ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及びその用途
本発明は、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及びその用途に関し、特に、香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質であるMmf1pをコードする遺伝子MMF1、特にビール酵母に特徴的なnonScMMF1遺伝子又はScMMF1遺伝子の発現量を高めることによって、製品の香味を向上させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及びその用途に関し、特に、香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質であるMmf1pをコードする遺伝子MMF1、特にビール酵母に特徴的なnonScMMF1遺伝子又はScMMF1遺伝子の発現量を高めることによって、製品のオフフレーバーとなるビシナルジケトン類、特にダイアセチル生産量を低減させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類の香気成分のうち、ダイアセチル（以下DA）臭はビール、清酒及びワイン等の醸造酒における代表的オフフレーバーのひとつである。DA臭（ビールではムレ臭またはバター臭、清酒ではツワリ香とも表現される）はDAを主とするビシナルジケトン類（以下VDK）が製品中に閾値以上存在することによって発生し、ビールにおける閾値は0.1ppm（Journal of the Institute of Brewing、76、486（1970））といわれている。
【０００３】
酒類中のVDKはDA と2,3-ペンタンジオン（以下PD）に大別される。DA とPDは、それぞれバリン及びイソロイシン生合成系中間産物のα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸を前駆体として、酵母の関与しない非酵素的反応によって生成される。
【０００４】
以上のことから、VDK（DA及びPD）及びその前駆体α-アセトヒドロキシ酸類（α-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸）全体が製品にDA臭をもたらす可能性のあるものとしてとらえることができ、これらを安定的に低減させる酵母の育種は酒類の製造管理を容易にするばかりでなく、新商品開発の可能性を広げることができる。
清酒製造では、例えば特開2001-204457公報）においてα-アセトヒドロキシ酸類の前駆体となるピルビン酸濃度の低い酒母を用いることでDAの生成を抑制する方法が報告されている。ビール製造についても、Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 94-99（1973））ではバリン・ロイシン・イソロイシン要求性酵母でVDK生成量が低減することが報告されているが、栄養要求性株では増殖・発酵遅延が生じやすいことから実用化には至っていない。特開2002-291465号公報ではこれらの分岐アミノ酸のアナログに対して感受性となる変異株を取得し、それらの中からDA低蓄積株を選抜するという方法が示されている。Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84（1987）では実験室酵母に由来するILV5遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母が、また、European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560（1987）では同じくILV3遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母がそれぞれ報告されている。このときILV5遺伝子がコードするアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素活性は5-7倍増加し、VDK生成量は4割程度まで減少した。
【０００５】
また、ILV3遺伝子がコードするジヒドロキシ酸デヒドラターゼの酵素活性は5-6倍増加したが、VDK生成量に有意な減少はみられなかった。ただし上記2報告とも合成培地を用いており、実際のビール醸造への影響は解析されていない。一方、Villa らはJournal of American Society of Brewing Chemists,53：49-53（1995）においてILV5遺伝子、ILV3遺伝子およびこれら両者の高発現により、麦汁を用いた発酵試験においてVDK生成量がそれぞれ70％、40％、60％減少することを報告している。
また、Dulieuらは、European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460（1997）においてα-アセト乳酸脱炭酸酵素を使用することでDAの前駆体となるα-アセト乳酸をアセトインに迅速に変換する方法を提案したしたが、遺伝子組み換え技術によってのみ製造されている酵素であり、日本では消費者に対するマイナスイメージが強く、本酵素を使用することは困難である。特開平2-265488号公報及び特開平7-171号公報ではいずれもα-アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするDNA鎖を用いた遺伝子操作酵母が報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、酵母においてVDK、特にDA臭の発生を低減させることのできるタンパク質をコードする遺伝子ならびに該タンパク質を利用してVDK低生産性の酵母を育種し、香味に優れた酒類の製造を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母からビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、ビール中のVDK濃度、特にDA濃度が低減することを確認して、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、ビール酵母に存在するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる製品中のVDK濃度、特にDA濃度の制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【０００９】
（1）以下の(a)〜(ｆ) からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：2のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(ｆ)配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（但し、配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを除く）。
【００１０】
（2）以下の(g)〜(i) からなる群から選択される上記（1）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：2のアミノ酸配列又は配列番号：2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h)配列番号：2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（3）配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（1）に記載のポリヌクレオチド。
（4）配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（1）に記載のポリヌクレオチド。
（5）DNAである、上記（1）〜（4）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（6）上記（1）〜（5）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【００１１】
（7） 上記（1）〜（5）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（８）以下の(j)〜(l) からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクター：
(j)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k) 配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（８a）以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（7）に記載のベクター：
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；
(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記（1）〜（5）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（９）上記（7）又は（８）に記載のベクターが導入された酵母。
（１０）上記（７）又は（８）に記載のベクターを導入することによって、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能が低減された上記（９）に記載の酵母。
（１１）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、醸造時に全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能が低減された上記（１０）に記載の酵母。
（１２）上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１３）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１２）に記載の酒類の製造方法。
