ヒドロゲルナノ粒子に基づく免疫測定
試料収集容器内にあるか、または分析デバイスの液体流路内の多孔性基層に含浸されているかのいずれかである多孔性ポリマー性捕捉ナノ粒子を組み込んでいる免疫測定デバイスが提供されている。捕捉粒子を免疫測定デバイスに組み込むことにより、感度が向上し、本免疫測定デバイスへの負荷前に試料を前処理する必要性が取り除かれる。好ましい実施形態は、溶液中で、以下の３つの機能を１ステップで実施する捕捉ナノ粒子を含有するコアシェルベイトである：ａ）分子サイズふるい、ｂ）標的被検体の隔離および濃縮、およびｃ）分解からの保護。捕捉粒子のポリマー性マトリックスは、構造ポリマーおよび親和性モノマーを有するコポリマー性物質で構成されており、親和性モノマーは、被検体を捕捉粒子に誘引する特性を有する。本デバイスは、生物医学的応用のためのポイントオブケア診断アッセイに有用であり、ならびに環境、病原体、および化学的または生物学的脅威を識別するための屋外で使用可能なアッセイとして有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２００８年８月２６に出願された、「Ｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂａｓｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」と題する米国特許仮出願第６１／０９１，９３５号に開示された発明を請求するものである。これにより優先権が請求される。これにより３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）に基づく該米国仮出願の利益が請求され、これにより前述の出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、側方流動免疫測定（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）またはイムノクロマトグラフィーストリップデバイスなどのポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）免疫測定に、試料収集容器の一部としてまたは液体流動帯内に固定化されたヒドロゲルナノ粒子を組み込むことに関する。より具体的には、本発明は、被検体を分解から保護することに加えて、分子ふるい、標的被検体の隔離および濃縮が可能である回収ヒドロゲルナノ粒子の集団を含有する携帯用免疫測定デバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
側方流動アッセイ（ＬＦＡ）は、診断ツールとして１５年を超えて順調に使用されてきた。ＬＦＡは、ポイントオブケア（ＰＯＣ）診断を提供するが、包括的な臨床検査室および特別に訓練された技術スタッフを必要としない。ＬＦＡデバイスは、一般的に、製造が安価であり、有効期間が長く、保管に求められる条件が最小限であると考えられている。ＬＦＡ診断結果は、クロマトグラフィーストリップの目視検査、または分光光度計「測定」装置の使用のいずれかにより読み取られる。アッセイ結果の目視検査は、典型的には、はい／いいえ、または陽性／陰性という結果に制限される。
【０００４】
視覚的測定および測定器測定は、両方とも定性的または半定量的であり、低含有量バイオマーカーのレベルを定量的に評価するには感度が十分ではないと考えられている。また、ＰＯＣ使用するための現行のＬＦＡ設計は、免疫測定分析の前に複雑な生物学的液体を前処理することができないため、制限されている。これらの制限により、低含有量の被検体およびバイオマーカーに対するＬＦＡの感度が低減され、同時に、低含有量バイオマーカーおよび他の低分子量化合物用のＰＯＣ診断デバイスとしてのＬＦＡの有効性が最小化されている。
【０００５】
ＰＯＣ免疫測定を診断デバイスとして使用する場合の主要な課題は、標準的実験室設備を使用せずに複雑な生物学的液体を処理する能力である。多くの場合、血液試料を前処理して血漿試料を提供するか、または血液試料から細胞を除去するためには、遠心機が必要とされる場合がある。コアシェルヒドロゲルナノ粒子を組み込んで分子ふるいおよび標的被検体隔離をすることは、この制限に対する独特な解決策を提供する。特異的なふるいおよび親和性特徴を有するように設計されたヒドロゲルナノ粒子は、分析の前に、標的被検体のフィルター、濃縮器、および分解から保護するものとして作用する。これらの機能は、バイオマーカーの発見および低含有量被検体用の診断アッセイにおける分析上の主要課題に取り組むための新規な解決策を提供する。
【０００６】
ＬＦＡデバイスの別の主要課題は、特定の目的被検体に対するＬＦＡの感度である。分析前に試料を前処理することができないことは、感度の不良、高バックグラウンド干渉、および試料の希釈に結びつく。ヒドロゲルナノ粒子を試料前処理の手段としてデバイスに組み込むことは、標的被検体のみを隔離および濃縮し、その後粒子から抽出して免疫測定を行うことにより、感度を著しく向上させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ、Ｆｅｒｒａｒｉ Ｍ、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ Ｅ（２００３年）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｗｒｉｔｔｅｎ ｉｎ ｂｌｏｏｄ．Ｎａｔｕｒｅ ４２５巻：９０５頁
【非特許文献２】Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＬ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＧ（２００２年）Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｏｍｅ：ｈｉｓｔｏｒｙ，ｃｈａｒａｃｔｅｒ，ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １巻：８４５〜８６７頁
【非特許文献３】Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ、Ａｒｄｅｋａｎｉ ＡＭ、Ｈｉｔｔ ＢＡ、Ｌｅｖｉｎｅ ＰＪ、Ｆｕｓａｒｏ ＶＡら、（２００２年）Ｕｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ ３５９巻：５７２〜５７７頁
【非特許文献４】Ｍｅｒｒｅｌｌ Ｋ、Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ Ｋ、Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ、Ｅｓｐｌｉｎ ＭＳ、Ｌｅｗｉｓ ＮＥら、（２００４年）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｏｗ ａｂｕｎｄａｎｃｅ，ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｔｅｃｈ １５巻：２３８〜２４８頁
【非特許文献５】Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ、Ｂｅｌｌｕｃｏ Ｃ、Ａｒａｕｊｏ ＲＰ、Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ（２００６年）Ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｅ：ａ ｈｉｇｈｅｒ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ６巻：９６１〜９６７頁
【非特許文献６】Ｌｏｐｅｚ ＭＦ、Ｍｉｋｕｌｓｋｉｓ Ａ、Ｋｕｚｄｚａｌ Ｓ、Ｂｅｎｎｅｔｔ ＤＡ、Ｋｅｌｌｙ Ｊら、（２００５年）Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｏｕｎｄ ｍａｓｓ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５１巻：１９４６〜１９５４頁
【非特許文献７】Ｚｈｏｕ Ｍ、Ｌｕｃａｓ ＤＡ、Ｃｈａｎ ＫＣ、Ｉｓｓａｑ ＨＪ、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ，３ｒｄら、（２００４年）Ａｎ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ“ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ”．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２５巻：１２８９〜１２９８頁
【非特許文献８】Ａｙａｃｈｅ Ｓ、Ｐａｎｅｌｌｉ Ｍ、Ｍａｒｉｎｃｏｌａ ＦＭ、Ｓｔｒｏｎｃｅｋ ＤＦ（２００６年）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｔｏｒａｇｅ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １２６巻：１７４〜１８４頁
【非特許文献９】Ｌｕｃｈｉｎｉ Ａ、Ｇｅｈｏ ＤＨ、Ｂｉｓｈｏｐ Ｂ、Ｔｒａｎ Ｄ、Ｘｉａ Ｃら、（２００８年）Ｓｍａｒｔ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ：ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ，ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ８巻：３５０〜３６１頁
【非特許文献１０】Ｈｏｆｆｍａｎ ＡＳ（２００２年）Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５４巻：３〜１２頁
【非特許文献１１】Ｄｒｕｒｙ ＪＬ、Ｍｏｏｎｅｙ ＤＪ（２００３年）Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｓｃａｆｆｏｌｄ ｄｅｓｉｇｎ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４巻：４３３７〜４３５１頁
【非特許文献１２】Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ ＤＦ、Ｍａｌｐａｓｓ ＴＷ、Ｆｏｓｔｅｒ ＤＭ、Ｒｏｓｓ Ｒ（１９８４年）Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ５４１ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ：ｌｅｖｅｌｓ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｌｅａｒａｎｃｅ．Ｂｌｏｏｄ ６４巻：４５８〜４６９頁
【非特許文献１３】Ｈｅｎｎｉｎｋ ＷＥ、ｖａｎ Ｎｏｓｔｒｕｍ ＣＦ（２００２年）Ｎｏｖｅｌ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｄｅｓｉｇｎ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５４巻：１３〜３６頁
【非特許文献１４】Ｐｅｌｔｏｎ Ｒ（２０００年）Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ．Ａｄｖ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ ８５巻：１〜３３頁
【非特許文献１５】Ｎａｙａｋ Ｓ、Ｇａｎ Ｄ、Ｓｅｒｐｅ ＭＪ、Ｌｙｏｎ ＬＡ（２００５年）Ｈｏｌｌｏｗ ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ．Ｓｍａｌｌ １巻：４１６〜４２１頁
【非特許文献１６】Ｆｏｒｔｉｎａ Ｐ、Ｋｒｉｃｋａ ＬＪ、Ｓｕｒｒｅｙ Ｓ、Ｇｒｏｄｚｉｎｓｋｉ Ｐ（２００５年）Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｅ ａｎｄ ｒｅａｌｉｔｙ ｏｆ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３巻：１６８〜１７３頁
【非特許文献１７】Ｍｏｇｈｉｍｉ ＳＭ、Ｈｕｎｔｅｒ ＡＣ、Ｍｕｒｒａｙ ＪＣ（２００５年）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ １９巻：３１１〜３３０頁
【非特許文献１８】Ｓａｋａｍｏｔｏ ＪＨ、Ｓｍｉｔｈ ＢＲ、Ｘｉｅ Ｂ、Ｒｏｋｈｌｉｎ ＳＩ、Ｌｅｅ ＳＣら、（２００５年）Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂａｓｅｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ４巻：６２７〜６３６頁
【非特許文献１９】Ｌｉ Ｘ、Ｐｏｎｔｅｎ Ａ、Ａａｓｅ Ｋ、Ｋａｒｌｓｓｏｎ Ｌ、Ａｂｒａｍｓｓｏｎ Ａら、（２０００年）ＰＤＧＦ−Ｃ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ＰＤＧＦ ａｌｐｈａ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２巻：３０２〜３０９頁
【非特許文献２０】Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ Ｌ、Ｌｉ Ｈ、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｕ（２００４年）Ｔｈｅ ＰＤＧＦ ｆａｍｉｌｙ：ｆｏｕｒ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ｆｉｖｅ ｄｉｍｅｒｉｃ ｉｓｏｆｏｒｍｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １５巻：１９７〜２０４頁
【非特許文献２１】Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ＭＣ、Ｃｏｒｌｅｓｓ ＣＬ、Ｄｕｅｎｓｉｎｇ Ａ、ＭｃＧｒｅｅｖｅｙ Ｌ、Ｃｈｅｎ ＣＪら、（２００３年）ＰＤＧＦＲＡ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９巻：７０８〜７１０頁
【非特許文献２２】Ｂａｘｔｅｒ ＥＪ、Ｈｏｃｈｈａｕｓ Ａ、Ｂｏｌｕｆｅｒ Ｐ、Ｒｅｉｔｅｒ Ａ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＪＭら、（２００２年）Ｔｈｅ ｔ（４；２２）（ｑ１２；ｑ１１）ｉｎ ａｔｙｐｉｃａｌ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｆｕｓｅｓ ＢＣＲ ｔｏ ＰＤＧＦＲＡ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １１巻：１３９１〜１３９７頁
【非特許文献２３】Ｙｕ Ｊ、Ｕｓｔａｃｈ Ｃ、Ｋｉｍ ＨＲ（２００３年）Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６巻：４９〜５９頁
【非特許文献２４】Ｂｏａｒｄ Ｒ、Ｊａｙｓｏｎ ＧＣ（２００５年）Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＤＧＦＲ）：ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ Ｕｐｄａｔ ８巻：７５〜８３頁
【非特許文献２５】Ｋａｂｂｉｎａｖａｒ Ｆ、Ｈｕｒｗｉｔｚ ＨＩ、Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ Ｌ、Ｍｅｒｏｐｏｌ ＮＪ、Ｎｏｖｏｔｎｙ ＷＦら、（２００３年）Ｐｈａｓｅ ＩＩ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｐｌｕｓ ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（ＦＵ）／ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ（ＬＶ）ｗｉｔｈ ＦＵ／ＬＶ ａｌｏｎｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２１巻：６０〜６５頁
【非特許文献２６】ＭｃＡｒｔｈｕｒ ＧＡ、Ｄｅｍｅｔｒｉ ＧＤ、ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｒｏｍ Ａ、Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ＭＣ、Ｄｅｂｉｅｃ−Ｒｙｃｈｔｅｒ Ｍら、（２００５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｏｃａｌｌｙ ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｅｒｍａｔｏｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍａｔｉｎｉｂ：Ｉｍａｔｉｎｉｂ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｓｔｕｄｙ Ｂ２２２５．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３巻：８６６〜８７３頁
【非特許文献２７】Ｍａｔｈｅｗ Ｐ、Ｔｈａｌｌ ＰＦ、Ｊｏｎｅｓ Ｄ、Ｐｅｒｅｚ Ｃ、Ｂｕｃａｎａ Ｃら、（２００４年）Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｍｅｓｙｌａｔｅ ａｎｄ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ：ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｉｎ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２巻：３３２３〜３３２９頁
【非特許文献２８】Ｋｕｂｏ Ｔ、Ｐｉｐｅｒｄｉ Ｓ、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ Ｊ、Ａｎｔｏｎｅｓｃｕ ＣＲ、Ｃｈｅｎ Ｗら、（２００８年）Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｍｅｓｙｌａｔｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ １１２巻：２１１９〜２１２９頁
【非特許文献２９】Ｋａｇａｍｉ Ｓ、Ｋａｋｉｎｕｍａ Ｔ、Ｓａｅｋｉ Ｈ、Ｔｓｕｎｅｍｉ Ｙ、Ｆｕｊｉｔａ Ｈら、（２００５年）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｒｕｍ ＣＣＬ２８ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ａｎｄ ｂｕｌｌｏｕｓ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２４巻：１０８８〜１０９０頁
【非特許文献３０】Ｊａｈｎｚ−Ｒｏｚｙｋ Ｋ、Ｔａｒｇｏｗｓｋｉ Ｔ、Ｇｌｏｄｚｉｎｓｋａ−Ｗｙｓｚｏｇｒｏｄｚｋａ Ｅ、Ｐｌｕｓａ Ｔ（５８５ ２００３年）Ｃｃ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｅｏｔａｘｉｎ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ＩｇＥ５８７ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ ５８巻：５９５〜６０１頁
【非特許文献３１】Ｒｏｂａｋ Ｅ、Ｋｕｌｃｚｙｃｋａ Ｌ、Ｓｙｓａ−Ｊｅｄｒｚｅｊｏｗｓｋａ Ａ、Ｗｉｅｒｚｂｏｗｓｋａ Ａ、Ｒｏｂａｋ Ｔ（２００７年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＰＩＧＦ、ＳＤＦ−１ ａｎｄ ｓＶＣＡＭ−１ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ １８巻：１８１〜１８７頁
【非特許文献３２】Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ、Ｄｅｗａｌｄ Ｂ、Ｍｏｓｅｒ Ｂ（１９９４年）Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ−ＣＸＣ ａｎｄ ＣＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ．Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５５巻：９７〜１７９頁
【非特許文献３３】Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ＭＪ、Ｃｌａｙｍａｎ ＧＬ（２００１年）Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ３巻：１〜１８頁
【非特許文献３４】Ｂｒａｕｄｅ ＥＡ、Ｎａｃｈｏｄ ＦＣ（１９５５年）Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献３５】Ｄｅｎｉｚｌｉ Ａ、Ｐｉｓｋｉｎ Ｅ（２００１年）Ｄｙｅ−ｌｉｇａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４９巻：３９１〜４１６頁
【非特許文献３６】Ｓｅｒｅｉｋａｉｔｅ Ｊ、Ｂｕｍｅｌｉｓ ＶＡ（２００６年）Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｇｅｌ−ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ２０巻：１９５〜１９９頁
【非特許文献３７】Ｆｒｅｄｏｌｉｎｉ Ｃ、Ｍｅａｎｉ Ｆ、Ｒｅｅｄｅｒ ＫＡ、Ｒｕｃｋｅｒ Ｓ、Ｐａｔａｎａｒｕｔ Ａら、（２００８年）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｕｒｉｎｅ，ｓｕｃｈ ａｓ Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ（ｈＧＨ），ｂｙ Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３Ｇ−Ａ Ｌｏａｄｅｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｎａｎｏ Ｒｅｓ １巻：５０２〜５１８頁
【非特許文献３８】Ｕｅｋａｍａ Ｋ、Ｈｉｒａｙａｍａ Ｆ、Ａｒｉｍａ Ｈ（２００６年）Ｒｅｃｅｎｔ Ａｓｐｅｃｔ ｏｆ Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｐｈｅｎｏｍ Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ ５６巻：３〜８頁
【非特許文献３９】Ｊｉｎ Ｓ、Ｌｅｅ Ｙ、Ｋａｎｇ Ｈ Ｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ．Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ ８巻：４５１〜４５４頁
【非特許文献４０】Ｃａｉ Ｗ、Ｙａｏ Ｘ、Ｓｈａｏ Ｘ、Ｐａｎ Ｚ（２００５年）Ｂｉｍｏｄａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ｗｉｔｈ Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ ｂｙ ａ Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｄｏｃｋｉｎｇ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ｊ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｐｈｅｎｏｍ Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ ５１巻：４１〜５１頁
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従来技術の側方流動免疫測定は、サンドイッチ型免疫測定が代表的であり、そこでは、抗体対の一方のメンバーが、金コロイド粒子または発色ビーズなどの視覚的タグまたはシグナル発生タグで標識されており、他方のメンバーの抗体が固相に結合されている。抗体対の標識されたメンバーおよび混合物と共にインキュベートされた被検体を、該対のうち固定化されている抗体メンバーを横切るように滲出させる。被検体が存在すれば、標識抗体と固定化抗体との間にサンドイッチが形成され、それにより固定化抗体の区域において検出可能なシグナルが生じることになる。本発明は、被検体親和性ベイト（ｂａｉｔ）を含有する多孔性ヒドロゲルナノ粒子を、目的被検体の前処理および前濃縮および保存の手段として使用する手段を提供する。本発明は、ポイントオブケアの状況または屋外において、免疫測定の感度を向上させ、被検体を分解から保護する手段を提供する。１つの実施形態では、試料液体（例えば、尿または血液）中の被検体を、乾燥形態のナノ粒子を含有する収集チャンバーに導入する。ナノ粒子は試料中に分散され、標的被検体を直ちに隔離する。９９パーセントを超える隔離効率が多種多様な被検体で達成された。隔離された被検体は、粒子内の親和性ベイトに固定化されるため、分解から独特に保護される。このように、大量試料容積中の被検体の総含有量を、低容積の粒子中に濃縮することができる。容積濃縮係数は、１０〜１００倍であり得る。本主題発明に基づくと、被検体を含有する試料液体をナノ粒子と接触させた後、粒子を含有する試料液体を、ニトロセルロース、酢酸セルロース、多孔性ガラス、ガラス繊維、または紙などの透過性多孔性マトリックスへと受動的に滲出させる。滲出物質の細孔径は、粒子が多孔性マトリックス内を移動しないように選択される。このステップの後、粒子は、多孔性マトリックスへの液体進入地点で捕捉され、試料液体の容積すべては、捕捉されたナノ粒子を通って滲出してしまっているだろう。この時点で、粒子内に捕捉された被検体は、親和性ベイトに結合しているため、開始試料溶液から完全に回収され、はるかに小さな容積中に濃縮され、分解から保護される。この時点で、収集された被検体は、今や小さな容積中で安定化されており、保管するかまたは出荷することができる。
