フィブロネクチンのＥＤ―Ｂドメインに対する抗体、それらの構造及び用途
【課題】腫瘍関連抗原を標的にすることによって固形腫瘍を治療する抗体を提供する。
【解決手段】フィブロネクチン（ＦＮ）は、細胞外マトリックス及び体液の多機能性高分子量の糖蛋白成分である。正常細胞の定着（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ）及び維持、細胞移動、うっ血、血栓症、創傷の治癒、腫瘍原性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）転換等、多くの異なる生物過程に関与する、フィブロネクチン（ＦＮ）のＥＤ−Ｂ腫瘍胎児ドメインに対して特異的であり、且つその腫瘍胎児ドメインに直接結合する特異性結合抗体又は抗体断片でありそのような結合メンバを製造するための物質及び方法。
【解決手段】フィブロネクチン（ＦＮ）は、細胞外マトリックス及び体液の多機能性高分子量の糖蛋白成分である。正常細胞の定着（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ）及び維持、細胞移動、うっ血、血栓症、創傷の治癒、腫瘍原性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）転換等、多くの異なる生物過程に関与する、フィブロネクチン（ＦＮ）のＥＤ−Ｂ腫瘍胎児ドメインに対して特異的であり、且つその腫瘍胎児ドメインに直接結合する特異性結合抗体又は抗体断片でありそのような結合メンバを製造するための物質及び方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
本発明は、フィブロネクチン、ＥＤ−Ｂ（これはまた、免疫細胞学と生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍を標的にすることとの両方によって実証されている通り、成長している腫瘍の新生血管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）において滲出する）の胎児イソ型（ｆｏｅｔａｌ ｉｓｏｆｏｒｍ）のための特殊な結合剤に関する。本発明はまた、かかる特殊な結合剤に係る物質及び方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍治療の現行技術の大抵のものの第一の狙いは、腫瘍のできるだけ多くの構成細胞を殺すことにある。化学療法及び放射線療法を用いて経験してきた成功が限られているのは、治療の特殊性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，専門性）が比較的欠如していること、及び正常組織に及ぼす有毒性副作用の傾向があることと関係がある。腫瘍のための治療の選択性を改善し得る一つの方法は、結合タンパク質を通して、腫瘍へ物質（ａｇｅｎｔ，活性物質）を運ぶことである。この結合タンパク質は通常、腫瘍の表面上に滲出した標識抗原（ｍａｒｋｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ）のための特殊性を有する、抗体結合ドメイン（ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，結合領域）から成る。俗に「マジック弾（ｍａｇｉｃ ｂｕｌｌｅｔｓ）」と呼ばれている、標的にされた腫瘍のかかる形態は、げっ歯類（ｒｏｄｅｎｔｓ）からの単クローン性抗体（ｍＡｂｓ）によって、主に実証されてきた。ｍＡｂは、細胞表面上に滲出したいわゆる腫瘍関連抗原に対して特異性がある。そのようなｍＡｂは、細胞毒部分（例えば、毒素又は薬物）へ化学的に結合していても良いし、或いは組換え融合蛋白質として産生しても良い。ここに、ｍＡｂを記号化した遺伝子と毒素とは一緒に連結され、縦列に滲出される。
【０００３】
「マジック弾」のアプローチは、ヒト・癌の治療において重要であり有効であり、リンパ起始（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒｉｇｉｎ）の腫瘍を標的にする場合に最も注目されている（ここに、悪性細胞は循環中の治効量に最も影響を受けやすい）が、このアプローチには限界がある。しかし、固体腫瘍の治療は、全細胞塊の微小部分（腫瘍の最も外側の周辺の細胞が支配的である）のみが循環中の治療的免疫接合（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）にさらされるという点で、重大な臨床的問題を残している；これらの周辺標的は、腫瘍内部に対していわゆる「結合部障壁（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｂａｒｒｉｅｒ）」を形成する（非特許文献１）。腫瘍内部における組織の構造は、一般的に線維支質を有し、あまりにも稠密であり、腫瘍細胞に密に包み込まれているため、抗体の大きさ範囲の分子は浸透することができない。更に、腫瘍は、リンパ排液が欠如しているため、大きな間隙圧力を有することが知られている。腫瘍はまた、外因性分子の流入を妨げる。腫瘍内への治療薬の取込みに影響を及ぼす諸因子に関する最近の報告については、非特許文献２を参照。
【０００４】
