ヒトＴＳＬＰＤＮＡおよびポリペプチド
【課題】ヒトＴＳＬＰ核酸およびこれらの核酸にコードされるポリペプチドを提供する。
【解決手段】ヒトにおいて同定、単離、精製された新規ヒトＴＳＬＰポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする核酸、ポリペプチドの組換え型を産生するための方法、これらのポリペプチドに対し生成された抗体、これらのポリペプチドに由来する断片化ペプチド、およびその使用。
【解決手段】ヒトにおいて同定、単離、精製された新規ヒトＴＳＬＰポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする核酸、ポリペプチドの組換え型を産生するための方法、これらのポリペプチドに対し生成された抗体、これらのポリペプチドに由来する断片化ペプチド、およびその使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロス・リファレンス
本出願は、１９９８年１１月１３日に提出された米国仮特許出願第６０／１０８，４５
２号の利益を請求し、前記出願の全開示は、本明細書に頼られ、そして援用される。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、精製されそして単離されている新規のヒト胸腺間質リンホポエチン（ｌｙｍ
ｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）（ＴＳＬＰ）ポリペプチドおよびその断片、こうしたポリペプチ
ドをコードする核酸、こうしたポリペプチドの組換え型を産生するための方法、これらの
ポリペプチドに対し生成された抗体、これらのポリペプチドに由来する断片化ペプチド、
およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
Ｂ細胞発生は詳細に研究されてきているが、造血幹細胞から成熟Ｂ細胞につながる経路
には、いまだに空白がある。サイトカインがＢ細胞発生および増殖に影響を与え、そして
重要な役割を果たすことが認識されている。Ｂ細胞発生に影響を与える既知のサイトカイ
ンには、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−ガンマ、および
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が含まれる。
【０００４】
近年、胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）と称される、新規ネズミ増殖因子が、Ｂ細
胞発生および成熟に役割を果たすことが示されてきている。ネズミＴＳＬＰのサイトカイ
ン活性は、ＩＬ−７のものと非常によく似ており、プレＢ細胞の増殖および生存中に必要
とされる（Ｊａｎｅｗａｙら， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版（１９９６）
）。これらのサイトカインはどちらも、ＮＡＧ８／７細胞を維持し（Ｆｒｉｅｎｄら，
Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２２：３２１−３２８（１９９４））、そしてＢリンパ
球新生を持続させることが示されてきている。さらに、成熟Ｂリンパ球は、ＩＬ−７また
はネズミＴＳＬＰいずれかの非存在下で、発生することができない。さらに、ネズミＴＳ
ＬＰは、Ｂ細胞増殖反応の維持において、ＩＬ−７の代わりをすることが可能であると示
されてきている（Ｒａｙら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２６：１０−１６
（１９９６））。したがって、マウスの系において、ＴＳＬＰは、Ｂ細胞発生において重
要な機能を有する。
【０００５】
ＩＬ−７同様、ネズミＴＳＬＰはまた、胸腺細胞および成熟Ｔ細胞も共刺激（ｃｏｓｔ
ｉｍｕｌａｔｅ）する（Ｆｒｉｅｎｄら， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２２：３２
１−３２８（１９９４））。ＩＬ−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）ノックアウトマウスを用いた
研究により、ＩＬ−７、ＴＳＬＰ、または両方が、おそらくＶＤＪ組換え酵素に対するＴ
細胞受容体−ガンマ（ＴＣＲγ）遺伝子の接近可能性を仲介することにより、ＴＣＲγ遺
伝子座の再配置の調節に重要な役割を果たすことが示される（Ｃａｎｄｅｉａｓら， Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ５７：９−１４（１９９７））。したがって、
ネズミＴＳＬＰはまた、Ｔ細胞発生にも重要な役割を果たす。
【０００６】
ネズミＴＳＬＰ受容体およびＩＬ−７受容体は、共に、その情報伝達複合体の一部とし
てＩＬ−７Ｒ α−鎖を用いる（Ｌｅｖｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６２：
６７７−６８３（１９９９））。しかし、ＩＬ−７Ｒ α−鎖が共通であるのにもかかわ
らず、ＩＬ−７およびＴＳＬＰは、異なる機構を通じ、そのリンパ球新生効果を仲介する
ようである。ＩＬ−７はＳｔａｔ５およびＪａｎｕｓファミリーキナーゼＪａｋ１および
Ｊａｋ３の活性化を誘導する一方、ネズミＴＳＬＰはＳｔａｔ５の活性化を誘導するが、
既知のＪａｎｕｓファミリーキナーゼのいずれの活性化も誘導しない（Ｌｅｖｉｎら，
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６２：６７７−６８３（１９９９））。
【０００７】
ネズミＴＳＬＰの重要な機能、並びにネズミの系におけるＢ細胞およびＴ細胞発生およ
び成熟におけるその役割の重要性を考えると、当該技術分野には、ヒトＴＳＬＰを同定し
そして単離し、そしてヒトＢ細胞およびＴ細胞発生および成熟におけるその役割を研究す
る必要性がある。さらに、リンパ球発生および免疫系における継続する興味を考慮すると
、ヒトＴＳＬＰおよびその受容体などの新規タンパク質の発見、同定、および役割は、現
代の分子生物学、生化学、および免疫学の最前線である。知識が増えているのにもかかわ
らず、細胞および免疫反応に関与するタンパク質の同一性および機能に関し、当該技術分
野には、いまだに必要性がある。
【０００８】
別の側面において、未知のタンパク質の一次構造、または配列の同定は、実験の困難な
過程が成就した結果である。未知の試料タンパク質を同定するため、研究者は、当業者に
知られる多様な技術を用い、未知の試料タンパク質の既知のペプチドへの比較に頼ること
が可能である。例えば、タンパク質は、電気泳動、沈降、クロマトグラフィー、配列決定
および質量分析などの技術を用い、日常的に解析される。
【０００９】
特に、未知のタンパク質試料を既知の分子量と比較することにより、未知のタンパク質
の見かけの分子量を決定することが可能になる（Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ．
Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｐｐ． ７
６−７７， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版，（１９９１））。タンパク質分子
量標準は、未知のタンパク質試料の分子量概算を援助するため、商業的に入手可能である
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．カタログ：１３０−１３１（１９
９５））；（Ｊ．Ｌ． Ｈａｒｔｌｅｙ、米国特許第５，４４９，７５８号）。しかし、
分子量標準は、見かけの分子量の正確な概算を可能にするには、未知のタンパク質に十分
近い大きさに相当しない可能性がある。化学的または酵素的手段により断片化にさらされ
、翻訳後修飾またはプロセシングにより修飾され、および／または非共有複合体において
他のタンパク質と結合しているタンパク質の場合、分子量概算における困難の度合いが増
す。
【００１０】
さらに、特定のアミノ酸構成要素に関するタンパク質組成の特有の性質は、タンパク質
内の切断部位の特有の配置を生じる。化学的または酵素的切断によるタンパク質の特定の
断片化は、特有の「ペプチドフィンガープリント」を生じる（Ｄ．Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａ
ｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２−１１０６（１９７７）；
Ｍ． Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ５０：３０９−３１６（１９８
０））。その結果、特定の部位での切断は、既定のタンパク質の、正確な分子量のペプチ
ドへの、再現可能な断片化を生じる。さらに、これらのペプチドは、該ペプチドの等電点
ｐＨを決定する特有の電荷特性を持つ。これらの特有の特性は、多様な電気泳動および他
の技術を用い、利用することが可能である（Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ． Ｍａ
ｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ｐｐ． ７６
−７７， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版（１９９１））。
【００１１】
タンパク質の断片化、特に「保護（ｂｌｏｃｋｅｄ）」Ｎ−末端を持つタンパク質由来
の断片の産生は、さらに、アミノ酸組成解析およびタンパク質配列決定に使用される（Ｐ
． Ｍａｔｓｕｄｉａｒａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６２：１００３５−
１００３８（１９８７）；Ｃ． Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ， ９：８３０−８３８（１９８８））。さらに断片化タンパク質は、免疫感作、
親和性選択（Ｒ．Ａ． Ｂｒｏｗｎ、米国特許第５，１５１，４１２号）、修飾（例えば
リン酸化）部位決定、活性生物学的化合物の生成（Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ．
Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ３００−
３０１（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版（１９９１））、および相同タンパク質
の区別（Ｍ． Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ５０：３０９−３１
６（１９８０））に用いることが可能である。
【００１２】
さらに、未知のタンパク質のペプチドフィンガープリントが得られたならば、質量分析
を用いた、この未知のタンパク質の同定を援助するため、既知のタンパク質のデータベー
スに比較してもよい（Ｗ．Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０１１−５０１５（１９９３）；Ｄ． Ｆｅｎｙｏら，
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １９：９９８−１００５（１９９８））。多様な
コンピューターソフトウェアプログラム、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ
（インターネットサイト：ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｓｃｆ．ｅｄｕ）、ＭｕｌｔｉＩｄ
ｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉ
ｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ（インターネットサイト：ｗｗｗ
．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＿
ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈＦｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インター
ネットサイト：ｗｗｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ
−ｂｉｎ／ｐｒｏｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）などが、こうした比較を容易にするた
め、インターネットを介し、利用可能である。これらのプログラムは、使用者が切断剤お
よび指示された許容範囲の断片化ペプチドの分子量を特定するのを可能にする。該プログ
ラムは、未知のタンパク質の同一性の決定を援助するため、これらの分子量をデータベー
スに保存されているタンパク質分子量情報と比較する。正確な同定には、断片化ペプチド
の数およびこれらのペプチドの正確な分子量に関する正確な情報が必要である。したがっ
て、断片化ペプチドの数および正確な分子量の決定の正確さが増せば、未知のタンパク質
の同定における成功は高まるはずである。
【００１３】
さらに、未知のタンパク質のペプチド消化物は、タンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を
用いて配列決定してもよく、そして生じた配列をデータベースに対し検索してもよい（Ｊ
．Ｋ． Ｅｎｇら， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． ５：９７６−９
８９（１９９４）；Ｍ． ＭａｎｎおよびＭ． Ｗｉｌｍ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．，
６６：４３９０−４３９９（１９９４）；Ｊ．Ａ． ＴａｙｌｏｒおよびＲ．Ｓ． Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．， １１：１０６７−
１０７５（１９９７））。本方法に用いてもよい検索プログラムは、Ｌｕｔｅｆｉｓｋ
９７（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｌｓｂｃ．ｃｏｍ：７０／Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７
．ｈｔｍｌ）、並びに上述のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅ
ＳｅａｒｃｈおよびＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムなど、インターネット上に存在する。し
たがって、遺伝子の配列およびその予測されるタンパク質配列およびペプチド断片を、配
列データベースに添加することは、タンデム型質量分析を用いた、未知のタンパク質の同
定を援助する可能性がある。
【００１４】
このように、当該技術分野にはまた、ペプチド断片化研究における使用に、分子量測定
における使用に、そしてタンデム型質量分析を用いたタンパク質配列決定における使用に
適したポリペプチドに対する必要性もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】Ｊ．Ｌ． Ｈａｒｔｌｅｙ、米国特許第５，４４９，７５８号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｊａｎｅｗａｙら， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版（１９９６）
【非特許文献２】Ｆｒｉｅｎｄら， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２２：３２１−３２８（１９９４）
【非特許文献３】Ｒａｙら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２６：１０−１６（１９９６）
【非特許文献４】Ｃａｎｄｅｉａｓら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ５７：９−１４（１９９７）
【非特許文献５】Ｌｅｖｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６２：６７７−６８３（１９９９）
【非特許文献６】Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ． Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｐｐ． ７６−７７， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版，（１９９１）
【非特許文献７】Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．カタログ：１３０−１３１（１９９５）
【非特許文献８】Ｄ．Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２−１１０６（１９７７）
【非特許文献９】Ｍ． Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ５０：３０９−３１６（１９８０）
【非特許文献１０】Ｐ． Ｍａｔｓｕｄｉａｒａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６２：１００３５−１００３８（１９８７）
【非特許文献１１】Ｃ． Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ９：８３０−８３８（１９８８）
【非特許文献１２】Ｗ．Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０１１−５０１５（１９９３）
【非特許文献１３】Ｄ． Ｆｅｎｙｏら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １９：９９８−１００５（１９９８）
【非特許文献１４】Ｊ．Ｋ． Ｅｎｇら， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． ５：９７６−９８９（１９９４）
【非特許文献１５】Ｍ． ＭａｎｎおよびＭ． Ｗｉｌｍ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６６：４３９０−４３９９（１９９４）
【非特許文献１６】Ｊ．Ａ． ＴａｙｌｏｒおよびＲ．Ｓ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．， １１：１０６７−１０７５（１９９７）
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、単離ヒトＴＳＬＰ核酸およびこれらの核酸にコードされるポリペプチドを提
供することにより、当該技術分野におけるこれらの多様な必要性を満たすのを援助する。
本発明の特定の態様は、配列番号１のＤＮＡ配列を含む単離ＴＳＬＰ核酸分子、および配
列番号２のアミノ酸配列をコードする単離ＴＳＬＰ核酸分子と共に、これらの配列に相補
的な核酸分子に関する。一本鎖および二本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ核酸分子両方と共に、配
列番号１のすべてまたは一部を含む、変性二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする核酸分子が
本発明に含まれる。やはり含まれるのは、配列番号１の配列を含む核酸分子からｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ突然変異誘発により得られる単離核酸分子、配列番号１の配列を含む核酸分子か
ら縮重している単離核酸分子、および本発明のＤＮＡの対立遺伝子変異体である単離核酸
分子である。本発明はまた、これらの核酸分子の発現を指示する組換えベクターおよびこ
れらのベクターで形質転換またはトランスフェクションされている宿主細胞も含む。
【００１８】
さらに、本発明は、上述の核酸を用い、Ｂ細胞系譜またはＴ細胞系譜細胞増殖を誘導す
る能力を有するタンパク質をコードする核酸を同定する方法；ヒト染色体第５番を同定す
る方法；ヒト染色体第５番上の遺伝子をマッピングする方法；特定の疾患、症候群、また
はヒト染色体第５番に関連する他のヒト異常に関連する遺伝子を同定する方法；および細
胞情報伝達および免疫系を研究する方法を含む。
【００１９】
本発明はまた、配列番号１の核酸由来のセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド
の、ＴＳＬＰ遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を阻害するための使用も含む。
本発明はまた、配列番号２の可溶性ポリペプチド部分を含む、これらの核酸分子にコー
ドされる単離ポリペプチドおよびその断片も含む。本発明はさらに、これらのポリペプチ
ドを産生するための方法であって、宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養し、そして
培地から該ポリペプチドを回収することを含む、前記方法を含む。特に、細菌、酵母、植
物、昆虫、および動物細胞におけるこれらのポリペプチドの発現が、本発明に含まれる。
【００２０】
一般的に、本発明のポリペプチドを用い、細胞過程、例えば免疫制御、細胞増殖、細胞
分化、細胞死、細胞移動、細胞・細胞相互作用、および炎症性反応を研究することが可能
である。さらに、これらのポリペプチドを用い、ＴＳＬＰリガンドおよびＴＳＬＰ受容体
と関連するタンパク質を同定することが可能である。
【００２１】
さらに、本発明は、ポリペプチド対構造（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）分子
と関連する活性の潜在的な阻害剤に関しスクリーニングするのに、これらのポリペプチド
を利用するアッセイ、およびＴＳＬＰポリペプチド対構造分子に仲介される疾患の治療の
ための療法剤として、これらのポリペプチドを用いる方法を含む。さらに、阻害剤の設計
にこれらのポリペプチドを用いる方法もまた、本発明の側面である。
【００２２】
本発明はさらに、タンパク質または断片化タンパク質の分子量の概算を可能にする分子
量マーカーとしてこれらのポリペプチドを使用するための方法と共に、電気泳動を用い、
本発明の分子量マーカーを視覚化するための方法も含む。本発明はさらに、未知のタンパ
ク質の等電点の決定のためのマーカーとしてと共に、タンパク質の断片化の程度を確かめ
るためのコントロールとして、本発明のポリペプチドを用いるための方法を含む。
【００２３】
本発明にさらに含まれるのは、これらの決定を補助するキットである。
本発明にさらに含まれるのは、試料核酸および／またはタンパク質の同定を援助するコ
ンピューターデータベースの検索における使用のための、ヒトＴＳＬＰ核酸配列、ポリペ
プチドまたはその断片の予測されるアミノ酸配列、あるいはポリペプチドおよびその断片
の予測されるアミノ酸配列の組み合わせの使用である。
【００２４】
これらのポリペプチドに結合する単離ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、並び
に、ＴＳＬＰポリペプチド精製を援助するこれらの抗体の使用もまた、本発明に含まれる
。さらに、単離抗体を用い、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を確立し、血清な
どの試料中のＴＳＬＰを測定してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ヒトＴＳＬＰ ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２は、ヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明に含まれる核酸分子には、以下のヌクレオチド配列：
名称：ＴＳＬＰ
【００２７】
【化１】
【００２８】
が含まれる。
本発明のヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列には：
名称：ＴＳＬＰ（ポリペプチド）
【００２９】
【化２】
【００３０】
が含まれる。
本発明の核酸の発見により、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターの
構築；発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換されている宿主細胞の構築；
単離されそして精製されている、生物学的に活性があるポリペプチドおよびその断片；Ｔ
ＳＬＰ様活性を有する（例えばＢ細胞系譜またはＴ細胞系譜細胞増殖を誘導する）タンパ
ク質をコードする核酸を同定するためのプローブとしての核酸またはそのオリゴヌクレオ
チドの使用；ヒト染色体第５番を同定するための、核酸またはそのオリゴヌクレオチドの
使用；ヒト染色体第５番上の遺伝子をマッピングするための、核酸またはそのオリゴヌク
レオチドの使用；ガードナー症候群、線腫様結腸ポリポーシス、遺伝性類線維腫（ｄｅｓ
ｍｏｉｄ）疾患、ターコット症候群、および結腸直腸癌を含む、ヒト染色体第５番、およ
び特に染色体第５番のｑ２１−ｑ２２領域と関連する、特定の疾患、症候群、または他の
ヒト異常と関連する遺伝子を同定するための、核酸またはそのオリゴヌクレオチドの使用
；ＴＳＬＰ遺伝子にコードされるポリヌクレオチドの発現を阻害するための、核酸由来の
一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用；Ｂ細胞系譜またはＴ細胞系
譜細胞増殖を誘導するための、こうしたポリペプチドおよび可溶性断片の使用；分子量マ
ーカーとしてのこうしたポリペプチドおよび断片化ペプチドの使用；ペプチド断片化のコ
ントロールとしての、こうしたポリペプチドおよび断片化ペプチド、並びにこれらの試薬
を含むキットの使用；抗体を生成するためのこうしたポリペプチドおよびその断片の使用
；並びにＴＳＬＰポリペプチドを精製するための抗体の使用が可能になる。
【００３１】
核酸分子
特定の態様において、本発明は内因性成分の汚染がない、特定の単離ヌクレオチド配列
に関する。「ヌクレオチド配列」は、別個の断片の形の、またはより大きな核酸構築物の
構成要素としてのポリヌクレオチド分子を指す。核酸分子は、実質的に純粋な型で、そし
て標準的生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ニューヨーク州コールドスプリングハー
バー（１９８９）に略述されているものなど）によるその構成要素ヌクレオチド配列の同
定、操作、および回収を可能にする量または濃度で、少なくとも１度単離されているＤＮ
ＡまたはＲＮＡに由来している。好ましくは、こうした配列は、真核遺伝子に典型的に存
在する、内部非翻訳配列、またはイントロンにより中断されない読み枠の形で提供されお
よび/または構築される。非翻訳ＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列がコード領域の操作または
発現に干渉しない、読み枠の５’または３’に存在していてもよい。
【００３２】
本発明の核酸分子は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ並びに、そのＲＮＡ相補体（
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）も含む。ＤＮＡには、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に
合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれ
る。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号１のｃＤＮＡまたは適切なその断片をプローブと
して用い、慣用技術により単離してもよい。
【００３３】
本発明のＤＮＡ分子は、全長遺伝子と共にそのポリヌクレオチドおよび断片を含む。全
長遺伝子はまた、Ｎ−末端シグナルペプチドも含んでもよい。他の態様は、可溶性型をコ
ードする、例えばシグナルペプチドを含むまたは含まない、該タンパク質の細胞外ドメイ
ンをコードするＤＮＡを含む。
【００３４】
本発明の核酸は、好ましくは、ヒト供給源に由来するが、本発明は、非ヒト種由来のも
のもまた含む。
好ましい配列
本発明の特に好ましいヌクレオチド配列は、上述のように、配列番号１である。配列番
号１のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクローンは、実施例１に記載されるように単離
された。配列番号１のＤＮＡにコードされるアミノ酸の配列を配列番号２に示す。本配列
は、ＴＳＬＰポリヌクレオチドを、Ｂ細胞系譜およびＴ細胞系譜細胞の増殖に影響を与え
る因子の群のメンバーと同定する（Ｒａｙら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
２６：１０−１６（１９９６））；（Ｆｒｉｅｎｄら， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．，
２２：３２１−３２８（１９９４））。
【００３５】
さらなる配列
１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする可能性がある、遺伝暗号の既知の縮重
のため、ＤＮＡ配列は配列番号１に示されるものと異なり、そしてなお配列番号２のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする可能性がある。こうした変異体ＤＮＡ配列は
、沈黙（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよい
し、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。
【００３６】
したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ配列であって：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｂ）配列番号２のポリペプチドを
コードするＤＮＡ；（ｃ）中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）のＤ
ＮＡにハイブリダイズすることが可能であり、そして本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡ；（ｄ）非常にストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにハイブ
リダイズすることが可能であり、そして本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ；およ
び（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に定義されるＤＮＡに対し遺伝暗号の結
果として縮重しており、そして本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡより選択される
、前記単離ＤＮＡ配列を提供する。もちろん、こうしたＤＮＡ配列にコードされるポリペ
プチドが本発明に含まれる。
【００３７】
本明細書において、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づ
き、一般の技術を有する当業者により、容易に決定することが可能である。基本的な条件
は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｖｏｌ． １， ｐｐ．１．１０１−１０４， Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）
に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５ Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤ
Ｓ、１．０ ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホ
ルムアミド、６ Ｘ ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、例えばス
ターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーシ
ョン溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５ Ｘ ＳＳＣ、０．
１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。非常にストリンジェントな条件もまた、例え
ばＤＮＡの長さに基づき、当業者により、容易に決定することが可能である。一般的に、
こうした条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．
２ Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は温度および洗浄
溶液塩濃度は、プローブの長さなどの要因にしたがい、必要に応じ調整してもよいことを
認識するであろう。
【００３８】
本発明の態様としてやはり含まれるのは、以下に記載されるような、不活性化Ｎ−糖鎖
付加部位、不活性化プロテアーゼプロセシング部位、または保存的アミノ酸置換を含む、
ポリペプチド断片およびポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００３９】
別の態様において、本発明の核酸分子はまた、天然配列に少なくとも８０％同一である
ヌクレオチド配列も含む。やはり意図されるのは、核酸分子が、天然配列に少なくとも９
０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、また
は少なくとも９９．９％同一である配列を含む、態様である。
【００４０】
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、
２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ． １２：３８７（１９８４））に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コ
ンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、
バージョン６．０を用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログ
ラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａ
ｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃ
ｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載さ
れるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．， １４：６７４５（１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対す
る３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；
および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、
配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。
【００４１】
本発明はまた、ポリペプチドの産生に有用な単離核酸も提供する。こうしたポリペプチ
ドは、いくつかの慣用技術のいずれにより調製してもよい。ヒトＴＳＬＰポリペプチド、
または望ましいその断片をコードするＤＮＡ配列を、該ポリペプチドまたは断片を産生す
るための発現ベクター内にサブクローニングしてもよい。ＤＮＡ配列は、好都合に、適切
なリーダーまたはシグナルペプチドをコードする配列に融合させる。あるいは、既知の技
術を用い、望ましい断片を化学的に合成してもよい。ＤＮＡ断片はまた、全長クローン化
ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化により産生し、そしてアガロースゲル上の電気
泳動により単離してもよい。必要であれば、望ましい点まで５’または３’末端を再構築
するオリゴヌクレオチドを、制限酵素消化により生成されたＤＮＡ断片に連結してもよい
。こうしたオリゴヌクレオチドはさらに、望ましいコード配列、およびコード配列のＮ−
末端の開始コドン（ＡＴＧ）位の上流に、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含んでもよ
い。
【００４２】
周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法もまた、望ましいタンパク質断片をコードす
るＤＮＡ配列を単離しそして増幅するのに使用してもよい。ＤＮＡ断片の望ましい末端を
定めるオリゴヌクレオチドを、５’および３’プライマーとして使用する。該オリゴヌク
レオチドはさらに、発現ベクターへの増幅ＤＮＡ断片の挿入を容易にするため、制限エン
ドヌクレアーゼの認識部位を含んでもよい。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら， Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏ
ｌｏｇｙ， Ｗｕら監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，サンディエゴ
， ｐｐ．１８９−１９６（１９８９）；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇ
ｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓら
監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９０）に記載される。
【００４３】
ポリペプチドおよびその断片
本発明は、多様な型のポリペプチドおよびその断片を含み、天然発生である、または組
換えＤＮＡ技術を伴う方法などの多様な技術を通じ産生されるものを含む。こうした型に
は、限定されるわけではないが、誘導体、変異体、およびオリゴマーと共に、融合タンパ
ク質またはその断片が含まれる。
【００４４】
ポリペプチドおよびその断片
本発明のポリペプチドは、上述のような核酸配列にコードされる全長タンパク質を含む
。特に好ましいポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、特に好ましい断片は
、配列番号２のアミノ酸２９ないし１５９（成熟ポリペプチド配列）を含む。
【００４５】
配列番号２のポリペプチドは、シグナルペプチドとして機能するＮ−末端疎水性領域を
含む。コンピューター解析により、該シグナルペプチドは配列番号２の残基１ないし２８
に相当することが予測される（が、コンピューターが予測する、その次に最もありうるシ
グナルペプチド切断部位は（降順に）配列番号２のアミノ酸３４および１１６の後ろに現
れる）。シグナルペプチドの切断は、したがって、配列番号２のアミノ酸２９から１５９
を含む成熟タンパク質を生じるであろう。
【００４６】
当業者は、ポリペプチドのこうした領域の上述の境界はおよそのものであることを認識
するであろう。例えば、（その目的のために利用可能なコンピュータープログラムを用い
ることにより、予測することが可能な）シグナルペプチドの境界は、上述のものと異なる
可能性がある。
【００４７】
本発明のポリペプチドは、膜に結合していても、または分泌されそしてしたがって可溶
性であってもよい。可溶性ポリペプチドは、発現される細胞から分泌されることが可能で
ある。一般的に、可溶性ポリペプチドは、例えば遠心分離などにより、望ましいポリペプ
チドを発現する、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞を培地から分離し、そして望ま
しいポリペプチドの存在に関し培地（上清）をアッセイすることにより、同定する（そし
て非可溶性膜結合対応物と区別する）ことが可能である。培地中にポリペプチドが存在す
ることにより、該ポリペプチドが細胞から分泌され、そしてしたがって該タンパク質の可
溶性型であることが示される。
【００４８】
１つの態様において、可溶性ポリペプチドおよびその断片は、細胞外ドメインのすべて
または一部を含むが、細胞膜へのポリペプチドの保持を生じるであろう膜貫通領域を欠く
。可溶性ポリペプチドは、該ポリペプチドが産生細胞から分泌される限り、細胞質ドメイ
ン、またはその一部を含んでもよい。
【００４９】
他の態様には、アミノ酸２９または３５のＮ−末端およびアミノ酸１５９のＣ−末端を
有する、可溶性断片が含まれる。
一般的に、可溶性型の使用は特定の適用に有益である。可溶性ポリペプチドは宿主細胞
から分泌されるため、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が容易になる。さらに、
可溶性ポリペプチドは、一般的に、静脈内投与に、より適している。
【００５０】
本発明はまた、ポリペプチド、および望ましい生物学的活性を保持する細胞外ドメイン
の断片も提供する。特定の態様は、ＴＳＬＰ受容体に結合する能力を保持するポリペプチ
ド断片に関する。こうした断片は、上述のように可溶性ポリペプチドであってもよい。別
の態様において、ポリペプチドおよび断片は、好都合に、上述のようなＢ細胞系譜または
Ｔ細胞系譜細胞の増殖に影響を与えるタンパク質のファミリー中に保存される領域を含む
。
【００５１】
本明細書にやはり提供されるのは、配列番号２の配列の隣接アミノ酸を少なくとも２０
、または少なくとも３０含むポリペプチド断片である。細胞質ドメイン由来の断片は、情
報伝達研究において、そして生物学的情報の伝達に関連する細胞過程の制御において、使
用を見出す。ポリペプチド断片はまた、抗体を産生する際の免疫原として使用してもよい
。
【００５２】
変異体
天然発生変異体と共に、ポリペプチドおよび断片由来変異体が本明細書に提供される。
変異体は、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を示してもよい。やはり意図され
るのは、ポリペプチドまたは断片が、好ましいポリペプチドまたはその断片に、少なくと
も９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、
または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む、態様である。同一性パーセ
ントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク
質配列の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏ． ４８：４４３（１９７０））のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシ
ン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータ
ープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラム
の好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆ
ｆ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：１０９１５（１
９９２））に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２
）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；および（４）末端ギャップに対する
ペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、
用いてもよい。
【００５３】
本発明の変異体には、例えば、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象またはタンパク質分
解切断から生じるものが含まれる。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、例えば、一部切
除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）が生物学的に活性があるタンパク質を生じる可能性
があり、例えば該タンパク質の天然発生可溶性型などがある。タンパク質分解に起因する
と考えられる変動には、例えば、異なる種類の宿主細胞における発現に際しての、該タン
パク質からの１つまたはそれ以上の末端アミノ酸（一般的に１−５末端アミノ酸）のタン
パク質分解的除去によるＮ−またはＣ−末端の相違が含まれる。アミノ酸配列の相違を遺
伝的多型性（該タンパク質を産生する個体の間の対立遺伝子変動）に起因しうるタンパク
質もまた、本明細書に意図される。
【００５４】
本発明の範囲内のさらなる変異体には、他の化学部分、例えばグリコシル基、脂質、リ
ン酸、アセチル基およびそれらに匹敵するものと共有または凝集結合体を形成することに
より、修飾され、誘導体を生成する可能性があるポリペプチドが含まれる。共有誘導体は
、アミノ酸側鎖上の、あるいはポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端の、官能基上に、
化学部分を連結することにより、調製してもよい。以下により詳細に論じられるような、
結合している診断用剤（検出可能）または療法剤を含む結合体が本発明に意図される。
【００５５】
他の誘導体には、例えばＮ−末端またはＣ−末端融合体として組換え培養において合成
されることによる、該ポリペプチドと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または
凝集結合体が含まれる。融合タンパク質の例は、オリゴマーと関連し、以下に論じられる
。さらに、融合タンパク質は精製および同定を容易にするため添加されるペプチドを含ん
でもよい。こうしたペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，
９１２号およびＨｏｐｐら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４（１９８８
）に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登
録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
（配列番号３）であり、該ペプチドは抗原性が高く、そして特異的なモノクローナル抗体
が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイ
および容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書
に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イ
オンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する
。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号第ＨＢ ９２５９号下に、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノク
ローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍ
ａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手
可能である。
【００５６】
本明細書に提供される変異体ポリペプチドの中に、天然の生物学的活性を保持する天然
ポリペプチドの変異体または実質的なその同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）がある。１つ
の例は、天然型と本質的に同一の結合親和性で結合する変異体である。結合親和性は、例
えば米国特許第５，５１２，４５７号に記載されるように、そして以下に示されるように
、慣用法により測定することが可能である。
【００５７】
変異体には、実質的に天然型と相同であるが、1つまたはそれ以上の欠失、挿入または
置換のため、天然型と異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドが含まれる。特定の態
様には、限定されるわけではないが、天然配列と比較して、アミノ酸残基の１ないし１０
の欠失、挿入または置換を含む、ポリペプチドが含まれる。
【００５８】
既定のアミノ酸を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよい。
こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、ま
たはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換；あるいは芳
香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するも
のが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、
周知である。
【００５９】
同様に、本発明のＤＮＡには、１つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換のため、天
然ＤＮＡ配列とは異なるが、生物学的に活性があるポリペプチドをコードする変異体が含
まれる。
【００６０】
本発明はさらに、結合する天然パターン糖鎖付加を含むまたは含まないポリペプチドを
含む。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７細胞）で発現され
たポリペプチドは、発現系の選択に応じ、分子量および糖鎖付加パターンにおいて、天然
ポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異なる可能性もある。細菌発現系、例
えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）での本発明のポリペプチドの発現は、非糖鎖付加分子を提
供する。さらに、既定の調製は、多数の異なって糖鎖付加されたタンパク質種を含む可能
性がある。グリコシル基は、慣用法、特にグリコペプチダーゼを利用するものを通じ、除
去してもよい。一般的に、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを、モル過剰のグリコペプチダ
ーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とインキュベーションしてもよい。
【００６１】
これに対応して、アミノ酸残基または配列の多様な付加または置換、あるいは末端また
は内部の残基または配列の欠失をコードする同様のＤＮＡ構築物が、本発明に含まれる。
例えば、ポリペプチド細胞外ドメインのＮ−糖鎖付加部位を修飾し、糖鎖付加を妨げても
よく、これにより哺乳動物および酵母発現系における炭水化物減少類似体（ａｎａｌｏｇ
）の発現が可能になる。真核ポリペプチドのＮ−糖鎖付加部位はアミノ酸トリプレットＡ
ｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、ここでＸはいかなるアミノ酸でもよく、そしてＹはＳ
ｅｒまたはＴｈｒである。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する
適切な置換、付加または欠失は、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合の防止を生じるであ
ろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸により置換されるように選択される、単一のヌク
レオチドの改変は、Ｎ−糖鎖付加部位を不活性化するのに十分である。あるいは、Ｓｅｒ
またはＴｈｒを別のアミノ酸、例えばＡｌａで置換してもよい。タンパク質のＮ−糖鎖付
加部位を不活性化するための既知の方法には、本明細書に援用される、米国特許第５，０
７１，９７２号およびＥＰ ２７６，８４６に記載されるものが含まれる。
【００６２】
変異体の別の例において、生物学的活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする配列を改
変し、Ｃｙｓ残基が欠失され、または他のアミノ酸で置換されるようにし、フォールディ
ングまたは再生の際、誤った分子内ジスルフィド架橋が形成されるのを妨げてもよい。
【００６３】
他の変異体は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を亢進させる
ため、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾することにより調製される。ＥＰ ２１２，
９１４は、タンパク質のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するための部
位特異的突然変異誘発の使用を開示する。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を改変し、これらの隣接する塩
基性残基の発生を除去するため、残基を欠失させ、付加し、または置換することにより、
不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対はＫＥＸ２切断にかなり感受性が低く、そしてＡｒｇ
−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化す
る保存的なそして好ましいアプローチを代表する。
【００６４】
オリゴマー
本発明に含まれるのは、ヒトＴＳＬＰポリペプチドを含むオリゴマーまたは融合タンパ
ク質である。こうしたオリゴマーは、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーを含
む、共有結合または非共有結合多量体型であってもよい。上述のように、好ましいポリペ
プチドは可溶性であり、そしてしたがってこれらのオリゴマーは可溶性ポリペプチドを含
んでもよい。本発明の１つの側面において、オリゴマーはポリペプチド構成要素の結合能
を維持し、そしてしたがって、二価、三価などの結合部位を提供する。
【００６５】
本発明の１つの態様は、ポリペプチドに融合しているペプチド部分間の共有または非共
有相互作用を介し結合している多数のポリペプチドを含むオリゴマーに関する。こうした
ペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）であってもよく、またはオリゴマー化を促
進する特性を有するペプチドであってもよい。以下により詳細に記載されるように、ロイ
シンジッパーおよび抗体由来の特定のポリペプチドが、結合するポリペプチドのオリゴマ
ー化を促進することが可能なペプチドの中にある。
【００６６】
免疫グロブリンに基づくオリゴマー
１つの代替物として、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用い、オリゴマーを調
製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合している特定
の異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例
えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５（１９９１））；Ｂ
ｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７（１９９０））；並びにＨｏｌｌｅｎｂａｕｇ
ｈおよびＡｒｕｆｆｏ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ中， “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓ
ｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， Ｓｕｐｐｌ．４， １０．１９．１−１０．１９．１１
（１９９２））に記載されている。
【００６７】
本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドを抗体由来のＦｃポリペプチドに融合さ
せることにより生成される２つの融合タンパク質を含む二量体に関する。ポリペプチド／
Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。該組換
え発現ベクターで形質転換された宿主細胞でポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質を発現し
、そして抗体分子によく似た形で集合させ、その結果、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分
間に形成され、二価分子を生じる。
【００６８】
本明細書において、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域のＣＨドメインのす
べてを含む抗体のＦｃ領域から構成される天然および突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ
）型ポリペプチドを含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含むこうしたポリペプチドの
一部切除型もまた含まれる。好ましいポリペプチドはヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃポリペ
プチドを含む。
【００６９】
ＰＣＴ出願第ＷＯ ９３／１０１５１号（本明細書に援用される）に記載される１つの
適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ−末端ヒンジ領域から天然
Ｃ−末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、本明細書に
援用される米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら（ＥＭＢＯ Ｊ．， １３
：３９９２−４００１（１９９４））に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。本突
然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ
酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化して
いることを除けば、ＷＯ ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である
。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少した親和性を示す。
【００７０】
Ｆｃ部分を含む上述の融合タンパク質（およびそれから形成されるオリゴマー）は、プ
ロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる容易
な精製という利点を提供する。
【００７１】
他の態様において、本発明のポリペプチドを、抗体重鎖または軽鎖の可変部に関し置換
してもよい。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されている場合、４つも
のＴＳＬＰ細胞外領域を持つオリゴマーを形成することが可能である。
【００７２】
ペプチドリンカーに基づくオリゴマー
あるいは、オリゴマーはペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含むまたは含まな
い多数のポリペプチドを含む融合タンパク質である。適切なペプチドリンカーの中に、本
明細書に援用される米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記
載されるものがある。望ましいペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列は、いかなる適
切な慣用的技術を用い、本発明のＤＮＡ配列の間に、そして該ＤＮＡ配列と同じ読み枠で
挿入してもよい。例えば、リンカーをコードする化学的に合成されたオリゴヌクレオチド
を、配列間に連結してもよい。特定の態様において、融合タンパク質は、ペプチドリンカ
ーにより分離された、２ないし４つの可溶性ＴＳＬＰポリペプチドを含む。
【００７３】
ロイシンジッパー
本発明のオリゴマーを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロ
イシンジッパードメインは、該ドメインが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進する
ペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質で同定さ
れ（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９（１９８８））、そ
して以来、多様な異なるタンパク質で見出されてきている。既知のロイシンジッパーの中
に、二量体化または三量体化する天然発生ペプチドおよびその誘導体がある。
【００７４】
ジッパードメイン（本明細書において、オリゴマー化、またはオリゴマー形成ドメイン
とも呼ばれる）は、繰り返される７残基反復を含み、しばしば４つまたは５つのロイシン
残基が、他のアミノ酸に点在する。ジッパードメインの例には、酵母転写因子ＧＣＮ４お
よびラット肝臓に見られる熱安定性ＤＮＡ結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ； Ｌａｎｄｓｃ
ｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６８１（１９８９））がある。２つの核トラ
ンスフォーミングタンパク質、ｆｏｓおよびｊｕｎもまたジッパードメインを示し、ネズ
ミプロトオンコジーンｃ−ｍｙｃの遺伝子産物も同様である（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０：１７５９（１９８８））。核発癌遺伝子、ｆｏｓおよびｊ
ｕｎの産物は、ヘテロ二量体を優先して形成するジッパードメインを含む（Ｏ’Ｓｈｅａ
ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４５；６４６（１９８９）、ＴｕｒｎｅｒおよびＴｉｊａｎ
， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６８９（１９８９））。ジッパードメインは、これらの
タンパク質の生物学的活性（ＤＮＡ結合）に必要である。
【００７５】
パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイルスを含
む、いくつかの異なるウイルスの融合体形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）タンパク質もまた
、ジッパードメインを所有する（ＢｕｃｋｌａｎｄおよびＷｉｌｄ， Ｎａｔｕｒｅ，
３３８：５４７（１９８９））；（Ｂｒｉｔｔｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５３：３９４
（１９９１））；（ＤｅｌｗａｒｔおよびＭｏｓｉａｌｏｓ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， ６：７０３（１９９０））。
これらの融合体形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルスタンパク質のジッパードメインは
、該タンパク質の膜貫通領域の近くにあり；ジッパードメインが、該融合体形成性タンパ
ク質のオリゴマー構造に寄与する可能性が示唆されてきている。融合体形成性ウイルスタ
ンパク質のオリゴマー化は、融合孔（ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｒｅ）形成に関与している（Ｓ
ｐｒｕｃｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８
：３５２３（１９９１））。ジッパードメインはまた、最近、熱ショック転写因子のオリ
ゴマー化に役割を果たしているとも報告されてきている（Ｒａｂｉｎｄｒａｎら， Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５９：２３０（１９９３））。
【００７６】
ジッパードメインは、短い、平行コイルドコイル（ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｉｌｅｄ
ｃｏｉｌ）として折りたたまれている（Ｏ’Ｓｈｅａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：５
３９（１９９１））。平行コイルドコイルの一般的構造は、Ｃｒｉｃｋにより提唱された
ような「ノブを穴へ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」パッキング（Ａｃｔａ Ｃ
ｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．， ６：６８９）により、よく特徴付けられている。ジッパード
メインにより形成された二量体は、ＭｃＬａｃｈｌａｎおよびＳｔｅｗｅｒｔ（Ｊ． Ｍ
ｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ９８：２９３（１９７５））の表記にしたがい、（ａｂｃｄｅｆ
ｇ）ｎと表される、７残基反復により安定化される。ここでａおよびｄは一般的に疎水性
残基であり、ｄはロイシンであり、これらはらせんの同じ面に並ぶ。逆に荷電した残基は
普通、ｇおよびｅ位にある。したがって、２つのらせん状ジッパードメインから形成され
る平行コイルドコイルにおいて、第一のらせんの疎水性側鎖により形成された「ノブ」は
、第二のらせんの側鎖間に形成された「穴」にパッキングされる。
【００７７】
ｄ位の残基（しばしばロイシン）は、巨大な疎水性安定化エネルギーに寄与し、そして
オリゴマー形成に重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｒｅｓ．， ３８：２２９（１９９１））。Ｌｏｖｅｊｏｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９
：１２８８（１９９３））は最近、らせんが上−上−下に走る、三重鎖αらせん束合成を
報告した。彼らの研究により、疎水性安定化エネルギーが、らせん単量体からのコイルド
コイルの形成のための主要な原動力を提供していることが裏付けられた。これらの研究は
また、静電相互作用がコイルドコイルの化学量論および形状に寄与していることも示して
いる。ロイシンジッパーの構造のさらなる議論は、Ｈａｒｂｕｒｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２６２：１４０１（２６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９３））に見られる。
【００７８】
可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例は、
ＰＣＴ出願第ＷＯ ９４／１０３０８号に記載され、そして肺界面活性物質プロテインＤ
（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパードメインが、本明細書に援用されるＨｏｐｐｅら（Ｆ
ＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３４４：１９１（１９９４））に記載される。修飾ロイシン
ジッパーに融合している異種性タンパク質の安定した三量体化を可能にする、該修飾ロイ
シンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗら（Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６：２
６７−２７８（１９９４））に記載されている。ロイシンジッパーペプチドに融合してい
る可溶性ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を適切な宿主細胞で発現し、そして形
成される可溶性オリゴマーを培養上清から回収する。
【００７９】
特定のロイシンジッパー部分は、優先的に三量体を形成する。１つの例は、本明細書に
完全に援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３４４：１９１（１９９
４））および米国特許第５，７１６，８０５号に記載されるような、肺界面活性物質プロ
テインＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーである。本肺ＳＰＤ由来ロイシンジッパーペ
プチドは、アミノ酸配列Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇ
ｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇ
ｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ（配
列番号４）を含む。
【００８０】
三量体化を促進するロイシンジッパーの別の例は、米国特許第５，７１６，８０５号に
記載されるような、アミノ酸配列Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａ
ｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔ
ｙｒ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌ
ｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ（配列番号５）を含むペプチド
である。１つの別の態様において、Ｎ−末端Ａｓｐ残基が付加され；別の態様では、該ペ
プチドはＮ−末端Ａｒｇ残基を欠いている。
【００８１】
オリゴマー化を促進する特性を保持する、前述のジッパーペプチドの断片もまた、使用
してもよい。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、前述のアミノ酸配列に
示される１つまたは２つのＮ−末端またはＣ−末端残基を欠くペプチドが含まれる。ロイ
シンジッパーは、天然発生ロイシンジッパーペプチドから、例えばオリゴマー化を促進す
るペプチドの能力が保持されるように、天然アミノ酸配列の保存的置換を介し、得てもよ
い。
【００８２】
天然発生三量体タンパク質由来の他のペプチドを、三量体オリゴマーを調製するのに使
用してもよい。あるいは、オリゴマー化を促進する合成ペプチドを使用してもよい。特定
の態様において、ロイシンジッパー部分のロイシン残基を、イソロイシン残基により置換
してもよい。イソロイシンを含むこうしたペプチドは、イソロイシンジッパーと呼んでも
よいが、本明細書において「ロイシンジッパー」という用語に含まれる。
【００８３】
ポリペプチドおよびその断片の産生
本発明のポリペプチドおよび断片の発現、単離および精製は、いかなる適切な技術によ
り達成してもよく、限定されるわけではないが以下を含む：
発現系
本発明はまた、ＤＮＡを含む組換えクローニング用および発現ベクター、並びに、該組
換えベクターを含む宿主細胞も提供する。ＤＮＡを含む発現ベクターを用い、該ＤＮＡに
コードされる本発明のポリペプチドまたは断片を調製してもよい。ポリペプチドを産生す
るための方法は、ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換されている宿
主細胞を、該ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し、その後培養から発現ポリペ
プチドを回収することを含む。当業者は、発現ポリペプチドを精製するための方法は使用
する宿主細胞の種類、および該ポリペプチドが膜に結合しているかまたは宿主細胞から分
泌される可溶性型かなどの要因にしたがい、多様であろうことを認識するであろう。
【００８４】
いかなる適切な発現系を使用してもよい。ベクターは、適切な転写または翻訳制御ヌク
レオチド配列、例えば、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来のものなど
に、機能可能であるように連結されている、本発明のポリペプチドまたは断片をコードす
るＤＮＡを含む。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハン
サー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始および終結を調節する適
切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が該ＤＮＡ配列に機能的に関連して
いるとき、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチ
ド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節するならば、ＤＮ
Ａ配列に、機能可能であるように連結されている。望ましい宿主細胞において複製する能
力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクター
に取り込まれている。
【００８５】
さらに、適切なシグナルペプチド（天然または異種性）をコードする配列を、発現ベク
ターに取り込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、インフレ
ームで本発明の核酸配列に融合させ、ＤＮＡがまず転写され、そしてｍＲＮＡがシグナル
ペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるようにしてもよい。意図される宿主細胞で機
能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは
、ポリペプチドの細胞からの分泌に際し、ポリペプチドから切断される。
【００８６】
当業者はまた、シグナルペプチドが切断される位は、コンピュータープログラムに予測
されるものと異なる可能性があり、そして組換えポリペプチドを発現するのに使用される
宿主細胞の種類などの要因にしたがい、多様である可能性があることも認識するであろう
。タンパク質調製物は、１つ以上の部位でのシグナルペプチドの切断から生じる、異なる
Ｎ−末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物を含む可能性がある。本明細書に提供
される成熟タンパク質の特定の態様には、限定されるわけではないが、Ｎ−末端アミノ酸
として、配列番号２の１６、２９、３５、９５、または１１７位の残基を有するタンパク
質が含まれる。
【００８７】
ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核、酵母またはより高次の真核細胞が含
まれる。宿主細胞としての使用には、哺乳動物または昆虫細胞が一般的に好ましい。細菌
、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主での使用に適したクローニング用および発現ベク
ターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ニューヨーク州エルセビア（１９８５）に記載されて
いる。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開示されるＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用い、
ポリペプチドを産生するのに使用してもよい。
【００８８】
原核発現系
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物が含まれる。形質転換に適した原核宿
主細胞には、例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並び
にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な他の種
が含まれる。大腸菌などの原核宿主細胞において、組換えポリペプチドの該原核宿主細胞
における発現を容易にするため、ポリペプチドはＮ−末端メチオニン残基を含んでもよい
。Ｎ−末端Ｍｅｔは、発現された組換えポリペプチドから切断してもよい。
【００８９】
原核宿主細胞に用いるための発現ベクターは、一般的に、１つまたはそれ以上の表現型
選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐
性を与える、または独立栄養必要条件を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。
原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴ
ＣＣ ３７０１７）など、商業的に入手可能なプラスミド由来のものが含まれる。ｐＢＲ
３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を含み、そしてしたがって、形質転
換細胞を同定する簡単な手段を提供する。適切なプロモーターおよびＤＮＡ配列をｐＢＲ
３２２ベクター中に挿入する。他の商業的に入手可能なベクターには、例えば、ｐＫＫ２
２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン・ウプサ
ラ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、米国ウィスコンシン州マディソ
ン）が含まれる。
【００９０】
組換え原核宿主細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーター配列には、β−ラクタ
マーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ
２７５：６１５（１９７８）；およびＧｏｅｄｄｅｌら， Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５
４４（１９７９））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，
Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７（１９８０）；およびＥＰ−Ａ−３６
７７６）およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ｐ．４１２（１９８２））が含まれる。特に有用
な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性
リプレッサー配列を使用する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手
可能な、λＰＬプロモーターの誘導体を組み込んだプラスミドベクターには、プラスミド
ｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９、ＡＴＣＣ ３７０９２に常住）およびｐＰＬｃ２８（大
腸菌ＲＲ１、ＡＴＣＣ ５３０８２に常住）が含まれる。
【００９１】
酵母系
あるいは、ポリペプチドは、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）属（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来の酵母宿主細胞に
おいて発現してもよい。酵母の他の属、例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）またはクロイベ
ロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）もまた使用してもよい。酵母ベクターは、し
ばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモータ
ー領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー
遺伝子を含むであろう。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、とりわけ、メタロ
チオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ
． Ｃｈｅｍ． ２５５：２０７３（１９８０））あるいは、エノラーゼ、グリセルアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ
、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリ
ン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコース
イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら， Ｊ． Ａｄｖ
． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ７：１４９（１９６８））；および（Ｈｏｌｌａｎｄら，
Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７：４９００（１９７８））のプロモーターが含まれる。酵母発
現に用いるのに適した他のベクターおよびプロモーターはＨｉｔｚｅｍａｎ， ＥＰＡ−
７３，６５７にさらに記載されている。別の代替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８：２６７４（１９８２））およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ
３００：７２４（１９８２））に記載されるグルコース抑制可能ＡＤＨ２プロモーター
である。大腸菌での選択および複製のため、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺
伝子および複製起点）を上述の酵母ベクターに挿入することにより、酵母および大腸菌両
方において複製可能なシャトルベクターを構築してもよい。
【００９２】
酵母α−因子リーダー配列を使用し、ポリペプチドを直接分泌させてもよい。α−因子
リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列および構造遺伝子配列の間に挿入される。
例えば、Ｋｕｒｊａｎら， Ｃｅｌｌ ３０：９３３（１９８２）およびＢｉｔｔｅｒら
， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：５３３０（１９８
４）を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を容易にするのに適した
他のリーダー配列が当業者に知られる。リーダー配列を、その３’端近傍に、１つまたは
それ以上の制限部位を含むよう修飾してもよい。これは、リーダー配列が構造遺伝子に融
合するのを容易にするであろう。
【００９３】
酵母形質転換プロトコルが当業者に知られる。こうしたプロトコルの１つがＨｉｎｎｅ
ｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：１９２９（１
９７８）に記載される。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコルは、Ｔｒｐ＋形質転換体を選択培地
中で選択し、ここで該選択培地は０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カザミノ酸、２％グ
ルコース、１０ｍｇ／ｍｌアデニンおよび２０ｍｇ／ｍｌウラシルからなる。
【００９４】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は、発現
を誘導するため「リッチ」培地中で増殖させてもよい。リッチ培地の例は、８０ｍｇ／ｍ
ｌアデニンおよび８０ｍｇ／ｍｌウラシルを補った、１％酵母エキス、２％ペプトン、お
よび１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除（ｄｅｒｅｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ）は、培地からグルコースが枯渇したとき起こる。
【００９５】
哺乳動物または昆虫系
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、組換えポリペプチドを発現するのに使用し
てもよい。昆虫細胞において異種性タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系がＬ
ｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８
８）に概説されている。哺乳動物起源の樹立細胞株もまた、使用してもよい。適切な哺乳
動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）
（Ｇｌｕｚｍａｎら， Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１））、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞
、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら
（ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１（１９９１））に記載されるようなアフリカミドリザ
ル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
７０）由来であるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株が含まれる。
【００９６】
哺乳動物細胞内にＤＮＡを導入するための確立された方法が記載されてきている（Ｋａ
ｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．， Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ
Ｃｕｌｔｕｒｅ， ｐｐ．１５−６９（１９９０））。商業的に入手可能な試薬、例えば
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬を用いた、さらなるプロトコルを用い、細胞をトランスフェ
クションしてもよい（Ｆｅｌｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７））。さらに、エレクトロポレーシ
ョンを用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版． Ｖｏｌ．１−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））におけるもののよ
うな、慣用法を用い、哺乳動物細胞をトランスフェクションしてもよい。安定形質転換体
の選択は、例えば細胞毒性薬剤に対する耐性など、当該技術分野に知られる方法を用い、
行ってもよい。Ｋａｕｆｍａｎら， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５
：４８７−５１１（１９９０）は、いくつかの選択計画、例えばジヒドロ葉酸レダクター
ゼ（ＤＨＦＲ）耐性を記載する。ＤＨＦＲ選択に適した宿主株は、ＤＨＦＲ不全であるＣ
ＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１であってもよい（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０（１９８０））
。ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを発現しているプラスミドをＤＸ−Ｂ１１株に導入してもよく、そ
してプラスミドを含む細胞のみを適切な選択培地中で増殖させてもよい。発現ベクターに
組み込んでもよい選択可能マーカーの他の例には、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢな
どの抗生物質に対する耐性を与えるｃＤＮＡが含まれる。該ベクターを宿する細胞を、こ
れらの化合物に対する耐性に基づき選択してもよい。
【００９７】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノムよ
り切り出されてもよい。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポ
リオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒト
・サイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば
ＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポ
リアデニル化部位を用い、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の
遺伝要素を提供してもよい。ウイルス初期および後期プロモーターは、どちらもウイルス
複製起点をも含む可能性がある断片として容易にウイルスゲノムから得られるため、特に
有用である（Ｆｉｅｒｓら， Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３（１９７８））；（Ｋａｕ
ｆｍａｎ， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９０））。ＳＶ４０ウイル
ス複製起点部位に位置するＨｉｎｄ ＩＩＩ部位からＢｇｌ Ｉ部位に渡るおよそ２５０
ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片もまた用いて
もよい。
【００９８】
哺乳動物発現ベクターからの異種性遺伝子の発現を改善することが示されたさらなる調
節配列には、ＣＨＯ細胞由来の発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓら， Ａｎ
ｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐｐ．５２９−５３４およびＰＣＴ出願
第ＷＯ ９７／２５４２０号（１９９７））並びにアデノウイルス２由来の三分割（ｔｒ
ｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら，
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７：１３４７５−１３４９１（１９８２））など
の要素が含まれる。ウイルス起源の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列により、二
シストロン性ｍＲＮＡが効率的に翻訳されることが可能になる（ＯｈおよびＳａｒｎｏｗ
， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ ３：２９５−３００（１９９３））；（Ｒａｍｅｓｈら， Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７−２７００（１９９６））。選択可能
マーカー（例えばＤＨＦＲ）遺伝子が続く、二シストロン性ｍＲＮＡの一部としての異種
性ｃＤＮＡの発現は、宿主のトランスフェクション可能性および異種性ｃＤＮＡの発現を
改善することが示されてきている（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ（１９９０））。二シストロン性ｍＲＮＡを使用する典型的な発現ベクターは、
Ｍｏｓｓｅｒら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１５０−１６１（１９９７）に
記載されるｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓら， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，， ｐｐ．５２９−５３４（１９９７）に記載されるｐ２Ａ５Ｉ
である。
【００９９】
有用な高発現ベクター、ｐＣＡＶＮＯＴがＭｏｓｌｅｙら， Ｃｅｌｌ ５９：３３５
−３４８（１９８９）に記載されてきている。哺乳動物宿主細胞において用いるための他
の発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．
３：２８０（１９８３））に開示されるように構築してもよい。Ｃ１２７ネズミ乳腺上
皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系を、実質的にＣｏｓ
ｍａｎら（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：９３５（１９８６））に記載されるよう
に構築してもよい。Ｃｏｓｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記
載される有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ ３９８９０として
寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、本明細書に援用される、ＥＰ
−Ａ−０３６７５６６およびＷＯ ９１／１８９８２に記載されている。さらに別の代替
物として、ベクターは、レトロウイルス由来であってもよい。
【０１００】
別の有用な発現ベクター、ｐＦＬＡＧ（登録商標）を用いてもよい。ＦＬＡＧ（登録商
標）技術は、低分子量（１ｋＤ）親水性ＦＬＡＧ（登録商標）マーカーペプチドを、ｐＦ
ＬＡＧ（登録商標）発現ベクターにより発現される組換えタンパク質のＮ−末端に融合さ
せることを中心とする。ｐＤＣ３１１は、ＣＨＯ細胞でタンパク質を発現させるために用
いる、別の特殊化ベクターである。ｐＤＣ３１１は、目的の遺伝子およびジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を、ＤＨＦＲ翻訳のための内部リボソーム結合部位、発現
増大配列要素（ＥＡＳＥ）、ヒトＣＭＶプロモーター、三分割リーダー配列、およびポリ
アデニル化部位と共に含む、二シストロン性配列により特徴付けられる。
【０１０１】
使用してもよいシグナルペプチドに関し、望ましいならば、天然シグナルペプチドを異
種シグナルペプチドまたはリーダー配列に置き換えてもよい。シグナルペプチドまたはリ
ーダーの選択は、組換えポリペプチドが産生されるべき宿主細胞の種類などの要因に依存
する可能性がある。例えば、哺乳動物宿主細胞で機能する異種性シグナルペプチドの例に
は、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）の
シグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載さ
れるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ ３６７，５６６に記載されるイ
ンターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載さ
れるＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ ４６０，８４６に
記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。
【０１０２】
精製
本発明はまた、ポリペプチドおよびその断片を単離しそして精製する方法も含む。
単離および精製
本発明に含まれる「単離」ポリペプチドまたはその断片は、天然に見られる可能性があ
る環境と同一でない環境にあるポリペプチドまたは断片である。本発明に含まれる「精製
」ポリペプチドまたはその断片は、例えば上述のような組換え発現系の精製産物のように
、または天然発生細胞および／または組織などの非組換え供給源からの精製産物のように
、他のタンパク質またはポリペプチドとの結合を本質的に含まない。
【０１０３】
１つの好ましい態様において、組換えポリペプチドまたは断片の精製は、本発明のポリ
ペプチドまたは断片の、本発明のポリペプチドまたは断片の精製を援助する別のポリペプ
チドへの融合を用い、達成してもよい。こうした融合パートナーは、上述のようなポリ−
Ｈｉｓまたは他の抗原性同定ペプチドと共に先に記載されるＦｃ部分を含んでもよい。
【０１０４】
いかなる種類の宿主細胞に関しても、当業者に知られるように、組換えポリペプチドま
たは断片を精製するための方法は、使用する宿主細胞の種類および組換えポリペプチドま
たは断片が培地に分泌されるかどうかなどの要因にしたがい、多様であろう。
【０１０５】
一般的に、組換えポリペプチドまたは断片は、分泌されない場合、宿主細胞から、ある
いは可溶性でありそして分泌される場合、培地または上清から単離してもよく、その後１
つまたはそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー精製また
はサイズ排除クロマトグラフィー段階が続く。これらの段階を達成する特定の方法につい
ては、培地をまず、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏ
ｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用い、濃縮してもよい。
濃縮段階に続き、濃縮物をゲル濾過媒体などの精製マトリックスに適用してもよい。ある
いは、陰イオン交換樹脂、例えばペンダントな（ｐｅｎｄａｎｔ）ジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは支持体を使用してもよい。マトリックスは、
アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に通常使
用される他の種類であってもよい。あるいは、陽イオン交換段階を使用してもよい。適切
な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む多様な不溶性マ
トリックスが含まれる。さらに、クロマトフォーカシング段階を使用してもよい。あるい
は疎水性相互作用クロマトグラフィー段階を使用してもよい。適切なマトリックスは、樹
脂に結合しているフェニルまたはオクチル部分であってもよい。さらに、組換えタンパク
質に選択的に結合するマトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィーを使用し
てもよい。使用されるこうした樹脂の例は、レクチンカラム、色素カラム、および金属キ
レートカラムである。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ）媒体（例えば、ペンダントなメチル、オクチル、オクチルデシルまたは他の脂肪族基
を有するシリカゲルまたはポリマー樹脂）を使用する１つまたはそれ以上の逆相高性能液
体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）段階を使用し、ポリペプチドをさらに精製して
もよい。いくつかまたはすべての前記の精製段階の多様な組み合わせが周知であり、そし
て単離されそして精製されている組換えタンパク質を提供するのに使用してもよい。
【０１０６】
本発明のポリペプチド−結合タンパク質、例えば本発明のポリペプチドに対し生成され
たモノクローナル抗体などを含むアフィニティーカラムを利用し、発現されたポリペプチ
ドをアフィニティー精製することもまた、可能である。これらのポリペプチドは、慣用的
技術を用い、例えば、高塩溶出緩衝液中、そしてその後、使用のためより低塩緩衝液中に
透析することによって、あるいは利用されたアフィニティーマトリックスに応じて、ｐＨ
または他の構成要素を変化させることによって、あるいは親和性部分の天然発生基質、例
えば本発明由来のポリペプチドを用い、競合的に除去することによって、アフィニティー
カラムから除去してもよい。
【０１０７】
本発明の本側面において、ポリペプチド−結合タンパク質、例えば本発明の抗ポリペプ
チド抗体または本発明のポリペプチドと相互作用する可能性がある他のタンパク質を、そ
の表面に本発明のポリペプチドを発現する細胞を同定し、分離し、または精製するのに適
したカラムクロマトグラフィーマトリックスまたは同様の支持体などの固相支持体に結合
させてもよい。固相接触表面への本発明のポリペプチド結合タンパク質の結合は、いかな
る手段により達成してもよく、例えば磁気微小球体をこれらのポリペプチド結合タンパク
質で被覆し、そして磁気場を通じインキュベーション容器に保持してもよい。細胞混合物
の懸濁物を、上にこうしたポリペプチド結合タンパク質を有する固相と接触させる。本発
明のポリペプチドを表面上に有する細胞が固定ポリペプチド結合タンパク質に結合し、そ
してその後非結合細胞を洗い流す。本親和性結合法は、溶液からこうしたポリペプチド発
現細胞を精製し、スクリーニングし、または分離するのに有用である。固相から陽性に選
択された細胞を遊離させる方法は当該技術分野に知られ、そして例えば酵素の使用を含む
。こうした酵素は好ましくは細胞に対し非毒性および非傷害性であり、そして好ましくは
細胞表面結合パートナーを切断するよう、指示される。
【０１０８】
あるいは、本発明のポリペプチド発現細胞を含むと疑われる細胞混合物をまず、ビオチ
ン化した本発明のポリペプチド結合タンパク質とインキュベーションしてもよい。インキ
ュベーション時間は、本発明のポリペプチドへの十分な結合を確実にするため、典型的に
は少なくとも連続１時間である。生じた混合物をその後、アビジン被覆ビーズを充填した
カラムに通過させ、それによりアビジンに対するビオチンの高い親和性が、ポリペプチド
結合細胞のビーズへの結合を提供する。アビジン被覆ビーズの使用は当該技術分野に知ら
れる。Ｂｅｒｅｎｓｏｎら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０Ｄ：２３９
（１９８６）を参照されたい。非結合成分の洗浄および結合細胞の遊離は、慣用法を用い
行う。
【０１０９】
望ましい純度は、タンパク質の意図される使用に依存する。例えば、タンパク質がｉｎ
ｖｉｖｏで投与されるとき、比較的高い純度が望ましい。こうした場合、ポリペプチド
は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析に際し、
他のタンパク質に相当するタンパク質バンドが検出不能であるように精製される。当業者
は、異なる糖鎖付加、異なる翻訳後プロセシング等により、該ポリペプチドに相当する多
数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化される可能性があることを認識するであろう
。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の際、単一の
タンパク質バンドにより示されるように、実質的に均一に精製される。タンパク質バンド
は銀染色、クーマシーブルー染色により、または（タンパク質が放射標識されている場合
は）オートラジオグラフィーにより、視覚化してもよい。
【０１１０】
アッセイ
本発明の精製ポリペプチド（タンパク質、ポリペプチド、断片、変異体、オリゴマー、
および他の型を含む）を、慣用的な結合アッセイなど、いかなる適切なアッセイにおいて
、ＴＳＬＰ受容体に結合する能力に関し試験してもよい。例として、ポリペプチドを検出
可能試薬（例えば、放射性核種、発色団、比色もしくは蛍光分光反応を触媒する酵素など
）で標識してもよい。標識ポリペプチドを、ＴＳＬＰ受容体を発現している細胞と接触さ
せる。細胞をその後、洗浄し、非結合標識ポリペプチドを除去し、そして細胞に結合して
いる標識の存在を、標識の性質にしたがい選択される適切な技術により、決定してもよい
。
【０１１１】
結合アッセイ法の１つの例は以下の通りである。当該技術分野に知られる方法により、
ＴＳＬＰ ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターを構築する。マウスＴＳＬＰ受容体は、Ｎ
−末端細胞外ドメイン、膜貫通領域、およびＣ−末端細胞質ドメインを含む。１０ ｃｍ
２プレート中のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞を該組換え発現ベクターでトランスフェクショ
ンする。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４７８）は、ＣＭＶ極初
期エンハンサー／プロモーターからドライブされるＥＢＶ核抗原１を恒常的に発現する。
ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は、ＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１（１９９
１））に記載されるように、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
７０）由来であった。
【０１１２】
トランスフェクション細胞を２４時間培養し、そして各プレート中の細胞をその後、２
４ウェルプレートに分ける。さらに４８時間培養した後、トランスフェクション細胞（約
４ ｘ １０４細胞／ウェル）をＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。ＢＭ−ＮＦＤＭは５０ ｍ
ｇ／ｍｌ脱脂粉乳が添加されている結合培地（２５ ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２
ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．２を含むＲＰＭＩ
１６４０）である。該細胞をその後、多様な濃度の、例えば上述のように作成された可
溶性ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質と、３７℃で１時間インキュベーションする。細
胞をその後、洗浄し、そして結合培地中で、１２５Ｉマウス抗ヒトＩｇＧの一定の飽和濃
度で、穏やかに攪拌しながら３７℃で１時間インキュベーションする。徹底した洗浄の後
、トリプシン処理を介し細胞を遊離させる。
【０１１３】
上に使用されるマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けられ、そし
てＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎ
ｃ．、ペンシルバニア州ウェストグローブから得ることが可能である。抗体は標準的クロ
ラミン−Ｔ法を用い、放射ヨウ素標識される。該抗体は、細胞に結合しているいかなるポ
リペプチド／Ｆｃタンパク質のＦｃ部分にも結合するであろう。すべてのアッセイにおい
て、１２５Ｉ抗体の非特異的結合をＦｃ融合タンパク質／Ｆｃの非存在下でアッセイする
と共に、Ｆｃ融合タンパク質および２００倍のモル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体
の存在下でもアッセイする。
【０１１４】
細胞結合１２５Ｉ抗体は、Ｐａｃｋａｒｄ Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンターで定量化す
る。親和性計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
５１：６６０（１９４９））はＭｉｃｒｏｖａｘコンピューター上で実行されるＲＳ／
１（ＢＢＮ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、マサチューセッツ州ボストン）上で生み出される。
【０１１５】
別の種類の適切な結合アッセイは、競合結合アッセイである。例えば、変異体の生物学
的活性は、該変異体が、ＴＳＬＰ受容体への結合に関し、天然タンパク質と競合する能力
をアッセイすることにより、決定してもよい。
【０１１６】
競合結合アッセイは、慣用的方法論により、行いうる。競合結合アッセイに使用しても
よい試薬には、放射標識ＴＳＬＰ、およびＴＳＬＰ受容体（内因性または組換え）を細胞
表面に発現している、損なわれていない細胞が含まれる。例えば、放射標識可溶性ＴＳＬ
Ｐ断片を用い、細胞表面ＴＳＬＰ受容体への結合に関し、可溶性ＴＳＬＰ変異体と競合さ
せてもよい。損なわれていない細胞の代わりに、（固相上の）プロテインＡまたはプロテ
インＧのＦｃ部分との相互作用を通じ固相に結合している可溶性ＴＳＬＰ受容体／Ｆｃ融
合タンパク質で代用してもよい。プロテインＡおよびプロテインＧを含むクロマトグラフ
ィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．、ニュージャージー
州ピスカタウェイより入手可能なものが含まれる。
【０１１７】
別の種類の競合結合アッセイは、放射標識可溶性ＴＳＬＰ受容体、例えばＴＳＬＰ受容
体／Ｆｃ融合タンパク質、および内因性または組換えＴＳＬＰ受容体を発現する、損なわ
れていない細胞を利用する。放射標識ＴＳＬＰ受容体を用い、可溶性ＴＳＬＰに関し、膜
結合ＴＳＬＰ受容体と競合させてもよい。定性的結果は、競合オートラジオグラフプレー
ト結合アッセイにより得てもよく、一方、定量的結果を生成するのにＳｃａｔｃｈａｒｄ
プロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１
：６６０（１９４９））を利用してもよい。
【０１１８】
ヒトＴＳＬＰ核酸またはオリゴヌクレオチドの使用
上述のように、ポリペプチドを発現するのに用いられるほか、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮ
Ａを含む本発明の核酸およびそのオリゴヌクレオチドを以下に用いてもよい：
Ｂ細胞系譜またはＴ細胞系譜細胞増殖を誘導する能力を有するタンパク質をコードする
核酸を同定するためのプローブとして；
ヒト染色体第５番を同定するため
ヒト染色体第５番上の遺伝子をマッピングするため
ヒト染色体第５番と関連する、特定の疾患、症候群、または他の異常に関連する遺伝子
を同定するため；
一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ＴＳＬＰ遺伝子にコード
されるポリペプチドの発現を阻害するため；
個体において不全遺伝子を検出するのを補助するため；および
遺伝子治療のため。
【０１１９】
プローブ
本発明の核酸の使用の中に、プローブまたはプライマーとしての断片の使用がある。こ
うした断片は、一般的に、ＤＮＡ配列の少なくとも約１７の隣接するヌクレオチドを含む
。他の態様において、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも３０、または少なくとも６
０の隣接するヌクレオチドを含む。
【０１２０】
他の哺乳動物種由来の配列番号１の相同体が本明細書に意図されるため、配列番号１の
ヒトＤＮＡ配列に基づくプローブを用い、慣用的な種間（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）
ハイブリダイゼーション技術を用い、他の哺乳動物種由来のｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングしてもよい。
【０１２１】
遺伝暗号の知識を、上に示されるアミノ酸配列と組み合わせて用い、縮重オリゴヌクレ
オチドの組を調製してもよい。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ断片を単離
しそして増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーとして有用であ
る。
【０１２２】
染色体マッピング
配列番号１のすべてまたは一部は、オリゴヌクレオチドを含め、当業者により、周知の
技術を用い、ヒト染色体第５番、および他のＴＳＬＰファミリーメンバーのＤＮＡを含む
可能性がある、特定のその遺伝子座を同定するのに用いてもよい。有用な技術には、限定
されるわけではないが、放射ハイブリッド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ）マッピ
ング（高解像度）、染色体伸展（ｓｐｒｅａｄ）に対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーション（中程度の解像度）、および個々のヒト染色体を含むハイブリッド細胞株に対す
るサザンブロットハイブリダイゼーション（低解像度）などの、多様な周知の技術におけ
るプローブとして、オリゴヌクレオチドを含む、配列または部分を使用することを含む。
【０１２３】
例えば、染色体はＰＣＲおよび放射ハイブリダイゼーションを用いることによりマッピ
ングしてもよい。９３の放射ハイブリッドのＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／
ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇ
ｅ４パネルを用い、ＰＣＲを行う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ
．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ
／ｊｕｌｙ９７／ｒｈｍａｐ／ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４．ｈｔｍｌ）。目的の遺伝子の推
定上のエクソン内にあり、イントロンに渡り、またはイントロン・エクソン断片に渡り、
そしてヒトゲノムＤＮＡから産物を増幅するが、例えばコントロール・ハムスターゲノム
ＤＮＡを増幅しないプライマーを用いる。ＰＣＲの結果をデータベクトルに変換し、イン
ターネット上のＷｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ放射マッピングサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ−ｓｅｑ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）に提出する。該データはスコア化され、そして放射
ハイブリッドマップ上の既知の配列タグ部位（ＳＴＳ）マーカーに比べた染色体割り当て
および配置が提供される。以下のウェブサイトは、放射ハイブリッドマッピングに関し、
さらなる情報を提供する：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂ
ｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／０７−９７．ＩＮ
ＴＲＯ．ｈｔｍｌ。
【０１２４】
関連する疾患の同定
以下に示すように、ネズミ遺伝子のシンテニー解析（ｓｙｎｔｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓ
ｉｓ）により、配列番号１は染色体第５番のｑ２１−ｑ２２領域にマッピングされている
。したがって、当業者は、周知の技術を用い、ガードナー症候群、線腫様結腸ポリポーシ
ス、遺伝性類線維腫疾患、ターコット症候群、および結腸直腸癌を含む、ヒト染色体第５
番、および特に染色体第５番のｑ２１−ｑ２２領域に関連する異常を解析するのに、配列
番号１の核酸またはその断片を用いてもよい。これにより本マーカーが再配置または欠失
されている状態を識別することが可能になる。さらに、配列番号１のヌクレオチドまたは
その断片は、未知の位置の他の遺伝子をマッピングする、位置マーカーとして用いてもよ
い。
【０１２５】
本発明の核酸に相当する遺伝子の不全または不十分な量により（直接または間接的に）
仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのに、該ＤＮＡを用いてもよい。天然ヌ
クレオチド配列の本明細書の開示により、不全遺伝子の検出、および正常遺伝子でのその
置換が可能になる。不全遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイにおいて、そして本明
細書に開示される天然ヌクレオチド配列と、本遺伝子に不全を宿すると疑われるヒト由来
の遺伝子のものとを比較することにより、検出してもよい。
【０１２６】
センス−アンチセンス
核酸の他の有用な断片には、標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配
列に結合することが可能な一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡいずれか）を含む、アン
チセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスまたはセンスオリゴ
ヌクレオチドは、本発明にしたがい、ＤＮＡの断片（配列番号１）を含む。こうした断片
は、一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４ないし約３０ヌクレオ
チドを含む。既定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンスまたは
センスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：２６５９（１９８８））およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら（
ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８（１９８８））に記載されている。
【０１２７】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、ＲＮアーゼ
ＨによるｍＲＮＡ分解の亢進、スプライシングの阻害、転写または翻訳の未成熟な終結、
あるいは他の手段によるものを含む、いくつかの手段の１つにより、タンパク質発現を遮
断するまたは阻害する二重鎖の形成を生じる。このように、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを用い、タンパク質の発現を遮断することが可能である。アンチセンスまたはセンス
オリゴヌクレオチドはさらに、修飾糖−ホスホジエステル骨格（または、ＷＯ ９１／０
６６２９に記載されるものなど、他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、そし
てこのような糖結合は内因性ヌクレアーゼに耐性である。耐性糖結合を持つこうしたオリ
ゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで安定である（すなわち酵素分解に抵抗することが可
能である）が、標的ヌクレオチド配列に結合することが可能な配列特異性を保持する。
【０１２８】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ ９０／１０４４８
に記載されるものなどの有機部分、およびポリ−（Ｌ−リジン）などの標的核酸配列に対
するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に共有結合しているオリゴヌクレ
オチドが含まれる。さらに、エリプチシンなどの挿入剤、およびアルキル化剤または金属
錯体がセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合し、標的ヌクレオチド配列へ
のアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾してもよい。
【０１２９】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、リポフェクション、ＣａＰ
Ｏ４仲介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む、いかなる遺伝子
トランスファー法により、あるいはエプスタイン・バーウイルスなどの遺伝子トランスフ
ァーベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。
【０１３０】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ ９１／０４７５３に記載
されるように、リガンド結合分子との結合体の形成により、標的ヌクレオチド配列を含む
細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子には、限定されるわけではないが、細胞
表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガン
ドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子の結合体化は、実質的にリガンド結合分子
がその対応する分子または受容体に結合する能力に干渉せず、あるいはセンスまたはアン
チセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合体型が細胞内に入るのを遮断しない。
【０１３１】
あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９０／１０４４８
に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含
む細胞に導入してもよい。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は
、好ましくは、内因性リパーゼにより、細胞内で分離される。
【０１３２】
ヒトＴＳＬＰポリペプチドおよび断片化ポリペプチドの使用
使用には、限定されるわけではないが、以下が含まれる：
タンパク質の精製およびその活性の測定
搬送剤
療法および研究用試薬
分子量および等電点電気泳動マーカー
ペプチド断片化のコントロール
未知のタンパク質の同定
抗体の調製。
【０１３３】
精製試薬
本発明のポリペプチドは、タンパク質精製試薬として使用を見出す。例えば、該ポリペ
プチドは、ＴＳＬＰ結合パートナー、例えばヒトＴＳＬＰ受容体を精製するのに用いても
よい。特定の態様において、ポリペプチド（ＴＳＬＰ受容体に結合することが可能な、本
明細書に記載されるいかなる型でもよい）を、慣用法により固体支持体に結合させる。１
つの例として、タンパク質のアミノ酸側鎖上の官能基と反応するであろう官能基を含む、
アフィニティークロマトグラフィーカラムが入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。あるいは、ＴＳＬＰポ
リペプチド／Ｆｃタンパク質（上述のようなもの）を、Ｆｃ部分との相互作用を通じ、プ
ロテインＡまたはプロテインＧ含有クロマトグラフィーカラムに結合させる。
【０１３４】
該ポリペプチドはまた、細胞表面上にＴＳＬＰ受容体を発現する細胞を精製する、また
は同定するのに使用を見出す。ポリペプチドを、カラムクロマトグラフィーマトリックス
または同様の適切な支持体などの固相に結合させる。例えば、磁気微小球体をポリペプチ
ドで被覆し、そして磁気場を通じインキュベーション容器に保持してもよい。ＴＳＬＰ受
容体発現細胞を含む細胞混合物の懸濁物を、ポリペプチドをその上に有する固相と接触さ
せる。細胞表面上にＴＳＬＰ受容体を発現する細胞を固定ポリペプチドに結合させ、そし
てその後、非結合細胞を洗い流す。
【０１３５】
あるいは、ポリペプチドを検出可能な部分に結合させ、その後、ＴＳＬＰ受容体発現に
関し試験しようとする細胞とインキュベーションしてもよい。インキュベーション後、非
結合標識成分を除去し、そして細胞上の検出可能部分の存在または非存在を測定する。
【０１３６】
さらに別の代替物において、ＴＳＬＰ受容体を含むと疑われる細胞混合物をビオチン化
ポリペプチドとインキュベーションする。インキュベーション時間は、十分な結合を確実
にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。生じた混合物をその後、アビジン
被覆ビーズを装填したカラムに通過させ、これによりビオチンのアビジンに対する高い親
和性が、望ましい細胞のビーズへの結合を提供する。アビジン被覆ビーズを用いる方法が
知られる（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０Ｄ：２
３９（１９８６）を参照されたい）。非結合成分を除去するための洗浄、および結合細胞
の遊離は、慣用法を用い行う。
【０１３７】
活性測定
ポリペプチドはまた、その結合親和性に関しＴＳＬＰ受容体の生物学的活性を測定する
のにも使用を見出す。したがって、ポリペプチドは、例えば異なる条件下でのタンパク質
の貯蔵寿命および安定性をモニターするための、「品質保証」研究を行うものにより、使
用してもよい。例えば、ポリペプチドを結合親和性研究に使用し、異なる温度で保存され
ている、または異なる細胞種で産生されたＴＳＬＰ受容体の生物学的活性を測定してもよ
い。該タンパク質はまた、ＴＳＬＰ受容体の修飾（例えば、化学的修飾、一部切除、突然
変異など）後、生物学的活性が保持されているかどうか決定するのにも用いてもよい。修
飾ＴＳＬＰ受容体の結合親和性を非修飾ＴＳＬＰ受容体のものと比較し、ＴＳＬＰ受容体
の生物学的活性に対する該修飾のいかなる不利な影響も検出する。したがって、例えばＴ
ＳＬＰ受容体の生物学的活性を、調査研究において用いる前に確認することが可能である
。
【０１３８】
搬送剤
該ポリペプチドはまた、結合する剤を、ＴＳＬＰ受容体を持つ細胞に搬送するためのキ
ャリアーとしての使用も見出す。ＴＳＬＰ受容体発現細胞には、胸腺、脾臓、腎臓、およ
び骨髄に同定されるものが含まれる。したがって、該ポリペプチドを用い、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法において、診断用剤または療法剤をこうした細胞に（または
細胞表面上にＴＳＬＰ受容体を発現することが見出されている他の細胞種に）搬送しても
よい。
【０１３９】
ポリペプチドに結合させてもよい検出可能な剤（診断用剤）および療法剤には、限定さ
れるわけではないが、毒素、他の細胞毒性剤、薬剤、放射性核種、発色団、比色もしくは
蛍光分光反応を触媒する酵素等が、意図される適用にしたがって選択される特定の剤と共
に含まれる。毒素の中には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リボソーム不活性化タンパク質、トリコ
セセンなどのマイコトキシン、並びにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）がある
。診断使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、１２３Ｉ、１３１Ｉ、
９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、および７６Ｂｒがある。療法使用に適した放射性核種の例には
、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、７７Ｂｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ
、１０９Ｐｄ、６４Ｃｕ、および６７Ｃｕがある。
【０１４０】
こうした剤は、いかなる適切な慣用法により、ポリペプチドに結合させてもよい。ポリ
ペプチドは、例えば、望ましい剤上の官能基と反応し、共有結合を形成することが可能で
ある、アミノ酸側鎖上の官能基を含む。あるいは、タンパク質または剤を誘導体化し、望
ましい反応性官能基を生成し、または結合させてもよい。誘導体化には、多様な分子をタ
ンパク質に結合させるのに利用可能である、二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）の１つの結合を伴って
もよい。タンパク質を放射標識するためのいくつかの技術が知られる。放射性核種金属を
、例えば適切な二官能性キレート剤を用いることにより、ポリペプチドに結合させてもよ
い。
【０１４１】
ポリペプチドおよび適切な診断用剤または療法剤を含む（好ましくは共有結合している
）結合体をこのように調製する。特定の適用に適した量で、該結合体を投与し、またはそ
うでなければ使用してもよい。
【０１４２】
療法剤
本発明のポリペプチドを、ポリペプチドの不全、または不十分な量により（直接または
間接的に）仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのに用いてもよい。これらの
ポリペプチドを、こうした障害を患う哺乳動物に投与してもよい。
【０１４３】
ポリペプチドはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法において、ＴＳＬＰ受
容体の生物学的活性を阻害するのにも使用してもよい。例えば、精製または修飾ポリペプ
チドまたはその断片（例えば、受容体に結合するが、情報伝達を誘導する能力を欠く、修
飾ＴＳＬＰポリペプチド）を用い、内因性ＴＳＬＰの細胞表面受容体への結合を阻害して
もよい。こうして、内因性ＴＳＬＰの受容体への結合から生じる生物学的影響を阻害する
。
【０１４４】
さらに、ＴＳＬＰ受容体ポリペプチドを哺乳動物に投与し、ＴＳＬＰ受容体が仲介する
障害を治療してもよい。こうしたＴＳＬＰ受容体仲介障害には、ＴＳＬＰ受容体により（
直接または間接的に）引き起こされるまたは悪化される異常が含まれる。
【０１４５】
本発明の組成物は、本明細書に記載されるいかなる型のポリペプチド、例えば天然タン
パク質、変異体、誘導体、オリゴマー、および生物学的に活性がある断片を含んでもよい
。特定の態様において、該組成物は、可溶性ポリペプチド、または可溶性ＴＳＬＰポリペ
プチドを含むオリゴマーを含む。
【０１４６】
本発明のポリペプチドの有効量を、生理学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、または
賦形剤などの他の構成要素と組み合わせて含む組成物が、本明細書に提供される。薬学的
に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法にしたがい、ポリペプチドを処方し
てもよい。これらは、単一の活性成分として、または既定の徴候に適した他の既知の活性
成分と共に、薬学的に許容しうる希釈剤（例えば、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸
、およびリン酸緩衝液）、保存剤（例えば、チメロサル、ベンジルアルコール、パラベン
類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーと混合して組み合わせ
てもよい。薬剤組成物に適した処方には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１６版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ， ペンシルバニア州イーストン（１９８０）に記載されるものが含まれる。
【０１４７】
さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体
化していてもよく、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストランなど
のポリマー化合物に取り込まれていてもよく、またはリポソーム、微小乳剤、ミセル、単
層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに取り込まれていてもよ
い。こうした組成物は、物理的状態、可溶性、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、および
ｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えるであろうし、そしてしたがって意図され
る適用にしたがい、選択される。
【０１４８】
本発明の組成物は、例えば局所、非経口、または吸入によるなど、いかなる適切な方式
で、投与してもよい。「非経口」という用語には、例えば皮下、静脈内、または筋内経路
による注射が含まれ、また例えば疾患または損傷の部位での局所化投与も含まれる。移植
物からの持続放出もまた、意図される。当業者は、適切な投薬量が、治療しようとする障
害の性質、患者の体重、年齢、および全身状態、並びに投与経路などの要因に応じ、多様
であろうことを認識するであろう。予備的用量は動物試験にしたがい決定してもよく、そ
してヒト投与のための投薬量の見積もりを、当該技術分野に認められる実施にしたがい、
行う。
【０１４９】
生理学的に許容しうる処方中の核酸を含む組成物もまた、意図される。ＤＮＡは、例え
ば注射のため処方してもよい。
研究用剤
本発明のポリペプチドの別の使用は、異なる細胞種上のＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ受容体相互
作用を阻害することから生じる生物学的影響を研究するための研究ツールとしての使用で
ある。ポリペプチドはまた、ＴＳＬＰまたはＴＳＬＰ受容体あるいはそれらの相互作用を
検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに使用してもよい。
【０１５０】
本発明の別の態様は、Ｂ細胞またはＴ細胞情報伝達を研究するためのヒトＴＳＬＰの使
用に関する。ヒトＴＳＬＰおよび他のサイトカインは、細胞シグナルを伝達し、細胞を刺
激しサイトカインを分泌させ、そしてＢ細胞およびＴ細胞増殖を誘導することを含め、Ｂ
細胞およびＴ細胞発生、並びに免疫反応に中心的な役割を果たす。こうしたものとして、
ＴＳＬＰの発現および／または活性化における改変は、限定されるわけではないが、細胞
特異的反応および増殖の活性化または阻害を含む、多くの細胞過程に激しい影響を有する
可能性がある。クローン化ＴＳＬＰまたはＴＳＬＰの触媒的に不活性な突然変異体の発現
は、特定のタンパク質が特定の情報伝達事象を仲介するのに果たす役割を同定するために
用いられてきている。
【０１５１】
細胞情報伝達は、しばしば、分子活性化カスケードを伴い、該カスケード中、受容体が
、標的基質をリン酸化する細胞内キナーゼを特異的に活性化することにより、リガンド−
受容体仲介シグナルを伝達する。これらの基質は、それ自体キナーゼであってもよく、該
基質がリン酸化後活性化されてもよい。あるいは、該基質は、リン酸化後、タンパク質−
タンパク質相互作用を通じ、下流情報伝達を容易にするアダプター分子であってもよい。
基質分子の性質に関係なく、発現されたＴＳＬＰリガンド受容体の触媒的に活性である型
を用い、ＴＳＬＰリガンド受容体により、どの基質が認識されそして活性化されるか同定
してもよい。このようなものとして、これらの新規ＴＳＬＰ受容体は、情報伝達経路に関
与する新規分子を同定する試薬として用いてもよい。
【０１５２】
さらに、ＴＳＬＰを用い、当業者により、Ｂ細胞系譜およびＴ細胞系譜細胞増殖を刺激
する周知の技術（Ｒａｙら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２６、 １０−
１６（１９９６）およびＮａｍｉｋａｗａら， Ｂｌｏｏｄ ８７：１８８１−１８９０
（１９９６））を用い、ヒトＴＳＬＰ受容体を発現クローニング（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｃｌｏｎｅ）し（Ｓｉｍｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５８５−５８９（１９８８
））、関連タンパク質をクローニングし（Ｋｏｚｌｏｓｋｙら， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９
：５４０−５４９（１９９７）およびＬｙｍａｎら， Ｂｌｏｏｄ １０：２７９５−２
８０１（１９９４））、そして細胞をｅｘ ｖｉｖｏ拡大し（Ｐｉａｃｉｂｅｌｌｏら，
Ｂｌｏｏｄ ８９：２６４４−２６５３（１９９７））てもよい。
【０１５３】
その使用
したがって、本発明は、ＢおよびＴリンパ球増殖を刺激する方法であって、ヒトＴＳＬ
Ｐとリンパ球をインキュベーションすることを含む前記方法を含む。さらなる態様におい
て、該方法は、ヒトＴＳＬＰおよび少なくとも１つの他のサイトカインとリンパ球を、ｉ
ｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションすることを含む。好ましくは
、サイトカインは、ＩＬ−７、スチール因子、幹細胞因子、マスト細胞増殖因子またはｆ
ｌｔ３リガンドの群より選択される。より好ましくは、サイトカインはＩＬ−７である。
【０１５４】
本発明はまた、リンパ球発生またはリンパ球新生を刺激する方法であって、ヒトＴＳＬ
Ｐと、前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、例えば骨髄由来単核細胞を、ｉｎ
ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションすることを含む、前記方法も含
む。さらなる態様において、該方法は、ヒトＴＳＬＰおよび少なくとも１つの他のサイト
カインとリンパ球をインキュベーションすることを含む。好ましくは、サイトカインは、
ＩＬ−７、スチール因子、幹細胞因子、マスト細胞増殖因子またはｆｌｔ３リガンドの群
より選択される。より好ましくは、サイトカインはＩＬ−７である。
【０１５５】
分子量および等電点マーカー
本発明のポリペプチドは、化学的および酵素的手段により、より小さいペプチドへの断
片化に供してもよく、そしてこうして産生されたペプチド断片を、他のタンパク質または
ポリペプチドの解析に用いてもよい。例えば、こうしたペプチド断片を、ペプチド分子量
マーカー、ペプチド等電点マーカーとして、またはペプチド断片化の度合いの解析におい
て、用いてもよい。したがって、本発明はまた、これらのポリペプチドおよびペプチド断
片並びに、未知のタンパク質の見かけの分子量および等電点の決定を援助するキット、お
よび未知のタンパク質の断片化の度合いを評価するキットも含む。
【０１５６】
断片化の方法すべてが本発明に含まれるが、化学的断片化が好ましい態様であり、そし
て特異的な切断がメチオニン残基で起こるように、中性または酸性条件下で切断する臭化
シアンの使用が含まれる（Ｅ． Ｇｒｏｓｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ． １１
：２３８−２５５（１９６７））。これは、システイン残基を非反応種に変換するカルボ
キシメチル化段階などのさらなる段階を、さらに含んでもよい。
【０１５７】
酵素的断片化には、アスパラギン・エンドペプチダーゼ、アルギニン・エンドペプチダ
ーゼ、アクロモバクター・プロテアーゼＩ、トリプシン、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、
またはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃなどのプロテアーゼの、特定のアミノ酸残基での
切断を生じる慣用的な条件下での使用が含まれる。アスパラギン・エンドペプチダーゼは
、本発明のポリペプチド内に存在するアスパラギン残基のカルボキシル側を特異的に切断
することが可能である。アルギニン・エンドペプチダーゼは、これらのペプチド内に存在
するアルギニン残基のカルボキシル側を特異的に切断することが可能である。アクロモバ
クター・プロテアーゼＩは、該ポリペプチド内に存在するリジン残基のカルボキシル側を
特異的に切断することが可能である（ＳａｋｉｙａｍａおよびＮａｋａｔ、米国特許第５
，２４８，５９９号；Ｔ． Ｍａｓａｋｉら， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ ６６０：４４−５０（１９８１）；Ｔ． Ｍａｓａｋｉら， Ｂｉｏｃｈｉｍ
． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６６０：５１−５５（１９８１））。トリプシンは、
本発明のポリペプチド内に存在するアルギニンおよびリジン残基のカルボキシル側を特異
的に切断することが可能である。酵素的断片化はまた、多数のアミノ酸残基で切断するプ
ロテアーゼでも起こる可能性がある。例えば、黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼは、ポリ
ペプチド内に存在するアスパラギン酸およびグルタミン酸残基のカルボキシル側を特異的
に切断することが可能である（Ｄ． Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ３：１１０２−１１０６（１９７７））。エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ
は、ポリペプチド内に存在するアスパラギン残基のアミノ側を特異的に切断することが可
能である。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃは、本発明のポリペプチド内に存在するリジ
ン残基のカルボキシル側を特異的に切断することが可能である。他の酵素的および化学的
処理を、同様に用い、これらのポリペプチドを特定のペプチドの特有の組に断片化しても
よい。
【０１５８】
もちろん、本発明のペプチドおよびポリペプチドの断片はまた、当該技術分野に周知の
慣用的な組換え法および合成法により産生してもよい。組換え法に関し、本発明に含まれ
るポリペプチドおよびペプチド断片は、これらが発現される宿主細胞に応じ、多様な分子
量を有する可能性がある。多様な細胞種における本発明のポリペプチドおよびペプチド断
片の糖鎖付加は、修飾の度合いに応じ、これらの片（ｐｉｅｃｅ）の分子量の変動を生じ
る可能性がある。これらの片の大きさは、該ポリペプチドの細胞外部分由来のポリペプチ
ド断片で最も雑多である可能性がある。一貫したポリペプチドおよびペプチド断片は、完
全に膜貫通および細胞質領域由来のポリペプチドを用いる、Ｎ−グリカナーゼで前処理し
、糖鎖付加を除く、または細菌宿主でポリペプチドを発現させることにより、得ることが
可能である。
【０１５９】
これらのポリペプチドの分子量はまた、本発明のポリペプチドのアミノおよびカルボキ
シル末端両方に、さらなるペプチド配列を融合させることにより、変化させてもよい。本
発明のポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端でのさらなるペプチド配列の融合を
用い、これらのポリペプチドの発現を亢進し、または該タンパク質の精製を援助してもよ
い。さらに、本発明のポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端でのさらなるペプチ
ド配列の融合は、酵素的または化学的処理により生成されるポリペプチドの断片化ペプチ
ドを、通常すべてではないがいくつか、改変するであろう。もちろん、分子生物学の日常
的でそして既知の技術を用い、本発明のポリペプチドに、突然変異を導入してもよい。例
えば、特定の酵素によるタンパク質分解切断の部位または特定の化学的に誘導される断片
化法による切断の部位を除去するように、突然変異を設計してもよい。該部位の除去は、
特定の酵素または化学的方法での断片化に際し、本発明のポリペプチドのペプチドフィン
ガープリントを改変するであろう。
【０１６０】
ポリペプチドおよび生じた断片化ペプチドは、沈降、電気泳動、クロマトグラフィー、
