ビタミンＤ結合タンパク質に特異的に結合する化合物
【課題】ＤＢＰのアッセイや分離・精製などに用いることができる、新たなＤＢＰ結合化合物。
【解決手段】２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除くビタミンＤより選択されるＤＢＰに結合可能なビタミンＤを固相支持体に結合させてなるＤＢＰ結合化合物。
【解決手段】２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除くビタミンＤより選択されるＤＢＰに結合可能なビタミンＤを固相支持体に結合させてなるＤＢＰ結合化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＤ結合タンパク質のアッセイや分離・精製などに用いることができる、ビタミンＤ結合タンパク質と特異的に結合可能な新規化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＤ結合タンパク質（以下、「ＤＢＰ」と記載）は動物血清中に存在し、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３の運び屋として、また、細胞骨格アクチンの調節タンパク質として知られている。
【０００３】
ＤＢＰは、ヒトにおいてはＧｃ−グロブリンまたは「グループ特異的成分」（非特許文献１）としても知られている分子量約５２，０００の糖タンパク質で３つのドメインを有することが知られており、１番目のドメインにビタミンＤ結合サイトが、２番目および３番目のドメインにわたってアクチン結合サイトが、また、３番目のドメインにはマクロファージ活性化サイトがある（非特許文献２）。
【０００４】
ＤＢＰの研究のためには、ＤＢＰを分取・精製することが必要であるが、当該分取・精製の操作には従来から２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を固相支持体に結合させたＤＢＰ結合化合物が合成され使用されている。一つの態様において、当該ＤＢＰ結合化合物は、エポキシ化した２５−ＯＨ−ビタミンＤ３とＳＨ基を導入したセファロースＣＬ−６Ｂ樹脂を反応させることで合成される（非特許文献３）。また別の態様においては、当該ＤＢＰ結合化合物は、アミノプロピル基を導入した２５−ＯＨ−ビタミンＤ３とＮ−ヒドロキシスクシンイミドを導入したアガロース樹脂（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０）を反応させることで合成される。（非特許文献４）。
【０００５】
２５−ＯＨ−ビタミンＤ３は、２５位が水酸化されているビタミンＤ３であって、他のビタミンＤと比べ、ＤＢＰに対する特異的結合力が極めて強いことが知られている。ＤＢＰと各種ビタミンＤの結合力は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３の結合力を１とするとき、ビタミンＤ３で２０分の１、ビタミンＤ３の代謝産物である１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３で６６８分の１であることが報告されている（非特許文献５，６）。この性質より、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３は上記ＤＢＰ結合化合物に利用されている。
【０００６】
しかしながら、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３は、生体内で生成されるプレビタミンＤ３が肝臓にて代謝され合成される希少な天然材料である。血清中に含まれる２５−ＯＨ−ビタミンＤ３は、ビタミンＤ濃度の９５％以上を占めるが、それでもその血中濃度は５ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬと非常に小さく、大量に入手することは困難である。そのため、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を利用したＤＢＰ結合化合物を、安価かつ大量に生産することは困難であった。使用者は、使用済みのＤＢＰ結合化合物を再生して、長期の管理をしなければならず、使用者にとって大きな負担となっていた。
【０００７】
そのため、当該分野においては、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を結合させたＤＢＰ結合化合物に代わる、新たなＤＢＰ結合化合物が切望されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｇ．Ｈａｄｄａｄ， Ｊ． ＳｔｅｒｉｏｄＢｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． （１９９５） ５３， ５７９−５８２
【非特許文献２】堀 均ら，放射線生物研究 ３９（３），３２８−３４１（２００４）
【非特許文献３】Ｒｅｂｅｃｃａ Ｐ． ｅｔ．ａｌ， ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ， １５７， ２６２−２６９ （１９８６）
【非特許文献４】Ｓｗａｍｙ Ｎ．ｅｔ．ａｌ， ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ， ６， １８５−１８８ （１９９５）
【非特許文献５】Ｂｉｓｈｏｐ Ｊ．Ｅ．ｅｔ．ａｌ， Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ．， ９（８）， １２７７−８８， １９９４．
【非特許文献６】Ｂｏｕｉｌｌｏｎ Ｒ． ｅｔ．ａｌ， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ．， １６（２）， ２００−５７， １９９５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＤＢＰのアッセイや分離・精製などに用いることができる、ビタミンＤ結合タンパク質と特異的に結合可能な新規ＤＢＰ結合化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３と比べて、ＤＢＰとの結合力が弱いビタミンＤであっても、当該ビタミンＤと固相支持体とを結合させてなる化合物が、ＤＢＰに対して、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を固相支持体に結合させてなる従来のＤＢＰ結合化合物と同程度またはそれ以上の結合特異性および結合力を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 固相支持体と、ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３とが結合してなる、ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物であって、該ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３が、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除くビタミンＤ３より選択される、上記ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物。
［２］ 固相支持体が、セファロース樹脂またはアガロース樹脂である、［１］のビタミンＤ結合タンパク質結合化合物。
［３］ ［１］または［２］のビタミンＤ結合タンパク質結合化合物を充填剤として含む、ビタミンＤ結合タンパク質精製用カラム。
［４］ ［１］または［２］のビタミンＤ結合タンパク質結合化合物または［３］のビタミンＤ結合タンパク質精製用カラムを用いた、ビタミンＤ結合タンパク質の分離または精製方法であって、
（ｉ）ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物とビタミンＤ結合タンパク質を含む試料とを接触させ、該ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物に該ビタミンＤ結合タンパク質を結合させる工程；
（ｉｉ）該ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物に結合しているビタミンＤ結合タンパク質を溶出する工程；ならびに
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）にて溶出されたビタミンＤ結合タンパク質を回収する工程。
［５］ ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物の製造方法であって、
固相支持体と、ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３とを結合させる工程を含み、該ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３が、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除くビタミンＤ３より選択される、上記方法。
［６］ 固相支持体が、セファロース樹脂またはアガロース樹脂である、［５］の方法。
［７］ 結合させる工程が、
（ｉ）ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３をエポキシ化する工程；
（ｉｉ）固相支持体にチオール基を導入する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉ）で得られたビタミンＤ３と工程（ｉｉ）で得られた固相支持体を反応させ、該ビタミンＤ３と該固相支持体を結合させる工程、を含む、［５］または［６］の方法。
［８］ 結合させる工程が、
（ｉ）ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３をアミノプロピルエーテル化する工程；
（ｉｉ）固相支持体にＮ−ヒドロキシスクシンイミドを導入する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉ）で得られたビタミンＤ３と工程（ｉｉ）で得られた固相支持体を反応させ、該ビタミンＤ３と該固相支持体を結合させる工程、を含む、［５］または［６］の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ＤＢＰのアッセイや分離・精製などに用いることができる、新たなＤＢＰ結合化合物を安価にかつ大量に提供することが可能となり、これによりＤＢＰの研究分野において飛躍的な進展をもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、操作１の条件で回収したタンパク質濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）の結果を示す。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。Ｍ：マーカー；１：対照化合物（１）で処理したサンプル；２：従来化合物（１）で処理したサンプル；３−６：本発明化合物（１）で処理したサンプル。
【図２】図２は、操作３の条件で回収したＧｃタイプ １ｆ１ｆ、１ｓ１ｓまたは２２の血清に由来するタンパク質濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）の結果を示す。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。Ｍ：マーカー；１：シグマ社製のＧｃグロブリン；２：１ｆ１ｆタイプ；３：１ｓ１ｓタイプ；４：２２タイプ。
【図３】図３は、操作３の条件で回収したＧｃタイプ １ｆ１ｆ、１ｓ１ｓまたは２２の血清に由来するタンパク質濃縮液のヒト抗ＩｇＧ抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。１：１ｆ１ｆタイプ；２：１ｓ１ｓタイプ；３：２２タイプ；４：精製ＤＢＰ（Ｇｃタイプ １ｆ１ｆ）。
【図４】図４は、操作３の条件で回収したＧｃタイプ １ｆ１ｆ、１ｓ１ｓまたは２２の血清に由来するタンパク質濃縮液のＰＮＡレクチンを用いたウエスタンブロットの結果を示す。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。１：１ｆ１ｆタイプ；２：１ｓ１ｓタイプ；３：２２タイプ；４：精製ＤＢＰ（Ｇｃタイプ １ｆ１ｆ）。
【図５】図５は、操作３の条件を用いて回収したＧｃタイプ １ｓ１ｓの血清に由来するタンパク質濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）の結果を示す。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。１：シグマ社製のＧｃグロブリン；２−３：本発明化合物（１）で処理したサンプル；４−５：本発明化合物（３）で処理したサンプル；６−７：対照化合物（２）で処理したサンプル；８：シグマ社製のＧｃ精製品；９：血清。
【図６】図６は、操作３の条件を用いて回収したＧｃタイプ １ｓ１ｓの血清に由来するタンパク質濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）の結果を示す。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。１：シグマ社製のＧｃグロブリン；２−３：本発明化合物（１）で処理したサンプル；４−５：従来化合物（２）で処理したサンプル；６−７：本発明化合物（２）で処理したサンプル；８−９：本発明類似化合物で処理したサンプル；１０−１１：対照化合物（１）で処理したサンプル。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、固相支持体と、ＤＢＰに結合可能なビタミンＤとが結合してなる、ＤＢＰに特異的に結合する化合物に関する。
【００１５】
本発明においてＤＢＰは、ヒト由来のＤＢＰおよび非ヒト動物由来のＤＢＰを含む。
本発明において「ＤＢＰに結合可能なビタミンＤ」としては、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除く、ＤＢＰに対して親和性を有し得る任意のビタミンＤが含まれる。
