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３の位置１２を、実質的にＫoffに影響を与えずにＴｙｒ又はＡｓｎで占めることができる。従って、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３のコンセンサスモチーフは、アミノ酸配列：Ｖ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−（Ｙ／Ｎ）（SEQ ID NO:４）を含む。その上、実施例２に示すように、Ｄ２Ｅ７重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３ドメインは、実質的にＫoffに影響を与えずに、単一アラニン残基による置換を受けやすい（ＶＬＣＤＲ３内の位置１、４、５、７若しくは８又はＶＨＣＤＲ３内の位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１において）。尚更に、当業者は、アラニンによる置換に対するＤ２Ｅ７ＶＬ及びＶＨＣＤＲ３ドメインの従順性を仮定するならば、やはり、抗体の低い解離速度定数を保持したままでの、ＣＤＲ３ドメイン内の他のアミノ酸の置換、特に保存的アミノ酸での置換が可能であろうことを認めるであろう。「保存的アミノ酸置換」は、ここで用いる場合、一のアミノ酸残基が類似の側鎖を有する他のアミノ酸残基により置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で規定されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。好ましくは、１〜５以下の保存的アミノ酸置換を、Ｄ２Ｅ７ＶＬ及び／又はＶＨＣＤＲ３ドメイン内に作る。一層好ましくは、１〜３以下の保存的アミノ酸置換を、Ｄ２Ｅ７ＶＬ及び／又はＶＨＣＤＲ３ドメイン内に作る。更に、保存的アミノ酸置換は、ｈＴＮＦαへの結合に決定的に重要なアミノ酸位置には作るべきでない。実施例３に示すように、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３の位置２及び５並びにＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３の位置１及び７は、ｈＴＮＦαとの相互作用に決定的に重要であるらしく、従って、保存的アミノ酸置換は、好ましくは、これらの位置には作らない（もっとも、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３の位置５におけるアラニン置換は、上記のように、許容される）。
【００４４】
従って、他の具体例において、この発明は、下記の特性を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する：
ａ）ヒトＴＮＦαから、表面プラズモン共鳴で測定して、１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離し；
ｂ）SEQ ID NO:３のアミノ酸配列、又は位置１、４、５、７若しくは８における単一アラニン置換又は位置１、３、４、６、７、８及び／若しくは９における１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有し；
ｃ）SEQ ID NO:４のアミノ酸配列、又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１における単一アラニン置換又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／若しくは１２における１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
【００４５】
一層好ましくは、抗体又はその抗原結合部分は、５×１０-4ｓ-1以下のＫoffで、ヒトＴＮＦαから解離する。尚一層好ましくは、抗体又はその抗原結合部分は、１×１０-4ｓ-1以下のＫoffでヒトＴＮＦαから解離する。
【００４６】
更に別の具体例において、この発明は、SEQ ID NO:３のアミノ酸配列、又は位置１、４、５、７若しくは８における単一アラニン置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及びSEQ ID NO:４のアミノ酸配列、又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１における単一アラニン置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。好ましくは、ＬＣＶＲは、更に、SEQ ID NO:５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン（即ち、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ２）を有し且つＨＣＶＲは、更に、SEQ ID NO:６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン（即ち、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ２）を有する。尚一層好ましくは、ＬＣＶＲは、更に、SEQ ID NO:７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン（即ち、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ１）を有し且つＨＣＶＲは、SEQ ID NO:８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン（即ち、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ１）を有する。ＶＬのフレームワーク領域は、好ましくは、ＶK Ｉヒト生殖細胞系のファミリーに由来し、一層好ましくは、Ａ２０ヒト生殖細胞系のＶｋ遺伝子に由来し、最も好ましくは、図１Ａ及び１Ｂに示したＤ２Ｅ７ＶＬフレームワーク配列に由来する。これらのＶＨのフレームワーク領域は、好ましくは、ＶH３ヒト生殖細胞系のファミリーに由来し、一層好ましくは、ＤＰ−３１ヒト生殖細胞系のＶＨ遺伝子に由来し、最も好ましくは、図２Ａ及び２Ｂに示したＤ２Ｅ７ＶＨフレームワーク配列に由来する。
【００４７】
更に別の具体例において、この発明は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）（即ち、Ｄ２Ｅ７ＶＬ）及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）（即ち、Ｄ２Ｅ７ＶＨ）を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。ある具体例において、この抗体は、重鎖定常領域例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域を含む。好ましくは、この重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域である。更に、この抗体は、軽鎖定常領域、カッパー軽鎖定常領域又はラムダ軽鎖定常領域を含むことができる。好ましくは、この抗体は、カッパー軽鎖定常領域を含む。或は、この抗体部分は、例えば、Ｆａｂ断片又は一本鎖Ｆｖ断片であってよい。
【００４８】
更に別の具体例において、この発明は、Ｄ２Ｅ７関連ＶＬ及びＶＨＣＤＲ３ドメインを有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分、例えば、SEQ ID NO:３、SEQ ID NO:１１、SEQ ID NO:１２、SEQ ID NO:１３、SEQ ID NO:１４、SEQID NO:１５、SEQ ID NO:１６、SEQ ID NO:１７、SEQ ID NO:１８、SEQ ID NO:１９、SEQ ID NO:２０、SEQ ID NO:２１、SEQ ID NO:２２、SEQ ID NO:２３、SEQID NO:２４、SEQ ID NO:２５及びSEQ ID NO:２６よりなる群から選択するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を有するか又はSEQ ID NO:４、SEQ ID NO:２７、SEQ ID NO:２８、SEQ ID NO:２９、SEQ ID NO:３０、SEQ ID NO:３１、SEQ ID NO:３２、SEQ ID NO:３３、SEQ ID NO:３４及びSEQ ID NO:３５よりなる群から選択するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００４９】
更に別の具体例において、この発明は、ヒトＴＮＦαの活性を中和するが、ヒトＴＮＦβの活性は中和しない組換えヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。好ましくは、抗体又はその抗原結合部分は又、チンパンジーのＴＮＦα及びヒヒＴＮＦα、キヌザルＴＮＦα、カニクイザルＴＮＦα及びアカゲザルＴＮＦαよりなる群から選択する少なくとも一つの更なる霊長類ＴＮＦαの活性をも中和する。好ましくは、この抗体又はその抗原結合部分は、ヒト、チンパンジー及び／又は更なる霊長類のＴＮＦαを、標準的イン・ビトロＬ９２９アッセイにおいて、１×１０-8Ｍ以下の、一層好ましくは１×１０-9Ｍ以下の、尚一層好ましくは５×１０-10Ｍ以下のＩＣ50で中和する。一つのサブ具体例において、この抗体は又、イヌＴＮＦαの活性をも、好ましくは、標準的イン・ビトロＬ９２９アッセイにおいて、１×１０-7Ｍ以下の、一層好ましくは１×１０-8Ｍ以下の、尚一層好ましくは５×１０-9Ｍ以下のＩＣ50で中和する。他のサブ具体例において、この抗体は又、ブタＴＮＦαの活性をも、好ましくは、１×１０-5Ｍ以下の、一層好ましくは１×１０-6Ｍ以下の、尚一層好ましくは５×１０-7Ｍ以下のＩＣ50で中和する。更に別の具体例において、この抗体は又、マウスＴＮＦαの活性をも、好ましくは、１×１０-4Ｍ以下の、一層好ましくは１×１０-5Ｍ以下の、尚一層好ましくは５×１０-6Ｍ以下のＩＣ50で中和する。
【００５０】
この発明の抗体又は抗体部分は、誘導体化したり、他の機能的分子（例えば、他のペプチド又は蛋白質）に結合することができる。従って、この発明の抗体及び抗体部分は、免疫接着分子を含むここに記載のヒト抗ｈＴＮＦα抗体の誘導体化され或は改変された形態を含むことを意図している。例えば、この発明の抗体又は抗体部分は、１つ以上の他の分子実体例えば他の抗体（例えば、２特異性抗体又はディアボディー）、検出可能な薬剤、細胞毒性剤、医薬、及び／又は抗体若しくは抗体部分と他の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグ）との会合を媒介することのできる蛋白質若しくはペプチドと（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性の会合、その他により）機能的に結合することができる。
【００５１】
一つの型の誘導体化抗体は、（同じ型の、又は例えば２特異性抗体を造るには異なる型の）２つ以上の抗体の架橋により生成される。適当な架橋剤には、適当なスペーサーにより分離された２つの異なる反応性の基を有するヘテロ二官能性のもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はホモ二官能性のもの（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）が含まれる。かかるリンカーは、イリノイ州、Rockford在、Pierce Chemical Companyより入手することができる。
【００５２】
この発明の抗体又は抗体部分を誘導体化することのできる有用な検出可能な薬剤には、蛍光性化合物が含まれる。典型的な蛍光性の検出可能な薬剤には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン等が含まれる。抗体は又、検出可能な酵素例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等により誘導体化することもできる。抗体を検出可能な酵素により誘導体化する場合は、それを、その酵素が利用して検出可能な反応生成物を生成する更なる試薬を加えることにより検出する。例えば、検出可能な薬剤、西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素とジアミノベンジジンの添加は、検出可能な彩色された反応生成物を生じる。抗体は又、ビオチンを用いて誘導体化することもでき、アビジン又はストレプトアビジン結合の間接的測定により検出することができる。
【００５３】
II．抗体の発現
本発明の抗体または抗体部分は、宿主細胞中での免疫グロブリンＬおよびＨ鎖の組換え発現によって製造することができる。組換えによって抗体を発現するには、該抗体の免疫グロブリンＬおよびＨ鎖をコードするＤＮＡフラグメントを有する１種類またはそれ以上の組換え発現ベクターを、宿主細胞に核酸移入して、該ＬおよびＨ鎖が、該宿主細胞中で発現され、好ましくは、宿主細胞を培養する培地中に分泌されるようにし、該培地から、抗体を回収することができる。抗体のＨおよびＬ鎖遺伝子を入手し、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入するには、標準的な組換えＤＮＡの方法、例えば、Sambrook,Fritsch & Maniatis編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sedond Ed.,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989);Ausubel,F.M.et al.編、Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates,(1989)およびBossらによる米国特許第4,816,397号明細書に記載のものを用いる。
【００５４】
Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連抗体を発現するには、ＬおよびＨ鎖の可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを初めに得る。これらのＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた、生殖系列のＬおよびＨ鎖可変配列の増幅および修飾によって得ることができる。ヒトＨおよびＬ鎖可変領域の遺伝子に関する生殖系列のＤＮＡ配列は、当技術に公知である［例えば、「Vbase」というヒト生殖系列の配列データベースを参照されたい；また、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson,I.M.,et.al.,(1992)“The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals aboutFifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops”J.Mol.Biol.227:776-798;およびCox,J.P.L.et al.(1994)“A Directory of Human Germ-line Vκ Segments Reveals a Strong Bias in their Usage"Eur.J.Immunol.24:827-846も参照されたい。それぞれの内容は、引用によって本明細書に明示的に組込まれる］。Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連抗体のＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを得るには、ヒト生殖系列のＶＨ遺伝子のＶH３族の一員を標準的なＰＣＲによって増幅する。最も好ましくは、ＤＰ−３１というＶＨ生殖系列の配列を増幅する。Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連抗体のＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを得るには、ヒト生殖系列のＶＬ遺伝子のＶκＩ族の一員を標準的なＰＣＲによって増幅する。最も好ましくは、Ａ２０というＶＬ生殖系列の配列を増幅する。ＤＰ−３１生殖系列ＶＨおよびＡ２０生殖系列ＶＬの配列を増幅する際に用いるのに適したＰＣＲプライマーは、標準的な方法を用いて、上に引用した参考文献に開示されたヌクレオチド配列に基づいて設定できる。
【００５５】
生殖系列のＶＨおよびＶＬフラグメントを得たならば、これらの配列を、本明細書に開示のＤ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連アミノ酸配列をコードするように突然変異させることができる。生殖系列ＶＨおよびＶＬＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を、初めに、Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列と比較して、生殖系列とは異なるＤ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連配列中のアミノ酸残基を特定する。次いで、生殖系列ＤＮＡ配列の適切なヌクレオチドを、突然変異した生殖系列配列が、Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連アミノ酸配列をコードするように、どのヌクレオチドを変化させなければならないかを決定するための遺伝暗号を用いて突然変異させる。生殖系列配列の突然変異誘発は、標準的方法、例えば、ＰＣＲ仲介突然変異形成（突然変異したヌクレオチドをＰＣＲプライマーに組み込む結果、ＰＣＲ産物が突然変異を含む）、または部位指向性突然変異誘発によって実施する。
【００５６】
更に、ＰＣＲ増幅によって得られた「生殖系列」の配列が、フレームワーク領域での真の生殖系列立体配置とのアミノ酸の相違（すなわち、例えば体細胞突然変異の結果としての、真の生殖系列の配列と比較しての増幅された配列中の相違）をコードするならば、これらのアミノ酸の相違は、真の生殖系列配列へと戻すよう変化させること（すなわち、生殖系列立体配置へのフレームワーク残基の「戻し突然変異」）が望ましいと思われることに注目すべきである。
【００５７】
Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントを（上記のような、生殖系列ＶＨおよびＶＬ遺伝子の増幅と突然変異誘発とによって）得たならば、これらのＤＮＡフラグメントは、標準的な組換えＤＮＡの手法によって、例えば、可変領域遺伝子を完全長の抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子へと転換するために、更に操作することができる。これらの操作の際は、ＶＬ−またはＶＨ−コーディングＤＮＡフラグメントを、もう一つのタンパク質、例えば抗体の不変部領域または可変リンカーをコードするもう一つのＤＮＡフラグメントに機能的に結合する。用語「機能的に結合」とは、本明細書に用いられる限りで、二つのＤＮＡフラグメントを結合した結果、該二つのＤＮＡフラグメントがコードするアミノ酸配列がフレーム内に留まることを意味するものとする。
【００５８】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨコーディングＤＮＡをＨ鎖不変部領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードするもう一つのＤＮＡ分子と機能的に結合することによって、完全長のＨ鎖遺伝子へと転換することができる。ヒトＨ鎖不変部領域の遺伝子の配列は、当技術に公知であり［例えば、Kabat,E.A..etal.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242を参照されたい］、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。Ｈ鎖不変部領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの不変部領域であることができるが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の不変部領域である。ＦａｂフラグメントＨ鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡを、Ｈ鎖ＣＨ１不変部領域のみをコードするにすぎないもう一つのＤＮＡ分子に機能的に結合することができる。
【００５９】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬコーディングＤＮＡをＬ鎖不変部領域であるＣＬをコードするもう一つのＤＮＡ分子と機能的に結合することによって、完全長のＬ鎖遺伝子（およびＦａｂＬ鎖遺伝子）へと転換することができる。ヒトＬ鎖不変部領域の遺伝子の配列は、当技術に公知であり［例えば、Kabat,E.A..etal.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242を参照されたい］、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。Ｌ鎖不変部領域は、κまたはλ不変部領域であることができるが、最も好ましくはκ不変部領域である。
【００６０】
ｓｃＦｖ遺伝子を生成するには、ＶＨ−またはＶＬ−コーディングＤＮＡフラグメントを、可変リンカーをコードする、すなわちアミノ酸配列（Gly4−Ser）3をコードするもう一つのフラグメントと機能的に結合し、そのため、ＶＨおよびＶＬ配列が、ＶＬおよびＶＨ領域が可変リンカーによって結合されて、隣接する一本鎖タンパク質として発現され得るようにする［例えば、Bird et al.(1988)Science 242:423-426；Huston et at.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；McCafferty et al.,Nature(1990)348:552-554を参照されたい]。
【００６１】
本発明の抗体または抗体部分を発現するには、上記のとおりに得た、部分または完全長のＬおよびＨ鎖を発現ベクターに挿入して、遺伝子が、転写および翻訳制御配列と機能的に結合される。この状況では、用語「機能的に結合される」とは、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図された機能に役立つようにベクター中に結合されることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いた発現宿主細胞と共存できるように選ぶ。抗体Ｌ鎖遺伝子および抗体Ｈ鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入できるか、より代表的には、両遺伝子とも同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントとベクターの相補的制限部位の結合、または制限部位が全く存在しないならば、平滑末端結合）によって、発現ベクターに挿入する。Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連のＬまたはＨ鎖配列を挿入する前に、発現ベクターは、抗体不変部領域の配列を既に保有していてよい。例えば、Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連ＶＨおよびＶＬ配列を完全長の抗体遺伝子へと転換する一つの方策は、それぞれＨ鎖不変部およびＬ鎖不変部領域を既にコードしている発現ベクターに、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに機能的に結合され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに機能的に結合されるように挿入することである。追加的または代替的には、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促すシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレームに収まって結合されるように、ベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであるか、または異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であることができる。
【００６２】
抗体鎖遺伝子に加え、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内での抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーその他の、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を包含するものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel;Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)に記載されている。当業者には、調節配列の選択を包含する発現ベクターの設定は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、望まれるタンパク質の発現レベル等々のような要因に依存し得ることが認識されると思われる。哺乳動物宿主細胞の発現に好適な調節配列は、哺乳動物細胞での高レベルのタンパク質発現を指図するウイルス性の要素、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー)、シミアンウイルス４０(ＳＶ４０)（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー)、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）)、およびポリオーマを包含する。ウイルス性調節要素およびそれらの配列のこれ以上の説明には、例えば、Stinskiによる米国特許第5,168,062号明細書、Bellらによる米国特許第4,510,245号明細書、およびSchaffnerらによる米国特許第4,968,615号明細書を参照されたい。
【００６３】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば、宿主細胞でのベクターの複製を調節する配列(例えば複製起点)、および選別可能マーカーの遺伝子を保有してもよい。選別可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選別を容易にする（例えば、すべてAxelらによる米国特許第4,399,216号、第4,634.665号および第5,179,017号明細書を参照されたい)。例えば、代表的には、選別可能マーカー遺伝子は、薬物、例えばＧ418、ヒグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を、ベクターを導入した宿主細胞に賦与する。好適な選別可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子(dhfr-宿主細胞でメトトレキサート選別／増幅とともに用いるため）、およびneo遺伝子（Ｇ418の選別のため）を包含する。
【００６４】
ＬおよびＨ鎖の発現のためには、ＨおよびＬ鎖をコードする発現ベクターを、標準的手法によって宿主細胞に核酸移入する。様々な形態の用語「核酸移入」は、原核または真核宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入に一般的に用いられる非常に様々な手法、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈澱、ＤＥＡＥデキストラン核酸移入などを包含するものとする。本発明の抗体は、原核または真核宿主細胞のいずれでも発現することが理論的には可能であるが、真核宿主細胞、最も好ましくは哺乳動物の宿主細胞での抗体の発現が、最も好ましく、それは、そのような真核細胞、特に哺乳動物細胞は、適正に折畳まれた、免疫学的に活性を有する抗体を形成かつ分泌する可能性が、原核細胞よりも高いためである。抗体遺伝子の原核細胞での発現は、活性抗体の高収率での生産には無効果であると報告されている（Boss,M.A.and Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6:12-13）。
【００６５】
本発明の組換え抗体を発現するのに好適な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）[Urlaub & Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220に記載され、例えば、R.J.Kaufman & P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621に記載されたとおりのＤＨＦＲ選別可能マーカーとともに用いられたdhfr-ＣＨＯ細胞を包含する]、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を包含する。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入するときは、宿主細胞を、該宿主細胞での抗体の発現を許し、より好ましくは該宿主細胞を増殖させる培地中への抗体の分泌を許すのに充分な期間培養することによって、抗体を生産する。抗体は、標準的なタンパク質精製の方法を用いて、培地から回収することができる。
【００６６】
宿主細胞は、完全な抗体の一部、例えばＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子を生産するのに用いることもできる。上記手順の変化形は、本発明の範囲内であることが理解されると思われる。例えば、本発明の抗体のＬ鎖またはＨ鎖のいずれか（双方ではなく）をコードするＤＮＡを、宿主細胞に移入するのが望ましいことがある。組換えＤＮＡの技術は、ｈＴＮＦαとの結合に不必要であるＬおよびＨ鎖のいずれかもしくは双方をコードするＤＮＡのいくらかまたはすべてを除去するのに用いてもよい。そのような断端ＤＮＡ分子から発現される分子も、本発明の抗体に包含される。加えて、一方のＨ鎖および一方のＬ鎖が本発明の抗体であり、他方のＨ鎖およびＬ鎖がｈＴＮＦα以外の抗原に特異的である二機能性抗体を、本発明の抗体と第二の抗体とを標準的な化学的架橋結合法によって架橋結合させることによって生産してもよい。
【００６７】
本発明の抗体、またはその抗原結合部分の組換え発現に好適な系では、抗体Ｈ鎖と抗体Ｌ鎖との双方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム仲介核酸移入によってdhfr-ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内では、抗体ＨおよびＬ鎖遺伝子が、それぞれ、エンハンサー／プロモーター調節要素（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来する、例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素、またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素）と機能的に結合されて、遺伝子の高レベルの転写を駆使する。組換え発現ベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子も保有し、これが、ベクターが移入されているＣＨＯ細胞の、メトトレキサートによる選別／増幅を用いた選別を可能にする。選別した形質転換体の宿主細胞を培養して、抗体ＨおよびＬ鎖の発現を許し、完全な抗体を培地から回収する。標準的な分子生物学的手法を用いて、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞に核酸移入し、形質転換体について選別し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収する。
【００６８】
前記に照らして、本発明のもう一つの態様は、本発明の抗体および抗体部分の組換え発現に用いることができる、核酸、ベクターおよび宿主細胞組成物に関する。Ｄ２Ｅ７Ｌ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を、図７およびSEQ IDNO:３６に示す。ＬＣＶＲのＣＤＲ１ドメインはヌクレオチド７０〜１０２を包含し、ＣＤＲ２ドメインはヌクレオチド１４８〜１６８を包含し、ＣＤＲ３ドメインは、ヌクレオチド２６５〜２９１を包含する。Ｄ２Ｅ７Ｈ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を図８およびSEQ ID NO:３７に示す。ＬＣＶＲのＣＤＲ１ドメインは、ヌクレオチド９１〜１０５を包含し、ＣＤＲ２ドメインはヌクレオチド１４８〜１９８を包含し、ＣＤＲ３ドメインは、ヌクレオチド２９５〜３３０を包含する。当業者には、Ｄ２Ｅ７関連抗体またはその部分（例えばＣＤＲドメイン、例えばＣＤＲ３ドメイン）をコードするヌクレオチド配列は、遺伝暗号と標準的な分子生物学の手法とを用いて、Ｄ２Ｅ７ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲをコードするヌクレオチド配列から誘導できることが認識されると思われる。
【００６９】
一実施態様では、本発明は、SEQ ID NO:３のアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ３（すなわちＤ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３）、あるいは第１、４、５、７もしくは８位でのただ１回のアラニン置換によってか、または第１、３、４、６、７、８および／または９位での１〜５回の同類アミノ酸置換によってSEQ ID NO:３から修飾されたそれをコードする単離核酸を提供する。この核酸は、ＣＤＲ３領域のみをコードできるにすぎないか、またはより好ましくは、抗体Ｌ鎖可変領域（ＬＣＶＲ）全体をコードする。例えば、該核酸は、SEQ ID NO:５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン（すなわちＤ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ２）と、SEQ ID NO:７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン（すなわちＤ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ１）とを有するＬＣＶＲをコードすることができる。
【００７０】
もう一つの実施態様では、本発明は、SEQ ID NO:４のアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ３ドメイン（すなわちＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３）、あるいは第２、３、４、５、６、８、９、１０もしくは１１位でのただ１回のアラニン置換によってか、または第２、３、４、５、６、８、９、１０、１１および／または１２位での１〜５回の同類アミノ酸置換によってSEQ ID NO:４から修飾されたそれをコードする単離核酸を提供する。この核酸は、ＣＤＲ３領域のみをコードできるにすぎないか、またはより好ましくは、抗体Ｈ鎖可変領域（ＨＣＶＲ）全体をコードする。例えば、該核酸は、SEQ ID NO:６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン（すなわちＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ２）と、SEQ ID NO:８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン（すなわちＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ１）とを有するＨＣＶＲをコードすることができる。
【００７１】
更にもう一つの実施態様では、本発明は、例えば、SEQ ID NO:３、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:１１、SEQ ID NO: １２、SEQ ID NO:１３、SEQ ID NO:１４、SEQ ID NO:１５、SEQ ID NO:１６、SEQ ID NO:１７、SEQ ID NO:１８、SEQ ID NO:１９、SEQ ID NO:２０、SEQ ID NO:２１、SEQ ID NO:２２、SEQ ID NO:２３、SEQ ID NO:２４、SEQ ID NO:２５、SEQ ID NO:２６、SEQ ID NO:２７、SEQ ID NO:２８、SEQ ID NO:２９、SEQ ID NO:３０、SEQ ID NO:３１、SEQ ID NO:３２、SEQ ID NO:３３、SEQ ID NO:３４およびSEQ ID NO:３５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、Ｄ２Ｅ７関連ＣＤＲ３ドメインをコードする単離核酸を提供する。
【００７２】
更にもう一つの実施態様では、本発明は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む抗体Ｌ鎖可変領域（すなわちＤ２Ｅ７ＬＣＶＲ）をコードする単離核酸を提供する。好ましくは、この核酸は、SEQ ID NO:３６のヌクレオチド配列を含むが、当業者は、遺伝暗号の縮重のため、他のヌクレオチド配列がSEQ ID NO:１のアミノ酸配列をコードできることを認識するものと思われる。該核酸は、ＬＣＶＲのみをコードできるにすぎないか、またはＬＣＶＲに機能的に結合した抗体Ｌ鎖不変部領域もコードできる。一実施態様では、この核酸は組換え発現ベクターである。
【００７３】
更にもう一つの実施態様では、本発明は、SEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む抗体Ｈ鎖可変領域（すなわちＤ２Ｅ７ＬＣＶＲ）をコードする単離核酸を提供する。好ましくは、この核酸は、SEQ ID NO:３７のヌクレオチド配列を含むが、当業者は、遺伝暗号の縮重のため、他のヌクレオチド配列がSEQ ID NO:２のアミノ酸配列をコードできることを認識するものと思われる。該核酸は、ＨＣＶＲのみをコードできるにすぎないか、またはＨＣＶＲに機能的に結合したＨ鎖不変部領域もコードできる。例えば、該核酸は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の不変部領域を含むことができる。一実施態様では、この核酸は組換え発現ベクターである。
【００７４】
本発明は、抗体Ｈ鎖と抗体Ｌ鎖との双方をコードする組換え発現ベクターも提供する。例えば、一実施態様では、本発明は、
（ａ）SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体Ｌ鎖（すなわちＤ２Ｅ７ＬＣＶＲ）；および
（ｂ）SEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体Ｈ鎖（すなわちＤ２Ｅ７ＨＣＶＲ）をコードする組換え発現ベクターを提供する。
【００７５】
本発明は、本発明の組換え発現ベクターのうち１種類またはそれ以上を導入した宿主細胞も提供する。好ましくは、該宿主細胞は、哺乳動物の宿主細胞、より好ましくは、該宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞またはＣＯＳ細胞である。更に、本発明は、本発明の組換えヒト抗体が合成されるまで、本発明の宿主細胞を適切な培地で培養することによって、本発明の組換えヒト抗体を合成する方法を提供する。該方法は、該組換えヒト抗体を該培地から単離する段階を、更に含むことができる。
【００７６】
III．組換えヒト抗体の選別
本明細書に開示したＤ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連抗体に加えて、本発明の組換えヒト抗体は、ヒトのリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製したヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを用いて調製した、組換え組合せ抗体ライブラリー、好ましくはｓｃＦｖファージ表示ライブラリーのスクリーニングによって単離することができる。そのようなライブラリーを調製し、スクリーニングする方法は、当技術に公知である。ファージ表示ライブラリーの作成のための商業的に入手できるキット（例えば、PharmaciaのRecombinant Phage Antibody System、カタログ番号第27-9400-01号；およびStratageneのSurfZAP（商品名）ファージ表示キット、カタログ番号第240612号）に加えて、抗体表示ライブラリーの作成やスクリーニングに用いるのに特に適応する方法および試薬の例は、例えば、Ladnerらの米国特許第5,223,409号明細書；Kangらの国際公開特許第WO92/18619号公報；Dowerらの国際公開特許第WO91/17271；Winterらの国際公開特許第WO92/20791号公報；Marklandらの国際公開特許第WO92/15679号公報；Breitlingらの国際公開特許第WO93/01288号公報；McCaffertyらの国際公開特許第WO92/01047号公報；Garrardらの国際公開特許第WO92/09690号公報；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay et al.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3:81-85;Huse et al.(1989)Science 246:1275-1281；McCafferty etal.,Nature(1990)348:552-554；Griffiths etal.(1993)EMBO J.12:725-734；Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.226:889-896；Clackson et al.(1991)Nature352:624-628；Gram et al.(1992)PNAS 89:3576-3580；Garrad et al.(1991)Bio/Technology 2:1373-1377；Hoogenboom et al.(1991)Nuc.Acid Res.19:4133-4137およびBarbas et al.(1991)PNAS88:7978-7982に見出すことが できる。
【００７７】
好適実施態様では、ｈＴＮＦαに対する高い親和性と低いオフ速度とを有するヒト抗体を単離するのに、ｈＴＮＦαに対する高親和性および低オフ速度を有するマウス抗ｈＴＮＦα抗体（例えば、ＥＣＡＣＣ受託番号第87 050801号を有するハイブリドーマであるＭＡＫ１９５）を初めに用い、ｈＴＮＦαとの類似の結合活性を有するヒトＨおよびＬ鎖配列を、Hoogenboomらの国際公開特許第WO93/06213号公報に記載の方法である、エピトープ刻印または誘導選別を用いて選別する。この方法に用いる抗体ライブラリーは、好ましくは、McCaffertyらの国際公開特許第WO92/01047、McCafferty et al.,Nature(1990)348:552-554およびGriffiths et al.,(1993)EMBO J.12:725-734に記載のとおりに調製かつスクリーニングしたｓｃＦｖライブラリーである。ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、好ましくは、組換えヒトＴＮＦαを抗原として用いてスクリーニングする。
【００７８】
最初のヒトＶＬおよびＶＨセグメントを選別したならば、最初に選別したＶＬおよびＶＨセグメントの異なる対をｈＴＮＦαとの結合についてスクリーニングする「混合と適合」の実験を実施して、好適なＶＬ／ＶＨ対の組合せを選別する。加えて、ｈＴＮＦαと結合するための親和性を更に向上させ、かつ／またはオフ速度定数を低めるために、好ましいＶＬ／ＶＨ対のＶＬおよびＶＨセグメントを、好ましくはＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３領域内で、自然の免疫応答の際の抗体の親和性成熟の原因となるin vivoでの体細胞突然変異の過程と同様の過程で無差別に突然変異させることができる。このin vitroでの親和性成熟は、それぞれＶＨＣＤＲ３またはＣＤＲ３ＶＬに相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ＶＨおよびＶＬ領域を増幅することによって達成できるが、これらのプライマーは、４種類のヌクレオチド塩基の無作為混合物で一定の位置を「スパイク」して、得られるＰＣＲ産物が、ＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ３領域内で無差別突然変異を導入したＶＨおよびＶＬセグメントをコードするようにしておく。これらの無差別に突然変異させたＶＨおよびＶＬセグメントは、ｈＴＮＦαとの結合について再スクリーニングすることができ、ｈＴＮＦαと結合するための高い親和性と低いオフ速度とを示す配列が選別できる。
【００７９】