【０００９】
この時点で、使用者は、ナノ粒子内に存在する捕捉された被検体を測定または分析する準備ができており、ナノ粒子内から結合被検体を分離し、濃縮された被検体の分析デバイスへの溶出およびキャピラリー滲出を可能にする溶出緩衝液を導入する必要があるだけである。好ましい実施形態の１つでは、ナノ粒子の出口溶出液は、測定を完全させるために標準的サンドイッチ免疫測定の入口へと直接的に流入する。図１〜３に示されているように、側方流動アッセイデバイスは、それが２つの状態のうちの１つであり得るように構成される。状態１では、被検体を含有していた試料液体は不要物として先に滲出し、下流の免疫測定に寄与する。状態２では、溶出緩衝液が導入され、液体浸透経路が変更されて、溶出液がサンドイッチ免疫測定に進入することが可能になる。そのような状態の変化により、捕捉されたナノ粒子から被検体が出でくる地点で液体浸透経路が切替えられる。これは、図に示されているように、２つの滲出マトリックスストリップをそれらが接触に至るように屈曲させ、被検体が標識抗体と遭遇する免疫測定進入口へと流れを転進させることにより達成することができる。さらなる実施形態では、ナノ粒子は、被検体を含有する試料液体がナノ粒子を通って受動的にまたは能動的にろ過されて被検体のナノ粒子隔離が達成されるよう、粒子が開始試料溶液に懸濁される代りに滲出マトリックスにあらかじめ負荷されている。
【００１０】
本発明の捕捉粒子は、ａ）分子ふるい部分、およびｂ）被検体結合部分を含むヒドロゲルナノ粒子であり、分子ふるい部分、被検体結合部分、またはその両方は、多孔度が改変された架橋区域をさらに含む。ナノ粒子は、標的被検体を回収、濃縮、および分解から保護するために使用される。
【００１１】
１つの実施形態では、本発明は、ヒドロゲルナノ粒子を、液体収集容器または多孔性基層のいずれかに、マイクロ流体免疫測定デバイスの一部として組み込むことを記述する。ヒドロゲルナノ粒子は、タンパク質、ペプチド、もしくは核酸に基づくバイオマーカー、または他の低分子量被検体を隔離、濃縮、および分解から保護する手段として機能する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、ヒドロゲルナノ粒子を免疫測定デバイスの流動帯内に固定化し得る方法について記述する。ヒドロゲルナノ粒子は、試料沈着用の多孔性マトリックスチャンバー内に含浸されていてもよい。試料液体（生物学的であってもよく、または非生物学的であってもよい）は、ヒドロゲルナノ粒子チャンバーを通過して所望の被検体をナノ粒子内に隔離し、不要な試料液体を先に滲出させることを可能にする。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、ヒドロゲル粒子を試料収集デバイス内に含有させ得る方法を記述する。試料収集デバイスに設置されたヒドロゲルナノ粒子は、分子サイズふるい、親和性被検体隔離、濃縮、および分解からの保護を可能にする。残りの試料液体は、収集デバイスから滲出して先に出ていき、要望の被検体は、抽出緩衝液を使用して免疫測定デバイスを通って輸送される。
【００１４】
別の実施形態は、全血、ならびに尿、脳脊髄液、汗、唾液、乳頭吸引液、呼気凝縮液、気管支肺胞洗浄液、および羊水などの他の体液、ならびに環境水試料などの非生物学的液体中に存在する個々の種類の低分子量分子に特異的な複数の亜集団を含有する回収用ナノ粒子の集団を含有する側方流動免疫測定を記述する。複数の亜集団を含有するデバイスは、単一デバイス構成で、複数の被検体を同時に定量化する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】側方流動免疫測定デバイスにアプライする前に試料液体を前処理する収集デバイス（１０）を使用して試料を収集する方法を示す図である。血液試料を指（２０）から採取し、キャピラリースロットである試料収集デバイス（３０）を既知量の血液で満たす。その後、試料を緩衝液（４０）に分散させ、試料はそこでＬＦＡ用に前処理される。
【図１ｂ】基層に含浸されたナノ粒子を有する側方流動免疫測定デバイスの設計を示す図である。試料アプライ側には、２つの区画（５０）があり、１つは前処理された試料を添加するためのものであり、１つは溶出液を添加するためのものである。ナノ粒子で含浸されているストリップ部分（６０）も存在する。測定側には、抗体および金粒子を含有するストリップ部分（７０）がある。サンドイッチアッセイを生成する別のセットの抗体を含有する部分（８０）も存在する。この第２の抗体群の上には、測定窓（９０）がある。
【図２】基層に含浸されたナノ粒子を有する側方流動免疫測定デバイスの設計を示す図であり、固定されているヒドロゲルナノ粒子から標的被検体が溶出されるまで、ＬＦＡの試料アプライ部分は、測定部分と離れている（１００）。試料は、試験ストリップ（１１０）に添加され、その後ストリップに含浸されているナノ粒子部分（１２０）を通って移動する。液体緩衝液および試料は、液体が端部（１４０）で吸収されるまでストリップ（１３０）を流動していく。第２のステップは、ナノ粒子と第１のセットの抗体との間の接触（１５０）がもたらされることを必要とする。接触がもたらされた後、粒子は溶出され（１６０）、標的被検体は測定ライン（１７０）へと移動していく。
【図３】ＬＦＡ試験ストリップに含浸される代りに初期試料と混合されているヒドロゲルナノ粒子を捕捉するための疎性網目部分（１９０）を有する側方流動免疫測定デバイスの設計を示す図である。ステップ１の略図では、試料は網目に隣接している容器（１８０）を介してストリップに導入され、緩衝液は、ストリップ（２００）の長さを先に滲出していく。略図のステップ２では、溶出液は、ナノ粒子の上（２１０）に添加され、標的被検体は、測定窓（２２０）に向かってストリップを移動していく。
【図４】コアシェル粒子（２３０）の略図を示す図である。ナノ粒子は、ベイトとして機能するＮＩＰＡｍ−ＡＡｃコア（２７０）で構成される。タンパク質溶液に粒子を添加した後（２４０）、バイオマーカーは、このベイトに誘引および捕捉される（２５０）。ＮＩＰＡｍシェル（２６０）は、ナノ粒子のふるい特性を増大させる。
【図５】ナノ粒子の光散乱および原子間力顕微鏡による特徴付けを示す図である。（Ａ） 室温では、コアは、サイズがおよそ３６０ｎｍであるが、付加コア−シェル粒子は、ｐＨ４．５で７００ｎｍの直径を有する。コアおよびコアシェル粒子は、典型的な温度依存性挙動に従う。（Ｂ）ＭｉｌｌｉＱ水中の粒子懸濁液（ｐＨ５．５、１μｇ／ｍＬ）を、室温、加湿雰囲気下で１５分間、新しく劈開されたマイカ上に配置し、窒素下で乾燥した。ナノ粒子の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を取得した。粒子は、およそ８００ｎｍの直径を有しており、均一なサイズ分布を示す。粒子の高さについてのスケールバーは、１６８ｎｍの最大高さを示す。ＡＦＭ画像は乾燥状態下で取得されたため、粒子は、マイカ表面で乾燥することによりそれらの球形状から歪められている（平らにされている）。
【図６】粒子と共にインキュベートされたＰＤＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。（Ａ）レーン１）ＢＳＡおよびＰＤＧＦを含有する開始溶液（対照）、２）上清（外）；３）粒子内容物（内）。粒子は、担体アルブミンからＰＤＧＦを取り除き、アルブミン自体を完全に排除する。（Ｂ）レーン１）ＰＤＧＦ、ＢＳＡ、アプロチニン（ＭＷ６，５００Ｄａ）、リゾチーム（ＭＷ１４，４００ ６７３Ｄａ）、トリプシン阻害剤（ＭＷ２１，５００Ｄａ）、炭酸脱水酵素（ＭＷ３１，０００Ｄａ）、およびオバルブミン（ＭＷ４５，０００ ６７５Ｄａ）を含有する開始溶液（対照）、２）上清（外）；３）粒子内容物（内）。粒子は、低分子量タンパク質と一緒にＰＤＧＦを回収し、およそ２０，０００Ｄａを超えるタンパク質を除外する。
【図７】コアシェル粒子が、検出不能なＰＤＧＦの濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイの検出範囲に上昇させることを示す図である。（Ａ）較正物質希釈液ＲＤ６−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、保存剤を有する動物血清）中１８．９２±４．３１３ｐｇ／ｍＬの濃度のＰＤＧＦ開始溶液、およびコア−シェル粒子から溶出されたＰＤＧＦ（８５．２７±２．２４ｐｇ／ｍＬ）のＥＬＩＳＡ測定値。（Ｂ）インキュベーション重複実験に使用された粒子の量に対してプロットされた、コア−シェル粒子溶出液中のＰＤＧＦ濃度。（Ｃ）ＰＤＧＦ濃度対吸光度のＥＬＩＳＡ検量６８４線。検量線は、各ＰＤＧＦ較正物質濃度につき２回反復で生成された。
【図８】コアシェル粒子が、非常に希釈されたＰＤＧＦの濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定したところ、およそ１０倍（１０００パーセント）増加させることを示す図である。（Ａ）較正物質希釈液ＲＤ６−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、保存剤を有する動物血清）中６３．６９±１．４４８ｐｇ／ｍＬの濃度のＰＤＧＦ開始溶液、およびコア−シェル粒子から溶出されたＰＤＧＦ（４９１．１４±４．８１８ｐｇ／ｍＬ）のＥＬＩＳＡ測定値。（Ｂ）インキュベーション重複実験に使用された粒子の量に対してプロットされた、コア−シェル粒子溶出液中のＰＤＧＦ濃度。６９４（Ｃ）ＰＤＧＦ濃度対吸光度のＥＬＩＳＡ検量線。検量線は、各ＰＤＧＦ較正物質濃度につき２回反復で生成された。
【図９】コアシェル粒子が、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定したところ、血清中の未処理ＰＤＧＦの濃度を増加させることを示す図である。（Ａ）較正物質希釈液ＲＤ６−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、保存剤を有する動物血清）中１７０．９１±４．６６ｐｇ／ｍＬの濃度の開始血清溶液、およびコア−シェル粒子から溶出されたＰＤＧＦ（１７４３．４３±１１．０６ｐｇ／ｍＬ）のＥＬＩＳＡ測定値。（Ｂ）インキュベーション重複実験に使用された粒子の量に対してプロットされた、コア−シェル粒子溶出液中のＰＤＧＦ濃度。（Ｃ）ＰＤＧＦ濃度対吸光度のＥＬＩＳＡ検量線。検量線は、各ＰＤＧＦ較正物質濃度につき２回反復で生成された。
【図１０】粒子によるケモカイン取り込みを示すＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。コア−シェル粒子を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下において、以下のケモカインと共にインキュベートした：粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ／ＣＣＬ２８）、ストロマ細胞由来因子−１ベータ（ＳＤＦ−１β／ＣＸＣＬ１２ｂ）、およびエオタキシン−２（ＣＣＬ２４）。ケモカインおよびＢＳＡの溶液は、レーン１、４、および７に示されている。粒子と共にインキュベーションした後、上清中に残存するケモカインはなく（Ｓ、レーン２、５、および８）、ケモカインはすべて粒子により捕捉された（Ｐ、レーン３、６、および９）。ＢＳＡは、粒子により完全に除外された。
【図１１】コア−シェル粒子が、捕捉されたＰＤＧＦをトリプシン分解から保護することを示す免疫ブロット分析を示す図である。（Ａ）Ｓｙｐｒｏ ｒｕｂｙによる全タンパク質染色、および（Ｂ）同一ＰＶＤＦ膜の抗ＰＤＧＦ抗体による免疫ブロット分析が示されている。レーン１）対照ＰＤＧＦ＋ＢＳＡ溶液；２）ＰＤＧＦ＋ＢＳＡと共にインキュベートされた粒子の内容物（内）；３）ＰＤＧＦ＋ＢＳＡと共にインキュベートされた粒子の上清（外）；４）ＢＳＡ＋ＰＤＧＦ＋トリプシンと共にインキュベートされた粒子の内容物（内＋トリプシン）；５）ＢＳＡ＋ＰＤＧＦ＋トリプシンと共にインキュベートされた粒子の上清（外＋トリプシン）；６）粒子なしで４０分間インキュベートされたＢＳＡ＋ＰＤＧＦ＋トリプシン（＋トリプシン４０’）；７））粒子なしで２０分間インキュベートされたＢＳＡ＋ＰＤＧＦ＋トリプシン（＋トリプシン２０’）；８））粒子なしで１０分間インキュベートされたＢＳＡ＋ＰＤＧＦ＋トリプシン（＋トリプシン１０’）；９））粒子なしで０ ７２７分間インキュベートされたＢＳＡ＋ＰＤＧＦ＋トリプシン（＋トリプシン０’）。
【図１２】コア−シェル粒子がケモカインを酵素分解から保護することを示すＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。コア−シェル粒子を、トリプシンの存在下において、以下のケモカインと共にインキュベートした：粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ／ＣＣＬ２８）、ストロマ細胞由来因子−１ベータ（ＳＤＦ−１β／ＣＸＣＬ１２ｂ）、およびエオタキシン−２（ＣＣＬ２４）。ケモカインの溶液（対照）は、レーン１、４、および７に示されている。粒子と共にインキュベートされたケモカイン（レーン３、６、および９）は、トリプシン分解から保護されるが、粒子と共にインキュベートされなかったケモカイン（レーン２、５、および８）は、タンパク質分解性消化に感受性である。黒色ボックスは暗色ブロットを表し、斜線ボックスは画像の明色ブロットを表す。
【図１３】ヒト血清中にスパイクされたＰＤＧＦの回収を実証する免疫ブロット分析を示す図である。レーン１）ヒト血清＋ＰＤＧＦ（５ｎｇ／μＬ）：血清が粒子と共にインキュベートされない場合、ＰＤＧＦは検出することができない；２）粒子上清（外）；３）粒子内容物（内）；４）ヒト血清＋ＰＤＧＦ（２ｎｇ／μＬ）：血清が粒子と共にインキュベートされない場合、ＰＤＧＦは検出することができない；５）粒子上清（外）；６）粒子内容物（内）。 黒色ボックスは暗色ブロットを表し、斜線ボックスは画像の明色ブロットを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１ａに示されているように、試料希釈液を含有する滴瓶バイアルの一体化部分である細棒の端部にあるキャピラリースロットにより、一定容積の試料を収集することができる。これは、当分野において、手掌採血で試料を収集し、再現性のある容積稀釈を実施するための手段である。希釈バイアルは、懸濁されている本発明のナノ粒子を含有することができる。溶液中にナノ粒子を含有する試料を漏斗状開口部が受容するように、滴瓶バイアル中の試料を該デバイスに導入し、被検体を含有するナノ粒子を、滲出進入口でろ過する。
【００１７】
図１ａに示されている方法が完了すると、前処理された試料は、図１ｂに示されているように、側方流動免疫測定デバイス内で二段階分析法にかけられる。免疫測定デバイスは、ａ）試料アプライ側、およびｂ）測定側を備えており、それらは互いにサンドイッチされる。試料アプライ側は、前処理された試料および溶出緩衝液が添加される一方の端部に２つの別々のスロットを含有し、該ストリップの反対側の端部に吸収パッドを含有するストリップである。２つの端部の間で、該スロットの一方の下方には、捕捉粒子を含浸させたストリップの区画がある。該デバイスの測定側は、ａ）標的被検体の１つのエピトープに誘引される抗体および金粒子を含有する捕捉粒子の下方にある区域、ｂ）抗体の第１の区域とは異なる標的被検体のエピトープに誘引される抗体の区域、ｃ）抗体の第２の区域付近の測定窓、およびｄ）吸収性パッドを備える。図１ｂに例示されている方法の第１のステップでは、前処理された試料が、第１のスロットに添加される。試料は、捕捉粒子の区域を通過して、ストリップの長さを移動していく。捕捉粒子は、試料から標的被検体を回収し、試料の残りは、端部の吸収性パッドに向かって先に滲出していく。第１のステップが完了すると、その時点で標的被検体を含有している捕捉粒子の区域の上方にある第２のスロットに、溶出緩衝液が直接添加される。被検体は、捕捉粒子から溶出され、第１のセットの抗体および金の粒子を含有している区域へと移動する。抗体は標的被検体に結合し、試料は抗体の第２の区域に向かってストリップを移動いていく。標的被検体は、抗体の第２の区域に結合し、２つのセットの抗体の間にサンドイッチされる。これが生じると、該デバイスの測定窓において色の変化が観察される。試料の残りは、端部の吸収性パッドに向かってストリップの長さを移動し続ける。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、該デバイスの試料アプライ側および測定側は、図２に示されているように、最初は空隙により分離されている。この実施形態では、捕捉粒子の区域は、２つの区域を一緒に押し、つまみを回し、分離タブを引き抜き、該デバイスの試料アプライ層を膨潤させることにより、または２つの区域の接触をもたらす他の幾つかの手段により、溶出中に抗体の第１の区域に接触するに至る。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、捕捉粒子は、図３に示されているように、側方流動デバイスに含浸させるのではなく、試料に直接添加される。捕捉粒子が標的被検体を回収すると、その後、捕捉粒子を捕捉する疎性網目区画を有する該デバイスの試料部位に試料をアプライし、試料の残りが端部の吸収性パッドに向かって先に滲出していく際に、側方流動免疫測定の第１のステップが生じる。第２のステップには、図３に示されているように、捕捉粒子から標的被検体を抽出する疎性網目に抽出緩衝液を添加して、被検体が、該デバイスの測定側に含有されているサンドイッチアッセイを通って移動することを可能にさせることが伴う。
【００２０】
したがって、本明細書に記述されている本発明の実施形態は、本発明の原理の応用の例示に過ぎないことが理解されるべきである。例示されている実施形態の詳細を本明細書で参照することは、本発明にとって不可欠であると見なされる特徴をそれら自体が列挙している特許請求の範囲を制限することを意図しない。
【実施例１】
【００２１】
１．バイオマーカー測定における主要な問題は、血液中のマーカー候補の含有量（濃度）が非常に低いことであり、マーカー候補は、質量分析および従来の免疫測定の検出限界未満で存在する。初期段階の疾患では、患部組織は患者の組織容積の少しの割合を占めているだけであるため、そのような低含有量が予測されるだろう。初期段階の疾患検出は、一般的により良好な全体的患者予後を提供する。
【００２２】
２．バイオマーカーの発見および測定の第２の主要な問題は、循環血漿タンパク質の９０％を占める、アルブミンおよび免疫グロブリンなどの常在性タンパク質の圧倒的な含有量であり、それにより、希少バイオマーカーの単離が妨害および隠蔽される［６］。実際、低含有量バイオマーカーの大部分は、希少バイオマーカーと比較して１０億倍の過剰量で存在するアルブミンなどの担体タンパク質と非共有結合で内因性に結合している［７］。
【００２３】
バイオマーカー測定の第３の主要な課題は、低含有量バイオマーカーは、血液試料を患者から採取した直後から内因性および外因性プロテイナーゼにより急速に分解される傾向があるということである。バイオマーカー候補の分解は、血液の輸送および保管中にも生じ、著しい偽陽性および偽陰性の結果をもたらす［８］。
【００２４】
ナノテクノロジーの分野は、バイオマーカー発見に対するこれら３つの根本的な生理学的障害に取り組むための新しい手法を提供する。最近、本発明者らは、これら３つの障害を溶液中で１ステップで克服する高機能ヒドロゲルコアシェルナノ粒子を設計した［９］。ヒドロゲル粒子は、環境的な引き金、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度、または電場を適用した結果として膨潤および収縮することが可能である親水性ポリマーで構成されるサブマイクロメートルサイズの架橋粒子である［１０〜１４］。ヒドロゲル粒子は、生体適合性が高く、独特の生理化学的特性を有するため、生体医学およびバイオテクノロジーにおいて広範囲の応用を有する［１５〜１８］。
【００２５】
ナノ粒子は、分子ふるいクロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーを溶液中で１ステップで同時に実施する［９］。粒子の親和性マトリックス内に捕捉および結合された分子は、外因性または内因性のプロテアーゼによる分解から保護される。この実行可能性研究は有望だったが［９］、そのようなヒドロゲル粒子技術が、臨床的に関連した、非常に不安定で、含有量が非常に低いバイオマーカーに応用可能であることを示し得るかどうかはこれから証明されなければならなかった。この課題に取り組むために、本発明者らは、新しい種類のコア−シェル粒子を生成し、モデルバイオマーカーである血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を特異的に捕捉するコアベイトを個別に作製した。現実世界の問題に対するヒドロゲル粒子の応用可能性を研究するために、非常に低濃度（３ｎｇ／ｍＬ）で血液中に存在し、半減期が短い（２分）ため［１２］、ＰＤＧＦを癌関連バイオマーカー分析の非常に困難なモデルとして選択した。ＰＤＧＦは、細胞表面チロシンキナーゼ受容体を介してシグナル伝達するペプチド増殖因子のファミリーであり、成長、増殖、および分化を含む種々の細胞機能を刺激する。異なる遺伝子（染色体４、７、１１、２２）によりコードされた異なる４つのポリペプチド鎖（ＰＤＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、および−Ｄ）が、記述されている［１９、２０］。ＰＤＧＦは、腫瘍進行中の血管新生および腫瘍間質圧力レベルに役割を果たす［２１〜２３］。ＰＤＧＦおよびその受容体を標的とするように設計された、いくつかの新しい治療薬が、現在、腫瘍学臨床で使用されている［２４〜２８］。ＰＤＧＦは、このような治療診断価値（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ）が知られているにも関わらず、この低分子量増殖因子の含有量が極端に低く、非常に不安定であるため、臨床において日常的におよび正確に測定することができない。ＰＤＧＦの他に、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ２４、およびＣＸＣＬ１２などの、含有量が非常に低く非常に不安定な一連の追加的なケモカインの隔離および分解からの保護を確認した。これらケモカインは、それぞれ４４ｐｇ／ｍＬ［２９］、１０３ｐｇ／ｍＬ［３０］、および１．５ｎｇ／ｍＬ［３１］の血清中濃度を有する。ケモカインの血中半減期は非常に短く、１０分未満である［３２］。ケモカインは、白血球の遊走を指図し、炎症応答を活性化し、腫瘍成長に寄与する小型サイトカインである。ケモカインは、３つの重要な機序：腫瘍関連血管新生の制御、宿主の腫瘍特異的免疫学的応答の活性化、および自己分泌様式での腫瘍細胞増殖の直接刺激により腫瘍挙動を調節する。これら機序はすべて有望な薬物標的である［３３］。
【００２６】
多孔性ラテックスへのベイト分子の組み込みは、ヒドロゲル粒子が溶液中の分子の取り込みを推進する際に、粒子との結合に向けて平衡状態をシフトさせ、捕捉された分子が分解から保護されることを保証する。ベイトは、化学部分を担持するモノマーの共重合により、または既に形成されたヒドロゲル粒子と共有結合している化学部分を負荷することにより導入することができる。
【００２７】
ａ）タンパク質およびペプチド、ｂ）代謝産物、ｃ）脂質および脂肪酸、ｄ）核酸、ならびにｅ）翻訳後修飾されたペプチド（例えば、グリコシル化およびリン酸化）などの多様な範囲のバイオマーカーに選択的に結合し濃縮するために、様々な種類のベイト化学を生成した。ベイト化学には、電荷に基づくベイト（アクリル酸、アリルアミンコモノマー）、トリアジン負荷染料（シバクロンブルー）、ベータ−シクロデキストリン、ボロン酸が含まれる。
【００２８】
アクリル酸は、３．５を超えるｐＨ値で脱プロトン化され、したがって、正荷電ポリペプチドおよびタンパク質を標的とする負電荷を担持する。アリルアミン（ｐＫ＝９．６９［３４］）は、正味負電荷を有するポリペプチドおよびタンパク質に対するベイトとして作用する。荷電粒子に対するポリペプチドの親和性は、担体タンパク質に対するポリペプチドの親和性より高いことが証明されており、タンパク質の等電点および粒子の解離定数の値に依存する［９］。荷電粒子１４１の回収および濃縮特性は、溶液のｐＨおよびイオン強度に依存する。
【００２９】
代替的ベイト戦略は、ＮＩＰＡｍに基づく粒子にトリアジン由来の繊維染料（シバクロンブルー Ｆ３Ｇ−Ａ、プロシオンレッド Ｈ８ＢＮ）を負荷することである［３５］。染料は、低価格であり、分子認識が高度に特異的であるため、親和性クロマトグラフィーで使用されてきた［３６］。本発明者らは、シバクロンブルー染料を負荷したヒドロゲル粒子の合成に成功し、それらが、小型タンパク質およびホルモンを尿から効果的に取り込むことを実証した［３７］。
【００３０】
加えて、シクロデキストリンをヒドロゲル粒子に結合させた。シクロデキストリンは、親油性内部空洞および親水性外側表面を有する環式グルコースオリゴ糖であり、疎水性ゲスト分子と相互作用して非共有結合による複合体を形成可能であり、薬物送達の媒介体として広範に使用されている［３８］。シクロデキストリンは、コレステロール［３９］、ステロイド［４０］、ＤＯＰＡ［４１］に結合することが示されている。好適なサイズおよび好ましくは疎水性の特徴を有するゲスト分子を誘引および安定化する力は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用であると考えられている［４２］。
【００３１】
さらに、本発明者らは、標的生体分子のジオール基と複合体を形成することが知られているボロン酸基を含有する粒子を設計した。ボロン酸イオンは、ヌクレオチド、ＲＮＡ、糖化タンパク質、および糖酵素の選択的単離に関与する親和性クロマトグラフィー応用に使用されている［４３〜４８］。
【００３２】
