ヒドロキシ脂肪酸化合物並びに疾患治療及び診断のためのその使用

式(I)の化合物:[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]。そのような化合物は、対象において、炎症、炎症性障害及びがんを検出するために有用であり、これらの状態の治療及び/又は予防を包含する治療的用途においても使用され得る。したがって、医薬組成物、組合せ及び補給剤、並びに記載した化合物を使用する治療方法についても記載されている。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、疾患及び生理学的状態の検出及び治療において有用な化合物に関する。より具体的には、本発明は、ヒドロキシ脂肪酸化合物、それを含む組成物、並びに、結腸直腸がん、炎症及び炎症性疾患を治療及び検出するためにこれらの化合物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
結腸直腸がん(CRC,colorectal cancer)の死亡率は、すべてのがんの中で、依然として肺がんに次いで2番目に高い(Canadian Cancer Statistics, 2008)。早期検出という公知の利益にもかかわらず、結腸鏡検査法及び糞便潜血検査に基づくスクリーニングプログラムは、パブリックアクセプタンス、コスト、限りある資源、正確さ及び標準化等の課題に悩まされてきた。当分野においては、CRCスクリーニングのための結腸鏡検査法単独での使用は実際的ではなく(Roy HK, Backman V, Goldberg MJ. Colon cancer screening: the good, the bad, and the ugly. Arch Intern Med 2006; 166:2177-9)、CRC発症のリスクが高い対象を正確に特定することができる低侵襲性の血清ベース試験は、現在のアプローチよりも高いスクリーニングコンプライアンス及び既存の内視鏡検査手段のより良好な利用をもたらし得る(Roy HK, Backman V, Goldberg MJ. Colon cancer screening: the good, the bad, and the ugly. Arch Intern Med 2006; 166:2177-9、Ouyang DL, Chen JJ, Getzenberg RH, Schoen RE. Noninvasive testing for colorectal cancer: a review. Am J Gastroenterol 2005; 100:1393-403、Davies RJ, Miller R, Coleman N. Colorectal cancer screening: prospects for molecular stool analysis. Nat Rev Cancer 2005; 5:199-209)という合意がある。CRC患者由来の生物試料に関連して、転写レベルの改変(Kleivi K, Lind GE, Diep CB, Meling GI, Brandal LT, Nesland JM, Myklebost O, Rognum TO, Giercksky KE, Skotheim RI, Lothe RA. Gene expression profiles of primary colorectal carcinomas, liver metastases, and carcinomatoses. Mol Cancer 2007; 6:2、Solmi R, Ugolini G, Rosati G, Zanotti S, Lauriola M, Montroni I, del Governatore M, Caira A, Taffurelli M, Santini D, Coppola D, Guidotti L, Carinci P, Strippoli P. Microarray-based identification and RT-PCR test screening for epithelial specific mRNAs in peripheral blood of patients with colon cancer. BMC Cancer 2006; 6:250、Komori T, Takemasa I, Higuchi H, Yamasaki M, Ikeda M, Yamamoto H, Ohue M, Nakamori S, Sekimoto M, Matsubara K, Monden M. Identification of differentially expressed genes involved in colorectal carcinogenesis using a cDNA microarray. J Exp Clin Cancer Res 2004; 23:521-7、Hegde P, Qi R, Gaspard R, Abernathy K, Dharap S, Earle-Hughes J, Gay C, Nwokekeh NU, Chen T, Saeed AI, Sharov V, Lee NH, Yeatman TJ, Quackenbush J. Identification of tumor markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray. Cancer Res 2001; 61:7792-7、Kitahara O, Furukawa Y, Tanaka T, Kihara C, Ono K, Yanagawa R, Nita ME, Takagi T, Nakamura Y, Tsunoda T. Alterations of gene expression during colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays after laser-capture microdissection of tumor tissues and normal epithelia. Cancer Res 2001; 61:3544-9、Notterman DA, Alon U, Sierk AJ, Levine AJ. Transcriptional gene expression profiles of colorectal adenoma, adenocarcinoma, and normal tissue examined by oligonucleotide arrays. Cancer Res 2001; 61:3124-30、Takemasa I, Higuchi H, Yamamoto H, Sekimoto M, Tomita N, Nakamori S, Matoba R, Monden M, Matsubara K. Construction of preferential cDNA microarray specialized for human colorectal carcinoma: molecular sketch of colorectal cancer. Biochem Biophys Res Commun 2001; 285:1244-9、Backert S, Gelos M, Kobalz U, Hanski ML, Bohm C, Mann B, Lovin N, Gratchev A, Mansmann U, Moyer MP, Riecken EO, Hanski C. Differential gene expression in colon carcinoma cells and tissues detected with a cDNA array. Int J Cancer 1999; 82:868-74)、異常にメチル化された遺伝子産物(Mori Y, Cai K, Cheng Y, Wang S, Paun B, Hamilton JP, Jin Z, Sato F, Berki AT, Kan T, Ito T, Mantzur C, Abraham JM, Meltzer SJ. A genome-wide search identifies epigenetic silencing of somatostatin, tachykinin-1, and 5 other genes in colon cancer. Gastroenterology 2006; 131:797-808、Chen WD, Han ZJ, Skoletsky J, Olson J, Sah J, Myeroff L, Platzer P, Lu S, Dawson D, Willis J, Pretlow TP, Lutterbaugh J, Kasturi L, Willson JK, Rao JS, Shuber A, Markowitz SD.Detection in fecal DNA of colon cancer-specific methylation of the nonexpressed vimentin gene. J Natl Cancer Inst 2005; 97:1124-32、Leung WK, To KF, Man EP, Chan MW, Bai AH, Hui AJ, Chan FK, Sung JJ. Quantitativedetection of promoter hypermethylation in multiple genes in the serum of patients with colorectal cancer. Am J Gastroenterol 2005; 100:2274-9)及びプロテオームパターン(Ward DG, Suggett N, Cheng Y, Wei W, Johnson H, Billingham LJ, Ismail T, Wakelam MJ, Johnson PJ, Martin A. Identification of serum biomarkers for colon cancer by proteomic analysis. Br J Cancer 2006; 94:1898-905、Lou J, Fatima N, Xiao Z, Stauffer S, Smythers G, Greenwald P, Ali IU. Proteomic profiling identifies cyclooxygenase-2-independent global proteomic changes by celecoxib in colorectal cancer cells. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15:1598-606、Mazzanti R, Solazzo M, Fantappie O, Elfering S, Pantaleo P, Bechi P, Cianchi F, Ettl A, Giulivi C. Differential expression proteomics of human colon cancer. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006; 290:G1329-38、Roblick UJ, Hirschberg D, Habermann JK, Palmberg C, Becker S, Kruger S, Gustafsson M, Bruch HP, Franzen B, Ried T, Bergmann T, Auer G, Jornvall H. Sequential proteome alterations during genesis and progression of colon cancer. Cell Mol Life Sci 2004; 61:1246-55)がいくつも報告されているが、臨床的に有用な試験まで進んだのは、あるとしてもごくわずかである。これは、アッセイ設計における技術的な困難、再現性のある結果を得る課題、コスト及び長時間の調節過程を包含する複数の理由に起因し得る。さらに、現在使用されている又は開発中の試験のほとんどは、腫瘍特異的マーカーの検出に基づいており、極めて初期段階である又はリスクが高まりやすいが疾患の臨床提示を示していない対象を特定するための感度に乏しい。
【0003】
CRCの原因となる遺伝子変化はよく特徴付けられているが、大腸腺腫性ポリポーシス(APC,adenomatous polyposis coli)及び遺伝性の非ポリポーシス結腸直腸がん(HNPCC,hereditary nonpolyposis colorectal cancer)に起因する症例数は全体の5%未満であり、およそ15%が、未だ解明されていない浸透度の低い突然変異の複合パターンに起因すると思われる遺伝性家族性リスクを原因とするものであると言われている(de la Chapelle A. Genetic predisposition to colorectal cancer. Nat Rev Cancer 2004; 4:769-80)。CRC症例のおよそ80%が、食習慣及び生活様式を主なリスク要因として散発的に生じると考えられていることもまた事実である(Marshall JR. Prevention of colorectal cancer: diet, chemoprevention, and lifestyle. Gastroenterol Clin North Am 2008; 37:73-82, vi、Fearnhead NS, Wilding JL, Bodmer WF. Genetics of colorectal cancer: hereditary aspects and overview of colorectal tumorigenesis. Br Med Bull 2002; 64:27-43)。加えて、個体のミクロビオームはその胃腸の生理学的状況と複雑に関係しており、それ自体がリスク要因として関与し得る(McGarr SE, Ridlon JM, Hylemon PB. Diet, anaerobic bacterial metabolism, and colon cancer: a review of the literature. J Clin Gastroenterol 2005;39:98-109)。代謝が食習慣及び生活様式の両方によって大きく影響されること、並びにミクロビオームが自らの代謝過程に寄与することを考慮すれば、CRCのリスク指標としての代謝マーカーを同定することを目標とした努力がほとんど為されてこなかったことは驚くべきことである。これは、部分的に、DNAマイクロアレイ又は表面増強レーザー脱離/イオン化(SELDI,surface-enhanced laser desorption/ionization)が転写物又はタンパク質をそれぞれ特徴付けることができるのと同様の手法で、代謝産物を包括的に特徴付けることができるプラットフォーム技術及び情報学的アプローチの欠如に起因していたかもしれない。
【0004】
したがって、CRCを検出するための正確な方法、特に、該疾患の初期段階を検出するための方法が依然として必要である。
【0005】
代謝産物分析のための質量分析ベースのシステム
近年、試料内の多数の代謝成分を並列方式で同定することができる質量分析ベースのシステムが進歩してきている(Aharoni A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, Maliepaard CA, Kruppa G, Bino R, Goodenowe DB. Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics 2002;6:217-34、Dettmer K, Aronov PA, Hammock BD. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev 2007;26:51-78、Want EJ, Nordstrom A, Morita H, Siuzdak G. From exogenous to endogenous: the inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. J Proteome Res 2007;6:459-68)。
【0006】
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析(FTICR−MS,Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry)は、荷電粒子が磁場においてサイクロトロン運動を呈するという原理に基づいており、ここで、スピン周波数は質量に比例する(Pinto DM, Boyd RK, Volmer DA. Ultra-high resolution for mass spectrometric analysis of complex and low-abundance mixtures - the emergence of FTICR-MS as an essential analytical tool. Anal Bioanal Chem 2002; 373:378-89)。FTICR−MSは、その高分解能及び1パート・パー・ミリオン(ppm,part per million)未満の質量精度でイオンを検出する性能で知られている。液体試料抽出物は、エレクトロスプレーイオン化(ESI,electrospray ionization)及び大気圧化学イオン化(APCI,atmospheric pressure chemical ionization)を使用してクロマトグラフ分離なしで直接注入することができ(Aharoni A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, Maliepaard CA, Kruppa G, Bino R, Goodenowe DB. Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics 2002;6:217-34)、ここで、フーリエ変換を使用して、質量対電荷(M/Z,mass to charge)比が異なるイオンを同時に分解することができる。情報学的アプローチを使用して、いくつもの試料からのスペクトルファイルを正確に整列化し、試料全体にわたってピーク強度を比較することができる(Aharoni A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, Maliepaard CA, Kruppa G, Bino R, Goodenowe DB. Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics 2002;6:217-34)。高分解能は、試料において検出されたすべてのイオンの元素組成予測も可能にし、代謝産物の分類及び同定のための確固たる基盤、並びにデノボ代謝ネットワークを構成する能力を提供する(Aharoni A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, Maliepaard CA, Kruppa G, Bino R, Goodenowe DB. Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics 2002;6:217-34、Breitling R, Ritchie S, Goodenowe D, Stewart ML, Barrett MP. Ab initio prediction of metabolic networks using Fourier transform mass spectrometry data. Metabolomics 2006; 2:155-164)。
【0007】
それでも、CRCの初期段階において該疾患を検出するために利用可能である正確な血清マーカーなしでは、質量分析ベースの診断システムは臨床試験において広く使用されてこなかった。
【0008】
炎症及び疾患における生物活性脂質の役割
炎症は、がんを包含する多くのヒト疾患の根底にある重大な構成要素である。炎症がどのように生じ、体によって制御されるか、並びに食事及び環境要因が炎症にどのように影響を与えるかを理解することは、疾患の予防及び治療のために重要である。
【0009】
炎症における生物活性脂質の役割は、アラキドン酸が、シクロオキシゲナーゼ及びリポキシゲナーゼの活性を介して、種々の炎症促進性メディエーター、プロスタグランジン及びロイコトリエンを生じさせることを示したBorgeat及びSamuelssonにより、1979年に報告された(Borgeat P, Samuelsson B. Metabolism of arachidonic acid in polymorphonuclear leukocytes. Structural analysis of novel hydroxylated compounds. J. Biol. Chem., 1979, 254:7865-9)。それ以来、多価不飽和脂肪酸(PUFA,polyunsaturated fatty acid)が有益な健康効果も有し得、がんを包含する複数の炎症関連障害から保護し得ることを示唆する優位なデータが報告されてきた(Chapkin RS, Davidson LA, Ly L, et al. Immunomodulatory effects of (n-3) fatty acids: putative link to inflammation and colon cancer. J. Nutr. 2007, 137:200S-204S、Chapkin RS, McMurray DN, Lupton JR. Colon cancer, fatty acids and anti-inflammatory compounds. Curr. Opin. Gastroenterol. 2007, 23:48-54、Chapkin RS, Seo J, McMurray DN, et al. Mechanisms by which docosahexaenoic acid and related fatty acids reduce colon cancer risk and inflammatory disorders of the intestine. Chem. Phys. Lipids 2008, 153:14-23)。特に興味深いのは、炎症の消散におけるn−3及びn−6脂肪酸の役割である。
【0010】
PUFAのn−3クラスは、魚油に多く、アシル鎖のメチル位から1番目の二重結合の位置によって定義される。超長鎖ドコサヘキサエン酸(DHA,docosahexaenoic acid;22:6n−3)及びエイコサペンタエン酸(EPA,eicosapentaenoic acid;20:5n−3)は、魚油において高度に豊富なn−3PUFAであり、一方、短鎖リノレン酸(LNA,linolenic acid;18:3n−3)は、アマ及びアブラナ等の種子油において豊富である。n−3脂肪酸の内因性レベルは、食習慣によって大きく影響されるが、インビボにおけるそれらの合成が可能である。n−3抗炎症活性の厳密な機序は、ほとんど理解されておらず、事実上多様である。しかしながら、多面発現効果の多くは、細胞膜構築及び流動性の変調、プロスタグランジン合成の阻害、PPAR及びトール様受容体を介するNF−κBの調節、タンパク質標的における変化、並びに種々の炎症消散生成物への変換に帰する場合がある(Chapkin RS, Davidson LA, Ly L, et al. Immunomodulatory effects of (n-3) fatty acids: putative link to inflammation and colon cancer. J. Nutr. 2007, 137:200S-204S、Chapkin RS, McMurray DN, Lupton JR. Coloncancer, fatty acids and anti-inflammatory compounds. Curr. Opin. Gastroenterol. 2007, 23:48-54、Chapkin RS, Seo J, McMurray DN, et al. Mechanisms by which docosahexaenoic acid and related fatty acids reduce colon cancer risk and inflammatory disorders of the intestine. Chem. Phys. Lipids 2008, 153:14-23)。
【0011】
急性炎症は、感染、負傷又は外傷に対する短期的応答であり、n−6アラキドン酸に由来するロイコトリエン及びプロスタグランジン等の炎症促進性メディエーターの放出によって特徴付けられ、他の化学誘引剤と組み合わせて、感染又は負傷部位への白血球の動員をもたらす。炎症のこの初期波には、その後まもなく消散の波が付随して起こり、ここで、アラキドン酸からもリポキシゲナーゼ由来のエイコサノイドを産生する血小板−白血球相互作用を介するさらなるPMN動員が確認される。生じたリポキシンは非常に強力であり、ピクトグラム数で作用する。リポキシンはアスピリン誘発性であってもよく、炎症の消散を促進するための非ステロイド性抗炎症薬(NSAID,non-steroidal anti-inflammatory drug)に固有の能力をアスピリンに与える。
【0012】
リポキシンに加えて、n−3超長鎖脂肪酸(VLCFA,very-long-chain fatty acid)メディエーターの並列する役割が同定された。これらは、2つの別個のクラス:レソルビン(消散相相互作用生成物)及びプロテクチン(ニューロプロテクチンとも称される神経組織の初期保護から発生する)に分けられる。EPAを発生源とするレソルビンはEシリーズ、レソルビンE1(RvE1,resolvin E1)は原型的メンバーと称され、一方、DHAを発生源とするレソルビンは、レソルビンD1(RvD1,resolvin D1)に代表されるDシリーズを表す。しかしながら、DHAは、ニューロプロテクチンD1等のプロテクチンも生じさせ得る(Serhan CN. Novel chemical mediators in the resolution of inflammation: resolvins and protectins. Anesthesiol Clin 2006; 24:341-64、Serhan CN. Novel eicosanoid and docosanoid mediators: resolvins, docosatrienes, and neuroprotectins. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 2005, 8:115-21、Serhan CN, Gotlinger K, Hong S, Lu Y, Siegelman J, Baer T, Yang R, Colgan SP, Petasis NA. Anti-inflammatory actions of neuroprotectin D1/protectin D1 and its natural stereoisomers: assignments of dihydroxy-containing docosatrienes. J Immunol 2006; 176:1848-59)。リポキシンのように、E及びDシリーズ両方のレソルビンは、アスピリンによっても誘発され得る(Serhan CN, Hong S, Gronert K, Colgan SP, Devchand PR, Mirick G, Moussignac RL. Resolvins: a family of bioactive products of omega-3 fatty acid transformation circuits initiated by aspirin treatment that counter proinflammation signals. J Exp Med 2002; 196:1025-37)。
【0013】
多くの疾患における炎症の中心的役割を考慮すれば、炎症制御に関与する内因性代謝系の同定は最高に興味深い。急性炎症を十分に「消散」できないことが、がん及びアルツハイマー病等の状態の根底をなす慢性炎症状態の背景にある有力な説である。特に関連性があるのは、炎症性腸疾患(IDB,inflammatory bowel disease)、クローン病、結腸炎及び結腸がん等の腸管の炎症性状態に対する消散促進性メディエーターの効果である。
【0014】
RvE1及びLXA4はいずれも、結腸炎症に対する保護効果に関わっているとされてきた。RvE1は、白血球浸潤のブロック、炎症促進性遺伝子発現の減少、一酸化窒素シンターゼの誘導が生存率及び体重の維持における改善に付随して起こる、マウスにおける2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸誘導性結腸炎の発症から保護することが示された(Arita M, Yoshida M, Hong S, Tjonahen E, Glickman JN, Petasis NA, Blumberg RS, Serhan CN. Resolvin E1, an endogenous lipid mediator derived from omega-3 eicosapentaenoic acid, protects against 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102:7671-6)。同様に、LXA4アナログは、ヒト結腸におけるケモカイン分泌をエクスビボで減衰させることが示されており(Goh J, Baird AW, O'Keane C, Watson RW, Cottell D, Bernasconi G, Petasis NA, Godson C, Brady HR, MacMathuna P. Lipoxin A(4) and aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A(4) antagonize TNF-alpha-stimulated neutrophil-enterocyte interactions in vitro and attenuate TNF-alpha-induced chemokine release and colonocyte apoptosis in human intestinal mucosa ex vivo. J Immunol 2001; 167:2772-80)、病原誘導性胃腸炎に応答して誘導された遺伝子、特にNFκBによって調節される遺伝子の50%を減衰させた(Gewirtz AT, Collier-Hyams LS, Young AN, Kucharzik T, Guilford WJ, Parkinson JF, Williams IR, Neish AS, Madara JL. Lipoxin a4 analogs attenuate induction of intestinal epithelial proinflammatory gene expression and reduce the severity of dextran sodium sulfate-induced colitis. J Immunol 2002; 168:5260-7)。インビボでは、LXA4アナログはDSS誘導性炎症性結腸炎において腸管の炎症を低減させ、体重損失、血便及び死亡率の有意な低減をもたらした(Gewirtz AT, Collier-Hyams LS, Young AN, Kucharzik T, Guilford WJ, Parkinson JF, Williams IR, Neish AS, Madara JL. Lipoxin a4 analogs attenuate induction of intestinal epithelial proinflammatory gene expression and reduce the severity of dextran sodium sulfate-induced colitis. J Immunol 2002; 168:5260-7)。
【0015】
構造的に、リポキシン、レソルビン及びプロテクチンは、種々のリポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ及びp450酵素によって触媒される親VLCFAの一、二及び三水酸化生成物である。これらの分子のある特定の生理学的効果を上記で論じた通り立証してきたが、これらの消散「停止シグナル」がどのように発揮されるかを記述する機序は、依然として謎のままである。
【0016】
本発明者らは、本明細書において、炎症及びアポトーシス促進性抗がん活性の促進を低減させる上で役割を果たす新規クラスの水酸化脂肪酸について記述する。これらの水酸化脂肪酸は、疾患及び生理学的状態を診断するための有用なバイオマーカーでもある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0017】
【非特許文献1】Canadian Cancer Statistics, 2008
【非特許文献2】Roy HK, Backman V, Goldberg MJ. Colon cancer screening: the good, the bad, and the ugly. Arch Intern Med 2006; 166:2177-9
【非特許文献3】Ouyang DL, Chen JJ, Getzenberg RH, Schoen RE. Noninvasive testing for colorectal cancer: a review. Am J Gastroenterol 2005; 100:1393-403
【非特許文献4】Davies RJ, Miller R, Coleman N. Colorectal cancer screening: prospects for molecular stool analysis. Nat Rev Cancer 2005; 5:199-209
【非特許文献5】Kleivi K, Lind GE, Diep CB, Meling GI, Brandal LT, Nesland JM, Myklebost O, Rognum TO, Giercksky KE, Skotheim RI, Lothe RA. Gene expression profiles of primary colorectal carcinomas, liver metastases, and carcinomatoses. Mol Cancer 2007; 6:2
【非特許文献6】Solmi R, Ugolini G, Rosati G, Zanotti S, Lauriola M, Montroni I, del Governatore M, Caira A, Taffurelli M, Santini D, Coppola D, Guidotti L, Carinci P, Strippoli P. Microarray-based identification and RT-PCR test screening for epithelial specific mRNAs in peripheral blood of patients with colon cancer. BMC Cancer 2006; 6:250
【非特許文献7】Komori T, Takemasa I, Higuchi H, Yamasaki M, Ikeda M, Yamamoto H, Ohue M, Nakamori S, Sekimoto M, Matsubara K, Monden M. Identification of differentially expressed genes involved in colorectal carcinogenesis using a cDNA microarray. J Exp Clin Cancer Res 2004; 23:521-7
【非特許文献8】Hegde P, Qi R, Gaspard R, Abernathy K, Dharap S, Earle-Hughes J, Gay C, Nwokekeh NU, Chen T, Saeed AI, Sharov V, Lee NH, Yeatman TJ, Quackenbush J. Identification of tumor markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray. Cancer Res 2001; 61:7792-7
【非特許文献9】Kitahara O, Furukawa Y, Tanaka T, Kihara C, Ono K, Yanagawa R, Nita ME, Takagi T, Nakamura Y, Tsunoda T. Alterations of gene expression during colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays after laser-capture microdissection of tumor tissues and normal epithelia. Cancer Res 2001; 61:3544-9
【非特許文献10】Notterman DA, Alon U, Sierk AJ, Levine AJ. Transcriptional gene expression profiles of colorectal adenoma, adenocarcinoma, and normal tissue examined by oligonucleotide arrays. Cancer Res 2001; 61:3124-30
【非特許文献11】Takemasa I, Higuchi H, Yamamoto H, Sekimoto M, Tomita N, Nakamori S, Matoba R, Monden M, Matsubara K. Construction of preferential cDNA microarray specialized for human colorectal carcinoma: molecular sketch of colorectal cancer. Biochem Biophys Res Commun 2001; 285:1244-9
【非特許文献12】Backert S, Gelos M, Kobalz U, Hanski ML, Bohm C, Mann B, Lovin N, Gratchev A, Mansmann U, Moyer MP, Riecken EO, Hanski C. Differential gene expression in colon carcinoma cells and tissues detected with a cDNA array. Int J Cancer 1999; 82:868-74
【非特許文献13】Mori Y, Cai K, Cheng Y, Wang S, Paun B, Hamilton JP, Jin Z, Sato F, Berki AT, Kan T, Ito T, Mantzur C, Abraham JM, Meltzer SJ. A genome-wide search identifies epigenetic silencing of somatostatin, tachykinin-1, and 5 other genes in colon cancer. Gastroenterology 2006; 131:797-808
【非特許文献14】Chen WD, Han ZJ, Skoletsky J, Olson J, Sah J, Myeroff L, Platzer P, Lu S, Dawson D, Willis J, Pretlow TP, Lutterbaugh J, Kasturi L, Willson JK, Rao JS, Shuber A, Markowitz SD.Detection in fecal DNA of colon cancer-specific methylation of the nonexpressed vimentin gene. J Natl Cancer Inst 2005; 97:1124-32
【非特許文献15】Leung WK, To KF, Man EP, Chan MW, Bai AH, Hui AJ, Chan FK, Sung JJ. Quantitativedetection of promoter hypermethylation in multiple genes in the serum of patients with colorectal cancer. Am J Gastroenterol 2005; 100:2274-9
【非特許文献16】Ward DG, Suggett N, Cheng Y, Wei W, Johnson H, Billingham LJ, Ismail T, Wakelam MJ, Johnson PJ, Martin A. Identification of serum biomarkers for colon cancer by proteomic analysis. Br J Cancer 2006; 94:1898-905
【非特許文献17】Lou J, Fatima N, Xiao Z, Stauffer S, Smythers G, Greenwald P, Ali IU. Proteomic profiling identifies cyclooxygenase-2-independent global proteomic changes by celecoxib in colorectal cancer cells. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15:1598-606
【非特許文献18】Mazzanti R, Solazzo M, Fantappie O, Elfering S, Pantaleo P, Bechi P, Cianchi F, Ettl A, Giulivi C. Differential expression proteomics of human colon cancer. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006; 290:G1329-38
【非特許文献19】Roblick UJ, Hirschberg D, Habermann JK, Palmberg C, Becker S, Kruger S, Gustafsson M, Bruch HP, Franzen B, Ried T, Bergmann T, Auer G, Jornvall H. Sequential proteome alterations during genesis and progression of colon cancer. Cell Mol Life Sci 2004; 61:1246-55
【非特許文献20】de la Chapelle A. Genetic predisposition to colorectal cancer. Nat Rev Cancer 2004; 4:769-80
【非特許文献21】Marshall JR. Prevention of colorectal cancer: diet, chemoprevention, and lifestyle. Gastroenterol Clin North Am 2008; 37:73-82, vi
【非特許文献22】Fearnhead NS, Wilding JL, Bodmer WF. Genetics of colorectal cancer: hereditary aspects and overview of colorectal tumorigenesis. Br Med Bull 2002; 64:27-43
【非特許文献23】McGarr SE, Ridlon JM, Hylemon PB. Diet, anaerobic bacterial metabolism, and colon cancer: a review of the literature. J Clin Gastroenterol 2005;39:98-109
【非特許文献24】Aharoni A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, Maliepaard CA, Kruppa G, Bino R, Goodenowe DB. Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics 2002;6:217-34
【非特許文献25】Dettmer K, Aronov PA, Hammock BD. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev 2007;26:51-78
【非特許文献26】Want EJ, Nordstrom A, Morita H, Siuzdak G. From exogenous to endogenous: the inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. J Proteome Res 2007;6:459-68
【非特許文献27】Pinto DM, Boyd RK, Volmer DA. Ultra-high resolution for mass spectrometric analysis of complex and low-abundance mixtures - the emergence of FTICR-MS as an essential analytical tool. Anal Bioanal Chem 2002; 373:378-89
【非特許文献28】Breitling R, Ritchie S, Goodenowe D, Stewart ML, Barrett MP. Ab initio prediction of metabolic networks using Fourier transform mass spectrometry data. Metabolomics 2006; 2:155-164
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
本発明は、炎症、炎症性障害及びがんの治療及び緩和のための化合物、並びに関係する医薬組成物及び治療の方法を提供することを目的とする。
【0019】
本発明は、対象において、炎症、炎症性障害及びがんを検出するために有用な化合物、並びに関係する検出又は診断の方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0020】
本発明の態様によれば、式(I)の化合物:
【0021】
【化1】