腫瘍関連抗原を標的にすることによって固形腫瘍を治療することには明らかに限界があるものの、これらの腫瘍は、抗体を治療するために代替的な抗原を標的にするという共通の特徴を有するのである。一旦、腫瘍がある大きさを越えて成長したとき、腫瘍は一般的に、成長を支えるための十分な酸素と養分とを、独立した血液供給に依存する。もし、この血液供給を妨げるか、又は遮ることができるのなら、過程において、現実的に何千もの腫瘍細胞を餓死させることができる。腫瘍が成長するにつれて、腫瘍は、隣接した毛管内皮細胞に作用する脈管由来諸因子の別種の配列を生じさせ、それらを誘導して（ｉｎｄｕｃｉｎｇ）増殖し移動しながら、スウィッチを受けて脈管由来表現型になる。これらの新たに形成された血管の構造は、正常組織の秩序のある構造とは著しく対照的に、出口のない末端（ｂｌｉｎｄ ｅｎｄｉｎｇｓ）と漏出の増大に通じる穿孔とを有し、高度に崩壊している。血管形成の誘導は、ある細胞表面の抗原の表現のアップレギュレーション（ｕｐｒｅｇｌａｔｉｏｎ）によって成し遂げられ、それらの多くは正常組織の脈管構造に共通している。
【０００５】
腫瘍の新生血管形成に特有な抗原を識別することは、血管を標的にすることによる、固形腫瘍の一般的療法を開発する上での主要な限定因子（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）であった。本発明の主題である抗原は、かかる問題に直接向いている。
【０００６】
腫瘍が進行している間、周囲組織の細胞外マトリックスは、二つの主要過程、即ち、（１）正常組織の細胞外マトリックス成分のタンパク分解の低下、及び（２）腫瘍細胞と、腫瘍誘導された（ｔｕｍｏｕｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ）シトキンによって活性化された支質細胞とによる、細胞外マトリックス成分のドゥノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成によって、再構築される。これらの二つの過程は、安定な状態で、「腫瘍細胞外マトリックス（ｔｕｍｏｒａｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）」を生じさせる。この腫瘍細胞外マトリックスは、腫瘍の進行にとって一層適した環境を与え、しかも定性的かつ定量的に正常組織のそれと全く異なっている。このマトリックスの諸成分の中には、テナシン及びフィブロネクチン（ＦＮ）のイソ型が多量存在する。これらの蛋白質のイソ型としての記述（ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）から、それらの構造上の大きな異質性が認識される。この構造上の異質性は、転写レベル、転写後レベル及び翻訳後レベルでもたらされる。本発明の主題は、フィブロネクチンのイソ型の一種の、いわゆるＢ＋イソ型（Ｂ−ＦＮ）である。
【０００７】
フィブロネクチン（ＦＮ）は、細胞外マトリックス及び体液の多機能性高分子量の糖蛋白成分である。これらの成分は、正常細胞の定着（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ）及び維持、細胞移動、うっ血、血栓症、創傷の治癒、腫瘍原性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）転換等、多くの異なる生物過程に関与している（報告に関しては、非特許文献３〜６；ハイネス，１９９０；非特許文献７を参照）。ＦＮｓの構造上の相違は、ＦＮ一次転写物の三つの領域（ＥＤ−Ａ、ＥＤ−Ｂ及びＩＩＩＣＳ）によってもたらされ（非特許文献５及び８）、少なくとも２０種の異なるイソ型が生じる。これらイソ型の幾つかは、腫瘍及び正常組織では区別して表現される。ＦＮ−プレ−ｍＲＮＡのスプライシングパターンは、進行中のものに特異的な組織態様に調整されるだけではなく、移動済み細胞及び悪性疾患の中で調整解除されることが知られている（非特許文献８〜１６）。実際、ＥＤ−Ａ、ＥＤ−Ｂ及びＩＩＩＣＳの配列を有するＦＮイソ型は、大部分、正常細胞中よりも移動済み細胞及び悪性腫瘍細胞の中に表現される。特に、ＥＤ−Ｂ配列（Ｂ＋イソ型）を有するＦＮイソ型は、創傷治癒の間だけではなく、胎児組織及び腫瘍組織の中に高度に表現される。しかし、成人の正常組織中では表現が制限される（非特許文献１３及び１７〜２３）。Ｂ＋ＦＮの分子は、成熟した血管中では検知できないが、正常な発育（例えば、子宮内膜の発育）、病の進行（例えば、糖尿病性の網膜障害の）及び腫瘍の進行の状態にある脈管由来の血管中では、アップレギュレーションとなる（非特許文献２４）。
【０００８】
ＥＤ−Ｂ配列は、単エクソンによってコード化された完全型ＩＩＩ−相同（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）の繰り返しであり、９１種のアミノ酸から成る。細胞型特異性結合部を有する、代替的スプライシングされたＩＩＩＣＳイソ型とは対照的に、Ａ＋イソ型及びＢ＋イソ型の生物機能は、まだ推測の域を出ていない（非特許文献２５）。
【０００９】