（１４）醸造する酒類がワインである上記（１２）に記載の酒類の製造方法。
（１５）上記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【００１２】
（１６）配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能について評価する方法。
（１６a）上記（１６）に記載の方法によって、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能が低減された酵母を選別する方法。
（１６b）上記（１６a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
【００１３】
（１７）被検酵母を培養し、配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能を評価する方法。
（１７a）上記（１７）に記載の方法で、被検酵母を評価し、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量が高い酵母を選別する、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能の低減された酵母を選別する方法。
（１７b）上記（１７a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
【００１４】
（１８）被検酵母を培養し、上記（６）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とする全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（１８ａ）被検酵母を培養して、全ビシナルジケトン生産能もしくは全ダイアセチル生産能またはビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を測定し、目的とする全ビシナルジケトン生産能もしくは全ダイアセチル生産能の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（１９）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、上記（１８）記載の酵母の選択方法。
【００１５】
（２０）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記（６）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（１８）に記載の酵母の選択方法。
（２１）上記（９）〜（１１）に記載の酵母および上記（１８）〜（２０）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、製品中でオフフレーバーとなるVDK、特にDA生産量を低減させることができるため、香味に優れた酒類を容易に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明者らは、特開2004-283169に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするnonScMMF1遺伝子及びScMMF1遺伝子を単離・同定した。これらの塩基配列を、それぞれ配列番号：1と配列番号：3に示す。またこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：2と配列番号：4に示す。
【００１８】
1．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(b)配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来のビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質を有するタンパク質が挙げられる。
【００１９】
このようなタンパク質としては、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個（1〜数個）、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２０】
なお、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性は、例えばDrews らの方法（Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966）で醪中の全VDK（DA及びPD）濃度を測定し、比較することによって評価することができる。
また、本発明は、(e)配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００２１】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号2又は配列番号：4のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、DNA）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮA）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２２】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、DNA）を検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
【００２３】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。
【００２４】
2．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(ｌ)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００２５】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２６】
3．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
【００２７】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
【００２８】
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。
【００２９】
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００３０】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約30℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。
その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genitics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００３１】
4．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって所望の酒類でVDK、特にDA生成量が減少し、香味に優れた酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。
【００３２】
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、VDK、特にDA生成量が減少した酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、香味に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
【００３３】
5．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母のVDK生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、WO01／040514号公報、特開平8−205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
【００３４】
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマー又はプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遺伝子又は特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
【００３５】
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のVDK生産能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
【００３６】
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のVDK生成能を評価することもできる。なお、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の転写産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的RT-PCRによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。なお、被検酵母を培養した際に得られる発酵液中のVDK濃度を測定することによって、その被検酵母における上記遺伝子の発現量を予測することも可能である。
【００３７】
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：1または配列番号：3の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とするビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1または配列番号：3の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である株を選択することによって所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
