ピロロキノリンキノン（ＱＵＩＮＩＮＥ）依存性可溶性グルコースデヒドロゲナーゼの突然変異体
本発明は、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ−ｓＧＤＨのタンパク質配列（配列番号２）の４２８位にアミノ酸置換を含有する、ＰＱＱ−ｓＧＤＨの新規の突然変異体に関する。本発明は、グルコースアッセイ、特に糖尿病の被験体における血中グルコースアッセイにおいて関心がもたれるグルコース電極の開発、及びグルコースを燃料として利用するバイオ燃料電池の実現のための上記ＰＱＱ−ｓＧＤＨ突然変異体の使用にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースアッセイ、特に糖尿病の被験体の血中グルコースアッセイにおいて関心がもたれるグルコース電極の開発の分野、及びグルコースを燃料として使用するバイオ燃料電池を応用するための分野に関する。
【０００２】
本発明は、より具体的には、野生型酵素に比べて有利な特性を有する酵素ピロロキノリンキノン可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨとも呼ばれる）の突然変異体に関する。
【背景技術】
【０００３】
２型糖尿病はフランスにおいて２００万人近くの人々に影響を与えているが、この数に疾患に気付いていない６０００００人を加える必要がある。米国においては状況は更に深刻である。先進国では、糖尿病は２０歳〜６５歳という年齢層での失明の主要な原因である。
【０００４】
この疾患のモニタリング及び管理は、とりわけ血中グルコースの毎日の定量及びインシュリンの注射に基づく。様々な会社によって、患者が血糖値を自分で測定することを可能にするグルコースセンサーが提供されている。これらのセンサーは電流測定センサー、電位差測定センサー又は電量測定センサーであり得るが、全てグルコースを酸化することが可能な酵素の使用に基づいている。２つの主要な酵素はグルコースオキシダーゼ及びＰＱＱ ｓ−ＧＤＨである。
【０００５】
ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼは、アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）において同定されたキノプロテインファミリーに属し、２つのタイプがある（一方は膜酵素であり、他方は可溶性酵素である）。これらの酵素はＤ−グルコノラクトンへのグルコースの酸化を触媒し、電子供給体として使用することができる。
【０００６】
アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨは、約５０ｋＤａの２つのサブユニット（アポ酵素）とピロロキノリンキノン補因子（ＰＱＱ）とからなるホモ二量体から構成される（非特許文献１）。この酵素は活性部位を有し、ＰＱＱの存在下ではその内部でグルコースの酸化が触媒される。この活性部位は７６位、１４４位、１６９位、３４３位、３４６位及び４２８位に位置するアミノ酸から構成される。
【０００７】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨは容易に大量に得ることができるため、産業的にかなりの関心がもたれている。このため、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨは血糖値の自己モニタリングのためのグルコースセンサーに使用される主要な酵素となっている。キノプロテインの利点は、電子受容体としてＯ２を利用するグルコースオキシダーゼとは対照的に、酸素に依存しないことである。
【０００８】
その物理化学的特性に基づくと、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨをバイオ燃料電池（その原理は電流を発生するグルコースの酸化に基づく）の製造に使用することも想定される。
【０００９】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの欠点は、その熱安定性の低さ、生理的ｐＨでの安定性の低さ及び活性の穏やかさである。
【００１０】
幾つかの著作物において、その特性を改善するためにＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの変異体を開発することが試みられている。
【００１１】
「突然変異体」又は「変異体」は、そのタンパク質配列が、野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのタンパク質配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を含むＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを意味する。以下、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの参照ヌクレオチド配列及び参照タンパク質配列は、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの配列とする（それぞれ配列番号１及び配列番号２）。
【００１２】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの安定性を改善することを目的とする突然変異
特許文献１は、２つのサブユニットがジスルフィド架橋によって結合するように突然変異させたＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを記載している。この突然変異は、４１５位及び４１４位の少なくとも１つのアミノ酸、並びに／又は同時に３４０位及び４１８位に位置する２つのアミノ酸をシステイン残基で置き換えることからなる。これらの修飾は、より良好な熱安定性を酵素に与えている。
【００１３】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨをその基質による阻害に対する感受性が低下したものにすることを目的とする突然変異
特許文献２は、領域３４９〜３７７内の少なくとも１つのアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えたＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを記載している。この修飾は、基質による阻害に対する感受性が低下した酵素をもたらし、したがって高濃度のグルコースの存在下で使用することができる。
【００１４】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨをその天然基質（グルコース）に対してより特異的なものにすることを目的とする突然変異
野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを修飾して、より基質特異的なものにすることも可能である。或る基質に対して特異的な酵素は該基質が関与する反応しか触媒しないが、逆に基質特異性の低い酵素は、その天然基質に構造的に類似した基質に基づく反応を触媒することが可能である。ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの天然基質はグルコースであるが、野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの特異性は低く、他の単糖類及び二糖類の酸化を触媒することも可能である。
【００１５】
幾つかの著作物が、野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨをグルコースに対してより特異的にするために修飾することを提案している：
このため、特許文献３は４９位、６７位〜６９位、７６位、８９位、１２９位〜１３１位、１６７位〜１７０位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、２４９位、３００位、３４１位〜３４３位、３４９位、３５１位及び４２９位に位置するアミノ酸の少なくとも１つを置換すること、並びに／又はアミノ酸を４２８位と４２９位との間に導入することによってＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを修飾することを提案している；
特許文献４は、４２８位と４２９位との間にロイシン、リシン又はアラニンを挿入することによってＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを修飾することを提案している；
特許文献５は、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの７５位、３２６位〜３５４位、２７８位〜３２０位及び１６２位〜１９７位のうちの１つの位置でアミノ酸を置換することを記載している；
特許文献６は、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの４２８位と４２９位との間にアミノ酸を挿入し、任意で４２８位のアミノ酸をロイシン、プロリン又はバリンで置換することを提言している；
特許文献７は、１２５位、１２８位、１４２位、１６８位、１６９位、１７０位、２２４位、２３０位、２３６位、３４５位、３５１位、４１６位又は４２８位に１つ又は複数の置換を有するアシネトバクター属のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体を記載している。この文献は更に、多数の突然変異部位を有する具体的な突然変異体を列挙している；
特許文献８は、４２８位と４２９位との間にロイシン、アラニン又はリシンの挿入を有するアシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumanii）のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体、又は４２９位のアミノ酸がフェニルアラニン、プロリン、ロイシン又はチロシンで置換されている突然変異体を挙げている；
特許文献９は、３４８位のアミノ酸をアラニン、グリシン又はセリンで、４２８位のアミノ酸をロイシン、プロリン又はバリンで置換することを提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第７，２４４，６００号
【特許文献２】米国特許第７，２４４，５８１号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０１０５１７３号
【特許文献４】欧州特許出願公開第１３６７１２０号
【特許文献５】米国特許第７，０３７，６９８号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００７／０２４３５６６号
【特許文献７】国際公開第２００６／０８５５０９号
【特許文献８】欧州特許出願公開第１６６６５８６号
【特許文献９】米国特許第７，１３２，２７０号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Oubrieet al.， J. Mol. Biol; 289，319-333 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
グルコースセンサーで使用するためには、より活性の高い、すなわちＤ−グルコノラクトンへのグルコースのより速い変換反応を可能にするＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を得ることが必要とされるが、これは既存の突然変異体では可能ではない。
【００１９】
したがって、十分な又は更には改善された熱安定性及びｐＨ安定性を保持したうえで、野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨよりも良好な活性を示すＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを開発することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この要求を満たすために、本発明者らは、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの新規の突然変異体を開発した。これらの突然変異体は、４２８位に位置するアスパラギンがシステイン、チロシン、アラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸で置換されているようなものである。
【００２１】
したがって、本発明の第１の目的は、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨに対して少なくとも８０％の同一率を有するＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体であって、４２８位に位置するそのアミノ酸が、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのタンパク質配列（配列番号２）と比べてシステイン、チロシン、アラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸を含む群から選択されるアミノ酸で置換されていることを特徴とする、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨに対して少なくとも８０％の同一率を有するＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体に関する。
【００２２】
本発明に至った研究において、本発明者らは、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体であって、４２８位に位置するそのアミノ酸が、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのタンパク質配列（配列番号２）と比べてリシンで置換されていることを特徴とする、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体も作製した（実施例第４部を参照されたい）。この突然変異体は配列番号１０のタンパク質配列を有し、配列番号９の核酸分子によってコードされる。この突然変異体は、下記表Ｉに提示される配列番号１７及び配列番号１８のオリゴヌクレオチドを用いて作製することができる。
【００２３】
アミノ酸のナンバリングは、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの配列を基準とする。しかしながら、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体は、このアシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体に限定されず、本発明はアシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨに対して少なくとも９０％の同一率を有するＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体にも関する。