Ｂ＋イソ型の存在自体は、腫瘍誘導された新生抗原を構成する。しかし、加えるに、ＥＤ−Ｂ表現は、ＩＩＩ型の繰り返し７以内の、正常に潜在する（ｎｏｒｍａｌｌｙ ｃｒｙｐｔｉｃ）抗原を露出する（前のＥＤ−Ｂ）；このエピトープはＦＮ分子欠乏ＥＤ−Ｂの中に露出されないので、ＥＤ−Ｂ表現は直接的にも間接的にも新生抗原の表現を誘導することとなる。この潜在的抗原の部位は、ＢＣ−１と呼ばれる単クローン性抗体（ｍＡｂ）の標的を形成する（非特許文献２６）。このｍＡｂの特異性と生物諸特性は、特許文献１に記載されており、イギリス（ＵＫ），ソールズベリー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ），ポートンダウン（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ），動物細胞培養欧州共同体（ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に委託されている融合細胞腫（番号８８０４２１０１）から入手することができる。ｍＡｂは、成熟した血管内皮への交差反応性なしで、腫瘍の脈管由来の血管を一局部に止めるのに使用され成功してきており、抗体を使用して血管を標的にするためのＦＮイソ型の可能性を説明している。
【００１０】
しかし、ＢＣ−１ ｍＡｂの特異性に対する幾つかの注意点が残っている。ＢＣ−１がＢ＋イソ型を直接的に認識しないという事実により、幾つかの組織において、ＢＣ−１によって認識されるエピトープはＥＤ−Ｂが存在しなくても暴露され（ｕｎｍａｓｋｅｄ）、その結果、不要なＢＣ−１の交差反応性へ間接的に導き得るかどうかという疑問が生じた。また、ＢＣ−１は、ヒト・Ｂ＋イソ型には厳密に特異的であり、生物分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）及びＢＣ−１の腫瘍局在化に関する、動物の研究はできないということを意味する。Ｂ＋イソ型を有する組換え融合蛋白に対する多クローン性抗体は生成されてきた（非特許文献２７）が、それら抗体は、エピトープを暴露するためのＮ−グリカナーゼ（Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ）で処理されたＦＮと反応するのみである。
【００１１】
マウス・単クローン性抗体を使用する上での更なる一般的問題は、ヒト・抗マウス抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ＨＡＭＡ）の反応である（非特許文献２８及び２９）。ＨＡＭＡ反応は、治療量の減量に役立つ、投与済み抗体の中和から、アレルギー反応、血清病及び腎臓障害まで、ある範囲の効果を有する。
【００１２】
組換えＥＤ−Ｂと反応する多クローン性抗血清は確認されてきた（上記を参照）が、マウスの免疫化の結果として生じるＢＣ−１と同一の特異性を有するｍＡｂの分離は、一般的に困難であることが分かった。なぜなら、ヒト及びマウスのＥＤ−Ｂ蛋白は、ほぼ１００％の配列相同を示すからである。従って、ヒト・蛋白は、それへの免疫反応を備えていないマウスにとっては自己抗原であるように見えるかも知れない。実際、何十年にも渡るこの分野の徹底した研究において、ＥＤ−Ｂを直接的に認識するものは何もなく、単ｍＡｂのみがＢ＋ＦＮイソ型（ＢＣ−１）に対する間接的反応性を有するものとして認定されてきた。ＢＣ−１の特異性は、ＥＤ−Ｂ自体の部分のためというよりむしろ、潜在的エピトープのために、ＥＤ−Ｂの結果として暴露されるということは間違いなく意義がある。
ＥＤ−Ｂは、マウスＦＮが恐らく欠けていて、マウスの免疫系による「自己」と見られないものと思われる。
【００１３】
本発明は、以前使用されたものに対する代替的方法を使用して実現された。ここでは、フィブロネクチン又はＥＤ−Ｂによる従来の免疫化は必要でない：ＥＤ−Ｂイソ型に対する特異性を有する抗体は、線維状バクテリオファージの表面に表示される、ヒト・抗体の種々の領域のライブラリ（ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）から単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）として得られてきた（非特許文献３０及び特許文献２〜６をも参照）。
【００１４】
ＥＤ−Ｂを有する組換えＦＮ−断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）と、組換えＥＤ−Ｂ自体との両者の上に直接選択することにより、特異性ｓｃＦｖが分離され得ることを、我々は、抗体ファージライブラリ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ）を使用することによって見いだした。このとき、これら抗体は固形表面の上に被覆される（「パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」）。抗原のこれら同一源もまた、「二代雑種第二子世代（ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」のｓｃＦｖを生成するのに使用され成功し、「親和力成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」の過程で、親クローンに関する諸特性が改善されてきた。分離されたｓｃＦｖは、Ｎ−グリカナーゼで前処理をしないで、ヒト・ＦＮのＢ＋イソ型と強く且つ特異的に反応することを我々は見いだした。
【００１５】