【００１６】
本発明において「２５−ＯＨ−ビタミンＤ３」とは、２５位のみが水酸化されているビタミンＤ３および２５位のみが水酸化されているその誘導体を意味する。２５−ＯＨ−ビタミンＤ３は、ＤＢＰに対して高い親和性を有することから、ＤＢＰに特異的に結合する既存の化合物の製造に用いられている（Ｒｅｂｅｃｃａ Ｐ．ら、（上掲）、Ｓｗａｍｙ Ｎ．ら、（上掲））。本発明における「ＤＢＰに結合可能なビタミンＤ」は、ＤＢＰに対して親和性を有し得る限り２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除く全てのビタミンＤ類（ビタミンＤ３、ビタミンＤ４、ビタミンＤ５、ビタミンＤ６、ビタミンＤ７など）ならびにそれらのプロビタミン、プレビタミン、代謝産物、および誘導体より選択することができる。具体的には、ビタミンＤ３、２４，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３、２５，２６（ＯＨ）２ビタミンＤ３、１α，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ３など、およびこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ビタミンＤ３を用いる。ビタミンＤ３は、高純度のものを大量に入手できるために、有利である。
【００１７】
本発明において利用し得る「ＤＢＰに結合可能なビタミンＤ」それ自体はＤＢＰに対して、必ずしも２５−ＯＨ−ビタミンＤ３と同等またはそれを超越する結合力を持っていなくても良い。当該「ＤＢＰに結合可能なビタミンＤ」は、下記にて詳述する固相支持体と結合することによって、ＤＢＰに対して、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３と同等またはそれを超越する結合力を備えることができる。
【００１８】
本発明において利用し得るビタミンＤは、遺伝子組換え技術または化学合成技術を用いて人工的に製造されたものであっても良いし、植物または動物に由来する天然のものであっても良い。
【００１９】
本発明において「固相支持体」には、固相支持体として利用し得ることが公知である様々な材料、例えば、セルロース、セルロース誘導体、セファロース、アガロース、金属、ガラス、セラミック、樹脂など（これらに限定されない）を用いることができる。好ましくは、セファロースおよびアガロースであり、さらに好ましくはセファロースである。固相支持体は市販のものを用いることが可能であり、例えば、セファロースＣＬ−６Ｂ樹脂（シグマ社）を利用することができる。
【００２０】
固相支持体は、本発明のＤＢＰ結合化合物の用途および使用方法に応じて、平板、ビーズ、粒子、球体など（これらに限定されない）任意の形状を有することが可能である。固相支持体の大きさは、特に限定されることなく本発明の化合物の用途および使用方法に応じて適宜決定することができる。好ましくは、固相支持体は、粒径７５〜３００μｍのビーズの形状を有する。
【００２１】
ビタミンＤと固相支持体との結合は、共有結合または非共有結合を利用して行うことができる。ビタミンＤと固相支持体との結合は、特に限定するものではないが、公知の手法を利用して行うことができる。例えば、ビタミンＤをエポキシ化し、チオール基を導入した固相支持体と反応させ、両者を結合することができる（Ｒｅｂｅｃｃａ Ｐ．ｅｔ．ａｌ（上掲））。
【００２２】
あるいは、ビタミンＤをアミノプロピルエーテル化し、固相支持体のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いてエステル化して活性化エステル基とし、両者を反応させることによって結合することができる（Ｓｗａｍｙ Ｎ．ｅｔ．ａｌ（上掲））。
【００２３】
上記反応に際しては、３位のヒドロキシ基をエポキシ化またはアミノプロピルエーテル化したビタミンＤ３を利用することが好ましい。
【００２４】
本発明のＤＢＰ結合化合物は、試料中に含まれるＤＢＰと特異的に結合することが可能であり、ＤＢＰを分取および精製することに利用することができる。なお、本明細書において、本発明のＤＢＰ結合化合物とＤＢＰとの「結合」を、「吸着」と記載する場合がある。この場合、「結合」と「吸着」なる記載は互換的に使用される。
【００２５】
ＤＢＰを含む試料としては、ヒトおよび非ヒト動物に由来する、生体組織破砕液、体液（全血、血漿、血清、リンパ液など）を利用することができる（これらに限定されない）。ＤＢＰを含む試料はＤＢＰ結合化合物と接触させる前に、予め精製されていても良いし、精製されていなくても良い。好ましくは、ＤＢＰを含む試料は予め精製されている。ここでＤＢＰを含む試料を予め精製するとは、ＤＢＰ結合化合物と非特異的に結合する、試料中に含まれるタンパク質を除去することを意味する。「除去」とは、当該非特異的なタンパク質が全て試料中より除かれる場合だけでなく、その一部が試料中より除かれる場合も含む。当該精製方法は、ＤＢＰ結合化合物と非特異的に結合する、試料中に含まれるタンパク質を除去し得る限り、特に限定されないが、例えば、使用するＤＢＰ結合化合物に含まれる固相支持体のみを、ＤＢＰを含む試料と接触させ、当該固相支持体に吸着するタンパク質を除去することによって行うことができる。あるいは、DBP含有溶液を陽イオン交換カラム入れて素通りさせることで行うことができる。当該操作は必要に応じて、１回以上行うことができる。あるいは、ＤＢＰを含む試料は、ＤＢＰを精製または粗精製したものであっても良い。
【００２６】
本発明のＤＢＰ結合化合物とＤＢＰの結合に際しては、上記ＤＢＰを含む試料を、適当な緩衝液を用いてｐＨ６．０〜９．０、好ましくはｐＨ６．５〜８．０に調整する。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液（リン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等）、Ｔｒｉｓ緩衝液（ＳＴＥ緩衝液等）を用いることができる。緩衝液を添加してｐＨを調整したＤＢＰを含む試料を、同じ緩衝液を用いて平衡化した本発明の化合物と接触させ、試料中のＤＢＰを本発明の化合物に結合させる。両者の結合反応は、バッチ式で行っても良いし、連続式で行っても良い。両者の接触は、４℃〜４０℃、好ましくは４℃または室温において、1分間〜４時間振とうしながら行う。バッチ式で行う場合には好ましくはおよそ５〜１０分間振とうしながら行う。あるいは、両者の結合反応は、カラム法によって行っても良い。この場合、本発明のＤＢＰ結合化合物は、ＤＢＰを精製するための各種クロマトグラフィー用カラム、特にアフィニティーロマトグラフィー用カラム、の充填剤として利用することができる。
【００２７】
次いで、本発明のＤＢＰ結合化合物に結合したＤＢＰを溶出する。本発明のＤＢＰ結合化合物からＤＢＰを溶出する際の溶出液としては、塩化ナトリウム溶液、塩化カリウム溶液等の塩溶液、リン酸、酢酸、クエン酸、トリス等の緩衝液、グアニジン等の変性剤およびこれらの混合溶液等を利用することができる。溶出は当業者に公知の一般的な手法を用いて行うことができ、例えば、溶出液の塩濃度を徐々に増やして溶出する方法、ＤＢＰが本発明のＤＢＰ結合化合物と結合するｐＨから反撥するｐＨへ徐々に溶出液のｐＨを変化させる方法またはそれらの組合せを用いて行うことができる。ＤＢＰの結合した本発明のＤＢＰ結合化合物を遠心分離して回収した後、溶出液を添加して、４℃〜４０℃、好ましくは４℃または室温において、およそ１〜３０分間振とうした後、遠心分離して本発明のＤＢＰ結合化合物を沈降させ、上清に含まれるＤＢＰを回収する。
【００２８】
回収されたＤＢＰは、タンパク質精製に用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体などを利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過、ダイアフィルトレーション等の濾過処理など、を１つまたは複数組み合わせて用いて、さらに精製することが可能である。
【００２９】
本発明のＤＢＰ結合化合物を用いることによって血清よりＤＢＰを９７％、９８％、９９％またはそれ以上の高純度で得ることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれにより限定されるものではない。
【００３１】
（実施例１）樹脂の合成
（Ｉ）新規ＤＢＰ結合化合物（１）（以下、本発明化合物（１）と記載）
（ｉ）ビタミンＤ３のエポキシ化
５０ｍｇのビタミンＤ３（コレカルシフェロール：東京化成工業社製）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４．０ｍｌに溶解させ、枝付きフラスコに入れ、Ｎ２で置換した。次いで０．０６ｍｌのエピブロモヒドリン（和光社製）と２０ｍｇのＮａＨとを順次加え室温で攪拌しながら、Ｎ２気流中でエポキシ化反応を行う。
【００３２】
薄層クロマトグラフィーで反応完了を確認した後、反応液に氷水および酢酸エチルを加え生成物の溶媒抽出を行う。この抽出操作を３回行い、抽出液を集めて氷水で洗浄し、ＭｇＳＯ４を加えて乾燥後、減圧乾固して生成物を含む残渣を得た。
【００３３】
得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル系）に通し、原材料を除去し、エポキシ化ビタミンＤ３を回収し、減圧乾燥させ、（ｉｉｉ）のＤＢＰ結合化合物合成工程に用いた。
【００３４】
（ｉｉ）セファロース樹脂へのチオール基の導入
セファロースＣＬ−６Ｂ樹脂（シグマ社製）約１０ｇに１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル１０ｇおよびＮａＢＨ４２０ｍｌを含む１Ｍ ＮａＯＨ １０ｍｌを加え室温で１０〜１２時間振とうして、セファロースＣＬ−６Ｂ樹脂にエポキシ側鎖を導入する。この樹脂を蒸留水で洗浄した後、２．０ＭのＮａ２Ｓ２Ｏ３を１５ｍｌ加え、室温で約８時間振とうしながら、当該樹脂にチオール基（Ｓ−Ｓ）を導入した。チオール基を導入したセファロースＣＬ−６Ｂ樹脂を蒸留水、次いでＳＰＢで洗浄した後、樹脂にＤＴＴ２００ｍｇと１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａを含む０．３Ｍ ＮａＨＣＯ３２０ｍｌ（ＰＨ８．５）を加え、室温で１時間振とうして、ＳＨ−ａｃｔｉｖａｔｅｄセファロースＣＬ−６Ｂ樹脂を得た。０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄、次いで０．３Ｍ ＮａＨＣＯ３（含１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）で洗浄して、以下の本発明化合物（１）の合成工程に用いた。
【００３５】
（ｉｉｉ）本発明化合物（１）の合成
上記（ｉ）にて得られたエポキシ化ビタミンＤ３を１，４−ジオキサン２０ｍｌに溶解させ、１Ｍ ＮａＯＨ １０ｍｌおよび上記（ｉｉ）にて得られたＳＨ−ａｃｔｉｖａｔｅｄセファロースＣＬ−６Ｂ樹脂を加え、ウオータバス上、４０℃、Ｎ２気流中で撹拌した。１８時間後、６０％ アセトン／イオン交換水、アセトン、６０％ アセトン／イオン交換水、イオン交換水、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、イオン交換水（各２５０ ｍＬ）で洗浄後、遠心して上清を取り除いた。本発明化合物（１）約１０ｇを得た。
【００３６】
（ｉｖ）樹脂保管
合成した本発明品は０．０２％ ＮａＮ３を入れたＳＴＥバッファー（ｐＨ７．４， Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ６．０５ｇ，ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．５６ｇ，ＮａＣｌ ８．７７ｇをＳＤＷに溶かし、全量を１０００ｍｌとして濾過し、オートクレーブにかける。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１ｍｌ加えたもの）２０ｍＬを加えて、密栓し４℃で保管した。
【００３７】
（ＩＩ）新規ＤＢＰ結合化合物（２）（以下、本発明化合物（２）と記載）
ビタミンＤ３（コレカルシフェロール：東京化成工業製）（１００ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）をｔ−ＢｕＯＨ／ＭｅＣＮ（９／１，ｖ／ｖ）混合液（３．０ｍＬ）に溶解し、氷上撹拌下、アクリロニトリル（３００μＬ，０．５６ｍｍｏｌ，２．０ｅｑ．）を滴下した。ＮａＨを加え、１時間後、冷Ｅｔ２Ｏ、冷水を滴下し、減圧化で溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１）に付し、９８．４ｍｇ，（０．２２ｍｍｏｌ，８６％）の固体１を得た。その固体１２４．９ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）をＥｔ２Ｏ（５．０ｍＬ）に溶解し、氷上撹拌下、ＬｉＡｌＨ４／ＡｌＣｌ３ ６０．３ｍｇ，（１．０７ｍｍｏｌ， ３．９ｅｑ．）を加えた。１時間後、１Ｎ ＮａＯＨを滴下し、ＥｔＯＡｃで４回抽出し、有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過後、ろ液を減圧下で溶媒を留去し、固体２を得た。次の反応のためにＡｆｆｉＧｅｌ−１０（４．０ｍＬ，４５μｍｏｌ）を１，４−ジオキサンで３回洗浄した。これに固体２（全量）を１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）で加え、プロペラで室温下、撹拌した。２２時間後、エタノールアミン（２．５ｍＬ）を加え、さらに撹拌した。２時間後、１，４−ジオキサン／アセトン（１／１，ｖ／ｖ）で３回洗浄し、上清を取り除き、０．０２％ ＮａＮ３／ＳＴＥバッファーを加え、ビタミンＤ３結合アガロース樹脂（本発明化合物（２））４．０ｍＬを得た。
【００３８】
（ＩＩＩ）新規ＤＢＰ結合化合物（３）（以下、本発明化合物（３）と記載）
Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）２．５ｇを蒸留水およびリン酸バッファーで洗浄し、遠心後、上清を取り除いた。ＤＴＴ２００ｍｇと１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａを含む０．３Ｍ ＮａＨＣＯ３２０ｍｌ（ＰＨ８．４）を加え、室温で１時間振とうして、チオール基の還元反応を行った。生成したＳＨ−ａｃｔｉｖａｔｅｄセファロースＣＬ−４Ｂ樹脂を０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄、次いで０．３Ｍ ＮａＨＣＯ３（含１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）で洗浄して、これに上記本発明化合物（１）と同様にして得られた、エポキシ化ビタミンＤ３を１，４−ジオキサン（２０ｍｌ）に溶解して加え、さらに１Ｍ ＮａＯＨ １０ｍｌを加え、ウオータバス上、４０℃、Ｎ２気流中で撹拌して、ビタミンＤ３結合ＣＬ−４Ｂ樹脂（本発明化合物（３））を得た。
【００３９】
（ＩＶ）ビタミンＤ２を含む化合物（以下、本発明類似化合物と記載）
上記本発明化合物（１）と同様に、ビタミンＤ２（カルシフェロール：東京化成工業社製）１００ｍｇをエポキシ化して、エポキシ化ビタミンＤ２とした。さらに、上記本発明化合物（１）と同様に合成したＳＨ−ａｃｔｉｖａｔｅｄセファロースＣＬ−６Ｂ樹脂とを同様な操作で反応させ、ビタミンＤ２結合ＣＬ−６Ｂ樹脂（本発明類似化合物）を得た。
【００４０】
（Ｖ）従来公知のＤＢＰ結合化合物（１）（以下、従来化合物（１）と記載）
２５−ＯＨ−ビタミンＤ３とセファロースＣＬ−６Ｂ樹脂からなる従来公知のＤＢＰ結合化合物として、徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部 堀均博士より恵与された２５−ＯＨ−ビタミンＤ２結合ＣＬ−６Ｂ樹脂（従来化合物（１））を使用した。
【００４１】
（ＶＩ）連結部の構造が異なる従来公知のＤＢＰ結合化合物（２）（以下、従来化合物（２）と記載）
洗浄したＡｆｆｉＧｅｌ−１０ ４．０ｍｌを準備し、これに２５−ＯＨ−ビタミンＤ３（カルシフェディジール：東京化成工業製）１００．０ｍｇ，（０．２５ｍｍｏｌ）をｔ−ＢｕＯＨ／ＭｅＣＮ（９／１，ｖ／ｖ）混合液（３．０ｍＬ）に溶解し、上記（ＩＩ）新規ＤＢＰ結合化合物（２）と同様に操作して得た固体（全量）を１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）で加え、さらに同様に処理して２５−ＯＨ−ビタミンＤ３結合アガロース樹脂４．０ｍＬ（従来化合物（２））を得た。従来化合物（２）は、ビタミンＤ３と固相支持体の連結部に、エーテル結合と３つのヒドロキシ側鎖を有する。
【００４２】
（ＶＩＩ）対照化合物（１）
対照化合物（１）として、セファロースＣＬ−６Ｂ樹脂をそのまま使用した。
【００４３】
（ＶＩＩＩ）対照化合物（２）
対照化合物（２）としてはＡｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４ＢセファロースＣＬ−４Ｂ樹脂をそのまま使用した。
【００４４】
（実施例２）本発明化合物と従来化合物の比較
血清（Ｇｃタイプ １ｆ１ｆ）から硫安分画した粗Ｇｃグロブリンを、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３とセファロース樹脂からなる従来化合物（１）（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部 堀均博士より恵与のもの）をアフィニティカラムとして使って一次精製し、次にヒドロキシアパタイトカラムで二次精製し、精製ＤＢＰを得た。この精製ＤＢＰを用いて、実施例１で製造した本発明化合物（１）および従来化合物（１）のタンパク質吸着能を比較した。
【００４５】
（ｉ）使用前の樹脂の調整
１．５ｍｌのエッペンチューブに加えた樹脂は、使用する前にＰＨ７．４のＳＴＥバッファーを５００μＬ加え、３０秒間振とう後、３分間遠心分離（３，０００ｒｐｍ）した。この洗浄を５回繰り返し、樹脂の保存のために加えたアジ化ナトリウムを除いた。
【００４６】
（ｉｉ）吸着および洗浄、溶出操作
上記（ｉ）の操作でアジ化ナトリウムを除いた本発明化合物（１）および従来化合物（１）を各０．５ｇ含むエッペンチューブに１００μｇ相当量の精製ＤＢＰ溶液１８．３１μｌとＳＴＥバッファー９８１．７μｌを加えて、タンパク質を吸着させるため常温にて１時間振とうした。以下、４℃、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、上澄み液を除いた後、化合物を洗浄するためＳＴＥバッファー５００μｌを加え、キュートミキサー（１，８００ｒｐｍ）で６０秒間振とうした。その後、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し上澄み液を除いた。この洗浄操作を５回繰り返した後に、溶出液としてｐＨ５．０の０．５Ｍ酢酸バッファー５００μＬを加えキュートミキサー（１，８００ｒｐｍ）で６０秒間振とうし、４℃、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）した。この溶出操作を３回繰り返し、溶出液を得た。
【００４７】
（ｉｉｉ）タンパク質の定量
各溶出液６００μｌを正確にとり、タンパク質定量用ＢＣＡ（ビシンコニン酸）試薬２．４ｍｌを加えて３７℃で３０分間加温した後、５６２ｎｍの吸光度を測定した。溶出液中のタンパク質量は、ＢＳＡ（シグマ社製）を標準品とした検量線から求めた。
【００４８】
その結果、溶出液中のタンパク質量は、本発明化合物（１）では４６．５μｇ／ｍｌ、また、従来化合物（１）では３６．５μｇ／ｍｌとなった。
この結果は、従来化合物（１）と同様、本発明化合物（１）がＤＢＰと結合することを示す。
【００４９】
（実施例３）ＤＢＰおよびＢＳＡの吸着比較
（ｉ）吸着および洗浄、溶出操作
アジ化ナトリウムを除いた本発明化合物（１）を各０．５ｇ含むエッペンチューブに１００μｇ相当量の精製ＤＢＰ溶液あるいはＢＳＡ溶液を加え、さらに、全量が１０００μｌとなるようにＳＴＥバッファーを加えて、以下、１時間振とうし、実施例２（ｉｉ）と同様に、洗浄、溶出操作を行い、溶出液を得た。
【００５０】
（ｉｉ）タンパク質定量
各溶出液６００μＬを正確にとり、タンパク質定量用ＢＣＡ液（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）２．４ｍｌを加えて３７℃で３０分間加温した後、５６２ｎｍの吸光度を測定した。回収液中のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準品とした検量線から求めた。
【００５１】
結果を以下の表１に示す。なお表１中、用いた化合物は、それぞれ別個の操作により合成された化合物を意味する。
【００５２】
【表１】
【００５３】
ＤＢＰサンプルでの回収タンパク質量は本発明化合物（１）では４２．４２μｇ、従来化合物（１）では３５．７６μｇであった。一方、ＢＳＡサンプルでの回収タンパク質量はブランク値の範囲内でタンパク質量は算出できなかった。
【００５４】
この結果は、本発明化合物がＤＢＰを特異的に結合することが可能であり、また従来化合物（１）よりも優れた結合能を有することを示す。
【００５５】
実施例４：血清からのタンパク質の回収
（ｉ）吸着および洗浄、溶出操作
（操作１）
Ｇｃタイプ １ｓ１ｓのボランティアからヒト血液を２０ｍｌ採取し、室温で３０分静置し、その後遠心により血清を回収し、４℃で保管する。室温に戻して３０分間、静置し、１０分間遠心分離（３，０００ｒｐｍ）して血清（約１０ｍｌ）を回収し、４℃に保管した。
【００５６】
各エッペンチューブに本発明化合物（１）、従来化合物（１）および対照品化合物（１）をそれぞれ０．５ｇ分注し、アジ化ナトリウムを除いた後、２５０μｌの血清と２５０μｌのＳＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）を加え、実施例２（ｉｉ）と同様な操作を行い、溶出液を得た。
【００５７】
得られた溶出液の５００μＬをアミコン（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製アミコンウルトラ０．５ １０００００Ｍ．Ｗ．ＣＯ）上で１０分間、４℃、１３，０００Ｇで、限外濾過した。さらに残りの溶出液を加えて同様に処理した。このアミコンの中に、１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５００μＬを加えて、４℃で、１０分間、１３，０００Ｇで、バッファー置換を行う。これを５回行い、その後、４℃で、３分間、遠心分離（１０００Ｇ）して、タンパク質濃縮液を得た。
【００５８】
（操作２）
対照化合物（１）０．５ｇをとり、アジ化ナトリウムを除いた後、１ｓ１ｓタイプのヒト血清２５０μＬとリン酸ナトリウムバッファー２５０μＬを加えて、常温にて１時間振とうし、４℃で、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、上澄み液を回収した（前処理操作）。
【００５９】
この上澄み液５００μＬずつを、アジ化ナトリウムを除いた本発明化合物（１）、従来化合物（１）および対照化合物（１）をそれぞれ０．５ｇ含むエッペンチューブに加え、１時間振とうし、その後、４℃で、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、上澄み液を除いた。化合物を洗浄するため、５００μＬのＳＴＥバッファー（ＰＨ７．４）を加え、キュートミキサー（１，８００ｒｐｍ）で３０秒間振とうし、さらに、４℃で、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）を行い、上澄み液を除いた。この洗浄操作を１０回繰り返した後に、０．５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）５００μＬを加え、６０秒間振とう、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）を行い、上澄み液を回収した。この回収操作を３回繰り返し、上澄み液を合わせて溶出液とした。以下、上記（操作１）と同様な限外濾過およびバッファー置換を行い、タンパク質濃縮液を得た。
【００６０】
（ｉｉ）タンパク質定量
操作１または操作２の条件で回収したタンパク質濃縮液を用いて、本発明化合物（１）、対照化合物（１）および従来化合物（１）のタンパク質吸着能について、ＢＣＡ法を用いたタンパク質定量によって解析した。すなわち、ＢＳＡ溶液を２．０，１．０，０．５，０．２５，０，１ｍｇ／ｍｌの濃度で用意した。タンパク質濃縮液はそれぞれ３０倍に希釈した。調製したＢＳＡおよびタンパク質濃縮液６０μＬを９６穴プレートに正確に加え、さらにＢＣＡ液（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を２４０μＬずつ加える。３７℃、３０分間インキュベーションした後、吸光度を波長５７０ｎｍで測定し、タンパク濃度を算出した。
【００６１】
結果を以下の表２および表３に示す。なお表２および３中、用いた化合物は、それぞれ別個の操作により合成された化合物を意味する。
【００６２】
【表２】
【００６３】
【表３】
【００６４】
上記（操作１）において、対照化合物も含め、全ての樹脂で数百μｇレベルのタンパク質を得た（表２参照）。非特異的なタンパク質が大量に混入しており、各樹脂のＤＢＰ結合能については判断できなかった。
【００６５】
上記（操作２）において、本発明化合物および従来化合物では１４μｇ〜２８μｇのタンパク質の吸着が得られた。対照化合物ではタンパク質の吸着は得られなかった（表３参照）。これは（操作２）において、本発明化合物（１）および従来化合物（１）がＤＢＰを回収できたことを示唆する。
【００６６】
（ｉｉｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）
上記（操作１）と（操作２）の結果を確認するために、（操作１）の濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルをＣＢＢ染色した。すなわち、ＣＢＢ溶液（ＣＢＢ ０．２５ｇをメタノール：酢酸：ｍＱ（５：１：４）に溶かしたもの）を５００〜１０００μＬをゲルにかけ、２〜３分程度染色した後、脱色液に１０分間ほど浸して振盪し脱色した後、一晩、風乾した。
【００６７】
その結果、対照化合物（１）、従来化合物（１）および４ロットの本発明化合物（１）のいずれのサンプルでも多くのタンパク質バンドが見られた（図１参照）。上記（操作１）では、洗浄不足のため非特異的タンパク質が大量に混入するため、従来化合物（１）でもＤＢＰバンドを確認することができなかった。
【００６８】
（ｉｖ）ＨＰＬＣ解析
さらに、上記（操作１）と（操作２）の違いを確認するため、各濃縮液をリン酸ナトリウムバッファーでタンパク濃度２５０ｎｇ／μＬに希釈して、下記の条件でＨＰＬＣを行った。ＤＢＰ標準品にシグマ社製Ｇｃグロブリンを用いて、標準品の保持時間と重なるピークの保持時間およびそのピークの面積を全タンパク質の面積で割り、見かけ上のＧｃ％を調べた。
・移動相：５０ｍＭ ＳＰＢ＋０．３Ｍ ＮａＣｌ
・流量：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
・注入量：タンパク質２．５μｇ相当（１０μＬ ｉｎｊｅｃｔ）
・カラム：東ソーＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ
・カラム温度：２５℃
・検出波長：２２５ｎｍ
結果を以下の表４に示す。なお表４中、用いた化合物は、それぞれ別個の操作により合成された化合物を意味する。
【００６９】
【表４】
【００７０】
【表５】
【００７１】
上記（操作１）によるタンパク質濃縮液で当該ピークの保持時間は、いずれの樹脂の場合も標準品には一致しなかった（表４参照）。一方、（操作２）によるタンパク質濃縮液において、本発明化合物（１）および従来化合物（１）で処理したサンプルでは当該ピークの保持時間が、完全に標準品と一致した（表５参照）。
【００７２】
タンパク定量、電気泳動およびＨＰＬＣ分析から、（操作２）の条件で、不純タンパク質が除去でき、本発明化合物（１）および従来化合物（１）を用いてＤＢＰを精製できることが示された。
【００７３】
（実施例５）Ｇｃタイプ １ｆ１ｆ、１ｓ１ｓおよび２２の血清からの直接ＤＢＰ濃縮