【００２４】
参照配列であるアシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの配列（配列番号２）に対する配列の同一性は、２つの配列をそれらの間で最大の一致が得られるようにアラインメントした場合に同一であるアミノ酸残基のパーセンテージに応じて評価する。
【００２５】
当業者は配列を比較するためのコンピュータプログラム、例えばＢＬＡＳＴ ｓｕｉｔｅのプログラム（Altschul et al., NAR, 25, 3389-3402）を用いて同一率を算出することができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、参照配列として示した配列番号２全体からなる比較ウィンドウ上で採用される。
【００２６】
参照配列と少なくともＸ％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明においては、該参照ペプチドの機能的特性（本発明の場合、そのグルコース酸化の酵素活性）を保持したまま、参照配列の１００個のアミノ酸に対して最大で１００−Ｘ個の変化をその配列中に含むことのできるペプチドとして定義される。本発明の意味において、変化という用語は、参照配列におけるアミノ酸の欠失、置換、又は連続的若しくは分散した挿入を含む。
【００２７】
アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの４２８位に位置するアミノ酸に対応するアミノ酸は、該相同酵素とアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨとの配列アラインメントによって同定される。
【００２８】
本発明は特に、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１２及び配列番号１４（それぞれＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのシステイン突然変異体、チロシン突然変異体、アラニン突然変異体、アスパラギン酸突然変異体及びグルタミン酸突然変異体のアミノ酸配列に対応する）から選択されるアミノ酸配列を有するＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体に関する。これらの突然変異酵素は、好適なオリゴヌクレオチド対によるアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ遺伝子の突然変異によって得られるヌクレオチド断片によってコードされる。
【００２９】
これらの本発明による新規のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体は、市販のグルコースセンサーに使用される酵素であるアシネトバクター・カルコアセチカスの野生型酵素に比べて以下の改善された性能を示す：
これらの活性は、とりわけ生理的濃度、すなわち１ｍＭ〜１０ｍＭのグルコースで野生型酵素の活性よりも高い。酵素の活性は、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨによるグルコースのグルコノラクトンへの酸化反応中に起こるレドックス試薬の着色をモニタリングすることによって定量化することができる。レドックス試薬は例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）と組み合わせたフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）、フェリシアン化カリウム及びフェロセンである；
これらは高濃度でのグルコースの阻害効果に対する感受性が低い。
【００３０】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体の基質に対する特異性は、基質であるグルコース及び幾つかの他の糖類（二糖類等）に対する該突然変異体の酵素活性を比較することによって評価することができる。
【００３１】
本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体の有利な特性によって、それらはグルコースをエネルギー源として用いるバイオ燃料電池等の生体電気システム及びグルコースバイオセンサーに特に好適に使用されるものとなる。
【００３２】
本発明は、野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ（例えばアシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ）を、表Ｉに示されるオリゴヌクレオチド対からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド対で修飾することによって得られる、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体をコードする核酸分子にも関する。
【００３３】
【表１】
【００３４】
本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体をコードする核酸分子は特に、アシネトバクター・カルコアセチカスによって生成される配列番号１の配列の野生型酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を修飾することによって作製することができる。遺伝子の配列を修飾する幾つかの技法が当業者に既知である（Igarashi et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 428 (2004) 52-63による概説を参照されたい）。特定の作製方法によると、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体をコードする核酸分子は、導入すべき突然変異を有するオリゴヌクレオチドの存在下でのＰＣＲによる突然変異誘発によって作製される（下記の実施例を参照されたい）。
【００３５】
特定の実施の形態によると、本発明は、その配列が配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１及び配列番号１３の配列からなる群から選択される、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体をコードする核酸分子に関する。本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体をコードする核酸分子を、次いでプラスミド等の発現ベクターにクローニングした後、細菌、酵母又は細胞培養物等の好適な宿主において形質転換させることができる。
【００３６】
発現ベクターとは、その発現に不可欠なシグナル、特にプロモーター（構成的又は誘導性）、リボソーム結合部位、転写終結シグナル、及び任意で抗生物質抵抗性遺伝子等の選択マーカーの間にヌクレオチドコード配列を挿入することを可能にする領域を有するベクターを意味する。
【００３７】
本発明は、上記核酸分子を含む発現ベクター、及び該発現ベクターで形質転換され、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を発現する宿主細胞に更に関する。
【００３８】
発現ベクターは当業者に既知の任意の方法、特に宿主細胞の膜透過性を例えばカルシウムイオンの存在下で変化させること、又はエレクトロポレーションによって宿主細胞内に導入することができる。
【００３９】
本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を発現するように形質転換した宿主細胞の培養の後、該細胞を遠心分離によって回収し、本発明による該ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を含む酵素を放出するように溶解することができる。
【００４０】
大腸菌（Escherichia coli）が宿主微生物である場合、使用することのできるプラスミドは、特にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８等である。
【００４１】
例としては、使用することのできる宿主細胞は、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌Ｃ６００、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＪＭ１０１、大腸菌ＤＨ５α等を含む。
【００４２】
好ましくは、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体は大腸菌ＪＭ１０１株において生成される。それらをコードする核酸分子は、アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ遺伝子を修飾し、ベクターｐＵＣ１８にクローニングすることによって得られる（Cleton-Jansen et al., Mol. Gen. Genet. 217 (1989) 430-436）。このように生成された突然変異体は、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのシグナル配列のために細菌のペリプラズムに輸送される。次いで、この突然変異体を超音波処理によって細菌を破壊した後に精製する。
【００４３】
本発明は、溶液中のグルコースを定量するため、すなわちサンプル、特に生体サンプル、特に血液中のグルコース濃度を測定するための本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体の使用にも関する。
【００４４】
所与の生体サンプルにおける溶液中のグルコースの定量は、レドックス試薬及び本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を該サンプルに導入した後、得られる着色の強さをグルコース含量が既知の標準溶液と比較することによって行うことができる。
【００４５】
本発明は、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を含むことを特徴とする、溶液中のグルコースを定量するためのキットにも関する。
【００４６】
上記アッセイキットは通常、グルコースアッセイを行うために必要とされる試薬、特に緩衝液（任意の緩衝液を本発明によるキットに使用することができ、リン酸緩衝液及び酢酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）を含む緩衝液、Ｎ−モルホリノ−３−プロパンスルホン酸（ＭＰＯＳ）を含む緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含む緩衝液、ＴＲＩＳ−酢酸緩衝液等の緩衝液の混合物を含む緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない）、レドックス試薬（ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を酸化する任意の試薬であり得るが、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）と組み合わせたフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）、フェリシアン化カリウム、フェロセン、並びにフェロセンメタノール、フェロセンカルボン酸等のフェロセンから誘導される錯体、並びにオスミウム及びルテニウムの錯体を含む群から選択することができる）、検量線を作成するための標準グルコース溶液、及びアッセイを行うために必要とされる使用説明書を更に含む。
【００４７】
本発明は、導電性金属、特に白金、銅、銀、アルミニウム、金若しくは鋼、又はガラス状炭素、カーボンファイバー、カーボンナノチューブファイバー若しくはダイヤモンド等の炭素といった導電材料を含むグルコース電極に更に関する。該導電材料は、少なくとも１つの本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を含む被着物で被覆されている。該被着物は、導電材料の導電性を改善するためのレドックスポリマーを更に含んでいてもよい。
【００４８】
レドックスポリマーは、フェロセン、オスミウム及びルテニウムをベースとしたポリマー、並びにポリピロール及びポリアニリン等の導電性ポリマーから選択される。
【００４９】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を上記導電材料上に固定化する方法は、特にポリマーマトリクスへのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体の封入、ポリマー膜の表面上へのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体の吸着、共有結合による固定、又は電着を含む、当業者が利用可能な従来の方法から選択することができる（Gao et al., Chem. Int. ED. 2002, 41, No. 5, 810-813）。
【００５０】
固定化されたＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体は、補因子ＰＱＱと会合したアポ酵素からなるのが好ましいが、アポ酵素を単独で固定化し、補因子ＰＱＱを、例えば反応混合物において溶液中に更に供給することも可能である。
【００５１】
かかる電極は、グルコースベースのバイオ燃料電池又はグルコースバイオセンサー等の生体電気システムにおいて有利に使用される。
【００５２】
本発明はしたがって、本発明による電極を含むグルコースバイオセンサーにも関する。
【００５３】
グルコースバイオセンサーは、生物学的標的を認識することが可能なバイオレセプターが固定化された電極からなる。バイオレセプターへの生物学的標的の結合によって、膜の物理化学的変化、及び電極に取り付けられた電気化学的変換器（電流測定変換器、電位差測定変換器、電気伝導測定変換器等）による電気信号の生成がもたらされる。本発明の場合、バイオレセプターは本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体であり、生物学的標的はその基質（グルコース）である。
【００５４】
１つの実施の形態によると、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体が固定化された電極はまた、電極からの該突然変異体の脱離を防止する膜で被覆されている。該膜はナフィオン、セルロース、又は任意の生体適合性材料、すなわち生理環境と適合する材料からなるものであり得る。
【００５５】
本発明の１つの実施の形態によると、グルコースバイオセンサーは皮下に埋め込まれ、血中グルコース濃度を記録することを可能にする。
【００５６】