【００３８】
あるいは、被検酵母を培養して、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性の高い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母又は基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性は、例えばDrews らの方法（Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966）で醪中の全VDK（DA及びPD）濃度を測定し、比較することによって評価することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、EMS（エチルメタンスルホネート）、N-メチル-N-ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センターなど参照）。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母などが挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵（例えば、サッカロマイセス パストリアヌス、サッカロマイセス セレビシエおよびサッカロマイセス カールスベルゲンシス）が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母群から任意の組合せで選択してもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例1： ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする新規遺伝子（nonScMMF1）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有のビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする新規遺伝子、nonScMMF1を見出した（配列番号：1）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScMMF1_for（配列番号：5）／nonScMMF1_rv（配列番号：6）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株（「W34/70株」と略記することがある）の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScMMF1の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
上記のようにして得られたnonScMMF1遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。nonScMMF1遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４１】
実施例2： ビール試醸中のnonScMMF1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScMMF1遺伝子の発現パターンを（図３）に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScMMF1遺伝子が発現していることが確認できた。
【００４２】
実施例3： nonScMMF1高発現株の作製
実施例1に記載のnonScMMF1/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製した。この断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、nonScMMF1高発現ベクターnonScMMF1/pYCGPYNotを構築した。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株を形質転換した。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択し、nonScMMF1高発現株とした。
【００４３】
実施例4： ビール試験醸造におけるVDK生成量の解析
親株ならびに実施例3で得られたnonScMMF1高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 11.85%
麦汁容量 2L
麦汁溶存酸素濃度 8ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）（図４）、エキス消費量の経時変化を調べた（図５）。醪中の全VDKの定量は、VDK（DA及びPD）をヒドロキシルアミンと反応させ、生成したグリオキシム誘導体と2価鉄イオンが反応して生じる錯体の吸光度を測定することによって行った（Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966）。この時、前駆体であるα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸をあらかじめガス洗い法（酸化的脱炭酸反応）によってそれぞれDA、PDに変換しておくことにより、これらを含めた全VDK量とした。
図６に示されるように、nonScMMF1高発現株を用いることによって、発酵終了時における全VDK濃度は約90%減少し、ビールでの閾値とされている0.1ppmを大きく下回った。またこのとき、親株と高発現株の間で、酵母増殖量およびエキス消費速度には有意な差がみられなかった。
【００４４】
実施例5： ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ScMMF1）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有のビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、ScMMF1を見出した（配列番号：3）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーScMMF1_for（配列番号：7）／ScMMF1_rv（配列番号：8）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株の染色体DNAを鋳型としたPCRによってScMMF1の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
上記のようにして得られたScMMF1遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。ScMMF1遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４５】
実施例6： ビール試醸中のScMMF1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図７）、外観エキス濃度（図８）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。ScMMF1遺伝子の発現パターンを（図９）に示す。この結果より、通常のビール発酵においてScMMF1遺伝子が発現していることが確認できた。
【００４６】
実施例7： ScMMF高発現株の作製
実施例５に記載のScMMF1/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製した。この断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、ScMMF1高発現ベクターScMMF1/pYCGPYNotを構築した。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株を形質転換した。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択し、ScMMF1高発現株とした。
【００４７】
実施例8： ビール試験醸造におけるVDK生成量の解析
親株ならびに実施例7で得られたScMMF1高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 11.85%
麦汁容量 2L
麦汁溶存酸素濃度 8ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）（図１０）、エキス消費量の経時変化を調べた（図１１）。醪中の全VDKの定量は、VDK（DA及びPD）をヒドロキシルアミンと反応させ、生成したグリオキシム誘導体と2価鉄イオンが反応して生じる錯体の吸光度を測定することによって行った（Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966）。この時、前駆体であるα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸をあらかじめガス洗い法（酸化的脱炭酸反応）によってそれぞれDA、PDに変換しておくことにより、これらを含めた全VDK量とした。
図１２に示されるように、ScMMF1高発現株を用いることによって、発酵終了時における全VDK濃度は約65%減少し、ビールでの閾値とされている0.1ppmを大きく下回った。またこのとき、親株と高発現株の間で、酵母増殖量およびエキス消費速度には有意な差がみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の酒類製造法によれば、製品中でオフフレーバーとなるVDK、特にDA生成量が低減され、香味に優れた酒類を容易に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScMMF1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図４】nonScMMF1高発現株を用いたビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図５】nonScMMF1高発現株を用いたビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図６】nonScMMF1高発現株を用いたビール試験醸造における醪中のVDK濃度（発酵終了時）を示す図である。
