ピロリ菌リポ多糖類の外殻エピトープ
もっとも一般的なヒトの病原体であるヘリコバクター・ピロリは、ヒトの慢性胃炎、消化性潰瘍、および、胃癌の進行に関連している。本発明は式Ｉ：Ｒがα１，３−ＤＤ−ヘプタンに結合したα１，６−グルカンで置換したα−ＤＤＨｅｐ−３−α−Ｌ−Ｆｕｃ−３−β−ＧｌｃＮＡｃ三糖類であり、α１，３−ＤＤ−ヘプタンの最後のＤＤ−Ｈｅｐ残基は、β−ＧｌｃＮＡｃ残基でキャッピングされる：の構造を含むα１，６−グルカン化合物を含むヘリコバクター・ピロリ化合物に関する。この化合物を含む組成物、化合物の使用、および、化合物に対して産生される抗体についても同様に記載される。
【化１】
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（先願の情報）
本出願は、２００９年７月３１日に出願され米国仮特許出願第６１／２３０，３１５号の利益を主張し、その全体は引用によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は新しいヘリコバクター・ピロリＬＰＳ外殻エピトープに関する。より具体的には、本発明は、新しいピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）外殻エピトープ、その合成、特徴づけ、および、複合体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリは、ヒトの慢性胃炎、消化性潰瘍、および、胃癌に関連する最も一般的な細菌感染と認められる。ピロリ菌感染は、世界の人口の約半分に蔓延していると推測され、開発途上国では７０％、先進工業国では２０−３０％にまで達している（Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。大部分の人は小児期にピロリ菌にかかり、開発途上国の子供の間での感染の有病率は、社会経済的地位の低さと衛生状態の悪さに関連している（Ｃａｓｔｉｌｌｏ−Ｒｏｊａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。ピロリ菌は胃癌の相対リスクを少なくとも６倍増加させるため、世界保健機構（ＷＨＯ）によってクラスＩの発癌物質であると確認されている。胃癌は世界で２番目に多い死亡原因であり、毎年７００，０００人が死亡している（Ｐａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。
【０００４】
ピロリ菌の現在の根絶方策はプロトンポンプインヒビターと抗生物質の使用に基づいている。しかしながら、化学療法の介入治療の有効性は、ピロリ菌分離物中の抗生物質耐性の頻度、および、再感染に対する免疫の欠如によって限定されてしまう。したがって、ピロリ菌感染の予防および根絶のためのグローバルな戦略を提供するために新しい治療が必要である。
【０００５】
近年の調査がピロリ菌の病因におけるタンパク成分の役割と、防御免疫にタンパク質成分の役割に焦点が当てられている一方で、ワクチン製剤中にタンパク質以外の抗原を含めるという可能性を探った研究は比較的少ない。例えば、多糖類に基づいた複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ワクチンは、全身感染を防ぎ、宿主のコロニー形成を阻害することが知られている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６； Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｐｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７； Ｐａｓｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１； Ｐａｓｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）。腸内病原菌の近年の研究は、人間に使用するための候補ワクチンとして、ＬＰＳ複合体に基づいた手法を検査している（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６； Ｍｉｅｓｚａｌａ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００５； Ｙｕ ａｎｄ Ｇｕ， ２００７）。リポ多糖類（ＬＰＳ）はピロリ菌の主要な細胞表面成分である。多くのピロリ菌で行なわれた構造研究（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ， ２００１）は、Ｏ鎖と、脂質Ａ部分に付けられたコアオリゴ糖とからなるＬＰＳの構造モデルをもたらした。ほとんどのピロリ菌株のＯ鎖多糖類骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）の構造は独特で、ヒト胃細胞と腫瘍細胞の細胞表面にある決定因子を模倣するＩＩ型および／またはＩ型のルイス（Ｌｅ）式血液型決定因子を表示し（Ｗｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、これらは、萎縮性胃炎につながる有害な自己免疫反応に関与していることもある（Ａｐｐｅｌｍｅｌｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。加えて、ピロリ菌ＬＰＳの分離外殻領域は、２つの異常な高分子成分：ＤＤ−ヘプトグリカン、および、α１，６−グルカンを含む（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ， ２００１）。外殻領域ピロリ菌ＬＰＳ分離株中のα１，６−グルカンポリマーは、ＨＰ０１５９オープンリーディングフレームの生成物によって合成される。ピロリ菌中でのＨＰ０１５９遺伝子の存在および発現は一般的である。
【０００６】
多くのピロリ菌ＬＰＳ生合成遺伝子が特徴付けられ、病因とコロニー形成におけるそれらの役割が測定されてきた（Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｈｉｒａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｃｈａｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。ピロリ菌ＨＰ０８２６変異株が構築され、この変異が、Ｌｅ抗原を欠いた、切断されたＬＰＳの形成をもたらすことが実証された。しかしながら、ＬＰＳの構造の十分な特徴づけは達成されなかった。
【０００７】
当該技術分野での進展にもかかわらず、ピロリ菌の複数のタイプにわたって有効な免疫原性エピトープは捉えがたいままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は新しいヘリコバクター・ピロリＬＰＳ外殻エピトープに関する。より具体的には、本発明は、新しいピロリ菌外殻エピトープ、その合成、特徴づけ、および、複合体に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は式Ｉの構造を含む、α１，６−グルカンを含むヘリコバクター・ピロリ化合物を提供し、
【００１０】
【化１】
【００１１】
Ｒは、α１，３−ＤＤ−ヘプタンに結合したα１，６−グルカンで置換したα−ＤＤＨｅｐ−３−α−Ｌ−Ｆｕｃ−３−β−ＧｌｃＮＡｃ三糖類であり、α１，３−ＤＤ−ヘプタンの最後のＤＤ−Ｈｅｐ残基は、β−ＧｌｃＮＡｃ残基でキャッピングされる。記載されたような化合物において、α１，６−グルカンは、約３から約１２のα１，６−結合グルコース残基を含み、α１，３−ＤＤ−ヘプタンは、約２から約６のα１，３−結合ヘプトース残基を含んでもよい。
【００１２】
上記の化合物のＲ基は、以下のとおりであってもよい。
【００１３】
【化２】
【００１４】
ここで、β−ＧｌｃＮＡｃ残基Ｌは、Ｈｅｐ ＧのＯ−２に結合する。記載されたような化合物では、グルカンの残基ＱおよびＺは、α１，６−結合グルコース残基であり、ｎは約１乃至１１の間の任意の値であってもよく、残基Ｔ、ＹおよびＸは、α１，３−結合ヘプトース残基であり、ｍは約０から４の間の任意の値であってもよい。
【００１５】
上記のような化合物は、ピロリ菌株ＨＰ０８２６：：Ｋａｎから分離されるか、または、精製される。
【００１６】
上記のような化合物では、式Ｉの構造は、Ｋｄｏ残基Ｃに共有結合している脂質Ａ部分をさらに含んでもよい。脂質Ａ分子は、Ｏ−脱アシル化するか、または、Ｋｄｏ残基のケトシド結合の加水分解によって開裂する。
【００１７】
本発明は同様に、リンカー分子、タンパク質担体、または、その組み合わせに共役した、ほぼ線形のα１，６−グルカンを含む化合物を含む複合体を提供する。ほぼ線形のα１，６−グルカンを含む化合物は、本明細書に記載の化合物であり、ここで、式Ｉの構造は、リンカー分子、タンパク質担体、またはその組み合わせに共役される。ほぼ線形のα１，６−グルカンを含む化合物は、代替的に、デキストランＴ５などのデキストランであってもよい。タンパク質担体は、破傷風トキソイドまたはウシ血清アルブミンであってもよい。
【００１８】
本発明は、上記のように、１つ以上の化合物または複合体を含む組成物も含む。
【００１９】
本発明は、上記のようにα１，６−グルカンのエピトープを含む化合物に対する抗体をさらに含む。抗体はモノクローナル抗体１Ｃ４Ｆ９であってもよい。本発明はハイブリドーマ細胞株１Ｃ４Ｆ９をさらに包含し、これはモノクローナル抗体１Ｃ４Ｆ９を作り出す。
【００２０】
上記のモノクローナル抗体は、そのような処置を必要としている個体において、α１，６−グルカンを発現するピロリ菌株の補体を媒介とした溶菌を引き起こすために利用されてもよい。
【００２１】
本発明は、同様に、個体内でのピロリ菌に対する免疫反応を誘発するために、上記の有効な量の組成物の使用を提供する。組成物中の化合物は適切な担体タンパク質に共役され、さらに、組成物中の化合物は、リポ多糖類の２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸（Ｋｄｏ）を介して、適切な担体タンパク質に共役してもよい。
【００２２】
本発明は、本明細書に記載の免疫原性の組成物で哺乳動物を免疫化することによって作られた免疫抗血清をさらに提供する。免疫抗血清は、ピロリ菌の同種および異種の分類可能なおよび分類不可能な変異株および野生株における、α１，６−結合グルカンエピトープを認識するＩｇＧを含む。ＩｇＧは、変異株（ｍｕｔａｎｔ）および野生株のａ１，６−グルカンを発現するピロリ菌株の補体を媒介とした溶菌を引き起こす。
【００２３】
本発明の追加の態様および利点は、以下の記載を考慮して明らかとなる。本発明の範囲内の様々な変化および修正は、この発明の教示を踏まえて当業者に明らかになるため、詳細な記載および実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、たんなる説明として与えられるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本発明のこうした実施形態と他の実施形態は、添付の図面を参照しつつ、ほんの一例としてここで記載される。
【図１】陽イオンモードでピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎから脱脂したＬＰＳの分画１におけるＬＰＳグリコフォームのＣＥ−ＭＳ分析を示す。図１Ａが抽出された質量スペクトル（ｍ／ｚ １０００−１５００）を示す一方で、図１Ｂは、ｍ／ｚ １２６６．３でのイオンの生成イオンスペクトルを示している。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図２】陰イオンモードでピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：ＫａｎからＯ−脱アシル化したＬＰＳのＬＰＳグリコフォームのＣＥ−ＭＳ分析を示す。図２Ａが抽出された質量スペクトル（ｍ／ｚ ６００−２０００）を示す一方で、図２Ｂは、ｍ／ｚ １５９７．７でのイオンの生成イオンスペクトルを示している。脂質Ａ部分に相当するフラグメントイオンは星印で印をつけている。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図３Ａ】ピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎからの主要なＬＰＳグリコフォームの構造を示す。アシル化は示されていない。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図３Ｂ】図３ＡのＬＰＳのＫＯＨ脱アシル化の生成物が、図３Ｂで示される（化合物１〜４）。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図３Ｃ】化合物４の脱アミノの生成物が、図３Ｃで示される（化合物５および６）。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図３Ｄ】化合物６の過ヨウ素酸酸化の生成物が図３Ｄで示される（化合物７および８）。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図３Ｅ】菌株２６６９５（ＦＩＧＵＲＥ ３Ｅ）からのピロリ菌ＬＰＳ（図３Ｅ）と、菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株からのピロリ菌ＬＰＳ（図３Ｆ）に関して当該技術分野で先に提案された構造も同様に示される（出典「Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００」）。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図３Ｆ】菌株２６６９５（ＦＩＧＵＲＥ ３Ｅ）からのピロリ菌ＬＰＳ（図３Ｅ）と、菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株からのピロリ菌ＬＰＳ（図３Ｆ）に関して当該技術分野で先に提案された構造も同様に示される（出典「Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００」）。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図４】本発明のＬＰＳベースの複合体の調製のための反応スキームを示す。
【図５】陰イオンモードで脱脂されたピロリ菌Ｏ：３ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳの主要な分画のＣＥ−ＭＳ分析を示す。●：側鎖に１つのＨｅｐ残基を含むＬＰＳグリコフォーム、Ｒ＝Ｈｅｘ５−１３、Ｈｅｐ、ＨｅｘＮＡｃ、Ｆｕｃ； ■：側鎖に２つのＨｅｐ残基を含むＬＰＳグリコフォーム、Ｒ＝Ｈｅｘ８−１３、Ｈｅｐ、Ｈｅｐ、ＨｅｘＮＡｃ、Ｆｕｃ
【図６】２６６９５ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎ（図６Ａ）、および、２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ（図６Ｂ）による阻害ＥＬＩＳＡによって、ｄＬＰＳ−ＴＴ複合体により誘発されたウサギ抗体の特異性を測定するためのグラフである。ＬＰＳのコーティングは以下のように描かれる：黒四角−２６６９５；黒菱形−２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ；黒丸−２６６９５ ＨＰ０１５９：：Ｋａｎ；黒三角−２６６９５ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎ；白丸−ＳＳ１；白四角−ＳＳ１ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ；白三角−ＳＳ１ ＨＰ０１５９：：Ｋａｎ；白逆三角−ＳＳ１ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎ
【図７】ＣＤ−１マウス中のピロリ菌特異抗体反応を表すグラフを示す。マウスは、１μｇ／マウスのコレラ毒素で補助された（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）２５μｇ／マウスのｄＬＰＳ−ＴＴ複合体（黒棒）、１μｇ／マウスのコレラ毒素で補助されたＰＪ２細胞を含まない超音波処理物（斜線棒）、または、食塩水（白棒）で、週１回の間隔で４度、ワクチン接種した。最初の免疫化から４週間後、血清、糞便、膣の洗浄サンプルを採取し、ピロリ菌に特異的なＩｇＧおよびＩｇＡについてアッセイした。個々のマウスは、群平均を示す（ｎ＝５／群）水平棒でグラフ上にプロットされる。片側マン・ホイットニー検定（ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔ）によって、※ ｐ＜０．０５、※※ ｐ＜０．０１
【図８】ＣＤ−１マウスの胃におけるピロリ菌負荷（ｂｕｒｄｅｎ）を表す棒グラフである。１μｇ／マウスのコレラ毒素で補助された２５μｇ／マウスのｄＬＰＳ−ＴＴ複合体（黒棒）、１μｇ／マウスのコレラ毒素で補助されたＰＪ２細胞を含まない超音波処理物（斜線棒）、または、食塩水（白棒）で、マウスに週１回の間隔で４度、ワクチン接種した。第１の免疫から５週間後に、〜１０８ｃｆｕ ピロリ菌、ＰＪ２菌株によって、一日おきに３度、マウスに経口でチューブから栄養補給させた。４週間後にマウスを殺処分し、胃からの一般細菌を数えた。棒は、４−５のマウス±ＳＥＭの群を表わす（片側マン・ホイットニー検定によって、※ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は新しいヘリコバクター・ピロリＬＰＳ外殻エピトープに関する。より具体的には、本発明は、新しいピロリ菌外殻エピトープ、その合成、特徴づけ、および、複合体に関する。
【００２６】
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているこれらのものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験で用いることができるが、好ましい方法と材料がこれより記載される。以下に記載される全ての刊行物は、引用することによって本明細書に組み入れられる。
【００２７】
本明細書で使用されているように、「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、必ずしも絶対的な純度を意味するわけではないが、むしろ相対的な定義として意図されている。同様に、本明細書で使用されているように、「分離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、その本来の環境から何かを除去することを言う。
【００２８】
ヘリコバクター・ピロリは、ヒトの慢性胃炎、消化性潰瘍、および、胃癌に一般的に関連する細菌性病原菌である。ピロリ菌感染に関連する胃癌のリスクの増加の結果として、それはクラスＩ発癌物質として分類されている。リポ多糖類（ＬＰＳ）はピロリ菌の主要な細胞表面成分である。ピロリ菌ＬＰＳの構造研究に関する従来の出版物は、Ｏ鎖多糖類がコアオリゴ糖に共有結合される提案されたモデルをもたらし、コアオリゴ糖は順に脂質Ａ部分に付く。ほとんどのピロリ菌株のＯ鎖多糖類骨格は独特で、タイプ２および／またはタイプ１のルイス（Ｌｅ）血液型決定子を表示することができ、この多糖類成分は抗原である。「分類可能な」ピロリ菌株は、抗ルイス抗体（抗Ｌｅ）によって認識することができるルイスエピトープ（ＬｅＸおよび／またはＬｅＹ抗原）を有し、このような抗体は市販で入手可能であり、分類の助けとなる。「分類不可能な」菌株はルイス構造を含んでいない。
【００２９】
さらなる構造研究は、ピロリ菌ＬＰＳの外殻領域が２つの異常な高分子成分、ＤＤ−ヘプトグリカン、および、α１，６−グルカン側鎖を含む（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ， ２００１）。Ｌｏｇａｎら（２０００）はＬＰＳの構造についても洞察した。具体的に、もし側鎖中のＤＤ−ヘプトース（ＤＤ−Ｈｅｐ）が骨格中のＤＤ−Ｈｅｐに付けられていれば、その一方で、α１，６−グルカンがこの側鎖ＤＤ−Ｈｅｐに付き、別の分岐を形成していると仮定した場合の提案された構造（図３Ｅおよび図３Ｆを参照）。具体的に、Ｌｏｇａｎら（２０００）は、０８２６変異株ＬＰＳ内のグルカン鎖の長さを、ＦＡＢ−ＭＳスペクトル（高速原子衝撃質量分析）に基づいた１乃至３のグルコースとなるように決定した。ピロリ菌株２６６９５ ＬＰＳ中でのα１，６−結合グルコースの存在も記載され、メチル化分析データに基づいているが、グルカンの長さは決められなかった。菌株２６６９５ ＬＰＳにおいて、３−置換ＨｅｐはＯ鎖のＧｌｃＮＡｃ単位とコアとの間で結合を形成する。ピロリ菌ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳでの３−結合ヘプトースの存在も記載されているが、α１，３−ヘプタンの存在またはその長さについては記載されなかった。ヘプタンまたはグルカンの側鎖の構造または長さに関するさらなる情報は提供されなかった。ピロリ菌ＬＰＳの構造は、現在さらに定義されている。
【００３０】
本発明は式Ｉの構造を含む、新規なα１，６−グルカンを含むヘリコバクター・ピロリ化合物を提供し、
【００３１】
【化３】
【００３２】
ここで、Ｒは、α１，６−グルカンで、その後、α１，３−ＤＤ−ヘプタンで置換された、α−ＤＤＨｅｐ−３−α−Ｌ−Ｆｕｃ−３−β−ＧｌｃＮＡｃ三糖類であり、α１，３−ＤＤ−ヘプタンの最後のＤＤ−Ｈｅｐ残基は、β−ＧｌｃＮＡｃ残基でキャッピングされる。
【００３３】
上記のような構造では、三糖類（α−ＤＤＨｅｐ−３−α−Ｌ−Ｆｕｃ−３−β−ＧｌｃＮＡｃ）のβ−ＧｌｃＮＡｃは、α−ＤＤＨｅｐ Ｇに結合される。三糖類のα−ＤＤＨｅｐは、α１，６−グルカンに結合され、これは順にα１，３−ＤＤ−ヘプタンに結合される。α１，３−ＤＤ−ヘプタンはその後、β−ＧｌｃＮＡｃ残基に結合され、後者はＯ鎖多糖類に付着点を提供する。「結合した（ｌｉｎｋｅｄ）」または「置換した（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」との用語によって、２つの部分が共有結合によって連結することが意味される。
【００３４】
本明細書で使用される「α１，６−グルカン」という用語は、「グルカン」、「α１，６−グルカン側鎖」、「グルカン側鎖」、「α１，６−グルカン部分」、および／または、「グルカン部分」と交互に呼ばれる。α１，６−グルカンは、α１，６−Ｏグリコシド結合によって結合したブドウ糖モノマーの線形の多糖類鎖である。任意の方法に限定することを意図していない１つの例では、α１，６−グルカンは線形の多糖類であってもよい。α１，６−グルカンが任意の適切な量のα１，６−グルコース残基を含んでもよい。例えば、任意の方法で限定することを望まず、グルカンは、約３乃至約１２のα１，６−結合したグルコース残基を含んでもよく、具体的には、グルカン部分は約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または、１２のα１，６−結合グルコース残基、あるいは、ちょうど列挙された任意の２つの値によって定義される任意の範囲を含んでもよい。１つの非限定的な実施例では、α１，６−グルカンは、９−１２のα１，６−グルコース残基を含んでもよい。別の非限定的な実施例では、α１，６−グルカンは、１０のα１，６−グルコース残基を含んでもよい。
【００３５】
本明細書で使用されるような「グリコフォーム」という用語は、同じＬＰＳ構造を含むが、α１，６−グルコースまたはα１，３−ヘプトース残基の数が異なる、さまざまな形態またはタイプの化合物を示す。例えば、および、理論に縛られることを望まずに、各々のグリコフォームは、特定の長さのグルカンおよび／またはヘプタン部分、あるいは、それらの組み合わせを含んでもよい。
【００３６】
本明細書で使用されるような「α１，３−ヘプタン」という用語は、「α１，３−ＤＤ−ヘプタン」、「ヘプタン」、「α１，３−ヘプタン側鎖」、「ヘプタン側鎖」、「α１，３−ヘプタン部分」、「ヘプタン部分」、および／または、「ＤＤ−ヘプトグリカン」と交互に呼ばれる。α１，３−ヘプタンは、α１，３−Ｏグリコシド結合によって結合したヘプトースモノマーの多糖類鎖である。任意の方法に限定することを意図していない１つの例では、α１，３−ヘプタンは線形の多糖類であってもよい。α１，３−ヘプタンは、任意の適切な量のα１，３−ヘプトース残基を含んでもよい。例えば、任意の方法で限定することを望まずに、ヘプタンは、約２乃至約６のα１，３−結合ヘプトース残基を含んでもよく、具体的には、ヘプタン部分は、約２、３、４、５、または、６のα１，３−結合ヘプトース残基、または、ちょうど列挙された任意の２つの値によって定義される任意の範囲を含んでもよい。
【００３７】
上記のα１，３−ＤＤヘプタンの最後のＤＤ−Ｈｅｐ残基は、β−ＧｌｃＮＡｃ残基でキャップされる。「キャップされた（ｃａｐｐｅｄ）」という用語によって、β−ＧｌｃＮＡｃ残基が側鎖の最後の残基であることを意味し、「末端の（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）」という用語が使用されてもよい。β−ＧｌｃＮＡｃはヘプトースの位置Ｏ−２を介してＤＤ−Ｈｅｐに結合されてもよい。理論に縛られることを望まずに、β−ＧｌｃＮＡｃ残基はＯ鎖多糖類に付着点を与えてもよい。
【００３８】
１つの非限定的な実施例において、Ｒは以下のとおりであり、
【００３９】
【化４】
【００４０】
ここで、β−ＧｌｃＮＡｃ残基Ｌは、Ｈｅｐ残基ＧのＯ−２に結合される。この実施例では、β−ＧｌｃＮＡｃ残基Ｗは、Ｏ鎖多糖類に付着点を与えてもよい。ちょうど記載された化合物では、グルカンの残基ＱおよびＺは、α１，６−結合グルコース残基であり、ｎは、グルカンがα１，６−結合で約３乃至約１２のグルコース残基を含むように、約１乃至１１の間の任意の値でもよい。１つの具体的な非限定的な例において、主要なグリコフォームは、１０の連続するα１，６−結合グルコース残基（ｎ＝９）を含んでもよい。ちょうど記載された化合物では、残基Ｔ、Ｙ、および、Ｘは、α１，３−結合ヘプトース残基であり、ｍは、ヘプタンがα１，３−結合において約２乃至約６のヘプトース残基を含むように、約０乃至４の間の任意の値であってもよく、１つの具体的な非限定的な例において、主要なグリコフォームは４つの連続するα１，３−結合ヘプトース残基（ｍ＝２）を含んでもよい。
【００４１】
構造は任意の適切なピロリ菌株から分離および／または精製され、例えば、任意の方法で限定することを望まずに、切断されたピロリ菌ＬＰＳ分子は、限定されないが、Ｏ鎖多糖類を欠く同質遺伝子変異株をもたらすＨＰ０８２６遺伝子中の変異株を有するピロリ菌株などの分類不可能なピロリ菌株（すなわち、ルイス抗原が欠けたもの）から分離される。非限定的な例において、本明細書に記載されている化合物はピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎまたは菌株ＰＪ２から分離および／または精製されてもよい。
【００４２】
「内殻分子（ｉｎｎｅｒ ｃｏｒｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）」とも本明細書で呼ばれる式Ｉの構造は、Ｋｄｏ残基（例えば、Ｋｄｏ残基Ｃ）に共有結合している脂質Ａ部分をさらに含む。他の実施形態では、脂質Ａ分子はＯ−脱アシル化しても、または、完全に脱アシル化してもよい。さらに他の実施形態では、脂質Ａ部分は、Ｋｄｏ残基のケトシド結合の加水分解を介して開裂してもよい。理論によって縛られることを望まず、脂質Ａの開裂は、ＬＰＳの毒性を除去し、かつ、複合体の可能な凝集と不溶性を回避するために行われてもよい。当業者は、脂質Ａ部分のケトシド結合のＯ−脱アシル化、脱アシル化、または、加水分解のための方法に精通しているであろう。（例を参照。「Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１； Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３」）
【００４３】
本発明は、同様に、タンパク質担体に共役されたほぼ線形のα１，６−グルカンを含有する化合物を含む複合体を提供する。ほぼ線形のα１，６−グルカンを含有する化合物は、α１，６−結合グルコース残基で構成された任意の適切なほぼ線形の多糖類であってもよい。「ほぼ線形の」という用語によって、α１，６−グルカンが分岐をほとんど含まず、例えば、任意の方法で限定することを望まずに、α１，６−グルカンがα１，６−グルカン中に約０乃至約５％の分岐を含んでもよいことを意味する。具体的に、α１，６−グルカンは、約０、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または、５％の分岐またはその間の任意の量を含んでもよく、化合物は混合物であってもよく、このとき、混合物内の分岐の量は、１つの化合物から別の化合物まで様々である。１つの非限定的な例では、α１，６−グルカンを含む化合物は上記のような、および、本明細書で記載されるような構造であってもよい。別の実施例では、α１，６−グルカンを含有する化合物はデキストランであってもよい。デキストランは上記のような、かつ、１〜１０ｋＤａの分子量を有する必要条件を満たす任意の適切なデキストランであってもよく、例えば、しかしながら任意の方法で限定することを望まずに、デキストランは、約１、３．５、５、６．５、８、または１０ｋＤａ、または、その間の任意の値であってもよい。具体的な非限定的な例において、デキストランはデキストランＴ５であってもよい。さらに別の例では、α１，６−グルカンを含有する化合物は、約５〜８の間のα１，６−結合グルコース残基の直鎖であってもよく、例えば、任意の方法で限定することを望まずに、α１，６−グルカンを包含する化合物は、５、６、７、または、８のα１，６−結合グルコース残基の直鎖であってもよい。
【００４４】
α１，６−グルカンを含有する化合物は、リンカー分子および／または担体タンパク質に共役し、当業者によって理解されるであろうように、本明細書に記載される構造は、担体タンパク質に直接共役されるか、または、順に担体タンパク質に共役されるリンカー分子（本明細書では「リンカー」とも呼ばれる）に変化してもよい。「共役した」という用語によって、構造がリンカー分子および／または担体タンパク質に共有結合している（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ ｏｒ ｌｉｎｋｅｄ）ことを意味する。リンカーおよび／または担体タンパク質の共有結合のための方法は当業者に周知であり、当業者によって認識されるように、共有結合のための方法（および、リンカーが存在しているかどうか）は、使用される担体タンパク質によって変化する。任意の方法で限定することを望まずに、このような１つの方法が図４に示され、これは「Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９８）」からの出典であり、この方法では、脱アシル化したＬＰＳまたは脱脂したＬＰＳは、Ｋｄｏ残基のカルボキシル基をリンカー分子に共有結合し、その後、マレイミド官能性を導入することによって活性化される。活性化されたＬＰＳを、チオレート化した担体タンパク質と混ぜ合わせることで、共役した構造を生み出す。当業者によって評価されるように、本明細書に記載の方法は、一般的なものであり、従って、任意の他の適切な方法が使用されてもよい（例えば、限定されないが、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００５； Ｇｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｍｉｅｓｚａｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３； Ｙｕ ａｎｄ Ｇｕ， ２００７によって記載されたもの）。α１，６−グルカンを含有する化合物は、構造中の任意の適切なカルボキシル基を介して、リンカー／担体タンパク質に付けられてもよい。特定の非限定的な例では、α１，６−グルカンを含有する化合物は、本発明の構造であってもよく、内殻Ｋｄｏ残基Ｃによって付けられてもよい。
【００４５】