(I)
【0022】
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、該鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
が提供される。
【0023】
上記の式(I)において、Rは、好ましくはC28−C36脂肪族基、より好ましくはC28脂肪族基であってよい。直鎖脂肪族基が意味するのは、本明細書において使用される場合、例えばオレフィン基又はアルケニル基としての開鎖飽和炭化水素である。ヒドロキシ置換が意味するのは、本明細書において使用される場合、化合物が、炭化水素鎖中の1又は2以上の水素原子と置き換えて、1又は2以上のヒドロキシ置換基を有し得ることである。
【0024】
何ら限定することを望まないが、上記の化合物は、ある特定の実施形態において、下記化合物の1つであってよい。
【0025】
【化2】

【0026】
上記の化合物は天然源から単離してよく、又は化学的に合成してもよい。加えて、すべての化合物は、単一の立体異性体として若しくはその混合物として、及び/又は薬学的に許容されるその塩若しくはエステルとして提供され得る。
【0027】
上記の化合物は、例えば、診断アッセイ、インビボでの分析物レベルの定量化等における基準物質としての使用を容易にするために、標識されていてもよい。非限定的な実施形態において、化合物は、13C等の安定同位体、32P若しくは35S等の放射性同位体、フルオレセイン等の蛍光タグ、又は等価物で標識される。代替的非限定的な実施形態において、化合物は、インビトロ又はインビボにおける検出を容易にするように、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP,horse radish peroxidase)、アルカリ性ホスファターゼ、ビオチン等の酵素又はタンパク質で標識される、又はそれらと共役される。
【0028】
故に、本発明は、検出剤で標識された式(I)の化合物を含む基準物質をさらに提供する。
【0029】
上述した基準物質を含むキットも提供される。そのようなキットは、取扱説明書、及び分析物を定量化するため又は診断アッセイを本明細書において記載されている通りに実施するために有用な他の材料を含み得る。
【0030】
本発明の別の態様として、式(I)の化合物を、CRCを治療、予防又は緩和するのに十分な量で投与するステップを含む、該癌疾患と診断された、又は該疾患を有する疑いがある対象を治療する方法が提供される。
【0031】
式(I)の化合物を、腫瘍の成長を阻害するのに十分な量で投与するステップを含む、腫瘍成長を阻害する方法が追加で提供される。ある特定の実施形態において、腫瘍成長の阻害は、成長の完全阻害を包含する種々の程度の腫瘍成長遅延を包含し得る。そのような治療は、腫瘍サイズの低減も伴い得る。腫瘍は、腺癌等の大腸及び直腸のがん、胃がん(gastric and stomach cancers)、膵がん、卵巣がん、食道がん、並びに他の胃腸/腹部がんを包含し得るがこれらに限定されない。
【0032】
本発明は、対象に、該対象において胃腸(GI,gastrointestinal)障害を治療、予防又は緩和するのに十分な量で、式(I)の化合物を投与するステップを含む、該対象において該疾患を治療又は予防する方法をさらに提供する。GI障害は、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病及び/若しくは結腸炎等の非悪性障害、又はポリープ若しくは種々の異型度の異形成の存在であってよい。
【0033】
それを必要とする対象に、炎症及び/又は炎症に関係する障害を予防するのに有効な量で、式(I)の化合物を投与するステップを含む、該対象において前記炎症及び/又は炎症に関係する障害を予防する方法も、本明細書において提供される。
【0034】
上記で言及した通り、本発明は、疾患の初期兆候を包含する疾患の診断及び検出の方法にも関する。したがって、
a)対象由来の試料を分析して、前記試料中の式(I)の化合物の量を定量するステップと、
b)対象試料中の定量された化合物の量を、1又は2以上の標準試料中の対応する化合物の量と比較して、対象試料中の化合物の量における増加又は減少の存在又は非存在を決定するステップと、
c)前記増加又は減少を、対象のCRC健康状態若しくは健康状態における変化を診断するために、又は対象においてCRC若しくはCRCのリスクを診断するために使用するステップと
を含む、対象のCRC健康状態若しくは健康状態における変化を診断するための、又は対象においてCRC若しくはCRCのリスクを診断するための方法を本明細書においてさらに提供する。
【0035】
本発明はさらに、対象における式(I)の化合物のレベルを計測するステップと、前記レベルを健常状態における水酸化多価不飽和超長鎖脂肪酸(hPULCFA,hydroxylated polyunsaturated ultra long-chain fatty acid)の対応する標準レベルと比較するステップとを含む、hPULCFA欠乏障害(hPDD,hPULCFA deficiency disorder)を有する対象の同定及び/又は診断の方法に関する。そのような方法は、
a)対象由来の試料を分析して、試料中の式(I)の化合物の量を定量するステップと、
b)対象試料中の定量された化合物の量を、1又は2以上の標準試料中の対応する化合物の量と比較して、対象試料中の化合物の量における増加又は減少の存在又は非存在を決定するステップと、
c)増加又は減少を、対象においてhPDDを診断するために使用するステップと
を含み得る。
【0036】
本発明はさらに、対象においてhPDDを寛解させるのに十分な量で式(I)の化合物を投与することにより、対象においてhPDDを治療する方法に関する。好ましくは、投与される化合物の量は、hPULCFAレベルを上昇させるのに、より好ましくは、hPULCFAレベルを健常状態に修復するのに有効なものである。
【0037】
「健常状態」が意味するのは、健康であるとみなされる又はhPDDを有さない対象におけるhPULCFAのレベルである。
【0038】
本発明は、炎症のマーカーとしての、及び抗炎症薬の効果をモニターするための、1又は2以上の式(I)の化合物の使用にも関する。したがって、
a)対象由来の試料を分析して、試料中の式(I)の化合物の量を定量するステップと、
b)対象試料中の定量された化合物の量を、1又は2以上の標準試料中の対応する化合物の量と比較して、対象試料中の化合物の量における増加又は減少の存在又は非存在を決定するステップと、
c)増加又は減少を、対象において炎症又は炎症性疾患を診断するために使用するステップと
を含む方法が提供される。
【0039】
炎症又は炎症性疾患を診断する上記の方法において、炎症は、IBD、クローン病及び/若しくは結腸炎等のGI障害によって引き起こされ得る、又は炎症性疾患はそれらを包含し得る。故に、そのような方法は、そのようなGI障害を診断する方法を包括し得る。
【0040】
抗炎症薬の効果をモニターする方法は、
a)前記抗炎症薬で治療される対象由来の試料を分析して、試料中の式(I)の化合物の量を定量するステップと、
b)対象試料中の定量された化合物の量を、1又は2以上の標準試料中の対応する化合物の量と比較して、対象試料中の化合物の量における増加又は減少の存在又は非存在を決定するステップとを含み、
ここで、対象試料中の化合物の量における増加又は減少は、対象において抗炎症薬によって引き起こされる効果を指示する。
【0041】
上記の方法において、前記抗炎症薬で治療される対象は、典型的には、炎症及び/若しくは炎症性状態若しくは疾患と診断される、又はそれらを有すると疑われることになる。代替として、方法は、炎症及び/若しくは炎症性状態若しくは疾患と診断される、又はそれらを有すると疑われる第一の亜群又は集団と、炎症及び/若しくは炎症性状態若しくは疾患を有さないと診断される、又はそれらの生理学的兆候を呈さない第二の亜群又は集団とを包含する、対象群を包含する比較分析に適用され得る。
【0042】
上記診断法のある特定の実施形態において、対象由来の試料は、ステップa)において、化合物についての正確な質量強度データを得るために、質量分析によって分析され、該正確な質量強度データが、ステップb)において、正確な質量強度における増加又は減少を特定するために、1又は2以上の標準試料から得られた対応する正確な質量強度データと比較される。加えて、対象由来の試料は、1又は2以上の内部対照代謝産物を定量するため、又は該代謝産物についての正確な質量強度データを得るためにさらに分析され得る。そのような実施形態において、定量された化合物の量又は得られる正確な質量強度と、1又は2以上の内部対照代謝産物について得られる定量された量又は正確な質量強度との比を決定することができる。比較するステップ(b)は、次いで、各比を、1又は2以上の標準試料について得られる1又は2以上の対応する比と比較するステップを含む。
【0043】
上述した診断法において、データを定量するステップは、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析、飛行時間、オービトラップ(Orbitrap)、四重極又は三連四重極質量分析計を使用して得ることができる。タンデム質量分析、NMR又は酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA,enzyme-linked immunosorbent assay)法を包含するがこれらに限定されない、分析物を定量化する他の方法を使用してもよい。加えて、試料は、対象由来のいかなる生物試料であってもよく、好ましくは、血液試料、血清試料、脳脊髄液試料等である。さらに、正確な質量強度は、本明細書において記載されている通りの抽出法によって、例えば、非極性代謝産物を有機溶媒に溶解し、極性代謝産物を水性溶媒に溶解する液液抽出を試料に対して実施することによって得られた試料内のイオン化された代謝産物を表す。この手法で、ポジティブエレクトロスプレーイオン化、ネガティブエレクトロスプレーイオン化、ポジティブ大気圧化学イオン化、ネガティブ大気圧化学イオン化、又はこれらの方法の組合せ等のイオン化法を使用して、抽出された試料のイオン化から正確な質量強度を得ることができる。
【0044】
本明細書において参照される通りの標準試料は、1又は2以上の標準試料を包含し得、試験される疾患又は状態に基づいて選択されることになる。例えば、対象のCRC健康状態若しくは健康状態における変化を試験する場合、又は患者におけるCRC若しくはCRCのリスクを診断するためには、1又は2以上の標準試料は、CRCと診断されておらず、且つ/又はCRCに関連する生理学的状態を呈さない1又は2以上の健常な個体由来のものとする。hPDDについて対象を試験する場合、1又は2以上の標準試料は、hPDDと診断されておらず、一般集団のレベルと一致するhPULCFAレベルを有し、且つ/又はhPDDに関連する生理学的状態を呈さない1又は2以上の健常な個体由来のものとする。炎症又は炎症性疾患を診断する方法のためには、1又は2以上の標準試料は、炎症とも炎症性疾患とも診断されておらず、且つ/又は炎症若しくは炎症性疾患に関連する生理学的状態を呈さない1又は2以上の健常な個体由来のものとする。他方で、抗炎症薬の効果をモニターする場合、1又は2以上の標準試料は、抗炎症薬の投与又はそれを用いる治療前に採取された同対象由来の試料であってよく、又は、代替として、炎症及び/若しくは炎症性状態若しくは疾患を有さないと診断される、又はそれらの生理学的兆候を呈さない1又は2以上の健常な個体由来の試料であってよい。
【0045】
本明細書において、下記化合物も提供される。
【0046】
【化3】

【0047】
そのような化合物は、化合物D046−124:
【0048】
【化4】

(D046-124)
【0049】
の合成における中間体として特に有用である。
【0050】
(i)式(II)の化合物:
【化5】

(II)
と式(III)の化合物:
【化6】

(III)
とを、式(IV)の化合物:
【化7】

(IV)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
(ii)TBDPS基を除去して式(V)の化合物:
【化8】

(V)
を生成するステップと、
(iii)式(V)の化合物と式(VI)の化合物:
【化9】

(VI)
とを、式(VII)の化合物:
【化10】

(VII)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
(iv)式(VII)の化合物と触媒とを、式(VIII)の化合物:
【化11】