本発明化合物（１）によるＤＢＰの精製能を高めるため、下記操作３の条件を見出した。Ｇｃタイプの異なる３種類１ｆ１ｆ、１ｓ１ｓおよび２２のヒト血清を用いて、操作３の条件を用いてＤＢＰ精製を行い、サンプルのタンパク質定量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ウエスタンブロッティングを行った。
【００７４】
（ｉ）吸着および洗浄、溶出操作
（操作３）
３本のエッペンチューブに本発明化合物（１）０．５ｇずつを分注し、アジ化ナトリウムを除いた後、各エッペンチューブに各々３タイプの血清２５０μｌを加え、さらにＳＴＥバッファー２５０μｌを加えて、キュートミキサー（１，８００ｒｐｍ）で５分間振とうした。次に、４℃で、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、上澄み液を除いた。さらに、ＳＴＥバッファー（ＰＨ７．４）を５００μｌ加え、キュートミキサー（１，８００ｒｐｍ）で１０秒間振とうし、化合物の洗浄を行い、４℃で、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、上澄み液を除いた。この洗浄操作を１５回行った。次に、０．５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）５００μｌを加え、キュートミキサー（１，８００ｒｐｍ）で１０秒間振とうしタンパク質を溶出させ、４℃で、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）した。これを２回行い、上澄み液を回収液とした。以下、限外濾過、バッファー置換を行い、タンパク質濃縮液を得た。
【００７５】
（ｉｉ）タンパク質定量とＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）
操作３の条件で回収したタンパク質濃縮液を用いて、本発明化合物（１）のタンパク質吸着能について、ＢＣＡ法を用いたタンパク質定量によって解析した。
結果を以下の表６に示す。
【００７６】
【表６】
【００７７】
結果、血清２５０μＬ当り２４〜２７μｇのタンパク質が得られた（表６参照）。
【００７８】
次に、操作３の条件で回収したタンパク質濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）を行った。
結果を図２に示す。結果、Ｇｃタイプに関係なく同一の単一バンドを得た（図２）。
【００７９】
シグマ社製のＧｃグロブリンはバンドの位置がサンプルとは異なるが、これは他のサンプルと異なり、操作３の条件を用いて精製されていないためであり、シグマ社製のＧｃグロブリンも（操作３）の条件を用いて精製することによって、血清由来のＧｃグロブリンとバンド位置は一致する（図５レーン１および２参照）。
【００８０】
（ｉｉｉ）ウエスタンブロット
操作３の条件で回収したタンパク質濃縮液を用いて、ヒト抗ＩｇＧ抗体およびＰＮＡレクチンを用いたウエスタンブロットを行った。標準品には精製ＤＢＰ（実施例２参照）を使用した。転写後、膜を０．１％ ＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄を行い、１．０％ ＢＳＡ ｉｎ ＴＢＳＴでブロッキングを行った後、０．１％ ＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄を行った。以下、室温で１時間、振盪させて一次抗体と反応させた後、０．１％ ＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄を行い、室温で二次抗体と１時間、振盪反応させた。反応後、同様に０．１％ ＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄を行った。この膜を暗室に運び、プラスティック容器内で膜に１分間程ＥＣＬ液をまんべんなくかけ、それをプラスティックシートにはさみ、フィルムをシートの上に３０秒〜３分間置いた。
【００８１】
以下、現像液に１分間漬け、水洗いし、停止液に１分間漬けて現像を行った。
結果を、図３および図４に示す。結果、バンドはヒト抗ＩｇＧ抗体を用いたウエスタンブロットで染色され、それは精製ＤＢＰと一致した（図３参照）。また、ＰＮＡレクチンを用いたウエスタンブロットでもバンドは染色され、精製ＤＢＰと一致した（図４参照）。 これより、本発明化合物（１）を用いて、血清中のＤＢＰを回収できることが明らかとなった。
【００８２】
（ｉｖ）ＨＰＬＣ解析
１ｆ１ｆ、１ｓ１ｓ、２．２の３タイプのＧｃサンプルについて、実施例４（ｉｖ）と同じ条件でＨＰＬＣ法を行い、ＨＰＬＣ法で精製ＤＢＰの純度分析が可能かどうかを調べた。標準品としてシグマ社製Ｇｃグロブリンを使用し、サンプルの保持時間（ＲＴ）が標準品のそれと±０．０２ｍｉｎ以内であることを事前に調査し、また、シンメトリー係数を調べ、その値が１．００〜１．３０を示した場合、分析の信頼性があるものとした。この２つの条件をクリアにしたサンプルは正しい評価ができるとして、次式からピーク面積法によりタンパク質当りのＤＢＰ純度を求めた。
ＤＢＰ純度＝主ピーク面積÷９〜１６分間に見られる全体のピーク面積×１００％
結果を以下の表７に示す。
【００８３】
【表７】
【００８４】
結果、３タイプのＧｃサンプル全てにおいて、保持時間が標準品の保持時間と、０．００２〜０．０１４分以内で一致した（表７参照）。また、シンメトリー係数は１．１６７〜１．１８６で、分析の信頼性があることを確認した。
【００８５】
ＤＢＰ純度を求めた結果、いずれのサンプルも全タンパク質ピーク面積の９８．７％以上であった。これはシグマ社製Ｇｃグロブリンの純度９８．１６％と同等あるいはそれ以上である。
【００８６】
以上の結果は、ＨＰＬＣ法によって、本発明化合物（１）の処理で得られたサンプル中のＤＢＰの純度評価が可能であることを示す。また、本発明化合物（１）を用いることにより、Ｇｃタイプを問わず、血清より高純度のＤＢＰを回収できることを示す。
【００８７】
（実施例６）本発明化合物と本発明類似化合物の比較。
実施例１で合成したビタミンＤ２結合ＣＬ−６Ｂ樹脂である本発明類似化合物、さらにビタミンＤ３結合アガロース樹脂（本発明化合物（２））および連結部分の構造が異なるビタミンＤ３結合ＣＬ−４Ｂ樹脂（本発明化合物（３））についてＤＢＰを吸着するかどうかを、タンパク定量法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで検討した。
【００８８】
（ｉ）吸着および洗浄、溶出操作
１ｓ１ｓのヒト血清を使い、（操作３）の条件に従って回収したタンパク質濃縮液、ならびに（操作３）において、本発明化合物（１）に代えて、本発明類似化合物、本発明化合物（２）、本発明化合物（３）、対照化合物（１）もしくは（２）、または従来化合物（２）を用いる以外は同様の条件を用いて調製された各タンパク質濃縮液を、以下（ｉｉ）−（ｉｖ）の実験に用いた。
【００８９】
（ｉｉ）本発明類似品化合物
本発明類似化合物を用いて回収したタンパク質濃縮液を用いて、本発明類似化合物のタンパク質吸着能について、ＢＣＡ法を用いたタンパク質定量によって解析した。結果を以下の表８に示す。なお表８中、用いた化合物は、それぞれ別個の操作により合成された化合物を意味する。
【００９０】
【表８】
【００９１】
ＢＣＡ法によるタンパク質定量の結果、本発明類似化合物によって２７〜３８μｇ程度のタンパク質が得られた（表８参照）。
【００９２】
しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）においては、ＤＢＰのバンドは認められなかった。本発明類似化合物にはＤＢＰが吸着しないことが明らかとなった（図６レーン８および９参照）。
【００９３】
（ｉｉｉ）本発明化合物（２）
従来化合物（２）である２５（ＯＨ）ビタミンＤ３結合アガロース樹脂は、ＤＢＰのアフィニティカラムとして使用される（非特許文献４）。そこで、従来化合物（２）または本発明化合物（２）を用いて回収したタンパク質濃縮液を用いて、従来化合物（２）および本発明化合物（２）のそれぞれのタンパク質吸着能について、ＢＣＡ法を用いたタンパク質定量によって解析した。
【００９４】
結果を以下の表９に示す。なお表９中、用いた化合物は、それぞれ別個の操作により合成された化合物を意味する。
【００９５】
【表９】
【００９６】
ＢＣＡ法によるタンパク質定量の結果、本発明化合物（２）および従来化合物（２）には本発明化合物（１）よりも多くのタンパク質が吸着した（表８および９参照）。タンパク質濃縮液には不純タンパク質の混入があるが、このサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＢＣＣ染色）をおこなった結果、本発明化合物（２）と従来化合物（２）には、同様の２つのバンドが見られ、下側のバンドが本発明化合物（１）のＤＢＰバンドに一致した。したがって、本発明化合物（２）を用いて、ＤＢＰを吸着できることが示された（図６レーン４−７参照）。
【００９７】
（ｉｖ）本発明化合物（３）
本発明化合物（３）を用いて回収したタンパク質濃縮液を用いて、本発明化合物（３）のタンパク質吸着能について、ＢＣＡ法を用いたタンパク質定量によって解析した。結果を、以下の表１０に示す。なお表１０中、用いた化合物は、それぞれ別個の操作により合成された化合物を意味する。
【００９８】
【表１０】
【００９９】
結果、本発明化合物（３）を用いることによって、本発明化合物（１）よりも少ない、５．１〜６．０μｇ程度のタンパク量が回収された（表１０参照）。そこで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）を行ったこころ、本発明化合物（１）に一致した１つバンドが見られ、ＤＢＰが吸着することが示された（図５レーン４および５参照）。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明により、ＤＢＰのアッセイや分離・精製などに用いることができる、新たなＤＢＰ結合化合物を安価にかつ大量に供給することが可能となるために、これによりＤＢＰの研究利用や臨床利用など様々な分野において重要な貢献をすることが期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＤ結合タンパク質のアッセイや分離・精製などに用いることができる、ビタミンＤ結合タンパク質と特異的に結合可能な新規化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＤ結合タンパク質（以下、「ＤＢＰ」と記載）は動物血清中に存在し、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３の運び屋として、また、細胞骨格アクチンの調節タンパク質として知られている。
【０００３】
ＤＢＰは、ヒトにおいてはＧｃ−グロブリンまたは「グループ特異的成分」（非特許文献１）としても知られている分子量約５２，０００の糖タンパク質で３つのドメインを有することが知られており、１番目のドメインにビタミンＤ結合サイトが、２番目および３番目のドメインにわたってアクチン結合サイトが、また、３番目のドメインにはマクロファージ活性化サイトがある（非特許文献２）。
【０００４】
ＤＢＰの研究のためには、ＤＢＰを分取・精製することが必要であるが、当該分取・精製の操作には従来から２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を固相支持体に結合させたＤＢＰ結合化合物が合成され使用されている。一つの態様において、当該ＤＢＰ結合化合物は、エポキシ化した２５−ＯＨ−ビタミンＤ３とＳＨ基を導入したセファロースＣＬ−６Ｂ樹脂を反応させることで合成される（非特許文献３）。また別の態様においては、当該ＤＢＰ結合化合物は、アミノプロピル基を導入した２５−ＯＨ−ビタミンＤ３とＮ−ヒドロキシスクシンイミドを導入したアガロース樹脂（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０）を反応させることで合成される。（非特許文献４）。
【０００５】
２５−ＯＨ−ビタミンＤ３は、２５位が水酸化されているビタミンＤ３であって、他のビタミンＤと比べ、ＤＢＰに対する特異的結合力が極めて強いことが知られている。ＤＢＰと各種ビタミンＤの結合力は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３の結合力を１とするとき、ビタミンＤ３で２０分の１、ビタミンＤ３の代謝産物である１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３で６６８分の１であることが報告されている（非特許文献５，６）。この性質より、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３は上記ＤＢＰ結合化合物に利用されている。
【０００６】
しかしながら、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３は、生体内で生成されるプレビタミンＤ３が肝臓にて代謝され合成される希少な天然材料である。血清中に含まれる２５−ＯＨ−ビタミンＤ３は、ビタミンＤ濃度の９５％以上を占めるが、それでもその血中濃度は５ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬと非常に小さく、大量に入手することは困難である。そのため、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を利用したＤＢＰ結合化合物を、安価かつ大量に生産することは困難であった。使用者は、使用済みのＤＢＰ結合化合物を再生して、長期の管理をしなければならず、使用者にとって大きな負担となっていた。
【０００７】
そのため、当該分野においては、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を結合させたＤＢＰ結合化合物に代わる、新たなＤＢＰ結合化合物が切望されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｇ．Ｈａｄｄａｄ， Ｊ． ＳｔｅｒｉｏｄＢｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． （１９９５） ５３， ５７９−５８２