担体タンパク質は免疫原性の担体を含む、当該技術分野で知られている任意の適切な担体であってもよい。例えば、担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ジフテリアトキソイド（Ｄｉｐｈｔｅｒｉａ ｔｏｘｏｉｄ）、変異株ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ、ＣＲＭ１９７タンパク質、シュードモナスＡタンパク質（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）、コレラ毒素（ＣＴ）タンパク質、コレラ毒素変異株ＣＴ−Ｅ２９Ｈタンパク質、および、例えば、限定されないが、鞭毛、線毛、および、他の毒素の一部などの当該技術分野で知られている他のものであってもよい。
【００４６】
先に示されたように、複合体は、担体タンパク質を、自然発生の基を介して本発明の構造に直接結合させるか、または、一級アミノ基、ヒドラジド、チオール、カルボキシルなどに決して限定されないがこれらを含むスペーサーまたはリンカー分子の導入によって結合させることによって、複合体を調整することができる。
【００４７】
本発明は、本明細書に記載の１以上の化合物、本明細書に記載の１以上の複合体、または、それらの組み合わせを含む組成物をさらに提供する。１つの実施形態では、組成物は、上記の化合物のグリコフォームの混合物を含む。例えば、任意の方法で限定することを望まずに、組成物は、グルカン部分中に１０の連続するα１，６−結合グルコース残基（ｎ＝９）を含む主要なグリコフォームを含んでもよい。同様に、任意の方法で限定することを望まずに、組成物は、本明細書に記載の１以上のグリコフォームから調製された複合体を含むことができる。実施例で実証されたように、複合体の調製に使用されたピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎによって合成されたＬＰＳ構造は、３つのグリコフォーム：主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）オリゴ糖Ｉ、ＧｌｃＮＡｃと［ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｈｅｐ］でキャップした主鎖オリゴ糖Ｉ、および、もっとも長いグルカン鎖がＣＥ−ＭＳ分析によって測定されるように約１２のα−１，６−結合残基に対応する、α−１，６−結合グルカンを含むオリゴ糖の混合物であった（表２（図２））。
【００４８】
ちょうど記載されたような組成物は免疫原性のものであってもよい。「免疫原性の」という用語によって、組成物がピロリ菌の野生株および／または変異株に対する免疫反応を誘発することを意味する。免疫反応は、ピロリ菌の分類可能な、および、分類不可能な菌株に対する広範な免疫原性反応を提供してもよい。
【００４９】
本発明は、同様に、個体内でのピロリ菌に対する免疫反応を誘発するために、本明細書に記載の有効な量の組成物の使用を提供する。前に記載されたように、組成物は本発明に従って１以上の化合物を含んでもよい。１以上の化合物は、リンカーおよび／または適切な担体分子に共役してもよい。
【００５０】
本発明は、上記の免疫原性の組成物で哺乳動物を免疫化することにより産生される免疫抗血清をさらに提供する。免疫抗血清は、ピロリ菌の同種および異種の、分類可能なおよび分類不可能な、変異株および野生型であり、α１，６−結合グルカンエピトープを認識する免疫後血清ＩｇＧを含むか、または、産生する。ＩｇＧは、変異株および野生株のα１，６−グルカンを発現するピロリ菌の補体を媒介とした溶菌を引き起こすこともある。
【００５１】
本発明はさらに抗α１，６−グルカン抗体を提供する。抗体は、本明細書に記載の本発明の化合物に対して産生されるか、または、デキストラン（例えば、限定されないが、ＢＳＡデキストラン複合体などのデキストラン複合体）といった他のα１，６−グルカンを含む分子に対して産生されてもよい。１つの非限定的な例において、抗体は、当該技術分野で知られている既知の方法に従って産出されたモノクローナル抗体であってもよい（実施例１０を参照。Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。例えば、任意の方法で限定することを望まずに、抗体は、ピロリ菌ＨＰ０８２６変異株ＬＰＳの外殻領域にあるα１，６−グルカンエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体であってもよく、より具体的には、抗体は、図５で示す化合物に対して産生されてもよい。さらにもっと具体的な例において、モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞株１Ｃ４Ｆ９によって産生されたＩｇＭ １Ｃ４Ｆ９であってもよい。この細胞株は、２００９年７月３０日にカナダの国際預託機関（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）（国立微生物学研究所（カナダ マニトバ州 ウィニペグ アーリントン・ストリート １０１５）に預けられ、受け入れ番号３００７０９−０１を割り当てられた。例で実証されたように、１Ｃ４Ｆ９は、ＬＰＳ中のα１，６−グルカンエピトープと、分類可能な、および、分類不可能なピロリ菌のすべての細胞を認識し、生きている細菌の表面で容易に入手可能であり、さらに、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴとｄＬＰＳ−ＢＳＡまたはｄＬＰＳ−ＴＴ複合体の両方で同じようによく反応した。
【００５２】
本発明は、このような処置を必要としている個体において、変異株および野生株の、分類可能なおよび分類不可能なα１，６−グルカンを発現するピロリ菌の補体を媒介とした溶菌を引き起こすために、１Ｃ４Ｆ９抗体の使用を提供する。先に記載されたように、分類可能なピロリ菌株は抗Ｌｅ抗体によって認識されるルイスの抗原を有し、その一方で、分類不可能なピロリ菌株はそのような抗原を有していない。しかしながら、分類可能なおよび分類不可能な菌株の両方がα１，６−グルカンを含んでおり、両方の菌株は１Ｃ４Ｆ９抗体によって認識される。
【００５３】
現在、当該技術分野では、ピロリ菌株はルイスの抗原に対する市販の抗体を使用して分類されるが、しかしながら、分類不可能な株がルイスの構造を含んでいないため、この手法を用いてそれらを分類することはできない。ほとんどの分類可能なおよび分類不可能なピロリ菌株は、α１，６−グルカンエピトープを運ぶため、抗α１，６−グルカン抗体（ｍＡｂ １Ｃ４Ｆ９など）は、ピロリ菌分離物（ｉｓｏｌａｔｅ）を選別して特徴づける追加の方法を提供することができる。
【００５４】
ピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：ＫａｎのＬＰＳを精製し、その化学構造を、組成物、メチル化、徹底した核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析に加え、ＣＥ−ＭＳデータによって測定した。ピロリ菌ＨＰ０８２６変異株ＬＰＳの外殻領域中のα１，６−結合グルカンの存在も実証された。この構造はα１，６−グルカンに特有のモノクローナル抗体、１Ｃ４Ｆ９によって認識された。後者の抗体は、ピロリ菌（Ｏ）：３ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ突然変異株のホルマリンで固定した細胞を用いて精製した。これらの抗体は細胞表面接触可能であり殺菌性であった。以前は、ルイスの構造のみが抗原であると信じられていた。したがって、α１，６−グルカンに対する抗体の生成は予期しえなかった。
【００５５】
ピロリ菌ＬＰＳのワクチンの可能性を調べるために、ピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株の修飾ＬＰＳを共役して、破傷風トキソイド（ＴＴ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にした。部分的に脱脂したＬＰＳまたは脱脂したＬＰＳの調製のための２つの手法：やかなヒドラジン分解によるＬＰＳのＯ脱アシル化（ＬＰＳ−ＯＨ）、または、穏やかな酸処理によるＬＰＳの脱脂（ｄＬＰＳ）ｆを利用した。脱脂および／または部分的な脱脂のさらなる方法は技術分野において周知であり、このような適切な方法は本発明の範囲内で用いられてもよい。ＬＰＳ−ＯＨおよびｄＬＰＳの両方を、２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸（Ｋｄｏ）残基を介して、ジアミノ基を含むスペーサーに共有結合させ、その後、マレイミド官能性の導入と、チオール化したＴＴまたはＢＳＡとの共役によって、それぞれ、複合体、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、および、ｄＬＰＳ−ＴＴを得た。個別の実験では、分類不可能な株ＰＪ２を脱脂し、共役のために利用することによって、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ複合体を得た。
【００５６】
ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴと同様に、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴ複合体は、ＩｇＭ １Ｃ４Ｆ９による間接的なＥＬＩＳＡによって設定されるように、表面接触可能なα１，６−グルカン決定子の抗原を保持した。抗体はα１，６−グルカン決定子への優れた特異性を有することを示し、その結合特性が、ピロリ菌の分類可能なおよび分類不可能な菌株からの生成されたＬＰＳと、イソマルト−系（ｉｓｏｍａｌｔ−ｓｅｒｉｅｓ）からのオリゴ糖とによる阻害ＥＬＩＳＡによって測定された。これらの研究により、１Ｃ４Ｆ９が５または６の連続するα１，６−結合グルコース残基についての必要条件、Ｋａｂａｔ（１９９３）が主張した部位を結合する抗−α−（１→６）デキストランの大きさと一致したパターンを有することが分かった。
【００５７】
ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴ、または、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ複合体は、マウスとウサギにおいては免疫原性であり、ピロリ菌の異種の、同種の、および、野生型の菌株からのＬＰＳに対する有意なＩｇＧ抗体反応を誘発した。免疫抗原に対する１０倍強固なＩｇＧ免疫反応が、ｄＬＰＳを含む複合体を受け取ったマウスおよびウサギで生じた。ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴ、または、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴのいずれかで免疫化したウサギの免疫後の血清は、ピロリ菌の２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株および野生型２６６９５菌株に対する殺菌活性を示した。
【００５８】
要約すると、これらの結果は、Ｌｅ抗原を欠いた、かつ、長いα１，６−グルカン鎖を保有する、脱脂したか部分的に脱脂したピロリ菌ＬＰＳベースのタンパク質複合体が、マウスとウサギの両方において免疫原性であり、殺菌性の抗体を誘発するということを示唆している。このエピトープが免疫原性であると同定されたことに留意することが重要である。このことは以前は確立されていなかった。なぜなら、抗原性であり、かつ、特定の抗体を産生すると知られていたのは、ルイスの構造だけだったからである。
【００５９】
本発明は、以下の実施例においてさらに例証される。しかしながら、これらの実施例がたんなる説明目的のためのもので、任意の方法で本発明の範囲を制限するためには使用されてはならない。
【実施例】
【００６０】
（実施例１：ピロリ菌２６６９６ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳの分離および構造分析）
ヘリコバクター・ピロリ菌株２６６９５は、Ｒ．Ａｌｍ博士（マイアミ州ボストンのアストラゼネカ）から入手し、ピロリ菌（Ｏ）：３分離株はＪ．Ｐｅｎｎｅｒ博士から、Ｊ９９は、Ｄ．Ｔａｙｌｏｒ博士（カナダ・エドモントンのアルバータ大学）から入手し、ＳＳ１はＡ．Ｌｅｅ博士（オーストラリア・シドニーのニューサウスウェールズ大学）から、ＰＪ１とＰＪ２の臨床分離株は、Ｗ．Ｃｏｎｌａｎ博士（ＩＢＳ、ＮＲＣ）からの新鮮な臨床分離株であり、および、Ｍ６はＫ．Ｅａｔｏｎ博士（ミシガン州のミシガン州立大学）から入手した。
【００６１】
細菌株の増殖は、Ｈｉｒａｔｓｕｋａら（２００５）によって記載されたように実行された。手短にいえば、先に記載されたように（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ）、微好気性環境下で、７％のウマ血液を含む、抗生物質を補ったコロンビア血液寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）上で、細胞を３７°Ｃで４８時間増殖させた（Ｋａｎ２０μｇ／ｍＬ）。液体培養中の増殖のために、１０％ウシ胎児血清を含む抗生物質を補ったブルセラ菌ブロスに、４８時間のコロンビア血液寒天培地／ウマ血液プレートから採取したピロリ菌細胞を接種し、以前に記載されたように（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ、２００５）、微好気性条件下で（８５％Ｎ２、１０％ＣＯ２、５％Ｏ２）攪拌機内で４８時間インキュベートした。
【００６２】
ピロリ菌株を上記の液体培養において培養し、細菌増殖の遠心分離によって得られた浸潤細胞を、エタノール、アセトン、および、石油エーテル（ｌｉｇｈｔ ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）によって２度連続して洗浄し、空気乾燥させた。ＷｅｓｔｐｈａｌとＪａｎｎ（１９６５）の暖かいフェノール水抽出手順（ｈｏｔ ｐｈｅｎｏｌ−ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって、空気乾燥した細胞塊からＬＰＳを抽出した。広範な透析と凍結乾燥後に、水相からＬＰＳを得た。超遠心分離（１０５，０００×ｇ，４°Ｃ、１２時間）によってピロリ菌ＬＰＳをさらに精製し、ペレットを蒸留水で懸濁し、凍結乾燥させた。
【００６３】
アルジトール酢酸方法（Ｓａｗａｒｄｅｋｅｒ ｅｌ ａｌ，１９６７）によって糖組成分析を行なった。加水分解を１００°Ｃで４Ｍトリフルオロ酢酸で４時間行うか、または、１００°Ｃで２Ｍトリフルオロ酢酸で１６時間行い、その後、ＮａＢＨ４によるＨ２Ｏの還元と、その後の無水酢酸／ピリジンによるアセチル化が続く。アルジトール酢酸誘導体を先に記載したように分析した（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００３）。Ｃｉｕｃａｎｕ ＆ Ｋｅｒｅｋ（１９８４）の方法によって、および、先に記載したように（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００３）、ガス液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＧＬＣ−ＭＳ）による完全メチル化されたアルジトール酢酸誘導体の特徴付けによって、メチル化分析を行った。
【００６４】
アルジトール酢酸としてのピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎから精製されたＬＰＳの糖分析は、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース（ＤＤ−Ｈｅｐ）、および、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース（ＬＤ−Ｈｅｐ）が、０．４：５．０：１．５：４．３：６．４：１．４の適切なモル比で存在していることを明らかにし、このことは、Ｏ鎖を欠く構造の存在を示している（Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。未処置の２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ上で行なわれたメチル化分析は、これらの発見と一致しており、末端のＬ−Ｆｕｃ、３−置換したＬ−Ｆｕｃ、末端Ｄ−Ｇｌｕ、末端Ｄ−Ｇａｌ、３−置換したグルコース、４−置換したＤ−Ｇａｌ、６−置換したグルコース、末端ＤＤ−Ｈｅｐ、２−置換したＤＤ−Ｈｅｐ、６−置換したＤＤ−Ｈｅｐ、３−置換したＤＤ−Ｈｅｐ、７−置換したＤＤ−Ｈｅｐ、２，７−置換したＤＤ−Ｈｅｐ、２−置換したＬＤ−Ｈｅｐ、３−置換したＬＤ−Ｈｅｐ、末端Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ、および、３−置換Ｄ−ＧｌｃＮＡｃが、０．１：１．０：１．１：０．１：１．２：１．０：６．０：０．４：１．２：１．１：３．１：０．５：１．６：１．２：０．１：０．３：０．４の近似モル比で存在していることを示す。Ｏ鎖を含んでいるＬｅ抗原の特徴である３，４−置換したＤ−ＧｌｃＮＡｃおよび２−結合Ｄ−Ｇａｌは、まったく検知されなかった。ＬＰＳの純度はＲＮＡ由来のリビトールの欠如によって確認された。２６６９５ ＬＰＳの組成物およびメチル化分析は、他で報告されている（Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。すべての糖がピラノース形態であった。
【００６５】
（実施例２）：キャピラリー電気泳動法−質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）によって脱脂したピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳによる特徴づけ
実施例１で得られた生成した２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ（２０ｍｇ）を、０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）において１００°Ｃで２時間加水分解し、先に記載したように（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００３）Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ−２カラムでのゲルろ過によって分画することで、脱脂したＬＰＳ（ｄＬＰＳ）を生成した。３つの分画（分画１−３）を集めて、キャピラリー電気泳動質量分析法（ＣＥ−ＭＳ；表１）によって分析した。
【００６６】
ＣＥ−ＭＳに関して、Ｐｒｉｎｃｅ ＣＥシステム（Ｐｒｉｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，オランダ）を、４０００ＱＴＲＡＰ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ，カナダ）につないだ。シース溶液（イソプロパノール−メタノール、２：１）を、流速１．０μＬ／分で送達した。ｐＨ ９．０の脱イオン水中の１５ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて、約９０ｃｍの長さの剥き出しの石英ガラスの毛細管上で分離物を得た。５ｋＶのエレクトロスプレーイオン化電圧は陽イオン検出モードに使用した。４０００ｄａ／ｓの走査速度で増強された産生イオン走査モード（ＥＰＩ）を用いて、タンデム質量スペクトルを得た。（１２の値の）カーテン（ｃｕｒｔａｉｎ）および（「高い」縮尺に設定された）衝突ガスとして、窒素を使用した。
【００６７】
陽イオンモードでの主要な分画１のＣＥ−ＭＳ分析は、約１１のα−１，６−結合残基に相当する最長のグルカン鎖である、Ｈｅｘ残基の連続的な追加に一致して、ｍ／ｚ １２１２．３、ｍ／ｚ １２６６．３、および、ｍ／ｚ １３２０．４で一連の三価イオンの存在を確認した。イオンの信号強度に基づいて、ｍ／ｚ １２６６．３での最も豊富なグリコフォームは、１０のα−１，６−結合Ｈｅｘを含む（図１）。陽イオン検出モードにおけるｍ／ｚ １２６６．３でのイオンの生成スペクトルは、以前観察された主鎖コア断片（ｃｏｒｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）Ｈｅｘ２Ｈｅｐ３（ＰＥｔｎ）ＫｄｏとＨｅｘＮＡｃＨｅｘ２Ｈｅｐ３（ＰＥｔｎ）Ｋｄｏそれぞれに一致して、ｍ／ｚ １２４４．５とｍ／ｚ １４４７．６での診断のイオンの存在を確認した（図１）。ＬＰＳコア中にα１，６−グルカンを保有する分画１および２を組み合わせて共役のために用いた。
【００６８】
【表１】
【００６９】
（実施例３）：ＣＥ−ＭＳによるＯ−脱アシル化した２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳの特徴付け
（実施例１の）２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳのＯ−脱アシル化は、幾つかの修正をしたＨｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．に従って実行された（１９９１）。手短にいえば、ＬＰＳ（４ｍｇ）を４時間、３７°Ｃで無水ヒドラジン（０．２ｍｌ）中で撹拌した。反応混合物を冷却し、冷たいアセトン（２ｍｌ）をゆっくりと加えることで超過ヒドラジンを破壊した。３０分後、沈殿したＯ−脱アシル化したＬＰＳ（ＬＰＳ−ＯＨ）を、遠心分離（４°Ｃ、９３００×ｇ、１０分）によって集めた。ペレットを冷たいアセトンで２度洗浄し、水に溶解させ、凍結乾燥させることでＬＰＳ−ＯＨ（３．５ｍｇ）を得た。
【００７０】
陽イオンモードでのＯ−脱アシル化した２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ（ＬＰＳ−ＯＨ）のＣＥ−ＭＳ分析を、実施例２に記載のように行った。ＣＥ−ＭＳの結果は脱脂したＬＰＳについて得られたＭＳデータと一致しており、主鎖オリゴ糖、および、ＨｅｘＮＡｃ、および、［ＨｅｘＡｃ、Ｆｕｃ、Ｈｅｐ］のそれぞれでキャップした主鎖オリゴ糖のそれぞれの存在と一致して、ｍ／ｚ １１３７．２、ｍ／ｚ １２３９．２、および、ｍ／ｚ １４０８．０で３つの主要な二価イオンを提供したが（表２）、その一方で、ｍ／ｚ １５９７．７、ｍ／ｚ １６５１．４、および、ｍ／ｚ １７０５．５での三価イオンは、約１２のα−１，６−結合残基に相当する最長のグルカン鎖である、グルカンの存在と一致した（表２、図２）。ｍ／ｚ １５９７．７のＭＳ／ＭＳスペクトルは、［Ｆｕｃ，Ｈｅｐ］と［Ｆｕｃ，Ｈｅｐ，ＨｅｘＮＡｃ］のそれぞれの連続的な損失と一致して、ｍ／ｚ １４４７．６とｍ／ｚ １２４４．５での診断のイオンの存在を示し（図２）、さらに、Ｋｄｏ残基を介してＯ−脱アシル化された脂質Ａ（脂質Ａ−ＯＨ）に結合したコア断片ＦｕｃＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃＨｅｐ４（ＰＥｔｎ）Ｋｄｏに一致して、ｍ／ｚ １７８６．８で一価イオンをもたらし、その一方で、ｍ／ｚ ４４４．４およびｍ／ｚ ８８７．８でのイオンは、２つのアミド結合した３−ヒドロキシオクタデカン［Ｃ１８：０（３−ＯＨ）］脂肪酸鎖により置換されたジグルコサミン（ｄｉｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）主鎖からなる脂質Ａ−ＯＨ部分に相当した（図２）。
【００７１】
【表２】
【００７２】
（実施例４）：ピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳのＮＭＲ分析
ＰＥｔＮ置換基のアルカリ加水分解がアグリコンを含まない還元末端を残すため（Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、（実施例１の）ピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：ＫａｎからのＬＰＳの分解は、脂質Ａ ＧｌｃＮの即時還元のためのＮａＢＨ４の存在下で、４Ｍ ＫＯＨによる完全な脱アシル化で始まった。ゲルクロマトグラフィーによる生成物の分離は、クロマトグラムのオリゴ糖領域で溶出された、２つの分画をもたらした。更なる分析によって、これらの分画は、グルカン鎖の長さによって明らかに異なる、類似する化合物を含むことが示された。低分子量分画（Ｌｏｗｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｆｒａｃｔｉｏｎ）は、質量分析法によって同定された化合物１−３を含み、両方の分画は、グルカン部分の異なる長さの化合物４を含んでいた（図３）。
【００７３】
ＮＭＲスペクトル（ＤＱＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ ＨＳＱＣ、および、ＨＭＢＣ）は、先に記載されたような（Ｂｒｉｓｓｏｎ、２００２）標準のソフトウェアを用いてＶａｒｉａｎ ５００または６００ＭＨｚの分光計で行われた。ＮＭＲ実験はすべて、１Ｈスペクトルにはδ２．２２５ｐｐｍで、１３Ｃスペクトルには３１．４５ｐｐｍで、内部基準としてアセトンを用いて２５°Ｃで行われた。
【００７４】
その複雑さゆえにスペクトルを完全に解釈することはできなかったが、両方の分画のＮＭＲスペクトルは化合物４に相当した。α−１，６−グルカン、および、ＤＤ−ヘプタンの末端残基のＨ−１プロトンは、グルカンおよびヘプタンＨ−１の残りには重複せず、したがって、図３に示されるように、全体的な構造内でこれらのホモポリマーの位置を同定することができる。しかしながら、α−１，６−グルカン鎖の還元末端Ｇｌｕ残基Ｚの結合位置は測定されなかった。それは、同定されていない陽子（後に、ＨｅｐＮのＨ−６に割り当てられる）との強いＮＯＥ相関を示した。化合物４のＮＭＲデータは、ヘプタン部分（Ｘ）の第１のＨｅｐ残基がα−１，６−グルカンに属する非還元末端Ｇｌｃ残基ＶのＯ−３に結合されたため、α−１，６−グルカンがＤＤ−ヘプタンと内殻との間に置かれたことを明確に示した。ＤＤ−ヘプタンの非還元末端は、Ｏ−３でβ−ＧｌｃＮ Ｗに置換された。小さなオリゴ糖１−３と同一の化合物は、α−１，６−グルカンがほとんどない変異株ＨＰ０１５９：：Ｋａｎのピロリ菌ＬＰＳの主要な構成要素として先に発見され、それらのＮＭＲデータが公表された（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。化合物４に関して選択されたＮＭＲデータが表３に示される。Ｋｄｏに結合した４つの近接するヘプトース残基の以前提案された配列は、調べた化合物のいずれにも存在しなかったことが容易にわかるであろう（図３）。β−ＧｌｃＮ残基Ｌは、ＨｅｐＧのＯ−２に直接結合し、ＬＰＳ構造の任意の部分においてＨｅｐのＯ−７につなげられたＧｌｃＮはなかった。
【００７５】
【表３】
【００７６】
ＬＰＳ構造のさらなる分析について、化合物１−４を脱アミノ化した。手短にいえば、サンプルを１０％ＡｃＯＨに溶解させ、過度のＮａＮＯ２を加えた。３時間後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラムで、ゲルクロマトグラフィーによって生成物を分離した。その後、化合物のいくつかをＮａＢＤ４で還元し、脱塩した。結果として生じる生成物が化合物５および６であった。（上記のように行なわれた）化合物５のＮＭＲスペクトルは、（アルカリ条件下のリン酸塩移動によって）ＨｅｐＥの位置６または７で、リン酸塩を含む２つの異性体を示した。再度、３つの近接するＨｅｐ残基が存在し、以前に提案された構造が正確である場合に予測されるであろうように、４つではなかった。脱アミノ処置（上記の）による全側鎖の除去は、ＧｌｃＮ ＬがＯＳ５の糖と分子の残部の間の接続を形成することを確認した。
【００７７】
化合物６は、還元末端に、ＤＤ−ヘプタン、α−１，６−グルカン、および、三糖類ＤＤＨｅｐ−Ｆｕｃ−ａｎｈ−Ｍａｎ−ｏｌ（ＧｌｃＮ Ｌに由来するＮ−Ｍ−Ｌおよびａｎｈ−Ｍａｎ Ｌ）を含んでいた。この生成物のスペクトルはそれほど密集しておらず、（ＤＤＨｅｐ ＮのＨ−１とＨ−６の間のＴＯＣＳＹからの）ＤＤＨｅｐ ＮのＯ−６に対するα−１，６−グルカンの付着点を同定することが可能になった。分岐糖を全く示さなかったメチル化分析によって確認されるように、構造は直線的であった。予測された生成物はすべて、提案された構造に一致して同定された（表４）。
【００７８】
【表４】
【００７９】
ＤＤ−ヘプタン−α−１，６−グルカン領域の構造のさらなる確認が、化合物６の過ヨウ素酸酸化の結果から得られた。過ヨウ素酸酸化は２４時間、過度の０．１Ｍ ＮａｌＯ４で行なわれた。エチレングリコールを加え、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラムでのゲルクロマトグラフィーによって生成物を分離させた。それをＮａＢＤ４で還元し、脱塩し、２％ＡｃＯＨによって、１００°Ｃで３時間加水分解した。２つの主要な生成物７と８を得て、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラムでのゲルクロマトグラフィーによって分離した。
【００８０】
ＮａＢＤ４による酸化オリゴ糖の還元は、ＮＭＲスペクトル（ＡＰＴ−ＨＳＱＣ中のＣＨ２ＯＨ信号に対するＣＨＤＯＨ信号の反転位相）での酸化炭素の同定を可能にした。化合物７および８の構造は、ＮＭＲ分光法およびメチル化分析によって測定された。化合物７の形成は、ＤＤＨｅｐ Ｎが位置３では置換されなかったことを証明した。化合物６のメチル化が末端の３−および６−置換ＤＤ Ｈｅｐのみを示したため、化合物６のＮＭＲデータから提案されたように、ＤＤ−Ｈｅｐ Ｎは位置６で置換された。還元末端でグリセロール（Ｇｒｏ）を有する化合物８の形成は、酸化還元後にグリセロールを産生可能なオリゴ糖６の他の成分がなかったため、ＯＳ６中のＧｌｃ Ｖが位置６で次のＧｌｃ残基をグリコシル化したことを確認した。そのことは、同様に、末端グルコースの位置３でのα−１，６−グルカンの非還元末端へのＤＤ−ヘプタン部分の付着を証明した。
【００８１】
ＤＤ−ヘプタン領域のサイズを推定することができる。化合物８はＤＤ−ヘプトースに由来する４つのマンノース残基を含んでいた。化合物８のスペクトルはよく分解し、Ｈ−１信号の統合はほぼ等モルの比率を与え、４つのマンノース残基の存在を示した。したがって、化合物６の完全なＤＤ−ヘプタン領域は、ほとんど５つのＤＤ−ヘプトース単位からなり、そのうちのひとつ（末端）は、過ヨウ素酸酸化によって取り除かれた。この結論は質量分析法によって確認された。ピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎによって産生された主要なＬＰＳグリコフォームの構造が図３に示される。
【００８２】
（実施例５）：ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴ、および、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ複合体の調製および特徴付け
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および／または破傷風トキソイド（ＴＴ）に対する、ＬＰＳ−ＯＨ（実施例３を参照）およびｄＬＰＳ（実施例２を参照）のＫｄｏ結合複合体を調製した。
【００８３】
ＬＰＳ−ＯＨ（４７８９Ｄａの推定平均分子量に基づき、４ｍｇ、０．８μｍｏｌ）またはｄＬＰＳ（３７７９Ｄａの推定平均分子量に基づき、４ｍｇ、１μｍｏｌ）を、０．１Ｍ ＮａＣｌ（０．４ ｍＬ）を含む０．１Ｍ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸酸（ＭＥＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）緩衝液（ｐＨ ４．８）に溶解させた。１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ；３４．３８ｍｇ、１００：１モル比；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、その後、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（１５μＬ、１０３μｍｏｌ； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、その反応を２２°Ｃで４時間、ｐＨ ４．８で維持した。溶液をｐＨ ７．０に調節し、蒸留水に対して透析し、Ｍｉｃｒｏｓｅｐの遠心分離装置１，０００Ｄａ ｃｕｔｏｆｆ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ミシガン州）を用いて脱塩または凍結乾燥させた。