および質量分析を含む方法により解析し、それらの分子量を決定してもよい。各片の特有
のアミノ酸配列が分子量を特定するため、これらの片はその後、未知のタンパク質、ポリ
ペプチドまたはその断片の分子量決定を援助するこうした解析技術を用い、分子量マーカ
ーとして利用することが可能である。本発明の分子量マーカーは、同様の見かけの分子量
を有するタンパク質の見かけの分子量概算のための分子量マーカーとして特によく働き、
そしてその結果、タンパク質の見かけの分子量測定の正確さを増加させることが可能にな
る。
【０１６１】
本発明が断片化ペプチド分子量マーカーの使用に関する場合、これらのマーカーは、好
ましくは大きさが少なくとも１０アミノ酸である。より好ましくは、これらの断片化ペプ
チド分子量マーカーは、大きさが１０および１００アミノ酸の間である。さらにより好ま
しいのは、大きさが１０および５０アミノ酸の間の断片化ペプチド分子量マーカーであり
、そして特に大きさが１０および３５アミノ酸の間のものである。最も好ましいのは、大
きさが１０および２０アミノ酸の間の断片化ペプチド分子量マーカーである。
【０１６２】
分子量測定法の中に、沈降、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、および質量分析があ
る。特に好ましい態様は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕ．Ｋ． Ｌａｅｍｍ
ｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９７０））である。慣用的には、該
方法は、ドデシル硫酸ナトリウムおよび６−２０％の間の濃度のアクリルアミドを含むゲ
ルの２つの別個のレーンを用いる。マーカーおよび試料を、同一の条件下で同時に分離す
る能力により、正確さを増加させることが可能になる。もちろん、本発明のポリペプチド
を用いた未知のタンパク質の分子量測定には、多くの異なる技術を用いてもよく、そして
本態様はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【０１６３】
各非糖鎖付加ポリペプチドまたはその断片は、その特有のアミノ酸配列により本質的に
決定されるｐＩを有する（このｐＩは、当業者により、現在利用可能なｐＩ値を予測する
よう設計されたいかなるコンピュータープログラムを用い概算しても、いかなる周知のア
ミノ酸ｐＫａ表を用い計算しても、または実験により測定してもよい）。したがって、こ
れらのポリペプチドおよびその断片は、等電点電気泳動などの技術を用い、未知のタンパ
ク質、ポリペプチド、または断片化ペプチドの等電点測定を援助する、特定のマーカーと
して利用することが可能である。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーは
、本発明のポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーのものと近い見かけの等電点を有
する未知のタンパク質の見かけの等電点概算に、特によく働く。
【０１６４】
等電点電気泳動技術は、さらに、ゲル電気泳動などの他の技術と組み合わせ、分子量お
よび電荷に基づき、タンパク質を同時に分離してもよい。これらのポリペプチドまたは断
片化ペプチドマーカーおよび未知のタンパク質を、同一の条件下で同時に分離する能力に
より、未知のタンパク質の見かけの等電点測定の正確さを増加させることが可能になる。
これは、方法の性質が、いかなるマーカーも未知のタンパク質と同時に分離されることを
指令する、二次元電気泳動（Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ． Ｍａｄｉｇａｎ，
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ７６−７７， Ｐｒｅｎｔｉｃ
ｅ Ｈａｌｌ， 第６版（１９９１））などの技術に特有の目的である。さらに、こうし
た方法を用い、これらのポリペプチドおよびその断片化ペプチドは、未知のタンパク質ま
たは断片化ペプチドの等電点および分子量両方の測定を援助することが可能である。
【０１６５】
ポリペプチドおよび断片化ペプチドは、未知のタンパク質および分子量マーカー間の区
別を可能にする２つの異なる方法を用い、視覚化してもよい。１つの態様において、本発
明のポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーは、これらのマーカーに対して生
成された抗体および慣用的なイムノブロッティング技術を用い、視覚化してもよい。本検
出は、未知のタンパク質の検出を生じない慣用的な条件下で行われる。小さなペプチドは
免疫原性エピトープを含まない可能性があるため、本発明のすべてのポリペプチド断片に
対する抗体を生成することは不可能である可能性があることが理解される。さらに、本ア
ッセイにおいて、すべての抗体が働くわけではないであろうことが理解される；が、本発
明のポリペプチドおよび断片に結合することが可能な抗体は、慣用的技術を用い、容易に
決定することが可能である。
【０１６６】
未知のタンパク質もまた、慣用的染色法を用い、視覚化する。本発明のポリペプチドま
たは断片ペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質のモル過剰は、慣用的な染色
法が、主に未知のタンパク質を検出する程度である。これらのポリペプチドまたは断片化
ペプチド分子量マーカーレベルは、慣用的染色法により、これらのマーカーがほとんどま
たはまったく検出されない程度である。本発明のポリペプチド分子量マーカーに対する未
知のタンパク質の好ましいモル過剰は、２および１００，０００倍の間である。より好ま
しくは、これらのポリペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質の好ましいモル
過剰は、１０および１０，０００倍の間であり、そして特に１００および１，０００倍の
間である。
【０１６７】
もちろん、これらのポリペプチド分子量マーカーおよびそのペプチド断片を用いた未知
のタンパク質、ポリペプチド、およびその断片化ペプチドの分子量および等電点の測定お
よび検出に、多くの技術を用いてもよく、そしてこれらの態様はいかなる点でも本発明の
範囲を限定しないことが理解される。
【０１６８】
別の態様において、例えば断片化反応の時間または温度を改変することによる、本発明
のポリペプチドの特定のペプチドへの進行性断片化の解析（Ｄ．Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａｎ
ｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２−１１０６（１９７７））を
、未知のタンパク質の切断の度合いのコントロールとして用いてもよい。例えば、同量の
ポリペプチドおよび未知のタンパク質の、同一の条件下での切断により、断片化の度合い
の直接比較が可能になる。ポリペプチドの完全な断片化を生じる条件はまた、未知のタン
パク質の完全な断片化をも生じる可能性がある。
【０１６９】
分子量マーカーとしての本発明のポリペプチドおよび断片化ペプチドの特定の使用に関
しては、臭化シアンを用いた配列番号２のポリペプチドの断片化は、断片化ペプチド分子
量マーカーの特有の組を生じる。メチオニン残基の分布が各ペプチドのアミノ酸数を決定
し、そして各ペプチドの特有のアミノ酸組成がその分子量を決定する。
【０１７０】
さらに、本発明の好ましい精製ポリペプチド（配列番号２）は、およそ２１，０００ダ
ルトンの観察分子量を有する。
損なわれていないタンパク質を用いる場合、これらのポリペプチド分子量マーカーの使
用は、２１，０００ダルトンに近い見かけの分子量を有するタンパク質の見かけの分子量
の決定の正確さの増加を可能にする。断片を用いる場合、断片の分子量の範囲にわたる分
子量決定の正確さが増加する。
【０１７１】
最後に、本発明に含まれるキットに関しては、こうしたキットの構成要素は、多様であ
る可能性があるが、典型的には、ポリペプチドおよび断片化ペプチド分子量マーカーを含
む。また、こうしたキットは、断片化に必要な部位が除去されているポリペプチドを含ん
でもよい。さらに、キットは、ポリペプチドおよび未知のタンパク質の化学的または酵素
的切断による、特異的切断のための試薬を含んでもよい。キットはさらに、本発明のポリ
ペプチドまたはその断片に対して向けられる抗体を含んでもよい。
【０１７２】
未知のタンパク質の同定
上述のように、ポリペプチドまたはペプチドフィンガープリントを、既知のタンパク質
のデータベースに入力しまたは該データベースと比較し、質量分析を用いた未知のタンパ
ク質の同定を補助してもよい（Ｗ．Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０１１−５０１５（１９９３）；Ｄ． Ｆｅｎ
ｙｏら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９：９９８−１００５（１９９８））。
これらの比較を容易にする多様なコンピューターソフトウェアプログラム、例えばＰｒｏ
ｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（インターネットサイト：ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｓ
ｃｆ．ｅｄｕ）、ＭｕｌｔｉＩｄｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ
．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ
（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ
．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＿ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ Ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、
およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃ
ｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）な
どが、インターネットを介し利用可能である。これらのプログラムは、使用者が切断剤お
よび指示された許容範囲の断片化ペプチドの分子量を特定するのを可能にする。該プログ
ラムは、未知のタンパク質の同定の決定を援助するため、これらの分子量をタンパク質デ
ータベースと比較する。
【０１７３】
さらに、タンデム型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を用い、ポリペプチドまたはペプチド消
化物を配列決定し、そして生じた配列をデータベースに対し検索してもよい（Ｊ．Ｋ．
Ｅｎｇら， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． ５：９７６−９８９（１
９９４）；Ｍ． ＭａｎｎおよびＭ． Ｗｉｌｍ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６：４
３９０−４３９９（１９９４）；Ｊ．Ａ． ＴａｙｌｏｒおよびＲ．Ｓ． Ｊｏｈｎｓｏ
ｎ， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． １１：１０６７−１０７５（１
９９７））。本方法に用いてもよい検索プログラムは、Ｌｕｔｅｆｉｓｋ ９７（インタ
ーネットサイト：ｗｗｗ．ｌｓｂｃ．ｃｏｍ：７０／Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７．ｈｔｍｌ）
、並びに上述のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅａｒｃｈ
およびＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムなど、インターネット上に存在する。したがって、遺
伝子配列並びにその予測されるタンパク質配列およびペプチド断片を配列データベースに
添加することにより、タンデム型質量分析を用いた未知のタンパク質の同定を援助するこ
とが可能である。
【０１７４】
抗体
本発明のポリペプチドに免疫反応性である抗体が本明細書に提供される。こうした抗体
は、（非特異的結合と対照的に）抗体の抗原結合部位を介し、該ポリペプチドに特異的に
結合する。したがって、上述のようなポリペプチド、断片、変異体、融合タンパク質など
を、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用してもよい。より
詳細には、ポリペプチド、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗
原決定基またはエピトープを含む。
【０１７５】
これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもコンホメーション性（ｃｏｎｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。直鎖エピトープは、該ポリペプチド
のアミノ酸の単一の部分から構成されるが、コンホメーション性または断続的エピトープ
は、タンパク質フォールディングに際し接近する、ポリペプチド鎖の異なる領域由来のア
ミノ酸部分から構成される（Ｃ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙ， Ｊｒ．およびＰ． Ｔｒａｖ
ｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：９， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ Ｉｎｃ．， 第２版（１９９６））。フォールディングされたタンパク質は、複
雑な表面を有するため、利用可能なエピトープの数は非常に多い；が、タンパク質のコン
ホメーションおよび立体障害のため、実際にエピトープに結合する抗体の数は、利用可能
なエピトープの数より少ない（Ｃ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙ， Ｊｒ．およびＰ． Ｔｒａ
ｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１４， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， 第２版（１９９６））。エピトープは、当該技術分野に知られ
るいかなる手段により同定してもよい。
【０１７６】
したがって、本発明の１つの側面は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関す
る。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクロー
ナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のポリペプチド由来のエピトープは
、アッセイにおいて、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマ由来の上清な
どの材料から特異的に結合する抗体を精製する研究試薬として用いてもよい。こうしたエ
ピトープまたはその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学的または酵素的切断などの
、当該技術分野に周知の技術を用い、あるいは組換えＤＮＡ技術を用い、産生してもよい
。
【０１７７】
本発明のポリペプチドのエピトープにより引き出される可能性がある抗体に関しては、
エピトープが単離されていてもまたはポリペプチドの一部のままであっても、ポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術により調製することが可能である
。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：
Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ．
Ｋｅｎｎｅｔら（監修）， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８０）；
およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒ
ｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を
参照されたい。
【０１７８】
本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株
もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術により産生しそ
して同定してもよい。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動
物をポリペプチドで免疫感作し；免疫感作された動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細
胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し；そして該ポリペ
プチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを
含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術により回収してもよい。
【０１７９】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体の
ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既知の技術により調
製し、そして抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少という利点を提供してもよい
。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変部（またはその
抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定常部を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、
ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変部断片（抗原結合部
位を欠く）を含んでもよい。キメラおよび工学技術で作成されるさらなるモノクローナル
抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）
）、 Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ ８４：３４３９（１９８７））、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４（１９８９））、およびＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒ
ｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９（Ｍａｙ １９９３））に記載されるものが含まれる。
導入遺伝子的に抗体を生成する方法は、ＧＢ ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６
９，８２５号および５，５４５，８０６号並びにそれらから優先権を請求する関連特許に
見出すことが可能であり、該特許はすべて本明細書に援用される。
【０１８０】
慣用的技術により産生されてもよい、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。
こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が
含まれる。遺伝子工学技術により産生される抗体断片および誘導体もまた提供される。
【０１８１】
１つの態様において、抗体は本発明のポリペプチドに特異的であり、そして他のタンパ
ク質と交差反応しない。こうした抗体を同定することが可能なスクリーニング法が周知で
あり、そして例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーを伴ってもよい。
【０１８２】
抗体の使用
本発明の抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、本発明のポリペプチドま
たは断片の存在を検出するアッセイにおいて用いてもよい。抗体はまた、免疫アフィニテ
ィークロマトグラフィーにより本発明のポリペプチドまたは断片を精製するのに使用して
もよい。
【０１８３】
さらに本発明のポリペプチドのＴＳＬＰ受容体への結合を遮断することが可能な、これ
らの抗体を用い、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害してもよい。こうした遮断
抗体は、ＴＳＬＰ受容体を発現している特定の細胞へのＴＳＬＰの結合を阻害する能力に
関し、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用い、同定してもよ
い。こうした細胞の例は、ＢおよびＴリンパ球細胞株、それぞれ７０Ｚ／３および７Ｂ９
である。あるいは、遮断抗体は、ＴＳＬＰの標的細胞上のＴＳＬＰ受容体への結合から生
じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて同定してもよい。抗体は、例
えば、ＴＳＬＰ受容体発現細胞の、ＴＳＬＰ仲介溶解を阻害する能力に関しアッセイして
もよい。
【０１８４】
こうした抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法で使用し、またはｉｎ ｖｉｖｏで投与し、抗体
を生成した実体により仲介される生物学的活性を阻害してもよい。このように、ＴＳＬＰ
と細胞表面ＴＳＬＰ受容体との相互作用により、（直接または間接的に）引き起こされる
または悪化される障害を治療してもよい。療法は、ＴＳＬＰ仲介生物学的活性を阻害する
のに有効な量の遮断抗体を、哺乳動物にｉｎ ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、
こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結
合抗体断片が使用される。
【０１８５】
抗体は、アゴニスト性（すなわちリガンド模倣性）特性に関しスクリーニングしてもよ
い。こうした抗体は、細胞表面ＴＳＬＰ受容体への結合に際し、ＴＳＬＰが細胞表面ＴＳ
ＬＰ受容体に結合する際に誘導される生物学的影響と同様の生物学的影響（例えば生物学
的シグナルの伝達）を誘導する。アゴニスト性抗体を用い、Ｂ細胞系譜またはＴ細胞系譜
細胞増殖を誘導してもよい。
【０１８６】
ヒトＴＳＬＰに対して向けられる抗体、および生理学的に許容しうる希釈剤、賦形剤、
またはキャリアーを含む組成物が、本明細書に提供される。こうした組成物の適切な構成
要素は、ヒトＴＳＬＰタンパク質を含む組成物に関し、上述された通りである。
【０１８７】
やはり本明細書に提供されるのは、抗体に結合している検出可能（例えば診断用剤）ま
たは療法剤を含む結合体である。こうした剤の例は、上に示される。該結合体は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法に使用を見出す。
【０１８８】
以下の実施例は、本発明の特定の態様をさらに例示するため提供され、そして本発明の
範囲を限定すると解釈してはならない。
【実施例】
【０１８９】
実施例１：核酸の単離
ヒトＴＳＬＰ核酸配列は、ＥＳＴ ＩＭＡＧＥクローン１４０７２６０、寄託番号ＡＡ
８８９５８１を配列決定することにより、得た。ネズミＴＳＬＰ配列との比較により、本
配列は、ＥＳＴクローンが部分的クローンであることを示唆した。内部プライマーを用い
、いくつかのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ＴＳＬＰ ｃＤＮＡクローンの
失われている３’端を得るために用いることが可能なｃＤＮＡの供給源を決定した。ヒト
ＴＳＬＰ配列の２つの内部プライマーを用いた６０サイクルのＰＣＲの後、以下のｃＤＮ
ＡライブラリーがＴＳＬＰ配列に関し陽性であった：ヒト精巣、ヒト包皮線維芽細胞、お
よび胎児脳（弱陽性）；一方、全ＭｏＴ、ＨＳ４３１、骨髄、ＨＰＴ４、ＨＢＴ３、Ｗ１
２６、Ｈｕｔ１０２、ＰＢＴ、Ｓｋ Ｈｅｐ、ヒト真皮線維芽細胞、Ｒａｊｉ、ヒト胎盤
、およびＫＢライブラリーはすべて陰性であった。
【０１９０】
内部ＴＳＬＰプライマーおよびλｇｔ１０ベクタープライマーを用いた、ヒト精巣λｇ
ｔ１０ライブラリーに対するＰＣＲを用い、内部ヒトＴＳＬＰ配列と同一の配列を持つ２
つのクローン（１９Ｅおよび１９Ｆ）を単離した。両クローンは同一の５’端を有したが
、異なる長さの３’端を有した。クローン１９Ｅのコード配列及び非コード配列は、クロ
ーン１９Ｆと同一であり；これらのクローンは、３’非コード領域の長さが異なり、クロ
ーン１９Ｆは１９Ｅより、約３４ ｂｐ長かった。したがって、１９Ｆ由来の配列を用い
、ヒトＴＳＬＰタンパク質の３’コード領域配列を完成させた。これにより、ＥＳＴに存
在しないＣ−末端１５アミノ酸の同定が可能になった。ＰＣＲは慣用法にしたがい、行っ
た。
【０１９１】
実施例２：ＴＳＬＰポリペプチドの精製
ＴＳＬＰ特異的ＥＬＩＳＡ：
ＴＳＬＰ含有試料の連続希釈（ＮａＯＨでｐＨ ９にした５０ ｍＭ ＮａＨＣＯ３中
）で、Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉｔｅｒｔｅｋ ９６ウェル平底Ｅ．Ｉ．Ａ．マイクロタイトレ
ーションプレート（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、オハイオ州オーロラ）
を、１００：１／ウェルで被覆する。４℃で１６時間インキュベーションした後、２００
：１の０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）でウェルを６
回洗浄する。その後、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、１μｇ
／ｍｌのＦＬＡＧ（登録商標）−ＴＳＬＰ受容体と、ウェルを９０分間インキュベーショ
ンし（ウェル当たり１００：１）、その後、上述のように洗浄する。次に、各ウェルを、
抗ＦＬＡＧ（登録商標）（５％ ＦＣＳを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、１μｇ／ｍｌのモ
ノクローナル抗体Ｍ２）と、ウェルを９０分間インキュベーションし（ウェル当たり１０
０：１）、その後、上述のように洗浄する。続いて、ポリクローナルヤギ抗ｍＩｇＧ１特
異的西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体（５％ ＦＣＳを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、
商業的ストックの１：５０００希釈）と、ウェルを９０分間インキュベーションする（ウ
ェル当たり１００：１）。ＨＲＰ結合抗体は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．、アラバマ州バーミンガムから得る。その後
、ウェルを上述のように６回洗浄する。
【０１９２】
ＥＬＩＳＡの発色（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）のため、基質混合物［ＴＭＢペルオキシ
ダーゼ基質およびペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）の１：１プレミックスのウェル
当たり１００：１］をウェルに添加する。十分な呈色反応後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加（
ウェル当たり５０：１）により、酵素反応を終結させる。呈色強度（ＴＳＬＰ−ＴＳＬＰ
受容体結合を示す）は、Ｖ Ｍａｘプレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖ
ｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）上で、４５０ｎｍの消光を測定することによ
り、決定する。
【０１９３】
実施例３：アミノ酸配列
ヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列は、完全ヒトＴＳＬＰヌクレオチド配列の翻訳により、決
定した。選択された読み枠は、ヒトＴＳＬＰとネズミＴＳＬＰの相同性に基づいた。
【０１９４】
実施例４：ＤＮＡおよびアミノ酸配列
ヒトＴＳＬＰ核酸配列は、ＥＳＴ ＩＭＡＧＥクローン１４０７２６０、寄託番号ＡＡ
８８９５８１、およびクローン１９Ｆ由来のさらなる３’配列の合成配列の標準的二本鎖
配列決定により、決定した。
【０１９５】
単離ヒトＴＳＬＰ ＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ酸
配列は、配列番号１および２に示される。ＰＣＲにより単離された全ヒトＴＳＬＰ ＤＮ
Ａ断片の配列は、配列番号１のヌクレオチド１ないし７６７に相当し、該配列は配列番号
２のアミノ酸１ないし１５９をコードする。
【０１９６】
配列番号２のアミノ酸配列は、ネズミＴＳＬＰに有意な類似性（４９％）および同一性
（４３％）を持ち、そしてＩＬ−７に弱い相同性を持つ。
【０１９７】
実施例５：ＴＳＬＰに結合するモノクローナル抗体
本実施例は、ＴＳＬＰに結合するモノクローナル抗体を調製するための方法を例示する
。こうした抗体を生成するのに使用してもよい適切な免疫原には、限定されるわけではな
いが、精製ヒトＴＳＬＰポリペプチドまたはその免疫原性断片、例えば細胞外ドメイン、
またはヒトＴＳＬＰを含む融合タンパク質（例えば可溶性ＴＳＬＰ／Ｆｃ融合タンパク質
）が含まれる。
【０１９８】
精製ヒトＴＳＬＰを用い、慣用的な技術、例えば、米国特許第４，４１１，９９３号に
記載される技術を用い、ＴＳＬＰに免疫反応性であるモノクローナル抗体を生成してもよ
い。簡潔には、ヒトＴＳＬＰ免疫原を完全フロイントアジュバント中に乳化し、そして１
０−１００μｇの範囲の量を皮下または腹腔内注射して、マウスを免疫する。１０ないし
１２日後、不完全フロイントアジュバント中に乳化したさらなるヒトＴＳＬＰで、免疫動
物に追加免疫する。その後、毎週ないし隔週の免疫スケジュールで、マウスに定期的に追
加免疫する。後眼窩出血または尾先端切除により、血清試料を定期的に採取し、ドットブ
ロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）またはＴＳＬＰ受容体結合の
阻害により、ＴＳＬＰ抗体に関し試験する。
【０１９９】
適切な抗体力価の検出後、陽性動物に最後に一度、生理食塩水中のヒトＴＳＬＰを静脈
内注射する。３から４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞をネズミ
骨髄腫細胞株、例えばＮＳ１または好ましくはｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ １５８０）に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、これを非融
合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するため、ＨＡ
Ｔ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）選択培地中、多重マイクロタイ
タープレート中に蒔く。
【０２００】
ハイブリドーマ細胞をＥｎｇｖａｌｌら， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ． ８：８７１（１
９７１）および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術を適合させることによ
り、精製ＴＳＬＰに対する反応性に関し、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。好まし
いスクリーニング技術はＢｅｃｋｍａｎｎら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４：４２１
２（１９９０））に記載される抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を、同系Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射し、高濃度の抗ＴＳＬＰモノクローナル抗体を含む腹水を
産生してもよい。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、多様な技術によりフラスコまたは回
転ビン（ｒｏｌｌｅｒ ｂｏｔｔｌｅ）中でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させてもよい。マウ
ス腹水中に産生されたモノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈澱に続くゲル排除クロ
マトグラフィーにより精製してもよい。あるいは、抗体がプロテインＡまたはプロテイン
Ｇに結合することに基づくアフィニティークロマトグラフィーもまた用いてもよく、ＴＳ
ＬＰに結合することに基づくアフィニティークロマトグラフィーも用いてもよい。
【０２０１】
実施例６：ノーザンブロット解析
ヒトＴＳＬＰ ｍＲＮＡの組織分布を、以下のように、ノーザンブロット解析により調
べた。放射標識プローブのアリコットを、２つの異なるヒト多数組織ノーザンブロット（
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト；Ｂｉｏｃｈａｉｎ、カリフォルニア州
パロアルト）に添加した。ブロットを、１０ Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ、５０ ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ ｐＨ ７．５、９００ ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ピロリン酸Ｎａ、１％ Ｓ
ＤＳ、２００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ中でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーシ
ョンは、先に記載されるように（Ｍａｒｃｈら， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６４１−６４
７（１９８５））、５０％ホルムアミドで、６３℃で一晩行った。その後、ブロットを、
２ ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで、６８℃で３０分間、洗浄した。
【０２０２】
１．４キロ塩基（ｋｂ）の単一の転写物が、心臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾
臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸に存在した。陰性組織は、脳、胎盤、および
末梢血白血球であった。ＴＳＬＰ ｍＲＮＡが最も高いレベルの細胞および組織は、β−
アクチン特異的プローブで探査した（ｐｒｏｂｅ）コントロールとの比較により示される
ように、心臓、肝臓、前立腺、および精巣である。
【０２０３】
実施例７：結合アッセイ
全長ヒトＴＳＬＰを発現させ、そしてＴＳＬＰ受容体に結合する能力に関し、試験して
もよい。結合アッセイは、以下のように行うことが可能である。
【０２０４】
本アッセイでは、可溶性ヒトＴＳＬＰポリペプチドのＮ−末端に融合しているロイシン
ジッパーペプチドを含む融合タンパク質（ＬＺ−ＴＳＬＰ）を使用する。ＦＬＡＧ（登録
商標）ペプチドをコードするＤＮＡを、三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーをコ
ードする配列と置き換えた以外は、本質的に、本明細書に援用されるＷｉｌｅｙら（Ｉｍ
ｍｕｎｉｔｙ， ３：６７３−６８２（１９９５））において、ＦＬＡＧ（登録商標）（
ＴＳＬＰ）発現構築物を調製するために記載されるように、発現構築物を調製する。発現
ベクターｐＤＣ４０９中の該構築物は、ヒト・サイトメガロウイルス由来のリーダー配列
に続き、可溶性ヒトＴＳＬＰポリペプチドのＮ−末端に融合しているロイシンジッパー部
分をコードする。ＬＺ−ＴＳＬＰをＣＨＯ細胞中で発現させ、そして培養上清から精製す
る。
【０２０５】
ｐＤＣ４０９と称される発現ベクターは、本明細書に援用される、ＭｃＭａｈａｎら，
ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１−２８３２（１９９１）に記載されるｐＤＣ４０６ベ
クター由来の哺乳動物発現ベクターである。（ｐＤＣ４０６と比較し）ｐＤＣ４０９に付
加された特徴には、マルチクローニングサイト（ｍｃｓ）中のさらなる特有の制限部位；
ｍｃｓの下流に位置する３つの停止コドン（各読み枠に１つ）；およびｍｃｓに挿入され
たＤＮＡの配列決定を容易にする、ｍｃｓの下流のＴ７ポリメラーゼプロモーターが含ま
れる。
【０２０６】
全長ヒトＴＳＬＰタンパク質の発現のため、全コード領域（すなわち配列番号１に示さ
れるＤＮＡ配列）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。ＰＣＲに使用す
るテンプレートは、実施例１に記載されるような、ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーから単
離したｃＤＮＡクローンである。単離されそして増幅されたＤＮＡを発現ベクターｐＤＣ
４０９に挿入し、ｐＤＣ４０９−ＴＳＬＰと称される構築物を得る。
【０２０７】
ＬＺ−ＴＳＬＰポリペプチドを使用し、上に論じられるように、組換えまたは内因性Ｔ
ＳＬＰ受容体を発現している宿主細胞に結合する能力を試験する。ＴＳＬＰ受容体を発現
している細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタ
ミンを補ったＤＭＥＭ中で培養する。細胞をＬＺ−ＴＳＬＰ（５ ｍｇ／ｍｌ）と、約１
時間インキュベーションする。インキュベーション後、細胞を洗浄し、非結合ＬＺ−ＴＳ
ＬＰを除去し、そしてビオチン化抗ＬＺモノクローナル抗体（５ ｍｇ／ｍｌ）、および
フィコエリトリン結合ストレプトアビジン（１：４００）とインキュベーションした後、
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）により解析する。細胞数測定解析は、ＦＡＣｓｃａｎ（
Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）上で行った。
【０２０８】
ＴＳＬＰ受容体を発現している細胞は、ＴＳＬＰ受容体を発現していないコントロール
細胞と比較し、有意に亢進したＬＺ−ＴＳＬＰ結合を示した。
【０２０９】
実施例８：ＴＳＬＰおよびＩＬ−７による骨髄からのＴ細胞増殖の誘導
ヒトＴＳＬＰは、ＩＬ−７と組み合わせると、ヒト骨髄からＴ細胞の増殖を誘導する。
【０２１０】
ヒト骨髄由来単核細胞（ＢＭ ＭＮＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ上の全骨髄の遠心分離により
単離した。ＢＭ ＭＮＣを、１０％ウシ胎児血清、並びにアミノ酸およびビタミン補足剤
を補ったＭｃＣｏｙの培地中で、４．５−１０ ｘ １０５細胞／ｍｌの間の濃度範囲で
、フラスコ（Ｔ２５）当たり総体積６または７ ｍｌ中で培養した。ヒトＴＳＬＰ（２０
ｎｇ／ｍｌ）および他のサイトカイン、すなわちＩＬ−７、ＳＬＦ（すなわちスチール
因子または幹細胞因子、またはマスト細胞増殖因子）、またはｆｌｔ３Ｌを、単独でまた
は組み合わせて、第０日に培養に添加した。１４日後およびそれから毎週、培養の半分を
除き、計数した。培養に新鮮な培地およびサイトカインを添加し、総体積６または７ ｍ
ｌに戻した。
【０２１１】
採取細胞はまた、培養１４日後およびそれから毎週、細胞表面抗原に特異的な抗体を用
い、フローサイトメトリーを介し、解析した。用いた抗体は、Ｔ細胞抗原（すなわちαβ
Ｔ細胞受容体、δγ Ｔ細胞受容体、およびＣＤ３）、Ｂ細胞抗原（すなわちＣＤ１９
および表面ＩｇＭ）、ナチュラルキラー細胞抗原（すなわちＣＤ５６）、単球抗原（すな
わちＣＤ１４）、および顆粒球抗原（すなわちＣＤ１５）に特異的であった。
【０２１２】
ＢＭ ＭＮＣ培養へのヒトＴＳＬＰおよびＩＬ−７の添加は、表１に示されるように、
細胞増殖を誘導した。第０日には、ＢＭ ＭＮＣのおよそ５％がＴ細胞であった。ＴＳＬ
ＰおよびＩＬ−７を用いた培養の２週間後には、培養は７０％ ＣＤ３＋ Ｔ細胞からな
った。第２１日には、細胞の８６％がＣＤ３＋ Ｔ細胞であった。培養は、第４２日の実
験終了まで、主にＴ細胞であった。
【０２１３】
【表１】
【０２１４】
別の実験組では、細胞生存および拡大に影響を与える能力に関し、Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（
登録商標）でタグをつけた、３つの別個のバッチのヒトＴＳＬＰ（ＴＳＬＰ ７４８９、
ＴＳＬＰ ７８１１、またはＴＳＬＰ ７８１２）を単独でまたはＩＬ−７と組み合わせ
て試験した。ＢＭ ＭＮＣ培養は、２つの別個の新鮮な骨髄試料から得て、そして５ ｘ
１０５細胞／ｍｌ（群１）または１０ ｘ １０５細胞／ｍｌ（群２）いずれかの濃度
で植え付けた。Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（登録商標）タグＴＳＬＰ（２０ ｍｇ／ｍｌ）および
ＩＬ−７を上述のように培養に添加した。ＩＬ−７と組み合わせたＴＳＬＰは、表２（骨
髄試料１）および表３（骨髄試料２）に示されるように、ＢＭ ＭＮＣ培養の拡大を生じ
た。第２１日までに、拡大細胞集団の８０％は、ＣＤ４＋ αβ＋またはＣＤ８＋ αβ
＋ Ｔ細胞からなった。ＩＬ−７およびＴＳＬＰで処理した培養のうち４つでは、細胞は
、４−５週の実験終了まで、培養が主にＴ細胞を含むように拡大した。
【０２１５】
【表２】
【０２１６】
【表３】
【０２１７】
本明細書は、本明細書に援用される、本明細書中に引用される参考文献の解説を考慮に
入れると、最も完全に理解される。本明細書中の態様は、本発明の態様の例示を提供し、
そして本発明の範囲を限定するとみなしてはならない。当業者は、多くの他の態様が本発
明に含まれることを容易に認識する。
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロス・リファレンス
本出願は、１９９８年１１月１３日に提出された米国仮特許出願第６０／１０８，４５
２号の利益を請求し、前記出願の全開示は、本明細書に頼られ、そして援用される。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、精製されそして単離されている新規のヒト胸腺間質リンホポエチン（ｌｙｍ
ｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）（ＴＳＬＰ）ポリペプチドおよびその断片、こうしたポリペプチ
ドをコードする核酸、こうしたポリペプチドの組換え型を産生するための方法、これらの
ポリペプチドに対し生成された抗体、これらのポリペプチドに由来する断片化ペプチド、
およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
Ｂ細胞発生は詳細に研究されてきているが、造血幹細胞から成熟Ｂ細胞につながる経路
には、いまだに空白がある。サイトカインがＢ細胞発生および増殖に影響を与え、そして
重要な役割を果たすことが認識されている。Ｂ細胞発生に影響を与える既知のサイトカイ
ンには、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−ガンマ、および
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が含まれる。
【０００４】
近年、胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）と称される、新規ネズミ増殖因子が、Ｂ細
胞発生および成熟に役割を果たすことが示されてきている。ネズミＴＳＬＰのサイトカイ
ン活性は、ＩＬ−７のものと非常によく似ており、プレＢ細胞の増殖および生存中に必要
とされる（Ｊａｎｅｗａｙら， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版（１９９６）
）。これらのサイトカインはどちらも、ＮＡＧ８／７細胞を維持し（Ｆｒｉｅｎｄら，
Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２２：３２１−３２８（１９９４））、そしてＢリンパ
球新生を持続させることが示されてきている。さらに、成熟Ｂリンパ球は、ＩＬ−７また
はネズミＴＳＬＰいずれかの非存在下で、発生することができない。さらに、ネズミＴＳ
ＬＰは、Ｂ細胞増殖反応の維持において、ＩＬ−７の代わりをすることが可能であると示
されてきている（Ｒａｙら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２６：１０−１６
（１９９６））。したがって、マウスの系において、ＴＳＬＰは、Ｂ細胞発生において重
要な機能を有する。
【０００５】
ＩＬ−７同様、ネズミＴＳＬＰはまた、胸腺細胞および成熟Ｔ細胞も共刺激（ｃｏｓｔ
ｉｍｕｌａｔｅ）する（Ｆｒｉｅｎｄら， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２２：３２
１−３２８（１９９４））。ＩＬ−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）ノックアウトマウスを用いた
研究により、ＩＬ−７、ＴＳＬＰ、または両方が、おそらくＶＤＪ組換え酵素に対するＴ
細胞受容体−ガンマ（ＴＣＲγ）遺伝子の接近可能性を仲介することにより、ＴＣＲγ遺
伝子座の再配置の調節に重要な役割を果たすことが示される（Ｃａｎｄｅｉａｓら， Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ５７：９−１４（１９９７））。したがって、
ネズミＴＳＬＰはまた、Ｔ細胞発生にも重要な役割を果たす。
【０００６】
ネズミＴＳＬＰ受容体およびＩＬ−７受容体は、共に、その情報伝達複合体の一部とし
てＩＬ−７Ｒ α−鎖を用いる（Ｌｅｖｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６２：
６７７−６８３（１９９９））。しかし、ＩＬ−７Ｒ α−鎖が共通であるのにもかかわ
らず、ＩＬ−７およびＴＳＬＰは、異なる機構を通じ、そのリンパ球新生効果を仲介する
ようである。ＩＬ−７はＳｔａｔ５およびＪａｎｕｓファミリーキナーゼＪａｋ１および
Ｊａｋ３の活性化を誘導する一方、ネズミＴＳＬＰはＳｔａｔ５の活性化を誘導するが、
既知のＪａｎｕｓファミリーキナーゼのいずれの活性化も誘導しない（Ｌｅｖｉｎら，
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６２：６７７−６８３（１９９９））。
【０００７】
ネズミＴＳＬＰの重要な機能、並びにネズミの系におけるＢ細胞およびＴ細胞発生およ
び成熟におけるその役割の重要性を考えると、当該技術分野には、ヒトＴＳＬＰを同定し
そして単離し、そしてヒトＢ細胞およびＴ細胞発生および成熟におけるその役割を研究す
る必要性がある。さらに、リンパ球発生および免疫系における継続する興味を考慮すると
、ヒトＴＳＬＰおよびその受容体などの新規タンパク質の発見、同定、および役割は、現