【図７】ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図８】ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図９】ビール試験醸造中の酵母におけるScMMF1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図１０】ScMMF1高発現株を用いたビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図１１】ScMMF1高発現株を用いたビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図１２】ScMMF1高発現株を用いたビール試験醸造における醪中のVDK濃度（発酵終了時）を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及びその用途に関し、特に、香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質であるMmf1pをコードする遺伝子MMF1、特にビール酵母に特徴的なnonScMMF1遺伝子又はScMMF1遺伝子の発現量を高めることによって、製品のオフフレーバーとなるビシナルジケトン類、特にダイアセチル生産量を低減させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類の香気成分のうち、ダイアセチル（以下DA）臭はビール、清酒及びワイン等の醸造酒における代表的オフフレーバーのひとつである。DA臭（ビールではムレ臭またはバター臭、清酒ではツワリ香とも表現される）はDAを主とするビシナルジケトン類（以下VDK）が製品中に閾値以上存在することによって発生し、ビールにおける閾値は0.1ppm（Journal of the Institute of Brewing、76、486（1970））といわれている。
【０００３】
酒類中のVDKはDA と2,3-ペンタンジオン（以下PD）に大別される。DA とPDは、それぞれバリン及びイソロイシン生合成系中間産物のα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸を前駆体として、酵母の関与しない非酵素的反応によって生成される。
【０００４】
以上のことから、VDK（DA及びPD）及びその前駆体α-アセトヒドロキシ酸類（α-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸）全体が製品にDA臭をもたらす可能性のあるものとしてとらえることができ、これらを安定的に低減させる酵母の育種は酒類の製造管理を容易にするばかりでなく、新商品開発の可能性を広げることができる。
清酒製造では、例えば特開2001-204457公報）においてα-アセトヒドロキシ酸類の前駆体となるピルビン酸濃度の低い酒母を用いることでDAの生成を抑制する方法が報告されている。ビール製造についても、Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 94-99（1973））ではバリン・ロイシン・イソロイシン要求性酵母でVDK生成量が低減することが報告されているが、栄養要求性株では増殖・発酵遅延が生じやすいことから実用化には至っていない。特開2002-291465号公報ではこれらの分岐アミノ酸のアナログに対して感受性となる変異株を取得し、それらの中からDA低蓄積株を選抜するという方法が示されている。Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84（1987）では実験室酵母に由来するILV5遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母が、また、European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560（1987）では同じくILV3遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母がそれぞれ報告されている。このときILV5遺伝子がコードするアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素活性は5-7倍増加し、VDK生成量は4割程度まで減少した。
【０００５】
また、ILV3遺伝子がコードするジヒドロキシ酸デヒドラターゼの酵素活性は5-6倍増加したが、VDK生成量に有意な減少はみられなかった。ただし上記2報告とも合成培地を用いており、実際のビール醸造への影響は解析されていない。一方、Villa らはJournal of American Society of Brewing Chemists,53：49-53（1995）においてILV5遺伝子、ILV3遺伝子およびこれら両者の高発現により、麦汁を用いた発酵試験においてVDK生成量がそれぞれ70％、40％、60％減少することを報告している。
また、Dulieuらは、European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460（1997）においてα-アセト乳酸脱炭酸酵素を使用することでDAの前駆体となるα-アセト乳酸をアセトインに迅速に変換する方法を提案したしたが、遺伝子組み換え技術によってのみ製造されている酵素であり、日本では消費者に対するマイナスイメージが強く、本酵素を使用することは困難である。特開平2-265488号公報及び特開平7-171号公報ではいずれもα-アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするDNA鎖を用いた遺伝子操作酵母が報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、酵母においてVDK、特にDA臭の発生を低減させることのできるタンパク質をコードする遺伝子ならびに該タンパク質を利用してVDK低生産性の酵母を育種し、香味に優れた酒類の製造を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母からビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、ビール中のVDK濃度、特にDA濃度が低減することを確認して、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、ビール酵母に存在するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる製品中のVDK濃度、特にDA濃度の制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【０００９】
（1）以下の(a)〜(ｆ) からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：2のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(ｆ)配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（但し、配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを除く）。
【００１０】
（2）以下の(g)〜(i) からなる群から選択される上記（1）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：2のアミノ酸配列又は配列番号：2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h)配列番号：2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（3）配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（1）に記載のポリヌクレオチド。
（4）配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（1）に記載のポリヌクレオチド。
（5）DNAである、上記（1）〜（4）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（6）上記（1）〜（5）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【００１１】
（7） 上記（1）〜（5）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（８）以下の(j)〜(l) からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクター：
(j)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k) 配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（８a）以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（7）に記載のベクター：
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；
(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記（1）〜（5）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（９）上記（7）又は（８）に記載のベクターが導入された酵母。
（１０）上記（７）又は（８）に記載のベクターを導入することによって、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能が低減された上記（９）に記載の酵母。
