本発明は、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に結合可能な修飾ユビキチンから得られる新規な組換えタンパク質に関する。さらに、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した前記組換えタンパク質を含む、融合タンパク質に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に結合可能な、新規なタンパク質、特に、ヘテロ多量体タンパク質に関する。さらに、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した前記結合タンパク質を含む融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、このような結合タンパク質または融合タンパク質の製造方法、ならびに、前記結合タンパク質または融合タンパク質を含む医薬組成物／診断用組成物を対象とする。加えて、本発明は、相互作用する結合決定領域（ＢＤＲ）を少なくとも２個備えた直鎖状ポリユビキチン鎖を含む足場タンパク質をベースとするライブラリーに関する。
【０００２】
別の実施形態では、本発明は、前記結合タンパク質または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および、前記タンパク質、前記融合タンパク質、前記ベクターおよび／または前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を対象とする。好ましい実施形態において、前記結合タンパク質または前記融合タンパク質は、医薬品または診断剤に含まれる。さらに、前記組換えタンパク質または前記融合タンパク質の製造方法、ならびに、医学的治療方法における前記タンパク質の使用についても記載する。
【背景技術】
【０００３】
免疫グロブリンではないアミノ酸からなる結合分子の需要が高まりつつある。現在に至るまで、抗体は、最もよく確立された結合分子に類別されるが、免疫グロブリン分子にはいくつかの主要な欠点があることから、高い親和性と特異性でリガンドを標的とするために、新たな結合分子がなお求められている。免疫グロブリン分子は、非常に容易に製造でき、ほとんど全ての標的を対象とし得るが、その分子構造は極めて複雑である。そのため、容易に取扱い可能な、より小さな分子によって、抗体を代用することが絶えず求められている。これら代替結合剤は、例えば、疾病の診断、予防、および治療といった医療分野において、有用である。
【０００４】
比較的明らかな三次元構造を有するタンパク質は、通常、タンパク質足場と呼ばれ、前記代替結合剤の設計の開始物質として用いられる。これら足場は、通常、特定またはランダムな配列変異を許容する１以上の領域を含んでおり、このような配列のランダム化が、タンパク質ライブラリーの製造のためにしばしば行われる。このようなライブラリーから、特異的結合分子を選択してもよい。抗体よりもサイズが小さく、かつ、標的抗原への親和性が、抗体に匹敵するか、あるいはより高い分子は、薬物動態的な性質および免疫原性の点から、抗体よりも優れていると予想される。
【０００５】
従来の多くのアプローチにおいて、結合タンパク質の開始物質として、タンパク質足場が用いられている。例えば、国際公開第９９／１６８７３号パンフレット（特許文献１）において、特定のリガンドに結合活性を示すリポカリンファミリー（いわゆるアンチカリン）の修飾タンパク質が開発されている。リポカリンファミリーのペプチド構造は、遺伝子工学的方法を用いた、天然のリガンド結合ポケット内でのアミノ酸置換によって修飾されている。アンチカリンは、免疫グロブリンと同様に、分子構造の同定または結合に使用可能である。抗体と同様の方法で、可動性ループ構造が修飾され、これらの修飾により、天然のものとは異なるリガンドの認識が可能となる。
【０００６】
国際公開第０１／０４１４４号パンフレット（特許文献２）には、それ自体には結合部分がないβシート構造タンパク質のタンパク質表面における、結合ドメインの人工的な生成が記載されている。この手法によれば、高い親和性と特異性でリガンドと相互作用する、新規に生成された人工結合ドメイン（例えば、眼水晶体構造タンパク質であるγクリスタンのバリエーション）が得られる。アンチカリンに関して先に述べたような可動性ループ構造から形成される、既存の結合部位の修飾とは対照的に、これらの結合ドメインは、βシートの表面に新規に生成される。しかしならが、国際公開第０１／０４１４４号パンフレットには、新規結合特性を生じるための、比較的大きなタンパク質の改変について記載されているのみである。国際公開第０１／０４１４４号パンフレットのタンパク質は、その大きさのため、ある程度の労力を必要とする方法でしか、遺伝子工学レベルで修飾できない。さらに、これまでに開示されたタンパク質においては、タンパク質の全体構造を維持するために、全アミノ酸のうち、比較的小さいパーセンテージのみが修飾されていた。したがって、従前は存在しない結合特性の発生に利用できるのは、タンパク質表面の比較的に小さい領域のみである。さらに、国際公開第０１／０４１４４号パンフレットには、γ−クリスタンに対する結合特性の生成のみが記載されている。
【０００７】
国際公開第０４／１０６３６８号パンフレット（特許文献３）には、ユビキチンタンパク質に基づく人工結合タンパク質の製造が記載されている。ユビキチンは、小型、単量体、細胞質性のタンパク質であり、配列が高度に保存され、原虫から脊椎動物にいたるまでのあらゆる既知の真核細胞に存在する。生物において、ユビキチンは、細胞タンパク質の制御分解の調節において重要な役割を担う。この目的のために、分解予定のタンパク質は、酵素カスケードを通過する間に、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖と共有結合し、この標識のおかげで、選択的に分解される。最近の研究結果によると、ユビキチン、またはユビキチンによるタンパク質の標識は、それぞれ、数種のタンパク質の移入またはその遺伝子制御等の他の細胞プロセスにおいても、重要な役割を担っている。
【０００８】
ユビキチンは、その生理的機能の解明に加えて、主としてその構造およびタンパク質の化学特性のために、研究対象となっている。ユビキチンのポリペプチド鎖は、並外れてコンパクトなα／β構造に折りたたまれた７６個のアミノ酸からなる（Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ， １９８７（非特許文献１））。前記ポリペプチド鎖のほぼ８７％が、水素結合を介した二次構造エレメントの形成に関与する。二次構造は、３回転半のαヘリックス、ならびに、４つの鎖からなる逆平行βシートである。これらの要素の特徴的な配置（逆平行βシートがタンパク質表面に露出し、その裏側にαヘリックスが包まれ、これが前記逆平行βシート上に垂直に延びている）が、一般的に、いわゆるユビキチン様折り畳みモチーフと考えられている。さらなる構造的な特徴は、前記αヘリックスと前記βシート間のタンパク質内部における際立った疎水性領域である。
【０００９】
その小さなサイズのため、ユビキチンの人工的な調製は、化学合成によっても、バイオテクノロジー手法によっても実施可能である。その有利な折り畳み特性のため、ユビキチンは、遺伝子工学により、大腸菌等の微生物を使用して比較的大量に、そのサイトゾルまたはペリプラズム空間に製造できる。ペリプラズムにおける優勢な酸化条件のため、後者の戦略は、一般的に、分泌タンパク質の製造に使用される。簡易かつ効率的な細菌調製により、ユビキチンは、その製造に問題がある他の異種タンパク質の調製のための融合パートナーとして使用できる。ユビキチンとの融合によって、溶解度の改善、およびそれによる製造収率の改善が達成できる。
【００１０】
抗体または他の代替足場と比べ、ユビキチンタンパク質をベースとする人工結合タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）ともいう）は、小さいサイズ、高い安定性、高い親和性、高い特異性、費用対効果の高い微生物による製造、血清半減期の調整という利点を有している。しかしながら、特定の標的に対する高い親和性を利用した新たな治療方法の観点から、それらのタンパク質をさらに開発する必要がある。国際公開第０５／０５７３０号パンフレット（特許文献４）には、人工結合タンパク質を得るためのユビキチン足場の使用が、概略的に記載されているが、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂとの特異的かつ高親和性の結合を得るためにどのようにユビキチンタンパク質を修飾すべきかについては記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９９／１６８７３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／０４１４４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０４／１０６３６８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０５／０５７３０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９７／４５５４４号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０７／０５４１２０号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９９／５８５７０号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０１／６２８００号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０６／１１９８９７号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０７／１２８５６３号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第０１／６２２９８号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第０７／１１５８３７号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ， １９８７
【非特許文献２】Ｍｅｎｒａｄ ｕ． Ｍｅｎｓｓｅｎ， ２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット（特許文献５）には、組換え結合タンパク質が記載されており、新しい結合タンパク質を得るために、ＦＹＮキナーゼのＳｒｃホモロジー３ドメイン（ＳＨ３）を使用している。タンパク質治療法および／またはタンパク質診断法を開発するために、ＲＴループおよび／またはＳｒｃループを変異させて標的特異性を設計できることが見出された。足場として利用されるリポカリンにおいてと同様に、変異誘発されるアミノ酸残基は、抗体／抗原結合機能の基礎をなす原理を擬態する可変性および可動性のループ領域内に存在している。相互作用部位の全体的な可動性により、抗体がエピトープに結合するが、これは主としてエンタルピーによって駆動されるプロセスである。しかしながら、このプロセスは、可動相補性決定領域の会合による移動度の欠失によって、不利なエントロピー寄与を招く。本発明者らは、それとは反対に、ユビキチンを足場として使用し、アミノ酸残基をそもそも可動性ループ領域内で改変するのではなく、βシート領域の強固で不動のβ鎖内、または前記β鎖に密接した範囲内で改変した。ＥＤ−Ｂとの結合領域として、ユビキチンの不動かつ強固なβ鎖または前記β鎖に密接した範囲内でアミノ酸残基を選択する利点は、特に、以下の通りである。結合パートナー同士は、強い結合に適した相補的形状をすでに示していると考えられる。したがって、これらの相互作用には、前記結合パートナーのより強固な構造における形状の相補性、電荷、および親水性／疎水性要素が関係する。これらの強固な本体の相互作用は、界面を最適化し、生物機能に対応する。
【００１４】
フィブロネクチン（ＦＮ）は、健康な組織および体液において大量に発現する、重要なクラスの高分子量細胞外マトリックス糖タンパク質である。その主な役割は、多数の異なる細胞外マトリックスへの細胞の接着を促進することである。
【００１５】
培養下の非形質転換細胞の表面にはフィブロネクチンが存在し、形質転換細胞にはフィブロネクチンが存在しないことから、フィブロネクチンは、重要な接着タンパク質として同定された。フィブロネクチンは、多数の様々な他の分子、例えば、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびフィブリン等と相互作用し、細胞の形状および細胞骨格の形成を制御する。さらに、フィブロネクチンは、胚形成時の細胞移入および細胞分化に関与する。フィブロネクチンはまた、創傷治癒においても重要な役割を担い、マクロファージおよび他の免疫細胞の移入を促進し、また、血餅の形成においても、血管の損傷領域への血小板の接着を可能とすることにより、重要な役割を担う。
【００１６】
フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）は、一次ＲＮＡ転写物の選択的スプライシングによってフィブロネクチン分子に挿入された、小さいドメインである。前記分子は、細胞外マトリックスのフィブロネクチン分子において、存在するかまたは取去されているかのいずれかであり、新しい血管の周辺に大量に発現するが、実質的に全ての正常成人の組織（子宮と卵巣を除く）において検出不能であるため、血管新生や組織の再構築と関連する最も選択的なマーカーの一つとなっている。ＥＤ−Ｂは、癌および乾癬に関与することが知られている。高レベルのＥＤ−Ｂ発現が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌、頭蓋内髄膜腫、ヒトの皮膚癌、膠芽細胞腫を含む多くのヒトの固体癌のエンティティにおいて検出された（Ｍｅｎｒａｄ ｕ． Ｍｅｎｓｓｅｎ、２００５（非特許文献２））。さらに、ＥＤ−Ｂは、診断剤と結合でき、診断ツールとして有利に使用できる。一例として、例えば、動脈硬化プラークの分子の画像化や、例えば、癌患者の免疫シンチグラフィーによる、癌検出おける使用があげられる。さらに多くの診断用途が考えられる。
【００１７】
フィブロネクチンのヒトエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）の９１個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を、配列番号２に示す。前記タンパク質を発現させるには、開始メチオニンを加えなければならない。ＥＤ−Ｂは、哺乳類、例えば、げっ歯類、ウシ、霊長類、肉食動物、ヒト等に保存されている。ヒトＥＤ−Ｂと１００％の配列同一性を有する動物の例は、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、ハイイロオオカミ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）である。
【００１８】
ＥＤ−Ｂは、新生血管構造に特異的に蓄積し、癌における分子介入の標的となる。フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対する抗体または抗体断片の多くは、当該技術分野において、癌およびその他の適応症の有望な治療薬として公知である（例えば、国際公開第９７／４５５４４号パンフレット（特許文献６）、国際公開第０７／０５４１２０号パンフレット（特許文献７）、国際公開第９９／５８５７０号パンフレット（特許文献８）、国際公開第０１／６２８００号パンフレット（特許文献９）参照）。ヒト一本鎖Ｆｖ抗体断片ＳｃＦｖＬ１９（Ｌ１９ともいう）は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに特異的であり、実験腫瘍モデルおよび癌患者の両方において、選択的に新生脈管構造の腫瘍（ｔｕｍｏｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）を標的とすることが確認されている。さらに、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４またはＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカインと、抗ＥＤ−Ｂ抗体または抗ＥＤ−Ｂ抗体断片を含むコンジュゲートは、特に、癌、血管新生、または腫瘍の成長を阻害する医薬品の製造のための標的薬剤として記載されている（例えば、国際公開第０６／１１９８９７号パンフレット（特許文献１０）、国際公開第０７／１２８５６３号パンフレット（特許文献１１）、国際公開第０１／６２２９８号パンフレット（特許文献１２）参照）。細胞傷害性薬剤または免疫刺激薬剤のような適切なエフェクター機能と抱合させた、抗ＥＤ−Ｂ抗体またはＬ１９等抗ＥＤ−Ｂ抗体断片による固体腫瘍の新生脈管構造の選択的なターゲティングは、動物実験では成功することが判明している。膵臓癌の治療のため、インターロイキン−２部分（ＩＬ−２）と抗ＥＤ−Ｂ抗体部分とを含む融合タンパク質を、小分子ゲムシタビン（２’−デオキシ−２’、２’−デフルオロシチジン）と併用した（例えば、国際公開第０７／１１５８３７号パンフレット（特許文献１３）参照）。
【００１９】
前記先行技術文献には、新しいＥＤ−Ｂ結合タンパク質の製造のため、抗体を含む様々なタンパク質足場を使用することが記載されている。
【００２０】
現在入手可能な化合物よるＥＤ−Ｂのターゲティングには、ある種の不都合が伴う。ＥＤ−Ｂ抗原に対して、同等またはより高い親和性を有する、より小さい分子（本発明の、ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合タンパク質等）は、抗体や他の結合タンパク質に対して、顕著な利点を有すると期待される。
【００２１】
癌は、世界的に主要な死亡原因であるため、癌治療のための改善された薬剤の必要性が高まっている。現在の化学療法剤および放射線治療は、選択性が低いという欠点があり、多くの化学療法剤は、腫瘍部位に蓄積せず、よって腫瘍内において十分なレベルに到達できない。癌の効果的な治療に対する高い医学的ニーズが存在する。
【００２２】
よって、本発明の目的は、フィブロネクチンの細胞外ドメイン（ＥＤ−Ｂ）に非常に高い親和性で特異的に結合できる、ユビキチンベースの新規結合タンパク質の提供である。本発明のさらに別の目的は、例えば、癌の治療に使用する、ＥＤ−Ｂに対して非常に高い結合特異性を有する新規結合タンパク質の同定および提供である。さらに、前記結合分子を製造するための方法も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
前記課題は、提出した独立請求項の主題によって解決される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項、ならびに下記の記載、実施例、および図面に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、種々の腫瘍におけるＥＤ−Ｂの発生を列記した表を示す。
【図２】図２Ａは、修飾ユビキチンＥＤ−Ｂバインダー５Ｅ１に関する濃度依存性ＥＬＩＳＡの結果を示す。図２Ｂは、修飾ユビキチンＥＤ−Ｂバインダー１Ｈ４に関する濃度依存性ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３】図３は、修飾ユビキチン単量体からなる四量体と比較した、修飾ユビキチン単量体のＫｄ値を、表に示す。
【図４Ａ】図４Ａは、単量体４１Ｂ１０について、結合親和性がＫｄ＝９．４５μＭであることを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、４１Ｂ１０が異なる第２単量体と結合して得られた４６Ｈ９について、結合親和性がＫｄ＝１３１ｎＭであることを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合エフェクター融合タンパク質の模式図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、前記修飾ユビキチンエフェクター結合５Ｅ１−ＴＮＦコンジュゲートが、アポトースシス促進活性（Ｌ９２９アポトーシスアッセイで測定）を有すること示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、１Ｈ４−ＴＮＦα融合物のＥＤ−Ｂへの高結合親和性（Ｋｄ＝１５．１ｎＭ）を示す。
【図６】図６は、サイトカイン、例えば、ＴＮＦαに融合した、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子の親和性および活性を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子２４Ｈ１２の親和性を示す（Ｋｄ ５０．７ｎＭ）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、サイトカインＴＮＦαと遺伝子融合し、前記ヘテロ二量体２４Ｈ１２が多量体化された、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子２４Ｈ１２の親和性を示す（Ｋｄ＝５．６ｎＭ）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ヘテロ二量体修飾ユビキチンライブラリーから選択される候補例、例えば、ヘテロ二量体クローン９Ｅ１２、２２Ｄ１、２４Ｈ１２、４１Ｂ１０の分析結果を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾ヘテロ二量体ユビキチン分子９Ｅ１２の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾ヘテロ二量体ユビキチン分子４１Ｂ１０の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。
【図７】図７は、結合親和性および結合特異性に対する、異なる修飾がなされたユビキチン変異体の寄与を示す。
【図８】図８は、配列アライメントを示す。
【図９】図９は、「Ｕｂ２＿ＴｓＸ９」（両単量体の４５位がトリプトファンに修飾され、２つの単量体の間にリンカーＧＩＧ（７７〜７９位；８０位のメチオニンから第２単量体が開始）を有し、前記第２単量体の最後のＣ末端アミノ酸において、グリシンからアラニンに置換されているユビキチン）に対する、修飾ユビキチンへテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１（１行目）の配列アライメントを示す。
【図１０】図１０は、ヒトＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図１１】図１１は、フィブロネクチン断片を含む固定化されたＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）に対するヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を、遊離標的の量を増加させながら分析した競合濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図１２】図１２は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾へテロ二量体ユビキチン分子１０４１−Ｄ１１の、無標識相互作用分析における分析結果を示す。
【図１３】図１３は、結合活性の血清安定性を同時に分析する濃度依存性ＥＬＩＳＡにおける、ＥＤ−Ｂへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。
【図１４】図１４は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１とフィブロネクチン断片との複合体形成の、ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、固定化されたヒト胎児肺繊維芽細胞（Ｗｉ３８）への前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、バイタル（ｖｉｔａｌ）ヒト胎児肺繊維芽細胞（Ｗｉ３８）への結合を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、固定化されたマウスＢａｌｂ ３Ｔ３細胞への結合を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、固定化されたマウスＳＴ−２細胞への結合を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、哺乳類組織切片における、ターゲットへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の特異性を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、野生型ユビキチンとの比較における、腫瘍組織での１０４１−Ｄ１１の蓄積を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質におけるＴＮＦαのアポトーシス誘導活性についての、細胞ベースアッセイ（ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）（Ｌ９２９細胞）によるテストを示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質におけるＴＮＦαのアポトーシス誘導活性についての、細胞ベースアッセイ（Ｌ９２９細胞）によるテストを示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、標的ＥＤ−Ｂに対するヘテロ二量体ユビキチン１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質の高い選択性を証明している。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、修飾ユビキチンＥＤ−Ｂ結合１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質についての、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる結合分析を示す。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、培養細胞における変異体１０４１−Ｄ１１で観察された高い結合特異性が、１０４１−Ｄ１１がＴＮＦαに融合されても維持されることを示す。
【図１８】図１８は、ＴＮＦαに融合した変異体１０４１−Ｄ１１とメルファランとの併用による、７日間のマウスの処置期間中のｉｎ ｖｉｖｏでの相対的腫瘍成長を示す。
【図１９】図１９は、ＥＤ−Ｂに対して驚くほど強力な結合親和性を有することが見出されたさらなる１６種類の配列について、コンセンサスな位置およびアミノ酸置換を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
より具体的には、本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列に対して６０％以上のアミノ酸配列同一性を有する修飾ユビキチンタンパク質を含む、ヒトフィブロネクチンのＥＤ−Ｂに結合可能なタンパク質であり、
前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂに対し、Ｋｄ＝１０^−６〜１０^−１２Ｍの特異的結合親和性で検出可能な結合を示す修飾ユビキチンタンパク質を得るため、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位における、少なくとも４個のアミノ酸が修飾されたタンパク質を提供する。
【００２６】
好ましい実施形態において、前記タンパク質は、組換えタンパク質である。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態では、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位における、４、５、６、７、８、９個、または全てのアミノ酸が修飾される。
【００２８】
本願で使用されている重要な用語の定義
「フィブロネクチンのエキストラドメインＢ」という用語、またはその略語「ＥＤ−Ｂ」は、配列番号２との配列同一性が、少なくとも７０％、任意に７５％以上、さらに任意に８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、または９７％以上、または１００％を示し、先に定義したＥＤ−Ｂの機能を有する、全てのタンパク質を含む。
【００２９】
「結合可能なタンパク質」または「結合タンパク質」という用語は、下記にさらに詳細に定義するように、ＥＤ−Ｂに対する結合ドメインを含むユビキチンタンパク質を指す。このようなユビキチンベースの結合タンパク質は、いずれも、例えば、多量体化部位（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー等の、結合ドメインでない付加的なタンパク質ドメイン、および／または、非タンパク性のポリマー分子を含んでもよい。非タンパク性のポリマー分子は、例えば、ヒドロキシエチルでんぷん、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン等である。
【００３０】
抗体およびその断片は、当業者に周知である。本発明の結合タンパク質は、抗体またはその断片、例えば、ＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片等ではない。また、本発明の結合ドメインは、抗体中に存在する免疫グロブリンフォールドを含まない。
【００３１】
本明細書において、「リガンド」、「標的」および「結合パートナー」は、同義に用いられ、置き換え可能である。リガンドは、前述のヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質に、本明細書中で定義される親和性をもって結合可能な任意の分子である。
【００３２】
「ユビキチンタンパク質」という用語は、配列番号１のユビキチン、および、下記の定義によるその修飾物を包含する。ユビキチンは、真核生物において、高度に保存されている。例えば、今日まで研究されてきた全ての哺乳類において、ユビキチンは、同一のアミノ酸配列を有する。ヒト、げっ歯類、ブタ、および霊長類由来のユビキチン分子が、特に好ましい。また、任意の他の真核生物起源のユビキチンを使用することもできる。例えば、酵母由来のユビキチンは、配列番号１と３個のアミノ酸が異なるのみである。前記「ユビキチンタンパク質」という用語に包含される前記ユビキチンタンパク質は、通常、配列番号１に対し、７０％を超える、好ましくは７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９６％を超えるアミノ酸同一性を示すか、あるいは、９７％までの配列同一性を示す。
【００３３】
「修飾ユビキチンタンパク質」という用語は、アミノ酸の置換、挿入、または欠失のいずれか一つ、あるいはそれらの組み合わせによる、前記ユビキチンタンパク質の修飾物を指す。本発明の修飾ユビキチンタンパク質は、標的に対する新規な結合親和性を有する改変タンパク質である。
【００３４】
配列番号１のアミノ酸配列に対する前記ユビキチン誘導体の配列同一性の程度の決定には、例えば、ＳＩＭ Ｌｏｃａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｐｒｏｇｒａｍ（Xiaoquin Huang and Webb Miller, Advances in Applied Mathematics, vol. 12: 337-357, 1991）またはＣｌｕｓｔａｌ，Ｗ．を使用できる（Thompson et al., Nucleic Acids Res., 22(22): 4673-4680, 1994.）。好ましくは、配列番号１に対する前記修飾タンパク質の配列同一性の程度は、配列番号１の完全配列に対して相対的に決定される。
【００３５】
本発明の「ヘテロ二量体融合タンパク質」または「ヘテロ二量体タンパク質」は、異なる修飾がなされた２つの単量体ユビキチンタンパク質を含むタンパク質と考えられる。前記２つの単量体ユビキチンタンパク質は、特異的結合パートナーであるＥＤ−Ｂに対する一価の結合特性（結合ドメイン）を共同でもたらす、２つの相互作用結合ドメイン領域を有する。ヘテロ二量体は、２つの単量体ユビキチン分子の融合により得られるが、これらの両分子は、本明細書に記載のように、異なる修飾がなされている。
【００３６】
異なる修飾がなされたユビキチン単量体を多量体化して一価の結合活性を有するヘテロ多量体結合タンパク質（ここでは、ヘテロ二量体タンパク質）を生成する利点は、ＥＤ−Ｂに対する新規な高親和性の結合特性を発生させるために修飾することが可能なアミノ酸残基の総数の増加にある。主な利点は、修飾されるアミノ酸が増加しても、ＥＤ−Ｂに対する前記新規に生成された結合タンパク質の足場の全体的な安定性を低下させることなく、タンパク質化学的完全性（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が維持されることである。ＥＤ−Ｂに対する新規結合部位を発生させるために修飾可能な残基の総数は、前記修飾残基が２つの単量体ユビキチンタンパク質に割り当てられることで増加する。修飾数は、修飾単量体ユビキチン分子数に応じて、２倍にできる。ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合タンパク質のモジュール構造により、修飾アミノ酸の総数を増加できる。これは、前記修飾アミノ酸が、２つの単量体ユビキチン分子に含まれるからである。本発明の方法は、ＥＤ−Ｂに対する一価の特異性を有するヘテロ二量体ユビキチン分子の同定を提供する。
【００３７】
したがって、結合パートナーに対して共通の結合部位を有するヘテロ二量体の使用は、最終的な結合分子のタンパク質化学的完全性に過度に影響を与えない修飾残基数を増加させる可能性を切り開く。なぜなら、これらの修飾残基の全量が、前記二量体を形成する２つの単量体ユニットに分散するためである。ＥＤ−Ｂに結合する前記ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質は、タンパク質ライブラリーに存在する。
【００３８】
「一価」とは、前記修飾二量体ユビキチンの第１および第２単量体ユニットにおいて生成された両結合領域が、共に、ＥＤ−Ｂに相乗的に組み合わせられるように結合する機能、すなわち、両結合領域が、共同で一価の結合活性を形成するように作用する能力と理解すべきである。前記へテロ二量体分子における前記第１および前記第２修飾ユビキチン両方の各結合領域を別々に見た場合、前記二量体分子と比較して、ＥＤ−Ｂへの結合の効率および親和性は、明らかに低いと考えられる。前記修飾ユビキチンが、各単量体タンパク質を単独で使用するよりも、より効率的にＥＤ−Ｂに結合可能となるように、両結合領域は、前記ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質表面に、アミノ酸の連続領域として形成される固有の結合部位を形成する。本発明によれば、最も有力な結合ユビキチン分子をスクリーニングした後に、前記２つの単量体タンパク質が互いに結合されるのではなく、既に前記ヘテロ二量体ユビキチンが存在する状態でスクリーニング工程を行うことが、特に重要である。最も有力な結合ユビキチン分子の配列情報を取得した後に、任意の他の方法、例えば、化学合成または遺伝子工学手法により、例えば、前記２つの同定した単量体ユビキチンユニット同士を結合することにより、これらの分子を得てもよい。
【００３９】
本発明によれば、１つのリガンドに結合する異なる修飾がなされた前記少なくとも２つのユビキチン単量体は、例えば、遺伝学的手法を使用して、互いにヘッドトゥテイル融合で結合される。前記異なる修飾がなされた融合ユビキチン単量体は、一価で結合し、両方の「結合ドメイン領域」（「ＢＤＲ」）が共に作用する場合にのみ効果的である。本明細書中において、「結合ドメイン領域」は、標的への結合に関与する、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも４個、好ましくは６個のアミノ酸が修飾されたユビキチン単量体における領域と定義される。
【００４０】
前記ヘテロ二量体タンパク質を形成する、前記修飾され結合されたユビキチン単量体は、一つの連続的な結合領域を介して同一のエピトープに結合する。前記ヘテロマーのこの連続的な領域は、異なる修飾がなされた２つのユビキチン単量体により形成される前記２つのモジュールの両結合決定領域により形成される。
【００４１】
「ヘッドトゥテイル融合」は、２つのタンパク質を、前記二量体に含まれるユニット数に応じて、Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ方向に連結することにより、互いに融合させることと理解すべきである。このヘッドトゥテイル融合において、前記ユビキチン単量体は、リンカーを介さずに直接連結されてもよい。または、前記ユビキチン単量体の融合を、リンカーを介して行うこともできる。前記リンカーとしては、例えば、少なくともＧＩＧのアミノ酸配列もしくは少なくともＳＧＧＧＧのアミノ酸配列を有するリンカー、または、任意の他のリンカー、例えば、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧもしくはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧがあげられる。２つのユビキチン単量体の遺伝子融合用の他のリンカーも、当該技術分野では公知であり、使用可能である。
【００４２】
本発明の修飾ユビキチンタンパク質は、標的またはリガンド（両用語は、同じ意味として使用される）としてのＥＤ−Ｂに対する新規な結合親和性を有する改変タンパク質である。「置換」という用語は、例えば、元のアミノ酸への化学基もしくは残基の置換または付加によるアミノ酸の化学的修飾も含む。βシート領域の少なくとも１つのβシート鎖に位置するアミノ酸または前記βシート鎖に隣接した３つ目までのアミノ酸を含む、タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域におけるアミノ酸の置換が重要である。
【００４３】
本発明によれば、ＥＤ−Ｂに特異的な新規の結合ドメインの生成のためのアミノ酸の置換を、任意の所望のアミノ酸を用いて行うことができる。すなわち、ＥＤ−Ｂに対する新規結合特性を発生させるための修飾において、前記アミノ酸が、置換するアミノ酸のものと類似する特定の化学的特性または側鎖を有するよう配慮する必要はなく、よって任意の所望のアミノ酸をこの目的に使用することができる。
【００４４】
本発明によれば、選択されたアミノ酸の修飾工程は、ランダム突然変異誘発による遺伝子レベルでの突然変異誘発、すなわち、前記選択されたアミノ酸のランダム置換により行われることが好ましい。ユビキチンの修飾は、各タンパク質に属するＤＮＡを改変する遺伝子工学的手法により行われることが好ましい。ユビキチンタンパク質の発現は、その後、原核生物または真核生物内で行われることが好ましい。
【００４５】
置換は、特に、ユビキチンタンパク質のβシートの４つのβ鎖の表面露出アミノ酸、または、前記βシート鎖に隣接する３つ目までの表面露出アミノ酸において行われる。各β鎖は、通常、５〜７個のアミノ酸からなる。配列番号１を参照すると、例えば、前記β鎖は、通常、アミノ酸残基２〜７、１２〜１６、４１〜４５および６５〜７１を包含する。これに加えて好ましく修飾され得る領域として、前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸位置（すなわち、１番目、２番目または３番目）が挙げられる。これに加えて好ましく修飾され得る好ましい領域としては、特に、アミノ酸残基８〜１１、６２〜６４および７２〜７５が挙げられる。前記好ましい領域は、２つのβ鎖を互いに連結するβターンを含む。好ましいβターンとして、アミノ酸残基６２〜６４があげられる。前記βシート鎖に密接する最も好ましいアミノ酸は、８位のアミノ酸である。また、アミノ酸置換のさらなる好ましい例は、３６、４４、７０および／または７１位である。例えば、これに加えて好ましく修飾され得る領域としては、６２、６３、および６４位のアミノ酸（３個のアミノ酸）、７２、７３位のアミノ酸（２個のアミノ酸）、または８位のアミノ酸（１個のアミノ酸）が挙げられる。
【００４６】
好ましい実施形態において、前記アミノ酸残基は、アミノ酸置換により改変される。欠失および挿入も可能である。付加または欠失され得るアミノ酸数は、単量体ユビキチンサブユニットにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸に限定され、それに応じて、前記二量体ユビキチンタンパク質については、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または２８個のアミノ酸に限定され、通常は、前記単量体タンパク質における修飾数のｘ倍である。一実施形態において、アミノ酸挿入はなされない。さらに別の実施形態において、欠失は行われない。
【００４７】
本発明の修飾ユビキチンタンパク質が、１以上のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を含む場合には、対応するタンパク質同士を割り当てるために、野生型ヒトユビキチン（配列番号１）のアミノ酸位置と、前記修飾ユビキチンとのアライメントを行わなければならない。融合タンパク質の場合（後述を参照）、各単量体ユビキチンサブユニットのナンバリング（およびアライメント）は、同様の方法によりなされる。すなわち、例えば、二量体のアライメントは、各サブユニットについて、１位のアミノ酸から開始される。
【００４８】
本発明によれば、好ましくは哺乳類由来の、例えば、ヒトの単量体ユビキチンにおいて、β鎖内または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸位置に存在するアミノ酸の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも２５％を修飾、好ましくは置換することができ、これにより、以前は存在しなかった結合特性が発生する。β鎖内または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸位置に存在するアミノ酸の、好ましくは最大で約５０％、さらに好ましくは最大で約４０％もしくは約３５％、または約３０％もしくは約２５％までが修飾、好ましくは置換される。１つのβ鎖内において、通常、１〜４個のアミノ酸が修飾される。一実施形態では、好ましくは、第１β鎖および第４β鎖、例えば、アミノ酸残基２〜７もしくは６５〜７１の領域において、６個のアミノ酸のうちの３個が修飾される。
【００４９】
ヘテロ二量体の構成ユニットとして使用される本発明の修飾単量体ユビキチンは、合計でアミノ酸の２０％までを占める。これを考慮すると、配列番号１に対する前記修飾ユビキチンタンパク質の配列同一性は、少なくとも６０％である。本発明のさらに別の実施形態において、アミノ酸レベルでの配列同一性は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、７０％、少なくとも８０％、さらに、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、６５％を超える、７５％超える、８５％超える、または９７％超える前記修飾ユビキチンタンパク質のアミノ酸配列同一性も包含する。
【００５０】
本発明のさらに別の実施形態において、ユビキチンは、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位における、３、４、５、６、または７個のアミノ酸が修飾される。他の実施形態では、これらの位置が修飾されるユビキチンを、既に前修飾（ｐｒｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）されていた。例えば、さらなる修飾は、７４および７５位のアミノ酸または４５位のアミノ酸における修飾を含むことができ、この修飾により、より良好な安定性またはタンパク質化学特性が発生する。修飾ユビキチン単量体は、配列番号１のユビキチンにおける、合計９、１０、１１、１２、１３、１４、および、最大で１５個のアミノ酸が修飾、好ましくは置換されることで得られる。一例によれば、１４個の置換および１個の欠失を有する修飾単量体ユビキチンを得ることができた。これは、ユビキチンの総アミノ酸数の約２０％の割合に相当する。このことは、非常に驚くべきことであり、通常、もっと低い割合でも、タンパク質のフォールディングを阻害するのに十分であるため、予測できなかったことである。
【００５１】
本発明の一実施形態において、これらのアミノ酸は、タンパク質表面上に連続的な領域を形成する、新規な結合特性を有する領域を生成するために修飾される。このようにして、ＥＤ−Ｂへの結合特性を有する連続的な領域を生成することができる。本発明において、「連続的な領域」は、以下の通りである。側鎖の電荷、空間的構造、および疎水性／親水性により、アミノ酸は、それらに応じた形で環境と相互作用する。前記環境は、溶媒、一般的には水、または、例えば、空間的に近いアミノ酸等の他の分子であり得る。タンパク質に関する構造情報および各種ソフトウェアにより、前記タンパク質の表面を特徴付けできる。例えば、タンパク質の原子と溶媒との界面領域について、この界面領域がどのような構造であるか、溶媒に接触しやすい表面領域はどれか、または、電荷が表面においてどのように分布しているかについての情報も含めて、この方法により可視化できる。連続的な領域は、例えば、適切なソフトウェアを使用したこの種の可視化により明らかにすることができる。このような方法は、当業者に公知である。本発明によれば、基本的に、表面露出領域全体を、新規結合特性の生成のために修飾される表面上の前記連続的な領域として使用することができる。一実施形態において、この目的のために、修飾は、αへリックス領域も含むことができる。ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質において、結合決定領域は、１つの連続的な領域を共同で形成する２つの前記表面露出領域を含み、前記連続的な領域は、１つの結合決定領域の２倍の長さを有する。
【００５２】
βシート領域の少なくとも一本のβ鎖内または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸位置のいずれかを含む、前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域においてアミノ酸を修飾することが重要である。前記「βシート構造」は、本質的にシート状であり、ほぼ完全に伸長している（ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ）ことにより定義される。ポリペプチド鎖の連続したセグメントから形成されるαへリックスとは対照的に、βシートは、ポリペプチド鎖の異なる領域により形成され得る。このようにして、一次構造では離れて位置する領域同士が、互いに近接することができる。β鎖は、一般的に、５〜１０アミノ酸長（通常、ユビキチンにおいて５〜６残基）であって、ほぼ完全に伸長した立体構造である。前記β鎖は、互いに近接しており、一方の鎖のＣ＝Ｏ基と他方の鎖のＮＨ基との間で、水素結合が形成される。逆もまた同様である。βシートは、複数の鎖から形成され、シート状構造を有することができ、Ｃα原子の位置が、シート状平面の上方または下方の間を行ったり来たりする。アミノ酸側鎖は、このパターンに追随し、よって、二者択一的に、上の方向又は下の方向を指す。前記β鎖の方向により、前記シートは、平行シートおよび逆平行シートに分類される。本発明によれば、両方とも、変異可能であり、請求項記載のタンパク質の調製に使用可能である。
【００５３】
前記β鎖および前記βシート構造の突然変異誘発のために、表面に近いβ鎖または前記β鎖（前記βシートの１つの鎖）に隣接する３つ目までのアミノ酸位置が、ユビキチンにおいて選択される。表面露出アミノ酸は、入手可能なＸ線結晶構造により同定できる。結晶構造が入手できない場合には、コンピューター解析を用いて、入手可能な一次構造について表面露出βシート領域および個々のアミノ酸位置の接触性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を予測するか、あるいは３次元タンパク質構造をモデル化し、このようにして、潜在的な表面露出アミノ酸についての情報を入手することを試みることができる。さらなる開示は、例えば、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９８７ Ａｐｒ ５； １９４（３）：５３１−４４． Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ Ｓ， Ｂｕｇｇ Ｃ．Ｅ．， Ｃｏｏｋ Ｗ．Ｊから得ることができる。
【００５４】
しかしながら、突然変異させるアミノ酸位置の時間のかかる事前選択を省略して、前記βシートまたは前記β鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸位置における修飾を行うことも可能である。前記βシート構造または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸をコードするＤＮＡ領域を、ＤＮＡ環境（ＤＮＡ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）から単離し、ランダム突然変異誘発に供し、その後、それらを予め除去したタンパク質をコードするＤＮＡに再度組み込む。続いて、所望の結合特性を有する変異体の選択工程を行う。
【００５５】
本発明の他の実施形態においては、表面に近い、前記β鎖または前記β鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸位置は、前述のように選択され、これらの選択された領域内の突然変異誘発するアミノ酸位置が同定される。ついで、このようにして選択されたアミノ酸位置は、その後、部位特異的突然変異誘発により、ＤＮＡレベルで突然変異を誘発され得る。すなわち、特定のアミノ酸をコードするコドンが、予め選択された他の特定のアミノ酸をコードするコドンにより置換される。あるいは、この置換は、ランダム突然変異誘発により行われる。この場合、置換されるアミノ酸位置は規定されるが、新規な未決定のアミノ酸をコードするコドンは規定されない。
【００５６】
「表面露出アミノ酸」は、周囲の溶媒に接触可能なアミノ酸である。タンパク質におけるアミノ酸の接触性が、モデルトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙにおけるアミノ酸の接触性と比較して８％を超える場合、前記アミノ酸は、「表面露出」と呼ばれる。これらのタンパク質領域または個々のアミノ酸位置もまた、それぞれ、本発明により選択される、潜在的な結合パートナーに対する好ましい結合部位である。また、参考文献として、Ｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８３ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２１， ７０９ − ７１３， ａｎｄ Ｓｈｒａｋｅ ＆ Ｒｕｐｌｅｙ， １９７３ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７９（２）：３５１−３７１があげられ、開示全体を、引用により本願に取り込む。
【００５７】
アミノ酸置換により、新規に生成された人工結合部位の領域が、その親タンパク質と比べて、ならびに互いに相違するユビキチンタンパク質足場のバリエーションを、それぞれの配列セグメントの標的突然変異誘発により生成できる。この場合、極性、電荷、溶解性、疎水性／親水性等の特定の特性を有するアミノ酸を、それぞれ、他の特性を有するアミノ酸と交換または置換できる。置換に加えて、「突然変異誘発」、「修飾」、および「交換」という用語は、挿入および欠失も含む。タンパク質レベルでは、前記修飾を、当業者に公知の方法によるアミノ酸側鎖の化学変性により行うこともできる。
【００５８】
ユビキチンの突然変異誘発方法
各配列セグメントの突然変異誘発の開始点として、例えば、当業者に公知の方法により調製、改変、および増幅が可能なユビキチンのｃＤＮＡを使用できる。一次配列の比較的狭い領域（例えば、１〜３個のアミノ酸）におけるユビキチンの部位特異的改変には、市販の試薬および方法が利用可能である（「Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ」、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；「Ｍｕｔａｇｅｎｅ ファージミド ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」、Ｂｉｏｒａｄ）。より大きい領域の部位特異的な突然変異誘発には、具体的な実施形態として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、当業者に利用可能である。この目的のために、所望の位置に縮退した塩基対組成を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドの混合物が、例えば、突然変異の導入に使用できる。これは、イノシン等の、ゲノムＤＮＡには自然発生しない塩基対類似体の使用によっても達成できる。
【００５９】
βシート領域の１つ以上のβ鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸位置の突然変異誘発の開始点は、例えば、ユビキチンのｃＤＮＡでもよいし、ゲノムＤＮＡでもよい。また、ユビキチンタンパク質をコードする遺伝子は、合成によって調製されてもよい。
【００６０】
突然変異誘発には、それ自体公知の様々な方法が利用可能である。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ランダム突然変異誘発法、ＰＣＲを使用する突然変異誘発、または類似の方法が挙げられる。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態において、突然変異が誘発されるアミノ酸位置は予め定められている。修飾されるアミノ酸の選択は、修飾されるべきアミノ酸に関する請求項１の限定を満たすように行われる。いずれの場合にも、一般的に、様々な変異体のライブラリーが確立され、それ自体公知の方法を用いてスクリーニングされる。一般的に、修飾されるアミノ酸の事前選択は、修飾されるユビキチンタンパク質について、十分な構造情報が入手できる場合には、特に容易に実施できる。
【００６２】
例えば、ＰＣＲ、化学的突然変異誘発、またはバクテリアの突然変異誘発株の使用により、標的突然変異誘発およびより長い配列セグメントの突然変異誘発を行う方法もまた、従来技術に属しており、本発明において利用可能である。
【００６３】
本発明の一実施形態において、突然変異誘発は、アミノ酸コドンＮＮＫを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドのアセンブリにより行われる。ただし、他のコドン（トリプレット）も使用可能であることも理解すべきである。突然変異は、好ましくはβシート構造が維持されるように行われる。一般的に、突然変異誘発は、タンパク質表面に露出する安定なβシート領域の外側で行われる。それには、部位特異的突然変異誘発およびランダム突然変異誘発の両方が含まれる。一次構造の比較的狭い領域（例えば、３〜５個のアミノ酸）を含む部位特異的突然変異誘発は、市販のキットにより行える。前記市販のキットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標））またはＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）（Ｍｕｔａｇｅｎｅ（登録商標） ファージミド ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）（米国特許第５，７８９，１６６号明細書および米国特許第４，８７３，１９２号明細書参照）があげられる。
【００６４】
より広い領域を部位特異的突然変異誘発に供する場合、ＤＮＡカセットを調製しなければならない。ここで、突然変異が誘発される領域は、突然変異させる位置および変化していない位置を含むオリゴヌクレオチドのアセンブリにより得られる（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８， ７７２−７７７； ＭｃＣｏｎｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｅｓｓ， １９９５ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５０， ４６０−４７０．）。ランダム突然変異誘発は、突然変異誘発株におけるＤＮＡの増殖、または、ＰＣＲ増幅（エラープローンＰＣＲ）により導入できる（例えば、Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｇｅｎｅ １２８， １３５ １４０）。この目的のため、エラー率が増大したポリメラーゼが使用される。導入される突然変異誘発の度合いを高めるため、あるいは、異なる変異同士をそれぞれ組み合わせるために、ＰＣＲ断片における変異を、ＤＮＡシャッフリングにより組み合わせることができる（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−３９１）。酵素に関するこれらの突然変異誘発戦略についての概説は、Ｋｕｃｈｎｅｒ ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ （１９９７） ＴＩＢＴＥＣＨ １５， ５２３−５３０の概説中に記載されている。このランダム突然変異誘発を選択されたＤＮＡ領域において実施するためにも、突然変異誘発に使用するＤＮＡカセットの構築が必要である。
【００６５】
ランダム修飾は、当該技術分野において、十分に確立された公知の方法により行われる。「ランダムに修飾されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列」は、多数の位置において、ヌクレオチドまたはアミノ酸が挿入、欠失、または置換されており、特性が予測できないヌクレオチド配列またはアミノ酸配列である。多くの場合、挿入されたランダムヌクレオチド（アミノ酸）配列またはヌクレオチド（アミノ酸）配列は、（例えば、ランダム化合成またはＰＣＲを介した突然変異誘発の結果）「完全にランダム」となる。ただし、前記ランダム配列は、共通の機能的特性（例えば、発現産物のリガンドへの反応性）を有する配列も含むことができる。あるいは、前記ランダム配列は、最終的な発現産物が、例えば、異なるアミノ酸が均等に分布した完全にランダムな配列であるという意味で、ランダムとなり得る。
【００６６】
ランダム化された断片をベクター中に適切に導入するために、本発明では、前記ランダムヌクレオチドは、部位特異的ＰＣＲを介した突然変異誘発の原理により、発現ベクター中に導入されるのが好ましい。ただし、他の選択肢も当業者に公知であり、例えば、合成ランダム配列ライブラリーをベクターに挿入することも可能である。
【００６７】
融合ＰＣＲにより変異体またはライブラリーを発生させるために、例えば、３回のＰＣＲ反応を行ってもよい。２回のＰＲＣ反応は、部分的に重なった中間体断片を発生するために行われる。３回目のＰＣＲ反応は、前記中間体断片を融合するために行われる。
【００６８】
ライブラリーまたは変異体株の構築方法は、所望の制限酵素認識部位周辺のプライマー（制限酵素認識部位プライマー）であるフォワード制限プライマーとリバース制限プライマーからなる第１のプライマーセット、および、例えば、対象のコドンの上流および下流周辺のプライマー（変異原性プライマー）であるフォワード変異原性プライマーおよびリバース変異原性プライマーからなる第２のプライマーセットを構築する工程を含んでもよい。一実施形態において、前記プライマーは、対象のコドンのすぐ上流およびすぐ下流に構築される。前記制限プライマーおよび前記変異原性プライマーを使用して、第１中間体断片および第２中間体断片が構築される。２回のＰＣＲ反応により、これらの直線状の中間体断片が生成される。これらの各直線状の中間体断片は、対象の変異コドンを少なくとも１つと、フランキングヌクレオチド配列と、切断部位とを含む。３回目のＰＣＲ反応では、前記２つの中間体断片、前記フォワード制限プライマー、および前記リバース制限プライマーを使用して、直線状の融合産物が生成される。一方、前記直線状産物の未結合の末端は、制限酵素で切断され、前記直線状産物に付着末端が生じる。前記直線状産物の前記付着末端は、ＤＮＡリガーゼの使用により融合され、環状産物、例えば、環状のポリヌクレオチド配列が生成される。
【００６９】
前記中間体断片の構築のため、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの２つのセットの設計および合成は、制限酵素切断部位およびそのフランキングヌクレオチド配列を含む第１のセット、ならびに、対象の変異コドンを少なくとも１つ含む第２のセット（変異原性プライマー）を用意することによって行われる。当業者であれば、前記変異体の数は、所望の変異アミノ酸修飾の数に対応することを認識するであろう。本発明者は、他の制限酵素を前記工程に使用する場合には、この切断部位の正確な位置、ならびに、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーの対応する配列を、これに応じて改変すればよいと企図している。その他の方法も当該技術分野において利用可能であり、これらを代わりに使用してもよい。
【００７０】
本発明に従って発現産物のランダム化断片を足場に導入することとは別に、少なくとも１つの融合パートナーをコードするヌクレオチド配列にランダム化ヌクレオチド配列を融合させることにより、前記ランダム配列を融合パートナーに連結することがしばしば必要となる。このような融合パートナーは、例えば、前記発現産物の発現および／または精製／単離および／またはさらなる安定化を促進できる。
【００７１】
本発明の一例によれば、単量体ユビキチンの２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位における、少なくとも３または４個のアミノ酸のランダム置換を、ＰＣＲにより非常に簡易に行うことができる。これは、前述の位置が、前記タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端の近くに局在しているためである。したがって、操作されるコドンは、対応するｃＤＮＡ鎖の５’末端および３’末端に位置する。そこで、突然変異誘発ＰＣＲ反応に使用される第１のオリゴデオキシヌクレオチドは、変異される２、４、６および／または８位のコドンから離れており、その配列は、ユビキチンのアミノ末端のコード鎖に対応する。したがって、第２のオリゴデオキシヌクレオチドは、変異される６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位から離れており、カルボキシ末端のポリペプチド配列の非コード鎖に、少なくとも部分的に対応する。両オリゴデオキシヌクレオチドにより、単量体ユビキチンをコードするＤＮＡ配列を鋳型として用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことができる。
【００７２】
また、得られた増幅産物を、例えば、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を導入するフランキングオリゴデオキシヌクレオチドを使用する、他のポリメラーゼ連鎖反応に添加することが可能である。本発明では、得られた遺伝子カセットを、所定のハプテンまたは抗原に対する結合特性を有するユビキチン変異体の単離のための次の選択工程での使用に適したベクター系中に導入するのが好ましい。
【００７３】
ユビキチンの修飾領域
修飾領域は、基本的にが、結合パートナーであるＥＤ−Ｂに接触可能かどうか、ならびに、タンパク質の全体構造が、推測上修飾に耐性を示すかどうかに応じて選択できる。
【００７４】
表面露出β鎖における修飾に加えて、前記タンパク質の他の表面露出領域における修飾も可能であり、前記修飾は、前記β鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸位置において行われことが好ましい。これらの修飾領域は、新規に生成される、ＥＤ−Ｂに対する高結合親和性での結合に関与する。
【００７５】
本発明の別の好ましい実施形態では、ユビキチン、好ましくは、哺乳類またはヒトのユビキチンにおける表面露出アミノ酸の少なくとも３、４、または６個、任意に、少なくとも８、１０、１２個、最大で１５個を修飾することができ、ここで、前記修飾としては、置換が好ましい。これは、ユビキチンにおける３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の表面露出アミノ酸の修飾を含む。これらの４個以上最大１５個の表面露出修飾アミノ酸により、所定の結合パートナーに対して結合親和性を有する領域が形成される。本明細書中において、この領域を、「結合ドメイン領域」（ＢＤＲ）と定義する。これに関しては、少なくとも２個、任意に少なくとも４個、さらに任意に少なくとも６、８、１０、１２個、最大で１５個の表面露出アミノ酸が、βシート領域内に存在すること、すなわち、単一のβシート鎖に存在するか、もしくは複数のβ鎖に分散すること、または、βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸位置に存在することが特に好ましい。修飾された、好ましくは置換された全てのアミノ酸のうちの少なくとも３個が、一次配列において、互いに直接隣接していることがさらに好ましい。
【００７６】
本発明の別の任意の実施形態において、前記タンパク質における４つのβ鎖の１つもしくは２つにおけるアミノ酸、好ましくは２つにおけるアミノ酸、または、前記４つのβ鎖のうちの好ましくは２つに隣接する３つ目までのアミノ酸位置におけるアミノ酸が、修飾されて、新規の結合特性を生成している。前記４つのβ鎖のうちの３つもしくは４つにおける修飾、または前記β鎖のうちの３つもしくは４つに隣接する３つ目までのアミノ酸位置における修飾も、ＥＤ−Ｂ結合発生のために、任意で行ってもよい。
【００７７】
アミノ末端鎖およびカルボキシ末端鎖におけるアミノ酸、または、アミノ末端鎖およびカルボキシ末端鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸位置におけるアミノ酸を修飾、好ましくは置換して、ＥＤ−Ｂへの新規の結合部位を生成することが特に好ましい。これに関し、前記カルボキシ末端βシート鎖に隣接する４つ目までのアミノ酸が修飾、好ましくは置換されること、および、前記アミノ末端βシート鎖に隣接する１つ目までのアミノ酸が修飾、好ましくは置換されることが特に好ましい。
【００７８】
哺乳類のユビキチン、好ましくはヒトのユビキチンにおける下記の位置の表面露出アミノ酸の少なくとも３つが、修飾される、好ましくは置換されることが特に好ましい：２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位。前記アミノ酸グループから選択されるこれら少なくとも４つのアミノ酸により、ユビキチンの表面に連続的な表面露出領域が形成されるが、前記領域は、結合パートナーであるＥＤ−Ｂに対し、以前は存在しなかった結合親和性を有する修飾タンパク質の生成に特に適していることが見出された。これらのアミノ酸残基のうち、少なくとも３つが修飾されなければならない。前記アミノ酸残基の３、４、５、６、７、８、９または１０個が、任意にさらに別のアミノ酸残基と共に、任意に修飾される。
【００７９】
上記修飾後、本発明者らは、実施例で述べるアミノ酸修飾ユビキチン配列が、非常に高い親和性（Ｋｄ値１０^−９以下）でＥＤ−Ｂと結合することを見出した。
【００８０】
融合タンパク質
別の好ましい実施形態において、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した本発明の結合タンパク質を含む融合タンパク質に関する。
【００８１】
さらに別の態様において、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した本発明のヘテロ二量体結合タンパク質を含む融合タンパク質に関する。本発明の融合タンパク質は、非ポリペプチド成分、例えば、非ペプチドリンカー、例えば、治療または診断に関連する放射線核種に対する非ペプチドリガンドを含んでもよい。前記融合タンパク質は、さらに、低分子の有機化合物または非アミノ酸化合物、例えば、糖、オリゴ糖、多糖、脂肪酸等を含んでもよい。本発明の好ましい一実施形態において、前記ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合ヘテロマー分子は、治療または診断に関連する特性を有するタンパク質またはペプチドに、共有または非共有結合される。
【００８２】
ＥＤ−Ｂ結合能を有するユビキチンベースの融合タンパク質を得るための方法について、いくつかの例を、以下に示す。
ａ）ユビキチンに存在するリジン残基を介した前記タンパク質の結合；
ｂ）システイン残基を介した前記ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質の結合
前記システイン残基は、Ｃ末端に位置するか、または任意の他の部位（例えば、２４もしくは５７位のアミノ酸残基）に位置し得る；マレイミド選択的成分による結合；
ｃ）ペプチド性またはタンパク質性の結合−遺伝子融合（好ましくはＣ末端またはＮ末端）
ｄ）タグに基づく融合−標的タンパク質ＥＤ−ＢのＣ末端またはＮ末端に位置するタンパク質またはペプチド。融合「タグ」、例えば、ポリヒスチジン（特に、放射性標識に関する）。
【００８３】
対象のタンパク質を支持体に共有および非共有結合させるための、これらおよび他の方法は、当該技術分野において周知であるので、さらに詳細には説明しない。
【００８４】
前記活性成分は、任意に、サイトカインであり、好ましくは、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦα、ＴＮＦβ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ（ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ）、ＭＩＰ（ＭＩＰ−１−α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β）、ＴＧＦ−β ＬＩＦ１ ＣＤ８０、ＣＤ−４０リガンド、Ｂ７０、ＬＴ−β、Ｆａｓ−リガンド、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１α／β、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＣ−ＣＫ１、ＭＣＰ−１−５、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、リンホタクチン、フラクタルカイン等からなる群から選択されるサイトカインである。
【００８５】
本発明において使用される最も好ましいサイトカインの一つは、ＴＮＦである。炎症性サイトカインであるＴＮＦは、哺乳類の体内において、抗腫瘍作用を含む複数の活性を有する。前記抗腫瘍作用は、ヒトにおいて有効投与量を用いた場合に許容できない毒性を示すことから、現在、臨床上活用されていない。現在、ＴＮＦは、メルファラン等の細胞増殖抑制物質との併用で、治療に使用される。
【００８６】
さらに、前記ヘテロ多量体ユビキチン結合タンパク質に結合可能な前記活性成分は、任意に、毒性化合物、好ましくは、低分子有機化合物またはポリペプチドであり、任意に、例えば、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、トランケート緑膿菌外毒素Ａ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ）、組換えゲロニン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｌｏｎｉｎ）、リシン−Ａ鎖（Ｒｉｃｉｎ−Ａ ｃｈａｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）、ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ケダルシジン（ｋｅｄａｒｃｉｄｉｎ）、マデュロペプチン（ｍａｄｕｒｏｐｅｐｔｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、コレラトキシン（ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ）、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ）からなる群から選択される毒性化合物である。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態において、前記本発明のユビキチン結合タンパク質は、人工アミノ酸を含んでもよい。
【００８８】
前記本発明の融合タンパク質のさらなる実施形態において、前記活性成分は、蛍光色素である。好ましくは、前記活性成分は、ガンマ放射同位体のグループ、好ましくは、９９_Ｔｃ、１２３_Ｉ、１１１_Ｉｎ、陽電子放出体のグループ、好ましくは、１８_Ｆ、６４_Ｃｕ、６８_Ｇａ、８６_Ｙ、１２４_Ｉ、ベータ放出体のグループ、好ましくは、１３１_Ｉ、９０_Ｙ、１７７_Ｌｕ、６７_Ｃｕ、またはアルファ放射体のグループ、好ましくは、２１３_Ｂｉ、２１１_Ａｔのいずれかのグループから選択される放射線核種；Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒまたはＣｙ ｄｙｅｓ（Ｂｅｒｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ５１ （１２）： １６９９−１７１２， ２００３）；光増感剤；プロコアグラント因子、好ましくは、組織因子（例えば、ｔＴＦ（短縮化組織因子）；プロドラッグ活性化のための酵素、好ましくは、カルボキシぺプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼからなる群から選択される一つの酵素；および／または機能性Ｆｃドメイン、好ましくは、ヒト機能性Ｆｃドメインからなる群から選択される１つの成分である。
【００８９】
本発明の融合タンパク質に関するさらなる実施形態は、さらに、血清半減期を調整する成分を含み、好ましくは、ポリエチレングリコールアルブミン結合ペプチドおよび免疫グロブリンからなる群から選択される成分を含む。
【００９０】
結合特異性
本発明の融合タンパク質の結合特異性（解離定数）は、非融合タンパク質に関して先に定義した通りであり、Ｋｄで示す。本発明によれば、「Ｋｄ」という用語は、特異的結合親和性を定義するものであり、本発明においては、特異的結合親和性は、１０^−５〜１０^−１２Ｍの範囲である。１０^−５Ｍ以下の値であれば、定量化可能な結合親和性であると考えることができる。用途に応じ、Ｋｄの値は、例えば、クロマトグラフィーへの適用の場合には、１０^−６Ｍ〜１０^−１２Ｍが好ましく、１０^−６Ｍ〜１０^−１１Ｍがさらに好ましく、または、診断もしくは治療への適用の場合には、１０^−９Ｍ〜１０^−１２Ｍが好ましい。さらに好ましい結合親和性は、１０^−７〜１０^−１０Ｍであり、好ましくは、１０^−１１Ｍである。
【００９１】
前記結合親和性を決定する方法は、それ自体公知であり、例えば、下記の方法から選択できる：ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）により提供される）、蛍光分光法、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、超遠心分析法、ＦＡＣＳ。当該技術分野において利用可能なその他の方法もまた、当業者の一般的な知識の範疇において使用可能である。
【００９２】
上記修飾後、本発明者らは、実施例で述べるアミノ酸修飾ユビキチン配列が、非常に高い親和性（Ｋｄ値１０^−１２Ｍ以下）で標的と結合することを見出した。
【００９３】
ユビキチンの多量体化
本発明のさらなる実施形態では、ＥＤ−Ｂに結合可能な前記ユビキチンタンパク質を、ＥＤ−Ｂに結合可能な少なくとも１つの第２のユビキチンタンパク質と融合させ、任意にサイトカインである薬学的活性成分、または診断用成分と任意に融合される、前記ユビキチンタンパク質の多量体、任意に二量体または三量体を得る。あるいは、ＥＤ−Ｂに結合可能な前記ユビキチンタンパク質を、ＥＤ−Ｂに結合可能な少なくとも１つの第２のユビキチンタンパク質と融合させ、任意にＴＮＦαである前記薬学的活性成分、または前記診断用成分を介して形成される、前記ユビキチンタンパク質の多量体、任意に二量体または三量体を得る。
【００９４】
本明細書中において、「多量体」は、同一または１以上の異なる単量体ユビキチンタンパク質を含み得るタンパク質と考えられる。前記多量体が同一の単量体ユビキチンユニットを含有する場合には、ホモマーまたはホモ多量体（例えば、ホモ二量体またはホモ三量体）が形成される。二量体が異なる修飾がなされた２つの単量体を含む場合、前記二量体は、「異種二量体」または「ヘテロ二量体」と呼ばれる。２以上の異なる単量体ユビキチンユニットが存在する場合、ヘテロマーまたはヘテロ多量体が形成される。この発明の最も好ましい実施形態においては、ＥＤ−Ｂへの結合能を有する前記ヘテロマーは、少なくとも２つの異なる修飾ユビキチン単量体からなる。本発明の「ヘテロ二量体」は、特定の結合パートナーに対し、一価の結合特性をそれぞれ有する２つの異なる単量体ユビキチンタンパク質からなる、修飾ユビキチンタンパク質の融合物と考えられる。
【００９５】
よって、本発明の「ヘテロ多量体」、任意に「ヘテロ二量体」は、特定の結合パートナーＥＤ−Ｂに対して共同で一価の結合特性を示す、異なる修飾がなされた少なくとも２つの（あるいは、少なくとも１つは修飾され、１つは非修飾である）単量体ユビキチンタンパク質の融合物と考えられる。本発明の修飾ヘテロ二量体ＥＤ−Ｂ結合ユビキチンタンパク質は、各単量体ユビキチンタンパク質を個々にスクリーニングし、その後、これら２つを結合して得るのではなく、前記ＥＤ−Ｂリガンドに対して共同での一価の結合活性を示す第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットからなるヘテロ二量体タンパク質をスクリーニングすることによって得られることを強調しておく。前記サブユニットのそれぞれは、ＥＤ−Ｂへの結合親和性がかなり制限され、結合した二量体修飾ユビキチンタンパク質のみが、本明細書に記載の優れた結合特性を有すると考えられる（例えば、図４参照）。
【００９６】
本発明によれば、ヘッドトゥテイル融合により遺伝学的に結合された（genetically linked）、異なる修飾がなされた２つのユビキチン単量体（あるいは、少なくとも１つは修飾され、１つは非修飾である）は、ＥＤ−Ｂの同じエピトープに結合し、両方の結合ドメイン領域が共に作用する場合のみ効果を示す。前記単量体の前記ＢＤＲは、単一の連続的な結合領域を形成する。
【００９７】
本発明の一実施形態においては、本発明により提供される修飾ユビキチンタンパク質を、異なる特異性のユビキチンタンパク質に、好ましくは部位特異的に結合させることができ、これにより、結合パートナーに対して一価の結合特性を有する、モジュール構成されたユビキチンが得られる。
【００９８】
よって、例えば、上述の手順で得られたユビキチンの２つの変異体を、部位特異的に互いに結合させることができる。したがって、多量体を形成する場合、前記単量体ユビキチンユニットを生成し、これらをヘッドトゥテイルで結合させることによって形成可能である。換言すると、前記単量体ユニットは、前記多量体内に含まれるユニットの数に応じ、Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ−方向に結合される。前記多量体化は、リンカーを使用することなく直接行うか、またはリンカーを介して行うことができる。
【００９９】
本発明の別の実施形態では、ＥＤ−Ｂに結合する修飾ユビキチン単量体の２つの変異体を、適切な方法で互いに遺伝学的に結合させることができ、これにより、極めて特異的な結合分子が得られる。ヘッドトゥテイル融合により遺伝学的に結合した修飾ユビキチン単量体の２つの変異体が、同じエピトープに結合し、両方の結合ドメイン領域が共に作用する場合のみ効果を示すことが特に好ましい。換言すると、これらは、前記２つのモジュールの両結合領域が共に作用することによって形成される単一の連続的な結合領域を介して、同一のエピトープに結合する。
【０１００】
したがって、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂに効果的に結合させるべく本発明により修飾されたユビキチンタンパク質は、多量体化されてもよく、特に、二量体化または三量体化されてもよい。ユビキチン単量体の融合は、リンカーを介して行うことができる。前記リンカーとしては、例えば、少なくともＧＩＧの配列、または、任意の他のリンカー、例えば、ＳＧＧＧＧＩＧまたはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧがあげられる。２以上のユビキチン単量体の遺伝子融合用の他のリンカーを使用することもできる。好ましくは、このようなユビキチンタンパク質は、少なくとも２つの結合決定領域（ＢＤＲ）からなり、各ＢＤＲにおいて、２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位におけるアミノ酸の少なくとも１個が修飾され、前記ＢＤＲが、互いに遺伝子融合（genetically fused）されている。前記標的への結合は、両ＢＤＲが共同で媒介する。
【０１０１】
前記修飾ユビキチンタンパク質のさらなる多量体化を、例えば、前記修飾ユビキチンタンパク質を、サイトカインのような多量体化ドメインを有するエフェクター分子、例えば、ＴＮＦαに融合させることによって行うことができる。１以上の修飾ユビキチン単量体（二量体等、好ましくはヘテロ二量体）と、ＴＮＦαとの融合は、リンカーを介して行うことができる。さらに別の実施形態においては、前記多量体化は、２以上の修飾ユビキチン分子を遺伝子融合させるか、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを使用することによって行われる。さらに別の実施形態においては、前記多量体化ドメインが、薬学的活性成分としても作用する。一例を挙げると、ＴＮＦαは、多量体化ドメインおよび医薬品成分の両方の役割を果たす。
【０１０２】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の多量体化修飾ユビキチンタンパク質は、ヘテロマーからなる。「ヘテロマー」という用語は、異なる組成のユビキチン単量体が、多量体化分子に含まれることを意味する。遺伝子融合された２つのユビキチン単量体からなるヘテロ二量体であって、前記２つのユビキチン単量体が、結合ドメイン領域は異なるが、単一の結合部位を有しているものが特に好ましい。これらのヘテロ二量体は、例えば、ＴＮＦ、最も好ましくは、ＴＮＦαを使用することによって多量体化できる。ユビキチンヘテロ二量体を使用する利点の１つは、高い結合特異性でＥＤ−Ｂを標的とすることができることである。
【０１０３】
二量体化、または一般的には多量体化のさらなる利点は、ＥＤ−Ｂに対する前記新たに生成された結合タンパク質の足場の全体的な安定性を低下させることなく、タンパク質化学的完全性を維持しながら、修飾可能なアミノ酸残基の数を増加できることにある。一方では、ＥＤ−Ｂに対する結合部位を生成するために修飾可能な残基の総数は、前記修飾残基を、２つまたは３つのユビキチンタンパク質の足場に割り当てることができるために増加する。他方では、単一のユビキチンタンパク質の足場上の残基の数は減少するが、前記修飾結合分子のタンパク質化学的安定性は維持される。要約すると、前記修飾アミノ酸は、２個または３個のユビキチン分子に含まれるため、前記ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合タンパク質のモジュール構造により、修飾アミノ酸の総数を増加することが可能となる。先に述べた修飾数は、修飾ユビキチン一分子当たりの数である。
【０１０４】
さらに、多量体化により、標的物質に対する２つ（以上）の結合部位と、１つの一価の特異性（一つのシングルエピトープに対する）を有する修飾ユビキチン分子を提供し得るが、二特異性または多特異性（よって、２以上の異なるエピトープを同時に認識する）が付与される場合もある。
【０１０５】
２以上の修飾ユビキチン分子を、好ましくはヘッドトゥテイル遺伝子融合により融合する場合、修飾数は、修飾ユビキチン分子数に応じて、２倍またはｘ倍にできる。代替例として、前記融合を翻訳後に行うこともできる。
【０１０６】
修飾された状態の単量体ユビキチンタンパク質の使用に関し、二量体、特に、ホモ二量体またはヘテロ二量体等の多量体構造を使用する利点は、下層にある足場のタンパク質化学的完全性に影響を与えることなく修飾可能な残基の数を増加できることにある。
【０１０７】
（ＥＤ−Ｂに結合する修飾ユビキチンタンパク質）
本発明により、ＥＤ−Ｂに結合する修飾ユビキチン単量体が同定された。ＥＤ−Ｂに特異的に結合する好ましい修飾ユビキチンヘテロ二量体は、以下の通りである。
１．第１ユビキチン分子の結合決定領域（ＢＤＲ１）：２、４、６、６２〜６８位の修飾アミノ酸。好ましくは、第２ユビキチン分子に遺伝子融合されている。
第２ユビキチン分子：６、８、６２〜６８位の修飾アミノ酸によりＢＤＲ２が規定されている。
２．第１ユビキチン分子の結合決定領域（ＢＤＲ１）：６、８、６２〜６８位の修飾アミノ酸。好ましくは第２ユビキチン分子に遺伝子融合されている。
第２ユビキチン分子：６、８、６２〜６８位の修飾アミノ酸によりＢＤＲ２が規定されている。
３．第１ユビキチン分子の結合決定領域（ＢＤＲ１）：２、４、６、８、６２〜６８位の修飾アミノ酸。好ましくは第２ユビキチン分子に遺伝子融合されている。
第２ユビキチン分子：２、４、６、８、６２〜６８位の修飾アミノ酸によりＢＤＲ２が規定されている。
４．第１ユビキチン分子の結合決定領域（ＢＤＲ１）：６、８、６３〜６６位の修飾アミノ酸。好ましくは第２ユビキチン分子に遺伝子融合されている。
第２ユビキチン分子：２、６、８、６２〜６８位の修飾アミノ酸によりＢＤＲ２が規定されている。
【０１０８】
実施形態において、前記融合タンパク質は、前記ユビキチンタンパク質の遺伝子融合による二量体であり、第１ユビキチン単量体の６、８、６３〜６６位のアミノ酸が置換され、第２ユビキチン単量体の６、８、６２〜６６位、および、任意に２位のアミノ酸が置換されている。好ましくは、
６位におけるリジン（Ｋ）のトリプトファン（Ｗ）またはフェニルアラニン（Ｆ）への置換、
８位におけるロイシン（Ｌ）のトリプトファンまたはフェニルアラニン（Ｗ、Ｆ）への置換、
６３位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）への置換、
６４位におけるグルタミン酸（Ｅ）のリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）への置換、
６５位におけるセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換、
６６位におけるトレオニン（Ｔ）のプロリン（Ｐ）への置換；
前記第２ユビキチン単量体において、
６位におけるリジン（Ｋ）のトレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、またはグルタミン（Ｑ）への置換
８位におけるロイシン（Ｌ）のグルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、またはセリン（Ｓ）への置換
６２位におけるグルタミン（Ｑ）のトリプトファン（Ｗ）またはフェニルアラニン（Ｆ）への置換
６３位におけるリジン（Ｋ）のセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、またはグルタミン（Ｑ）への置換
６４位におけるグルタミン酸（Ｅ）のアスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはグルタミン（Ｑ）への置換
６５位におけるセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換
６６位におけるトレオニン（Ｔ）のグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）への置換
任意に、２位におけるグルタミン（Ｑ）のアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、またはリジン（Ｋ）への置換が好ましい。
【０１０９】
最も好ましい置換は、下記の通りである。
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５Ｆ、およびＴ６６Ｐの置換；
および、第２単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５ＷおよびＴ６６Ｅの置換；任意にさらにＱ２Ｒの置換、または
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくともＱ２Ｔ、Ｆ４Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｑ６２Ｎ、Ｋ６３Ｆ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＬおよびＴ６６Ｓの置換；
および、第２単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｘ、Ｌ８Ｘ、Ｑ６２Ｘ、Ｋ６３Ｘ、Ｅ６４Ｘ、Ｓ６５ＸおよびＴ６６Ｘの置換；任意にさらにＱ２Ｘの置換、Ｘは、任意のアミノ酸。
【０１１０】
ＥＤ−Ｂへの結合タンパク質を生成するための前記第１ユビキチン単量体における特に好ましい置換は、下記の通りである。
２位：Ｑ→Ｔ、４位：Ｆ→Ｗ、６位：Ｋ→Ｈ、６２位：Ｑ→Ｎ、６３位：Ｋ→Ｆ、６４位：Ｅ→Ｋ、６５位：Ｓ→Ｌ、６６位：Ｔ→Ｓ
【０１１１】
２つの単量体のヘッドトゥテイルでの結合には、リンカーを使用しなくてもよいし、どのようなリンカーを使用してもよい。好ましいリンカーは、配列番号３２のリンカー、または、ＧＩＧ配列、ＳＧＧＧＧＩＧ配列、もしくはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ配列のリンカーである。
【０１１２】
好ましい実施形態において、ＥＤ−Ｂに対する結合のために共に作用する２つの結合決定領域（ＢＤＲ）を備えたユビキチンヘテロ二量体は、配列番号３３または３４のアミノ酸配列を含む。薬学的活性成分としてＴＮＦαを含む、本発明の好ましい融合タンパク質は、配列番号３５または３６の配列を有する。さらに好ましいタンパク質は、下記配列（配列番号４７）を有するものであるが、下記配列中、ＸＸＸＸは、どのようなアミノ酸でもよい。リンカーとして、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ配列が使用される（イタリック体で示す）。他の種類のリンカー、またはリンカーなしも、実施可能な代替例と理解すべきである。
【化１】

