説明

ピチア・パストリスにおいて産生される治療用糖タンパク質上のN−グリコシル化部位占拠を増加させるための方法

治療用糖タンパク質を発現するように遺伝的に操作され本明細書に記載のとおりに修飾された組換え宿主細胞において産生される該治療用糖タンパク質のN−グリコシル化部位占拠を、本明細書に記載のとおりには修飾されていない組換え宿主細胞において産生される治療用糖タンパク質のN−グリコシル化部位占拠と比べて増加させるための方法を記載する。特に、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ[これは、特定の実施形態においては、酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体、例えばリーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質の少なくとも1つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を、内在性OTase複合体をコードする宿主細胞遺伝子の発現の存在下、機能的に抑制しうる]を過剰発現する組換え宿主細胞を提供する。該方法は、酵母および糸状菌のような下等真核細胞ならびに植物および昆虫細胞および哺乳類細胞のような高等真核細胞において、N−グリコシル化部位占拠の増加を伴う治療用糖タンパク質を製造するのに有用である。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
異種糖タンパク質の製造方法であって、
(a)異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つの核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む宿主細胞[ここにおいて、内在性OTase複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される]を準備し、
(b)該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む製造方法。
【請求項2】
該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア属種(Leishmania sp.)STT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組合せである、請求項1記載の製造方法。
【請求項3】
該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア・メジャー(Leishmania major)STT3Dタンパク質である、請求項1記載の製造方法。
【請求項4】
該宿主細胞により産生された該異種糖タンパク質の少なくとも70%が完全占拠N−グリコシル化部位を有する、請求項1記載の製造方法。
【請求項5】
該宿主細胞が、1以上の哺乳類またはヒト様N−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項1記載の製造方法。
【請求項6】
該異種糖タンパク質が、エリスロポエチン(EPO);サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω;ならびに顆粒球−コロニー刺激因子(GCSF);顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF);凝固因子、例えば因子VIII、因子IXおよびヒトプロテインC;アンチトロンビンIII;トロンビン;可溶性IgE受容体α鎖;免疫グロブリン、例えばIgG、IgGフラグメント、IgG融合体およびIgM;免疫接着物質および他のFc融合タンパク質、例えば可溶性TNF受容体−Fc融合タンパク質;RAGE−Fc融合タンパク質;インターロイキン;ウロキナーゼ;キマーゼ;尿素トリプシンインヒビター;IGF結合性タンパク質;上皮増殖因子;成長ホルモン放出因子;アネキシンV融合タンパク質;アンジオスタチン;血管内皮増殖因子−2;骨髄前駆体抑制因子−1;オステオプロテジェリン;α−1−アンチトリプシン;α−フェトプロテイン;DNアーゼII;ヒトプラスミノーゲンのクリングル3;グルコセレブロシダーゼ;TNF結合タンパク質1;濾胞刺激ホルモン;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4−Ig;膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド;グルカゴン様タンパク質1;またはIL−2受容体アゴニストである、請求項1記載の製造方法。
【請求項7】
該異種タンパク質が抗Her2抗体、抗RSV(呼吸器性シンシチウムウイルス)抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受容体抗体、抗CD41 7E3抗体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受容体抗体または抗CD20抗体である、請求項1記載の製造方法。
【請求項8】
該宿主細胞が、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、ピチア・フィンランディカ(Pichia finlandica)、ピチア・トレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピチア・コクラメ(Pichia koclamae)、ピチア・メンブラネファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピチア・オプンチエ(Pichia opuntiae)、ピチア・テルモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピチア・サリクタリア(Pichia salictaria)、ピチア・グエルクウム(Pichia guercuum)、ピチア・ピエペリ(Pichia pijperi)、ピチア・スチプティス(Pichia stiptis)、ピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピチア・ミヌタ(Pichia minuta)(オガタエア・ミヌタ(Ogataea minuta)、ピチア・リンドネリ(Pichia lindneri))、ピチア属種(Pichia sp.)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス属種(Saccharomyces sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クライベロミセス属種(Kluyveromyces sp.)、クライベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・レーゼイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ルックノウエンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム属種(Fusarium sp.)、フザリウム・グラミネウム(Fusarium gramineum)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、植物細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項1記載の製造方法。