代の分子生物学、生化学、および免疫学の最前線である。知識が増えているのにもかかわ
らず、細胞および免疫反応に関与するタンパク質の同一性および機能に関し、当該技術分
野には、いまだに必要性がある。
【０００８】
別の側面において、未知のタンパク質の一次構造、または配列の同定は、実験の困難な
過程が成就した結果である。未知の試料タンパク質を同定するため、研究者は、当業者に
知られる多様な技術を用い、未知の試料タンパク質の既知のペプチドへの比較に頼ること
が可能である。例えば、タンパク質は、電気泳動、沈降、クロマトグラフィー、配列決定
および質量分析などの技術を用い、日常的に解析される。
【０００９】
特に、未知のタンパク質試料を既知の分子量と比較することにより、未知のタンパク質
の見かけの分子量を決定することが可能になる（Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ．
Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｐｐ． ７
６−７７， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版，（１９９１））。タンパク質分子
量標準は、未知のタンパク質試料の分子量概算を援助するため、商業的に入手可能である
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．カタログ：１３０−１３１（１９
９５））；（Ｊ．Ｌ． Ｈａｒｔｌｅｙ、米国特許第５，４４９，７５８号）。しかし、
分子量標準は、見かけの分子量の正確な概算を可能にするには、未知のタンパク質に十分
近い大きさに相当しない可能性がある。化学的または酵素的手段により断片化にさらされ
、翻訳後修飾またはプロセシングにより修飾され、および／または非共有複合体において
他のタンパク質と結合しているタンパク質の場合、分子量概算における困難の度合いが増
す。
【００１０】
さらに、特定のアミノ酸構成要素に関するタンパク質組成の特有の性質は、タンパク質
内の切断部位の特有の配置を生じる。化学的または酵素的切断によるタンパク質の特定の
断片化は、特有の「ペプチドフィンガープリント」を生じる（Ｄ．Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａ
ｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２−１１０６（１９７７）；
Ｍ． Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ５０：３０９−３１６（１９８
０））。その結果、特定の部位での切断は、既定のタンパク質の、正確な分子量のペプチ
ドへの、再現可能な断片化を生じる。さらに、これらのペプチドは、該ペプチドの等電点
ｐＨを決定する特有の電荷特性を持つ。これらの特有の特性は、多様な電気泳動および他
の技術を用い、利用することが可能である（Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ． Ｍａ
ｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ｐｐ． ７６
−７７， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版（１９９１））。
【００１１】
タンパク質の断片化、特に「保護（ｂｌｏｃｋｅｄ）」Ｎ−末端を持つタンパク質由来
の断片の産生は、さらに、アミノ酸組成解析およびタンパク質配列決定に使用される（Ｐ
． Ｍａｔｓｕｄｉａｒａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６２：１００３５−
１００３８（１９８７）；Ｃ． Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ， ９：８３０−８３８（１９８８））。さらに断片化タンパク質は、免疫感作、
親和性選択（Ｒ．Ａ． Ｂｒｏｗｎ、米国特許第５，１５１，４１２号）、修飾（例えば
リン酸化）部位決定、活性生物学的化合物の生成（Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ．
Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ３００−
３０１（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版（１９９１））、および相同タンパク質
の区別（Ｍ． Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ５０：３０９−３１
６（１９８０））に用いることが可能である。
【００１２】
さらに、未知のタンパク質のペプチドフィンガープリントが得られたならば、質量分析
を用いた、この未知のタンパク質の同定を援助するため、既知のタンパク質のデータベー
スに比較してもよい（Ｗ．Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０１１−５０１５（１９９３）；Ｄ． Ｆｅｎｙｏら，
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １９：９９８−１００５（１９９８））。多様な
コンピューターソフトウェアプログラム、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ
（インターネットサイト：ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｓｃｆ．ｅｄｕ）、ＭｕｌｔｉＩｄ
ｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉ
ｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ（インターネットサイト：ｗｗｗ
．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＿
ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈＦｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インター
ネットサイト：ｗｗｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ
−ｂｉｎ／ｐｒｏｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）などが、こうした比較を容易にするた
め、インターネットを介し、利用可能である。これらのプログラムは、使用者が切断剤お
よび指示された許容範囲の断片化ペプチドの分子量を特定するのを可能にする。該プログ
ラムは、未知のタンパク質の同一性の決定を援助するため、これらの分子量をデータベー
スに保存されているタンパク質分子量情報と比較する。正確な同定には、断片化ペプチド
の数およびこれらのペプチドの正確な分子量に関する正確な情報が必要である。したがっ
て、断片化ペプチドの数および正確な分子量の決定の正確さが増せば、未知のタンパク質
の同定における成功は高まるはずである。
【００１３】
さらに、未知のタンパク質のペプチド消化物は、タンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を
用いて配列決定してもよく、そして生じた配列をデータベースに対し検索してもよい（Ｊ
．Ｋ． Ｅｎｇら， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． ５：９７６−９
８９（１９９４）；Ｍ． ＭａｎｎおよびＭ． Ｗｉｌｍ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．，
６６：４３９０−４３９９（１９９４）；Ｊ．Ａ． ＴａｙｌｏｒおよびＲ．Ｓ． Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．， １１：１０６７−
１０７５（１９９７））。本方法に用いてもよい検索プログラムは、Ｌｕｔｅｆｉｓｋ
９７（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｌｓｂｃ．ｃｏｍ：７０／Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７
．ｈｔｍｌ）、並びに上述のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅ
ＳｅａｒｃｈおよびＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムなど、インターネット上に存在する。し
たがって、遺伝子の配列およびその予測されるタンパク質配列およびペプチド断片を、配
列データベースに添加することは、タンデム型質量分析を用いた、未知のタンパク質の同
定を援助する可能性がある。
【００１４】
このように、当該技術分野にはまた、ペプチド断片化研究における使用に、分子量測定
における使用に、そしてタンデム型質量分析を用いたタンパク質配列決定における使用に
適したポリペプチドに対する必要性もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】Ｊ．Ｌ． Ｈａｒｔｌｅｙ、米国特許第５，４４９，７５８号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｊａｎｅｗａｙら， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版（１９９６）
【非特許文献２】Ｆｒｉｅｎｄら， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２２：３２１−３２８（１９９４）
【非特許文献３】Ｒａｙら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２６：１０−１６（１９９６）
【非特許文献４】Ｃａｎｄｅｉａｓら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ５７：９−１４（１９９７）
【非特許文献５】Ｌｅｖｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６２：６７７−６８３（１９９９）
【非特許文献６】Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ． Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｐｐ． ７６−７７， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版，（１９９１）
【非特許文献７】Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．カタログ：１３０−１３１（１９９５）
【非特許文献８】Ｄ．Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２−１１０６（１９７７）
【非特許文献９】Ｍ． Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ５０：３０９−３１６（１９８０）
【非特許文献１０】Ｐ． Ｍａｔｓｕｄｉａｒａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６２：１００３５−１００３８（１９８７）
【非特許文献１１】Ｃ． Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ９：８３０−８３８（１９８８）
【非特許文献１２】Ｗ．Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０１１−５０１５（１９９３）
【非特許文献１３】Ｄ． Ｆｅｎｙｏら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １９：９９８−１００５（１９９８）
【非特許文献１４】Ｊ．Ｋ． Ｅｎｇら， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． ５：９７６−９８９（１９９４）
【非特許文献１５】Ｍ． ＭａｎｎおよびＭ． Ｗｉｌｍ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６６：４３９０−４３９９（１９９４）
【非特許文献１６】Ｊ．Ａ． ＴａｙｌｏｒおよびＲ．Ｓ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．， １１：１０６７−１０７５（１９９７）
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、単離ヒトＴＳＬＰ核酸およびこれらの核酸にコードされるポリペプチドを提
供することにより、当該技術分野におけるこれらの多様な必要性を満たすのを援助する。
本発明の特定の態様は、配列番号１のＤＮＡ配列を含む単離ＴＳＬＰ核酸分子、および配
列番号２のアミノ酸配列をコードする単離ＴＳＬＰ核酸分子と共に、これらの配列に相補
的な核酸分子に関する。一本鎖および二本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ核酸分子両方と共に、配
列番号１のすべてまたは一部を含む、変性二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする核酸分子が
本発明に含まれる。やはり含まれるのは、配列番号１の配列を含む核酸分子からｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ突然変異誘発により得られる単離核酸分子、配列番号１の配列を含む核酸分子か
ら縮重している単離核酸分子、および本発明のＤＮＡの対立遺伝子変異体である単離核酸
分子である。本発明はまた、これらの核酸分子の発現を指示する組換えベクターおよびこ
れらのベクターで形質転換またはトランスフェクションされている宿主細胞も含む。
【００１８】
さらに、本発明は、上述の核酸を用い、Ｂ細胞系譜またはＴ細胞系譜細胞増殖を誘導す
る能力を有するタンパク質をコードする核酸を同定する方法；ヒト染色体第５番を同定す
る方法；ヒト染色体第５番上の遺伝子をマッピングする方法；特定の疾患、症候群、また
はヒト染色体第５番に関連する他のヒト異常に関連する遺伝子を同定する方法；および細
胞情報伝達および免疫系を研究する方法を含む。
【００１９】
本発明はまた、配列番号１の核酸由来のセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド
の、ＴＳＬＰ遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を阻害するための使用も含む。
本発明はまた、配列番号２の可溶性ポリペプチド部分を含む、これらの核酸分子にコー
ドされる単離ポリペプチドおよびその断片も含む。本発明はさらに、これらのポリペプチ
ドを産生するための方法であって、宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養し、そして
培地から該ポリペプチドを回収することを含む、前記方法を含む。特に、細菌、酵母、植
物、昆虫、および動物細胞におけるこれらのポリペプチドの発現が、本発明に含まれる。
【００２０】
一般的に、本発明のポリペプチドを用い、細胞過程、例えば免疫制御、細胞増殖、細胞
分化、細胞死、細胞移動、細胞・細胞相互作用、および炎症性反応を研究することが可能
である。さらに、これらのポリペプチドを用い、ＴＳＬＰリガンドおよびＴＳＬＰ受容体
と関連するタンパク質を同定することが可能である。
【００２１】
さらに、本発明は、ポリペプチド対構造（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）分子
と関連する活性の潜在的な阻害剤に関しスクリーニングするのに、これらのポリペプチド
を利用するアッセイ、およびＴＳＬＰポリペプチド対構造分子に仲介される疾患の治療の
ための療法剤として、これらのポリペプチドを用いる方法を含む。さらに、阻害剤の設計
にこれらのポリペプチドを用いる方法もまた、本発明の側面である。
【００２２】
本発明はさらに、タンパク質または断片化タンパク質の分子量の概算を可能にする分子
量マーカーとしてこれらのポリペプチドを使用するための方法と共に、電気泳動を用い、
本発明の分子量マーカーを視覚化するための方法も含む。本発明はさらに、未知のタンパ
ク質の等電点の決定のためのマーカーとしてと共に、タンパク質の断片化の程度を確かめ
るためのコントロールとして、本発明のポリペプチドを用いるための方法を含む。
【００２３】
本発明にさらに含まれるのは、これらの決定を補助するキットである。
本発明にさらに含まれるのは、試料核酸および／またはタンパク質の同定を援助するコ
ンピューターデータベースの検索における使用のための、ヒトＴＳＬＰ核酸配列、ポリペ
プチドまたはその断片の予測されるアミノ酸配列、あるいはポリペプチドおよびその断片
の予測されるアミノ酸配列の組み合わせの使用である。
【００２４】
これらのポリペプチドに結合する単離ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、並び
に、ＴＳＬＰポリペプチド精製を援助するこれらの抗体の使用もまた、本発明に含まれる
。さらに、単離抗体を用い、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を確立し、血清な
どの試料中のＴＳＬＰを測定してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ヒトＴＳＬＰ ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２は、ヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明に含まれる核酸分子には、以下のヌクレオチド配列：
名称：ＴＳＬＰ
【００２７】
【化１】
【００２８】
が含まれる。
本発明のヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列には：
名称：ＴＳＬＰ（ポリペプチド）
【００２９】
【化２】
【００３０】
が含まれる。
本発明の核酸の発見により、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターの
構築；発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換されている宿主細胞の構築；
単離されそして精製されている、生物学的に活性があるポリペプチドおよびその断片；Ｔ
ＳＬＰ様活性を有する（例えばＢ細胞系譜またはＴ細胞系譜細胞増殖を誘導する）タンパ
ク質をコードする核酸を同定するためのプローブとしての核酸またはそのオリゴヌクレオ
チドの使用；ヒト染色体第５番を同定するための、核酸またはそのオリゴヌクレオチドの
使用；ヒト染色体第５番上の遺伝子をマッピングするための、核酸またはそのオリゴヌク
レオチドの使用；ガードナー症候群、線腫様結腸ポリポーシス、遺伝性類線維腫（ｄｅｓ
ｍｏｉｄ）疾患、ターコット症候群、および結腸直腸癌を含む、ヒト染色体第５番、およ
び特に染色体第５番のｑ２１−ｑ２２領域と関連する、特定の疾患、症候群、または他の
ヒト異常と関連する遺伝子を同定するための、核酸またはそのオリゴヌクレオチドの使用
；ＴＳＬＰ遺伝子にコードされるポリヌクレオチドの発現を阻害するための、核酸由来の
一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用；Ｂ細胞系譜またはＴ細胞系
譜細胞増殖を誘導するための、こうしたポリペプチドおよび可溶性断片の使用；分子量マ
ーカーとしてのこうしたポリペプチドおよび断片化ペプチドの使用；ペプチド断片化のコ
ントロールとしての、こうしたポリペプチドおよび断片化ペプチド、並びにこれらの試薬
を含むキットの使用；抗体を生成するためのこうしたポリペプチドおよびその断片の使用
；並びにＴＳＬＰポリペプチドを精製するための抗体の使用が可能になる。
【００３１】
核酸分子
特定の態様において、本発明は内因性成分の汚染がない、特定の単離ヌクレオチド配列
に関する。「ヌクレオチド配列」は、別個の断片の形の、またはより大きな核酸構築物の
構成要素としてのポリヌクレオチド分子を指す。核酸分子は、実質的に純粋な型で、そし
て標準的生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ニューヨーク州コールドスプリングハー
バー（１９８９）に略述されているものなど）によるその構成要素ヌクレオチド配列の同
定、操作、および回収を可能にする量または濃度で、少なくとも１度単離されているＤＮ
ＡまたはＲＮＡに由来している。好ましくは、こうした配列は、真核遺伝子に典型的に存
在する、内部非翻訳配列、またはイントロンにより中断されない読み枠の形で提供されお
よび/または構築される。非翻訳ＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列がコード領域の操作または
発現に干渉しない、読み枠の５’または３’に存在していてもよい。
【００３２】
本発明の核酸分子は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ並びに、そのＲＮＡ相補体（
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）も含む。ＤＮＡには、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に
合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれ
る。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号１のｃＤＮＡまたは適切なその断片をプローブと
して用い、慣用技術により単離してもよい。
【００３３】
本発明のＤＮＡ分子は、全長遺伝子と共にそのポリヌクレオチドおよび断片を含む。全
長遺伝子はまた、Ｎ−末端シグナルペプチドも含んでもよい。他の態様は、可溶性型をコ
ードする、例えばシグナルペプチドを含むまたは含まない、該タンパク質の細胞外ドメイ
ンをコードするＤＮＡを含む。
【００３４】
本発明の核酸は、好ましくは、ヒト供給源に由来するが、本発明は、非ヒト種由来のも
のもまた含む。
好ましい配列
本発明の特に好ましいヌクレオチド配列は、上述のように、配列番号１である。配列番
号１のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクローンは、実施例１に記載されるように単離
された。配列番号１のＤＮＡにコードされるアミノ酸の配列を配列番号２に示す。本配列
は、ＴＳＬＰポリヌクレオチドを、Ｂ細胞系譜およびＴ細胞系譜細胞の増殖に影響を与え
る因子の群のメンバーと同定する（Ｒａｙら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
２６：１０−１６（１９９６））；（Ｆｒｉｅｎｄら， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．，
２２：３２１−３２８（１９９４））。
【００３５】
さらなる配列
１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする可能性がある、遺伝暗号の既知の縮重
のため、ＤＮＡ配列は配列番号１に示されるものと異なり、そしてなお配列番号２のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする可能性がある。こうした変異体ＤＮＡ配列は
、沈黙（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよい
し、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。
【００３６】
したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ配列であって：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｂ）配列番号２のポリペプチドを
コードするＤＮＡ；（ｃ）中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）のＤ
ＮＡにハイブリダイズすることが可能であり、そして本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡ；（ｄ）非常にストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにハイブ
リダイズすることが可能であり、そして本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ；およ
び（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に定義されるＤＮＡに対し遺伝暗号の結
果として縮重しており、そして本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡより選択される
、前記単離ＤＮＡ配列を提供する。もちろん、こうしたＤＮＡ配列にコードされるポリペ
プチドが本発明に含まれる。
【００３７】
本明細書において、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づ
き、一般の技術を有する当業者により、容易に決定することが可能である。基本的な条件
は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｖｏｌ． １， ｐｐ．１．１０１−１０４， Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）
に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５ Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤ
Ｓ、１．０ ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホ
ルムアミド、６ Ｘ ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、例えばス
ターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーシ
ョン溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５ Ｘ ＳＳＣ、０．
１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。非常にストリンジェントな条件もまた、例え
ばＤＮＡの長さに基づき、当業者により、容易に決定することが可能である。一般的に、
こうした条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．
２ Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は温度および洗浄
溶液塩濃度は、プローブの長さなどの要因にしたがい、必要に応じ調整してもよいことを
認識するであろう。
【００３８】
本発明の態様としてやはり含まれるのは、以下に記載されるような、不活性化Ｎ−糖鎖
付加部位、不活性化プロテアーゼプロセシング部位、または保存的アミノ酸置換を含む、
ポリペプチド断片およびポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００３９】
別の態様において、本発明の核酸分子はまた、天然配列に少なくとも８０％同一である
ヌクレオチド配列も含む。やはり意図されるのは、核酸分子が、天然配列に少なくとも９
０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、また
は少なくとも９９．９％同一である配列を含む、態様である。
【００４０】
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、
２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ． １２：３８７（１９８４））に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コ
ンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、
バージョン６．０を用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログ
ラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａ
ｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃ
ｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載さ
れるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．， １４：６７４５（１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対す
る３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；
および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、
配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。
【００４１】
本発明はまた、ポリペプチドの産生に有用な単離核酸も提供する。こうしたポリペプチ
ドは、いくつかの慣用技術のいずれにより調製してもよい。ヒトＴＳＬＰポリペプチド、
または望ましいその断片をコードするＤＮＡ配列を、該ポリペプチドまたは断片を産生す
るための発現ベクター内にサブクローニングしてもよい。ＤＮＡ配列は、好都合に、適切
なリーダーまたはシグナルペプチドをコードする配列に融合させる。あるいは、既知の技
術を用い、望ましい断片を化学的に合成してもよい。ＤＮＡ断片はまた、全長クローン化
ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化により産生し、そしてアガロースゲル上の電気
泳動により単離してもよい。必要であれば、望ましい点まで５’または３’末端を再構築
するオリゴヌクレオチドを、制限酵素消化により生成されたＤＮＡ断片に連結してもよい
。こうしたオリゴヌクレオチドはさらに、望ましいコード配列、およびコード配列のＮ−
末端の開始コドン（ＡＴＧ）位の上流に、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含んでもよ
い。
【００４２】
周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法もまた、望ましいタンパク質断片をコードす
るＤＮＡ配列を単離しそして増幅するのに使用してもよい。ＤＮＡ断片の望ましい末端を
定めるオリゴヌクレオチドを、５’および３’プライマーとして使用する。該オリゴヌク
レオチドはさらに、発現ベクターへの増幅ＤＮＡ断片の挿入を容易にするため、制限エン
ドヌクレアーゼの認識部位を含んでもよい。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら， Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏ
ｌｏｇｙ， Ｗｕら監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，サンディエゴ
， ｐｐ．１８９−１９６（１９８９）；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇ
ｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓら
監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９０）に記載される。
【００４３】
ポリペプチドおよびその断片
本発明は、多様な型のポリペプチドおよびその断片を含み、天然発生である、または組
換えＤＮＡ技術を伴う方法などの多様な技術を通じ産生されるものを含む。こうした型に
は、限定されるわけではないが、誘導体、変異体、およびオリゴマーと共に、融合タンパ
ク質またはその断片が含まれる。
【００４４】
ポリペプチドおよびその断片
本発明のポリペプチドは、上述のような核酸配列にコードされる全長タンパク質を含む
。特に好ましいポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、特に好ましい断片は
、配列番号２のアミノ酸２９ないし１５９（成熟ポリペプチド配列）を含む。
【００４５】
配列番号２のポリペプチドは、シグナルペプチドとして機能するＮ−末端疎水性領域を
含む。コンピューター解析により、該シグナルペプチドは配列番号２の残基１ないし２８
に相当することが予測される（が、コンピューターが予測する、その次に最もありうるシ
グナルペプチド切断部位は（降順に）配列番号２のアミノ酸３４および１１６の後ろに現
れる）。シグナルペプチドの切断は、したがって、配列番号２のアミノ酸２９から１５９
を含む成熟タンパク質を生じるであろう。
【００４６】
当業者は、ポリペプチドのこうした領域の上述の境界はおよそのものであることを認識
するであろう。例えば、（その目的のために利用可能なコンピュータープログラムを用い
ることにより、予測することが可能な）シグナルペプチドの境界は、上述のものと異なる
可能性がある。
【００４７】
本発明のポリペプチドは、膜に結合していても、または分泌されそしてしたがって可溶
性であってもよい。可溶性ポリペプチドは、発現される細胞から分泌されることが可能で
ある。一般的に、可溶性ポリペプチドは、例えば遠心分離などにより、望ましいポリペプ
チドを発現する、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞を培地から分離し、そして望ま
しいポリペプチドの存在に関し培地（上清）をアッセイすることにより、同定する（そし
て非可溶性膜結合対応物と区別する）ことが可能である。培地中にポリペプチドが存在す
ることにより、該ポリペプチドが細胞から分泌され、そしてしたがって該タンパク質の可
溶性型であることが示される。
【００４８】
１つの態様において、可溶性ポリペプチドおよびその断片は、細胞外ドメインのすべて
または一部を含むが、細胞膜へのポリペプチドの保持を生じるであろう膜貫通領域を欠く
。可溶性ポリペプチドは、該ポリペプチドが産生細胞から分泌される限り、細胞質ドメイ
ン、またはその一部を含んでもよい。
【００４９】
他の態様には、アミノ酸２９または３５のＮ−末端およびアミノ酸１５９のＣ−末端を
有する、可溶性断片が含まれる。
一般的に、可溶性型の使用は特定の適用に有益である。可溶性ポリペプチドは宿主細胞
から分泌されるため、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が容易になる。さらに、
可溶性ポリペプチドは、一般的に、静脈内投与に、より適している。
【００５０】
本発明はまた、ポリペプチド、および望ましい生物学的活性を保持する細胞外ドメイン
の断片も提供する。特定の態様は、ＴＳＬＰ受容体に結合する能力を保持するポリペプチ
ド断片に関する。こうした断片は、上述のように可溶性ポリペプチドであってもよい。別
の態様において、ポリペプチドおよび断片は、好都合に、上述のようなＢ細胞系譜または
Ｔ細胞系譜細胞の増殖に影響を与えるタンパク質のファミリー中に保存される領域を含む
。
【００５１】
本明細書にやはり提供されるのは、配列番号２の配列の隣接アミノ酸を少なくとも２０
、または少なくとも３０含むポリペプチド断片である。細胞質ドメイン由来の断片は、情
報伝達研究において、そして生物学的情報の伝達に関連する細胞過程の制御において、使
用を見出す。ポリペプチド断片はまた、抗体を産生する際の免疫原として使用してもよい
。
【００５２】
変異体
天然発生変異体と共に、ポリペプチドおよび断片由来変異体が本明細書に提供される。
変異体は、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を示してもよい。やはり意図され
るのは、ポリペプチドまたは断片が、好ましいポリペプチドまたはその断片に、少なくと
も９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、
または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む、態様である。同一性パーセ
ントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク
質配列の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏ． ４８：４４３（１９７０））のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシ
ン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータ
ープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラム
の好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆ
ｆ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：１０９１５（１
９９２））に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２
）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；および（４）末端ギャップに対する
ペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、
用いてもよい。
【００５３】
本発明の変異体には、例えば、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象またはタンパク質分
解切断から生じるものが含まれる。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、例えば、一部切
除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）が生物学的に活性があるタンパク質を生じる可能性
があり、例えば該タンパク質の天然発生可溶性型などがある。タンパク質分解に起因する
と考えられる変動には、例えば、異なる種類の宿主細胞における発現に際しての、該タン
パク質からの１つまたはそれ以上の末端アミノ酸（一般的に１−５末端アミノ酸）のタン
パク質分解的除去によるＮ−またはＣ−末端の相違が含まれる。アミノ酸配列の相違を遺
伝的多型性（該タンパク質を産生する個体の間の対立遺伝子変動）に起因しうるタンパク
質もまた、本明細書に意図される。
【００５４】
本発明の範囲内のさらなる変異体には、他の化学部分、例えばグリコシル基、脂質、リ
ン酸、アセチル基およびそれらに匹敵するものと共有または凝集結合体を形成することに
より、修飾され、誘導体を生成する可能性があるポリペプチドが含まれる。共有誘導体は
、アミノ酸側鎖上の、あるいはポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端の、官能基上に、
化学部分を連結することにより、調製してもよい。以下により詳細に論じられるような、
結合している診断用剤（検出可能）または療法剤を含む結合体が本発明に意図される。
【００５５】
他の誘導体には、例えばＮ−末端またはＣ−末端融合体として組換え培養において合成
されることによる、該ポリペプチドと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または
凝集結合体が含まれる。融合タンパク質の例は、オリゴマーと関連し、以下に論じられる
。さらに、融合タンパク質は精製および同定を容易にするため添加されるペプチドを含ん
でもよい。こうしたペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，
９１２号およびＨｏｐｐら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４（１９８８
）に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登
録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
（配列番号３）であり、該ペプチドは抗原性が高く、そして特異的なモノクローナル抗体
が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイ
および容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書
に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イ
オンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する
。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号第ＨＢ ９２５９号下に、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノク
ローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍ
ａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手
可能である。
【００５６】
本明細書に提供される変異体ポリペプチドの中に、天然の生物学的活性を保持する天然
ポリペプチドの変異体または実質的なその同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）がある。１つ
の例は、天然型と本質的に同一の結合親和性で結合する変異体である。結合親和性は、例
えば米国特許第５，５１２，４５７号に記載されるように、そして以下に示されるように
、慣用法により測定することが可能である。
【００５７】
変異体には、実質的に天然型と相同であるが、1つまたはそれ以上の欠失、挿入または
置換のため、天然型と異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドが含まれる。特定の態
様には、限定されるわけではないが、天然配列と比較して、アミノ酸残基の１ないし１０
の欠失、挿入または置換を含む、ポリペプチドが含まれる。
【００５８】
既定のアミノ酸を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよい。
こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、ま
たはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換；あるいは芳
香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するも
のが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、
周知である。
【００５９】
同様に、本発明のＤＮＡには、１つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換のため、天
然ＤＮＡ配列とは異なるが、生物学的に活性があるポリペプチドをコードする変異体が含
まれる。
【００６０】
本発明はさらに、結合する天然パターン糖鎖付加を含むまたは含まないポリペプチドを
含む。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７細胞）で発現され
たポリペプチドは、発現系の選択に応じ、分子量および糖鎖付加パターンにおいて、天然
ポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異なる可能性もある。細菌発現系、例
えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）での本発明のポリペプチドの発現は、非糖鎖付加分子を提
供する。さらに、既定の調製は、多数の異なって糖鎖付加されたタンパク質種を含む可能
性がある。グリコシル基は、慣用法、特にグリコペプチダーゼを利用するものを通じ、除
去してもよい。一般的に、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを、モル過剰のグリコペプチダ
ーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とインキュベーションしてもよい。
【００６１】
これに対応して、アミノ酸残基または配列の多様な付加または置換、あるいは末端また
は内部の残基または配列の欠失をコードする同様のＤＮＡ構築物が、本発明に含まれる。
例えば、ポリペプチド細胞外ドメインのＮ−糖鎖付加部位を修飾し、糖鎖付加を妨げても
よく、これにより哺乳動物および酵母発現系における炭水化物減少類似体（ａｎａｌｏｇ
）の発現が可能になる。真核ポリペプチドのＮ−糖鎖付加部位はアミノ酸トリプレットＡ
ｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、ここでＸはいかなるアミノ酸でもよく、そしてＹはＳ
ｅｒまたはＴｈｒである。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する
適切な置換、付加または欠失は、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合の防止を生じるであ
ろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸により置換されるように選択される、単一のヌク
レオチドの改変は、Ｎ−糖鎖付加部位を不活性化するのに十分である。あるいは、Ｓｅｒ
またはＴｈｒを別のアミノ酸、例えばＡｌａで置換してもよい。タンパク質のＮ−糖鎖付
加部位を不活性化するための既知の方法には、本明細書に援用される、米国特許第５，０
７１，９７２号およびＥＰ ２７６，８４６に記載されるものが含まれる。
【００６２】
変異体の別の例において、生物学的活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする配列を改
変し、Ｃｙｓ残基が欠失され、または他のアミノ酸で置換されるようにし、フォールディ
ングまたは再生の際、誤った分子内ジスルフィド架橋が形成されるのを妨げてもよい。
【００６３】
他の変異体は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を亢進させる
ため、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾することにより調製される。ＥＰ ２１２，
９１４は、タンパク質のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するための部
位特異的突然変異誘発の使用を開示する。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を改変し、これらの隣接する塩
基性残基の発生を除去するため、残基を欠失させ、付加し、または置換することにより、
不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対はＫＥＸ２切断にかなり感受性が低く、そしてＡｒｇ
−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化す