【０１１３】
これらの配列のタンパク質のコンセンサス配列の例を、図１９に示す。
【０１１４】
さらに別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＴＮＦαに融合したユビキチンヘテロ二量体の融合タンパク質の三量体であり、前記融合タンパク質は、配列番号３５または３６の配列を有するか、あるいは、配列番号３５または３６に対して９０％以上の配列同一性、好ましくは９５％を超える配列同一性、９６％を超える配列同一性、または９７％までの配列同一性を有し、また同時に、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対する元の融合タンパク質の高親和性での結合能を、維持または向上することが好ましい。
【０１１５】
本発明のさらなる態様において、本発明は、前述のタンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをも包含する。さらに、前記ポリヌクレオチドを含むベクターも、本発明に包含される。
【０１１６】
本発明のさらなる態様において、本明細書中に記載のタンパク質もしくは融合タンパク質、および／あるいは、本発明の組換えタンパク質もしくは組換え融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、宿主細胞が包含される。
【０１１７】
（本発明のタンパク質、例えば、ＴＮＦα等のエフェクターに融合したＥＤ−Ｂ特異性ヘテロ二量体ユビキチンベース結合タンパク質の使用）
本発明の修飾ユビキチンＥＤ−Ｂ結合タンパク質は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用する診断手段の調製、ならびに治療手段の調製に使用される。前記本発明のタンパク質は、例えば、直接的なエフェクター分子（修飾物質、拮抗物質、作用物質）または抗原認識ドメインとして使用できる。ＥＤ−Ｂ抗原が大量に出現する腫瘍の例を、図１の表に示す。
【０１１８】
選択する融合パートナーに応じて、本発明の医薬組成物は、癌、例えば、乳癌および結腸直腸癌、またはＥＤ−Ｂが大量に出現する任意の他の腫瘍性疾患（図１に列記したこれらの例を参照）の治療を対象とするように適合される。
【０１１９】
前記組成物は、治療上の有効量を含むように適合される。投与量は、治療対象の組織、疾患の種類、患者の年齢および体重、ならびにそれ自体公知である他の要因によって決まる。
【０１２０】
前記組成物は、薬学的または診断的に許容されるキャリアを含み、さらに、それ自体公知の助剤を任意に含み得る。これらは、例えば、安定化剤、界面活性剤、塩類、緩衝剤、着色剤等を含むが、これらに限定されない。
【０１２１】
前記医薬組成物は、局所塗布用の液状製剤、クリーム、ローションの剤形；エアロゾル；粉末、細粒、錠剤、座剤、カプセル剤の剤形；エマルジョン、リポソーム製剤の剤形を取り得る。前記組成物は、無菌、非発熱原性、等張性であり、それ自体公知である、薬学的に既存かつ許容可能な添加剤を含むことが好ましい。加えて、米国薬局方またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）の規則も参照する。
【０１２２】
ヒトおよび獣医学の医薬療法および予防法の分野において、本発明により修飾されたＥＤ−Ｂ結合ユビキチンタンパク質を少なくとも１つ含む薬学的に有効な医薬品を、それ自体公知の方法により調製できる。ガレノス式製剤学（ｇａｌｅｎｉｃ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）に応じて、これらの組成物を、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、または他の適用方法により投与できる。医薬調合物の種類は、治療対象の疾患の種類、疾患の重症度、治療対象の患者、および医学分野の当業者に公知の他の要因によって決定される。投与は、注射もしくは点滴による非経口的な投与、全身的、直腸的、経皮的な投与、または従来使用されている他の方法による投与のいずれかとすることができる。
【０１２３】
一実施形態において、前記医薬組成物は、本発明のタンパク質もしくは融合タンパク質、またはこれらの混合物を含み、さらに、１以上の化学療法剤、好ましくは、下記表に示すものから選択される化学療法剤を含む。
【０１２４】
【表１】