（１１）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、醸造時に全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能が低減された上記（１０）に記載の酵母。
（１２）上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１３）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１２）に記載の酒類の製造方法。
（１４）醸造する酒類がワインである上記（１２）に記載の酒類の製造方法。
（１５）上記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【００１２】
（１６）配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能について評価する方法。
（１６a）上記（１６）に記載の方法によって、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能が低減された酵母を選別する方法。
（１６b）上記（１６a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
【００１３】
（１７）被検酵母を培養し、配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能を評価する方法。
（１７a）上記（１７）に記載の方法で、被検酵母を評価し、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量が高い酵母を選別する、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能の低減された酵母を選別する方法。
（１７b）上記（１７a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
【００１４】
（１８）被検酵母を培養し、上記（６）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とする全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（１８ａ）被検酵母を培養して、全ビシナルジケトン生産能もしくは全ダイアセチル生産能またはビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を測定し、目的とする全ビシナルジケトン生産能もしくは全ダイアセチル生産能の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（１９）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、上記（１８）記載の酵母の選択方法。
【００１５】
（２０）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記（６）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（１８）に記載の酵母の選択方法。
（２１）上記（９）〜（１１）に記載の酵母および上記（１８）〜（２０）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、製品中でオフフレーバーとなるVDK、特にDA生産量を低減させることができるため、香味に優れた酒類を容易に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明者らは、特開2004-283169に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするnonScMMF1遺伝子及びScMMF1遺伝子を単離・同定した。これらの塩基配列を、それぞれ配列番号：1と配列番号：3に示す。またこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：2と配列番号：4に示す。
【００１８】
1．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(b)配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来のビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質を有するタンパク質が挙げられる。
【００１９】
このようなタンパク質としては、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個（1〜数個）、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２０】
なお、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性は、例えばDrews らの方法（Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966）で醪中の全VDK（DA及びPD）濃度を測定し、比較することによって評価することができる。
また、本発明は、(e)配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００２１】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号2又は配列番号：4のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、DNA）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮA）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２２】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、DNA）を検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
【００２３】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。
【００２４】
2．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(ｌ)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００２５】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２６】
3．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
【００２７】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
【００２８】
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。
【００２９】
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００３０】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約30℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。
その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genitics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００３１】
4．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって所望の酒類でVDK、特にDA生成量が減少し、香味に優れた酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。
【００３２】
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、VDK、特にDA生成量が減少した酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、香味に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
【００３３】
5．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母のVDK生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、WO01／040514号公報、特開平8−205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
【００３４】
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマー又はプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遺伝子又は特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
【００３５】
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のVDK生産能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
【００３６】
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のVDK生成能を評価することもできる。なお、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の転写産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的RT-PCRによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。なお、被検酵母を培養した際に得られる発酵液中のVDK濃度を測定することによって、その被検酵母における上記遺伝子の発現量を予測することも可能である。