(VIII)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
(v)式(VIII)の化合物の末端エステル官能基を加水分解してカルボン酸基とし、それによって表題化合物を生成するステップと
を含む、化合物D046−124を調製するための方法も、本明細書において提供される。
【0051】
上記の方法は、化合物D046−124を単離するための1又は2以上の精製ステップをさらに含み得る。加えて、式(VII)の化合物を、ある特定の非限定的な実施形態では、上記のステップ(iv)において、Pd触媒の存在下、炭酸カルシウムと1気圧の水素下で反応させて、三重結合を二重結合へ選択的に変換し、それによって式(VIII)の化合物を生成し得る。
【0052】
当業者であれば、日常的実験を超えるものは使用せずに、本明細書において記載されている通りの具体的手順の数々の等価物を認識し又は見極めることができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内であるとみなされ、下記請求項によって網羅される。
【0053】
本発明のこれら及び他の特色は、下記の図を参照する下記の記述から、より明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図1】研究設計図である。研究は、3つの相:3つの独立な試料セットにおけるFTICR−MSメタボロミック発見、hPULCFAとしての代謝バイオマーカーの構造研究及び決定、並びに三連四重極MRM標的アッセイを使用するバリデーションを含むものであった。
【図2】3つの独立な研究における、CRCと健常な患者の血清との間の平均試料ピーク強度倍数変化の散布図である。すべての対象の試料特異的なピークを、log2で正規化して対照集団の平均値とし、質量(Da)に従ってプロットした。対応のないStudentのt−検定に基づく有意性に従って点を着色する(説明文を参照)。(A)GCI社製発見集団、(B)Seracare社製1発見集団、(C)大阪発見集団。灰色の枠で囲まれた領域は、3つすべてのコホートにおける対照と比較した、CRC患者において一貫して低減する440〜600Daの質量のクラスターを表す。
【図3】病期ごとの代謝産物446及び448の相対強度並びに各発見データセットについてのAUCを示す図である。(A)各試料セットにおける相対強度対病期の棒グラフ、(B)代謝産物446及び448についての病期と対照とのP値比較の概要、(C)マーカー446及び448、並びに各発見セットにおけるすべてのCRC対すべての対照に基づくROC分析。
【図4】健常な対象及びCRC患者由来の血清の抽出質量スペクトルである。GCI社製発見セットの5つの代表的なCRC及び5つの対照試料からの抽出物を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC,high performance liquid chromatography)、続いて、APCIネガティブモードのApplied Biosystems社製QSTAR XL(商標)質量分析計でのフルスキャン検出に供した。16〜18分で溶離する質量範囲100〜700Da内のすべてのイオンの平均強度を、各コホートについて示す。枠で囲まれた領域は、健常な患者には存在するがCRC陽性血清には存在しないスペクトルの特色を指示している。
【図5】Seracare社製2バリデーション試料セットの三連四重極MRM分析の結果を示す図である。(A)無症候性対照及び前治療CRC患者において13C−コール酸等価物として発現するhPULCFA446、448及び450の濃度の散布図、(B)(A)における対応する散布図に基づくROC分析。灰色の点線は、95%信頼区間を指示している。(C)病期ごとのhPULCFAの平均濃度当量の棒グラフ。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。(D)病期ごとのROC分析。
【図6】Chiba検証試料セットの三連四重極MRM分析の結果を示す図である。(A)無症候性対照及び前治療CRC患者において13C−コール酸等価物として発現するhPULCFA446、448及び450の濃度の散布図、(B)(A)における対応する散布図に基づくROC分析。灰色の点線は、95%信頼区間を指示している。(C)病期ごとのhPULCFAの平均濃度当量の棒グラフ。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。(D)病期ごとのROC分析。
【図7】バイオマーカーm/z446のMS/MSスペクトル図である。
【図8】バイオマーカーm/z448のMS/MSスペクトル図である。
【図9】バイオマーカーm/z450のMS/MSスペクトル図である。
【図10】バイオマーカーm/z464のMS/MSスペクトル図である。
【図11】バイオマーカーm/z466のMS/MSスペクトル図である。
【図12】バイオマーカーm/z468のMS/MSスペクトル図である。
【図13】ヒト血清からhPULCFA富化画分を得るための精製過程を示す図である。血清の乾燥有機抽出物を、水/アセトニトリル溶媒ステップ勾配を使用する逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーによって初期精製して、半精製hPULCFA富化画分(F9)を得た。F9のいくつかを、ヘキサン/クロロホルム/メタノール溶媒ステップ勾配を使用する順相フラッシュカラムクロマトグラフィーによる二次精製ステップのために合わせて、高度hPULCFA富化画分7(F7_2)を得た。
【図14】逆相カラム上で血清抽出物を分画した後に得られる脂肪酸と結腸直腸がんバイオマーカーとの混合物を含有する第I期画分9(F9)のLC/MSスペクトル図である。
【図15】CRCバイオマーカー中におよそ65%の富化度を含有する第II期画分7(F7)のLC/MSスペクトル図である。
【図16】未精製ヒト血清抽出物の全イオンクロマトグラム(A)、すべてのイオンの抽出質量スペクトル(B)、及び440〜520Daのイオンの抽出質量スペクトル(C)図である。
【図17】本明細書において記載されている富化手順後のヒトhPULCFA陰性血清抽出物の全イオンクロマトグラム(A)、抽出質量スペクトル(B)図である。hPULCFAは存在しない。
【図18】本明細書において記載されている富化手順後のヒトhPULCFA陽性血清抽出物の全イオンクロマトグラム(A)、抽出質量スペクトル(B)図である。hPULCFAは、440〜600Daで存在する。
【図19】可変用量の全血清抽出物(図16に示す通り)で48時間処理したSW620結腸がん細胞の細胞増殖アッセイを示す図である。
【図20】hPUCLFA富化抽出物で処理した細胞の明視野検査を示す図である。hPULCFAを富化(hPULCFA+ve)又は枯渇(hPULCFA−ve)させた80ug/mlの半精製抽出物、ビヒクル又は1uMのドキソルビシンでMCF−7細胞を24時間処理し、倒立光学顕微鏡で撮像した。細胞の拡大を各パネルの左上に示す。細胞生存性及び形態学に対するhPULCFA+ve処理(左下)の有意な効果は、他の処理と比較して顕著である。
【図21】hPULCFA+ve及び−ve抽出物(80ug/ml)による処理後のカスパーゼ媒介性アポトーシス促進性ポリ−ADP−リボースポリメラーゼ(PARP,Poly-ADP-Ribose Polymerase)開裂断片について、MCF7細胞溶解物のウエスタン(免疫ブロット)を示す図である。
【図22】80ug/mlのhPUCLFA陽性、hPULCFA陰性及びビヒクルによる、12、24及び48時間の処理後のSW620結腸がん細胞の細胞増殖率を示す図である。
【図23】hPULCFA+ve及び−ve抽出物(80ug/ml)による処理後のカスパーゼ媒介性アポトーシス促進性ポリ−ADP−リボースポリメラーゼ(PARP)開裂断片について、SW620細胞溶解物のウエスタン(免疫ブロット)を示す図である。
【図24】hPULCFA+ve及び−ve抽出物(80ug/ml)による処理後の炎症促進性転写因子NFκBについて、SW620細胞溶解物のウエスタン(免疫ブロット)を示す図である。
【図25】hPULCFA+ve及び−ve抽出物(80ug/ml)による処理後のNFκB陰性調節タンパク質IκBαについて、SW620細胞溶解物のウエスタン(免疫ブロット)を示す図である。
【図26】hPULCFA+ve及び−ve抽出物(80ug/ml)による処理後の誘導型一酸化窒素シンターゼ(iNOS又はNOS2)について、SW620細胞溶解物のウエスタン(免疫ブロット)を示す図である。
【図27】Griess試薬系を使用する、hPULCFA+ve及び−ve抽出物(80ug/ml)によるSW620細胞の処理後の、馴化培地中における一酸化窒素生成の指標としての亜硝酸塩のレベルを示す図である。
【図28】hPULCFA+ve及び−ve抽出物による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の前処理後の、定量的リアルタイムrtPCRに基づく相対的なTNFα mRNA転写レベルを示す図である。三角形は、20、40及び80ug/mlの漸増用量を表す。*p<0.05対+LPS処理単独。
【図29】hPULCFA+ve及び−ve抽出物(80ug/ml)による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の前処理後の、ELISAによって決定した際の相対的なTNFα細胞溶解物タンパク質レベルを示す図である。*p<0.05対+LPS処理単独。
【図30】hPULCFA+ve及び−ve抽出物(80ug/ml)による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の前処理後の、ELISAによって決定した際の馴化培地中における相対的なTNFαタンパク質レベルを示す図である。*p<0.05対+LPS処理単独。
【図31】hPULCFA+ve及び−ve抽出物による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の前処理後の、定量的リアルタイムrtPCRに基づく相対的なiNOS mRNA転写レベルを示す図である。三角形は、20、40及び80ug/mlの漸増用量を表す。*p<0.05対+LPS処理単独。
【図32】hPULCFA+ve及び−ve抽出物(80ug/ml)による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の前処理後の、ウエスタンブロット法によって決定した際の細胞溶解物中における相対的なiNOSタンパク質レベルを示す図である。ns、非特異的。
【図33】Griess試薬系を使用する、hPULCFA+ve及び−ve抽出物(80ug/ml)による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の処理後の、馴化培地中における一酸化窒素生成の指標としての亜硝酸塩の相対的レベルを示す図である。*p<0.05対+LPS処理単独。
【図34】hPULCFA+ve及び−ve抽出物による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の前処理後の、定量的リアルタイムrtPCRに基づく相対的なCOX2 mRNA転写レベルを示す図である。三角形は、20、40及び80ug/mlの漸増用量を表す。*p<0.05対+LPS処理単独。
【図35】hPULCFA+ve及び−ve抽出物による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の前処理後の、定量的リアルタイムrtPCRに基づく相対的なIL−1β mRNA転写レベルを示す図である。三角形は、20、40及び80ug/mlの漸増用量を表す。*p<0.05対+LPS処理単独。
【図36】hPULCFA+ve及び−ve抽出物(80ug/ml)による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の前処理後の、ELISAによって決定した際の細胞溶解物中における相対的なIL−1βタンパク質レベルを示す図である。*p<0.05対+LPS処理単独。
【図37】種々の濃度の純粋な合成hPULCFA D046−124による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の前処理後の、定量的リアルタイムrtPCRによって決定した際の相対的なTNFα転写レベルを示す図である。*p<0.05対+LPS処理単独。
【図38】0.5及び1mMの純粋合成hPULCFA D046−124による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の前処理後の、ELISAによって決定した際の馴化培地中における相対的なTNFαタンパク質レベルを示す図である。
【図39】種々の濃度の純粋な合成hPULCFA D046−124による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の前処理後の、定量的リアルタイムrtPCRによって決定した際の相対的なiNOS転写レベルを示す図である。*p<0.05対+LPS処理単独。
【図40】種々の濃度の純粋な合成hPULCFA D046−124による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の処理後の、馴化培地中における一酸化窒素生成の指標としての亜硝酸塩の相対的レベルを示す図である。*p<0.05対+LPS処理単独。
【図41】種々の濃度の純粋な合成hPULCFA D046−124による1ug/mlのLPS刺激RAW293マクロファージ細胞の前処理後の、ELISAによって決定した際の馴化培地中における相対的なIL−1βタンパク質レベルを示す図である。*p<0.05対+LPS処理単独。
【図42】6つのhPULCFAに対するSeracare社製前治療NSAID効果を示す図である。
【図43】6つのhPULCFAに対するBioserve社製前治療NSAID効果を示す図である。
【図44】LPS誘導後のhPULCFA陽性抽出物におけるTNF−アルファレベルの低減を示す図である。
【図45】hPULCFA陽性抽出物におけるLPS誘導性一酸化窒素シンターゼ(NOS2,LPS-induced nitric oxide synthase)の低減を示す図である。トップペイン;ウエスタンブロッティング分析、ボトムペイン:Ponceau S染色ゲル。
【図46】hPULCFA陽性抽出物で処理した細胞の馴化培地中における亜硝酸塩レベルの用量依存的低減を示す図である。
【図47】化合物2のNMRスペクトル図である。
【図48】化合物2のNMRスペクトル図である。
【図49】化合物3のNMRスペクトル図である。
【図50】化合物4のNMRスペクトル図である。
【図51】化合物5のNMRスペクトル図である。
【図52】化合物6のNMRスペクトル図である。
【図53】化合物7のNMRスペクトル図である。
【図54】化合物7のLCクロマトグラフ図である。
【図55】化合物7のMSスペクトル図である。
【図56】断片AのNMRスペクトル図である。
【図57】断片AのLCクロマトグラフ図である。
【図58】断片AのMSスペクトル図である。
【図59】化合物9のNMRスペクトル図である。
【図60】化合物9のNMRスペクトル図である。
【図61】化合物9のMSスペクトル図である。
【図62】断片BのIR吸収スペクトル図である。
【図63】断片BのNMRスペクトル図である。
【図64】断片BのMSスペクトル図である。
【図65】化合物11のNMRスペクトル図である。
【図66】化合物11のNMRスペクトル図である。
【図67】化合物12のNMRスペクトル図である。
【図68】化合物12のLCクロマトグラフ図である。
【図69】化合物12のMSスペクトル図である。
【図70】化合物13のNMRスペクトル図である。
【図71】化合物13のLCクロマトグラフ図である。
【図72】化合物13のMSスペクトル図である。
【図73】断片CのNMRスペクトル図である。
【図74】断片CのNMRスペクトル図である。
【図75】断片CのLCクロマトグラフ図である。
【図76】断片CのMSスペクトル図である。
【図77】化合物15のNMRスペクトル図である。
【図78】化合物15のLCクロマトグラフ図である。
【図79】化合物15のMSスペクトル図である。
【図80】化合物16のNMRスペクトル図である。
【図81】化合物16のNMRスペクトル図である。
【図82】化合物16のMSスペクトル図である。
【図83】化合物17のNMRスペクトル図である。
【図84】化合物17のLCクロマトグラフ図である。
【図85】化合物17のMSスペクトル図である。
【図86】化合物18のNMRスペクトル図である。
【図87】化合物18のLCクロマトグラフ図である。
【図88】化合物18のMSスペクトル図である。
【図89】化合物D046−124(本明細書においては、GVK−FFS−09−06−PHMとも称する)のLCクロマトグラフ図である。
【図90】化合物D046−124のMSスペクトル図である。
【発明を実施するための形態】
【0055】
これまで、結腸直腸がん(CRC)の初期リスクを検出するための正確な血清マーカーはなかった。この必要性に対処するために、質量分析ベースの発見プラットフォームを使用して、治療未経験のCRC患者の血清メタボローム内の代謝バイオマーカーを同定した。「非標的」アプローチは、新規化合物を検出するという利点を有し、したがって、バイオマーカー駆動型アプローチに理想的に適していた。質量分析ベースの発見プラットフォームの使用は、三連四重多重反応モニタリング(TQ−MRM,triple-quadruple multiple-reaction-monitoring)に基づく定量的診断法に容易に移行されるという追加の利点も有する。
【0056】
バイオマーカー発見は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析(FTICR−MS)を使用して実施した。異なる大陸からの3つの独立な集団由来のCRC患者及び対照(米国及び日本;総n=222)の包括的な代謝プロファイルを得、研究間の最良バイオマーカーを決定した。これら及び関係するマーカーの構造的特徴付けは、MS/MS及びNMR技術を使用して実施した。商業的な臨床的有用性評価は、米国及び日本(総n=220)からの2つのさらなる独立な集団由来の3つのバイオマーカーについて、標的化ハイスループット三連四重極MRM(TQ−MRM,triple-quadrupoleMRM)法を使用して実施した。
【0057】
これらの包括的なメタボロミクス分析は、対照と比べて、CRC患者試料の3つの独立なコホートすべてにおけるC28−C36水酸化多価不飽和超長鎖脂肪酸(hPULCFA)のレベルの有意な低減を明らかにした。C28分子についての構造解明研究は、2つのヒドロキシル置換(446、448及び450)又は3つのヒドロキシル置換(464、466及び468)のいずれかを持つ2つのファミリー、並びに可変不飽和度を明らかにした。TQ−MRM法は、2つのさらなる独立な研究において、FTMS結果を首尾よく再現した。合計で、2つの大陸域にわたって5つの独立な集団(FTICR−MSによって3つ、及びTQ−MRMによって2つ)のうちの2つのバイオマーカーを評価した。生じた10の受信者動作特性曲線AUCは、0.85〜0.98の範囲であった(平均=0.91±0.04)。
【0058】
今まで未知であったこれらの代謝産物の全身性代謝調節異常は、CRCの存在に高度に関連していることが分かった。代謝産物は血清等の生物試料中で計測可能であり、それらの濃度の減少は、人種的又は地理的バックグラウンドにかかわらず、CRCの存在に感受性が高く且つ特異的である。したがって、これらの代謝産物の計測は、CRCの早期検出及びスクリーニングのための有用なツールを提供する。
【0059】
有用なCRCバイオマーカーであることに加えて、本明細書において記載されているhPULCFAは細胞増殖を低減させ、アポトーシス促進において役割を果たすことが示されている。hPULCFAは、NFκB、IκBα、NOS2、COX2、TNF−アルファ及びSODを包含する一連の炎症性タンパク質を使用する調査を介して、並びに馴化細胞の培地中における亜硝酸塩レベルを計測することによって実証される通り、抗炎症活性も有する。抗炎症活性は、CRC及びNSAIDを摂取している健常な対象の臨床試験を介しても実証され、これにより、NSAIDの使用は、欠損対象におけるhPULCFAレベルの増加をもたらした。
【0060】
全体からみると、本発明者らは、以下でさらに詳細に論じる治療的及び診断的用途における、記載したhPULCFAの使用に幅広い裏付けを提供した。
【0061】
したがって、本明細書において、式(I)による化合物:
【0062】
【化12】