【非特許文献２】堀 均ら，放射線生物研究 ３９（３），３２８−３４１（２００４）
【非特許文献３】Ｒｅｂｅｃｃａ Ｐ． ｅｔ．ａｌ， ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ， １５７， ２６２−２６９ （１９８６）
【非特許文献４】Ｓｗａｍｙ Ｎ．ｅｔ．ａｌ， ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ， ６， １８５−１８８ （１９９５）
【非特許文献５】Ｂｉｓｈｏｐ Ｊ．Ｅ．ｅｔ．ａｌ， Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ．， ９（８）， １２７７−８８， １９９４．
【非特許文献６】Ｂｏｕｉｌｌｏｎ Ｒ． ｅｔ．ａｌ， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ．， １６（２）， ２００−５７， １９９５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＤＢＰのアッセイや分離・精製などに用いることができる、ビタミンＤ結合タンパク質と特異的に結合可能な新規ＤＢＰ結合化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３と比べて、ＤＢＰとの結合力が弱いビタミンＤであっても、当該ビタミンＤと固相支持体とを結合させてなる化合物が、ＤＢＰに対して、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を固相支持体に結合させてなる従来のＤＢＰ結合化合物と同程度またはそれ以上の結合特異性および結合力を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 固相支持体と、ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３とが結合してなる、ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物であって、該ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３が、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除くビタミンＤ３より選択される、上記ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物。
［２］ 固相支持体が、セファロース樹脂またはアガロース樹脂である、［１］のビタミンＤ結合タンパク質結合化合物。
［３］ ［１］または［２］のビタミンＤ結合タンパク質結合化合物を充填剤として含む、ビタミンＤ結合タンパク質精製用カラム。
［４］ ［１］または［２］のビタミンＤ結合タンパク質結合化合物または［３］のビタミンＤ結合タンパク質精製用カラムを用いた、ビタミンＤ結合タンパク質の分離または精製方法であって、
（ｉ）ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物とビタミンＤ結合タンパク質を含む試料とを接触させ、該ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物に該ビタミンＤ結合タンパク質を結合させる工程；
（ｉｉ）該ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物に結合しているビタミンＤ結合タンパク質を溶出する工程；ならびに
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）にて溶出されたビタミンＤ結合タンパク質を回収する工程。
［５］ ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物の製造方法であって、
固相支持体と、ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３とを結合させる工程を含み、該ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３が、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除くビタミンＤ３より選択される、上記方法。
［６］ 固相支持体が、セファロース樹脂またはアガロース樹脂である、［５］の方法。
［７］ 結合させる工程が、
（ｉ）ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３をエポキシ化する工程；
（ｉｉ）固相支持体にチオール基を導入する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉ）で得られたビタミンＤ３と工程（ｉｉ）で得られた固相支持体を反応させ、該ビタミンＤ３と該固相支持体を結合させる工程、を含む、［５］または［６］の方法。
［８］ 結合させる工程が、
（ｉ）ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３をアミノプロピルエーテル化する工程；
（ｉｉ）固相支持体にＮ−ヒドロキシスクシンイミドを導入する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉ）で得られたビタミンＤ３と工程（ｉｉ）で得られた固相支持体を反応させ、該ビタミンＤ３と該固相支持体を結合させる工程、を含む、［５］または［６］の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ＤＢＰのアッセイや分離・精製などに用いることができる、新たなＤＢＰ結合化合物を安価にかつ大量に提供することが可能となり、これによりＤＢＰの研究分野において飛躍的な進展をもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、操作１の条件で回収したタンパク質濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）の結果を示す。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。Ｍ：マーカー；１：対照化合物（１）で処理したサンプル；２：従来化合物（１）で処理したサンプル；３−６：本発明化合物（１）で処理したサンプル。
【図２】図２は、操作３の条件で回収したＧｃタイプ １ｆ１ｆ、１ｓ１ｓまたは２２の血清に由来するタンパク質濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）の結果を示す。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。Ｍ：マーカー；１：シグマ社製のＧｃグロブリン；２：１ｆ１ｆタイプ；３：１ｓ１ｓタイプ；４：２２タイプ。
【図３】図３は、操作３の条件で回収したＧｃタイプ １ｆ１ｆ、１ｓ１ｓまたは２２の血清に由来するタンパク質濃縮液のヒト抗ＩｇＧ抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。１：１ｆ１ｆタイプ；２：１ｓ１ｓタイプ；３：２２タイプ；４：精製ＤＢＰ（Ｇｃタイプ １ｆ１ｆ）。
【図４】図４は、操作３の条件で回収したＧｃタイプ １ｆ１ｆ、１ｓ１ｓまたは２２の血清に由来するタンパク質濃縮液のＰＮＡレクチンを用いたウエスタンブロットの結果を示す。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。１：１ｆ１ｆタイプ；２：１ｓ１ｓタイプ；３：２２タイプ；４：精製ＤＢＰ（Ｇｃタイプ １ｆ１ｆ）。
【図５】図５は、操作３の条件を用いて回収したＧｃタイプ １ｓ１ｓの血清に由来するタンパク質濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）の結果を示す。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。１：シグマ社製のＧｃグロブリン；２−３：本発明化合物（１）で処理したサンプル；４−５：本発明化合物（３）で処理したサンプル；６−７：対照化合物（２）で処理したサンプル；８：シグマ社製のＧｃ精製品；９：血清。
【図６】図６は、操作３の条件を用いて回収したＧｃタイプ １ｓ１ｓの血清に由来するタンパク質濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）の結果を示す。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。１：シグマ社製のＧｃグロブリン；２−３：本発明化合物（１）で処理したサンプル；４−５：従来化合物（２）で処理したサンプル；６−７：本発明化合物（２）で処理したサンプル；８−９：本発明類似化合物で処理したサンプル；１０−１１：対照化合物（１）で処理したサンプル。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、固相支持体と、ＤＢＰに結合可能なビタミンＤとが結合してなる、ＤＢＰに特異的に結合する化合物に関する。
【００１５】
本発明においてＤＢＰは、ヒト由来のＤＢＰおよび非ヒト動物由来のＤＢＰを含む。
本発明において「ＤＢＰに結合可能なビタミンＤ」としては、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除く、ＤＢＰに対して親和性を有し得る任意のビタミンＤが含まれる。
【００１６】
本発明において「２５−ＯＨ−ビタミンＤ３」とは、２５位のみが水酸化されているビタミンＤ３および２５位のみが水酸化されているその誘導体を意味する。２５−ＯＨ−ビタミンＤ３は、ＤＢＰに対して高い親和性を有することから、ＤＢＰに特異的に結合する既存の化合物の製造に用いられている（Ｒｅｂｅｃｃａ Ｐ．ら、（上掲）、Ｓｗａｍｙ Ｎ．ら、（上掲））。本発明における「ＤＢＰに結合可能なビタミンＤ」は、ＤＢＰに対して親和性を有し得る限り２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除く全てのビタミンＤ類（ビタミンＤ３、ビタミンＤ４、ビタミンＤ５、ビタミンＤ６、ビタミンＤ７など）ならびにそれらのプロビタミン、プレビタミン、代謝産物、および誘導体より選択することができる。具体的には、ビタミンＤ３、２４，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３、２５，２６（ＯＨ）２ビタミンＤ３、１α，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ３など、およびこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ビタミンＤ３を用いる。ビタミンＤ３は、高純度のものを大量に入手できるために、有利である。
【００１７】
本発明において利用し得る「ＤＢＰに結合可能なビタミンＤ」それ自体はＤＢＰに対して、必ずしも２５−ＯＨ−ビタミンＤ３と同等またはそれを超越する結合力を持っていなくても良い。当該「ＤＢＰに結合可能なビタミンＤ」は、下記にて詳述する固相支持体と結合することによって、ＤＢＰに対して、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３と同等またはそれを超越する結合力を備えることができる。
【００１８】
本発明において利用し得るビタミンＤは、遺伝子組換え技術または化学合成技術を用いて人工的に製造されたものであっても良いし、植物または動物に由来する天然のものであっても良い。
【００１９】
本発明において「固相支持体」には、固相支持体として利用し得ることが公知である様々な材料、例えば、セルロース、セルロース誘導体、セファロース、アガロース、金属、ガラス、セラミック、樹脂など（これらに限定されない）を用いることができる。好ましくは、セファロースおよびアガロースであり、さらに好ましくはセファロースである。固相支持体は市販のものを用いることが可能であり、例えば、セファロースＣＬ−６Ｂ樹脂（シグマ社）を利用することができる。
【００２０】
固相支持体は、本発明のＤＢＰ結合化合物の用途および使用方法に応じて、平板、ビーズ、粒子、球体など（これらに限定されない）任意の形状を有することが可能である。固相支持体の大きさは、特に限定されることなく本発明の化合物の用途および使用方法に応じて適宜決定することができる。好ましくは、固相支持体は、粒径７５〜３００μｍのビーズの形状を有する。
【００２１】
ビタミンＤと固相支持体との結合は、共有結合または非共有結合を利用して行うことができる。ビタミンＤと固相支持体との結合は、特に限定するものではないが、公知の手法を利用して行うことができる。例えば、ビタミンＤをエポキシ化し、チオール基を導入した固相支持体と反応させ、両者を結合することができる（Ｒｅｂｅｃｃａ Ｐ．ｅｔ．ａｌ（上掲））。
【００２２】
あるいは、ビタミンＤをアミノプロピルエーテル化し、固相支持体のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いてエステル化して活性化エステル基とし、両者を反応させることによって結合することができる（Ｓｗａｍｙ Ｎ．ｅｔ．ａｌ（上掲））。
【００２３】
上記反応に際しては、３位のヒドロキシ基をエポキシ化またはアミノプロピルエーテル化したビタミンＤ３を利用することが好ましい。
【００２４】
本発明のＤＢＰ結合化合物は、試料中に含まれるＤＢＰと特異的に結合することが可能であり、ＤＢＰを分取および精製することに利用することができる。なお、本明細書において、本発明のＤＢＰ結合化合物とＤＢＰとの「結合」を、「吸着」と記載する場合がある。この場合、「結合」と「吸着」なる記載は互換的に使用される。
【００２５】