【００８４】
基本的に、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９８）によってオリゴ糖について記載されたように、共役手順を行った。手短に言えば、乾燥したＤＭＳＯ中で３−マレイミドプロピオン酸（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ；２ｍｇ、７．５μｍｏｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、スペーサーを含んでいるＬＰＳ−ＯＨ（２ｍｇ、０．４μｍｏｌ）またはｄＬＰＳ（２ｍｇ、０．５μｍｏｌ）を２２°Ｃで２４時間、反応させた。溶液を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥させた。
【００８５】
ＢＳＡの活性化のために、乾燥したＤＭＳＯ中で３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＴＳＰ；０．６３ｍｇ、１．６μｍｏｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、６ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度４ｍｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＭ ＰＢＳの緩衝液（ｐＨ ８．０）に事前に溶解しておいたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（分子量６６，３２０Ｄａ）（８ｍｇ、０．１２μｍｏｌ）の溶液に、Ｎ２雰囲気下で加えた。その混合物を２２°Ｃで２時間撹拌した。その後に、Ｎ２雰囲気下でジチオトレイトール（ＤＴＴ； ７．１２ｍｇ、４６μｍｏｌ； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、その混合物を４°Ｃで１時間撹拌した。再生セルロース細胞膜３０，０００Ｄａ ｃｕｔｏｆｆ（ＹＭ３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）全体の圧力源としてＮ２を用いて、撹拌した限外濾過細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州）中に５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ＰＢＳの緩衝液（ｐＨ７．２）に対して、結果として生じた溶液を４°Ｃで透析した。タンパク質とＳＨの含有量を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（ＢＣＡ；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）とＥｌｌｍａｎ（１９５９）方法によってそれぞれ測定した。２０−２２ＳＨ基のモル置換が得られた。
【００８６】
破傷風トキソイド（ＴＴ）（分子量、１５０，０００Ｄａ）の活性化のために、６ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度４ｍｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ８．０）中のＴＴ溶液（４ｍｇ、０．０３μｍｏｌ）に、Ｎ２雰囲気下で、乾燥したＤＭＳＯ（２５μＬ）中のＤＴＳＰ（０．３１６ｍｇ、０．８μｍｏｌ）を加え、その反応をＢＳＡについて上記したように処理を進めた。その後に、Ｎ２雰囲気下で、ジチオトレイトール（ＤＴＴ；３．５６ｍｇ、２３μｍｏｌ； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、その混合物を４°Ｃで１時間撹拌した。活性化したＴＴを、撹拌した限外濾過細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、再生セルロース細胞膜、１００，０００Ｄａ ｃｕｔｏｆｆ（ＹＭ１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にわたって、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ＰＢＳの緩衝液（ｐＨ７．２）に対して、４°Ｃで透析した。
【００８７】
５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）中のＢＳＡ−ＳＨ２１−２２またはＴＴ−ＳＨ２１−２２の溶液に、１０ｍＭ ＰＢＳの緩衝液中のマレイミド官能基を有するＬＰＳ−ＯＨまたはｄＬＰＳ誘導体の溶液を、Ｎ２雰囲気下で加えた。その反応物を４°Ｃで２４時間攪拌した。その後に、Ｎ−エチルマレイミド（１ｍｇ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。その反応を２２°Ｃで３０分間進め、結果として生じる複合体を、４°Ｃで４時間、１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）に対して透析し、０．２２μｍポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｋ、アイルランド）を用いて、フィルタを殺菌した。複合体は、その炭水化物とタンパク質含有量について、それぞれＬＰＳ−ＯＨまたはｄＬＰＳおよびＢＳＡを標準として、中性糖のためのフェノール硫酸方法（Ｄｕｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ、１９５６）、および、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて分析された。複合体の効率は、１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）で平衡に保たれたＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ １０／３００ ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ； Ａｇｉｌｅｎｔ １２００Ｓｅｒｉｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、ドイツ）によって確認された。クロマトグラフィーは、室温で、流速０．５ ｍＬ／分で行われた。溶出はダイオード・アレー検出器（ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２１０ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターされた。
【００８８】
スペーサーの存在は、ＣＨ２ＮＨ２基に対応する３．２２ｐｐｍでの新しい陽子共鳴の出現によって、１Ｈ−ＮＭＲ分光法で確認された。β−マレイミドプロピオネート（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）のＣＨ２αおよびＣＨ＝ＣＨ基にそれぞれ対応する２．５５ｐｐｍおよび６．９ｐｐｍでの陽子共鳴の存在によって確認されたように、スペーサー分子のアミン基が、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によってさらに誘導体化されたことで、マレイミド官能基を有するＬＰＳ−ＯＨまたはｄＬＰＳを得た。内殻のＬＤ−Ｈｅｐのホスホエタノールアミンの誘導体化は、化学量論量の試薬の使用により最小限に抑えられた。糖複合体は、担体タンパク質のチオ化（ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ）とチオ化したタンパク質のマレイミド官能基を有するＬＰＳ−ＯＨまたはｄＬＰＳへの追加によって得られた（図４）。共役の効率はＨＰＬＣによってモニターされた。得られた複合体はその炭水化物とタンパク質含有量について分析された。
【００８９】
３つの複合体におけるＴＴに対するＬＰＳ−ＯＨのモル比は、１０：１から２０：１まで及び、産出量は炭水化物含有量に基づいて１３％から２２％までで変動した（表５）。ＢＳＡまたはＴＴへのｄＬＰＳの共役は、著しく炭水化物含有量の多いｄＬＰＳ−ＢＳＡ−２、ｄＬＰＳ−ＴＴ、または、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ複合体を産出した（表５）。ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴとｄＬＰＳ−ＢＳＡまたはｄＬＰＳ−ＴＴの複合体の両方は、ＥＬＩＳＡによってα１，６−グルカンに特異的なｍＡｂと均等によく反応し、このことは、グルカンエピトープの形態が不変だったことを示唆している。
【００９０】
【表５】
【００９１】
（実施例６）：マウスとウサギにおける、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴの複合体、および、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ複合体の免疫原性
実施例５の複合体（ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴ、および、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ）の免疫性をマウスとウサギで試験した。
【００９２】
生後６−８週の５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、適切な複合体を用いて腹腔内で免疫化した。各々のマウスは、１回の注入当たり０．２ｍＬ Ｒｉｂｉアジュバント中の２μｇまたは１０μｇの炭水化物を受け取った。マウスを２１日目と４２日目にブーストして、血清を５１日目に末端の心臓穿刺（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｅａｒｔ Ｐｕｎｃｔｕｒｅ）から回収した。
【００９３】
３匹のニュージーランドホワイトウサギを、適切な複合体を用いて皮下で免疫化した。各々のウサギは、０．５ｍＬの不完全フロインドアジュバント中の１０μｇまたは５０μｇの炭水化物を受け取った。ウサギを２８日目と５６日目にブーストして、６５日目に失血後から回収した。
【００９４】
血清中の抗ＬＰＳ抗体のレベルは、精製されたＬＰＳを被膜抗原（１μｇ／ウェル）として用いるＥＬＩＳＡによって測定された。ＰＢＳで洗浄した後に、ＰＢＳまたはＭｉｌｋ希釈液／ブロッキング溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＭＤＢ）（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中の１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって、プレートを３７°Ｃで１時間ブロック（ｂｌｏｃｋ）した。希釈したマウスまたはウサギの免疫前後の血清を加え、プレートを３７°Ｃで２時間インキュベートした。阻害ＥＬＩＳＡについては、２６６９５ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎ ＬＰＳまたは２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳを阻害する一連の希釈物を、ＯＤ４５０＝０．６−０．８を与えたウサギ血清の事前に測定された希釈物と混合した。この混合物を２２°Ｃで１５分間インキュベートし、吸収したＬＰＳ抗原で遮断された元々のマイクロタイタープレートに移し、そこで３７°Ｃで２時間、さらにインキュベートした。この工程の後は、間接的なＥＬＩＳＡ処置に従った。手短にいえば、プレートをＰＢＳと第２抗体で洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭワサビダイコンペルオキシダーゼ複合体（Ｃａｌｔａｇ、Ｓｏ．サンフランシスコ、カリフォルニア州）を室温で１時間加えた。最終的な洗浄工程の後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジデン（ｂｅｎｚｉｄｅｎｅ）（ＴＭＢ）（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）基質を加え、１Ｍのリン酸で反応を止めた。マイクロタイタープレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を用いて、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００９５】
阻害割合を以下の式を用いて計算した。
％阻害＝１００×［（インヒビターを含むＯＤ−インヒビターを含まないＯＤ）／インヒビターを含まないＯＤ］
【００９６】
阻害対ログ濃度曲線が各インヒビターについてプロットされ、半最大阻害濃度（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＩＣ５０）に必要な濃度を、外挿曲線（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）から決定した。
【００９７】
反応は、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴ、または、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴのいずれかで免疫化した動物よりもＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴで免疫化したマウスとウサギの方で全般的に弱かったが、全ての複合体は、３度の注入後（表６乃至９）、ウサギとマウスの両方で同種（２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ）と対応する野生型（２６６９５）株からのＬＰＳに対するＩｇＧ反応を誘発した。ＬＰＳ−ＯＨ、ｄＬＰＳ、または、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）のいずれかと、タンパク質担体（アジュバントを有する）との混合物で免疫化した対照ウサギは、３度の免疫化後に、ピロリ菌の同族の菌株（２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株）、または、対応する野生型２６６９５菌株からのＬＰＳに対する特異的な反応は全くないか、低い値しか示さなかった。
【００９８】
【表６】
【００９９】
【表７】
【０１００】
【表８】
【０１０１】
【表９】
【０１０２】
交差反応性研究は、様々なＬＰＳ グリコタイプ （Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，２００１）を代表するピロリ菌株、および、選択された突然変異株からのＬＰＳに対して、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−２、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−３、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−４、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ−２、ｄＬＰＳ−ＴＴ、または、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）のいずれかで免疫化したウサギの免疫後血清を用いて行なわれた。結果を表１０、１１および１２で示す。
【０１０３】
【表１０】
【０１０４】
【表１１】
【０１０５】
【表１２】
【０１０６】
α１，６−グルカンを加えることができないピロリ菌株を代表するものである（Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）ＳＳ１およびＳＳ１ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳによって、弱い交差反応性しか得られなかったため、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−２、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−３、またはＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−４で免疫化したウサギから得た免疫後の血清の反応性は、α１，６−グルカンの存在の必要性を示した（表１０）。驚くことに、ｄＬＰＳ−ＴＴで免疫化したウサギから得た血清は同様に、任意の１，６−グルカンを含まなかった殻ＬＰＳエピトープ、即ち、株ＳＳ１、ＳＳ１ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ、Ｍ６およびＪ９９からのＬＰＳ（表１１）を認識し、これはより広い殻の認識を示し、おそらくはＴＴ担体タンパク質の存在により、ｄＬＰＳ−ＴＴ結合体がより免疫原性であったことを推測している（表１１）。あるいは、結合体が３のグリコフォームの混合物から調製されるように、免疫反応は他の主要でないＬＰＳ構成要素へと生成されていたかもしれない。このことは、観察された交差反応について説明する。
【０１０７】
ｄＬＰＳ−ＴＴ結合体によって誘発されるウサギ血清の結合特異性を調べるため、阻害ＥＬＩＳＡを、２つのグリコフォーム（およその比率１：１）、すなわち、線形の主鎖オリゴ糖構造および［ＧｌｃＮＡｃ，Ｆｕｃ］にキャッピングされた線形の主鎖オリゴ糖（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２００５）、ならびに、２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳからなる、精製された２６６９５ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎ ＬＰＳを用いて実行した。２６６９５ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎ ＬＰＳがインヒビターとして使用された時、株ＳＳ１、ＳＳ１ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＨＰ０１５９：：ＫａｎおよびＳＳ１ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎからのグルカン−陰性ＬＰＳへのウサギ血清の結合（図６）が有意に阻害され、その一方で、２６６９５ ＬＰＳがコーティング抗原（図６）として使用された時、２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳが最も効果的なインヒビターであった。
【０１０８】
異種の分類可能な株および分類不可能な株を認識する、ウサギの免疫後血清の能力も同様に、ピロリ菌の分類可能な株および分類不可能な株両方のピロリ菌代表物（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｓ）の選択された臨床分離株に対する細胞全体の間接的ＥＬＩＳＡ（ＷＣＥ）において確認された。細胞全体の間接的ＥＬＩＳＡ（ＷＣＥ）を、前述に記載の通りに実行した（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。手短に言えば、マイクロタイタープレートのウェル（ｗｅｌｌ）を、４°Ｃで一晩中、１０８細胞／ｍＬで、１００μＬの細菌懸濁液で覆った。その後、ウェルをメタノールで固定し、３７°Ｃで２時間、２００μＬのＭｉｌｋ希釈液／ブロッキング溶液（ＭＤＢ）（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）でブロックした。続いて、ＭＤＢ中で１：５００に希釈した１００μＬの１Ｃ４Ｆ９腹水を用いて、ウェルを３７°Ｃで２時間インキュベートし、その後、ＭＤＢ中で１：１，０００に希釈した抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｃａｌｔａｇ）を用いて、室温で１時間インキュベートした。間接的ＥＬＩＳＡに関して記載されるように、基質ＴＭＢを加えた。非特異性のバックグラウンド値を、細菌細胞、第２の抗体結合体および基質を含む、陰性対照のウェルのＯＤ４５０として決定した。これらＯＤ４５０値は≦０．２であった。ＯＤ４５０＜０．２の光学的濃度値を、陰性反応として分類し、ＯＤ４５０値≧０．２を陽性反応として分類した。プレート間の一貫性を保証するために、ピロリ菌株２６６９５細胞を陽性対照として使用した。アッセイは１０％以上は変わらなかった。
【０１０９】
ｄＬＰＳ−ＴＴ複合体で免疫化したウサギ由来の血清が、細胞全体の間接的ＥＬＩＳＡを使用して試験されたすべての株（表１３）に対し、もっとも強い交差反応性を示した。
【０１１０】
表１３：ピロリ菌の臨床分離株に対する細胞全体の間接的ＥＬＩＳＡｂにおけるウサギの免疫後血清ａの交差反応性。
【０１１１】
【表１３】
【０１１２】
（実施例７：ウサギ抗血清の殺菌力）
ワクチン接種前またはワクチン接種後のウサギの血清（実施例６）を使用して、殺菌アッセイを行なった。
【０１１３】
プレートで増殖した（Ｐｌａｔｅ−ｇｒｏｗｎ）ピロリ菌細胞を採取し、プレート１枚当たり５ｍＬのＰＢＳで洗浄した。遠心分離の後、ペレットを２５ｍＬのＰＢＳ中に懸濁した。最終的な細菌懸濁液を、４ｘ１０６ ＣＦＵ／ｍＬでダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ニューヨーク）内で希釈した。殺菌アッセイを、平底のマイクロタイタープレート（ＩＣＮ）内で行なった。補体除去した（ｄｅ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）免疫前または免疫後の血清（５０μＬ）の１０倍の連続希釈物を、各々のウェルに加えた。その後、細菌懸濁液（２５μＬ）を加え、３７°Ｃで１５分間プレインキュベートした。仔ウサギの補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｒｎｂｙ，ＯＮ）を１：５０に希釈し、２５μＬを適切なウェルに加えた。プレートを３７°Ｃで４５分間インキュベートし、次に、氷の上に置いた。１０μＬのアリコートを、コロンビア血液寒天（Ｃｏｌｕｍｂｉａ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ）上で３回播種し、４日間増殖させ、その後プレートを数えて、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を測定した。バクテリアと補体を含むが血清を含まない対照プレートを使用し、死滅率（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｋｉｌｌｉｎｇ）を計算した。殺菌力は、５０％を死滅させた血清のもっとも高い希釈として決定した。
【０１１４】
ワクチン接種前の血清またはタンパク質担体とＬＰＳ−ＯＨ、ｄＬＰＳまたはｄＬＰＳ（ＰＪ２）のいずれかとの混合物（アジュバントを有する）により免疫化されたウサギから得た血清は、同種のピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎまたは野生型の２６６９５菌株に対する殺菌力を示さないか、または、それらに対する低レベルの殺菌力を示した。ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−４、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ−２、ｄＬＰＳ−ＴＴおよびｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴで免疫化したウサギから得た免疫後血清は、２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株および対応する野生型菌株の両方に対し、有意で機能的な活性を示し（表１４）、ｄＬＰＳ−ＴＴ結合体で免疫化したウサギからのワクチン接種後の血清は、野生型菌株２６６９５に対してもっとも高い機能的な活性を示した（表１４）。
【０１１５】
【表１４】
【０１１６】
更に、ウサギ血清の殺菌力も同様に、ピロリ菌の選択された臨床分離株、すなわち、００２ＣＬ、０１５３ＣＬおよび０５８ＣＬに対して試験した（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。これら分離株を、抗−α１，６−グルカンｍＡｂｓを用いるＷＣＥアッセイにおけるそのＯＤ４５０値に基づき、高度、中度および低度の結合剤の代表物として選択した：株００２ＣＬ−Ｏ４５０ １．３６１、高度の結合剤；株１５３ＣＬ−ＯＤ４５０ ０．２９、中度の結合剤；および株０５８ＣＬ−ＯＤ４５０ ０．１６２、低度の結合剤である。ｄＬＰＳ−ＴＴまたはｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ複合体のいずれかで免疫化したウサギからの免疫後血清のみが、試験された３つの臨床分離株により機能的な活性を示したことを強調することが重要である（表１５）。
【０１１７】
【表１５】
【０１１８】
（実施例８：マウスにおけるｄＬＰＳ−ＴＴ複合体による防御試験）
候補ワクチンとしてのｄＬＰＳ−ＴＴ複合体の潜在性を、非近交系のＣＤ−１マウスにて評価した。
【０１１９】
１μｇ／マウスのコレラ毒素（ＣＴ；Ｓｉｇｍａ）で補助された２５μｇ／マウスのｄＬＰＳ−ＴＴ複合体、１ｍｇ／マウスのコレラ毒素で補助された３１．５μｇ／マウスのＰＪ２細胞を含まない音波処理物（ＰＪ２ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｏｎｉｃａｔｅ）（対照）、または食塩水（対照）を、グループ５のマウスに、週１回の間隔で４度、鼻腔内にワクチン接種した。最後の免疫の１週間後、血清、糞および膣の洗浄サンプルを、ピロリ菌特異的ＩｇＧおよびＩｇＡのために採取し、分析した。血清ＩｇＧおよび血清、糞および膣のＩｇＡ抗体レベルを、標準のＥＬＩＳＡによって測定した。プレートを本明細書に記載の通り、１μｇ／ウェルのピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳで覆った。血清サンプルを、ＩｇＧアッセイのため１：１００に希釈し、ＩｇＡアッセイのため１：５０に希釈した。糞のサンプルを１：２に希釈し、膣のサンプルを１：２０に希釈した。ピロリ菌特異的抗体レベルを決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０を使用して、マン・ホイットニー検定によってデータを分析した。
【０１２０】
最初の免疫の５週間後、〜１０８ ｃｆｕピロリ菌株ＰＪ２を一日おきに３回、マウスに経口的に強制投与した（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。４週間後に、マウスを殺し、胃からのその一般細菌を数え、ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０を使用して、マン・ホイットニー検定によってデータを分析した。
【０１２１】
ＣＴに加えてｄＬＰＳ−ＴＴ複合体による鼻腔内の免疫化は、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、非常に強力なピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ特異的ＩｇＧ反応を誘発し、中度のピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ特異血清ＩｇＡも同様に検出された（表１６および１７、図７）。加えて、膣または糞のサンプルにおけるピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ特異的反応も同様に検知した（ｐ＜０．０１）（表１７、図７）。
【０１２２】
【表１６】
【０１２３】
【表１７】
【０１２４】
長いα１，６−グルカンを含有すると以前に示された分類不可能なピロリ菌マウス−コロニー形成株（ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ）ＰＪ２を、全てのマウスのグループにその後経口胃（ｏｒｏｇａｓｔｒｉｃａｌｌｙ）接種した（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。防御は、対照グループと比較して、ワクチン接種したグループにおける細菌の負荷の統計的に有意な減少として定義される。ＣＴを加えたｄＬＰＳ−ＴＴ複合体により鼻腔内で免疫化したマウスのグループに関するコロニー形成のデータは、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）（図８）。さらに、これらのデータは、ピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ特異血清ＩｇＡ反応が、単独では細菌負荷に対する防御に十分ではないということ、および、ＬＰＳ特異血清ＩｇＧ反応も同様に、防御の増加に寄付するということを示唆する。
【０１２５】
〈実施例９：デキストラン−ＢＳＡ複合体および免疫原性の調製および特性付け並びに機能的な活性の研究〉
２５０μＬの０．２Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中に、１０ｍｇのデキストランＴ５（ＭＷ ５ ＫＤａ，Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ Ａ／Ｓ，Ｈｏｌｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を溶解させることにより、デキストラン−ＢＳＡ複合体を調製した。これを、０．２Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中の１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（２５ｍＬ）およびシアノヒドリドほう酸ナトリウム（１０ｍｇ）を含む溶液（２５０μｌ）に加えた（「Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４」に記載の通り）。反応を５５°Ｃで５日間行なった。ＬＰＳベースの複合体の調製に関して上述されたように、反応生成物を精製した。
【０１２６】
この反応はスペーサーの導入をもたらす。ＬＰＳベースの複合体に関して記載されるように、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によって、スペーサー分子のアミン基をさらに誘導体化した（実施例５を参照）。担体タンパク質のチオール化とマレイミドにより官能化されたデキストランＴ５のチオール化したタンパク質の付加とによって、糖複合体を得た。複合体においてＢＳＡに対するデキストランのモル比は２０：１であり、収量は炭水化物含有量に基づき、３２％であった。
【０１２７】
様々なＬＰＳグリコ型（ｇｌｙｃｏｔｙｐｅｓ）のピロリ菌代表物および選択された突然変異株からのＬＰＳに対するデキストラン−ＢＳＡにより免疫化されたウサギの免疫後血清を用いて、交差反応性研究を行なった（表１８）。
【０１２８】
【表１８】
【０１２９】
交差反応性がグルカン−陰性株ＳＳ１およびＳＳ１ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎにより得られなかったため、デキストラン−ＢＳＡにより免疫化されたウサギから得た免疫後血清の反応は、α１，６−グルカンが存在するための必要条件を表した。デキストラン−ＢＳＡにより免疫化したウサギから得た免疫後血清は、２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株および対応する野生型菌株の両方に対する機能的な活性を示した（表１９）。
【０１３０】
【表１９】
【０１３１】
異種の分類可能な株および分類不可能な株を認識し、殺菌性の抗体を誘発するといったウサギの免疫後血清の能力は、α１，６−結合グルコース反復単位の線形な主鎖を含むポリマーであるデキストランからなる複合体、または、連続するα１，６−結合グルコースの残基からなる最適化された線形のオリゴ糖を含む複合体からなる複合体、および、適切なタンパク質が、ピロリ菌感染に対する防御を与えるのに十分であるという可能性を示す。