本発明は、グルコースをエネルギー源として用い、アノードである本発明による第一電極と、カソードである第二電極とを備えるバイオ燃料電池にも関する。カソードは例えば、酸素を還元することを可能にし、銅をベースとする酵素群（マルチ銅オキシダーゼ）、特にビリルビンオキシダーゼ及びラッカーゼから選択される酵素を担持する酵素電極であり得る。カソードは例えば白金、金、又は白金合金若しくは金合金の金属電極であってもよい。
【００５７】
本発明は、サンプルにおけるグルコースの溶液アッセイの方法であって、
ａ）その還元が色の変化をもたらすレドックス試薬、及び本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を上記サンプル中に導入する工程、
ｂ）酵素反応後にサンプルの着色の強さを測定する工程、
ｃ）工程ｂ）において測定された着色の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程、
ｄ）上記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程
を含む、サンプルにおけるグルコースの溶液アッセイの方法に更に関する。
【００５８】
その還元が色の変化をもたらすレドックス試薬は、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）と組み合わせたフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）、フェリシアン化カリウム及びフェロセンから選択される。
【００５９】
本発明は、サンプルのグルコースアッセイの方法であって、
ａ）本発明によるグルコース電極を上記サンプル中に導入する工程、
ｂ）サンプル中の電流の強さを測定する工程、
ｃ）工程ｂ）において測定された電流の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程、
ｄ）上記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程
を含むことを特徴とする、サンプルのグルコースアッセイの方法にも関する。
【００６０】
本発明は、上記に提示された構成に加えて、他の構成を更に含むが、これらは本発明の適用例及び添付の図面を参照して、下記に与えられる説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】野生型のアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの活性部位を示す概略図である。この図は非特許文献１に記載の座標ｐｄｂ １ｃｑ１に従って、ＰｙＭｏｌソフトウェア（DeLano Scientific LLCにより公開、２００６年版）を用いて作成した。「Ｇ」はグルコースを表し、「ＰＱＱ」は補酵素ＰＱＱを表す。活性部位のアミノ酸残基のナンバリングは配列番号２に対応する。
【図１Ｂ】Ａｓｎ４２８Ｃｙｓの位置で突然変異させたアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの活性部位を示す概略図である。この図は非特許文献１に記載の座標ｐｄｂ １ｃｑ１に従って、ＰｙＭｏｌソフトウェア（DeLano Scientific LLCにより公開、２００６年版）を用いて作成した。「Ｇ」はグルコースを表し、「ＰＱＱ」は補酵素ＰＱＱを表す。活性部位のアミノ酸残基のナンバリングは配列番号２に対応する。
【図２Ａ】野生型（ＷＴ）及び４２８位でシステインに突然変異させた（Ｎ４２８Ｃ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示すグラフである。
【図２Ｂ】４２８位でチロシンに突然変異させた（Ｎ４２８Ｙ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示すグラフである。
【図２Ｃ】４２８位でアラニンに突然変異させた（Ｎ４２８Ａ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示すグラフである。
【図２Ｄ】４２８位でリシンに突然変異させた（Ｎ４２８Ｋ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示すグラフである。
【図２Ｅ】４２８位でアスパラギン酸に突然変異させた（Ｎ４２８Ｄ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示すグラフである。
【図２Ｆ】４２８位でグルタミン酸に突然変異させた（Ｎ４２８Ｅ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示すグラフである。
【図３Ａ】野生型（ＷＴ）及び４２８位でシステインに突然変異させた（Ｎ４２８Ｃ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのｐＨに応じた活性を示す図である。
【図３Ｂ】野生型（ＷＴ）及び４２８位でシステインに突然変異させた（Ｎ４２８Ｃ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのｐＨに応じた活性を示す図である。
【図４】野生型（ＷＴ）ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ及び４２８位でシステインに突然変異させたＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ（Ｎ４２８Ｃ）の温度に応じた活性曲線を示す図である。
【図５】４２８位でシステインに突然変異させたＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ（Ｎ４２８Ｃ）の異なる基質に応じた活性を示すグラフである。
【実施例】
【００６２】
１．材料
１．１．大腸菌の菌株
ＤＨ５α：ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９、（Φ８０ ｌａｃＺＤＭ１５）、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１（Hanahan, 1983）。この株はプラスミド作製及び定方向突然変異誘発に使用される。
【００６３】
ＪＭ１０１：Ｆ’ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ ｌａｃＩｑ Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５／Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ） ｇｌｎＶ ｔｈｉ。この株は、三角フラスコ内でのアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱグルコースデヒドロゲナーゼの生成に使用される。この株は、ｌａｃプロモーターの発現を阻害するプラスミドＦ−ｐｒｏ−ｌａｃＩを保有する。
【００６４】
１．２．プラスミド
ｐｇｐ４９２：Nora Goosenから提供、アシネトバクター・カルコアセチカスの可溶性ＰＱＱグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列をクローニングすることによって得られた組み換えプラスミド（Cleton-Jansen et al., Mol. Gen. Genet. 217 (1989) 430-436）。
【００６５】
１．３．培養培地
ＬＢ富栄養培地：トリプトン１０ｇ／Ｌ；酵母エキス５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ；蒸留水適量（全量１Ｌ）；ｐＨ無調整、１バールで５０分間オートクレーブ。
【００６６】
２．遺伝子工学技法
２．１．スーパーコンピテント細菌の形質転換
スーパーコンピテント細菌ＤＨ５αは、Inoueの方法によって作製する（Sambrook and Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００６７】
２．２．ＤＮＡの調製
プラスミドＤＮＡ精製キット（Quiagen）を少量及び大量のＤＮＡ調製に使用する。
【００６８】
２．３．二本鎖ＤＮＡのシークエンシング
二本鎖ＤＮＡを、シークエンシングキットＢｉｇＤｙｅターミネーターｖ１．１又はｖ３．１を用いてシークエンシングする。試薬は異なる蛍光マーカーを有する４つのｄｄＮＴＰ（ＢｉｇＤｙｅターミネーター）、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及び反応に必要とされる他の全ての成分を含有する。伸長産物をシークエンサーＡＢＩ ３１３０ｘｌにかける前に精製して、取り込まれなかったマーカー、塩及び他の汚染物質を除去しなくてはならない。
【００６９】
２．４．ＰＣＲ−定方向突然変異誘発
突然変異誘発プロトコルでは、プラスミドの二本鎖の複製に関してポリメラーゼＴａｑよりも６倍信頼性の高いパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）のＤＮＡポリメラーゼＰｆｕを用いてＰＣＲを行う。表Ｉに列挙したオリゴデオキシリボヌクレオチド（各々がプラスミドの鎖に相補的である）は、ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕによるＤＮＡ合成のプライマーとして働き、非再結合（non-religated）末端で突然変異したプラスミドをもたらす。
【００７０】
次いで、親ＤＮＡに特異的なエンドヌクレアーゼＤｐｎ Ｉ（標的配列５’−Ｇｍ６ＡＴＣ−３’）で増幅産物を処理し、それにより突然変異を含有する新合成（neosynthesized）ＤＮＡを選択することを可能にする。大半の大腸菌株から単離されるＤＮＡは「ＤＡＭメチル化（methylated DAM）」されており（ＤＡＭ：ＤＮＡアデニンメチラーゼ；ＧＡＴＣ配列のアデニン上のメチルの存在を示唆する）、したがってＤｐｎ Ｉによって消化することができる。消化混合物の一部を使用して、突然変異プラスミドの末端と再結合するスーパーコンピテントＤＨ５α細菌を形質転換する。
【００７１】
３．アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの生成、精製及び特徴決定
３．１．野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ及び突然変異ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの生成
アポ酵素ｓ−ＧＤＨを大腸菌ＪＭ１０１株において、野生型ｓ−ＧＤＨ又は突然変異ｓ−ＧＤＨをコードする配列を有する組み換えプラスミドｐｇｐ４９２によって生成させる。アンピシリン（２００ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢ培地（ＬＢＡ）５０ｍＬの前培養物に、アンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天皿上で単離されたクローンを播種し、３７℃で一晩２２０ｒｐｍで攪拌する。培養物をＬＢＡ培地に１００倍で播種する。これを３７℃で攪拌しながら（２２０ｒｐｍ）、ＯＤ６００ｎｍが０．４ＯＤ６００ｎｍ／ｍＬ〜１ＯＤ６００ｎｍ／ｍＬとなるまでインキュベートする。次いで、培養物を４００μＭのＩＰＴＧによって誘導した後、２５℃で２０時間攪拌する（１８０ｒｐｍ〜２２０ｒｐｍ）。遠心分離（５２８５ｇ、４℃）によって回収した細胞を、Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ３ｍＭの緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、−２０℃又は添加剤を加えずに−８０℃で保管する。
【００７２】
３．２．野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ酵素及び突然変異ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ酵素の精製
３．２．１．細胞破壊及びＤＮａｓｅ Ｉでの処理
１リットルの培養物から得られた細胞ペレットを、Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ３ｍＭの緩衝液（ｐＨ７．５）２０ｍＬ中に溶解させ、４０Ｗの超音波処理出力で超音波１秒、停止１秒のサイクルで３分間超音波処理する。得られたサンプル（粗抽出物と呼ぶ）に最後に２ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加し、室温で３０分間ＤＮａｓｅ Ｉ（粗抽出物１ｍＬ当たり１Ｕ）で処理する。次いで、不溶性細胞残屑を２００００ｇで４５分間の遠心分離によって粗抽出物から除去する。
【００７３】
３．２．２．陽イオン交換クロマトグラフィー
カットオフ値（cutoff threshold）が０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ ０．２２μｍ、Millipore）で濾過して、ＯＤ２８０ｎｍが１０となるように希釈した超音波処理上清を、ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（GE Healthcare（登録商標））に接続し、Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ３ｍＭの緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した陽イオン交換カラムｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ（GE Healthcare（登録商標））に投入する。溶出は同緩衝液中０Ｍから１ＭまでというＮａＣｌ勾配で、５ｍＬ／分の流速で行う。ｓ−ＧＤＨタンパク質を含有する画分を合わせ、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ１０膜上での遠心分離によって濾過することで濃縮する。この段階でｓ−ＧＤＨタンパク質は純粋であり、硫酸アンモニウム（９０％飽和）の存在下、−２０℃で沈殿形態で保管することができる。
【００７４】
３．２．３．野生型ｓ−ＧＤＨ酵素及び突然変異ｓ−ＧＤＨ酵素の特徴決定
３．２．３．１．分子量の決定
精製後のｓ−ＧＤＨ単量体の分子量を、ＭＡＬＤＩ質量分析によって決定する。タンパク質をＰＤ１０カラム（GE Healthcare）上で脱塩し、重炭酸アンモニウム５０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出する。次いで、凍結乾燥したサンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析すると、分子量が５０２３４．８３Ｄａであることが確認される。この分子量はシグナルペプチドを有しないＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの理論分子量に一致する。
【００７５】
３．２．３．２．補因子ＰＱＱによるｓ−ＧＤＨの再構成