(I)
【0063】
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、該鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
が提供される。
【0064】
上記の式(I)において、Rは、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39及び40を包含する、24〜40の任意の数のC原子を含有するC24−C40直鎖脂肪族基を包含し得る。好ましくは、炭化水素鎖は、C28−C36脂肪族基、とりわけC28脂肪族基である。直鎖脂肪族基が意味するのは、本明細書において使用される場合、例えばオレフィン基又はアルケニル基としての開鎖飽和炭化水素である。ヒドロキシ置換が意味するのは、本明細書において使用される場合、化合物が、炭化水素鎖中の1又は2以上の水素原子と置き換えて、1又は2以上のヒドロキシ置換基を有し得ることである。
【0065】
上記で述べた通り、Rの炭化水素鎖中の少なくとも1個の炭素はヒドロキシ(OH)基で置換されている。鎖中のOH置換の数は、脂肪アシル鎖の長さに沿って、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10を包含する1〜10個の任意の数のOH置換基であってよい。しかしながら、いくつかの実施形態においては、より少ないOH置換基、例えば1〜4、とりわけ2又は3個のOH置換基があるのが好ましい場合がある。アシル鎖の長さに沿ったこれらのOH置換基の位置付けは、炭素C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、又はより長い鎖ではC25、C26、C27、C28、C29、C30、C31、C32、C33、C34、C35、C36、C37、C38、C39、C30及びそれらの組合せを包含する等、変動し得る。
【0066】
上記の化合物中の二重結合の数は、概して、脂肪アシル鎖の長さによって決まることになり、したがって、C原子の数によって限定される。故に、二重結合の数は、アシル鎖の長さに沿って可変的に位置付けられた、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20、より好ましくは3〜6個の二重結合となり得る。
【0067】
上記の化合物は天然源から単離してよく、又は化学的に合成してもよい。化合物は、生体工学アプローチを介して、例えば、化合物を合成するために必要とされる代謝酵素を含有する遺伝子組み換え細菌又は哺乳類細胞培養物(又はバイオリアクター)の使用によって生成されてもよい。
【0068】
記載した化合物は、許容される担体若しくは賦形剤と一緒に、又は医薬組合せの一部として1若しくは2以上の別々の活性剤若しくは薬物と一緒に、医薬組成物において提供されてもよい。加えて、医薬組成物は、他の薬物又は医薬組成物を用いる治療計画において、別々に、又は合わせた製剤若しくは組合せでのいずれかで投与され得る。
【0069】
本明細書において、式(I)の化合物の組合せも提供される。そのような組合せは、組合せ又は混合物中の種々の化合物の相乗効果又は相加効果によりとりわけ有用となり得る。
【0070】
加えて、式(I)の化合物又はそれを含む組合せは、補給剤、栄養補助食品として調製され得るか、又は健康上の利益のある機能性食品に調製され得る。
【0071】
本発明の組成物は、好ましくは、それを必要とする対象、好ましくはヒトへの投与のために薬学的に許容されるビヒクルとともに製剤化される。そのような組成物の製剤化の方法は当技術分野において周知であり、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985等の標準的な参考テキストにおいて教示されている。本発明の組成物は、単一の化合物又はその組合せを含み得る。
【0072】
本発明の組成物は、単独で、又は第二の薬物若しくは作用物質と組み合わせて投与され得る。
【0073】
本発明において有用であると予想される製剤、例えば静脈内製剤を包含する注射製剤は、滅菌水溶液(水溶性である場合)又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を包含し得るがこれらに限定されない。すべての事例において、組成物は滅菌でなくてはならず、平易なシリンジ注入性(syringability)がある程度に流体でなくてはならない。該組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなくてはならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から守られなくてはならない。ビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等)、それらの適切な混合物、及び油(例えば植物油)を含有する溶媒又は分散媒体であってよい。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の事例においては必要とされる粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。
【0074】
微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成できる。いくつかの事例においては、等張剤、例えば、砂糖、塩化ナトリウム、又はマンニトール及びソルビトール等の多価アルコールを組成物中に包含することが好ましいであろう。注射組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを組成物中に包含することによって実現され得る。
【0075】
滅菌注射溶液は、上記で列挙した成分の1つ又はその組合せを必要に応じて加えた適切な溶媒に、本発明の組成物を必要とされる量で組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製できる。概して、分散液は、塩基性分散媒体及び上記で列挙したものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、本発明の組成物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、本発明の化合物の粉末、及び場合により予め滅菌濾過したその溶液から任意の追加の望ましい成分を生み出す真空乾燥及び凍結乾燥である。
【0076】
本発明の化合物の経口投与のための固体剤形は、摂取可能なカプセル剤、錠剤、丸剤、ロリポップ剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤、舌下又は口腔錠、トローチ剤等を包含するがこれらに限定されない。そのような固体剤形において、化合物は、少なくとも1つの不活性な薬学的に許容される賦形剤若しくは希釈剤又はクエン酸ナトリウム若しくは第二リン酸カルシウム等の同化可能な食用担体、及び/又はa)デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及びケイ酸等の充填剤若しくは増量剤、b)例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及びアカシア等の結合剤、c)グリセロール等の保湿剤、d)寒天、炭酸カルシウム、バレイショ若しくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケート、及び炭酸ナトリウム等の崩壊剤、e)パラフィン等の溶液遅延剤、f)第四級アンモニウム化合物等の吸収促進剤、g)例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート等の湿潤剤、h)カオリン及びベントナイト粘土等の吸収剤、並びにi)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物等の滑沢剤と混合されるか、或いは対象の食事に直接組み込まれる。カプセル剤、錠剤及び丸剤の事例において、剤形は、緩衝剤も含み得る。ラクトース又は乳糖及び高分子量ポリエチレングリコール等の賦形剤を使用する軟及び硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として、同様の種類の固体組成物を用いてもよい。組成物及び調製物中における本発明の化合物のパーセンテージは、当然ながら変動し得る。そのような治療上有用な組成物中における化合物の量は、適切な投薬量が得られるようなものである。
【0077】
錠剤、糖衣丸、カプセル剤、丸剤及び顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング及び医薬製剤化分野において周知である他のコーティング等、コーティング及び外皮を用いて調製され得る。該剤形は、乳白剤を含有していてもよく、本発明の化合物(複数可)のみを、又は優先的に、腸管のある特定の部分において、場合により遅延方式で放出する組成物のものであってもよい。使用され得る包埋組成物の例は、ポリマー性物質及びワックスを包含する。組成物は、適切ならば、上記で言及した賦形剤の1又は2以上を加えた、マイクロカプセル化形態のものであってもよい。
【0078】
経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤を包含する。本発明の化合物に加えて、液体剤形は、例えば、水、又は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(特に、綿実、ラッカセイ、コーン、胚芽、オリーブ、ヒマシ及びゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物等の他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤等、当技術分野において一般に使用される不活性希釈剤を含有し得る。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化及び懸濁化剤、甘味、香味及び着香剤等のアジュバントも包含し得る。
【0079】
懸濁剤は、本発明の化合物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカント、並びにそれらの混合物等の懸濁化剤を含有し得る。
【0080】
したがって、本発明の組成物は、疾患を治療及び/又は予防するために、対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与され得る。組成物は、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、局所、皮下、直腸内、経皮、舌下、口腔内、鼻腔内又は吸入を介してを包含するがこれらに限定されない種々の経路によって投与され得る。投与の製剤及び経路並びに投与の用量及び頻度は、治療されている状態の重症度、並びに年齢、体重等の患者特異的要因に基づいて、当業者により日常的に選択され得る。
【0081】
当業者であれば、Mordenti, Man versus Beast: Pharmacokinetic Scaling in Mammals, 1028, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 75, No. 11, November 1986において論じられている通り、種間薬物動力学的スケーリングを使用して、種の間の薬物の体内動態における根底にある(underlining)類似性(及び差異)を研究すること、未試験の種における薬物の体内動態を予測すること、種々の種における薬物動力学的等価物を定義すること、並びに実験的動物モデルのための投薬レジメンを設計することができると認識する。
【0082】
上記の化合物及び組成物は、炎症及びがん等の炎症に関係する障害の治療に使用され得る。例えば、式(I)の化合物又はそのような化合物を含む組成物は、CRCと診断される、又はCRCを有すると疑われる対象に、該疾患を治療、予防又は緩和するのに十分な量で投与され得る。式(I)の化合物を使用して、IBD、クローン病及び結腸炎等の他の非悪性GI障害を治療又は予防することもできる。
【0083】
化合物及び組成物は、例えば、炎症及びがん等の炎症に関係する障害を予防するためのレジメンにおいて、対象に式(I)の化合物を投与することによる、予防法においても有用となり得る。
【0084】
化合物及び組成物は、hPULCFA欠乏障害(hPDD)とも称される、hPULCFAが欠乏している対象の同定及び診断方法においても使用され得る。そのような対象は、炎症のリスクの上昇、急性炎症を十分に消散できないというリスク、及び/又は炎症に関連する病状を有し得る。同様に、化合物及び組成物を使用して、対象においてhPDDを治療することもでき、ここで、式(I)の化合物又は該化合物を含む組成物は、対象においてhPDDを寛解させるのに十分な量で投与される。
【0085】
1又は2以上の式(I)の化合物は、炎症のマーカーとして、及び抗炎症薬の効果をモニターするためにも使用され得る。
【0086】
上記の方法において使用される生物試料は、例えば、血液(血清/血漿)、脳脊髄液(CSF,cerebral spinal fluid)、尿、便、呼吸、唾液、又は、腫瘍、隣接正常、平滑及び骨格筋、脂肪組織、肝臓、皮膚、毛髪、脳、腎臓、膵臓、肺、結腸、胃等を包含する任意の固形組織の生検であるがこれらに限定されない体内のいかなる場所を発生源とするものであってもよい。特に興味深いのは、血清又はCSFである試料である。本明細書においては用語「血清」が使用されるが、当業者であれば、血漿又は全血若しくは全血の副画分を使用してよいことを認識するであろう。
【0087】
血液試料を患者から抜き取る場合、試料を処理することができる若干の手法がある。処置の範囲は、ほとんどないに等しい(すなわち、凍結全血)か、又は特定の細胞型の単離と同じくらい複雑であってよい。最も一般的且つ日常的な手順は、全血由来の血清又は血漿いずれかの調製を伴う。濾紙又は他の固定材料(immobile materials)等、固相支持体への血液試料のスポッティングを包含するすべての血液試料処理法も、本発明によって企図されている。
【0088】
次いで、上述した処理済みの血液試料をさらに処理して、処理済みの血清試料内に含有される生化学物質の検出及び計測において用いられる系統的分析技術と適合するようにした。処理の種類は、さらなる処理がほとんどないに等しいものから微分抽出及び化学誘導体化と同じくらい複雑なものまで多岐にわたり得る。抽出法は、メタノール、エタノール、アルコールと水との混合物、又は酢酸エチル若しくはヘキサン等の有機溶媒等、一般的な溶媒中での音波破砕、ソックスレー抽出、マイクロ波支援抽出(MAE,microwave assisted extraction)、超臨界流体抽出(SFE,supercritical fluid extraction)、加速溶媒抽出(ASE,accelerated solvent extraction)、加圧液体抽出(PLE,pressurized liquid extraction)、加圧温水抽出(PHWE,pressurized hot water extraction)及び/又は界面活性剤支援抽出(PHWE,surfactant assisted extraction)を包含し得る。HTS分析のために代謝産物を抽出する好ましい方法は、非極性代謝産物を有機溶媒に溶解し、極性代謝産物を水性溶媒に溶解する液液抽出を実施することである。
【0089】
試料を分析するステップは、質量分析計(MS,mass spectrometer)を使用して試料を分析することを含み得る。例えば、限定することを望まないが、そのような質量分析計は、FTMS、オービトラップ(Orbitrap)、飛行時間(TOF,time of flight)又は四重極型のものであってよい。代替として、質量分析計には追加の前置検出器質量フィルターが装備されていてよい。例えば、限定することを望まないが、そのような機器は一般に、四重極FTMS(Q−FTMS,quadrupole-FTMS)、四重極TOF(Q−TOF,quadrupole-TOF)又は三連四重極(TQ又はQQQ,triple quadrupole)と称される。加えて、質量分析計は、親イオン検出モード(MS)又はMSnモード(ここでnは2以上である)のいずれかで操作され得る。MSnは、親イオンが衝突誘起解離(CID,collision induced dissociation)又は他の断片化手順によって断片化されて断片イオンを作成し、次いで前記断片の1又は2以上が質量分析計によって検出される状況を指す。次いで、そのような断片をさらに断片化して、さらなる断片を作成することができる。代替として、試料は、液体若しくはガスクロマトグラフシステムを使用して、又は直接注射によって質量分析計に導入されてもよい。
【0090】
抽出された試料は、当技術分野において公知である任意の適切な方法を使用して分析され得る。例えば、何ら限定することを望まないが、生物試料の抽出物は、直接注射又はそれに続くクロマトグラフ分離のいずれかによって、本質的にいかなる質量分析プラットフォームでも分析を行いやすい。典型的な質量分析計は、試料内の分子をイオン化する源と、イオン化された分子又は分子の断片を検出するための検出器とから構成される。一般的な源の非限定的な例は、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、大気圧化学イオン化(APCI)、大気圧光イオン化(APPI,atmospheric pressure photo ionization)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI,matrix assisted laser desorption ionization)、表面増強レーザー脱離イオン化(SELDI)、及びそれらの派生物を包含する。一般的な質量分離及び検出システムは、四重極、四重極イオントラップ、線形イオントラップ、飛行時間(TOF)、磁気セクター、イオンサイクロトロン(FTMS)、オービトラップ(Orbitrap)、並びにそれらの派生物及び組合せを包含し得る。他のMSベースのプラットフォームを上回るFTMSの利点は、100分の1ダルトンだけ異なる代謝産物の分離を可能にするその高分解性能であり、これより低分解能の機器では多くが見逃されるであろう。
【0091】
用語「代謝産物」が意味するのは、そのレベル又は強度が試料において計測され、病状を診断するためのマーカーとして使用され得る、特異的な小分子である。これらの小分子は、本明細書において、「代謝産物マーカー」、「代謝産物成分」、「バイオマーカー」又は「生化学マーカー」とも称され得る。
【0092】
代謝産物は、概して、上記の方法において使用される質量分析技術によって計測した際の、それらの正確な質量によって特徴付けられる。正確な質量は、「正確な中性質量」又は「中性質量」とも称され得る。代謝産物の正確な質量は、本明細書においては、ダルトン(Da,Daltons)、又はそれと実質的に同等の質量で表示される。「それと実質的に同等の」が意味するのは、正確な質量における±5ppmの差異が、当業者によって認識されるであろうものと同じ代謝産物を指示することである。正確な質量は、中性代謝産物の質量として表示される。当業者によって認識されるであろう通り、試料の分析中に発生する代謝産物のイオン化、代謝産物は、1又は2以上の水素原子の損失又は獲得及び電子の損失又は獲得のいずれかを引き起こすことになる。これは、正確な質量を、イオン化中に損失若しくは獲得した水素(又は、ナトリウム、カリウム、アンモニア、及び当技術分野において公知の他のもの等の他の付加物)及び電子の質量分だけ正確な質量と異なる「イオン化された質量」に変化させる。別段の指定がない限り、本明細書においては正確な中性質量を参照する。
【0093】
同様に、代謝産物をその分子式によって記述する場合、中性代謝産物の分子式を表示する。必然的に、イオン化された代謝産物の分子式は、イオン化中に損失又は獲得した水素(又は、ナトリウム、カリウム、アンモニア、及び当技術分野において公知の他のもの等の他の付加物)の数だけ中性分子式と異なることになる。
【0094】
分析中にデータを収集し、1又は2以上の代謝産物について定量的データを得る。「定量的データ」は、試料中に存在する特異的な代謝産物のレベル又は強度を計測することによって得られる。
【0095】
定量的データを、1又は2以上の標準試料由来の対応するデータと比較する。「標準試料」は、特定の病状又は状態に適切な任意の標準試料である。当業者によって理解されるであろう通り、定量的データとの比較に2以上の標準試料を使用してよい。
【0096】
試料を分析するステップは、上述した通りであってよい。1又は2以上の標準試料は、対照個体から得られた第一の標準試料であってよい。「内部対照代謝産物」は、対象又は患者において自然に存在する内因性代謝産物を指す。病状又は状態によって変動しない任意の適切な内因性代謝産物は、内部対照代謝産物として使用され得る。
【0097】
代謝産物マーカー対内部対照代謝産物の比の使用によって、本明細書において記載されている方法のある特定の実施形態において、代謝産物マーカーの絶対レベルの計測よりも安定且つ再現性のある計測を提供できる。内部対照代謝産物がすべての試料中に自然に存在し、且つ病状によって有意に変動しないように思われるため、試料間の可変性(取扱い、抽出等による)は最小化される。
【0098】
定義
用語「有効量」は、例えば研究者又は臨床医が求めている組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を引き出す、化合物、薬物又は医薬品の量を意味する。さらに、用語「治療有効量」は、そのような量を受けていない対応する対象と比較した際に、疾患、障害若しくは副作用の治療、治癒、予防若しくは寛解の改善、又は疾患若しくは障害の進行速度の減少をもたらす任意の量を意味する。該用語は、その範囲内に、正常な生理学的機能を増強するために有効な量も包含する。
【0099】
「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」は、−OHを指す。
【0100】
「医薬品」又は「薬物」は、対象に適正に投与される場合、望ましい治療効果又は予防効果を誘導することができる化学化合物又は組成物を指す。
【0101】
すべての化学化合物は、(+)及び(−)立体異性体の両方、並びに(+)又は(−)立体異性体のいずれかを包含する。
【0102】
本明細書における他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1985)及びThe Condensed Chemical Dictionary (1981)によって例示される通り、当技術分野における従来の用法に従って使用される。
【0103】
下記の実施例において、本発明をさらに例証する。
[実施例]
【0104】
1.CRC患者におけるhPULCFAの血清中レベルの低減
材料及び方法
患者試料選択
第一の発見プロジェクトに使用される臨床試料は、Genomics Collaborative, Inc.(GCI)社から入手し、一方、第二の発見プロジェクト及び1つのバリデーションプロジェクトのための試料はSeracare Lifesciences社から入手した。これらの会社は、特に研究を目的とした血清及び組織試料の収集及び貯蔵を専門としている。標準化されたプロトコール及び操作手順を使用して、グローバルイニシアチブの一部としての医師団により、一貫した方式で試料を収集し、処理し、貯蔵した。すべての試料は適正に承認され、臨床プロトコールは倫理審査委員会によって認可された。発見及びバリデーションコホートの両方について、GCI社及びSeracare社のバイオバンクからの患者試料選択のための試験対象患者基準は、外科手術、化学又は放射線療法を包含するあらゆる形態の治療の前に血清を採取することであった。すべての試料に、GCI社及びSeracare社において認定された病理学者によって独立に検証された詳細な病理報告書が添付されていた。GCI社製発見試料セットは、40の前治療CRC患者及び50の対照由来の血清試料を包含し、Seracare社製発見セットは、26の前治療CRC及び25の対照由来の試料を包含し、バリデーションSeracare社製セットは、70の前治療CRC及び70の対照を包含していた。大阪医科大学によって提供された発見試料は、同学の標準的な収集プロトコールに従って事前に収集され、適正に承認された、46の手術前CRC患者及び35の対照を包含していた。Chiba Japanバリデーション集団の試料は、40の手術前CRC患者及び40の対照を包含しており、同じく倫理審査プロトコール及び適正な承認下で事前に収集された。病期分類を包含する集団の概要を表1に示す。すべての試料を無作為方式で処理及び分析し、分析後に結果を非盲検化した。
【0105】
【表1】