選ばれた抗体ＨおよびＬ鎖のアミノ酸配列は、生殖系列ＨおよびＬ鎖のアミノ酸配列と対照することができる。選ばれたＶＬおよび／またはＶＨ鎖の一定のフレームワーク残基が、(例えば、ファージライブラリーを調製するのに用いた免疫グロブリン遺伝子の体細胞突然変異の結果として）生殖系列の立体配置と異なる場合は、選ばれた抗体の変化したフレームワーク残基を、生殖系列立体配置へと「戻し突然変異」させる（すなわち、選ばれた抗体のフレームワークアミノ酸配列を、生殖系列アミノ酸配列と同じになるように変化させる）のが望ましいことがある。フレームワーク残基のそのような「戻し突然変異」（または「生殖系列化」）は、特定の突然変異を導入するための標準的な分子生物学的方法によって達成できる（例えば、部位指向性突然変異；ＰＣＲ仲介突然変異など）。
【００８０】
組換え免疫グロブリン表示ライブラリーからの本発明の抗ｈＴＮＦα抗体のスクリーニングおよび単離に続いて、選別した抗体をコードする核酸を、(例えばファージゲノムからの）表示パッケージから回収し、標準的な組換えＤＮＡの手法によって他の発現ベクター中にサブクローニングすることができる。望むならば、該核酸を更に操作して、本発明のその他の抗体形態（例えば、免疫グロブリンの追加のドメイン、例えば追加の不変部領域）を生成することができる。組合せライブラリーのスクリーニングによって単離した組換えヒト抗体を発現するには、該抗体をコードするＤＮＡを、上記の第II節で更に詳述したとおり、組換え発現ベクター中にクローニングし、哺乳動物の宿主細胞に導入する。
【００８１】
IV．製剤組成物および製剤投与
本発明の抗体および抗体部分は、被験者への投与に適した製剤組成物に組み込むことができる。代表的には、該製剤組成物は、本発明の抗体または抗体部分と、製薬上許容され得る担体とを含む。本明細書に用いられる限りで、「製薬上許容され得る担体」は、生理学的に適合できるいかなるかつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅緩剤などをも包含する。製薬上許容され得る担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどのうち１種類またはそれ以上、ならびにそれらの組合せを包含する。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトールのような多価アルコール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物に含めるのが好ましいと思われる。製薬上許容され得る担体は、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤または緩衝液のような、副次的量の補助的物質を更に含んでよく、これらは、該抗体または抗体部分の棚保ちや有効性を高める。
【００８２】
本発明の組成物は、様々な形態をなしてよい。これらは、例えば、液体、半固体および固体の投与形態、例えば液体の溶液(例えば注射および注入できる溶液)、分散もしくは懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソームおよび坐薬を包含する。好ましい形態は、意図される投与の様式や治療の用途に依存する。代表的な好適組成物は、注射または注入できる溶液、例えば、他の抗体によるヒトの受身感作に用いられるのと同様の組成物の形態をなす。好適な投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内）である。好適実施態様では、該抗体を、静脈内注入または注射によって投与する。もう一つの好適実施態様では、該抗体を、筋内または皮下注射によって投与する。
【００８３】
治療組成物は、代表的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定的でなければならない。該組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散、リポソーム、または高い薬物濃度に適するよう誂えたその他の構造として配合することができる。無菌注射液は、必要に応じて上記に列挙した成分の一種類または組合せとともに、活性化合物（すなわち抗体または抗体部分）を必要量で適切な溶媒に組み込むことによって調製できる。一般的には、塩基性分散媒と、必要とされる上記に列挙したものからのその他の成分とを含有する無菌の賦形剤に、活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合は、好適な調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であって、活性成分に、予め無菌濾過したその溶液からの望みのいかなる追加の成分も加えた粉末が得られる。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用い、分散の場合は必要な粒径を保ち、かつ界面活性剤を用いることによって維持することができる。注射可能組成物の長期的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含ませることによって達成できる。
【００８４】
本発明の抗体および抗体部分は、当技術に公知の様々な方法によって投与できるが、多くの治療用途のためには、投与の好適な経路／様式は、静脈内注射または注入である。当業者には認識されると思われるとおり、投与の経路／様式は、望まれる結果に応じて変動することになる。一定の実施態様、例えば、移植体、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された送達系を包含する制御放出配合物では、活性化合物を、急速な放出から該化合物を防護するような担体とともに調製してよい。生体分解できる生体適合重合体、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を用いることができる。そのような配合物の調製のための多くの方法は、特許されているか、または当業者に広く公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978を参照されたい。
【００８５】
一定の実施態様では、本発明の抗体または抗体部分は、例えば不活性希釈剤、または同化できる食用の担体とともに、経口的に投与してよい。該化合物（および望みならば他の成分）は、硬いか、もしくは軟らかい殻のゼラチンカプセルに封入し、錠剤に打錠し、または被験者の食餌に直接組み込んでもよい。経口の治療的投与のためには、該化合物を、添加剤とともに組み込み、摂取できる錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシュ剤などの形態で用いてよい。本発明の化合物を非経口投与以外によって投与するには、該化合物をその不活性化を防護する材料で被覆するか、またはそれらと該化合物とを同時投与することが必要であり得る。
【００８６】
補助的活性化合物を、該組成物に組み込むこともできる。一定の実施態様では、本発明の抗体または抗体部分を、ＴＮＦα活性が不都合である疾患を治療するのに役立つ１種類またはそれ以上の追加の治療剤とともに、同時配合し、および／または同時投与する。例えば、本発明の抗ＴＮＦα抗体または抗体部分を、他の標的と結合する一種類またはそれ以上の追加の抗体（例えば、他のサイトカインと結合するか、または細胞表面分子と結合する抗体）、１種類またはそれ以上のサイトカイン、可溶性ＴＮＦα受容体（例えば国際公開特許第WO94/06476号公報を参照されたい)、および／またはｈＴＮＦαの生産もしくは活性を阻害する１種類またはそれ以上の化学的薬剤（例えば、国際公開特許第93/19751号公報に記載のとおりのシクロヘキサン−イリデン誘導体）とともに、同時配合し、および／または同時投与する。その上、本発明の１種類またはそれ以上の抗体は、前記の治療剤のうち２種類またはそれ以上と併用してよい。そのような併用療法は、好都合にも、低投与量の投与治療剤を活用し、こうして様々な単剤療法に付随することがある毒性または併発症を回避し得る。
【００８７】
本発明の抗体または抗体部分を併用できる、リウマチ様関節炎に対する治療剤の非限定的な例は、下記を包含する：非ステロイド系抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)；サイトカイン抑制性抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）；ＣＤＰ−５７１／ＢＡＹ−１０−３３５６（人体適応抗ＴＮＦα抗体；Celltech/Bayer）；ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦα抗体；Centocor）；７５kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Immunex;例えばArthritis & Rheumatism(1994)Vol.37,S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235Aを参照されたい）；５５kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（５５kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Hoffmann-LaRoche）；ＩＤＥＣ−ＣＥ９．１／ＳＢ２１０３９６（非枯渇性霊長類適応抗ＣＤ４抗体；IDEC/SmithKline；例えばArthritis & Rheumatism(1995)Vol.38,S185を参照されたい);ＤＡＢ４８６−ＩＬ−２および／またはＤＡＢ３８９−ＩＬ−２（ＩＬ−２融合タンパク質；Seragen；例えばArthritis & Rheumatism(1993)Vol.36,1223を参照されたい）；抗Ｔａｃ(人体適応抗ＩＬ−２Ｒα；Protein Design Labs/Roche);ＩＬ−４（抗炎症性サイトカイン；DNAX/Schering）；ＩＬ−１０（ＳＣＨ５２０００；組換えＩＬ−１０、抗炎症性サイトカイン；DNAX/Schering）；ＩＬ−４；ＩＬ−１０および／またはＩＬ−４作用薬（例えば作用薬抗体);ＩＬ−１ＲＡ（ＩＬ−１受容体拮抗薬；Synergen/Amgen）；ＴＮＦ−ｂｐ／ｓ−ＴＮＦＲ（可溶性ＴＮＦ結合性タンパク質；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S284；Amer.J.Physiol.-Heart and Circulatory Physiology(1995)Vol.268,pp.37-42を参照されたい)；Ｒ９７３４０１（ホスホジエステラーゼIV型阻害剤；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S282を参照されたい）；ＭＫ−９６６（ＣＯＸ−２阻害剤；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S81を参照されたい）；Iloprost（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39.No.9(supplement),S82を参照されたい);メトトレキサート；サリドマイド（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S282を参照されたい)およびサリドマイド関連薬物（例えばClegen);レフルノミド（抗炎症剤およびサイトカイン阻害剤；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39,No.9(supplement),S131；Inflammation Research(1996)Vol.45,pp.103-107を参照されたい);トラネキサム酸（プラスミノーゲン活性化の阻害剤；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S284を参照されたい）；Ｔ−６１４(サイトカイン阻害剤；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S282を参照されたい）；プロスタグランジンＥ１（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S282を参照されたい)；Tenidap(非ステロイド系抗炎症薬；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39,No.9(supplement),S280を参照されたい）；ナプロキセン(非ステロイド系抗炎症薬；例えばNeuro Report(1996)Vol.7,pp.1209-1213を参照されたい）；メロキシカム（非ステロイド系抗炎症薬)；イブプロフェン(非ステロイド系抗炎症薬);ピロキシカム(非ステロイド系抗炎症薬)；ジクロフェナク（非ステロイド系抗炎症薬）；インドメタシン(非ステロイド系抗炎症薬）；スルファサラジン(例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S281を参照されたい）；アザチオプリン（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S281を参照されたい）；ＩＣＥ阻害剤（酵素のインターロイキン−１β変換酵素の阻害剤）；ｚａｐ−７０および／またはｌｃｋ阻害剤（チロシンキナーゼｚａｐ−70またはｌｃｋの阻害剤）；ＶＥＧＦ阻害剤および／またはＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤（血管内皮細胞成長因子または血管内皮細胞成長因子受容体の阻害剤；血管形成の阻害剤)；コルチコステロイド抗炎症薬(例えばＳＢ203580)；ＴＮＦ変換酵素阻害剤；抗ＩＬ−１２抗体；インターロイキン−１１（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39,No.9(supplement),S296を参照されたい）；インターロイキン−１３（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39,No.9(supplement),S308を参照されたい）；インターロイキン−１７阻害剤（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39,No.9(supplement),S120を参照されたい);金；ペニシラミン；クロロキノン；ヒドロキシクロロキノン；クロラムブシル；シクロホスファミド；シクロスポリン；全リンパ照射；抗胸腺細胞グロブリン；抗ＣＤ４抗体；ＣＤ５毒素；経口投与されるペプチドやコラーゲン；ロベンザリット二ナトリウム；サイトカイン調節剤（ＣＲＡ）ＨＰ２２８およびＨＰ４６６(Houghten Pharmaceuticals,Inc.)；ＩＣＡＭ−１アンチセンスモノチオリン酸オリゴヌクレオチド(ＩＳＩＳ2302；Isis Pharmaceuticals, Inc.)；可溶性補体受容体１(ＴＰ10；T Cell Sciences,Inc.);プレドニゾン；オルゴテイン；グリコサミノグリカンポリ硫酸；ミノサイクリン；抗ＩＬ−２Ｒ抗体；海産および植物産脂質（魚および植物種子の脂肪酸；例えばDeLuca et al.,(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21:759-777)；オーラノフィン；フェニルブタゾン；メクロフェナム酸；フルフェナム酸；静脈内免疫グロブリン；ジロイトン；ミコフェノール酸(ＲＳ−61443);タクロリムス(ＦＫ−506)；シロリムス（ラパマイシン）；アミプリロース(テラフェクチン）；クラドリビン(２−クロロデオキシアデノシン）；ならびにアザリビン。
【００８８】
本発明の抗体または抗体部分を併用できる炎症性腸疾患の治療剤の非限定的な例は、下記を包含する：ブデノシド；表皮成長因子；コルチコステロイド；シクロスポリン；スルファサラジン；アミノサリチル酸塩；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体拮抗薬；抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体；抗ＩＬ−６モノクローナル抗体；成長因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール複合体；ＣＤＰ-571／ＢＡＹ−１０−３３５６(人体適応抗ＴＮＦα抗体；Celltech/Bayer)；ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦα抗体；Centocor）；75kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（75kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Immunex；例えばArthritis & Rheumatism(1994)Vol.37,S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235Aを参照されたい）；55kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（55kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Hoffmann-LaRoche）；インターロイキン−10（ＳＣＨ52000；Schering Plough)；ＩＬ−４；ＩＬ−10および／またはＩＬ−４作用薬（例えば作用薬抗体）；インターロイキン−11；プレドニゾロン、デキサメタゾンもしくはブデソニドのグルクロニド−またはデキストラン−複合プロドラッグ；ＩＣＡＭ−１アンチセンスモノチオリン酸オリゴヌクレオチド(ＩＳＩＳ2302；Isis Pharmaceuticals, Inc.)；可溶性補体受容体１(ＴＰ10；T Cell Sciences,Inc.)；徐放性メサラジン；メトトレキサート；血小板活性化因子（ＰＡＦ）の拮抗薬；シフロフロキサシン；ならびにリグノカイン。
【００８９】
本発明の抗体または抗体部分を併用できる多発性硬化症の治療剤の非限定的な例は、下記を包含する：コルチコステロイド；プロドニゾロン；メチルプレドニゾロン；アザチオプリン；シクロホスファミド；シクロスポリン；メトトレキサート；４−アミノピリジン；チザニジン；インターフェロン−β１ａ（Avonex（商品名）；Biogen）；インターフェロン−β１ｂ（Betaseron（商品名）；Chiron/Berlex)；共重合体１(Cop-1；Copaxone（商品名)；Teva PharmaceuticalIndustries,Inc.)；高圧酸素；静脈内免疫グロブリン;クラブリビン;ＣＤＰ-571／ＢＡＹ−１０−３３５６(人体適応抗ＴＮＦα抗体；Celltech/Bayer）；ｃＡ２(キメラ抗ＴＮＦα抗体；Centocor）；75kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（75kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Immunex；例えばArthritis & Rheumatism(1994)Vol.37,S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235Aを参照されたい)；55kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（55kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Hoffmann-LaRoche）；ＩＬ−10；ＩＬ−４；ならびにＩＬ−１０および／またはＩＬ−４作用薬（例えば作用薬抗体）。
【００９０】
本発明の抗体または抗体部分を併用できる敗血症の治療剤の非限定的な例は、下記を包含する：高張生理食塩水溶液；抗生物質；静脈内γ−グロブリン；連続血液濾過；カルバペネム(メロペネム)；ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６および／またはＩＬ−８のようなサイトカインの拮抗薬；ＣＤＰ-571／ＢＡＹ−１０−３３５６（人体適応抗ＴＮＦα抗体；Celltech/Bayer）；ｃＡ２(キメラ抗ＴＮＦα抗体；Centocor）；75kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（75kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Immunex；例えばArthritis & Rheumatism(1994)Vol.37,S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235Aを参照されたい）；55kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（55kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Hoffmann-LaRoche);サイトカイン調節剤（ＣＲＡ）ＨＰ228およびＨＰ466（Houghten Pharmaceuticals,Inc.）；ＳＫ＆Ｆ107647（低分子ペプチド；SmithKline Beecham）；四価グアニルヒドラゾンのＣＮＩ−1493（Picower Institute);組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ；Chiron）；ＰＨＰ(化学的に修飾されたヘモグロビン；APEX Bioscience）；ジエチレントリアミン五酢酸−鉄（III)錯体（ＤＴＰＡ鉄（III)；Molichem Medicines）を包含する鉄キレート化剤およびキレート；リゾフィリン（合成小分子メチルキサンチン;Cell Therapeutics,Inc.)；ＰＧＧ−グルカン(水性可溶性β１，３グルカン；Alpha-Beta Technology)；脂質で再構成したアポリポタンパク質Ａ−１；キラルなヒドロキサム酸（脂質Ａの生合成を阻害する合成抗菌剤）；抗内毒素抗体；Ｅ5531（合成脂質Ａ拮抗薬；Eisai America,Inc.)；ｒＢＰＩ21(ヒト殺菌／透過性上昇タンパク質の組換えＮ末端フラグメント）；ならびに合成抗内毒素ペプチド（ＳＡＥＰ；Bios Ynth Research Laboratories）。
【００９１】
本発明の抗体または抗体部分を併用できる成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）の治療剤の非限定的な例は、下記を包含する：抗ＩＬ−８抗体；界面活性剤置換療法；ＣＤＰ-571／ＢＡＹ−１０−３３５６(人体適応抗ＴＮＦα抗体；Celltech/Bayer)；ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦα抗体；Centocor）；７５kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（75kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Immunex；例えばArthritis & Rheumatism(1994)Vol.37,S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235Aを参照されたい）；および５５kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（55kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Hoffmann-LaRoche）。
【００９２】
他の治療剤との本発明の抗体または抗体部分の併用は、サブセクションIVで更に考察する。
【００９３】
本発明の製剤組成物は、「治療的有効量」または「予防的有効量」の本発明の抗体または抗体部分を含んでよい。「治療的有効量」とは、必要な投与量および期間で、望みの治療上の結果を達成するのに効果的である量を意味する。抗体または抗体部分の治療的有効量は、個体の疾病状態、年齢、性別および体重、ならびに望みの応答を個体に誘発できる抗体または抗体部分の能力のような要因に従って変動してよい。治療的有効量は、抗体もしくは抗体部分のいかなる有害または不都合な効果よりも、治療上有益な効果の方が重視される量でもある。「予防的有効量」とは、必要な投与量および期間で、望みの予防上の結果を達成するのに効果的である量を意味する。代表的には、予防の用量は、疾病の前または初期段階で被験者に用いられることから、予防的有効量は、治療的有効量より少ないことになる。
【００９４】
投与方式は、望みの最適の応答（例えば、治療的または予防的応答）を与えるよう調整してよい。例えば、ただ１個の大型丸剤を投与しても、いくつかの分割された投与量を経時的に投与しても、あるいは治療状況の急迫が示すのに比例して、用量を増減してもよい。投与の簡易性と投与量の均一性とを求めて、非経口組成物を単位投与量形態で配合するのが、特に好都合である。本明細書に用いられる限りでの単位投与量形態とは、哺乳動物の被験体を治療するための一元的投与量として適した、物理的に分離した単位を意味し：各単位は、望みの治療的効果を生じるよう算出された所定量の活性化合物を、必要とされる製剤用担体を伴って含有する。本発明の単位投与量形態についての仕様は、(ａ)活性化合物の独自の特徴性、および達成しようとする特定の治療的または予防的効果と、(ｂ)個体における感受性の治療のためにそのような活性化合物を複合させる技術に固有の限界とに指定され、かつ直接依存する。
【００９５】
本発明の抗体もしくは抗体部分の治療的または予防的有効量についての例示的で非限定的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は、緩和しようとする状態の形式および重篤度とともに変動してよいことが注目される。特定のいかなる被験者についても、特有の投与方式は、個別的な必要性と、組成物の投与を管理または監督する者の専門的判断とに従って経時的に調整しなければならず、本明細書に述べた投与量の範囲は、単に例示的であるにすぎず、クレームされた組成物の範囲および実施を限定するものではないことを理解すべきである。
【００９６】
V．本発明の抗体の用途
ｈＴＮＦαと結合できることが示されたため、本発明の抗ｈＴＮＦα抗体またはその部分は、慣用の免疫検定法、例えば酵素結合免疫吸収検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）または組織の免疫組織化学を用いて、(例えば、生物学的試料、例えば血清または血漿中の）ｈＴＮＦαを検出するのに用いることができる。本発明は、生物学的試料中のｈＴＮＦαを検出する方法であって、生物学的を本発明の抗体または抗体部分と接触させ、ｈＴＮＦαと結合した抗体（もしくは抗体部分）、または結合しなかった抗体（もしくは抗体部分）のいずれかを検出し、それによって該生物学的試料中のｈＴＮＦαを検出することを含む方法を提供する。結合または未結合抗体の検出を容易にするために、抗体は、検出できる物質で直接または間接的に標識する。適切な検出可能物質は、様々な酵素、補欠基、蛍光性材料、発光性材料および放射性材料を包含する。適切な酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適切な補欠基複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンを包含し；発光性材料の例は、ルミノールを包含し;適切な放射性材料の例は、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈを包含する。
【００９７】
抗体の標識化に代えて、検出できる物質で標識したｒｈＴＮＦαの標準と、標識していない抗ｈＴＮＦα抗体とを用いた競争免疫検定法によって、ｈＴＮＦαを生体液中で検定することができる。この検定法では、生物学的試料、標識したｒｈＴＮＦαの標準、および抗ｈＴＮＦα抗体を組合せ、未標識抗体と結合した標識ｒｈＴＮＦα標準の量を決定する。生物学的試料中のｈＴＮＦαの量は、抗ｈＴＮＦα抗体に結合した標識ｒｈＴＮＦα標準の量に逆比例する。
【００９８】
本発明のＤ２Ｅ７は、ヒト以外の種からのＴＮＦα、特に霊長類（例えばチンパンジー、ヒヒ、キヌザル、カニクイザルおよびアカゲザル）、ブタおよびマウスからのＴＮＦαを検出するのに用いることもできるが、それは、Ｄ２Ｅ７がこれらのＴＮＦαのそれぞれと結合できるためである（実施例４サブセクションＥで更に考察する）。
【００９９】
本発明の抗体または抗体部分は、in vitroとin vivoとの双方で、ｈＴＮＦα活性を中和することができる（実施例４を参照されたい）。その上、本発明の抗体の少なくともいくつか、例えばＤ２Ｅ７は、他の種からのＴＮＦα活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体または抗体部分は、例えば、ｈＴＮＦαを含有する細胞培養体で、ヒトである被験者で、または本発明の抗体が交差反応するＴＮＦαを有する哺乳動物の被験体（例えばチンパンジー、ヒヒ、キヌザル、カニクイザルおよびアカゲザル、ブタまたはマウス）で、ＴＮＦα活性を阻害するのに用いることができる。一実施態様では、本発明は、ＴＮＦαを本発明の抗体または抗体部分と接触させる結果、ＴＮＦα活性が阻害されることを含む、ＴＮＦα活性を阻害する方法も提供する。好ましくは、ＴＮＦαは、ヒトのＴＮＦαである。例えば、ＴＮＦαを含有するか、または含有する疑いのある細胞培養体中に、本発明の抗体または抗体部分を培地に加えて、培養体中のｈＴＮＦα活性を阻害することができる。
【０１００】
もう一つの実施態様では、本発明は、ＴＮＦα活性が不都合である疾患に罹患した被験者での、ＴＮＦα活性を阻害する方法を提供する。ＴＮＦαは、非常に様々な疾患の病態生理学に関連している［例えば、Moeller,A.,et al.(1990)Cytokine 2:162-169；Moellerらへの米国特許第5,231,024号明細書；Moeller,A.によるヨーロッパ特許第260 610 B1号公報を参照されたい］。本発明は、そのような疾患に罹患した被験者でのＴＮＦα活性に関する方法であって、被験者に本発明の抗体または抗体部分を投与する結果、被験者のＴＮＦα活性が阻害される段階を含む方法を提供する。好ましくは、ＴＮＦαはヒトのＴＮＦαであり、被験者は、ヒトの被験者である。これに代えて、被験体は、本発明の抗体が交差反応するＴＮＦαを発現する哺乳動物であることができる。また更に、被験体は、（例えば、ｈＴＮＦαの投与、またはｈＴＮＦαの移入遺伝子の発現によって）ｈＴＮＦαを導入した哺乳動物であることもできる。本発明の抗体は、治療を目的としてヒトの被験者に投与することができる（以下に更に考察する）。その上、本発明の抗体は、該抗体が交差反応するＴＮＦαを発現するヒトではない哺乳動物（例えば霊長類、ブタまたはマウス）に、獣医学の目的でか、ヒトの疾病の動物モデルとして投与することができる。後者に関しては、そのような動物モデルは、本発明の抗体の治療的薬効を評価する（例えば投与量、および投与の時間的経過を試験する）のに役立ち得る。
【０１０１】
本明細書に用いられる限りで、用語「ＴＮＦα活性が不都合である疾患」は、該疾患に罹患した被験者でのＴＮＦαの存在が、該疾患の病態生理学の原因であることか、もしくは該疾患の悪化に寄与する要因であることのいずれかが示されているか、またはその疑いがある疾病その他の疾患を包含するものとする。したがって、ＴＮＦα活性が不都合である疾患は、ＴＮＦα活性の阻害が、該疾患の徴候および／または進行を緩和すると期待される疾患である。そのような疾患は、例えば、該疾患に罹患した被験者の体液中のＴＮＦαの濃度の上昇（例えば、被験者の血清、血漿、滑液等々中のＴＮＦαの濃度の上昇）によって証拠付けられてよく、それは、例えば、上記のとおり、抗ＴＮＦα抗体を用いて検出することができる。ＴＮＦα活性が不都合である疾患の無数の例が存在する。以下、特定の疾患の治療の際の本発明の抗体および抗体部分の用途を更に考察する：
【０１０２】
Ａ．敗血症
腫瘍壊死因子は、低血圧、心筋抑制、血管漏出症候群、器官壊死、有毒二次メジエーターの放出、および凝血カスケードの活性化を包含する生物学的効果を有して、敗血症の病態生理学で確定された役割を果たす［例えば、Moeller,A.,etal.(1990)Cytokine 2:162-169；Moellerらへの米国特許第5,231,024号明細書；Moeller,A.によるヨーロッパ特許第260 610 B1号公報；Tracey,K.J.& Cerami,A.(1994)Annu.Rev.Med.45:491-503；Russell,D & Thompson,R.C.(1993)Curr.Opin.Biotech.4:714-721を参照されたい]。したがって、本発明のヒトの抗体および抗体部分は、敗血症ショック、内毒素ショック、グラム陰性敗血症および毒物ショック症候群を包含する、その臨床的設定のいずれかにおいて敗血症を治療するのに用いることができる。
【０１０３】
その上、敗血症を治療するために、本発明の抗ＴＮＦα抗体または抗体部分は、敗血症を更に緩和し得る１種類またはそれ以上の追加の治療剤、例えばインターロイキン−１阻害剤（例えば国際公開特許第WO92/16221号および第WO92/17583号公報に記載のもの）、サイトカインのインターロイキン−６（例えば国際公開特許第WO93/11793号公報を参照されたい）、または血小板活性化因子の拮抗薬（例えばヨーロッパ特許第374 510号公報を参照されたい）と同時投与することができる。敗血症の治療のためのその他の併用療法は、サブセクションIIIで更に考察する。
【０１０４】
加えて、好適実施態様では、本発明の抗ＴＮＦα抗体または抗体部分は、治療の時点でＩＬ−６の血清または血漿濃度が５００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは１，０００ｐｇ／ｍｌを超える敗血症患者の下位群内のヒトである被験者に投与する（Daumらによる国際公開特許第WO95/20978号公報を参照されたい）。
【０１０５】
Ｂ．自己免疫病
腫瘍壊死因子は、様々な自己免疫病の病態生理学に役割を果たすことに関与している。例えば、ＴＮＦαは、リウマチ様関節炎では組織の炎症を活性化し、関節の破損を生起することに関与している［例えば、Moeller,A.,et al.(1990)Cytokine2:162-169；Moellerらへの米国特許第5,231,024号明細書；Moeller,A.によるヨーロッパ特許第260 610 B1号公報；Tracey,K.J. & Cerami,A.（前掲）；Arend,W.P.& Dayer,J-M.(1995)Arth.Rheum.38:151-160；Fava,R.A.,etal.(1993)Clin.Exp.Immunol.94:261-266を参照されたい］。ＴＮＦαは、糖尿病でも、島細胞の死を促進し、インスリン耐性を媒介することに関与している（例えばTracey &Cerami（前掲）；国際公開特許第WO94/08609号公報を参照されたい）。ＴＮＦαは、多発性硬化症でも、希突起神経膠細胞に対する細胞毒性の媒介、および炎症斑の誘導に関与している（例えばTracey & Cerami（前掲）を参照されたい）。キメラの人体適応マウス抗ｈＴＮＦα抗体は、リウマチ様関節炎の治療について臨床試験を経ている［例えば、Elliott,M.J.,et al.(1994)Lancet 344:1125-1127；Elliott,M.J.,et al.(1994)Lancet 344:1105-1110；Rankin,E.C.,et al.(1995)Br.J.Rheumatol.34:334-342を参照されたい］。
【０１０６】
本発明のヒトの抗体および抗体部分は、自己免疫病、特にリウマチ様関節炎、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎および痛風性関節炎を包含する炎症を伴うもの、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫糖尿病、自己免疫葡萄膜炎、ならびに腎症性症候群を治療するのに用いることができる。代表的には、抗体または抗体部分を全身的に投与するが、一定の疾患に対しては、炎症の部位への抗体または抗体部分の局所投与が有益であり得る（例えば、単独でか、または国際公開特許第WO93/19751号公報に記載のとおり、シクロヘキサン−イリデン誘導体との併用での、リウマチ様関節炎での関節への局所投与、または糖尿性潰瘍に対する局所塗布)。本発明の抗体または抗体部分は、サブセクションIIIで更に考察したとおり、自己免疫病の治療に役立つ１種類またはそれ以上の追加の治療剤とともに、投与することもできる。
【０１０７】
Ｃ．伝染病
腫瘍壊死因子は、様々な伝染病で観察される生物学的効果の仲介に関与している。例えば、ＴＮＦαは、マラリアでは、脳の炎症、および毛細血管の血栓症や梗塞の仲介に関与している。ＴＮＦαは、髄膜炎では、脳の炎症を仲介し、血液−脳関門の破壊を誘導し、敗血症ショック症候群を誘発し、静脈梗塞を活性化することにも関与している。ＴＮＦαは、後天性免疫不全症候群（エイズ）では、悪液質を誘導し、ウイルス増殖を刺激し、中枢神経系の損傷を仲介することにも関与している。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、細菌性髄膜炎（例えばヨーロッパ特許第585705号公報を参照されたい）、脳性マラリア、エイズやエイズ関連症候群（ＡＲＣ）（例えばヨーロッパ特許第230574号公報を参照されたい）を包含する伝染病、および移植に副次的なサイトメガロウイルス感染［例えばFietze,E.,et al.(1994)Transplantation58:675-680を参照されたい］の治療に用いることができる。本発明の抗体または抗体部分は、感染（例えばインフルエンザ）による発熱や筋肉痛、および感染に副次的な悪液質（例えばエイズまたはＡＲＣに副次的な）を包含する、伝染病に付随する徴候を緩和するのにも用いることができる。
【０１０８】
Ｄ．移植
腫瘍壊死因子は、同種移植拒絶や移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の中枢的メジエーターとして、およびＴ細胞受容体のＣＤ３複合体に仕向けたラット抗体ＯＫＴ３を、腎移植体の拒絶を阻害するのに用いたときに観察される副作用を仲介することに関与している［例えば,Eason,J.D.,etal.(1995)Transplantation59:300-305；Suthanthiran,M.& Strom,T.B.(1994)New Engl.J.Med.331:365-375を参照されたい］。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、同種および異種移植片の拒絶を包含する移植体拒絶を阻害し、ＧＶＨＤを阻害するのに用いることができる。抗体または抗体部分は、単独で用いてよいが、最も好ましくは、同種移植片に対する免疫応答を阻害するか、またはＧＶＨＤを阻害する１種類またはそれ以上の他の薬剤と併用する。例えば、一実施態様では、本発明の抗体または抗体部分をＯＫＴ３と併用して、ＯＫＴ３で誘導される反応を阻害する。もう一つの実施態様では、本発明の抗体または抗体部分を、免疫応答の調節に関与する他の標的、例えば細胞表面分子のＣＤ２５（インターロイキン−２受容体α）、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）および／またはＣＤ８６（Ｂ７−２）に仕向けた１種類またはそれ以上の抗体と併用する。更にもう一つの実施態様では、本発明の抗体または抗体部分を、１種類またはそれ以上の一般的な免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６と併用する。
【０１０９】
Ｅ．悪性腫瘍
腫瘍壊死因子は、悪性腫瘍では、悪液質の誘導、腫瘍成長の刺激、転移能の増強、および細胞毒性の仲介に関与している。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、腫瘍成長もしくは転移を阻害し、および／または悪性腫瘍に副次的である悪液質を緩和するために、悪性腫瘍の治療に用いることができる。該抗体または抗体部分は、全身的にか、または腫瘍部位に局所的に投与してよい。
【０１１０】
Ｆ．肺疾患
腫瘍壊死因子は、白血球−内皮活性化の刺激、肺細胞への細胞毒性の指向、および血管漏出症候群の誘導を包含する、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）の病態生理学に関与している。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、成人呼吸困難症候群（例えば国際公開特許第WO91/04054号公報を参照されたい）、ショック肺、慢性炎症性肺病、肺サルコイドーシス、肺線維症およびケイ肺症を包含する様々な肺疾患を治療するのに用いることができる。該抗体または抗体部分は、全身的にか、または肺表面に局所的に、例えばエアゾルとして投与してよい。本発明の抗体または抗体部分は、サブセクションIIIで更に考察したとおり、肺疾患の治療に役立つ１種類またはそれ以上の追加の治療剤とともに、投与することもできる。
【０１１１】
Ｇ．腸疾患
腫瘍壊死因子は、炎症性腸疾患の病態生理学に関与している［例えば、Tracy,K.J.,et al.(1986)Science 234:470-474;Sun,X-M.,et al.(1988)J.Clin.Invest.81:1328-1331；MacDonald,T.T.,et al.(1990)Clin.Exp.Immunol. 81:301-305を参照されたい］。キメラマウスの抗ｈＴＮＦα抗体は、クローン病の治療について臨床試験を受けている［van Dullemen,H.M.,et al.(1995)Gastroenterology 109:129-135］。本発明のヒト抗体および抗体部分は、腸疾患、例えば、二つの症候群：クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する自発性炎症性腸疾患を治療するのに用いることもできる。本発明の抗体または抗体部分は、サブセクションIIIで更に考察したとおり、腸疾患の治療に役立つ１種類またはそれ以上の追加の治療剤とともに、投与することもできる。
【０１１２】
Ｈ．心疾患
本発明の抗体および抗体部分は、心臓の虚血（例えばヨーロッパ特許第453898号公報を参照されたい）および心不全（心筋の弱化）（例えば国際公開特許第WO94/20139号公報を参照されたい）を包含する様々な心疾患を治療するのに用いることもできる。
【０１１３】
Ｉ．その他
本発明の抗体および抗体部分は、ＴＮＦα活性が不都合であるその他の様々な疾患を治療するのに用いることもできる。ＴＮＦαが病態生理学に関与しており、そのため本発明の抗体または抗体部分を用いて治療できるその他の疾病および疾患の例は、炎症性骨疾患および骨吸収病［例えば、Bertolini,D.R.,et al.(1986)Nature 319:516-518;Konig,A.,et al.(1988)J.Bone Miner.Res.3:621-627；Lerner,U.H.& Ohlin A.(1993)J.Bone Miner.Res.8:147-155；およびShankar,G.&Stern,P.H.(1993)Bone14:871-876を参照されたい］、アルコール性肝炎［例えば、McClain,C.J.& Cohen,D.A.(1989)Hepatology 9:349-351；Felver,M.E.,et al.(1990)Alcohol Clin.Exp.Res.14:255-259；およびHansen,J.,et al.(1994)Hepatology 20:461-474を参照されたい］、ウイルス性肝炎［Sheron,N.,et al.(1991)J.Hepatol.12:241-245；およびHussain,M.J.,et al.(1994)J.Clin.Pathol.47:1112-1115］、および電撃的肝炎を包含する肝炎；凝固障害［例えば、van der Poll,T.,et al.(1990)N.Engl.J.Med.322:1622-1627；およびvan der Poll,T.,et al.(1991)Prog.Clin.Biol.Res.367:55-60を参照されたい]、火傷[例えば、Giroir,B.P.,et al.(1994)Am.J.Physiol.267:H118-124；およびLiu,X.S.,etal.(1994)Burns 20:40-44を参照されたい]、再灌流損傷[例えば、Scales,W.E.,et al.(1994)Am.J.Physiol.267:G1122-1127；Serrick,C.,et al.(1994)Transplantation58:1158-1162；およびYao,Y.M.,et al.(1995)Resuscitation 29:157-168を参照されたい］、ケロイド形成［例えば、McCauley,R.L.,et al.(1992)J.Clin.Immunol.12:300-308を参照されたい］、瘢痕組織形成；発熱；歯根膜病；肥満症、ならびに放射線毒性を包含する。
【０１１４】
本発明を下記の実施例によって更に説明するが、これは限定するとして解してはならない。本出願の全体を通じて、引用されたすべての参考文献、特許および公開特許願の内容は、引用によってここに組み込まれる。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：ｈＴＮＦαとのヒト抗体の結合の速度論的分析