精製（Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ３ｍＭの緩衝液（ｐＨ７．５））の終了時に、酵素溶液をＰＱＱと共に室温で１５分間プレインキュベートする。添加したＰＱＱは、酵素のモル濃度（molarity of the concentration）の２倍に等しい最終濃度に相当する。次いで、Ｐｉｐｅｓ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ３ｍＭの緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＰＤ１０カラム（GE Healthcare）上で脱塩することによって過剰のＰＱＱを除去する。
【００７６】
３．２．３．３．濃度の測定
溶液中の酵素濃度を、補因子ＰＱＱを有する又は有しない酵素（二量体又は単量体；吸光係数はそれぞれ１．２８ｌ・ｇ−１・ｃｍ−１又は１．６７ｌ・ｇ−１・ｃｍ−１である）を用いて２８０ｎｍで測定したＯＤから算出する（Olsthoorn et al., 1997）。
【００７７】
３．２．３．４．酵素試験
酵素試験は、リン酸ナトリウム２０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７）中、３７℃、３ｍＬの容量でVarianの分光光度計を用いて、電子受容体として働くＰＭＳを用いたＤＣＩＰの還元による消失を６００ｎｍで時間に応じてモニタリングすることで行う。酵素の特異的活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１分間に消失したＤＣＩＰのμｍｏｌ量で表される。ＰＭＳ及びＤＣＩＰの濃度はそれぞれ０．６ｍＭ及び０．０６ｍＭである。酵素を−０．０５ＯＤ６００ｎｍ／分と−０．２ＯＤ６００ｎｍ／分との間の傾きが測定されるように希釈する。
【００７８】
４．野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ及び突然変異ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの酵素特性を研究する技法
４．１．定常状態での速度定数（ｋｃａｔ）及びミカエリス定数（ＫＭ）の決定
実験はリン酸ナトリウム２０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７）中３７℃で、Varianの分光光度計上で行う。この試験における基質（グルコース及びマルトース）の濃度は、０ｍＭ〜８００ｍＭの間で変化させる。
【００７９】
ＰＭＳを第１の電子受容体として使用し、酵素活性を第２の電子受容体として使用されるＤＣＩＰの還元によって６００ｎｍでモニタリングする。ＰＭＳ及びＤＣＩＰの初期濃度はそれぞれ０．６ｍＭ及び０．０６ｍＭである。酵素を添加することによって試験を開始する。実験点は、以下の等式によるＳｉｇｍａ−ｐｌｏｔ ６．０ソフトウェアを用いた等式１、等式２又は等式３による非線形回帰によって、分析する：
（１）ミカエリス−メンテンモデル
ｋｓｓ＝ｋｃａｔ×［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］）
（２）二重直角双曲線関数（Double hyperbole）
ｋｓｓ＝ｋｃａｔ１×［Ｓ］／（ＫＭ１＋［Ｓ］）＋ｋｃａｔ２×［Ｓ］／ＫＭ２＋［Ｓ］）
（３）競合的阻害によるミカエリス−メンテンモデル
ｖ／ｖｍａｘ＝［Ｓ］／ＫＳ×（１＋［Ｓ］／ＫＳ＋［Ｉ］／ＫＩ）
【００８０】
結果
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ及び図２Ｆのグラフは、野生型（ＷＴ）及び４２８位で突然変異させた（Ｎ４２８Ｃ、Ｎ４２８Ｙ、Ｎ４２８Ａ、Ｎ４２８Ｋ、Ｎ４２８Ｄ及びＮ４２８Ｅ）アシネトバクター・カルコアセチカスの可溶性ＰＱＱグルコースデヒドロゲナーゼのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示す。
【００８１】
これらの結果から、マルトース及びグルコースという２つの基質について、本発明による突然変異酵素が野生型酵素の活性よりも高い活性を示すことが示される。これらの突然変異体の一部は野生型酵素の２倍の活性を有している。
【００８２】
４．２．ｐＨに応じた調査
４．２．１．ｐＨに応じた活性
ｐＨに応じた反応速度定数の変化の調査を、野生型酵素及び突然変異酵素をＴｒｉｓ １２０ｍＭ、イミダゾール３０ｍＭ、酢酸３０ｍＭから構成される混合緩衝液（ＴＩＡ）（ＮａＣｌを用いてイオン強度を１９０ｍＭに調整する）、又はｐＨ範囲が６〜８のリン酸ナトリウム２０ｍＭの緩衝液（ＮａＰｉ）中でインキュベートすることによって、５〜９のｐＨ範囲にわたって行う。Varianの分光光度計を用いて３７℃で実験を行う。ＰＭＳを第１の電子受容体として０．６ｍＭの濃度で使用する。活性を、第２の電子受容体として０．０６ｍＭの濃度で使用されるＤＣＩＰの消失によって６００ｎｍでモニタリングする。酵素を添加することによって試験を開始する。野生型酵素又は突然変異酵素の最適活性は１００％に対応し、各ｐＨに対する活性を示す。
【００８３】
結果
図３Ａ及び図３Ｂは、野生型（ＷＴ）及び４２８位でシステインに突然変異させた（Ｎ４２８Ｃ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのｐＨに応じた活性を示すグラフである。これらの結果から、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのシステイン突然変異体（Ｎ４２８Ｃ）が野生型酵素の活性に匹敵する相対活性を示すことが示され、この突然変異がｐＨに関わらず相対活性の喪失をもたらさないことが実証される。
【００８４】
４．２．２．ｐＨに応じた安定性
野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ又は突然変異ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのｐＨに応じた安定性を、精製した酵素を均質になるまでｐＨ範囲５〜９の混合緩衝液で希釈することによって決定する。この混合緩衝液はＴｒｉｓ １２０ｍＭ、イミダゾール３０ｍＭ、酢酸３０ｍＭから構成され、そのイオン強度をＮａＣｌを用いて１９０ｍＭに調整する。希釈した酵素溶液（１μｇ／ｍｌ〜６μｇ／ｍｌ）を３７℃でプレインキュベートする。時間に応じて様々なサンプルをとる。残存活性をリン酸ナトリウム２０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７）中、０．０６ｍＭ ＤＣＩＰ、０．６ｍＭ ＰＭＳの存在下でVarianの分光光度計を用いて３７℃で測定する。グルコース濃度は、野生型酵素の試験については７５ｍＭ、突然変異体Ｎ４２８Ｃの試験については１５０ｍＭである。
【００８５】
結果
本発明による突然変異酵素は、その安定性が試験したｐＨ範囲にわたって一定であるか否かを問わないが、ｐＨに関わらず野生型酵素よりも良好な安定性を示す。特に、突然変異酵素はｐＨが７を超えても安定なままである。
【００８６】
４．３．温度に応じた調査
４．３．１．温度に応じた活性
反応速度定数の変化を、リン酸ナトリウム２０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７）中、０．０６ｍＭのＤＣＩＰ及び０．６ｍＭのＰＭＳの存在下でｐＨに応じて調査する。グルコース濃度は、野生型酵素の試験については７５ｍＭ、突然変異体Ｎ４２８Ｃの試験については１５０ｍＭである。温度は１０℃〜６０℃で変化させる。温度制御したVarianの分光光度計ＣＡＲＹ ＵＶ Ｂｉｏｍｅｌｔ上で活性をモニタリングする。酵素を添加することによって試験を開始する。
【００８７】
結果
図４は、野生型（ＷＴ）及び突然変異させた（Ｎ４２８）ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの温度に応じた活性曲線を示す。
【００８８】
この曲線から、３０℃〜５０℃で突然変異酵素が野生型酵素よりも良好な活性を示すことが示される。
【００８９】
４．３．２．温度に応じた酵素の安定性
この研究は、リン酸ナトリウム２０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７）中、０．０６ｍＭのＤＣＩＰ及び０．６ｍＭのＰＭＳの存在下で行う。グルコース濃度は、野生型酵素の試験については７５ｍＭ、突然変異体Ｎ４２８Ｃの試験については１５０ｍＭである。温度は１０℃〜６０℃で変化させる。温度制御したVarianの分光光度計ＣＡＲＹ ＵＶ Ｂｉｏｍｅｌｔ上で３７℃で活性をモニタリングする。酵素を添加することによって試験を開始する。
【００９０】
結果
２００分未満のインキュベーション時間では、突然変異酵素Ｎ４２８Ｃが４０℃及び５０℃で野生型酵素よりも良好な活性を示すことが分かり、したがって血中グルコースアッセイキットについてのその利点が実証される。
【００９１】
４．４．基質に応じた調査
システイン突然変異体（Ｎ４２８Ｃ）の特異性を様々な基質に関して評価した。
【００９２】
この特異性の測定に採用したプロトコルは第４．１．項に記載しているものと同一であるが、異なる基質を用いる。
【００９３】
得られた結果を下記表ＩＩ及び図５に提示する。
【００９４】
【表２】
【００９５】
結果
突然変異体Ｎ４２８Ｃのｋｓｓの生値は大半の基質について野生型酵素の値よりも高いが、相対活性（或る基質に対する酵素の特異性を別の基質と比較して特徴付ける）から、突然変異体Ｎ４２８Ｃがグルコースに対してより特異的であることが示される。したがって、４ｍＭの基質では、マルトースを基質とすると、野生型酵素についてはグルコースと比べた相対活性は８１％であることが測定されるのに対して、突然変異体Ｎ４２８Ｃの示すグルコースと比べたマルトースの相対活性は６１％である。
【００９６】
この同じプロトコルをアスパラギン酸（Ｎ４２８Ｄ）突然変異体、グルタミン酸（Ｎ４２８Ｅ）突然変異体、アラニン（Ｎ４２８Ａ）突然変異体、チロシン（Ｎ４２８Ｙ）突然変異体及びリシン（Ｎ４２８Ｋ）突然変異体のグルコース及びマルトースに対する特異性を評価するために採用した。
【００９７】
結果を下記表ＩＩＩに提示する。
【００９８】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースアッセイ、特に糖尿病の被験体の血中グルコースアッセイにおいて関心がもたれるグルコース電極の開発の分野、及びグルコースを燃料として使用するバイオ燃料電池を応用するための分野に関する。
【０００２】
本発明は、より具体的には、野生型酵素に比べて有利な特性を有する酵素ピロロキノリンキノン可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨとも呼ばれる）の突然変異体に関する。
【背景技術】
【０００３】
２型糖尿病はフランスにおいて２００万人近くの人々に影響を与えているが、この数に疾患に気付いていない６０００００人を加える必要がある。米国においては状況は更に深刻である。先進国では、糖尿病は２０歳〜６５歳という年齢層での失明の主要な原因である。
【０００４】
この疾患のモニタリング及び管理は、とりわけ血中グルコースの毎日の定量及びインシュリンの注射に基づく。様々な会社によって、患者が血糖値を自分で測定することを可能にするグルコースセンサーが提供されている。これらのセンサーは電流測定センサー、電位差測定センサー又は電量測定センサーであり得るが、全てグルコースを酸化することが可能な酵素の使用に基づいている。２つの主要な酵素はグルコースオキシダーゼ及びＰＱＱ ｓ−ＧＤＨである。
【０００５】
ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼは、アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）において同定されたキノプロテインファミリーに属し、２つのタイプがある（一方は膜酵素であり、他方は可溶性酵素である）。これらの酵素はＤ−グルコノラクトンへのグルコースの酸化を触媒し、電子供給体として使用することができる。
【０００６】
アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨは、約５０ｋＤａの２つのサブユニット（アポ酵素）とピロロキノリンキノン補因子（ＰＱＱ）とからなるホモ二量体から構成される（非特許文献１）。この酵素は活性部位を有し、ＰＱＱの存在下ではその内部でグルコースの酸化が触媒される。この活性部位は７６位、１４４位、１６９位、３４３位、３４６位及び４２８位に位置するアミノ酸から構成される。
【０００７】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨは容易に大量に得ることができるため、産業的にかなりの関心がもたれている。このため、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨは血糖値の自己モニタリングのためのグルコースセンサーに使用される主要な酵素となっている。キノプロテインの利点は、電子受容体としてＯ２を利用するグルコースオキシダーゼとは対照的に、酸素に依存しないことである。
【０００８】
その物理化学的特性に基づくと、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨをバイオ燃料電池（その原理は電流を発生するグルコースの酸化に基づく）の製造に使用することも想定される。
【０００９】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの欠点は、その熱安定性の低さ、生理的ｐＨでの安定性の低さ及び活性の穏やかさである。
【００１０】
幾つかの著作物において、その特性を改善するためにＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの変異体を開発することが試みられている。
【００１１】
「突然変異体」又は「変異体」は、そのタンパク質配列が、野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのタンパク質配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を含むＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを意味する。以下、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの参照ヌクレオチド配列及び参照タンパク質配列は、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの配列とする（それぞれ配列番号１及び配列番号２）。
【００１２】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの安定性を改善することを目的とする突然変異
特許文献１は、２つのサブユニットがジスルフィド架橋によって結合するように突然変異させたＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを記載している。この突然変異は、４１５位及び４１４位の少なくとも１つのアミノ酸、並びに／又は同時に３４０位及び４１８位に位置する２つのアミノ酸をシステイン残基で置き換えることからなる。これらの修飾は、より良好な熱安定性を酵素に与えている。