【0106】
試料抽出
血清試料を分析のために解凍するまで−80℃で貯蔵し、1度だけ解凍した。すべての抽出を氷上で実施した。FTICR−MS分析のために、最初に等体積の血清を1%アンモニア水溶液及び酢酸エチル(EtOAc,ethyl acetate)で順次に3回抽出することによって、血清試料を調製した。抽出の合間に、試料を4℃、3500rpmで10分間遠心分離し、有機層を除去し、新たなチューブに移した(抽出物A)。第三のEtOAc抽出後、0.33%ギ酸を添加し、続いてもう2回EtOAc抽出を行った。最後の有機抽出の後、残った水性成分を水で2回さらに抽出し、3:1アセトニトリルでの沈殿によってタンパク質を除去した(抽出物B)。次いで、1:5比のEtOAc対ブタノール(BuOH)を窒素下で元のBuOH出発体積に濃縮した(抽出物C)。すべての抽出物を、FTICR−MS分析まで−80℃で貯蔵した。
【0107】
FTICR−MS分析
試料抽出物(画分C)を、ネガティブESIのためにメタノール:0.1%(v/v)アンモニア水溶液(50:50、v/v)中で10倍希釈した。APCIのために、画分A試料抽出物を希釈することなく直接注射した。分析はすべて、7.0T能動的遮蔽超電導磁石が装備されているBruker Daltonics APEX III FTICR-MS(Bruker Daltonics社製、Billerica、MA)で実施した。試料は、ESI及びAPCIを使用して1時間当たり600μLの流速で直接注入した。セリン、テトラ−アラニン、レセルピン、Hewlett-Packard社製チューニングミックス及び副腎皮質刺激ホルモン断片4〜10の標準ミックスを使用して、イオン移動/検出パラメーターを最適化した。加えて、機器製造業者の推奨に従って、イオン強度及び100〜1000amuの質量範囲にわたる広帯域蓄積を最適化するように機器条件を合わせた。上記で言及した基準物質の混合物を使用して、100〜1000amuの取得範囲にわたる質量精度の各試料スペクトルを内部較正した。線形最小二乗回帰線を使用してFTICRデータを分析し、各内部標準の質量ピークがその理論的質量と比較して1PPM未満の質量誤差を有するように質量軸値を較正した。Bruker Daltonics Inc.社製XMASS(商標)ソフトウェアを使用して、1メガワードのデータファイルサイズを取得し、2メガワードにゼロ埋めした。SINmデータ変換は、フーリエ変換及び振幅算出の前に実施した。各分析からの質量スペクトルを統合し、各ピークの正確な質量及び絶対強度を含有するピークリストを作成した。100〜1000m/zの範囲内の化合物を分析した。異なるイオン化モード及び極性にわたってデータを比較しまとめるために、水素付加物形成を想定して、検出されたすべての質量ピークをそれらの対応する中性質量に変換した。次いで、DISCOVAmetrics(商標)ソフトウェア(Phenomenome Discoveries Inc.社製、Saskatoon、SK、Canada)を使用して、自己生成した二次元(質量対試料強度)アレイを作成した。複数ファイルからのデータを統合し、次いで、この合わせたファイルを処理して、固有の質量をすべて決定した。各固有の質量の平均を決定し、y軸に表した。各ファイルについて、分析するために初めに選択した各ファイルにカラムを作製し、x軸に表した。次いで、選択されたファイルのそれぞれにおいて見られる各質量の強度を、その代表的なx,y座標に入れた。強度値を含有しない座標は、ブランクのままとした。次いで、スペクトルのそれぞれをピーク選別して、検出されたすべての代謝産物の質量及び強度を得た。次いで、すべてのモード由来のデータを併合して、1試料当たり1つのデータファイルを作成した。90すべての発見血清試料由来のデータを併合し、整列化して、各試料がカラムによって表され、各固有の代謝産物が単一の行によって表され、アレイ中の各セルが所与の試料の代謝産物強度に対応する、二次元代謝産物アレイを作成した。次いで、アレイ表を、「統計分析」において記載されている統計分析に使用した。
【0108】
フルスキャンQ−TOF及びHPLC接続タンデム質量分析
5つのCRC及び5つの健常者試料由来の酢酸エチル抽出物を窒素ガス下で濃縮し、70μLのイソプロパノール:メタノール:ギ酸(10:90:0.1)中で再構成した。フルスキャン用には10μL、MS/MS用には30μLの再構成した試料を、1ml/分の流速でHPLC(HP 1100、Agilent Technologies社製 Hypersil(商標) ODS 5μm、125×4mmカラム)に供した。HPLCからの溶離液を、APCI源が装着されたABI社製QSTAR(登録商標)XL質量分析計を使用してネガティブモードで分析した。フルスキャンモードにおけるスキャン型は、蓄積時間1.0000秒、質量範囲50〜1500Da、及び継続時間55分の飛行時間(TOF)であった。ソースパラメーターは次の通りであった:イオン源ガス1(GS1,Ion source gas 1)80;イオン源ガス2(GS2,Ion source gas 2)10;カーテンガス(CUR,Curtain gas)30;ネブライザー電流(NC,Nebulizer Current)−3.0;温度400℃;クラスタ分離電位(DP,Declustering Potential)−60;集束電圧(FP,Focusing Potential)−265;クラスタ分離電位2(DP2,Declustering Potential 2)−15。MS/MSモードにおいて、スキャン型は生成物イオンであり、蓄積時間は1.0000秒であり、スキャン範囲は50〜650Daであり、継続時間は55分であった。ソースパラメーターはすべて上記と同じであり、−35Vの衝突エネルギー(CE,collision energy)及び5psiの衝突ガス(CID,collision gas、窒素)を用いた。MS3作業では、励起エネルギーを180Vに設定した。
【0109】
CRCバイオマーカーの予備単離及びNMR分析
薄層クロマトグラフィー法では、すべての化学物質及び培地をSigma-Aldrich Canada Ltd.社、Oakville、ONから購入した。溶媒はすべてHPLC等級であった。分析用TLCは、プレコートシリカゲルTLCアルミニウム板(EM science社製、Kieselgel 60 F254、5×2cm×0.2mm)上で行った。化合物を、UV光(254/366nm)下で、又はヨウ素蒸気槽に入れて、1%(w/v)硫酸セリウム及び4%(v/v)HSOを含有する5%(w/v)リンモリブデン酸水溶液中にプレートを浸漬することによって可視化し、続いて加熱した。NMRスペクトルをBruker社製Avance質量分析計で記録し、δ値は、H(500MHz)についてはCDCl(7.24ppmにおけるCHCl)を基準とし、13C NMR(125.8MHz)についてはCDCl(77.23ppm)を基準とした。
【0110】
市販の血清の酢酸エチル抽出物(180mLの血清、500mgの抽出物)を、ステップ勾配溶離;アセトニトリル−水 25:75〜100%アセトニトリルを用いる逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーに供した。収集した画分を、LC/MS及びMS/MSによって分析した。CRCバイオマーカーを含有する画分をプールした(12.5mg)。この手順を数回繰り返して、約60mgのCRCバイオマーカーに富む画分を得た。次いで、この合わせた試料を、ステップ勾配溶離;ヘキサン−クロロホルム−メタノールを用いるFCCに供し、収集した画分をLC/MS及びMS/MS分析に供した。バイオマーカーに富む画分で標識した試料A(5.4mg、約65%)を、NMRによって分析した。次いで、試料A(3mg)を過剰なエーテルジアゾメタンで処理し、終夜室温に保った。溶媒の除去後、試料をNMRによって分析した。
【0111】
三連四重極多重反応モニタリング(TQ−MRM)方法論
抽出前に10ug/mlの[13]コール酸を血清に添加しておき、非標的FTICR−MS分析について記載されている通りに血清試料を抽出した(36nMの[13]コール酸の最終酢酸エチル濃度をもたらした。各試料の分析には、酢酸エチル有機画分を使用した。Randox社製血清抽出物由来の酢酸エチル中の一連の[13]コール酸希釈物を使用して、0.00022ug/ml〜0.222ug/mlの範囲の標準曲線を生成した。100uLの試料を、APCIプローブ付きのTurboV(商標)源が装備されている4000QTRAP(商標)に、フローインジェクション分析によって注射した。担体溶媒は90%メタノール:10%酢酸エチルであり、APCI源への流速は360uL/分であった。ソースガスパラメーターは次の通りであった:CUR:10.0、CAD:6、NC:−3.0、TEM:400、GS1:15、インターフェイスヒーターオン。「化合物」設定は次の通りであった:入口電位(EP,entrance potential):−10、及び衝突セル出口電位(CXP,collision cell exit potential):−20.0。方法は、C28分子のそれぞれについての1つの親イオン遷移(445.3〜383.4Da、447.4〜385.4Da及び449.4〜405.4Da)、及び内部標準についての単一遷移(408.3〜343.4Da)の多重反応モニタリング(MRM)に基づく。遷移のそれぞれを、250msについて総サイクル時間2.3秒間モニターした。1試料当たりの総取得時間は、およそ1分であった。許容されるすべての分析により、0.98を超える線形回帰方程式についてR2相関係数を示した。3つのC28分子のそれぞれの[13]コール酸等価物は、外挿濃度を0.0148ug/ml(36nM、各試料の酢酸エチル抽出物中に存在する理論量)で割って各試料中の[13]コール酸の回収率を決定することによって算出した。次いで、[13]コール酸等価物として表される代謝産物濃度を外挿し、回収率で割って正規化し、適切な抽出希釈因子を乗じて最終血清濃度を生み出した。
【0112】
統計分析
FTICR−MS正確な質量のアレイアライメントは、DISCOVAmetrics(商標)バージョン3.0(Phenomenome Discoveries Inc.社製、Saskatoon)を使用して実施した。Microsoft(商標)社製Office Excel(商標)2007及び三連四重極MRMデータの分布分析を使用して、FTICR−MSデータの統計分析及びグラフ化を行い、JMPバージョン8.0.1を使用して分析した。メタ分析(Fisherの逆カイ二乗法)は、SAS 9.2及びR 2.9.0を使用して行った。CRCと対照との間の有意性の決定に、対応のないStudentの両側t−検定(Two-tailed unpair Student’s t-Test)を使用した。p<0.05値は有意とみなした。JROCFIT(www.jrocfit.org)の連続データモードを使用して、ROC曲線を生成した。
【0113】
結果
FTICRメタボロミクスプロファイリング
記載した研究の実験ワークフローを図1にまとめる。治療未経験のCRC患者及び健常な対照の3つの独立な集団由来の血清の非標的メタボロミクスプロファイル(表1にまとめる)を24か月間にわたって生成した(すなわち、各研究をおよそ12か月ずつ分離した)。第一の研究は、Genomics Collaborative, Inc(GCI)社から取得された40のCRC患者及び50の対照対象を含み、第二の研究は、Seracare Lifesciences Inc社から取得された26のCRC対象及び25の対照を含み、第三の研究は、大阪(Monden et al)において事前に収集された46のCRC及び35の対照を包含するものであった。すべての事例において、液体抽出過程を介して血清代謝産物を捕捉し(上記の方法を参照)、続いて、FTICR質量分析計においてネガティブエレクトロスプレーイオン化(nESI,negative electrospray ionization)及びネガティブ大気圧化学イオン化(nAPCI,negative atmospheric pressure chemical ionization)を使用して、抽出物の直接注入を行った。各研究についてすべての対象の生じたスペクトルデータを1PPMの質量精度内で整列化し、バックグラウンドピークを減じ、カスタムインフォーマティクスソフトウェア(custom informatics software)を使用して試料特異的なスペクトルピークそれぞれの強度を含む二次元アレイ表を作成した(上記の方法を参照)。3つの独立な研究についてCRC患者と対照プロファイルとの間の代謝の差異を、図2A〜2Cに示す通りの検出された質量範囲にわたって対照平均値の正規化した対数比ピーク強度をプロットすることによって可視化した。各独立な研究において、およそ440〜600Daのスペクトル領域は、CRC患者における強度が対照と比べて一貫して低減するピークを示した(図2における緑色、黄色、橙色及び赤色の点)。平均して、この質量のクラスターは、対照と比較してCRC患者の血清における50%〜75%の低減を示し、各研究においてp値は1×10−5以下であった。
【0114】
各研究からのp値に基づいて上位50の質量をランク付けし、それらを、表2に示す通りの他の研究において有意な差異(CRCと対照との間のpが0.05未満)を示す質量と比較することによって、発見研究それぞれの間の重複をさらに調査した。例えば、GCI社製発見セットにおいて最も低いp値を有する上位50の代謝産物のうち46(92%)は、Seracare社製1データセットにおいて有意に異なることも分かり、一方、大阪データセットにおいてp<0.05を有する50のGCI社製質量のうちの31も検出された。同じように、大阪の研究における上位50の代謝産物は、88%及び94%の冗長性を示し、GCI社及びSeracare社1の研究においては代謝産物はそれぞれp<0.05を示した。これらの結果は、3つの研究全体にわたって有意に識別される質量の間における極めて高度の共通性を指示しており、実際に、他2つの研究の少なくとも1つの上位50以内に、各研究における上位50の質量の63%も存在していた(表2.1を参照)。上位50にランク付けされた質量のうち、2以上の研究において同定されたもののみが、上記で強調表示されている440〜600Daの質量範囲内に存在することが分かり、この領域外において、研究の任意の2つにおけるCRCと対照との間で有意に異なる単一ピークは検出されなかった。3つすべての研究において排他的に検出された代謝の差異のフィルタリング(並びにESI及びAPCIの両方において検出されたC13同位体ピーク及び冗長な質量の除去)により、表3に示す通りの個々の12C代謝産物を表す13の質量をもたらした。質量は、各研究内の患者試料全体にわたって同様の発現プロファイルを呈し、それらが関係し得ることを示唆した(Pearsonの相関係数によって評価した際;図示せず)。446及び448の公称質量を有する2つの最小分子量の分子の棒グラフを図3に示す。代謝産物の低減と病期との間の相関は、ほとんど又は全く観察されず(図3A及び3B)、受信者動作特性曲線分析は、合わせた全期について3つすべての研究にわたって0.91±0.03の平均化曲線下面積(AUC,area under-the-curve)をもたらした(図3C;個々のAUCを示す)。
【0115】
次いで、妥当な分子式の計算的帰属を、上記で同定された13の質量について行った。帰属は、精密な予測を高い質量精度に依存する、前述した通りの一連の数学的及び計量化学的規則(Aharoni A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, Maliepaard CA, Kruppa G, Bino R, Goodenowe DB. Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics 2002;6:217-34)に基づく。アルゴリズムは、炭素、水素、酸素及び他の元素の数をそれらの厳密な質量に基づいて計算し、それを定義された制約内の検出された正確な質量に帰属することができる。表3中の質量について論理上推定分子式を計算し、28、30、32又は36個の炭素及び4〜6個の酸素のいずれかを含有する元素組成をもたらした。種々の形態の脂溶性ビタミン、ステロイド及び脂肪酸を包含する若干のクラスの代謝産物は、理論的にはこれらの元素組成に当てはまる。本発明者らは、後続の項においてこの情報を使用して、構造比較研究のために適切な分子を選択した。集合的に、結果は、CRC患者の血清における、長さ28〜36炭素の範囲をとる有機的に可溶性の酸素化代謝産物の、対照と比較して一貫した50%〜75%の低減を指示した。
【0116】
【表2】

【0117】
【表3】

【0118】
【表4】

【0119】
HPLC接続タンデム質量分析
上述したFTICR−MS作業において使用したGCI社製コホート由来の血清の選択される酢酸エチル抽出物を、四重極飛行時間(Q−TOF)質量分析計と接続されたHPLCを使用して、フルスキャンAPCIネガティブイオンモードで再分析した。FTICR−MS結果と一致して、逆相HPLC後、16〜18分の保持時間で、およそ440〜600Daのピークのクラスターが無症候性対照の血清において検出されたが、CRC患者の血清には存在しなかった(図4)。6つすべてのC28バイオマーカー(m/z446、m/z448、m/z450、m/z464、m/z466及びm/z468)由来の分子イオン、並びに残ったC32及びC36マーカーの多くは、正常血清クラスター内で検出可能であった。16〜18分の保持時間内で最大400Daの抽出された質量は、両方の集団において、他の保持時間における抽出質量スペクトル(図示せず)と同様のピーク強度を示し(図4、枠の右側の領域)、CRC患者の血清に対するこの枯渇した代謝領域の特異性を強化した。
【0120】
次に、6つのC28バイオマーカー(表4、図7〜12も参照)並びにより高度なC32及びC36バイオマーカー(表4.1を参照)について、タンデム質量分光断片化フィンガープリントを生成した。6つのC28バイオマーカーのMS/MS及びMS3断片化データは、HOの損失(m/z427、429、431、445、447及び449)、HOの2分子の損失(m/z409、411、413、427、429、431)、COの損失(m/z401、403、405、419、421、423)、並びにCO及びHOの損失(m/z383、385、387、401、403、405)により生じたピークによって支配されており、カルボン酸官能基及び2個以上のヒドロキシル基の存在を指示するものであった。分子式、分子の有機特性及びタンデムMSデータに基づいて、本発明者らは、代謝産物が、レチノール及びレチノイン酸(ビタミンA)、カルシフェロール(ビタミンD)、トコフェロール(ビタミンE)、フィロキノン(ビタミンK)等の脂溶性ビタミン、ステロイド若しくは胆汁酸、又は長鎖多価不飽和ヒドロキシ脂肪酸を包含する1又は2以上の可能なクラスの分子の誘導体又はアナログであり得ると仮定した。したがって、タンデム質量分光断片化フィンガープリントを、基準物質5S,6S−(7E,9E,11Z,14Z)−ジヒドロキシエイコサテトラエン酸(1)、15S−ヒドロキシ−(5Z,8Z,11Z,13E)−エイコサテトラエン酸(2)及び8R−ヒドロキシ−(5Z,9E,11Z,14Z)−エイコサテトラエン酸(3)、α−トコフェロール(4)γ−トコフェロール(5)、13−(6−ヒドロキシ−2,7,8−トリメチルクロマン−2−イル)−2,6,10−トリメチルトリデカン酸(6)、16−(4,5−ジメチル−3,6−ジオキソシクロヘキサ−1,4−ジエニル)−2,6,10,14−テトラメチルヘキサデカン酸(7)、6−ヒドロキシ−2,7−ジメチル−2−(4,8,12−トリメチルトリデシル)クロマン−8−カルバルデヒド(8)、6−ヒドロキシ−2,7−ジメチル−2−(4,8,12−トリメチルトリデシル)クロマン−8−カルボン酸(9)、カルシフェロール(10)、コレカルシフェロール(11)、エルゴステロール(12)、フィロキノン(13)、レチノール(14)及び3β,7α−ジヒドロキシ−5−コレスタン酸(15)について生成した(表5)。生じたMS/MSデータは、ビタミンA、D、E、K、及びステロイド性分子(4〜15)について、メタボロミクスバイオマーカーのいずれとも類似性を示さず;ビタミンE型分子について、いずれもそれらのクロマン環の診断用断片の特徴(4、5、6、7、8及び9についてそれぞれm/z163、149、149、149、163及び179)を有しており、ビタミンD及びアナログについて、診断用断片が側鎖の損失の結果として形成され(10、11及び13についてそれぞれm/z271、273及び253)、フィロキノン(13)について、診断用断片m/z187は、キノン環系について顕著であり、ビタミンA(14)について、断片m/z269(M+H−HO)は、シクロヘキシル環部分を損失してレチノールの診断用m/z145を形成し、3β,7α−ジヒドロキシ−5−コレスタン酸(15)について、m/z277の診断用レトロディールス・アルダー断片が観察された。これに加えて、15のようにプレグナン環系を有する他のカルボン酸基準物質(例えば、ケノデオキシコール酸及びコール酸)は、MS/MS断片化時にCOの損失を示さない(図示せず)。しかしながら、ヒドロキシ脂肪酸基準物質1、2及び3のMS/MS断片化データ(表5)は、CRCバイオマーカーのMS/MSによって生成されるものと同様の、且つ種々の水酸化長鎖脂肪酸について他によって記載されたもの(Hong S, Gronert K, Devchand PR, Moussignac RL, Serhan CN. Novel docosatrienes and 17S-resolvins generated from docosahexaenoic acid in murine brain, human blood, and glial cells. Autacoids in anti-inflammation. J Biol Chem 2003; 278:14677-87、Hong S, Lu Y, Yang R, Gotlinger KH, Petasis NA, Serhan CN. Resolvin D1, protectin D1, and related docosahexaenoic acid-derived products: Analysis via electrospray/low energy tandem mass spectrometry based on spectra and fragmentation mechanisms. J Am Soc Mass Spectrom 2007; 18:128-44、Serhan CN, Hong S, Gronert K, Colgan SP, Devchand PR, Mirick G, Moussignac RL. Resolvins: a family of bioactive products of omega-3 fatty acid transformation circuits initiated by aspirin treatment that counter proinflammation signals. J Exp Med 2002; 196:1025-37、Lu Y, Hong S, Yang R, Uddin J, Gotlinger KH, Petasis NA, Serhan CN. Identification of endogenous resolvin E1 and other lipid mediators derived from eicosapentaenoic acid via electrospray low-energy tandem mass spectrometry: spectra and fragmentation mechanisms. Rapid Commun Mass Spectrom 2007; 21:7-22、Murphy RC, Fiedler J, Hevko J. Analysis of nonvolatile lipids by mass spectrometry. Chem Rev 2001;101:479-526)と一致する周辺切断イオン(peripheral cut ions)を示した。例えば、マーカーm/z446は、周辺切断イオン427[M−H−HO]−、401[M−H−CO]−、409[M−H−2HO]−、383[M−H−CO−HO]−及び365[M−H−CO−2HO]−並びに鎖切断イオン、223、205、277等を示した(図5及び図7を参照)。他のC28、C32及びC36代謝産物について同様のイオンが得られた(表4、表4.1を参照)。集合的に、これらの演繹は、メタボロミクスマーカーがビタミンA、D、E、K及びステロイドのアナログである可能性は低く、むしろ数個の不飽和とヒドロキシ基とを含有する長鎖脂肪酸型分子であることを示唆していた。本発明者らは、これらの代謝産物を、ヒドロキシ多価不飽和超長鎖脂肪酸(hPULCFA;ここで、用語「超」は、C30以上の長さの鎖脂肪酸を指すために使用されている(Poulos A, Beckman K, Johnson DW, Paton BC, Robinson BS, Sharp P, Usher S, Singh H.Very long-chain fatty acids in peroxisomal disease. Adv Exp Med Biol 1992; 318:331-40)と総称する。
【0121】
【表5】


【0122】
【表6】

【0123】
【表7】

【0124】
次に、バルク血清抽出物を使用する富化戦略及び2段階フラッシュカラムクロマトグラフィーアプローチ、続いてNMR分析を行って、hPULCFAのさらなる構造的特徴付けを提供した。最初に、水−アセトニトリル溶媒勾配を使用する逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー(FCC,reverse phase flash column chromatography)を実施し、生じた画分をLC/MSによって分析した。hPULCFAを含有する画分(画分9、図14)をプールし、クロロホルム−メタノール混合物を使用する順相FCCに供して、およそ65%の豊かな半精製画分で標識された試料Aを得た(図15参照)。試料AについてのLC及びタンデム質量分光分析(MS2及びMS3)データを使用して、マーカーの富化度を追跡及び確認した。試料A及びそのメチルエステルについての核磁気共鳴(NMR,Nuclear magnetic resonance、H、13C及びD)分析は、sp炭素に付着している水素原子に対する共鳴のいくらかの抑制の観察により、超長鎖多価不飽和ヒドロキシ脂肪酸と一致する共鳴及び相関(表6)を明らかにした。
【0125】
【表8】