コア−シェル構造では、ベイト含有区域は、多孔性シェルにより覆われている。コア−シェルヒドロゲル粒子は、コアおよびシェルの特性を別々に個別調製することができるため、特に有益である。薬物送達に使用される多くのコア−シェル粒子系では、その目的の応用に必要とされる特性を有するようにコアが設計される［１２、４９〜５１］。その後、別々にシェルが加えられて、コアが取り囲まれ遮蔽される。シェルの厚さを改変して、透過性または多孔度を変更することができる。
【００３３】
本研究において、本発明者らは、溶液中でタンパク質に対する親和性結合を実施するために、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ）−アクリル酸（ＡＡｃ）コアが、電荷に基づくベイトを含有し、ＮＩＰＡｍシェルが、コアを取り囲んでおり、シェルの多孔度を透過するのには大きすぎる溶液相のタンパク質を除外するためのふるいとして作用するコア−シェル粒子を合成した（図４）。ＮＩＰＡｍに基づく粒子は、それらの多孔性構造により、明確な分子サイズカットオフで大型分子を除外する。多孔性の度合いは、モノマーに関しては、架橋剤Ｎ，Ｎ’メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）の割合を変更することにより調整することができる。同時に、粒子は、ポリペプチドおよび他の低分子がポリマーマトリクスを透過し、希少タンパク質バイオマーカーの濃縮を可能にするのにも好ましい条件を供給する大量の水を吸収することができる［１４］。
【００３４】
本発明者らは、３つの独立実験系を使用して、この新粒子が、以下を達成することができるかどうかを試験した：ａ）全血清を含む、高含有量タンパク質の複雑な混合液内にある溶液相ＰＤＧＦおよびケモカイン分子をすべて迅速に回収すること、ｂ）アルブミンなどの高含有量タンパク質を完全に除去し、捕捉したＰＤＧＦおよびケモカインを、開始容積のほんの一部だった低容積中に放出すること。この濃縮ステップは、検出可能なマーカーレベルを低容積で増大させる能力を示し、これは、免疫測定プラットフォームまたは質量分析法などの測定系への入力に必要とされ、およびｃ）捕捉されたＰＤＧＦおよびケモカインを、高濃度で導入される外因性分解酵素による分解から保護すること。本研究のために使用した３つの独立した実験手法は、１）臨床等級のＥＬＩＳＡ免疫測定、２）開始溶液、上清、および粒子内容物のゲル電気泳動、その後の免疫ブロット、ならびに３）粒子捕捉溶出物と比較した、開始溶液の質量分析であった。
【００３５】
本研究の目的は、理論的な想定通りにバイオマーカーを濃縮および保存するコア−シェル粒子の能力を調査することであった。
【００３６】
結果
粒子合成および特徴付け
本研究で使用される粒子構造の場合、ＮＩＰＡｍシェルは、親和性ベイト部分を含有するＮＩＰＡｍ／ＡＡｃコアを取り囲んでいる。ＮＩＰＡｍシェルのふるい能力は、存在する可能性があり、低含有量で低分子量の目的分子標的と、コアの親和性ベイトに対する結合を競合することができるより大型の分子から、コアおよびその親和性ベイト基を遮蔽する。コアおよびコア−シェル粒子のサイズを比較するために、光散乱による特徴付けを、粒子に対して合成中およびプロセスの終了時に実施した。２５℃およびｐＨ４．５でのコア直径は、３６４．７±４．３ｎｍであり、同じ条件におけるコア−シェル粒子の直径は、６９９．４±６．２ｎｍである（図５Ａ）。これは、シェルの厚さが約１７０ｎｍであることを示唆する。ヒドロゲルを含有するＡＡｃの特徴的挙動に従って、コアおよびコア−シェル粒子のサイズは両方とも、温度の上昇およびｐＨの低下に従って減少した（図５Ａ）。粒子を、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によりさらに特徴付けた。ＡＦＭの粒子画像（図５Ｂ）は、サイズの均一性を確認し、ＡＦＭによる粒子直径の測定値は、光散乱で測定されたものと一致した。粒子濃度は、凍結乾燥された粒子を計量することにより取得したところ、１０ｍｇ／ｍＬであり、１ミリリットル当たりの粒子数は２億３０００万個であった。
【００３７】
コア−シェル粒子によるＰＤＧＦの分子ふるいおよび濃縮
ヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、ＭＷ１４，５００Ｄａ）を、ＰＤＧＦと結合する担体タンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＭＷ６６，０００Ｄａ）を含有する溶液にスパイクし、ＰＤＧＦ−ＢＳＡ溶液に添加されたコア−シェルヒドロゲルナノ粒子は、ＢＳＡと粒子との結合が検出されないことにより立証される分子ふるいとして作用し、粒子は、ＢＳＡを完全に除外し、溶液相ＰＤＧＦをすべて完全に隔離した（図６Ａ）。これは、ベイトに対するＰＤＧＦ親和性が、担体ＢＳＡの親和性より高かったことを示唆する。コア−シェル粒子の分子ふるい特性をさらに評価するために、ＰＤＧＦ、ＢＳＡ、アプロチニン（ＭＷ６，５００Ｄａ）、リゾチーム（ＭＷ１４，４００Ｄａ）、トリプシン阻害剤（ＭＷ ２１８ ２１，５００Ｄａ）、炭酸脱水酵素（ＭＷ３１，０００Ｄａ）、およびオバルブミン（ＭＷ４５，０００Ｄａ）を含有する溶液を使用した。粒子によるタンパク質の取り込みを、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより評価した。コア−シェル粒子は、２１，５００Ｄａ未満の重量を有する低分子量タンパク質を効果的に捕捉および濃縮したが、高分子量を有するタンパク質は粒子から除外されたままであった（図６Ｂ）。
【００３８】
コア−シェルヒドロゲルナノ粒子による溶液中ＰＤＧＦの濃縮
本発明者らは、濃度がＥＬＩＳＡの検出閾値未満である希釈ＰＤＧＦ試料を濃縮するナノ粒子能力を検討し、ＰＤＧＦの濃度が粒子隔離により増加されて、ＥＬＩＳＡによりＰＤＧＦが測定可能になるかどうかを決定した。
【００３９】
図６Ａで示されているように、以前は検出不能だったレベルのＰＤＧＦを粒子から回収し、ＥＬＩＳＡにより７５〜１０２ｐｇ／ｍＬの範囲の濃度で定量化することに成功した。図７Ａに報告されている開始溶液中のＰＤＧＦ濃度の値（１８．９２±４．３１３ｐｇ／ｍＬ）は、ＥＬＩＳＡ免疫測定の線形範囲未満（最低検出可能ＰＤＧＦ用量＝３０ｐｇ／ｍＬ）であり、光学密度の使用により評価し、２３２検量線から推定した。製造業者の説明書によると、この最低検出可能用量は、２０回のゼロ標準物質重複測定の平均光学密度値に、標準偏差を２倍にした値を加え、対応する濃度を計算することにより決定された。このように、コア−シェル粒子を、ＥＬＩＳＡでは検出不能な濃度のＰＤＧＦ溶液と共にインキュベートし、回収し、アッセイの検出限界より高いレベルにＰＤＧＦを濃縮した。予想通り、ＰＤＧＦ溶液が非常に希薄だった場合でも、最低限の量の粒子で飽和が到達された（図７Ｂ）。この手順の品質を評価するために、ＰＤＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイの検量線を生成した（図７Ｃ）。同様の実験を、より濃縮されたＰＤＧＦ溶液で実施した。開始溶液中のＰＤＧＦ濃度は、６３．６９（±１．４４８）ｐｇ／ｍＬであったが、粒子から回収したＰＤＧＦ濃度は、４５２．８１（±４．８１８）ｐｇ／ｍＬであり、約７００％の濃縮係数をもたらした（図８Ａ）。ＰＤＧＦ溶液を、様々な容積の粒子と共にインキュベートし、粒子の容積が２００μｌだった場合に、飽和が達成されたことを実証した（４６００万個の粒子、１：５容積／容積の粒子：ＰＤＧＦ溶液比、図８Ｂ）。ＰＤＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイの検量線を繰り返した（図８Ｃ）。
【００４０】
ヒト血清由来の未処理ＰＤＧＦを隔離、濃縮、および保存するコアシェル粒子の能力を試験するために、さらなる実験を実施した。本発明者らは、血清由来の未処理ＰＤＧＦの飽和および完全な枯渇に達するのに必要な粒子量に対する過剰量干渉タンパク質の影響を検討した。血清を、トリスＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ７で１：１０に希釈し、増加する量の粒子と共にインキュベートした（２００、５００、１０００、および１５００μＬ）。開始血清溶液中のＰＤＧＦ値は、１７０．９２±４．６６ｐｇ／ｍＬであると測定されたが、粒子から回収されたＰＤＧＦ濃度は、１７４３．４３±１１．０６ｐｇ／ｍＬであり、約１０倍（１０００パーセント）の濃縮係数をもたらした（図９Ａ）。１０００μＬの値で飽和が達成された（２億３０００万個の粒子、１：１容積／容積の粒子：血清溶液、図９Ｂ）。血清中のＰＤＧＦ開始濃度が図８の溶液中ＰＤＧＦ濃度より高いという事実を考慮して、本発明者らは、大量のタンパク質含有量を有する血清が開始試料中に存在しても、試料を枯渇させるために必要とされる粒子量は２倍未満であると結論付けることができ、したがって大量の血清タンパク質が存在する場合でさえも、粒子の結合能は非常に高いことを確認した。これらの研究で使用されたＰＤＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイの検量線が示されている（図９Ｃ）。
【００４１】
コア−シェル粒子による溶液中ケモカインの濃縮
図１０には、血清学的バイオマーカーの他の関連モデル、つまりＢＳＡと混合された粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ／ＣＣＬ２８、１２，３００Ｄａ）、ストロマ細胞由来因子−１ベータ（ＳＤＦ−１β／ＣＸＣＬ１２ｂ、８，５００Ｄａ）、およびエオタキシン−２（ＣＣＬ２４、８，８００Ｄａ）と共にインキュベートされたコアシェルアクリル酸官能化粒子のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析が示されている。ケモカインは、粒子により溶液から完全に除去され、捕捉され、および濃縮されたが、ＢＳＡは完全に除外されていた。
【００４２】
コア−シェル粒子による酵素分解からのＰＤＧＦの保護
内因性および外因性プロテアーゼによるバイオマーカーの分解は、バイオマーカーの性能バイアスの主な要因であり、バイオマーカー候補の発見および測定を妨害する。免疫ブロット分析を使用して、酵素分解からＰＤＧＦを保護する粒子の能力を評価した。粒子の非存在下において、ＰＤＧＦに対するトリプシン作用は１０分後には明らかであり、１４，０００〜１７，０００ＤａのＰＤＧＦバンドがほとんど検出不能であることにより示されるように（図１１Ａおよび図１１Ｂのレーン６〜８）、１時間後にはほとんど完了した。著しく対照的に、トリプシンおよびコア−シェル粒子と共にインキュベートされたＰＤＧＦは、染色強度が減少せず断片化されていなかった単一種のバンドを生成し、粒子がタンパク質分解からＰＤＧＦを保護することに成功したことを示唆した（図１１Ａおよび図１１Ｂのレーン４）。トリプシンなしでＰＤＧＦが負荷された粒子のＰＤＧＦバンド（図１１Ａおよび図１１Ｂのレーン２）は、ＰＤＧＦおよびトリプシンが負荷された粒子のＰＤＧＦバンド（図１１Ａおよび図１１Ｂのレーン４）と同一であり、ＰＤＧＦタンパク質が酵素分解により失われなかったことをさらに示唆した。
【００４３】
コア−シェル粒子による酵素分解からのケモカインの保護
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して、モデルとして選択されたケモカインを酵素分解から保護する粒子の能力を評価した。図１２に示されているように、トリプシンは、粒子による隔離がない場合、各種類のケモカインを急速に分解した（図１２、レーン２、５、８）。著しく対照的に、トリプシンおよび粒子と共にインキュベートされたケモカインは（図１２、レーン３、６、９）、断片化されていなかった単一種のバンドを生成し、粒子がタンパク質分解からバイオマーカーを保存することに成功したことを示唆した。
【００４４】
コア−シェル粒子は、ヒト血清にスパイクされたＰＤＧＦを濃縮および保存する
ＰＤＧＦの血漿中半減期が非常に短い（２分）ことは、分析上の主要な課題である。免疫ブロットおよび質量分析を使用して、ヒト血清にスパイクされたＰＤＧＦを回収、濃縮、および保存するコア−シェル粒子の効率を研究した。免疫ブロットを使用して、正しい分子量の完全タンパク質が存在することにより、ＰＤＧＦの保存を検証した。５０μＬ等量のコア−シェル粒子を、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７で１：２５に希釈されたヒト血清中にスパイクされた５０μＬのＰＤＧＦ溶液（５ｎｇ／ｍＬまたは２ｎｇ／ｍＬの濃度）と共に、室温で１時間インキュベートした。粒子は、上清（図１３、レーン２および５）、および同時に、２つの異なる濃度で血清中にスパイクされた濃縮ＰＤＧＦ（図１３、レーン３およびレーン６）に残っていた高分子量タンパク質を除外した。上記のＥＬＩＳＡで示されているように、開始溶液中のＰＤＧＦは検出不能であった（図１３、レーン１および４）。粒子は、ＰＤＧＦ分子の質量または含有量に検出可能な変化をもたらさずに、非常に複雑な血清溶液内のＰＤＧＦ濃度を、免疫ブロットの検出限界を十分に超える濃度に増加させた。
【００４５】
物質および方法
本研究で使用された血清は、ＩＲＢ認可の血清収集プロトコール（プロトコール番号 ＧＭＵ ＨＳＲＢ＃６０８１）に基づき、インフォームドコンセントに基づいて取得し、データは、ＨＩＰＡＡ、およびヘルシンキ宣言で表明された原則に従って匿名で分析した。
【００４６】
コア−シェルヒドロゲル粒子の合成：粒子は、ＮＩＰＡｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）およびＢＩＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用して、沈殿重合により合成した［４９］。ＡＡｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をＮＩＰＡｍ粒子に組み込み、ペプチドおよび低分子を親和性捕捉するための、電荷に基づく親和性部分ベイトを準備した［９］。
【００４７】
（ＮＩＰＡｍ／ＡＡｃ）コア：ＮＩＰＡｍ（０．１８４ｇ）、ＢＩＳ（０．００５５ｇ）、およびＡＡｃ（４８．４μＬ）を、３０ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、その後０．２μｍフィルターを通過させた。溶液を、１５分間室温で中程度の撹拌速度で窒素を用いてパージし、その後７０℃に加熱した。１ｍＬ Ｈ２Ｏ中の過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、０．００９９ｇ）を溶液に添加して、重合を開始させた。１０分後、シェル溶液を添加した。
【００４８】
（ＮＩＰＡｍ）シェル：シェル溶液を、０．７３６ｇのＮＩＰＡｍおよび０．１２０ｇのＢＩＳを１０ｍｌの水に溶解することにより調製した。溶液を、０．２μｍのフィルターに通し、１５分間室温で中程度の撹拌速度で窒素を用いてパージした。ＡＰＳ注入から１０分後、シェル溶液を反応コア溶液に添加した。反応物を窒素下で３時間７０℃で維持し、その後終夜冷却した。粒子を洗浄して未反応モノマーを除去し、その後１６．１ｒｃｆ、２５℃で、１５分間遠心分離した。上清を破棄し、粒子を１ｍｌの水に再懸濁した。
【００４９】
粒子の特徴付け：粒子の濃度は、凍結乾燥された粒子を計量することにより評価した。粒子は、フローサイトメトリーで計数した。
【００５０】
温度およびｐＨに対する粒子サイズの依存性は、光子相関分光法（サブミクロン粒子サイズ分析器、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）により決定した。溶液のｐＨは、ＫＣｌのバックグラウンド電解質溶液を有する適量のＮａＯＨ、ＨＣｌを添加することにより制御した。２００秒の積分時間を使用して３回の測定で平均値を計算し、各セットの測定前に溶液を１０分間熱平衡化させた。その後、測定値をストークス−アインシュタインの関係により粒子サイズに変換した［５４］。ＮＳＣＲＩＰＴＯＲ（商標）ＤＰＮ（登録商標）システム（Ｎａｎｏｌｎｋ社）を使用して、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により、粒子をさらに特徴付けた。ＭｉｌｌｉＱ水中の粒子懸濁液（ｐＨ５．５、１μｇ／ｍＬ）を、室温、加湿雰囲気下で１５分間、新しく劈開されたマイカ上に配置し、測定前に窒素下で乾燥した。画像は、３００ｋＨｚの典型的な共振周波数および１０ｎｍ未満の半径を有するシリコンチップを使用して、ＡＣモード下で取得した。
【００５１】
粒子のインキュベーション：以下を含有する５０μＬの溶液と共に、５０μＬのコア−シェル粒子をインキュベートした：
５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７中の０．０２ｍｇ／ｍＬ ＰＤＧＦ、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、
ＰＤＧＦ、ＢＳＡ、アプロチニン（ＭＷ６，５００Ｄａ）、リゾチーム（ＭＷ１４，４００Ｄａ）、トリプシン阻害剤（ＭＷ２１，５００Ｄａ）、炭酸脱水酵素（ＭＷ３１，０００Ｄａ）、およびオバルブミン（ＭＷ４５，０００
４１９Ｄａ）；これらの各々は、０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度で、５０ｍＭトリス ｐＨ７に溶解されていた。
粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ／ＣＣＬ２８、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ Ａｍｅｒｉｃａ社）、ストロマ細胞由来因子−１ベータ（ＳＤＦ−１β／ＣＸＣＬ１２ｂ、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ Ａｍｅｒｉｃａ社）、およびエオタキシン−２−（ＣＣＬ２４、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ Ａｍｅｒｉｃａ社）；これらの各々は、０．０２ｍｇ／ｍＬの濃度であり、ＢＳＡ（０．２ｍｇ／ｍＬ）と混合されており、５０ｍＭトリス ｐＨ７に溶解されていた。
【００５２】
インキュベーションは、室温で３０分間継続させた。インキュベーション後、試料を、１６．１ｒｃｆ、２５℃で７分間遠心分離し、上清を保存した。その後、粒子を１ｍＬの水中に再懸濁し、１６．１ｒｃｆ、２５℃で７分間遠心分離した。遠心分離および洗浄を３回繰り返した。
【００５３】
捕捉された被検体の粒子溶出：ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは免疫ブロット分析を実施した際、粒子をゲルに直接負荷した。ＥＬＩＳＡおよび質量分析を実施した際、洗浄した粒子を、溶出緩衝液（６０％アセトニトリル−２％酢酸）と共に３０分間インキュベートし、その後２５℃、１６，１ｒｃｆで７分間遠心分離した。溶出液を保存し、第２の溶出ステップを実施し、溶出液を同じバイアルに保存した。その後、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）で試料を乾燥し、ＥＬＩＳＡまたは質量分析で分析した。
【００５４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：粒子インキュベーションに由来する粒子および上清を、１８％トリスグリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）に負荷した。粒子はゲルのスタッキング区域に留まったが、捕捉されたタンパク質はすべて粒子から電気泳動され、ゲルで分離された。タンパク質は、銀染色により検出した。
【００５５】
酵素分解分析：５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７中のＰＤＧＦ−ＢＳＡ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）溶液（０．１１ｍｇ／ｍＬ総タンパク質）を、３７℃で様々な期間（０、１０、２０、および４０分間）の間、１：１００重量／重量のタンパク質：プロテアーゼ比率で、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）と共にインキュベートして、分解パターンを経時的に研究した。コア−シェル粒子を、ＰＤＧＦ−ＢＳＡ（０．１１ｍｇ／ｍＬ総タンパク質）およびトリプシン（０．００１１ｍｇ／ｍＬ）を含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７溶液中、１時間３７℃でインキュベートした。
【００５６】
０．０２ｍｇ／ｍＬの濃度で５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７に溶解された以下のケモカイン、ＭＥＣ／ＣＣＬ２８、ＳＤＦ−１β／ＣＸＣＬ１２ｂ、ＣＣＬ２４の各々を、１：５０重量／重量のタンパク質：プロテアーゼ比率のトリプシンと共に、およびコア−シェル粒子と共に、３７℃で４０分間別々にインキュベートした。
【００５７】
免疫ブロット分析：タンパク質を、上記のように１８％トリス−グリシンゲルで１−Ｄゲル電気泳動により分離し、その後Ｉｍｍｏｂｉｌｉｏｎ ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移し取った。販売業者の説明書に従って、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社）で膜を染色した。タンパク質ブロットは、Ｋｏｄａｋ社製４０００ＭＭ使用して画像化した。その後、膜を、０．２％Ｉ−Ｂｌｏｃｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社／Ｔｒｏｐｉｘ社）および０．１％ツイーン２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で補完されたＰＢＳと共に室温で１時間インキュベートし、その後ＰＤＧＦ−ＢＢに対する抗体と共に、継続して撹拌しながら４℃で終夜インキュベートした。０．２％Ｉ−Ｂｌｏｃｋ（重量／容積）および０．１％ツイーン２０で補完されたＰＢＳで洗浄した後、特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧ二次抗体および高感度化学ルミネセンス装置（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用することにより、免疫応答性を明らかにした。
【００５８】
ＥＬＩＳＡ分析：粒子を、較正物質希釈液ＲＤ６−３で希釈された１ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ標準物質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）と共にインキュベートした。インキュベーション時間、洗浄、および溶出は、以前に記述されているように実施した。Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃで乾燥した溶出物を、１００μＬの水に再懸濁して穏やかにボルテックスし、その後製造業者の説明書に従って、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢのＥＬＩＳＡを実施した。各測定は重複して実施し、分析した試料セットの各々について個別の検量線を生成した。このキットの検出限界（２０ｐｇ／ｍＬ）未満のＰＤＧＦ溶液の１ｍＬ等量を、様々な数の粒子（５０、１００、２００、および５００μｌ）と共に３０分間インキュベートした。タンパク質を、６０％アセトニトリルおよび２％酢酸を用いてその後２回溶出ステップを行うことにより、洗浄された粒子から溶出した。ＥＬＩＳＡ測定は、１００μＬの容積で実施した。
【００５９】
未処理血清ＰＤＧＦのＥＬＩＳＡ測定を使用して、血清に導入された一連の粒子濃度ごとに、粒子捕捉収率を判断した。５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨで１：１０に希釈された１０００μＬ等量の血清を、量を増加させた粒子（２００、５００、１０００、および１５００μＬ）と共に、室温で３０分間インキュベートした。以前に記述されているように粒子を洗浄し、１００μＬの溶出緩衝液（６０％アセトニトリル−２％酢酸）と共に１０分間インキュベートし、その後遠心分離した（２５℃、１６．１ｒｃｆで７分間）。粒子溶出液を凍結乾燥し、較正物質希釈液ＲＤ６−３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製に再懸濁した。血清溶液は、較正物質希釈液で希釈した。ＥＬＩＳＡ測定は、１００μＬの容積で実施した。
【００６０】
質量分析：以下の溶液を、コア−シェル粒子と共にインキュベートした：
複雑なタンパク質混合物でスパイクされたＰＤＧＦ：５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７中に６．７μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＭＷ６６，０００）、６．７μｇ／ｍＬアプロチニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＭＷ６，５００Ｄａ）、６．７μｇ／ｍＬリゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＭＷ１４，４００Ｄａ）、６．７μｇ／ｍＬトリプシン阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ＭＷ２１，５００Ｄａ）、６．７μｇ／ｍＬ炭酸脱水酵素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＭＷ３１，０００Ｄａ）、および６．７μｇ／ｍＬオバルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＭＷ４５，０００Ｄａ）を含有するタンパク質混合物を、４０μｇ／４８２ｍＬの総タンパク質濃度で使用した。ＰＤＧＦを以下の濃度で添加した：６７０ｎｇ／ｍＬ、６７ｎｇ／ｍＬ、６．７ｎｇ／ｍＬ、０．６７ｎｇ／ｍＬ。その結果、ＰＤＧＦと総タンパク質との比率は、それぞれ１：６０、１：６００、１：６，０００、および１：６０，０００だった。１．５ｍＬ等量の溶液を、１００μＬのコア−シェル粒子と共にインキュベートした。タンパク質を、６０％アセトニトリルおよび２％酢酸を用いて１００μＬの容積に溶出し、溶出液をＳｐｅｅｄ Ｖａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ社）で乾燥し、ナノ逆相液体クロマトグラフィー質量分析（ＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）で分析した。溶液および溶出液の両方から１００μＬ等量を分析し、したがって同じ容積を維持した。