ＤＢＰを含む試料としては、ヒトおよび非ヒト動物に由来する、生体組織破砕液、体液（全血、血漿、血清、リンパ液など）を利用することができる（これらに限定されない）。ＤＢＰを含む試料はＤＢＰ結合化合物と接触させる前に、予め精製されていても良いし、精製されていなくても良い。好ましくは、ＤＢＰを含む試料は予め精製されている。ここでＤＢＰを含む試料を予め精製するとは、ＤＢＰ結合化合物と非特異的に結合する、試料中に含まれるタンパク質を除去することを意味する。「除去」とは、当該非特異的なタンパク質が全て試料中より除かれる場合だけでなく、その一部が試料中より除かれる場合も含む。当該精製方法は、ＤＢＰ結合化合物と非特異的に結合する、試料中に含まれるタンパク質を除去し得る限り、特に限定されないが、例えば、使用するＤＢＰ結合化合物に含まれる固相支持体のみを、ＤＢＰを含む試料と接触させ、当該固相支持体に吸着するタンパク質を除去することによって行うことができる。あるいは、DBP含有溶液を陽イオン交換カラム入れて素通りさせることで行うことができる。当該操作は必要に応じて、１回以上行うことができる。あるいは、ＤＢＰを含む試料は、ＤＢＰを精製または粗精製したものであっても良い。
【００２６】
本発明のＤＢＰ結合化合物とＤＢＰの結合に際しては、上記ＤＢＰを含む試料を、適当な緩衝液を用いてｐＨ６．０〜９．０、好ましくはｐＨ６．５〜８．０に調整する。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液（リン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等）、Ｔｒｉｓ緩衝液（ＳＴＥ緩衝液等）を用いることができる。緩衝液を添加してｐＨを調整したＤＢＰを含む試料を、同じ緩衝液を用いて平衡化した本発明の化合物と接触させ、試料中のＤＢＰを本発明の化合物に結合させる。両者の結合反応は、バッチ式で行っても良いし、連続式で行っても良い。両者の接触は、４℃〜４０℃、好ましくは４℃または室温において、1分間〜４時間振とうしながら行う。バッチ式で行う場合には好ましくはおよそ５〜１０分間振とうしながら行う。あるいは、両者の結合反応は、カラム法によって行っても良い。この場合、本発明のＤＢＰ結合化合物は、ＤＢＰを精製するための各種クロマトグラフィー用カラム、特にアフィニティーロマトグラフィー用カラム、の充填剤として利用することができる。
【００２７】
次いで、本発明のＤＢＰ結合化合物に結合したＤＢＰを溶出する。本発明のＤＢＰ結合化合物からＤＢＰを溶出する際の溶出液としては、塩化ナトリウム溶液、塩化カリウム溶液等の塩溶液、リン酸、酢酸、クエン酸、トリス等の緩衝液、グアニジン等の変性剤およびこれらの混合溶液等を利用することができる。溶出は当業者に公知の一般的な手法を用いて行うことができ、例えば、溶出液の塩濃度を徐々に増やして溶出する方法、ＤＢＰが本発明のＤＢＰ結合化合物と結合するｐＨから反撥するｐＨへ徐々に溶出液のｐＨを変化させる方法またはそれらの組合せを用いて行うことができる。ＤＢＰの結合した本発明のＤＢＰ結合化合物を遠心分離して回収した後、溶出液を添加して、４℃〜４０℃、好ましくは４℃または室温において、およそ１〜３０分間振とうした後、遠心分離して本発明のＤＢＰ結合化合物を沈降させ、上清に含まれるＤＢＰを回収する。
【００２８】
回収されたＤＢＰは、タンパク質精製に用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体などを利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過、ダイアフィルトレーション等の濾過処理など、を１つまたは複数組み合わせて用いて、さらに精製することが可能である。
【００２９】
本発明のＤＢＰ結合化合物を用いることによって血清よりＤＢＰを９７％、９８％、９９％またはそれ以上の高純度で得ることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれにより限定されるものではない。
【００３１】
（実施例１）樹脂の合成
（Ｉ）新規ＤＢＰ結合化合物（１）（以下、本発明化合物（１）と記載）
（ｉ）ビタミンＤ３のエポキシ化
５０ｍｇのビタミンＤ３（コレカルシフェロール：東京化成工業社製）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４．０ｍｌに溶解させ、枝付きフラスコに入れ、Ｎ２で置換した。次いで０．０６ｍｌのエピブロモヒドリン（和光社製）と２０ｍｇのＮａＨとを順次加え室温で攪拌しながら、Ｎ２気流中でエポキシ化反応を行う。
【００３２】
薄層クロマトグラフィーで反応完了を確認した後、反応液に氷水および酢酸エチルを加え生成物の溶媒抽出を行う。この抽出操作を３回行い、抽出液を集めて氷水で洗浄し、ＭｇＳＯ４を加えて乾燥後、減圧乾固して生成物を含む残渣を得た。
【００３３】
得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル系）に通し、原材料を除去し、エポキシ化ビタミンＤ３を回収し、減圧乾燥させ、（ｉｉｉ）のＤＢＰ結合化合物合成工程に用いた。
【００３４】
（ｉｉ）セファロース樹脂へのチオール基の導入
セファロースＣＬ−６Ｂ樹脂（シグマ社製）約１０ｇに１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル１０ｇおよびＮａＢＨ４２０ｍｌを含む１Ｍ ＮａＯＨ １０ｍｌを加え室温で１０〜１２時間振とうして、セファロースＣＬ−６Ｂ樹脂にエポキシ側鎖を導入する。この樹脂を蒸留水で洗浄した後、２．０ＭのＮａ２Ｓ２Ｏ３を１５ｍｌ加え、室温で約８時間振とうしながら、当該樹脂にチオール基（Ｓ−Ｓ）を導入した。チオール基を導入したセファロースＣＬ−６Ｂ樹脂を蒸留水、次いでＳＰＢで洗浄した後、樹脂にＤＴＴ２００ｍｇと１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａを含む０．３Ｍ ＮａＨＣＯ３２０ｍｌ（ＰＨ８．５）を加え、室温で１時間振とうして、ＳＨ−ａｃｔｉｖａｔｅｄセファロースＣＬ−６Ｂ樹脂を得た。０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄、次いで０．３Ｍ ＮａＨＣＯ３（含１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）で洗浄して、以下の本発明化合物（１）の合成工程に用いた。
【００３５】
（ｉｉｉ）本発明化合物（１）の合成
上記（ｉ）にて得られたエポキシ化ビタミンＤ３を１，４−ジオキサン２０ｍｌに溶解させ、１Ｍ ＮａＯＨ １０ｍｌおよび上記（ｉｉ）にて得られたＳＨ−ａｃｔｉｖａｔｅｄセファロースＣＬ−６Ｂ樹脂を加え、ウオータバス上、４０℃、Ｎ２気流中で撹拌した。１８時間後、６０％ アセトン／イオン交換水、アセトン、６０％ アセトン／イオン交換水、イオン交換水、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、イオン交換水（各２５０ ｍＬ）で洗浄後、遠心して上清を取り除いた。本発明化合物（１）約１０ｇを得た。
【００３６】
（ｉｖ）樹脂保管
合成した本発明品は０．０２％ ＮａＮ３を入れたＳＴＥバッファー（ｐＨ７．４， Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ６．０５ｇ，ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．５６ｇ，ＮａＣｌ ８．７７ｇをＳＤＷに溶かし、全量を１０００ｍｌとして濾過し、オートクレーブにかける。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１ｍｌ加えたもの）２０ｍＬを加えて、密栓し４℃で保管した。
【００３７】
（ＩＩ）新規ＤＢＰ結合化合物（２）（以下、本発明化合物（２）と記載）
ビタミンＤ３（コレカルシフェロール：東京化成工業製）（１００ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）をｔ−ＢｕＯＨ／ＭｅＣＮ（９／１，ｖ／ｖ）混合液（３．０ｍＬ）に溶解し、氷上撹拌下、アクリロニトリル（３００μＬ，０．５６ｍｍｏｌ，２．０ｅｑ．）を滴下した。ＮａＨを加え、１時間後、冷Ｅｔ２Ｏ、冷水を滴下し、減圧化で溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１）に付し、９８．４ｍｇ，（０．２２ｍｍｏｌ，８６％）の固体１を得た。その固体１２４．９ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）をＥｔ２Ｏ（５．０ｍＬ）に溶解し、氷上撹拌下、ＬｉＡｌＨ４／ＡｌＣｌ３ ６０．３ｍｇ，（１．０７ｍｍｏｌ， ３．９ｅｑ．）を加えた。１時間後、１Ｎ ＮａＯＨを滴下し、ＥｔＯＡｃで４回抽出し、有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過後、ろ液を減圧下で溶媒を留去し、固体２を得た。次の反応のためにＡｆｆｉＧｅｌ−１０（４．０ｍＬ，４５μｍｏｌ）を１，４−ジオキサンで３回洗浄した。これに固体２（全量）を１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）で加え、プロペラで室温下、撹拌した。２２時間後、エタノールアミン（２．５ｍＬ）を加え、さらに撹拌した。２時間後、１，４−ジオキサン／アセトン（１／１，ｖ／ｖ）で３回洗浄し、上清を取り除き、０．０２％ ＮａＮ３／ＳＴＥバッファーを加え、ビタミンＤ３結合アガロース樹脂（本発明化合物（２））４．０ｍＬを得た。
【００３８】
（ＩＩＩ）新規ＤＢＰ結合化合物（３）（以下、本発明化合物（３）と記載）
Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）２．５ｇを蒸留水およびリン酸バッファーで洗浄し、遠心後、上清を取り除いた。ＤＴＴ２００ｍｇと１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａを含む０．３Ｍ ＮａＨＣＯ３２０ｍｌ（ＰＨ８．４）を加え、室温で１時間振とうして、チオール基の還元反応を行った。生成したＳＨ−ａｃｔｉｖａｔｅｄセファロースＣＬ−４Ｂ樹脂を０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄、次いで０．３Ｍ ＮａＨＣＯ３（含１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）で洗浄して、これに上記本発明化合物（１）と同様にして得られた、エポキシ化ビタミンＤ３を１，４−ジオキサン（２０ｍｌ）に溶解して加え、さらに１Ｍ ＮａＯＨ １０ｍｌを加え、ウオータバス上、４０℃、Ｎ２気流中で撹拌して、ビタミンＤ３結合ＣＬ−４Ｂ樹脂（本発明化合物（３））を得た。
【００３９】
（ＩＶ）ビタミンＤ２を含む化合物（以下、本発明類似化合物と記載）
上記本発明化合物（１）と同様に、ビタミンＤ２（カルシフェロール：東京化成工業社製）１００ｍｇをエポキシ化して、エポキシ化ビタミンＤ２とした。さらに、上記本発明化合物（１）と同様に合成したＳＨ−ａｃｔｉｖａｔｅｄセファロースＣＬ−６Ｂ樹脂とを同様な操作で反応させ、ビタミンＤ２結合ＣＬ−６Ｂ樹脂（本発明類似化合物）を得た。
【００４０】
（Ｖ）従来公知のＤＢＰ結合化合物（１）（以下、従来化合物（１）と記載）
２５−ＯＨ−ビタミンＤ３とセファロースＣＬ−６Ｂ樹脂からなる従来公知のＤＢＰ結合化合物として、徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部 堀均博士より恵与された２５−ＯＨ−ビタミンＤ２結合ＣＬ−６Ｂ樹脂（従来化合物（１））を使用した。
【００４１】
（ＶＩ）連結部の構造が異なる従来公知のＤＢＰ結合化合物（２）（以下、従来化合物（２）と記載）
洗浄したＡｆｆｉＧｅｌ−１０ ４．０ｍｌを準備し、これに２５−ＯＨ−ビタミンＤ３（カルシフェディジール：東京化成工業製）１００．０ｍｇ，（０．２５ｍｍｏｌ）をｔ−ＢｕＯＨ／ＭｅＣＮ（９／１，ｖ／ｖ）混合液（３．０ｍＬ）に溶解し、上記（ＩＩ）新規ＤＢＰ結合化合物（２）と同様に操作して得た固体（全量）を１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）で加え、さらに同様に処理して２５−ＯＨ−ビタミンＤ３結合アガロース樹脂４．０ｍＬ（従来化合物（２））を得た。従来化合物（２）は、ビタミンＤ３と固相支持体の連結部に、エーテル結合と３つのヒドロキシ側鎖を有する。
【００４２】
（ＶＩＩ）対照化合物（１）
対照化合物（１）として、セファロースＣＬ−６Ｂ樹脂をそのまま使用した。
【００４３】
（ＶＩＩＩ）対照化合物（２）
対照化合物（２）としてはＡｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｉｏｌ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４ＢセファロースＣＬ−４Ｂ樹脂をそのまま使用した。
【００４４】
（実施例２）本発明化合物と従来化合物の比較
血清（Ｇｃタイプ １ｆ１ｆ）から硫安分画した粗Ｇｃグロブリンを、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３とセファロース樹脂からなる従来化合物（１）（徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部 堀均博士より恵与のもの）をアフィニティカラムとして使って一次精製し、次にヒドロキシアパタイトカラムで二次精製し、精製ＤＢＰを得た。この精製ＤＢＰを用いて、実施例１で製造した本発明化合物（１）および従来化合物（１）のタンパク質吸着能を比較した。
【００４５】
（ｉ）使用前の樹脂の調整
１．５ｍｌのエッペンチューブに加えた樹脂は、使用する前にＰＨ７．４のＳＴＥバッファーを５００μＬ加え、３０秒間振とう後、３分間遠心分離（３，０００ｒｐｍ）した。この洗浄を５回繰り返し、樹脂の保存のために加えたアジ化ナトリウムを除いた。
【００４６】
（ｉｉ）吸着および洗浄、溶出操作
上記（ｉ）の操作でアジ化ナトリウムを除いた本発明化合物（１）および従来化合物（１）を各０．５ｇ含むエッペンチューブに１００μｇ相当量の精製ＤＢＰ溶液１８．３１μｌとＳＴＥバッファー９８１．７μｌを加えて、タンパク質を吸着させるため常温にて１時間振とうした。以下、４℃、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、上澄み液を除いた後、化合物を洗浄するためＳＴＥバッファー５００μｌを加え、キュートミキサー（１，８００ｒｐｍ）で６０秒間振とうした。その後、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し上澄み液を除いた。この洗浄操作を５回繰り返した後に、溶出液としてｐＨ５．０の０．５Ｍ酢酸バッファー５００μＬを加えキュートミキサー（１，８００ｒｐｍ）で６０秒間振とうし、４℃、２分間遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）した。この溶出操作を３回繰り返し、溶出液を得た。