【０１３２】
（実施例１０：抗グルカンｍＡｂｓの特異性の研究）
ピロリ菌株Ｏ：３ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎに対して特異的なモノクローナル抗体を生成し、その特異性を研究した。
【０１３３】
前に記載されたように、ハイブリドーマを生成した（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。８２日にわたって５度、ピロリ菌株Ｏ：３ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎの１０８細胞（２００μＬ）ホルマリン固定化細胞を、６匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ）に腹腔内に（ｉ．ｐ．）注入することで、有意な滴定濃度を達成した。最後の静脈内（ｉ．ｖ．）注入を行い、続いて３日後に融合させた。Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）に従い、２匹のマウスの脾臓細胞をＳｐ２／Ｏプラズマ細胞腫細胞株と融合した。３６８のウェルからの最初の融合の上澄みを、間接的な酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって選別した。
【０１３４】
ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマの選別に関して、マイクロタイタープレート（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）を、３７°Ｃで３時間、５０ｍＭの炭酸塩バッファー（ｐＨ９．８）中の１０μｇ／ｍＬの対応するピロリ菌Ｏ：３ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳで覆った。ＰＢＳでの洗浄後、プレートをＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。使い切った上澄みを加え、プレートを室温で３時間インキュベートした。プレートをＰＢＳと第２抗体で洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（Ｃａｌｔａｇ，Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を室温で１時間加えた。最後の洗浄の工程後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジデン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｅｎｅ）（ＴＭＢ）（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）基質を加え、反応を１Ｍのリン酸を用いて止めた。マイクロタイタープレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を使用し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。この工程の後に、実施例６に記載の通り、間接的ＥＬＩＳＡ手順を続けた。
【０１３５】
制限のある希釈クローニング（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）に従って、安定した２つのハイブリドーマを得た。１つのクローン、１Ｃ４Ｆ９、ＩｇＭを、さらなる特徴付けのために選択した。腹水はＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて上昇し、製造業者のプロトコルに従って、ＩｇＭ−特異的アフィニティカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用し、１Ｃ４Ｆ９モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を腹水から精製した。
【０１３６】
グルカンに特異的な抗体の特異性に関する研究は、連続するα１，６−結合グルコースの残基Ｇｌｃ→［α（１→６）Ｇｌｃ］ｎ＝１−６および選択的な精製されたピロリ菌ＬＰＳからなる、一連の線形のオリゴ糖を用いて行われた。阻害ＥＬＩＳＡに関して、イソマルト系（ｉｓｏｍａｌｔｏ−ｓｅｒｉｅｓ）［Ｇｌｃα１→（６Ｇｌｃα１→）ｎ＝１−６］（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＳ）またはピロリ菌２６６９５、Ｏ：３およびＰＪ２ ＬＰＳインヒビターからの線形のα１，６−結合グルコースを含むオリゴ糖の一連の希釈物を調製して、ＯＤ４５０＝１を与えた精製１Ｃ４Ｆ９の以前に調製された希釈物と混合した。インキュベーション（２２°Ｃ、１５分）の後、この混合物を３７°Ｃでもう２時間インキュベートした場合、吸着したＬＰＳ抗原を含む最初のブロックされたマイクロタイタープレートに混合物を移動させた。この工程の後、実施例６に記載の通り、間接的ＥＬＩＳＡの手順を続けた。阻害の割合を、以下の式を使用して計算した：
【０１３７】
％阻害＝１００ｘ［（インヒビターを含むＯＤ−インヒビターを含まないＯＤ）／インヒビターを含まないＯＤ］
【０１３８】
阻害対ログの濃度の曲線を各々のインヒビターに関してプロットし、半分の最大阻害濃度に必要な濃度（ＩＣ５０）を外挿曲線から決定した。
【０１３９】
イソマルトヘキサオース（ｎ＝５）およびイソマルトヘプタオース（ｉｓｏｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ）（ｎ＝６）を使用すると、阻害特性が最適化した（表２０）。グルカン鎖（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）に平均で６から８の残基を含むと以前に示されたピロリ菌ＰＪ２ ＬＰＳは、最も有効なインヒビターであった（表２０）。
【０１４０】
【表２０】
【０１４１】
（実施例１１：抗グルカンｍＡｂｓを使用する接触性の研究（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｙ）および殺菌アッセイ）
抗グルカンｍＡｂｓは、間接型のＩＦ顕微鏡観察法研究によって実証されるように、代表的なピロリ菌株から生存する細菌の表面に容易に接触可能であった（表２１）。α１，６−グルカンおよびＣａｇＡの両方を、細菌の表面上で同時に識別する。
【０１４２】
モノクローナル抗体の殺菌力を決定するために、補体除去された腹水（５０μＬ）からの１Ｃ４Ｆ９ ｍＡｂの１０倍の連続希釈物を各々のウェルに加え、その後、細菌懸濁液（２５μＬ）を加え、３７°Ｃで１５分間プレインキュベートした。この工程の後、実施例７に記載の通り、手順を続けた。１Ｃ４Ｆ９の細胞表面結合は、ピロリ菌の野生株および変異株に対する殺菌アッセイによって測定されるように、機能的な活性と相互に関連付けられた（表２１）。
【０１４３】
【表２１】
【０１４４】
本発明の好ましい実施形態が上述された一方で、様々な修正がその中で行われること、添付の請求項が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、全てのそのような修正を含むことを意図していることを認識し、かつ理解されたい。
【０１４５】
（引用文）
すべての特許、特許出願および出版物は、本明細書を指し、本明細書により出願の全体にわたって引用文に組み込まれる。
Ａｌｔｍａｎ Ｅ， Ｃｈａｎｄａｎ Ｖ， Ｌａｒｏｃｑｕｅ Ｓ， Ａｕｂｒｙ Ａ， Ｌｏｇａｎ ＳＭ， Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ Ｅ， Ｌｉ Ｊ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ＨＰ０１５９ ＯＲＦ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ． ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００８； ５３： ２０４−２１３．
Ａｌｔｍａｎ Ｅ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｈ， Ｃｈａｎｄａｎ Ｖ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＢＡ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ Ｍ， Ｏｔｔｈ Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ Ｌ， Ｔｏｌｅｄｏ Ｃ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｌｅ： ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｙｐｅ １ Ｌｅｗｉｓ ｂ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ． Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００８； ５７： ５８５−５９１．
Ａｌｔｍａｎ Ｅ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＢＡ， Ｈｉｒａｍａ Ｔ， Ｃｈａｎｄａｎ Ｖ， Ｔｏ Ｒ， ＭａｃＫｅｎｚｉｅ Ｒ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ Ｌｅｘ ａｎｄ Ｌｅｙ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００５； ８３： ５８９−５９６．
Ａｌｔｍａｎ Ｅ， Ｓｍｉｒｎｏｖａ Ｎ， Ｌｉ Ｊ， Ａｕｂｒｙ Ａ， Ｌｏｇａｎ ＳＭ． Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｎｏｎｔｙｐａｂｌｅ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｓｔｒａｉｎ ｌａｃｋｉｎｇ Ｌｅｗｉｓ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ Ｏ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ＤＤ−ｈｅｐｔｏｇｌｙｃａｎ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ａｌｐｈａ１，６−ｇｌｕｃａｎ ｉｎ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００３； １３： ７７７−７８３．
Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＰＷ， Ｐｉｃｈｉｃｈｅｒｏ ＭＥ， Ｉｎｓｅｌ ＲＡ， Ｂｅｔｔｓ Ｒ， Ｅｂｙ Ｒ， Ｓｍｉｔｈ ＤＨ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｃｌｅａｖｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃａｐｓｕｌｅ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｒｒｉｅｒ： ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐｒｉｍｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｆａｎｔ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８６； １３７： １１８１−１１８６．
Ａｎｇｅｌａｋｏｐｏｕｌｏｓ Ｈ， Ｈｏｈｍａｎｎ ＥＬ． Ｐｉｌｏｔ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ−ｄｅｌｅｔｅｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｕｒｅａｓｅ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０００； ６８： ２１３５−２１４１．
Ａｐｐｅｌｍｅｌｋ ＢＪ， Ｓｉｍｍｏｎｓ−Ｓｍｉｔ Ｌ， Ｎｅｇｒｉｎｉ Ｒ， Ｍｏｒａｎ ＡＰ， Ａｓｐｉｎａｌｌ ＧＯ， Ｆｏｒｔｅ ＪＧ ｅｔ ａｌ． Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｍｉｃｒｙ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ ｈｏｓｔ Ｌｅｗｉｓ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９６； ６４： ２０３１−２０４０．
Ｂｒｉｓｓｏｎ Ｊ−Ｒ， Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｅ， Ｕｈｒｉｎ Ｄ， Ｋｈｉｅｕ ＮＨ， Ｐｅｒｒｙ ＭＢ， Ｓｅｖｅｒｎ ＷＢ， Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＣ． Ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ （Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ） ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ａ１ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ Ｌ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｍａｎｎｏ− ａｎｄ Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｍａｎｎｏ−ｈｅｐｔｏｓｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ． Ｃａｎ Ｊ Ｃｈｅｍ ２００２； ８０： ９４９−９６３．
Ｃａｓｔｉｌｌｏ−Ｒｏｊａｓ Ｇ， Ｍａｚａｒｉ−Ｈｉｒｉａｒｔ Ｍ ＆ Ｌｏｐｅｚ−Ｖｉｄａｌ Ｙ （２００４）． Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ： ｆｏｃｕｓ ｏｎ ＣａｇＡ ａｎｄ ＶａｃＡ ｍａｊｏｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｓａｌｕｄ ｐｕｂｌｉｃａ ｄｅ Ｍｅｘｉｃｏ ４６： ５３８−５４８．
Ｃｈａｎｄａｎ Ｖ， Ｌｏｇａｎ ＳＭ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＢＡ， Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ Ｅ， Ａｕｂｒｙ Ａ， Ｓｔｕｐａｋ Ｊ， Ｌｉ Ｊ， Ａｌｔｍａｎ， Ｅ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｗａａＦ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｓｔｒａｉｎｓ ２６６９５ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ａｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｈａｓ ａ ｌｉｍｉｔｅｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００７； ８５： ５８２−５９０．
Ｃｈｕ Ｃ， Ｌｉｕ Ｂ， Ｗａｔｓｏｎ Ｄ， Ｓｚｕ Ｓ， Ｂｒｙｌａ Ｄ， Ｓｈｉｌｏａｃｈ Ｊ， Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ Ｒ， Ｒｏｂｂｉｎｓ ＪＢ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｆ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ ｔｙｐｅ １ （Ｓｈｉｇａ’ｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ） ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｏｉｄ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９１； ５９： ４４５０−４４５８．
Ｃｉｕｃａｎｕ Ｉ， Ｋｅｒｅｋ Ｆ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ ２００４； １３１： ２０９−２１７．
Ｃｉｕｃａｎｕ Ｉ， Ｋｅｒｅｋ， Ｆ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ ２００４， １３１： ２０９−２１７．
Ｃｏｘ ＡＤ， Ｚｏｕ Ｗ， Ｇｉｄｎｅｙ ＭＡＪ， Ｌａｃｅｌｌｅ Ｓ， Ｐｌｅｓｔｅｄ ＪＳ， Ｍａｋｅｐｅａｃｅ Ｋ， Ｗｒｉｇｈｔ ＪＣ， Ｃｏｕｌｌ ＰＡ， Ｍｏｘｏｎ ＥＲ， Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＣ． Ｃａｎｄｉｄａｃｙ ｏｆ ＬＰＳ−ｂａｓｅｄ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２００５； ２３： ５０４５−５０５４．
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Ｐａｓｓｗｅｌｌ ＪＨ， Ａｓｈｋｅｎａｚｉ Ｓ， Ｈａｒｌｅｖ Ｅ， Ｍｉｒｏｎ Ｄ， Ｒａｍｏｎ Ｒ， Ｆａｒｚａｍ Ｎ， Ｌｅｒｎｅｒ−Ｇｅｖａ Ｌ， Ｌｅｖｉ Ｙ， Ｃｈｕ Ｃ， Ｓｈｉｌｏａｃｈ Ｊ， Ｒｏｂｂｉｎｓ ＪＢ， Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ Ｒ， Ｉｓｒａｅｌ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ． Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ−ＣＲＭ９ ａｎｄ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｔｙｐｅ ２ａ−ｒＥＰＡｓｕｃｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｏｎｅ− ｔｏ ｆｏｕｒ−ｙｅａｒ ｏｌｄ ｃｈｉｌｄｒｅｎ． Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ ２００３； ２２： ７０１−７０６．
Ｐａｓｓｗｅｌｌ ＪＨ， Ｈａｒｌｅｖ Ｅ， Ａｓｈｋｅｎａｚｉ Ｓ， Ｃｈｕ Ｃ， Ｍｉｒｏｎ Ｄ， Ｒａｍｏｎ Ｒ， Ｆａｒｚａｎ Ｎ， Ｓｈｉｌｏａｃｈ Ｊ， Ｂｒｙｌａ ＤＡ， Ｍａｊａｄｌｙ Ｆ， Ｒｏｂｅｒｓｏｎ Ｒ， Ｒｏｂｂｉｎｓ ＪＢ， Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ Ｒ． Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｉｎ Ｉｓｒａｅｌ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０００； ６９： １３５１−１３５７．
Ｐｏｎ ＲＡ， Ｌｕｓｓｉｅｒ Ｍ， Ｙａｎｇ Ｑ−Ｌ， Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ＨＪ． Ｎ−Ｐｒｏｐｉｏｎｙｌａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ Ｂ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｍｉｍｉｃｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｃａｐｓｕｌａｒ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９７； １８５： １９２９−１９３８．
Ｒｏｓｓｉ Ｇ， Ｒｕｇｇｉｅｒｏ Ｐ， Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉ Ｓ， Ｐａｎｃｏｔｔｏ Ｌ， Ｆｏｒｔｕｎａ Ｄ， Ｌａｕｒｅｔｔｉ Ｌ， Ｖｏｌｐｉｎｉ Ｇ， Ｍａｎｃｉａｎｔｉ Ｓ， Ｃｏｒａｚｚａ Ｍ， Ｔａｃｃｉｎｉ Ｅ， Ｄｉ Ｐｉｓａ Ｆ， Ｒａｐｐｕｏｌｉ Ｒ， Ｄｅｌ Ｇｉｕｄｉｃｅ Ｇ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｎ ｔｈｅ ｂｅａｇｌｅ ｄｏｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ： ｓａｆｅｔｙ， ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ， ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２００４； ７２： ３２５２−３２５９．
Ｒｏｙ， Ｒ．， Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ， Ｅ．， ａｎｄ Ｊｅｎｎｉｎｇｓ， Ｈ．Ｊ． １９８４． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ａｍｉｎａｔｉｏｎ． Ｃａｎ Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２， ２７０−２７５．
Ｒｕｇｇｉｅｒｏ Ｐ， Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉ Ｓ， Ｒａｐｐｕｏｌｉ Ｒ， Ｄｅｌ Ｇｉｕｄｉｃｅ Ｇ． Ｔｈｅ ｑｕｅｓｔ ｆｏｒ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ： ｈｏｗ ｔｏ ｍｏｖｅ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｔｏ ｍａｎ？ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ２００３； ５： ７４９−７５６．
Ｓａｗａｒｄｅｋｅｒ ＪＨ， Ｓｌｏｎｅｋｅｒ ＪＨ， Ｊｅａｎｎｅｓ Ａ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｓ ｔｈｅｉｒ ａｌｄｉｔｏｌ ａｃｅｔａｔｅｓ ｂｙ ｇａｓ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ １９６７； ３９： １６０２−１６０４．
Ｗｅｓｔｐｈａｌ， Ｏ Ｊａｎｎ Ｋ． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ． Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｏｌ−ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ． Ｍｅｔｈ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｃｈｅｍ １９６５； ５： ８３−９１．
Ｗｉｒｔｈ ＨＰ， Ｙａｎｇ Ｍ， Ｋａｒｉｔａ Ｍ， Ｂｌａｓｅｒ ＭＪ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｌｅｗｉｓ Ｘ ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ Ｙ ｂｙ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｃａｇＡ ｓｔａｔｕｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９６； ６４： ４５９８−４６０５．
Ｙｏｋｏｔａ， Ｓ．， Ａｍａｎｏ， Ｋ．， Ｆｕｊｉｉ， Ｎ．， Ｙｏｋｏｃｈｉ， Ｔ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒｓ ｔｏ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ， ＣａｇＡ， ＶａｃＡ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｉｎ ａ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２０００； １８５： １９３−１９８．
Ｙｕ Ｓ， Ｇｕ Ｘ−Ｘ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｃ Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２００７； ７５： ２９７４−２９８０．
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
（先願の情報）
本出願は、２００９年７月３１日に出願され米国仮特許出願第６１／２３０，３１５号の利益を主張し、その全体は引用によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は新しいヘリコバクター・ピロリＬＰＳ外殻エピトープに関する。より具体的には、本発明は、新しいピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）外殻エピトープ、その合成、特徴づけ、および、複合体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリは、ヒトの慢性胃炎、消化性潰瘍、および、胃癌に関連する最も一般的な細菌感染と認められる。ピロリ菌感染は、世界の人口の約半分に蔓延していると推測され、開発途上国では７０％、先進工業国では２０−３０％にまで達している（Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。大部分の人は小児期にピロリ菌にかかり、開発途上国の子供の間での感染の有病率は、社会経済的地位の低さと衛生状態の悪さに関連している（Ｃａｓｔｉｌｌｏ−Ｒｏｊａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。ピロリ菌は胃癌の相対リスクを少なくとも６倍増加させるため、世界保健機構（ＷＨＯ）によってクラスＩの発癌物質であると確認されている。胃癌は世界で２番目に多い死亡原因であり、毎年７００，０００人が死亡している（Ｐａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。
【０００４】
ピロリ菌の現在の根絶方策はプロトンポンプインヒビターと抗生物質の使用に基づいている。しかしながら、化学療法の介入治療の有効性は、ピロリ菌分離物中の抗生物質耐性の頻度、および、再感染に対する免疫の欠如によって限定されてしまう。したがって、ピロリ菌感染の予防および根絶のためのグローバルな戦略を提供するために新しい治療が必要である。
【０００５】
近年の調査がピロリ菌の病因におけるタンパク成分の役割と、防御免疫にタンパク質成分の役割に焦点が当てられている一方で、ワクチン製剤中にタンパク質以外の抗原を含めるという可能性を探った研究は比較的少ない。例えば、多糖類に基づいた複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ワクチンは、全身感染を防ぎ、宿主のコロニー形成を阻害することが知られている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６； Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｐｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７； Ｐａｓｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１； Ｐａｓｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）。腸内病原菌の近年の研究は、人間に使用するための候補ワクチンとして、ＬＰＳ複合体に基づいた手法を検査している（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６； Ｍｉｅｓｚａｌａ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００５； Ｙｕ ａｎｄ Ｇｕ， ２００７）。リポ多糖類（ＬＰＳ）はピロリ菌の主要な細胞表面成分である。多くのピロリ菌で行なわれた構造研究（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ， ２００１）は、Ｏ鎖と、脂質Ａ部分に付けられたコアオリゴ糖とからなるＬＰＳの構造モデルをもたらした。ほとんどのピロリ菌株のＯ鎖多糖類骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）の構造は独特で、ヒト胃細胞と腫瘍細胞の細胞表面にある決定因子を模倣するＩＩ型および／またはＩ型のルイス（Ｌｅ）式血液型決定因子を表示し（Ｗｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、これらは、萎縮性胃炎につながる有害な自己免疫反応に関与していることもある（Ａｐｐｅｌｍｅｌｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。加えて、ピロリ菌ＬＰＳの分離外殻領域は、２つの異常な高分子成分：ＤＤ−ヘプトグリカン、および、α１，６−グルカンを含む（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ， ２００１）。外殻領域ピロリ菌ＬＰＳ分離株中のα１，６−グルカンポリマーは、ＨＰ０１５９オープンリーディングフレームの生成物によって合成される。ピロリ菌中でのＨＰ０１５９遺伝子の存在および発現は一般的である。
【０００６】
多くのピロリ菌ＬＰＳ生合成遺伝子が特徴付けられ、病因とコロニー形成におけるそれらの役割が測定されてきた（Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｈｉｒａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｃｈａｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。ピロリ菌ＨＰ０８２６変異株が構築され、この変異が、Ｌｅ抗原を欠いた、切断されたＬＰＳの形成をもたらすことが実証された。しかしながら、ＬＰＳの構造の十分な特徴づけは達成されなかった。
【０００７】
当該技術分野での進展にもかかわらず、ピロリ菌の複数のタイプにわたって有効な免疫原性エピトープは捉えがたいままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は新しいヘリコバクター・ピロリＬＰＳ外殻エピトープに関する。より具体的には、本発明は、新しいピロリ菌外殻エピトープ、その合成、特徴づけ、および、複合体に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は式Ｉの構造を含む、α１，６−グルカンを含むヘリコバクター・ピロリ化合物を提供し、
【００１０】
【化１】
【００１１】
Ｒは、α１，３−ＤＤ−ヘプタンに結合したα１，６−グルカンで置換したα−ＤＤＨｅｐ−３−α−Ｌ−Ｆｕｃ−３−β−ＧｌｃＮＡｃ三糖類であり、α１，３−ＤＤ−ヘプタンの最後のＤＤ−Ｈｅｐ残基は、β−ＧｌｃＮＡｃ残基でキャッピングされる。記載されたような化合物において、α１，６−グルカンは、約３から約１２のα１，６−結合グルコース残基を含み、α１，３−ＤＤ−ヘプタンは、約２から約６のα１，３−結合ヘプトース残基を含んでもよい。
【００１２】
上記の化合物のＲ基は、以下のとおりであってもよい。
【００１３】
【化２】
【００１４】