ヒト血清：２００Ｌの健常ドナー血清を、１００Ｌのコア−シェル粒子を有する５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７で１：３に希釈した。粒子を１０％アセトニトリル、０．５×ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、６０％アセトニトリル、２％酢酸で溶出した。試料をＳｐｅｅｄ Ｖａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ社）で乾燥し、ｎａｎｏＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
【００６１】
粒子からの溶出液を、ｎａｎｏＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃで乾燥したタンパク質を８Ｍ尿素中に再構成し、１０ｍＭ ＤＴＴで還元し、５０ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシンにより終夜３７℃で消化した。トリプシンペプチドを、Ｚｉｐ−Ｔｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でさらに精製し、線形イオントラップ質量分析計（ＬＴＱ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ）を使用して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。試料注入後、カラムを移動相Ａ（０．４％酢酸）で５分間洗浄し、２５０ナノリットル／分、３０分間で０％移動相Ｂ（０．４％酢酸、８０％アセトニトリル）から５０％移動相Ｂへの線形濃度勾配を使用してペプチドを溶出し、その後さらに５分間、移動相Ｂを１００％にした。ＬＴＱ質量分析計は、３５％の正規化衝突エネルギーを使用する衝突誘起解離（ＣＩＤ）用に５つの最も豊富な分子イオンが動的に選択された５つのＭＳ／ＭＳスキャンが、各完全ＭＳスキャン後に行われるデータ依存モードで操作された。タンデム質量スペクトルを、トリプシン切断の制約を使用して、ＳＥＱＵＥＳＴデータベースに対して探索した。検索結果に以下のフィルターを適用することにより、高信頼度のペプチド同定が取得された：１＋の場合、相互相関スコア（ＸＣｏｒｒ）は１．９以上、２＋の場合は２．２以上、３＋の場合は３．５以上、ランダム同定の最大確率は０．０１。
【００６２】
総タンパク質に対して１：６０、１：６００、および１：６，０００の比率でＰＤＧＦを含有する溶液の質量分析により、ヒトＰＤＧＦに属する１３、６、および１つのペプチドがそれぞれ同定されたが、コア−シェル粒子からの溶出液は、それぞれ３３、１５、および５つのペプチドを含有していた。総タンパク質に対して１：６０，０００のＰＤＧＦ比率では、ＰＤＧＦペプチドは、トリプシン消化後の原溶液中に質量分析では検出されなかったが（０．６７ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ濃度）、粒子からの溶出液からは、ＰＤＧＦトリプシンペプチドの明瞭な質量分析計検出スペクトルが得られた。したがって、コア−シェル粒子は、質量分析計の既知検出レベル内にＰＤＧＦが存在していた場合、質量分析により溶液から同定されるペプチドの数を増加させた。加えて、このバイオマーカーが１ｍｌ当たり１ナノグラム未満に希釈され、非常に大量のタンパク質により隠蔽された場合、コア−シェル粒子は、ＰＤＧＦを濃縮し、質量分析の検出範囲へその濃度を上昇させることができた。
【００６３】
生理学的媒体中のＰＤＧＦを濃縮および保存し、同時に、隔離された任意のタンパク質を同定する粒子の能力をさらに評価するために、ＰＤＧＦ（５ｎｇ／μＬの濃度の）を、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７で１：２５に希釈されたヒト血清にスパイクし、５０μｌのコア−シェル粒子と共に１時間インキュベートした。タンパク質を溶出し、乾燥し、ｎａｎｏＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。表Ｓ１に示されているように、ＰＤＧＦを回収し、質量分析計分析により高ペプチドヒット範囲（ｈｉｇｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｉｔ ｃｏｖｅｒａｇｅ）で明白に同定した。多数の希少な低分子量タンパク質が、コア−シェル粒子により捕捉されたタンパク質の混合物内で同定された。加えて、コア−シェル粒子をヒト血清と共にインキュベートし、粒子から溶出されたタンパク質をｎａｎｏＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。非常に低い含有量（約１ｎｇ／ｍＬ）で血液中に存在する未処理ＰＤＧＦに属するペプチドを同定した。
【００６４】
これらのデータは、血清から既知のバイオマーカーを回収および保存するためのコア−シェル粒子の使用を支持するものであり、バイオマーカーの濃度、および現行のバイオマーカーの測定および発見技術の有効感度を劇的に増加させる方法を提供する。
【００６５】
全体として、本発明は、内部親和性ベイトを含有する１ｎｍ〜１００μｍのサイズ範囲の粒子による一体型の被検体濃縮および単離ステップを含み、ａ）被検体を含有する試料液体を、被検体を認識する親和性ベイトを封入する開放型ポリマー性網目構造で構成されるナノ粒子の帯域と接触させ、ｂ）被検体を、粒子内部で濃縮、隔離、および分解から保護し、ｃ）標識リガンドまたは抗体により認識されるように被検体を放出させる免疫測定系またはデバイスである。免疫測定デバイスでは、粒子は被検体含有試料液体に懸濁されており、懸濁された粒子は浮揚性であり、溶液中に留まり重力により沈殿せず、粒子は開放型ポリマー性構造であり、粒子が懸濁されている溶質が粒子の８０％超を占める。また、免疫測定デバイスでは、粒子および試料液体の混合物がデバイスにアプライされ、側方流動免疫測定デバイス内にある流体経路内の帯域に粒子が配置および固定化されている。
【００６６】
本発明は、被検体捕捉粒子を含むポイントオブケアの免疫測定デバイスでもあり、そのような粒子は、固定化された親和性リガンドを含有するポリマー性マトリックスシェルおよび内部コアを含み、ポリマー性マトリックスは、ある条件下で被検体がポリマー性マトリックスに進入することを可能にするが、混合物に由来する他の化合物をポリマー性マトリックスへの進入から除外する細孔サイズを有し、親和性リガンドは、目的の被検体を認識し、捕捉粒子は、側方流動免疫測定デバイスの一部として多孔性基層に組み込まれている。粒子が目的の被検体を隔離した後、液体試料の流路を変更することができる。被検体捕捉粒子を分離するための方法は、試料中に存在する細胞由来の標的被検体を含有しており、捕捉粒子は、異なる多孔度を通って免疫測定帯内を滲出により流動し、粒子は、１〜１０００ナノメートルのサイズ範囲である。試料は、全血、または尿、脳脊髄液、汗、唾液、乳頭吸引液、もしくは羊水などの別の体液；非生物学的液体；環境試料、農業試料、もしくは食品試料である。また、本発明は、捕捉粒子から標的バイオマーカーを分離し、そこでは抽出緩衝液を使用して、隔離されたバイオマーカーを捕捉粒子から取り除く。試料は、全血、または尿、脳脊髄液、汗、唾液、乳頭吸引液、もしくは羊水などの別の体液；非生物学的液体；環境試料、農業試料、もしくは食品試料である。
【００６７】
タンパク質、ペプチド、または核酸バイオマーカーを隔離、濃縮、および分解から保護するための方法は、ａ）ある条件下で被検体がポリマー性マトリックスに進入することを可能にするが、混合物に由来する他の化合物をポリマー性マトリックスへの進入から除外する細孔サイズを有するポリマー性マトリックス、およびｂ）内部の固定化された親和性ベイトを含む捕捉粒子を混合物と接触させることであり、試料中に存在する個々の種類の低分子量分子に対して特異的な複数の亜集団を含有する捕捉粒子の集団が、側方流動免疫測定デバイス内に組み込まれている。被検体を前濃縮および保存する本発明の手段も作用しており、そこでは、ａ）被検体が、被検体に対する親和性ベイトを含有するヒドロゲル粒子の存在下の液体溶液中に存在し、粒子は、溶液中に留まり重力により沈殿しないのに十分なほどの小さなサイズおよび浮揚性であり、ｂ）高い割合の被検体が粒子内に隔離され、ｃ）バルク枯渇液体容積は多孔性マトリックス内で先に滲出していく。本発明の捕捉粒子は、ａ）分子ふるい部分、およびｂ）被検体結合部分を含み、分子ふるい部分、被検体結合部分、またはその両方は、多孔度が改変された架橋区域をさらに含み、ふるい部分は、物理的および／または化学的処理に応じて、捕捉粒子内に被検体を捕捉するように収縮および／または膨張する。被検体結合部分は、化学的または静電気的に被検体に結合または隔離することが可能である少なくとも１つのタイプの部分を含む。被検体結合部分は、カルボキシ基、アミン基、脂質、リンタンパク質、リン脂質、アミド基、ヒドロキシル基、エステル基、アクリル基、チオール基、アクリル酸、抗体、結合タンパク質、結合対、金属、キレート剤、核酸、アプタマー、酵素結合ポケット、レクチン、薬理学的作用剤、合成ペプチド、抗体断片、疎水性表面、親水性表面、およびそれらの任意の誘導体またはそれらの組み合わせを含む。被検体は、被検体結合部分に結合し、被検体は、有機分子、無機分子、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。分子ふるい部分は、内部コアを封入する外側シェルであり、内部コアは、被検体結合部分を含んでいる。分子ふるい部分、被検体結合部分、またはその両方は、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、Ｎ−アルキル置換ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（ベンジルグルタメート）、ポリ（２−エチルアクリル酸）、ポリ（４−ビニルピリジン）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。架橋区域は、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、またはそれらの任意の組み合わせを含む。分子ふるい部分、被検体結合体部分、またはその両方は、ヒドロゲルを含む。捕捉粒子は、物理的または化学的処理に曝されると、結合または隔離されている被検体を放出し、物理的または化学的処理は、電荷、静水圧、ｐＨ変化、温度変化、酸性作用剤、塩基性作用剤、ＵＶ、超音波、Ｘ線、またはそれらの組み合わせに曝されることを含む。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２００８年８月２６に出願された、「Ｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂａｓｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」と題する米国特許仮出願第６１／０９１，９３５号に開示された発明を請求するものである。これにより優先権が請求される。これにより３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）に基づく該米国仮出願の利益が請求され、これにより前述の出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、側方流動免疫測定（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）またはイムノクロマトグラフィーストリップデバイスなどのポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）免疫測定に、試料収集容器の一部としてまたは液体流動帯内に固定化されたヒドロゲルナノ粒子を組み込むことに関する。より具体的には、本発明は、被検体を分解から保護することに加えて、分子ふるい、標的被検体の隔離および濃縮が可能である回収ヒドロゲルナノ粒子の集団を含有する携帯用免疫測定デバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
側方流動アッセイ（ＬＦＡ）は、診断ツールとして１５年を超えて順調に使用されてきた。ＬＦＡは、ポイントオブケア（ＰＯＣ）診断を提供するが、包括的な臨床検査室および特別に訓練された技術スタッフを必要としない。ＬＦＡデバイスは、一般的に、製造が安価であり、有効期間が長く、保管に求められる条件が最小限であると考えられている。ＬＦＡ診断結果は、クロマトグラフィーストリップの目視検査、または分光光度計「測定」装置の使用のいずれかにより読み取られる。アッセイ結果の目視検査は、典型的には、はい／いいえ、または陽性／陰性という結果に制限される。
【０００４】
視覚的測定および測定器測定は、両方とも定性的または半定量的であり、低含有量バイオマーカーのレベルを定量的に評価するには感度が十分ではないと考えられている。また、ＰＯＣ使用するための現行のＬＦＡ設計は、免疫測定分析の前に複雑な生物学的液体を前処理することができないため、制限されている。これらの制限により、低含有量の被検体およびバイオマーカーに対するＬＦＡの感度が低減され、同時に、低含有量バイオマーカーおよび他の低分子量化合物用のＰＯＣ診断デバイスとしてのＬＦＡの有効性が最小化されている。
【０００５】
ＰＯＣ免疫測定を診断デバイスとして使用する場合の主要な課題は、標準的実験室設備を使用せずに複雑な生物学的液体を処理する能力である。多くの場合、血液試料を前処理して血漿試料を提供するか、または血液試料から細胞を除去するためには、遠心機が必要とされる場合がある。コアシェルヒドロゲルナノ粒子を組み込んで分子ふるいおよび標的被検体隔離をすることは、この制限に対する独特な解決策を提供する。特異的なふるいおよび親和性特徴を有するように設計されたヒドロゲルナノ粒子は、分析の前に、標的被検体のフィルター、濃縮器、および分解から保護するものとして作用する。これらの機能は、バイオマーカーの発見および低含有量被検体用の診断アッセイにおける分析上の主要課題に取り組むための新規な解決策を提供する。
【０００６】
ＬＦＡデバイスの別の主要課題は、特定の目的被検体に対するＬＦＡの感度である。分析前に試料を前処理することができないことは、感度の不良、高バックグラウンド干渉、および試料の希釈に結びつく。ヒドロゲルナノ粒子を試料前処理の手段としてデバイスに組み込むことは、標的被検体のみを隔離および濃縮し、その後粒子から抽出して免疫測定を行うことにより、感度を著しく向上させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ、Ｆｅｒｒａｒｉ Ｍ、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ Ｅ（２００３年）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｗｒｉｔｔｅｎ ｉｎ ｂｌｏｏｄ．Ｎａｔｕｒｅ ４２５巻：９０５頁
【非特許文献２】Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＬ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＧ（２００２年）Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｏｍｅ：ｈｉｓｔｏｒｙ，ｃｈａｒａｃｔｅｒ，ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １巻：８４５〜８６７頁
【非特許文献３】Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ、Ａｒｄｅｋａｎｉ ＡＭ、Ｈｉｔｔ ＢＡ、Ｌｅｖｉｎｅ ＰＪ、Ｆｕｓａｒｏ ＶＡら、（２００２年）Ｕｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ ３５９巻：５７２〜５７７頁
【非特許文献４】Ｍｅｒｒｅｌｌ Ｋ、Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ Ｋ、Ｇｒａｖｅｓ ＳＷ、Ｅｓｐｌｉｎ ＭＳ、Ｌｅｗｉｓ ＮＥら、（２００４年）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｏｗ ａｂｕｎｄａｎｃｅ，ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｔｅｃｈ １５巻：２３８〜２４８頁
【非特許文献５】Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ、Ｂｅｌｌｕｃｏ Ｃ、Ａｒａｕｊｏ ＲＰ、Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ（２００６年）Ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｅ：ａ ｈｉｇｈｅｒ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ６巻：９６１〜９６７頁
【非特許文献６】Ｌｏｐｅｚ ＭＦ、Ｍｉｋｕｌｓｋｉｓ Ａ、Ｋｕｚｄｚａｌ Ｓ、Ｂｅｎｎｅｔｔ ＤＡ、Ｋｅｌｌｙ Ｊら、（２００５年）Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｏｕｎｄ ｍａｓｓ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５１巻：１９４６〜１９５４頁
【非特許文献７】Ｚｈｏｕ Ｍ、Ｌｕｃａｓ ＤＡ、Ｃｈａｎ ＫＣ、Ｉｓｓａｑ ＨＪ、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＥＦ，３ｒｄら、（２００４年）Ａｎ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ“ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ”．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２５巻：１２８９〜１２９８頁
【非特許文献８】Ａｙａｃｈｅ Ｓ、Ｐａｎｅｌｌｉ Ｍ、Ｍａｒｉｎｃｏｌａ ＦＭ、Ｓｔｒｏｎｃｅｋ ＤＦ（２００６年）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｔｏｒａｇｅ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １２６巻：１７４〜１８４頁
【非特許文献９】Ｌｕｃｈｉｎｉ Ａ、Ｇｅｈｏ ＤＨ、Ｂｉｓｈｏｐ Ｂ、Ｔｒａｎ Ｄ、Ｘｉａ Ｃら、（２００８年）Ｓｍａｒｔ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ：ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ，ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ８巻：３５０〜３６１頁
【非特許文献１０】Ｈｏｆｆｍａｎ ＡＳ（２００２年）Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５４巻：３〜１２頁
【非特許文献１１】Ｄｒｕｒｙ ＪＬ、Ｍｏｏｎｅｙ ＤＪ（２００３年）Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｓｃａｆｆｏｌｄ ｄｅｓｉｇｎ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４巻：４３３７〜４３５１頁
【非特許文献１２】Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ ＤＦ、Ｍａｌｐａｓｓ ＴＷ、Ｆｏｓｔｅｒ ＤＭ、Ｒｏｓｓ Ｒ（１９８４年）Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ５４１ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ：ｌｅｖｅｌｓ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｌｅａｒａｎｃｅ．Ｂｌｏｏｄ ６４巻：４５８〜４６９頁
【非特許文献１３】Ｈｅｎｎｉｎｋ ＷＥ、ｖａｎ Ｎｏｓｔｒｕｍ ＣＦ（２００２年）Ｎｏｖｅｌ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｄｅｓｉｇｎ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５４巻：１３〜３６頁
【非特許文献１４】Ｐｅｌｔｏｎ Ｒ（２０００年）Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ．Ａｄｖ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ ８５巻：１〜３３頁
【非特許文献１５】Ｎａｙａｋ Ｓ、Ｇａｎ Ｄ、Ｓｅｒｐｅ ＭＪ、Ｌｙｏｎ ＬＡ（２００５年）Ｈｏｌｌｏｗ ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ．Ｓｍａｌｌ １巻：４１６〜４２１頁
【非特許文献１６】Ｆｏｒｔｉｎａ Ｐ、Ｋｒｉｃｋａ ＬＪ、Ｓｕｒｒｅｙ Ｓ、Ｇｒｏｄｚｉｎｓｋｉ Ｐ（２００５年）Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｅ ａｎｄ ｒｅａｌｉｔｙ ｏｆ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３巻：１６８〜１７３頁
【非特許文献１７】Ｍｏｇｈｉｍｉ ＳＭ、Ｈｕｎｔｅｒ ＡＣ、Ｍｕｒｒａｙ ＪＣ（２００５年）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ １９巻：３１１〜３３０頁
【非特許文献１８】Ｓａｋａｍｏｔｏ ＪＨ、Ｓｍｉｔｈ ＢＲ、Ｘｉｅ Ｂ、Ｒｏｋｈｌｉｎ ＳＩ、Ｌｅｅ ＳＣら、（２００５年）Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂａｓｅｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ４巻：６２７〜６３６頁
【非特許文献１９】Ｌｉ Ｘ、Ｐｏｎｔｅｎ Ａ、Ａａｓｅ Ｋ、Ｋａｒｌｓｓｏｎ Ｌ、Ａｂｒａｍｓｓｏｎ Ａら、（２０００年）ＰＤＧＦ−Ｃ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ＰＤＧＦ ａｌｐｈａ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２巻：３０２〜３０９頁
【非特許文献２０】Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ Ｌ、Ｌｉ Ｈ、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｕ（２００４年）Ｔｈｅ ＰＤＧＦ ｆａｍｉｌｙ：ｆｏｕｒ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ｆｉｖｅ ｄｉｍｅｒｉｃ ｉｓｏｆｏｒｍｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １５巻：１９７〜２０４頁
【非特許文献２１】Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ＭＣ、Ｃｏｒｌｅｓｓ ＣＬ、Ｄｕｅｎｓｉｎｇ Ａ、ＭｃＧｒｅｅｖｅｙ Ｌ、Ｃｈｅｎ ＣＪら、（２００３年）ＰＤＧＦＲＡ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９巻：７０８〜７１０頁
【非特許文献２２】Ｂａｘｔｅｒ ＥＪ、Ｈｏｃｈｈａｕｓ Ａ、Ｂｏｌｕｆｅｒ Ｐ、Ｒｅｉｔｅｒ Ａ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＪＭら、（２００２年）Ｔｈｅ ｔ（４；２２）（ｑ１２；ｑ１１）ｉｎ ａｔｙｐｉｃａｌ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｆｕｓｅｓ ＢＣＲ ｔｏ ＰＤＧＦＲＡ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １１巻：１３９１〜１３９７頁
【非特許文献２３】Ｙｕ Ｊ、Ｕｓｔａｃｈ Ｃ、Ｋｉｍ ＨＲ（２００３年）Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６巻：４９〜５９頁
【非特許文献２４】Ｂｏａｒｄ Ｒ、Ｊａｙｓｏｎ ＧＣ（２００５年）Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＤＧＦＲ）：ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ Ｕｐｄａｔ ８巻：７５〜８３頁
【非特許文献２５】Ｋａｂｂｉｎａｖａｒ Ｆ、Ｈｕｒｗｉｔｚ ＨＩ、Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ Ｌ、Ｍｅｒｏｐｏｌ ＮＪ、Ｎｏｖｏｔｎｙ ＷＦら、（２００３年）Ｐｈａｓｅ ＩＩ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｐｌｕｓ ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（ＦＵ）／ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ（ＬＶ）ｗｉｔｈ ＦＵ／ＬＶ ａｌｏｎｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２１巻：６０〜６５頁