る保存的なそして好ましいアプローチを代表する。
【００６４】
オリゴマー
本発明に含まれるのは、ヒトＴＳＬＰポリペプチドを含むオリゴマーまたは融合タンパ
ク質である。こうしたオリゴマーは、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーを含
む、共有結合または非共有結合多量体型であってもよい。上述のように、好ましいポリペ
プチドは可溶性であり、そしてしたがってこれらのオリゴマーは可溶性ポリペプチドを含
んでもよい。本発明の１つの側面において、オリゴマーはポリペプチド構成要素の結合能
を維持し、そしてしたがって、二価、三価などの結合部位を提供する。
【００６５】
本発明の１つの態様は、ポリペプチドに融合しているペプチド部分間の共有または非共
有相互作用を介し結合している多数のポリペプチドを含むオリゴマーに関する。こうした
ペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）であってもよく、またはオリゴマー化を促
進する特性を有するペプチドであってもよい。以下により詳細に記載されるように、ロイ
シンジッパーおよび抗体由来の特定のポリペプチドが、結合するポリペプチドのオリゴマ
ー化を促進することが可能なペプチドの中にある。
【００６６】
免疫グロブリンに基づくオリゴマー
１つの代替物として、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用い、オリゴマーを調
製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合している特定
の異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例
えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５（１９９１））；Ｂ
ｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７（１９９０））；並びにＨｏｌｌｅｎｂａｕｇ
ｈおよびＡｒｕｆｆｏ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ中， “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓ
ｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， Ｓｕｐｐｌ．４， １０．１９．１−１０．１９．１１
（１９９２））に記載されている。
【００６７】
本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドを抗体由来のＦｃポリペプチドに融合さ
せることにより生成される２つの融合タンパク質を含む二量体に関する。ポリペプチド／
Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。該組換
え発現ベクターで形質転換された宿主細胞でポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質を発現し
、そして抗体分子によく似た形で集合させ、その結果、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分
間に形成され、二価分子を生じる。
【００６８】
本明細書において、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域のＣＨドメインのす
べてを含む抗体のＦｃ領域から構成される天然および突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ
）型ポリペプチドを含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含むこうしたポリペプチドの
一部切除型もまた含まれる。好ましいポリペプチドはヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃポリペ
プチドを含む。
【００６９】
ＰＣＴ出願第ＷＯ ９３／１０１５１号（本明細書に援用される）に記載される１つの
適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ−末端ヒンジ領域から天然
Ｃ−末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、本明細書に
援用される米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら（ＥＭＢＯ Ｊ．， １３
：３９９２−４００１（１９９４））に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。本突
然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ
酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化して
いることを除けば、ＷＯ ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である
。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少した親和性を示す。
【００７０】
Ｆｃ部分を含む上述の融合タンパク質（およびそれから形成されるオリゴマー）は、プ
ロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる容易
な精製という利点を提供する。
【００７１】
他の態様において、本発明のポリペプチドを、抗体重鎖または軽鎖の可変部に関し置換
してもよい。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されている場合、４つも
のＴＳＬＰ細胞外領域を持つオリゴマーを形成することが可能である。
【００７２】
ペプチドリンカーに基づくオリゴマー
あるいは、オリゴマーはペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含むまたは含まな
い多数のポリペプチドを含む融合タンパク質である。適切なペプチドリンカーの中に、本
明細書に援用される米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記
載されるものがある。望ましいペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列は、いかなる適
切な慣用的技術を用い、本発明のＤＮＡ配列の間に、そして該ＤＮＡ配列と同じ読み枠で
挿入してもよい。例えば、リンカーをコードする化学的に合成されたオリゴヌクレオチド
を、配列間に連結してもよい。特定の態様において、融合タンパク質は、ペプチドリンカ
ーにより分離された、２ないし４つの可溶性ＴＳＬＰポリペプチドを含む。
【００７３】
ロイシンジッパー
本発明のオリゴマーを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロ
イシンジッパードメインは、該ドメインが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進する
ペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質で同定さ
れ（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９（１９８８））、そ
して以来、多様な異なるタンパク質で見出されてきている。既知のロイシンジッパーの中
に、二量体化または三量体化する天然発生ペプチドおよびその誘導体がある。
【００７４】
ジッパードメイン（本明細書において、オリゴマー化、またはオリゴマー形成ドメイン
とも呼ばれる）は、繰り返される７残基反復を含み、しばしば４つまたは５つのロイシン
残基が、他のアミノ酸に点在する。ジッパードメインの例には、酵母転写因子ＧＣＮ４お
よびラット肝臓に見られる熱安定性ＤＮＡ結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ； Ｌａｎｄｓｃ
ｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６８１（１９８９））がある。２つの核トラ
ンスフォーミングタンパク質、ｆｏｓおよびｊｕｎもまたジッパードメインを示し、ネズ
ミプロトオンコジーンｃ−ｍｙｃの遺伝子産物も同様である（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０：１７５９（１９８８））。核発癌遺伝子、ｆｏｓおよびｊ
ｕｎの産物は、ヘテロ二量体を優先して形成するジッパードメインを含む（Ｏ’Ｓｈｅａ
ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４５；６４６（１９８９）、ＴｕｒｎｅｒおよびＴｉｊａｎ
， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６８９（１９８９））。ジッパードメインは、これらの
タンパク質の生物学的活性（ＤＮＡ結合）に必要である。
【００７５】
パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイルスを含
む、いくつかの異なるウイルスの融合体形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）タンパク質もまた
、ジッパードメインを所有する（ＢｕｃｋｌａｎｄおよびＷｉｌｄ， Ｎａｔｕｒｅ，
３３８：５４７（１９８９））；（Ｂｒｉｔｔｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５３：３９４
（１９９１））；（ＤｅｌｗａｒｔおよびＭｏｓｉａｌｏｓ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， ６：７０３（１９９０））。
これらの融合体形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルスタンパク質のジッパードメインは
、該タンパク質の膜貫通領域の近くにあり；ジッパードメインが、該融合体形成性タンパ
ク質のオリゴマー構造に寄与する可能性が示唆されてきている。融合体形成性ウイルスタ
ンパク質のオリゴマー化は、融合孔（ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｒｅ）形成に関与している（Ｓ
ｐｒｕｃｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８
：３５２３（１９９１））。ジッパードメインはまた、最近、熱ショック転写因子のオリ
ゴマー化に役割を果たしているとも報告されてきている（Ｒａｂｉｎｄｒａｎら， Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５９：２３０（１９９３））。
【００７６】
ジッパードメインは、短い、平行コイルドコイル（ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｉｌｅｄ
ｃｏｉｌ）として折りたたまれている（Ｏ’Ｓｈｅａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：５
３９（１９９１））。平行コイルドコイルの一般的構造は、Ｃｒｉｃｋにより提唱された
ような「ノブを穴へ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」パッキング（Ａｃｔａ Ｃ
ｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．， ６：６８９）により、よく特徴付けられている。ジッパード
メインにより形成された二量体は、ＭｃＬａｃｈｌａｎおよびＳｔｅｗｅｒｔ（Ｊ． Ｍ
ｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ９８：２９３（１９７５））の表記にしたがい、（ａｂｃｄｅｆ
ｇ）ｎと表される、７残基反復により安定化される。ここでａおよびｄは一般的に疎水性
残基であり、ｄはロイシンであり、これらはらせんの同じ面に並ぶ。逆に荷電した残基は
普通、ｇおよびｅ位にある。したがって、２つのらせん状ジッパードメインから形成され
る平行コイルドコイルにおいて、第一のらせんの疎水性側鎖により形成された「ノブ」は
、第二のらせんの側鎖間に形成された「穴」にパッキングされる。
【００７７】
ｄ位の残基（しばしばロイシン）は、巨大な疎水性安定化エネルギーに寄与し、そして
オリゴマー形成に重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｒｅｓ．， ３８：２２９（１９９１））。Ｌｏｖｅｊｏｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９
：１２８８（１９９３））は最近、らせんが上−上−下に走る、三重鎖αらせん束合成を
報告した。彼らの研究により、疎水性安定化エネルギーが、らせん単量体からのコイルド
コイルの形成のための主要な原動力を提供していることが裏付けられた。これらの研究は
また、静電相互作用がコイルドコイルの化学量論および形状に寄与していることも示して
いる。ロイシンジッパーの構造のさらなる議論は、Ｈａｒｂｕｒｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２６２：１４０１（２６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９３））に見られる。
【００７８】
可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例は、
ＰＣＴ出願第ＷＯ ９４／１０３０８号に記載され、そして肺界面活性物質プロテインＤ
（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパードメインが、本明細書に援用されるＨｏｐｐｅら（Ｆ
ＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３４４：１９１（１９９４））に記載される。修飾ロイシン
ジッパーに融合している異種性タンパク質の安定した三量体化を可能にする、該修飾ロイ
シンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗら（Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６：２
６７−２７８（１９９４））に記載されている。ロイシンジッパーペプチドに融合してい
る可溶性ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を適切な宿主細胞で発現し、そして形
成される可溶性オリゴマーを培養上清から回収する。
【００７９】
特定のロイシンジッパー部分は、優先的に三量体を形成する。１つの例は、本明細書に
完全に援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３４４：１９１（１９９
４））および米国特許第５，７１６，８０５号に記載されるような、肺界面活性物質プロ
テインＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーである。本肺ＳＰＤ由来ロイシンジッパーペ
プチドは、アミノ酸配列Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇ
ｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇ
ｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ（配
列番号４）を含む。
【００８０】
三量体化を促進するロイシンジッパーの別の例は、米国特許第５，７１６，８０５号に
記載されるような、アミノ酸配列Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａ
ｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔ
ｙｒ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌ
ｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ（配列番号５）を含むペプチド
である。１つの別の態様において、Ｎ−末端Ａｓｐ残基が付加され；別の態様では、該ペ
プチドはＮ−末端Ａｒｇ残基を欠いている。
【００８１】
オリゴマー化を促進する特性を保持する、前述のジッパーペプチドの断片もまた、使用
してもよい。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、前述のアミノ酸配列に
示される１つまたは２つのＮ−末端またはＣ−末端残基を欠くペプチドが含まれる。ロイ
シンジッパーは、天然発生ロイシンジッパーペプチドから、例えばオリゴマー化を促進す
るペプチドの能力が保持されるように、天然アミノ酸配列の保存的置換を介し、得てもよ
い。
【００８２】
天然発生三量体タンパク質由来の他のペプチドを、三量体オリゴマーを調製するのに使
用してもよい。あるいは、オリゴマー化を促進する合成ペプチドを使用してもよい。特定
の態様において、ロイシンジッパー部分のロイシン残基を、イソロイシン残基により置換
してもよい。イソロイシンを含むこうしたペプチドは、イソロイシンジッパーと呼んでも
よいが、本明細書において「ロイシンジッパー」という用語に含まれる。
【００８３】
ポリペプチドおよびその断片の産生
本発明のポリペプチドおよび断片の発現、単離および精製は、いかなる適切な技術によ
り達成してもよく、限定されるわけではないが以下を含む：
発現系
本発明はまた、ＤＮＡを含む組換えクローニング用および発現ベクター、並びに、該組
換えベクターを含む宿主細胞も提供する。ＤＮＡを含む発現ベクターを用い、該ＤＮＡに
コードされる本発明のポリペプチドまたは断片を調製してもよい。ポリペプチドを産生す
るための方法は、ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換されている宿
主細胞を、該ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し、その後培養から発現ポリペ
プチドを回収することを含む。当業者は、発現ポリペプチドを精製するための方法は使用
する宿主細胞の種類、および該ポリペプチドが膜に結合しているかまたは宿主細胞から分
泌される可溶性型かなどの要因にしたがい、多様であろうことを認識するであろう。
【００８４】
いかなる適切な発現系を使用してもよい。ベクターは、適切な転写または翻訳制御ヌク
レオチド配列、例えば、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来のものなど
に、機能可能であるように連結されている、本発明のポリペプチドまたは断片をコードす
るＤＮＡを含む。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハン
サー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始および終結を調節する適
切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が該ＤＮＡ配列に機能的に関連して
いるとき、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチ
ド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節するならば、ＤＮ
Ａ配列に、機能可能であるように連結されている。望ましい宿主細胞において複製する能
力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクター
に取り込まれている。
【００８５】
さらに、適切なシグナルペプチド（天然または異種性）をコードする配列を、発現ベク
ターに取り込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、インフレ
ームで本発明の核酸配列に融合させ、ＤＮＡがまず転写され、そしてｍＲＮＡがシグナル
ペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるようにしてもよい。意図される宿主細胞で機
能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは
、ポリペプチドの細胞からの分泌に際し、ポリペプチドから切断される。
【００８６】
当業者はまた、シグナルペプチドが切断される位は、コンピュータープログラムに予測
されるものと異なる可能性があり、そして組換えポリペプチドを発現するのに使用される
宿主細胞の種類などの要因にしたがい、多様である可能性があることも認識するであろう
。タンパク質調製物は、１つ以上の部位でのシグナルペプチドの切断から生じる、異なる
Ｎ−末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物を含む可能性がある。本明細書に提供
される成熟タンパク質の特定の態様には、限定されるわけではないが、Ｎ−末端アミノ酸
として、配列番号２の１６、２９、３５、９５、または１１７位の残基を有するタンパク
質が含まれる。
【００８７】
ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核、酵母またはより高次の真核細胞が含
まれる。宿主細胞としての使用には、哺乳動物または昆虫細胞が一般的に好ましい。細菌
、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主での使用に適したクローニング用および発現ベク
ターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ニューヨーク州エルセビア（１９８５）に記載されて
いる。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開示されるＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用い、
ポリペプチドを産生するのに使用してもよい。
【００８８】
原核発現系
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物が含まれる。形質転換に適した原核宿
主細胞には、例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並び
にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な他の種
が含まれる。大腸菌などの原核宿主細胞において、組換えポリペプチドの該原核宿主細胞
における発現を容易にするため、ポリペプチドはＮ−末端メチオニン残基を含んでもよい
。Ｎ−末端Ｍｅｔは、発現された組換えポリペプチドから切断してもよい。
【００８９】
原核宿主細胞に用いるための発現ベクターは、一般的に、１つまたはそれ以上の表現型
選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐
性を与える、または独立栄養必要条件を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。
原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴ
ＣＣ ３７０１７）など、商業的に入手可能なプラスミド由来のものが含まれる。ｐＢＲ
３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を含み、そしてしたがって、形質転
換細胞を同定する簡単な手段を提供する。適切なプロモーターおよびＤＮＡ配列をｐＢＲ
３２２ベクター中に挿入する。他の商業的に入手可能なベクターには、例えば、ｐＫＫ２
２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン・ウプサ
ラ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、米国ウィスコンシン州マディソ
ン）が含まれる。
【００９０】
組換え原核宿主細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーター配列には、β−ラクタ
マーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ
２７５：６１５（１９７８）；およびＧｏｅｄｄｅｌら， Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５
４４（１９７９））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，
Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７（１９８０）；およびＥＰ−Ａ−３６
７７６）およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ｐ．４１２（１９８２））が含まれる。特に有用
な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性
リプレッサー配列を使用する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手
可能な、λＰＬプロモーターの誘導体を組み込んだプラスミドベクターには、プラスミド
ｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９、ＡＴＣＣ ３７０９２に常住）およびｐＰＬｃ２８（大
腸菌ＲＲ１、ＡＴＣＣ ５３０８２に常住）が含まれる。
【００９１】
酵母系
あるいは、ポリペプチドは、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）属（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来の酵母宿主細胞に
おいて発現してもよい。酵母の他の属、例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）またはクロイベ
ロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）もまた使用してもよい。酵母ベクターは、し
ばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモータ
ー領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー
遺伝子を含むであろう。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、とりわけ、メタロ
チオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ
． Ｃｈｅｍ． ２５５：２０７３（１９８０））あるいは、エノラーゼ、グリセルアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ
、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリ
ン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコース
イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら， Ｊ． Ａｄｖ
． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ７：１４９（１９６８））；および（Ｈｏｌｌａｎｄら，
Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７：４９００（１９７８））のプロモーターが含まれる。酵母発
現に用いるのに適した他のベクターおよびプロモーターはＨｉｔｚｅｍａｎ， ＥＰＡ−
７３，６５７にさらに記載されている。別の代替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８：２６７４（１９８２））およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ
３００：７２４（１９８２））に記載されるグルコース抑制可能ＡＤＨ２プロモーター
である。大腸菌での選択および複製のため、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺
伝子および複製起点）を上述の酵母ベクターに挿入することにより、酵母および大腸菌両
方において複製可能なシャトルベクターを構築してもよい。
【００９２】
酵母α−因子リーダー配列を使用し、ポリペプチドを直接分泌させてもよい。α−因子
リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列および構造遺伝子配列の間に挿入される。
例えば、Ｋｕｒｊａｎら， Ｃｅｌｌ ３０：９３３（１９８２）およびＢｉｔｔｅｒら
， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：５３３０（１９８
４）を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を容易にするのに適した
他のリーダー配列が当業者に知られる。リーダー配列を、その３’端近傍に、１つまたは
それ以上の制限部位を含むよう修飾してもよい。これは、リーダー配列が構造遺伝子に融
合するのを容易にするであろう。
【００９３】
酵母形質転換プロトコルが当業者に知られる。こうしたプロトコルの１つがＨｉｎｎｅ
ｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：１９２９（１
９７８）に記載される。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコルは、Ｔｒｐ＋形質転換体を選択培地
中で選択し、ここで該選択培地は０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カザミノ酸、２％グ
ルコース、１０ｍｇ／ｍｌアデニンおよび２０ｍｇ／ｍｌウラシルからなる。
【００９４】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は、発現
を誘導するため「リッチ」培地中で増殖させてもよい。リッチ培地の例は、８０ｍｇ／ｍ
ｌアデニンおよび８０ｍｇ／ｍｌウラシルを補った、１％酵母エキス、２％ペプトン、お
よび１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除（ｄｅｒｅｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ）は、培地からグルコースが枯渇したとき起こる。
【００９５】
哺乳動物または昆虫系
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、組換えポリペプチドを発現するのに使用し
てもよい。昆虫細胞において異種性タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系がＬ
ｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８
８）に概説されている。哺乳動物起源の樹立細胞株もまた、使用してもよい。適切な哺乳
動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）
（Ｇｌｕｚｍａｎら， Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１））、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞
、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら
（ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１（１９９１））に記載されるようなアフリカミドリザ
ル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
７０）由来であるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株が含まれる。
【００９６】
哺乳動物細胞内にＤＮＡを導入するための確立された方法が記載されてきている（Ｋａ
ｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．， Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ
Ｃｕｌｔｕｒｅ， ｐｐ．１５−６９（１９９０））。商業的に入手可能な試薬、例えば
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬を用いた、さらなるプロトコルを用い、細胞をトランスフェ
クションしてもよい（Ｆｅｌｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７））。さらに、エレクトロポレーシ
ョンを用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版． Ｖｏｌ．１−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））におけるもののよ
うな、慣用法を用い、哺乳動物細胞をトランスフェクションしてもよい。安定形質転換体
の選択は、例えば細胞毒性薬剤に対する耐性など、当該技術分野に知られる方法を用い、
行ってもよい。Ｋａｕｆｍａｎら， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５
：４８７−５１１（１９９０）は、いくつかの選択計画、例えばジヒドロ葉酸レダクター
ゼ（ＤＨＦＲ）耐性を記載する。ＤＨＦＲ選択に適した宿主株は、ＤＨＦＲ不全であるＣ
ＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１であってもよい（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０（１９８０））
。ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを発現しているプラスミドをＤＸ−Ｂ１１株に導入してもよく、そ
してプラスミドを含む細胞のみを適切な選択培地中で増殖させてもよい。発現ベクターに
組み込んでもよい選択可能マーカーの他の例には、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢな
どの抗生物質に対する耐性を与えるｃＤＮＡが含まれる。該ベクターを宿する細胞を、こ
れらの化合物に対する耐性に基づき選択してもよい。
【００９７】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノムよ
り切り出されてもよい。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポ
リオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒト
・サイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば
ＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポ
リアデニル化部位を用い、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の
遺伝要素を提供してもよい。ウイルス初期および後期プロモーターは、どちらもウイルス
複製起点をも含む可能性がある断片として容易にウイルスゲノムから得られるため、特に
有用である（Ｆｉｅｒｓら， Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３（１９７８））；（Ｋａｕ
ｆｍａｎ， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９０））。ＳＶ４０ウイル
ス複製起点部位に位置するＨｉｎｄ ＩＩＩ部位からＢｇｌ Ｉ部位に渡るおよそ２５０
ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片もまた用いて
もよい。
【００９８】
哺乳動物発現ベクターからの異種性遺伝子の発現を改善することが示されたさらなる調
節配列には、ＣＨＯ細胞由来の発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓら， Ａｎ
ｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐｐ．５２９−５３４およびＰＣＴ出願
第ＷＯ ９７／２５４２０号（１９９７））並びにアデノウイルス２由来の三分割（ｔｒ
ｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら，
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７：１３４７５−１３４９１（１９８２））など
の要素が含まれる。ウイルス起源の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列により、二
シストロン性ｍＲＮＡが効率的に翻訳されることが可能になる（ＯｈおよびＳａｒｎｏｗ
， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ ３：２９５−３００（１９９３））；（Ｒａｍｅｓｈら， Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７−２７００（１９９６））。選択可能
マーカー（例えばＤＨＦＲ）遺伝子が続く、二シストロン性ｍＲＮＡの一部としての異種
性ｃＤＮＡの発現は、宿主のトランスフェクション可能性および異種性ｃＤＮＡの発現を
改善することが示されてきている（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ（１９９０））。二シストロン性ｍＲＮＡを使用する典型的な発現ベクターは、
Ｍｏｓｓｅｒら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１５０−１６１（１９９７）に
記載されるｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓら， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，， ｐｐ．５２９−５３４（１９９７）に記載されるｐ２Ａ５Ｉ
である。
【００９９】
有用な高発現ベクター、ｐＣＡＶＮＯＴがＭｏｓｌｅｙら， Ｃｅｌｌ ５９：３３５
−３４８（１９８９）に記載されてきている。哺乳動物宿主細胞において用いるための他
の発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．
３：２８０（１９８３））に開示されるように構築してもよい。Ｃ１２７ネズミ乳腺上
皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系を、実質的にＣｏｓ
ｍａｎら（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：９３５（１９８６））に記載されるよう
に構築してもよい。Ｃｏｓｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記
載される有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ ３９８９０として
寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、本明細書に援用される、ＥＰ
−Ａ−０３６７５６６およびＷＯ ９１／１８９８２に記載されている。さらに別の代替
物として、ベクターは、レトロウイルス由来であってもよい。
【０１００】
別の有用な発現ベクター、ｐＦＬＡＧ（登録商標）を用いてもよい。ＦＬＡＧ（登録商
標）技術は、低分子量（１ｋＤ）親水性ＦＬＡＧ（登録商標）マーカーペプチドを、ｐＦ
ＬＡＧ（登録商標）発現ベクターにより発現される組換えタンパク質のＮ−末端に融合さ
せることを中心とする。ｐＤＣ３１１は、ＣＨＯ細胞でタンパク質を発現させるために用
いる、別の特殊化ベクターである。ｐＤＣ３１１は、目的の遺伝子およびジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を、ＤＨＦＲ翻訳のための内部リボソーム結合部位、発現
増大配列要素（ＥＡＳＥ）、ヒトＣＭＶプロモーター、三分割リーダー配列、およびポリ
アデニル化部位と共に含む、二シストロン性配列により特徴付けられる。
【０１０１】
使用してもよいシグナルペプチドに関し、望ましいならば、天然シグナルペプチドを異
種シグナルペプチドまたはリーダー配列に置き換えてもよい。シグナルペプチドまたはリ
ーダーの選択は、組換えポリペプチドが産生されるべき宿主細胞の種類などの要因に依存
する可能性がある。例えば、哺乳動物宿主細胞で機能する異種性シグナルペプチドの例に
は、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）の
シグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載さ
れるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ ３６７，５６６に記載されるイ
ンターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載さ
れるＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ ４６０，８４６に
記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。
【０１０２】
精製
本発明はまた、ポリペプチドおよびその断片を単離しそして精製する方法も含む。
単離および精製
本発明に含まれる「単離」ポリペプチドまたはその断片は、天然に見られる可能性があ
る環境と同一でない環境にあるポリペプチドまたは断片である。本発明に含まれる「精製
」ポリペプチドまたはその断片は、例えば上述のような組換え発現系の精製産物のように
、または天然発生細胞および／または組織などの非組換え供給源からの精製産物のように
、他のタンパク質またはポリペプチドとの結合を本質的に含まない。
【０１０３】
１つの好ましい態様において、組換えポリペプチドまたは断片の精製は、本発明のポリ
ペプチドまたは断片の、本発明のポリペプチドまたは断片の精製を援助する別のポリペプ
チドへの融合を用い、達成してもよい。こうした融合パートナーは、上述のようなポリ−
Ｈｉｓまたは他の抗原性同定ペプチドと共に先に記載されるＦｃ部分を含んでもよい。
【０１０４】
いかなる種類の宿主細胞に関しても、当業者に知られるように、組換えポリペプチドま
たは断片を精製するための方法は、使用する宿主細胞の種類および組換えポリペプチドま
たは断片が培地に分泌されるかどうかなどの要因にしたがい、多様であろう。
【０１０５】
一般的に、組換えポリペプチドまたは断片は、分泌されない場合、宿主細胞から、ある
いは可溶性でありそして分泌される場合、培地または上清から単離してもよく、その後１
つまたはそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー精製また
はサイズ排除クロマトグラフィー段階が続く。これらの段階を達成する特定の方法につい
ては、培地をまず、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏ
ｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用い、濃縮してもよい。
濃縮段階に続き、濃縮物をゲル濾過媒体などの精製マトリックスに適用してもよい。ある
いは、陰イオン交換樹脂、例えばペンダントな（ｐｅｎｄａｎｔ）ジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは支持体を使用してもよい。マトリックスは、
アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に通常使
用される他の種類であってもよい。あるいは、陽イオン交換段階を使用してもよい。適切
な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む多様な不溶性マ
トリックスが含まれる。さらに、クロマトフォーカシング段階を使用してもよい。あるい
は疎水性相互作用クロマトグラフィー段階を使用してもよい。適切なマトリックスは、樹
脂に結合しているフェニルまたはオクチル部分であってもよい。さらに、組換えタンパク
質に選択的に結合するマトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィーを使用し
てもよい。使用されるこうした樹脂の例は、レクチンカラム、色素カラム、および金属キ
レートカラムである。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ）媒体（例えば、ペンダントなメチル、オクチル、オクチルデシルまたは他の脂肪族基
を有するシリカゲルまたはポリマー樹脂）を使用する１つまたはそれ以上の逆相高性能液
体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）段階を使用し、ポリペプチドをさらに精製して
もよい。いくつかまたはすべての前記の精製段階の多様な組み合わせが周知であり、そし
て単離されそして精製されている組換えタンパク質を提供するのに使用してもよい。
【０１０６】
本発明のポリペプチド−結合タンパク質、例えば本発明のポリペプチドに対し生成され
たモノクローナル抗体などを含むアフィニティーカラムを利用し、発現されたポリペプチ
ドをアフィニティー精製することもまた、可能である。これらのポリペプチドは、慣用的
技術を用い、例えば、高塩溶出緩衝液中、そしてその後、使用のためより低塩緩衝液中に
透析することによって、あるいは利用されたアフィニティーマトリックスに応じて、ｐＨ
または他の構成要素を変化させることによって、あるいは親和性部分の天然発生基質、例
えば本発明由来のポリペプチドを用い、競合的に除去することによって、アフィニティー
カラムから除去してもよい。
【０１０７】
本発明の本側面において、ポリペプチド−結合タンパク質、例えば本発明の抗ポリペプ
チド抗体または本発明のポリペプチドと相互作用する可能性がある他のタンパク質を、そ
の表面に本発明のポリペプチドを発現する細胞を同定し、分離し、または精製するのに適
したカラムクロマトグラフィーマトリックスまたは同様の支持体などの固相支持体に結合
させてもよい。固相接触表面への本発明のポリペプチド結合タンパク質の結合は、いかな
る手段により達成してもよく、例えば磁気微小球体をこれらのポリペプチド結合タンパク
質で被覆し、そして磁気場を通じインキュベーション容器に保持してもよい。細胞混合物
の懸濁物を、上にこうしたポリペプチド結合タンパク質を有する固相と接触させる。本発
明のポリペプチドを表面上に有する細胞が固定ポリペプチド結合タンパク質に結合し、そ
してその後非結合細胞を洗い流す。本親和性結合法は、溶液からこうしたポリペプチド発
現細胞を精製し、スクリーニングし、または分離するのに有用である。固相から陽性に選
択された細胞を遊離させる方法は当該技術分野に知られ、そして例えば酵素の使用を含む
。こうした酵素は好ましくは細胞に対し非毒性および非傷害性であり、そして好ましくは