【００１３】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨをその基質による阻害に対する感受性が低下したものにすることを目的とする突然変異
特許文献２は、領域３４９〜３７７内の少なくとも１つのアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えたＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを記載している。この修飾は、基質による阻害に対する感受性が低下した酵素をもたらし、したがって高濃度のグルコースの存在下で使用することができる。
【００１４】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨをその天然基質（グルコース）に対してより特異的なものにすることを目的とする突然変異
野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを修飾して、より基質特異的なものにすることも可能である。或る基質に対して特異的な酵素は該基質が関与する反応しか触媒しないが、逆に基質特異性の低い酵素は、その天然基質に構造的に類似した基質に基づく反応を触媒することが可能である。ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの天然基質はグルコースであるが、野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの特異性は低く、他の単糖類及び二糖類の酸化を触媒することも可能である。
【００１５】
幾つかの著作物が、野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨをグルコースに対してより特異的にするために修飾することを提案している：
このため、特許文献３は４９位、６７位〜６９位、７６位、８９位、１２９位〜１３１位、１６７位〜１７０位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、２４９位、３００位、３４１位〜３４３位、３４９位、３５１位及び４２９位に位置するアミノ酸の少なくとも１つを置換すること、並びに／又はアミノ酸を４２８位と４２９位との間に導入することによってＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを修飾することを提案している；
特許文献４は、４２８位と４２９位との間にロイシン、リシン又はアラニンを挿入することによってＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを修飾することを提案している；
特許文献５は、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの７５位、３２６位〜３５４位、２７８位〜３２０位及び１６２位〜１９７位のうちの１つの位置でアミノ酸を置換することを記載している；
特許文献６は、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの４２８位と４２９位との間にアミノ酸を挿入し、任意で４２８位のアミノ酸をロイシン、プロリン又はバリンで置換することを提言している；
特許文献７は、１２５位、１２８位、１４２位、１６８位、１６９位、１７０位、２２４位、２３０位、２３６位、３４５位、３５１位、４１６位又は４２８位に１つ又は複数の置換を有するアシネトバクター属のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体を記載している。この文献は更に、多数の突然変異部位を有する具体的な突然変異体を列挙している；
特許文献８は、４２８位と４２９位との間にロイシン、アラニン又はリシンの挿入を有するアシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumanii）のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体、又は４２９位のアミノ酸がフェニルアラニン、プロリン、ロイシン又はチロシンで置換されている突然変異体を挙げている；
特許文献９は、３４８位のアミノ酸をアラニン、グリシン又はセリンで、４２８位のアミノ酸をロイシン、プロリン又はバリンで置換することを提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第７，２４４，６００号
【特許文献２】米国特許第７，２４４，５８１号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０１０５１７３号
【特許文献４】欧州特許出願公開第１３６７１２０号
【特許文献５】米国特許第７，０３７，６９８号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００７／０２４３５６６号
【特許文献７】国際公開第２００６／０８５５０９号
【特許文献８】欧州特許出願公開第１６６６５８６号
【特許文献９】米国特許第７，１３２，２７０号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Oubrieet al.， J. Mol. Biol; 289，319-333 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
グルコースセンサーで使用するためには、より活性の高い、すなわちＤ−グルコノラクトンへのグルコースのより速い変換反応を可能にするＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を得ることが必要とされるが、これは既存の突然変異体では可能ではない。
【００１９】
したがって、十分な又は更には改善された熱安定性及びｐＨ安定性を保持したうえで、野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨよりも良好な活性を示すＰＱＱ ｓ−ＧＤＨを開発することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この要求を満たすために、本発明者らは、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの新規の突然変異体を開発した。これらの突然変異体は、４２８位に位置するアスパラギンがシステイン、チロシン、アラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸で置換されているようなものである。
【００２１】
したがって、本発明の第１の目的は、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨに対して少なくとも８０％の同一率を有するＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体であって、４２８位に位置するそのアミノ酸が、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのタンパク質配列（配列番号２）と比べてシステイン、チロシン、アラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸を含む群から選択されるアミノ酸で置換されていることを特徴とする、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨに対して少なくとも８０％の同一率を有するＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体に関する。
【００２２】
本発明に至った研究において、本発明者らは、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体であって、４２８位に位置するそのアミノ酸が、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのタンパク質配列（配列番号２）と比べてリシンで置換されていることを特徴とする、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体も作製した（実施例第４部を参照されたい）。この突然変異体は配列番号１０のタンパク質配列を有し、配列番号９の核酸分子によってコードされる。この突然変異体は、下記表Ｉに提示される配列番号１７及び配列番号１８のオリゴヌクレオチドを用いて作製することができる。
【００２３】
アミノ酸のナンバリングは、アシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの配列を基準とする。しかしながら、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体は、このアシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体に限定されず、本発明はアシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨに対して少なくとも９０％の同一率を有するＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体にも関する。
【００２４】
参照配列であるアシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの配列（配列番号２）に対する配列の同一性は、２つの配列をそれらの間で最大の一致が得られるようにアラインメントした場合に同一であるアミノ酸残基のパーセンテージに応じて評価する。
【００２５】
当業者は配列を比較するためのコンピュータプログラム、例えばＢＬＡＳＴ ｓｕｉｔｅのプログラム（Altschul et al., NAR, 25, 3389-3402）を用いて同一率を算出することができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、参照配列として示した配列番号２全体からなる比較ウィンドウ上で採用される。
【００２６】
参照配列と少なくともＸ％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明においては、該参照ペプチドの機能的特性（本発明の場合、そのグルコース酸化の酵素活性）を保持したまま、参照配列の１００個のアミノ酸に対して最大で１００−Ｘ個の変化をその配列中に含むことのできるペプチドとして定義される。本発明の意味において、変化という用語は、参照配列におけるアミノ酸の欠失、置換、又は連続的若しくは分散した挿入を含む。
【００２７】
アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの４２８位に位置するアミノ酸に対応するアミノ酸は、該相同酵素とアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨとの配列アラインメントによって同定される。
【００２８】
本発明は特に、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１２及び配列番号１４（それぞれＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのシステイン突然変異体、チロシン突然変異体、アラニン突然変異体、アスパラギン酸突然変異体及びグルタミン酸突然変異体のアミノ酸配列に対応する）から選択されるアミノ酸配列を有するＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体に関する。これらの突然変異酵素は、好適なオリゴヌクレオチド対によるアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ遺伝子の突然変異によって得られるヌクレオチド断片によってコードされる。
【００２９】
これらの本発明による新規のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体は、市販のグルコースセンサーに使用される酵素であるアシネトバクター・カルコアセチカスの野生型酵素に比べて以下の改善された性能を示す：
これらの活性は、とりわけ生理的濃度、すなわち１ｍＭ〜１０ｍＭのグルコースで野生型酵素の活性よりも高い。酵素の活性は、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨによるグルコースのグルコノラクトンへの酸化反応中に起こるレドックス試薬の着色をモニタリングすることによって定量化することができる。レドックス試薬は例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）と組み合わせたフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）、フェリシアン化カリウム及びフェロセンである；
これらは高濃度でのグルコースの阻害効果に対する感受性が低い。
【００３０】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体の基質に対する特異性は、基質であるグルコース及び幾つかの他の糖類（二糖類等）に対する該突然変異体の酵素活性を比較することによって評価することができる。
【００３１】
本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体の有利な特性によって、それらはグルコースをエネルギー源として用いるバイオ燃料電池等の生体電気システム及びグルコースバイオセンサーに特に好適に使用されるものとなる。
【００３２】
本発明は、野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ（例えばアシネトバクター・カルコアセチカスの野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ）を、表Ｉに示されるオリゴヌクレオチド対からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド対で修飾することによって得られる、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体をコードする核酸分子にも関する。
【００３３】
【表１】
【００３４】
本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体をコードする核酸分子は特に、アシネトバクター・カルコアセチカスによって生成される配列番号１の配列の野生型酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を修飾することによって作製することができる。遺伝子の配列を修飾する幾つかの技法が当業者に既知である（Igarashi et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 428 (2004) 52-63による概説を参照されたい）。特定の作製方法によると、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体をコードする核酸分子は、導入すべき突然変異を有するオリゴヌクレオチドの存在下でのＰＣＲによる突然変異誘発によって作製される（下記の実施例を参照されたい）。