リガンド（バイオセンサーのマトリックスに固定化されたビオチニル化組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα））と被分析物（溶液中の抗体）との実時間での結合相互作用を、ＢＩＡコアシステム（Pharmacia Biosensor, Piscataway,NJ)を用いた表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。このシステムは、ＳＰＲの光学的特性を利用して、デキストランバイオセンサーマトリックス中のタンパク質の濃度の変化を検出する。タンパク質は、既知の濃度でデキストランのマトリックスと共有結合させる。抗体は、デキストランマトリックスを通じて注入し、注入された抗体と固定化されたリガンドとの特異的結合が、マトリックスのタンパク質濃度の上昇、および結果的なＳＰＲシグナルの変化を招く。ＳＰＲでのこれらの変化は、共鳴単位（ＲＵ）として記録され、センサー記録図のｙ軸に沿って時間について表示される。バイオセンサーマトリックスへのビオチニル化ｒｈＴＮＦαの固定化を促すため、初めに１００ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および４００ｍＭの塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）によるマトリックス上のカルボキシル基の活性化によって、ストレプトアビジンを、遊離アミノ基を介してデキストランマトリックスに共有結合させる。次いで、活性化されたマトリックス越しにストレプトアビジンを注入する。酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５に希釈したストレプトアビジン３５μｌ（２５μｇ／ｍｌ）を、活性化されたバイオセンサー越しに注入し、タンパク質上の遊離アミンを、活性化されたカルボキシル基に直接結合させる。１Ｍのエタノールアミンの注入によって、未反応のマトリックスＥＤＣ−エステルを失活させる。ストレプトアビジンと結合したバイオセンサーのチップは、商業的に入手可能でもある（Pharmacia BR-1000-16、Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ）。
【０１１６】
ビオチニル化ｒｈＴＮＦαは、初めにビオチン（Ｄ−ビオチニル−ε−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；Boehringer Mannheimカタログ番号第1008960号）５．０ｍｇをジメチルスルホキシド５００μｌに溶かして、１０ｍｇ／ｍｌの溶液を作成することによって調製した。（２．６５ｍｇ／ｍｌの）ｒｈＴＮＦα１ｍｌあたりビオチン１０μｌを、ビオチンが２：１のモル比となるようにｒｈＴＮＦαに加えた。反応物を静かに混合し、暗中で室温にて２時間インキュベートした。ＰＤ−１０のカラム、セファデックスＧ−２５Ｍ（Pharmaciaカタログ番号第17-085-01号）を、冷ＰＢＳ２５ｍｌで平衡させ、カラムあたり２ｍｌのｒｈＴＮＦα−ビオチンを装荷した。カラムを１０×１ｍｌの冷ＰＢＳで溶出した。画分を捕集し、ＯＤ２８０で読み取った（１．０ＯＤ＝１．２５ｍｇ／ｍｌ）。適切な画分をプールし、使用まで−８０℃で保管した。ビオチニル化ｒｈＴＮＦαは、商業的に入手可能でもある（R&D Systemsカタログ番号第FTA00号、Minneapolis,MN）。
【０１１７】
ストレプトアビジンを介してマトリックスに固定化しようとするビオチニル化ｒｈＴＮＦαを、０．０５％の(BIAcore)界面活性剤Ｐ２０（Pharmacia BR-1000-54、Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ）で補強したＰＢＳ実施緩衝液（Gibcoカタログ番号第1490-144号、Gibco BRL,Grand Island,NY）中に希釈した。固定化したｒｈＴＮＦαと結合するｒｈＴＮＦα特異性抗体の容量を決定するために、結合検定を下記のとおり遂行した。ビオチニル化ｒｈＴＮＦαのアリコート（２５ｎＭ；１０μｌアリコート）を、ストレプトアビジン結合デキストランマトリックス中に５μl/分の流量で注入した。タンパク質の注入の前および直後に、ＰＢＳ緩衝液のみを各フローセルに流通させた。基線と、ビオチニル化ｒｈＴＮＦα注入の完了の約３０秒後との間のシグナルの正味の差が、結合の値を表すと解釈した（約５００ＲＵ)。固定化されたビオチニル化ｒｈＴＮＦαとのｒｈＴＮＦα特異性抗体の直接的結合を測定した。抗体（２０μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ操業緩衝液中に希釈し、２５μｌアリコートを、固定化タンパク質マトリックス中に５μl/分の流量で注入した。抗体の注入の前および直後に、ＰＢＳ緩衝液のみを各フローセルに流通させた。基線シグナルと、抗体注入の完了後のシグナルとの正味の差が、特定の試料の結合の値を表すと解釈した。次の試料の注入の前に、１００ｍＭＨＣlを用いてバイオセンサーのマトリックスを再生した。オフ速度(Ｋoff)、オン速度(Ｋon)、会合速度（Ｋa）および解離速度（Ｋd）定数を決定するために、BIAcoreの速度論的評価ソフトウエア（バージョン２．１）を用いた。
【０１１８】
ビオチニル化ｒｈＴＮＦαとのＤ２Ｅ７（ＩｇＧ４完全長抗体）の結合の、マウスｍＡｂのＭＡＫ１９５（Ｆ(ａｂ’）2フラグメント）と比較しての代表的な結果を下記の表１に示す。
【０１１９】
【表２】
第二の一連の実験では、ＩｇＧ１完全長形態のＤ２Ｅ７とビオチニル化ｒｈＴＮＦαとの分子速度論的相互作用を、上記のとおり、BIAcore技術を用いて定量的に分析し、速度論的速度定数を導出し、下記の表２、３および４に要約した。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
【表４】
【０１２２】
【表５】
【０１２３】
解離および会合速度定数は、ＢＩＡ分析ソフトウエアによってセンサーグラムの解離および会合領域を分析することによって算出した。Ｄ２Ｅ７とビオチニル化ｒｈＴＮＦα分子との相互作用に、慣用の化学的反応速度論：ゼロ次の解離および一次の会合速度論を仮定した。分析のために、速度論データの分析用の分子モデルを選ぶのに、二価のＤ２Ｅ７抗体の一方の腕と三量体のビオチニル化ｒｈＴＮＦの一方の単位との相互作用のみを考慮した。３回の独立した実験を実施し、結果を別個に分析した。Ｄ２Ｅ７とビオチニル化ｒｈＴＮＦとの相互作用の平均した見かけの解離速度定数(ｋd）は、８．８１±１．０６×１０-5秒-1であり、平均した見かけの会合速度定数(ｋa）は、１．９１±１．２６×１０5Ｍ-1秒-1であった。次いで、見かけの固有解離定数(Ｋd）を、式：Ｋd＝ｋd／ｋaによって算出した。こうして、速度論的パラメータから導いた、ｒｈＴＮＦに対するＤ２Ｅ７の平均Ｋdは、６．０９±３．４２×１０-10Ｍであった。ＩｇＧ１形態のＤ２Ｅ７（表２、３および４に提示）とＩｇＧ４形態のＤ２Ｅ７（表１および実施例２および３に提示）とに対する速度論上の値の僅かな差は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４不変部領域のいずれかの存在に起因する真の差ではなく、むしろ、ＩｇＧ１の速度論的分析に用いた、より正確な抗体濃度測定に起因すると考えられる。したがって、ここに提示したＩｇＧ１形態のＤ２Ｅ７に対する速度論的な値が、Ｄ２Ｅ７抗体の最も正確な速度論的パラメータであると考えられる。
【０１２４】
実施例２：Ｄ２Ｅ７のＣＤＲ３ドメインのアラニン走査突然変異形成
標準的方法を用い、Ｄ２Ｅ７ＶＬおよびＤ２Ｅ７ＶＨ領域のＣＤＲドメイン沿いに、一連のアラニン単一突然変異を導入した。Ｌ鎖の突然変異を図１Ｂに示す（ＬＤ２Ｅ７*．Ａ１、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ３、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ４、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ５、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ７およびＬＤ２Ｅ７*．Ａ８：Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３ドメインの、それぞれ第１、３、４、５、７または８位でのアラニン突然変異を有する）。Ｈ鎖の突然変異を図２Ｂに示す（ＨＤ２Ｅ７*．Ａ１、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ２、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ３、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ４、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ５、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ６、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ７、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ８およびＨＤ２Ｅ７*．Ａ９：Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３ドメインの、それぞれ第２、３、４、５、６、８、９、１０または１１位でのアラニン突然変異を有する）。野生型Ｄ２Ｅ７ＶＬおよびＶＨで構成される抗体とのｒｈＴＮＦαの相互作用の速度論を、（１）アラニン置換Ｄ２Ｅ７ＶＨと対合させた野生型Ｄ２Ｅ７ＶＬ；（２）アラニン置換Ｄ２Ｅ７ＶＬと対合させた野生型Ｄ２Ｅ７ＶＨ；または（３）アラニン置換Ｄ２Ｅ７ＶＨと対合させたアラニン置換Ｄ２Ｅ７ＶＬで構成される抗体とのそれと比較した。すべての抗体は、完全長ＩｇＧ４分子として試験した。
【０１２５】
ｒｈＴＮＦαとの抗体の相互作用の速度論を、実施例１に記載のとおり、表面プラスモン共鳴によって決定した。異なるＶＨ／ＶＬ対についてのＫoff速度を、下記の表５に要約する：
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
これらの結果は、Ｄ２Ｅ７のＶＬ領域およびＶＨ領域のＣＤＲ３ドメインの位置の大多数は、ただ１個のアラニン残基との置換を受け易いことを立証する。Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３ドメインの第１、４、５もしくは７位、またはＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３ドメインの第２、５、６、８、９もしくは１０位でのただ１個のアラニンの置換は、野生型の両親のＤ２Ｅ７抗体と比較した限りでは、ｈＴＮＦαの結合のオフ速度に有意な効果を及ぼさない。Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３の第８位、またはＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３の第３位でのアラニンの置換は、４倍速いＫoffを与え、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３の第４または１１位でのアラニン置換は、８倍速いＫoffを与えて、これらの位置は、ｈＴＮＦαとの結合に、より決定的であることが示される。しかし、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３ドメインの第１、４、５、７もしくは８位、またはＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３ドメインの第２、３、４、５、６、８、９、10もしくは１１位でのただ１個のアラニン置換は、１×１０-3秒-1またはそれ以下のＫoffを有する抗ｈＴＮＦα抗体を依然として生じる。
【０１２８】
実施例３：Ｄ２Ｅ７関連抗体の結合分析
Ｄ２Ｅ７に順次関連する一連の抗体を、実施例１に記載のとおりの表面プラスモン共鳴によって、ｒｈＴＮＦαとのそれらの結合について分析した。試験したＶＬ領域のアミノ酸配列を図１Ａおよび１Ｂに示す。試験したＶＨ領域のアミノ酸配列を図２Ａおよび２Ｂに示す。（完全長ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４抗体、またはｓｃＦｖのいずれかとして示されたフォーマットでの)様々なＶＨ／ＶＬ対についてのＫoff速度を、下記の表６に要約する：
【０１２９】
【表７】
【０１３０】
第９位にトレオニンまたはアラニンのいずれかを有する、Ｄ２Ｅ７、ＬＯＥ７、ＬＯＥ７．ＴおよびＬＯＥ７．Ａから選ばれたＶＬを有する完全長抗体（すなわち、ＩｇＧフォーマット）についての遅いオフ速度(すなわち、Ｋoff≦１×１０-4秒-1）は、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３の第９位が、これら二つの残基によって、Ｋoffに実質的に影響することなく占められ得ることを示す。したがって、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３に関する共通モチーフは、アミノ酸配列：Ｑ−Ｒ−Ｙ−Ｎ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｙ−（Ｔ／Ａ)(SEQ ID NO:３）を含む。更に、第１２位にチロシンまたはアスパラギンのいずれかを有する、Ｄ２Ｅ７、ＶＨ１−Ｄ２．ＮおよびＶＨ１−Ｄ２．Ｙから選ばれたＶＨを有する抗体についての遅いオフ速度(すなわち、Ｋoff≦１×１０-4秒-1）は、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３の第１２位が、これら二つの残基によって、Ｋoffに実質的に影響することなく占められ得ることを示す。したがって、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３に関する共通モチーフは、アミノ酸配列：Ｖ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−(Ｙ／Ｎ)(SEQ ID NO:4）を含む。
【０１３１】
表６に示した結果は、ｓｃＦｖフォーマットでは、２ＳＤ４ＶＬまたはＶＨＣＤＲ３領域を含む抗体は、Ｄ２Ｅ７ＶＬまたはＶＨＣＤＲ３領域を含む抗体と比較して、より速いＫoff(すなわち、Ｋoff≧１×１０-3秒-1）を示すことを立証する。ＶＬＣＤＲ３内では、２ＳＤ４は、第２、５および９位でＤ２Ｅ７と異なる。しかし、上記に考察したとおり、第９位は、Ａｌａ(２ＳＤ４でのように）またはＴｈｒ（Ｄ２Ｅ７でのように）によって、Ｋoffに実質的に影響することなく占められ得る。したがって、２ＳＤ４およびＤ２Ｅ７の比較によって、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３の第２および５位は、ともにアルギニンであって、ｈＴＮＦαとの抗体の会合に決定的であるとして特定できる。これらの残基は、抗体結合部位での接触残基として直接関与できるか、またはこの領域での抗体分子の骨格的構造の維持に決定的に寄与できると思われる。第２位の重要性に関しては、Ｌｙｓ（ＥＰＢ１２での）とのＡｒｇ（Ｄ２Ｅ７と同じＶＬＣＤＲ３を有するＬＯＥ７での）の置換は、オフ速度を２倍に加速する。第５位の重要性に関しては、実施例２に記載したとおり、Ａｌａ（ＬＤ２Ｅ７*．Ａ５での）とのＡｒｇ（Ｄ２Ｅ７での）の置換も、オフ速度を２倍に加速する。その上、第２および５位のいずれにもＡｒｇがないと(２ＳＤ４での)オフ速度は５倍も速い。しかし、第５位は、ｈＴＮＦαとの改良された結合に重要ではあるが、この位置での変化は、ＶＬＬＯＥ４、ＶＬＬＯＨ１またはＶＬ０．１Ｈ８に見られるとおり、他の位置での変化によって打ち消され得ることに注目すべきである。
【０１３２】
ＶＨＣＤＲ３内では、第１、７および１２位でＤ２Ｅ７と異なる。しかし、上記に考察したとおり、第１２位は、Ａｓｎ（２ＳＤ４でのように）またはＴｙｒ（Ｄ２Ｅ７でのように）によって、Ｋoffに実質的に影響することなく占められ得る。したがって、２ＳＤ４およびＤ２Ｅ７の比較によって、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３の第１および７位は、ｈＴＮＦαとの結合に決定的であるとして特定できる。上記に考察したとおり、これらの残基は、抗体結合部位での接触残基として直接関与できるか、またはこの領域での抗体分子の骨格的構造の維持に決定的に寄与できると思われる。両位置とも、ｈＴＮＦαとの結合に重要であり、それは、３Ｃ−Ｈ２ＶＨＣＤＲ３（Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３に関して、第１位にバリンからアラニンへの変化を有する）を用いたとき、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３を用いたときより３倍も速いオフ速度をｓｃＦｖが有するからであるが、しかし、このオフ速度は、２ＳＤ４ＶＨＣＤＲ３（Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３に関して、第１および７位の双方に変化を有する）を用いたときより依然として４倍も遅い。
【０１３３】
実施例４：Ｄ２Ｅ７の機能的活性
Ｄ２Ｅ７の機能的活性を調べるために、該抗体がｈＴＮＦα活性をin vitroまたはin vivoのいずれでも阻害できる能力を測定するいくつかの検定で、該抗体を用いた。
【０１３４】
Ａ．Ｌ９２９細胞でのＴＮＦαの誘導による細胞毒性の中和
ヒト組換えＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）は、１８〜２４時間のインキュベーション期間後にマウスＬ９２９細胞に細胞毒性を生起する。ヒト抗ｈＴＮＦα抗体を、下記のような、ｒｈＴＮＦαおよび細胞との抗体の同時インキュベーションによるＬ９２９の検定で評価した。抗ｈＴＮＦαＡｂ１００μｌを含む９６穴微量滴定プレートを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ培地を用いて、二重にしたプレート伝いに１／３に系統希釈した。ｒｈＴＮＦα５０μｌを加えて、各試料のウェル中で５００ｐｇ／ｍｌの最終濃度とした。次いで、プレートを室温で３０分間インキュベートした。次に、ＴＮＦα感受性であるＬ９２９マウス線維芽細胞５０μｌを加えて、１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを含む１ウェルあたり、５×１０4の細胞の最終濃度とした。対照は、培地に細胞を加えたものと、ｒｈＴＮＦαに細胞を加えたものとを含んだ。これらの対照、および２ｎｇ／ｍｌ〜８．２ｐｇ／ｍｌにわたるＴＮＦαの標準曲線を用いて、検定の質を決定し、中和の窓口を与えた。次いで、プレートを５％ＣＯ2中で３７℃で終夜（１８〜２４時間）インキュベートした。
【０１３５】
培地１００μｌを各ウェルから除去し、ＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌの３，（４，４−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウム＝ブロミド（ＭＴＴ；Sigma Chemical Co.,St.Louis,Moより商業的に入手できる）５０μｌを加えた。次いで、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。次いで、２０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）５０μｌを各ウェルに加え、プレートを３７℃で終夜インキュベートした。５７０／６３０ｎｍでの光学密度を測定し、各試料について曲線をプロットし、標準的方法によってＩＣ50を決定した。
【０１３６】
様々なＶＬおよびＶＨ対を有するヒト抗体についての、マウスのＭＡＫ１９５ｍＡｂと比較した限りでの代表的な結果を下記の図３および表７に示す。
【０１３７】
【表８】
【０１３８】
図３および表７の結果は、Ｄ２Ｅ７のヒト抗ｈＴＮＦα抗体、および様々なＤ２Ｅ７関連抗体は、ＴＮＦα誘導によるＬ９２９細胞毒性を、マウス抗ｈＴＮＦαｍＡｂであるＭＡＫ１９５のそれとほぼ同等の能力で中和することを立証する。
【０１３９】
もう一連の実験では、ＩｇＧ１形態のＤ２Ｅ７がＴＮＦα誘導Ｌ９２９細胞毒性を中和できる能力を、上記のとおりに調べた。３回の独立した実験から得られた結果、およびその平均を下記に要約する。
【０１４０】
【表９】
この一連の実験は、完全長ＩｇＧ１の形態でのＤ２Ｅ７が、ＴＮＦα誘導Ｌ９２９細胞毒性を、１．２５±０．０１×１０-10の平均ＩＣ50［Ｍ］で中和することを確認した。
【０１４１】
Ｂ．Ｕ−９３７細胞でのＴＮＦα受容体とのＴＮＦαの結合の阻害
ヒト抗ｈＴＮＦα抗体が、細胞の表面でｈＴＮＦα受容体とのｈＴＮＦαの結合を阻害できる能力を、ｈＴＮＦα受容体を発現するヒト組織球細胞系統であるＵ−９３７細胞系統（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１５９３）を用いて調べた。Ｕ−９３７細胞を、１０％ウシ胎児血清（Hyclone A-1111、Hyclone Laboratories,Logan,UT）、Ｌ−グルタミン（４ｎＭ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ）、ペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）で強化したＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。完全長ＩｇＧ抗体の活性を調べるために、１ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Sigma Ｉ-4506、Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）で強化したＰＢＳとともにＵ−９３７細胞を氷上で４５分間前インキュベートし、次いで、細胞を結合用緩衝液で３回洗浄した。受容体結合検定のためには、Ｕ−９３７細胞(５×１０6細胞／ウェル）を、９６穴微量滴定プレート（Costar3799、CostarCorp.,Cambridge,MA）内で結合用緩衝液中で、１２５Ｉ標識化ｒｈＴＮＦα（３×１０-10M；２５μＣｉ／ｍｌ；より入手）とともに、抗ｈＴＮＦαを加えるか、または加えずに、０．２ｍｌの総量でインキュベートした。プレートを氷上で１．５時間インキュベートした。次いで、各試料７５μｌを、ジブチルフタル酸塩（Sigma D-2270、Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）およびジノニルフタル酸塩（ＩＣＮ210733、ICN,Irvine,CA）を含む１．０ｍｌ入り試験管（Sarstedt 72.700、Sarstedt Corp.,Princeton,NJ）に移した。試験管は、ジブチルフタル酸塩およびジノニルフタル酸塩のそれぞれ２：１の体積比の混合物３００ｍｌを含んだ。遊離（すなわち未結合）125Ｉ標識化ｒｈＴＮＦαを、５分間の微量遠心分離によって除去した。次いで、細胞のペレットを含む各試験管端を、微小管鋏（Bel-Art210180001、Bel-Art Products,Pequannock,NJ）を援用して切断した。細胞ペレットは、ｐ６０またはｐ８０ＴＮＦα受容体と125Ｉ標識化ｒｈＴＮＦαを含むが、油混合物の上の水相は、過剰な遊離125Ｉ標識化ｒｈＴＮＦαを含む。すべての細胞ペレットを計数管（Falcon2052、Becton DickinsonLabware,Lincoln Park,NJ）内に捕集し、シンチレーションカウンターで計数した。
【０１４２】
代表的な結果を図４に示す。Ｕ−９３７細胞でのｈＴＮＦα受容体とのｈＴＮＦαの結合のＤ２Ｅ７による阻害についてのＩＣ50値は、これらの実験では約３×１０-10Ｍである。これらの結果は、Ｄ２Ｅ７というヒト抗ｈＴＮＦα抗体は、Ｕ−９３７細胞でのｈＴＮＦα受容体とのｈＴＮＦαの結合を、マウス抗ｈＴＮＦαのｍＡｂであるＮＡＫ１９５のそれとほぼ等価の濃度で阻害することを立証する。
【０１４３】
もう一連の実験では、ＩｇＧ１形態のＤ２Ｅ７がＵ−９３７細胞でのｈＴＮＦα受容体とのｒｈＴＮＦαの結合を阻害できる能力を、上記のとおりに調べた。これらの実験の結果、およびその平均を、下記の表９に要約する。
【０１４４】
【表１０】
この一連の実験は、完全長のＩｇＧ１形態でのＤ２Ｅ７は、Ｕ−９３７細胞でのＴＮＦ受容体の結合を、１．５６±０．１２×１０-10の平均ＩＣ50[Ｍ]で阻害することを確認する。
【０１４５】
個々のｐ５５およびｐ７５受容体と結合する125Ｉ−ｒｈＴＮＦαの結合におけるＤ２Ｅ７の阻害能を調べるため、固相放射線免疫検定を実施した。Ｄ２Ｅ７のＩＣ50値を別個のＴＮＦ受容体について測定するため、様々な濃度の抗体を、３×１０-10の濃度の125Ｉ−ｒｈＴＮＦαとともにインキュベートした。次いで、ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体のいずれかを含む別個のプレートで、混合物を用量依存方式で試験した。結果を下記の表１０に要約する：
【０１４６】
【表１１】
Ｄ２Ｅ７によるＵ９３７細胞でのｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ受容体との125Ｉ−ｒｈＴＮＦの結合の阻害は、Ｓ字状曲線に従い、各受容体について類似のＩＣ50値を示した。組換えＴＮＦ受容体による固相放射線免疫検定（ＲＩＡ）の実験では、Ｄ２Ｅ７によるｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ受容体との125Ｉ−ｒｈＴＮＦの結合の阻害に対するＩＣ50値は、それぞれ１．４７×１０-9および１．２６×１０-9Ｍとして算出された。固相でのＩＣ50値の減少は、非標識ｒｈＴＮＦも同様のＩＣ50値で阻害したことから、おそらく、ＲＩＡフォーマットでの受容体の、より高い濃度によるものであった。非標識ｒｈＴＮＦによるｐ５５およびｐ７５受容体との125Ｉ−ｒｈＴＮＦの結合の阻害についてのＩＣ50値は、それぞれ２．３１×１０-9および２．７０×１０-9Ｍであった。
【０１４７】
Ｃ．ＨＵＶＥＣでのＥＬＡＭ−１の発現の阻害
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ｒｈＴＮＦαの投与によって、それらの細胞表面で内皮細胞白血球付着分子１（ＥＬＡＭ−１）を発現するよう誘導することができ、これは、ｒｈＴＮＦα投与ＨＵＶＥＣをマウス抗ヒトＥＬＡＭ−１抗体と反応させることによって検出できる。ヒト抗ｈＴＮＦα抗体がＨＵＶＥＣでのＥＬＡＭ−１のこのＴＮＦαに誘導された発現を阻害できる能力を、下記のとおり調べた：ＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ １７３０号）を９６穴プレートに接種し（５×１０4細胞／ウェル）、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、ヒト抗ｈＴＮＦα抗体の系統希釈（１：１０）を、２０〜１００μｇ／ｍｌの抗体で開始して、微量滴定プレート中に調製した。ｒｈＴＮＦαの原液を４．５ｎｇ／ｍｌで調製し、ｒｈＴＮＦαのアリコートを、抗体を含む各ウェルに加え、内容を充分混合した。対照は、培地のみ、培地プラス抗ｈＴＮＦα抗体、および培地プラスｒｈＴＮＦαを包含した。ＨＵＶＥＣのプレートを、その３７℃での終夜インキュベーションから取り出し、培地を各ウェルから静かに吸引した。抗体−ｒｈＴＮＦα混合物２００μｌをＨＵＶＥＣプレートの各ウェルに移した。次いで、ＨＵＶＥＣプレートを３７℃で更に４時間インキュベートした。次に、マウス抗ＥＬＡＭ−１抗体の原液をＲＰＭＩで１：１，０００に希釈した。ＨＵＶＥＣプレートの各ウェルの培地を静かに吸引し、５０μｌ／ウェルの抗ＥＬＡＭ−１抗体液を加え、ＨＵＶＥＣプレートを室温で６０分インキュベートした。125Ｉ標識化抗マウスＩｇ抗体液をＲＰＭＩ中に調製した（５０μｌ中約５０，０００ｃｐｍ）。ＨＵＶＥＣプレートの各ウェルの培地を静かに吸引し、ウェルをＲＰＭＩで２回洗浄し、125Ｉ標識化抗マウスＩｇ液５０μｌを各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで、各ウェルをＲＰＭＩで３回洗浄した。５％ＳＤＳ１８０μｌを各ウェルに加えて、細胞を溶解させた。次いで、各ウェルからの細胞溶解液を管に移し、シンチレーションカウンターで計数した。
【０１４８】
代表的結果を図５に示す。ＨＵＶＥＣでのＥＬＡＭ−１のｈＴＮＦαで誘導される発現のＤ２Ｅ７による阻害に関するＩＣ50値は、これらの実験では約６×１０-11Ｍである。これらの結果は、Ｄ２Ｅ７のヒト抗ｈＴＮＦα抗体は、ＨＵＶＥＣでのｈＴＮＦα受容体で誘導されるＥＬＡＭ−１の発現を、マウス抗ｈＴＮＦαｍＡｂであるＮＡＫ１９５のそれとほぼ等価の濃度で阻害することを立証する。
【０１４９】
もう一連の実験では、ＩｇＧ１形態のＤ２Ｅ７がＨＵＶＥＣでのｈＴＮＦα受容体で誘導されるＥＬＡＭ−１の発現を阻害できる能力を、上記のとおりにして調べた。３回の独立した実験からの結果、およびそれらの平均を下記の表１１に要約する。
【０１５０】
【表１２】
【０１５１】
この一連の実験は、完全長のＩｇＧ１形態でのＤ２Ｅ７は、ＨＵＶＥＣでのＴＮＦα誘導ＥＬＡＭ−１発現を、１．８５±０．１４×１０-10の平均ＩＣ50［Ｍ］で阻害することを確認する。
【０１５２】
Ｄ２Ｅ７ＩｇＧ１の中和能を、他の２種類の付着分子、すなわちＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１のｒｈＴＮＦ誘導での発現についても調べた。１６時間でのＩＣＡＭ−１の発現についてのｒｈＴＮＦの滴定曲線は、ＥＬＡＭ−１発現の曲線に非常に似ているため、同じ濃度のｒｈＴＮＦを、抗体中和実験に用いた。様々な濃度のＤ２Ｅ７の存在下で、ＨＵＶＥＣをｒｈＴＮＦとともに３７℃のＣＯ2恒温器内で１６時間インキュベートし、マウス抗ＩＣＡＭ−１抗体、およびその後の125Ｉ標識化ヒツジ抗マウス抗体によって測定した。
【０１５３】
ＶＣＡＭ−１発現の阻害を試験する実験の手順は、ＥＬＡＭ−１発現のための手順と同じであるが、抗ＥＬＡＭ−１ＭＡｂに代えて、抗ＶＣＡＭ−１ＭＡｂを用いた。３回の独立した実験を実施し、ＩＣ50値を算出した。無関係のヒトＩｇＧ１抗体は、ＶＣＡＭ−１の発現を阻害しなかった。結果を下記の表１２に要約する：
【０１５４】
【表１３】
【０１５５】
これらの実験は、ヒトの一次臍静脈内皮細胞へのｒｈＴＮＦの投与は、４時間で付着分子：ＥＬＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の最適発現へと、かつ１６時間でＩＣＡＭ−１の上方調節された最大の発現へと導いた：Ｄ２Ｅ７は、３種類の付着分子の発現を用量依存方式で阻害することができた。ＥＬＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の阻害に関するＩＣ50値は、それぞれ１．８５×１０-10、２．１７×１０-10および１．０１×１０-10Ｍであった。これらの値は非常に近く、ＥＬＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の誘導を発現するにはｒｈＴＮＦ活性化シグナルの用量が必要であることを示す。興味深いことに、Ｄ２Ｅ７は、ＩＣＡＭ−１の発現の比較的長期の阻害検定で、同様に効果的であった。ＩＣＡＭ−１の阻害検定は、ＥＬＡＭ−１やＶＣＡＭ−１の阻害検定に要する４時間に対して、１６時間のｒｈＴＮＦおよびＤ２Ｅ７とＨＵＶＥＣとの同時インキュベーションを必要とした。Ｄ２Ｅ７がｒｈＴＮＦに対して遅いオフ速度を有することから、１６時間の同時インキュベーション期間の間に、ＨＵＶＥＣのＴＮＦ受容体による有意な競争は皆無であったと考えられる。
【０１５６】
Ｄ．ｈＴＮＦαのin vivoでの中和
３種類のin vivo系を用いて、Ｄ２Ｅ７がin vivoでｈＴＮＦα活性の阻害に有効であることを立証した。
【０１５７】
Ｉ．Ｄ−ガラクトサミン感作マウスでのＴＮＦで誘導した致死性
Ｄ−ガラクトサミンで感作したマウスへの組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）の注入は、２４時間以内に致死性を生じる。このモデルでヒト抗ｈＴＮＦα抗体がｈＴＮＦαをin vivoで中和できることを調べるため、ＰＢＳ中の様々な濃度のＤ２Ｅ７−ＩｇＧ１または対照タンパク質を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに腹腔内（i.p.）注射した。３０分後、ＰＢＳ中のｒｈＴＮＦα１μｇ、およびＤ−ガラクトサミン２０ｍｇ、ｉ．ｐ．にマウスを挑戦させ、２４時間後に観察した。ｒｈＴＮＦαおよびＤ−ガラクトサミンのこれらの量は、８０〜９０％の致死率を達成するよう予め決定した。
【０１５８】
代表的な結果を、生存率の％対抗体濃度の棒グラフとして表し、図６に示す。黒い棒がＤ２Ｅ７を表すのに対し、斜線の棒はＭＡＫ１９５を表す。マウス１匹あたり２．５〜２５μｇの注入は、ＴＮＦαに誘導される致死性から動物を防護した。ＥＤ50値は約１〜２．５μｇ／マウスである。正の対照の抗体であるＭＡＫ１９５は、その防護能力が同様であった。ｒｈＴＮＦα不在下でのＤ２Ｅ７の注入は、マウスにいかなる不都合な効果もなかった。非特異的ヒトＩｇＧ１抗体の注入は、ＴＮＦα誘導致死性からのいかなる防護も与えなかった。
【０１５９】
第二の実験では、４９匹のマウスを７群に等分した。各群には、様々な用量のＤ２Ｅ７を３０分前に与えてから、ＬＤ80の用量のｒｈＴＮＦ／Ｄ−ガラクトサミン混合物（１マウスあたりｒｈＴＮＦ１．０μｇおよびＤ−ガラクトサミン２０ｍｇ）を与えた。対照の群７には、正常なヒトＩｇＧ１κ抗体を２５μｇ／マウスの用量で与えた。２４時間後にマウスを調べた。各群についての生存率を、下記の表１３に要約する。
【０１６０】
【表１４】
【０１６１】
II．ＴＮＦで誘導されるウサギの発熱の阻害
ウサギでのｒｈＴＮＦで誘導される発熱応答の阻害におけるＤ２Ｅ７の薬効を調べた。体重約２．５ｋｇのＮＺＷ系雌ウサギ３匹の群に、それぞれ、Ｄ２Ｅ７、ｒｈＴＮＦ、およびＤ２Ｅ７とｒｈＴＮＦとの免疫複合体を静脈内注射した。Ｋａｙｅ熱記録装置に接続したサーミスタのプローブによって、直腸温を１分ごとに約４時間測定した。５μｇ／ｋｇとして注入した、生理食塩水中の組換えヒトＴＮＦは、０．４℃を超える温度の上昇を注射の約４５分後に誘発した。生理食塩水中に１３８μｇ／ｋｇの用量での抗体製剤自体は、投与の１４０分後までウサギに温度上昇を全く誘発しなかった。以後のすべての実験では、Ｄ２Ｅ７または対照試薬（ヒトＩｇＧ１または生理食塩水担体）をウサギに静脈内注射した後、１５分後に、生理食塩水中のｒｈＴＮＦを５μｇ／ｋｇとして静脈内注射した。いくつかの実験の代表的な結果を、下記の表１４に要約する。
【０１６２】
【表１５】
【０１６３】
１４μｇ／ｋｇの用量でのＤ２Ｅ７の静脈内事前投与は、生理食塩水のみ事前投与したウサギに比して、発熱応答を部分的に阻害した。１３７μｇ／ｋｇで投与したＤ２Ｅ７は、同じ実験でのｒｈＴＮＦの発熱応答を完全に抑制した。第二の実験では、２４μｇ／ｋｇで投与したＤ２Ｅ７は、やはり、生理食塩水のみ事前投与したウサギに比して、発熱応答を部分的に阻害した。この実験でのＤ２Ｅ７対ｒｈＴＮＦのモル比は１／６：１であった。第三の実験では、４８μｇ／ｋｇで静脈内注射したＤ２Ｅ７(Ｄ２Ｅ７：ｒｈＴＮＦのモル比＝３．３：１）は、生理食塩水中の３０μｇ／ｋｇで対照ヒトＩｇＧ１を事前投与したウサギに比して、温度上昇を完全に抑制した。最後の実験では、ｒｈＴＮＦに対する非常に高いモル比（５５：１）でＤ２Ｅ７(７９２μｇ／ｋｇ）を事前投与されたウサギは、観察４時間までのいかなる時点でも、温度のいかなる上昇も発症しなかった。５５：１のモル比で３７℃で１時間インキュベートした、Ｄ２Ｅ７とｒｈＴＮＦとの混合物から生成した免疫複合体のウサギへの投与も、同じ実験で、いかなる温度上昇も誘発しなかった。
【０１６４】
III．Ｔｇ１９７トランスジェニックマウスでの多発性関節炎の防護
疾病の発症に対するＤ２Ｅ７の効果を、関節炎のトランスジェニックマウスのモデルで調査した。ヒト野生型ＴＮＦを発現する（コーディング配列を越えた３’領域が修飾されている）トランスジェニックマウス（Tg197）を生成し、これらのマウスは、生後４〜７週に１００％の発生率で慢性多発性関節炎を発症する［多発性Tg197モデルのこれ以上の説明についてはEMBO J.(1991)10:4025-4031を参照されたい］。
【０１６５】
トランスジェニックな動物は、生後３日にＰＣＲによって同定した。トランスジェニックマウスの同腹仔を６群に分けた。生後１５日に、スロットブロットハイブリダイゼーション分析によってトランスジェニックマウスを確認した。６群の処理プロトコルは、次のとおりである：群１＝処理なし；群２＝生理食塩水(担体)；群３＝１．５μｇ／ｇでのＤ２Ｅ７；群４＝１５μｇ／ｇでのＤ２Ｅ７；群５＝３０μｇ／ｇでのＤ２Ｅ７；群６＝対照として３０μｇ／ｇでのイソタイプ。非トランスジェニックマウスを有する同腹仔も含めて、対照として役立てた（群７＝非トランスジェニック；処理なし）。各群には、指示された処理の週３回の腹腔内注射を与えた。注射は１０週間継続した。毎週、各動物について関節の形態学での巨視的変化を記録した。１０週目に、すべてのマウスを殺し、マウスの組織をホルマリン中に捕集した。組織の顕微鏡検査を実施した。
【０１６６】
毎週の初めに、グラムでの動物の体重を各マウスについて計った。同時に、関節の大きさの測定（ｍｍで）も、疾病の重篤度の測定として実施した。関節の大きさは、マイクロメータ装置を用い、後右足首での３回の測定の平均として確定した。毎週、関節炎の評点を次のとおり記録した：０＝関節炎なし（正常な外見および屈曲）；＋＝軽い関節炎（関節の歪み）；＋＋＝程ほどの関節炎(腫脹、関節の変形)；および＋＋＋＝重い関節炎（屈曲と、ひどく損なわれた運動とで検出される強直）。関節切片のヘマトキシリン／エオシン染色に基づく組織病理学的評点は、次のとおりである：０＝検出できる疾病なし；１＝滑液膜の増殖；２＝重度の滑液の濃化；３＝軟骨の破壊および骨の侵食。
【０１６７】
Tg197トランスジェニック関節炎マウスの平均の関節の大きさに対するＤ２Ｅ７投与の効果を、図９のグラフに示す。Tg197トランスジェニックマウスの生後１１週での組織病理学的および関節炎的評点を、下記の表１５に要約する：
【０１６８】
【表１６】
【０１６９】
この実験は、Ｄ２Ｅ７抗体が、野生型ヒトＴＮＦ（Tg197）を発現するトランスジェニックマウスに対する明確で好都合な効果を有し、研究期間後も明白な関節炎を伴わないことを立証する。
【０１７０】
Ｅ．他種からのＴＮＦαのＤ２Ｅ７による中和
Ｄ２Ｅ７の結合特異性を、Ｌ９２９細胞毒性検定（上記の実施例４、サブセクションＡで記載したとおり）を用い、様々な霊長類の種およびマウスからの腫瘍壊死因子を中和できるその能力によって調べた。結果を、下記の表１６に要約する：
【０１７１】
【表１７】
表１６の結果は、Ｄ２Ｅ７が、５種の霊長類のＴＮＦαの活性をヒトＴＮＦαとほぼ等しく中和でき、その上、イヌＴＮＦα（ヒトＴＮＦαより約１／１０）、およびブタとマウスのＴＮＦα（ヒトＴＮＦαより約１／１，０００未満）の活性を中和できることを立証する。その上、液相ｒｈＴＮＦαとのＤ２Ｅ７の結合は、他のサイトカイン、例えばリンホトキシン（ＴＮＦβ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮγおよびＴＧＦβによっては阻害されず、ＤＮＡが、リガンドであるＴＮＦαに対して非常に特異的であることを示した。
【０１７２】
Ｆ．Ｄ２Ｅ７とともにインキュベートしたヒト全血によって放出されるサイトカインの欠如
この実施例では、Ｄ２Ｅ７がそれ自体で、正常なヒトの血球を、サイトカインを分泌し、細胞表面の分子を脱落させるよう誘導できることを調べた。異なる３種類の正常な供与体からの、様々な濃度に希釈した全血とともに、Ｄ２Ｅ７を２４時間インキュベートした。同時に、ＬＰＳの正の対照を、免疫担当血球を刺激してサイトカインを分泌させるよう予め決定した濃度で行動させた。上清を採集し、一連の１０種類のサイトカイン、受容体および付着分子のＥＬＩＳＡキット：すなわちＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体作用薬、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、可溶性ＴＮＦ受容体Ｉ、可溶性ＴＮＦ受容体II、可溶性ＩＣＡＭ−１および可溶性Ｅ−セレクチン中で試験した。３４３μｇ／ｍｌまでの濃度でのＤ２Ｅ７抗体との同時インキュベーションの結果として測定された、有意量のサイトカイン、または脱落した細胞表面分子は皆無であった。抗体の添加なしの対照培養体も、何ら測定可能量のサイトカインを生産しなかったのに対して、ＬＰＳと同時培養の対照は、高いｐｇないし低いｎｇの範囲の増大した値を生じた。これらの結果は、Ｄ２Ｅ７が、生体外での培養体で全血球を、正常レベルを超えてサイトカインを分泌するか、または細胞表面タンパク質を脱落させるよう誘導しなかったことを示す。
【０１７３】
本開示の形成部分は、添付の配列表であり、その内容を下記の表に要約する。
【表１８】
等価のもの
当業者は、本明細書に記載の発明の特定の実施態様と等価である多くのものを、定型的であることを超えない実験を用いて認識し、または確定できると思われる。そのような等価のものは、下記のクレームに包含されるものとする。
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、単球及びマクロファージを含む多くの型の細胞により産生されるサイトカインであり、それは、元々、ある種のマウスの腫瘍の壊死を誘導するその能力に基づいて同定されたものである。（例えば、非特許文献１参照）。その後、悪液質と関連するカケクチンと呼ばれる因子が、ＴＮＦαと同一分子であることが示された。ＴＮＦαは、ショックの媒介に関与してきた（例えば、非特許文献２、非特許文献３参照）。その上、ＴＮＦαは、敗血症、感染症、自己免疫疾患、移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む様々な他のヒトの病気及び障害の病態生理学に関係してきた（例えば、非特許文献４、特許文献１、特許文献２、非特許文献５、非特許文献６参照）。
【０００２】
種々のヒトの病気におけるヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）の有害な役割の故に、治療ストラテジーは、ｈＴＮＦαを阻害し又は打ち消すようにデザインされてきた。特に、ｈＴＮＦαに結合する（そして中和する）抗体が、ｈＴＮＦα活性を阻害する手段として探究されてきた。最も初期のかかる抗体の幾つかは、ｈＴＮＦαで免疫されたマウスのリンパ球から調製されたハイブリドーマにより分泌されるマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であった（例えば、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献４、特許文献１、特許文献３、特許文献４、特許文献２参照）。これらのマウスの抗ｈＴＮＦα抗体は、しばしば、ｈＴＮＦαに対する高い親和性（例えば、Ｋｄ≦１０-9Ｍ）を示し且つｈＴＮＦα活性を中和することができたが、それらのイン・ビボでの利用は、マウス抗体のヒトへの投与に関係した問題例えば短い血清の半減期、ある種のヒトのエフェクター機能の引き金を引くことができないこと及びヒトにおけるマウス抗体に対する望ましくない免疫応答（「ヒト抗マウス抗体」（ＨＡＭＡ）反応）の誘出により制限され得る。
【０００３】
ヒトにおける完全にマウスの抗体の使用に関係する問題を克服する試みにおいて、マウス抗ｈＴＮＦα抗体は、遺伝子工学的に一層「ヒト様」にされてきた。例えば、抗体鎖の可変領域がマウス由来で且つ定常領域がヒト由来であるキメラ抗体が製造されてきた（非特許文献１１、特許文献５）。更に、抗体の可変領域の超可変ドメインはマウス由来であるが、可変領域の残りと抗体の定常領域がヒト由来であるヒト化抗体も製造されてきた（特許文献６）。しかしながら、これらのキメラ抗体及びヒト化抗体は、未だ幾らかのマウス配列を保持しているので、それらは、やはり望ましくない免疫反応、ヒトの抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応を、特に、例えばリウマチ様関節炎等の慢性適応症のために長期間投与した場合に誘出し得る（例えば、非特許文献１２、非特許文献１３参照）。
【０００４】
マウスのｍＡｂ又はその誘導体（例えば、キメラ又はヒト化抗体）より好適なｈＴＮＦα阻害剤は、完全にヒトの抗ｈＴＮＦα抗体であろう。何故なら、かかる剤は、たとえ長期間使用しても、ＨＡＭＡ反応を誘出しないからである。ｈＴＮＦαに対するヒトモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマ技術を用いて製造されてきた（非特許文献１４、非特許文献１５、特許文献７）。しかしながら、これらのハイブリドーマ由来のモノクローナル自己抗体は、慣用の方法で計算するには低過ぎるｈＴＮＦαに対する親和性を有し、可溶性のｈＴＮＦαに結合することができず、且つｈＴＮＦαにより誘導される細胞障害作用を中和することができなかった（Boyle,等;前出、参照）。その上、ヒトハイブリドーマ技術の成功は、ヒトの末梢血液中の、ｈＴＮＦαに特異的な自己抗体を産生するリンパ球の自然の存在に依存している。ある研究では、ｈＴＮＦαに対する血清自己抗体がヒト患者で検出された（非特許文献１６、非特許文献１７）が、他の研究では、検出されていない（非特許文献１８）。
【０００５】
天然のヒトの抗ｈＴＮＦα抗体の代替物は、組換えｈＴＮＦα抗体であろう。ｈＴＮＦαに比較的低い親和性（即ち、Ｋd〜１０-7Ｍ）及び速い解離速度（即ち、Ｋoff〜１０-2秒-1）で結合する組換えヒト抗体は、記載されている（非特許文献１９）。しかしながら、それらの比較的速い解離動力学の故に、これらの抗体は、治療用途に適していない。更に、組換えのヒトの抗ｈＴＮＦαは、ｈＴＮＦα活性を中和せず、むしろｈＴＮＦαの細胞表面への結合を促進してｈＴＮＦαの内在化を促進すると記載されてきた（非特許文献２０、特許文献８）。
【０００６】