【０１２５】
好ましい実施形態において、前記化学療法剤は、メルファラン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ダクチノマイシン、フルオロデオキシウラシル、シスプラチン、パクリタキセル、およびゲムシタビンから選択されるか、またはキナーゼ阻害剤群から選択される。
【０１２６】
本発明の「医薬組成物」は、種々の活性成分と希釈剤および／または担体が互いに混合された組成物の形態で存在してもよいし、あるいは、前記活性成分が、部分的にまたは全体的に別個に存在する組み合わせ製剤の形態を取ってもよい。このような組み合わせまたは組み合わせ製剤の一例は、複数の部品からなるキットである。
【０１２７】
本発明の「組成物」は、少なくとも２つの薬学的活性化合物を含む。これらの化合物は、同時に投与してもよいし、１分〜数日の時間間隔で個々に投与してもよい。これらの化合物は、同じ経路で投与してもよいし、異なる経路、例えば、活性化合物の１つを経口投与し、他の活性化合物を非経口投与することも可能である。また、前記活性化合物は、一つの医薬品、例えば、一つの点滴液中に調剤されてもよいし、別々に調剤された両化合物を含むキットとして提供されてもよい。また、両化合物を、２以上の包装内に存在させることも可能である。
【０１２８】
特に好ましい組み合わせは、本発明の融合タンパク質とメルファランおよび／またはドキソルビシン（リポソーム製剤）である。ＡＴＣ Ｌ０１分類の抗悪性腫瘍剤以外にも、本発明のＴＮＦ融合タンパク質は、サイトカインとその誘導体、放射性医薬品、細胞ベースの治療薬、およびナノ粒子を含む、他の抗悪性腫瘍物質と併用できる。
【０１２９】
腫瘍透過処理活性（ｔｕｍｏｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）により、本発明のＴＮＦ融合タンパク質は（さらに、本発明の他の組換えタンパク質／融合タンパク質も）、世界保健機関提供の解剖治療化学分類法（ＡＴＣ）においてＬ０１として列挙される全ての抗悪性腫瘍剤と併用できる。ここで、驚くべきことに、ＴＮＦαに融合したユビキチンヘテロ二量体の融合タンパク質、好ましくは、配列番号３５または３６の配列を有する融合タンパク質が、有利に治療に適用できることがわかった。ＴＮＦαは毒性が高く、よって、低用量でしか投与できないが、このような用量は、通常、最小治療閾値を下回る（よって、治療上不活性である）。ＴＮＦαのこの毒性のため、治療上有効な濃度を達成するために、現在、ＴＮＦαの使用に際しては、四肢分離かん流アプローチが選択されている。四肢かん流は、腕または足に直接抗癌剤を輸送するために使用できる医療技術である。四肢への血流および四肢からの血流を止血帯で一次的に停止させ、抗癌剤を直接四肢の血液に注入する。これにより、患者は、癌が発生している領域に高い投与量のＴＮＦαを受けることができる。
【０１３０】
しかしながら、本発明のＴＮＦα融合タンパク質を適用すれば、非毒性でありながら、治療的に有効な濃度でＴＮＦαを投与することが可能となる。ＴＮＦαは、本発明の（結合）融合タンパク質に連結されるため、疾病部位（例えば、腫瘍部位）において直接活性を示し、よって、「遊離」ＴＮＦαの量を激減させることができる。
【０１３１】
ＴＮＦαの全身性副作用は、ＴＮＦαを本発明の融合タンパク質として投与することにより、著しく軽減できる。本発明のＴＮＦα融合タンパク質を使用することにより、治療効果に達するためのＴＮＦαの全投与量を大幅に低減でき、特に、化学療法剤（上記参照）を併用する全身的な腫瘍治療において、有利に使用できる（四肢かん流の必要性および制約がない）。
【０１３２】
さらなる実施形態において、前記医薬組成物は、複数の部品からなるキットの形態であり、本発明の組換えタンパク質／組換え融合タンパク質、および１以上の化学療法剤が別々に提供される。
【０１３３】
（本発明のＥＤ−Ｂ結合タンパク質の製造方法）
本発明のＥＤ−Ｂ結合タンパク質は、例えば、単純な有機合成戦略、固相支援合成技術等の多数の従来公知の技術のいずれかにより、または、市販の自動合成装置により、調製すればよい。また、本発明のＥＤ−Ｂ結合タンパク質は、従来の遺伝子組換え技術を単独で使用するか、または、従来の合成技術と併用することにより、調製してもよい。
【０１３４】
本発明の他の態様において、組換え修飾タンパク質の製造方法が提供される。前記方法は、少なくとも下記の工程を含む。
ａ）ユビキチンタンパク質を提供する工程
ｂ）フィブロネクチンのＥＤ−Ｂを提供する工程
ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して６０％以上のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を得るために前記ユビキチンタンパク質を修飾する工程であり、
２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６、および／または６８位における、少なくとも４個のアミノ酸を、置換、欠失、または付加により修飾する工程
ｄ）前記修飾ユビキチンタンパク質を、前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂと接触させる工程
ｅ）１０^−５〜１０^−１２Ｍの特異的結合親和性で前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂと結合する修飾ユビキチンタンパク質をスクリーニングする工程
ｆ）前記修飾ユビキチンタンパク質を単離する任意の工程
【０１３５】
前記修飾は、任意にＤＮＡレベルでの遺伝子工学により行われてもよく、前記修飾タンパク質の発現は、任意に原核生物、真核生物、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて行われてもよい。
【０１３６】
さらなる実施形態において、前記修飾工程は、化学的合成工程を含む。
【０１３７】
さらに別の実施形態において、前記方法は、前記修飾ユビキチンタンパク質が、薬学的活性成分（任意にサイトカイン、好ましくはＴＮＦα）または診断用成分と融合するように適合されている。あるいは、前記方法は、前記組換えタンパク質を、少なくとも１つの第２の組換えユビキチンタンパク質と融合させて前記組換えユビキチンタンパク質の多量体、任意に二量体または三量体とし、この多量体を、任意にサイトカインである薬学的活性成分、または診断用成分と任意に融合させるか、または、前記組換えタンパク質を少なくとも１つの第２の組換えユビキチンタンパク質と融合させて前記組換えユビキチンタンパク質の多量体、任意に二量体または三量体とし、この多量体を、任意にＴＮＦαである前記薬学的活性成分、または前記診断用成分を介して形成させるように適合されている。
【０１３８】
本発明によれば、修飾タンパク質は、さらに、化学的合成により調製されてもよい。この実施形態において、請求項１の前記ｃ）工程からｄ）工程は、一つの工程で行われる。
【０１３９】
本発明の別の態様においては、ヘテロ多量体融合タンパク質の製造方法が提供される。前記方法は、以下の工程を含む。
ａ）好適なリンカーを介して結合された２以上の修飾ユビキチン単量体を含む多量体ユビキチンタンパク質を提供する工程であり、
配列番号１のアミノ酸配列に対して６０％以上のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を得るために、前記多量体ユビキチンタンパク質における各単量体が修飾されており、
各単量体において、２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６、および／または６８位における少なくとも４個のアミノ酸が、置換、欠失、または付加により修飾されている工程
ｂ）フィブロネクチンのＥＤ−Ｂを提供する工程
ｃ）前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質を、前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂと接触させる工程
ｄ）１０^−５〜１０^−１２Ｍの特異的結合親和性で前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂに結合する修飾ユビキチンタンパク質をスクリーニングする工程
ｅ）前記修飾ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質を単離する任意の工程
【０１４０】
本発明の別の態様においては、組換え修飾ユビキチンタンパク質の製造方法が提供される。前記方法は、少なくとも以下の工程を含む。
ａ）単量体ユビキチンタンパク質から生じる、異なる修飾がなされた二量体ユビキチンタンパク質群を提供する工程であり、
前記群が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された２つの修飾ユビキチン単量体を含む二量体ユビキチンタンパク質を含み、
前記二量体タンパク質の各単量体は、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸の置換により、異なる修飾がなされ、
前記置換は、下記（１）または（２）を含む、前記工程
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換、または
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
ｂ）潜在的なリガンドとして、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）を提供する工程
ｃ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群を、前記フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）と接触させる工程
ｄ）スクリーニング処理により、修飾二量体ユビキチンタンパク質を同定する工程であり、
前記修飾二量体ユビキチンタンパク質は、前記フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）と、Ｋｄ１０^−７〜１０^−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して、一価の結合活性を示すタンパク質である、前記工程
ｅ）前記修飾二量体ユビキチンタンパク質を、前記結合親和性を用いて単離する任意の工程
【０１４１】
前記好ましい実施形態において、前記ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質は、ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質である。
【０１４２】
さらに別の態様において、本発明は、上述の直線状ポリユビキチン鎖をベースとし、少なくとも２つのＢＤＲにおいてランダム化されているライブラリーに関する。
【０１４３】
本発明のさらなる態様において、前述の２つのライブラリーの融合により得られるＤＮＡを含む融合ライブラリーが提供される。ヘテロ二量体ユビキチン融合タンパク質を得るために、各ライブラリーは、異なる修飾がなされた単量体ユビキチンタンパク質ユニットをコードし、前記単量体ユニットは、互いにヘッドトゥテイル配置で結合される。前記ライブラリーは、前記フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示すユビキチンのヘテロ二量体融合タンパク質をコードする。前記相互結合は、当業者に公知のリンカーのいずれか１つ、または本明細書に記載のリンカーを用いて行われる。本発明の一実施形態において、ＴＮＦαは、同時に薬学的活性化合物としての役割も果たすリンカーとして使用される。
【０１４４】
複合ライブラリーの製造の概要を、実施例１で述べる。ただし、このようなライブラリーの品質に注意を払わなければならない。抗体または足場技術におけるライブラリーの品質は、そもそも、複雑性（個々の変異体の数）および機能性（得られた候補の構造的およびタンパク質化学的完全性）に左右される。しかしながら、両特性が互いに悪影響を及ぼし合う場合があり、前記足場における修飾位置の数を増加させてライブラリーの複雑性を向上しようとすれば、変異体のタンパク質化学的特性の低下を招くおそれがある。これにより、溶解度の低下、凝集、および／または低収量が起こることもある。これは、エネルギー的に良好なタンパク質パッケージを有する未変性の足場からの逸脱がより大きくなることによる。
【０１４５】
このため、このような足場ライブラリーの適切な構築は、標的への結合性を最適化するために、元の配列にできるだけ多くの変異を導入することと、一方で、タンパク質化学的な悪影響を避けるために、元の一次配列をできるだけ保存するという、両極端な姿勢の間でバランスをとる作業となる。
【０１４６】
本開示は、本発明の態様または実施形態を考慮して考え得る、本明細書に記載の特徴の各組み合わせも包含する。
【０１４７】
標的ＥＤ−Ｂに対して結合親和性を有する修飾ユビキチンタンパク質の選択、および、結合親和性を発生させる修飾アミノ酸の決定
例えば、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質をコードする少なくとも２つのＤＮＡライブラリーが、各単量体ユビキチンユニットにおいて、選択されたアミノ酸に異なる修飾をすることにより確立された後、これらのライブラリーを、例えば、リンカー技術によって遺伝子融合し、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡ分子を得る。これらのライブラリーのＤＮＡによりタンパク質を発現させ、得られた修飾二量体タンパク質を、本発明によりＥＤ−Ｂに接触させ、結合親和性が存在する場合には、パートナー同士の結合が任意に可能となる。
【０１４８】
接触工程およびスクリーニング工程が、ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質について、既に行われていることが本発明の重要な態様である。この工程により、ＥＤ−Ｂへの一価の結合活性を提供するユビキチンタンパク質のスクリーニングが可能となる。
【０１４９】
本発明による接触は、適切な提示および選択方法、例えば、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、ｍＲＮＡディスプレイ法、細胞表面ディスプレイ法、酵母表面ディスプレイ法、または細菌表面ディスプレイ法等の方法により行うことが好ましく、ファージディスプレイ法により行うことが好ましい。完全な開示としては、下記の参考文献を参照できる；Ｈｏｅｓｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．． ３ （１９９３）， ５７２−５７９；Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２ （１９９２）， ５９７−６０４；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９９６）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。前述の方法は、当業者に公知であり、それらを改変した方法も含めて、本発明において使用可能である。
【０１５０】
本発明において、前記修飾タンパク質が、所定の結合パートナーに対して、定量化可能な結合親和性を有するかどうかの決定は、好ましくは、下記の方法の１以上により、行うことができる：ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分光法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定、および超遠心分析法。
【０１５１】
ファージディスプレイ選択法
本願に適合するファージディスプレイ法の一種を、結合特性を示すユビキチン変異体についての、本発明による選択手法の一例として後述する。同様に、例えば、細菌上（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １１（９）：８２５−８３２）もしくは酵母細胞上に提示する方法（ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ； Ｋｉｅｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０（１１）：１３０３−１０）、または、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， １９９７ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９４（１０）：４９３７−４９４２； Ｈｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ， １９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（２４）：５１３２−５１３４）、ｃｉｓディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．， ２００４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０１（９）：２８０６−２８１０）もしくはｍＲＮＡディスプレイ等の無細胞選択システムを適用できる。後者の場合、遺伝子型と表現型との一時的な物理的結合が、リボソームを介したタンパク質変異体の適切なｍＲＮＡへの結合により達成される。
【０１５２】
本明細書に記載のファージディスプレイ法において、ユビキチンの組換え変異体は、繊維状ファージ上に提示され、一方、提示される変異体をコードするＤＮＡは、同時に、ファージエンベロープ中に、一本鎖の形で詰め込まれる。このように、親和性の向上という枠組みにおいて、特定の特性を有する変異体をライブラリーから選択することができ、それらの遺伝情報は、適切な細菌への感染により増幅できるか、または、異なる濃縮サイクルに添加できる。ファージ表面での変異したユビキチンの提示は、アミノ末端シグナル配列、好ましくは、ＰｅｌＢシグナル配列、および、前記ファージのカプシドまたは表面タンパク質への遺伝子融合により達成される。カプシドタンパク質ｐＩＩＩまたはその断片へのカルボキシ末端融合が好ましい。また、コードされた融合タンパク質は、例えば、親和性クロマトグラフィーによる検出および／または精製のための親和性タグもしくは抗体エピトープ、または、親和性濃縮過程における融合タンパク質の特異的な切断のためのプロテアーゼ認識配列等の、さらなる機能性成分を含むことができる。また、例えば、ユビキチン変異体の遺伝子と、ファージカプシドタンパク質またはその断片のコード領域との間に、アンバー停止コドンを存在させることができる。前記アンバー停止コドンは、部分的には１つのアミノ酸の導入に起因して、適切なサプレッサー株内での翻訳中には認識されない。
【０１５３】
所定のハプテンまたは抗原への結合特性を有するユビキチン変異体の単離に関する選択方法に適した細菌ベクターであって、前述の融合タンパク質の遺伝子カセットが挿入される細菌ベクターは、ファージミドという。数ある中でも、それは、繊維状ファージの遺伝子間領域（例えば、Ｍ１３もしくはｆ１）またはその一部分を含み、例えば、Ｍ１３Ｋ０７等のヘルパーファージにより前記ファージミドを担持する細菌細胞の重複感染の際、ファージカプシド中に、ファージミドＤＮＡの閉鎖鎖がパッケージングされる。このようにして生成されたファージミドは、細菌により分泌され、コードされた各ユビキチン変異体を、前記カプシドタンパク質ｐＩＩＩまたはその断片への融合により、細菌表面に提示する。天然型ｐＩＩＩカプシドタンパク質は、ファージミド中に存在し、適合するバクテリア株に再感染する能力、およびそれゆえに同一ＤＮＡを増幅する可能性を保持する。このため、前記ユビキチン変異体の表現型、すなわち、その潜在的な結合特性と、その遺伝子型との間の物理的結合が確保される。
【０１５４】
得られたファージミドを、そこに提示されたユビキチン変異体の所定のハプテンまたは抗原への結合に関し、当業者に公知の手法により選択することができる。この目的のために、提示されたユビキチン変異体を、例えば、マイクロタイタープレート上に結合した標的物質に一時的に固定化することができ、非結合の変異体を分離した後に、特異的に溶出することができる。前記溶出は、例えば、１００ｍＭトリエチルアミン等の塩基性溶液により行うことが好ましい。あるいは、前記溶出は、酸性条件下で、タンパク質分解または感染細菌の直接添加により行うことができる。このようにして得られたファージミドは、所定のハプテンまたは抗原への結合特性を有するユビキチン変異体の選択と増幅の連続サイクルにより、再増幅と濃縮が可能である。
【０１５５】
このようにして得られた前記ユビキチン変異体のさらなる特性評価は、ファージミドの形態、すなわち、ファージに融合した形態で、または、対応する遺伝子カセットを好適な発現ベクターにクローニングした後に、可溶性タンパク質の形態で行うことができる。適切な方法は、当業者に公知であるか、または前記文献に記載されている。前記特性評価は、例えば、ＤＮＡ配列の決定、よって、単離された変異体の一次配列の決定を含み得る。さらに、単離された変異体の親和性および特異性を、例えば、ＥＬＩＳＡもしくは表面プラズモン共鳴分光法等の標準的な生化学的方法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定、超遠心分析法、またはその他の方法により検出できる。安定性分析については、例えば、化学的または物理的アンフォールディングについての分光法が、当業者に公知である。
【０１５６】
リボソームディスプレイ選択法
本発明のさらなる実施形態であるリボソームディスプレイ法において、ユビキチン変異体は、無細胞転写／翻訳系により調製され、対応するｍＲＮＡおよびリボソームとの複合体として提示される。この目的のために、前述のＤＮＡライブラリーが、基礎として使用され、前記ＤＮＡライブラリー中で、変異体の遺伝子は、発現およびタンパク質生合成のための対応する制御配列との融合物の形態で存在する。前記遺伝子ライブラリーの３’末端での前記停止コドンの欠失、および適切な実験条件（低温、高Ｍｇ^２＋濃度）により、新生タンパク質、ｍＲＮＡ、およびリボソームからなる三元複合体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳の間、維持される。
【０１５７】
ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質を含むタンパク質ライブラリーが、各単量体ユビキチンユニットにおいて、選択されたアミノ酸に異なる修飾をすることにより確立された後、前記修飾二量体タンパク質を、本発明によりＥＤ−Ｂに接触させ、結合親和性が存在する場合には、パートナー同士の結合が可能となる。これらのタンパク質ライブラリーは、前記修飾タンパク質と前記ＥＤ−Ｂ標的タンパク質間の接触を可能とする方法でディスプレイを行うか、前記修飾タンパク質を提示する任意の他の方法を使用する、ディスプレイ法のライブラリーの形態であってもよい。前記ディスプレイ法は、任意に、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、ＴＡＴファージディスプレイ法、酵母ディスプレイ法、細菌ディスプレイ法、またはｍＲＮＡディスプレイ法である。
【０１５８】
Ｋｄ＝１０^−７〜１０^−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性によるＥＤ−Ｂへの結合活性に関する修飾ユビキチン変異体の選択を、当業者に公知の方法により行うことができる。この目的のために、例えば、リボソーム複合体上に提示される前記ユビキチン変異体を、例えば、マイクロタイタープレート上に結合した標的物質に一時的に固定化することができ、または、溶液中での結合後に磁性粒子に結合することができる。非結合変異体を分離した後に、リボソーム複合体を破壊することにより、結合活性を有する変異体の遺伝子情報を、ｍＲＮＡの形態で特異的に溶出できる。前記溶出は、５０ｍＭ ＥＤＴＡで行うことが好ましい。このようにして得られたｍＲＮＡは、単離して適切な方法を使用してＤＮＡに逆転写でき（逆転写反応）、このようにして得られた前記ＤＮＡは、再増幅できる。
【０１５９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳、選択および増幅の連続サイクルにより、所定のハプテンまたは抗原に対する結合特性を有するユビキチン変異体を濃縮できる。
【０１６０】
ＥＤ−Ｂ結合タンパク質の特性評価
このようにして得られたユビキチン変異体のさらなる特性評価は、上述の通り、対応する遺伝子カセットを好適な発現ベクターにクローニングした後に、可溶性タンパク質の形態で行うことができる。適切な方法は、当業者に公知であるか、または前記文献に記載されている。
【０１６１】
好ましくは、所定の結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質の検出工程の後に、検出したタンパク質の単離および／または濃縮工程が続く。
【０１６２】
本発明により修飾したユビキチンタンパク質の発現に続いて、それ自体公知の方法により、これをさらに精製して濃縮することができる。選択される方法は、例えば、使用する発現ベクター、宿主生物、使用予定分野、タンパク質の大きさ、およびその他の要因等、それ自体当業者に公知の複数の要因により決定される。簡易に精製するために、本発明により修飾したタンパク質を、分離材料に対して高い親和性を有する他のペプチド配列に融合させることができる。好ましくは、ユビキチンタンパク質の機能性に有害な影響を及ぼさないか、あるいは、特定のプロテアーゼ切断部位の導入により精製後に分離可能な融合物が選択される。このような方法もまた、それ自体当業者に公知である。
【０１６３】
（図面の簡単な説明）
図１は、種々の腫瘍におけるＥＤ−Ｂの発生について列記した表を示す。
【０１６４】
図２Ａは、修飾ユビキチンＥＤ−Ｂバインダー５Ｅ１に関する濃度依存性ＥＬＩＳＡの結果を示す。前記修飾ユビキチンＥＤ−Ｂバインダー５Ｅ１は、２３ｎＭの親和性でヒトＥＤ−Ｂに結合し（黒丸）、一方、ＢＳＡへは結合しなかった（白丸）。
【０１６５】
図２Ｂは、修飾ユビキチンＥＤ−Ｂバインダー１Ｈ４に関する濃度依存性ＥＬＩＳＡの結果を示す。前記修飾ユビキチンＥＤ−Ｂバインダー１Ｈ４は、７．８ｎＭの親和性でヒトＥＤ−Ｂに結合した（黒丸）。コントロールとして、ＢＳＡへの結合をプロットしている（白丸）。
【０１６６】
図３は、四量体化により親和性が向上することを示している。図３の表に、修飾ユビキチン単量体のＫｄ値を、修飾ユビキチン単量体からなる四量体のものと比較して示している。図中の例は、ユビキチン変異体５Ｅ１および１Ｈ４である。ＥＤ−Ｂ結合を、ｃ−ＦＮ（細胞性フィブロネクチン）への結合と比較している。図３は、標的ＥＤ−Ｂへの四量体変異体の結合親和性（例えば、５Ｅ１は５６ｎＭ、１Ｈ４は１．４ｎＭ）が、前記単量体の結合親和性（５Ｅ１は４．５１μＭ、１Ｈ４は９．９８μＭ）と比べて著しく高いことを示している。
【０１６７】
図４は、前方（第１）修飾ユビキチン単量体（ＢＤＲ１を有する）と異なる修飾がされた後方（第２）ユビキチン単量体（ＢＤＲ２を有する）との遺伝子組換えによるヘテロ二量体の生成により、親和性および特異性が有意に向上することを示している。前記修飾ユビキチン分子は、Ｂｉａｃｏｒｅ、蛍光偏光測定、細胞および組織切片への結合により分析した。複数の変異体のヒトＥＤ−Ｂへの結合に関する濃度依存性ＥＬＩＳＡ（ｃｏｎｃ−ＥＬＩＳＡ）の結果を示す。
【０１６８】
図４Ａは、単量体４１Ｂ１０について、結合親和性がＫｄ＝９．４５μＭであることを示している。
【０１６９】
図４Ｂは、４１Ｂ１０が異なる第２単量体と結合して得られた４６Ｈ９について、結合親和性がＫｄ＝１３１ｎＭであることを示している。
【０１７０】
図５は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）と融合した特異的変異体を示す。前記融合タンパク質は、前記修飾ユビキチン単量体を三量体化したものであり、生物学的に活性な分子である。
【０１７１】
図５Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合エフェクター融合タンパク質の模式図である。同図において、緑色（上部の構造）は、エフェクター、例えば、サイトカイン、好ましくは、ＴＮＦα；茶色、薄い茶色は、修飾ユビキチン単量体（Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標））である。
【０１７２】
図５Ｂは、前記修飾ユビキチンエフェクター結合５Ｅ１−ＴＮＦコンジュゲートが、アポトースシス促進活性（Ｌ９２９アポトーシスアッセイで測定）を有すること示す。
【０１７３】
図５Ｃは、１Ｈ４−ＴＮＦα融合物のＥＤ−Ｂへの高結合親和性（Ｋｄ＝１５．１ｎＭ）を示す（適合線により連結された黒丸）。コントロールとして、ＢＳＡへの結合をプロットしている（線により連結されていない黒丸）。
【０１７４】
図６は、サイトカイン、例えば、ＴＮＦαに融合した、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子の親和性および活性を示す。
・修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合サイトカイン融合物のアポトーシス誘導活性：ＥＣ_５０ ０．７８±０．２４ｐＭ
・遊離サイトカインのアポトーシス誘導活性：ＥＣ_５０ ３．１４±３．５９ｐＭ
【０１７５】
図６Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子２４Ｈ１２の親和性を示す（Ｋｄ ５０．７ｎＭ）。
【０１７６】
図６Ｂは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子２４Ｈ１２がサイトカインＴＮＦαに遺伝子融合し、これにより多量体化した前記ヘテロ二量体２４Ｈ１２の親和性を示す（Ｋｄ＝５．６ｎＭ）。
【０１７７】
図６Ｃは、ヘテロ二量体修飾ユビキチンライブラリーから選択される候補例、例えば、ヘテロ二量体クローン９Ｅ１２、２２Ｄ１、２４Ｈ１２、４１Ｂ１０の分析結果を示す。標的ＥＤ−Ｂに対するＫｄ ＥＬＩＳＡ値は、コントロールとして用いた細胞基質のフィブロネクチンと比べて向上しており、前記標的への特異的結合が確認された。
【０１７８】
図６Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した無標識相互作用分析による、前記修飾ヘテロ二量体ユビキチン分子９Ｅ１２の分析結果を示す。種々の濃度（図中の凡例参照：０〜１５μＭの９Ｅ１２）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化されたＥＤ−Ｂへの結合を分析し、前記ヘテロ二量体変異体９Ｅ１２とＥＤ−Ｂ間の相互作用を分析した。会合解離曲線の分析からは、Ｋｄを、決定できなかった。
【０１７９】
図６Ｅは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した無標識相互作用分析による、前記修飾ヘテロ二量体ユビキチン分子４１Ｂ１０の分析結果を示す。種々の濃度（図中の凡例参照：０〜１５μＭの４１Ｂ１０）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化されたＥＤ−Ｂへの結合を分析し、前記ヘテロ二量体変異体４１Ｂ１０とＥＤ−Ｂとの間の相互作用を分析した。会合解離曲線を分析したところ、Ｋｄは、６２３ｎＭ（６２３×１０^−９Ｍ、６．２×１０^−７Ｍ）であった。
【０１８０】
図７は、異なる修飾がなされたユビキチンベースの変異体の、結合親和性および結合特異性に対する寄与を示す。前記異なる変異体は、小文字で示す共通の配列モジュールを有する。前記変異体を、そのＥＤ−Ｂ結合に関して分析した。図３は、修飾ユビキチンへテロ二量体が得られる、単量体の種々の組み合わせを示す。ヘテロ二量体変異体４６−Ａ５、５０−Ｇ１１、および４６−Ｈ４は全て、ＢＤＲ１が同一の第１（前方）修飾単量体（同図において、「ａ」で示す）を有するが、ＢＤＲ２の異なる位置が修飾された第２（後方）ユビキチン単量体を有する。変異体５２−Ｄ１０および５２−Ｂ３は、４６−Ｈ９と比べて、ＢＤＲ１が異なる第１（前方）修飾単量体を有するが、ＢＤＲ２が同一の第２（後方）ユビキチン単量体（同図において、「ｅ」で示す）を有している。
【０１８１】
前記修飾ユビキチンヘテロ二量体は、下記配列を有する。
４６−Ｈ４：配列番号２５、４５−Ｈ９：配列番号２６、４６−Ａ５：配列番号２７、５０−Ｇ１１：配列番号２８、５２−Ｂ３：配列番号２９、５２−Ｄ１０：配列番号３０
【０１８２】
上記配列は、実験過程において、配列ＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号３１）を有するＨｉｓタグの付加により修飾した。
【０１８３】
図７からわかるように、４６−Ｈ４は、ＥＤ−Ｂへの優れた結合親和性を有する（Ｋｄ＝１８９ｎＭ）。４６−Ａ５および５２−Ｄ１０は、結合活性を有さない。また、他の修飾ユビキチンタンパク質は、ＥＤ−Ｂへの結合活性が４６−Ｈ４と比べて低い。したがって、ヘテロ二量体変異体における両単量体が、標的への高い結合親和性のために必要とされ、両単量体が標的に対する一価の結合を示すと結論付けることができる。
【０１８４】
高いＥＤ−Ｂ結合活性を有する修飾ユビキチンヘテロ二量体４６−Ｈ９は、野生型ユビキチン単量体と比較して、前記２つの単量体の両結合ドメイン領域における下記アミノ酸の置換により同定される。
第１モジュール（ＢＤＲ１）において、（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ａ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
第２モジュール（ＢＤＲ２）において、（ｅ）Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
５０Ｇ１１
第１モジュール（４６Ｈ９）において、（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
第２モジュールにおいて、（ｃ）Ｋ６Ｍ、Ｌ８Ｒ、Ｑ６２Ｍ、Ｋ６３Ｎ、Ｅ６４Ａ、Ｓ６５Ｒ、Ｔ６６Ｌ
４６Ｈ４
第１モジュール（４６Ｈ９）において、（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
第２モジュールにおいて、（ｄ）Ｋ６Ｇ、Ｌ８Ｗ、Ｑ６２Ｔ、Ｋ６３Ｑ、Ｅ６４Ｑ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｒ
５２Ｂ３
第１モジュールにおいて、（ｇ）Ｑ２Ｒ、Ｆ４Ｐ、Ｋ６Ｙ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｆ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｒ
第２モジュール（４６Ｈ９）において、Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
５２Ｄ１０（ＥＤ−Ｂに結合しない）
第１モジュールにおいて、Ｑ２Ｖ、Ｆ４Ｃ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｔ、Ｋ６３Ａ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｇ、Ｔ６６Ｄ
第２モジュール（４６Ｈ９）において、（ｅ）Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
４６Ａ５（ＥＤ−Ｂに結合しない）
第１モジュール（４６Ｈ９）において、（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
第２モジュールにおいて、（ｂ）Ｋ６Ｌ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｌ、Ｋ６３Ａ、Ｅ６４Ｆ、Ｓ６５Ａ
【０１８５】
図８は、配列アライメントを示す。１行目：野生型ユビキチンタンパク質の２つの単量体（１行目）は、７７位から８８位までに存在する、１２個のアミノ酸からなるリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧにより結合される。ＢＤＲ２を有する第２単量体は、８９位のメチオニンから始まる。この二量体野生型ユビキチンタンパク質を、第１単量体および第２単量体に異なる修飾を有し、これにより２つのＢＤＲが生じた、前記修飾ユビキチンへテロ二量体変異体４６−Ｈ９（２行目）とアライメントさせる。標的への一価の結合のために、両ＢＤＲは、標的との結合において共に作用する。
【０１８６】
図９は、「Ｕｂ２＿ＴｓＸ９」（両単量体の４５位がトリプトファンに修飾され、２つの単量体の間にリンカーＧＩＧ（７７〜７９位；８０位のメチオニンから第２単量体が開始）を有し、前記第２単量体の最後のＣ末端アミノ酸において、グリシンからアラニンに置換されているユビキチン）に対する、修飾ユビキチンへテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１（１行目）の配列アライメントを示す。３行目は、二量体である野生型ユビキチンであり、リンカーアライメントを示さない（このため、７７位のメチオニンから第２単量体が開始する）、「Ｕｂｉ−Ｄｉｍｅｒ ｗｔ」を示す。４行目は、ヒトの野生型ユビキチンである「Ｕｂｉ−Ｍｏｎｏｍｅｒ ｗｔ」を示す。
【０１８７】
図１０は、ヒトＥＤ−Ｂへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。変異体１０４１−Ｄ１１は、非常に高いＥＤ−Ｂへの結合親和性を示す（Ｋｄ＝６．９ｎＭ＝６．９×１０^−９Ｍ）。黒丸は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の、フィブロネクチン断片を含むＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９−ｔ０という）に対する結合親和性を示す。対照的に、この変異体は、ネガティブコントロール（６７８９−ｔ０という）には結合しない（白丸）。
【０１８８】
図１１は、フィブロネクチン断片を含む固定化されたＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）に対するヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を、遊離標的の量を増加させながら分析した競合濃度依存性ＥＬＩＳＡの結果を示す。ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１は、非常に高いＥＤ−Ｂへの結合親和性を示す（ＩＣ５０＝１４０ｎＭ）。
【０１８９】
図１２は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した無標識相互作用分析による、前記修飾へテロ二量体ユビキチン分子１０４１−Ｄ１１の分析結果を示す。種々の濃度（図中の凡例参照：０〜２００ｎＭ １０４１−Ｄ１１）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、ＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化された、フィブロネクチン断片を含むＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９という）への結合を分析した。会合解離曲線を分析したところ、Ｋｄは１ｎＭ（１×１０^−９Ｍ）であり、ｋ_ｏｆｆ率は７．７×１０^−４ｓ^−１であり、このｋ_ｏｆｆ率により、１０４１−Ｄ１１とＥＤ−Ｂとの複合体の半減期が長いことが示される。
【０１９０】
図１３は、結合活性の血清安定性を同時に分析する濃度依存性ＥＬＩＳＡにおける、ＥＤ−Ｂへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。同図には、種々の異なる条件、例えば、前記変異体の、マウス血清中、ラット血清中、またはコントロールであるＰＢＳＴ中での、３７℃で１時間でのプレインキュベーション等が示されている。Ｋｄ値は、全て１０〜２０ｎＭの範囲内である。したがって、ＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体１０４１−Ｄ１１の結合は、血清による有意な影響を受けないと結論付けることができる。
【０１９１】
図１４は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１とフィブロネクチン断片との複合体形成の、ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析を示す。
【０１９２】
図１４Ａは、１０４１−Ｄ１１とＥＤ−Ｂとの複合体形成を示す。３回のＨＰＬＣのランを重ねている。保持時間２１．６５１分の青色のピークは、純粋な１０４１−Ｄ１１に由来する。保持時間２６．２８９分の黒色のピークは、フィブロネクチン断片６７Ｂ８９を表す。１０４１−Ｄ１１と６７Ｂ８９との混合物により、ＳＥ−ＨＰＬＣ後の保持時間２１．４０７分の赤色のピークが得られた。１０４１−Ｄ１１のピークの保持時間が短くなる側へのシフト、および、６７Ｂ８９のピークの消失は、１０４１−Ｄ１１と可溶性ＥＤ−Ｂとの複合体が形成されたことを示す。
【０１９３】
図１４Ｂは、１０４１−Ｄ１１（青色、２１．９４４分）、ＥＤ−Ｂを含まないフィブロネクチン断片６７８９（黒色、２６．２８９分）、および１０４１−Ｄ１１と６７８９との混合物（２１．９２９分および２６．２８９分にピークを有する赤色線）について、３回のＳＥ−ＨＰＬＣのランを重ねて示している。１０４１−Ｄ１１のピークのシフトは、ほとんど観察されなかった。この事実は、６７８９のピークが消失しなかったことと併せて、ＥＤ−Ｂを含まないフィブロネクチン断片６７８９との有意な結合を示さないことを表す。
【０１９４】
図１５は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の培養細胞への結合を示す。
【０１９５】
図１５Ａは、固定されたヒト胎児肺繊維芽細胞（Ｗｉ３８）へのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。図１５において、１列目は、抗ＥＤ−Ｂ抗体を使用したコントロールを示し、２列目は、タンパク質濃度５８．７ｎＭでの変異体のインキュベーションを示し、３列目は、１０倍濃度（５８７ｎＭ）の１０４１−Ｄ１１タンパク質でのインキュベーションを示し、４列目は、ＰＢＳを用いたネガティブコントロールを示す。１行目において、ヒトＷｉ３８繊維芽細胞を、位相差で示し、２行目において、免疫蛍光法で示し、３行目において、核のＤＡＰＩ染色を示す。変異体１０４１−Ｄ１１は、ＥＤ−Ｂ含有細胞外マトリックスに対する高特異性で、Ｗｉ３８に結合すると結論付けることができる。ＥＤＢを低レベルで発現するＮＨＤＦ細胞を使用するコントロールを行った（データは示さず）。前記変異体は、これらの細胞には結合しなかった。
【０１９６】
図１５Ｂは、バイタル（ｖｉｔａｌ）ヒト胎児肺繊維芽細胞（Ｗｉ３８）への結合を示す。前記ネガティブコントロールのＮＨＤＦ細胞は、初代の正常繊維芽細胞であり、ＥＤＢ−フィブロネクチンを低レベルで発現する。１行目および３行目は、種々のタンパク質濃度での変異体、ならびにネガティブコントロールを示す。２行目および４行目は、ＥＤＢ抗体を用いたコントロールのインキュベーションを示す。１〜２行目は、Ｗｉ３８細胞株における前記変異体とポジティブコントロールを示す。３〜４行目は、ＮＨＤＦ細胞のインキュベーションを示す。変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂ含有細胞外マトリックスに対する高特異性で、Ｗｉ３８に結合することがわかる。
【０１９７】
図１５Ｃは、固定されたマウスＢａｌｂ ３Ｔ３細胞への結合を示す。前記変異体について、３つの異なるタンパク質濃度（１、１０、５０ｎＭ）でテストした。１行目は、細胞における前記変異体（ＳＰＶＦ−２８−１０４１−４１１−ＴｓＸ９）を示し、２行目は、ポジティブコントロール（Ｆｖ２８−ＥＤＢ−抗体）を示し、３行目は、ネガティブコントロール（ＵＢ２＿ＴｓＳ９；配列番号１に相当する非修飾ユビキチン）を用いたインキュベーションを示す。変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂ含有細胞外マトリックスに対する高特異性で、マウスＢａｌｂ ３Ｔ３細胞に結合することがわかる。
【０１９８】
図１５Ｄは、固定されたマウスＳＴ−２細胞への結合を示す。前記変異体について、３つの異なるタンパク質濃度（１、１０、５０ｎＭ）でテストした。１行目は、細胞における前記変異体（ＳＰＶＦ−２８−１０４１−４１１−ＴｓＸ９）を示し、２行目は、ポジティブコントロール（Ｆｖ２８−ＥＤＢ−抗体）を示し、３行目は、ネガティブコントロール（ＵＢ２＿ＴｓＳ９；配列番号１に相当する非修飾ユビキチン）を用いたインキュベーションを示す。前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂ含有細胞外マトリックスに対する高特異性で、マウスＢａｌｂ ＳＴ−２細胞に結合することがわかる。
【０１９９】
図１６Ａは、哺乳類組織切片における、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の標的に対する特異性を示す。７つの検体から採取したＦ９腫瘍組織について評価を行った。１０ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の異なる濃度のヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１を用いた免疫組織化学検査において、マウス由来のＦ９腫瘍でのＥＤ−Ｂ特異的血管染色（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ）が見られた。ＥＤ−Ｂは、腫瘍血管系の高特異的マーカーである。標的タンパク質であるＥＤ−Ｂは、血管の反管腔側に局在する。変異体１０４１−Ｄ１１は、Ｆ９腫瘍由来の組織切片において、特異的に血管系を装飾する。得られた結果は、抗体フラグメントＬ１９に匹敵する。さらに、４８組織をテストしたところ、ＦＤＡ関連パネルにおける４８組織のいずれにおいても、非特異的な染色は観察されなかった。
【０２００】
図１６Ｂは、腫瘍組織における１０４１−Ｄ１１の蓄積を、野生型ユビキチン（同図において、Ｕｂ２（ＮＣＰ２））と比較して示している。Ｆ９腫瘍組織について、３０分から１６時間の間の異なる時点で、１０４１−Ｄ１１および野生型ユビキチンの存在を分析した。腫瘍組織における１０４１−Ｄ１１の最も高い蓄積は、投与から３０分後および１６時間後に観察されている。一方、Ｆ９腫瘍組織における野生型ユビキチンの蓄積は低い。前記変異体は、ＥＤ−Ｂを発現する腫瘍において、野生型ユビキチンと比べて濃縮されている。このことは、１０４１−Ｄ１１の腫瘍組織指向性のターゲッティングの証拠となる。また、癌モデルにおける１０４１−Ｄ１１の腫瘍／血液比は、動物における１０４１−Ｄ１１変異体ｉｎ ｖｉｖｏ活性を明らかに証明している（データは示さず）。
【０２０１】
図１７は、１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦα融合タンパク質の、ＥＤ−Ｂに対する高い選択性および特異性を示す。
【０２０２】
図１７Ａおよび１７Ｂ：１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦα融合タンパク質のアポトーシス誘導ＴＮＦα活性を、細胞ベースアッセイ（ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）（Ｌ９２９細胞）によりテストした。前記両図は、培養細胞において、前記１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦα融合タンパク質（図１７Ｂ）が、遊離ＴＮＦα（図１７Ｂ）と同程度に活性であることを、明らかに示している。
【０２０３】
図１７Ｃは、標的ＥＤ−Ｂに対する、ヘテロ二量体ユビキチン１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦα融合タンパク質の高い選択性を証明している。前記ヒトＥＤ−Ｂフィブロネクチンドメイン６７Ｂ８９は、見かけのＫＤ値１．８ｎＭで１０４１−Ｄ１１変異体に結合し（黒丸）、標的への高い親和性を示す。ＥＤ−Ｂドメインを欠損するヒトフィブロネクチン（ｈ６７８９）には、１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαは結合しない（白丸）。
【０２０４】
図１７Ｄは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦα融合タンパク質についての、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる結合分析を示す。結果から、１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質が、ＫＤ値１．１３ｎＭの高い親和性を示すことが証明された。
【０２０５】
図１７Ｅは、培養細胞における変異体１０４１−Ｄ１１で観察された高い結合特異性が、１０４１−Ｄ１１がＴＮＦαに融合されても維持されることを示す。前記融合タンパク質は、ＥＤＢ発現細胞に特異的に結合する。したがって、１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質は、非常に高い親和性および特異性で標的ＥＤ−Ｂ（ターゲット（＋））に結合する。ＥＤ−Ｂを含まない血清（ターゲット（−））では、交差反応は観察されなかった。
【０２０６】
図１８は、ＴＮＦαに融合した変異体１０４１−Ｄ１１とメルファランとの併用による、７日間のマウスの処置期間中のｉｎ ｖｉｖｏでの相対的腫瘍成長を示す。データから、１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαを細胞増殖抑制剤であるメルファランと併用した場合には、ｍＴＮＦαとメルファランとを併用した場合、またはメルファラン単独の場合と比べ、より効率的に相対的腫瘍成長が減少されることをはっきりと示している。７日間の処置後の前記腫瘍成長動態は、１０４１−Ｄ１１−ｍＴＮＦαによる高効率での減少を示す。このことは、融合タンパク質１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαとメルファランとの併用による腫瘍治療の有効性の明らかな証拠である。ＥＤ−Ｂは、マウスおよびヒトを含む数種の哺乳類において同一である。このため、前記結果から、ヒトにおける変異体１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαの性能が予測される。
【０２０７】
図１９は、ＥＤ−Ｂに対して驚くほど強力な結合親和性を有することが見出されたさらなる１６種類の配列について、コンセンサスな位置およびアミノ酸置換を示す。前記コンセンサスなアミノ酸位置は、第１単量体の結合決定領域２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６位にあり、一方、コンセンサスなアミノ酸置換は、Ｑ２Ｔ、Ｆ４Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｑ６２Ｎ、Ｋ６３Ｆ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５Ｌ、およびＴ６６Ｓである。図２からわかるように、４種類のファミリーの配列を濃縮できた（コンセンサス配列、文字サイズはアミノ酸の発生頻度に対応する）。８５および８７位は、前記ヘテロ二量体タンパク質において、前記第２単量体における６および８位に対応する位置であり、１４１〜１４５位は、６２〜６４位に対応する。暗青色で示したＴＷＨ ＮＦＫＬＳは、１０７１−Ｃ１２由来である。赤色で示した残基は、前記４種類のファミリーの配列のうちの１種類に属する。赤色で示した残基が、主に濃縮され（１７８／４５７配列）、ＨＩＴ ＥＬＩＳＡによれば、最も強力な結合分子を含む。
【実施例】
【０２０８】
下記実施例は、本発明をさらに説明するために提供するものである。本発明は、特に、ユビキチンの修飾を例にあげて実証されている。しかしながら、本発明は、これに限定されるものではなく、以下の実施例は、単に、前述の記載に基づいた本発明の実施可能性を示しているにすぎない。本発明の完全な開示のため、本願および付属書類に引用されている文献についても言及しているが、これらの引用文献は全て、引用により、その開示全体が本願に取り込まれている。
【０２０９】
［実施例１］
修飾ユビキチンタンパク質ベースのＥＤ−Ｂ結合タンパク質の同定
【０２１０】
単量体結合タンパク質のライブラリーの構築およびクローニング
特に示さない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されているような、確立された組換え遺伝学的手法を使用した。合計１０の選択されたアミノ酸位置における協奏的な変異誘発によって、高度な複雑性を有するヒトユビキチン単量体のランダムライブラリーを用意した。ＮＮＫトリプレットによって置換された修飾アミノ酸は、ユビキチン単量体内の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位から選択された少なくとも３個のアミノ酸を含む。
【０２１１】
ヘテロ二量結合タンパク質のライブラリーの構築とクローニング
特に示さない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されているような、確立された組換え遺伝学的手法を使用した。合計１５の選択されたアミノ酸位置における協奏的な変異誘発によって、高度な複雑性を有するヒトユビキチンヘテロ二量体のランダムライブラリーを用意した。ＮＮＫトリプレットによって置換された修飾アミノ酸は、近位（第１）ユビキチン単量体内の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位から選択された少なくとも３個のアミノ酸、および遠位（第２）ユビキチン単量体内の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位から選択された少なくとも３個のアミノ酸を含む。両ユビキチン単量体は、少なくともＧＩＧ配列、または少なくともＳＧＧＧＧ配列を有するグリシン／セリンリンカーによって遺伝学的に結合（ヘッドトゥテイル配置）しており、リンカー配列の例としては、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号３２）またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧがあげられるが、その他のリンカーでもよい。
【０２１２】
ＴＡＴファージディスプレイ選択
ユビキチンライブラリーを、例えば、選択システムとしてＴＡＴファージディスプレイを使用し、標的に対して濃縮した。当該技術分野において公知である他の選択方法を用いることもできる。前記標的は、タンパク質結合表面上に、またはタンパク質に共有結合されたビオチン化残基を介して、非特異的に固定化され得る。ストレプトアビジンビーズまたはニュートラアビジンストリップ上へのビオチンを介した固定化が好ましい。標的結合ファージは、溶液中または固定化標的上のいずれかにおいて選択される。例えば、ビオチン化され固定化された標的とファージとを、インキュベートし、続いて、マトリックスに結合したファージの洗浄およびマトリックス結合ファージの溶出を行った。標的のインキュベーションに続く各サイクルにおいて、前記ビーズを磁力により溶液から分離し、数回洗浄した。最初の選択サイクルにおいて、ビオチン化標的を、ニュートラアビジンストリップに固定化し、一方、２回目から４回目のサイクルにおいて、溶液中での選択を行い、続いて、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）上に、標的とファージとの複合体を固定化した。最初の２回の選択サイクルでの洗浄後、標的が結合した修飾ユビキチン分子のファージを、酸性溶液での溶出により遊離させた。選択サイクルにおいて、過剰量の標的を用いた競合的溶出により、３回目および４回目のファージ溶出を行った。溶出したファージを再増幅した。バインダーの特異性を誘導するため、選択に際し、標的に類似するタンパク質を含めてもよい。
【０２１３】
ＴＡＴファージディスプレイ選択の代替：リボソームディスプレイ選択
ユビキチンライブラリーを、例えば、選択システムとしてリボソームディスプレイを使用して、標的に対して濃縮した（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００７、Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。当該技術分野において公知である他の選択方法を用いることもできる。前記標的を、標準的な方法によってビオチン化し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に固定化した。リボソーム、ｍＲＮＡ、および新生ユビキチンポリペプチドを含む三元複合体を、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓ（商標） Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ社製）を用いて構築した。選択の一次ラウンドを２回行い、三元複合体をインキュベートし、続いて、同様の選択ラウンドを２回行った。標的インキュベーションに続く各サイクルにおいて、ビーズを磁力により溶液から分離し、ストリンジェンシーを増加させながら、リボソームディスプレイバッファーで洗浄した。最初の２回の選択サイクルでの洗浄後、前記ビーズを再度磁力により溶液から分離し、５０ｍＭ ＥＤＴＡの添加により、標的が結合した修飾ユビキチン分子のｍＲＮＡをリボソームから遊離させた。選択サイクルにおいて、過剰量の標的を用いた競合的溶出により、３回目および４回目のｍＲＮＡの溶出を行った（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， ２００４）。各サイクルの後、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、ドイツ）、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、アメリカ）、およびＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製、ドイツ）を用いて、ＲＮＡの精製とｃＤＮＡの合成を行った。
【０２１４】
濃縮プールのクローニング
４回目の選択サイクルの後、合成ｃＤＮＡを、Ｆ１プライマー（ＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧ）（配列番号９）およびＷＵＢＩ（ｃｏ）ＲＤ＿ｘｈｏプライマー（ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＣＣＡＧ）（配列番号１０）を用いたＰＣＲにより増幅し、制限ヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、アメリカ）で切断し、適合性付着末端を介して発現ベクターｐＥＴ−２０ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）に連結した。
【０２１５】
単一コロニーのヒット解析
ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）への形質転換の後、アンピシリン耐性単一コロニーを、２００μｌ ＳＯＢＡＧ培地（１００μｇ／ｍｌ アンピシリンおよび２０ｇ／ｌ グルコースを含むＳＯＢ培地）において、３７℃で６時間培養した。５００μｌの自己誘導培地ＺＹＭ−５０５２（Ｓｔｕｄｉｅｒ社製、２００５）を用い、９６ディープウェルプレート（Ｇｅｎｅｔｉｘ社製、イギリス）において、３７℃で１６時間培養することにより、ＥＤ−Ｂ結合修飾ユビキチンを発現させた。４℃、３６００×ｇで、１５分間遠心分離して、細胞を回収した。その後、ウェルあたり３００μｌの溶解バッファーを用いて、３７℃で３０分間インキュベートし、前記細胞を溶解した。前記溶解バッファーは、０．２×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）、０．３ｍｇ／ｍｌリゾチーム（ＶＷＲ社製、ドイツ）、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｒｏｔｈ社製、ドイツ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２および０．２Ｕ／ｍｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（ＶＷＲ社製、ドイツ）を含む、５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）とした。４℃、３６００×ｇで、３０分間遠心分離した後、得られた上清を、４μｇ／ｍｌ ＥＤ−Ｂ、およびセイヨウワサビぺルオキシダーゼ（ＰＯＤ）とのユビキチン特異的ＦａｂフラグメントコンジュゲートでコートしたＮｕｎｃ ＭｅｄｉＳｏｒｐ ｐｌａｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、アメリカ）を用いて、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。検出試薬として、ＴＭＢ−Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ社製、ドイツ）を用いた。ウェルあたり５０μｌの０．２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４溶液を用いて黄色を発色させ、プレートリーダーにおいて４５０ｎｍと６２０ｎｍを測定した。
【０２１６】
数サイクルの選択ディスプレイを、ＥＤ−Ｂに対して行った。最後の２サイクルの選択において、結合分子を、過剰量の遊離ＥＤ−Ｂを用いて溶出した。これらのＥＤ−Ｂ結合変異体を、他のものとの間で同定した。
【化２】