ここで、β−ＧｌｃＮＡｃ残基Ｌは、Ｈｅｐ ＧのＯ−２に結合する。記載されたような化合物では、グルカンの残基ＱおよびＺは、α１，６−結合グルコース残基であり、ｎは約１乃至１１の間の任意の値であってもよく、残基Ｔ、ＹおよびＸは、α１，３−結合ヘプトース残基であり、ｍは約０から４の間の任意の値であってもよい。
【００１５】
上記のような化合物は、ピロリ菌株ＨＰ０８２６：：Ｋａｎから分離されるか、または、精製される。
【００１６】
上記のような化合物では、式Ｉの構造は、Ｋｄｏ残基Ｃに共有結合している脂質Ａ部分をさらに含んでもよい。脂質Ａ分子は、Ｏ−脱アシル化するか、または、Ｋｄｏ残基のケトシド結合の加水分解によって開裂する。
【００１７】
本発明は同様に、リンカー分子、タンパク質担体、または、その組み合わせに共役した、ほぼ線形のα１，６−グルカンを含む化合物を含む複合体を提供する。ほぼ線形のα１，６−グルカンを含む化合物は、本明細書に記載の化合物であり、ここで、式Ｉの構造は、リンカー分子、タンパク質担体、またはその組み合わせに共役される。ほぼ線形のα１，６−グルカンを含む化合物は、代替的に、デキストランＴ５などのデキストランであってもよい。タンパク質担体は、破傷風トキソイドまたはウシ血清アルブミンであってもよい。
【００１８】
本発明は、上記のように、１つ以上の化合物または複合体を含む組成物も含む。
【００１９】
本発明は、上記のようにα１，６−グルカンのエピトープを含む化合物に対する抗体をさらに含む。抗体はモノクローナル抗体１Ｃ４Ｆ９であってもよい。本発明はハイブリドーマ細胞株１Ｃ４Ｆ９をさらに包含し、これはモノクローナル抗体１Ｃ４Ｆ９を作り出す。
【００２０】
上記のモノクローナル抗体は、そのような処置を必要としている個体において、α１，６−グルカンを発現するピロリ菌株の補体を媒介とした溶菌を引き起こすために利用されてもよい。
【００２１】
本発明は、同様に、個体内でのピロリ菌に対する免疫反応を誘発するために、上記の有効な量の組成物の使用を提供する。組成物中の化合物は適切な担体タンパク質に共役され、さらに、組成物中の化合物は、リポ多糖類の２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸（Ｋｄｏ）を介して、適切な担体タンパク質に共役してもよい。
【００２２】
本発明は、本明細書に記載の免疫原性の組成物で哺乳動物を免疫化することによって作られた免疫抗血清をさらに提供する。免疫抗血清は、ピロリ菌の同種および異種の分類可能なおよび分類不可能な変異株および野生株における、α１，６−結合グルカンエピトープを認識するＩｇＧを含む。ＩｇＧは、変異株（ｍｕｔａｎｔ）および野生株のａ１，６−グルカンを発現するピロリ菌株の補体を媒介とした溶菌を引き起こす。
【００２３】
本発明の追加の態様および利点は、以下の記載を考慮して明らかとなる。本発明の範囲内の様々な変化および修正は、この発明の教示を踏まえて当業者に明らかになるため、詳細な記載および実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、たんなる説明として与えられるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本発明のこうした実施形態と他の実施形態は、添付の図面を参照しつつ、ほんの一例としてここで記載される。
【図１】陽イオンモードでピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎから脱脂したＬＰＳの分画１におけるＬＰＳグリコフォームのＣＥ−ＭＳ分析を示す。図１Ａが抽出された質量スペクトル（ｍ／ｚ １０００−１５００）を示す一方で、図１Ｂは、ｍ／ｚ １２６６．３でのイオンの生成イオンスペクトルを示している。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図２】陰イオンモードでピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：ＫａｎからＯ−脱アシル化したＬＰＳのＬＰＳグリコフォームのＣＥ−ＭＳ分析を示す。図２Ａが抽出された質量スペクトル（ｍ／ｚ ６００−２０００）を示す一方で、図２Ｂは、ｍ／ｚ １５９７．７でのイオンの生成イオンスペクトルを示している。脂質Ａ部分に相当するフラグメントイオンは星印で印をつけている。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図３Ａ】ピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎからの主要なＬＰＳグリコフォームの構造を示す。アシル化は示されていない。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図３Ｂ】図３ＡのＬＰＳのＫＯＨ脱アシル化の生成物が、図３Ｂで示される（化合物１〜４）。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図３Ｃ】化合物４の脱アミノの生成物が、図３Ｃで示される（化合物５および６）。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図３Ｄ】化合物６の過ヨウ素酸酸化の生成物が図３Ｄで示される（化合物７および８）。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図３Ｅ】菌株２６６９５（ＦＩＧＵＲＥ ３Ｅ）からのピロリ菌ＬＰＳ（図３Ｅ）と、菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株からのピロリ菌ＬＰＳ（図３Ｆ）に関して当該技術分野で先に提案された構造も同様に示される（出典「Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００」）。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図３Ｆ】菌株２６６９５（ＦＩＧＵＲＥ ３Ｅ）からのピロリ菌ＬＰＳ（図３Ｅ）と、菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株からのピロリ菌ＬＰＳ（図３Ｆ）に関して当該技術分野で先に提案された構造も同様に示される（出典「Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００」）。ＰＥｔｎ＝ホスホエタノールアミン；Ｇｌｃ＝Ｄ−グルコピラノース；Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトピラノース；Ｋｄｏ＝２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸；ＬＤＨｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＤＤＨｅｐ＝Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース；ＧｌｃＮＡｃ＝２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ＝２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；Ｐ＝リン酸塩；および、Ｇｒｏ＝グリセロール。
【図４】本発明のＬＰＳベースの複合体の調製のための反応スキームを示す。
【図５】陰イオンモードで脱脂されたピロリ菌Ｏ：３ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳの主要な分画のＣＥ−ＭＳ分析を示す。●：側鎖に１つのＨｅｐ残基を含むＬＰＳグリコフォーム、Ｒ＝Ｈｅｘ５−１３、Ｈｅｐ、ＨｅｘＮＡｃ、Ｆｕｃ； ■：側鎖に２つのＨｅｐ残基を含むＬＰＳグリコフォーム、Ｒ＝Ｈｅｘ８−１３、Ｈｅｐ、Ｈｅｐ、ＨｅｘＮＡｃ、Ｆｕｃ
【図６】２６６９５ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎ（図６Ａ）、および、２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ（図６Ｂ）による阻害ＥＬＩＳＡによって、ｄＬＰＳ−ＴＴ複合体により誘発されたウサギ抗体の特異性を測定するためのグラフである。ＬＰＳのコーティングは以下のように描かれる：黒四角−２６６９５；黒菱形−２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ；黒丸−２６６９５ ＨＰ０１５９：：Ｋａｎ；黒三角−２６６９５ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎ；白丸−ＳＳ１；白四角−ＳＳ１ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ；白三角−ＳＳ１ ＨＰ０１５９：：Ｋａｎ；白逆三角−ＳＳ１ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎ
【図７】ＣＤ−１マウス中のピロリ菌特異抗体反応を表すグラフを示す。マウスは、１μｇ／マウスのコレラ毒素で補助された（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）２５μｇ／マウスのｄＬＰＳ−ＴＴ複合体（黒棒）、１μｇ／マウスのコレラ毒素で補助されたＰＪ２細胞を含まない超音波処理物（斜線棒）、または、食塩水（白棒）で、週１回の間隔で４度、ワクチン接種した。最初の免疫化から４週間後、血清、糞便、膣の洗浄サンプルを採取し、ピロリ菌に特異的なＩｇＧおよびＩｇＡについてアッセイした。個々のマウスは、群平均を示す（ｎ＝５／群）水平棒でグラフ上にプロットされる。片側マン・ホイットニー検定（ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔ）によって、※ ｐ＜０．０５、※※ ｐ＜０．０１
【図８】ＣＤ−１マウスの胃におけるピロリ菌負荷（ｂｕｒｄｅｎ）を表す棒グラフである。１μｇ／マウスのコレラ毒素で補助された２５μｇ／マウスのｄＬＰＳ−ＴＴ複合体（黒棒）、１μｇ／マウスのコレラ毒素で補助されたＰＪ２細胞を含まない超音波処理物（斜線棒）、または、食塩水（白棒）で、マウスに週１回の間隔で４度、ワクチン接種した。第１の免疫から５週間後に、〜１０８ｃｆｕ ピロリ菌、ＰＪ２菌株によって、一日おきに３度、マウスに経口でチューブから栄養補給させた。４週間後にマウスを殺処分し、胃からの一般細菌を数えた。棒は、４−５のマウス±ＳＥＭの群を表わす（片側マン・ホイットニー検定によって、※ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は新しいヘリコバクター・ピロリＬＰＳ外殻エピトープに関する。より具体的には、本発明は、新しいピロリ菌外殻エピトープ、その合成、特徴づけ、および、複合体に関する。
【００２６】
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているこれらのものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験で用いることができるが、好ましい方法と材料がこれより記載される。以下に記載される全ての刊行物は、引用することによって本明細書に組み入れられる。
【００２７】
本明細書で使用されているように、「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、必ずしも絶対的な純度を意味するわけではないが、むしろ相対的な定義として意図されている。同様に、本明細書で使用されているように、「分離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、その本来の環境から何かを除去することを言う。
【００２８】
ヘリコバクター・ピロリは、ヒトの慢性胃炎、消化性潰瘍、および、胃癌に一般的に関連する細菌性病原菌である。ピロリ菌感染に関連する胃癌のリスクの増加の結果として、それはクラスＩ発癌物質として分類されている。リポ多糖類（ＬＰＳ）はピロリ菌の主要な細胞表面成分である。ピロリ菌ＬＰＳの構造研究に関する従来の出版物は、Ｏ鎖多糖類がコアオリゴ糖に共有結合される提案されたモデルをもたらし、コアオリゴ糖は順に脂質Ａ部分に付く。ほとんどのピロリ菌株のＯ鎖多糖類骨格は独特で、タイプ２および／またはタイプ１のルイス（Ｌｅ）血液型決定子を表示することができ、この多糖類成分は抗原である。「分類可能な」ピロリ菌株は、抗ルイス抗体（抗Ｌｅ）によって認識することができるルイスエピトープ（ＬｅＸおよび／またはＬｅＹ抗原）を有し、このような抗体は市販で入手可能であり、分類の助けとなる。「分類不可能な」菌株はルイス構造を含んでいない。
【００２９】
さらなる構造研究は、ピロリ菌ＬＰＳの外殻領域が２つの異常な高分子成分、ＤＤ−ヘプトグリカン、および、α１，６−グルカン側鎖を含む（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ， ２００１）。Ｌｏｇａｎら（２０００）はＬＰＳの構造についても洞察した。具体的に、もし側鎖中のＤＤ−ヘプトース（ＤＤ−Ｈｅｐ）が骨格中のＤＤ−Ｈｅｐに付けられていれば、その一方で、α１，６−グルカンがこの側鎖ＤＤ−Ｈｅｐに付き、別の分岐を形成していると仮定した場合の提案された構造（図３Ｅおよび図３Ｆを参照）。具体的に、Ｌｏｇａｎら（２０００）は、０８２６変異株ＬＰＳ内のグルカン鎖の長さを、ＦＡＢ−ＭＳスペクトル（高速原子衝撃質量分析）に基づいた１乃至３のグルコースとなるように決定した。ピロリ菌株２６６９５ ＬＰＳ中でのα１，６−結合グルコースの存在も記載され、メチル化分析データに基づいているが、グルカンの長さは決められなかった。菌株２６６９５ ＬＰＳにおいて、３−置換ＨｅｐはＯ鎖のＧｌｃＮＡｃ単位とコアとの間で結合を形成する。ピロリ菌ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳでの３−結合ヘプトースの存在も記載されているが、α１，３−ヘプタンの存在またはその長さについては記載されなかった。ヘプタンまたはグルカンの側鎖の構造または長さに関するさらなる情報は提供されなかった。ピロリ菌ＬＰＳの構造は、現在さらに定義されている。
【００３０】
本発明は式Ｉの構造を含む、新規なα１，６−グルカンを含むヘリコバクター・ピロリ化合物を提供し、
【００３１】
【化３】
【００３２】
ここで、Ｒは、α１，６−グルカンで、その後、α１，３−ＤＤ−ヘプタンで置換された、α−ＤＤＨｅｐ−３−α−Ｌ−Ｆｕｃ−３−β−ＧｌｃＮＡｃ三糖類であり、α１，３−ＤＤ−ヘプタンの最後のＤＤ−Ｈｅｐ残基は、β−ＧｌｃＮＡｃ残基でキャッピングされる。
【００３３】
上記のような構造では、三糖類（α−ＤＤＨｅｐ−３−α−Ｌ−Ｆｕｃ−３−β−ＧｌｃＮＡｃ）のβ−ＧｌｃＮＡｃは、α−ＤＤＨｅｐ Ｇに結合される。三糖類のα−ＤＤＨｅｐは、α１，６−グルカンに結合され、これは順にα１，３−ＤＤ−ヘプタンに結合される。α１，３−ＤＤ−ヘプタンはその後、β−ＧｌｃＮＡｃ残基に結合され、後者はＯ鎖多糖類に付着点を提供する。「結合した（ｌｉｎｋｅｄ）」または「置換した（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」との用語によって、２つの部分が共有結合によって連結することが意味される。
【００３４】
本明細書で使用される「α１，６−グルカン」という用語は、「グルカン」、「α１，６−グルカン側鎖」、「グルカン側鎖」、「α１，６−グルカン部分」、および／または、「グルカン部分」と交互に呼ばれる。α１，６−グルカンは、α１，６−Ｏグリコシド結合によって結合したブドウ糖モノマーの線形の多糖類鎖である。任意の方法に限定することを意図していない１つの例では、α１，６−グルカンは線形の多糖類であってもよい。α１，６−グルカンが任意の適切な量のα１，６−グルコース残基を含んでもよい。例えば、任意の方法で限定することを望まず、グルカンは、約３乃至約１２のα１，６−結合したグルコース残基を含んでもよく、具体的には、グルカン部分は約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または、１２のα１，６−結合グルコース残基、あるいは、ちょうど列挙された任意の２つの値によって定義される任意の範囲を含んでもよい。１つの非限定的な実施例では、α１，６−グルカンは、９−１２のα１，６−グルコース残基を含んでもよい。別の非限定的な実施例では、α１，６−グルカンは、１０のα１，６−グルコース残基を含んでもよい。
【００３５】
本明細書で使用されるような「グリコフォーム」という用語は、同じＬＰＳ構造を含むが、α１，６−グルコースまたはα１，３−ヘプトース残基の数が異なる、さまざまな形態またはタイプの化合物を示す。例えば、および、理論に縛られることを望まずに、各々のグリコフォームは、特定の長さのグルカンおよび／またはヘプタン部分、あるいは、それらの組み合わせを含んでもよい。
【００３６】
本明細書で使用されるような「α１，３−ヘプタン」という用語は、「α１，３−ＤＤ−ヘプタン」、「ヘプタン」、「α１，３−ヘプタン側鎖」、「ヘプタン側鎖」、「α１，３−ヘプタン部分」、「ヘプタン部分」、および／または、「ＤＤ−ヘプトグリカン」と交互に呼ばれる。α１，３−ヘプタンは、α１，３−Ｏグリコシド結合によって結合したヘプトースモノマーの多糖類鎖である。任意の方法に限定することを意図していない１つの例では、α１，３−ヘプタンは線形の多糖類であってもよい。α１，３−ヘプタンは、任意の適切な量のα１，３−ヘプトース残基を含んでもよい。例えば、任意の方法で限定することを望まずに、ヘプタンは、約２乃至約６のα１，３−結合ヘプトース残基を含んでもよく、具体的には、ヘプタン部分は、約２、３、４、５、または、６のα１，３−結合ヘプトース残基、または、ちょうど列挙された任意の２つの値によって定義される任意の範囲を含んでもよい。
【００３７】
上記のα１，３−ＤＤヘプタンの最後のＤＤ−Ｈｅｐ残基は、β−ＧｌｃＮＡｃ残基でキャップされる。「キャップされた（ｃａｐｐｅｄ）」という用語によって、β−ＧｌｃＮＡｃ残基が側鎖の最後の残基であることを意味し、「末端の（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）」という用語が使用されてもよい。β−ＧｌｃＮＡｃはヘプトースの位置Ｏ−２を介してＤＤ−Ｈｅｐに結合されてもよい。理論に縛られることを望まずに、β−ＧｌｃＮＡｃ残基はＯ鎖多糖類に付着点を与えてもよい。
【００３８】
１つの非限定的な実施例において、Ｒは以下のとおりであり、
【００３９】
【化４】
【００４０】
ここで、β−ＧｌｃＮＡｃ残基Ｌは、Ｈｅｐ残基ＧのＯ−２に結合される。この実施例では、β−ＧｌｃＮＡｃ残基Ｗは、Ｏ鎖多糖類に付着点を与えてもよい。ちょうど記載された化合物では、グルカンの残基ＱおよびＺは、α１，６−結合グルコース残基であり、ｎは、グルカンがα１，６−結合で約３乃至約１２のグルコース残基を含むように、約１乃至１１の間の任意の値でもよい。１つの具体的な非限定的な例において、主要なグリコフォームは、１０の連続するα１，６−結合グルコース残基（ｎ＝９）を含んでもよい。ちょうど記載された化合物では、残基Ｔ、Ｙ、および、Ｘは、α１，３−結合ヘプトース残基であり、ｍは、ヘプタンがα１，３−結合において約２乃至約６のヘプトース残基を含むように、約０乃至４の間の任意の値であってもよく、１つの具体的な非限定的な例において、主要なグリコフォームは４つの連続するα１，３−結合ヘプトース残基（ｍ＝２）を含んでもよい。
【００４１】
構造は任意の適切なピロリ菌株から分離および／または精製され、例えば、任意の方法で限定することを望まずに、切断されたピロリ菌ＬＰＳ分子は、限定されないが、Ｏ鎖多糖類を欠く同質遺伝子変異株をもたらすＨＰ０８２６遺伝子中の変異株を有するピロリ菌株などの分類不可能なピロリ菌株（すなわち、ルイス抗原が欠けたもの）から分離される。非限定的な例において、本明細書に記載されている化合物はピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎまたは菌株ＰＪ２から分離および／または精製されてもよい。
【００４２】
「内殻分子（ｉｎｎｅｒ ｃｏｒｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）」とも本明細書で呼ばれる式Ｉの構造は、Ｋｄｏ残基（例えば、Ｋｄｏ残基Ｃ）に共有結合している脂質Ａ部分をさらに含む。他の実施形態では、脂質Ａ分子はＯ−脱アシル化しても、または、完全に脱アシル化してもよい。さらに他の実施形態では、脂質Ａ部分は、Ｋｄｏ残基のケトシド結合の加水分解を介して開裂してもよい。理論によって縛られることを望まず、脂質Ａの開裂は、ＬＰＳの毒性を除去し、かつ、複合体の可能な凝集と不溶性を回避するために行われてもよい。当業者は、脂質Ａ部分のケトシド結合のＯ−脱アシル化、脱アシル化、または、加水分解のための方法に精通しているであろう。（例を参照。「Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１； Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３」）
【００４３】
本発明は、同様に、タンパク質担体に共役されたほぼ線形のα１，６−グルカンを含有する化合物を含む複合体を提供する。ほぼ線形のα１，６−グルカンを含有する化合物は、α１，６−結合グルコース残基で構成された任意の適切なほぼ線形の多糖類であってもよい。「ほぼ線形の」という用語によって、α１，６−グルカンが分岐をほとんど含まず、例えば、任意の方法で限定することを望まずに、α１，６−グルカンがα１，６−グルカン中に約０乃至約５％の分岐を含んでもよいことを意味する。具体的に、α１，６−グルカンは、約０、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または、５％の分岐またはその間の任意の量を含んでもよく、化合物は混合物であってもよく、このとき、混合物内の分岐の量は、１つの化合物から別の化合物まで様々である。１つの非限定的な例では、α１，６−グルカンを含む化合物は上記のような、および、本明細書で記載されるような構造であってもよい。別の実施例では、α１，６−グルカンを含有する化合物はデキストランであってもよい。デキストランは上記のような、かつ、１〜１０ｋＤａの分子量を有する必要条件を満たす任意の適切なデキストランであってもよく、例えば、しかしながら任意の方法で限定することを望まずに、デキストランは、約１、３．５、５、６．５、８、または１０ｋＤａ、または、その間の任意の値であってもよい。具体的な非限定的な例において、デキストランはデキストランＴ５であってもよい。さらに別の例では、α１，６−グルカンを含有する化合物は、約５〜８の間のα１，６−結合グルコース残基の直鎖であってもよく、例えば、任意の方法で限定することを望まずに、α１，６−グルカンを包含する化合物は、５、６、７、または、８のα１，６−結合グルコース残基の直鎖であってもよい。
【００４４】
α１，６−グルカンを含有する化合物は、リンカー分子および／または担体タンパク質に共役し、当業者によって理解されるであろうように、本明細書に記載される構造は、担体タンパク質に直接共役されるか、または、順に担体タンパク質に共役されるリンカー分子（本明細書では「リンカー」とも呼ばれる）に変化してもよい。「共役した」という用語によって、構造がリンカー分子および／または担体タンパク質に共有結合している（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ ｏｒ ｌｉｎｋｅｄ）ことを意味する。リンカーおよび／または担体タンパク質の共有結合のための方法は当業者に周知であり、当業者によって認識されるように、共有結合のための方法（および、リンカーが存在しているかどうか）は、使用される担体タンパク質によって変化する。任意の方法で限定することを望まずに、このような１つの方法が図４に示され、これは「Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９８）」からの出典であり、この方法では、脱アシル化したＬＰＳまたは脱脂したＬＰＳは、Ｋｄｏ残基のカルボキシル基をリンカー分子に共有結合し、その後、マレイミド官能性を導入することによって活性化される。活性化されたＬＰＳを、チオレート化した担体タンパク質と混ぜ合わせることで、共役した構造を生み出す。当業者によって評価されるように、本明細書に記載の方法は、一般的なものであり、従って、任意の他の適切な方法が使用されてもよい（例えば、限定されないが、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００５； Ｇｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｍｉｅｓｚａｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３； Ｙｕ ａｎｄ Ｇｕ， ２００７によって記載されたもの）。α１，６−グルカンを含有する化合物は、構造中の任意の適切なカルボキシル基を介して、リンカー／担体タンパク質に付けられてもよい。特定の非限定的な例では、α１，６−グルカンを含有する化合物は、本発明の構造であってもよく、内殻Ｋｄｏ残基Ｃによって付けられてもよい。
【００４５】
担体タンパク質は免疫原性の担体を含む、当該技術分野で知られている任意の適切な担体であってもよい。例えば、担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ジフテリアトキソイド（Ｄｉｐｈｔｅｒｉａ ｔｏｘｏｉｄ）、変異株ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ、ＣＲＭ１９７タンパク質、シュードモナスＡタンパク質（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）、コレラ毒素（ＣＴ）タンパク質、コレラ毒素変異株ＣＴ−Ｅ２９Ｈタンパク質、および、例えば、限定されないが、鞭毛、線毛、および、他の毒素の一部などの当該技術分野で知られている他のものであってもよい。
【００４６】
先に示されたように、複合体は、担体タンパク質を、自然発生の基を介して本発明の構造に直接結合させるか、または、一級アミノ基、ヒドラジド、チオール、カルボキシルなどに決して限定されないがこれらを含むスペーサーまたはリンカー分子の導入によって結合させることによって、複合体を調整することができる。
【００４７】
本発明は、本明細書に記載の１以上の化合物、本明細書に記載の１以上の複合体、または、それらの組み合わせを含む組成物をさらに提供する。１つの実施形態では、組成物は、上記の化合物のグリコフォームの混合物を含む。例えば、任意の方法で限定することを望まずに、組成物は、グルカン部分中に１０の連続するα１，６−結合グルコース残基（ｎ＝９）を含む主要なグリコフォームを含んでもよい。同様に、任意の方法で限定することを望まずに、組成物は、本明細書に記載の１以上のグリコフォームから調製された複合体を含むことができる。実施例で実証されたように、複合体の調製に使用されたピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎによって合成されたＬＰＳ構造は、３つのグリコフォーム：主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）オリゴ糖Ｉ、ＧｌｃＮＡｃと［ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｈｅｐ］でキャップした主鎖オリゴ糖Ｉ、および、もっとも長いグルカン鎖がＣＥ−ＭＳ分析によって測定されるように約１２のα−１，６−結合残基に対応する、α−１，６−結合グルカンを含むオリゴ糖の混合物であった（表２（図２））。
【００４８】
ちょうど記載されたような組成物は免疫原性のものであってもよい。「免疫原性の」という用語によって、組成物がピロリ菌の野生株および／または変異株に対する免疫反応を誘発することを意味する。免疫反応は、ピロリ菌の分類可能な、および、分類不可能な菌株に対する広範な免疫原性反応を提供してもよい。
【００４９】
本発明は、同様に、個体内でのピロリ菌に対する免疫反応を誘発するために、本明細書に記載の有効な量の組成物の使用を提供する。前に記載されたように、組成物は本発明に従って１以上の化合物を含んでもよい。１以上の化合物は、リンカーおよび／または適切な担体分子に共役してもよい。
【００５０】
本発明は、上記の免疫原性の組成物で哺乳動物を免疫化することにより産生される免疫抗血清をさらに提供する。免疫抗血清は、ピロリ菌の同種および異種の、分類可能なおよび分類不可能な、変異株および野生型であり、α１，６−結合グルカンエピトープを認識する免疫後血清ＩｇＧを含むか、または、産生する。ＩｇＧは、変異株および野生株のα１，６−グルカンを発現するピロリ菌の補体を媒介とした溶菌を引き起こすこともある。
【００５１】
本発明はさらに抗α１，６−グルカン抗体を提供する。抗体は、本明細書に記載の本発明の化合物に対して産生されるか、または、デキストラン（例えば、限定されないが、ＢＳＡデキストラン複合体などのデキストラン複合体）といった他のα１，６−グルカンを含む分子に対して産生されてもよい。１つの非限定的な例において、抗体は、当該技術分野で知られている既知の方法に従って産出されたモノクローナル抗体であってもよい（実施例１０を参照。Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。例えば、任意の方法で限定することを望まずに、抗体は、ピロリ菌ＨＰ０８２６変異株ＬＰＳの外殻領域にあるα１，６−グルカンエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体であってもよく、より具体的には、抗体は、図５で示す化合物に対して産生されてもよい。さらにもっと具体的な例において、モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞株１Ｃ４Ｆ９によって産生されたＩｇＭ １Ｃ４Ｆ９であってもよい。この細胞株は、２００９年７月３０日にカナダの国際預託機関（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）（国立微生物学研究所（カナダ マニトバ州 ウィニペグ アーリントン・ストリート １０１５）に預けられ、受け入れ番号３００７０９−０１を割り当てられた。例で実証されたように、１Ｃ４Ｆ９は、ＬＰＳ中のα１，６−グルカンエピトープと、分類可能な、および、分類不可能なピロリ菌のすべての細胞を認識し、生きている細菌の表面で容易に入手可能であり、さらに、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴとｄＬＰＳ−ＢＳＡまたはｄＬＰＳ−ＴＴ複合体の両方で同じようによく反応した。
【００５２】
本発明は、このような処置を必要としている個体において、変異株および野生株の、分類可能なおよび分類不可能なα１，６−グルカンを発現するピロリ菌の補体を媒介とした溶菌を引き起こすために、１Ｃ４Ｆ９抗体の使用を提供する。先に記載されたように、分類可能なピロリ菌株は抗Ｌｅ抗体によって認識されるルイスの抗原を有し、その一方で、分類不可能なピロリ菌株はそのような抗原を有していない。しかしながら、分類可能なおよび分類不可能な菌株の両方がα１，６−グルカンを含んでおり、両方の菌株は１Ｃ４Ｆ９抗体によって認識される。
【００５３】
現在、当該技術分野では、ピロリ菌株はルイスの抗原に対する市販の抗体を使用して分類されるが、しかしながら、分類不可能な株がルイスの構造を含んでいないため、この手法を用いてそれらを分類することはできない。ほとんどの分類可能なおよび分類不可能なピロリ菌株は、α１，６−グルカンエピトープを運ぶため、抗α１，６−グルカン抗体（ｍＡｂ １Ｃ４Ｆ９など）は、ピロリ菌分離物（ｉｓｏｌａｔｅ）を選別して特徴づける追加の方法を提供することができる。
【００５４】
ピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：ＫａｎのＬＰＳを精製し、その化学構造を、組成物、メチル化、徹底した核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析に加え、ＣＥ−ＭＳデータによって測定した。ピロリ菌ＨＰ０８２６変異株ＬＰＳの外殻領域中のα１，６−結合グルカンの存在も実証された。この構造はα１，６−グルカンに特有のモノクローナル抗体、１Ｃ４Ｆ９によって認識された。後者の抗体は、ピロリ菌（Ｏ）：３ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ突然変異株のホルマリンで固定した細胞を用いて精製した。これらの抗体は細胞表面接触可能であり殺菌性であった。以前は、ルイスの構造のみが抗原であると信じられていた。したがって、α１，６−グルカンに対する抗体の生成は予期しえなかった。