【請求項9】
該宿主細胞がピチア・パストリス(P.pastoris)のoch1突然変異体である、請求項1記載の製造方法。
【請求項10】
糖タンパク質組成物における糖タンパク質上のN−グリコシル化部位の少なくとも70%がN−グリカンで占拠されている、該糖タンパク質組成物の製造方法であって、
(a)異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つの核酸分子と、該糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む組換え宿主細胞[ここにおいて、内在性OTase複合体をコードする宿主細胞遺伝子が発現される]を準備し、
(b)該糖タンパク質を発現させるための条件下、該組換え宿主細胞を培養して、該組成物における糖タンパク質上のN−グリコシル化部位の少なくとも70%がN−グリカンで占拠されている該組成物を産生させることを含む製造方法。
【請求項11】
該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア属種(Leishmania sp.)STT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組合せである、請求項10記載の製造方法。
【請求項12】
該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア・メジャー(Leishmania major)STT3Dタンパク質である、請求項10記載の製造方法。
【請求項13】
該異種糖タンパク質が、エリスロポエチン(EPO);サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω;ならびに顆粒球−コロニー刺激因子(GCSF);顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF);凝固因子、例えば因子VIII、因子IXおよびヒトプロテインC;アンチトロンビンIII;トロンビン;可溶性IgE受容体α鎖;免疫グロブリン、例えばIgG、IgGフラグメント、IgG融合体およびIgM;免疫接着物質および他のFc融合タンパク質、例えば可溶性TNF受容体−Fc融合タンパク質;RAGE−Fc融合タンパク質;インターロイキン;ウロキナーゼ;キマーゼ;尿素トリプシンインヒビター;IGF結合性タンパク質;上皮増殖因子;成長ホルモン放出因子;アネキシンV融合タンパク質;アンジオスタチン;血管内皮増殖因子−2;骨髄前駆体抑制因子−1;オステオプロテジェリン;α−1−アンチトリプシン;α−フェトプロテイン;DNアーゼII;ヒトプラスミノーゲンのクリングル3;グルコセレブロシダーゼ;TNF結合タンパク質1;濾胞刺激ホルモン;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4−Ig;膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド;グルカゴン様タンパク質1;またはIL−2受容体アゴニストである、請求項10記載の製造方法。
【請求項14】
該異種タンパク質が抗Her2抗体、抗RSV(呼吸器性シンシチウムウイルス)抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受容体抗体、抗CD41 7E3抗体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受容体抗体または抗CD20抗体である、請求項10記載の製造方法。
【請求項15】
該組換え宿主細胞が酵母または糸状菌宿主細胞である、請求項10記載の製造方法。
【請求項16】
(a)少なくとも1つの異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第1核酸分子と、
(b)異種糖タンパク質をコードする第2核酸分子とを含む宿主細胞であって、
該宿主細胞が、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を含むタンパク質をコードする遺伝子を発現する、宿主細胞。
【請求項17】
該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア属種(Leishmania sp.)STT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質またはSTT3Dタンパク質である、請求項16記載の製造方法。
【請求項18】
該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア・メジャー(Leishmania major)STT3Dタンパク質である、請求項16記載の製造方法。
【請求項19】
該宿主細胞が、1以上の哺乳類またはヒト様N−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項16記載の宿主細胞。
【請求項20】
該異種糖タンパク質が、エリスロポエチン(EPO);サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω;ならびに顆粒球−コロニー刺激因子(GCSF);顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF);凝固因子、例えば因子VIII、因子IXおよびヒトプロテインC;アンチトロンビンIII;トロンビン;可溶性IgE受容体α鎖;免疫グロブリン、例えばIgG、IgGフラグメント、IgG融合体およびIgM;免疫接着物質および他のFc融合タンパク質、例えば可溶性TNF受容体−Fc融合タンパク質;RAGE−Fc融合タンパク質;インターロイキン;ウロキナーゼ;キマーゼ;尿素トリプシンインヒビター;IGF結合性タンパク質;上皮増殖因子;成長ホルモン放出因子;アネキシンV融合タンパク質;アンジオスタチン;血管内皮増殖因子−2;骨髄前駆体抑制因子−1;オステオプロテジェリン;α−1−アンチトリプシン;α−フェトプロテイン;DNアーゼII;ヒトプラスミノーゲンのクリングル3;グルコセレブロシダーゼ;TNF結合タンパク質1;濾胞刺激ホルモン;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4−Ig;膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド;グルカゴン様タンパク質1;またはIL−2受容体アゴニストである、請求項16記載の宿主細胞。
【請求項21】
該異種糖タンパク質が抗Her2抗体、抗RSV(呼吸器性シンシチウムウイルス)抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受容体抗体、抗CD41 7E3抗体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受容体抗体または抗CD20抗体である、請求項16記載の宿主細胞。
【請求項22】