【００３５】
特定の実施の形態によると、本発明は、その配列が配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１及び配列番号１３の配列からなる群から選択される、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体をコードする核酸分子に関する。本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体をコードする核酸分子を、次いでプラスミド等の発現ベクターにクローニングした後、細菌、酵母又は細胞培養物等の好適な宿主において形質転換させることができる。
【００３６】
発現ベクターとは、その発現に不可欠なシグナル、特にプロモーター（構成的又は誘導性）、リボソーム結合部位、転写終結シグナル、及び任意で抗生物質抵抗性遺伝子等の選択マーカーの間にヌクレオチドコード配列を挿入することを可能にする領域を有するベクターを意味する。
【００３７】
本発明は、上記核酸分子を含む発現ベクター、及び該発現ベクターで形質転換され、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を発現する宿主細胞に更に関する。
【００３８】
発現ベクターは当業者に既知の任意の方法、特に宿主細胞の膜透過性を例えばカルシウムイオンの存在下で変化させること、又はエレクトロポレーションによって宿主細胞内に導入することができる。
【００３９】
本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を発現するように形質転換した宿主細胞の培養の後、該細胞を遠心分離によって回収し、本発明による該ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を含む酵素を放出するように溶解することができる。
【００４０】
大腸菌（Escherichia coli）が宿主微生物である場合、使用することのできるプラスミドは、特にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８等である。
【００４１】
例としては、使用することのできる宿主細胞は、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌Ｃ６００、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＪＭ１０１、大腸菌ＤＨ５α等を含む。
【００４２】
好ましくは、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体は大腸菌ＪＭ１０１株において生成される。それらをコードする核酸分子は、アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ遺伝子を修飾し、ベクターｐＵＣ１８にクローニングすることによって得られる（Cleton-Jansen et al., Mol. Gen. Genet. 217 (1989) 430-436）。このように生成された突然変異体は、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのシグナル配列のために細菌のペリプラズムに輸送される。次いで、この突然変異体を超音波処理によって細菌を破壊した後に精製する。
【００４３】
本発明は、溶液中のグルコースを定量するため、すなわちサンプル、特に生体サンプル、特に血液中のグルコース濃度を測定するための本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体の使用にも関する。
【００４４】
所与の生体サンプルにおける溶液中のグルコースの定量は、レドックス試薬及び本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を該サンプルに導入した後、得られる着色の強さをグルコース含量が既知の標準溶液と比較することによって行うことができる。
【００４５】
本発明は、本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を含むことを特徴とする、溶液中のグルコースを定量するためのキットにも関する。
【００４６】
上記アッセイキットは通常、グルコースアッセイを行うために必要とされる試薬、特に緩衝液（任意の緩衝液を本発明によるキットに使用することができ、リン酸緩衝液及び酢酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）を含む緩衝液、Ｎ−モルホリノ−３−プロパンスルホン酸（ＭＰＯＳ）を含む緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含む緩衝液、ＴＲＩＳ−酢酸緩衝液等の緩衝液の混合物を含む緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない）、レドックス試薬（ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を酸化する任意の試薬であり得るが、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）と組み合わせたフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）、フェリシアン化カリウム、フェロセン、並びにフェロセンメタノール、フェロセンカルボン酸等のフェロセンから誘導される錯体、並びにオスミウム及びルテニウムの錯体を含む群から選択することができる）、検量線を作成するための標準グルコース溶液、及びアッセイを行うために必要とされる使用説明書を更に含む。
【００４７】
本発明は、導電性金属、特に白金、銅、銀、アルミニウム、金若しくは鋼、又はガラス状炭素、カーボンファイバー、カーボンナノチューブファイバー若しくはダイヤモンド等の炭素といった導電材料を含むグルコース電極に更に関する。該導電材料は、少なくとも１つの本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を含む被着物で被覆されている。該被着物は、導電材料の導電性を改善するためのレドックスポリマーを更に含んでいてもよい。
【００４８】
レドックスポリマーは、フェロセン、オスミウム及びルテニウムをベースとしたポリマー、並びにポリピロール及びポリアニリン等の導電性ポリマーから選択される。
【００４９】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を上記導電材料上に固定化する方法は、特にポリマーマトリクスへのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体の封入、ポリマー膜の表面上へのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体の吸着、共有結合による固定、又は電着を含む、当業者が利用可能な従来の方法から選択することができる（Gao et al., Chem. Int. ED. 2002, 41, No. 5, 810-813）。
【００５０】
固定化されたＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体は、補因子ＰＱＱと会合したアポ酵素からなるのが好ましいが、アポ酵素を単独で固定化し、補因子ＰＱＱを、例えば反応混合物において溶液中に更に供給することも可能である。
【００５１】
かかる電極は、グルコースベースのバイオ燃料電池又はグルコースバイオセンサー等の生体電気システムにおいて有利に使用される。
【００５２】
本発明はしたがって、本発明による電極を含むグルコースバイオセンサーにも関する。
【００５３】
グルコースバイオセンサーは、生物学的標的を認識することが可能なバイオレセプターが固定化された電極からなる。バイオレセプターへの生物学的標的の結合によって、膜の物理化学的変化、及び電極に取り付けられた電気化学的変換器（電流測定変換器、電位差測定変換器、電気伝導測定変換器等）による電気信号の生成がもたらされる。本発明の場合、バイオレセプターは本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体であり、生物学的標的はその基質（グルコース）である。
【００５４】
１つの実施の形態によると、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体が固定化された電極はまた、電極からの該突然変異体の脱離を防止する膜で被覆されている。該膜はナフィオン、セルロース、又は任意の生体適合性材料、すなわち生理環境と適合する材料からなるものであり得る。
【００５５】
本発明の１つの実施の形態によると、グルコースバイオセンサーは皮下に埋め込まれ、血中グルコース濃度を記録することを可能にする。
【００５６】
本発明は、グルコースをエネルギー源として用い、アノードである本発明による第一電極と、カソードである第二電極とを備えるバイオ燃料電池にも関する。カソードは例えば、酸素を還元することを可能にし、銅をベースとする酵素群（マルチ銅オキシダーゼ）、特にビリルビンオキシダーゼ及びラッカーゼから選択される酵素を担持する酵素電極であり得る。カソードは例えば白金、金、又は白金合金若しくは金合金の金属電極であってもよい。
【００５７】
本発明は、サンプルにおけるグルコースの溶液アッセイの方法であって、
ａ）その還元が色の変化をもたらすレドックス試薬、及び本発明によるＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体を上記サンプル中に導入する工程、
ｂ）酵素反応後にサンプルの着色の強さを測定する工程、
ｃ）工程ｂ）において測定された着色の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程、
ｄ）上記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程
を含む、サンプルにおけるグルコースの溶液アッセイの方法に更に関する。
【００５８】
その還元が色の変化をもたらすレドックス試薬は、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）と組み合わせたフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）、フェリシアン化カリウム及びフェロセンから選択される。
【００５９】
本発明は、サンプルのグルコースアッセイの方法であって、
ａ）本発明によるグルコース電極を上記サンプル中に導入する工程、
ｂ）サンプル中の電流の強さを測定する工程、
ｃ）工程ｂ）において測定された電流の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程、
ｄ）上記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程
を含むことを特徴とする、サンプルのグルコースアッセイの方法にも関する。
【００６０】
本発明は、上記に提示された構成に加えて、他の構成を更に含むが、これらは本発明の適用例及び添付の図面を参照して、下記に与えられる説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】野生型のアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの活性部位を示す概略図である。この図は非特許文献１に記載の座標ｐｄｂ １ｃｑ１に従って、ＰｙＭｏｌソフトウェア（DeLano Scientific LLCにより公開、２００６年版）を用いて作成した。「Ｇ」はグルコースを表し、「ＰＱＱ」は補酵素ＰＱＱを表す。活性部位のアミノ酸残基のナンバリングは配列番号２に対応する。
【図１Ｂ】Ａｓｎ４２８Ｃｙｓの位置で突然変異させたアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの活性部位を示す概略図である。この図は非特許文献１に記載の座標ｐｄｂ １ｃｑ１に従って、ＰｙＭｏｌソフトウェア（DeLano Scientific LLCにより公開、２００６年版）を用いて作成した。「Ｇ」はグルコースを表し、「ＰＱＱ」は補酵素ＰＱＱを表す。活性部位のアミノ酸残基のナンバリングは配列番号２に対応する。
【図２Ａ】野生型（ＷＴ）及び４２８位でシステインに突然変異させた（Ｎ４２８Ｃ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示すグラフである。
【図２Ｂ】４２８位でチロシンに突然変異させた（Ｎ４２８Ｙ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示すグラフである。
【図２Ｃ】４２８位でアラニンに突然変異させた（Ｎ４２８Ａ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示すグラフである。
【図２Ｄ】４２８位でリシンに突然変異させた（Ｎ４２８Ｋ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示すグラフである。
【図２Ｅ】４２８位でアスパラギン酸に突然変異させた（Ｎ４２８Ｄ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示すグラフである。
【図２Ｆ】４２８位でグルタミン酸に突然変異させた（Ｎ４２８Ｅ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示すグラフである。
【図３Ａ】野生型（ＷＴ）及び４２８位でシステインに突然変異させた（Ｎ４２８Ｃ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのｐＨに応じた活性を示す図である。
【図３Ｂ】野生型（ＷＴ）及び４２８位でシステインに突然変異させた（Ｎ４２８Ｃ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのｐＨに応じた活性を示す図である。
【図４】野生型（ＷＴ）ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ及び４２８位でシステインに突然変異させたＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ（Ｎ４２８Ｃ）の温度に応じた活性曲線を示す図である。
【図５】４２８位でシステインに突然変異させたＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ（Ｎ４２８Ｃ）の異なる基質に応じた活性を示すグラフである。