【００５５】
ピロリ菌ＬＰＳのワクチンの可能性を調べるために、ピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株の修飾ＬＰＳを共役して、破傷風トキソイド（ＴＴ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にした。部分的に脱脂したＬＰＳまたは脱脂したＬＰＳの調製のための２つの手法：やかなヒドラジン分解によるＬＰＳのＯ脱アシル化（ＬＰＳ−ＯＨ）、または、穏やかな酸処理によるＬＰＳの脱脂（ｄＬＰＳ）ｆを利用した。脱脂および／または部分的な脱脂のさらなる方法は技術分野において周知であり、このような適切な方法は本発明の範囲内で用いられてもよい。ＬＰＳ−ＯＨおよびｄＬＰＳの両方を、２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸（Ｋｄｏ）残基を介して、ジアミノ基を含むスペーサーに共有結合させ、その後、マレイミド官能性の導入と、チオール化したＴＴまたはＢＳＡとの共役によって、それぞれ、複合体、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、および、ｄＬＰＳ−ＴＴを得た。個別の実験では、分類不可能な株ＰＪ２を脱脂し、共役のために利用することによって、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ複合体を得た。
【００５６】
ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴと同様に、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴ複合体は、ＩｇＭ １Ｃ４Ｆ９による間接的なＥＬＩＳＡによって設定されるように、表面接触可能なα１，６−グルカン決定子の抗原を保持した。抗体はα１，６−グルカン決定子への優れた特異性を有することを示し、その結合特性が、ピロリ菌の分類可能なおよび分類不可能な菌株からの生成されたＬＰＳと、イソマルト−系（ｉｓｏｍａｌｔ−ｓｅｒｉｅｓ）からのオリゴ糖とによる阻害ＥＬＩＳＡによって測定された。これらの研究により、１Ｃ４Ｆ９が５または６の連続するα１，６−結合グルコース残基についての必要条件、Ｋａｂａｔ（１９９３）が主張した部位を結合する抗−α−（１→６）デキストランの大きさと一致したパターンを有することが分かった。
【００５７】
ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴ、または、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ複合体は、マウスとウサギにおいては免疫原性であり、ピロリ菌の異種の、同種の、および、野生型の菌株からのＬＰＳに対する有意なＩｇＧ抗体反応を誘発した。免疫抗原に対する１０倍強固なＩｇＧ免疫反応が、ｄＬＰＳを含む複合体を受け取ったマウスおよびウサギで生じた。ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴ、または、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴのいずれかで免疫化したウサギの免疫後の血清は、ピロリ菌の２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株および野生型２６６９５菌株に対する殺菌活性を示した。
【００５８】
要約すると、これらの結果は、Ｌｅ抗原を欠いた、かつ、長いα１，６−グルカン鎖を保有する、脱脂したか部分的に脱脂したピロリ菌ＬＰＳベースのタンパク質複合体が、マウスとウサギの両方において免疫原性であり、殺菌性の抗体を誘発するということを示唆している。このエピトープが免疫原性であると同定されたことに留意することが重要である。このことは以前は確立されていなかった。なぜなら、抗原性であり、かつ、特定の抗体を産生すると知られていたのは、ルイスの構造だけだったからである。
【００５９】
本発明は、以下の実施例においてさらに例証される。しかしながら、これらの実施例がたんなる説明目的のためのもので、任意の方法で本発明の範囲を制限するためには使用されてはならない。
【実施例】
【００６０】
（実施例１：ピロリ菌２６６９６ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳの分離および構造分析）
ヘリコバクター・ピロリ菌株２６６９５は、Ｒ．Ａｌｍ博士（マイアミ州ボストンのアストラゼネカ）から入手し、ピロリ菌（Ｏ）：３分離株はＪ．Ｐｅｎｎｅｒ博士から、Ｊ９９は、Ｄ．Ｔａｙｌｏｒ博士（カナダ・エドモントンのアルバータ大学）から入手し、ＳＳ１はＡ．Ｌｅｅ博士（オーストラリア・シドニーのニューサウスウェールズ大学）から、ＰＪ１とＰＪ２の臨床分離株は、Ｗ．Ｃｏｎｌａｎ博士（ＩＢＳ、ＮＲＣ）からの新鮮な臨床分離株であり、および、Ｍ６はＫ．Ｅａｔｏｎ博士（ミシガン州のミシガン州立大学）から入手した。
【００６１】
細菌株の増殖は、Ｈｉｒａｔｓｕｋａら（２００５）によって記載されたように実行された。手短にいえば、先に記載されたように（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ）、微好気性環境下で、７％のウマ血液を含む、抗生物質を補ったコロンビア血液寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）上で、細胞を３７°Ｃで４８時間増殖させた（Ｋａｎ２０μｇ／ｍＬ）。液体培養中の増殖のために、１０％ウシ胎児血清を含む抗生物質を補ったブルセラ菌ブロスに、４８時間のコロンビア血液寒天培地／ウマ血液プレートから採取したピロリ菌細胞を接種し、以前に記載されたように（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ、２００５）、微好気性条件下で（８５％Ｎ２、１０％ＣＯ２、５％Ｏ２）攪拌機内で４８時間インキュベートした。
【００６２】
ピロリ菌株を上記の液体培養において培養し、細菌増殖の遠心分離によって得られた浸潤細胞を、エタノール、アセトン、および、石油エーテル（ｌｉｇｈｔ ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）によって２度連続して洗浄し、空気乾燥させた。ＷｅｓｔｐｈａｌとＪａｎｎ（１９６５）の暖かいフェノール水抽出手順（ｈｏｔ ｐｈｅｎｏｌ−ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって、空気乾燥した細胞塊からＬＰＳを抽出した。広範な透析と凍結乾燥後に、水相からＬＰＳを得た。超遠心分離（１０５，０００×ｇ，４°Ｃ、１２時間）によってピロリ菌ＬＰＳをさらに精製し、ペレットを蒸留水で懸濁し、凍結乾燥させた。
【００６３】
アルジトール酢酸方法（Ｓａｗａｒｄｅｋｅｒ ｅｌ ａｌ，１９６７）によって糖組成分析を行なった。加水分解を１００°Ｃで４Ｍトリフルオロ酢酸で４時間行うか、または、１００°Ｃで２Ｍトリフルオロ酢酸で１６時間行い、その後、ＮａＢＨ４によるＨ２Ｏの還元と、その後の無水酢酸／ピリジンによるアセチル化が続く。アルジトール酢酸誘導体を先に記載したように分析した（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００３）。Ｃｉｕｃａｎｕ ＆ Ｋｅｒｅｋ（１９８４）の方法によって、および、先に記載したように（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００３）、ガス液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＧＬＣ−ＭＳ）による完全メチル化されたアルジトール酢酸誘導体の特徴付けによって、メチル化分析を行った。
【００６４】
アルジトール酢酸としてのピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎから精製されたＬＰＳの糖分析は、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース（ＤＤ−Ｈｅｐ）、および、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース（ＬＤ−Ｈｅｐ）が、０．４：５．０：１．５：４．３：６．４：１．４の適切なモル比で存在していることを明らかにし、このことは、Ｏ鎖を欠く構造の存在を示している（Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。未処置の２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ上で行なわれたメチル化分析は、これらの発見と一致しており、末端のＬ−Ｆｕｃ、３−置換したＬ−Ｆｕｃ、末端Ｄ−Ｇｌｕ、末端Ｄ−Ｇａｌ、３−置換したグルコース、４−置換したＤ−Ｇａｌ、６−置換したグルコース、末端ＤＤ−Ｈｅｐ、２−置換したＤＤ−Ｈｅｐ、６−置換したＤＤ−Ｈｅｐ、３−置換したＤＤ−Ｈｅｐ、７−置換したＤＤ−Ｈｅｐ、２，７−置換したＤＤ−Ｈｅｐ、２−置換したＬＤ−Ｈｅｐ、３−置換したＬＤ−Ｈｅｐ、末端Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ、および、３−置換Ｄ−ＧｌｃＮＡｃが、０．１：１．０：１．１：０．１：１．２：１．０：６．０：０．４：１．２：１．１：３．１：０．５：１．６：１．２：０．１：０．３：０．４の近似モル比で存在していることを示す。Ｏ鎖を含んでいるＬｅ抗原の特徴である３，４−置換したＤ−ＧｌｃＮＡｃおよび２−結合Ｄ−Ｇａｌは、まったく検知されなかった。ＬＰＳの純度はＲＮＡ由来のリビトールの欠如によって確認された。２６６９５ ＬＰＳの組成物およびメチル化分析は、他で報告されている（Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。すべての糖がピラノース形態であった。
【００６５】
（実施例２）：キャピラリー電気泳動法−質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）によって脱脂したピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳによる特徴づけ
実施例１で得られた生成した２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ（２０ｍｇ）を、０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）において１００°Ｃで２時間加水分解し、先に記載したように（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００３）Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ−２カラムでのゲルろ過によって分画することで、脱脂したＬＰＳ（ｄＬＰＳ）を生成した。３つの分画（分画１−３）を集めて、キャピラリー電気泳動質量分析法（ＣＥ−ＭＳ；表１）によって分析した。
【００６６】
ＣＥ−ＭＳに関して、Ｐｒｉｎｃｅ ＣＥシステム（Ｐｒｉｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，オランダ）を、４０００ＱＴＲＡＰ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ，カナダ）につないだ。シース溶液（イソプロパノール−メタノール、２：１）を、流速１．０μＬ／分で送達した。ｐＨ ９．０の脱イオン水中の１５ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて、約９０ｃｍの長さの剥き出しの石英ガラスの毛細管上で分離物を得た。５ｋＶのエレクトロスプレーイオン化電圧は陽イオン検出モードに使用した。４０００ｄａ／ｓの走査速度で増強された産生イオン走査モード（ＥＰＩ）を用いて、タンデム質量スペクトルを得た。（１２の値の）カーテン（ｃｕｒｔａｉｎ）および（「高い」縮尺に設定された）衝突ガスとして、窒素を使用した。
【００６７】
陽イオンモードでの主要な分画１のＣＥ−ＭＳ分析は、約１１のα−１，６−結合残基に相当する最長のグルカン鎖である、Ｈｅｘ残基の連続的な追加に一致して、ｍ／ｚ １２１２．３、ｍ／ｚ １２６６．３、および、ｍ／ｚ １３２０．４で一連の三価イオンの存在を確認した。イオンの信号強度に基づいて、ｍ／ｚ １２６６．３での最も豊富なグリコフォームは、１０のα−１，６−結合Ｈｅｘを含む（図１）。陽イオン検出モードにおけるｍ／ｚ １２６６．３でのイオンの生成スペクトルは、以前観察された主鎖コア断片（ｃｏｒｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）Ｈｅｘ２Ｈｅｐ３（ＰＥｔｎ）ＫｄｏとＨｅｘＮＡｃＨｅｘ２Ｈｅｐ３（ＰＥｔｎ）Ｋｄｏそれぞれに一致して、ｍ／ｚ １２４４．５とｍ／ｚ １４４７．６での診断のイオンの存在を確認した（図１）。ＬＰＳコア中にα１，６−グルカンを保有する分画１および２を組み合わせて共役のために用いた。
【００６８】
【表１】
【００６９】
（実施例３）：ＣＥ−ＭＳによるＯ−脱アシル化した２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳの特徴付け
（実施例１の）２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳのＯ−脱アシル化は、幾つかの修正をしたＨｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．に従って実行された（１９９１）。手短にいえば、ＬＰＳ（４ｍｇ）を４時間、３７°Ｃで無水ヒドラジン（０．２ｍｌ）中で撹拌した。反応混合物を冷却し、冷たいアセトン（２ｍｌ）をゆっくりと加えることで超過ヒドラジンを破壊した。３０分後、沈殿したＯ−脱アシル化したＬＰＳ（ＬＰＳ−ＯＨ）を、遠心分離（４°Ｃ、９３００×ｇ、１０分）によって集めた。ペレットを冷たいアセトンで２度洗浄し、水に溶解させ、凍結乾燥させることでＬＰＳ−ＯＨ（３．５ｍｇ）を得た。
【００７０】
陽イオンモードでのＯ−脱アシル化した２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ（ＬＰＳ−ＯＨ）のＣＥ−ＭＳ分析を、実施例２に記載のように行った。ＣＥ−ＭＳの結果は脱脂したＬＰＳについて得られたＭＳデータと一致しており、主鎖オリゴ糖、および、ＨｅｘＮＡｃ、および、［ＨｅｘＡｃ、Ｆｕｃ、Ｈｅｐ］のそれぞれでキャップした主鎖オリゴ糖のそれぞれの存在と一致して、ｍ／ｚ １１３７．２、ｍ／ｚ １２３９．２、および、ｍ／ｚ １４０８．０で３つの主要な二価イオンを提供したが（表２）、その一方で、ｍ／ｚ １５９７．７、ｍ／ｚ １６５１．４、および、ｍ／ｚ １７０５．５での三価イオンは、約１２のα−１，６−結合残基に相当する最長のグルカン鎖である、グルカンの存在と一致した（表２、図２）。ｍ／ｚ １５９７．７のＭＳ／ＭＳスペクトルは、［Ｆｕｃ，Ｈｅｐ］と［Ｆｕｃ，Ｈｅｐ，ＨｅｘＮＡｃ］のそれぞれの連続的な損失と一致して、ｍ／ｚ １４４７．６とｍ／ｚ １２４４．５での診断のイオンの存在を示し（図２）、さらに、Ｋｄｏ残基を介してＯ−脱アシル化された脂質Ａ（脂質Ａ−ＯＨ）に結合したコア断片ＦｕｃＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃＨｅｐ４（ＰＥｔｎ）Ｋｄｏに一致して、ｍ／ｚ １７８６．８で一価イオンをもたらし、その一方で、ｍ／ｚ ４４４．４およびｍ／ｚ ８８７．８でのイオンは、２つのアミド結合した３−ヒドロキシオクタデカン［Ｃ１８：０（３−ＯＨ）］脂肪酸鎖により置換されたジグルコサミン（ｄｉｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）主鎖からなる脂質Ａ−ＯＨ部分に相当した（図２）。
【００７１】
【表２】
【００７２】
（実施例４）：ピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳのＮＭＲ分析
ＰＥｔＮ置換基のアルカリ加水分解がアグリコンを含まない還元末端を残すため（Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、（実施例１の）ピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：ＫａｎからのＬＰＳの分解は、脂質Ａ ＧｌｃＮの即時還元のためのＮａＢＨ４の存在下で、４Ｍ ＫＯＨによる完全な脱アシル化で始まった。ゲルクロマトグラフィーによる生成物の分離は、クロマトグラムのオリゴ糖領域で溶出された、２つの分画をもたらした。更なる分析によって、これらの分画は、グルカン鎖の長さによって明らかに異なる、類似する化合物を含むことが示された。低分子量分画（Ｌｏｗｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｆｒａｃｔｉｏｎ）は、質量分析法によって同定された化合物１−３を含み、両方の分画は、グルカン部分の異なる長さの化合物４を含んでいた（図３）。
【００７３】
ＮＭＲスペクトル（ＤＱＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ ＨＳＱＣ、および、ＨＭＢＣ）は、先に記載されたような（Ｂｒｉｓｓｏｎ、２００２）標準のソフトウェアを用いてＶａｒｉａｎ ５００または６００ＭＨｚの分光計で行われた。ＮＭＲ実験はすべて、１Ｈスペクトルにはδ２．２２５ｐｐｍで、１３Ｃスペクトルには３１．４５ｐｐｍで、内部基準としてアセトンを用いて２５°Ｃで行われた。
【００７４】
その複雑さゆえにスペクトルを完全に解釈することはできなかったが、両方の分画のＮＭＲスペクトルは化合物４に相当した。α−１，６−グルカン、および、ＤＤ−ヘプタンの末端残基のＨ−１プロトンは、グルカンおよびヘプタンＨ−１の残りには重複せず、したがって、図３に示されるように、全体的な構造内でこれらのホモポリマーの位置を同定することができる。しかしながら、α−１，６−グルカン鎖の還元末端Ｇｌｕ残基Ｚの結合位置は測定されなかった。それは、同定されていない陽子（後に、ＨｅｐＮのＨ−６に割り当てられる）との強いＮＯＥ相関を示した。化合物４のＮＭＲデータは、ヘプタン部分（Ｘ）の第１のＨｅｐ残基がα−１，６−グルカンに属する非還元末端Ｇｌｃ残基ＶのＯ−３に結合されたため、α−１，６−グルカンがＤＤ−ヘプタンと内殻との間に置かれたことを明確に示した。ＤＤ−ヘプタンの非還元末端は、Ｏ−３でβ−ＧｌｃＮ Ｗに置換された。小さなオリゴ糖１−３と同一の化合物は、α−１，６−グルカンがほとんどない変異株ＨＰ０１５９：：Ｋａｎのピロリ菌ＬＰＳの主要な構成要素として先に発見され、それらのＮＭＲデータが公表された（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。化合物４に関して選択されたＮＭＲデータが表３に示される。Ｋｄｏに結合した４つの近接するヘプトース残基の以前提案された配列は、調べた化合物のいずれにも存在しなかったことが容易にわかるであろう（図３）。β−ＧｌｃＮ残基Ｌは、ＨｅｐＧのＯ−２に直接結合し、ＬＰＳ構造の任意の部分においてＨｅｐのＯ−７につなげられたＧｌｃＮはなかった。
【００７５】
【表３】
【００７６】
ＬＰＳ構造のさらなる分析について、化合物１−４を脱アミノ化した。手短にいえば、サンプルを１０％ＡｃＯＨに溶解させ、過度のＮａＮＯ２を加えた。３時間後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラムで、ゲルクロマトグラフィーによって生成物を分離した。その後、化合物のいくつかをＮａＢＤ４で還元し、脱塩した。結果として生じる生成物が化合物５および６であった。（上記のように行なわれた）化合物５のＮＭＲスペクトルは、（アルカリ条件下のリン酸塩移動によって）ＨｅｐＥの位置６または７で、リン酸塩を含む２つの異性体を示した。再度、３つの近接するＨｅｐ残基が存在し、以前に提案された構造が正確である場合に予測されるであろうように、４つではなかった。脱アミノ処置（上記の）による全側鎖の除去は、ＧｌｃＮ ＬがＯＳ５の糖と分子の残部の間の接続を形成することを確認した。
【００７７】
化合物６は、還元末端に、ＤＤ−ヘプタン、α−１，６−グルカン、および、三糖類ＤＤＨｅｐ−Ｆｕｃ−ａｎｈ−Ｍａｎ−ｏｌ（ＧｌｃＮ Ｌに由来するＮ−Ｍ−Ｌおよびａｎｈ−Ｍａｎ Ｌ）を含んでいた。この生成物のスペクトルはそれほど密集しておらず、（ＤＤＨｅｐ ＮのＨ−１とＨ−６の間のＴＯＣＳＹからの）ＤＤＨｅｐ ＮのＯ−６に対するα−１，６−グルカンの付着点を同定することが可能になった。分岐糖を全く示さなかったメチル化分析によって確認されるように、構造は直線的であった。予測された生成物はすべて、提案された構造に一致して同定された（表４）。
【００７８】
【表４】
【００７９】
ＤＤ−ヘプタン−α−１，６−グルカン領域の構造のさらなる確認が、化合物６の過ヨウ素酸酸化の結果から得られた。過ヨウ素酸酸化は２４時間、過度の０．１Ｍ ＮａｌＯ４で行なわれた。エチレングリコールを加え、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラムでのゲルクロマトグラフィーによって生成物を分離させた。それをＮａＢＤ４で還元し、脱塩し、２％ＡｃＯＨによって、１００°Ｃで３時間加水分解した。２つの主要な生成物７と８を得て、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラムでのゲルクロマトグラフィーによって分離した。
【００８０】
ＮａＢＤ４による酸化オリゴ糖の還元は、ＮＭＲスペクトル（ＡＰＴ−ＨＳＱＣ中のＣＨ２ＯＨ信号に対するＣＨＤＯＨ信号の反転位相）での酸化炭素の同定を可能にした。化合物７および８の構造は、ＮＭＲ分光法およびメチル化分析によって測定された。化合物７の形成は、ＤＤＨｅｐ Ｎが位置３では置換されなかったことを証明した。化合物６のメチル化が末端の３−および６−置換ＤＤ Ｈｅｐのみを示したため、化合物６のＮＭＲデータから提案されたように、ＤＤ−Ｈｅｐ Ｎは位置６で置換された。還元末端でグリセロール（Ｇｒｏ）を有する化合物８の形成は、酸化還元後にグリセロールを産生可能なオリゴ糖６の他の成分がなかったため、ＯＳ６中のＧｌｃ Ｖが位置６で次のＧｌｃ残基をグリコシル化したことを確認した。そのことは、同様に、末端グルコースの位置３でのα−１，６−グルカンの非還元末端へのＤＤ−ヘプタン部分の付着を証明した。
【００８１】
ＤＤ−ヘプタン領域のサイズを推定することができる。化合物８はＤＤ−ヘプトースに由来する４つのマンノース残基を含んでいた。化合物８のスペクトルはよく分解し、Ｈ−１信号の統合はほぼ等モルの比率を与え、４つのマンノース残基の存在を示した。したがって、化合物６の完全なＤＤ−ヘプタン領域は、ほとんど５つのＤＤ−ヘプトース単位からなり、そのうちのひとつ（末端）は、過ヨウ素酸酸化によって取り除かれた。この結論は質量分析法によって確認された。ピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎによって産生された主要なＬＰＳグリコフォームの構造が図３に示される。
【００８２】
（実施例５）：ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴ、および、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ複合体の調製および特徴付け
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および／または破傷風トキソイド（ＴＴ）に対する、ＬＰＳ−ＯＨ（実施例３を参照）およびｄＬＰＳ（実施例２を参照）のＫｄｏ結合複合体を調製した。
【００８３】
ＬＰＳ−ＯＨ（４７８９Ｄａの推定平均分子量に基づき、４ｍｇ、０．８μｍｏｌ）またはｄＬＰＳ（３７７９Ｄａの推定平均分子量に基づき、４ｍｇ、１μｍｏｌ）を、０．１Ｍ ＮａＣｌ（０．４ ｍＬ）を含む０．１Ｍ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸酸（ＭＥＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）緩衝液（ｐＨ ４．８）に溶解させた。１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ；３４．３８ｍｇ、１００：１モル比；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、その後、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（１５μＬ、１０３μｍｏｌ； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、その反応を２２°Ｃで４時間、ｐＨ ４．８で維持した。溶液をｐＨ ７．０に調節し、蒸留水に対して透析し、Ｍｉｃｒｏｓｅｐの遠心分離装置１，０００Ｄａ ｃｕｔｏｆｆ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ミシガン州）を用いて脱塩または凍結乾燥させた。
【００８４】
基本的に、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９８）によってオリゴ糖について記載されたように、共役手順を行った。手短に言えば、乾燥したＤＭＳＯ中で３−マレイミドプロピオン酸（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ；２ｍｇ、７．５μｍｏｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、スペーサーを含んでいるＬＰＳ−ＯＨ（２ｍｇ、０．４μｍｏｌ）またはｄＬＰＳ（２ｍｇ、０．５μｍｏｌ）を２２°Ｃで２４時間、反応させた。溶液を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥させた。
【００８５】
ＢＳＡの活性化のために、乾燥したＤＭＳＯ中で３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＴＳＰ；０．６３ｍｇ、１．６μｍｏｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、６ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度４ｍｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＭ ＰＢＳの緩衝液（ｐＨ ８．０）に事前に溶解しておいたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（分子量６６，３２０Ｄａ）（８ｍｇ、０．１２μｍｏｌ）の溶液に、Ｎ２雰囲気下で加えた。その混合物を２２°Ｃで２時間撹拌した。その後に、Ｎ２雰囲気下でジチオトレイトール（ＤＴＴ； ７．１２ｍｇ、４６μｍｏｌ； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、その混合物を４°Ｃで１時間撹拌した。再生セルロース細胞膜３０，０００Ｄａ ｃｕｔｏｆｆ（ＹＭ３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）全体の圧力源としてＮ２を用いて、撹拌した限外濾過細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州）中に５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ＰＢＳの緩衝液（ｐＨ７．２）に対して、結果として生じた溶液を４°Ｃで透析した。タンパク質とＳＨの含有量を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（ＢＣＡ；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）とＥｌｌｍａｎ（１９５９）方法によってそれぞれ測定した。２０−２２ＳＨ基のモル置換が得られた。
【００８６】
破傷風トキソイド（ＴＴ）（分子量、１５０，０００Ｄａ）の活性化のために、６ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度４ｍｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ８．０）中のＴＴ溶液（４ｍｇ、０．０３μｍｏｌ）に、Ｎ２雰囲気下で、乾燥したＤＭＳＯ（２５μＬ）中のＤＴＳＰ（０．３１６ｍｇ、０．８μｍｏｌ）を加え、その反応をＢＳＡについて上記したように処理を進めた。その後に、Ｎ２雰囲気下で、ジチオトレイトール（ＤＴＴ；３．５６ｍｇ、２３μｍｏｌ； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、その混合物を４°Ｃで１時間撹拌した。活性化したＴＴを、撹拌した限外濾過細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、再生セルロース細胞膜、１００，０００Ｄａ ｃｕｔｏｆｆ（ＹＭ１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にわたって、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ＰＢＳの緩衝液（ｐＨ７．２）に対して、４°Ｃで透析した。
【００８７】
５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）中のＢＳＡ−ＳＨ２１−２２またはＴＴ−ＳＨ２１−２２の溶液に、１０ｍＭ ＰＢＳの緩衝液中のマレイミド官能基を有するＬＰＳ−ＯＨまたはｄＬＰＳ誘導体の溶液を、Ｎ２雰囲気下で加えた。その反応物を４°Ｃで２４時間攪拌した。その後に、Ｎ−エチルマレイミド（１ｍｇ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。その反応を２２°Ｃで３０分間進め、結果として生じる複合体を、４°Ｃで４時間、１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）に対して透析し、０．２２μｍポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｋ、アイルランド）を用いて、フィルタを殺菌した。複合体は、その炭水化物とタンパク質含有量について、それぞれＬＰＳ−ＯＨまたはｄＬＰＳおよびＢＳＡを標準として、中性糖のためのフェノール硫酸方法（Ｄｕｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ、１９５６）、および、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて分析された。複合体の効率は、１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）で平衡に保たれたＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ １０／３００ ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ； Ａｇｉｌｅｎｔ １２００Ｓｅｒｉｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、ドイツ）によって確認された。クロマトグラフィーは、室温で、流速０．５ ｍＬ／分で行われた。溶出はダイオード・アレー検出器（ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２１０ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターされた。
【００８８】