【０２１７】
野生型ユビキチン単量体（Ｕｂｉ ｍｏｎｏｍｅｒ ｗｔ）と、野生型ユビキチン二量体（ｕｂｉ ｄｉｍｅｒ ｗｔ）、野生型ユビキチンタンパク質（図９におけるＵｂ２−ＴｓＸ、各単量体の４５位における置換およびＣ末端における２つの置換を有する）、および修飾ユビキチンヘテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１との配列アライメントを、図９に示す。Ｕｂ２−ＴｓＸにおいて、前記単量体のＣ末端の置換（ＧＧからＡＡ）は、血清における安定性を増加させる。これは、デユビキチナーゼは、ユビキチンのＧＧの後ろを切断し、ＡＡの後ろを切断しないためである。野生型ユビキチンの二次構造は、前記Ｃ末端における置換を有するユビキチンと比較して、ほぼ同一である。
【０２１８】
１０４１−Ｄ１１（図９、配列番号３６）または１０４５−Ｄ１０と呼ばれる、優れたＥＤ−Ｂ結合活性を有する修飾ユビキチンは、野生型と比較して、後述のアミノ酸置換によって同定される。
第１モジュール
Ｋ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５Ｆ、Ｔ６６Ｐ
第２モジュール
Ｋ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５Ｗ、Ｔ６６Ｅ
任意に、Ｑ２Ｒ（当該置換は、変異体１０４１−Ｄ１１に存在し、変異体１０４５−Ｄ１０には存在しない）
融合タンパク質に適した好ましいリンカーは、配列番号３２のリンカーまたはＧＩＧ配列である。ただし、代わりに使用できる、多くのリンカーが考えられる。
【０２１９】
さらに好ましい例として、下記の配列のタンパク質（配列番号４７）が提示され、前記配列において、Ｘはどのようなアミノ酸でもよい。リンカーとして、ここでは、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧが使用される（イタリック体で示す）。ただし、他の種類のリンカー、またはリンカーなしも、代替可能である。
【化３】