従って、可溶性ｈＴＮＦαと高い親和性及び遅い解離動力学で結合し、ｈＴＮＦα誘導された細胞障害性（イン・ビトロ及びイン・ビボ）及びｈＴＮＦα誘導された細胞活性を含むｈＴＮＦα活性を中和する能力を有するヒト抗体例えば組換えヒト抗体がやはり必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】Moeller等の米国特許第５，２３１，０２４号
【特許文献２】Moeller,A.等による欧州特許出願第２６０６１０Ｂ１号
【特許文献３】Wallach,D.による欧州特許公開第１８６８３３Ｂ１号
【特許文献４】Old等による欧州特許出願公開第２１８８６８Ａ１号
【特許文献５】Dassona,P.E.等によるＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９２／１６５５３
【特許文献６】Adair,J.R.等によるＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９２／１１３８３
【特許文献７】Boyle,等による欧州特許出願公開第６１４９８４Ａ２号
【特許文献８】Aston,R.等によるＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９２／０３１４５
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Old,L.(1985)Science230:630-632
【非特許文献２】Beutler,B.及びCerami,A.(1988)Annu.Rev.Biochem.57:505-518
【非特許文献３】Beutler,B.及びCerami,A.(1989)Annu.Rev.Immunol.7:625-655
【非特許文献４】Moeller,A.等(1990)Cytokine 2:162-169
【非特許文献５】Vasilli,P.(1992)Annu.Rev.Immunol.10:411-452
【非特許文献６】Tracey,K.J.及びCerami,A.(1994)Annu.Rev.Med.45:491-503
【非特許文献７】Hahn T;等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3814-3818
【非特許文献８】Liang,C-M.,等(1986)Biochem.Biophys.Res.Commun.137:847-854
【非特許文献９】Hirai,M.,等(1987)J.Immunol.Methods 96:57-62
【非特許文献１０】Fendly,B.M.,等(1987)Hybridoma 6:359-370
【非特許文献１１】Knight,D.M.等(1993)Mol.Immunol.30:1443-1453
【非特許文献１２】Elliott,M.J.,等(1994)Lancet 344:1125-1127
【非特許文献１３】Elliot,M.J.,等(1994)Lancet 344:1105-1110
【非特許文献１４】Boyle,P.,等(1993)Cell.Immunol.152:556-568
【非特許文献１５】Boyle,P.,等(1993)Cell.Immunol.152:569-581
【非特許文献１６】Fomsgaard,A.,等(1989)Scand.J.Immunol.30:219-223
【非特許文献１７】Bendtzen,K.,等(1990)Prog.Leukocyte Biol.10B:447-452
【非特許文献１８】Leusch,H-G.,等(1991)J.Immunol.Methods139:145-147
【非特許文献１９】Griffiths,A.D.,等(1993)EMBO J.12:725-734
【非特許文献２０】Lidbury,A.,等(1994)Biotechnol.Ther.5:27-45
【発明の概要】
【０００９】
発明の要約
この発明は、ヒトＴＮＦαに特異的に結合するヒト抗体好ましくは組換えヒト抗体を提供する。この発明の抗体は、ｈＴＮＦαへの高い親和性及び遅い解離動力学での結合により及び、ｈＴＮＦα誘導された細胞障害性（イン・ビトロ及びイン・ビボ）及びｈＴＮＦα誘導された細胞活性化を含むｈＴＮＦα活性を中和することにより特徴付けられる。この発明の抗体は、更に、ｈＴＮＦαには結合するがｈＴＮＦβ（リンホトキシン）には結合しないこと及びヒトＴＮＦαに加えて他の霊長類のＴＮＦα及び非霊長類ＴＮＦαに結合する能力を有することにより特徴付けられる。
【００１０】
この発明の抗体は、完全長であってもよいし（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）又は抗原結合部分のみを含んでもよい（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ')2又はｓｃＦｖ断片）。Ｄ２Ｅ７と呼ばれるこの発明の最も好適な組換え抗体は、SEQ ID NO:３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメイン及びSEQ ID NO:４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。好ましくは、Ｄ２Ｅ７抗体は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する。
【００１１】
一具体例において、この発明は、１×１０-8Ｍ以下のＫd及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数でヒトＴＮＦαから解離し（これら両定数は、表面プラズモン共鳴により測定する）、１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50の標準的イン・ビトロＬ９２９アッセイにおけるヒトＴＮＦα細胞障害性を中和する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。一層好ましくは、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は、５×１０-4ｓ-1以下のＫoffで、尚一層好ましくは、１×１０-4ｓ-1以下のＫoffでヒトＴＮＦαから解離する。一層好ましくは、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は、１×１０-8Ｍ以下のＩＣ50、尚一層好ましくは、１×１０-9Ｍ以下のＩＣ50、更に一層好ましくは、５×１０-10Ｍ以下のＩＣ50の標準的イン・ビトロＬ９２９アッセイにおけるヒトＴＮＦα細胞障害性を中和する。
【００１２】
他の具体例において、この発明は、下記の特徴を有するヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する：
ａ）表面プラズモン共鳴により測定して、１×１０-3ｓ-1以下のＫoffでヒトＴＮＦαから解離する；
ｂ）SEQ ID NO:３のアミノ酸配列又は位置１、４、５、７若しくは８の単一のアラニン置換により又は位置１、３、４、６、７、８及び／若しくは９の１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有する；
ｃ）SEQ ID NO:４のアミノ酸配列又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１の単一のアラニン置換により又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／若しくは１２の１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
【００１３】
一層好ましくは、抗体又はその抗原結合部分は、５×１０-4ｓ-1以下のＫoffでヒトＴＮＦαから解離する。更に一層好ましくは、この抗体又はその抗原結合部分は、１×１０-4ｓ-1以下のＫoffでヒトＴＮＦαから解離する。
【００１４】
更に別の具体例において、この発明は、SEQ ID NO:３のアミノ酸配列又は位置１、４、５、７若しくは８の単一アラニン置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有するＬＣＶＲ及びSEQ ID NO:４のアミノ酸配列又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１の単一アラニン置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有するＨＣＶＲを有するヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。一層好ましくは、ＬＣＶＲは、更に、SEQ ID NO:５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインを有し且つＨＣＶＲは、更に、SEQ ID NO:６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインを有する。更に一層好ましくは、ＬＣＶＲは、更に、SEQ ID NO:７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを有し且つＨＣＶＲは、SEQ ID NO:８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを有する。
【００１５】
更に別の具体例において、この発明は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。ある具体例において、この抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域を有する。更に別の具体例において、この抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ')2断片又は単一鎖のＦｖ断片である。
【００１６】
更に別の具体例において、この発明は、SEQ ID NO:３、SEQ ID NO:１１、SEQID NO:１２、SEQ ID NO:１３、SEQ ID NO:１４、SEQ ID NO:１５、SEQ ID NO:１６、SEQ ID NO:１７、SEQ ID NO:１８、SEQ ID NO:１９、SEQ ID NO:２０、SEQID NO:２１、SEQ ID NO:２２、SEQ ID NO:２３、SEQ ID NO:２４、SEQ ID NO:２５、SEQ ID NO:２６よりなる群から選択するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有するＬＣＶＲ又はSEQ ID NO:４、SEQ ID NO:２７、SEQ ID NO:２８、SEQID NO:２９、SEQ ID NO:３０、SEQ ID NO:３１、SEQ ID NO:３２、SEQ ID NO:３３、SEQ ID NO:３４及びSEQ ID NO:３５よりなる群から選択するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有するＨＣＶＲを有する抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００１７】
更に別の具体例において、この発明は、ヒトＴＮＦαの活性を中和するがヒトＴＮＦβ（リンホトキシン）の活性を中和しない単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。好適具体例において、ヒト抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＴＮＦα、チンパンジーＴＮＦα及び、ヒヒＴＮＦα、キヌザルＴＮＦα、カニクイザルＴＮＦα及びアカゲザルＴＮＦαよりなる群から選択する少なくとも一種の霊長類ＴＮＦαの活性を中和する。好ましくは、この抗体は又、少なくとも一種の非霊長類ＴＮＦαの活性をも中和する。例えば、一つのサブ具体例において、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は又、イヌＴＮＦαの活性をも中和する。他のサブ具体例において、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は又、ブタＴＮＦαの活性をも中和する。更に別のサブ具体例においては、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は又、マウスＴＮＦαの活性をも中和する。
【００１８】
この発明の他の面は、この発明の抗体又は抗原結合部分をコードする核酸分子に関係する。Ｄ２Ｅ７ＬＣＶＲをコードするこの発明の好適な核酸は、図７及びSEQ ID NO:３６に示したヌクレオチド配列を有する。Ｄ２Ｅ７ＨＣＶＲをコードするこの発明の他の好適な核酸は、図８及びSEQ ID NO:３７に示したヌクレオチド配列を有する。この発明の抗体をコードする核酸を有する組換え発現ベクター及びかかるベクターが導入された宿主細胞も又、この発明に包含され、それは、この発明の宿主細胞を培養することによるこの発明の抗体の製造方法である。
【００１９】
この発明の更に別の面は、この発明の抗体又はその抗原結合部分を用いてヒトＴＮＦα活性を阻害する方法に関係する。一具体例において、この方法は、ヒトＴＮＦαをこの発明の抗体又はその抗原結合部分と、ヒトＴＮＦα活性が阻害されるように接触させることを含む。他の具体例において、この方法は、この発明の抗体又はその抗原結合部分を、ＴＮＦα活性が有害な病気を患っているヒト患者に、そのヒト患者におけるヒトＴＮＦα活性が阻害されるように投与することを含む。この病気は、例えば、敗血症、自己免疫疾患（例えば、リウマチ様関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎及びネフローゼ症候群）、感染性疾患、悪性疾患、移植の拒絶又は移植片宿主病、肺病、骨の病気、腸疾患又は心臓病であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】Ｄ２Ｅ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（Ｄ２Ｅ７ＶＬ；SEQ ID NO:１にも示されている）、Ｄ２Ｅ７ＶＬのアラニンスキャン変異物（ＬＤ２Ｅ７*．Ａ１、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ３、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ４、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ５、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ７及びＬＤ２Ｅ７*．Ａ８）、Ｄ２Ｅ７関連抗体２ＳＤ４の軽鎖可変領域（２ＳＤ４ＶＬ；SEQ ID NO:９にも示されている）及び他のＤ２Ｅ７関連軽鎖可変領域（ＥＰＢ１２、ＶＬ１０Ｅ４、ＶＬ１００Ａ９、ＶＬ１００Ｄ２、ＶＬ１０Ｆ４、ＬＯＥ５、ＶＬＬＯＦ９、ＶＬＬ０Ｆ１０、ＶＬＬＯＧ７、ＶＬＬＯＧ９、ＶＬＬＯＨ１、ＶＬＬＯＨ１０、ＶＬ１Ｂ７、ＶＬ１Ｃ１、ＶＬ１Ｃ７、ＶＬ０．１Ｆ４、ＶＬ０．１Ｈ８、ＬＯＥ７、ＬＯＥ７．Ａ及びＬＯＥ７．Ｔ）のアミノ酸配列を示す図である。図１Ａは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２及びＣＤＲ２ドメインを示す。軽鎖のＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）及びＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）ドメインを、四角で囲んである。
【図１Ｂ】Ｄ２Ｅ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（Ｄ２Ｅ７ＶＬ；SEQ ID NO:１にも示されている）、Ｄ２Ｅ７ＶＬのアラニンスキャン変異物（ＬＤ２Ｅ７*．Ａ１、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ３、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ４、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ５、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ７及びＬＤ２Ｅ７*．Ａ８）、Ｄ２Ｅ７関連抗体２ＳＤ４の軽鎖可変領域（２ＳＤ４ＶＬ；SEQ ID NO:９にも示されている）及び他のＤ２Ｅ７関連軽鎖可変領域（ＥＰＢ１２、ＶＬ１０Ｅ４、ＶＬ１００Ａ９、ＶＬ１００Ｄ２、ＶＬ１０Ｆ４、ＬＯＥ５、ＶＬＬＯＦ９、ＶＬＬ０Ｆ１０、ＶＬＬＯＧ７、ＶＬＬＯＧ９、ＶＬＬＯＨ１、ＶＬＬＯＨ１０、ＶＬ１Ｂ７、ＶＬ１Ｃ１、ＶＬ１Ｃ７、ＶＬ０．１Ｆ４、ＶＬ０．１Ｈ８、ＬＯＥ７、ＬＯＥ７．Ａ及びＬＯＥ７．Ｔ）のアミノ酸配列を示す図である。図１Ｂは、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４ドメインを示す。軽鎖のＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）及びＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）ドメインを、四角で囲んである。
【図２Ａ】Ｄ２Ｅ７の重鎖可変領域（Ｄ２Ｅ７ＶＨ；SEQ ID NO:２にも示されている）、Ｄ２Ｅ７ＶＨのアラニンスキャン変異物（ＨＤ２Ｅ７*．Ａ１、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ２、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ３、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ４、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ５、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ６、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ７、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ８及びＨＤ２Ｅ７*．Ａ９）、Ｄ２Ｅ７関連抗体２ＳＤ４の重鎖可変領域（２ＳＤ４ＶＨ；SEQ ID NO:１０にも示されている）及び他のＤ２Ｅ７関連重鎖可変領域（ＶＨ１Ｂ１１、ＶＨ１Ｄ８、ＶＨ１Ａ１１、ＶＨ１Ｂ１２、ＶＨ１−Ｄ２、ＶＨ１Ｅ４、ＶＨ１Ｆ６、ＶＨ１Ｇ１、３Ｃ−Ｈ２、ＶＨ１−Ｄ２．Ｎ及びＶＨ１−Ｄ２．Ｙ）のアミノ酸配列を示す図である。図２Ａは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２及びＣＤＲ２ドメインを示す。重鎖のＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）及びＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）を四角で囲んである。
【図２Ｂ】Ｄ２Ｅ７の重鎖可変領域（Ｄ２Ｅ７ＶＨ；SEQ ID NO:２にも示されている）、Ｄ２Ｅ７ＶＨのアラニンスキャン変異物（ＨＤ２Ｅ７*．Ａ１、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ２、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ３、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ４、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ５、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ６、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ７、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ８及びＨＤ２Ｅ７*．Ａ９）、Ｄ２Ｅ７関連抗体２ＳＤ４の重鎖可変領域（２ＳＤ４ＶＨ；SEQ ID NO:１０にも示されている）及び他のＤ２Ｅ７関連重鎖可変領域（ＶＨ１Ｂ１１、ＶＨ１Ｄ８、ＶＨ１Ａ１１、ＶＨ１Ｂ１２、ＶＨ１−Ｄ２、ＶＨ１Ｅ４、ＶＨ１Ｆ６、ＶＨ１Ｇ１、３Ｃ−Ｈ２、ＶＨ１−Ｄ２．Ｎ及びＶＨ１−Ｄ２．Ｙ）のアミノ酸配列を示す図である。図２Ｂは、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４ドメインを示す。重鎖のＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）及びＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）を四角で囲んである。
【図３】ＴＮＦα誘導されたＬ９２９細胞障害性の、ヒトの抗ｈＴＮＦα抗体Ｄ２Ｅ７による阻害を、マウスの抗ｈＴＮＦα抗体ＭＡＫ１９５と比較して描いたグラフである。
【図４】Ｕ−９３７細胞上のｈＴＮＦαレセプターへのｒｈＴＮＦαの結合の、ヒトの抗ｈＴＮＦα抗体Ｄ２Ｅ７による阻害を、マウスの抗ｈＴＮＦα抗体ＭＡＫ１９５と比較して描いたグラフである。
【図５】ＴＮＦα誘導されたＥＬＡＭ−１のＨＵＶＥＣにおける発現の、ヒト抗ｈＴＮＦα抗体Ｄ２Ｅ７による阻害を、マウスの抗ｈＴＮＦα抗体ＭＡＫ１９５と比較して描いたグラフである。
【図６】ヒト抗ｈＴＮＦα抗体Ｄ２Ｅ７（黒い棒）の投与による、Ｄ−ガラクトサミン感作されたマウスにおけるＴＮＦα誘導される致死性からの防護を、マウスの抗ｈＴＮＦα抗体ＭＡＫ１９５（斜線を引いた棒）と比較して描いた棒グラフである。
【図７】Ｄ２Ｅ７の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の下に予想されるアミノ酸配列と共に示す図である。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３領域に下線を引いてある。
【図８】Ｄ２Ｅ７の重鎖可変領域のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の下に予想されるアミノ酸配列と共に示す図である。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に下線を引いてある。
【図９】多発性関節炎モデルとしてのＴｇ１９７トランスジェニックマウスの平均関節サイズに対するに対するＤ２Ｅ７抗体処理の効果を描いたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
この発明は、ＴＮＦαに、高い親和性、低い解離速度及び高い中和能力をもって結合する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分に関係する。この発明の種々の面は、抗体及び抗体断片、及びそれらの製薬組成物、並びに、かかる抗体及び断片を製造するための核酸、組換え発現ベクター及び宿主細胞に関係する。ヒトＴＮＦαを検出し又はヒトＴＮＦα活性を阻害するためのこの発明の抗体の利用方法（イン・ビトロ又はイン・ビボ）も又、この発明に包含される。
【００２２】
本発明が一層容易に理解され得るように、若干の用語を先ず定義する。用語「ヒトＴＮＦα」（ここでは、ｈＴＮＦα又は単にｈＴＮＦと略記する）は、ここでは、１７ｋＤの分泌型及び２６ｋＤの膜結合型として存在し、生物学的に活性な型が非共有結合により結合された１７ｋＤ分子の３量体よりなるヒトのサイトカインをいうことを意図している。ｈＴＮＦαの構造は、例えば、Pennica,D.,等(1984)Nature 312:724-729;Davis,J.M.,等(1987)Biochemistry 26:1322-1326;及びJones,E.Y.,等(1989)Nature 338:225-228に、更に説明されている。用語ヒトＴＮＦαは、標準的組換え発現方法により製造され得る又は市販の組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）（ミネソタ、Minneapolis在、R&D Systems,カタログ番号210-TA）を包含することを意図している。
【００２３】
用語「抗体」は、ここで用いる場合、ジスルフィド結合により相互に結合された４つのポリペプチド鎖｛２つの重（Ｌ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖｝よりなる免疫グロブリン分子をいうことを意図している。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨと略す）及び重鎖定常領域よりなる。この重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３よりなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ又はＶＬと略す）及び軽鎖定常領域よりなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬよりなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、更に、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる一層保存されている領域に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分割され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲよりなり、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００２４】
用語抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）は、ここで用いる場合、抗原（例えば、ｈＴＮＦα）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片をいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により遂行され得ることが示されている。用語抗体の「抗原結合部分」に包含される結合性断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインよりなる一価断片；（ii）Ｆ(ab')2断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋により架橋された２つのＦａｂ断片よりなる二価断片；（iii)ＶＨ及びＣＨ１ドメインよりなるＦｄ断片；（iv）抗体の一本のアームのＶＬ及びＶＨドメインよりなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインよりなるｄＡｂ断片（Ward等(1989)Nature 341:544-546）；及び（vi）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によりコードされているにもかかわらず、組換え技術を用いて、それらを単一の蛋白質鎖（ＶＬ及びＶＨ領域が対をなして一価分子を形成する）として作ることのできる合成リンカーにより、それらを連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Bird等(1988)Science 242:423-426;及びHuston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883参照）。かかる一本鎖抗体も又、用語抗体の「抗原結合部分」に包含されることを意図している。他の形態の一本鎖抗体例えばディアボディー（diabody）も包含される。ディアボディーは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現され（同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を与えるには短過ぎるリンカーは用いない）、それにより、これらのドメインを他の鎖の相補性ドメインと対にさせて２抗原結合部位を造る二価の二特異性抗体である（例えば、Holliger,P.,等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak,R.J.,等(1994)Structure 2:1121-1123参照）。
【００２５】
尚、更に、抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体の部分の他の１つ以上の蛋白質又はペプチドとの共有又は非共有結合により形成される一層大きい免疫接着分子の部分であってよい。かかる免疫接着分子の例には、二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を造るための４量体のｓｃＦｖ分子を造るストレプトアビジンコア領域の利用（Kipriyanov,S.M.,等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101）及びシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの利用（Kipriyanov,S.M.,等(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058）が含まれる。Ｆａｂ及びＦ(ab')2断片等の抗体部分は、慣用の技術例えば、それぞれ、全抗体のパパイン又はペプシン消化を用いて、全抗体から調製することができる。その上、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を、ここに記載のように、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。
【００２６】
用語「ヒト抗体」は、ここで用いる場合、ヒトの生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。この発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、イン・ビトロでランダム若しくは位置指定突然変異誘発により又はイン・ビボで体細胞突然変異により誘導された突然変異）を、例えばＣＤＲ中に（特に、ＣＤＲ３中に）含んでよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、ここで用いる場合、他の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図していない。
【００２７】
用語「組換えヒト抗体」は、ここで用いる場合、組換え手段により調製され、発現され、造られ又は単離されたすべてのヒト抗体例えば宿主細胞内にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体（下記の第ＩＩ節で更に説明する）、組換え組合せヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（下記の第III節で更に説明する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Taylor,L.D.,等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295参照）又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製され、発現され、造られ又は単離された抗体を含むことを意図している。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する。しかしながら、ある具体例においては、かかる組換えヒト抗体をイン・ビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックな動物を用いる場合には、イン・ビボ体細胞突然変異誘発）にかけ、従って、これらの組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ及びＶＬ配列に由来し関係するにもかかわらず、天然にはイン・ビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に存在し得ない配列である。
【００２８】
「単離された抗体」は、ここで用いる場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいうことを意図している（例えば、ｈＴＮＦαに特異的に結合する単離された抗体は、ｈＴＮＦα以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ｈＴＮＦαに特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原例えば他の種からのＴＮＦα分子に対する交差反応性を有する（下記に、一層詳細に論じる）。その上、単離された抗体は、他の細胞性物質及び／又は化学物質を実質的に含まない。
【００２９】
「中和抗体」は、ここで用いる場合（又は、「ｈＴＮＦα活性を中和した抗体」）、そのｈＴＮＦαへの結合がｈＴＮＦαの生物学的活性の阻害を生じる抗体をいうことを意図している。このｈＴＮＦαの生物学的活性の阻害は、ｈＴＮＦαの生物学的活性の一種以上の指標例えばｈＴＮＦα誘導された細胞障害性（イン・ビトロ又はイン・ビボ）、ｈＴＮＦα誘導された細胞活性化及びｈＴＮＦαレセプターに対するｈＴＮＦαの結合を測定することにより評価することができる。これらのｈＴＮＦαの生物学的活性の指標は、当分野で公知の幾つかの標準的イン・ビトロ又はイン・ビボアッセイの１つ以上により評価することができる（実施例４参照）。好ましくは、ｈＴＮＦα活性を中和する抗体の能力を、Ｌ９２９細胞のｈＴＮＦα誘導された細胞障害性の阻害により評価する。ｈＴＮＦα活性の更なる又は別のパラメーターとして、ＨＵＶＥＣ上でのＥＬＡＭ−１のｈＴＮＦα誘導された発現を阻止する抗体の能力を、ｈＴＮＦα誘導された細胞活性化の尺度として、評価することができる。
【００３０】
用語「表面プラズモン共鳴」は、ここで用いる場合、リアルタイムの生体特異的相互作用の分析を、バイオセンサーマトリックス内の蛋白質濃度の変化を例えばＢＩＡコアシステム（スゥエーデン国、Uppsala及びニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia Biosensor AB）を用いて検出することにより可能にする光学的現象をいう。更なる説明は、実施例１及びJonsson,U.,等(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26;Jonsson,U.,等(1991)Biotechniques 11:620-627;Johnsson,B.,等(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131;及びJohnnson,B.,等(1991)Anal.Biochem.198:268-277を参照されたい。
【００３１】
用語「Ｋoff」は、ここで用いる場合、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数をいうことを意図している。
【００３２】
用語「Ｋd」は、ここで用いる場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数をいうことを意図している。
【００３３】
用語「核酸分子」は、ここで用いる場合、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図している。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【００３４】
用語「単離された核酸分子」は、ｈＴＮＦαに結合する抗体又は抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関してここで用いる場合、抗体又は抗体部分をコードするヌクレオチド配列がｈＴＮＦα以外の抗原と結合する抗体又は抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸分子をいうことを意図しており、この他の配列は、天然において、ヒトのゲノムＤＮＡ中でこの核酸と隣接していてよい。従って、例えば、抗ＴＮＦα抗体のＶＨ領域をコードするこの発明の単離された核酸は、ＴＮＦα以外の抗原に結合する他のＶＨ領域をコードする他の配列を含まない。
【００３５】
用語「ベクター」は、ここで用いる場合、それに結合された他の核酸を輸送することのできる核酸分子をいうことを意図している。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、それは、追加のＤＮＡセグメントを連結することのできる環状二本鎖ＤＮＡループである。他の型のベクターは、ウイルスベクターであり、そこでは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に連結することができる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律的に複製することができる（例えば、細菌の複製オリジンを有する細菌ベクター及びエピソーム性の哺乳動物用ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物用ベクター）は、宿主細胞中に導入した際に宿主細胞のゲノム中にインテグレートされ得て、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。その上、ある種のベクターは、それらが機能的に結合された遺伝子の発現を指図することができる。かかるベクターは、ここでは、「組換え発現ベクター」（又は単に、「発現ベクター」）として言及する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミド型である。プラスミドは最も普通に用いられるベクターの型であるので、本願明細書においては、「プラスミド」及び「ベクター」を、交換可能に用いることができる。しかしながら、この発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）等の他の型の発現ベクターを包含することを意図している。
【００３６】
用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は、ここで用いる場合、組換え発現ベクターが導入された細胞をいうことを意図している。かかる用語が特定の主題の細胞のみならずかかる細胞の子孫をもいうことを意図していることは、理解されるべきである。突然変異又は環境の影響のために、ある種の変化が続く世代に生じ得るので、かかる子孫が、実際、親細胞と同一でないことはあり得るが、やはり、ここで用いる用語「宿主細胞」の範囲に含まれる。
【００３７】
この発明の種々の面を、下記の小区分で更に詳細に説明する。
Ｉ．ヒトＴＮＦαに結合するヒト抗体
この発明は、ヒトＴＮＦαに高い親和性、低い解離速度及び高い中和能力で結合する、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。好ましくは、この発明のヒト抗体は、組換えの中和ヒト抗ｈＴＮＦα抗体である。最も好適なこの発明の組換えの中和抗体は、ここでは、Ｄ２Ｅ７といい、図１Ａ、１Ｂ及び図２Ａ、２Ｂに、それぞれ示したＶＬ及びＶＨ配列を有する（Ｄ２Ｅ７ＶＬ領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:１にも示されており；Ｄ２Ｅ７ＶＨ領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:２にも示されている）。高い親和性及び遅い解離動力学を示すマウス抗ｈＴＮＦαＭＡＫ１９５ｍＡｂ及びＤ２Ｅ７、２ＳＤ４と配列において関連する他のヒト抗ｈＴＮＦα抗体と比較したＤ２Ｅ７の結合特性を下記にまとめる：
【００３８】
【表１】
【００３９】
Ｄ２Ｅ７抗体及び関連抗体は又、幾つかのイン・ビトロ及びイン・ビボアッセイにより評価したとき、強力なｈＴＮＦα活性中和能力を示す（実施例４参照）。例えば、これらの抗体は、Ｌ９２９細胞のｈＴＮＦα誘導された細胞障害性を、約１０-7〜１０-10Ｍの範囲のＩＣ50で中和する。Ｄ２Ｅ７は、完全長ＩｇＧ１抗体として発現された場合、Ｌ９２９細胞のｈＴＮＦα誘導された細胞障害性を、約１．２５×１０-10ＭのＩＣ50で中和する。その上、このＤ２Ｅ７の中和能力は、抗体がＦａｂ、Ｆ(ab')2又はｓｃＦｖ断片として発現されるときに維持される。Ｄ２Ｅ７は又、ＨＵＶＥＣ上のｈＴＮＦα誘導されたＥＬＡＭ−１発現により測定したとき、ＴＮＦα誘導された細胞活性化をも阻害し（ＩＣ50＝約１．８５×１０-10Ｍ）且つＵ−９３７細胞上のｈＴＮＦαレセプターへのｈＴＮＦαの結合をも阻害する（ＩＣ50＝約１．５６×１０-10Ｍ）。後者に関して、Ｄ２Ｅ７は、ｐ５５及びｐ７５ｈＴＮＦαレセプターの両者へのｈＴＮＦαの結合を阻害する。更にその上、この抗体は、マウスにおいて、イン・ビボで、ｈＴＮＦα誘導される致死性を阻害する（ＥＤ50＝１〜２．５μｇ／マウス）。
【００４０】
Ｄ２Ｅ７の結合特異性に関して、この抗体は、可溶性ｈＴＮＦα、膜貫通型ｈＴＮＦα及び細胞のレセプターに結合したｈＴＮＦαを含む種々の型のヒトＴＮＦαに結合する。Ｄ２Ｅ７は、他のサイトカイン例えばリンホトキシン（ＴＮＦβ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮγ及びＴＧＦβには、特異的に結合しない。しかしながら、Ｄ２Ｅ７は、他の種に由来する腫瘍壊死因子に対する交差反応性を示す。例えば、この抗体は、少なくとも５種類の霊長類ＴＮＦα（チンパンジー、ヒヒ、キヌザル、カニクイザル及びアカゲザル）の活性を、ｈＴＮＦαの中和とほぼ等しいＩＣ50値で中和する（実施例４、小区分Ｅ参照）。Ｄ２Ｅ７は又、ヒトＴＮＦαより約１０００倍弱いが、マウスＴＮＦαの活性をも中和する（実施例４、小区分Ｅ参照）。Ｄ２Ｅ７は又、イヌ及びブタのＴＮＦαにも結合する。
【００４１】
一面において、この発明は、Ｄ２Ｅ７抗体及び抗体部分、Ｄ２Ｅ７関連の抗体及び抗体部分、並びにＤ２Ｅ７と同等の特性例えばｈＴＮＦαに対して高い親和性と低い解離動力学で結合すること及び高い中和能力を有する他のヒトの抗体及び抗体部分に関係する。一具体例において、この発明は、ヒトＴＮＦαから、１×１０-8Ｍ以下のＫd及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数（これら両者は、表面プラズモン共鳴により測定する）で解離し、且つ標準的なイン・ビトロＬ９２９アッセイにおけるヒトＴＮＦα細胞障害性を１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50で中和する、単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。一層好ましくは、この単離された抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＴＮＦαから、５×１０-4ｓ-1以下のＫoffで、尚一層好ましくは、１×１０-4ｓ-1以下のＫoffで解離する。一層好ましくは、この単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分は、標準的なイン・ビトロのＬ９２９アッセイにおけるヒトＴＮＦα細胞障害性を、１×１０-8Ｍ以下のＩＣ50で、更に一層好ましくは、１×１０-9Ｍ以下のＩＣ50で、そして尚一層好ましくは、５×１０-10Ｍ以下のＩＣ50で中和する。好適具体例において、この抗体は、単離されたヒト組換え抗体又はその抗原結合部分である。他の好適具体例において、この抗体は又、ＴＮＦα誘導された細胞活性化をも、ヒトの臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＴＮＦα誘導されたＥＬＡＭ−１発現についての標準的イン・ビトロアッセイを用いて評価したときに中和する。
【００４２】
Ｋd及びＫoffを測定するための表面プラズモン共鳴は、実施例１に記載のようにして行なうことができる。ＩＣ50値を測定するための標準的なイン・ビトロＬ９２９アッセイを、実施例４、小区分Ａに記載する。ヒトの臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＴＮＦα誘導されたＥＬＡＭ−１発現についての標準的イン・ビトロアッセイを、実施例４、小区分Ｃに記載する。前記の動力学及び中和基準を満たすか又は満たすと予想される組換えヒト抗体の例には、下記の［ＶＨ／ＶＬ］対を有する抗体が含まれ、これらの配列を、図１Ａ、１Ｂ、２Ａ及び２Ｂに示す（動力学及び中和分析については、実施例２、３及び４も参照されたい）：［Ｄ２Ｅ７ＶＨ／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］；［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ１／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ２／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ３／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ４／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ５／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ６／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ７／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ８／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ９／Ｄ２Ｅ７ＶＬ］、［Ｄ２Ｅ７ＶＨ／ＬＤ２Ｅ７*.Ａ１］、［Ｄ２Ｅ７ＶＨ／ＬＤ２Ｅ７*.Ａ４］、［Ｄ２Ｅ７ＶＨ／ＬＤ２Ｅ７*.Ａ５］、［Ｄ２Ｅ７ＶＨ／ＬＤ２Ｅ７*.Ａ７］、［Ｄ２Ｅ７ＶＨ／ＬＤ２Ｅ７*.Ａ８］、［ＨＤ２Ｅ７*.Ａ９／ＬＤ２Ｅ７*.Ａ１］、［ＶＨ１−Ｄ２／ＬＯＥ７］、［ＶＨ１−Ｄ２．Ｎ／ＬＯＥ７．Ｔ］、［ＶＨ１−Ｄ２．Ｙ／ＬＯＥ７．Ａ］、［ＶＨ１−Ｄ２．Ｎ／ＬＯＥ７．Ａ］、［ＶＨ１−Ｄ２／ＥＰＢ１２］及び［３Ｃ−Ｈ２／ＬＯＥ７］。