【００４７】
（ｉｉｉ）タンパク質の定量
各溶出液６００μｌを正確にとり、タンパク質定量用ＢＣＡ（ビシンコニン酸）試薬２．４ｍｌを加えて３７℃で３０分間加温した後、５６２ｎｍの吸光度を測定した。溶出液中のタンパク質量は、ＢＳＡ（シグマ社製）を標準品とした検量線から求めた。
【００４８】
その結果、溶出液中のタンパク質量は、本発明化合物（１）では４６．５μｇ／ｍｌ、また、従来化合物（１）では３６．５μｇ／ｍｌとなった。
この結果は、従来化合物（１）と同様、本発明化合物（１）がＤＢＰと結合することを示す。
【００４９】
（実施例３）ＤＢＰおよびＢＳＡの吸着比較
（ｉ）吸着および洗浄、溶出操作
アジ化ナトリウムを除いた本発明化合物（１）を各０．５ｇ含むエッペンチューブに１００μｇ相当量の精製ＤＢＰ溶液あるいはＢＳＡ溶液を加え、さらに、全量が１０００μｌとなるようにＳＴＥバッファーを加えて、以下、１時間振とうし、実施例２（ｉｉ）と同様に、洗浄、溶出操作を行い、溶出液を得た。
【００５０】
（ｉｉ）タンパク質定量
各溶出液６００μＬを正確にとり、タンパク質定量用ＢＣＡ液（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）２．４ｍｌを加えて３７℃で３０分間加温した後、５６２ｎｍの吸光度を測定した。回収液中のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準品とした検量線から求めた。
【００５１】
結果を以下の表１に示す。なお表１中、用いた化合物は、それぞれ別個の操作により合成された化合物を意味する。
【００５２】
【表１】
【００５３】
ＤＢＰサンプルでの回収タンパク質量は本発明化合物（１）では４２．４２μｇ、従来化合物（１）では３５．７６μｇであった。一方、ＢＳＡサンプルでの回収タンパク質量はブランク値の範囲内でタンパク質量は算出できなかった。
【００５４】
この結果は、本発明化合物がＤＢＰを特異的に結合することが可能であり、また従来化合物（１）よりも優れた結合能を有することを示す。
【００５５】
実施例４：血清からのタンパク質の回収
（ｉ）吸着および洗浄、溶出操作
（操作１）
Ｇｃタイプ １ｓ１ｓのボランティアからヒト血液を２０ｍｌ採取し、室温で３０分静置し、その後遠心により血清を回収し、４℃で保管する。室温に戻して３０分間、静置し、１０分間遠心分離（３，０００ｒｐｍ）して血清（約１０ｍｌ）を回収し、４℃に保管した。
【００５６】
各エッペンチューブに本発明化合物（１）、従来化合物（１）および対照品化合物（１）をそれぞれ０．５ｇ分注し、アジ化ナトリウムを除いた後、２５０μｌの血清と２５０μｌのＳＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）を加え、実施例２（ｉｉ）と同様な操作を行い、溶出液を得た。
【００５７】
得られた溶出液の５００μＬをアミコン（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製アミコンウルトラ０．５ １０００００Ｍ．Ｗ．ＣＯ）上で１０分間、４℃、１３，０００Ｇで、限外濾過した。さらに残りの溶出液を加えて同様に処理した。このアミコンの中に、１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５００μＬを加えて、４℃で、１０分間、１３，０００Ｇで、バッファー置換を行う。これを５回行い、その後、４℃で、３分間、遠心分離（１０００Ｇ）して、タンパク質濃縮液を得た。
【００５８】
（操作２）
対照化合物（１）０．５ｇをとり、アジ化ナトリウムを除いた後、１ｓ１ｓタイプのヒト血清２５０μＬとリン酸ナトリウムバッファー２５０μＬを加えて、常温にて１時間振とうし、４℃で、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、上澄み液を回収した（前処理操作）。
【００５９】
この上澄み液５００μＬずつを、アジ化ナトリウムを除いた本発明化合物（１）、従来化合物（１）および対照化合物（１）をそれぞれ０．５ｇ含むエッペンチューブに加え、１時間振とうし、その後、４℃で、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、上澄み液を除いた。化合物を洗浄するため、５００μＬのＳＴＥバッファー（ＰＨ７．４）を加え、キュートミキサー（１，８００ｒｐｍ）で３０秒間振とうし、さらに、４℃で、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）を行い、上澄み液を除いた。この洗浄操作を１０回繰り返した後に、０．５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）５００μＬを加え、６０秒間振とう、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）を行い、上澄み液を回収した。この回収操作を３回繰り返し、上澄み液を合わせて溶出液とした。以下、上記（操作１）と同様な限外濾過およびバッファー置換を行い、タンパク質濃縮液を得た。
【００６０】
（ｉｉ）タンパク質定量
操作１または操作２の条件で回収したタンパク質濃縮液を用いて、本発明化合物（１）、対照化合物（１）および従来化合物（１）のタンパク質吸着能について、ＢＣＡ法を用いたタンパク質定量によって解析した。すなわち、ＢＳＡ溶液を２．０，１．０，０．５，０．２５，０，１ｍｇ／ｍｌの濃度で用意した。タンパク質濃縮液はそれぞれ３０倍に希釈した。調製したＢＳＡおよびタンパク質濃縮液６０μＬを９６穴プレートに正確に加え、さらにＢＣＡ液（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を２４０μＬずつ加える。３７℃、３０分間インキュベーションした後、吸光度を波長５７０ｎｍで測定し、タンパク濃度を算出した。
【００６１】
結果を以下の表２および表３に示す。なお表２および３中、用いた化合物は、それぞれ別個の操作により合成された化合物を意味する。
【００６２】
【表２】
【００６３】
【表３】
【００６４】
上記（操作１）において、対照化合物も含め、全ての樹脂で数百μｇレベルのタンパク質を得た（表２参照）。非特異的なタンパク質が大量に混入しており、各樹脂のＤＢＰ結合能については判断できなかった。
【００６５】
上記（操作２）において、本発明化合物および従来化合物では１４μｇ〜２８μｇのタンパク質の吸着が得られた。対照化合物ではタンパク質の吸着は得られなかった（表３参照）。これは（操作２）において、本発明化合物（１）および従来化合物（１）がＤＢＰを回収できたことを示唆する。
【００６６】
（ｉｉｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）
上記（操作１）と（操作２）の結果を確認するために、（操作１）の濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルをＣＢＢ染色した。すなわち、ＣＢＢ溶液（ＣＢＢ ０．２５ｇをメタノール：酢酸：ｍＱ（５：１：４）に溶かしたもの）を５００〜１０００μＬをゲルにかけ、２〜３分程度染色した後、脱色液に１０分間ほど浸して振盪し脱色した後、一晩、風乾した。
【００６７】
その結果、対照化合物（１）、従来化合物（１）および４ロットの本発明化合物（１）のいずれのサンプルでも多くのタンパク質バンドが見られた（図１参照）。上記（操作１）では、洗浄不足のため非特異的タンパク質が大量に混入するため、従来化合物（１）でもＤＢＰバンドを確認することができなかった。
【００６８】
（ｉｖ）ＨＰＬＣ解析
さらに、上記（操作１）と（操作２）の違いを確認するため、各濃縮液をリン酸ナトリウムバッファーでタンパク濃度２５０ｎｇ／μＬに希釈して、下記の条件でＨＰＬＣを行った。ＤＢＰ標準品にシグマ社製Ｇｃグロブリンを用いて、標準品の保持時間と重なるピークの保持時間およびそのピークの面積を全タンパク質の面積で割り、見かけ上のＧｃ％を調べた。
・移動相：５０ｍＭ ＳＰＢ＋０．３Ｍ ＮａＣｌ
・流量：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
・注入量：タンパク質２．５μｇ相当（１０μＬ ｉｎｊｅｃｔ）
・カラム：東ソーＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ
・カラム温度：２５℃
・検出波長：２２５ｎｍ
結果を以下の表４に示す。なお表４中、用いた化合物は、それぞれ別個の操作により合成された化合物を意味する。
【００６９】
【表４】
【００７０】
【表５】
【００７１】
上記（操作１）によるタンパク質濃縮液で当該ピークの保持時間は、いずれの樹脂の場合も標準品には一致しなかった（表４参照）。一方、（操作２）によるタンパク質濃縮液において、本発明化合物（１）および従来化合物（１）で処理したサンプルでは当該ピークの保持時間が、完全に標準品と一致した（表５参照）。
【００７２】
タンパク定量、電気泳動およびＨＰＬＣ分析から、（操作２）の条件で、不純タンパク質が除去でき、本発明化合物（１）および従来化合物（１）を用いてＤＢＰを精製できることが示された。
【００７３】
（実施例５）Ｇｃタイプ １ｆ１ｆ、１ｓ１ｓおよび２２の血清からの直接ＤＢＰ濃縮
本発明化合物（１）によるＤＢＰの精製能を高めるため、下記操作３の条件を見出した。Ｇｃタイプの異なる３種類１ｆ１ｆ、１ｓ１ｓおよび２２のヒト血清を用いて、操作３の条件を用いてＤＢＰ精製を行い、サンプルのタンパク質定量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ウエスタンブロッティングを行った。
【００７４】
（ｉ）吸着および洗浄、溶出操作
（操作３）
３本のエッペンチューブに本発明化合物（１）０．５ｇずつを分注し、アジ化ナトリウムを除いた後、各エッペンチューブに各々３タイプの血清２５０μｌを加え、さらにＳＴＥバッファー２５０μｌを加えて、キュートミキサー（１，８００ｒｐｍ）で５分間振とうした。次に、４℃で、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、上澄み液を除いた。さらに、ＳＴＥバッファー（ＰＨ７．４）を５００μｌ加え、キュートミキサー（１，８００ｒｐｍ）で１０秒間振とうし、化合物の洗浄を行い、４℃で、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）し、上澄み液を除いた。この洗浄操作を１５回行った。次に、０．５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）５００μｌを加え、キュートミキサー（１，８００ｒｐｍ）で１０秒間振とうしタンパク質を溶出させ、４℃で、２分間、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ）した。これを２回行い、上澄み液を回収液とした。以下、限外濾過、バッファー置換を行い、タンパク質濃縮液を得た。
【００７５】
（ｉｉ）タンパク質定量とＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）
操作３の条件で回収したタンパク質濃縮液を用いて、本発明化合物（１）のタンパク質吸着能について、ＢＣＡ法を用いたタンパク質定量によって解析した。
結果を以下の表６に示す。
【００７６】
【表６】
【００７７】
結果、血清２５０μＬ当り２４〜２７μｇのタンパク質が得られた（表６参照）。
【００７８】
次に、操作３の条件で回収したタンパク質濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）を行った。
結果を図２に示す。結果、Ｇｃタイプに関係なく同一の単一バンドを得た（図２）。
【００７９】
シグマ社製のＧｃグロブリンはバンドの位置がサンプルとは異なるが、これは他のサンプルと異なり、操作３の条件を用いて精製されていないためであり、シグマ社製のＧｃグロブリンも（操作３）の条件を用いて精製することによって、血清由来のＧｃグロブリンとバンド位置は一致する（図５レーン１および２参照）。
【００８０】
（ｉｉｉ）ウエスタンブロット
操作３の条件で回収したタンパク質濃縮液を用いて、ヒト抗ＩｇＧ抗体およびＰＮＡレクチンを用いたウエスタンブロットを行った。標準品には精製ＤＢＰ（実施例２参照）を使用した。転写後、膜を０．１％ ＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄を行い、１．０％ ＢＳＡ ｉｎ ＴＢＳＴでブロッキングを行った後、０．１％ ＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄を行った。以下、室温で１時間、振盪させて一次抗体と反応させた後、０．１％ ＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄を行い、室温で二次抗体と１時間、振盪反応させた。反応後、同様に０．１％ ＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄を行った。この膜を暗室に運び、プラスティック容器内で膜に１分間程ＥＣＬ液をまんべんなくかけ、それをプラスティックシートにはさみ、フィルムをシートの上に３０秒〜３分間置いた。
【００８１】
以下、現像液に１分間漬け、水洗いし、停止液に１分間漬けて現像を行った。
結果を、図３および図４に示す。結果、バンドはヒト抗ＩｇＧ抗体を用いたウエスタンブロットで染色され、それは精製ＤＢＰと一致した（図３参照）。また、ＰＮＡレクチンを用いたウエスタンブロットでもバンドは染色され、精製ＤＢＰと一致した（図４参照）。 これより、本発明化合物（１）を用いて、血清中のＤＢＰを回収できることが明らかとなった。
【００８２】
（ｉｖ）ＨＰＬＣ解析