これらの配列を有するタンパク質の例を、図１９に示す。
【０２２０】
［実施例２］
ＥＤ−Ｂ結合修飾ユビキチン変異体とＴＮＦα（例えば、ヒトＴＮＦα、ＴＮＦαという）からの融合タンパク質の生成
【０２２１】
前記変異体は、修飾ユビキチン、例えば、ヘテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１と、哺乳類のＴＮＦα、例えば、マウスまたはヒトのＴＮＦαとの間の融合タンパク質として、大腸菌内で発現させることができる。融合タンパク質のタンパク質解析には、タンパク質発現と純度、非凝集能、細胞培養におけるＴＮＦα活性、標的タンパク質ＥＤ−Ｂへの親和性、選択性、細胞培養における特異的結合が含まれる。Ｆ９腫瘍を有するマウスにおける腫瘍の縮小を誘導するための動物実験における必須条件は、マウスＴＮＦαとの融合物である。
【０２２２】
工程１：融合タンパク質のクローニングのためのベクターの生成（ｐＥＴＳＵＭＯ−ＴＮＦα）
ｐＥＴＳＵＭＯａｄａｐｔは、修飾ベクターｐＥＴＳＵＭＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）であり、付加マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の挿入によって修飾されている。ｐＥＴＳＵＭＯａｄａｐｔへのＴＮＦαのクローン化から開始し、ＥＤ−Ｂに結合する修飾ユビキチン変異体を挿入するための制限部位を導入した。得られた構築物は、下記ＤＮＡ配列（配列番号１１）の構造体Ｈｉｓ_６−ＳＵＭＯ−ＴＮＦαの構造を有する。
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCTAGCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTGTGCGTAGCAGCAGCCGTACCCCGAGCGATAAACCGGTGGCGCATGTGGTGGCGAATCCGCAGGCGGAAGGCCAGCTGCAGTGGCTGAACCGTCGTGCGAATGCGCTGCTGGCCAACGGCGTGGAACTGCGTGATAATCAGCTGGTTGTGCCGAGCGAAGGCCTGTATCTGATTTATAGCCAGGTGCTGTTTAAAGGCCAGGGCTGCCCGAGCACCCATGTGCTGCTGACCCATACCATTAGCCGTATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAACCTGCTGTCTGCGATTAAAAGCCCGTGCCAGCGTGAAACCCCGGAAGGCGCGGAAGCGAAACCGTGGTATGAACCGATTTATCTGGGCGGCGTGTTTCAGCTGGAAAAAGGCGATCGTCTGAGCGCGGAAATTAACCGTCCGGATTATCTGGATTTTGCGGAAAGCGGCCAGGTGTATTTTGGCATTATTGCGCTGTAATAA
【０２２３】
ＴＮＦα配列を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位の導入により、ＰＣＲで増幅した。
使用したプライマーは、以下の通りである。
【化４】