【００４３】
抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３ドメインが抗原に対する抗体の結合特異性／親和性に重要な役割を演じていることは、当分野で周知である。従って、他の面において、この発明は、ｈＴＮＦαとの会合に関する遅い解離動力学を有し且つＤ２Ｅ７のものと構造的に同じか又は関連した軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３ドメインを有するヒト抗体に関係する。実施例３で示すように、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３の位置９を、実質的にＫoffに影響を与えずにＡｌａ又はＴｈｒで占めることができる。従って、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３のコンセンサスモチーフは、アミノ酸配列：Ｑ−Ｒ−Ｙ−Ｎ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｙ−（Ｔ／Ａ）（SEQ ID NO:３）を含む。更に、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３の位置１２を、実質的にＫoffに影響を与えずにＴｙｒ又はＡｓｎで占めることができる。従って、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３のコンセンサスモチーフは、アミノ酸配列：Ｖ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−（Ｙ／Ｎ）（SEQ ID NO:４）を含む。その上、実施例２に示すように、Ｄ２Ｅ７重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３ドメインは、実質的にＫoffに影響を与えずに、単一アラニン残基による置換を受けやすい（ＶＬＣＤＲ３内の位置１、４、５、７若しくは８又はＶＨＣＤＲ３内の位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１において）。尚更に、当業者は、アラニンによる置換に対するＤ２Ｅ７ＶＬ及びＶＨＣＤＲ３ドメインの従順性を仮定するならば、やはり、抗体の低い解離速度定数を保持したままでの、ＣＤＲ３ドメイン内の他のアミノ酸の置換、特に保存的アミノ酸での置換が可能であろうことを認めるであろう。「保存的アミノ酸置換」は、ここで用いる場合、一のアミノ酸残基が類似の側鎖を有する他のアミノ酸残基により置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で規定されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。好ましくは、１〜５以下の保存的アミノ酸置換を、Ｄ２Ｅ７ＶＬ及び／又はＶＨＣＤＲ３ドメイン内に作る。一層好ましくは、１〜３以下の保存的アミノ酸置換を、Ｄ２Ｅ７ＶＬ及び／又はＶＨＣＤＲ３ドメイン内に作る。更に、保存的アミノ酸置換は、ｈＴＮＦαへの結合に決定的に重要なアミノ酸位置には作るべきでない。実施例３に示すように、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３の位置２及び５並びにＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３の位置１及び７は、ｈＴＮＦαとの相互作用に決定的に重要であるらしく、従って、保存的アミノ酸置換は、好ましくは、これらの位置には作らない（もっとも、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３の位置５におけるアラニン置換は、上記のように、許容される）。
【００４４】
従って、他の具体例において、この発明は、下記の特性を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する：
ａ）ヒトＴＮＦαから、表面プラズモン共鳴で測定して、１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離し；
ｂ）SEQ ID NO:３のアミノ酸配列、又は位置１、４、５、７若しくは８における単一アラニン置換又は位置１、３、４、６、７、８及び／若しくは９における１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有し；
ｃ）SEQ ID NO:４のアミノ酸配列、又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１における単一アラニン置換又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／若しくは１２における１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
【００４５】
一層好ましくは、抗体又はその抗原結合部分は、５×１０-4ｓ-1以下のＫoffで、ヒトＴＮＦαから解離する。尚一層好ましくは、抗体又はその抗原結合部分は、１×１０-4ｓ-1以下のＫoffでヒトＴＮＦαから解離する。
【００４６】
更に別の具体例において、この発明は、SEQ ID NO:３のアミノ酸配列、又は位置１、４、５、７若しくは８における単一アラニン置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及びSEQ ID NO:４のアミノ酸配列、又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１における単一アラニン置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。好ましくは、ＬＣＶＲは、更に、SEQ ID NO:５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン（即ち、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ２）を有し且つＨＣＶＲは、更に、SEQ ID NO:６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン（即ち、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ２）を有する。尚一層好ましくは、ＬＣＶＲは、更に、SEQ ID NO:７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン（即ち、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ１）を有し且つＨＣＶＲは、SEQ ID NO:８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン（即ち、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ１）を有する。ＶＬのフレームワーク領域は、好ましくは、ＶK Ｉヒト生殖細胞系のファミリーに由来し、一層好ましくは、Ａ２０ヒト生殖細胞系のＶｋ遺伝子に由来し、最も好ましくは、図１Ａ及び１Ｂに示したＤ２Ｅ７ＶＬフレームワーク配列に由来する。これらのＶＨのフレームワーク領域は、好ましくは、ＶH３ヒト生殖細胞系のファミリーに由来し、一層好ましくは、ＤＰ−３１ヒト生殖細胞系のＶＨ遺伝子に由来し、最も好ましくは、図２Ａ及び２Ｂに示したＤ２Ｅ７ＶＨフレームワーク配列に由来する。
【００４７】
更に別の具体例において、この発明は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）（即ち、Ｄ２Ｅ７ＶＬ）及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）（即ち、Ｄ２Ｅ７ＶＨ）を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。ある具体例において、この抗体は、重鎖定常領域例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域を含む。好ましくは、この重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域である。更に、この抗体は、軽鎖定常領域、カッパー軽鎖定常領域又はラムダ軽鎖定常領域を含むことができる。好ましくは、この抗体は、カッパー軽鎖定常領域を含む。或は、この抗体部分は、例えば、Ｆａｂ断片又は一本鎖Ｆｖ断片であってよい。
【００４８】
更に別の具体例において、この発明は、Ｄ２Ｅ７関連ＶＬ及びＶＨＣＤＲ３ドメインを有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分、例えば、SEQ ID NO:３、SEQ ID NO:１１、SEQ ID NO:１２、SEQ ID NO:１３、SEQ ID NO:１４、SEQID NO:１５、SEQ ID NO:１６、SEQ ID NO:１７、SEQ ID NO:１８、SEQ ID NO:１９、SEQ ID NO:２０、SEQ ID NO:２１、SEQ ID NO:２２、SEQ ID NO:２３、SEQID NO:２４、SEQ ID NO:２５及びSEQ ID NO:２６よりなる群から選択するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を有するか又はSEQ ID NO:４、SEQ ID NO:２７、SEQ ID NO:２８、SEQ ID NO:２９、SEQ ID NO:３０、SEQ ID NO:３１、SEQ ID NO:３２、SEQ ID NO:３３、SEQ ID NO:３４及びSEQ ID NO:３５よりなる群から選択するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインを有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００４９】
更に別の具体例において、この発明は、ヒトＴＮＦαの活性を中和するが、ヒトＴＮＦβの活性は中和しない組換えヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。好ましくは、抗体又はその抗原結合部分は又、チンパンジーのＴＮＦα及びヒヒＴＮＦα、キヌザルＴＮＦα、カニクイザルＴＮＦα及びアカゲザルＴＮＦαよりなる群から選択する少なくとも一つの更なる霊長類ＴＮＦαの活性をも中和する。好ましくは、この抗体又はその抗原結合部分は、ヒト、チンパンジー及び／又は更なる霊長類のＴＮＦαを、標準的イン・ビトロＬ９２９アッセイにおいて、１×１０-8Ｍ以下の、一層好ましくは１×１０-9Ｍ以下の、尚一層好ましくは５×１０-10Ｍ以下のＩＣ50で中和する。一つのサブ具体例において、この抗体は又、イヌＴＮＦαの活性をも、好ましくは、標準的イン・ビトロＬ９２９アッセイにおいて、１×１０-7Ｍ以下の、一層好ましくは１×１０-8Ｍ以下の、尚一層好ましくは５×１０-9Ｍ以下のＩＣ50で中和する。他のサブ具体例において、この抗体は又、ブタＴＮＦαの活性をも、好ましくは、１×１０-5Ｍ以下の、一層好ましくは１×１０-6Ｍ以下の、尚一層好ましくは５×１０-7Ｍ以下のＩＣ50で中和する。更に別の具体例において、この抗体は又、マウスＴＮＦαの活性をも、好ましくは、１×１０-4Ｍ以下の、一層好ましくは１×１０-5Ｍ以下の、尚一層好ましくは５×１０-6Ｍ以下のＩＣ50で中和する。
【００５０】
この発明の抗体又は抗体部分は、誘導体化したり、他の機能的分子（例えば、他のペプチド又は蛋白質）に結合することができる。従って、この発明の抗体及び抗体部分は、免疫接着分子を含むここに記載のヒト抗ｈＴＮＦα抗体の誘導体化され或は改変された形態を含むことを意図している。例えば、この発明の抗体又は抗体部分は、１つ以上の他の分子実体例えば他の抗体（例えば、２特異性抗体又はディアボディー）、検出可能な薬剤、細胞毒性剤、医薬、及び／又は抗体若しくは抗体部分と他の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグ）との会合を媒介することのできる蛋白質若しくはペプチドと（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性の会合、その他により）機能的に結合することができる。
【００５１】
一つの型の誘導体化抗体は、（同じ型の、又は例えば２特異性抗体を造るには異なる型の）２つ以上の抗体の架橋により生成される。適当な架橋剤には、適当なスペーサーにより分離された２つの異なる反応性の基を有するヘテロ二官能性のもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はホモ二官能性のもの（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）が含まれる。かかるリンカーは、イリノイ州、Rockford在、Pierce Chemical Companyより入手することができる。
【００５２】
この発明の抗体又は抗体部分を誘導体化することのできる有用な検出可能な薬剤には、蛍光性化合物が含まれる。典型的な蛍光性の検出可能な薬剤には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン等が含まれる。抗体は又、検出可能な酵素例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等により誘導体化することもできる。抗体を検出可能な酵素により誘導体化する場合は、それを、その酵素が利用して検出可能な反応生成物を生成する更なる試薬を加えることにより検出する。例えば、検出可能な薬剤、西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素とジアミノベンジジンの添加は、検出可能な彩色された反応生成物を生じる。抗体は又、ビオチンを用いて誘導体化することもでき、アビジン又はストレプトアビジン結合の間接的測定により検出することができる。
【００５３】
II．抗体の発現
本発明の抗体または抗体部分は、宿主細胞中での免疫グロブリンＬおよびＨ鎖の組換え発現によって製造することができる。組換えによって抗体を発現するには、該抗体の免疫グロブリンＬおよびＨ鎖をコードするＤＮＡフラグメントを有する１種類またはそれ以上の組換え発現ベクターを、宿主細胞に核酸移入して、該ＬおよびＨ鎖が、該宿主細胞中で発現され、好ましくは、宿主細胞を培養する培地中に分泌されるようにし、該培地から、抗体を回収することができる。抗体のＨおよびＬ鎖遺伝子を入手し、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入するには、標準的な組換えＤＮＡの方法、例えば、Sambrook,Fritsch & Maniatis編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sedond Ed.,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989);Ausubel,F.M.et al.編、Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates,(1989)およびBossらによる米国特許第4,816,397号明細書に記載のものを用いる。
【００５４】
Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連抗体を発現するには、ＬおよびＨ鎖の可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを初めに得る。これらのＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた、生殖系列のＬおよびＨ鎖可変配列の増幅および修飾によって得ることができる。ヒトＨおよびＬ鎖可変領域の遺伝子に関する生殖系列のＤＮＡ配列は、当技術に公知である［例えば、「Vbase」というヒト生殖系列の配列データベースを参照されたい；また、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson,I.M.,et.al.,(1992)“The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals aboutFifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops”J.Mol.Biol.227:776-798;およびCox,J.P.L.et al.(1994)“A Directory of Human Germ-line Vκ Segments Reveals a Strong Bias in their Usage"Eur.J.Immunol.24:827-846も参照されたい。それぞれの内容は、引用によって本明細書に明示的に組込まれる］。Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連抗体のＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを得るには、ヒト生殖系列のＶＨ遺伝子のＶH３族の一員を標準的なＰＣＲによって増幅する。最も好ましくは、ＤＰ−３１というＶＨ生殖系列の配列を増幅する。Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連抗体のＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを得るには、ヒト生殖系列のＶＬ遺伝子のＶκＩ族の一員を標準的なＰＣＲによって増幅する。最も好ましくは、Ａ２０というＶＬ生殖系列の配列を増幅する。ＤＰ−３１生殖系列ＶＨおよびＡ２０生殖系列ＶＬの配列を増幅する際に用いるのに適したＰＣＲプライマーは、標準的な方法を用いて、上に引用した参考文献に開示されたヌクレオチド配列に基づいて設定できる。
【００５５】
生殖系列のＶＨおよびＶＬフラグメントを得たならば、これらの配列を、本明細書に開示のＤ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連アミノ酸配列をコードするように突然変異させることができる。生殖系列ＶＨおよびＶＬＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を、初めに、Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列と比較して、生殖系列とは異なるＤ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連配列中のアミノ酸残基を特定する。次いで、生殖系列ＤＮＡ配列の適切なヌクレオチドを、突然変異した生殖系列配列が、Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連アミノ酸配列をコードするように、どのヌクレオチドを変化させなければならないかを決定するための遺伝暗号を用いて突然変異させる。生殖系列配列の突然変異誘発は、標準的方法、例えば、ＰＣＲ仲介突然変異形成（突然変異したヌクレオチドをＰＣＲプライマーに組み込む結果、ＰＣＲ産物が突然変異を含む）、または部位指向性突然変異誘発によって実施する。
【００５６】
更に、ＰＣＲ増幅によって得られた「生殖系列」の配列が、フレームワーク領域での真の生殖系列立体配置とのアミノ酸の相違（すなわち、例えば体細胞突然変異の結果としての、真の生殖系列の配列と比較しての増幅された配列中の相違）をコードするならば、これらのアミノ酸の相違は、真の生殖系列配列へと戻すよう変化させること（すなわち、生殖系列立体配置へのフレームワーク残基の「戻し突然変異」）が望ましいと思われることに注目すべきである。
【００５７】
Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントを（上記のような、生殖系列ＶＨおよびＶＬ遺伝子の増幅と突然変異誘発とによって）得たならば、これらのＤＮＡフラグメントは、標準的な組換えＤＮＡの手法によって、例えば、可変領域遺伝子を完全長の抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子へと転換するために、更に操作することができる。これらの操作の際は、ＶＬ−またはＶＨ−コーディングＤＮＡフラグメントを、もう一つのタンパク質、例えば抗体の不変部領域または可変リンカーをコードするもう一つのＤＮＡフラグメントに機能的に結合する。用語「機能的に結合」とは、本明細書に用いられる限りで、二つのＤＮＡフラグメントを結合した結果、該二つのＤＮＡフラグメントがコードするアミノ酸配列がフレーム内に留まることを意味するものとする。
【００５８】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨコーディングＤＮＡをＨ鎖不変部領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードするもう一つのＤＮＡ分子と機能的に結合することによって、完全長のＨ鎖遺伝子へと転換することができる。ヒトＨ鎖不変部領域の遺伝子の配列は、当技術に公知であり［例えば、Kabat,E.A..etal.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242を参照されたい］、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。Ｈ鎖不変部領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの不変部領域であることができるが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の不変部領域である。ＦａｂフラグメントＨ鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡを、Ｈ鎖ＣＨ１不変部領域のみをコードするにすぎないもう一つのＤＮＡ分子に機能的に結合することができる。
【００５９】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬコーディングＤＮＡをＬ鎖不変部領域であるＣＬをコードするもう一つのＤＮＡ分子と機能的に結合することによって、完全長のＬ鎖遺伝子（およびＦａｂＬ鎖遺伝子）へと転換することができる。ヒトＬ鎖不変部領域の遺伝子の配列は、当技術に公知であり［例えば、Kabat,E.A..etal.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242を参照されたい］、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。Ｌ鎖不変部領域は、κまたはλ不変部領域であることができるが、最も好ましくはκ不変部領域である。
【００６０】
ｓｃＦｖ遺伝子を生成するには、ＶＨ−またはＶＬ−コーディングＤＮＡフラグメントを、可変リンカーをコードする、すなわちアミノ酸配列（Gly4−Ser）3をコードするもう一つのフラグメントと機能的に結合し、そのため、ＶＨおよびＶＬ配列が、ＶＬおよびＶＨ領域が可変リンカーによって結合されて、隣接する一本鎖タンパク質として発現され得るようにする［例えば、Bird et al.(1988)Science 242:423-426；Huston et at.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；McCafferty et al.,Nature(1990)348:552-554を参照されたい]。
【００６１】
本発明の抗体または抗体部分を発現するには、上記のとおりに得た、部分または完全長のＬおよびＨ鎖を発現ベクターに挿入して、遺伝子が、転写および翻訳制御配列と機能的に結合される。この状況では、用語「機能的に結合される」とは、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図された機能に役立つようにベクター中に結合されることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いた発現宿主細胞と共存できるように選ぶ。抗体Ｌ鎖遺伝子および抗体Ｈ鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入できるか、より代表的には、両遺伝子とも同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントとベクターの相補的制限部位の結合、または制限部位が全く存在しないならば、平滑末端結合）によって、発現ベクターに挿入する。Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連のＬまたはＨ鎖配列を挿入する前に、発現ベクターは、抗体不変部領域の配列を既に保有していてよい。例えば、Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連ＶＨおよびＶＬ配列を完全長の抗体遺伝子へと転換する一つの方策は、それぞれＨ鎖不変部およびＬ鎖不変部領域を既にコードしている発現ベクターに、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに機能的に結合され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに機能的に結合されるように挿入することである。追加的または代替的には、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促すシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレームに収まって結合されるように、ベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであるか、または異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であることができる。
【００６２】
抗体鎖遺伝子に加え、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内での抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーその他の、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を包含するものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel;Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)に記載されている。当業者には、調節配列の選択を包含する発現ベクターの設定は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、望まれるタンパク質の発現レベル等々のような要因に依存し得ることが認識されると思われる。哺乳動物宿主細胞の発現に好適な調節配列は、哺乳動物細胞での高レベルのタンパク質発現を指図するウイルス性の要素、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー)、シミアンウイルス４０(ＳＶ４０)（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー)、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）)、およびポリオーマを包含する。ウイルス性調節要素およびそれらの配列のこれ以上の説明には、例えば、Stinskiによる米国特許第5,168,062号明細書、Bellらによる米国特許第4,510,245号明細書、およびSchaffnerらによる米国特許第4,968,615号明細書を参照されたい。
【００６３】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば、宿主細胞でのベクターの複製を調節する配列(例えば複製起点)、および選別可能マーカーの遺伝子を保有してもよい。選別可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選別を容易にする（例えば、すべてAxelらによる米国特許第4,399,216号、第4,634.665号および第5,179,017号明細書を参照されたい)。例えば、代表的には、選別可能マーカー遺伝子は、薬物、例えばＧ418、ヒグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を、ベクターを導入した宿主細胞に賦与する。好適な選別可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子(dhfr-宿主細胞でメトトレキサート選別／増幅とともに用いるため）、およびneo遺伝子（Ｇ418の選別のため）を包含する。
【００６４】
ＬおよびＨ鎖の発現のためには、ＨおよびＬ鎖をコードする発現ベクターを、標準的手法によって宿主細胞に核酸移入する。様々な形態の用語「核酸移入」は、原核または真核宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入に一般的に用いられる非常に様々な手法、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈澱、ＤＥＡＥデキストラン核酸移入などを包含するものとする。本発明の抗体は、原核または真核宿主細胞のいずれでも発現することが理論的には可能であるが、真核宿主細胞、最も好ましくは哺乳動物の宿主細胞での抗体の発現が、最も好ましく、それは、そのような真核細胞、特に哺乳動物細胞は、適正に折畳まれた、免疫学的に活性を有する抗体を形成かつ分泌する可能性が、原核細胞よりも高いためである。抗体遺伝子の原核細胞での発現は、活性抗体の高収率での生産には無効果であると報告されている（Boss,M.A.and Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6:12-13）。
【００６５】
本発明の組換え抗体を発現するのに好適な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）[Urlaub & Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220に記載され、例えば、R.J.Kaufman & P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621に記載されたとおりのＤＨＦＲ選別可能マーカーとともに用いられたdhfr-ＣＨＯ細胞を包含する]、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を包含する。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入するときは、宿主細胞を、該宿主細胞での抗体の発現を許し、より好ましくは該宿主細胞を増殖させる培地中への抗体の分泌を許すのに充分な期間培養することによって、抗体を生産する。抗体は、標準的なタンパク質精製の方法を用いて、培地から回収することができる。
【００６６】
宿主細胞は、完全な抗体の一部、例えばＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子を生産するのに用いることもできる。上記手順の変化形は、本発明の範囲内であることが理解されると思われる。例えば、本発明の抗体のＬ鎖またはＨ鎖のいずれか（双方ではなく）をコードするＤＮＡを、宿主細胞に移入するのが望ましいことがある。組換えＤＮＡの技術は、ｈＴＮＦαとの結合に不必要であるＬおよびＨ鎖のいずれかもしくは双方をコードするＤＮＡのいくらかまたはすべてを除去するのに用いてもよい。そのような断端ＤＮＡ分子から発現される分子も、本発明の抗体に包含される。加えて、一方のＨ鎖および一方のＬ鎖が本発明の抗体であり、他方のＨ鎖およびＬ鎖がｈＴＮＦα以外の抗原に特異的である二機能性抗体を、本発明の抗体と第二の抗体とを標準的な化学的架橋結合法によって架橋結合させることによって生産してもよい。
【００６７】
本発明の抗体、またはその抗原結合部分の組換え発現に好適な系では、抗体Ｈ鎖と抗体Ｌ鎖との双方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム仲介核酸移入によってdhfr-ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内では、抗体ＨおよびＬ鎖遺伝子が、それぞれ、エンハンサー／プロモーター調節要素（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来する、例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素、またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素）と機能的に結合されて、遺伝子の高レベルの転写を駆使する。組換え発現ベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子も保有し、これが、ベクターが移入されているＣＨＯ細胞の、メトトレキサートによる選別／増幅を用いた選別を可能にする。選別した形質転換体の宿主細胞を培養して、抗体ＨおよびＬ鎖の発現を許し、完全な抗体を培地から回収する。標準的な分子生物学的手法を用いて、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞に核酸移入し、形質転換体について選別し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収する。
【００６８】
前記に照らして、本発明のもう一つの態様は、本発明の抗体および抗体部分の組換え発現に用いることができる、核酸、ベクターおよび宿主細胞組成物に関する。Ｄ２Ｅ７Ｌ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を、図７およびSEQ IDNO:３６に示す。ＬＣＶＲのＣＤＲ１ドメインはヌクレオチド７０〜１０２を包含し、ＣＤＲ２ドメインはヌクレオチド１４８〜１６８を包含し、ＣＤＲ３ドメインは、ヌクレオチド２６５〜２９１を包含する。Ｄ２Ｅ７Ｈ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を図８およびSEQ ID NO:３７に示す。ＬＣＶＲのＣＤＲ１ドメインは、ヌクレオチド９１〜１０５を包含し、ＣＤＲ２ドメインはヌクレオチド１４８〜１９８を包含し、ＣＤＲ３ドメインは、ヌクレオチド２９５〜３３０を包含する。当業者には、Ｄ２Ｅ７関連抗体またはその部分（例えばＣＤＲドメイン、例えばＣＤＲ３ドメイン）をコードするヌクレオチド配列は、遺伝暗号と標準的な分子生物学の手法とを用いて、Ｄ２Ｅ７ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲをコードするヌクレオチド配列から誘導できることが認識されると思われる。
【００６９】
一実施態様では、本発明は、SEQ ID NO:３のアミノ酸配列を含むＬ鎖ＣＤＲ３（すなわちＤ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３）、あるいは第１、４、５、７もしくは８位でのただ１回のアラニン置換によってか、または第１、３、４、６、７、８および／または９位での１〜５回の同類アミノ酸置換によってSEQ ID NO:３から修飾されたそれをコードする単離核酸を提供する。この核酸は、ＣＤＲ３領域のみをコードできるにすぎないか、またはより好ましくは、抗体Ｌ鎖可変領域（ＬＣＶＲ）全体をコードする。例えば、該核酸は、SEQ ID NO:５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン（すなわちＤ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ２）と、SEQ ID NO:７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン（すなわちＤ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ１）とを有するＬＣＶＲをコードすることができる。
【００７０】
もう一つの実施態様では、本発明は、SEQ ID NO:４のアミノ酸配列を含むＨ鎖ＣＤＲ３ドメイン（すなわちＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３）、あるいは第２、３、４、５、６、８、９、１０もしくは１１位でのただ１回のアラニン置換によってか、または第２、３、４、５、６、８、９、１０、１１および／または１２位での１〜５回の同類アミノ酸置換によってSEQ ID NO:４から修飾されたそれをコードする単離核酸を提供する。この核酸は、ＣＤＲ３領域のみをコードできるにすぎないか、またはより好ましくは、抗体Ｈ鎖可変領域（ＨＣＶＲ）全体をコードする。例えば、該核酸は、SEQ ID NO:６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン（すなわちＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ２）と、SEQ ID NO:８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメイン（すなわちＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ１）とを有するＨＣＶＲをコードすることができる。
【００７１】
更にもう一つの実施態様では、本発明は、例えば、SEQ ID NO:３、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:１１、SEQ ID NO: １２、SEQ ID NO:１３、SEQ ID NO:１４、SEQ ID NO:１５、SEQ ID NO:１６、SEQ ID NO:１７、SEQ ID NO:１８、SEQ ID NO:１９、SEQ ID NO:２０、SEQ ID NO:２１、SEQ ID NO:２２、SEQ ID NO:２３、SEQ ID NO:２４、SEQ ID NO:２５、SEQ ID NO:２６、SEQ ID NO:２７、SEQ ID NO:２８、SEQ ID NO:２９、SEQ ID NO:３０、SEQ ID NO:３１、SEQ ID NO:３２、SEQ ID NO:３３、SEQ ID NO:３４およびSEQ ID NO:３５よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、Ｄ２Ｅ７関連ＣＤＲ３ドメインをコードする単離核酸を提供する。
【００７２】
更にもう一つの実施態様では、本発明は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む抗体Ｌ鎖可変領域（すなわちＤ２Ｅ７ＬＣＶＲ）をコードする単離核酸を提供する。好ましくは、この核酸は、SEQ ID NO:３６のヌクレオチド配列を含むが、当業者は、遺伝暗号の縮重のため、他のヌクレオチド配列がSEQ ID NO:１のアミノ酸配列をコードできることを認識するものと思われる。該核酸は、ＬＣＶＲのみをコードできるにすぎないか、またはＬＣＶＲに機能的に結合した抗体Ｌ鎖不変部領域もコードできる。一実施態様では、この核酸は組換え発現ベクターである。
【００７３】
更にもう一つの実施態様では、本発明は、SEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む抗体Ｈ鎖可変領域（すなわちＤ２Ｅ７ＬＣＶＲ）をコードする単離核酸を提供する。好ましくは、この核酸は、SEQ ID NO:３７のヌクレオチド配列を含むが、当業者は、遺伝暗号の縮重のため、他のヌクレオチド配列がSEQ ID NO:２のアミノ酸配列をコードできることを認識するものと思われる。該核酸は、ＨＣＶＲのみをコードできるにすぎないか、またはＨＣＶＲに機能的に結合したＨ鎖不変部領域もコードできる。例えば、該核酸は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の不変部領域を含むことができる。一実施態様では、この核酸は組換え発現ベクターである。
【００７４】
本発明は、抗体Ｈ鎖と抗体Ｌ鎖との双方をコードする組換え発現ベクターも提供する。例えば、一実施態様では、本発明は、
（ａ）SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体Ｌ鎖（すなわちＤ２Ｅ７ＬＣＶＲ）；および
（ｂ）SEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体Ｈ鎖（すなわちＤ２Ｅ７ＨＣＶＲ）をコードする組換え発現ベクターを提供する。
【００７５】
本発明は、本発明の組換え発現ベクターのうち１種類またはそれ以上を導入した宿主細胞も提供する。好ましくは、該宿主細胞は、哺乳動物の宿主細胞、より好ましくは、該宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞またはＣＯＳ細胞である。更に、本発明は、本発明の組換えヒト抗体が合成されるまで、本発明の宿主細胞を適切な培地で培養することによって、本発明の組換えヒト抗体を合成する方法を提供する。該方法は、該組換えヒト抗体を該培地から単離する段階を、更に含むことができる。
【００７６】
III．組換えヒト抗体の選別
本明細書に開示したＤ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連抗体に加えて、本発明の組換えヒト抗体は、ヒトのリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製したヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを用いて調製した、組換え組合せ抗体ライブラリー、好ましくはｓｃＦｖファージ表示ライブラリーのスクリーニングによって単離することができる。そのようなライブラリーを調製し、スクリーニングする方法は、当技術に公知である。ファージ表示ライブラリーの作成のための商業的に入手できるキット（例えば、PharmaciaのRecombinant Phage Antibody System、カタログ番号第27-9400-01号；およびStratageneのSurfZAP（商品名）ファージ表示キット、カタログ番号第240612号）に加えて、抗体表示ライブラリーの作成やスクリーニングに用いるのに特に適応する方法および試薬の例は、例えば、Ladnerらの米国特許第5,223,409号明細書；Kangらの国際公開特許第WO92/18619号公報；Dowerらの国際公開特許第WO91/17271；Winterらの国際公開特許第WO92/20791号公報；Marklandらの国際公開特許第WO92/15679号公報；Breitlingらの国際公開特許第WO93/01288号公報；McCaffertyらの国際公開特許第WO92/01047号公報；Garrardらの国際公開特許第WO92/09690号公報；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay et al.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3:81-85;Huse et al.(1989)Science 246:1275-1281；McCafferty etal.,Nature(1990)348:552-554；Griffiths etal.(1993)EMBO J.12:725-734；Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.226:889-896；Clackson et al.(1991)Nature352:624-628；Gram et al.(1992)PNAS 89:3576-3580；Garrad et al.(1991)Bio/Technology 2:1373-1377；Hoogenboom et al.(1991)Nuc.Acid Res.19:4133-4137およびBarbas et al.(1991)PNAS88:7978-7982に見出すことが できる。
【００７７】
好適実施態様では、ｈＴＮＦαに対する高い親和性と低いオフ速度とを有するヒト抗体を単離するのに、ｈＴＮＦαに対する高親和性および低オフ速度を有するマウス抗ｈＴＮＦα抗体（例えば、ＥＣＡＣＣ受託番号第87 050801号を有するハイブリドーマであるＭＡＫ１９５）を初めに用い、ｈＴＮＦαとの類似の結合活性を有するヒトＨおよびＬ鎖配列を、Hoogenboomらの国際公開特許第WO93/06213号公報に記載の方法である、エピトープ刻印または誘導選別を用いて選別する。この方法に用いる抗体ライブラリーは、好ましくは、McCaffertyらの国際公開特許第WO92/01047、McCafferty et al.,Nature(1990)348:552-554およびGriffiths et al.,(1993)EMBO J.12:725-734に記載のとおりに調製かつスクリーニングしたｓｃＦｖライブラリーである。ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、好ましくは、組換えヒトＴＮＦαを抗原として用いてスクリーニングする。