スペーサーの存在は、ＣＨ２ＮＨ２基に対応する３．２２ｐｐｍでの新しい陽子共鳴の出現によって、１Ｈ−ＮＭＲ分光法で確認された。β−マレイミドプロピオネート（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）のＣＨ２αおよびＣＨ＝ＣＨ基にそれぞれ対応する２．５５ｐｐｍおよび６．９ｐｐｍでの陽子共鳴の存在によって確認されたように、スペーサー分子のアミン基が、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によってさらに誘導体化されたことで、マレイミド官能基を有するＬＰＳ−ＯＨまたはｄＬＰＳを得た。内殻のＬＤ−Ｈｅｐのホスホエタノールアミンの誘導体化は、化学量論量の試薬の使用により最小限に抑えられた。糖複合体は、担体タンパク質のチオ化（ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ）とチオ化したタンパク質のマレイミド官能基を有するＬＰＳ−ＯＨまたはｄＬＰＳへの追加によって得られた（図４）。共役の効率はＨＰＬＣによってモニターされた。得られた複合体はその炭水化物とタンパク質含有量について分析された。
【００８９】
３つの複合体におけるＴＴに対するＬＰＳ−ＯＨのモル比は、１０：１から２０：１まで及び、産出量は炭水化物含有量に基づいて１３％から２２％までで変動した（表５）。ＢＳＡまたはＴＴへのｄＬＰＳの共役は、著しく炭水化物含有量の多いｄＬＰＳ−ＢＳＡ−２、ｄＬＰＳ−ＴＴ、または、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ複合体を産出した（表５）。ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴとｄＬＰＳ−ＢＳＡまたはｄＬＰＳ−ＴＴの複合体の両方は、ＥＬＩＳＡによってα１，６−グルカンに特異的なｍＡｂと均等によく反応し、このことは、グルカンエピトープの形態が不変だったことを示唆している。
【００９０】
【表５】
【００９１】
（実施例６）：マウスとウサギにおける、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴの複合体、および、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ複合体の免疫原性
実施例５の複合体（ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴ、および、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ）の免疫性をマウスとウサギで試験した。
【００９２】
生後６−８週の５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、適切な複合体を用いて腹腔内で免疫化した。各々のマウスは、１回の注入当たり０．２ｍＬ Ｒｉｂｉアジュバント中の２μｇまたは１０μｇの炭水化物を受け取った。マウスを２１日目と４２日目にブーストして、血清を５１日目に末端の心臓穿刺（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｅａｒｔ Ｐｕｎｃｔｕｒｅ）から回収した。
【００９３】
３匹のニュージーランドホワイトウサギを、適切な複合体を用いて皮下で免疫化した。各々のウサギは、０．５ｍＬの不完全フロインドアジュバント中の１０μｇまたは５０μｇの炭水化物を受け取った。ウサギを２８日目と５６日目にブーストして、６５日目に失血後から回収した。
【００９４】
血清中の抗ＬＰＳ抗体のレベルは、精製されたＬＰＳを被膜抗原（１μｇ／ウェル）として用いるＥＬＩＳＡによって測定された。ＰＢＳで洗浄した後に、ＰＢＳまたはＭｉｌｋ希釈液／ブロッキング溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＭＤＢ）（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中の１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって、プレートを３７°Ｃで１時間ブロック（ｂｌｏｃｋ）した。希釈したマウスまたはウサギの免疫前後の血清を加え、プレートを３７°Ｃで２時間インキュベートした。阻害ＥＬＩＳＡについては、２６６９５ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎ ＬＰＳまたは２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳを阻害する一連の希釈物を、ＯＤ４５０＝０．６−０．８を与えたウサギ血清の事前に測定された希釈物と混合した。この混合物を２２°Ｃで１５分間インキュベートし、吸収したＬＰＳ抗原で遮断された元々のマイクロタイタープレートに移し、そこで３７°Ｃで２時間、さらにインキュベートした。この工程の後は、間接的なＥＬＩＳＡ処置に従った。手短にいえば、プレートをＰＢＳと第２抗体で洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭワサビダイコンペルオキシダーゼ複合体（Ｃａｌｔａｇ、Ｓｏ．サンフランシスコ、カリフォルニア州）を室温で１時間加えた。最終的な洗浄工程の後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジデン（ｂｅｎｚｉｄｅｎｅ）（ＴＭＢ）（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）基質を加え、１Ｍのリン酸で反応を止めた。マイクロタイタープレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を用いて、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００９５】
阻害割合を以下の式を用いて計算した。
％阻害＝１００×［（インヒビターを含むＯＤ−インヒビターを含まないＯＤ）／インヒビターを含まないＯＤ］
【００９６】
阻害対ログ濃度曲線が各インヒビターについてプロットされ、半最大阻害濃度（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＩＣ５０）に必要な濃度を、外挿曲線（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）から決定した。
【００９７】
反応は、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ、ｄＬＰＳ−ＴＴ、または、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴのいずれかで免疫化した動物よりもＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴで免疫化したマウスとウサギの方で全般的に弱かったが、全ての複合体は、３度の注入後（表６乃至９）、ウサギとマウスの両方で同種（２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ）と対応する野生型（２６６９５）株からのＬＰＳに対するＩｇＧ反応を誘発した。ＬＰＳ−ＯＨ、ｄＬＰＳ、または、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）のいずれかと、タンパク質担体（アジュバントを有する）との混合物で免疫化した対照ウサギは、３度の免疫化後に、ピロリ菌の同族の菌株（２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株）、または、対応する野生型２６６９５菌株からのＬＰＳに対する特異的な反応は全くないか、低い値しか示さなかった。
【００９８】
【表６】
【００９９】
【表７】
【０１００】
【表８】
【０１０１】
【表９】
【０１０２】
交差反応性研究は、様々なＬＰＳ グリコタイプ （Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，２００１）を代表するピロリ菌株、および、選択された突然変異株からのＬＰＳに対して、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−２、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−３、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−４、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ−２、ｄＬＰＳ−ＴＴ、または、ｄＬＰＳ（ＰＪ２）のいずれかで免疫化したウサギの免疫後血清を用いて行なわれた。結果を表１０、１１および１２で示す。
【０１０３】
【表１０】
【０１０４】
【表１１】
【０１０５】
【表１２】
【０１０６】
α１，６−グルカンを加えることができないピロリ菌株を代表するものである（Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）ＳＳ１およびＳＳ１ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳによって、弱い交差反応性しか得られなかったため、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−２、ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−３、またはＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−４で免疫化したウサギから得た免疫後の血清の反応性は、α１，６−グルカンの存在の必要性を示した（表１０）。驚くことに、ｄＬＰＳ−ＴＴで免疫化したウサギから得た血清は同様に、任意の１，６−グルカンを含まなかった殻ＬＰＳエピトープ、即ち、株ＳＳ１、ＳＳ１ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ、Ｍ６およびＪ９９からのＬＰＳ（表１１）を認識し、これはより広い殻の認識を示し、おそらくはＴＴ担体タンパク質の存在により、ｄＬＰＳ−ＴＴ結合体がより免疫原性であったことを推測している（表１１）。あるいは、結合体が３のグリコフォームの混合物から調製されるように、免疫反応は他の主要でないＬＰＳ構成要素へと生成されていたかもしれない。このことは、観察された交差反応について説明する。
【０１０７】
ｄＬＰＳ−ＴＴ結合体によって誘発されるウサギ血清の結合特異性を調べるため、阻害ＥＬＩＳＡを、２つのグリコフォーム（およその比率１：１）、すなわち、線形の主鎖オリゴ糖構造および［ＧｌｃＮＡｃ，Ｆｕｃ］にキャッピングされた線形の主鎖オリゴ糖（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２００５）、ならびに、２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳからなる、精製された２６６９５ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎ ＬＰＳを用いて実行した。２６６９５ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎ ＬＰＳがインヒビターとして使用された時、株ＳＳ１、ＳＳ１ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＨＰ０１５９：：ＫａｎおよびＳＳ１ ＨＰ０４７９：：Ｋａｎからのグルカン−陰性ＬＰＳへのウサギ血清の結合（図６）が有意に阻害され、その一方で、２６６９５ ＬＰＳがコーティング抗原（図６）として使用された時、２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳが最も効果的なインヒビターであった。
【０１０８】
異種の分類可能な株および分類不可能な株を認識する、ウサギの免疫後血清の能力も同様に、ピロリ菌の分類可能な株および分類不可能な株両方のピロリ菌代表物（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｓ）の選択された臨床分離株に対する細胞全体の間接的ＥＬＩＳＡ（ＷＣＥ）において確認された。細胞全体の間接的ＥＬＩＳＡ（ＷＣＥ）を、前述に記載の通りに実行した（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。手短に言えば、マイクロタイタープレートのウェル（ｗｅｌｌ）を、４°Ｃで一晩中、１０８細胞／ｍＬで、１００μＬの細菌懸濁液で覆った。その後、ウェルをメタノールで固定し、３７°Ｃで２時間、２００μＬのＭｉｌｋ希釈液／ブロッキング溶液（ＭＤＢ）（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）でブロックした。続いて、ＭＤＢ中で１：５００に希釈した１００μＬの１Ｃ４Ｆ９腹水を用いて、ウェルを３７°Ｃで２時間インキュベートし、その後、ＭＤＢ中で１：１，０００に希釈した抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｃａｌｔａｇ）を用いて、室温で１時間インキュベートした。間接的ＥＬＩＳＡに関して記載されるように、基質ＴＭＢを加えた。非特異性のバックグラウンド値を、細菌細胞、第２の抗体結合体および基質を含む、陰性対照のウェルのＯＤ４５０として決定した。これらＯＤ４５０値は≦０．２であった。ＯＤ４５０＜０．２の光学的濃度値を、陰性反応として分類し、ＯＤ４５０値≧０．２を陽性反応として分類した。プレート間の一貫性を保証するために、ピロリ菌株２６６９５細胞を陽性対照として使用した。アッセイは１０％以上は変わらなかった。
【０１０９】
ｄＬＰＳ−ＴＴ複合体で免疫化したウサギ由来の血清が、細胞全体の間接的ＥＬＩＳＡを使用して試験されたすべての株（表１３）に対し、もっとも強い交差反応性を示した。
【０１１０】
表１３：ピロリ菌の臨床分離株に対する細胞全体の間接的ＥＬＩＳＡｂにおけるウサギの免疫後血清ａの交差反応性。
【０１１１】
【表１３】
【０１１２】
（実施例７：ウサギ抗血清の殺菌力）
ワクチン接種前またはワクチン接種後のウサギの血清（実施例６）を使用して、殺菌アッセイを行なった。
【０１１３】
プレートで増殖した（Ｐｌａｔｅ−ｇｒｏｗｎ）ピロリ菌細胞を採取し、プレート１枚当たり５ｍＬのＰＢＳで洗浄した。遠心分離の後、ペレットを２５ｍＬのＰＢＳ中に懸濁した。最終的な細菌懸濁液を、４ｘ１０６ ＣＦＵ／ｍＬでダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ニューヨーク）内で希釈した。殺菌アッセイを、平底のマイクロタイタープレート（ＩＣＮ）内で行なった。補体除去した（ｄｅ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）免疫前または免疫後の血清（５０μＬ）の１０倍の連続希釈物を、各々のウェルに加えた。その後、細菌懸濁液（２５μＬ）を加え、３７°Ｃで１５分間プレインキュベートした。仔ウサギの補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｒｎｂｙ，ＯＮ）を１：５０に希釈し、２５μＬを適切なウェルに加えた。プレートを３７°Ｃで４５分間インキュベートし、次に、氷の上に置いた。１０μＬのアリコートを、コロンビア血液寒天（Ｃｏｌｕｍｂｉａ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ）上で３回播種し、４日間増殖させ、その後プレートを数えて、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を測定した。バクテリアと補体を含むが血清を含まない対照プレートを使用し、死滅率（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｋｉｌｌｉｎｇ）を計算した。殺菌力は、５０％を死滅させた血清のもっとも高い希釈として決定した。
【０１１４】
ワクチン接種前の血清またはタンパク質担体とＬＰＳ−ＯＨ、ｄＬＰＳまたはｄＬＰＳ（ＰＪ２）のいずれかとの混合物（アジュバントを有する）により免疫化されたウサギから得た血清は、同種のピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎまたは野生型の２６６９５菌株に対する殺菌力を示さないか、または、それらに対する低レベルの殺菌力を示した。ＬＰＳ−ＯＨ−ＴＴ−４、ｄＬＰＳ−ＢＳＡ−２、ｄＬＰＳ−ＴＴおよびｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴで免疫化したウサギから得た免疫後血清は、２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株および対応する野生型菌株の両方に対し、有意で機能的な活性を示し（表１４）、ｄＬＰＳ−ＴＴ結合体で免疫化したウサギからのワクチン接種後の血清は、野生型菌株２６６９５に対してもっとも高い機能的な活性を示した（表１４）。
【０１１５】
【表１４】
【０１１６】
更に、ウサギ血清の殺菌力も同様に、ピロリ菌の選択された臨床分離株、すなわち、００２ＣＬ、０１５３ＣＬおよび０５８ＣＬに対して試験した（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。これら分離株を、抗−α１，６−グルカンｍＡｂｓを用いるＷＣＥアッセイにおけるそのＯＤ４５０値に基づき、高度、中度および低度の結合剤の代表物として選択した：株００２ＣＬ−Ｏ４５０ １．３６１、高度の結合剤；株１５３ＣＬ−ＯＤ４５０ ０．２９、中度の結合剤；および株０５８ＣＬ−ＯＤ４５０ ０．１６２、低度の結合剤である。ｄＬＰＳ−ＴＴまたはｄＬＰＳ（ＰＪ２）−ＴＴ複合体のいずれかで免疫化したウサギからの免疫後血清のみが、試験された３つの臨床分離株により機能的な活性を示したことを強調することが重要である（表１５）。
【０１１７】
【表１５】
【０１１８】
（実施例８：マウスにおけるｄＬＰＳ−ＴＴ複合体による防御試験）
候補ワクチンとしてのｄＬＰＳ−ＴＴ複合体の潜在性を、非近交系のＣＤ−１マウスにて評価した。
【０１１９】
１μｇ／マウスのコレラ毒素（ＣＴ；Ｓｉｇｍａ）で補助された２５μｇ／マウスのｄＬＰＳ−ＴＴ複合体、１ｍｇ／マウスのコレラ毒素で補助された３１．５μｇ／マウスのＰＪ２細胞を含まない音波処理物（ＰＪ２ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｏｎｉｃａｔｅ）（対照）、または食塩水（対照）を、グループ５のマウスに、週１回の間隔で４度、鼻腔内にワクチン接種した。最後の免疫の１週間後、血清、糞および膣の洗浄サンプルを、ピロリ菌特異的ＩｇＧおよびＩｇＡのために採取し、分析した。血清ＩｇＧおよび血清、糞および膣のＩｇＡ抗体レベルを、標準のＥＬＩＳＡによって測定した。プレートを本明細書に記載の通り、１μｇ／ウェルのピロリ菌株２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳで覆った。血清サンプルを、ＩｇＧアッセイのため１：１００に希釈し、ＩｇＡアッセイのため１：５０に希釈した。糞のサンプルを１：２に希釈し、膣のサンプルを１：２０に希釈した。ピロリ菌特異的抗体レベルを決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０を使用して、マン・ホイットニー検定によってデータを分析した。
【０１２０】
最初の免疫の５週間後、〜１０８ ｃｆｕピロリ菌株ＰＪ２を一日おきに３回、マウスに経口的に強制投与した（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。４週間後に、マウスを殺し、胃からのその一般細菌を数え、ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０を使用して、マン・ホイットニー検定によってデータを分析した。
【０１２１】
ＣＴに加えてｄＬＰＳ−ＴＴ複合体による鼻腔内の免疫化は、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、非常に強力なピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ特異的ＩｇＧ反応を誘発し、中度のピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ特異血清ＩｇＡも同様に検出された（表１６および１７、図７）。加えて、膣または糞のサンプルにおけるピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ特異的反応も同様に検知した（ｐ＜０．０１）（表１７、図７）。
【０１２２】
【表１６】
【０１２３】
【表１７】
【０１２４】
長いα１，６−グルカンを含有すると以前に示された分類不可能なピロリ菌マウス−コロニー形成株（ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ）ＰＪ２を、全てのマウスのグループにその後経口胃（ｏｒｏｇａｓｔｒｉｃａｌｌｙ）接種した（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。防御は、対照グループと比較して、ワクチン接種したグループにおける細菌の負荷の統計的に有意な減少として定義される。ＣＴを加えたｄＬＰＳ−ＴＴ複合体により鼻腔内で免疫化したマウスのグループに関するコロニー形成のデータは、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）（図８）。さらに、これらのデータは、ピロリ菌２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳ特異血清ＩｇＡ反応が、単独では細菌負荷に対する防御に十分ではないということ、および、ＬＰＳ特異血清ＩｇＧ反応も同様に、防御の増加に寄付するということを示唆する。
【０１２５】
〈実施例９：デキストラン−ＢＳＡ複合体および免疫原性の調製および特性付け並びに機能的な活性の研究〉
２５０μＬの０．２Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中に、１０ｍｇのデキストランＴ５（ＭＷ ５ ＫＤａ，Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ Ａ／Ｓ，Ｈｏｌｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を溶解させることにより、デキストラン−ＢＳＡ複合体を調製した。これを、０．２Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中の１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（２５ｍＬ）およびシアノヒドリドほう酸ナトリウム（１０ｍｇ）を含む溶液（２５０μｌ）に加えた（「Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４」に記載の通り）。反応を５５°Ｃで５日間行なった。ＬＰＳベースの複合体の調製に関して上述されたように、反応生成物を精製した。
【０１２６】
この反応はスペーサーの導入をもたらす。ＬＰＳベースの複合体に関して記載されるように、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によって、スペーサー分子のアミン基をさらに誘導体化した（実施例５を参照）。担体タンパク質のチオール化とマレイミドにより官能化されたデキストランＴ５のチオール化したタンパク質の付加とによって、糖複合体を得た。複合体においてＢＳＡに対するデキストランのモル比は２０：１であり、収量は炭水化物含有量に基づき、３２％であった。
【０１２７】
様々なＬＰＳグリコ型（ｇｌｙｃｏｔｙｐｅｓ）のピロリ菌代表物および選択された突然変異株からのＬＰＳに対するデキストラン−ＢＳＡにより免疫化されたウサギの免疫後血清を用いて、交差反応性研究を行なった（表１８）。
【０１２８】
【表１８】
【０１２９】
交差反応性がグルカン−陰性株ＳＳ１およびＳＳ１ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎにより得られなかったため、デキストラン−ＢＳＡにより免疫化されたウサギから得た免疫後血清の反応は、α１，６−グルカンが存在するための必要条件を表した。デキストラン−ＢＳＡにより免疫化したウサギから得た免疫後血清は、２６６９５ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ変異株および対応する野生型菌株の両方に対する機能的な活性を示した（表１９）。
【０１３０】
【表１９】
【０１３１】
異種の分類可能な株および分類不可能な株を認識し、殺菌性の抗体を誘発するといったウサギの免疫後血清の能力は、α１，６−結合グルコース反復単位の線形な主鎖を含むポリマーであるデキストランからなる複合体、または、連続するα１，６−結合グルコースの残基からなる最適化された線形のオリゴ糖を含む複合体からなる複合体、および、適切なタンパク質が、ピロリ菌感染に対する防御を与えるのに十分であるという可能性を示す。
【０１３２】
（実施例１０：抗グルカンｍＡｂｓの特異性の研究）
ピロリ菌株Ｏ：３ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎに対して特異的なモノクローナル抗体を生成し、その特異性を研究した。
【０１３３】
前に記載されたように、ハイブリドーマを生成した（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。８２日にわたって５度、ピロリ菌株Ｏ：３ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎの１０８細胞（２００μＬ）ホルマリン固定化細胞を、６匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ）に腹腔内に（ｉ．ｐ．）注入することで、有意な滴定濃度を達成した。最後の静脈内（ｉ．ｖ．）注入を行い、続いて３日後に融合させた。Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）に従い、２匹のマウスの脾臓細胞をＳｐ２／Ｏプラズマ細胞腫細胞株と融合した。３６８のウェルからの最初の融合の上澄みを、間接的な酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって選別した。
【０１３４】
ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマの選別に関して、マイクロタイタープレート（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）を、３７°Ｃで３時間、５０ｍＭの炭酸塩バッファー（ｐＨ９．８）中の１０μｇ／ｍＬの対応するピロリ菌Ｏ：３ ＨＰ０８２６：：Ｋａｎ ＬＰＳで覆った。ＰＢＳでの洗浄後、プレートをＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。使い切った上澄みを加え、プレートを室温で３時間インキュベートした。プレートをＰＢＳと第２抗体で洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（Ｃａｌｔａｇ，Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を室温で１時間加えた。最後の洗浄の工程後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジデン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｅｎｅ）（ＴＭＢ）（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）基質を加え、反応を１Ｍのリン酸を用いて止めた。マイクロタイタープレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を使用し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。この工程の後に、実施例６に記載の通り、間接的ＥＬＩＳＡ手順を続けた。
【０１３５】
制限のある希釈クローニング（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）に従って、安定した２つのハイブリドーマを得た。１つのクローン、１Ｃ４Ｆ９、ＩｇＭを、さらなる特徴付けのために選択した。腹水はＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて上昇し、製造業者のプロトコルに従って、ＩｇＭ−特異的アフィニティカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用し、１Ｃ４Ｆ９モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を腹水から精製した。
【０１３６】
グルカンに特異的な抗体の特異性に関する研究は、連続するα１，６−結合グルコースの残基Ｇｌｃ→［α（１→６）Ｇｌｃ］ｎ＝１−６および選択的な精製されたピロリ菌ＬＰＳからなる、一連の線形のオリゴ糖を用いて行われた。阻害ＥＬＩＳＡに関して、イソマルト系（ｉｓｏｍａｌｔｏ−ｓｅｒｉｅｓ）［Ｇｌｃα１→（６Ｇｌｃα１→）ｎ＝１−６］（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＳ）またはピロリ菌２６６９５、Ｏ：３およびＰＪ２ ＬＰＳインヒビターからの線形のα１，６−結合グルコースを含むオリゴ糖の一連の希釈物を調製して、ＯＤ４５０＝１を与えた精製１Ｃ４Ｆ９の以前に調製された希釈物と混合した。インキュベーション（２２°Ｃ、１５分）の後、この混合物を３７°Ｃでもう２時間インキュベートした場合、吸着したＬＰＳ抗原を含む最初のブロックされたマイクロタイタープレートに混合物を移動させた。この工程の後、実施例６に記載の通り、間接的ＥＬＩＳＡの手順を続けた。阻害の割合を、以下の式を使用して計算した：
【０１３７】
％阻害＝１００ｘ［（インヒビターを含むＯＤ−インヒビターを含まないＯＤ）／インヒビターを含まないＯＤ］
【０１３８】
阻害対ログの濃度の曲線を各々のインヒビターに関してプロットし、半分の最大阻害濃度に必要な濃度（ＩＣ５０）を外挿曲線から決定した。
【０１３９】
イソマルトヘキサオース（ｎ＝５）およびイソマルトヘプタオース（ｉｓｏｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ）（ｎ＝６）を使用すると、阻害特性が最適化した（表２０）。グルカン鎖（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）に平均で６から８の残基を含むと以前に示されたピロリ菌ＰＪ２ ＬＰＳは、最も有効なインヒビターであった（表２０）。
【０１４０】
【表２０】
【０１４１】
（実施例１１：抗グルカンｍＡｂｓを使用する接触性の研究（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｙ）および殺菌アッセイ）
抗グルカンｍＡｂｓは、間接型のＩＦ顕微鏡観察法研究によって実証されるように、代表的なピロリ菌株から生存する細菌の表面に容易に接触可能であった（表２１）。α１，６−グルカンおよびＣａｇＡの両方を、細菌の表面上で同時に識別する。
【０１４２】
モノクローナル抗体の殺菌力を決定するために、補体除去された腹水（５０μＬ）からの１Ｃ４Ｆ９ ｍＡｂの１０倍の連続希釈物を各々のウェルに加え、その後、細菌懸濁液（２５μＬ）を加え、３７°Ｃで１５分間プレインキュベートした。この工程の後、実施例７に記載の通り、手順を続けた。１Ｃ４Ｆ９の細胞表面結合は、ピロリ菌の野生株および変異株に対する殺菌アッセイによって測定されるように、機能的な活性と相互に関連付けられた（表２１）。
【０１４３】
【表２１】
【０１４４】
本発明の好ましい実施形態が上述された一方で、様々な修正がその中で行われること、添付の請求項が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、全てのそのような修正を含むことを意図していることを認識し、かつ理解されたい。
【０１４５】
（引用文）
すべての特許、特許出願および出版物は、本明細書を指し、本明細書により出願の全体にわたって引用文に組み込まれる。