前記ｆｗプライマー（配列番号１２）は、ＴＮＦαの最初の１５塩基対（下線部）を認識し、ＢａｍＨＩ配列（太字部）を有する。前記ｒｅｖプライマー（配列番号１３）は、ＴＮＦαの最後の塩基対、終止コドン（下線部）、およびＸｈｏＩ制限部位（太字部）を含む。
【０２２４】
＜ＰＣＲ反応ミックス（１００μｌ）＞
８４．５μｌ Ｈ_２Ｏ；
１０μｌ １０×Ｐｗｏバッファー＋Ｍｇ；
２μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（＝２００μＭ）；
各０．５μｌ １００μＭ プライマーｆｗ／ｒｅｖ（＝各０．５μＭ）；
２μｌ ＤＮＡ（＝０．２５μｇ）；
０．５μｌ Ｐｗｏポリメラーゼ（＝２．５Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）
【０２２５】
＜ＰＣＲプログラム＞
９４℃で３分、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分（工程２〜４：３０サイクル）、７２℃で５分、続いて４℃で処理し、続いて、Ｑｉａｇｅｎ−ＭｉｎＥｌｕｔｅ−Ｋｉｔ（１０μｌ ＥＢに溶出）によるＰＣＲ産物の精製を行った。前記ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ制限およびライゲーションにより、ベクターｐＥＴＳＵＭＯａｄａｐｔのＭＣＳに導入した。
【０２２６】
＜制限ミックス（１００μｌ）＞
ベクター：８３μｌ Ｈ_２Ｏ；
１０μｌ １０×ＮＥバッファー３；
１μｌ １００×ＢＳＡ；
３μｌ ＢａｍＨＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ），
１．５μｌ ＸｈｏＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ）；
１．６５μｌ ベクター；
３ｈ、３７℃でインキュベーション
ＰＣＲ産物：７６．５μｌ Ｈ_２Ｏ；
１０μｌ １０×ＮＥバッファー３；
１μｌ １００×ＢＳＡ；
３μｌ ＢａｍＨＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ），
１．５μｌ ＸｈｏＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ）；
８μｌ 挿入断片；
３ｈ、３７℃でインキュベーション
１％アガロースゲル（１００Ｖ、６０分間ラン）において制限ミックスを分離；
ベクター断片（５６５９ｂｐ）と挿入断片（４９１ｂｐ）の切断；
Ｑｉａｇｅｎ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いた精製（３０μｌ ＥＢに溶出）。
【０２２７】
＜ライゲーション（２０μｌ）＞
１５．２μｌ Ｈ_２Ｏ；
２μｌ １０×Ｔ４−ＤＮＡリガーゼバッファー；
２．２６μｌ ベクター（２００ｎｇ）；
０．５４μｌ 挿入断片（４０ｎｇ）
５分間、６５℃でインキュベーション；
１６℃に冷却；
１μｌ Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（＝３Ｕ；ＮＥＢ）添加；
１６時間、１６℃でインキュベーション
【０２２８】
＜ＮａＡｃ／イソプロパノール沈殿＞
ライゲーションミクスチャー（２０μｌ）＋２．２μｌ ３Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ５．０）＋２２．２μｌ イソプロパノール；
３０分間、−２０℃；
１５分間、４℃、１３０００Ｕｐｍ；
５００μｌの７０％ ＥｔＯＨにペレットを再懸濁；
スピン；
１０μｌのＨ_２Ｏにペレットを再懸濁
【０２２９】
＜形質転換＞
エレクトロコンピテントＮｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）細胞（４０μｌアリコート）と１０μｌのライゲーション産物とを混合；
０．１ｃｍ エレクトロポレーションキュベットに移動；
エレクトロポレーターでパルスを印加（１．８ｋＶ、５０μＦ、１００ Ｏｈｍ）；
３７℃、２２０Ｕｐｍ、４５分間、１ｍｌのＳＯＣ培地と、溶液とをインキュベート；
カナマイシン含有ＬＢプレートに、１００μｌを播き、３７℃、一晩インキュベーション
【０２３０】
工程２：修飾ユビキチンベースのＥＤＢ融合タンパク質のクローニング
ＥＤＢ結合修飾ユビキチンベースの変異体とＴＮＦαとの融合物の生成のために、ＰＣＲにより、対象であるＥＤＢ修飾ユビキチンベースの配列をｐＥＴ２０ｂベクターから増幅し、ＢｓａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入する。この方法は、単量体および二量体ＥＤＢ修飾ユビキチンベースの変異体に好適である。単量体ＷＴユビキチン（Ｗｕｂｉ）用のプライマーは、下記の通りである。
【化５】