【００７８】
最初のヒトＶＬおよびＶＨセグメントを選別したならば、最初に選別したＶＬおよびＶＨセグメントの異なる対をｈＴＮＦαとの結合についてスクリーニングする「混合と適合」の実験を実施して、好適なＶＬ／ＶＨ対の組合せを選別する。加えて、ｈＴＮＦαと結合するための親和性を更に向上させ、かつ／またはオフ速度定数を低めるために、好ましいＶＬ／ＶＨ対のＶＬおよびＶＨセグメントを、好ましくはＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３領域内で、自然の免疫応答の際の抗体の親和性成熟の原因となるin vivoでの体細胞突然変異の過程と同様の過程で無差別に突然変異させることができる。このin vitroでの親和性成熟は、それぞれＶＨＣＤＲ３またはＣＤＲ３ＶＬに相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ＶＨおよびＶＬ領域を増幅することによって達成できるが、これらのプライマーは、４種類のヌクレオチド塩基の無作為混合物で一定の位置を「スパイク」して、得られるＰＣＲ産物が、ＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ３領域内で無差別突然変異を導入したＶＨおよびＶＬセグメントをコードするようにしておく。これらの無差別に突然変異させたＶＨおよびＶＬセグメントは、ｈＴＮＦαとの結合について再スクリーニングすることができ、ｈＴＮＦαと結合するための高い親和性と低いオフ速度とを示す配列が選別できる。
【００７９】
選ばれた抗体ＨおよびＬ鎖のアミノ酸配列は、生殖系列ＨおよびＬ鎖のアミノ酸配列と対照することができる。選ばれたＶＬおよび／またはＶＨ鎖の一定のフレームワーク残基が、(例えば、ファージライブラリーを調製するのに用いた免疫グロブリン遺伝子の体細胞突然変異の結果として）生殖系列の立体配置と異なる場合は、選ばれた抗体の変化したフレームワーク残基を、生殖系列立体配置へと「戻し突然変異」させる（すなわち、選ばれた抗体のフレームワークアミノ酸配列を、生殖系列アミノ酸配列と同じになるように変化させる）のが望ましいことがある。フレームワーク残基のそのような「戻し突然変異」（または「生殖系列化」）は、特定の突然変異を導入するための標準的な分子生物学的方法によって達成できる（例えば、部位指向性突然変異；ＰＣＲ仲介突然変異など）。
【００８０】
組換え免疫グロブリン表示ライブラリーからの本発明の抗ｈＴＮＦα抗体のスクリーニングおよび単離に続いて、選別した抗体をコードする核酸を、(例えばファージゲノムからの）表示パッケージから回収し、標準的な組換えＤＮＡの手法によって他の発現ベクター中にサブクローニングすることができる。望むならば、該核酸を更に操作して、本発明のその他の抗体形態（例えば、免疫グロブリンの追加のドメイン、例えば追加の不変部領域）を生成することができる。組合せライブラリーのスクリーニングによって単離した組換えヒト抗体を発現するには、該抗体をコードするＤＮＡを、上記の第II節で更に詳述したとおり、組換え発現ベクター中にクローニングし、哺乳動物の宿主細胞に導入する。
【００８１】
IV．製剤組成物および製剤投与
本発明の抗体および抗体部分は、被験者への投与に適した製剤組成物に組み込むことができる。代表的には、該製剤組成物は、本発明の抗体または抗体部分と、製薬上許容され得る担体とを含む。本明細書に用いられる限りで、「製薬上許容され得る担体」は、生理学的に適合できるいかなるかつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅緩剤などをも包含する。製薬上許容され得る担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどのうち１種類またはそれ以上、ならびにそれらの組合せを包含する。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトールのような多価アルコール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物に含めるのが好ましいと思われる。製薬上許容され得る担体は、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤または緩衝液のような、副次的量の補助的物質を更に含んでよく、これらは、該抗体または抗体部分の棚保ちや有効性を高める。
【００８２】
本発明の組成物は、様々な形態をなしてよい。これらは、例えば、液体、半固体および固体の投与形態、例えば液体の溶液(例えば注射および注入できる溶液)、分散もしくは懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソームおよび坐薬を包含する。好ましい形態は、意図される投与の様式や治療の用途に依存する。代表的な好適組成物は、注射または注入できる溶液、例えば、他の抗体によるヒトの受身感作に用いられるのと同様の組成物の形態をなす。好適な投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内）である。好適実施態様では、該抗体を、静脈内注入または注射によって投与する。もう一つの好適実施態様では、該抗体を、筋内または皮下注射によって投与する。
【００８３】
治療組成物は、代表的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定的でなければならない。該組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散、リポソーム、または高い薬物濃度に適するよう誂えたその他の構造として配合することができる。無菌注射液は、必要に応じて上記に列挙した成分の一種類または組合せとともに、活性化合物（すなわち抗体または抗体部分）を必要量で適切な溶媒に組み込むことによって調製できる。一般的には、塩基性分散媒と、必要とされる上記に列挙したものからのその他の成分とを含有する無菌の賦形剤に、活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合は、好適な調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であって、活性成分に、予め無菌濾過したその溶液からの望みのいかなる追加の成分も加えた粉末が得られる。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用い、分散の場合は必要な粒径を保ち、かつ界面活性剤を用いることによって維持することができる。注射可能組成物の長期的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含ませることによって達成できる。
【００８４】
本発明の抗体および抗体部分は、当技術に公知の様々な方法によって投与できるが、多くの治療用途のためには、投与の好適な経路／様式は、静脈内注射または注入である。当業者には認識されると思われるとおり、投与の経路／様式は、望まれる結果に応じて変動することになる。一定の実施態様、例えば、移植体、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された送達系を包含する制御放出配合物では、活性化合物を、急速な放出から該化合物を防護するような担体とともに調製してよい。生体分解できる生体適合重合体、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を用いることができる。そのような配合物の調製のための多くの方法は、特許されているか、または当業者に広く公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978を参照されたい。
【００８５】
一定の実施態様では、本発明の抗体または抗体部分は、例えば不活性希釈剤、または同化できる食用の担体とともに、経口的に投与してよい。該化合物（および望みならば他の成分）は、硬いか、もしくは軟らかい殻のゼラチンカプセルに封入し、錠剤に打錠し、または被験者の食餌に直接組み込んでもよい。経口の治療的投与のためには、該化合物を、添加剤とともに組み込み、摂取できる錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシュ剤などの形態で用いてよい。本発明の化合物を非経口投与以外によって投与するには、該化合物をその不活性化を防護する材料で被覆するか、またはそれらと該化合物とを同時投与することが必要であり得る。
【００８６】
補助的活性化合物を、該組成物に組み込むこともできる。一定の実施態様では、本発明の抗体または抗体部分を、ＴＮＦα活性が不都合である疾患を治療するのに役立つ１種類またはそれ以上の追加の治療剤とともに、同時配合し、および／または同時投与する。例えば、本発明の抗ＴＮＦα抗体または抗体部分を、他の標的と結合する一種類またはそれ以上の追加の抗体（例えば、他のサイトカインと結合するか、または細胞表面分子と結合する抗体）、１種類またはそれ以上のサイトカイン、可溶性ＴＮＦα受容体（例えば国際公開特許第WO94/06476号公報を参照されたい)、および／またはｈＴＮＦαの生産もしくは活性を阻害する１種類またはそれ以上の化学的薬剤（例えば、国際公開特許第93/19751号公報に記載のとおりのシクロヘキサン−イリデン誘導体）とともに、同時配合し、および／または同時投与する。その上、本発明の１種類またはそれ以上の抗体は、前記の治療剤のうち２種類またはそれ以上と併用してよい。そのような併用療法は、好都合にも、低投与量の投与治療剤を活用し、こうして様々な単剤療法に付随することがある毒性または併発症を回避し得る。
【００８７】
本発明の抗体または抗体部分を併用できる、リウマチ様関節炎に対する治療剤の非限定的な例は、下記を包含する：非ステロイド系抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)；サイトカイン抑制性抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）；ＣＤＰ−５７１／ＢＡＹ−１０−３３５６（人体適応抗ＴＮＦα抗体；Celltech/Bayer）；ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦα抗体；Centocor）；７５kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Immunex;例えばArthritis & Rheumatism(1994)Vol.37,S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235Aを参照されたい）；５５kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（５５kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Hoffmann-LaRoche）；ＩＤＥＣ−ＣＥ９．１／ＳＢ２１０３９６（非枯渇性霊長類適応抗ＣＤ４抗体；IDEC/SmithKline；例えばArthritis & Rheumatism(1995)Vol.38,S185を参照されたい);ＤＡＢ４８６−ＩＬ−２および／またはＤＡＢ３８９−ＩＬ−２（ＩＬ−２融合タンパク質；Seragen；例えばArthritis & Rheumatism(1993)Vol.36,1223を参照されたい）；抗Ｔａｃ(人体適応抗ＩＬ−２Ｒα；Protein Design Labs/Roche);ＩＬ−４（抗炎症性サイトカイン；DNAX/Schering）；ＩＬ−１０（ＳＣＨ５２０００；組換えＩＬ−１０、抗炎症性サイトカイン；DNAX/Schering）；ＩＬ−４；ＩＬ−１０および／またはＩＬ−４作用薬（例えば作用薬抗体);ＩＬ−１ＲＡ（ＩＬ−１受容体拮抗薬；Synergen/Amgen）；ＴＮＦ−ｂｐ／ｓ−ＴＮＦＲ（可溶性ＴＮＦ結合性タンパク質；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S284；Amer.J.Physiol.-Heart and Circulatory Physiology(1995)Vol.268,pp.37-42を参照されたい)；Ｒ９７３４０１（ホスホジエステラーゼIV型阻害剤；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S282を参照されたい）；ＭＫ−９６６（ＣＯＸ−２阻害剤；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S81を参照されたい）；Iloprost（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39.No.9(supplement),S82を参照されたい);メトトレキサート；サリドマイド（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S282を参照されたい)およびサリドマイド関連薬物（例えばClegen);レフルノミド（抗炎症剤およびサイトカイン阻害剤；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39,No.9(supplement),S131；Inflammation Research(1996)Vol.45,pp.103-107を参照されたい);トラネキサム酸（プラスミノーゲン活性化の阻害剤；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S284を参照されたい）；Ｔ−６１４(サイトカイン阻害剤；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S282を参照されたい）；プロスタグランジンＥ１（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S282を参照されたい)；Tenidap(非ステロイド系抗炎症薬；例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39,No.9(supplement),S280を参照されたい）；ナプロキセン(非ステロイド系抗炎症薬；例えばNeuro Report(1996)Vol.7,pp.1209-1213を参照されたい）；メロキシカム（非ステロイド系抗炎症薬)；イブプロフェン(非ステロイド系抗炎症薬);ピロキシカム(非ステロイド系抗炎症薬)；ジクロフェナク（非ステロイド系抗炎症薬）；インドメタシン(非ステロイド系抗炎症薬）；スルファサラジン(例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S281を参照されたい）；アザチオプリン（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39 No.9(supplement),S281を参照されたい）；ＩＣＥ阻害剤（酵素のインターロイキン−１β変換酵素の阻害剤）；ｚａｐ−７０および／またはｌｃｋ阻害剤（チロシンキナーゼｚａｐ−70またはｌｃｋの阻害剤）；ＶＥＧＦ阻害剤および／またはＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤（血管内皮細胞成長因子または血管内皮細胞成長因子受容体の阻害剤；血管形成の阻害剤)；コルチコステロイド抗炎症薬(例えばＳＢ203580)；ＴＮＦ変換酵素阻害剤；抗ＩＬ−１２抗体；インターロイキン−１１（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39,No.9(supplement),S296を参照されたい）；インターロイキン−１３（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39,No.9(supplement),S308を参照されたい）；インターロイキン−１７阻害剤（例えばArthritis & Rheumatism(1996)Vol.39,No.9(supplement),S120を参照されたい);金；ペニシラミン；クロロキノン；ヒドロキシクロロキノン；クロラムブシル；シクロホスファミド；シクロスポリン；全リンパ照射；抗胸腺細胞グロブリン；抗ＣＤ４抗体；ＣＤ５毒素；経口投与されるペプチドやコラーゲン；ロベンザリット二ナトリウム；サイトカイン調節剤（ＣＲＡ）ＨＰ２２８およびＨＰ４６６(Houghten Pharmaceuticals,Inc.)；ＩＣＡＭ−１アンチセンスモノチオリン酸オリゴヌクレオチド(ＩＳＩＳ2302；Isis Pharmaceuticals, Inc.)；可溶性補体受容体１(ＴＰ10；T Cell Sciences,Inc.);プレドニゾン；オルゴテイン；グリコサミノグリカンポリ硫酸；ミノサイクリン；抗ＩＬ−２Ｒ抗体；海産および植物産脂質（魚および植物種子の脂肪酸；例えばDeLuca et al.,(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21:759-777)；オーラノフィン；フェニルブタゾン；メクロフェナム酸；フルフェナム酸；静脈内免疫グロブリン；ジロイトン；ミコフェノール酸(ＲＳ−61443);タクロリムス(ＦＫ−506)；シロリムス（ラパマイシン）；アミプリロース(テラフェクチン）；クラドリビン(２−クロロデオキシアデノシン）；ならびにアザリビン。
【００８８】
本発明の抗体または抗体部分を併用できる炎症性腸疾患の治療剤の非限定的な例は、下記を包含する：ブデノシド；表皮成長因子；コルチコステロイド；シクロスポリン；スルファサラジン；アミノサリチル酸塩；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体拮抗薬；抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体；抗ＩＬ−６モノクローナル抗体；成長因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール複合体；ＣＤＰ-571／ＢＡＹ−１０−３３５６(人体適応抗ＴＮＦα抗体；Celltech/Bayer)；ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦα抗体；Centocor）；75kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（75kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Immunex；例えばArthritis & Rheumatism(1994)Vol.37,S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235Aを参照されたい）；55kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（55kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Hoffmann-LaRoche）；インターロイキン−10（ＳＣＨ52000；Schering Plough)；ＩＬ−４；ＩＬ−10および／またはＩＬ−４作用薬（例えば作用薬抗体）；インターロイキン−11；プレドニゾロン、デキサメタゾンもしくはブデソニドのグルクロニド−またはデキストラン−複合プロドラッグ；ＩＣＡＭ−１アンチセンスモノチオリン酸オリゴヌクレオチド(ＩＳＩＳ2302；Isis Pharmaceuticals, Inc.)；可溶性補体受容体１(ＴＰ10；T Cell Sciences,Inc.)；徐放性メサラジン；メトトレキサート；血小板活性化因子（ＰＡＦ）の拮抗薬；シフロフロキサシン；ならびにリグノカイン。
【００８９】
本発明の抗体または抗体部分を併用できる多発性硬化症の治療剤の非限定的な例は、下記を包含する：コルチコステロイド；プロドニゾロン；メチルプレドニゾロン；アザチオプリン；シクロホスファミド；シクロスポリン；メトトレキサート；４−アミノピリジン；チザニジン；インターフェロン−β１ａ（Avonex（商品名）；Biogen）；インターフェロン−β１ｂ（Betaseron（商品名）；Chiron/Berlex)；共重合体１(Cop-1；Copaxone（商品名)；Teva PharmaceuticalIndustries,Inc.)；高圧酸素；静脈内免疫グロブリン;クラブリビン;ＣＤＰ-571／ＢＡＹ−１０−３３５６(人体適応抗ＴＮＦα抗体；Celltech/Bayer）；ｃＡ２(キメラ抗ＴＮＦα抗体；Centocor）；75kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（75kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Immunex；例えばArthritis & Rheumatism(1994)Vol.37,S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235Aを参照されたい)；55kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（55kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Hoffmann-LaRoche）；ＩＬ−10；ＩＬ−４；ならびにＩＬ−１０および／またはＩＬ−４作用薬（例えば作用薬抗体）。
【００９０】
本発明の抗体または抗体部分を併用できる敗血症の治療剤の非限定的な例は、下記を包含する：高張生理食塩水溶液；抗生物質；静脈内γ−グロブリン；連続血液濾過；カルバペネム(メロペネム)；ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６および／またはＩＬ−８のようなサイトカインの拮抗薬；ＣＤＰ-571／ＢＡＹ−１０−３３５６（人体適応抗ＴＮＦα抗体；Celltech/Bayer）；ｃＡ２(キメラ抗ＴＮＦα抗体；Centocor）；75kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（75kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Immunex；例えばArthritis & Rheumatism(1994)Vol.37,S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235Aを参照されたい）；55kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（55kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Hoffmann-LaRoche);サイトカイン調節剤（ＣＲＡ）ＨＰ228およびＨＰ466（Houghten Pharmaceuticals,Inc.）；ＳＫ＆Ｆ107647（低分子ペプチド；SmithKline Beecham）；四価グアニルヒドラゾンのＣＮＩ−1493（Picower Institute);組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ；Chiron）；ＰＨＰ(化学的に修飾されたヘモグロビン；APEX Bioscience）；ジエチレントリアミン五酢酸−鉄（III)錯体（ＤＴＰＡ鉄（III)；Molichem Medicines）を包含する鉄キレート化剤およびキレート；リゾフィリン（合成小分子メチルキサンチン;Cell Therapeutics,Inc.)；ＰＧＧ−グルカン(水性可溶性β１，３グルカン；Alpha-Beta Technology)；脂質で再構成したアポリポタンパク質Ａ−１；キラルなヒドロキサム酸（脂質Ａの生合成を阻害する合成抗菌剤）；抗内毒素抗体；Ｅ5531（合成脂質Ａ拮抗薬；Eisai America,Inc.)；ｒＢＰＩ21(ヒト殺菌／透過性上昇タンパク質の組換えＮ末端フラグメント）；ならびに合成抗内毒素ペプチド（ＳＡＥＰ；Bios Ynth Research Laboratories）。
【００９１】
本発明の抗体または抗体部分を併用できる成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）の治療剤の非限定的な例は、下記を包含する：抗ＩＬ−８抗体；界面活性剤置換療法；ＣＤＰ-571／ＢＡＹ−１０−３３５６(人体適応抗ＴＮＦα抗体；Celltech/Bayer)；ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦα抗体；Centocor）；７５kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（75kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Immunex；例えばArthritis & Rheumatism(1994)Vol.37,S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235Aを参照されたい）；および５５kdＴＮＦＲ−ＩｇＧ（55kDＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Hoffmann-LaRoche）。
【００９２】
他の治療剤との本発明の抗体または抗体部分の併用は、サブセクションIVで更に考察する。
【００９３】
本発明の製剤組成物は、「治療的有効量」または「予防的有効量」の本発明の抗体または抗体部分を含んでよい。「治療的有効量」とは、必要な投与量および期間で、望みの治療上の結果を達成するのに効果的である量を意味する。抗体または抗体部分の治療的有効量は、個体の疾病状態、年齢、性別および体重、ならびに望みの応答を個体に誘発できる抗体または抗体部分の能力のような要因に従って変動してよい。治療的有効量は、抗体もしくは抗体部分のいかなる有害または不都合な効果よりも、治療上有益な効果の方が重視される量でもある。「予防的有効量」とは、必要な投与量および期間で、望みの予防上の結果を達成するのに効果的である量を意味する。代表的には、予防の用量は、疾病の前または初期段階で被験者に用いられることから、予防的有効量は、治療的有効量より少ないことになる。
【００９４】
投与方式は、望みの最適の応答（例えば、治療的または予防的応答）を与えるよう調整してよい。例えば、ただ１個の大型丸剤を投与しても、いくつかの分割された投与量を経時的に投与しても、あるいは治療状況の急迫が示すのに比例して、用量を増減してもよい。投与の簡易性と投与量の均一性とを求めて、非経口組成物を単位投与量形態で配合するのが、特に好都合である。本明細書に用いられる限りでの単位投与量形態とは、哺乳動物の被験体を治療するための一元的投与量として適した、物理的に分離した単位を意味し：各単位は、望みの治療的効果を生じるよう算出された所定量の活性化合物を、必要とされる製剤用担体を伴って含有する。本発明の単位投与量形態についての仕様は、(ａ)活性化合物の独自の特徴性、および達成しようとする特定の治療的または予防的効果と、(ｂ)個体における感受性の治療のためにそのような活性化合物を複合させる技術に固有の限界とに指定され、かつ直接依存する。
【００９５】
本発明の抗体もしくは抗体部分の治療的または予防的有効量についての例示的で非限定的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は、緩和しようとする状態の形式および重篤度とともに変動してよいことが注目される。特定のいかなる被験者についても、特有の投与方式は、個別的な必要性と、組成物の投与を管理または監督する者の専門的判断とに従って経時的に調整しなければならず、本明細書に述べた投与量の範囲は、単に例示的であるにすぎず、クレームされた組成物の範囲および実施を限定するものではないことを理解すべきである。
【００９６】
V．本発明の抗体の用途
ｈＴＮＦαと結合できることが示されたため、本発明の抗ｈＴＮＦα抗体またはその部分は、慣用の免疫検定法、例えば酵素結合免疫吸収検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）または組織の免疫組織化学を用いて、(例えば、生物学的試料、例えば血清または血漿中の）ｈＴＮＦαを検出するのに用いることができる。本発明は、生物学的試料中のｈＴＮＦαを検出する方法であって、生物学的を本発明の抗体または抗体部分と接触させ、ｈＴＮＦαと結合した抗体（もしくは抗体部分）、または結合しなかった抗体（もしくは抗体部分）のいずれかを検出し、それによって該生物学的試料中のｈＴＮＦαを検出することを含む方法を提供する。結合または未結合抗体の検出を容易にするために、抗体は、検出できる物質で直接または間接的に標識する。適切な検出可能物質は、様々な酵素、補欠基、蛍光性材料、発光性材料および放射性材料を包含する。適切な酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適切な補欠基複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンを包含し；発光性材料の例は、ルミノールを包含し;適切な放射性材料の例は、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈを包含する。
【００９７】
抗体の標識化に代えて、検出できる物質で標識したｒｈＴＮＦαの標準と、標識していない抗ｈＴＮＦα抗体とを用いた競争免疫検定法によって、ｈＴＮＦαを生体液中で検定することができる。この検定法では、生物学的試料、標識したｒｈＴＮＦαの標準、および抗ｈＴＮＦα抗体を組合せ、未標識抗体と結合した標識ｒｈＴＮＦα標準の量を決定する。生物学的試料中のｈＴＮＦαの量は、抗ｈＴＮＦα抗体に結合した標識ｒｈＴＮＦα標準の量に逆比例する。
【００９８】
本発明のＤ２Ｅ７は、ヒト以外の種からのＴＮＦα、特に霊長類（例えばチンパンジー、ヒヒ、キヌザル、カニクイザルおよびアカゲザル）、ブタおよびマウスからのＴＮＦαを検出するのに用いることもできるが、それは、Ｄ２Ｅ７がこれらのＴＮＦαのそれぞれと結合できるためである（実施例４サブセクションＥで更に考察する）。
【００９９】
本発明の抗体または抗体部分は、in vitroとin vivoとの双方で、ｈＴＮＦα活性を中和することができる（実施例４を参照されたい）。その上、本発明の抗体の少なくともいくつか、例えばＤ２Ｅ７は、他の種からのＴＮＦα活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体または抗体部分は、例えば、ｈＴＮＦαを含有する細胞培養体で、ヒトである被験者で、または本発明の抗体が交差反応するＴＮＦαを有する哺乳動物の被験体（例えばチンパンジー、ヒヒ、キヌザル、カニクイザルおよびアカゲザル、ブタまたはマウス）で、ＴＮＦα活性を阻害するのに用いることができる。一実施態様では、本発明は、ＴＮＦαを本発明の抗体または抗体部分と接触させる結果、ＴＮＦα活性が阻害されることを含む、ＴＮＦα活性を阻害する方法も提供する。好ましくは、ＴＮＦαは、ヒトのＴＮＦαである。例えば、ＴＮＦαを含有するか、または含有する疑いのある細胞培養体中に、本発明の抗体または抗体部分を培地に加えて、培養体中のｈＴＮＦα活性を阻害することができる。
【０１００】
もう一つの実施態様では、本発明は、ＴＮＦα活性が不都合である疾患に罹患した被験者での、ＴＮＦα活性を阻害する方法を提供する。ＴＮＦαは、非常に様々な疾患の病態生理学に関連している［例えば、Moeller,A.,et al.(1990)Cytokine 2:162-169；Moellerらへの米国特許第5,231,024号明細書；Moeller,A.によるヨーロッパ特許第260 610 B1号公報を参照されたい］。本発明は、そのような疾患に罹患した被験者でのＴＮＦα活性に関する方法であって、被験者に本発明の抗体または抗体部分を投与する結果、被験者のＴＮＦα活性が阻害される段階を含む方法を提供する。好ましくは、ＴＮＦαはヒトのＴＮＦαであり、被験者は、ヒトの被験者である。これに代えて、被験体は、本発明の抗体が交差反応するＴＮＦαを発現する哺乳動物であることができる。また更に、被験体は、（例えば、ｈＴＮＦαの投与、またはｈＴＮＦαの移入遺伝子の発現によって）ｈＴＮＦαを導入した哺乳動物であることもできる。本発明の抗体は、治療を目的としてヒトの被験者に投与することができる（以下に更に考察する）。その上、本発明の抗体は、該抗体が交差反応するＴＮＦαを発現するヒトではない哺乳動物（例えば霊長類、ブタまたはマウス）に、獣医学の目的でか、ヒトの疾病の動物モデルとして投与することができる。後者に関しては、そのような動物モデルは、本発明の抗体の治療的薬効を評価する（例えば投与量、および投与の時間的経過を試験する）のに役立ち得る。
【０１０１】
本明細書に用いられる限りで、用語「ＴＮＦα活性が不都合である疾患」は、該疾患に罹患した被験者でのＴＮＦαの存在が、該疾患の病態生理学の原因であることか、もしくは該疾患の悪化に寄与する要因であることのいずれかが示されているか、またはその疑いがある疾病その他の疾患を包含するものとする。したがって、ＴＮＦα活性が不都合である疾患は、ＴＮＦα活性の阻害が、該疾患の徴候および／または進行を緩和すると期待される疾患である。そのような疾患は、例えば、該疾患に罹患した被験者の体液中のＴＮＦαの濃度の上昇（例えば、被験者の血清、血漿、滑液等々中のＴＮＦαの濃度の上昇）によって証拠付けられてよく、それは、例えば、上記のとおり、抗ＴＮＦα抗体を用いて検出することができる。ＴＮＦα活性が不都合である疾患の無数の例が存在する。以下、特定の疾患の治療の際の本発明の抗体および抗体部分の用途を更に考察する：
【０１０２】
Ａ．敗血症
腫瘍壊死因子は、低血圧、心筋抑制、血管漏出症候群、器官壊死、有毒二次メジエーターの放出、および凝血カスケードの活性化を包含する生物学的効果を有して、敗血症の病態生理学で確定された役割を果たす［例えば、Moeller,A.,etal.(1990)Cytokine 2:162-169；Moellerらへの米国特許第5,231,024号明細書；Moeller,A.によるヨーロッパ特許第260 610 B1号公報；Tracey,K.J.& Cerami,A.(1994)Annu.Rev.Med.45:491-503；Russell,D & Thompson,R.C.(1993)Curr.Opin.Biotech.4:714-721を参照されたい]。したがって、本発明のヒトの抗体および抗体部分は、敗血症ショック、内毒素ショック、グラム陰性敗血症および毒物ショック症候群を包含する、その臨床的設定のいずれかにおいて敗血症を治療するのに用いることができる。
【０１０３】
その上、敗血症を治療するために、本発明の抗ＴＮＦα抗体または抗体部分は、敗血症を更に緩和し得る１種類またはそれ以上の追加の治療剤、例えばインターロイキン−１阻害剤（例えば国際公開特許第WO92/16221号および第WO92/17583号公報に記載のもの）、サイトカインのインターロイキン−６（例えば国際公開特許第WO93/11793号公報を参照されたい）、または血小板活性化因子の拮抗薬（例えばヨーロッパ特許第374 510号公報を参照されたい）と同時投与することができる。敗血症の治療のためのその他の併用療法は、サブセクションIIIで更に考察する。
【０１０４】
加えて、好適実施態様では、本発明の抗ＴＮＦα抗体または抗体部分は、治療の時点でＩＬ−６の血清または血漿濃度が５００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは１，０００ｐｇ／ｍｌを超える敗血症患者の下位群内のヒトである被験者に投与する（Daumらによる国際公開特許第WO95/20978号公報を参照されたい）。
【０１０５】
Ｂ．自己免疫病
腫瘍壊死因子は、様々な自己免疫病の病態生理学に役割を果たすことに関与している。例えば、ＴＮＦαは、リウマチ様関節炎では組織の炎症を活性化し、関節の破損を生起することに関与している［例えば、Moeller,A.,et al.(1990)Cytokine2:162-169；Moellerらへの米国特許第5,231,024号明細書；Moeller,A.によるヨーロッパ特許第260 610 B1号公報；Tracey,K.J. & Cerami,A.（前掲）；Arend,W.P.& Dayer,J-M.(1995)Arth.Rheum.38:151-160；Fava,R.A.,etal.(1993)Clin.Exp.Immunol.94:261-266を参照されたい］。ＴＮＦαは、糖尿病でも、島細胞の死を促進し、インスリン耐性を媒介することに関与している（例えばTracey &Cerami（前掲）；国際公開特許第WO94/08609号公報を参照されたい）。ＴＮＦαは、多発性硬化症でも、希突起神経膠細胞に対する細胞毒性の媒介、および炎症斑の誘導に関与している（例えばTracey & Cerami（前掲）を参照されたい）。キメラの人体適応マウス抗ｈＴＮＦα抗体は、リウマチ様関節炎の治療について臨床試験を経ている［例えば、Elliott,M.J.,et al.(1994)Lancet 344:1125-1127；Elliott,M.J.,et al.(1994)Lancet 344:1105-1110；Rankin,E.C.,et al.(1995)Br.J.Rheumatol.34:334-342を参照されたい］。
【０１０６】
本発明のヒトの抗体および抗体部分は、自己免疫病、特にリウマチ様関節炎、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎および痛風性関節炎を包含する炎症を伴うもの、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫糖尿病、自己免疫葡萄膜炎、ならびに腎症性症候群を治療するのに用いることができる。代表的には、抗体または抗体部分を全身的に投与するが、一定の疾患に対しては、炎症の部位への抗体または抗体部分の局所投与が有益であり得る（例えば、単独でか、または国際公開特許第WO93/19751号公報に記載のとおり、シクロヘキサン−イリデン誘導体との併用での、リウマチ様関節炎での関節への局所投与、または糖尿性潰瘍に対する局所塗布)。本発明の抗体または抗体部分は、サブセクションIIIで更に考察したとおり、自己免疫病の治療に役立つ１種類またはそれ以上の追加の治療剤とともに、投与することもできる。
【０１０７】
Ｃ．伝染病
腫瘍壊死因子は、様々な伝染病で観察される生物学的効果の仲介に関与している。例えば、ＴＮＦαは、マラリアでは、脳の炎症、および毛細血管の血栓症や梗塞の仲介に関与している。ＴＮＦαは、髄膜炎では、脳の炎症を仲介し、血液−脳関門の破壊を誘導し、敗血症ショック症候群を誘発し、静脈梗塞を活性化することにも関与している。ＴＮＦαは、後天性免疫不全症候群（エイズ）では、悪液質を誘導し、ウイルス増殖を刺激し、中枢神経系の損傷を仲介することにも関与している。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、細菌性髄膜炎（例えばヨーロッパ特許第585705号公報を参照されたい）、脳性マラリア、エイズやエイズ関連症候群（ＡＲＣ）（例えばヨーロッパ特許第230574号公報を参照されたい）を包含する伝染病、および移植に副次的なサイトメガロウイルス感染［例えばFietze,E.,et al.(1994)Transplantation58:675-680を参照されたい］の治療に用いることができる。本発明の抗体または抗体部分は、感染（例えばインフルエンザ）による発熱や筋肉痛、および感染に副次的な悪液質（例えばエイズまたはＡＲＣに副次的な）を包含する、伝染病に付随する徴候を緩和するのにも用いることができる。
【０１０８】
Ｄ．移植
腫瘍壊死因子は、同種移植拒絶や移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の中枢的メジエーターとして、およびＴ細胞受容体のＣＤ３複合体に仕向けたラット抗体ＯＫＴ３を、腎移植体の拒絶を阻害するのに用いたときに観察される副作用を仲介することに関与している［例えば,Eason,J.D.,etal.(1995)Transplantation59:300-305；Suthanthiran,M.& Strom,T.B.(1994)New Engl.J.Med.331:365-375を参照されたい］。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、同種および異種移植片の拒絶を包含する移植体拒絶を阻害し、ＧＶＨＤを阻害するのに用いることができる。抗体または抗体部分は、単独で用いてよいが、最も好ましくは、同種移植片に対する免疫応答を阻害するか、またはＧＶＨＤを阻害する１種類またはそれ以上の他の薬剤と併用する。例えば、一実施態様では、本発明の抗体または抗体部分をＯＫＴ３と併用して、ＯＫＴ３で誘導される反応を阻害する。もう一つの実施態様では、本発明の抗体または抗体部分を、免疫応答の調節に関与する他の標的、例えば細胞表面分子のＣＤ２５（インターロイキン−２受容体α）、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）および／またはＣＤ８６（Ｂ７−２）に仕向けた１種類またはそれ以上の抗体と併用する。更にもう一つの実施態様では、本発明の抗体または抗体部分を、１種類またはそれ以上の一般的な免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６と併用する。
【０１０９】
Ｅ．悪性腫瘍
腫瘍壊死因子は、悪性腫瘍では、悪液質の誘導、腫瘍成長の刺激、転移能の増強、および細胞毒性の仲介に関与している。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、腫瘍成長もしくは転移を阻害し、および／または悪性腫瘍に副次的である悪液質を緩和するために、悪性腫瘍の治療に用いることができる。該抗体または抗体部分は、全身的にか、または腫瘍部位に局所的に投与してよい。
【０１１０】
Ｆ．肺疾患
腫瘍壊死因子は、白血球−内皮活性化の刺激、肺細胞への細胞毒性の指向、および血管漏出症候群の誘導を包含する、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）の病態生理学に関与している。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、成人呼吸困難症候群（例えば国際公開特許第WO91/04054号公報を参照されたい）、ショック肺、慢性炎症性肺病、肺サルコイドーシス、肺線維症およびケイ肺症を包含する様々な肺疾患を治療するのに用いることができる。該抗体または抗体部分は、全身的にか、または肺表面に局所的に、例えばエアゾルとして投与してよい。本発明の抗体または抗体部分は、サブセクションIIIで更に考察したとおり、肺疾患の治療に役立つ１種類またはそれ以上の追加の治療剤とともに、投与することもできる。
【０１１１】
Ｇ．腸疾患
腫瘍壊死因子は、炎症性腸疾患の病態生理学に関与している［例えば、Tracy,K.J.,et al.(1986)Science 234:470-474;Sun,X-M.,et al.(1988)J.Clin.Invest.81:1328-1331；MacDonald,T.T.,et al.(1990)Clin.Exp.Immunol. 81:301-305を参照されたい］。キメラマウスの抗ｈＴＮＦα抗体は、クローン病の治療について臨床試験を受けている［van Dullemen,H.M.,et al.(1995)Gastroenterology 109:129-135］。本発明のヒト抗体および抗体部分は、腸疾患、例えば、二つの症候群：クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する自発性炎症性腸疾患を治療するのに用いることもできる。本発明の抗体または抗体部分は、サブセクションIIIで更に考察したとおり、腸疾患の治療に役立つ１種類またはそれ以上の追加の治療剤とともに、投与することもできる。
【０１１２】
Ｈ．心疾患
本発明の抗体および抗体部分は、心臓の虚血（例えばヨーロッパ特許第453898号公報を参照されたい）および心不全（心筋の弱化）（例えば国際公開特許第WO94/20139号公報を参照されたい）を包含する様々な心疾患を治療するのに用いることもできる。
【０１１３】
Ｉ．その他
本発明の抗体および抗体部分は、ＴＮＦα活性が不都合であるその他の様々な疾患を治療するのに用いることもできる。ＴＮＦαが病態生理学に関与しており、そのため本発明の抗体または抗体部分を用いて治療できるその他の疾病および疾患の例は、炎症性骨疾患および骨吸収病［例えば、Bertolini,D.R.,et al.(1986)Nature 319:516-518;Konig,A.,et al.(1988)J.Bone Miner.Res.3:621-627；Lerner,U.H.& Ohlin A.(1993)J.Bone Miner.Res.8:147-155；およびShankar,G.&Stern,P.H.(1993)Bone14:871-876を参照されたい］、アルコール性肝炎［例えば、McClain,C.J.& Cohen,D.A.(1989)Hepatology 9:349-351；Felver,M.E.,et al.(1990)Alcohol Clin.Exp.Res.14:255-259；およびHansen,J.,et al.(1994)Hepatology 20:461-474を参照されたい］、ウイルス性肝炎［Sheron,N.,et al.(1991)J.Hepatol.12:241-245；およびHussain,M.J.,et al.(1994)J.Clin.Pathol.47:1112-1115］、および電撃的肝炎を包含する肝炎；凝固障害［例えば、van der Poll,T.,et al.(1990)N.Engl.J.Med.322:1622-1627；およびvan der Poll,T.,et al.(1991)Prog.Clin.Biol.Res.367:55-60を参照されたい]、火傷[例えば、Giroir,B.P.,et al.(1994)Am.J.Physiol.267:H118-124；およびLiu,X.S.,etal.(1994)Burns 20:40-44を参照されたい]、再灌流損傷[例えば、Scales,W.E.,et al.(1994)Am.J.Physiol.267:G1122-1127；Serrick,C.,et al.(1994)Transplantation58:1158-1162；およびYao,Y.M.,et al.(1995)Resuscitation 29:157-168を参照されたい］、ケロイド形成［例えば、McCauley,R.L.,et al.(1992)J.Clin.Immunol.12:300-308を参照されたい］、瘢痕組織形成；発熱；歯根膜病；肥満症、ならびに放射線毒性を包含する。