【非特許文献２６】ＭｃＡｒｔｈｕｒ ＧＡ、Ｄｅｍｅｔｒｉ ＧＤ、ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｒｏｍ Ａ、Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ＭＣ、Ｄｅｂｉｅｃ−Ｒｙｃｈｔｅｒ Ｍら、（２００５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｏｃａｌｌｙ ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｅｒｍａｔｏｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍａｔｉｎｉｂ：Ｉｍａｔｉｎｉｂ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｓｔｕｄｙ Ｂ２２２５．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３巻：８６６〜８７３頁
【非特許文献２７】Ｍａｔｈｅｗ Ｐ、Ｔｈａｌｌ ＰＦ、Ｊｏｎｅｓ Ｄ、Ｐｅｒｅｚ Ｃ、Ｂｕｃａｎａ Ｃら、（２００４年）Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｍｅｓｙｌａｔｅ ａｎｄ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ：ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｉｎ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２巻：３３２３〜３３２９頁
【非特許文献２８】Ｋｕｂｏ Ｔ、Ｐｉｐｅｒｄｉ Ｓ、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ Ｊ、Ａｎｔｏｎｅｓｃｕ ＣＲ、Ｃｈｅｎ Ｗら、（２００８年）Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｍｅｓｙｌａｔｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ １１２巻：２１１９〜２１２９頁
【非特許文献２９】Ｋａｇａｍｉ Ｓ、Ｋａｋｉｎｕｍａ Ｔ、Ｓａｅｋｉ Ｈ、Ｔｓｕｎｅｍｉ Ｙ、Ｆｕｊｉｔａ Ｈら、（２００５年）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｒｕｍ ＣＣＬ２８ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ａｎｄ ｂｕｌｌｏｕｓ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２４巻：１０８８〜１０９０頁
【非特許文献３０】Ｊａｈｎｚ−Ｒｏｚｙｋ Ｋ、Ｔａｒｇｏｗｓｋｉ Ｔ、Ｇｌｏｄｚｉｎｓｋａ−Ｗｙｓｚｏｇｒｏｄｚｋａ Ｅ、Ｐｌｕｓａ Ｔ（５８５ ２００３年）Ｃｃ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｅｏｔａｘｉｎ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ＩｇＥ５８７ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ ５８巻：５９５〜６０１頁
【非特許文献３１】Ｒｏｂａｋ Ｅ、Ｋｕｌｃｚｙｃｋａ Ｌ、Ｓｙｓａ−Ｊｅｄｒｚｅｊｏｗｓｋａ Ａ、Ｗｉｅｒｚｂｏｗｓｋａ Ａ、Ｒｏｂａｋ Ｔ（２００７年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＰＩＧＦ、ＳＤＦ−１ ａｎｄ ｓＶＣＡＭ−１ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ １８巻：１８１〜１８７頁
【非特許文献３２】Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ、Ｄｅｗａｌｄ Ｂ、Ｍｏｓｅｒ Ｂ（１９９４年）Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ−ＣＸＣ ａｎｄ ＣＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ．Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５５巻：９７〜１７９頁
【非特許文献３３】Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ＭＪ、Ｃｌａｙｍａｎ ＧＬ（２００１年）Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ３巻：１〜１８頁
【非特許文献３４】Ｂｒａｕｄｅ ＥＡ、Ｎａｃｈｏｄ ＦＣ（１９５５年）Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献３５】Ｄｅｎｉｚｌｉ Ａ、Ｐｉｓｋｉｎ Ｅ（２００１年）Ｄｙｅ−ｌｉｇａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４９巻：３９１〜４１６頁
【非特許文献３６】Ｓｅｒｅｉｋａｉｔｅ Ｊ、Ｂｕｍｅｌｉｓ ＶＡ（２００６年）Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｇｅｌ−ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ２０巻：１９５〜１９９頁
【非特許文献３７】Ｆｒｅｄｏｌｉｎｉ Ｃ、Ｍｅａｎｉ Ｆ、Ｒｅｅｄｅｒ ＫＡ、Ｒｕｃｋｅｒ Ｓ、Ｐａｔａｎａｒｕｔ Ａら、（２００８年）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｕｒｉｎｅ，ｓｕｃｈ ａｓ Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ（ｈＧＨ），ｂｙ Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３Ｇ−Ａ Ｌｏａｄｅｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｎａｎｏ Ｒｅｓ １巻：５０２〜５１８頁
【非特許文献３８】Ｕｅｋａｍａ Ｋ、Ｈｉｒａｙａｍａ Ｆ、Ａｒｉｍａ Ｈ（２００６年）Ｒｅｃｅｎｔ Ａｓｐｅｃｔ ｏｆ Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｐｈｅｎｏｍ Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ ５６巻：３〜８頁
【非特許文献３９】Ｊｉｎ Ｓ、Ｌｅｅ Ｙ、Ｋａｎｇ Ｈ Ｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ．Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ ８巻：４５１〜４５４頁
【非特許文献４０】Ｃａｉ Ｗ、Ｙａｏ Ｘ、Ｓｈａｏ Ｘ、Ｐａｎ Ｚ（２００５年）Ｂｉｍｏｄａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ｗｉｔｈ Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ ｂｙ ａ Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｄｏｃｋｉｎｇ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ｊ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｐｈｅｎｏｍ Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ ５１巻：４１〜５１頁
【非特許文献４１】Ｂｏｒｓｔ Ｃ、Ｈｏｌｚｇｒａｂｅ Ｕ（２００８年）Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｐａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｂｙ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．
【非特許文献４２】Ｄｏｄｚｉｕｋ Ｈ（２００６年）Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｏｂｏｋｅｎ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ．
【非特許文献４３】Ｅｌｍａｓ Ｂ、Ｏｎｕｒ Ｍ、Ｓｅｎｅｌ Ｓ、Ｔｕｎｃｅｌ Ａ（２００２年）Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｎ６１６ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｖｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｌａｔｅｘ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ ２８０巻：１１３７〜１１４６頁
【非特許文献４４】Ｋａｔａｏｋａ Ｋ、Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｈ、Ｏｋａｎｏ Ｔ、Ｓａｋｕｒａｉ Ｙ（１９９４年）Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｏｗｅｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｏｌｙ［Ｎ，Ｎ−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）−ｃｏ−３−（ａｃｒｙｌａｍｉｄｏ）−ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ］ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｌｉｎｅ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２７巻：１０６１〜１０６２頁
【非特許文献４５】Ｌｏｒａｎｄ ＪＰ、Ｅｄｗａｒｄｓ ＪＯ（１９５９年）Ｐｏｌｙｏｌ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｅｎｚｅｎｅｂｏｒｏｎａｔｅ Ｉｏｎ．Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ２４巻：７６９〜７７４頁
【非特許文献４６】Ｍａｄｅｒ ＨＳ、Ｗｏｌｆｂｅｉｓ ＯＳ（２００８年）Ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｂａｓｅｄ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ Ａｃｔａ １６２巻：１〜３４頁
【非特許文献４７】Ｙａｍａｕｃｈｉ Ａ、Ｓｕｚｕｋｉ Ｉ、Ｈａｙａｓｈｉｔａ Ｔ（２００６年）Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｂｏｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ／Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ Ｗａｔｅｒ．Ｉｎ：Ｇｅｄｄｅｓ ＣＤＬ、Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ．ｅｄｉｔｏｒ．Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ，Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２３７〜２５８頁
【非特許文献４８】Ｚｈａｎｇ Ｙ、Ｇａｏ Ｘ、Ｈａｒｄｃａｓｔｌｅ Ｋ、Ｗａｎｇ Ｂ（２００６年）Ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｅｎｓｉｎｇ：ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２巻：１３７７〜１３８４頁
【非特許文献４９】Ｊｏｎｅｓ ＣＤ、Ｌｙｏｎ ＬＡ（２０００年）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ６３１ Ｃｏｒｅ− Ｓｈｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３３巻：８３０１〜８３０６頁
【非特許文献５０】Ｃｏｕｖｒｅｕｒ Ｐ、Ｒｅｄｄｙ ＬＨ、Ｍａｎｇｅｎｏｔ Ｓ、Ｐｏｕｐａｅｒｔ ＪＨ、Ｄｅｓｍａｅｌｅ Ｄら、（２００８年）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｎｅｗ ｈｅｘａｇｏｎａｌ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｓｑｕａｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｓｍａｌｌ ４巻：２４７〜２５３頁
【非特許文献５１】Ｃｈｏ ＥＣ、Ｋｉｍ ＪＷ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｎｉｅｖｅｓ Ａ、Ｗｅｉｔｚ ＤＡ（２００８年）Ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｅｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ８巻：１６８〜１７２頁
【非特許文献５２】Ｓｍｉｔｈ ＥＲ、Ｚｕｒａｋｏｗｓｋｉ Ｄ、Ｓａａｄ Ａ、Ｓｃｏｔｔ ＲＭ、Ｍｏｓｅｓ ＭＡ（２００８年）Ｕｒｉｎａｒｙ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ １４巻：２３７８〜２３８６頁
【非特許文献５３】Ｂａｒｒａｔｔ Ｊ、Ｔｏｐｈａｍ Ｐ（２００７年）Ｕｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ．ＣＭＡＪ １７７巻：３６１〜３６８頁
【非特許文献５４】Ｐｅｃｏｒａ Ｒ（１９８５年）Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｈｏｔｏ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．４３６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従来技術の側方流動免疫測定は、サンドイッチ型免疫測定が代表的であり、そこでは、抗体対の一方のメンバーが、金コロイド粒子または発色ビーズなどの視覚的タグまたはシグナル発生タグで標識されており、他方のメンバーの抗体が固相に結合されている。抗体対の標識されたメンバーおよび混合物と共にインキュベートされた被検体を、該対のうち固定化されている抗体メンバーを横切るように滲出させる。被検体が存在すれば、標識抗体と固定化抗体との間にサンドイッチが形成され、それにより固定化抗体の区域において検出可能なシグナルが生じることになる。本発明は、被検体親和性ベイト（ｂａｉｔ）を含有する多孔性ヒドロゲルナノ粒子を、目的被検体の前処理および前濃縮および保存の手段として使用する手段を提供する。本発明は、ポイントオブケアの状況または屋外において、免疫測定の感度を向上させ、被検体を分解から保護する手段を提供する。１つの実施形態では、試料液体（例えば、尿または血液）中の被検体を、乾燥形態のナノ粒子を含有する収集チャンバーに導入する。ナノ粒子は試料中に分散され、標的被検体を直ちに隔離する。９９パーセントを超える隔離効率が多種多様な被検体で達成された。隔離された被検体は、粒子内の親和性ベイトに固定化されるため、分解から独特に保護される。このように、大量試料容積中の被検体の総含有量を、低容積の粒子中に濃縮することができる。容積濃縮係数は、１０〜１００倍であり得る。本主題発明に基づくと、被検体を含有する試料液体をナノ粒子と接触させた後、粒子を含有する試料液体を、ニトロセルロース、酢酸セルロース、多孔性ガラス、ガラス繊維、または紙などの透過性多孔性マトリックスへと受動的に滲出させる。滲出物質の細孔径は、粒子が多孔性マトリックス内を移動しないように選択される。このステップの後、粒子は、多孔性マトリックスへの液体進入地点で捕捉され、試料液体の容積すべては、捕捉されたナノ粒子を通って滲出してしまっているだろう。この時点で、粒子内に捕捉された被検体は、親和性ベイトに結合しているため、開始試料溶液から完全に回収され、はるかに小さな容積中に濃縮され、分解から保護される。この時点で、収集された被検体は、今や小さな容積中で安定化されており、保管するかまたは出荷することができる。
【０００９】
この時点で、使用者は、ナノ粒子内に存在する捕捉された被検体を測定または分析する準備ができており、ナノ粒子内から結合被検体を分離し、濃縮された被検体の分析デバイスへの溶出およびキャピラリー滲出を可能にする溶出緩衝液を導入する必要があるだけである。好ましい実施形態の１つでは、ナノ粒子の出口溶出液は、測定を完全させるために標準的サンドイッチ免疫測定の入口へと直接的に流入する。図１〜３に示されているように、側方流動アッセイデバイスは、それが２つの状態のうちの１つであり得るように構成される。状態１では、被検体を含有していた試料液体は不要物として先に滲出し、下流の免疫測定に寄与する。状態２では、溶出緩衝液が導入され、液体浸透経路が変更されて、溶出液がサンドイッチ免疫測定に進入することが可能になる。そのような状態の変化により、捕捉されたナノ粒子から被検体が出でくる地点で液体浸透経路が切替えられる。これは、図に示されているように、２つの滲出マトリックスストリップをそれらが接触に至るように屈曲させ、被検体が標識抗体と遭遇する免疫測定進入口へと流れを転進させることにより達成することができる。さらなる実施形態では、ナノ粒子は、被検体を含有する試料液体がナノ粒子を通って受動的にまたは能動的にろ過されて被検体のナノ粒子隔離が達成されるよう、粒子が開始試料溶液に懸濁される代りに滲出マトリックスにあらかじめ負荷されている。
【００１０】
本発明の捕捉粒子は、ａ）分子ふるい部分、およびｂ）被検体結合部分を含むヒドロゲルナノ粒子であり、分子ふるい部分、被検体結合部分、またはその両方は、多孔度が改変された架橋区域をさらに含む。ナノ粒子は、標的被検体を回収、濃縮、および分解から保護するために使用される。
【００１１】
１つの実施形態では、本発明は、ヒドロゲルナノ粒子を、液体収集容器または多孔性基層のいずれかに、マイクロ流体免疫測定デバイスの一部として組み込むことを記述する。ヒドロゲルナノ粒子は、タンパク質、ペプチド、もしくは核酸に基づくバイオマーカー、または他の低分子量被検体を隔離、濃縮、および分解から保護する手段として機能する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、ヒドロゲルナノ粒子を免疫測定デバイスの流動帯内に固定化し得る方法について記述する。ヒドロゲルナノ粒子は、試料沈着用の多孔性マトリックスチャンバー内に含浸されていてもよい。試料液体（生物学的であってもよく、または非生物学的であってもよい）は、ヒドロゲルナノ粒子チャンバーを通過して所望の被検体をナノ粒子内に隔離し、不要な試料液体を先に滲出させることを可能にする。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、ヒドロゲル粒子を試料収集デバイス内に含有させ得る方法を記述する。試料収集デバイスに設置されたヒドロゲルナノ粒子は、分子サイズふるい、親和性被検体隔離、濃縮、および分解からの保護を可能にする。残りの試料液体は、収集デバイスから滲出して先に出ていき、要望の被検体は、抽出緩衝液を使用して免疫測定デバイスを通って輸送される。
【００１４】
別の実施形態は、全血、ならびに尿、脳脊髄液、汗、唾液、乳頭吸引液、呼気凝縮液、気管支肺胞洗浄液、および羊水などの他の体液、ならびに環境水試料などの非生物学的液体中に存在する個々の種類の低分子量分子に特異的な複数の亜集団を含有する回収用ナノ粒子の集団を含有する側方流動免疫測定を記述する。複数の亜集団を含有するデバイスは、単一デバイス構成で、複数の被検体を同時に定量化する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】側方流動免疫測定デバイスにアプライする前に試料液体を前処理する収集デバイス（１０）を使用して試料を収集する方法を示す図である。血液試料を指（２０）から採取し、キャピラリースロットである試料収集デバイス（３０）を既知量の血液で満たす。その後、試料を緩衝液（４０）に分散させ、試料はそこでＬＦＡ用に前処理される。
【図１ｂ】基層に含浸されたナノ粒子を有する側方流動免疫測定デバイスの設計を示す図である。試料アプライ側には、２つの区画（５０）があり、１つは前処理された試料を添加するためのものであり、１つは溶出液を添加するためのものである。ナノ粒子で含浸されているストリップ部分（６０）も存在する。測定側には、抗体および金粒子を含有するストリップ部分（７０）がある。サンドイッチアッセイを生成する別のセットの抗体を含有する部分（８０）も存在する。この第２の抗体群の上には、測定窓（９０）がある。
【図２】基層に含浸されたナノ粒子を有する側方流動免疫測定デバイスの設計を示す図であり、固定されているヒドロゲルナノ粒子から標的被検体が溶出されるまで、ＬＦＡの試料アプライ部分は、測定部分と離れている（１００）。試料は、試験ストリップ（１１０）に添加され、その後ストリップに含浸されているナノ粒子部分（１２０）を通って移動する。液体緩衝液および試料は、液体が端部（１４０）で吸収されるまでストリップ（１３０）を流動していく。第２のステップは、ナノ粒子と第１のセットの抗体との間の接触（１５０）がもたらされることを必要とする。接触がもたらされた後、粒子は溶出され（１６０）、標的被検体は測定ライン（１７０）へと移動していく。
【図３】ＬＦＡ試験ストリップに含浸される代りに初期試料と混合されているヒドロゲルナノ粒子を捕捉するための疎性網目部分（１９０）を有する側方流動免疫測定デバイスの設計を示す図である。ステップ１の略図では、試料は網目に隣接している容器（１８０）を介してストリップに導入され、緩衝液は、ストリップ（２００）の長さを先に滲出していく。略図のステップ２では、溶出液は、ナノ粒子の上（２１０）に添加され、標的被検体は、測定窓（２２０）に向かってストリップを移動していく。
【図４】コアシェル粒子（２３０）の略図を示す図である。ナノ粒子は、ベイトとして機能するＮＩＰＡｍ−ＡＡｃコア（２７０）で構成される。タンパク質溶液に粒子を添加した後（２４０）、バイオマーカーは、このベイトに誘引および捕捉される（２５０）。ＮＩＰＡｍシェル（２６０）は、ナノ粒子のふるい特性を増大させる。
【図５】ナノ粒子の光散乱および原子間力顕微鏡による特徴付けを示す図である。（Ａ） 室温では、コアは、サイズがおよそ３６０ｎｍであるが、付加コア−シェル粒子は、ｐＨ４．５で７００ｎｍの直径を有する。コアおよびコアシェル粒子は、典型的な温度依存性挙動に従う。（Ｂ）ＭｉｌｌｉＱ水中の粒子懸濁液（ｐＨ５．５、１μｇ／ｍＬ）を、室温、加湿雰囲気下で１５分間、新しく劈開されたマイカ上に配置し、窒素下で乾燥した。ナノ粒子の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を取得した。粒子は、およそ８００ｎｍの直径を有しており、均一なサイズ分布を示す。粒子の高さについてのスケールバーは、１６８ｎｍの最大高さを示す。ＡＦＭ画像は乾燥状態下で取得されたため、粒子は、マイカ表面で乾燥することによりそれらの球形状から歪められている（平らにされている）。
【図６】粒子と共にインキュベートされたＰＤＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。（Ａ）レーン１）ＢＳＡおよびＰＤＧＦを含有する開始溶液（対照）、２）上清（外）；３）粒子内容物（内）。粒子は、担体アルブミンからＰＤＧＦを取り除き、アルブミン自体を完全に排除する。（Ｂ）レーン１）ＰＤＧＦ、ＢＳＡ、アプロチニン（ＭＷ６，５００Ｄａ）、リゾチーム（ＭＷ１４，４００ ６７３Ｄａ）、トリプシン阻害剤（ＭＷ２１，５００Ｄａ）、炭酸脱水酵素（ＭＷ３１，０００Ｄａ）、およびオバルブミン（ＭＷ４５，０００ ６７５Ｄａ）を含有する開始溶液（対照）、２）上清（外）；３）粒子内容物（内）。粒子は、低分子量タンパク質と一緒にＰＤＧＦを回収し、およそ２０，０００Ｄａを超えるタンパク質を除外する。
【図７】コアシェル粒子が、検出不能なＰＤＧＦの濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイの検出範囲に上昇させることを示す図である。（Ａ）較正物質希釈液ＲＤ６−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、保存剤を有する動物血清）中１８．９２±４．３１３ｐｇ／ｍＬの濃度のＰＤＧＦ開始溶液、およびコア−シェル粒子から溶出されたＰＤＧＦ（８５．２７±２．２４ｐｇ／ｍＬ）のＥＬＩＳＡ測定値。（Ｂ）インキュベーション重複実験に使用された粒子の量に対してプロットされた、コア−シェル粒子溶出液中のＰＤＧＦ濃度。（Ｃ）ＰＤＧＦ濃度対吸光度のＥＬＩＳＡ検量６８４線。検量線は、各ＰＤＧＦ較正物質濃度につき２回反復で生成された。
【図８】コアシェル粒子が、非常に希釈されたＰＤＧＦの濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定したところ、およそ１０倍（１０００パーセント）増加させることを示す図である。（Ａ）較正物質希釈液ＲＤ６−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、保存剤を有する動物血清）中６３．６９±１．４４８ｐｇ／ｍＬの濃度のＰＤＧＦ開始溶液、およびコア−シェル粒子から溶出されたＰＤＧＦ（４９１．１４±４．８１８ｐｇ／ｍＬ）のＥＬＩＳＡ測定値。（Ｂ）インキュベーション重複実験に使用された粒子の量に対してプロットされた、コア−シェル粒子溶出液中のＰＤＧＦ濃度。６９４（Ｃ）ＰＤＧＦ濃度対吸光度のＥＬＩＳＡ検量線。検量線は、各ＰＤＧＦ較正物質濃度につき２回反復で生成された。