１ｆ１ｆ、１ｓ１ｓ、２．２の３タイプのＧｃサンプルについて、実施例４（ｉｖ）と同じ条件でＨＰＬＣ法を行い、ＨＰＬＣ法で精製ＤＢＰの純度分析が可能かどうかを調べた。標準品としてシグマ社製Ｇｃグロブリンを使用し、サンプルの保持時間（ＲＴ）が標準品のそれと±０．０２ｍｉｎ以内であることを事前に調査し、また、シンメトリー係数を調べ、その値が１．００〜１．３０を示した場合、分析の信頼性があるものとした。この２つの条件をクリアにしたサンプルは正しい評価ができるとして、次式からピーク面積法によりタンパク質当りのＤＢＰ純度を求めた。
ＤＢＰ純度＝主ピーク面積÷９〜１６分間に見られる全体のピーク面積×１００％
結果を以下の表７に示す。
【００８３】
【表７】
【００８４】
結果、３タイプのＧｃサンプル全てにおいて、保持時間が標準品の保持時間と、０．００２〜０．０１４分以内で一致した（表７参照）。また、シンメトリー係数は１．１６７〜１．１８６で、分析の信頼性があることを確認した。
【００８５】
ＤＢＰ純度を求めた結果、いずれのサンプルも全タンパク質ピーク面積の９８．７％以上であった。これはシグマ社製Ｇｃグロブリンの純度９８．１６％と同等あるいはそれ以上である。
【００８６】
以上の結果は、ＨＰＬＣ法によって、本発明化合物（１）の処理で得られたサンプル中のＤＢＰの純度評価が可能であることを示す。また、本発明化合物（１）を用いることにより、Ｇｃタイプを問わず、血清より高純度のＤＢＰを回収できることを示す。
【００８７】
（実施例６）本発明化合物と本発明類似化合物の比較。
実施例１で合成したビタミンＤ２結合ＣＬ−６Ｂ樹脂である本発明類似化合物、さらにビタミンＤ３結合アガロース樹脂（本発明化合物（２））および連結部分の構造が異なるビタミンＤ３結合ＣＬ−４Ｂ樹脂（本発明化合物（３））についてＤＢＰを吸着するかどうかを、タンパク定量法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで検討した。
【００８８】
（ｉ）吸着および洗浄、溶出操作
１ｓ１ｓのヒト血清を使い、（操作３）の条件に従って回収したタンパク質濃縮液、ならびに（操作３）において、本発明化合物（１）に代えて、本発明類似化合物、本発明化合物（２）、本発明化合物（３）、対照化合物（１）もしくは（２）、または従来化合物（２）を用いる以外は同様の条件を用いて調製された各タンパク質濃縮液を、以下（ｉｉ）−（ｉｖ）の実験に用いた。
【００８９】
（ｉｉ）本発明類似品化合物
本発明類似化合物を用いて回収したタンパク質濃縮液を用いて、本発明類似化合物のタンパク質吸着能について、ＢＣＡ法を用いたタンパク質定量によって解析した。結果を以下の表８に示す。なお表８中、用いた化合物は、それぞれ別個の操作により合成された化合物を意味する。
【００９０】
【表８】
【００９１】
ＢＣＡ法によるタンパク質定量の結果、本発明類似化合物によって２７〜３８μｇ程度のタンパク質が得られた（表８参照）。
【００９２】
しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）においては、ＤＢＰのバンドは認められなかった。本発明類似化合物にはＤＢＰが吸着しないことが明らかとなった（図６レーン８および９参照）。
【００９３】
（ｉｉｉ）本発明化合物（２）
従来化合物（２）である２５（ＯＨ）ビタミンＤ３結合アガロース樹脂は、ＤＢＰのアフィニティカラムとして使用される（非特許文献４）。そこで、従来化合物（２）または本発明化合物（２）を用いて回収したタンパク質濃縮液を用いて、従来化合物（２）および本発明化合物（２）のそれぞれのタンパク質吸着能について、ＢＣＡ法を用いたタンパク質定量によって解析した。
【００９４】
結果を以下の表９に示す。なお表９中、用いた化合物は、それぞれ別個の操作により合成された化合物を意味する。
【００９５】
【表９】
【００９６】
ＢＣＡ法によるタンパク質定量の結果、本発明化合物（２）および従来化合物（２）には本発明化合物（１）よりも多くのタンパク質が吸着した（表８および９参照）。タンパク質濃縮液には不純タンパク質の混入があるが、このサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＢＣＣ染色）をおこなった結果、本発明化合物（２）と従来化合物（２）には、同様の２つのバンドが見られ、下側のバンドが本発明化合物（１）のＤＢＰバンドに一致した。したがって、本発明化合物（２）を用いて、ＤＢＰを吸着できることが示された（図６レーン４−７参照）。
【００９７】
（ｉｖ）本発明化合物（３）
本発明化合物（３）を用いて回収したタンパク質濃縮液を用いて、本発明化合物（３）のタンパク質吸着能について、ＢＣＡ法を用いたタンパク質定量によって解析した。結果を、以下の表１０に示す。なお表１０中、用いた化合物は、それぞれ別個の操作により合成された化合物を意味する。
【００９８】
【表１０】
【００９９】
結果、本発明化合物（３）を用いることによって、本発明化合物（１）よりも少ない、５．１〜６．０μｇ程度のタンパク量が回収された（表１０参照）。そこで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）を行ったこころ、本発明化合物（１）に一致した１つバンドが見られ、ＤＢＰが吸着することが示された（図５レーン４および５参照）。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明により、ＤＢＰのアッセイや分離・精製などに用いることができる、新たなＤＢＰ結合化合物を安価にかつ大量に供給することが可能となるために、これによりＤＢＰの研究利用や臨床利用など様々な分野において重要な貢献をすることが期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相支持体と、ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３とが結合してなる、ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物であって、該ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３が、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除くビタミンＤ３より選択される、上記ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物。
【請求項２】
固相支持体が、セファロース樹脂またはアガロース樹脂である、請求項１に記載のビタミンＤ結合タンパク質結合化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載のビタミンＤ結合タンパク質結合化合物を充填剤として含む、ビタミンＤ結合タンパク質精製用カラム。
【請求項４】
請求項１または２に記載のビタミンＤ結合タンパク質結合化合物または請求項３に記載のビタミンＤ結合タンパク質精製用カラムを用いた、ビタミンＤ結合タンパク質の分離または精製方法であって、
（ｉ）ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物とビタミンＤ結合タンパク質を含む試料とを接触させ、該ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物に該ビタミンＤ結合タンパク質を結合させる工程；
（ｉｉ）該ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物に結合しているビタミンＤ結合タンパク質を溶出する工程；ならびに
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）にて溶出されたビタミンＤ結合タンパク質を回収する工程。
【請求項５】
ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物の製造方法であって、
固相支持体と、ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３とを結合させる工程を含み、該ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３が、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除くビタミンＤ３より選択される、上記方法。
【請求項６】
固相支持体が、セファロース樹脂またはアガロース樹脂である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
結合させる工程が、
（ｉ）ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３をエポキシ化する工程；
（ｉｉ）固相支持体にチオール基を導入する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉ）で得られたビタミンＤ３と工程（ｉｉ）で得られた固相支持体を反応させ、該ビタミンＤ３と該固相支持体を結合させる工程、を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
結合させる工程が、
（ｉ）ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３をアミノプロピルエーテル化する工程；
（ｉｉ）固相支持体にＮ−ヒドロキシスクシンイミドを導入する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉ）で得られたビタミンＤ３と工程（ｉｉ）で得られた固相支持体を反応させ、該ビタミンＤ３と該固相支持体を結合させる工程、を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１】
固相支持体と、ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３とが結合してなる、ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物であって、該ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３が、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除くビタミンＤ３より選択される、上記ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物。
【請求項２】
固相支持体が、セファロース樹脂またはアガロース樹脂である、請求項１に記載のビタミンＤ結合タンパク質結合化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載のビタミンＤ結合タンパク質結合化合物を充填剤として含む、ビタミンＤ結合タンパク質精製用カラム。
【請求項４】
請求項１または２に記載のビタミンＤ結合タンパク質結合化合物または請求項３に記載のビタミンＤ結合タンパク質精製用カラムを用いた、ビタミンＤ結合タンパク質の分離または精製方法であって、
（ｉ）ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物とビタミンＤ結合タンパク質を含む試料とを接触させ、該ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物に該ビタミンＤ結合タンパク質を結合させる工程；
（ｉｉ）該ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物に結合しているビタミンＤ結合タンパク質を溶出する工程；ならびに
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）にて溶出されたビタミンＤ結合タンパク質を回収する工程。
【請求項５】
ビタミンＤ結合タンパク質結合化合物の製造方法であって、
固相支持体と、ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３とを結合させる工程を含み、該ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３が、２５−ＯＨ−ビタミンＤ３を除くビタミンＤ３より選択される、上記方法。
【請求項６】
固相支持体が、セファロース樹脂またはアガロース樹脂である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
結合させる工程が、
（ｉ）ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３をエポキシ化する工程；
（ｉｉ）固相支持体にチオール基を導入する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉ）で得られたビタミンＤ３と工程（ｉｉ）で得られた固相支持体を反応させ、該ビタミンＤ３と該固相支持体を結合させる工程、を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
結合させる工程が、
（ｉ）ビタミンＤ結合タンパク質に結合可能なビタミンＤ３をアミノプロピルエーテル化する工程；
（ｉｉ）固相支持体にＮ−ヒドロキシスクシンイミドを導入する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉ）で得られたビタミンＤ３と工程（ｉｉ）で得られた固相支持体を反応させ、該ビタミンＤ３と該固相支持体を結合させる工程、を含む、請求項５または６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１２２０３８（Ｐ２０１２−１２２０３８Ａ）
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７６１２８（Ｐ２０１０−２７６１２８）
【出願日】平成２２年１２月１０日（２０１０．１２．１０）
【出願人】（５１０３２７１６１）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１０日（２０１０．１２．１０）
【出願人】（５１０３２７１６１）
【Ｆターム（参考）】
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