細胞表面結合パートナーを切断するよう、指示される。
【０１０８】
あるいは、本発明のポリペプチド発現細胞を含むと疑われる細胞混合物をまず、ビオチ
ン化した本発明のポリペプチド結合タンパク質とインキュベーションしてもよい。インキ
ュベーション時間は、本発明のポリペプチドへの十分な結合を確実にするため、典型的に
は少なくとも連続１時間である。生じた混合物をその後、アビジン被覆ビーズを充填した
カラムに通過させ、それによりアビジンに対するビオチンの高い親和性が、ポリペプチド
結合細胞のビーズへの結合を提供する。アビジン被覆ビーズの使用は当該技術分野に知ら
れる。Ｂｅｒｅｎｓｏｎら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０Ｄ：２３９
（１９８６）を参照されたい。非結合成分の洗浄および結合細胞の遊離は、慣用法を用い
行う。
【０１０９】
望ましい純度は、タンパク質の意図される使用に依存する。例えば、タンパク質がｉｎ
ｖｉｖｏで投与されるとき、比較的高い純度が望ましい。こうした場合、ポリペプチド
は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析に際し、
他のタンパク質に相当するタンパク質バンドが検出不能であるように精製される。当業者
は、異なる糖鎖付加、異なる翻訳後プロセシング等により、該ポリペプチドに相当する多
数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化される可能性があることを認識するであろう
。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の際、単一の
タンパク質バンドにより示されるように、実質的に均一に精製される。タンパク質バンド
は銀染色、クーマシーブルー染色により、または（タンパク質が放射標識されている場合
は）オートラジオグラフィーにより、視覚化してもよい。
【０１１０】
アッセイ
本発明の精製ポリペプチド（タンパク質、ポリペプチド、断片、変異体、オリゴマー、
および他の型を含む）を、慣用的な結合アッセイなど、いかなる適切なアッセイにおいて
、ＴＳＬＰ受容体に結合する能力に関し試験してもよい。例として、ポリペプチドを検出
可能試薬（例えば、放射性核種、発色団、比色もしくは蛍光分光反応を触媒する酵素など
）で標識してもよい。標識ポリペプチドを、ＴＳＬＰ受容体を発現している細胞と接触さ
せる。細胞をその後、洗浄し、非結合標識ポリペプチドを除去し、そして細胞に結合して
いる標識の存在を、標識の性質にしたがい選択される適切な技術により、決定してもよい
。
【０１１１】
結合アッセイ法の１つの例は以下の通りである。当該技術分野に知られる方法により、
ＴＳＬＰ ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターを構築する。マウスＴＳＬＰ受容体は、Ｎ
−末端細胞外ドメイン、膜貫通領域、およびＣ−末端細胞質ドメインを含む。１０ ｃｍ
２プレート中のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞を該組換え発現ベクターでトランスフェクショ
ンする。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４７８）は、ＣＭＶ極初
期エンハンサー／プロモーターからドライブされるＥＢＶ核抗原１を恒常的に発現する。
ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は、ＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１（１９９
１））に記載されるように、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
７０）由来であった。
【０１１２】
トランスフェクション細胞を２４時間培養し、そして各プレート中の細胞をその後、２
４ウェルプレートに分ける。さらに４８時間培養した後、トランスフェクション細胞（約
４ ｘ １０４細胞／ウェル）をＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。ＢＭ−ＮＦＤＭは５０ ｍ
ｇ／ｍｌ脱脂粉乳が添加されている結合培地（２５ ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２
ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．２を含むＲＰＭＩ
１６４０）である。該細胞をその後、多様な濃度の、例えば上述のように作成された可
溶性ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質と、３７℃で１時間インキュベーションする。細
胞をその後、洗浄し、そして結合培地中で、１２５Ｉマウス抗ヒトＩｇＧの一定の飽和濃
度で、穏やかに攪拌しながら３７℃で１時間インキュベーションする。徹底した洗浄の後
、トリプシン処理を介し細胞を遊離させる。
【０１１３】
上に使用されるマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けられ、そし
てＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎ
ｃ．、ペンシルバニア州ウェストグローブから得ることが可能である。抗体は標準的クロ
ラミン−Ｔ法を用い、放射ヨウ素標識される。該抗体は、細胞に結合しているいかなるポ
リペプチド／Ｆｃタンパク質のＦｃ部分にも結合するであろう。すべてのアッセイにおい
て、１２５Ｉ抗体の非特異的結合をＦｃ融合タンパク質／Ｆｃの非存在下でアッセイする
と共に、Ｆｃ融合タンパク質および２００倍のモル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体
の存在下でもアッセイする。
【０１１４】
細胞結合１２５Ｉ抗体は、Ｐａｃｋａｒｄ Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンターで定量化す
る。親和性計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
５１：６６０（１９４９））はＭｉｃｒｏｖａｘコンピューター上で実行されるＲＳ／
１（ＢＢＮ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、マサチューセッツ州ボストン）上で生み出される。
【０１１５】
別の種類の適切な結合アッセイは、競合結合アッセイである。例えば、変異体の生物学
的活性は、該変異体が、ＴＳＬＰ受容体への結合に関し、天然タンパク質と競合する能力
をアッセイすることにより、決定してもよい。
【０１１６】
競合結合アッセイは、慣用的方法論により、行いうる。競合結合アッセイに使用しても
よい試薬には、放射標識ＴＳＬＰ、およびＴＳＬＰ受容体（内因性または組換え）を細胞
表面に発現している、損なわれていない細胞が含まれる。例えば、放射標識可溶性ＴＳＬ
Ｐ断片を用い、細胞表面ＴＳＬＰ受容体への結合に関し、可溶性ＴＳＬＰ変異体と競合さ
せてもよい。損なわれていない細胞の代わりに、（固相上の）プロテインＡまたはプロテ
インＧのＦｃ部分との相互作用を通じ固相に結合している可溶性ＴＳＬＰ受容体／Ｆｃ融
合タンパク質で代用してもよい。プロテインＡおよびプロテインＧを含むクロマトグラフ
ィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．、ニュージャージー
州ピスカタウェイより入手可能なものが含まれる。
【０１１７】
別の種類の競合結合アッセイは、放射標識可溶性ＴＳＬＰ受容体、例えばＴＳＬＰ受容
体／Ｆｃ融合タンパク質、および内因性または組換えＴＳＬＰ受容体を発現する、損なわ
れていない細胞を利用する。放射標識ＴＳＬＰ受容体を用い、可溶性ＴＳＬＰに関し、膜
結合ＴＳＬＰ受容体と競合させてもよい。定性的結果は、競合オートラジオグラフプレー
ト結合アッセイにより得てもよく、一方、定量的結果を生成するのにＳｃａｔｃｈａｒｄ
プロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１
：６６０（１９４９））を利用してもよい。
【０１１８】
ヒトＴＳＬＰ核酸またはオリゴヌクレオチドの使用
上述のように、ポリペプチドを発現するのに用いられるほか、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮ
Ａを含む本発明の核酸およびそのオリゴヌクレオチドを以下に用いてもよい：
Ｂ細胞系譜またはＴ細胞系譜細胞増殖を誘導する能力を有するタンパク質をコードする
核酸を同定するためのプローブとして；
ヒト染色体第５番を同定するため
ヒト染色体第５番上の遺伝子をマッピングするため
ヒト染色体第５番と関連する、特定の疾患、症候群、または他の異常に関連する遺伝子
を同定するため；
一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ＴＳＬＰ遺伝子にコード
されるポリペプチドの発現を阻害するため；
個体において不全遺伝子を検出するのを補助するため；および
遺伝子治療のため。
【０１１９】
プローブ
本発明の核酸の使用の中に、プローブまたはプライマーとしての断片の使用がある。こ
うした断片は、一般的に、ＤＮＡ配列の少なくとも約１７の隣接するヌクレオチドを含む
。他の態様において、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも３０、または少なくとも６
０の隣接するヌクレオチドを含む。
【０１２０】
他の哺乳動物種由来の配列番号１の相同体が本明細書に意図されるため、配列番号１の
ヒトＤＮＡ配列に基づくプローブを用い、慣用的な種間（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）
ハイブリダイゼーション技術を用い、他の哺乳動物種由来のｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングしてもよい。
【０１２１】
遺伝暗号の知識を、上に示されるアミノ酸配列と組み合わせて用い、縮重オリゴヌクレ
オチドの組を調製してもよい。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ断片を単離
しそして増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーとして有用であ
る。
【０１２２】
染色体マッピング
配列番号１のすべてまたは一部は、オリゴヌクレオチドを含め、当業者により、周知の
技術を用い、ヒト染色体第５番、および他のＴＳＬＰファミリーメンバーのＤＮＡを含む
可能性がある、特定のその遺伝子座を同定するのに用いてもよい。有用な技術には、限定
されるわけではないが、放射ハイブリッド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ）マッピ
ング（高解像度）、染色体伸展（ｓｐｒｅａｄ）に対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーション（中程度の解像度）、および個々のヒト染色体を含むハイブリッド細胞株に対す
るサザンブロットハイブリダイゼーション（低解像度）などの、多様な周知の技術におけ
るプローブとして、オリゴヌクレオチドを含む、配列または部分を使用することを含む。
【０１２３】
例えば、染色体はＰＣＲおよび放射ハイブリダイゼーションを用いることによりマッピ
ングしてもよい。９３の放射ハイブリッドのＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／
ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇ
ｅ４パネルを用い、ＰＣＲを行う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ
．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ
／ｊｕｌｙ９７／ｒｈｍａｐ／ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４．ｈｔｍｌ）。目的の遺伝子の推
定上のエクソン内にあり、イントロンに渡り、またはイントロン・エクソン断片に渡り、
そしてヒトゲノムＤＮＡから産物を増幅するが、例えばコントロール・ハムスターゲノム
ＤＮＡを増幅しないプライマーを用いる。ＰＣＲの結果をデータベクトルに変換し、イン
ターネット上のＷｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ放射マッピングサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ−ｓｅｑ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）に提出する。該データはスコア化され、そして放射
ハイブリッドマップ上の既知の配列タグ部位（ＳＴＳ）マーカーに比べた染色体割り当て
および配置が提供される。以下のウェブサイトは、放射ハイブリッドマッピングに関し、
さらなる情報を提供する：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂ
ｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／０７−９７．ＩＮ
ＴＲＯ．ｈｔｍｌ。
【０１２４】
関連する疾患の同定
以下に示すように、ネズミ遺伝子のシンテニー解析（ｓｙｎｔｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓ
ｉｓ）により、配列番号１は染色体第５番のｑ２１−ｑ２２領域にマッピングされている
。したがって、当業者は、周知の技術を用い、ガードナー症候群、線腫様結腸ポリポーシ
ス、遺伝性類線維腫疾患、ターコット症候群、および結腸直腸癌を含む、ヒト染色体第５
番、および特に染色体第５番のｑ２１−ｑ２２領域に関連する異常を解析するのに、配列
番号１の核酸またはその断片を用いてもよい。これにより本マーカーが再配置または欠失
されている状態を識別することが可能になる。さらに、配列番号１のヌクレオチドまたは
その断片は、未知の位置の他の遺伝子をマッピングする、位置マーカーとして用いてもよ
い。
【０１２５】
本発明の核酸に相当する遺伝子の不全または不十分な量により（直接または間接的に）
仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのに、該ＤＮＡを用いてもよい。天然ヌ
クレオチド配列の本明細書の開示により、不全遺伝子の検出、および正常遺伝子でのその
置換が可能になる。不全遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイにおいて、そして本明
細書に開示される天然ヌクレオチド配列と、本遺伝子に不全を宿すると疑われるヒト由来
の遺伝子のものとを比較することにより、検出してもよい。
【０１２６】
センス−アンチセンス
核酸の他の有用な断片には、標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配
列に結合することが可能な一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡいずれか）を含む、アン
チセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスまたはセンスオリゴ
ヌクレオチドは、本発明にしたがい、ＤＮＡの断片（配列番号１）を含む。こうした断片
は、一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４ないし約３０ヌクレオ
チドを含む。既定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンスまたは
センスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：２６５９（１９８８））およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら（
ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８（１９８８））に記載されている。
【０１２７】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、ＲＮアーゼ
ＨによるｍＲＮＡ分解の亢進、スプライシングの阻害、転写または翻訳の未成熟な終結、
あるいは他の手段によるものを含む、いくつかの手段の１つにより、タンパク質発現を遮
断するまたは阻害する二重鎖の形成を生じる。このように、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを用い、タンパク質の発現を遮断することが可能である。アンチセンスまたはセンス
オリゴヌクレオチドはさらに、修飾糖−ホスホジエステル骨格（または、ＷＯ ９１／０
６６２９に記載されるものなど、他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、そし
てこのような糖結合は内因性ヌクレアーゼに耐性である。耐性糖結合を持つこうしたオリ
ゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで安定である（すなわち酵素分解に抵抗することが可
能である）が、標的ヌクレオチド配列に結合することが可能な配列特異性を保持する。
【０１２８】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ ９０／１０４４８
に記載されるものなどの有機部分、およびポリ−（Ｌ−リジン）などの標的核酸配列に対
するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に共有結合しているオリゴヌクレ
オチドが含まれる。さらに、エリプチシンなどの挿入剤、およびアルキル化剤または金属
錯体がセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合し、標的ヌクレオチド配列へ
のアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾してもよい。
【０１２９】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、リポフェクション、ＣａＰ
Ｏ４仲介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む、いかなる遺伝子
トランスファー法により、あるいはエプスタイン・バーウイルスなどの遺伝子トランスフ
ァーベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。
【０１３０】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ ９１／０４７５３に記載
されるように、リガンド結合分子との結合体の形成により、標的ヌクレオチド配列を含む
細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子には、限定されるわけではないが、細胞
表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガン
ドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子の結合体化は、実質的にリガンド結合分子
がその対応する分子または受容体に結合する能力に干渉せず、あるいはセンスまたはアン
チセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合体型が細胞内に入るのを遮断しない。
【０１３１】
あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９０／１０４４８
に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含
む細胞に導入してもよい。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は
、好ましくは、内因性リパーゼにより、細胞内で分離される。
【０１３２】
ヒトＴＳＬＰポリペプチドおよび断片化ポリペプチドの使用
使用には、限定されるわけではないが、以下が含まれる：
タンパク質の精製およびその活性の測定
搬送剤
療法および研究用試薬
分子量および等電点電気泳動マーカー
ペプチド断片化のコントロール
未知のタンパク質の同定
抗体の調製。
【０１３３】
精製試薬
本発明のポリペプチドは、タンパク質精製試薬として使用を見出す。例えば、該ポリペ
プチドは、ＴＳＬＰ結合パートナー、例えばヒトＴＳＬＰ受容体を精製するのに用いても
よい。特定の態様において、ポリペプチド（ＴＳＬＰ受容体に結合することが可能な、本
明細書に記載されるいかなる型でもよい）を、慣用法により固体支持体に結合させる。１
つの例として、タンパク質のアミノ酸側鎖上の官能基と反応するであろう官能基を含む、
アフィニティークロマトグラフィーカラムが入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。あるいは、ＴＳＬＰポ
リペプチド／Ｆｃタンパク質（上述のようなもの）を、Ｆｃ部分との相互作用を通じ、プ
ロテインＡまたはプロテインＧ含有クロマトグラフィーカラムに結合させる。
【０１３４】
該ポリペプチドはまた、細胞表面上にＴＳＬＰ受容体を発現する細胞を精製する、また
は同定するのに使用を見出す。ポリペプチドを、カラムクロマトグラフィーマトリックス
または同様の適切な支持体などの固相に結合させる。例えば、磁気微小球体をポリペプチ
ドで被覆し、そして磁気場を通じインキュベーション容器に保持してもよい。ＴＳＬＰ受
容体発現細胞を含む細胞混合物の懸濁物を、ポリペプチドをその上に有する固相と接触さ
せる。細胞表面上にＴＳＬＰ受容体を発現する細胞を固定ポリペプチドに結合させ、そし
てその後、非結合細胞を洗い流す。
【０１３５】
あるいは、ポリペプチドを検出可能な部分に結合させ、その後、ＴＳＬＰ受容体発現に
関し試験しようとする細胞とインキュベーションしてもよい。インキュベーション後、非
結合標識成分を除去し、そして細胞上の検出可能部分の存在または非存在を測定する。
【０１３６】
さらに別の代替物において、ＴＳＬＰ受容体を含むと疑われる細胞混合物をビオチン化
ポリペプチドとインキュベーションする。インキュベーション時間は、十分な結合を確実
にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。生じた混合物をその後、アビジン
被覆ビーズを装填したカラムに通過させ、これによりビオチンのアビジンに対する高い親
和性が、望ましい細胞のビーズへの結合を提供する。アビジン被覆ビーズを用いる方法が
知られる（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０Ｄ：２
３９（１９８６）を参照されたい）。非結合成分を除去するための洗浄、および結合細胞
の遊離は、慣用法を用い行う。
【０１３７】
活性測定
ポリペプチドはまた、その結合親和性に関しＴＳＬＰ受容体の生物学的活性を測定する
のにも使用を見出す。したがって、ポリペプチドは、例えば異なる条件下でのタンパク質
の貯蔵寿命および安定性をモニターするための、「品質保証」研究を行うものにより、使
用してもよい。例えば、ポリペプチドを結合親和性研究に使用し、異なる温度で保存され
ている、または異なる細胞種で産生されたＴＳＬＰ受容体の生物学的活性を測定してもよ
い。該タンパク質はまた、ＴＳＬＰ受容体の修飾（例えば、化学的修飾、一部切除、突然
変異など）後、生物学的活性が保持されているかどうか決定するのにも用いてもよい。修
飾ＴＳＬＰ受容体の結合親和性を非修飾ＴＳＬＰ受容体のものと比較し、ＴＳＬＰ受容体
の生物学的活性に対する該修飾のいかなる不利な影響も検出する。したがって、例えばＴ
ＳＬＰ受容体の生物学的活性を、調査研究において用いる前に確認することが可能である
。
【０１３８】
搬送剤
該ポリペプチドはまた、結合する剤を、ＴＳＬＰ受容体を持つ細胞に搬送するためのキ
ャリアーとしての使用も見出す。ＴＳＬＰ受容体発現細胞には、胸腺、脾臓、腎臓、およ
び骨髄に同定されるものが含まれる。したがって、該ポリペプチドを用い、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法において、診断用剤または療法剤をこうした細胞に（または
細胞表面上にＴＳＬＰ受容体を発現することが見出されている他の細胞種に）搬送しても
よい。
【０１３９】
ポリペプチドに結合させてもよい検出可能な剤（診断用剤）および療法剤には、限定さ
れるわけではないが、毒素、他の細胞毒性剤、薬剤、放射性核種、発色団、比色もしくは
蛍光分光反応を触媒する酵素等が、意図される適用にしたがって選択される特定の剤と共
に含まれる。毒素の中には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リボソーム不活性化タンパク質、トリコ
セセンなどのマイコトキシン、並びにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）がある
。診断使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、１２３Ｉ、１３１Ｉ、
９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、および７６Ｂｒがある。療法使用に適した放射性核種の例には
、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、７７Ｂｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ
、１０９Ｐｄ、６４Ｃｕ、および６７Ｃｕがある。
【０１４０】
こうした剤は、いかなる適切な慣用法により、ポリペプチドに結合させてもよい。ポリ
ペプチドは、例えば、望ましい剤上の官能基と反応し、共有結合を形成することが可能で
ある、アミノ酸側鎖上の官能基を含む。あるいは、タンパク質または剤を誘導体化し、望
ましい反応性官能基を生成し、または結合させてもよい。誘導体化には、多様な分子をタ
ンパク質に結合させるのに利用可能である、二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）の１つの結合を伴って
もよい。タンパク質を放射標識するためのいくつかの技術が知られる。放射性核種金属を
、例えば適切な二官能性キレート剤を用いることにより、ポリペプチドに結合させてもよ
い。
【０１４１】
ポリペプチドおよび適切な診断用剤または療法剤を含む（好ましくは共有結合している
）結合体をこのように調製する。特定の適用に適した量で、該結合体を投与し、またはそ
うでなければ使用してもよい。
【０１４２】
療法剤
本発明のポリペプチドを、ポリペプチドの不全、または不十分な量により（直接または
間接的に）仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのに用いてもよい。これらの
ポリペプチドを、こうした障害を患う哺乳動物に投与してもよい。
【０１４３】
ポリペプチドはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法において、ＴＳＬＰ受
容体の生物学的活性を阻害するのにも使用してもよい。例えば、精製または修飾ポリペプ
チドまたはその断片（例えば、受容体に結合するが、情報伝達を誘導する能力を欠く、修
飾ＴＳＬＰポリペプチド）を用い、内因性ＴＳＬＰの細胞表面受容体への結合を阻害して
もよい。こうして、内因性ＴＳＬＰの受容体への結合から生じる生物学的影響を阻害する
。
【０１４４】
さらに、ＴＳＬＰ受容体ポリペプチドを哺乳動物に投与し、ＴＳＬＰ受容体が仲介する
障害を治療してもよい。こうしたＴＳＬＰ受容体仲介障害には、ＴＳＬＰ受容体により（
直接または間接的に）引き起こされるまたは悪化される異常が含まれる。
【０１４５】
本発明の組成物は、本明細書に記載されるいかなる型のポリペプチド、例えば天然タン
パク質、変異体、誘導体、オリゴマー、および生物学的に活性がある断片を含んでもよい
。特定の態様において、該組成物は、可溶性ポリペプチド、または可溶性ＴＳＬＰポリペ
プチドを含むオリゴマーを含む。
【０１４６】
本発明のポリペプチドの有効量を、生理学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、または
賦形剤などの他の構成要素と組み合わせて含む組成物が、本明細書に提供される。薬学的
に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法にしたがい、ポリペプチドを処方し
てもよい。これらは、単一の活性成分として、または既定の徴候に適した他の既知の活性
成分と共に、薬学的に許容しうる希釈剤（例えば、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸
、およびリン酸緩衝液）、保存剤（例えば、チメロサル、ベンジルアルコール、パラベン
類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーと混合して組み合わせ
てもよい。薬剤組成物に適した処方には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１６版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ， ペンシルバニア州イーストン（１９８０）に記載されるものが含まれる。
【０１４７】
さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体
化していてもよく、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストランなど
のポリマー化合物に取り込まれていてもよく、またはリポソーム、微小乳剤、ミセル、単
層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに取り込まれていてもよ
い。こうした組成物は、物理的状態、可溶性、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、および
ｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えるであろうし、そしてしたがって意図され
る適用にしたがい、選択される。
【０１４８】
本発明の組成物は、例えば局所、非経口、または吸入によるなど、いかなる適切な方式
で、投与してもよい。「非経口」という用語には、例えば皮下、静脈内、または筋内経路
による注射が含まれ、また例えば疾患または損傷の部位での局所化投与も含まれる。移植
物からの持続放出もまた、意図される。当業者は、適切な投薬量が、治療しようとする障
害の性質、患者の体重、年齢、および全身状態、並びに投与経路などの要因に応じ、多様
であろうことを認識するであろう。予備的用量は動物試験にしたがい決定してもよく、そ
してヒト投与のための投薬量の見積もりを、当該技術分野に認められる実施にしたがい、
行う。
【０１４９】
生理学的に許容しうる処方中の核酸を含む組成物もまた、意図される。ＤＮＡは、例え
ば注射のため処方してもよい。
研究用剤
本発明のポリペプチドの別の使用は、異なる細胞種上のＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ受容体相互
作用を阻害することから生じる生物学的影響を研究するための研究ツールとしての使用で
ある。ポリペプチドはまた、ＴＳＬＰまたはＴＳＬＰ受容体あるいはそれらの相互作用を
検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに使用してもよい。
【０１５０】
本発明の別の態様は、Ｂ細胞またはＴ細胞情報伝達を研究するためのヒトＴＳＬＰの使
用に関する。ヒトＴＳＬＰおよび他のサイトカインは、細胞シグナルを伝達し、細胞を刺
激しサイトカインを分泌させ、そしてＢ細胞およびＴ細胞増殖を誘導することを含め、Ｂ
細胞およびＴ細胞発生、並びに免疫反応に中心的な役割を果たす。こうしたものとして、
ＴＳＬＰの発現および／または活性化における改変は、限定されるわけではないが、細胞
特異的反応および増殖の活性化または阻害を含む、多くの細胞過程に激しい影響を有する
可能性がある。クローン化ＴＳＬＰまたはＴＳＬＰの触媒的に不活性な突然変異体の発現
は、特定のタンパク質が特定の情報伝達事象を仲介するのに果たす役割を同定するために
用いられてきている。
【０１５１】
細胞情報伝達は、しばしば、分子活性化カスケードを伴い、該カスケード中、受容体が
、標的基質をリン酸化する細胞内キナーゼを特異的に活性化することにより、リガンド−
受容体仲介シグナルを伝達する。これらの基質は、それ自体キナーゼであってもよく、該
基質がリン酸化後活性化されてもよい。あるいは、該基質は、リン酸化後、タンパク質−
タンパク質相互作用を通じ、下流情報伝達を容易にするアダプター分子であってもよい。
基質分子の性質に関係なく、発現されたＴＳＬＰリガンド受容体の触媒的に活性である型
を用い、ＴＳＬＰリガンド受容体により、どの基質が認識されそして活性化されるか同定
してもよい。このようなものとして、これらの新規ＴＳＬＰ受容体は、情報伝達経路に関
与する新規分子を同定する試薬として用いてもよい。
【０１５２】
さらに、ＴＳＬＰを用い、当業者により、Ｂ細胞系譜およびＴ細胞系譜細胞増殖を刺激
する周知の技術（Ｒａｙら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２６、 １０−
１６（１９９６）およびＮａｍｉｋａｗａら， Ｂｌｏｏｄ ８７：１８８１−１８９０
（１９９６））を用い、ヒトＴＳＬＰ受容体を発現クローニング（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｃｌｏｎｅ）し（Ｓｉｍｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５８５−５８９（１９８８
））、関連タンパク質をクローニングし（Ｋｏｚｌｏｓｋｙら， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９
：５４０−５４９（１９９７）およびＬｙｍａｎら， Ｂｌｏｏｄ １０：２７９５−２
８０１（１９９４））、そして細胞をｅｘ ｖｉｖｏ拡大し（Ｐｉａｃｉｂｅｌｌｏら，
Ｂｌｏｏｄ ８９：２６４４−２６５３（１９９７））てもよい。
【０１５３】
その使用
したがって、本発明は、ＢおよびＴリンパ球増殖を刺激する方法であって、ヒトＴＳＬ
Ｐとリンパ球をインキュベーションすることを含む前記方法を含む。さらなる態様におい
て、該方法は、ヒトＴＳＬＰおよび少なくとも１つの他のサイトカインとリンパ球を、ｉ
ｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションすることを含む。好ましくは
、サイトカインは、ＩＬ−７、スチール因子、幹細胞因子、マスト細胞増殖因子またはｆ
ｌｔ３リガンドの群より選択される。より好ましくは、サイトカインはＩＬ−７である。
【０１５４】
本発明はまた、リンパ球発生またはリンパ球新生を刺激する方法であって、ヒトＴＳＬ
Ｐと、前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、例えば骨髄由来単核細胞を、ｉｎ
ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションすることを含む、前記方法も含
む。さらなる態様において、該方法は、ヒトＴＳＬＰおよび少なくとも１つの他のサイト
カインとリンパ球をインキュベーションすることを含む。好ましくは、サイトカインは、
ＩＬ−７、スチール因子、幹細胞因子、マスト細胞増殖因子またはｆｌｔ３リガンドの群
より選択される。より好ましくは、サイトカインはＩＬ−７である。
【０１５５】
分子量および等電点マーカー
本発明のポリペプチドは、化学的および酵素的手段により、より小さいペプチドへの断
片化に供してもよく、そしてこうして産生されたペプチド断片を、他のタンパク質または
ポリペプチドの解析に用いてもよい。例えば、こうしたペプチド断片を、ペプチド分子量
マーカー、ペプチド等電点マーカーとして、またはペプチド断片化の度合いの解析におい
て、用いてもよい。したがって、本発明はまた、これらのポリペプチドおよびペプチド断
片並びに、未知のタンパク質の見かけの分子量および等電点の決定を援助するキット、お
よび未知のタンパク質の断片化の度合いを評価するキットも含む。
【０１５６】
断片化の方法すべてが本発明に含まれるが、化学的断片化が好ましい態様であり、そし
て特異的な切断がメチオニン残基で起こるように、中性または酸性条件下で切断する臭化
シアンの使用が含まれる（Ｅ． Ｇｒｏｓｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ． １１
：２３８−２５５（１９６７））。これは、システイン残基を非反応種に変換するカルボ
キシメチル化段階などのさらなる段階を、さらに含んでもよい。
【０１５７】
酵素的断片化には、アスパラギン・エンドペプチダーゼ、アルギニン・エンドペプチダ
ーゼ、アクロモバクター・プロテアーゼＩ、トリプシン、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、
またはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃなどのプロテアーゼの、特定のアミノ酸残基での
切断を生じる慣用的な条件下での使用が含まれる。アスパラギン・エンドペプチダーゼは
、本発明のポリペプチド内に存在するアスパラギン残基のカルボキシル側を特異的に切断
することが可能である。アルギニン・エンドペプチダーゼは、これらのペプチド内に存在
するアルギニン残基のカルボキシル側を特異的に切断することが可能である。アクロモバ
クター・プロテアーゼＩは、該ポリペプチド内に存在するリジン残基のカルボキシル側を
特異的に切断することが可能である（ＳａｋｉｙａｍａおよびＮａｋａｔ、米国特許第５
，２４８，５９９号；Ｔ． Ｍａｓａｋｉら， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ ６６０：４４−５０（１９８１）；Ｔ． Ｍａｓａｋｉら， Ｂｉｏｃｈｉｍ
． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６６０：５１−５５（１９８１））。トリプシンは、
本発明のポリペプチド内に存在するアルギニンおよびリジン残基のカルボキシル側を特異
的に切断することが可能である。酵素的断片化はまた、多数のアミノ酸残基で切断するプ
ロテアーゼでも起こる可能性がある。例えば、黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼは、ポリ
ペプチド内に存在するアスパラギン酸およびグルタミン酸残基のカルボキシル側を特異的
に切断することが可能である（Ｄ． Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ３：１１０２−１１０６（１９７７））。エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ
は、ポリペプチド内に存在するアスパラギン残基のアミノ側を特異的に切断することが可
能である。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃは、本発明のポリペプチド内に存在するリジ
ン残基のカルボキシル側を特異的に切断することが可能である。他の酵素的および化学的
処理を、同様に用い、これらのポリペプチドを特定のペプチドの特有の組に断片化しても
よい。
【０１５８】
もちろん、本発明のペプチドおよびポリペプチドの断片はまた、当該技術分野に周知の
慣用的な組換え法および合成法により産生してもよい。組換え法に関し、本発明に含まれ
るポリペプチドおよびペプチド断片は、これらが発現される宿主細胞に応じ、多様な分子
量を有する可能性がある。多様な細胞種における本発明のポリペプチドおよびペプチド断
片の糖鎖付加は、修飾の度合いに応じ、これらの片（ｐｉｅｃｅ）の分子量の変動を生じ
る可能性がある。これらの片の大きさは、該ポリペプチドの細胞外部分由来のポリペプチ
ド断片で最も雑多である可能性がある。一貫したポリペプチドおよびペプチド断片は、完
全に膜貫通および細胞質領域由来のポリペプチドを用いる、Ｎ−グリカナーゼで前処理し
、糖鎖付加を除く、または細菌宿主でポリペプチドを発現させることにより、得ることが
可能である。
【０１５９】
これらのポリペプチドの分子量はまた、本発明のポリペプチドのアミノおよびカルボキ
シル末端両方に、さらなるペプチド配列を融合させることにより、変化させてもよい。本
発明のポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端でのさらなるペプチド配列の融合を
用い、これらのポリペプチドの発現を亢進し、または該タンパク質の精製を援助してもよ
い。さらに、本発明のポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端でのさらなるペプチ
ド配列の融合は、酵素的または化学的処理により生成されるポリペプチドの断片化ペプチ
ドを、通常すべてではないがいくつか、改変するであろう。もちろん、分子生物学の日常
的でそして既知の技術を用い、本発明のポリペプチドに、突然変異を導入してもよい。例
えば、特定の酵素によるタンパク質分解切断の部位または特定の化学的に誘導される断片
化法による切断の部位を除去するように、突然変異を設計してもよい。該部位の除去は、
特定の酵素または化学的方法での断片化に際し、本発明のポリペプチドのペプチドフィン
ガープリントを改変するであろう。
【０１６０】
ポリペプチドおよび生じた断片化ペプチドは、沈降、電気泳動、クロマトグラフィー、
および質量分析を含む方法により解析し、それらの分子量を決定してもよい。各片の特有
のアミノ酸配列が分子量を特定するため、これらの片はその後、未知のタンパク質、ポリ
ペプチドまたはその断片の分子量決定を援助するこうした解析技術を用い、分子量マーカ
ーとして利用することが可能である。本発明の分子量マーカーは、同様の見かけの分子量
を有するタンパク質の見かけの分子量概算のための分子量マーカーとして特によく働き、
そしてその結果、タンパク質の見かけの分子量測定の正確さを増加させることが可能にな
る。
【０１６１】
本発明が断片化ペプチド分子量マーカーの使用に関する場合、これらのマーカーは、好
ましくは大きさが少なくとも１０アミノ酸である。より好ましくは、これらの断片化ペプ
チド分子量マーカーは、大きさが１０および１００アミノ酸の間である。さらにより好ま
しいのは、大きさが１０および５０アミノ酸の間の断片化ペプチド分子量マーカーであり
、そして特に大きさが１０および３５アミノ酸の間のものである。最も好ましいのは、大
きさが１０および２０アミノ酸の間の断片化ペプチド分子量マーカーである。
【０１６２】
分子量測定法の中に、沈降、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、および質量分析があ
る。特に好ましい態様は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕ．Ｋ． Ｌａｅｍｍ
ｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９７０））である。慣用的には、該
方法は、ドデシル硫酸ナトリウムおよび６−２０％の間の濃度のアクリルアミドを含むゲ
ルの２つの別個のレーンを用いる。マーカーおよび試料を、同一の条件下で同時に分離す
る能力により、正確さを増加させることが可能になる。もちろん、本発明のポリペプチド
を用いた未知のタンパク質の分子量測定には、多くの異なる技術を用いてもよく、そして
本態様はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【０１６３】
各非糖鎖付加ポリペプチドまたはその断片は、その特有のアミノ酸配列により本質的に
決定されるｐＩを有する（このｐＩは、当業者により、現在利用可能なｐＩ値を予測する
よう設計されたいかなるコンピュータープログラムを用い概算しても、いかなる周知のア
ミノ酸ｐＫａ表を用い計算しても、または実験により測定してもよい）。したがって、こ
れらのポリペプチドおよびその断片は、等電点電気泳動などの技術を用い、未知のタンパ
ク質、ポリペプチド、または断片化ペプチドの等電点測定を援助する、特定のマーカーと
して利用することが可能である。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーは
、本発明のポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーのものと近い見かけの等電点を有
する未知のタンパク質の見かけの等電点概算に、特によく働く。
【０１６４】
等電点電気泳動技術は、さらに、ゲル電気泳動などの他の技術と組み合わせ、分子量お
よび電荷に基づき、タンパク質を同時に分離してもよい。これらのポリペプチドまたは断
片化ペプチドマーカーおよび未知のタンパク質を、同一の条件下で同時に分離する能力に
より、未知のタンパク質の見かけの等電点測定の正確さを増加させることが可能になる。
これは、方法の性質が、いかなるマーカーも未知のタンパク質と同時に分離されることを
指令する、二次元電気泳動（Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ． Ｍａｄｉｇａｎ，
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ７６−７７， Ｐｒｅｎｔｉｃ
ｅ Ｈａｌｌ， 第６版（１９９１））などの技術に特有の目的である。さらに、こうし
た方法を用い、これらのポリペプチドおよびその断片化ペプチドは、未知のタンパク質ま
たは断片化ペプチドの等電点および分子量両方の測定を援助することが可能である。
【０１６５】
ポリペプチドおよび断片化ペプチドは、未知のタンパク質および分子量マーカー間の区
別を可能にする２つの異なる方法を用い、視覚化してもよい。１つの態様において、本発
明のポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーは、これらのマーカーに対して生
成された抗体および慣用的なイムノブロッティング技術を用い、視覚化してもよい。本検
出は、未知のタンパク質の検出を生じない慣用的な条件下で行われる。小さなペプチドは
免疫原性エピトープを含まない可能性があるため、本発明のすべてのポリペプチド断片に
対する抗体を生成することは不可能である可能性があることが理解される。さらに、本ア
ッセイにおいて、すべての抗体が働くわけではないであろうことが理解される；が、本発
明のポリペプチドおよび断片に結合することが可能な抗体は、慣用的技術を用い、容易に
決定することが可能である。
【０１６６】
未知のタンパク質もまた、慣用的染色法を用い、視覚化する。本発明のポリペプチドま
たは断片ペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質のモル過剰は、慣用的な染色
法が、主に未知のタンパク質を検出する程度である。これらのポリペプチドまたは断片化
ペプチド分子量マーカーレベルは、慣用的染色法により、これらのマーカーがほとんどま
たはまったく検出されない程度である。本発明のポリペプチド分子量マーカーに対する未
知のタンパク質の好ましいモル過剰は、２および１００，０００倍の間である。より好ま
しくは、これらのポリペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質の好ましいモル
過剰は、１０および１０，０００倍の間であり、そして特に１００および１，０００倍の
間である。
【０１６７】
もちろん、これらのポリペプチド分子量マーカーおよびそのペプチド断片を用いた未知
のタンパク質、ポリペプチド、およびその断片化ペプチドの分子量および等電点の測定お