【実施例】
【００６２】
１．材料
１．１．大腸菌の菌株
ＤＨ５α：ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９、（Φ８０ ｌａｃＺＤＭ１５）、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１（Hanahan, 1983）。この株はプラスミド作製及び定方向突然変異誘発に使用される。
【００６３】
ＪＭ１０１：Ｆ’ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ ｌａｃＩｑ Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５／Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ） ｇｌｎＶ ｔｈｉ。この株は、三角フラスコ内でのアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱグルコースデヒドロゲナーゼの生成に使用される。この株は、ｌａｃプロモーターの発現を阻害するプラスミドＦ−ｐｒｏ−ｌａｃＩを保有する。
【００６４】
１．２．プラスミド
ｐｇｐ４９２：Nora Goosenから提供、アシネトバクター・カルコアセチカスの可溶性ＰＱＱグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列をクローニングすることによって得られた組み換えプラスミド（Cleton-Jansen et al., Mol. Gen. Genet. 217 (1989) 430-436）。
【００６５】
１．３．培養培地
ＬＢ富栄養培地：トリプトン１０ｇ／Ｌ；酵母エキス５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ；蒸留水適量（全量１Ｌ）；ｐＨ無調整、１バールで５０分間オートクレーブ。
【００６６】
２．遺伝子工学技法
２．１．スーパーコンピテント細菌の形質転換
スーパーコンピテント細菌ＤＨ５αは、Inoueの方法によって作製する（Sambrook and Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００６７】
２．２．ＤＮＡの調製
プラスミドＤＮＡ精製キット（Quiagen）を少量及び大量のＤＮＡ調製に使用する。
【００６８】
２．３．二本鎖ＤＮＡのシークエンシング
二本鎖ＤＮＡを、シークエンシングキットＢｉｇＤｙｅターミネーターｖ１．１又はｖ３．１を用いてシークエンシングする。試薬は異なる蛍光マーカーを有する４つのｄｄＮＴＰ（ＢｉｇＤｙｅターミネーター）、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及び反応に必要とされる他の全ての成分を含有する。伸長産物をシークエンサーＡＢＩ ３１３０ｘｌにかける前に精製して、取り込まれなかったマーカー、塩及び他の汚染物質を除去しなくてはならない。
【００６９】
２．４．ＰＣＲ−定方向突然変異誘発
突然変異誘発プロトコルでは、プラスミドの二本鎖の複製に関してポリメラーゼＴａｑよりも６倍信頼性の高いパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）のＤＮＡポリメラーゼＰｆｕを用いてＰＣＲを行う。表Ｉに列挙したオリゴデオキシリボヌクレオチド（各々がプラスミドの鎖に相補的である）は、ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕによるＤＮＡ合成のプライマーとして働き、非再結合（non-religated）末端で突然変異したプラスミドをもたらす。
【００７０】
次いで、親ＤＮＡに特異的なエンドヌクレアーゼＤｐｎ Ｉ（標的配列５’−Ｇｍ６ＡＴＣ−３’）で増幅産物を処理し、それにより突然変異を含有する新合成（neosynthesized）ＤＮＡを選択することを可能にする。大半の大腸菌株から単離されるＤＮＡは「ＤＡＭメチル化（methylated DAM）」されており（ＤＡＭ：ＤＮＡアデニンメチラーゼ；ＧＡＴＣ配列のアデニン上のメチルの存在を示唆する）、したがってＤｐｎ Ｉによって消化することができる。消化混合物の一部を使用して、突然変異プラスミドの末端と再結合するスーパーコンピテントＤＨ５α細菌を形質転換する。
【００７１】
３．アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの生成、精製及び特徴決定
３．１．野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ及び突然変異ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの生成
アポ酵素ｓ−ＧＤＨを大腸菌ＪＭ１０１株において、野生型ｓ−ＧＤＨ又は突然変異ｓ−ＧＤＨをコードする配列を有する組み換えプラスミドｐｇｐ４９２によって生成させる。アンピシリン（２００ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢ培地（ＬＢＡ）５０ｍＬの前培養物に、アンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天皿上で単離されたクローンを播種し、３７℃で一晩２２０ｒｐｍで攪拌する。培養物をＬＢＡ培地に１００倍で播種する。これを３７℃で攪拌しながら（２２０ｒｐｍ）、ＯＤ６００ｎｍが０．４ＯＤ６００ｎｍ／ｍＬ〜１ＯＤ６００ｎｍ／ｍＬとなるまでインキュベートする。次いで、培養物を４００μＭのＩＰＴＧによって誘導した後、２５℃で２０時間攪拌する（１８０ｒｐｍ〜２２０ｒｐｍ）。遠心分離（５２８５ｇ、４℃）によって回収した細胞を、Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ３ｍＭの緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、−２０℃又は添加剤を加えずに−８０℃で保管する。
【００７２】
３．２．野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ酵素及び突然変異ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ酵素の精製
３．２．１．細胞破壊及びＤＮａｓｅ Ｉでの処理
１リットルの培養物から得られた細胞ペレットを、Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ３ｍＭの緩衝液（ｐＨ７．５）２０ｍＬ中に溶解させ、４０Ｗの超音波処理出力で超音波１秒、停止１秒のサイクルで３分間超音波処理する。得られたサンプル（粗抽出物と呼ぶ）に最後に２ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加し、室温で３０分間ＤＮａｓｅ Ｉ（粗抽出物１ｍＬ当たり１Ｕ）で処理する。次いで、不溶性細胞残屑を２００００ｇで４５分間の遠心分離によって粗抽出物から除去する。
【００７３】
３．２．２．陽イオン交換クロマトグラフィー
カットオフ値（cutoff threshold）が０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ ０．２２μｍ、Millipore）で濾過して、ＯＤ２８０ｎｍが１０となるように希釈した超音波処理上清を、ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（GE Healthcare（登録商標））に接続し、Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ３ｍＭの緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した陽イオン交換カラムｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ（GE Healthcare（登録商標））に投入する。溶出は同緩衝液中０Ｍから１ＭまでというＮａＣｌ勾配で、５ｍＬ／分の流速で行う。ｓ−ＧＤＨタンパク質を含有する画分を合わせ、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ１０膜上での遠心分離によって濾過することで濃縮する。この段階でｓ−ＧＤＨタンパク質は純粋であり、硫酸アンモニウム（９０％飽和）の存在下、−２０℃で沈殿形態で保管することができる。
【００７４】
３．２．３．野生型ｓ−ＧＤＨ酵素及び突然変異ｓ−ＧＤＨ酵素の特徴決定
３．２．３．１．分子量の決定
精製後のｓ−ＧＤＨ単量体の分子量を、ＭＡＬＤＩ質量分析によって決定する。タンパク質をＰＤ１０カラム（GE Healthcare）上で脱塩し、重炭酸アンモニウム５０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出する。次いで、凍結乾燥したサンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析すると、分子量が５０２３４．８３Ｄａであることが確認される。この分子量はシグナルペプチドを有しないＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの理論分子量に一致する。
【００７５】
３．２．３．２．補因子ＰＱＱによるｓ−ＧＤＨの再構成
精製（Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ３ｍＭの緩衝液（ｐＨ７．５））の終了時に、酵素溶液をＰＱＱと共に室温で１５分間プレインキュベートする。添加したＰＱＱは、酵素のモル濃度（molarity of the concentration）の２倍に等しい最終濃度に相当する。次いで、Ｐｉｐｅｓ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ３ｍＭの緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＰＤ１０カラム（GE Healthcare）上で脱塩することによって過剰のＰＱＱを除去する。
【００７６】
３．２．３．３．濃度の測定
溶液中の酵素濃度を、補因子ＰＱＱを有する又は有しない酵素（二量体又は単量体；吸光係数はそれぞれ１．２８ｌ・ｇ−１・ｃｍ−１又は１．６７ｌ・ｇ−１・ｃｍ−１である）を用いて２８０ｎｍで測定したＯＤから算出する（Olsthoorn et al., 1997）。
【００７７】
３．２．３．４．酵素試験
酵素試験は、リン酸ナトリウム２０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７）中、３７℃、３ｍＬの容量でVarianの分光光度計を用いて、電子受容体として働くＰＭＳを用いたＤＣＩＰの還元による消失を６００ｎｍで時間に応じてモニタリングすることで行う。酵素の特異的活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１分間に消失したＤＣＩＰのμｍｏｌ量で表される。ＰＭＳ及びＤＣＩＰの濃度はそれぞれ０．６ｍＭ及び０．０６ｍＭである。酵素を−０．０５ＯＤ６００ｎｍ／分と−０．２ＯＤ６００ｎｍ／分との間の傾きが測定されるように希釈する。
【００７８】
４．野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ及び突然変異ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの酵素特性を研究する技法
４．１．定常状態での速度定数（ｋｃａｔ）及びミカエリス定数（ＫＭ）の決定
実験はリン酸ナトリウム２０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７）中３７℃で、Varianの分光光度計上で行う。この試験における基質（グルコース及びマルトース）の濃度は、０ｍＭ〜８００ｍＭの間で変化させる。
【００７９】
ＰＭＳを第１の電子受容体として使用し、酵素活性を第２の電子受容体として使用されるＤＣＩＰの還元によって６００ｎｍでモニタリングする。ＰＭＳ及びＤＣＩＰの初期濃度はそれぞれ０．６ｍＭ及び０．０６ｍＭである。酵素を添加することによって試験を開始する。実験点は、以下の等式によるＳｉｇｍａ−ｐｌｏｔ ６．０ソフトウェアを用いた等式１、等式２又は等式３による非線形回帰によって、分析する：
（１）ミカエリス−メンテンモデル
ｋｓｓ＝ｋｃａｔ×［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］）
（２）二重直角双曲線関数（Double hyperbole）
ｋｓｓ＝ｋｃａｔ１×［Ｓ］／（ＫＭ１＋［Ｓ］）＋ｋｃａｔ２×［Ｓ］／ＫＭ２＋［Ｓ］）
（３）競合的阻害によるミカエリス−メンテンモデル
ｖ／ｖｍａｘ＝［Ｓ］／ＫＳ×（１＋［Ｓ］／ＫＳ＋［Ｉ］／ＫＩ）
【００８０】
結果
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ及び図２Ｆのグラフは、野生型（ＷＴ）及び４２８位で突然変異させた（Ｎ４２８Ｃ、Ｎ４２８Ｙ、Ｎ４２８Ａ、Ｎ４２８Ｋ、Ｎ４２８Ｄ及びＮ４２８Ｅ）アシネトバクター・カルコアセチカスの可溶性ＰＱＱグルコースデヒドロゲナーゼのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示す。
【００８１】
これらの結果から、マルトース及びグルコースという２つの基質について、本発明による突然変異酵素が野生型酵素の活性よりも高い活性を示すことが示される。これらの突然変異体の一部は野生型酵素の２倍の活性を有している。
【００８２】
４．２．ｐＨに応じた調査
４．２．１．ｐＨに応じた活性
ｐＨに応じた反応速度定数の変化の調査を、野生型酵素及び突然変異酵素をＴｒｉｓ １２０ｍＭ、イミダゾール３０ｍＭ、酢酸３０ｍＭから構成される混合緩衝液（ＴＩＡ）（ＮａＣｌを用いてイオン強度を１９０ｍＭに調整する）、又はｐＨ範囲が６〜８のリン酸ナトリウム２０ｍＭの緩衝液（ＮａＰｉ）中でインキュベートすることによって、５〜９のｐＨ範囲にわたって行う。Varianの分光光度計を用いて３７℃で実験を行う。ＰＭＳを第１の電子受容体として０．６ｍＭの濃度で使用する。活性を、第２の電子受容体として０．０６ｍＭの濃度で使用されるＤＣＩＰの消失によって６００ｎｍでモニタリングする。酵素を添加することによって試験を開始する。野生型酵素又は突然変異酵素の最適活性は１００％に対応し、各ｐＨに対する活性を示す。
【００８３】
結果
図３Ａ及び図３Ｂは、野生型（ＷＴ）及び４２８位でシステインに突然変異させた（Ｎ４２８Ｃ）アシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのｐＨに応じた活性を示すグラフである。これらの結果から、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのシステイン突然変異体（Ｎ４２８Ｃ）が野生型酵素の活性に匹敵する相対活性を示すことが示され、この突然変異がｐＨに関わらず相対活性の喪失をもたらさないことが実証される。