【０１１４】
本発明を下記の実施例によって更に説明するが、これは限定するとして解してはならない。本出願の全体を通じて、引用されたすべての参考文献、特許および公開特許願の内容は、引用によってここに組み込まれる。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：ｈＴＮＦαとのヒト抗体の結合の速度論的分析
リガンド（バイオセンサーのマトリックスに固定化されたビオチニル化組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα））と被分析物（溶液中の抗体）との実時間での結合相互作用を、ＢＩＡコアシステム（Pharmacia Biosensor, Piscataway,NJ)を用いた表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。このシステムは、ＳＰＲの光学的特性を利用して、デキストランバイオセンサーマトリックス中のタンパク質の濃度の変化を検出する。タンパク質は、既知の濃度でデキストランのマトリックスと共有結合させる。抗体は、デキストランマトリックスを通じて注入し、注入された抗体と固定化されたリガンドとの特異的結合が、マトリックスのタンパク質濃度の上昇、および結果的なＳＰＲシグナルの変化を招く。ＳＰＲでのこれらの変化は、共鳴単位（ＲＵ）として記録され、センサー記録図のｙ軸に沿って時間について表示される。バイオセンサーマトリックスへのビオチニル化ｒｈＴＮＦαの固定化を促すため、初めに１００ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および４００ｍＭの塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）によるマトリックス上のカルボキシル基の活性化によって、ストレプトアビジンを、遊離アミノ基を介してデキストランマトリックスに共有結合させる。次いで、活性化されたマトリックス越しにストレプトアビジンを注入する。酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５に希釈したストレプトアビジン３５μｌ（２５μｇ／ｍｌ）を、活性化されたバイオセンサー越しに注入し、タンパク質上の遊離アミンを、活性化されたカルボキシル基に直接結合させる。１Ｍのエタノールアミンの注入によって、未反応のマトリックスＥＤＣ−エステルを失活させる。ストレプトアビジンと結合したバイオセンサーのチップは、商業的に入手可能でもある（Pharmacia BR-1000-16、Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ）。
【０１１６】
ビオチニル化ｒｈＴＮＦαは、初めにビオチン（Ｄ−ビオチニル−ε−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；Boehringer Mannheimカタログ番号第1008960号）５．０ｍｇをジメチルスルホキシド５００μｌに溶かして、１０ｍｇ／ｍｌの溶液を作成することによって調製した。（２．６５ｍｇ／ｍｌの）ｒｈＴＮＦα１ｍｌあたりビオチン１０μｌを、ビオチンが２：１のモル比となるようにｒｈＴＮＦαに加えた。反応物を静かに混合し、暗中で室温にて２時間インキュベートした。ＰＤ−１０のカラム、セファデックスＧ−２５Ｍ（Pharmaciaカタログ番号第17-085-01号）を、冷ＰＢＳ２５ｍｌで平衡させ、カラムあたり２ｍｌのｒｈＴＮＦα−ビオチンを装荷した。カラムを１０×１ｍｌの冷ＰＢＳで溶出した。画分を捕集し、ＯＤ２８０で読み取った（１．０ＯＤ＝１．２５ｍｇ／ｍｌ）。適切な画分をプールし、使用まで−８０℃で保管した。ビオチニル化ｒｈＴＮＦαは、商業的に入手可能でもある（R&D Systemsカタログ番号第FTA00号、Minneapolis,MN）。
【０１１７】
ストレプトアビジンを介してマトリックスに固定化しようとするビオチニル化ｒｈＴＮＦαを、０．０５％の(BIAcore)界面活性剤Ｐ２０（Pharmacia BR-1000-54、Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ）で補強したＰＢＳ実施緩衝液（Gibcoカタログ番号第1490-144号、Gibco BRL,Grand Island,NY）中に希釈した。固定化したｒｈＴＮＦαと結合するｒｈＴＮＦα特異性抗体の容量を決定するために、結合検定を下記のとおり遂行した。ビオチニル化ｒｈＴＮＦαのアリコート（２５ｎＭ；１０μｌアリコート）を、ストレプトアビジン結合デキストランマトリックス中に５μl/分の流量で注入した。タンパク質の注入の前および直後に、ＰＢＳ緩衝液のみを各フローセルに流通させた。基線と、ビオチニル化ｒｈＴＮＦα注入の完了の約３０秒後との間のシグナルの正味の差が、結合の値を表すと解釈した（約５００ＲＵ)。固定化されたビオチニル化ｒｈＴＮＦαとのｒｈＴＮＦα特異性抗体の直接的結合を測定した。抗体（２０μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ操業緩衝液中に希釈し、２５μｌアリコートを、固定化タンパク質マトリックス中に５μl/分の流量で注入した。抗体の注入の前および直後に、ＰＢＳ緩衝液のみを各フローセルに流通させた。基線シグナルと、抗体注入の完了後のシグナルとの正味の差が、特定の試料の結合の値を表すと解釈した。次の試料の注入の前に、１００ｍＭＨＣlを用いてバイオセンサーのマトリックスを再生した。オフ速度(Ｋoff)、オン速度(Ｋon)、会合速度（Ｋa）および解離速度（Ｋd）定数を決定するために、BIAcoreの速度論的評価ソフトウエア（バージョン２．１）を用いた。
【０１１８】
ビオチニル化ｒｈＴＮＦαとのＤ２Ｅ７（ＩｇＧ４完全長抗体）の結合の、マウスｍＡｂのＭＡＫ１９５（Ｆ(ａｂ’）2フラグメント）と比較しての代表的な結果を下記の表１に示す。
【０１１９】
【表２】
第二の一連の実験では、ＩｇＧ１完全長形態のＤ２Ｅ７とビオチニル化ｒｈＴＮＦαとの分子速度論的相互作用を、上記のとおり、BIAcore技術を用いて定量的に分析し、速度論的速度定数を導出し、下記の表２、３および４に要約した。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
【表４】
【０１２２】
【表５】
【０１２３】
解離および会合速度定数は、ＢＩＡ分析ソフトウエアによってセンサーグラムの解離および会合領域を分析することによって算出した。Ｄ２Ｅ７とビオチニル化ｒｈＴＮＦα分子との相互作用に、慣用の化学的反応速度論：ゼロ次の解離および一次の会合速度論を仮定した。分析のために、速度論データの分析用の分子モデルを選ぶのに、二価のＤ２Ｅ７抗体の一方の腕と三量体のビオチニル化ｒｈＴＮＦの一方の単位との相互作用のみを考慮した。３回の独立した実験を実施し、結果を別個に分析した。Ｄ２Ｅ７とビオチニル化ｒｈＴＮＦとの相互作用の平均した見かけの解離速度定数(ｋd）は、８．８１±１．０６×１０-5秒-1であり、平均した見かけの会合速度定数(ｋa）は、１．９１±１．２６×１０5Ｍ-1秒-1であった。次いで、見かけの固有解離定数(Ｋd）を、式：Ｋd＝ｋd／ｋaによって算出した。こうして、速度論的パラメータから導いた、ｒｈＴＮＦに対するＤ２Ｅ７の平均Ｋdは、６．０９±３．４２×１０-10Ｍであった。ＩｇＧ１形態のＤ２Ｅ７（表２、３および４に提示）とＩｇＧ４形態のＤ２Ｅ７（表１および実施例２および３に提示）とに対する速度論上の値の僅かな差は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４不変部領域のいずれかの存在に起因する真の差ではなく、むしろ、ＩｇＧ１の速度論的分析に用いた、より正確な抗体濃度測定に起因すると考えられる。したがって、ここに提示したＩｇＧ１形態のＤ２Ｅ７に対する速度論的な値が、Ｄ２Ｅ７抗体の最も正確な速度論的パラメータであると考えられる。
【０１２４】
実施例２：Ｄ２Ｅ７のＣＤＲ３ドメインのアラニン走査突然変異形成
標準的方法を用い、Ｄ２Ｅ７ＶＬおよびＤ２Ｅ７ＶＨ領域のＣＤＲドメイン沿いに、一連のアラニン単一突然変異を導入した。Ｌ鎖の突然変異を図１Ｂに示す（ＬＤ２Ｅ７*．Ａ１、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ３、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ４、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ５、ＬＤ２Ｅ７*．Ａ７およびＬＤ２Ｅ７*．Ａ８：Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３ドメインの、それぞれ第１、３、４、５、７または８位でのアラニン突然変異を有する）。Ｈ鎖の突然変異を図２Ｂに示す（ＨＤ２Ｅ７*．Ａ１、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ２、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ３、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ４、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ５、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ６、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ７、ＨＤ２Ｅ７*．Ａ８およびＨＤ２Ｅ７*．Ａ９：Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３ドメインの、それぞれ第２、３、４、５、６、８、９、１０または１１位でのアラニン突然変異を有する）。野生型Ｄ２Ｅ７ＶＬおよびＶＨで構成される抗体とのｒｈＴＮＦαの相互作用の速度論を、（１）アラニン置換Ｄ２Ｅ７ＶＨと対合させた野生型Ｄ２Ｅ７ＶＬ；（２）アラニン置換Ｄ２Ｅ７ＶＬと対合させた野生型Ｄ２Ｅ７ＶＨ；または（３）アラニン置換Ｄ２Ｅ７ＶＨと対合させたアラニン置換Ｄ２Ｅ７ＶＬで構成される抗体とのそれと比較した。すべての抗体は、完全長ＩｇＧ４分子として試験した。
【０１２５】
ｒｈＴＮＦαとの抗体の相互作用の速度論を、実施例１に記載のとおり、表面プラスモン共鳴によって決定した。異なるＶＨ／ＶＬ対についてのＫoff速度を、下記の表５に要約する：
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
これらの結果は、Ｄ２Ｅ７のＶＬ領域およびＶＨ領域のＣＤＲ３ドメインの位置の大多数は、ただ１個のアラニン残基との置換を受け易いことを立証する。Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３ドメインの第１、４、５もしくは７位、またはＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３ドメインの第２、５、６、８、９もしくは１０位でのただ１個のアラニンの置換は、野生型の両親のＤ２Ｅ７抗体と比較した限りでは、ｈＴＮＦαの結合のオフ速度に有意な効果を及ぼさない。Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３の第８位、またはＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３の第３位でのアラニンの置換は、４倍速いＫoffを与え、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３の第４または１１位でのアラニン置換は、８倍速いＫoffを与えて、これらの位置は、ｈＴＮＦαとの結合に、より決定的であることが示される。しかし、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３ドメインの第１、４、５、７もしくは８位、またはＤ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３ドメインの第２、３、４、５、６、８、９、10もしくは１１位でのただ１個のアラニン置換は、１×１０-3秒-1またはそれ以下のＫoffを有する抗ｈＴＮＦα抗体を依然として生じる。
【０１２８】
実施例３：Ｄ２Ｅ７関連抗体の結合分析
Ｄ２Ｅ７に順次関連する一連の抗体を、実施例１に記載のとおりの表面プラスモン共鳴によって、ｒｈＴＮＦαとのそれらの結合について分析した。試験したＶＬ領域のアミノ酸配列を図１Ａおよび１Ｂに示す。試験したＶＨ領域のアミノ酸配列を図２Ａおよび２Ｂに示す。（完全長ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４抗体、またはｓｃＦｖのいずれかとして示されたフォーマットでの)様々なＶＨ／ＶＬ対についてのＫoff速度を、下記の表６に要約する：
【０１２９】
【表７】
【０１３０】
第９位にトレオニンまたはアラニンのいずれかを有する、Ｄ２Ｅ７、ＬＯＥ７、ＬＯＥ７．ＴおよびＬＯＥ７．Ａから選ばれたＶＬを有する完全長抗体（すなわち、ＩｇＧフォーマット）についての遅いオフ速度(すなわち、Ｋoff≦１×１０-4秒-1）は、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３の第９位が、これら二つの残基によって、Ｋoffに実質的に影響することなく占められ得ることを示す。したがって、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３に関する共通モチーフは、アミノ酸配列：Ｑ−Ｒ−Ｙ−Ｎ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｙ−（Ｔ／Ａ)(SEQ ID NO:３）を含む。更に、第１２位にチロシンまたはアスパラギンのいずれかを有する、Ｄ２Ｅ７、ＶＨ１−Ｄ２．ＮおよびＶＨ１−Ｄ２．Ｙから選ばれたＶＨを有する抗体についての遅いオフ速度(すなわち、Ｋoff≦１×１０-4秒-1）は、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３の第１２位が、これら二つの残基によって、Ｋoffに実質的に影響することなく占められ得ることを示す。したがって、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３に関する共通モチーフは、アミノ酸配列：Ｖ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−(Ｙ／Ｎ)(SEQ ID NO:4）を含む。
【０１３１】
表６に示した結果は、ｓｃＦｖフォーマットでは、２ＳＤ４ＶＬまたはＶＨＣＤＲ３領域を含む抗体は、Ｄ２Ｅ７ＶＬまたはＶＨＣＤＲ３領域を含む抗体と比較して、より速いＫoff(すなわち、Ｋoff≧１×１０-3秒-1）を示すことを立証する。ＶＬＣＤＲ３内では、２ＳＤ４は、第２、５および９位でＤ２Ｅ７と異なる。しかし、上記に考察したとおり、第９位は、Ａｌａ(２ＳＤ４でのように）またはＴｈｒ（Ｄ２Ｅ７でのように）によって、Ｋoffに実質的に影響することなく占められ得る。したがって、２ＳＤ４およびＤ２Ｅ７の比較によって、Ｄ２Ｅ７ＶＬＣＤＲ３の第２および５位は、ともにアルギニンであって、ｈＴＮＦαとの抗体の会合に決定的であるとして特定できる。これらの残基は、抗体結合部位での接触残基として直接関与できるか、またはこの領域での抗体分子の骨格的構造の維持に決定的に寄与できると思われる。第２位の重要性に関しては、Ｌｙｓ（ＥＰＢ１２での）とのＡｒｇ（Ｄ２Ｅ７と同じＶＬＣＤＲ３を有するＬＯＥ７での）の置換は、オフ速度を２倍に加速する。第５位の重要性に関しては、実施例２に記載したとおり、Ａｌａ（ＬＤ２Ｅ７*．Ａ５での）とのＡｒｇ（Ｄ２Ｅ７での）の置換も、オフ速度を２倍に加速する。その上、第２および５位のいずれにもＡｒｇがないと(２ＳＤ４での)オフ速度は５倍も速い。しかし、第５位は、ｈＴＮＦαとの改良された結合に重要ではあるが、この位置での変化は、ＶＬＬＯＥ４、ＶＬＬＯＨ１またはＶＬ０．１Ｈ８に見られるとおり、他の位置での変化によって打ち消され得ることに注目すべきである。
【０１３２】
ＶＨＣＤＲ３内では、第１、７および１２位でＤ２Ｅ７と異なる。しかし、上記に考察したとおり、第１２位は、Ａｓｎ（２ＳＤ４でのように）またはＴｙｒ（Ｄ２Ｅ７でのように）によって、Ｋoffに実質的に影響することなく占められ得る。したがって、２ＳＤ４およびＤ２Ｅ７の比較によって、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３の第１および７位は、ｈＴＮＦαとの結合に決定的であるとして特定できる。上記に考察したとおり、これらの残基は、抗体結合部位での接触残基として直接関与できるか、またはこの領域での抗体分子の骨格的構造の維持に決定的に寄与できると思われる。両位置とも、ｈＴＮＦαとの結合に重要であり、それは、３Ｃ−Ｈ２ＶＨＣＤＲ３（Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３に関して、第１位にバリンからアラニンへの変化を有する）を用いたとき、Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３を用いたときより３倍も速いオフ速度をｓｃＦｖが有するからであるが、しかし、このオフ速度は、２ＳＤ４ＶＨＣＤＲ３（Ｄ２Ｅ７ＶＨＣＤＲ３に関して、第１および７位の双方に変化を有する）を用いたときより依然として４倍も遅い。
【０１３３】
実施例４：Ｄ２Ｅ７の機能的活性
Ｄ２Ｅ７の機能的活性を調べるために、該抗体がｈＴＮＦα活性をin vitroまたはin vivoのいずれでも阻害できる能力を測定するいくつかの検定で、該抗体を用いた。
【０１３４】
Ａ．Ｌ９２９細胞でのＴＮＦαの誘導による細胞毒性の中和
ヒト組換えＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）は、１８〜２４時間のインキュベーション期間後にマウスＬ９２９細胞に細胞毒性を生起する。ヒト抗ｈＴＮＦα抗体を、下記のような、ｒｈＴＮＦαおよび細胞との抗体の同時インキュベーションによるＬ９２９の検定で評価した。抗ｈＴＮＦαＡｂ１００μｌを含む９６穴微量滴定プレートを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ培地を用いて、二重にしたプレート伝いに１／３に系統希釈した。ｒｈＴＮＦα５０μｌを加えて、各試料のウェル中で５００ｐｇ／ｍｌの最終濃度とした。次いで、プレートを室温で３０分間インキュベートした。次に、ＴＮＦα感受性であるＬ９２９マウス線維芽細胞５０μｌを加えて、１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを含む１ウェルあたり、５×１０4の細胞の最終濃度とした。対照は、培地に細胞を加えたものと、ｒｈＴＮＦαに細胞を加えたものとを含んだ。これらの対照、および２ｎｇ／ｍｌ〜８．２ｐｇ／ｍｌにわたるＴＮＦαの標準曲線を用いて、検定の質を決定し、中和の窓口を与えた。次いで、プレートを５％ＣＯ2中で３７℃で終夜（１８〜２４時間）インキュベートした。
【０１３５】
培地１００μｌを各ウェルから除去し、ＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌの３，（４，４−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウム＝ブロミド（ＭＴＴ；Sigma Chemical Co.,St.Louis,Moより商業的に入手できる）５０μｌを加えた。次いで、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。次いで、２０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）５０μｌを各ウェルに加え、プレートを３７℃で終夜インキュベートした。５７０／６３０ｎｍでの光学密度を測定し、各試料について曲線をプロットし、標準的方法によってＩＣ50を決定した。
【０１３６】
様々なＶＬおよびＶＨ対を有するヒト抗体についての、マウスのＭＡＫ１９５ｍＡｂと比較した限りでの代表的な結果を下記の図３および表７に示す。
【０１３７】
【表８】
【０１３８】
図３および表７の結果は、Ｄ２Ｅ７のヒト抗ｈＴＮＦα抗体、および様々なＤ２Ｅ７関連抗体は、ＴＮＦα誘導によるＬ９２９細胞毒性を、マウス抗ｈＴＮＦαｍＡｂであるＭＡＫ１９５のそれとほぼ同等の能力で中和することを立証する。
【０１３９】
もう一連の実験では、ＩｇＧ１形態のＤ２Ｅ７がＴＮＦα誘導Ｌ９２９細胞毒性を中和できる能力を、上記のとおりに調べた。３回の独立した実験から得られた結果、およびその平均を下記に要約する。
【０１４０】
【表９】
この一連の実験は、完全長ＩｇＧ１の形態でのＤ２Ｅ７が、ＴＮＦα誘導Ｌ９２９細胞毒性を、１．２５±０．０１×１０-10の平均ＩＣ50［Ｍ］で中和することを確認した。
【０１４１】
Ｂ．Ｕ−９３７細胞でのＴＮＦα受容体とのＴＮＦαの結合の阻害
ヒト抗ｈＴＮＦα抗体が、細胞の表面でｈＴＮＦα受容体とのｈＴＮＦαの結合を阻害できる能力を、ｈＴＮＦα受容体を発現するヒト組織球細胞系統であるＵ−９３７細胞系統（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１５９３）を用いて調べた。Ｕ−９３７細胞を、１０％ウシ胎児血清（Hyclone A-1111、Hyclone Laboratories,Logan,UT）、Ｌ−グルタミン（４ｎＭ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ）、ペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）で強化したＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。完全長ＩｇＧ抗体の活性を調べるために、１ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Sigma Ｉ-4506、Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）で強化したＰＢＳとともにＵ−９３７細胞を氷上で４５分間前インキュベートし、次いで、細胞を結合用緩衝液で３回洗浄した。受容体結合検定のためには、Ｕ−９３７細胞(５×１０6細胞／ウェル）を、９６穴微量滴定プレート（Costar3799、CostarCorp.,Cambridge,MA）内で結合用緩衝液中で、１２５Ｉ標識化ｒｈＴＮＦα（３×１０-10M；２５μＣｉ／ｍｌ；より入手）とともに、抗ｈＴＮＦαを加えるか、または加えずに、０．２ｍｌの総量でインキュベートした。プレートを氷上で１．５時間インキュベートした。次いで、各試料７５μｌを、ジブチルフタル酸塩（Sigma D-2270、Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）およびジノニルフタル酸塩（ＩＣＮ210733、ICN,Irvine,CA）を含む１．０ｍｌ入り試験管（Sarstedt 72.700、Sarstedt Corp.,Princeton,NJ）に移した。試験管は、ジブチルフタル酸塩およびジノニルフタル酸塩のそれぞれ２：１の体積比の混合物３００ｍｌを含んだ。遊離（すなわち未結合）125Ｉ標識化ｒｈＴＮＦαを、５分間の微量遠心分離によって除去した。次いで、細胞のペレットを含む各試験管端を、微小管鋏（Bel-Art210180001、Bel-Art Products,Pequannock,NJ）を援用して切断した。細胞ペレットは、ｐ６０またはｐ８０ＴＮＦα受容体と125Ｉ標識化ｒｈＴＮＦαを含むが、油混合物の上の水相は、過剰な遊離125Ｉ標識化ｒｈＴＮＦαを含む。すべての細胞ペレットを計数管（Falcon2052、Becton DickinsonLabware,Lincoln Park,NJ）内に捕集し、シンチレーションカウンターで計数した。
【０１４２】
代表的な結果を図４に示す。Ｕ−９３７細胞でのｈＴＮＦα受容体とのｈＴＮＦαの結合のＤ２Ｅ７による阻害についてのＩＣ50値は、これらの実験では約３×１０-10Ｍである。これらの結果は、Ｄ２Ｅ７というヒト抗ｈＴＮＦα抗体は、Ｕ−９３７細胞でのｈＴＮＦα受容体とのｈＴＮＦαの結合を、マウス抗ｈＴＮＦαのｍＡｂであるＮＡＫ１９５のそれとほぼ等価の濃度で阻害することを立証する。
【０１４３】
もう一連の実験では、ＩｇＧ１形態のＤ２Ｅ７がＵ−９３７細胞でのｈＴＮＦα受容体とのｒｈＴＮＦαの結合を阻害できる能力を、上記のとおりに調べた。これらの実験の結果、およびその平均を、下記の表９に要約する。
【０１４４】
【表１０】
この一連の実験は、完全長のＩｇＧ１形態でのＤ２Ｅ７は、Ｕ−９３７細胞でのＴＮＦ受容体の結合を、１．５６±０．１２×１０-10の平均ＩＣ50[Ｍ]で阻害することを確認する。
【０１４５】
個々のｐ５５およびｐ７５受容体と結合する125Ｉ−ｒｈＴＮＦαの結合におけるＤ２Ｅ７の阻害能を調べるため、固相放射線免疫検定を実施した。Ｄ２Ｅ７のＩＣ50値を別個のＴＮＦ受容体について測定するため、様々な濃度の抗体を、３×１０-10の濃度の125Ｉ−ｒｈＴＮＦαとともにインキュベートした。次いで、ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体のいずれかを含む別個のプレートで、混合物を用量依存方式で試験した。結果を下記の表１０に要約する：
【０１４６】
【表１１】
Ｄ２Ｅ７によるＵ９３７細胞でのｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ受容体との125Ｉ−ｒｈＴＮＦの結合の阻害は、Ｓ字状曲線に従い、各受容体について類似のＩＣ50値を示した。組換えＴＮＦ受容体による固相放射線免疫検定（ＲＩＡ）の実験では、Ｄ２Ｅ７によるｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ受容体との125Ｉ−ｒｈＴＮＦの結合の阻害に対するＩＣ50値は、それぞれ１．４７×１０-9および１．２６×１０-9Ｍとして算出された。固相でのＩＣ50値の減少は、非標識ｒｈＴＮＦも同様のＩＣ50値で阻害したことから、おそらく、ＲＩＡフォーマットでの受容体の、より高い濃度によるものであった。非標識ｒｈＴＮＦによるｐ５５およびｐ７５受容体との125Ｉ−ｒｈＴＮＦの結合の阻害についてのＩＣ50値は、それぞれ２．３１×１０-9および２．７０×１０-9Ｍであった。
【０１４７】
Ｃ．ＨＵＶＥＣでのＥＬＡＭ−１の発現の阻害
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ｒｈＴＮＦαの投与によって、それらの細胞表面で内皮細胞白血球付着分子１（ＥＬＡＭ−１）を発現するよう誘導することができ、これは、ｒｈＴＮＦα投与ＨＵＶＥＣをマウス抗ヒトＥＬＡＭ−１抗体と反応させることによって検出できる。ヒト抗ｈＴＮＦα抗体がＨＵＶＥＣでのＥＬＡＭ−１のこのＴＮＦαに誘導された発現を阻害できる能力を、下記のとおり調べた：ＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ １７３０号）を９６穴プレートに接種し（５×１０4細胞／ウェル）、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、ヒト抗ｈＴＮＦα抗体の系統希釈（１：１０）を、２０〜１００μｇ／ｍｌの抗体で開始して、微量滴定プレート中に調製した。ｒｈＴＮＦαの原液を４．５ｎｇ／ｍｌで調製し、ｒｈＴＮＦαのアリコートを、抗体を含む各ウェルに加え、内容を充分混合した。対照は、培地のみ、培地プラス抗ｈＴＮＦα抗体、および培地プラスｒｈＴＮＦαを包含した。ＨＵＶＥＣのプレートを、その３７℃での終夜インキュベーションから取り出し、培地を各ウェルから静かに吸引した。抗体−ｒｈＴＮＦα混合物２００μｌをＨＵＶＥＣプレートの各ウェルに移した。次いで、ＨＵＶＥＣプレートを３７℃で更に４時間インキュベートした。次に、マウス抗ＥＬＡＭ−１抗体の原液をＲＰＭＩで１：１，０００に希釈した。ＨＵＶＥＣプレートの各ウェルの培地を静かに吸引し、５０μｌ／ウェルの抗ＥＬＡＭ−１抗体液を加え、ＨＵＶＥＣプレートを室温で６０分インキュベートした。125Ｉ標識化抗マウスＩｇ抗体液をＲＰＭＩ中に調製した（５０μｌ中約５０，０００ｃｐｍ）。ＨＵＶＥＣプレートの各ウェルの培地を静かに吸引し、ウェルをＲＰＭＩで２回洗浄し、125Ｉ標識化抗マウスＩｇ液５０μｌを各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで、各ウェルをＲＰＭＩで３回洗浄した。５％ＳＤＳ１８０μｌを各ウェルに加えて、細胞を溶解させた。次いで、各ウェルからの細胞溶解液を管に移し、シンチレーションカウンターで計数した。
【０１４８】
代表的結果を図５に示す。ＨＵＶＥＣでのＥＬＡＭ−１のｈＴＮＦαで誘導される発現のＤ２Ｅ７による阻害に関するＩＣ50値は、これらの実験では約６×１０-11Ｍである。これらの結果は、Ｄ２Ｅ７のヒト抗ｈＴＮＦα抗体は、ＨＵＶＥＣでのｈＴＮＦα受容体で誘導されるＥＬＡＭ−１の発現を、マウス抗ｈＴＮＦαｍＡｂであるＮＡＫ１９５のそれとほぼ等価の濃度で阻害することを立証する。
【０１４９】
もう一連の実験では、ＩｇＧ１形態のＤ２Ｅ７がＨＵＶＥＣでのｈＴＮＦα受容体で誘導されるＥＬＡＭ−１の発現を阻害できる能力を、上記のとおりにして調べた。３回の独立した実験からの結果、およびそれらの平均を下記の表１１に要約する。
【０１５０】
【表１２】
【０１５１】
この一連の実験は、完全長のＩｇＧ１形態でのＤ２Ｅ７は、ＨＵＶＥＣでのＴＮＦα誘導ＥＬＡＭ−１発現を、１．８５±０．１４×１０-10の平均ＩＣ50［Ｍ］で阻害することを確認する。
【０１５２】
Ｄ２Ｅ７ＩｇＧ１の中和能を、他の２種類の付着分子、すなわちＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１のｒｈＴＮＦ誘導での発現についても調べた。１６時間でのＩＣＡＭ−１の発現についてのｒｈＴＮＦの滴定曲線は、ＥＬＡＭ−１発現の曲線に非常に似ているため、同じ濃度のｒｈＴＮＦを、抗体中和実験に用いた。様々な濃度のＤ２Ｅ７の存在下で、ＨＵＶＥＣをｒｈＴＮＦとともに３７℃のＣＯ2恒温器内で１６時間インキュベートし、マウス抗ＩＣＡＭ−１抗体、およびその後の125Ｉ標識化ヒツジ抗マウス抗体によって測定した。
【０１５３】
ＶＣＡＭ−１発現の阻害を試験する実験の手順は、ＥＬＡＭ−１発現のための手順と同じであるが、抗ＥＬＡＭ−１ＭＡｂに代えて、抗ＶＣＡＭ−１ＭＡｂを用いた。３回の独立した実験を実施し、ＩＣ50値を算出した。無関係のヒトＩｇＧ１抗体は、ＶＣＡＭ−１の発現を阻害しなかった。結果を下記の表１２に要約する：
【０１５４】
【表１３】
【０１５５】
これらの実験は、ヒトの一次臍静脈内皮細胞へのｒｈＴＮＦの投与は、４時間で付着分子：ＥＬＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の最適発現へと、かつ１６時間でＩＣＡＭ−１の上方調節された最大の発現へと導いた：Ｄ２Ｅ７は、３種類の付着分子の発現を用量依存方式で阻害することができた。ＥＬＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の阻害に関するＩＣ50値は、それぞれ１．８５×１０-10、２．１７×１０-10および１．０１×１０-10Ｍであった。これらの値は非常に近く、ＥＬＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の誘導を発現するにはｒｈＴＮＦ活性化シグナルの用量が必要であることを示す。興味深いことに、Ｄ２Ｅ７は、ＩＣＡＭ−１の発現の比較的長期の阻害検定で、同様に効果的であった。ＩＣＡＭ−１の阻害検定は、ＥＬＡＭ−１やＶＣＡＭ−１の阻害検定に要する４時間に対して、１６時間のｒｈＴＮＦおよびＤ２Ｅ７とＨＵＶＥＣとの同時インキュベーションを必要とした。Ｄ２Ｅ７がｒｈＴＮＦに対して遅いオフ速度を有することから、１６時間の同時インキュベーション期間の間に、ＨＵＶＥＣのＴＮＦ受容体による有意な競争は皆無であったと考えられる。
【０１５６】
Ｄ．ｈＴＮＦαのin vivoでの中和
３種類のin vivo系を用いて、Ｄ２Ｅ７がin vivoでｈＴＮＦα活性の阻害に有効であることを立証した。
【０１５７】
Ｉ．Ｄ−ガラクトサミン感作マウスでのＴＮＦで誘導した致死性
Ｄ−ガラクトサミンで感作したマウスへの組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）の注入は、２４時間以内に致死性を生じる。このモデルでヒト抗ｈＴＮＦα抗体がｈＴＮＦαをin vivoで中和できることを調べるため、ＰＢＳ中の様々な濃度のＤ２Ｅ７−ＩｇＧ１または対照タンパク質を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに腹腔内（i.p.）注射した。３０分後、ＰＢＳ中のｒｈＴＮＦα１μｇ、およびＤ−ガラクトサミン２０ｍｇ、ｉ．ｐ．にマウスを挑戦させ、２４時間後に観察した。ｒｈＴＮＦαおよびＤ−ガラクトサミンのこれらの量は、８０〜９０％の致死率を達成するよう予め決定した。
【０１５８】
代表的な結果を、生存率の％対抗体濃度の棒グラフとして表し、図６に示す。黒い棒がＤ２Ｅ７を表すのに対し、斜線の棒はＭＡＫ１９５を表す。マウス１匹あたり２．５〜２５μｇの注入は、ＴＮＦαに誘導される致死性から動物を防護した。ＥＤ50値は約１〜２．５μｇ／マウスである。正の対照の抗体であるＭＡＫ１９５は、その防護能力が同様であった。ｒｈＴＮＦα不在下でのＤ２Ｅ７の注入は、マウスにいかなる不都合な効果もなかった。非特異的ヒトＩｇＧ１抗体の注入は、ＴＮＦα誘導致死性からのいかなる防護も与えなかった。
【０１５９】
第二の実験では、４９匹のマウスを７群に等分した。各群には、様々な用量のＤ２Ｅ７を３０分前に与えてから、ＬＤ80の用量のｒｈＴＮＦ／Ｄ−ガラクトサミン混合物（１マウスあたりｒｈＴＮＦ１．０μｇおよびＤ−ガラクトサミン２０ｍｇ）を与えた。対照の群７には、正常なヒトＩｇＧ１κ抗体を２５μｇ／マウスの用量で与えた。２４時間後にマウスを調べた。各群についての生存率を、下記の表１３に要約する。
【０１６０】
【表１４】
【０１６１】
II．ＴＮＦで誘導されるウサギの発熱の阻害
ウサギでのｒｈＴＮＦで誘導される発熱応答の阻害におけるＤ２Ｅ７の薬効を調べた。体重約２．５ｋｇのＮＺＷ系雌ウサギ３匹の群に、それぞれ、Ｄ２Ｅ７、ｒｈＴＮＦ、およびＤ２Ｅ７とｒｈＴＮＦとの免疫複合体を静脈内注射した。Ｋａｙｅ熱記録装置に接続したサーミスタのプローブによって、直腸温を１分ごとに約４時間測定した。５μｇ／ｋｇとして注入した、生理食塩水中の組換えヒトＴＮＦは、０．４℃を超える温度の上昇を注射の約４５分後に誘発した。生理食塩水中に１３８μｇ／ｋｇの用量での抗体製剤自体は、投与の１４０分後までウサギに温度上昇を全く誘発しなかった。以後のすべての実験では、Ｄ２Ｅ７または対照試薬（ヒトＩｇＧ１または生理食塩水担体）をウサギに静脈内注射した後、１５分後に、生理食塩水中のｒｈＴＮＦを５μｇ／ｋｇとして静脈内注射した。いくつかの実験の代表的な結果を、下記の表１４に要約する。
【０１６２】
【表１５】
【０１６３】
１４μｇ／ｋｇの用量でのＤ２Ｅ７の静脈内事前投与は、生理食塩水のみ事前投与したウサギに比して、発熱応答を部分的に阻害した。１３７μｇ／ｋｇで投与したＤ２Ｅ７は、同じ実験でのｒｈＴＮＦの発熱応答を完全に抑制した。第二の実験では、２４μｇ／ｋｇで投与したＤ２Ｅ７は、やはり、生理食塩水のみ事前投与したウサギに比して、発熱応答を部分的に阻害した。この実験でのＤ２Ｅ７対ｒｈＴＮＦのモル比は１／６：１であった。第三の実験では、４８μｇ／ｋｇで静脈内注射したＤ２Ｅ７(Ｄ２Ｅ７：ｒｈＴＮＦのモル比＝３．３：１）は、生理食塩水中の３０μｇ／ｋｇで対照ヒトＩｇＧ１を事前投与したウサギに比して、温度上昇を完全に抑制した。最後の実験では、ｒｈＴＮＦに対する非常に高いモル比（５５：１）でＤ２Ｅ７(７９２μｇ／ｋｇ）を事前投与されたウサギは、観察４時間までのいかなる時点でも、温度のいかなる上昇も発症しなかった。５５：１のモル比で３７℃で１時間インキュベートした、Ｄ２Ｅ７とｒｈＴＮＦとの混合物から生成した免疫複合体のウサギへの投与も、同じ実験で、いかなる温度上昇も誘発しなかった。
【０１６４】
III．Ｔｇ１９７トランスジェニックマウスでの多発性関節炎の防護
疾病の発症に対するＤ２Ｅ７の効果を、関節炎のトランスジェニックマウスのモデルで調査した。ヒト野生型ＴＮＦを発現する（コーディング配列を越えた３’領域が修飾されている）トランスジェニックマウス（Tg197）を生成し、これらのマウスは、生後４〜７週に１００％の発生率で慢性多発性関節炎を発症する［多発性Tg197モデルのこれ以上の説明についてはEMBO J.(1991)10:4025-4031を参照されたい］。
【０１６５】
トランスジェニックな動物は、生後３日にＰＣＲによって同定した。トランスジェニックマウスの同腹仔を６群に分けた。生後１５日に、スロットブロットハイブリダイゼーション分析によってトランスジェニックマウスを確認した。６群の処理プロトコルは、次のとおりである：群１＝処理なし；群２＝生理食塩水(担体)；群３＝１．５μｇ／ｇでのＤ２Ｅ７；群４＝１５μｇ／ｇでのＤ２Ｅ７；群５＝３０μｇ／ｇでのＤ２Ｅ７；群６＝対照として３０μｇ／ｇでのイソタイプ。非トランスジェニックマウスを有する同腹仔も含めて、対照として役立てた（群７＝非トランスジェニック；処理なし）。各群には、指示された処理の週３回の腹腔内注射を与えた。注射は１０週間継続した。毎週、各動物について関節の形態学での巨視的変化を記録した。１０週目に、すべてのマウスを殺し、マウスの組織をホルマリン中に捕集した。組織の顕微鏡検査を実施した。
【０１６６】
毎週の初めに、グラムでの動物の体重を各マウスについて計った。同時に、関節の大きさの測定（ｍｍで）も、疾病の重篤度の測定として実施した。関節の大きさは、マイクロメータ装置を用い、後右足首での３回の測定の平均として確定した。毎週、関節炎の評点を次のとおり記録した：０＝関節炎なし（正常な外見および屈曲）；＋＝軽い関節炎（関節の歪み）；＋＋＝程ほどの関節炎(腫脹、関節の変形)；および＋＋＋＝重い関節炎（屈曲と、ひどく損なわれた運動とで検出される強直）。関節切片のヘマトキシリン／エオシン染色に基づく組織病理学的評点は、次のとおりである：０＝検出できる疾病なし；１＝滑液膜の増殖；２＝重度の滑液の濃化；３＝軟骨の破壊および骨の侵食。
【０１６７】
Tg197トランスジェニック関節炎マウスの平均の関節の大きさに対するＤ２Ｅ７投与の効果を、図９のグラフに示す。Tg197トランスジェニックマウスの生後１１週での組織病理学的および関節炎的評点を、下記の表１５に要約する：
【０１６８】
【表１６】
【０１６９】
この実験は、Ｄ２Ｅ７抗体が、野生型ヒトＴＮＦ（Tg197）を発現するトランスジェニックマウスに対する明確で好都合な効果を有し、研究期間後も明白な関節炎を伴わないことを立証する。
【０１７０】
Ｅ．他種からのＴＮＦαのＤ２Ｅ７による中和
Ｄ２Ｅ７の結合特異性を、Ｌ９２９細胞毒性検定（上記の実施例４、サブセクションＡで記載したとおり）を用い、様々な霊長類の種およびマウスからの腫瘍壊死因子を中和できるその能力によって調べた。結果を、下記の表１６に要約する：
【０１７１】
【表１７】
表１６の結果は、Ｄ２Ｅ７が、５種の霊長類のＴＮＦαの活性をヒトＴＮＦαとほぼ等しく中和でき、その上、イヌＴＮＦα（ヒトＴＮＦαより約１／１０）、およびブタとマウスのＴＮＦα（ヒトＴＮＦαより約１／１，０００未満）の活性を中和できることを立証する。その上、液相ｒｈＴＮＦαとのＤ２Ｅ７の結合は、他のサイトカイン、例えばリンホトキシン（ＴＮＦβ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮγおよびＴＧＦβによっては阻害されず、ＤＮＡが、リガンドであるＴＮＦαに対して非常に特異的であることを示した。
【０１７２】
Ｆ．Ｄ２Ｅ７とともにインキュベートしたヒト全血によって放出されるサイトカインの欠如
この実施例では、Ｄ２Ｅ７がそれ自体で、正常なヒトの血球を、サイトカインを分泌し、細胞表面の分子を脱落させるよう誘導できることを調べた。異なる３種類の正常な供与体からの、様々な濃度に希釈した全血とともに、Ｄ２Ｅ７を２４時間インキュベートした。同時に、ＬＰＳの正の対照を、免疫担当血球を刺激してサイトカインを分泌させるよう予め決定した濃度で行動させた。上清を採集し、一連の１０種類のサイトカイン、受容体および付着分子のＥＬＩＳＡキット：すなわちＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体作用薬、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、可溶性ＴＮＦ受容体Ｉ、可溶性ＴＮＦ受容体II、可溶性ＩＣＡＭ−１および可溶性Ｅ−セレクチン中で試験した。３４３μｇ／ｍｌまでの濃度でのＤ２Ｅ７抗体との同時インキュベーションの結果として測定された、有意量のサイトカイン、または脱落した細胞表面分子は皆無であった。抗体の添加なしの対照培養体も、何ら測定可能量のサイトカインを生産しなかったのに対して、ＬＰＳと同時培養の対照は、高いｐｇないし低いｎｇの範囲の増大した値を生じた。これらの結果は、Ｄ２Ｅ７が、生体外での培養体で全血球を、正常レベルを超えてサイトカインを分泌するか、または細胞表面タンパク質を脱落させるよう誘導しなかったことを示す。
【０１７３】
本開示の形成部分は、添付の配列表であり、その内容を下記の表に要約する。
【表１８】
等価のもの
当業者は、本明細書に記載の発明の特定の実施態様と等価である多くのものを、定型的であることを超えない実験を用いて認識し、または確定できると思われる。そのような等価のものは、下記のクレームに包含されるものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＮＦαを抗体と、ヒトＴＮＦα活性が阻害されるように接触させることを含む、ヒトＴＮＦα活性を阻害する方法であって、ここに、この抗体はヒトＴＮＦαから１×１０-8Ｍ以下のＫd及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分であり、この両者は表面プラズモン共鳴により測定されたものであり、且つ該抗体はヒトＴＮＦαの細胞障害性を、標準イン・ビトロＬ９２９アッセイで１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50で中和する、上記の方法。
【請求項２】
ヒトＴＮＦαを抗体と、ヒトＴＮＦα活性が阻害されるように接触させることを含む、ヒトＴＮＦα活性を阻害する方法であって、ここに、この抗体は下記の特性を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分である上記の方法：
ａ）ヒトＴＮＦαから、表面プラズモン共鳴により測定して１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離し；
ｂ）SEQ ID NO:３のアミノ酸配列、又は位置１、４、５、７若しくは８における単一アラニン置換又は位置１、３、４、６、７、８及び／若しくは９における１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有し；
ｃ）SEQ ID NO:４のアミノ酸配列、又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１における単一アラニン置換又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／若しくは１２における１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
【請求項３】
ヒトＴＮＦαを抗体と、ヒトＴＮＦα活性が阻害されるように接触させることを含む、ヒトＴＮＦα活性を阻害する方法であって、ここに、この抗体は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分である、上記の方法。
【請求項４】
ヒトＴＮＦαから、表面プラズモン共鳴により測定して１×１０-8Ｍ以下のＫd及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離し且つヒトＴＮＦαの細胞障害性を、標準イン・ビトロＬ９２９アッセイで１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50で中和する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体をヒト患者に、そのヒト患者におけるヒトＴＮＦα活性が阻害されるように投与する、当該利用。
【請求項５】
下記の特性を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体をヒト患者に、そのヒト患者におけるヒトＴＮＦα活性が阻害されるように投与する、当該利用：
ａ）ヒトＴＮＦαから、表面プラズモン共鳴により測定して１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離し；
ｂ）SEQ ID NO:３のアミノ酸配列、又は位置１、４、５、７若しくは８における単一アラニン置換又は位置１、３、４、６、７、８及び／若しくは９におけるにおける１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有し；