よび検出に、多くの技術を用いてもよく、そしてこれらの態様はいかなる点でも本発明の
範囲を限定しないことが理解される。
【０１６８】
別の態様において、例えば断片化反応の時間または温度を改変することによる、本発明
のポリペプチドの特定のペプチドへの進行性断片化の解析（Ｄ．Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａｎ
ｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２−１１０６（１９７７））を
、未知のタンパク質の切断の度合いのコントロールとして用いてもよい。例えば、同量の
ポリペプチドおよび未知のタンパク質の、同一の条件下での切断により、断片化の度合い
の直接比較が可能になる。ポリペプチドの完全な断片化を生じる条件はまた、未知のタン
パク質の完全な断片化をも生じる可能性がある。
【０１６９】
分子量マーカーとしての本発明のポリペプチドおよび断片化ペプチドの特定の使用に関
しては、臭化シアンを用いた配列番号２のポリペプチドの断片化は、断片化ペプチド分子
量マーカーの特有の組を生じる。メチオニン残基の分布が各ペプチドのアミノ酸数を決定
し、そして各ペプチドの特有のアミノ酸組成がその分子量を決定する。
【０１７０】
さらに、本発明の好ましい精製ポリペプチド（配列番号２）は、およそ２１，０００ダ
ルトンの観察分子量を有する。
損なわれていないタンパク質を用いる場合、これらのポリペプチド分子量マーカーの使
用は、２１，０００ダルトンに近い見かけの分子量を有するタンパク質の見かけの分子量
の決定の正確さの増加を可能にする。断片を用いる場合、断片の分子量の範囲にわたる分
子量決定の正確さが増加する。
【０１７１】
最後に、本発明に含まれるキットに関しては、こうしたキットの構成要素は、多様であ
る可能性があるが、典型的には、ポリペプチドおよび断片化ペプチド分子量マーカーを含
む。また、こうしたキットは、断片化に必要な部位が除去されているポリペプチドを含ん
でもよい。さらに、キットは、ポリペプチドおよび未知のタンパク質の化学的または酵素
的切断による、特異的切断のための試薬を含んでもよい。キットはさらに、本発明のポリ
ペプチドまたはその断片に対して向けられる抗体を含んでもよい。
【０１７２】
未知のタンパク質の同定
上述のように、ポリペプチドまたはペプチドフィンガープリントを、既知のタンパク質
のデータベースに入力しまたは該データベースと比較し、質量分析を用いた未知のタンパ
ク質の同定を補助してもよい（Ｗ．Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０１１−５０１５（１９９３）；Ｄ． Ｆｅｎ
ｙｏら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９：９９８−１００５（１９９８））。
これらの比較を容易にする多様なコンピューターソフトウェアプログラム、例えばＰｒｏ
ｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（インターネットサイト：ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｓ
ｃｆ．ｅｄｕ）、ＭｕｌｔｉＩｄｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ
．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ
（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ
．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＿ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ Ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、
およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃ
ｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）な
どが、インターネットを介し利用可能である。これらのプログラムは、使用者が切断剤お
よび指示された許容範囲の断片化ペプチドの分子量を特定するのを可能にする。該プログ
ラムは、未知のタンパク質の同定の決定を援助するため、これらの分子量をタンパク質デ
ータベースと比較する。
【０１７３】
さらに、タンデム型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を用い、ポリペプチドまたはペプチド消
化物を配列決定し、そして生じた配列をデータベースに対し検索してもよい（Ｊ．Ｋ．
Ｅｎｇら， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． ５：９７６−９８９（１
９９４）；Ｍ． ＭａｎｎおよびＭ． Ｗｉｌｍ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６：４
３９０−４３９９（１９９４）；Ｊ．Ａ． ＴａｙｌｏｒおよびＲ．Ｓ． Ｊｏｈｎｓｏ
ｎ， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． １１：１０６７−１０７５（１
９９７））。本方法に用いてもよい検索プログラムは、Ｌｕｔｅｆｉｓｋ ９７（インタ
ーネットサイト：ｗｗｗ．ｌｓｂｃ．ｃｏｍ：７０／Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７．ｈｔｍｌ）
、並びに上述のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅａｒｃｈ
およびＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムなど、インターネット上に存在する。したがって、遺
伝子配列並びにその予測されるタンパク質配列およびペプチド断片を配列データベースに
添加することにより、タンデム型質量分析を用いた未知のタンパク質の同定を援助するこ
とが可能である。
【０１７４】
抗体
本発明のポリペプチドに免疫反応性である抗体が本明細書に提供される。こうした抗体
は、（非特異的結合と対照的に）抗体の抗原結合部位を介し、該ポリペプチドに特異的に
結合する。したがって、上述のようなポリペプチド、断片、変異体、融合タンパク質など
を、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用してもよい。より
詳細には、ポリペプチド、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗
原決定基またはエピトープを含む。
【０１７５】
これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもコンホメーション性（ｃｏｎｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。直鎖エピトープは、該ポリペプチド
のアミノ酸の単一の部分から構成されるが、コンホメーション性または断続的エピトープ
は、タンパク質フォールディングに際し接近する、ポリペプチド鎖の異なる領域由来のア
ミノ酸部分から構成される（Ｃ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙ， Ｊｒ．およびＰ． Ｔｒａｖ
ｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：９， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ Ｉｎｃ．， 第２版（１９９６））。フォールディングされたタンパク質は、複
雑な表面を有するため、利用可能なエピトープの数は非常に多い；が、タンパク質のコン
ホメーションおよび立体障害のため、実際にエピトープに結合する抗体の数は、利用可能
なエピトープの数より少ない（Ｃ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙ， Ｊｒ．およびＰ． Ｔｒａ
ｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１４， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， 第２版（１９９６））。エピトープは、当該技術分野に知られ
るいかなる手段により同定してもよい。
【０１７６】
したがって、本発明の１つの側面は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関す
る。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクロー
ナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のポリペプチド由来のエピトープは
、アッセイにおいて、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマ由来の上清な
どの材料から特異的に結合する抗体を精製する研究試薬として用いてもよい。こうしたエ
ピトープまたはその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学的または酵素的切断などの
、当該技術分野に周知の技術を用い、あるいは組換えＤＮＡ技術を用い、産生してもよい
。
【０１７７】
本発明のポリペプチドのエピトープにより引き出される可能性がある抗体に関しては、
エピトープが単離されていてもまたはポリペプチドの一部のままであっても、ポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術により調製することが可能である
。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：
Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ．
Ｋｅｎｎｅｔら（監修）， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８０）；
およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒ
ｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を
参照されたい。
【０１７８】
本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株
もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術により産生しそ
して同定してもよい。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動
物をポリペプチドで免疫感作し；免疫感作された動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細
胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し；そして該ポリペ
プチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを
含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術により回収してもよい。
【０１７９】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体の
ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既知の技術により調
製し、そして抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少という利点を提供してもよい
。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変部（またはその
抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定常部を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、
ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変部断片（抗原結合部
位を欠く）を含んでもよい。キメラおよび工学技術で作成されるさらなるモノクローナル
抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）
）、 Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ ８４：３４３９（１９８７））、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４（１９８９））、およびＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒ
ｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９（Ｍａｙ １９９３））に記載されるものが含まれる。
導入遺伝子的に抗体を生成する方法は、ＧＢ ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６
９，８２５号および５，５４５，８０６号並びにそれらから優先権を請求する関連特許に
見出すことが可能であり、該特許はすべて本明細書に援用される。
【０１８０】
慣用的技術により産生されてもよい、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。
こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が
含まれる。遺伝子工学技術により産生される抗体断片および誘導体もまた提供される。
【０１８１】
１つの態様において、抗体は本発明のポリペプチドに特異的であり、そして他のタンパ
ク質と交差反応しない。こうした抗体を同定することが可能なスクリーニング法が周知で
あり、そして例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーを伴ってもよい。
【０１８２】
抗体の使用
本発明の抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、本発明のポリペプチドま
たは断片の存在を検出するアッセイにおいて用いてもよい。抗体はまた、免疫アフィニテ
ィークロマトグラフィーにより本発明のポリペプチドまたは断片を精製するのに使用して
もよい。
【０１８３】
さらに本発明のポリペプチドのＴＳＬＰ受容体への結合を遮断することが可能な、これ
らの抗体を用い、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害してもよい。こうした遮断
抗体は、ＴＳＬＰ受容体を発現している特定の細胞へのＴＳＬＰの結合を阻害する能力に
関し、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用い、同定してもよ
い。こうした細胞の例は、ＢおよびＴリンパ球細胞株、それぞれ７０Ｚ／３および７Ｂ９
である。あるいは、遮断抗体は、ＴＳＬＰの標的細胞上のＴＳＬＰ受容体への結合から生
じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて同定してもよい。抗体は、例
えば、ＴＳＬＰ受容体発現細胞の、ＴＳＬＰ仲介溶解を阻害する能力に関しアッセイして
もよい。
【０１８４】
こうした抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法で使用し、またはｉｎ ｖｉｖｏで投与し、抗体
を生成した実体により仲介される生物学的活性を阻害してもよい。このように、ＴＳＬＰ
と細胞表面ＴＳＬＰ受容体との相互作用により、（直接または間接的に）引き起こされる
または悪化される障害を治療してもよい。療法は、ＴＳＬＰ仲介生物学的活性を阻害する
のに有効な量の遮断抗体を、哺乳動物にｉｎ ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、
こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結
合抗体断片が使用される。
【０１８５】
抗体は、アゴニスト性（すなわちリガンド模倣性）特性に関しスクリーニングしてもよ
い。こうした抗体は、細胞表面ＴＳＬＰ受容体への結合に際し、ＴＳＬＰが細胞表面ＴＳ
ＬＰ受容体に結合する際に誘導される生物学的影響と同様の生物学的影響（例えば生物学
的シグナルの伝達）を誘導する。アゴニスト性抗体を用い、Ｂ細胞系譜またはＴ細胞系譜
細胞増殖を誘導してもよい。
【０１８６】
ヒトＴＳＬＰに対して向けられる抗体、および生理学的に許容しうる希釈剤、賦形剤、
またはキャリアーを含む組成物が、本明細書に提供される。こうした組成物の適切な構成
要素は、ヒトＴＳＬＰタンパク質を含む組成物に関し、上述された通りである。
【０１８７】
やはり本明細書に提供されるのは、抗体に結合している検出可能（例えば診断用剤）ま
たは療法剤を含む結合体である。こうした剤の例は、上に示される。該結合体は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法に使用を見出す。
【０１８８】
以下の実施例は、本発明の特定の態様をさらに例示するため提供され、そして本発明の
範囲を限定すると解釈してはならない。
【実施例】
【０１８９】
実施例１：核酸の単離
ヒトＴＳＬＰ核酸配列は、ＥＳＴ ＩＭＡＧＥクローン１４０７２６０、寄託番号ＡＡ
８８９５８１を配列決定することにより、得た。ネズミＴＳＬＰ配列との比較により、本
配列は、ＥＳＴクローンが部分的クローンであることを示唆した。内部プライマーを用い
、いくつかのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ＴＳＬＰ ｃＤＮＡクローンの
失われている３’端を得るために用いることが可能なｃＤＮＡの供給源を決定した。ヒト
ＴＳＬＰ配列の２つの内部プライマーを用いた６０サイクルのＰＣＲの後、以下のｃＤＮ
ＡライブラリーがＴＳＬＰ配列に関し陽性であった：ヒト精巣、ヒト包皮線維芽細胞、お
よび胎児脳（弱陽性）；一方、全ＭｏＴ、ＨＳ４３１、骨髄、ＨＰＴ４、ＨＢＴ３、Ｗ１
２６、Ｈｕｔ１０２、ＰＢＴ、Ｓｋ Ｈｅｐ、ヒト真皮線維芽細胞、Ｒａｊｉ、ヒト胎盤
、およびＫＢライブラリーはすべて陰性であった。
【０１９０】
内部ＴＳＬＰプライマーおよびλｇｔ１０ベクタープライマーを用いた、ヒト精巣λｇ
ｔ１０ライブラリーに対するＰＣＲを用い、内部ヒトＴＳＬＰ配列と同一の配列を持つ２
つのクローン（１９Ｅおよび１９Ｆ）を単離した。両クローンは同一の５’端を有したが
、異なる長さの３’端を有した。クローン１９Ｅのコード配列及び非コード配列は、クロ
ーン１９Ｆと同一であり；これらのクローンは、３’非コード領域の長さが異なり、クロ
ーン１９Ｆは１９Ｅより、約３４ ｂｐ長かった。したがって、１９Ｆ由来の配列を用い
、ヒトＴＳＬＰタンパク質の３’コード領域配列を完成させた。これにより、ＥＳＴに存
在しないＣ−末端１５アミノ酸の同定が可能になった。ＰＣＲは慣用法にしたがい、行っ
た。
【０１９１】
実施例２：ＴＳＬＰポリペプチドの精製
ＴＳＬＰ特異的ＥＬＩＳＡ：
ＴＳＬＰ含有試料の連続希釈（ＮａＯＨでｐＨ ９にした５０ ｍＭ ＮａＨＣＯ３中
）で、Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉｔｅｒｔｅｋ ９６ウェル平底Ｅ．Ｉ．Ａ．マイクロタイトレ
ーションプレート（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、オハイオ州オーロラ）
を、１００：１／ウェルで被覆する。４℃で１６時間インキュベーションした後、２００
：１の０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）でウェルを６
回洗浄する。その後、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、１μｇ
／ｍｌのＦＬＡＧ（登録商標）−ＴＳＬＰ受容体と、ウェルを９０分間インキュベーショ
ンし（ウェル当たり１００：１）、その後、上述のように洗浄する。次に、各ウェルを、
抗ＦＬＡＧ（登録商標）（５％ ＦＣＳを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、１μｇ／ｍｌのモ
ノクローナル抗体Ｍ２）と、ウェルを９０分間インキュベーションし（ウェル当たり１０
０：１）、その後、上述のように洗浄する。続いて、ポリクローナルヤギ抗ｍＩｇＧ１特
異的西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体（５％ ＦＣＳを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、
商業的ストックの１：５０００希釈）と、ウェルを９０分間インキュベーションする（ウ
ェル当たり１００：１）。ＨＲＰ結合抗体は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．、アラバマ州バーミンガムから得る。その後
、ウェルを上述のように６回洗浄する。
【０１９２】
ＥＬＩＳＡの発色（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）のため、基質混合物［ＴＭＢペルオキシ
ダーゼ基質およびペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）の１：１プレミックスのウェル
当たり１００：１］をウェルに添加する。十分な呈色反応後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加（
ウェル当たり５０：１）により、酵素反応を終結させる。呈色強度（ＴＳＬＰ−ＴＳＬＰ
受容体結合を示す）は、Ｖ Ｍａｘプレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖ
ｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）上で、４５０ｎｍの消光を測定することによ
り、決定する。
【０１９３】
実施例３：アミノ酸配列
ヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列は、完全ヒトＴＳＬＰヌクレオチド配列の翻訳により、決
定した。選択された読み枠は、ヒトＴＳＬＰとネズミＴＳＬＰの相同性に基づいた。
【０１９４】
実施例４：ＤＮＡおよびアミノ酸配列
ヒトＴＳＬＰ核酸配列は、ＥＳＴ ＩＭＡＧＥクローン１４０７２６０、寄託番号ＡＡ
８８９５８１、およびクローン１９Ｆ由来のさらなる３’配列の合成配列の標準的二本鎖
配列決定により、決定した。
【０１９５】
単離ヒトＴＳＬＰ ＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ酸
配列は、配列番号１および２に示される。ＰＣＲにより単離された全ヒトＴＳＬＰ ＤＮ
Ａ断片の配列は、配列番号１のヌクレオチド１ないし７６７に相当し、該配列は配列番号
２のアミノ酸１ないし１５９をコードする。
【０１９６】
配列番号２のアミノ酸配列は、ネズミＴＳＬＰに有意な類似性（４９％）および同一性
（４３％）を持ち、そしてＩＬ−７に弱い相同性を持つ。
【０１９７】
実施例５：ＴＳＬＰに結合するモノクローナル抗体
本実施例は、ＴＳＬＰに結合するモノクローナル抗体を調製するための方法を例示する
。こうした抗体を生成するのに使用してもよい適切な免疫原には、限定されるわけではな
いが、精製ヒトＴＳＬＰポリペプチドまたはその免疫原性断片、例えば細胞外ドメイン、
またはヒトＴＳＬＰを含む融合タンパク質（例えば可溶性ＴＳＬＰ／Ｆｃ融合タンパク質
）が含まれる。
【０１９８】
精製ヒトＴＳＬＰを用い、慣用的な技術、例えば、米国特許第４，４１１，９９３号に
記載される技術を用い、ＴＳＬＰに免疫反応性であるモノクローナル抗体を生成してもよ
い。簡潔には、ヒトＴＳＬＰ免疫原を完全フロイントアジュバント中に乳化し、そして１
０−１００μｇの範囲の量を皮下または腹腔内注射して、マウスを免疫する。１０ないし
１２日後、不完全フロイントアジュバント中に乳化したさらなるヒトＴＳＬＰで、免疫動
物に追加免疫する。その後、毎週ないし隔週の免疫スケジュールで、マウスに定期的に追
加免疫する。後眼窩出血または尾先端切除により、血清試料を定期的に採取し、ドットブ
ロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）またはＴＳＬＰ受容体結合の
阻害により、ＴＳＬＰ抗体に関し試験する。
【０１９９】
適切な抗体力価の検出後、陽性動物に最後に一度、生理食塩水中のヒトＴＳＬＰを静脈
内注射する。３から４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞をネズミ
骨髄腫細胞株、例えばＮＳ１または好ましくはｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ １５８０）に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、これを非融
合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するため、ＨＡ
Ｔ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）選択培地中、多重マイクロタイ
タープレート中に蒔く。
【０２００】
ハイブリドーマ細胞をＥｎｇｖａｌｌら， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ． ８：８７１（１
９７１）および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術を適合させることによ
り、精製ＴＳＬＰに対する反応性に関し、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。好まし
いスクリーニング技術はＢｅｃｋｍａｎｎら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４：４２１
２（１９９０））に記載される抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を、同系Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射し、高濃度の抗ＴＳＬＰモノクローナル抗体を含む腹水を
産生してもよい。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、多様な技術によりフラスコまたは回
転ビン（ｒｏｌｌｅｒ ｂｏｔｔｌｅ）中でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させてもよい。マウ
ス腹水中に産生されたモノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈澱に続くゲル排除クロ
マトグラフィーにより精製してもよい。あるいは、抗体がプロテインＡまたはプロテイン
Ｇに結合することに基づくアフィニティークロマトグラフィーもまた用いてもよく、ＴＳ
ＬＰに結合することに基づくアフィニティークロマトグラフィーも用いてもよい。
【０２０１】
実施例６：ノーザンブロット解析
ヒトＴＳＬＰ ｍＲＮＡの組織分布を、以下のように、ノーザンブロット解析により調
べた。放射標識プローブのアリコットを、２つの異なるヒト多数組織ノーザンブロット（
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト；Ｂｉｏｃｈａｉｎ、カリフォルニア州
パロアルト）に添加した。ブロットを、１０ Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ、５０ ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ ｐＨ ７．５、９００ ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ピロリン酸Ｎａ、１％ Ｓ
ＤＳ、２００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ中でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーシ
ョンは、先に記載されるように（Ｍａｒｃｈら， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６４１−６４
７（１９８５））、５０％ホルムアミドで、６３℃で一晩行った。その後、ブロットを、
２ ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで、６８℃で３０分間、洗浄した。
【０２０２】
１．４キロ塩基（ｋｂ）の単一の転写物が、心臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾
臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸に存在した。陰性組織は、脳、胎盤、および
末梢血白血球であった。ＴＳＬＰ ｍＲＮＡが最も高いレベルの細胞および組織は、β−
アクチン特異的プローブで探査した（ｐｒｏｂｅ）コントロールとの比較により示される
ように、心臓、肝臓、前立腺、および精巣である。
【０２０３】
実施例７：結合アッセイ
全長ヒトＴＳＬＰを発現させ、そしてＴＳＬＰ受容体に結合する能力に関し、試験して
もよい。結合アッセイは、以下のように行うことが可能である。
【０２０４】
本アッセイでは、可溶性ヒトＴＳＬＰポリペプチドのＮ−末端に融合しているロイシン
ジッパーペプチドを含む融合タンパク質（ＬＺ−ＴＳＬＰ）を使用する。ＦＬＡＧ（登録
商標）ペプチドをコードするＤＮＡを、三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーをコ
ードする配列と置き換えた以外は、本質的に、本明細書に援用されるＷｉｌｅｙら（Ｉｍ
ｍｕｎｉｔｙ， ３：６７３−６８２（１９９５））において、ＦＬＡＧ（登録商標）（
ＴＳＬＰ）発現構築物を調製するために記載されるように、発現構築物を調製する。発現
ベクターｐＤＣ４０９中の該構築物は、ヒト・サイトメガロウイルス由来のリーダー配列
に続き、可溶性ヒトＴＳＬＰポリペプチドのＮ−末端に融合しているロイシンジッパー部
分をコードする。ＬＺ−ＴＳＬＰをＣＨＯ細胞中で発現させ、そして培養上清から精製す
る。
【０２０５】
ｐＤＣ４０９と称される発現ベクターは、本明細書に援用される、ＭｃＭａｈａｎら，
ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１−２８３２（１９９１）に記載されるｐＤＣ４０６ベ
クター由来の哺乳動物発現ベクターである。（ｐＤＣ４０６と比較し）ｐＤＣ４０９に付
加された特徴には、マルチクローニングサイト（ｍｃｓ）中のさらなる特有の制限部位；
ｍｃｓの下流に位置する３つの停止コドン（各読み枠に１つ）；およびｍｃｓに挿入され
たＤＮＡの配列決定を容易にする、ｍｃｓの下流のＴ７ポリメラーゼプロモーターが含ま
れる。
【０２０６】
全長ヒトＴＳＬＰタンパク質の発現のため、全コード領域（すなわち配列番号１に示さ
れるＤＮＡ配列）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。ＰＣＲに使用す
るテンプレートは、実施例１に記載されるような、ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーから単
離したｃＤＮＡクローンである。単離されそして増幅されたＤＮＡを発現ベクターｐＤＣ
４０９に挿入し、ｐＤＣ４０９−ＴＳＬＰと称される構築物を得る。
【０２０７】
ＬＺ−ＴＳＬＰポリペプチドを使用し、上に論じられるように、組換えまたは内因性Ｔ
ＳＬＰ受容体を発現している宿主細胞に結合する能力を試験する。ＴＳＬＰ受容体を発現
している細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタ
ミンを補ったＤＭＥＭ中で培養する。細胞をＬＺ−ＴＳＬＰ（５ ｍｇ／ｍｌ）と、約１
時間インキュベーションする。インキュベーション後、細胞を洗浄し、非結合ＬＺ−ＴＳ
ＬＰを除去し、そしてビオチン化抗ＬＺモノクローナル抗体（５ ｍｇ／ｍｌ）、および
フィコエリトリン結合ストレプトアビジン（１：４００）とインキュベーションした後、
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）により解析する。細胞数測定解析は、ＦＡＣｓｃａｎ（
Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）上で行った。
【０２０８】
ＴＳＬＰ受容体を発現している細胞は、ＴＳＬＰ受容体を発現していないコントロール
細胞と比較し、有意に亢進したＬＺ−ＴＳＬＰ結合を示した。
【０２０９】
実施例８：ＴＳＬＰおよびＩＬ−７による骨髄からのＴ細胞増殖の誘導
ヒトＴＳＬＰは、ＩＬ−７と組み合わせると、ヒト骨髄からＴ細胞の増殖を誘導する。
【０２１０】
ヒト骨髄由来単核細胞（ＢＭ ＭＮＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ上の全骨髄の遠心分離により
単離した。ＢＭ ＭＮＣを、１０％ウシ胎児血清、並びにアミノ酸およびビタミン補足剤
を補ったＭｃＣｏｙの培地中で、４．５−１０ ｘ １０５細胞／ｍｌの間の濃度範囲で
、フラスコ（Ｔ２５）当たり総体積６または７ ｍｌ中で培養した。ヒトＴＳＬＰ（２０
ｎｇ／ｍｌ）および他のサイトカイン、すなわちＩＬ−７、ＳＬＦ（すなわちスチール
因子または幹細胞因子、またはマスト細胞増殖因子）、またはｆｌｔ３Ｌを、単独でまた
は組み合わせて、第０日に培養に添加した。１４日後およびそれから毎週、培養の半分を
除き、計数した。培養に新鮮な培地およびサイトカインを添加し、総体積６または７ ｍ
ｌに戻した。
【０２１１】
採取細胞はまた、培養１４日後およびそれから毎週、細胞表面抗原に特異的な抗体を用
い、フローサイトメトリーを介し、解析した。用いた抗体は、Ｔ細胞抗原（すなわちαβ
Ｔ細胞受容体、δγ Ｔ細胞受容体、およびＣＤ３）、Ｂ細胞抗原（すなわちＣＤ１９
および表面ＩｇＭ）、ナチュラルキラー細胞抗原（すなわちＣＤ５６）、単球抗原（すな
わちＣＤ１４）、および顆粒球抗原（すなわちＣＤ１５）に特異的であった。
【０２１２】
ＢＭ ＭＮＣ培養へのヒトＴＳＬＰおよびＩＬ−７の添加は、表１に示されるように、
細胞増殖を誘導した。第０日には、ＢＭ ＭＮＣのおよそ５％がＴ細胞であった。ＴＳＬ
ＰおよびＩＬ−７を用いた培養の２週間後には、培養は７０％ ＣＤ３＋ Ｔ細胞からな
った。第２１日には、細胞の８６％がＣＤ３＋ Ｔ細胞であった。培養は、第４２日の実
験終了まで、主にＴ細胞であった。
【０２１３】
【表１】
【０２１４】
別の実験組では、細胞生存および拡大に影響を与える能力に関し、Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（
登録商標）でタグをつけた、３つの別個のバッチのヒトＴＳＬＰ（ＴＳＬＰ ７４８９、
ＴＳＬＰ ７８１１、またはＴＳＬＰ ７８１２）を単独でまたはＩＬ−７と組み合わせ
て試験した。ＢＭ ＭＮＣ培養は、２つの別個の新鮮な骨髄試料から得て、そして５ ｘ
１０５細胞／ｍｌ（群１）または１０ ｘ １０５細胞／ｍｌ（群２）いずれかの濃度
で植え付けた。Ｈｉｓ／ＦＬＡＧ（登録商標）タグＴＳＬＰ（２０ ｍｇ／ｍｌ）および
ＩＬ−７を上述のように培養に添加した。ＩＬ−７と組み合わせたＴＳＬＰは、表２（骨
髄試料１）および表３（骨髄試料２）に示されるように、ＢＭ ＭＮＣ培養の拡大を生じ
た。第２１日までに、拡大細胞集団の８０％は、ＣＤ４＋ αβ＋またはＣＤ８＋ αβ
＋ Ｔ細胞からなった。ＩＬ−７およびＴＳＬＰで処理した培養のうち４つでは、細胞は
、４−５週の実験終了まで、培養が主にＴ細胞を含むように拡大した。
【０２１５】
【表２】
【０２１６】
【表３】
【０２１７】
本明細書は、本明細書に援用される、本明細書中に引用される参考文献の解説を考慮に
入れると、最も完全に理解される。本明細書中の態様は、本発明の態様の例示を提供し、
そして本発明の範囲を限定するとみなしてはならない。当業者は、多くの他の態様が本発
明に含まれることを容易に認識する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１のＤＮＡ配列；
（ｂ）配列番号２の配列を含むアミノ酸配列をコードする単離核酸分子；
（ｃ）６０℃、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件を伴う、５０％ホルムアミ
ドおよび６ＸＳＳＣ、４２℃の、中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）または（
ｂ）の核酸配列を含む、変性二本鎖ＤＮＡのどちらかの鎖にハイブリダイズする単離核酸
分子；
（ｄ）配列番号１からｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により得られる単離核酸分子；
（ｅ）配列番号１から遺伝暗号の結果、縮重している単離核酸分子；および
（ｆ）ヒトＴＳＬＰ ＤＮＡ、ヒトＴＳＬＰ ＤＮＡの対立遺伝子変異体、およびＴＳＬ
Ｐ ＤＮＡの種相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）からなる群より選択される単離核酸分子
からなる群より選択される、単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号１のＤＮＡ配列を含む、請求項１の核酸分子。
【請求項３】
請求項１の核酸分子の発現を指示する組換えベクター。
【請求項４】
請求項１の核酸分子にコードされる単離ポリペプチド。
【請求項５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるように、およそ２１，０００ダルトンの分子量を有す
る、請求項４記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
非糖鎖付加型の請求項４記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
請求項４のポリペプチドに結合する単離抗体。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項７記載の抗体。
【請求項９】
ａ）配列番号２のＴＳＬＰポリペプチド；および
ｂ）（ａ）のポリペプチドの断片であって、ＴＳＬＰ受容体に結合することが可能な前記
断片
からなる群より選択される、精製ＴＳＬＰポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２に示されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む
、単離ＴＳＬＰポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項９のＴＳＬＰポリペプチド。
【請求項１２】
請求項４のポリペプチド、および生理学的に許容しうる希釈剤、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅ
ｎｔ）、またはキャリアーを含む、組成物。
【請求項１３】
請求項３のベクターでトランスフェクションまたは形質導入されている、宿主細胞。
【請求項１４】
ＴＳＬＰポリペプチドを産生するための方法であって、請求項１３の宿主細胞を、発現を
促進する条件下で培養し、そして培地から該ポリペプチドを回収することを含む、前記方
法。
【請求項１５】
宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群より選択される
、請求項１４の方法。
【請求項１６】
リンパ球増殖を刺激する方法であって、請求項４記載のポリペプチドとリンパ球をインキ
ュベーションすることを含む、前記方法。
【請求項１７】
ＩＬ−７とリンパ球をインキュベーションすることをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
スチール（Ｓｔｅｅｌ）因子、幹細胞因子、マスト細胞増殖因子またはｆｌｔ３リガンド
からなる群より選択されるサイトカインとリンパ球をインキュベーションすることをさら
に含む、請求項１６の方法。
【請求項１９】
リンパ球発生またはリンパ球新生（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｓｉｓ）を刺激する方法であっ
て、請求項４記載のポリペプチドと前駆細胞をインキュベーションすることを含む、前記
方法。
【請求項２０】
前駆細胞が骨髄由来単核細胞である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
ＩＬ−７と骨髄由来単核細胞をインキュベーションすることをさらに含む、請求項２０の
方法。
【請求項２２】
請求項４記載のポリペプチドおよびＩＬ−７とリンパ球をインキュベーションすることを
含む、リンパ球増殖を刺激する方法。
【請求項２３】
リンパ球発生またはリンパ球新生を刺激する方法であって、請求項４記載のポリペプチド
およびＩＬ−７と前駆細胞をインキュベーションすることを含む、前記方法。
【請求項１】
（ａ）配列番号１のＤＮＡ配列；
（ｂ）配列番号２の配列を含むアミノ酸配列をコードする単離核酸分子；
（ｃ）６０℃、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件を伴う、５０％ホルムアミ
ドおよび６ＸＳＳＣ、４２℃の、中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）または（
ｂ）の核酸配列を含む、変性二本鎖ＤＮＡのどちらかの鎖にハイブリダイズする単離核酸
分子；
（ｄ）配列番号１からｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により得られる単離核酸分子；
（ｅ）配列番号１から遺伝暗号の結果、縮重している単離核酸分子；および
（ｆ）ヒトＴＳＬＰ ＤＮＡ、ヒトＴＳＬＰ ＤＮＡの対立遺伝子変異体、およびＴＳＬ
Ｐ ＤＮＡの種相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）からなる群より選択される単離核酸分子
からなる群より選択される、単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号１のＤＮＡ配列を含む、請求項１の核酸分子。
【請求項３】
請求項１の核酸分子の発現を指示する組換えベクター。
【請求項４】
請求項１の核酸分子にコードされる単離ポリペプチド。
【請求項５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるように、およそ２１，０００ダルトンの分子量を有す
る、請求項４記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
非糖鎖付加型の請求項４記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
請求項４のポリペプチドに結合する単離抗体。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項７記載の抗体。
【請求項９】
ａ）配列番号２のＴＳＬＰポリペプチド；および
ｂ）（ａ）のポリペプチドの断片であって、ＴＳＬＰ受容体に結合することが可能な前記
断片
からなる群より選択される、精製ＴＳＬＰポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２に示されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む
、単離ＴＳＬＰポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項９のＴＳＬＰポリペプチド。
【請求項１２】
請求項４のポリペプチド、および生理学的に許容しうる希釈剤、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅ
ｎｔ）、またはキャリアーを含む、組成物。
【請求項１３】
請求項３のベクターでトランスフェクションまたは形質導入されている、宿主細胞。
【請求項１４】
ＴＳＬＰポリペプチドを産生するための方法であって、請求項１３の宿主細胞を、発現を
促進する条件下で培養し、そして培地から該ポリペプチドを回収することを含む、前記方
法。
【請求項１５】
宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群より選択される
、請求項１４の方法。
【請求項１６】
リンパ球増殖を刺激する方法であって、請求項４記載のポリペプチドとリンパ球をインキ
ュベーションすることを含む、前記方法。
【請求項１７】
ＩＬ−７とリンパ球をインキュベーションすることをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
スチール（Ｓｔｅｅｌ）因子、幹細胞因子、マスト細胞増殖因子またはｆｌｔ３リガンド
からなる群より選択されるサイトカインとリンパ球をインキュベーションすることをさら
に含む、請求項１６の方法。
【請求項１９】
リンパ球発生またはリンパ球新生（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｓｉｓ）を刺激する方法であっ
て、請求項４記載のポリペプチドと前駆細胞をインキュベーションすることを含む、前記
方法。
【請求項２０】
前駆細胞が骨髄由来単核細胞である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
ＩＬ−７と骨髄由来単核細胞をインキュベーションすることをさらに含む、請求項２０の
方法。
【請求項２２】
請求項４記載のポリペプチドおよびＩＬ−７とリンパ球をインキュベーションすることを
含む、リンパ球増殖を刺激する方法。
【請求項２３】
リンパ球発生またはリンパ球新生を刺激する方法であって、請求項４記載のポリペプチド
およびＩＬ−７と前駆細胞をインキュベーションすることを含む、前記方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１３−７８３３１（Ｐ２０１３−７８３３１Ａ）
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２７１９８３（Ｐ２０１２−２７１９８３）
【出願日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【分割の表示】特願２００９−２７８６１１（Ｐ２００９−２７８６１１）の分割
【原出願日】平成１１年１１月１２日（１９９９．１１．１２）
【出願人】（５９１１２３６０９）イミュネックス・コーポレーション (24)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＥＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【分割の表示】特願２００９−２７８６１１（Ｐ２００９−２７８６１１）の分割
【原出願日】平成１１年１１月１２日（１９９９．１１．１２）
【出願人】（５９１１２３６０９）イミュネックス・コーポレーション (24)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＥＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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