【図９】コアシェル粒子が、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定したところ、血清中の未処理ＰＤＧＦの濃度を増加させることを示す図である。（Ａ）較正物質希釈液ＲＤ６−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、保存剤を有する動物血清）中１７０．９１±４．６６ｐｇ／ｍＬの濃度の開始血清溶液、およびコア−シェル粒子から溶出されたＰＤＧＦ（１７４３．４３±１１．０６ｐｇ／ｍＬ）のＥＬＩＳＡ測定値。（Ｂ）インキュベーション重複実験に使用された粒子の量に対してプロットされた、コア−シェル粒子溶出液中のＰＤＧＦ濃度。（Ｃ）ＰＤＧＦ濃度対吸光度のＥＬＩＳＡ検量線。検量線は、各ＰＤＧＦ較正物質濃度につき２回反復で生成された。
【図１０】粒子によるケモカイン取り込みを示すＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。コア−シェル粒子を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下において、以下のケモカインと共にインキュベートした：粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ／ＣＣＬ２８）、ストロマ細胞由来因子−１ベータ（ＳＤＦ−１β／ＣＸＣＬ１２ｂ）、およびエオタキシン−２（ＣＣＬ２４）。ケモカインおよびＢＳＡの溶液は、レーン１、４、および７に示されている。粒子と共にインキュベーションした後、上清中に残存するケモカインはなく（Ｓ、レーン２、５、および８）、ケモカインはすべて粒子により捕捉された（Ｐ、レーン３、６、および９）。ＢＳＡは、粒子により完全に除外された。
【図１１】コア−シェル粒子が、捕捉されたＰＤＧＦをトリプシン分解から保護することを示す免疫ブロット分析を示す図である。（Ａ）Ｓｙｐｒｏ ｒｕｂｙによる全タンパク質染色、および（Ｂ）同一ＰＶＤＦ膜の抗ＰＤＧＦ抗体による免疫ブロット分析が示されている。レーン１）対照ＰＤＧＦ＋ＢＳＡ溶液；２）ＰＤＧＦ＋ＢＳＡと共にインキュベートされた粒子の内容物（内）；３）ＰＤＧＦ＋ＢＳＡと共にインキュベートされた粒子の上清（外）；４）ＢＳＡ＋ＰＤＧＦ＋トリプシンと共にインキュベートされた粒子の内容物（内＋トリプシン）；５）ＢＳＡ＋ＰＤＧＦ＋トリプシンと共にインキュベートされた粒子の上清（外＋トリプシン）；６）粒子なしで４０分間インキュベートされたＢＳＡ＋ＰＤＧＦ＋トリプシン（＋トリプシン４０’）；７））粒子なしで２０分間インキュベートされたＢＳＡ＋ＰＤＧＦ＋トリプシン（＋トリプシン２０’）；８））粒子なしで１０分間インキュベートされたＢＳＡ＋ＰＤＧＦ＋トリプシン（＋トリプシン１０’）；９））粒子なしで０ ７２７分間インキュベートされたＢＳＡ＋ＰＤＧＦ＋トリプシン（＋トリプシン０’）。
【図１２】コア−シェル粒子がケモカインを酵素分解から保護することを示すＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。コア−シェル粒子を、トリプシンの存在下において、以下のケモカインと共にインキュベートした：粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ／ＣＣＬ２８）、ストロマ細胞由来因子−１ベータ（ＳＤＦ−１β／ＣＸＣＬ１２ｂ）、およびエオタキシン−２（ＣＣＬ２４）。ケモカインの溶液（対照）は、レーン１、４、および７に示されている。粒子と共にインキュベートされたケモカイン（レーン３、６、および９）は、トリプシン分解から保護されるが、粒子と共にインキュベートされなかったケモカイン（レーン２、５、および８）は、タンパク質分解性消化に感受性である。黒色ボックスは暗色ブロットを表し、斜線ボックスは画像の明色ブロットを表す。
【図１３】ヒト血清中にスパイクされたＰＤＧＦの回収を実証する免疫ブロット分析を示す図である。レーン１）ヒト血清＋ＰＤＧＦ（５ｎｇ／μＬ）：血清が粒子と共にインキュベートされない場合、ＰＤＧＦは検出することができない；２）粒子上清（外）；３）粒子内容物（内）；４）ヒト血清＋ＰＤＧＦ（２ｎｇ／μＬ）：血清が粒子と共にインキュベートされない場合、ＰＤＧＦは検出することができない；５）粒子上清（外）；６）粒子内容物（内）。 黒色ボックスは暗色ブロットを表し、斜線ボックスは画像の明色ブロットを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１ａに示されているように、試料希釈液を含有する滴瓶バイアルの一体化部分である細棒の端部にあるキャピラリースロットにより、一定容積の試料を収集することができる。これは、当分野において、手掌採血で試料を収集し、再現性のある容積稀釈を実施するための手段である。希釈バイアルは、懸濁されている本発明のナノ粒子を含有することができる。溶液中にナノ粒子を含有する試料を漏斗状開口部が受容するように、滴瓶バイアル中の試料を該デバイスに導入し、被検体を含有するナノ粒子を、滲出進入口でろ過する。
【００１７】
図１ａに示されている方法が完了すると、前処理された試料は、図１ｂに示されているように、側方流動免疫測定デバイス内で二段階分析法にかけられる。免疫測定デバイスは、ａ）試料アプライ側、およびｂ）測定側を備えており、それらは互いにサンドイッチされる。試料アプライ側は、前処理された試料および溶出緩衝液が添加される一方の端部に２つの別々のスロットを含有し、該ストリップの反対側の端部に吸収パッドを含有するストリップである。２つの端部の間で、該スロットの一方の下方には、捕捉粒子を含浸させたストリップの区画がある。該デバイスの測定側は、ａ）標的被検体の１つのエピトープに誘引される抗体および金粒子を含有する捕捉粒子の下方にある区域、ｂ）抗体の第１の区域とは異なる標的被検体のエピトープに誘引される抗体の区域、ｃ）抗体の第２の区域付近の測定窓、およびｄ）吸収性パッドを備える。図１ｂに例示されている方法の第１のステップでは、前処理された試料が、第１のスロットに添加される。試料は、捕捉粒子の区域を通過して、ストリップの長さを移動していく。捕捉粒子は、試料から標的被検体を回収し、試料の残りは、端部の吸収性パッドに向かって先に滲出していく。第１のステップが完了すると、その時点で標的被検体を含有している捕捉粒子の区域の上方にある第２のスロットに、溶出緩衝液が直接添加される。被検体は、捕捉粒子から溶出され、第１のセットの抗体および金の粒子を含有している区域へと移動する。抗体は標的被検体に結合し、試料は抗体の第２の区域に向かってストリップを移動いていく。標的被検体は、抗体の第２の区域に結合し、２つのセットの抗体の間にサンドイッチされる。これが生じると、該デバイスの測定窓において色の変化が観察される。試料の残りは、端部の吸収性パッドに向かってストリップの長さを移動し続ける。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、該デバイスの試料アプライ側および測定側は、図２に示されているように、最初は空隙により分離されている。この実施形態では、捕捉粒子の区域は、２つの区域を一緒に押し、つまみを回し、分離タブを引き抜き、該デバイスの試料アプライ層を膨潤させることにより、または２つの区域の接触をもたらす他の幾つかの手段により、溶出中に抗体の第１の区域に接触するに至る。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、捕捉粒子は、図３に示されているように、側方流動デバイスに含浸させるのではなく、試料に直接添加される。捕捉粒子が標的被検体を回収すると、その後、捕捉粒子を捕捉する疎性網目区画を有する該デバイスの試料部位に試料をアプライし、試料の残りが端部の吸収性パッドに向かって先に滲出していく際に、側方流動免疫測定の第１のステップが生じる。第２のステップには、図３に示されているように、捕捉粒子から標的被検体を抽出する疎性網目に抽出緩衝液を添加して、被検体が、該デバイスの測定側に含有されているサンドイッチアッセイを通って移動することを可能にさせることが伴う。
【００２０】
したがって、本明細書に記述されている本発明の実施形態は、本発明の原理の応用の例示に過ぎないことが理解されるべきである。例示されている実施形態の詳細を本明細書で参照することは、本発明にとって不可欠であると見なされる特徴をそれら自体が列挙している特許請求の範囲を制限することを意図しない。
【実施例１】
【００２１】
１．バイオマーカー測定における主要な問題は、血液中のマーカー候補の含有量（濃度）が非常に低いことであり、マーカー候補は、質量分析および従来の免疫測定の検出限界未満で存在する。初期段階の疾患では、患部組織は患者の組織容積の少しの割合を占めているだけであるため、そのような低含有量が予測されるだろう。初期段階の疾患検出は、一般的により良好な全体的患者予後を提供する。
【００２２】
２．バイオマーカーの発見および測定の第２の主要な問題は、循環血漿タンパク質の９０％を占める、アルブミンおよび免疫グロブリンなどの常在性タンパク質の圧倒的な含有量であり、それにより、希少バイオマーカーの単離が妨害および隠蔽される［６］。実際、低含有量バイオマーカーの大部分は、希少バイオマーカーと比較して１０億倍の過剰量で存在するアルブミンなどの担体タンパク質と非共有結合で内因性に結合している［７］。
【００２３】
バイオマーカー測定の第３の主要な課題は、低含有量バイオマーカーは、血液試料を患者から採取した直後から内因性および外因性プロテイナーゼにより急速に分解される傾向があるということである。バイオマーカー候補の分解は、血液の輸送および保管中にも生じ、著しい偽陽性および偽陰性の結果をもたらす［８］。
【００２４】
ナノテクノロジーの分野は、バイオマーカー発見に対するこれら３つの根本的な生理学的障害に取り組むための新しい手法を提供する。最近、本発明者らは、これら３つの障害を溶液中で１ステップで克服する高機能ヒドロゲルコアシェルナノ粒子を設計した［９］。ヒドロゲル粒子は、環境的な引き金、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度、または電場を適用した結果として膨潤および収縮することが可能である親水性ポリマーで構成されるサブマイクロメートルサイズの架橋粒子である［１０〜１４］。ヒドロゲル粒子は、生体適合性が高く、独特の生理化学的特性を有するため、生体医学およびバイオテクノロジーにおいて広範囲の応用を有する［１５〜１８］。
【００２５】
ナノ粒子は、分子ふるいクロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーを溶液中で１ステップで同時に実施する［９］。粒子の親和性マトリックス内に捕捉および結合された分子は、外因性または内因性のプロテアーゼによる分解から保護される。この実行可能性研究は有望だったが［９］、そのようなヒドロゲル粒子技術が、臨床的に関連した、非常に不安定で、含有量が非常に低いバイオマーカーに応用可能であることを示し得るかどうかはこれから証明されなければならなかった。この課題に取り組むために、本発明者らは、新しい種類のコア−シェル粒子を生成し、モデルバイオマーカーである血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を特異的に捕捉するコアベイトを個別に作製した。現実世界の問題に対するヒドロゲル粒子の応用可能性を研究するために、非常に低濃度（３ｎｇ／ｍＬ）で血液中に存在し、半減期が短い（２分）ため［１２］、ＰＤＧＦを癌関連バイオマーカー分析の非常に困難なモデルとして選択した。ＰＤＧＦは、細胞表面チロシンキナーゼ受容体を介してシグナル伝達するペプチド増殖因子のファミリーであり、成長、増殖、および分化を含む種々の細胞機能を刺激する。異なる遺伝子（染色体４、７、１１、２２）によりコードされた異なる４つのポリペプチド鎖（ＰＤＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、および−Ｄ）が、記述されている［１９、２０］。ＰＤＧＦは、腫瘍進行中の血管新生および腫瘍間質圧力レベルに役割を果たす［２１〜２３］。ＰＤＧＦおよびその受容体を標的とするように設計された、いくつかの新しい治療薬が、現在、腫瘍学臨床で使用されている［２４〜２８］。ＰＤＧＦは、このような治療診断価値（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ）が知られているにも関わらず、この低分子量増殖因子の含有量が極端に低く、非常に不安定であるため、臨床において日常的におよび正確に測定することができない。ＰＤＧＦの他に、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ２４、およびＣＸＣＬ１２などの、含有量が非常に低く非常に不安定な一連の追加的なケモカインの隔離および分解からの保護を確認した。これらケモカインは、それぞれ４４ｐｇ／ｍＬ［２９］、１０３ｐｇ／ｍＬ［３０］、および１．５ｎｇ／ｍＬ［３１］の血清中濃度を有する。ケモカインの血中半減期は非常に短く、１０分未満である［３２］。ケモカインは、白血球の遊走を指図し、炎症応答を活性化し、腫瘍成長に寄与する小型サイトカインである。ケモカインは、３つの重要な機序：腫瘍関連血管新生の制御、宿主の腫瘍特異的免疫学的応答の活性化、および自己分泌様式での腫瘍細胞増殖の直接刺激により腫瘍挙動を調節する。これら機序はすべて有望な薬物標的である［３３］。
【００２６】
多孔性ラテックスへのベイト分子の組み込みは、ヒドロゲル粒子が溶液中の分子の取り込みを推進する際に、粒子との結合に向けて平衡状態をシフトさせ、捕捉された分子が分解から保護されることを保証する。ベイトは、化学部分を担持するモノマーの共重合により、または既に形成されたヒドロゲル粒子と共有結合している化学部分を負荷することにより導入することができる。
【００２７】
ａ）タンパク質およびペプチド、ｂ）代謝産物、ｃ）脂質および脂肪酸、ｄ）核酸、ならびにｅ）翻訳後修飾されたペプチド（例えば、グリコシル化およびリン酸化）などの多様な範囲のバイオマーカーに選択的に結合し濃縮するために、様々な種類のベイト化学を生成した。ベイト化学には、電荷に基づくベイト（アクリル酸、アリルアミンコモノマー）、トリアジン負荷染料（シバクロンブルー）、ベータ−シクロデキストリン、ボロン酸が含まれる。
【００２８】
アクリル酸は、３．５を超えるｐＨ値で脱プロトン化され、したがって、正荷電ポリペプチドおよびタンパク質を標的とする負電荷を担持する。アリルアミン（ｐＫ＝９．６９［３４］）は、正味負電荷を有するポリペプチドおよびタンパク質に対するベイトとして作用する。荷電粒子に対するポリペプチドの親和性は、担体タンパク質に対するポリペプチドの親和性より高いことが証明されており、タンパク質の等電点および粒子の解離定数の値に依存する［９］。荷電粒子１４１の回収および濃縮特性は、溶液のｐＨおよびイオン強度に依存する。
【００２９】
代替的ベイト戦略は、ＮＩＰＡｍに基づく粒子にトリアジン由来の繊維染料（シバクロンブルー Ｆ３Ｇ−Ａ、プロシオンレッド Ｈ８ＢＮ）を負荷することである［３５］。染料は、低価格であり、分子認識が高度に特異的であるため、親和性クロマトグラフィーで使用されてきた［３６］。本発明者らは、シバクロンブルー染料を負荷したヒドロゲル粒子の合成に成功し、それらが、小型タンパク質およびホルモンを尿から効果的に取り込むことを実証した［３７］。
【００３０】
加えて、シクロデキストリンをヒドロゲル粒子に結合させた。シクロデキストリンは、親油性内部空洞および親水性外側表面を有する環式グルコースオリゴ糖であり、疎水性ゲスト分子と相互作用して非共有結合による複合体を形成可能であり、薬物送達の媒介体として広範に使用されている［３８］。シクロデキストリンは、コレステロール［３９］、ステロイド［４０］、ＤＯＰＡ［４１］に結合することが示されている。好適なサイズおよび好ましくは疎水性の特徴を有するゲスト分子を誘引および安定化する力は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用であると考えられている［４２］。
【００３１】
さらに、本発明者らは、標的生体分子のジオール基と複合体を形成することが知られているボロン酸基を含有する粒子を設計した。ボロン酸イオンは、ヌクレオチド、ＲＮＡ、糖化タンパク質、および糖酵素の選択的単離に関与する親和性クロマトグラフィー応用に使用されている［４３〜４８］。
【００３２】
コア−シェル構造では、ベイト含有区域は、多孔性シェルにより覆われている。コア−シェルヒドロゲル粒子は、コアおよびシェルの特性を別々に個別調製することができるため、特に有益である。薬物送達に使用される多くのコア−シェル粒子系では、その目的の応用に必要とされる特性を有するようにコアが設計される［１２、４９〜５１］。その後、別々にシェルが加えられて、コアが取り囲まれ遮蔽される。シェルの厚さを改変して、透過性または多孔度を変更することができる。
【００３３】
本研究において、本発明者らは、溶液中でタンパク質に対する親和性結合を実施するために、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ）−アクリル酸（ＡＡｃ）コアが、電荷に基づくベイトを含有し、ＮＩＰＡｍシェルが、コアを取り囲んでおり、シェルの多孔度を透過するのには大きすぎる溶液相のタンパク質を除外するためのふるいとして作用するコア−シェル粒子を合成した（図４）。ＮＩＰＡｍに基づく粒子は、それらの多孔性構造により、明確な分子サイズカットオフで大型分子を除外する。多孔性の度合いは、モノマーに関しては、架橋剤Ｎ，Ｎ’メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）の割合を変更することにより調整することができる。同時に、粒子は、ポリペプチドおよび他の低分子がポリマーマトリクスを透過し、希少タンパク質バイオマーカーの濃縮を可能にするのにも好ましい条件を供給する大量の水を吸収することができる［１４］。
【００３４】
本発明者らは、３つの独立実験系を使用して、この新粒子が、以下を達成することができるかどうかを試験した：ａ）全血清を含む、高含有量タンパク質の複雑な混合液内にある溶液相ＰＤＧＦおよびケモカイン分子をすべて迅速に回収すること、ｂ）アルブミンなどの高含有量タンパク質を完全に除去し、捕捉したＰＤＧＦおよびケモカインを、開始容積のほんの一部だった低容積中に放出すること。この濃縮ステップは、検出可能なマーカーレベルを低容積で増大させる能力を示し、これは、免疫測定プラットフォームまたは質量分析法などの測定系への入力に必要とされ、およびｃ）捕捉されたＰＤＧＦおよびケモカインを、高濃度で導入される外因性分解酵素による分解から保護すること。本研究のために使用した３つの独立した実験手法は、１）臨床等級のＥＬＩＳＡ免疫測定、２）開始溶液、上清、および粒子内容物のゲル電気泳動、その後の免疫ブロット、ならびに３）粒子捕捉溶出物と比較した、開始溶液の質量分析であった。
【００３５】
本研究の目的は、理論的な想定通りにバイオマーカーを濃縮および保存するコア−シェル粒子の能力を調査することであった。
【００３６】
結果
粒子合成および特徴付け
本研究で使用される粒子構造の場合、ＮＩＰＡｍシェルは、親和性ベイト部分を含有するＮＩＰＡｍ／ＡＡｃコアを取り囲んでいる。ＮＩＰＡｍシェルのふるい能力は、存在する可能性があり、低含有量で低分子量の目的分子標的と、コアの親和性ベイトに対する結合を競合することができるより大型の分子から、コアおよびその親和性ベイト基を遮蔽する。コアおよびコア−シェル粒子のサイズを比較するために、光散乱による特徴付けを、粒子に対して合成中およびプロセスの終了時に実施した。２５℃およびｐＨ４．５でのコア直径は、３６４．７±４．３ｎｍであり、同じ条件におけるコア−シェル粒子の直径は、６９９．４±６．２ｎｍである（図５Ａ）。これは、シェルの厚さが約１７０ｎｍであることを示唆する。ヒドロゲルを含有するＡＡｃの特徴的挙動に従って、コアおよびコア−シェル粒子のサイズは両方とも、温度の上昇およびｐＨの低下に従って減少した（図５Ａ）。粒子を、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によりさらに特徴付けた。ＡＦＭの粒子画像（図５Ｂ）は、サイズの均一性を確認し、ＡＦＭによる粒子直径の測定値は、光散乱で測定されたものと一致した。粒子濃度は、凍結乾燥された粒子を計量することにより取得したところ、１０ｍｇ／ｍＬであり、１ミリリットル当たりの粒子数は２億３０００万個であった。
【００３７】
コア−シェル粒子によるＰＤＧＦの分子ふるいおよび濃縮
ヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、ＭＷ１４，５００Ｄａ）を、ＰＤＧＦと結合する担体タンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＭＷ６６，０００Ｄａ）を含有する溶液にスパイクし、ＰＤＧＦ−ＢＳＡ溶液に添加されたコア−シェルヒドロゲルナノ粒子は、ＢＳＡと粒子との結合が検出されないことにより立証される分子ふるいとして作用し、粒子は、ＢＳＡを完全に除外し、溶液相ＰＤＧＦをすべて完全に隔離した（図６Ａ）。これは、ベイトに対するＰＤＧＦ親和性が、担体ＢＳＡの親和性より高かったことを示唆する。コア−シェル粒子の分子ふるい特性をさらに評価するために、ＰＤＧＦ、ＢＳＡ、アプロチニン（ＭＷ６，５００Ｄａ）、リゾチーム（ＭＷ１４，４００Ｄａ）、トリプシン阻害剤（ＭＷ ２１８ ２１，５００Ｄａ）、炭酸脱水酵素（ＭＷ３１，０００Ｄａ）、およびオバルブミン（ＭＷ４５，０００Ｄａ）を含有する溶液を使用した。粒子によるタンパク質の取り込みを、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより評価した。コア−シェル粒子は、２１，５００Ｄａ未満の重量を有する低分子量タンパク質を効果的に捕捉および濃縮したが、高分子量を有するタンパク質は粒子から除外されたままであった（図６Ｂ）。
【００３８】
コア−シェルヒドロゲルナノ粒子による溶液中ＰＤＧＦの濃縮
本発明者らは、濃度がＥＬＩＳＡの検出閾値未満である希釈ＰＤＧＦ試料を濃縮するナノ粒子能力を検討し、ＰＤＧＦの濃度が粒子隔離により増加されて、ＥＬＩＳＡによりＰＤＧＦが測定可能になるかどうかを決定した。
【００３９】
図６Ａで示されているように、以前は検出不能だったレベルのＰＤＧＦを粒子から回収し、ＥＬＩＳＡにより７５〜１０２ｐｇ／ｍＬの範囲の濃度で定量化することに成功した。図７Ａに報告されている開始溶液中のＰＤＧＦ濃度の値（１８．９２±４．３１３ｐｇ／ｍＬ）は、ＥＬＩＳＡ免疫測定の線形範囲未満（最低検出可能ＰＤＧＦ用量＝３０ｐｇ／ｍＬ）であり、光学密度の使用により評価し、２３２検量線から推定した。製造業者の説明書によると、この最低検出可能用量は、２０回のゼロ標準物質重複測定の平均光学密度値に、標準偏差を２倍にした値を加え、対応する濃度を計算することにより決定された。このように、コア−シェル粒子を、ＥＬＩＳＡでは検出不能な濃度のＰＤＧＦ溶液と共にインキュベートし、回収し、アッセイの検出限界より高いレベルにＰＤＧＦを濃縮した。予想通り、ＰＤＧＦ溶液が非常に希薄だった場合でも、最低限の量の粒子で飽和が到達された（図７Ｂ）。この手順の品質を評価するために、ＰＤＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイの検量線を生成した（図７Ｃ）。同様の実験を、より濃縮されたＰＤＧＦ溶液で実施した。開始溶液中のＰＤＧＦ濃度は、６３．６９（±１．４４８）ｐｇ／ｍＬであったが、粒子から回収したＰＤＧＦ濃度は、４５２．８１（±４．８１８）ｐｇ／ｍＬであり、約７００％の濃縮係数をもたらした（図８Ａ）。ＰＤＧＦ溶液を、様々な容積の粒子と共にインキュベートし、粒子の容積が２００μｌだった場合に、飽和が達成されたことを実証した（４６００万個の粒子、１：５容積／容積の粒子：ＰＤＧＦ溶液比、図８Ｂ）。ＰＤＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイの検量線を繰り返した（図８Ｃ）。
【００４０】
ヒト血清由来の未処理ＰＤＧＦを隔離、濃縮、および保存するコアシェル粒子の能力を試験するために、さらなる実験を実施した。本発明者らは、血清由来の未処理ＰＤＧＦの飽和および完全な枯渇に達するのに必要な粒子量に対する過剰量干渉タンパク質の影響を検討した。血清を、トリスＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ７で１：１０に希釈し、増加する量の粒子と共にインキュベートした（２００、５００、１０００、および１５００μＬ）。開始血清溶液中のＰＤＧＦ値は、１７０．９２±４．６６ｐｇ／ｍＬであると測定されたが、粒子から回収されたＰＤＧＦ濃度は、１７４３．４３±１１．０６ｐｇ／ｍＬであり、約１０倍（１０００パーセント）の濃縮係数をもたらした（図９Ａ）。１０００μＬの値で飽和が達成された（２億３０００万個の粒子、１：１容積／容積の粒子：血清溶液、図９Ｂ）。血清中のＰＤＧＦ開始濃度が図８の溶液中ＰＤＧＦ濃度より高いという事実を考慮して、本発明者らは、大量のタンパク質含有量を有する血清が開始試料中に存在しても、試料を枯渇させるために必要とされる粒子量は２倍未満であると結論付けることができ、したがって大量の血清タンパク質が存在する場合でさえも、粒子の結合能は非常に高いことを確認した。これらの研究で使用されたＰＤＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイの検量線が示されている（図９Ｃ）。
【００４１】
コア−シェル粒子による溶液中ケモカインの濃縮
図１０には、血清学的バイオマーカーの他の関連モデル、つまりＢＳＡと混合された粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ／ＣＣＬ２８、１２，３００Ｄａ）、ストロマ細胞由来因子−１ベータ（ＳＤＦ−１β／ＣＸＣＬ１２ｂ、８，５００Ｄａ）、およびエオタキシン−２（ＣＣＬ２４、８，８００Ｄａ）と共にインキュベートされたコアシェルアクリル酸官能化粒子のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析が示されている。ケモカインは、粒子により溶液から完全に除去され、捕捉され、および濃縮されたが、ＢＳＡは完全に除外されていた。
【００４２】