【０２３１】
前記ｆｗプライマー（配列番号１４）は、修飾ユビキチンの最初の１５塩基対（下線部）を認識し、ＢｓａＩ配列（太字部）を有する。前記ｒｅｖプライマー（配列番号１５）は、修飾ユビキチンの最後の１５塩基対を認識し、アミノ酸リンカー（ＳＧＧＧＧ配列）およびＢａｍＨＩ制限部位（太字部分）を挿入する。修飾ユビキチンベースの変異体それぞれについて、特異的ｆｗプライマーを使用する。単量体ＥＤＢ修飾ユビキチンベースの変異体１Ｈ４、５Ｅ１および４Ｂ１０のプライマーは、下記の通りである。
【化６】

【０２３２】
前記ｒｅｖプライマーは、全ての単量体修飾ユビキチンベースの変異体に使用する。二量体修飾ユビキチンベースの変異体用のｒｅｖプライマーは、下記の通りである。
【化７】

【０２３３】
二量体ＷＴユビキチン（ＷｕｂｉＨｕｂｉ）のクローニング用および二量体ＥＤＢ修飾ユビキチンベースの変異体用のｆｗプライマーは、下記の通りである。
【化８】

【０２３４】
＜ＰＣＲミックス（１００μｌ）＞
８４．５μｌ Ｈ_２Ｏ；
１０μｌ １０×Ｐｗｏバッファー＋Ｍｇ；
２μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（＝２００μＭ）；
各０．５μｌ １００μＭ プライマーｆｗ／ｒｅｖ（＝０．５μＭ）；
２μｌ ＤＮＡ（変異体により決定）；
０．５μｌ Ｐｗｏポリメラーゼ（＝２．５Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）
【０２３５】
＜ＰＣＲプログラム＞
１．９４℃で３分
２．９４℃で３０秒
３．６０℃で３０秒
４．７２℃で２分（工程２〜４：３０サイクル）
５．７２℃で５分、続いて４℃
【０２３６】
アガロースゲルでＰＣＲ産物を精製し、必要なバンドを切り出し、Ｑｉａｇｅｎ−ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔで精製する。ＢｓａＩ−ＢａｍＨＩ制限により、前記ＰＣＲ産物をクローニングする（ｐＥＴＳＵＭＯ−ＴＮＦα内に）。
【０２３７】
＜制限ミックス（１００μｌ）＞
７５μｌ Ｈ_２Ｏ；
１０μｌ １０×ＮＥバッファー３；
１μｌ １００×ＢＳＡ；
３μｌ ＢｓａＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ）；
８μｌ ＤＮＡ（ベクターまたはＰＣＲ産物）２時間、５０℃でインキュベーション、
１０分間、６５℃、
３μｌ ＢａｍＨＩの添加（＝３０Ｕ；ＮＥＢ）、
２時間、３７℃
１％アガロースゲルにおいて制限ミックスを分離；
ベクター断片および挿入断片の切断；
Ｑｉａｇｅｎ−ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いた精製（３０μｌ ＥＢに溶出）。
【０２３８】
＜ライゲーション（２０μｌ）＞
１２．５μｌ Ｈ_２Ｏ；
２μｌ １０×Ｔ４−ＤＮＡリガーゼバッファー；
５μｌ ベクター（６６ｎｇ）；
０．５μｌ 挿入断片（変異体の種類により変わる）
５分間、６５℃でインキュベーション；
１６℃に冷却；
１μｌ Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（＝３Ｕ；ＮＥＢ）添加；
１６時間、１６℃でインキュベーション
【０２３９】
＜ＮａＡｃ／イソプロパノール沈殿＞（工程１参照）
【０２４０】
＜形質転換＞
エレクトロコンピテントＮｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）細胞の形質転換は、前述の通りである。結果として、下記の融合構築物が得られた。すなわち、Ｈｉｓ_６−ＳＵＭＯ−修飾ユビキチン−ＳＧＧＧＧ−ＴＮＦαを有するｐＥＴＳＵＭＯａｄａｐｔにおけるＥＤＢ修飾ユビキチンとＴＮＦαとの融合構築物である（単量体修飾ユビキチンの場合、３５９個のアミノ酸からなり、二量体修飾ユビキチンの場合、４４７個のアミノ酸からなる）。
【０２４１】
［実施例３］
ユビキチンベースのＴＮＦα融合タンパク質の発現と精製
【０２４２】
ＤＮＡ配列解析により、ＳＵＭＯ−ＴＮＦα融合タンパク質の正確な配列が示された。変異体の発現のために、前培養物をＬＢ／カナマイシンで１：１００に希釈し、前記培養液を、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）０．５まで、２００ｒｐｍ、３７℃で攪拌することで、クローンを振とうフラスコで培養した。発現は、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）の添加で誘導した。３０℃、４時間、２００ｒｐｍで、培養を続けた。４℃、６０００×ｇで２０分間遠心分離し、細菌細胞を回収した。前記細胞ぺレットを、ベンゾナーゼおよびリゾチームを含むＮＰＩ２０バッファー３０ｍｌに懸濁した。細胞を、氷上で超音波処理（３×２０秒）によって破砕した。懸濁液を４℃、４００００×ｇで３０分間遠心分離した後、可溶性タンパク質を含む上清を得た。両タンパク質を、室温での親和性クロマトグラフィーにより、精製した。Ｎｉ−アガロース（５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）の一本のカラムを、５０ｍｌのＮＰＩ−２０で平衡化した。可溶性タンパク質を含む前記上清を、前記カラムにアプライし、続いて、ＮＰＩ−２０で洗浄した。前記結合したタンパク質を、ＮＰＩ−２０から５０％ＮＰＩ−５００（１００ｍｌ）の直線勾配で溶出した。各画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、その純度を解析した。好適な画分をプールし、ＳＵＭＯヒドロラーゼ切断バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、１．６×６０ｃｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に、流速１ｍｌ／分で、アプライした。
【０２４３】
切断反応は、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の使用説明書にしたがって行った。切断後、前記タンパク質をＮｉ−アガロースカラム（５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にアプライした。Ｈｉｓタグ化ＳＵＭＯヒドロラーゼおよびＨｉｓタグ化ＳＵＭＯは、前記カラムに結合し、正しい融合タンパク質（Ｈｉｓタグフリー）は、前記カラムを通過した。前記タンパク質の純度は、ｒｐＨＰＬＣ解析およびゲル電気泳動によって、証明された。前記三量体（ＴＮＦαを介する）が正しい分子量を有することは、分析用ＳＥＣ解析（１０／３０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて確認した。
【０２４４】
［実施例４］
修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体のヒトＥＤ−Ｂに対する結合分析
【０２４５】
実施例４Ａ：濃度依存ＥＬＩＳＡによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
ユビキチンベースの変異体のヒトＥＤ−Ｂに対する結合を、濃度依存ＥＬＩＳＡによって分析した。精製タンパク質を、ヒトＥＤ−Ｂ、ＢＳＡおよび細胞フィブロネクチン（ｃＦＮ）でコーティングされた複数のＮＵＮＣ−ｍｅｄｉｓｏｒｐプレートに、量を増加させながらアプライした。ウェルあたり抗原５０μｌ（１０μｇ／ｍｌ）でのコーティングを、４℃で一晩行った。前記プレートを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４；ＰＢＳＴ）で洗浄した後、前記ウェルを、３７℃で２時間、ブロッキング溶液（ＰＢＳ ｐＨ７．４；３％ ＢＳＡ；０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてブロッキングした。前記ウェルを、ＰＢＳＴでさらに３回洗浄した。
【０２４６】
前記ウェルにおいて、異なる濃度の修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合タンパク質（５０μｌ量）を、室温で１時間インキュベートした（図１０、開始濃度として、５００ｎＭの１０４１−Ｄ１１タンパク質を使用した）。ＰＢＳＴで前記ウェルを洗浄した後、抗ユビキチンｆａｂフラグメント（ＡｂｙＤ）ＰＯＤコンジュゲートを、ＰＢＳＴに適切に希釈（例えば、１：２０００または１：６５００）して、アプライした。前記プレートを、ウェルあたり３００μｌのバッファーＰＢＳＴで、３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ基質溶液（ＫＥＭ−ＥＮ−Ｔｅｃ）を各ウェルに加え、１５分間インキュベートした。ウェルあたり５０μｌの０．２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加えて、反応を停止させ、前記ＥＬＩＳＡプレートを、ＴＥＣＡＮ Ｓｕｎｒｉｓｅ ＥＬＩＳＡ−Ｒｅａｄｅｒを用いて読み取った。参照波長を６２０ｎｍとして、４５０ｎｍで光度計による吸光光度測定を行った。図１は、みかけＫＤ値１１ｎＭという、ＥＤ−Ｂに対する１Ｈ４の特異的結合を明瞭に示している。変異体５Ｅ１は、みかけＫＤ値７．７μＭ、４Ｂ１０は、みかけＫＤ値２８０ｎＭを、それぞれ示している。図１０は、変異体１０４１−Ｄ１１のＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性を示す（ＫＤ＝６．９ｎＭ）。このように、ユビキチン野生型のわずかな修飾（各単量体において８個の置換まで）により、ＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性がもたらされる。
【０２４７】
実施例４Ｂ：競合的濃度依存ＥＬＩＳＡによる、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
競合的濃度依存ＥＬＩＳＡにより、量が増加する遊離標的の存在下、フィブロネクチン断片（６７Ｂ８９）を含む固定化ＥＤ−Ｂに対するユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を分析した。ＥＬＩＳＡの条件は、１０４１−Ｄ１１タンパク質を、ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）（０μＭ〜１０μＭ）、またはネガティブコントロール６７８９（０μＭ〜１０μＭ）で、１時間プレインキュベートし、その後、その混合物を、Ｍｅｄｉｓｏｒｐ−ｐｌａｔｅ上に配置した標的６７Ｂ８９に添加した以外は、実施例５Ａで述べた通りである。これに続き、前記変異体を、対応する抗体によって検出した（抗ユビキチン−Ｆａｂ−ＰＯＤ；希釈度１：６５００）。図１１は、変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂに対して非常に高い結合親和性を有することを示す（ＩＣ５０＝１４０ｎＭ）。図１０に示した結果が裏付けられている。すなわち、ユビキチン野生型のわずかな修飾（各単量体において８個の置換まで）のみにより、ＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性がもたらされる。
【０２４８】
実施例４Ｃ：結合活性の血清安定性を同時に分析する濃度依存ＥＬＩＳＡによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
当該技術分野において周知の方法により、前述（実施例５Ａおよび５Ｂ）と同様に、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＤ−Ｂ（ここでは、６７Ｂ８９という）を、マイクロタイタープレートにコーティングし、前記変異体を、ＥＤ−Ｂに結合させ、特異的ユビキチン抗体により検出する（抗ユビキチン−Ｆａｂ−ＰＯＤ）。この分析において、前記変異体は、異なる方法で処理される。すなわち、前記変異体を、３７℃で１時間、マウス血清中でインキュベートする処理（図１３参照、青丸部分）、前記変異体を、３７℃で１時間、ラット血清中でインキュベートする処理（図１３、赤丸部分）、または、前記変異体を、３７℃で１時間、ＰＢＳでインキュベートする処理（図１３、黒丸部分）である。図１３は、変異体１０４１−Ｄ１１の全てのＫＤが、１０．３ｎＭ（ＰＢＳ）から２０．７４ｎＭ（マウス血清）の間にあることを示す。
【０２４９】
実施例４Ｄ：Ｂｉａｃｏｒｅ分析による修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
当業者に公知の方法を用いて、ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化したＥＤ−Ｂ含有フィブロネクチン断片（６７Ｂ８９という）に対する結合について、前記変異体を異なる濃度で分析した（例えば、０〜２００ｎＭの変異体、好ましくは１０４１−Ｄ１１）。得られたデータは、ＢＩＡ評価ソフトウェアおよび１：１−Ｌａｎｇｍｕｉｒ−ｆｉｔｔｉｎｇにより処理した。図１２に示すように、変異体１０４１−Ｄ１１のＫ_Ｄは、１．０ｎＭであった。結合速度定数は、ｋ_ｏｎ＝７．６×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、ｋ_ｏｆｆ＝７．７×１０^−４ｓ^−１であった。図１７Ｄに示すように、融合タンパク質１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαのＫＤは、１．１３ｎＭであった。結合速度定数は、ｋ_ｏｎ＝４．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、ｋ_ｏｆｆ＝５．０×１０^−４ｓ^−１であった。
【０２５０】
実施例４Ｅ：ＳＥ−ＨＰＬＣによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の複合体構造の分析
複合体構造の分析のために、Ｔｒｉｃｏｒｎ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ５／１５０ ＧＬカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）（Ｖ＝３ｍｌ）を使用し、５０μｌのタンパク質をアプライした。さらなる条件は、バッファー：１×ＰＢＳ（ｐＨ７．３）、流速：０．３ｍｌ／分、ラン：４５分（サンプルの注入：１５分後）とした。条件：０．７２ｎｍｏｌ １０４１−Ｄ１１タンパク質＋０．７２ｎｍｏｌ ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９またはネガティブコントロール６７８９ともいう）を、室温で１時間インキュベートし、複合体構造を分析するために、カラムにアプライした。図１４では、前記変異体のみを黒で示し、標的ＥＤ−Ｂのみを青で示し、ＥＤ−Ｂとの複合体を構成する変異体結合をピンクで示す。図１４Ａは、前記変異体を有するＥＤ−Ｂを示す。図１４Ｂは、ＥＤ−Ｂを有さない変異体を示す。同図は、変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）と複合体を構築するが、６７８９とは複合体を構築しないことを示す。
【０２５１】
［実施例５］
ＴＮＦαの生物学的分析
ＴＮＦα修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合融合体の生理学的ＴＮＦα活性を、Ｌ９２９アポトーシス分析によって決定した（Ｆｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、１９８４ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ６８：１６７−１７５）。この分析では、ＴＮＦαが、ピコモル範囲のＥＣ_５０値で、アクチノマイシンＤ感受性細胞の細胞死を効率的に促進する。
【０２５２】
細胞を、ＦＢＳと抗生物質を含む培地に再懸濁した。密度３．５×１０^５細胞／ｍｌの細胞懸濁液１００μｌを、９６ウェル標準細胞培養プレートのウェルに播き、加湿したＣＯ_２インキュベーターで一晩インキュベートした。その後、前記培養培地を除去し、ＦＢＳ、アクチノマイシンＤおよび抗生物質を含む培地５０μｌを各ウェルに加え、その後、さらに３０分間インキュベートした。その後、各テスト項目５０μｌと、１０^−７から１０^−１８Ｍの適切な濃度範囲のＴＮＦα修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合融合体またはヒト組換えＴＮＦαコントロールを添加した。さらに４８時間インキュベートした後、細胞生存の尺度である代謝活性を、ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて決定した。
【０２５３】
１つのテスト項目あたり、少なくとも３通りの独立した実験を行い、各実験は３回行った。ＴＮＦα修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合融合タンパク質の各テストは、分析間のばらつきについての情報を得るために、ヒト組換えＴＮＦαの投与量範囲のテストと並行して行った。
【０２５４】
定量評価は、ＥＣ_５０値、すなわち、半数の細胞の生存を促進するテスト項目濃度による値に基づく。
【表２】