【００３７】
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：1または配列番号：3の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とするビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1または配列番号：3の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である株を選択することによって所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
【００３８】
あるいは、被検酵母を培養して、ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性の高い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母又は基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性は、例えばDrews らの方法（Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966）で醪中の全VDK（DA及びPD）濃度を測定し、比較することによって評価することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、EMS（エチルメタンスルホネート）、N-メチル-N-ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センターなど参照）。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母などが挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵（例えば、サッカロマイセス パストリアヌス、サッカロマイセス セレビシエおよびサッカロマイセス カールスベルゲンシス）が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母群から任意の組合せで選択してもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例1： ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする新規遺伝子（nonScMMF1）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有のビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする新規遺伝子、nonScMMF1を見出した（配列番号：1）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScMMF1_for（配列番号：5）／nonScMMF1_rv（配列番号：6）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株（「W34/70株」と略記することがある）の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScMMF1の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
上記のようにして得られたnonScMMF1遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。nonScMMF1遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４１】
実施例2： ビール試醸中のnonScMMF1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScMMF1遺伝子の発現パターンを（図３）に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScMMF1遺伝子が発現していることが確認できた。
【００４２】
実施例3： nonScMMF1高発現株の作製
実施例1に記載のnonScMMF1/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製した。この断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、nonScMMF1高発現ベクターnonScMMF1/pYCGPYNotを構築した。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株を形質転換した。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択し、nonScMMF1高発現株とした。
【００４３】
実施例4： ビール試験醸造におけるVDK生成量の解析
親株ならびに実施例3で得られたnonScMMF1高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 11.85%
麦汁容量 2L
麦汁溶存酸素濃度 8ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）（図４）、エキス消費量の経時変化を調べた（図５）。醪中の全VDKの定量は、VDK（DA及びPD）をヒドロキシルアミンと反応させ、生成したグリオキシム誘導体と2価鉄イオンが反応して生じる錯体の吸光度を測定することによって行った（Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966）。この時、前駆体であるα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸をあらかじめガス洗い法（酸化的脱炭酸反応）によってそれぞれDA、PDに変換しておくことにより、これらを含めた全VDK量とした。
図６に示されるように、nonScMMF1高発現株を用いることによって、発酵終了時における全VDK濃度は約90%減少し、ビールでの閾値とされている0.1ppmを大きく下回った。またこのとき、親株と高発現株の間で、酵母増殖量およびエキス消費速度には有意な差がみられなかった。
【００４４】
実施例5： ビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ScMMF1）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有のビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、ScMMF1を見出した（配列番号：3）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーScMMF1_for（配列番号：7）／ScMMF1_rv（配列番号：8）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株の染色体DNAを鋳型としたPCRによってScMMF1の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
上記のようにして得られたScMMF1遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。ScMMF1遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４５】
実施例6： ビール試醸中のScMMF1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図７）、外観エキス濃度（図８）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。ScMMF1遺伝子の発現パターンを（図９）に示す。この結果より、通常のビール発酵においてScMMF1遺伝子が発現していることが確認できた。
【００４６】
実施例7： ScMMF高発現株の作製
実施例５に記載のScMMF1/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製した。この断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、ScMMF1高発現ベクターScMMF1/pYCGPYNotを構築した。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株を形質転換した。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択し、ScMMF1高発現株とした。
【００４７】
実施例8： ビール試験醸造におけるVDK生成量の解析
親株ならびに実施例7で得られたScMMF1高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 11.85%
麦汁容量 2L
麦汁溶存酸素濃度 8ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）（図１０）、エキス消費量の経時変化を調べた（図１１）。醪中の全VDKの定量は、VDK（DA及びPD）をヒドロキシルアミンと反応させ、生成したグリオキシム誘導体と2価鉄イオンが反応して生じる錯体の吸光度を測定することによって行った（Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966）。この時、前駆体であるα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸をあらかじめガス洗い法（酸化的脱炭酸反応）によってそれぞれDA、PDに変換しておくことにより、これらを含めた全VDK量とした。