コア−シェル粒子による酵素分解からのＰＤＧＦの保護
内因性および外因性プロテアーゼによるバイオマーカーの分解は、バイオマーカーの性能バイアスの主な要因であり、バイオマーカー候補の発見および測定を妨害する。免疫ブロット分析を使用して、酵素分解からＰＤＧＦを保護する粒子の能力を評価した。粒子の非存在下において、ＰＤＧＦに対するトリプシン作用は１０分後には明らかであり、１４，０００〜１７，０００ＤａのＰＤＧＦバンドがほとんど検出不能であることにより示されるように（図１１Ａおよび図１１Ｂのレーン６〜８）、１時間後にはほとんど完了した。著しく対照的に、トリプシンおよびコア−シェル粒子と共にインキュベートされたＰＤＧＦは、染色強度が減少せず断片化されていなかった単一種のバンドを生成し、粒子がタンパク質分解からＰＤＧＦを保護することに成功したことを示唆した（図１１Ａおよび図１１Ｂのレーン４）。トリプシンなしでＰＤＧＦが負荷された粒子のＰＤＧＦバンド（図１１Ａおよび図１１Ｂのレーン２）は、ＰＤＧＦおよびトリプシンが負荷された粒子のＰＤＧＦバンド（図１１Ａおよび図１１Ｂのレーン４）と同一であり、ＰＤＧＦタンパク質が酵素分解により失われなかったことをさらに示唆した。
【００４３】
コア−シェル粒子による酵素分解からのケモカインの保護
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して、モデルとして選択されたケモカインを酵素分解から保護する粒子の能力を評価した。図１２に示されているように、トリプシンは、粒子による隔離がない場合、各種類のケモカインを急速に分解した（図１２、レーン２、５、８）。著しく対照的に、トリプシンおよび粒子と共にインキュベートされたケモカインは（図１２、レーン３、６、９）、断片化されていなかった単一種のバンドを生成し、粒子がタンパク質分解からバイオマーカーを保存することに成功したことを示唆した。
【００４４】
コア−シェル粒子は、ヒト血清にスパイクされたＰＤＧＦを濃縮および保存する
ＰＤＧＦの血漿中半減期が非常に短い（２分）ことは、分析上の主要な課題である。免疫ブロットおよび質量分析を使用して、ヒト血清にスパイクされたＰＤＧＦを回収、濃縮、および保存するコア−シェル粒子の効率を研究した。免疫ブロットを使用して、正しい分子量の完全タンパク質が存在することにより、ＰＤＧＦの保存を検証した。５０μＬ等量のコア−シェル粒子を、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７で１：２５に希釈されたヒト血清中にスパイクされた５０μＬのＰＤＧＦ溶液（５ｎｇ／ｍＬまたは２ｎｇ／ｍＬの濃度）と共に、室温で１時間インキュベートした。粒子は、上清（図１３、レーン２および５）、および同時に、２つの異なる濃度で血清中にスパイクされた濃縮ＰＤＧＦ（図１３、レーン３およびレーン６）に残っていた高分子量タンパク質を除外した。上記のＥＬＩＳＡで示されているように、開始溶液中のＰＤＧＦは検出不能であった（図１３、レーン１および４）。粒子は、ＰＤＧＦ分子の質量または含有量に検出可能な変化をもたらさずに、非常に複雑な血清溶液内のＰＤＧＦ濃度を、免疫ブロットの検出限界を十分に超える濃度に増加させた。
【００４５】
物質および方法
本研究で使用された血清は、ＩＲＢ認可の血清収集プロトコール（プロトコール番号 ＧＭＵ ＨＳＲＢ＃６０８１）に基づき、インフォームドコンセントに基づいて取得し、データは、ＨＩＰＡＡ、およびヘルシンキ宣言で表明された原則に従って匿名で分析した。
【００４６】
コア−シェルヒドロゲル粒子の合成：粒子は、ＮＩＰＡｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）およびＢＩＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用して、沈殿重合により合成した［４９］。ＡＡｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をＮＩＰＡｍ粒子に組み込み、ペプチドおよび低分子を親和性捕捉するための、電荷に基づく親和性部分ベイトを準備した［９］。
【００４７】
（ＮＩＰＡｍ／ＡＡｃ）コア：ＮＩＰＡｍ（０．１８４ｇ）、ＢＩＳ（０．００５５ｇ）、およびＡＡｃ（４８．４μＬ）を、３０ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、その後０．２μｍフィルターを通過させた。溶液を、１５分間室温で中程度の撹拌速度で窒素を用いてパージし、その後７０℃に加熱した。１ｍＬ Ｈ２Ｏ中の過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、０．００９９ｇ）を溶液に添加して、重合を開始させた。１０分後、シェル溶液を添加した。
【００４８】
（ＮＩＰＡｍ）シェル：シェル溶液を、０．７３６ｇのＮＩＰＡｍおよび０．１２０ｇのＢＩＳを１０ｍｌの水に溶解することにより調製した。溶液を、０．２μｍのフィルターに通し、１５分間室温で中程度の撹拌速度で窒素を用いてパージした。ＡＰＳ注入から１０分後、シェル溶液を反応コア溶液に添加した。反応物を窒素下で３時間７０℃で維持し、その後終夜冷却した。粒子を洗浄して未反応モノマーを除去し、その後１６．１ｒｃｆ、２５℃で、１５分間遠心分離した。上清を破棄し、粒子を１ｍｌの水に再懸濁した。
【００４９】
粒子の特徴付け：粒子の濃度は、凍結乾燥された粒子を計量することにより評価した。粒子は、フローサイトメトリーで計数した。
【００５０】
温度およびｐＨに対する粒子サイズの依存性は、光子相関分光法（サブミクロン粒子サイズ分析器、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）により決定した。溶液のｐＨは、ＫＣｌのバックグラウンド電解質溶液を有する適量のＮａＯＨ、ＨＣｌを添加することにより制御した。２００秒の積分時間を使用して３回の測定で平均値を計算し、各セットの測定前に溶液を１０分間熱平衡化させた。その後、測定値をストークス−アインシュタインの関係により粒子サイズに変換した［５４］。ＮＳＣＲＩＰＴＯＲ（商標）ＤＰＮ（登録商標）システム（Ｎａｎｏｌｎｋ社）を使用して、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により、粒子をさらに特徴付けた。ＭｉｌｌｉＱ水中の粒子懸濁液（ｐＨ５．５、１μｇ／ｍＬ）を、室温、加湿雰囲気下で１５分間、新しく劈開されたマイカ上に配置し、測定前に窒素下で乾燥した。画像は、３００ｋＨｚの典型的な共振周波数および１０ｎｍ未満の半径を有するシリコンチップを使用して、ＡＣモード下で取得した。
【００５１】
粒子のインキュベーション：以下を含有する５０μＬの溶液と共に、５０μＬのコア−シェル粒子をインキュベートした：
５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７中の０．０２ｍｇ／ｍＬ ＰＤＧＦ、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、
ＰＤＧＦ、ＢＳＡ、アプロチニン（ＭＷ６，５００Ｄａ）、リゾチーム（ＭＷ１４，４００Ｄａ）、トリプシン阻害剤（ＭＷ２１，５００Ｄａ）、炭酸脱水酵素（ＭＷ３１，０００Ｄａ）、およびオバルブミン（ＭＷ４５，０００
４１９Ｄａ）；これらの各々は、０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度で、５０ｍＭトリス ｐＨ７に溶解されていた。
粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ／ＣＣＬ２８、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ Ａｍｅｒｉｃａ社）、ストロマ細胞由来因子−１ベータ（ＳＤＦ−１β／ＣＸＣＬ１２ｂ、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ Ａｍｅｒｉｃａ社）、およびエオタキシン−２−（ＣＣＬ２４、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ Ａｍｅｒｉｃａ社）；これらの各々は、０．０２ｍｇ／ｍＬの濃度であり、ＢＳＡ（０．２ｍｇ／ｍＬ）と混合されており、５０ｍＭトリス ｐＨ７に溶解されていた。
【００５２】
インキュベーションは、室温で３０分間継続させた。インキュベーション後、試料を、１６．１ｒｃｆ、２５℃で７分間遠心分離し、上清を保存した。その後、粒子を１ｍＬの水中に再懸濁し、１６．１ｒｃｆ、２５℃で７分間遠心分離した。遠心分離および洗浄を３回繰り返した。
【００５３】
捕捉された被検体の粒子溶出：ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは免疫ブロット分析を実施した際、粒子をゲルに直接負荷した。ＥＬＩＳＡおよび質量分析を実施した際、洗浄した粒子を、溶出緩衝液（６０％アセトニトリル−２％酢酸）と共に３０分間インキュベートし、その後２５℃、１６，１ｒｃｆで７分間遠心分離した。溶出液を保存し、第２の溶出ステップを実施し、溶出液を同じバイアルに保存した。その後、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）で試料を乾燥し、ＥＬＩＳＡまたは質量分析で分析した。
【００５４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：粒子インキュベーションに由来する粒子および上清を、１８％トリスグリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）に負荷した。粒子はゲルのスタッキング区域に留まったが、捕捉されたタンパク質はすべて粒子から電気泳動され、ゲルで分離された。タンパク質は、銀染色により検出した。
【００５５】
酵素分解分析：５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７中のＰＤＧＦ−ＢＳＡ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）溶液（０．１１ｍｇ／ｍＬ総タンパク質）を、３７℃で様々な期間（０、１０、２０、および４０分間）の間、１：１００重量／重量のタンパク質：プロテアーゼ比率で、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）と共にインキュベートして、分解パターンを経時的に研究した。コア−シェル粒子を、ＰＤＧＦ−ＢＳＡ（０．１１ｍｇ／ｍＬ総タンパク質）およびトリプシン（０．００１１ｍｇ／ｍＬ）を含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７溶液中、１時間３７℃でインキュベートした。
【００５６】
０．０２ｍｇ／ｍＬの濃度で５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７に溶解された以下のケモカイン、ＭＥＣ／ＣＣＬ２８、ＳＤＦ−１β／ＣＸＣＬ１２ｂ、ＣＣＬ２４の各々を、１：５０重量／重量のタンパク質：プロテアーゼ比率のトリプシンと共に、およびコア−シェル粒子と共に、３７℃で４０分間別々にインキュベートした。
【００５７】
免疫ブロット分析：タンパク質を、上記のように１８％トリス−グリシンゲルで１−Ｄゲル電気泳動により分離し、その後Ｉｍｍｏｂｉｌｉｏｎ ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移し取った。販売業者の説明書に従って、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社）で膜を染色した。タンパク質ブロットは、Ｋｏｄａｋ社製４０００ＭＭ使用して画像化した。その後、膜を、０．２％Ｉ−Ｂｌｏｃｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社／Ｔｒｏｐｉｘ社）および０．１％ツイーン２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で補完されたＰＢＳと共に室温で１時間インキュベートし、その後ＰＤＧＦ−ＢＢに対する抗体と共に、継続して撹拌しながら４℃で終夜インキュベートした。０．２％Ｉ−Ｂｌｏｃｋ（重量／容積）および０．１％ツイーン２０で補完されたＰＢＳで洗浄した後、特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧ二次抗体および高感度化学ルミネセンス装置（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用することにより、免疫応答性を明らかにした。
【００５８】
ＥＬＩＳＡ分析：粒子を、較正物質希釈液ＲＤ６−３で希釈された１ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ標準物質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）と共にインキュベートした。インキュベーション時間、洗浄、および溶出は、以前に記述されているように実施した。Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃで乾燥した溶出物を、１００μＬの水に再懸濁して穏やかにボルテックスし、その後製造業者の説明書に従って、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢのＥＬＩＳＡを実施した。各測定は重複して実施し、分析した試料セットの各々について個別の検量線を生成した。このキットの検出限界（２０ｐｇ／ｍＬ）未満のＰＤＧＦ溶液の１ｍＬ等量を、様々な数の粒子（５０、１００、２００、および５００μｌ）と共に３０分間インキュベートした。タンパク質を、６０％アセトニトリルおよび２％酢酸を用いてその後２回溶出ステップを行うことにより、洗浄された粒子から溶出した。ＥＬＩＳＡ測定は、１００μＬの容積で実施した。
【００５９】
未処理血清ＰＤＧＦのＥＬＩＳＡ測定を使用して、血清に導入された一連の粒子濃度ごとに、粒子捕捉収率を判断した。５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨで１：１０に希釈された１０００μＬ等量の血清を、量を増加させた粒子（２００、５００、１０００、および１５００μＬ）と共に、室温で３０分間インキュベートした。以前に記述されているように粒子を洗浄し、１００μＬの溶出緩衝液（６０％アセトニトリル−２％酢酸）と共に１０分間インキュベートし、その後遠心分離した（２５℃、１６．１ｒｃｆで７分間）。粒子溶出液を凍結乾燥し、較正物質希釈液ＲＤ６−３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製に再懸濁した。血清溶液は、較正物質希釈液で希釈した。ＥＬＩＳＡ測定は、１００μＬの容積で実施した。
【００６０】
質量分析：以下の溶液を、コア−シェル粒子と共にインキュベートした：
複雑なタンパク質混合物でスパイクされたＰＤＧＦ：５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７中に６．７μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＭＷ６６，０００）、６．７μｇ／ｍＬアプロチニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＭＷ６，５００Ｄａ）、６．７μｇ／ｍＬリゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＭＷ１４，４００Ｄａ）、６．７μｇ／ｍＬトリプシン阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ＭＷ２１，５００Ｄａ）、６．７μｇ／ｍＬ炭酸脱水酵素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＭＷ３１，０００Ｄａ）、および６．７μｇ／ｍＬオバルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＭＷ４５，０００Ｄａ）を含有するタンパク質混合物を、４０μｇ／４８２ｍＬの総タンパク質濃度で使用した。ＰＤＧＦを以下の濃度で添加した：６７０ｎｇ／ｍＬ、６７ｎｇ／ｍＬ、６．７ｎｇ／ｍＬ、０．６７ｎｇ／ｍＬ。その結果、ＰＤＧＦと総タンパク質との比率は、それぞれ１：６０、１：６００、１：６，０００、および１：６０，０００だった。１．５ｍＬ等量の溶液を、１００μＬのコア−シェル粒子と共にインキュベートした。タンパク質を、６０％アセトニトリルおよび２％酢酸を用いて１００μＬの容積に溶出し、溶出液をＳｐｅｅｄ Ｖａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ社）で乾燥し、ナノ逆相液体クロマトグラフィー質量分析（ＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）で分析した。溶液および溶出液の両方から１００μＬ等量を分析し、したがって同じ容積を維持した。
ヒト血清：２００Ｌの健常ドナー血清を、１００Ｌのコア−シェル粒子を有する５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７で１：３に希釈した。粒子を１０％アセトニトリル、０．５×ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、６０％アセトニトリル、２％酢酸で溶出した。試料をＳｐｅｅｄ Ｖａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ社）で乾燥し、ｎａｎｏＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
【００６１】
粒子からの溶出液を、ｎａｎｏＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃで乾燥したタンパク質を８Ｍ尿素中に再構成し、１０ｍＭ ＤＴＴで還元し、５０ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシンにより終夜３７℃で消化した。トリプシンペプチドを、Ｚｉｐ−Ｔｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でさらに精製し、線形イオントラップ質量分析計（ＬＴＱ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ）を使用して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。試料注入後、カラムを移動相Ａ（０．４％酢酸）で５分間洗浄し、２５０ナノリットル／分、３０分間で０％移動相Ｂ（０．４％酢酸、８０％アセトニトリル）から５０％移動相Ｂへの線形濃度勾配を使用してペプチドを溶出し、その後さらに５分間、移動相Ｂを１００％にした。ＬＴＱ質量分析計は、３５％の正規化衝突エネルギーを使用する衝突誘起解離（ＣＩＤ）用に５つの最も豊富な分子イオンが動的に選択された５つのＭＳ／ＭＳスキャンが、各完全ＭＳスキャン後に行われるデータ依存モードで操作された。タンデム質量スペクトルを、トリプシン切断の制約を使用して、ＳＥＱＵＥＳＴデータベースに対して探索した。検索結果に以下のフィルターを適用することにより、高信頼度のペプチド同定が取得された：１＋の場合、相互相関スコア（ＸＣｏｒｒ）は１．９以上、２＋の場合は２．２以上、３＋の場合は３．５以上、ランダム同定の最大確率は０．０１。
【００６２】
総タンパク質に対して１：６０、１：６００、および１：６，０００の比率でＰＤＧＦを含有する溶液の質量分析により、ヒトＰＤＧＦに属する１３、６、および１つのペプチドがそれぞれ同定されたが、コア−シェル粒子からの溶出液は、それぞれ３３、１５、および５つのペプチドを含有していた。総タンパク質に対して１：６０，０００のＰＤＧＦ比率では、ＰＤＧＦペプチドは、トリプシン消化後の原溶液中に質量分析では検出されなかったが（０．６７ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ濃度）、粒子からの溶出液からは、ＰＤＧＦトリプシンペプチドの明瞭な質量分析計検出スペクトルが得られた。したがって、コア−シェル粒子は、質量分析計の既知検出レベル内にＰＤＧＦが存在していた場合、質量分析により溶液から同定されるペプチドの数を増加させた。加えて、このバイオマーカーが１ｍｌ当たり１ナノグラム未満に希釈され、非常に大量のタンパク質により隠蔽された場合、コア−シェル粒子は、ＰＤＧＦを濃縮し、質量分析の検出範囲へその濃度を上昇させることができた。
【００６３】
生理学的媒体中のＰＤＧＦを濃縮および保存し、同時に、隔離された任意のタンパク質を同定する粒子の能力をさらに評価するために、ＰＤＧＦ（５ｎｇ／μＬの濃度の）を、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７で１：２５に希釈されたヒト血清にスパイクし、５０μｌのコア−シェル粒子と共に１時間インキュベートした。タンパク質を溶出し、乾燥し、ｎａｎｏＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。表Ｓ１に示されているように、ＰＤＧＦを回収し、質量分析計分析により高ペプチドヒット範囲（ｈｉｇｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｉｔ ｃｏｖｅｒａｇｅ）で明白に同定した。多数の希少な低分子量タンパク質が、コア−シェル粒子により捕捉されたタンパク質の混合物内で同定された。加えて、コア−シェル粒子をヒト血清と共にインキュベートし、粒子から溶出されたタンパク質をｎａｎｏＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。非常に低い含有量（約１ｎｇ／ｍＬ）で血液中に存在する未処理ＰＤＧＦに属するペプチドを同定した。
【００６４】
これらのデータは、血清から既知のバイオマーカーを回収および保存するためのコア−シェル粒子の使用を支持するものであり、バイオマーカーの濃度、および現行のバイオマーカーの測定および発見技術の有効感度を劇的に増加させる方法を提供する。
【００６５】
全体として、本発明は、内部親和性ベイトを含有する１ｎｍ〜１００μｍのサイズ範囲の粒子による一体型の被検体濃縮および単離ステップを含み、ａ）被検体を含有する試料液体を、被検体を認識する親和性ベイトを封入する開放型ポリマー性網目構造で構成されるナノ粒子の帯域と接触させ、ｂ）被検体を、粒子内部で濃縮、隔離、および分解から保護し、ｃ）標識リガンドまたは抗体により認識されるように被検体を放出させる免疫測定系またはデバイスである。免疫測定デバイスでは、粒子は被検体含有試料液体に懸濁されており、懸濁された粒子は浮揚性であり、溶液中に留まり重力により沈殿せず、粒子は開放型ポリマー性構造であり、粒子が懸濁されている溶質が粒子の８０％超を占める。また、免疫測定デバイスでは、粒子および試料液体の混合物がデバイスにアプライされ、側方流動免疫測定デバイス内にある流体経路内の帯域に粒子が配置および固定化されている。
【００６６】
本発明は、被検体捕捉粒子を含むポイントオブケアの免疫測定デバイスでもあり、そのような粒子は、固定化された親和性リガンドを含有するポリマー性マトリックスシェルおよび内部コアを含み、ポリマー性マトリックスは、ある条件下で被検体がポリマー性マトリックスに進入することを可能にするが、混合物に由来する他の化合物をポリマー性マトリックスへの進入から除外する細孔サイズを有し、親和性リガンドは、目的の被検体を認識し、捕捉粒子は、側方流動免疫測定デバイスの一部として多孔性基層に組み込まれている。粒子が目的の被検体を隔離した後、液体試料の流路を変更することができる。被検体捕捉粒子を分離するための方法は、試料中に存在する細胞由来の標的被検体を含有しており、捕捉粒子は、異なる多孔度を通って免疫測定帯内を滲出により流動し、粒子は、１〜１０００ナノメートルのサイズ範囲である。試料は、全血、または尿、脳脊髄液、汗、唾液、乳頭吸引液、もしくは羊水などの別の体液；非生物学的液体；環境試料、農業試料、もしくは食品試料である。また、本発明は、捕捉粒子から標的バイオマーカーを分離し、そこでは抽出緩衝液を使用して、隔離されたバイオマーカーを捕捉粒子から取り除く。試料は、全血、または尿、脳脊髄液、汗、唾液、乳頭吸引液、もしくは羊水などの別の体液；非生物学的液体；環境試料、農業試料、もしくは食品試料である。
【００６７】