【0126】
多重反応モニタリング(MRM)方法論を使用する独立なバリデーション
もう2つの独立な集団におけるタンデム質量分析アプローチ(方法を参照)を使用して、CRC患者の血液中におけるhPULCFAのレベルの低減をさらに確認した。該アプローチは、分析物を定量するための親−娘断片イオン組合せの計測(多重反応モニタリング;MRMと称される)に基づくものである(Zytkovicz TH, Fitzgerald EF, Marsden D, Larson CA, Shih VE, Johnson DM, Strauss AW, Comeau AM, Eaton RB, Grady GF. Tandem mass spectrometric analysis for amino, organic, and fatty acid disorders in newborn dried blood spots: a two-year summary from the New England Newborn Screening Program. Clin Chem 2001; 47:1945-55、Johnson DW, Trinh MU. Analysis of isomeric long-chain hydroxy fatty acids by tandem mass spectrometry: application to the diagnosis of long-chain 3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase deficiency. Rapid Commun Mass Spectrom 2003; 17:171-5)。本発明者らは、方法において記載されている通り、4個の酸素を有する28の炭素hPULCFA(親質量446、448及び450;それぞれ、C2846、C2848及びC2850)のうち3つを計測するためのアッセイを開発した。hPULFAの標識した基準物質の合成は分析時において依然進行中であったため、結果は、内部標準として各試料にスパイクされた[13]コール酸の等価物(CAEs,equivalents to [13C1]cholic acid)として報告する。第一の研究は、70の治療未経験のCRC対象及び70のマッチング対照を含み、その全員が米国出身の白色人種であった。各対象について3つの28炭素hPULCFAのCAEs(公称質量446、448及び450に従って命名される)を図5Aに示す。代謝産物のそれぞれの、対照と比較して有意に低いレベル(p<0.001、図5Aに示される実際の値)が、治療未経験のCRC陽性対照において観察された。ROC分析は、28炭素含有hPULCFAのそれぞれについて、0.87±0.005のAUCをもたらした(図5B)。病期ごとに患者をプロットすることにより、第I〜III期にわずかなさらなる低減を示し、7人の対象のみであるが、第IV期の対象が最小の低減を示した(図5C及び5D)。期ごとの28炭素プールの対応する平均AUCは、第I期について0.87、第II期について0.88、第III期について0.94、及び第IV期について0.66であった。
【0127】
本発明者らは次に、Chiba, JapanのCRC及び対照対象の別の独立な集団(Nomura et al)を特徴付けるためにMRM法を使用した。40の前治療CRC対象及び40の対照由来の血清を分析し、CRC陽性群において有意な低減が再度観察された(図6A)。3つの代謝産物について対応する平均AUCは、0.97±0.014であった(図6B)。この研究において、第I、II及びIII/IV期の間のすべての比較について、該期との有意な相関(p<0.05)が観察された(図6C及び6D)。期ごとのAUCは、第I期について0.93、第II期について0.97、及び第III/IV期について1.0であった(2つの第IV期は第III期と同グループにした;図6D)。
【0128】
考察
本明細書において記載されているのは、ヒドロキシル及びカルボキシル官能部分を持ち、且つ、健常な無症候性対照と比較して治療未経験のCRC患者の血清における28〜36炭素の低減を含有する、長鎖炭化水素ベースの代謝産物の発見及び予備構造的特徴付けである。高分解能FTICR−MSをバイオマーカー発見のためのフローインジェクション技術と併せて使用し、該技術を3つの独立な被験集団に適用することによって、非標的メタボロミクスの有用性を試験した。多くの場合、バイオマーカーの性能をバリデートするために単一の試料セットを半分に分割することによって使用され(Lim JY, Cho JY, Paik YH, Chang YS, Kim HG. Diagnostic application of serum proteomic patterns in gastric cancer patients by ProteinChip surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Int J Biol Markers 2007; 22:281-6、Su Y, Shen J, Qian H, Ma H, Ji J, Ma L, Zhang W, Meng L, Li Z, Wu J, Jin G, Zhang J, Shou C. Diagnosis of gastric cancer using decision tree classification of mass spectral data. Cancer Sci 2007; 98:37-43、Chen YD, Zheng S, Yu JK, Hu X. Artificial neural networks analysis of surface-enhanced laser desorption/ionization mass spectra of serum protein pattern distinguishes colorectal cancer from healthy population. Clin Cancer Res 2004; 10:8380-5)、多くの場合、複合アルゴリズムに依存し(総説Ringner M, Peterson C, Khan J. Analyzing array data using supervised methods. Pharmacogenomics 2002; 3:403-15を参照)且つバイアスをもたらし得る(Baggerly KA, Morris JS, Coombes KR. Reproducibility of SELDI-TOF protein patterns in serum: comparing datasets from different experiments. Bioinformatics 2004; 20:777-85)「訓練/試験セット」アプローチとは対照的に、本発明者らは、世界中のいくつもの場所から収集された異なる人種的バックグラウンドの、症例にマッチングさせた3つの別々の試料セット及び対照について完全に独立な発見分析を行って、高度のロバスト性及びサンプリングバイアスの最小限の可能性を確実にした。大阪セットにおいて発見された上位50の代謝識別子(metabolic discriminators)のうちの44及び47も、それぞれGCI社製及びSeracare社製セットにおいて有意に変化した。この異例の研究協定は、非標的FTICR−MS技術が再現性のあるバイオマーカー発見原動力であることだけでなく、その疾患に関係するメタボロミクス変化が、地理的な位置及び民族全体にわたって高度に保存され得ることを示している。この簡易化法を2つのさらなる独立な被験集団に対して使用して、2つのバイオマーカー候補のための標的TQ−MRM法を開発し、次いで3つのFTICR−MS研究から生成されたROC AUCを、TQ−MRM法から生成されたROC AUCと比較することによっても、非標的FTICR−MS発見の簡易アッセイへの移行を試験した。簡易化法を使用して、同様の結果が得られた。222の治療未経験のCRC患者試料及び220の疾患のない無症候性対照を集合的に含む、合計で5つの独立な研究集団を、2つの異なる分析法を使用して評価した。実際のところ、hPULCFAの低減と、CRCが試料の5つの独立なセット全体にわたって偽陽性結果であることとの間の報告されている関連の可能性は、天文学的に低い。偽陽性率について、Fisherの逆カイ二乗法(P=−2Σi=1log p>CであればHを棄却;p=5つの独立な試料のP値、k=5つの異なる試料、C=2k自由度を有するカイ二乗分布の上側(X0.05,10=18.31))を使用してメタ分析を実施した(L.V. H. Meta-Analysis. Journal of Educational Statistics 1992; 17:279-296、Fisher RA. Statistical methods for research workers Oliver & Boyd, 193)。メタ分析に基づいて、マーカー446及び448について生じたp値は、それぞれ2.96×10−47及び8.11×10−49で、個々のp値よりも有意であった。したがって、本発明者らは、これらの代謝産物の低減がCRCの存在と相関していると強く確信して言うことができる。
【0129】
FTICR−MSは、抽出、イオン化、及び統計的相関情報と連動する正確な質量に基づいて、確信できる分子式予測に十分な分解能を提供した。多元素組成物は、理論的には所与のバイオマーカー質量に帰属可能であるが、28〜32個の炭素及び4〜6個の酸素を有する式だけが、発見セットの2又は3つにおいて検出される一般的な質量に一貫して帰属可能であった。hPULCFAの試料間の発現プロファイルの間の高度の統計的相互作用(すなわち、対象全体にわたるマーカーの相対強度間における高度の相関)を考慮して、本発明者らは、それらがすべて同じ代謝系の一部であり、しがって関係する組成物を示すはずとの疑いを抱いた。ネガティブイオン化モードにおける検出は、窒素が組成物のいずれかにおいて存在する可能性も低減させた。水及び二酸化炭素の顕著な損失を示すタンデム質量分析と連動するこの情報は、表3及び表2.1に示す分子式を本発明者らが確信を持って提案することにつながった。理論的には該分子式のクラスに当てはまる複数の候補クラスの分子も、タンデムMSを使用して除外した。例えば、本発明者らは、ステロイド又はビタミンD中のもの等の縮合環系を指示する断片も、ビタミンEトコフェロールにおいて観察されるもの等のクロマン環系を指示する断片も観察しなかった。ビタミンK及びレチノール、並びにコール酸及び3β,7α−ジヒドロキシ−5−コレスタン酸等の胆汁酸を包含する若干の他のクラスの分子も、類似の断片化パターンを示さなかった。しかしながら、断片化パターンにおける、特に、CO及びHOの損失により生じた娘イオンの相対存在量と、hPULCFAから公知のヒドロキシ脂肪酸基準物質並びにレソルビン及びプロテクチン等の文献において報告されている他の脂肪酸までの鎖切断イオン(以下で論じる)とにおける類似性は、水酸化直鎖脂肪酸型種を示唆していた。C28シリーズ(質量446、448、450、464、466及び448)についてのタンデムMSデータの検査により、本発明者らがカルボキシ末端鎖断片−CH−CH=CH−CH−CH−COOHを表していると合理的に予測する一貫した113Daの娘イオンが明らかになった。加えて、[M−(CO+HO)]娘イオンからの54の(−CH=CH−CH−CH−)の一貫した損失が446、448、464及び466分子について観察されたが450及び468分子については観察されず、1)450及び468が飽和カルボキシ末端領域を有し得ること、並びに2)分子のこの領域内にヒドロキシル部分がないであろうことを示唆していた。すべてのC28及び他のマーカーのMS/MSデータも、1について観察された通りの1,2−ジオールモチーフを用いて得られる診断用断片を示さず(基準ピークはm/z115における鎖切断イオンである)、フラッシュカラムクロマトグラフィーを介して富化された画分に対するNMRは、δ2.78(二重結合炭素間のメチレン中断)及びδ5.12〜5.90(二重結合炭素上の水素原子)におけるH NMRシグナルについて得られる、期待される積分値よりも低い値を示した。累積的に、これらの結果は、分子中のヒドロキシ基が、sp炭素とカルボキシ末端から少なくとも7番目の炭素との間の炭素原子と結合していると思われることを示唆するものであった。
【0130】
構造分析に基づいて、6つのC28バイオマーカーの構造は表6.1において以下に示す通りに提案された。
【0131】
【表9】

【0132】
興味深いことに、本明細書において報告される代謝産物マーカーは、ヒト特異的代謝系を表す。本発明者らは、ラット、マウス及びウシを包含するいくつもの種、並びに、GCI社製発見セットにおける患者からの数々の細胞株、馴化培地、腫瘍及び正常な結腸組織を包含するいくつもの異なる試料源、並びに、種々の種からの脳、肝臓、脂肪及び他の組織由来の血清試料を分析し、そのいずれも、これらのhPULCFAのいかなる検出可能なレベルも示すことがなかった(結果は図示せず)。本発明者らは、飽和C28以上の長さの鎖脂肪酸に富むポリコサノール抽出物を包含する種々の植物組織又は穀類においてこれらの分子を検出することもできなかった(Marinangeli CP, Kassis AN, Jain D, Ebine N, Cunnane SC, Jones PJ. Comparison of composition and absorption of sugarcane policosanols. Br J Nutr 2007; 97:381-8、Wang MF, Lian HZ, Mao L, Zhou JP, Gong HJ, Qian BY, Fang Y, Li J. Comparison of various extraction methods for policosanol from rice bran wax and establishment of chromatographic fingerprint of policosanol. J Agric Food Chem 2007; 55:5552-8)。これは、分子が、特異的p450媒介性及び/又は短命過程(microbiotic processes)等のヒト特異的代謝過程を発生源とすることを示唆している。腫瘍又は正常な結腸組織における検出の欠如は、代謝産物が「腫瘍マーカー」ではなく、第I期がんにおいて高い関連率で組み合わされており、低減が腫瘍量の結果ではないようだということを示唆している。しかしながら、いくつかの後期日本人症例において観察されるレベルのさらなる低減(図6)は、より低レベルのhPULCFAが実際にこの群における進行速度を指示するとすれば説明できる。本明細書において報告されるすべての対照群において、対象に腫瘍も進行性新生物もないと結腸鏡検査で確認されなかったことに留意することも重要である。Collins et alによる平均リスク対象における結腸鏡検査結果に基づいて、無症候性集団の最大10%が進行性新生物陽性である(Collins JF, Lieberman DA, Durbin TE, Weiss DG. Accuracy of screening for fecal occult blood on a single stool sample obtained by digital rectal examination: a comparison with recommended sampling practice. Ann Intern Med 2005; 142:81-5)。したがって、CRCのリスクがある対象とリスクがない対象とを識別するこれらの代謝産物の能力は、本発明者らの結果において過小評価されていると思われる。
【0133】
ヒドロキシル基を含有するこの長さの脂肪酸分子については今まで報告されていないが、該分子は、急性炎症の消散を促進するのに重大な、n3必須脂肪酸EPA及びDHAをそれぞれ発生源とするレソルビン及びプロテクチンとして公知である水酸化超長鎖脂肪酸のクラスに似ているように思われる。急性炎症を十分に「消散」できないことが、がん(Das UN. Essential fatty acids: biochemistry, physiology and pathology. Biotechnol J, 2006; 1:420-39)及びアルツハイマー病(Das UN. Folic acid and polyunsaturated fatty acids improve cognitive function and prevent depression, dementia, and Alzheimer's disease--but how and why? Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2008; 78:11-9)を包含するいくつもの状態の根底をなす慢性炎症状態の背景にある有力な説である。特に関連性があるのは、IDB、クローン病、結腸炎及び結腸がん等の腸管の炎症性状態に対する消散促進性長鎖ヒドロキシル脂肪酸メディエーターの効果である。レソルビンE1(RvE1)及びリポキシンA4(LXA4,Lipoxin A4)はいずれも、結腸炎症に対する保護効果に関わっているとされてきた。RvE1は、白血球浸潤のブロック、炎症促進性遺伝子発現の減少、一酸化窒素シンターゼの誘導が生存率及び体重の持続における改善に付随して起こる、マウスにおける2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸誘導性結腸炎の発症から保護することが示された(Arita M, Yoshida M, Hong S, Tjonahen E, Glickman JN, Petasis NA, Blumberg RS, Serhan CN. Resolvin E1, an endogenous lipid mediator derived from omega-3 eicosapentaenoic acid, protects against 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102:7671-6)。同様に、LXA4アナログは、ヒト結腸におけるケモカイン分泌をエクスビボで減衰させることが示されており(Goh J, Baird AW, O'Keane C, Watson RW, Cottell D, Bernasconi G, Petasis NA, Godson C, Brady HR, MacMathuna P. Lipoxin A(4) and aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A(4) antagonize TNF-alpha-stimulated neutrophil-enterocyte interactions in vitro and attenuate TNF-alpha-induced chemokine release and colonocyte apoptosis in human intestinal mucosa ex vivo. J Immunol 2001; 167:2772-80(、病原誘導性胃腸炎に応答して誘導された遺伝子、特にNFκBによって調節される遺伝子の50%を減衰させた(Gewirtz AT, Collier-Hyams LS, Young AN, Kucharzik T, Guilford WJ, Parkinson JF, Williams IR, Neish AS, Madara JL. Lipoxin a4 analogs attenuate induction of intestinal epithelial proinflammatory gene expression and reduce the severity of dextran sodium sulfate-induced colitis. J Immunol 2002; 168:5260-7)。インビボでは、LXA4アナログはDSS誘導性炎症性結腸炎において腸管の炎症を低減させ、体重損失、血便及び死亡率の有意な低減をもたらした(Gewirtz AT, Collier-Hyams LS, Young AN, Kucharzik T, Guilford WJ, Parkinson JF, Williams IR, Neish AS, Madara JL. Lipoxin a4 analogs attenuate induction of intestinal epithelial proinflammatory gene expression and reduce the severity of dextran sodium sulfate-induced colitis. J Immunol 2002; 168:5260-7)。構造的に、レソルビン及びプロテクチン(n6リポキシンも)は、種々のリポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ及びp450酵素によって触媒される親VLCFAの一、二及び三水酸化生成物を含む(Serhan CN. Controlling the resolution of acute inflammation: a new genus of dual anti-inflammatory and proresolving mediators. J Periodontol 2008;79:1520-6、Schwab JM, Chiang N, Arita M, Serhan CN. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature 2007; 447:869-74、Serhan CN, Gotlinger K, Hong S, Lu Y, Siegelman J, Baer T, Yang R, Colgan SP, Petasis NA. Anti-inflammatory actions of neuroprotectin D1/protectin D1 and its natural stereoisomers: assignments of dihydroxy-containing docosatrienes. J Immunol 2006; 176:1848-59、Serhan CN. Novel chemical mediators in the resolution of inflammation: resolvins and protectins. Anesthesiol Clin 2006; 24:341-64、Schwab JM, Serhan CN. Lipoxins and new lipid mediators in the resolution of inflammation. Curr Opin Pharmacol 2006; 6:414-20)。
【0134】
本明細書において記載されている診断法の有用性は、CRC患者において一貫して観察されるhPULCFAの低減によって裏付けられる。加えて、ここで報告される症例対照データすべてにわたる平均AUCは0.91±0.04であったが、これは病期のバイアスがほとんど又は全くなく90%の特異性でおよそ75%の感受性に移行するものである。代謝産物が血清において計測されるため、コンプライアンスは高くあるべきであり、試験は、代謝試験の先天異常と同様の方式で標準的な三連四重極質量分析計等によりコスト効率よく実行され得る(Zytkovicz TH, Fitzgerald EF, Marsden D, Larson CA, Shih VE, Johnson DM, Strauss AW, Comeau AM, Eaton RB, Grady GF. Tandem mass spectrometric analysis for amino, organic, and fatty acid disorders in newborn dried blood spots: a two-year summary from the New England Newborn Screening Program. Clin Chem 2001; 47:1945-55)。
【0135】
2.hPULCFAの生物学的役割の分析
材料及び方法
細胞株:SW620、MCF−7及びRAW264.7をATCC社から購入し、高グルコースDMEM、10%FBS中、37℃、5%COで培養した。
【0136】
定量的リアルタイムPCR:処理前日に、RAW264.7細胞を6ウェルプレート中に1×10/ウェルで播種した。翌日、細胞を、異なる濃度のhPUCLFA(D046)又はビヒクル対照として1%FA/DMSO(DMSO)で4時間処理し、各処理は二通りとし、次いで、1μg/mlのLPS(カタログ番号L4391、Sigma社製)で20時間刺激した。Trizol(カタログ番号15596−018、Invitrogen社製)を製造業者の取扱説明書通りに使用して、全RNAを細胞ペレットから単離した。RNAペレットを50μLのDEPC処理水に再懸濁させ、−80℃で貯蔵した。RNAの濃度及び純度を、260及び280nmにおける分光光度法によって決定した。逆転写はqScript cDNA super mix(カタログ番号95048−100、Quanta Biosciences社製)を使用して実施し、PCRはApplied Biosystems社製Step one PlusリアルタイムPCRシステムでFast SYBR Green Master Mix(カタログ番号4385612、AB Applied Biosystems社製)を使用して行った。リアルタイムPCRで使用したプライマーを以下に収載する。各転写物コピーの相対数を、ハウスキーピング遺伝子ベータアクチンによって正規化した。
【0137】
【表10】

【0138】
亜硝酸塩:亜硝酸塩濃度は、Griess試薬(カタログ番号G2930、Promega社製)によって計測した。RAW細胞又はSW620細胞を、リアルタイムPCRにおいて記載されている通りに処理した。馴化培地を亜硝酸塩計測のために収集した。計測は、96ウェルプレート中で製造業者の取扱説明書通りに行った。
【0139】
マウスTNFアルファのELISA:Raw細胞を、リアルタイムPCRにおいて記載されている通りに処理した。馴化培地を収集した。細胞を氷冷PBSで手早く洗浄し、細胞溶解緩衝液(Jerryの処方)で溶解し;Bio-Radタンパク質アッセイ(Bio-Rad社製、Hercules、CA)を使用して、細胞溶解物中のタンパク質を定量した。1ウェル当たり50ulの馴化培地又は100ugの細胞溶解物を使用して、TNFアルファの量を工場の取扱説明書通りに決定した(カタログ番号KMC3011、Invitrogen社製)。
【0140】
マウスIL−1ベータのELISA:Raw細胞を、リアルタイムPCRにおいて記載されている通りに処理した。50ulの馴化培地又は100ugの細胞溶解物を使用して、IL−1ベータの量を工場の取扱説明書通りに決定した(カタログ番号MLB00B、Quantikine社製)。
【0141】
ウエスタン分析:冷蔵PBS中にてラバーポリスマンを用いて100mmの組織培養プレートから細胞を除去し、4℃における遠心分離によって収集し、氷冷細胞溶解緩衝液(50mMのトリスpH7.5、150mMのNaCl、0.1%のNP−40、0.5mMのEDTA、0.1mMのEGTAプラス1X-Sigma哺乳類細胞抗プロテアーゼカクテル)中に100ulで再懸濁させた。いくつもの凍結融解サイクルを使用して細胞を溶解し、続いて、パルス音波破砕及び4℃における高速遠心分離をして、細胞残屑を除去した。ウエスタン分析では、当量のタンパク質(Biorad社製タンパク質試薬を使用するBradford社製タンパク質アッセイによって評価される)をSDS−PAGEによって溶解した。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜(Pall-VWR社製)上にトランスブロットした。0.1%のTween-20を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS,phosphate-buffered saline)中の5%の分子等級の無脂肪の脱脂粉乳(Biorad Laboratories社製、Mississauga ON Canada)を用いて、旋回プレート上4℃で膜を終夜ブロックした。Santa Cruz Biotechnology社製の一次抗体を、1:1000希釈、4℃で終夜インキュベートし、二次HRP抗体を1:10000希釈に室温で30分間適用した。後続の洗浄を同じ緩衝液中で行った。増強化学発光(ECL,enhanced chemiluminescence)検出システム(Dupont-NEN社製)を使用して、抗原/抗体複合物を検出した。ブロットをBioMax化学発光X線フィルム(Kodak社製)に暴露し、ImageJ濃度測定ソフトウェアを用いるHPスキャナー(Scanjet G4010)を使用して、標的シグナルをスキャンし定量した。
【0142】
hPULCFA富化抽出物の産生
hPULCFAを含有する健常ヒト血清の酢酸エチル抽出物(180mLの血清、500mgの抽出物)を、ステップ勾配溶離;アセトニトリル−水 25:75〜100%アセトニトリルを用いる逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーに供した。ここでは、他の同様の抽出法を使用してもよく、精製及び/又は富化を、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に限定されないが、他のクロマトグラフィーアプローチを使用して実施してもよいことに留意されたい。フラッシュカラム画分を収集し、LC/MS及びMS/MSによって分析した。CRCバイオマーカーを含有する画分をプールした(12.5mg)。APCI源が装着されたABI社製QSTAR(登録商標)XL質量分析計を負ネガティブモードで使用するHPLC(HP 1100、Agilent Technologies社製 Hypersil(商標) ODS 5μm、125×4mmカラム)接続飛行時間型質量分析に試料を供することによって、画分をhPULCFAについてモニターした。いかなる同等の質量分析計を使用してもよい。フルスキャンモードにおけるスキャン型は、蓄積時間1.0000秒、質量範囲50〜1500Da、及び継続時間55分の飛行時間(TOF)であった。ソースパラメーターは次の通りであった:イオン源ガス1(GS1)80;イオン源ガス2(GS2)10;カーテンガス(CUR)30;ネブライザー電流(NC)−3.0;温度400℃;クラスタ分離電位(DP)−60;集束電圧(FP)−265;クラスタ分離電位2(DP2)−15。MS/MSモードにおいて、スキャン型は生成物イオンであり、蓄積時間は1.0000秒であり、スキャン範囲は50〜650Daであり、継続時間は55分であった。ソースパラメーターはすべて上記と同じであり、−35Vの衝突エネルギー(CE)及び5psiの衝突ガス(CID、窒素)を用いた。
【0143】
hPULCFAのフラッシュカラム富化の結果は、図16、17及び18において見られる。食事性及び短鎖脂肪酸等の血清成分を除去し、濃縮されたレベルのhPULCFAを含有する半精製抽出物をもたらすことができる。
【0144】
hPULCFAの生物学的活性
hPULCFAの生物学的活性は、A).種々の細胞ベースシステムを使用し、hPULCFA富化抽出物の活性をhPULCFAが枯渇した抽出物と比べて評価すること、並びにB).特異的なhPULCFAを合成し、その活性を決定することによって決定した。
【0145】
80ug/mlのhPULCFA陽性抽出物で処理したMFCヒト乳癌細胞は、粒度、アポトソーム及び不規則な核の増加を包含するアポトーシス細胞に特有の形態学的転換をもたらし(図20)、これは、hPULCFA陰性抽出物又はビヒクルで処理した細胞(対照)においては観察されなかった。生存細胞の数も、hPULCFA処理細胞においては視覚的に低かった(図20)。ウエスタンブロット分析は、29kDaのポリ−ADPリボースポリメラーゼ(PARP,poly-ADP ribose polymerase)開裂生成物の出現を介して評価した際、hPULCFA処理MCF細胞中におけるカスパーゼ活性の存在を確認した(図21)。
【0146】
同様の様式で、hPULCFAが富化された80ug/ml血清抽出物で処理したSW620結腸がん細胞は、12時間で細胞増殖における40%の低減、48時間までに70%の低減を示し、これは対照にもビヒクル抽出物にも観察されなかった(図22)。MCF7細胞と同様に、細胞の光学顕微鏡検査は、可能なアポトーシス促進効果が増殖の低減に関連していることを示唆していた(図示せず)。図23に示す通り、PARP活性は、hPULCFA富化抽出物を用いて検出可能であるが、対照抽出物でもビヒクルでも不可能である。集合的に、結果は、アポトーシスを誘導する上でのhPULCFAの機能的役割を示唆している。
【0147】
次に、一連の炎症性タンパク質に対するhPULCFA抽出物の効果を免疫ブロットによって調査した。hPULCFA富化抽出物によるSW620細胞の処理は、炎症促進性転写因子NFκBの低減(図24)をNFκBの陰性調節因子であるIκBαの同時誘導(図25)とともにもたらした。加えて、hPULCFA富化抽出物は、誘導型一酸化窒素シンターゼ(iNOS又はNOS2、図26)に対する阻害効果を示したが、これは通常、炎症組織において誘導され、DNA酸化及びタンパク質ニトロシル化を介して変異原性変化を促進し得る多量の一酸化窒素を産生する。その後、馴化培地中における亜硝酸塩レベル低減の計測を介して、hPULCFA処理細胞における一酸化窒素の産生を決定した(図27)。亜硝酸塩は、種々の有機化合物と反応して、ニトロソアミン及び変異原性であってよい他の硝酸塩ラジカルを形成し得る、一酸化窒素の安定代謝産物である。留意すべきことに、NOは細菌感染等の種々の炎症性応答中に誘導されるものであり、結腸がんの原因として直接的に関わっているとされてきた(Erdman et al, PNAS, Jan 27, 2009, vol 106 No.4)。iNOS(NOS2)及びhPULCFA処理細胞中の亜硝酸塩の低減は、hPULCFAがこの炎症促進性過程を阻害し得ることを示唆している。
【0148】
化合物の抗炎症活性を評価するために、RAW293マウスマクロファージ細胞モデル系が一般的に使用される。細胞を、大規模な炎症性応答を誘導するリポ多糖体で処理し、該応答から保護する能力について化合物を試験することができる。RAW293細胞をhPULCFA富化抽出物で前処理し、続いてLPSで24時間処理し、その後、サイトカインである腫瘍壊死因子アルファ(TNFα,tumor necrosis factor alpha)及びインターロイキン−1ベータ(IL−1β,interleukin-1 beta)、上述した通りのiNOS、シクロオキシゲナーゼ2(COX2,cyclooxygenase 2、アラキドン酸からの炎症促進性エイコサノイドの生成を司る酵素)を包含する炎症促進性マーカーのmRNA転写物及びタンパク質レベルを評価した。LPSによる処理後、TNFα mRNA転写レベルのレベルは、hPULCFA富化抽出物に暴露された細胞における、対照抽出物と比較して統計的に有意な低減(0.05を超えるp)を示した(図28)。細胞溶解物(図29)及び馴化培地(図30)中において酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)によって評価した際のTNFαタンパク質のレベルは、hPULCFA処理細胞においても、対照と比較して有意に低減されていた(p<0.05)。hPULCFA処理は、iNOS mRNAのLPS−媒介性誘導も対照処理と比較してブロックし(p<0.05;図31)、これは、免疫ブロットによって評価した際のiNOSタンパク質における有意な低減(図32)及び亜硝酸塩レベルによって決定される通りの一酸化窒素生成の用量依存的阻害(図33)に対応するものであった。COX2のmRNA転写レベルは、図34に示す通り、IL−1βのmRNA転写レベル(図35;p<0.05)及び細胞溶解物タンパク質レベル(図36;p<0.05)のように、hPULCFA処理細胞対対照においても有意に低減されていた(p<0.05)。集合的に、これらの結果は、炎症促進性状態から保護する上でのhPULCFAの有用性を例証している。
【0149】
下記の構造の分子式C28H46O4:
【0150】
【化13】