ｃ）SEQ ID NO:４のアミノ酸配列、又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１における単一アラニン置換又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／若しくは１２における１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
【請求項６】
SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体をヒト患者に、そのヒト患者におけるヒトＴＮＦα活性が阻害されるように投与する、上記の利用。
【請求項７】
抗体Ｄ２Ｅ７の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体をヒト患者に、そのヒト患者におけるヒトＴＮＦα活性が阻害されるように投与する、上記の利用。
【請求項８】
病気が自己免疫疾患である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項９】
病気が感染性疾患である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１０】
病気が移植拒絶又は移植片対宿主病である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１１】
病気が悪性疾患である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１２】
病気が肺病である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１３】
病気が腸疾患である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１４】
病気が心臓病である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１５】
病気が敗血症である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１６】
抗体をヒト患者に、サイトカインインターロイキン６(ＩＬ−６)と一緒に投与するか又は５００ｐｇ／ｍｌより高い血清若しくは血漿ＩＬ−６濃度を有するヒト患者に投与する、請求項１５に記載の利用。
【請求項１７】
病気がリウマチ様関節炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１８】
病気がリウマチ様脊椎炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１９】
病気が骨関節炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２０】
病気が通風関節炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２１】
病気がアレルギーである、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２２】
病気が多発性硬化症である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２３】
病気が自己免疫性糖尿病である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２４】
病気が自己免疫性ブドウ膜炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２５】
病気がネフローゼ症候群である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２６】
病気が炎症性骨疾患である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２７】
病気が骨吸収病である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２８】
病気がアルコール性肝炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２９】
病気がウイルス性肝炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３０】
病気が凝固障害である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３１】
病気が火傷である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３２】
病気が再潅流傷害である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３３】
病気がケロイド形成である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３４】
病気が瘢痕組織形成である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３５】
病気が発熱である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３６】
ヒトＴＮＦαから、表面プラズモン共鳴により測定して、１×１０-8Ｍ以下のＫd及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離し且つヒトＴＮＦαの細胞障害性を標準イン・ビトロＬ９２９アッセイで１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50で中和する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体を患者にその病気が治療されるように投与する当該利用。
【請求項３７】
下記の特徴を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体を患者にその病気が治療されるように投与する当該利用：
ａ）ヒトＴＮＦαから、表面プラズモン共鳴により測定して１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離し；
ｂ）SEQ ID NO:３のアミノ酸配列、又は位置１、４、５、７若しくは８における単一アラニン置換又は位置１、３、４、６、７、８及び／若しくは９におけるにおける１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有し；
ｃ）SEQ ID NO:４のアミノ酸配列、又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１における単一アラニン置換又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／若しくは１２における１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
【請求項３８】
SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体を患者に、その病気が治療されるように投与する当該利用。
【請求項３９】
抗体Ｄ２Ｅ７の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体を患者に、その病気が治療されるように投与する当該利用。
【請求項４０】
病気が自己免疫疾患である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４１】
病気が感染性疾患である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４２】
病気が移植拒絶又は移植片対宿主病である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４３】
病気が悪性疾患である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４４】
病気が肺病である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４５】
病気が腸疾患である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４６】
病気が心臓病である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４７】
病気が敗血症である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４８】
抗体をヒト患者に、サイトカインインターロイキン６(ＩＬ−６)と一緒に投与するか又は５００ｐｇ／ｍｌより高濃度の血清若しくは血漿ＩＬ−６を有するヒト患者に投与する、請求項４７に記載の利用。
【請求項４９】
病気がリウマチ様関節炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５０】
病気がリウマチ様脊椎炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５１】
病気が骨関節炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５２】
病気が通風関節炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５３】
病気がアレルギーである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５４】
病気が多発性硬化症である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５５】
病気が自己免疫性糖尿病である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５６】
病気が自己免疫性ブドウ膜炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５７】
病気がネフローゼ症候群である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５８】
病気が炎症性骨疾患である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５９】
病気が骨吸収病である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６０】
病気がアルコール性肝炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６１】
病気がウイルス性肝炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６２】
病気が凝固障害である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６３】
病気が火傷である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６４】
病気が再潅流傷害である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６５】
病気がケロイド形成である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６６】
病気が瘢痕組織形成である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６７】
病気が発熱である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６８】
単離されたヒト抗体を製薬上許容し得るキャリアーと組合せる、請求項４、５、６、７、３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６９】
単離されたヒト抗体を少なくとも一種の追加の治療剤と共に投与する、請求項４、５、６、７、３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７０】
患者がヒトである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７１】
病気が敗血症性ショックである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７２】
病気がエンドトキシン性ショックである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７３】
病気がグラム陰性菌による敗血症である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７４】
病気が毒性ショック症候群である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７５】
病気がマラリアである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７６】
病気が髄膜炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７７】
病気が悪液質である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７８】
病気がＡＩＤＳである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７９】
病気が細菌性髄膜炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８０】
病気がＡＩＤＳ関連合併症(ＡＲＣ)である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８１】
病気が移植後のサイトメガロウイルス感染である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８２】
病気が感染及び感染後の悪液質による熱及び筋肉痛である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８３】
病気が同種異系移植片拒絶である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８４】
病気が腫瘍増殖の刺激である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８５】
病気が悪性疾患における転移の可能性の増大及び細胞障害性の媒介である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８６】
病気が腫瘍増殖又は転移の阻止である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８７】
病気が成人呼吸窮迫症候群である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８８】
病気がショック肺である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８９】
病気が慢性肺炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９０】
病気が肺サルコイドーシスである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９１】
病気が肺繊維症である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９２】
病気が珪肺症である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９３】
病気が炎症性腸疾患、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９４】
病気が特発性炎症性腸疾患、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９５】
病気がクローン病である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９６】
病気が潰瘍性大腸炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９７】
病気が心臓虚血である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９８】
病気が心不全である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９９】
病気が肝炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項１００】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である敗血症の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１０１】
抗体を、ヒト患者に、サイトカインインターロイキン６(ＩＬ−６)と一緒に投与するか又は５００ｐｇ／ｍｌより高い血清若しくは血漿ＩＬ−６濃度を有するヒト患者に投与する、請求項１００に記載の利用。
【請求項１０２】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である自己免疫疾患の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１０３】
自己免疫疾患を、リウマチ様関節炎、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎及び通風関節炎よりなる群から選択する、請求項１０２に記載の利用。
【請求項１０４】
自己免疫疾患を、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎及びネフローゼ症候群よりなる群から選択する、請求項１０２に記載の利用。
【請求項１０５】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である感染性疾患の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１０６】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である移植拒絶又は移植片対宿主病の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１０７】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である悪性疾患の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１０８】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である肺病の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１０９】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である腸疾患の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１１０】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である心臓病の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１１１】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である炎症性骨疾患、骨吸収病、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、凝固障害、火傷、再潅流傷害、ケロイド形成、瘢痕組織形成、発熱、歯周病、肥満及び照射毒性よりなる群から選択する病気の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１】
ヒトＴＮＦαを抗体と、ヒトＴＮＦα活性が阻害されるように接触させることを含む、ヒトＴＮＦα活性を阻害する方法であって、ここに、この抗体はヒトＴＮＦαから１×１０-8Ｍ以下のＫd及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分であり、この両者は表面プラズモン共鳴により測定されたものであり、且つ該抗体はヒトＴＮＦαの細胞障害性を、標準イン・ビトロＬ９２９アッセイで１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50で中和する、上記の方法。
【請求項２】
ヒトＴＮＦαを抗体と、ヒトＴＮＦα活性が阻害されるように接触させることを含む、ヒトＴＮＦα活性を阻害する方法であって、ここに、この抗体は下記の特性を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分である上記の方法：
ａ）ヒトＴＮＦαから、表面プラズモン共鳴により測定して１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離し；
ｂ）SEQ ID NO:３のアミノ酸配列、又は位置１、４、５、７若しくは８における単一アラニン置換又は位置１、３、４、６、７、８及び／若しくは９における１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有し；
ｃ）SEQ ID NO:４のアミノ酸配列、又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１における単一アラニン置換又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／若しくは１２における１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
【請求項３】
ヒトＴＮＦαを抗体と、ヒトＴＮＦα活性が阻害されるように接触させることを含む、ヒトＴＮＦα活性を阻害する方法であって、ここに、この抗体は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分である、上記の方法。
【請求項４】
ヒトＴＮＦαから、表面プラズモン共鳴により測定して１×１０-8Ｍ以下のＫd及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離し且つヒトＴＮＦαの細胞障害性を、標準イン・ビトロＬ９２９アッセイで１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50で中和する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体をヒト患者に、そのヒト患者におけるヒトＴＮＦα活性が阻害されるように投与する、当該利用。
【請求項５】
下記の特性を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体をヒト患者に、そのヒト患者におけるヒトＴＮＦα活性が阻害されるように投与する、当該利用：
ａ）ヒトＴＮＦαから、表面プラズモン共鳴により測定して１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離し；
ｂ）SEQ ID NO:３のアミノ酸配列、又は位置１、４、５、７若しくは８における単一アラニン置換又は位置１、３、４、６、７、８及び／若しくは９におけるにおける１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有し；
ｃ）SEQ ID NO:４のアミノ酸配列、又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１における単一アラニン置換又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／若しくは１２における１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
【請求項６】
SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体をヒト患者に、そのヒト患者におけるヒトＴＮＦα活性が阻害されるように投与する、上記の利用。
【請求項７】
抗体Ｄ２Ｅ７の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体をヒト患者に、そのヒト患者におけるヒトＴＮＦα活性が阻害されるように投与する、上記の利用。
【請求項８】
病気が自己免疫疾患である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項９】
病気が感染性疾患である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１０】
病気が移植拒絶又は移植片対宿主病である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１１】
病気が悪性疾患である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１２】
病気が肺病である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１３】
病気が腸疾患である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１４】
病気が心臓病である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１５】
病気が敗血症である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１６】
抗体をヒト患者に、サイトカインインターロイキン６(ＩＬ−６)と一緒に投与するか又は５００ｐｇ／ｍｌより高い血清若しくは血漿ＩＬ−６濃度を有するヒト患者に投与する、請求項１５に記載の利用。
【請求項１７】
病気がリウマチ様関節炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１８】
病気がリウマチ様脊椎炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項１９】
病気が骨関節炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２０】
病気が通風関節炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２１】
病気がアレルギーである、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２２】
病気が多発性硬化症である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２３】
病気が自己免疫性糖尿病である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２４】
病気が自己免疫性ブドウ膜炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２５】
病気がネフローゼ症候群である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２６】
病気が炎症性骨疾患である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２７】
病気が骨吸収病である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２８】
病気がアルコール性肝炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項２９】
病気がウイルス性肝炎である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３０】
病気が凝固障害である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３１】
病気が火傷である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３２】
病気が再潅流傷害である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３３】
病気がケロイド形成である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３４】
病気が瘢痕組織形成である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３５】
病気が発熱である、請求項４、５、６及び７の何れか一つに記載の利用。
【請求項３６】
ヒトＴＮＦαから、表面プラズモン共鳴により測定して、１×１０-8Ｍ以下のＫd及び１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離し且つヒトＴＮＦαの細胞障害性を標準イン・ビトロＬ９２９アッセイで１×１０-7Ｍ以下のＩＣ50で中和する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体を患者にその病気が治療されるように投与する当該利用。
【請求項３７】
下記の特徴を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体を患者にその病気が治療されるように投与する当該利用：
ａ）ヒトＴＮＦαから、表面プラズモン共鳴により測定して１×１０-3ｓ-1以下のＫoff速度定数で解離し；
ｂ）SEQ ID NO:３のアミノ酸配列、又は位置１、４、５、７若しくは８における単一アラニン置換又は位置１、３、４、６、７、８及び／若しくは９におけるにおける１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:３から改変されたアミノ酸配を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを有し；
ｃ）SEQ ID NO:４のアミノ酸配列、又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０若しくは１１における単一アラニン置換又は位置２、３、４、５、６、８、９、１０、１１及び／若しくは１２における１〜５の保存的アミノ酸置換によりSEQ ID NO:４から改変されたアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインを有する。
【請求項３８】
SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体を患者に、その病気が治療されるように投与する当該利用。
【請求項３９】
抗体Ｄ２Ｅ７の、ＴＮＦα活性が有害な病気の治療のための医薬の製造における利用であって、該抗体を患者に、その病気が治療されるように投与する当該利用。
【請求項４０】
病気が自己免疫疾患である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４１】
病気が感染性疾患である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４２】
病気が移植拒絶又は移植片対宿主病である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４３】
病気が悪性疾患である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４４】
病気が肺病である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４５】
病気が腸疾患である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４６】
病気が心臓病である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４７】
病気が敗血症である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項４８】
抗体をヒト患者に、サイトカインインターロイキン６(ＩＬ−６)と一緒に投与するか又は５００ｐｇ／ｍｌより高濃度の血清若しくは血漿ＩＬ−６を有するヒト患者に投与する、請求項４７に記載の利用。
【請求項４９】
病気がリウマチ様関節炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５０】
病気がリウマチ様脊椎炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５１】
病気が骨関節炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５２】
病気が通風関節炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５３】
病気がアレルギーである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５４】
病気が多発性硬化症である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５５】
病気が自己免疫性糖尿病である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５６】
病気が自己免疫性ブドウ膜炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５７】
病気がネフローゼ症候群である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５８】
病気が炎症性骨疾患である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項５９】
病気が骨吸収病である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６０】
病気がアルコール性肝炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６１】
病気がウイルス性肝炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６２】
病気が凝固障害である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６３】
病気が火傷である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６４】
病気が再潅流傷害である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６５】
病気がケロイド形成である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６６】
病気が瘢痕組織形成である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６７】
病気が発熱である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６８】
単離されたヒト抗体を製薬上許容し得るキャリアーと組合せる、請求項４、５、６、７、３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項６９】
単離されたヒト抗体を少なくとも一種の追加の治療剤と共に投与する、請求項４、５、６、７、３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７０】
患者がヒトである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７１】
病気が敗血症性ショックである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７２】
病気がエンドトキシン性ショックである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７３】
病気がグラム陰性菌による敗血症である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７４】
病気が毒性ショック症候群である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７５】
病気がマラリアである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７６】
病気が髄膜炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７７】
病気が悪液質である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７８】
病気がＡＩＤＳである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項７９】
病気が細菌性髄膜炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８０】
病気がＡＩＤＳ関連合併症(ＡＲＣ)である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８１】
病気が移植後のサイトメガロウイルス感染である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８２】
病気が感染及び感染後の悪液質による熱及び筋肉痛である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８３】
病気が同種異系移植片拒絶である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８４】
病気が腫瘍増殖の刺激である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８５】
病気が悪性疾患における転移の可能性の増大及び細胞障害性の媒介である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８６】
病気が腫瘍増殖又は転移の阻止である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８７】
病気が成人呼吸窮迫症候群である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８８】
病気がショック肺である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項８９】
病気が慢性肺炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９０】
病気が肺サルコイドーシスである、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９１】
病気が肺繊維症である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９２】
病気が珪肺症である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９３】
病気が炎症性腸疾患、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９４】
病気が特発性炎症性腸疾患、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９５】
病気がクローン病である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９６】
病気が潰瘍性大腸炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９７】
病気が心臓虚血である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９８】
病気が心不全である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項９９】
病気が肝炎である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れか一つに記載の利用。
【請求項１００】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である敗血症の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１０１】
抗体を、ヒト患者に、サイトカインインターロイキン６(ＩＬ−６)と一緒に投与するか又は５００ｐｇ／ｍｌより高い血清若しくは血漿ＩＬ−６濃度を有するヒト患者に投与する、請求項１００に記載の利用。
【請求項１０２】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である自己免疫疾患の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１０３】
自己免疫疾患を、リウマチ様関節炎、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎及び通風関節炎よりなる群から選択する、請求項１０２に記載の利用。
【請求項１０４】
自己免疫疾患を、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎及びネフローゼ症候群よりなる群から選択する、請求項１０２に記載の利用。
【請求項１０５】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である感染性疾患の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１０６】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である移植拒絶又は移植片対宿主病の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１０７】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である悪性疾患の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１０８】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である肺病の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１０９】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である腸疾患の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１１０】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である心臓病の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【請求項１１１】
下記の(ａ)又は(ｂ)の単離されたヒト抗体又はその抗原結合部分の、ＴＮＦα活性が有害である炎症性骨疾患、骨吸収病、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、凝固障害、火傷、再潅流傷害、ケロイド形成、瘢痕組織形成、発熱、歯周病、肥満及び照射毒性よりなる群から選択する病気の治療のための医薬の製造における利用：
(ａ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体
(ｂ)SEQ ID NO:１のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)及びSEQ ID NO:２のアミノ酸配列から１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／若しくは付加により得られるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)を有する単離されたヒト抗体であって、(ａ)に記載の抗体と同じ特性を有する単離されたヒト抗体。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−２０９１１９（Ｐ２０１０−２０９１１９Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４９０５３（Ｐ２０１０−１４９０５３）
【出願日】平成２２年６月３０日（２０１０．６．３０）
【分割の表示】特願２００６−２２２６２９（Ｐ２００６−２２２６２９）の分割
【原出願日】平成９年２月１０日（１９９７．２．１０）
【出願人】（５０５０８６４９５）アボット バイオテクノロジーズ リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月３０日（２０１０．６．３０）
【分割の表示】特願２００６−２２２６２９（Ｐ２００６−２２２６２９）の分割
【原出願日】平成９年２月１０日（１９９７．２．１０）
【出願人】（５０５０８６４９５）アボット バイオテクノロジーズ リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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