【００８４】
４．２．２．ｐＨに応じた安定性
野生型ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ又は突然変異ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨのｐＨに応じた安定性を、精製した酵素を均質になるまでｐＨ範囲５〜９の混合緩衝液で希釈することによって決定する。この混合緩衝液はＴｒｉｓ １２０ｍＭ、イミダゾール３０ｍＭ、酢酸３０ｍＭから構成され、そのイオン強度をＮａＣｌを用いて１９０ｍＭに調整する。希釈した酵素溶液（１μｇ／ｍｌ〜６μｇ／ｍｌ）を３７℃でプレインキュベートする。時間に応じて様々なサンプルをとる。残存活性をリン酸ナトリウム２０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７）中、０．０６ｍＭ ＤＣＩＰ、０．６ｍＭ ＰＭＳの存在下でVarianの分光光度計を用いて３７℃で測定する。グルコース濃度は、野生型酵素の試験については７５ｍＭ、突然変異体Ｎ４２８Ｃの試験については１５０ｍＭである。
【００８５】
結果
本発明による突然変異酵素は、その安定性が試験したｐＨ範囲にわたって一定であるか否かを問わないが、ｐＨに関わらず野生型酵素よりも良好な安定性を示す。特に、突然変異酵素はｐＨが７を超えても安定なままである。
【００８６】
４．３．温度に応じた調査
４．３．１．温度に応じた活性
反応速度定数の変化を、リン酸ナトリウム２０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７）中、０．０６ｍＭのＤＣＩＰ及び０．６ｍＭのＰＭＳの存在下でｐＨに応じて調査する。グルコース濃度は、野生型酵素の試験については７５ｍＭ、突然変異体Ｎ４２８Ｃの試験については１５０ｍＭである。温度は１０℃〜６０℃で変化させる。温度制御したVarianの分光光度計ＣＡＲＹ ＵＶ Ｂｉｏｍｅｌｔ上で活性をモニタリングする。酵素を添加することによって試験を開始する。
【００８７】
結果
図４は、野生型（ＷＴ）及び突然変異させた（Ｎ４２８）ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの温度に応じた活性曲線を示す。
【００８８】
この曲線から、３０℃〜５０℃で突然変異酵素が野生型酵素よりも良好な活性を示すことが示される。
【００８９】
４．３．２．温度に応じた酵素の安定性
この研究は、リン酸ナトリウム２０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７）中、０．０６ｍＭのＤＣＩＰ及び０．６ｍＭのＰＭＳの存在下で行う。グルコース濃度は、野生型酵素の試験については７５ｍＭ、突然変異体Ｎ４２８Ｃの試験については１５０ｍＭである。温度は１０℃〜６０℃で変化させる。温度制御したVarianの分光光度計ＣＡＲＹ ＵＶ Ｂｉｏｍｅｌｔ上で３７℃で活性をモニタリングする。酵素を添加することによって試験を開始する。
【００９０】
結果
２００分未満のインキュベーション時間では、突然変異酵素Ｎ４２８Ｃが４０℃及び５０℃で野生型酵素よりも良好な活性を示すことが分かり、したがって血中グルコースアッセイキットについてのその利点が実証される。
【００９１】
４．４．基質に応じた調査
システイン突然変異体（Ｎ４２８Ｃ）の特異性を様々な基質に関して評価した。
【００９２】
この特異性の測定に採用したプロトコルは第４．１．項に記載しているものと同一であるが、異なる基質を用いる。
【００９３】
得られた結果を下記表ＩＩ及び図５に提示する。
【００９４】
【表２】
【００９５】
結果
突然変異体Ｎ４２８Ｃのｋｓｓの生値は大半の基質について野生型酵素の値よりも高いが、相対活性（或る基質に対する酵素の特異性を別の基質と比較して特徴付ける）から、突然変異体Ｎ４２８Ｃがグルコースに対してより特異的であることが示される。したがって、４ｍＭの基質では、マルトースを基質とすると、野生型酵素についてはグルコースと比べた相対活性は８１％であることが測定されるのに対して、突然変異体Ｎ４２８Ｃの示すグルコースと比べたマルトースの相対活性は６１％である。
【００９６】
この同じプロトコルをアスパラギン酸（Ｎ４２８Ｄ）突然変異体、グルタミン酸（Ｎ４２８Ｅ）突然変異体、アラニン（Ｎ４２８Ａ）突然変異体、チロシン（Ｎ４２８Ｙ）突然変異体及びリシン（Ｎ４２８Ｋ）突然変異体のグルコース及びマルトースに対する特異性を評価するために採用した。
【００９７】
結果を下記表ＩＩＩに提示する。
【００９８】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨに対して少なくとも８０％の同一率を有するＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体であって、４２８位に位置するそのアミノ酸が配列番号２と比べてシステイン、アラニン又はアスパラギン酸を含む群から選択されるアミノ酸で置換されていることを特徴とする、配列番号２のアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨに対して少なくとも８０％の同一率を有するＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体。
【請求項２】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体であって、４２８位に位置するそのアミノ酸が配列番号２と比べて置換されており、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１２及び配列番号１４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の突然変異体ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨをコードすることを特徴とする核酸分子。
【請求項４】
配列番号１５と配列番号１６との対、配列番号１９と配列番号２０との対、配列番号２１と配列番号２２との対、配列番号２３と配列番号２４との対、及び配列番号２５と配列番号２６との対を含む群から選択されるオリゴヌクレオチド対による、配列番号１の配列を有する核酸分子の突然変異によって得られることを特徴とする、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１及び配列番号１３を含む群から選択される配列を有することを特徴とする、請求項３又は４に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターによって形質転換されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の酵素を発現する宿主細胞。
【請求項８】
サンプル中のグルコース濃度を測定するための請求項１又は２に記載のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体の使用。
【請求項９】
前記サンプルが生体サンプル、特に血液であることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体を含むことを特徴とするグルコースアッセイキット。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体を少なくとも１つ含む被着物で被覆された導電材料を含むことを特徴とするグルコース電極。
【請求項１２】
請求項１１に記載の電極からなることを特徴とするグルコースセンサー。
【請求項１３】
アノードである請求項１１に記載の第一電極と、カソードである第二電極とを備えることを特徴とするグルコースバイオ燃料電池。
【請求項１４】
サンプルにおいて溶液中のグルコースを定量する方法であって、
ａ）その還元が色の変化をもたらすレドックス試薬と、請求項１又は２に記載のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体とを前記サンプル中に導入する工程、
ｂ）酵素反応後に前記サンプルの着色の強さを測定する工程、
ｃ）工程ｂ）において測定された着色の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程、
ｄ）前記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程
を含むことを特徴とする、サンプルにおいて溶液中のグルコースを定量する方法。
【請求項１５】
サンプルのグルコースアッセイを行う方法であって、
ａ）請求項１１に記載のグルコース電極を前記サンプル中に導入する工程、
ｂ）前記サンプル中の電流の強さを測定する工程、
ｃ）工程ｂ）において測定された電流の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程、
ｄ）前記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程
を含むことを特徴とする、サンプルのグルコースアッセイを行う方法。
【請求項１】
配列番号２のアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨに対して少なくとも８０％の同一率を有するＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体であって、４２８位に位置するそのアミノ酸が配列番号２と比べてシステイン、アラニン又はアスパラギン酸を含む群から選択されるアミノ酸で置換されていることを特徴とする、配列番号２のアシネトバクター・カルコアセチカスのＰＱＱ ｓ−ＧＤＨに対して少なくとも８０％の同一率を有するＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体。
【請求項２】
ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体であって、４２８位に位置するそのアミノ酸が配列番号２と比べて置換されており、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１２及び配列番号１４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の突然変異体ＰＱＱ ｓ−ＧＤＨをコードすることを特徴とする核酸分子。
【請求項４】
配列番号１５と配列番号１６との対、配列番号１９と配列番号２０との対、配列番号２１と配列番号２２との対、配列番号２３と配列番号２４との対、及び配列番号２５と配列番号２６との対を含む群から選択されるオリゴヌクレオチド対による、配列番号１の配列を有する核酸分子の突然変異によって得られることを特徴とする、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１及び配列番号１３を含む群から選択される配列を有することを特徴とする、請求項３又は４に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターによって形質転換されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の酵素を発現する宿主細胞。
【請求項８】
サンプル中のグルコース濃度を測定するための請求項１又は２に記載のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体の使用。
【請求項９】
前記サンプルが生体サンプル、特に血液であることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体を含むことを特徴とするグルコースアッセイキット。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨの突然変異体を少なくとも１つ含む被着物で被覆された導電材料を含むことを特徴とするグルコース電極。
【請求項１２】
請求項１１に記載の電極からなることを特徴とするグルコースセンサー。
【請求項１３】
アノードである請求項１１に記載の第一電極と、カソードである第二電極とを備えることを特徴とするグルコースバイオ燃料電池。
【請求項１４】
サンプルにおいて溶液中のグルコースを定量する方法であって、
ａ）その還元が色の変化をもたらすレドックス試薬と、請求項１又は２に記載のＰＱＱ ｓ−ＧＤＨ突然変異体とを前記サンプル中に導入する工程、
ｂ）酵素反応後に前記サンプルの着色の強さを測定する工程、
ｃ）工程ｂ）において測定された着色の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程、
ｄ）前記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程
を含むことを特徴とする、サンプルにおいて溶液中のグルコースを定量する方法。
【請求項１５】
サンプルのグルコースアッセイを行う方法であって、
ａ）請求項１１に記載のグルコース電極を前記サンプル中に導入する工程、
ｂ）前記サンプル中の電流の強さを測定する工程、
ｃ）工程ｂ）において測定された電流の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程、
ｄ）前記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程
を含むことを特徴とする、サンプルのグルコースアッセイを行う方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５０００３３（Ｐ２０１３−５０００３３Ａ）
【公表日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２２１９８（Ｐ２０１２−５２２１９８）
【出願日】平成２２年７月２０日（２０１０．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０００５２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１２７７９
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５０２２０５８４６）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク (154)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２０日（２０１０．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０００５２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１２７７９
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５０２２０５８４６）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク (154)
【Ｆターム（参考）】
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