【0151】
を有するhPULCFA(D046−124と命名)を、実施例3(以下)において記載される合成スキームに従って98.7%純度(LCMSによって評価した際)に合成した。LPS刺激前に純粋なhPULCFAでRAW293細胞を処理することにより、図37に示す通りの500uM(0.5mM)におけるTNFα転写物の誘導(p<0.05)及び図38に示す通りの0.5mMの馴化培地におけるタンパク質レベルの誘導を防止した。0.5及び0.1mMの用量におけるiNOS(p<0.05)のmRNA転写レベル(図39)並びに同じ濃度の亜硝酸塩レベルを介して決定される通りの一酸化窒素(p<0.05、図40)について、同様の阻害効果が観察された。0.5mMの純粋なhPULCFAによってLPS媒介性刺激が完全にブロックされた馴化培地中におけるIL−1βのレベル(図41、p<0.05)についても、同様の効果が観察された。
【0152】
hPULCFAの抗炎症性役割をさらに探究するために、6つのhPULCFA(450Da、446Da、468Da、466Da、448Da及び464Da)のレベルを、NSAIDを服用しているCRC及び健常な対象の2つの大きな集団において計測した。図42及び43において見られるように(これについてそれぞれの集団の詳細は表7及び8において見ることができる)、非ステロイド性抗炎症薬を服用しているCRC対象において、hPULCFAレベルの統計的に有意且つ再現性のある増加が生じる。この効果は、治療未経験のCRC患者(表7、図42)及び治療後のCRC患者(表8、図43)の両方において観察され、NSAIDの使用が欠損対象におけるhPULCFAレベルの増加をもたらすことを示している。しかしながら、この効果は、正常なhPULCFAレベルを既に有する対象においては観察されない。したがって、hPULCFAレベルの計測を使用して、治療計画におけるNSAIDの効果をモニターすることができる。
【0153】
表7. 6つのhPULCFAに対するNSAID効果を試験される治療未経験の集団中の対象の人口分布
【表11】

【0154】
表8. 治療後の、且つ6つのhPULCFAに対するNSAID効果について試験されるCRC患者における対象の人口分布
【表12】

【0155】
2つの誘導型炎症促進性マーカーも試験して、hPULCFA効果を見極めた。最初に、RAW細胞中のLPSによる誘導後にTNFアルファレベルを計測し、図44の棒グラフに見られるように、hPULCFA陽性抽出物で処理した試料中では低減されているが、hPULCFA陰性抽出物で処理した試料中では低減されていないことが分かった。この結果は、TNFアルファを介して評価した際、hPULCFA含有抽出物が炎症から保護する能力を有することを示唆している。第二の炎症促進性マーカーである誘導性一酸化窒素シンターゼ(NOS2)のレベルを、LPS並びにhPULCFA陽性及び陰性画分を用いる併用治療後にウエスタンブロット分析によって計測した。図45のトップペインにおいて見られるように、hPULCFA富化抽出物は、RAW細胞中のLPS誘導性NOS2を低減させる。該図のボトムペインは、対応するPonceau S染色ゲルを示す。この結果も、hPULCFAについての抗炎症性役割と一致する。
【0156】
図46は、hPULCFA陽性抽出物が、細胞の馴化培地中における亜硝酸塩レベルを用量依存的方式で低減させることを示す。亜硝酸塩は、種々の有機化合物と反応して、ニトロソアミン及び変異原性であってよい他の硝酸塩ラジカルを形成し得る、一酸化窒素の安定代謝産物である。一酸化窒素(NO,Nitric oxide)は、上記で述べた通り、hPULCFA陽性抽出物によってタンパク質レベルで阻害される(図45)一酸化窒素シンターゼによっても生成される。留意すべきことに、NOは細菌感染等の種々の炎症性応答中に誘導されるものであり、結腸がんの原因として直接的に関わっているとされてきた(Erdman et al, PNAS, Jan 27, 2009, vol 106 No.4)。
【0157】
3.hPULCFA D046−124の合成
構造:
【0158】
【化14】

【0159】
分子式 C2846
LCMS純度 98.7%
【0160】
断片Aの合成スキーム:
【0161】
【化15】

【0162】
断片Bの合成スキーム:
【0163】
【化16】

【0164】
断片Cの合成スキーム:
【0165】
【化17】

【0166】
D046−124(本明細書においてはGVK−FFS−09−06−PHMとも称される)の合成スキーム:
【0167】
【化18】

【0168】
ステップ1:
LNB参照番号:B064−015A2
【0169】
【化19】

【0170】
手順:ベンゼン(400ml)中の化合物1(250g、2.906mol)の溶液に、ピリジン(262ml、3.196mol)、続いてSOCl(225ml、3.196mol)を0℃で添加し、出発材料がTLC上で消失するまで室温で終夜撹拌した(溶媒系 石油エーテル中20%EtOAc、生成物R=0.5)。
【0171】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物を氷冷水でクエンチし、EtOAc(200ml×3)で抽出し、合わせた有機層を、NaHCO溶液、水(300ml×2)及びブライン(200ml)で洗浄し、無水NaSOで乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物2(100g)を30%収率で淡褐色油(B064−015A2)として産生した。
【0172】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:4.18(s,2H)、4.34(s,2H)(図47及び48)。
【0173】
ステップ2:
LNB参照番号:B064−017A2
【0174】
【化20】

【0175】
手順:アセトン(50ml)中の化合物2(5g、48.07mmol)にNaBr(7.3g、72.11mmol)を添加し、出発材料がTLC上で消失するまで終夜還流させた(溶媒系 石油エーテル中20%EtOAc、生成物R=0.3)。
【0176】
ワークアップ:反応が完了したら、溶媒を減圧下で濃縮し、DCM(50ml)で希釈し、水(50ml×2)及びブライン(50ml)で洗浄し、無水NaSOで乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物3(4g)を70%収率で無色油(B064−017A2)として得た。
【0177】
特徴付け:H NMR(400MHz,DMSO)δ:4.3(s,2H)、4.45(s,2H)(図49)。
【0178】
ステップ3:
LNB参照番号:B064−025A1
【0179】
【化21】

【0180】
手順:DCM(1.5リットル)中の化合物3(150g、1.00mol)に、pTSA(1.9g、10.06mmol)を0℃で、続いてDHP(91ml、1.006mol)を滴下添加し、出発材料がTLC上で消失するまで室温で終夜撹拌した(溶媒系 石油エーテル中20%EtOAc、生成物R=0.8)。
【0181】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物をDCM(500ml)で希釈し、水(500ml×2)及びブライン(500ml)で洗浄し、無水NaSOで乾燥させ、減圧下で濃縮して粗化合物を得、これをシリカゲル(100〜200メッシュ)カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、化合物4(234.5g)を85%収率で無色油(B064−025A1)として産生した。
【0182】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:1.5〜1.79(m,4H)、1.8〜1.9(m.4H)、4.0(m,2H)、4.2(m,2H)、4.8(m,1H)(図50)。
【0183】
ステップ4:
LNB参照番号:B064−034A2
【0184】
【化22】

【0185】
手順:THF(500ml)中の亜鉛(139g、2.145mol)の懸濁液に、HgCl(30mg)を添加し、10分間撹拌し、次いで化合物4(200g、0.858mol)、続いてTHF(1リットル)中のブチルアルデヒド(92ml、1.030mol)を還流条件下で添加し、次いで、出発材料がTLC上で消失するまで室温で終夜撹拌を続けた(溶媒系 石油エーテル中20%EtOAc、生成物R=0.8)。
【0186】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物をAcOHでクエンチし、化合物をEtOAc(500ml×2)で抽出し、水(500ml×2)及びブライン(500ml)で洗浄し、無水NaSOで乾燥させ、減圧下で濃縮して粗化合物を得、これをシリカゲル(100〜200サイズ)カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、化合物5(35g)を25%収率で淡黄色油(B064−034A2)として産生した。
【0187】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:0.9(s,3H)、1.2〜1.8(m,11H)、3.5(m,1H)、3.7〜3.9(m,2H)、4.0〜4.3(m,4H)(図51)。
【0188】
ステップ5:
LNB参照番号:B064−042A1
【0189】
【化23】

【0190】
手順:DCM(350ml)中の化合物5(35g、15.486mmol)の懸濁液に、イミダゾール(26g、38.71mmol)、続いてtert−ブチルジフェニルクロロシラン(TBDPSCl)(43ml、17.035mmol)を0℃で添加し、出発材料がTLC上で消失するまで室温で終夜撹拌した(溶媒系 石油エーテル中20%EtOAc、生成物R=0.8)。
【0191】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物をDCM(100ml×2)で希釈し、水(200ml×2)及びブライン(100ml)で洗浄し、無水NaSOで乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物6(75g、85%)を淡黄色液体(B064−042A1)として産生した。
【0192】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:0.9(t,3H)、1.1(m,17H)、1.3(m,1H)、1.5(m,2H)、1.8(m,1H)、2.3(m,1H)、3.8(m,2H)、4.2(m,2H)、4.4(s,1H)、7.4(m,6H)、7.7(m,4H)(図52)。
【0193】
ステップ6:
LNB参照番号:B064−049A2
【0194】
【化24】

【0195】
手順:2−プロパノール(2.5リットル)及びジエチルエーテル(1.25リットル)中の化合物6(75g、161.63mmol)の懸濁液に、pTSA(3g、16.163mmol)を添加し、出発材料がTLC上で消失するまで室温で72時間撹拌した(溶媒系 石油エーテル中10%EtOAc、生成物R=0.4)。
【0196】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物をNaHCO溶液でクエンチし、濃縮した。残留物をDCM(300ml×2)で抽出し、水(200ml×2)及びブライン(100ml)で洗浄し、無水NaSOで乾燥させ、減圧下で濃縮し、シリカゲル(100〜200メッシュ)クロマトグラフィーで精製して、化合物7(27g、43%)を淡黄色液体(B064−049A2)として産生した。
【0197】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:0.8(t,3H)、1.1(s,9H)、1.3(m,2H)、1.6(m,2H)、2.3(m,2H)、3.9(m,1H)、4.2(m,2H)、7.4(m,6H)、7.7(m,4H)。LCMS:79%純度、m/z=251(m+1)。(図53〜55)。
【0198】
ステップ7:
LNB参照番号:B064−051A2
【0199】
【化25】

【0200】
手順:DCM(100ml)中の化合物7(12g、31.578mmol)の懸濁液に、DMP(16g、34.736mmol)を0℃で添加し、出発材料がTLC上で消失するまで室温で30分間撹拌した(溶媒系 石油エーテル中10%EtOAc、生成物R=0.5)。
【0201】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物をDCM(100ml)で希釈し、NaHCO溶液、水(200ml×2)及びブライン(100ml)で洗浄し、無水NaSOで乾燥させ、減圧下で濃縮し、次いでシリカゲル(100〜200メッシュ)クロマトグラフィーによって精製して、断片A(8g、75%)を淡黄色液体(B064−051A2)として産生した。
【0202】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:0.8(t,3H)、1.1(s,9H)、1.3(m,2H)、1.6(m,2H)、2.5(m,2H)、3.9(m,1H)、7.4(m,6H)、7.7(m,4H)、9.1(s,1H)LCMS:75%純度、m/z=379(m+1)(図56〜58)。
【0203】
ステップ8:
LNB参照番号:GK−PHM−030A1
【0204】
【化26】

【0205】
手順:クロロホルム(100ml)中の化合物8(25g、126.26mmol)の撹拌溶液に、臭素(30ml、631mmol)を滴下添加し、室温で2時間撹拌した。次いで、これを減圧下で濃縮して、残留物をエタノール(200ml)に溶解し、KOH(90g)を添加し、出発材料がTLC上で消失するまで80℃で3時間撹拌した(石油エーテル中20%EtOAc、R=0.6)。
【0206】
ワークアップ:反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた粗製物を6N HCl(30ml)で酸性化し、酢酸エチル(350ml)で抽出した。有機層を水(100ml)及びブライン(100ml)で洗浄し、無水NaSOで乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物9(18g、78%)を淡褐色油(GK−PHM−030A1)として産生した。これを、それ以上精製することなく次のステップにおいて直接使用した。
【0207】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:1.3(m,9H)、1.5(m,2H)、1.6〜1.7(m,2H)、2.0(m,1H)、2.2(m,1H)、2.4(m,2H)。質量:m/z=183(m+1)(図59〜61)。
【0208】
ステップ9:
LNB参照番号:GK−PHM−032A2
【0209】
【化27】

【0210】
手順:メタノール(200ml)中の化合物9(18g、98.9mmol)の撹拌溶液に、SOCl(23.5g、197.8mmol)を0℃で滴下添加し、次いで、出発材料がTLC上で消失するまで終夜還流させた(石油エーテル中20%EtOAc、R:0.7)。
【0211】
ワークアップ:反応混合物を濃縮し、DCM(200ml)で抽出し、次いで、NaHCO溶液、水(200ml×2)及びブライン(100ml)で洗浄し、次いで無水NaSOで乾燥させ、減圧下で濃縮して粗化合物を手に入れ、シリカゲル(100〜200メッシュ)を使用するカラムクロマトグラフィーによってこれをさらに精製して、断片B(14g、72%)を淡黄色油(GK−PHM−032A2)として産生した。
【0212】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:1.3(m,7H)、1.4(m,2H)、1.5〜1.6(m,2H)、1.7(m,2H)、2.1(m,1H)、2.2(m,1H)、2.3(m,2H)。IR(cm−1):634,704,741,724,1016,1172,1196,1240,1362,1436,1621,1739,2117,2856,2930,3305,3457。質量:m/z=197(m+1)(図62〜64)。
【0213】
ステップ10:
LNB参照番号:B064−015A2
【0214】
【化28】

【0215】
手順:ベンゼン(400ml)中の化合物10(250mg、2.906mol)の溶液に、ピリジン(262ml、3.196mol)、続いてSOCl(225ml、3.196mol)を0℃で添加し、出発材料がTLC上で消失するまで室温で終夜撹拌した(溶媒系 石油エーテル中20%EtOAc、生成物R=0.5)。
【0216】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物を氷冷水でクエンチし、EtOAc(200ml×3)で抽出し、合わせた有機層を、NaHCO溶液、水(300ml×2)、ブライン(200ml)で洗浄し、無水NaSOで乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物11(100g)を30%収率で産生した。
【0217】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:4.2(S,2H)、4.3(s,2H)(図65〜66)。
【0218】
ステップ11:
LNB参照番号:B064−064A2
【0219】
【化29】

【0220】
手順:乾燥DMF(70ml)中の画分B(7.54g、38.461mmol)の溶液に、NaI(7.49g、49.99mmol)、CsCO(16.28mmol)及びCuI(9.52g、49.99mmol)を0℃で添加し、20分間撹拌した。次いで、化合物11(4g、38.461mmol)を添加し、出発材料がTLC上で消失するまで室温で終夜撹拌した(溶媒系 石油エーテル中30%EtOAc、生成物R=0.3)。
【0221】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物をNHCl溶液(100ml)でクエンチし、ジエチルエーテル(200ml×3)で抽出し、合わせた有機層を水(100ml×2)及びブライン(100ml)で洗浄し、次いで無水NaSOで乾燥させ、減圧下で濃縮して粗化合物を産出し、これをシリカゲル(100〜200メッシュ)カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、化合物12(4.5g、43%)を無色油(B064−064A2)として産生した。
【0222】
特徴付け:H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.2(m,8H)、1.4(m,2H)、1.5(m,2H)、2.1(m,2H)、2.3(m,2H)、3.2(m,2H)、3.6(s,3H)、4.1(m,2H)、5.1(bs,1H)。LCMS:42%純度、m/z=265(m+1)(図67〜69)。
【0223】
ステップ12:
LNB参照番号:B064−114A2
【0224】
【化30】

【0225】
手順:Pd/BaSO(250mg)を、乾燥メタノール(50ml)中の化合物12(5g)の撹拌溶液に添加し、H圧力下、出発材料がTLC上で消失するまで室温で6時間撹拌した(溶媒系 石油エーテル中30%EtOAc、生成物R=0.4)。
【0226】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、メタノール(20ml×3)で洗浄し、濾液を減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをシリカゲル(100〜200メッシュ)カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、化合物13(3.6g)を68%収率で無色油(B064−114A2)として産生した。
【0227】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:1.3(m,10H)、1.6(m,2H)、2.1(m,2H)、2.3(m,2H)、2.8(m,2H)、3.7(s,3H)、4.3(m,2H)、5.3〜5.5,(m,2H,J=7.1)、5.5〜5.7(m,2H,J=6.4)、LCMS:94.75%純度、m/z=268(m+1)(図70〜72)。
【0228】
ステップ13:
LNB参照番号:B064−123A2
【0229】
【化31】

【0230】
手順:DCM(60ml)中の化合物13(4.1g、15.29mmol)の撹拌溶液に、PPh(5.21g、19.87mmol)、続いてトリクロロアセトニトリル(4.4g、30.59mmol)を0℃で添加し、出発材料がTLC上で消失するまで室温で6時間撹拌した(溶媒系 石油エーテル中30%EtOAc、生成物R=0.8)。
【0231】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物をDCM(50ml)で希釈し、水(100ml×2)及びブライン(100ml)で洗浄し、次いで減圧下で濃縮して粗化合物を得、これをシリカゲル(100〜200メッシュ)カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、断片C(3.1g)を70%収率で無色油(B064−123A2)として産生した。
【0232】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:1.2(m,10H)、1.6(m,2H)、2(m,2H)、2.3(m,2H)、2.9(m,2H)、3.7(s,3H)、4.1(m,2H)、5.3〜5.5(m,2H J=10.6)、5.7(m,2H J=10.8)。LCMS:78%純度、m/z=286(m+1)(図73〜76)。
【0233】
ステップ14:
LNB参照番号:B064−055A1
【0234】
【化32】