ｍｕｂ：修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合
【０２５５】
修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合融合体の、１つのユビキチン単量体構築物（Ｗｕｂｉ）および３つのユビキチン二量体構築物のＴＮＦαを分析した。ＴＮＦα部分に結合した修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体に依存して、ＴＮＦαに関連する活性は、約１桁分増加（ＳＰＷＦ−２８＿２４−Ｈ１２＿ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）または減少した（ＳＰＷＦ−２８＿２２−Ｄ１＿ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、Ｗｕｂｉ−Ｈｕｂｉ−ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）。変異体１０４１−Ｄ１１ ＴＮＦα分析は、図１７参照。
【０２５６】
［実施例６］
細胞培養分析におけるユビキチン変異体の結合分析
培養細胞に対する変異体１０４１−Ｄ１１等の結合をテストした。ＥＤ−Ｂが高発現レベルである正常ヒト胎児肺線維芽細胞（Ｗｉ３８細胞）、マウス胚性線維芽細胞株（Ｂａｌｂ ３Ｔ３）、マウス骨髄（ＳＴ−２）単球／マクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）由来のストローマ細胞株、ＮＨＤＦ細胞、およびマウス線維芽細胞（ＬＭ）を含む、異なる培養細胞を分析した。
【０２５７】
変異体１０４１−Ｄ１１（異なる濃度）またはＥＤ−Ｂ特異的抗体（５００ｎＭ ＦＶ２８ ＣＨ４／Ｆ１ １×ＰＢＳ）を、Ｗｉ３８細胞（６００００細胞／ｍｌ、ＡＴＣＣ由来）と共にインキュベートし（１時間、３７℃）、その後、メタノールで固定し（５分、−２０℃）、ブロッキングした（５％ウマ／ＰＢＳ、１時間）。その後、ｒａｂｂｉｔ−ａ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ−ＩｇＧ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製 Ａ００８７５、１：５００）と共に１時間インキュベートし、ａ−ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ^＊Ａｌｅｘａ４８８−ＡＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 Ａ１１００８、１：１０００）と共に１時間インキュベートした。核を、ＤＡＰＩで染色した。図１５Ａの１列目は、ＥＤＢ抗体を用いたコントロールを示し、２列目は、５８．７ｎＭのタンパク質濃度での変異体のインキュベーションを示し、３列目は、１０倍高濃度（５８７ｎＭ）の１０４１−Ｄ１１タンパク質のインキュベーションを示し、４列目は、ＰＢＳでのネガティブコントロールである。１行目には、ヒトＷｉ３８線維芽細胞を位相差で示し、２行目には、免疫蛍光法で示し、３行目には、ＤＡＰＩ染色を示す。これらの写真から、変異体１０４１−Ｄ１１は、ＥＤ−Ｂ含有細胞外マトリックスに対する高特異性で、固定Ｗｉ３８細胞に結合すると結論づけられる。ネガティブコントロール細胞型ＮＨＤＦは、ＥＤＢフィブロネクチンを低レベルで発現する初代の正常線維芽細胞である（データ示さず）。前記変異体は、これら細胞に結合しない。
【０２５８】
図１５Ｂは、バイタル（ｖｉｔａｌ）Ｗｉ３８細胞での変異体１０４１−Ｄ１１の分析を示す。ネガティブコントロール細胞型ＮＨＤＦは、ＥＤＢフィブロネクチンを低レベルで発現する初代の正常線維芽細胞である。前記細胞を、チャンバースライドに播いた（ＮＵＮＣ、６００００細胞／ｍｌ）。結合能の分析のため、前記細胞を、−２０℃で５分間、１００％ＭｅＯＨで固定した。非特異的結合をブロックするために、前記細胞を、３７℃で１時間、５％ウマ血清でインキュベートした。前記細胞を、異なる濃度の変異体１０４１−Ｄ１１と、ポジティブコントロールであるＥＤ−Ｂ特異的抗体ＦＶ２８ ＣＨ４／Ｆ１またはネガティブコントロールであるＵＢ＿２とで、室温で１時間、テストした。ｒａｂｂｉｔ−ａ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ−ＩｇＧ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製 Ａ００８７５、１：５００）との１時間のインキュベーション、ａ−ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ^＊ Ａｌｅｘａ４８８−ＡＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 Ａ１１００８、１：１０００）との１時間のインキュベーションにより、検証を行った。核を、ＤＡＰＩで染色した。図１５Ｂの１行目および３行目は、異なるタンパク質濃度の変異体およびネガティブコントロールを示す。２行目および４行目は、ＥＤＢ抗体を用いたコントロールのインキュベーションを示す。最初の２行は、Ｗｉ３８細胞株における前記変異体とポジティブコントロールを示す。３行目および４行目は、ＮＨＤＦ細胞のインキュベーションを示す。写真からわかるように、変異体１０４１−Ｄ１１は、ＥＤ−Ｂ含有細胞外マトリックスに対する高い特異性で、バイタル（ｖｉｔａｌ）Ｗｉ３８細胞に結合することがわかる。低ＥＤＢを含まないＮＨＤＦ細胞を用いた対照試験を行った（データ示さず）。前記変異体は、それらの細胞に結合しない。
【０２５９】
異なる細胞タイプ、例えば、Ｂａｌｂ３Ｔ３（ＡＴＣＣ、Ｋａｔ−Ｎｒ．３０−２００２）、Ｒａｗ（Ｌｏｎｚａ社製、Ｋａｔ−Ｎｒ．ＢＥ１２−１１５Ｆ／Ｕ１）、ＳＴ−２（Ｌｏｎｚａ社製、Ｋａｔ−Ｎｒ．ＢＥ１２−１１５Ｆ／Ｕ１）を用いて、同様の実験を行った。図１５ＣおよびＤは、ＥＤ−Ｂの結合が、マウスＢａｌｂ３Ｔ３とＳＴ−２細胞に高い特異性であることを示す。単球／マクロファージ（Ｒａｗ）への結合は、見られなかった（データ示さず）。
【０２６０】
概要を前述したとおり、図１６Ａは、組織切片における１０４１−Ｄ１１の特異性を示す。７つの検体から採取したＦ９腫瘍組織を評価した。５００ｎＭ １０４１−Ｄ１１を用いた免疫組織化学から、マウス由来のＦ９腫瘍におけるＥＤ−Ｂ特異的血管が染色される結果が得られた。ＥＤ−Ｂは、腫瘍脈管系に対する高い特異性のマーカーである。標的タンパク質ＥＤＢは、血管の反管腔側に局在する。１０４１−Ｄ１１は、Ｆ９腫瘍由来の組織切片において、血管系を特異的に装飾する。得られた結果は、抗体フラグメントＬ１９の組織特異性に匹敵する。さらに、４８組織をテストした。ＦＤＡ関連パネルにおける４８組織のいずれにおいても、非特異的な染色は観察されなかった。図１６Ｂは、野生型ユビキチンと比較した、腫瘍細胞における１０４１−Ｄ１１の蓄積を示す。このように、ＥＤ−Ｂに特異的に結合する修飾ユビキチンベースの融合タンパク質は、ＥＤ−Ｂに基づく癌の標的治療に好適である。
【０２６１】
［実施例７］
１０４１Ｄ１１−ＴＮＦαのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性
１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαの治療上の有効性を確立するために、当該化合物をマウスモデルにおけるＦ９テラトーマ（Ｂｏｒｓｉ ｅｔ ａｌ．、２００３ Ｂｌｏｏｄ １０２， ４３８４−４３９２参照）に関してテストした。マウスにおけるＥＤ−Ｂ発現は、ｉｎ ｖｉｖｏの状態でヒトと同等であり、１０４１−Ｄ１１−ｍＴＮＦα、好ましくはこれをメルファラン等の細胞傷害性化合物と併用した場合の癌に対する治療効果を評価する上で好適である。Ｆ９テラトーマは、高い血管密度を有する高悪性度の腫瘍である。Ｂｏｒｓｉらには、ＥＤＢ抗体を介したマウスＴＮＦαのターゲティングは、メルファランの有効性を向上させるものであり、このことは、腫瘍の成長の遅延によって実証されていると記載されている。有効性の検証のための実験計画は、Ｂｏｒｓｉ、２００３から採用した。
【０２６２】
ステージ１では、腫瘍対体重比率、体重減少、および生存率に関するエンドポイントにより、薬理的に活性かつ許容可能な投与量を規定した。本発明者らは、１０４１Ｄ１１−ＴＮＦαが、最も高い投与量（６．７５ｐｍｏｌ／ｇ）で許容されるが、腫瘍の成長に対して抑制効果を有さず（３、４、および８日後に体重の１０％を上回る→動物死亡）、一方、最も低投与量（０．２５ｐｍｏｌ／ｇ）の１０４１Ｄ１１−ＴＮＦαが、腫瘍の成長を遅らせるようであることを見出した。使用したさらに別の投薬グループでは、投与量２．２５ｐｍｏｌ／ｇ １０４１Ｄ１１−ＴＮＦαから、低下させた。
【０２６３】
研究のステージ２では、腫瘍成長の遅延をエンドポイントとするメルファランの投与量依存的な有効性を明らかにした（動物の体重減少＞１０％、腫瘍＞体重の１０％、腫瘍の潰瘍化）。この研究においては、メルファランと併用した１０４１Ｄ１１／ｍＴＮＦα（マウスＴＮＦα）についてテストを行った。１６８匹の動物を使用し、１４投薬グループ（各グループとも、Ｆ９腫瘍の大きさが３００〜４００ｍｍ^３の時点で採用した８匹のマウスからなる）について、テストサンプルを静脈（ｉ．ｖ．）に投与し、２４時間後にメルファランを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。表１は、投薬スケジュールを示す。
【表３】

【０２６４】
図１８は、処置期間中（７日間）の相対的腫瘍成長を示す。図１８ａは、メルファランと併用した本発明の化合物１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαが、メルファランと併用したｍＴＮＦαまたはメルファラン単独よりも効率的に、相対的腫瘍成長を減少させることを明確に示している。処置後７日間の腫瘍成長動態は、１０４１−Ｄ１１−ｍＴＮＦαによる腫瘍の有意な減少を示す。これは、メルファランとの併用の有効性の明らかな証拠である。
【０２６５】
刊行物
１． Birchler, M., F. Viti, L. Zardi, B. Spiess, and D. Neri. 1999. Selective targeting and photocoagulation of ocular angiogenesis mediated by a phage-derived human antibody fragment. Nat Biotechnol 17:984-8.
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列に対して６０％以上のアミノ酸配列同一性を有する修飾ユビキチンタンパク質を少なくとも１つ含む、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに結合可能なタンパク質であり、
前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対し、Ｋｄ＝１０^−５〜１０^−１２Ｍの特異的結合親和性で検出可能な結合を示す修飾ユビキチンタンパク質を得るため、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位における、少なくとも３個のアミノ酸が、置換、欠失、または付加によって修飾されたタンパク質。
【請求項２】
前記修飾により、前記タンパク質の表面に位置するアミノ酸の連続的なストレッチが形成され、
前記置換されたアミノ酸の少なくとも４個が、βシート内またはβシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸位置に存在する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記修飾が、前記ユビキチンの２〜７位、１２〜１６位、４１〜４５位、および６５〜７１位の範囲にあるβシート鎖内、ならびに／または６２〜６４位もしくは８〜１１位の範囲にあるβシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸位置に存在し、
前記タンパク質が、修飾後、配列番号１で示す対応配列に対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、
好ましくは、前記修飾が、前記ユビキチンタンパク質の前記βシート鎖内に位置するアミノ酸の少なくとも１０％、最大で４０％に対する修飾を含む、請求項１または２記載のタンパク質。
【請求項４】
２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および／または６８位に位置する少なくとも４個のアミノ酸が修飾され、
さらに追加で１〜７個のアミノ酸が修飾され、
前記追加で修飾されるアミノ酸は、任意に、３６、４４、７０、７１、７２、および７３位の１以上のアミノ酸から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
異なる修飾がなされた少なくとも２つのユビキチンタンパク質がヘッドトゥテイル配置で互いに結合されるか、あるいは、
少なくとも１つの修飾ユビキチンタンパク質と少なくとも１つの非修飾ユビキチンタンパク質がヘッドトゥテイル配置で互いに結合されたヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質であり、
前記多量体タンパク質は、任意に二量体または三量体タンパク質である、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
修飾多量体ユビキチンタンパク質、任意に、修飾二量体または三量体ユビキチンタンパク質を含む、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に結合可能なタンパク質であり、
少なくとも２つの単量体ユビキチンユニットがヘッドトゥテイル配置で互いに結合され、
前記多量体タンパク質の各単量体は、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位における、少なくとも３または４個のアミノ酸の置換により修飾され、
前記修飾単量体ユビキチンユニットが、配列番号１に対し、６０％以上、８５％以上、および９０％以上の群から選択される少なくとも一つのアミノ酸同一性を有し、
前記タンパク質が、前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対して、Ｋｄ＝１０^−５〜１０^−１２Ｍの特異的結合親和性を有し、前記フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示し、
前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対し、Ｋｄ＝１０^−５〜１０^−１２Ｍの特異的結合親和性で検出可能な結合を示す修飾ユビキチンタンパク質を得るため、各単量体ユビキチンにおいて、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位における、少なくとも３または４個のアミノ酸が、置換、欠失、または付加により修飾されているタンパク質。
【請求項７】
前記多量体が、同一または異なる修飾ユビキチンタンパク質により形成されている、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
前記修飾ユビキチンタンパク質が、遺伝子融合または翻訳後融合されている、請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
前記ユビキチンタンパク質のヘテロ二量体である請求項６から８のいずれか一項に記載のタンパク質であり、
第１のユビキチン単量体の少なくとも６、８、６３〜６６位、ならびに、第２のユビキチン単量体の６、８、６２〜６６位、さらに任意に２位に修飾を有し、
好ましくは、Ｋ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５Ｆ、Ｔ６６Ｐ、ならびに、Ｋ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５Ｗ、Ｔ６６Ｅ、任意にＱ２Ｒに修飾を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列番号４７の配列を含む前記ユビキチンタンパク質のヘテロ二量体である、請求項５から８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
ユビキチン単量体同士が、リンカー、好ましくは、配列番号３２のリンカーにより結合されるか、またはＧＩＧ配列によって結合される、請求項７から１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
配列番号３３または３４のユビキチンヘテロ二量体を含む、請求項１０または１１記載のタンパク質。
【請求項１３】
薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した請求項１から１２のいずれか一項に記載のタンパク質を含む融合タンパク質であり、
前記薬学的活性成分が、任意にサイトカイン、ケモカイン、細胞傷害性化合物、または酵素であり、前記サイトカインは好ましくはＴＮＦαであり、
前記診断用活性成分が、蛍光化合物、光増感剤、または放射性核種から選択される融合タンパク質。
【請求項１４】
前記融合タンパク質が、多量体修飾ユビキチンタンパク質を含み、前記多量体修飾ユビキチンタンパク質が、任意にサイトカインである薬学的または診断用活性成分と任意に融合しているか、あるいは
前記タンパク質が、多量体修飾ユビキチンタンパク質を含み、前記多量体が、任意にＴＮＦαである前記薬学的活性成分、または前記診断用成分を介して形成されている、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
ユビキチンヘテロ二量体がＴＮＦαに融合して得られる融合タンパク質の三量体である、請求項１３または１４記載の融合タンパク質であり、
前記融合タンパク質は、好ましくは、配列番号３５、３６、または４７の配列を有するか、あるいは、配列番号３５、３６、または４７の配列に対して９０％以上の同一性を有する融合タンパク質。
【請求項１６】
組換えタンパク質または組換え融合タンパク質である、請求項１から１５のいずれか一項に記載のタンパク質または融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質もしくは組換え融合タンパク質、またはこれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１８】
さらに、１以上の化学療法剤を含み、
前記化学療法剤が、好ましくは、メルファラン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ダクチノマイシン、フルオロデオキシウラシル、シスプラチン、パクリタキセル、およびゲムシタビンから選択されるか、あるいはキナーゼ阻害剤群、または放射性医薬品から選択される、請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
混合製剤の形態、好ましくは、複数の部品からなるキットの形態である、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２２】
請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、
請求項５から１２のいずれか一項に記載のタンパク質、
請求項１３から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、
請求項２１記載のベクター、および／または
請求項１９記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項５から１２のいずれか一項に記載の多量体タンパク質、または請求項１３から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、
診断上許容される担体とを含む、診断剤。
【請求項２４】
以下の工程を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の製造方法。
ａ）ユビキチンタンパク質を提供する工程
ｂ）フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインを提供する工程
ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して６０％以上のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を得るために前記ユビキチンタンパク質を修飾する工程であり、
２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および／または６８位における、少なくとも３または４個のアミノ酸を、置換、欠失、または付加によって修飾する工程
ｄ）前記修飾ユビキチンタンパク質を、前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインと接触させる工程
ｅ）１０^−５〜１０^−１２Ｍの特異的結合親和性で前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに結合する修飾ユビキチンタンパク質をスクリーニングする工程
ｆ）前記修飾ユビキチンタンパク質を単離する工程
【請求項２５】
前記修飾工程が化学的合成工程を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記修飾が、ＤＮＡレベルの遺伝子操作によって行われ、
前記タンパク質の発現が、原核もしくは真核生物内、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項２４または２５記載の方法。
【請求項２７】
請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法であり、
前記組換えタンパク質を、任意にサイトカイン、好ましくはＴＮＦαである薬学的活性成分、または診断用成分と融合させるか、
前記組換えタンパク質を、少なくとも１つの第２の組換えユビキチンタンパク質と融合させて前記組換えユビキチンタンパク質の多量体、任意に二量体または三量体とし、この多量体を、任意にサイトカインである薬学的活性成分、または診断用成分と任意に融合させるか、あるいは
前記組換えタンパク質を、少なくとも１つの第２の組換えユビキチンタンパク質と融合させて前記組換えユビキチンタンパク質の多量体、任意に二量体または三量体とし、この多量体、二量体または三量体を、任意にＴＮＦαである前記薬学的活性成分、または前記診断用成分を介して形成させる方法。
【請求項２８】
以下の工程を含む、請求項５から１４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体融合タンパク質の製造方法。
ａ）直接または好適なリンカーを介して結合された２以上の修飾ユビキチン単量体を含む多量体ユビキチンタンパク質を提供する工程であり、
配列番号１のアミノ酸配列に対して６０％以上のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を得るために、前記多量体ユビキチンタンパク質の各単量体を修飾し、各単量体において、２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６、および／または６８位における、少なくとも３または４個のアミノ酸を、置換、欠失、または付加によって修飾する工程
ｂ）フィブロネクチンのＥＤ−Ｂを提供する工程
ｃ）前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質を、前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂと接触させる工程
ｄ）１０^−５〜１０^−１２Ｍの特異的結合親和性で前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂに結合する修飾ユビキチンタンパク質をスクリーニングする工程
ｅ）前記修飾ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質を単離する任意の工程
【請求項２９】
前記ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質がヘテロ二量体ユビキチンタンパク質である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
医学的治療方法に使用するための、請求項１から のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項５から１２のいずれか一項に記載の多量体タンパク質、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
請求項５から１６の一項以上に規定する修飾多量体ユビキチンタンパク質またはユビキチン融合タンパク質の直鎖を含み、少なくとも２つの相互作用する結合決定領域（ＢＤＲ）においてランダム化されているライブラリー。

【図１】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図６】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図１１】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１７Ｃ】

【図１８】

【図２】

【図３】

【図５Ａ】

【図６Ｄ】

【図６Ｅ】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１５Ｃ】

【図１５Ｄ】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７Ｄ】

【図１７Ｅ】

【図１９】

【公表番号】特表２０１３−５１３３７５（Ｐ２０１３−５１３３７５Ａ）
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４２５８２（Ｐ２０１２−５４２５８２）
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６９６６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７３２０９
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５０１１３９８７０）シル　プロテインズ　ゲーエムベーハー (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｉｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｉｎｒｉｃｈ−Ｄａｍｅｒｏｗ−Ｓｔｒ．　０１，　Ｄ−０６１２０，　Ｈａｌｌｅ，　Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】