Ａｌｔｍａｎ Ｅ， Ｃｈａｎｄａｎ Ｖ， Ｌａｒｏｃｑｕｅ Ｓ， Ａｕｂｒｙ Ａ， Ｌｏｇａｎ ＳＭ， Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ Ｅ， Ｌｉ Ｊ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ＨＰ０１５９ ＯＲＦ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ． ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００８； ５３： ２０４−２１３．
Ａｌｔｍａｎ Ｅ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｈ， Ｃｈａｎｄａｎ Ｖ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＢＡ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ Ｍ， Ｏｔｔｈ Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ Ｌ， Ｔｏｌｅｄｏ Ｃ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｌｅ： ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｙｐｅ １ Ｌｅｗｉｓ ｂ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ． Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００８； ５７： ５８５−５９１．
Ａｌｔｍａｎ Ｅ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＢＡ， Ｈｉｒａｍａ Ｔ， Ｃｈａｎｄａｎ Ｖ， Ｔｏ Ｒ， ＭａｃＫｅｎｚｉｅ Ｒ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ Ｌｅｘ ａｎｄ Ｌｅｙ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００５； ８３： ５８９−５９６．
Ａｌｔｍａｎ Ｅ， Ｓｍｉｒｎｏｖａ Ｎ， Ｌｉ Ｊ， Ａｕｂｒｙ Ａ， Ｌｏｇａｎ ＳＭ． Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｎｏｎｔｙｐａｂｌｅ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｓｔｒａｉｎ ｌａｃｋｉｎｇ Ｌｅｗｉｓ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ Ｏ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ＤＤ−ｈｅｐｔｏｇｌｙｃａｎ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ａｌｐｈａ１，６−ｇｌｕｃａｎ ｉｎ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００３； １３： ７７７−７８３．
Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＰＷ， Ｐｉｃｈｉｃｈｅｒｏ ＭＥ， Ｉｎｓｅｌ ＲＡ， Ｂｅｔｔｓ Ｒ， Ｅｂｙ Ｒ， Ｓｍｉｔｈ ＤＨ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｃｌｅａｖｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃａｐｓｕｌｅ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｒｒｉｅｒ： ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐｒｉｍｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｆａｎｔ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８６； １３７： １１８１−１１８６．
Ａｎｇｅｌａｋｏｐｏｕｌｏｓ Ｈ， Ｈｏｈｍａｎｎ ＥＬ． Ｐｉｌｏｔ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ−ｄｅｌｅｔｅｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｕｒｅａｓｅ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０００； ６８： ２１３５−２１４１．
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Ｂｒｉｓｓｏｎ Ｊ−Ｒ， Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｅ， Ｕｈｒｉｎ Ｄ， Ｋｈｉｅｕ ＮＨ， Ｐｅｒｒｙ ＭＢ， Ｓｅｖｅｒｎ ＷＢ， Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＣ． Ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ （Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ） ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ａ１ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ Ｌ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｍａｎｎｏ− ａｎｄ Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｍａｎｎｏ−ｈｅｐｔｏｓｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ． Ｃａｎ Ｊ Ｃｈｅｍ ２００２； ８０： ９４９−９６３．
Ｃａｓｔｉｌｌｏ−Ｒｏｊａｓ Ｇ， Ｍａｚａｒｉ−Ｈｉｒｉａｒｔ Ｍ ＆ Ｌｏｐｅｚ−Ｖｉｄａｌ Ｙ （２００４）． Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ： ｆｏｃｕｓ ｏｎ ＣａｇＡ ａｎｄ ＶａｃＡ ｍａｊｏｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｓａｌｕｄ ｐｕｂｌｉｃａ ｄｅ Ｍｅｘｉｃｏ ４６： ５３８−５４８．
Ｃｈａｎｄａｎ Ｖ， Ｌｏｇａｎ ＳＭ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＢＡ， Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ Ｅ， Ａｕｂｒｙ Ａ， Ｓｔｕｐａｋ Ｊ， Ｌｉ Ｊ， Ａｌｔｍａｎ， Ｅ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｗａａＦ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｓｔｒａｉｎｓ ２６６９５ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ａｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｈａｓ ａ ｌｉｍｉｔｅｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００７； ８５： ５８２−５９０．
Ｃｈｕ Ｃ， Ｌｉｕ Ｂ， Ｗａｔｓｏｎ Ｄ， Ｓｚｕ Ｓ， Ｂｒｙｌａ Ｄ， Ｓｈｉｌｏａｃｈ Ｊ， Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ Ｒ， Ｒｏｂｂｉｎｓ ＪＢ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｆ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ ｔｙｐｅ １ （Ｓｈｉｇａ’ｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ） ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｏｉｄ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９１； ５９： ４４５０−４４５８．
Ｃｉｕｃａｎｕ Ｉ， Ｋｅｒｅｋ Ｆ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ ２００４； １３１： ２０９−２１７．
Ｃｉｕｃａｎｕ Ｉ， Ｋｅｒｅｋ， Ｆ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ ２００４， １３１： ２０９−２１７．
Ｃｏｘ ＡＤ， Ｚｏｕ Ｗ， Ｇｉｄｎｅｙ ＭＡＪ， Ｌａｃｅｌｌｅ Ｓ， Ｐｌｅｓｔｅｄ ＪＳ， Ｍａｋｅｐｅａｃｅ Ｋ， Ｗｒｉｇｈｔ ＪＣ， Ｃｏｕｌｌ ＰＡ， Ｍｏｘｏｎ ＥＲ， Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＣ． Ｃａｎｄｉｄａｃｙ ｏｆ ＬＰＳ−ｂａｓｅｄ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２００５； ２３： ５０４５−５０５４．
Ｄｕｂｏｉｓ Ｍ， Ｇｉｌｌｅｓ ＫＡ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＪＫ， Ｒｅｂｅｒｓ ＰＡ， Ｓｍｉｔｈ， Ｆ． Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ １９５６； ２８： ３５０−３５６．
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Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｎｔａｎａ Ｖ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｌｉｏ Ｒ， Ｓａｒｒａｃｅｎｔ−Ｐｅｒｅｚ Ｊ， Ｖｅｒｅｚ−Ｂｅｎｃｏｍｏ Ｖ． Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ５−ａｚｉｄｏ−３−ｏｘａｐｅｎｔｙｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ． Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ １９９８； １５： ５４９−５５３．
Ｇｕ Ｘ−Ｘ， Ｔｓａｉ Ｃ−Ｍ， Ｕｅｙａｍａ Ｔ， Ｂａｒｅｎｋａｍｐ ＳＪ， Ｒｏｂｂｉｎｓ ＪＢ， Ｌｉｍ ＤＪ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ ｎｏｎｔｙｐａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９６； ６４： ４０４７−４０５３．
Ｈｉｒａｔｓｕｋａ Ｋ， Ｌｏｇａｎ ＳＭ， Ｃｏｎｌａｎ ＪＷ， Ｃｈａｎｄａｎ Ｖ， Ａｕｂｒｙ Ａ， Ｓｍｉｒｎｏｖａ Ｎ， Ｕｌｒｉｃｈｓｅｎ Ｈ， Ｃｈａｎ ＫＨＮ， Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＤＷ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＢＡ， Ｌｉ Ｊ， Ａｌｔｍａｎ Ｅ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｍａｎｎｏ−ｈｅｐｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２００５； １８７： ５１５６−５１６５．
Ｈｏｌｓｔ Ｏ， Ｂｒａｄｅ Ｌ， Ｋｏｓｍａ Ｐ， Ｂｒａｄｅ， Ｈ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ Ｃｈｌａｍｉｄｉａ ｓｐｐ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９１； １７３：１８６２−１８６６．
Ｋａｂａｔ ＥＡ． Ｃｈａｐｔｅｒ １１． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉ−・−（１・６）ｄｅｘｔｒａｎｓ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ａ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｉｔｅ−Ｆｉｌｌｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ． Ｉｎ： Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ （ｖｏｌ． １５９）． Ｇａｒｅｇｇ ＰＪ， Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ＡＡ， ｅｄｓ． ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９３； １４６−５８．
Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ， Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ． Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． Ｎａｔｕｒｅ １９７５； ２５６： ４９５−４９７．
Ｌｏｇａｎ ＳＭ， Ａｌｔｍａｎ Ｅ， Ｍｙｋｙｔｃｚｕｋ Ｏ， Ｂｒｉｓｓｏｎ Ｊ−Ｒ， Ｃｈａｎｄａｎ Ｖ， Ｓｔ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｆ， Ｍａｓｓｏｎ Ａ， Ｌｅｃｌｅｒｃ Ｓ， Ｈｉｒａｔｓｕｋａ Ｋ， Ｓｍｉｒｎｏｖａ Ｎ， Ｌｉ Ｊ， Ｗｕ Ｙ， Ｗａｋａｒｃｈｕｋ ＷＷ． Ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｒｆａＪ ｈｏｍｏｌｏｇｓ ｆｒｏｍ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００５； １５： ７２１−７３３．
Ｌｏｇａｎ ＳＭ， Ｃｏｎｌａｎ ＪＷ， Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ＭＡ， Ｗａｋａｒｃｈｕｋ ＷＷ， Ａｌｔｍａｎ Ｅ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ： ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ・−１，４ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０００； ３５： １１５６−１１６７．
Ｍｉｅｓｚａｌａ Ｍ， Ｋｏｇａｎ Ｇ， Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ＨＪ． Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅｉｒ ｌｉｐｉｄ Ａ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｃｏｎｓｅｒｖｅｓ ｔｈｅｉｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｈａｖｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ ２００３； ３３８： １６７−１７５．
Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ＭＡ． Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ： ａ ｗｏｌｆ ｉｎ ｓｈｅｅｐ’ｓ ｃｌｏｔｈｉｎｇ： ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｔｙｐｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐｓ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ａｄｖ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００１； ５７： ９９−１５８．
Ｐａｓｓｗｅｌｌ ＪＨ， Ａｓｈｋｅｎａｚｉ Ｓ， Ｈａｒｌｅｖ Ｅ， Ｍｉｒｏｎ Ｄ， Ｒａｍｏｎ Ｒ， Ｆａｒｚａｍ Ｎ， Ｌｅｒｎｅｒ−Ｇｅｖａ Ｌ， Ｌｅｖｉ Ｙ， Ｃｈｕ Ｃ， Ｓｈｉｌｏａｃｈ Ｊ， Ｒｏｂｂｉｎｓ ＪＢ， Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ Ｒ， Ｉｓｒａｅｌ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ． Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ−ＣＲＭ９ ａｎｄ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｔｙｐｅ ２ａ−ｒＥＰＡｓｕｃｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｏｎｅ− ｔｏ ｆｏｕｒ−ｙｅａｒ ｏｌｄ ｃｈｉｌｄｒｅｎ． Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ ２００３； ２２： ７０１−７０６．
Ｐａｓｓｗｅｌｌ ＪＨ， Ｈａｒｌｅｖ Ｅ， Ａｓｈｋｅｎａｚｉ Ｓ， Ｃｈｕ Ｃ， Ｍｉｒｏｎ Ｄ， Ｒａｍｏｎ Ｒ， Ｆａｒｚａｎ Ｎ， Ｓｈｉｌｏａｃｈ Ｊ， Ｂｒｙｌａ ＤＡ， Ｍａｊａｄｌｙ Ｆ， Ｒｏｂｅｒｓｏｎ Ｒ， Ｒｏｂｂｉｎｓ ＪＢ， Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ Ｒ． Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｉｎ Ｉｓｒａｅｌ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０００； ６９： １３５１−１３５７．
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Ｒｏｓｓｉ Ｇ， Ｒｕｇｇｉｅｒｏ Ｐ， Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉ Ｓ， Ｐａｎｃｏｔｔｏ Ｌ， Ｆｏｒｔｕｎａ Ｄ， Ｌａｕｒｅｔｔｉ Ｌ， Ｖｏｌｐｉｎｉ Ｇ， Ｍａｎｃｉａｎｔｉ Ｓ， Ｃｏｒａｚｚａ Ｍ， Ｔａｃｃｉｎｉ Ｅ， Ｄｉ Ｐｉｓａ Ｆ， Ｒａｐｐｕｏｌｉ Ｒ， Ｄｅｌ Ｇｉｕｄｉｃｅ Ｇ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｎ ｔｈｅ ｂｅａｇｌｅ ｄｏｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ： ｓａｆｅｔｙ， ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ， ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２００４； ７２： ３２５２−３２５９．
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【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの構造を含む、α１，６−グルカンを含むヘリコバクター・ピロリ化合物であって、
【化１】
Ｒは、α１，３−ＤＤ−ヘプタンに結合したα１，６−グルカンで置換したα−ＤＤＨｅｐ−３−α−Ｌ−Ｆｕｃ−３−β−ＧｌｃＮＡｃ三糖類であり、
α１，３−ＤＤ−ヘプタンの最後のＤＤ−Ｈｅｐ残基は、β−ＧｌｃＮＡｃ残基でキャッピングされることを特徴とする化合物。
【請求項２】
グルカンは、３から１２のα１，６−結合グルコース残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ヘプタン部分が２から６のα１，３−結合ヘプトース残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒが以下を含み、
【化２】
β−ＧｌｃＮＡｃ残基ＬがＨｅｐ ＧのＯ−２に結合する場合、ｎ＝１乃至１１であり、ｍ＝０乃至４であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
ｎ＝９であることを特徴とする請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ｍ＝２であることを特徴とする請求項４または５に記載の化合物。
【請求項７】
式Ｉの構造がＫｄｏ残基Ｃに共有結合している脂質Ａ部分をさらに含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項８】
脂質Ａ分子は、Ｏ−脱アシル化するか、または、Ｋｄｏ残基のケトシド結合の加水分解によって開裂することを特徴とする請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物はピロリ菌株ＨＰ０８２６：：Ｋａｎから分離されるか、または、精製されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１０】
リンカー分子、タンパク質担体、または、その組み合わせに共役した、ほぼ線形のα１，６−グルカンを含む化合物を含む複合体。
【請求項１１】
ほぼ線形のα１，６−グルカンを含む化合物は、請求項１乃至９のいずれか１つに記載の化合物であり、
式Ｉの構造は、リンカー分子、タンパク質担体、またはその組み合わせに共役されることを特徴とする請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
ほぼ線形のα１，６−グルカンを含む化合物がデキストランであることを特徴とする請求項１０に記載の複合体。
【請求項１３】
タンパク質担体が、破傷風トキソイドまたはウシ血清アルブミン、ＣＲＭ、または、ＣＲＭ１９７であることを特徴とする請求項９乃至１２のいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１４】
請求項１乃至９のいずれか１つに記載の１以上の化合物、および／または、請求項１０乃至１３のいずれか１つに記載の複合体を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１のα１，６−グルカンエピトープを含む化合物を認識する抗体。
【請求項１６】
抗体がモノクローナル抗体１Ｃ４Ｆ９であることを特徴とする請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
処置を必要としている個体において、α１，６−グルカンを発現するピロリ菌株の補体を媒介とした溶菌を引き起こすための、請求項１５に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項１８】
請求項１５に記載のモノクローナル抗体を、必要としている個体に投与する工程を含む、α１，６−グルカンを発現するピロリ菌株の補体を媒介とした溶菌を誘発する方法。
【請求項１９】
個体内でピロリ菌に対する免疫反応を誘発するための、有効な量の請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
有効な量の請求項１４に記載の組成物を個体に投与する工程を含む、前記個体でのピロリ菌に対する免疫反応を誘発する方法。
【請求項２１】
化合物が適切な担体タンパク質に共役されることを特徴とする請求項１９に記載の使用、または、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
化合物が、リポ多糖類の２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸（Ｋｄｏ）を介して、適切な担体タンパク質に共役されることを特徴とする請求項１９に記載の使用、または、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
免疫原性の請求項１４に記載の組成物で哺乳動物を免疫化することによって作られた免疫抗血清。
【請求項２４】
免疫抗血清は、ピロリ菌の同種および異種の、分類可能なおよび分類不可能な、変異株および野生株における、α１，６−結合グルカンエピトープを認識するＩｇＧを含むことを特徴とする請求項２３に記載の免疫抗血清。
【請求項２５】
ＩｇＧは、変異体および野生型のα１，６−グルカンを発現するピロリ菌株の補体を媒介とした溶菌を引き起こすことを特徴とする請求項２４に記載の免疫抗血清。
【請求項２６】
ハイブリドーマ細胞株１Ｃ４Ｆ９。
【請求項１】
式Ｉの構造を含む、α１，６−グルカンを含むヘリコバクター・ピロリ化合物であって、
【化１】
Ｒは、α１，３−ＤＤ−ヘプタンに結合したα１，６−グルカンで置換したα−ＤＤＨｅｐ−３−α−Ｌ−Ｆｕｃ−３−β−ＧｌｃＮＡｃ三糖類であり、
α１，３−ＤＤ−ヘプタンの最後のＤＤ−Ｈｅｐ残基は、β−ＧｌｃＮＡｃ残基でキャッピングされることを特徴とする化合物。
【請求項２】
グルカンは、３から１２のα１，６−結合グルコース残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ヘプタン部分が２から６のα１，３−結合ヘプトース残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒが以下を含み、
【化２】
β−ＧｌｃＮＡｃ残基ＬがＨｅｐ ＧのＯ−２に結合する場合、ｎ＝１乃至１１であり、ｍ＝０乃至４であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
ｎ＝９であることを特徴とする請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ｍ＝２であることを特徴とする請求項４または５に記載の化合物。
【請求項７】
式Ｉの構造がＫｄｏ残基Ｃに共有結合している脂質Ａ部分をさらに含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項８】
脂質Ａ分子は、Ｏ−脱アシル化するか、または、Ｋｄｏ残基のケトシド結合の加水分解によって開裂することを特徴とする請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物はピロリ菌株ＨＰ０８２６：：Ｋａｎから分離されるか、または、精製されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１０】
リンカー分子、タンパク質担体、または、その組み合わせに共役した、ほぼ線形のα１，６−グルカンを含む化合物を含む複合体。
【請求項１１】
ほぼ線形のα１，６−グルカンを含む化合物は、請求項１乃至９のいずれか１つに記載の化合物であり、
式Ｉの構造は、リンカー分子、タンパク質担体、またはその組み合わせに共役されることを特徴とする請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
ほぼ線形のα１，６−グルカンを含む化合物がデキストランであることを特徴とする請求項１０に記載の複合体。
【請求項１３】
タンパク質担体が、破傷風トキソイドまたはウシ血清アルブミン、ＣＲＭ、または、ＣＲＭ１９７であることを特徴とする請求項９乃至１２のいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１４】
請求項１乃至９のいずれか１つに記載の１以上の化合物、および／または、請求項１０乃至１３のいずれか１つに記載の複合体を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１のα１，６−グルカンエピトープを含む化合物を認識する抗体。
【請求項１６】
抗体がモノクローナル抗体１Ｃ４Ｆ９であることを特徴とする請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
処置を必要としている個体において、α１，６−グルカンを発現するピロリ菌株の補体を媒介とした溶菌を引き起こすための、請求項１５に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項１８】
請求項１５に記載のモノクローナル抗体を、必要としている個体に投与する工程を含む、α１，６−グルカンを発現するピロリ菌株の補体を媒介とした溶菌を誘発する方法。
【請求項１９】
個体内でピロリ菌に対する免疫反応を誘発するための、有効な量の請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
有効な量の請求項１４に記載の組成物を個体に投与する工程を含む、前記個体でのピロリ菌に対する免疫反応を誘発する方法。
【請求項２１】
化合物が適切な担体タンパク質に共役されることを特徴とする請求項１９に記載の使用、または、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
化合物が、リポ多糖類の２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸（Ｋｄｏ）を介して、適切な担体タンパク質に共役されることを特徴とする請求項１９に記載の使用、または、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
免疫原性の請求項１４に記載の組成物で哺乳動物を免疫化することによって作られた免疫抗血清。
【請求項２４】
免疫抗血清は、ピロリ菌の同種および異種の、分類可能なおよび分類不可能な、変異株および野生株における、α１，６−結合グルカンエピトープを認識するＩｇＧを含むことを特徴とする請求項２３に記載の免疫抗血清。
【請求項２５】
ＩｇＧは、変異体および野生型のα１，６−グルカンを発現するピロリ菌株の補体を媒介とした溶菌を引き起こすことを特徴とする請求項２４に記載の免疫抗血清。
【請求項２６】
ハイブリドーマ細胞株１Ｃ４Ｆ９。
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｆ】
【図７】
【図３Ｅ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｆ】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５０１０８０（Ｐ２０１３−５０１０８０Ａ）
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２１９１６（Ｐ２０１２−５２１９１６）
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１１７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１１８７９
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５０６１７５７９２）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１１７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１１８７９
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５０６１７５７９２）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (9)
【Ｆターム（参考）】
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