タンパク質、ペプチド、または核酸バイオマーカーを隔離、濃縮、および分解から保護するための方法は、ａ）ある条件下で被検体がポリマー性マトリックスに進入することを可能にするが、混合物に由来する他の化合物をポリマー性マトリックスへの進入から除外する細孔サイズを有するポリマー性マトリックス、およびｂ）内部の固定化された親和性ベイトを含む捕捉粒子を混合物と接触させることであり、試料中に存在する個々の種類の低分子量分子に対して特異的な複数の亜集団を含有する捕捉粒子の集団が、側方流動免疫測定デバイス内に組み込まれている。被検体を前濃縮および保存する本発明の手段も作用しており、そこでは、ａ）被検体が、被検体に対する親和性ベイトを含有するヒドロゲル粒子の存在下の液体溶液中に存在し、粒子は、溶液中に留まり重力により沈殿しないのに十分なほどの小さなサイズおよび浮揚性であり、ｂ）高い割合の被検体が粒子内に隔離され、ｃ）バルク枯渇液体容積は多孔性マトリックス内で先に滲出していく。本発明の捕捉粒子は、ａ）分子ふるい部分、およびｂ）被検体結合部分を含み、分子ふるい部分、被検体結合部分、またはその両方は、多孔度が改変された架橋区域をさらに含み、ふるい部分は、物理的および／または化学的処理に応じて、捕捉粒子内に被検体を捕捉するように収縮および／または膨張する。被検体結合部分は、化学的または静電気的に被検体に結合または隔離することが可能である少なくとも１つのタイプの部分を含む。被検体結合部分は、カルボキシ基、アミン基、脂質、リンタンパク質、リン脂質、アミド基、ヒドロキシル基、エステル基、アクリル基、チオール基、アクリル酸、抗体、結合タンパク質、結合対、金属、キレート剤、核酸、アプタマー、酵素結合ポケット、レクチン、薬理学的作用剤、合成ペプチド、抗体断片、疎水性表面、親水性表面、およびそれらの任意の誘導体またはそれらの組み合わせを含む。被検体は、被検体結合部分に結合し、被検体は、有機分子、無機分子、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。分子ふるい部分は、内部コアを封入する外側シェルであり、内部コアは、被検体結合部分を含んでいる。分子ふるい部分、被検体結合部分、またはその両方は、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、Ｎ−アルキル置換ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（ベンジルグルタメート）、ポリ（２−エチルアクリル酸）、ポリ（４−ビニルピリジン）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。架橋区域は、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、またはそれらの任意の組み合わせを含む。分子ふるい部分、被検体結合体部分、またはその両方は、ヒドロゲルを含む。捕捉粒子は、物理的または化学的処理に曝されると、結合または隔離されている被検体を放出し、物理的または化学的処理は、電荷、静水圧、ｐＨ変化、温度変化、酸性作用剤、塩基性作用剤、ＵＶ、超音波、Ｘ線、またはそれらの組み合わせに曝されることを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体濃縮および単離ステップを側方流動免疫測定デバイスに組み込み、前記被検体濃縮および前記単離ステップが、１ｎｍ〜１００μｍの範囲の粒子により実施されること、 親和性ベイトを前記粒子内に内部的に含有していること、 被検体を含有する試料液体をナノ粒子の帯域と接触させ、前記ナノ粒子が、前記親和性ベイトを封入する開放型ポリマー性網目構造を含むこと、 前記被検体を、前記親和性ベイトおよび前記開放型ポリマー性網目構造により認識させること、 前記被検体を濃縮および隔離することにより前記粒子内部で前記被検体の分解を防止すること、 標識されているリガンドにより前記被検体が認識されるように、前記被検体を放出すること、および 標識されている抗体により前記被検体が認識されるように、前記被検体を放出することを含む、免疫測定系。
【請求項２】
前記被検体を含有する前記試料液体中に前記粒子を懸濁することをさらに含み、前記懸濁されている粒子が浮揚性であり、前記粒子が沈殿することなく前記試料液体に留まることになる、請求項１に記載の系。
【請求項３】
前記懸濁されている粒子を維持することをさらに含み、前記粒子が、前記試料液体により８０パーセント超が占められている開放型ポリマー性構造である、請求項２に記載の系。
【請求項４】
前記粒子と前記試料液体との混合物を、前記側方流動免疫測定デバイスにアプライすることをさらに含み、前記粒子が、前記ナノ粒子の帯域に配置および固定化され、前記ナノ粒子の帯域が、側方流動免疫測定デバイス内および前記試料液体の経路内にある、請求項１に記載の系。
【請求項５】
前記粒子を前記デバイスにより捕捉することをさらに含み、前記粒子がポリマー性マトリックスシェルを含み、前記ポリマー性マトリックスシェルが、前記被検体は前記ポリマー性マトリックスシェルに進入することを可能にするが、前記試料液体内にある他の化合物が前記ポリマー性マトリックスシェルに進入することを防止する細孔サイズを有し、内部コアが、固定化された親和性リガンドを含有し、前記親和性リガンドが、前記被検体を認識するように形成される、請求項１に記載の系。
【請求項６】
多孔性基層に捕捉されている前記粒子を、前記側方流動免疫測定デバイスの一部として組み込むことをさらに含む、請求項５に記載の系。
【請求項７】
前記粒子が前記被検体を隔離した後、前記試料液体の流路を変更することをさらに含む、請求項５に記載の系。
【請求項８】
前記粒子が１ナノメートル〜１０００ナノメートルのサイズ範囲にある場合、異なる多孔度を通って滲出することにより、捕捉されている粒子を前記ナノ粒子の帯域内に向かって流動させることをさらに含む、請求項５に記載の系。
【請求項９】
生物学的供給源に由来する試料液体を含むことをさらに含む、請求項１に記載の系。
【請求項１０】
非生物学的供給源に由来する試料液体を含むことをさらに含む、請求項１に記載の系。
【請求項１１】
標的バイオマーカーを前記捕捉されている粒子から分離し、抽出緩衝液を使用して、前記隔離されているバイオマーカーを前記捕捉されている粒子から取り除くことをさらに含む、請求項１に記載の系。
【請求項１２】
前記試料液体を前記捕捉されている粒子と接触させることにより、タンパク質、ペプチド、および核酸バイオマーカーを隔離、濃縮、および分解から保護することをさらに含み、前記粒子が、前記被検体は前記ポリマー性マトリックスに進入することを可能するが、前記試料液体内にある他の化合物が前記ポリマー性マトリックスに進入することを防止する細孔サイズを有するポリマー性マトリックスである、請求項１に記載の系。
【請求項１３】
前記粒子が、前記試料液体中に存在する個々の種類の低分子量分子に特異的な複数の亜集団を含有する場合、前記捕捉されている粒子の集団を前記側方流動免疫測定デバイスに組み込むことをさらに含む、請求項１に記載の系。
【請求項１４】
前記被検体が前記試料液体に存在する場合、前記被検体に対する前記親和性ベイトを含有するヒドロゲル粒子の存在下で、前記ヒドロゲル粒子が、前記試料液体に留まるのに十分なサイズおよび浮揚性であり、ならびに高い割合の前記被検体が前記ヒドロゲル粒子内に隔離されており、枯渇試料液体容積のバルクが多孔性マトリックス内に先に滲出していく際に、前記被検体を前濃縮および保存することをさらに含む、請求項１に記載の系。
【請求項１５】
前記被検体を捕捉粒子内に捕捉することをさらに含み、前記捕捉粒子が、分子ふるい部分および被検体結合部分により形成されており、前記分子ふるい部分および前記被検体結合部分が、改変された多孔度の架橋区域を有し、前記分子ふるい部分が、前記被検体を前記捕捉粒子内に捕捉するために、物理的および化学的処理に応じて収縮および膨張するように構成されている、請求項１に記載の系。
【請求項１６】
化学的および静電気的に前記被検体に結合および隔離することが可能である少なくとも１つのタイプの部分であるように前記被検体結合部分を形成することをさらに含む、請求項１５に記載の系。
【請求項１７】
カルボキシ基、アミン基、脂質、リンタンパク質、リン脂質、アミド基、ヒドロキシル基、エステル基、アクリル基、チオール基、アクリル酸、抗体、結合タンパク質、結合対、金属、キレート剤、核酸、アプタマー、酵素結合ポケット、レクチン、薬理学的作用剤、合成ペプチド、抗体断片、疎水性表面、および親水性表面の組み合わせを含むように前記被検体結合部分を形成することをさらに含む、請求項１５に記載の系。
【請求項１８】
前記被検体を前記被検体結合部分に結合させることをさらに含み、前記被検体が、有機分子、無機分子、ポリペプチド、炭水化物、核酸、および脂質の組み合わせである、請求項１５に記載の系。
【請求項１９】
内部コアを封入する外側シェルであるように前記分子ふるい部分を形成することをさらに含み、前記内部コアが、前記被検体結合部分で構成されている、請求項１５に記載の系。
【請求項２０】
被検体濃縮および単離ステップを側方流動免疫測定デバイスに組み込み、前記被検体濃縮および前記単離ステップが、１ｎｍ〜１００μｍの範囲の粒子により実施されること、 親和性ベイトを前記粒子内に内部的に含有していること、 被検体を含有する試料液体をナノ粒子の帯域と接触させ、前記ナノ粒子が、前記親和性ベイトを封入する開放型ポリマー性網目構造を含むこと、 前記被検体を、前記親和性ベイトおよび前記開放型ポリマー性網目構造により認識させること、 前記被検体を濃縮および隔離することにより前記粒子内部で前記被検体の分解を防止すること、 標識されているリガンドにより前記被検体が認識されるように、前記被検体を放出すること、 標識されている抗体により前記被検体が認識されるように、前記被検体を放出すること、 前記被検体を含有する前記試料液体中に前記粒子を懸濁し、前記懸濁されている粒子が浮揚性であり、前記粒子が沈殿することなく前記試料液体に留まることになることをさらに含むこと、 前記懸濁されている粒子を維持することをさらに含み、前記粒子が、前記試料液体により８０パーセント超が占められている開放型ポリマー性構造であること、 前記粒子と前記試料液体との混合物を、前記側方流動免疫測定デバイスにアプライすることをさらに含み、前記粒子が前記ナノ粒子の帯域に配置および固定化され、前記ナノ粒子の帯域が側方流動免疫測定デバイス内および前記試料液体の経路内にあること、 前記粒子を前記デバイスにより捕捉することをさらに含み、前記粒子がポリマー性マトリックスシェルを含み、前記ポリマー性マトリックスシェルが、前記被検体は前記ポリマー性マトリックスシェルに進入することを可能にするが、前記試料液体内にある他の化合物が前記ポリマー性マトリックスシェルに進入することを防止する細孔サイズを有し、内部コアが、固定化された親和性リガンドを含有し、前記親和性リガンドが、前記被検体を認識するように形成されること、 多孔性基層に捕捉されている前記粒子を、前記側方流動免疫測定デバイスの一部として組み込むことをさらに含むこと、 前記粒子が前記被検体を隔離した後、前記試料液体の流路を変更することをさらに含むこと、 前記粒子が１ナノメートル〜１０００ナノメートルのサイズ範囲にある場合、異なる多孔度を通って滲出することにより、前記捕捉されている粒子を前記ナノ粒子の帯域内で流動させることをさらに含むこと、 生物学的供給源に由来する試料液体を含むことをさらに含むこと、 非生物学的供給源に由来する試料液体を含むことをさらに含むこと、 標的バイオマーカーを前記捕捉されている粒子から分離し、抽出緩衝液を使用して、前記隔離されているバイオマーカーを前記捕捉されている粒子から取り除くことをさらに含むこと、 前記試料液体を前記捕捉されている粒子と接触させることにより、タンパク質、ペプチド、および核酸バイオマーカーを隔離、濃縮、および分解から保護することをさらに含み、前記粒子が、前記被検体は前記ポリマー性マトリックスに進入することを可能するが、前記試料液体内にある他の化合物が前記ポリマー性マトリックスに進入することを防止する細孔サイズを有するポリマー性マトリックスであること、 前記粒子が、前記試料液体中に存在する個々の種類の低分子量分子に特異的な複数の亜集団を含有する場合、前記捕捉されている粒子の集団を前記側方流動免疫測定デバイスに組み込むことをさらに含むこと、 前記被検体が前記試料液体に存在する場合、前記被検体に対する前記親和性ベイトを含有するヒドロゲル粒子の存在下で、前記ヒドロゲル粒子が前記試料液体に留まるのに十分なサイズおよび浮揚性であり、ならびに高い割合の前記被検体が前記ヒドロゲル粒子内に隔離されており、枯渇試料液体容積のバルクが多孔性マトリックス内に先に滲出していく際に、前記被検体を前濃縮および保存することをさらに含むこと、 前記被検体を捕捉粒子内に捕捉することをさらに含み、前記捕捉粒子が、分子ふるい部分および被検体結合部分により形成されており、前記分子ふるい部分および前記被検体結合部分が、改変された多孔度の架橋区域を有し、前記分子ふるい部分が、前記被検体を前記捕捉粒子内に捕捉するために、物理的および化学的処理に応じて収縮および膨張するように構成されていること、 化学的および静電気的に前記被検体に結合および隔離することが可能である少なくとも１つのタイプの部分を含むように前記被検体結合部分を形成することをさらに含むこと、 カルボキシ基、アミン基、脂質、リンタンパク質、リン脂質、アミド基、ヒドロキシル基、エステル基、アクリル基、チオール基、アクリル酸、抗体、結合タンパク質、結合対、金属、キレート剤、核酸、アプタマー、酵素結合ポケット、レクチン、薬理学的作用剤、合成ペプチド、抗体断片、疎水性表面、および親水性表面の組み合わせを含むように、前記被検体結合部分を形成することをさらに含むこと、 前記被検体を前記被検体結合部分に結合させることをさらに含み、前記被検体が、有機分子、無機分子、ポリペプチド、炭水化物、核酸、および脂質の組み合わせであること、 内部コアを封入する外側シェルであるように前記分子ふるい部分を形成することをさらに含み、前記内部コアが、前記被検体結合部分で構成されていること、 前記分子ふるい部分および前記被検体結合部分が、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、Ｎ−アルキル置換ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（ベンジルグルタメート）、ポリ（２−エチルアクリル酸）、ポリ（４−ビニルピリジン）の組み合わせを含むように、前記捕捉粒子を形成することをさらに含むこと、 架橋区域を、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリレートの組み合わせを含む前記捕捉粒子に形成することをさらに含むこと、 ヒドロゲルを、前記分子ふるい部分および前記被検体結合体部分に含めることをさらに含むこと、および 処理曝露に曝される際に、隔離された被検体を前記捕捉粒子から放出することをさらに含むことを含む、免疫測定系。
【請求項１】
被検体濃縮および単離ステップを側方流動免疫測定デバイスに組み込み、前記被検体濃縮および前記単離ステップが、１ｎｍ〜１００μｍの範囲の粒子により実施されること、 親和性ベイトを前記粒子内に内部的に含有していること、 被検体を含有する試料液体をナノ粒子の帯域と接触させ、前記ナノ粒子が、前記親和性ベイトを封入する開放型ポリマー性網目構造を含むこと、 前記被検体を、前記親和性ベイトおよび前記開放型ポリマー性網目構造により認識させること、 前記被検体を濃縮および隔離することにより前記粒子内部で前記被検体の分解を防止すること、 標識されているリガンドにより前記被検体が認識されるように、前記被検体を放出すること、および 標識されている抗体により前記被検体が認識されるように、前記被検体を放出することを含む、免疫測定系。
【請求項２】
前記被検体を含有する前記試料液体中に前記粒子を懸濁することをさらに含み、前記懸濁されている粒子が浮揚性であり、前記粒子が沈殿することなく前記試料液体に留まることになる、請求項１に記載の系。
【請求項３】
前記懸濁されている粒子を維持することをさらに含み、前記粒子が、前記試料液体により８０パーセント超が占められている開放型ポリマー性構造である、請求項２に記載の系。
【請求項４】
前記粒子と前記試料液体との混合物を、前記側方流動免疫測定デバイスにアプライすることをさらに含み、前記粒子が、前記ナノ粒子の帯域に配置および固定化され、前記ナノ粒子の帯域が、側方流動免疫測定デバイス内および前記試料液体の経路内にある、請求項１に記載の系。
【請求項５】
前記粒子を前記デバイスにより捕捉することをさらに含み、前記粒子がポリマー性マトリックスシェルを含み、前記ポリマー性マトリックスシェルが、前記被検体は前記ポリマー性マトリックスシェルに進入することを可能にするが、前記試料液体内にある他の化合物が前記ポリマー性マトリックスシェルに進入することを防止する細孔サイズを有し、内部コアが、固定化された親和性リガンドを含有し、前記親和性リガンドが、前記被検体を認識するように形成される、請求項１に記載の系。
【請求項６】
多孔性基層に捕捉されている前記粒子を、前記側方流動免疫測定デバイスの一部として組み込むことをさらに含む、請求項５に記載の系。
【請求項７】
前記粒子が前記被検体を隔離した後、前記試料液体の流路を変更することをさらに含む、請求項５に記載の系。
【請求項８】
前記粒子が１ナノメートル〜１０００ナノメートルのサイズ範囲にある場合、異なる多孔度を通って滲出することにより、捕捉されている粒子を前記ナノ粒子の帯域内に向かって流動させることをさらに含む、請求項５に記載の系。
【請求項９】
生物学的供給源に由来する試料液体を含むことをさらに含む、請求項１に記載の系。
【請求項１０】
非生物学的供給源に由来する試料液体を含むことをさらに含む、請求項１に記載の系。
【請求項１１】
標的バイオマーカーを前記捕捉されている粒子から分離し、抽出緩衝液を使用して、前記隔離されているバイオマーカーを前記捕捉されている粒子から取り除くことをさらに含む、請求項１に記載の系。
【請求項１２】
前記試料液体を前記捕捉されている粒子と接触させることにより、タンパク質、ペプチド、および核酸バイオマーカーを隔離、濃縮、および分解から保護することをさらに含み、前記粒子が、前記被検体は前記ポリマー性マトリックスに進入することを可能するが、前記試料液体内にある他の化合物が前記ポリマー性マトリックスに進入することを防止する細孔サイズを有するポリマー性マトリックスである、請求項１に記載の系。
【請求項１３】
前記粒子が、前記試料液体中に存在する個々の種類の低分子量分子に特異的な複数の亜集団を含有する場合、前記捕捉されている粒子の集団を前記側方流動免疫測定デバイスに組み込むことをさらに含む、請求項１に記載の系。
【請求項１４】
前記被検体が前記試料液体に存在する場合、前記被検体に対する前記親和性ベイトを含有するヒドロゲル粒子の存在下で、前記ヒドロゲル粒子が、前記試料液体に留まるのに十分なサイズおよび浮揚性であり、ならびに高い割合の前記被検体が前記ヒドロゲル粒子内に隔離されており、枯渇試料液体容積のバルクが多孔性マトリックス内に先に滲出していく際に、前記被検体を前濃縮および保存することをさらに含む、請求項１に記載の系。
【請求項１５】
前記被検体を捕捉粒子内に捕捉することをさらに含み、前記捕捉粒子が、分子ふるい部分および被検体結合部分により形成されており、前記分子ふるい部分および前記被検体結合部分が、改変された多孔度の架橋区域を有し、前記分子ふるい部分が、前記被検体を前記捕捉粒子内に捕捉するために、物理的および化学的処理に応じて収縮および膨張するように構成されている、請求項１に記載の系。
【請求項１６】
化学的および静電気的に前記被検体に結合および隔離することが可能である少なくとも１つのタイプの部分であるように前記被検体結合部分を形成することをさらに含む、請求項１５に記載の系。
【請求項１７】
カルボキシ基、アミン基、脂質、リンタンパク質、リン脂質、アミド基、ヒドロキシル基、エステル基、アクリル基、チオール基、アクリル酸、抗体、結合タンパク質、結合対、金属、キレート剤、核酸、アプタマー、酵素結合ポケット、レクチン、薬理学的作用剤、合成ペプチド、抗体断片、疎水性表面、および親水性表面の組み合わせを含むように前記被検体結合部分を形成することをさらに含む、請求項１５に記載の系。
【請求項１８】
前記被検体を前記被検体結合部分に結合させることをさらに含み、前記被検体が、有機分子、無機分子、ポリペプチド、炭水化物、核酸、および脂質の組み合わせである、請求項１５に記載の系。
【請求項１９】
内部コアを封入する外側シェルであるように前記分子ふるい部分を形成することをさらに含み、前記内部コアが、前記被検体結合部分で構成されている、請求項１５に記載の系。
【請求項２０】
被検体濃縮および単離ステップを側方流動免疫測定デバイスに組み込み、前記被検体濃縮および前記単離ステップが、１ｎｍ〜１００μｍの範囲の粒子により実施されること、 親和性ベイトを前記粒子内に内部的に含有していること、 被検体を含有する試料液体をナノ粒子の帯域と接触させ、前記ナノ粒子が、前記親和性ベイトを封入する開放型ポリマー性網目構造を含むこと、 前記被検体を、前記親和性ベイトおよび前記開放型ポリマー性網目構造により認識させること、 前記被検体を濃縮および隔離することにより前記粒子内部で前記被検体の分解を防止すること、 標識されているリガンドにより前記被検体が認識されるように、前記被検体を放出すること、 標識されている抗体により前記被検体が認識されるように、前記被検体を放出すること、 前記被検体を含有する前記試料液体中に前記粒子を懸濁し、前記懸濁されている粒子が浮揚性であり、前記粒子が沈殿することなく前記試料液体に留まることになることをさらに含むこと、 前記懸濁されている粒子を維持することをさらに含み、前記粒子が、前記試料液体により８０パーセント超が占められている開放型ポリマー性構造であること、 前記粒子と前記試料液体との混合物を、前記側方流動免疫測定デバイスにアプライすることをさらに含み、前記粒子が前記ナノ粒子の帯域に配置および固定化され、前記ナノ粒子の帯域が側方流動免疫測定デバイス内および前記試料液体の経路内にあること、 前記粒子を前記デバイスにより捕捉することをさらに含み、前記粒子がポリマー性マトリックスシェルを含み、前記ポリマー性マトリックスシェルが、前記被検体は前記ポリマー性マトリックスシェルに進入することを可能にするが、前記試料液体内にある他の化合物が前記ポリマー性マトリックスシェルに進入することを防止する細孔サイズを有し、内部コアが、固定化された親和性リガンドを含有し、前記親和性リガンドが、前記被検体を認識するように形成されること、 多孔性基層に捕捉されている前記粒子を、前記側方流動免疫測定デバイスの一部として組み込むことをさらに含むこと、 前記粒子が前記被検体を隔離した後、前記試料液体の流路を変更することをさらに含むこと、 前記粒子が１ナノメートル〜１０００ナノメートルのサイズ範囲にある場合、異なる多孔度を通って滲出することにより、前記捕捉されている粒子を前記ナノ粒子の帯域内で流動させることをさらに含むこと、 生物学的供給源に由来する試料液体を含むことをさらに含むこと、 非生物学的供給源に由来する試料液体を含むことをさらに含むこと、 標的バイオマーカーを前記捕捉されている粒子から分離し、抽出緩衝液を使用して、前記隔離されているバイオマーカーを前記捕捉されている粒子から取り除くことをさらに含むこと、 前記試料液体を前記捕捉されている粒子と接触させることにより、タンパク質、ペプチド、および核酸バイオマーカーを隔離、濃縮、および分解から保護することをさらに含み、前記粒子が、前記被検体は前記ポリマー性マトリックスに進入することを可能するが、前記試料液体内にある他の化合物が前記ポリマー性マトリックスに進入することを防止する細孔サイズを有するポリマー性マトリックスであること、 前記粒子が、前記試料液体中に存在する個々の種類の低分子量分子に特異的な複数の亜集団を含有する場合、前記捕捉されている粒子の集団を前記側方流動免疫測定デバイスに組み込むことをさらに含むこと、 前記被検体が前記試料液体に存在する場合、前記被検体に対する前記親和性ベイトを含有するヒドロゲル粒子の存在下で、前記ヒドロゲル粒子が前記試料液体に留まるのに十分なサイズおよび浮揚性であり、ならびに高い割合の前記被検体が前記ヒドロゲル粒子内に隔離されており、枯渇試料液体容積のバルクが多孔性マトリックス内に先に滲出していく際に、前記被検体を前濃縮および保存することをさらに含むこと、 前記被検体を捕捉粒子内に捕捉することをさらに含み、前記捕捉粒子が、分子ふるい部分および被検体結合部分により形成されており、前記分子ふるい部分および前記被検体結合部分が、改変された多孔度の架橋区域を有し、前記分子ふるい部分が、前記被検体を前記捕捉粒子内に捕捉するために、物理的および化学的処理に応じて収縮および膨張するように構成されていること、 化学的および静電気的に前記被検体に結合および隔離することが可能である少なくとも１つのタイプの部分を含むように前記被検体結合部分を形成することをさらに含むこと、 カルボキシ基、アミン基、脂質、リンタンパク質、リン脂質、アミド基、ヒドロキシル基、エステル基、アクリル基、チオール基、アクリル酸、抗体、結合タンパク質、結合対、金属、キレート剤、核酸、アプタマー、酵素結合ポケット、レクチン、薬理学的作用剤、合成ペプチド、抗体断片、疎水性表面、および親水性表面の組み合わせを含むように、前記被検体結合部分を形成することをさらに含むこと、 前記被検体を前記被検体結合部分に結合させることをさらに含み、前記被検体が、有機分子、無機分子、ポリペプチド、炭水化物、核酸、および脂質の組み合わせであること、 内部コアを封入する外側シェルであるように前記分子ふるい部分を形成することをさらに含み、前記内部コアが、前記被検体結合部分で構成されていること、 前記分子ふるい部分および前記被検体結合部分が、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、Ｎ−アルキル置換ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（ベンジルグルタメート）、ポリ（２−エチルアクリル酸）、ポリ（４−ビニルピリジン）の組み合わせを含むように、前記捕捉粒子を形成することをさらに含むこと、 架橋区域を、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリレートの組み合わせを含む前記捕捉粒子に形成することをさらに含むこと、 ヒドロゲルを、前記分子ふるい部分および前記被検体結合体部分に含めることをさらに含むこと、および 処理曝露に曝される際に、隔離された被検体を前記捕捉粒子から放出することをさらに含むことを含む、免疫測定系。
【図２】
【図３】
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図３】
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５０１４４７（Ｐ２０１２−５０１４４７Ａ）
【公表日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２５１７２（Ｐ２０１１−５２５１７２）
【出願日】平成２１年８月２６日（２００９．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５５０６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２５１９０
【国際公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（５１１０５３０９０）
【出願人】（５１１０５３１０４）
【出願人】（５１１０５３１１５）
【出願人】（５１１０５３１３７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２６日（２００９．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５５０６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２５１９０
【国際公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（５１１０５３０９０）
【出願人】（５１１０５３１０４）
【出願人】（５１１０５３１１５）
【出願人】（５１１０５３１３７）
【Ｆターム（参考）】
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