図１２に示されるように、ScMMF1高発現株を用いることによって、発酵終了時における全VDK濃度は約65%減少し、ビールでの閾値とされている0.1ppmを大きく下回った。またこのとき、親株と高発現株の間で、酵母増殖量およびエキス消費速度には有意な差がみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の酒類製造法によれば、製品中でオフフレーバーとなるVDK、特にDA生成量が低減され、香味に優れた酒類を容易に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】ビール試験醸造中の酵母におけるnonScMMF1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図４】nonScMMF1高発現株を用いたビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図５】nonScMMF1高発現株を用いたビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図６】nonScMMF1高発現株を用いたビール試験醸造における醪中のVDK濃度（発酵終了時）を示す図である。
【図７】ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図８】ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図９】ビール試験醸造中の酵母におけるScMMF1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図１０】ScMMF1高発現株を用いたビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図１１】ScMMF1高発現株を用いたビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図１２】ScMMF1高発現株を用いたビール試験醸造における醪中のVDK濃度（発酵終了時）を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(f) からなる群から選択される記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：2のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i) からなる群から選択される請求項1に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：2のアミノ酸配列又は配列番号：2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
以下の(j)〜(l) からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクター：
(j)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k)配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のベクターが導入された酵母。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載のベクターを導入することによって、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能が低減された請求項９に記載の酵母。
【請求項１１】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、醸造時に全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能が低減された請求項１０に記載の酵母。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１３】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１２に記載の酒類の製造方法。
【請求項１４】
醸造する酒類がワインである請求項１２に記載の酒類の製造方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１６】
配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能について評価する方法。
【請求項１７】
被検酵母を培養し、配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能を評価する方法。
【請求項１８】
被検酵母を培養し、請求項６に記載のタンパク質を定量または配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とする全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項１９】
基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、請求項１８記載の酵母の選択方法。
【請求項２０】
基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、請求項１８に記載の酵母の選択方法。
【請求項２１】
請求項９〜１１に記載の酵母および請求項１８〜２０に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【請求項１】
以下の(a)〜(f) からなる群から選択される記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：2のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i) からなる群から選択される請求項1に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：2のアミノ酸配列又は配列番号：2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
以下の(j)〜(l) からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクター：
(j)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k)配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のベクターが導入された酵母。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載のベクターを導入することによって、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能が低減された請求項９に記載の酵母。
【請求項１１】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、醸造時に全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能が低減された請求項１０に記載の酵母。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１３】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１２に記載の酒類の製造方法。
【請求項１４】
醸造する酒類がワインである請求項１２に記載の酒類の製造方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１６】
配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能について評価する方法。
【請求項１７】
被検酵母を培養し、配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能を評価する方法。
【請求項１８】
被検酵母を培養し、請求項６に記載のタンパク質を定量または配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とする全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項１９】
基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1又は配列番号：３の塩基配列を有するビシナルジケトン又はダイアセチル低減活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、請求項１８記載の酵母の選択方法。
【請求項２０】
基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、請求項１８に記載の酵母の選択方法。
【請求項２１】
請求項９〜１１に記載の酵母および請求項１８〜２０に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００８−５３０９８０（Ｐ２００８−５３０９８０Ａ）
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４１５２８（Ｐ２００７−５４１５２８）
【出願日】平成１８年１１月２１日（２００６．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２３８６５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９７０８８
【国際公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２１日（２００６．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２３８６５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９７０８８
【国際公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
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