該宿主細胞が、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、ピチア・フィンランディカ(Pichia finlandica)、ピチア・トレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピチア・コクラメ(Pichia koclamae)、ピチア・メンブラネファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピチア・オプンチエ(Pichia opuntiae)、ピチア・テルモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピチア・サリクタリア(Pichia salictaria)、ピチア・グエルクウム(Pichia guercuum)、ピチア・ピエペリ(Pichia pijperi)、ピチア・スチプティス(Pichia stiptis)、ピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピチア・ミヌタ(Pichia minuta)(オガタエア・ミヌタ(Ogataea minuta)、ピチア・リンドネリ(Pichia lindneri))、ピチア属種(Pichia sp.)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス属種(Saccharomyces sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クライベロミセス属種(Kluyveromyces sp.)、クライベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・レーゼイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ルックノウエンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム属種(Fusarium sp.)、フザリウム・グラミネウム(Fusarium gramineum)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、植物細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項16記載の宿主細胞。
【請求項23】
複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも70%が、占拠された両方のN−グリコシル化部位を有し、該N−グリカンの約50〜70モル%がG0であり、該N−グリカンの15〜25モル%がG1であり、該N−グリカンの約5〜15モル%がManGlcNAcコア構造を含む、糖タンパク質組成物。
【請求項24】
該抗体が、抗Her2抗体、抗RSV(呼吸器性シンシチウムウイルス)抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受容体抗体、抗CD41 7E3抗体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受容体抗体および抗CD20抗体からなる群から選択される抗体を含む、請求項23記載の組成物。
【請求項25】
組換えピチア・パストリス(Pichia pastoris)株YGLY14401の遺伝子型と同じ遺伝子型を有する組換えピチア・パストリス(Pichia pastoris)宿主細胞。
【請求項26】
N−およびO−グリコシル化パターン
【表1】

を有する抗RSV抗体と医薬上許容される担体とを含む抗体組成物を製造するための、組換えピチア・パストリス(Pichia pastoris)の使用。

【図1A】
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【図1B】
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【図1C】
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【図1D】
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【図1E】
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【図1F】
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【図1G】
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【図1H】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18】
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【図19A】
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【図19B】
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【図19C】
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【図20】
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【図21A】
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【図21B】
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【図22A】
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【図22B】
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【図23A】
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【図23B】
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【図23C】
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【図23D】
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【図23E】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図27】
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【図28】
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【図29】
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【図30A】
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【図30B】
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【公表番号】特表2013−520205(P2013−520205A)
【公表日】平成25年6月6日(2013.6.6)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−555104(P2012−555104)
【出願日】平成23年2月23日(2011.2.23)
【国際出願番号】PCT/US2011/025878
【国際公開番号】WO2011/106389
【国際公開日】平成23年9月1日(2011.9.1)
【出願人】(390023526)メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション (924)
【Fターム(参考)】