【0235】
手順:乾燥THF(35ml)中の化合物14(2.55g、18.382mmol)の撹拌溶液に、EtMgBr(6.8ml、20.22mmol)を0℃で添加し、20分間撹拌し、次いで、乾燥THF(35ml)中の断片A(6.9g、18.382mmol)を添加し、出発材料がTLC上で消失するまで室温で終夜撹拌を続けた(溶媒系 石油エーテル中20%EtOAc、生成物R=0.5)。
【0236】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物をNHCl溶液でクエンチし、EtOAc(100ml)で抽出し、水(100ml×2)及びブライン(100ml)で洗浄し、次いで、溶媒を減圧下で除去して、化合物15(9.3g、98%)を褐色油(B064−055A1)として産生した。
【0237】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:0.2(s,9H)、0.8(t,3H)、1.1(s,9H)、1.3(m,2H)、1.6(m,3H)、1.9(m,1H)、2.3(m,2H)、3.3(m,2H)、3.9(m,1H)、5(bs,1H)、7.4(m,6H)、7.7(m,4H)。LCMS:52.6%純度、m/z=531(m+1)(図77〜79)。
【0238】
ステップ15:
LNB参照番号:B064−057A2
【0239】
【化33】

【0240】
手順:乾燥THF(50ml)中の化合物15(4.6g、8.949mmol)の撹拌溶液に、TBAF(22ml、22.37mmol)を0℃で添加し、出発材料がTLC上で消失するまで室温で終夜撹拌した(溶媒系 石油エーテル中50%EtOAc、生成物R=0.5)。
【0241】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物を水でクエンチし、EtOAc(100ml)で抽出し、有機層を水(100ml×2)、ブライン(100ml)で洗浄し、次いで減圧下で濃縮して、化合物16(2.45g、64%)を褐色油(B064−057A2)として産生した。
【0242】
特徴付け:H NMR(400MHz,DMSO)δ:0.9(t,3H)、1.2〜1.6(m,5H)、2.3(m,2H)、2.6(m,2H)、3.5(bs,1H)、4.4(m,1H)、4.6(m,1H)、5.6(m,1H)(図80〜82)。
【0243】
ステップ16:
LNB参照番号:B064−125A2
【0244】
【化34】

【0245】
手順:乾燥DMF(10ml)中の化合物16(0.911g、4.465mmol)の撹拌溶液に、NaI(0.87g、5.804mmol)、CsCO(1.85g、5.804mmol)及びCuI(1.16g、5.804mmol)を0℃で添加し、20分間撹拌し、次いで、乾燥DMF(10ml)中の断片C(1.27g、4.465mmol)を添加し、出発材料がTLC上で消失するまで室温で終夜撹拌し続けた(溶媒系 石油エーテル中50%EtOAc、生成物R=0.5)。
【0246】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物をNHCl溶液でクエンチし、ジエチルエーテル(50ml×2)で抽出し、水(100ml×2)及びブライン(100ml)で洗浄し、無水NaSOで乾燥させ、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをシリカゲル(100〜200メッシュ)カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、化合物17(1.22g、60%)を淡褐色油(B064−125A2)として産生した。
【0247】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:0.9(t,3H)、1.3(m,10H)、1.6(m,10H)、2.1(m,2H)、2.3〜2.4(m,3H)、2.7〜2.8(m,3H)、3.1(m,2H)、3.7(s,3H)、3.8(bs,1H)、4.5(bs,1H)、5.3〜5.6(m,4H,J=6.4)。LCMS:90%純度、m/z=473(m+1)(図83〜85)。
【0248】
ステップ17:
LNB参照番号:B064−131A2−Fr−2
【0249】
【化35】

【0250】
手順:乾燥メタノール(18ml)中の化合物17(730mg)の撹拌溶液に、Pd/CaCO(140mg)を添加し、H圧力下、出発材料がTLC上で消失するまで室温で1時間撹拌した(溶媒系 石油エーテル中30%EtOAc、生成物R=0.5)。
【0251】
ワークアップ:反応が完了したら、反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、メタノール(20ml×2)で洗浄し、減圧下30℃で濃縮して粗化合物18(1.2g)を産生し、分取HPLCによってさらに精製して、純粋な化合物18(120mg)を10%収率で無色油(B064−131A2−Fr−2)として産生した。
【0252】
特徴付け:H NMR(400MHz,CDCl)δ:0.9(t,3H)1.3(m,8H)1.6(m,9H)2.1(m,5H)2.3(m,4H)2.5(m,3H)2.8〜3.0(m,3H)3.6(s,3H)4.5(m,1H)5.4(m,6H)5.7〜5.8(m,2H)6.3〜6.5(m,1H J=11)。LCMS:99%純度、m/z=461(m+1)(図86〜88)。
【0253】
ステップ18:
LNB参照番号:B064−136A2
【0254】
【化36】

【0255】
手順:LiOH.HO(55mg、1.3mmol)を、メタノール(10ml)及び水(5ml))中の化合物18(120mg、0.26mmol)の撹拌溶液に0℃で添加し、出発材料がTLC上で消失するまで室温で終夜撹拌し続けた(溶媒系 石油エーテル中30%EtOAc、生成物R=0.1)。
【0256】
ワークアップ:反応が完了したら、溶媒を減圧下30℃で留去し、次いでHClのエーテル溶液で酸性化しそして濃縮して160mgの粗生成物を産生し、これを分取HPLCによってさらに精製して、D046−124(11mg、9%)を無色油(B064−136A2)として産生した。
【0257】
特徴付け:LCMS:98.7%純度、m/z=445(m−1)(図89〜90)。
【0258】
1又は2以上の現在好ましい実施形態を例として記載してきた。請求項において定義されている通りの本発明の範囲から逸脱することなく、複数の変形及び修正が為され得ることが、当業者には明らかとなるであろう。
【0259】
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
式(I)の化合物:
【化1】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]。
【請求項2】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項1に記載の化合物。
【請求項3】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項2に記載の化合物。
【請求項4】
下記構造群:
【化2】

から選択される、請求項1に記載の化合物。
【請求項5】
下記構造の化合物D046−124:
【化3】

である、請求項1に記載の化合物。
【請求項6】
対象において、結腸直腸がん(CRC)を治療又は予防するのに十分な量で、式(I)の化合物:
【化4】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を投与するステップを含む、前記対象においてCRCを治療又は予防する方法。
【請求項7】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項6に記載の方法。
【請求項8】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項7に記載の方法。
【請求項9】
化合物が下記構造群:
【化5】

から選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項10】
化合物が下記構造のD046−124:
【化6】

である、請求項6に記載の方法。
【請求項11】
対象において、腫瘍の成長を阻害するのに十分な量で、式(I)の化合物:
【化7】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を投与するステップを含む、前記対象において腫瘍成長を阻害する方法。
【請求項12】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項11に記載の方法。
【請求項13】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項12に記載の方法。
【請求項14】
化合物が下記構造群:
【化8】

から選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項15】
化合物が下記構造のD046−124:
【化9】

である、請求項11に記載の方法。
【請求項16】
対象において、前記対象において胃腸(GI)障害を治療、予防又は緩和するのに十分な量で、式(I)の化合物:
【化10】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を投与するステップを含む、前記対象において前記GI障害を治療又は予防する方法。
【請求項17】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項16に記載の方法。
【請求項18】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項17に記載の方法。
【請求項19】
化合物が下記構造群:
【化11】

から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項20】
化合物が下記構造のD046−124:
【化12】

である、請求項16に記載の方法。
【請求項21】
それを必要とする対象において、炎症及び/又は炎症に関係する障害を予防するのに有効な量で、式(I)の化合物:
【化13】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を投与するステップを含む、前記対象において前記炎症及び/又は炎症に関係する障害を治療又は予防する方法。
【請求項22】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項21に記載の方法。
【請求項23】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項22に記載の方法。
【請求項24】
化合物が下記構造群:
【化14】

から選択される、請求項21に記載の方法。
【請求項25】
化合物が下記構造のD046−124:
【化15】

である、請求項21に記載の方法。
【請求項26】
対象において水酸化多価不飽和超長鎖脂肪酸(hPULCFA)欠乏障害(hPDD)を治療又は予防するのに十分な量で、式(I)の化合物:
【化16】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を投与するステップを含む、前記対象においてhPDDを治療又は予防する方法。
【請求項27】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項26に記載の方法。
【請求項28】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項27に記載の方法。
【請求項29】
化合物が下記構造群:
【化17】

から選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項30】
化合物が下記構造のD046−124:
【化18】

である、請求項26に記載の方法。
【請求項31】
投与される化合物の量が、hPULCFAレベルを上昇させ又は修復するのに有効なものである、請求項26〜30のいずれかに記載の方法。
【請求項32】
a)対象由来の試料を分析して、前記試料中の式(I)の化合物:
【化19】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
の量を定量するステップと、
b)前記対象試料中の定量された前記化合物の量を、1又は2以上の標準試料中の対応する前記化合物の量と比較して、前記対象試料中の前記化合物の量における増加又は減少の有無を決定するステップと、
c)前記増加又は減少を、前記対象のCRC健康状態若しくは健康状態における変化を診断するために、又は前記対象においてCRC若しくはCRCのリスクを診断するために使用するステップと
を含む、前記対象のCRC健康状態若しくは健康状態における変化を診断するための、又は前記対象においてCRC若しくはCRCのリスクを診断するための方法。
【請求項33】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項32に記載の方法。
【請求項34】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項33に記載の方法。
【請求項35】
化合物が下記構造群:
【化20】

から選択される、請求項32に記載の方法。
【請求項36】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップa)において、化合物についての正確な質量強度データを得るために、質量分析によって分析され、前記正確な質量強度データが、ステップb)において正確な質量強度における増加又は減少を特定するために、1又は2以上の標準試料から得られた対応する正確な質量強度データと比較される、請求項32に記載の方法。
【請求項37】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップa)において、タンデム質量分析、NMR又はELISAによって分析される、請求項32に記載の方法。
【請求項38】
a)対象由来の試料を分析して、前記試料中の式(I)の化合物:
【化21】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
の量を定量するステップと、
b)前記対象試料中の定量された前記化合物の量を、1又は2以上の標準試料中の対応する前記化合物の量と比較して、前記対象試料中の前記化合物の量における増加又は減少の有無を決定するステップと、
c)前記増加又は減少を、前記対象においてhPDDを診断するために使用するステップと
を含む、前記対象においてhPULCFA欠乏障害(hPDD)を診断する方法。
【請求項39】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項38に記載の方法。
【請求項40】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項39に記載の方法。
【請求項41】
化合物が下記構造群:
【化22】

から選択される、請求項38に記載の方法。
【請求項42】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップa)において、化合物についての正確な質量強度データを得るために、質量分析によって分析され、前記正確な質量強度データが、ステップb)において、正確な質量強度における増加又は減少を特定するために、1又は2以上の標準試料から得られた対応する正確な質量強度データと比較される、請求項38に記載の方法。
【請求項43】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップa)において、タンデム質量分析、NMR又はELISAによって分析される、請求項38に記載の方法。
【請求項44】
a)対象由来の試料を分析して、前記試料中の式(I)の化合物:
【化23】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
の量を定量するステップと、
b)前記対象試料中の定量された前記化合物の量を、1又は2以上の標準試料中の対応する前記化合物の量と比較して、前記対象試料中の前記化合物の量における増加又は減少の有無を決定するステップと、
c)前記増加又は減少を、前記対象において炎症又は炎症性疾患を診断するために使用するステップと
を含む、炎症又は炎症性疾患を診断する方法。
【請求項45】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項44に記載の方法。
【請求項46】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項45に記載の方法。
【請求項47】
化合物が下記構造群:
【化24】

から選択される、請求項44に記載の方法。
【請求項48】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップa)において、化合物についての正確な質量強度データを得るために、質量分析によって分析され、前記正確な質量強度データが、ステップb)において、正確な質量強度における増加又は減少を特定するために、1又は2以上の標準試料から得られた対応する正確な質量強度データと比較される、請求項44に記載の方法。
【請求項49】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップa)において、タンデム質量分析、NMR又はELISAによって分析される、請求項44に記載の方法。
【請求項50】
炎症が、IBD、クローン病及び/若しくは結腸炎から選択されるGI障害によって引き起こされる、又は炎症性疾患がそれらを包含する、請求項44〜49のいずれかに記載の方法。
【請求項51】
a)抗炎症薬で治療される対象由来の試料を分析して、前記試料中の式(I)の化合物:
【化25】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
の量を定量するステップと、
b)前記対象試料中の定量された前記化合物の量を、1又は2以上の標準試料中の対応する前記化合物の量と比較して、前記対象試料中の前記化合物の量における増加又は減少の有無を決定するステップとを含み、
ここで、前記対象試料中の前記化合物の量における増加又は減少が、前記対象において前記抗炎症薬によって引き起こされる効果を示す、
前記抗炎症薬の効果をモニターする方法。
【請求項52】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項51に記載の方法。
【請求項53】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項52に記載の方法。
【請求項54】
化合物が下記構造群:
【化26】

から選択される、請求項51に記載の方法。
【請求項55】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップa)において、化合物についての正確な質量強度データを得るために、質量分析によって分析され、前記正確な質量強度データが、ステップb)において、正確な質量強度における増加又は減少を特定するために、1又は2以上の標準試料から得られた対応する正確な質量強度データと比較される、請求項51に記載の方法。
【請求項56】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップa)において、タンデム質量分析、NMR又はELISAによって分析される、請求項51に記載の方法。
【請求項57】
抗炎症薬で治療される対象が、炎症及び/又は炎症性状態若しくは疾患を有する、請求項51〜56のいずれかに記載の方法。
【請求項58】
検出剤で標識された、請求項1〜5のいずれかに記載の化合物。
【請求項59】
検出剤で標識された、請求項1〜5のいずれかに記載の化合物又はそのいずれか2以上の混合物を含む基準物質。
【請求項60】
検出剤が、インビトロ又はインビボにおける検出を可能にする、安定同位体若しくは放射性同位体、酵素、又はタンパク質である、請求項59に記載の基準物質。
【請求項61】
請求項59又は60に記載の基準物質と、分析物を定量化するため、又は診断検査を実施するための取扱説明書とを含むキット。
【請求項62】
薬学的に許容される担体又は賦形剤と、式(I)の化合物:
【化27】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
とを含む医薬組成物。
【請求項63】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項62に記載の組成物。
【請求項64】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項63に記載の組成物。
【請求項65】
化合物が下記構造群:
【化28】

から選択される、請求項62に記載の組成物。
【請求項66】
下記構造の化合物D046−124:
【化29】

である、請求項62に記載の組成物。
【請求項67】
式(I):
【化30】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
によって定義されるとおりの2以上の化合物を含む組合せ。
【請求項68】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項67に記載の組合せ。
【請求項69】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項67に記載の組合せ。
【請求項70】
2以上の化合物が下記構造群:
【化31】

から選択される、請求項67に記載の組合せ。
【請求項71】
医薬組合せ、栄養補給剤、栄養補助食品又は機能性食品として製剤化される、請求項67に記載の組合せ。
【請求項72】
対象において結腸直腸がん(CRC)を治療又は予防するための、下記構造:
【化32】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を有する式(I)の化合物の使用。
【請求項73】
対象において結腸直腸がん(CRC)を治療又は予防するための薬剤の製造のための、以下の式(I)で示される下記構造:
【化33】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を有する式(I)の化合物の使用。
【請求項74】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項72又は73に記載の使用。
【請求項75】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項74に記載の使用。
【請求項76】
化合物が下記構造群:
【化34】

から選択される、請求項72又は73に記載の使用。
【請求項77】
化合物が下記構造のD046−124:
【化35】

である、請求項72又は73に記載の使用。
【請求項78】
対象において腫瘍の成長を阻害するための、下記構造:
【化36】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を有する式(I)の化合物の使用。
【請求項79】
対象において腫瘍の成長を阻害するための薬剤の製造のための、下記構造:
【化37】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を有する式(I)の化合物の使用。
【請求項80】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項78又は79に記載の使用。
【請求項81】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項80に記載の使用。
【請求項82】
化合物が下記構造群:
【化38】

から選択される、請求項78又は79に記載の使用。
【請求項83】
化合物が下記構造のD046−124:
【化39】

である、請求項78又は79に記載の使用。
【請求項84】
対象において胃腸(GI)障害を治療又は予防するための、下記構造:
【化40】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を有する式(I)の化合物の使用。
【請求項85】
対象において胃腸(GI)障害を治療又は予防するための薬剤の製造のための、下記構造:
【化41】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を有する式(I)の化合物の使用。
【請求項86】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項84又は85に記載の使用。
【請求項87】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項86に記載の使用。
【請求項88】
化合物が下記構造群:
【化42】

から選択される、請求項84又は85に記載の使用。
【請求項89】
化合物が下記構造のD046−124:
【化43】

である、請求項84又は85に記載の使用。
【請求項90】
それを必要とする対象において炎症及び/又は炎症に関係する障害を治療又は予防するための、下記構造:
【化44】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を有する式(I)の化合物の使用。
【請求項91】
それを必要とする対象において炎症及び/又は炎症に関係する障害を治療又は予防するための薬剤の製造のための、下記構造:
【化45】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を有する式(I)の化合物の使用。
【請求項92】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項90又は91に記載の使用。
【請求項93】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項92に記載の使用。
【請求項94】
化合物が下記構造群:
【化46】

から選択される、請求項90又は91に記載の使用。
【請求項95】
化合物が下記構造のD046−124:
【化47】

である、請求項90又は91に記載の使用。
【請求項96】
対象において水酸化多価不飽和超長鎖脂肪酸(hPULCFA)欠乏障害(hPDD)を治療又は予防するための、下記構造:
【化48】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を有する式(I)の化合物の使用。
【請求項97】
対象において水酸化多価不飽和超長鎖脂肪酸(hPULCFA)欠乏障害(hPDD)を治療又は予防するための薬剤の製造のための、下記構造:
【化49】

(I)
[式中、Rが、炭素鎖中に少なくとも1個の二重結合を含有するヒドロキシ置換C24−C40直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも1個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている]
を有する式(I)の化合物の使用。
【請求項98】
RがC28−C36脂肪族基である、請求項96又は97に記載の使用。
【請求項99】
鎖中の2、3又は4個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項98に記載の使用。
【請求項100】
化合物が下記構造群:
【化50】

から選択される、請求項96又は97に記載の使用。
【請求項101】
化合物が下記構造のD046−124:
【化51】

である、請求項96又は97に記載の使用。
【請求項102】
化合物が、hPULCFAレベルを上昇させ又は修復するのに有効な量で投与するためのものである、請求項96〜101のいずれかに記載の使用。
【請求項103】
【化52】

からなる群から選択される化合物。
【請求項104】
化合物D046−124:
【化53】

(D046-124)
の合成における、
【化54】

からなる群から選択される中間体。
【請求項105】
化合物D046−124:
【化55】

(D046-124)
を調製するための方法であって、
(i)式(II)の化合物:
【化56】

(II)
と式(III)の化合物:
【化57】

(III)
とを、式(IV)の化合物:
【化58】

(IV)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
(ii)TBDPS基を除去して式(V)の化合物:
【化59】

(V)
を生成するステップと、
(iii)前記式(V)の化合物と式(VI)の化合物:
【化60】

(VI)
とを、式(VII)の化合物:
【化61】

(VII)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
(iv)前記式(VII)の化合物を触媒と、式(VIII)の化合物:
【化62】


(VIII)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
(v)前記式(VIII)の化合物の末端エステル官能基を加水分解してカルボン酸基とし、それによって表題化合物を生成するステップと
を含む方法。
【請求項106】
表題化合物を単離するための1又は2以上の精製ステップをさらに含む、請求項105に記載の方法。
【請求項107】
式(VII)の化合物を、ステップ(iv)において、Pd触媒の存在下、炭酸カルシウムと1気圧の水素下で反応させて、三重結合を二重結合へ選択的に変換し、それによって式(VIII)の化合物を生成する、請求項104に記載の方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5A−B】
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【図5C−D】
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【図6A−B】
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【図6C−D】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22】
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【図23】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図27】
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【図28】
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【図29】
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【図30】
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【図31】
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【図32】
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【図33】
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【図34】
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【図35】
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【図36】
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【図37】
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【図38】
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【図39】
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【図40】
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【図41】
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【図42】
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【図43】
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【図44】
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【図45】
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【図46】
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【図47】
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【図48】
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【図49】
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【図50】
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【図51】
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【図52】
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【図53】
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【図54】
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【図55】
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【図56】
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【図57】
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【図58】
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【図59】
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【図60】
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【図61】
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【図62】
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【図63】
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【図64】
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【図65】
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【図66】
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【図67】
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【図68】
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【図69】
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【図70】
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【図71】
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【図72】
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【図73】
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【図74】
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【図75】
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【図76】
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【図77】
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【図78】
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【図79】
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【図80】
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【図81】
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【図82】
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【図83】
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【図84】
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【図85】
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【図86】
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【図87】
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【図88】
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【図89】
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【図90】
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【公表番号】特表2013−500275(P2013−500275A)
【公表日】平成25年1月7日(2013.1.7)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−521919(P2012−521919)
【出願日】平成22年7月29日(2010.7.29)
【国際出願番号】PCT/CA2010/001179
【国際公開番号】WO2011/011882
【国際公開日】平成23年2月3日(2011.2.3)
【出願人】(504353730)フェノメノーム ディスカバリーズ インク (16)
【Fターム(参考)】