抗腫瘍の適用において、本発明によって提供されるヒト・抗体抗原結合ドメインは、ＨＡＭＡ反応を受けないという利点を有する。また、本明細書中に例証される通り、これら結合ドメインは、生体外でも生体内でも、腫瘍組織の免疫組織化学分析において有用である。これらの用途及び他の用途は、本明細書中で更に論じられ、当業者には容易に理解できる。
【００１６】
術語
特異的結合メンバ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒ）
特異性結合メンバとは、相互に対して結合特異性を有する一対の分子のメンバをいう。特異性結合ペアメンバは、自然界で得られるが、全部又は一部を合成によって生成することができる。一対の分子の一つのメンバは、その表面上に、領域又はキャビティ（ｃａｖｉｔｙ，空洞）を有する。この領域又はキャビティは、その一対の分子の他のメンバに特異的に結合し、それ故に、その極性空隙機構に対して相補的である。このように、ペアメンバは相互に特異的に結合する特性を有する。特異性結合メンバのタイプの例は、抗原−抗体、ビオチンーアビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質である。
【００１７】
抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）
抗体とは、自然界に存在し、又は一部若しくは全部を合成によって生成される免疫グロブリンをいう。この術語には、結合ドメインを有するあらゆるポリペプチド又は蛋白質も含まれる。この結合ドメインは、抗体の結合ドメインであるか、又は抗体の結合ドメインと同種のものである。これらは、自然源から得ることができるが、一部又は全部を合成によって生成することができる。抗体の例は、免疫グロブリンのイソ型（ｉｓｏｔｙｐｅｓ）及びこれらイソ型の亜綱（ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ）；Ｆａｂ，ｓｃＦｖ，Ｆｖ，ｄＡｂ，Ｆｄ等の抗原結合ドメインから成る断片；並びにダイヤボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）である。
【００１８】
単クローン抗体及び他の抗体を利用し、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、原抗体の特異性を保持する、他の抗体又はキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）分子を生成することは可能である。そのような技法には、免疫グロブリンの不変領域又は不変領域プラス外郭構造に対する抗体の、免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコード化するＤＮＡを導入することを伴うこともある。例えば、特許文献７〜９を参照。抗体を生成する融合細胞腫又は他の細胞は、遺伝的変異（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又は他の変化を受けることもある。これらの変化によって、生成される諸抗体の結合特異性を変えても良いし変えなくても良い。
【００１９】
抗体は多くの方法によって変性することができるのであるから、用語「抗体」は、必要とされる特異性を持つ結合ドメインを有する、あらゆる特異性結合メンバ又は物質と解釈されるべきである。このように、この用語は、抗体断片、誘導体、機能的に同等の物、及び抗体の同族体を意味し、自然界で得られようと全部又は一部を合成によって得られようといずれにせよ、免疫グロブリン結合ドメインから成るあらゆるポリペプチドを含んでいる。それ故に、もう一つのポリペプチドに融合した、免疫グロブリン結合ドメイン又は同等物から成るキメラ分子が含有される。キメラ抗体のクローン化及び表現は、特許文献１０及び１１に記載されている。
【００２０】
抗体全体の断片は結合性抗原の機能を果たし得るということが示された。結合性断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１のドメインから成るＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１のドメインから成るＦｄ断片；（ｉｉｉ）単抗体のＶＬ及びＶＨのドメインから成るＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（非特許文献３１）；（ｖ）分離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、二つの連結したＦａｂ断片から成る二価の断片；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ここに、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、この二つのドメインを結合させて抗原結合部を形成させるペプチドリンカーによって連結される（非特許文献３２及び３３）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（特許文献１２）；並びに（ｉｘ）「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」、遺伝子融合によって構成される多価断片又は多重特異性断片（特許文献１３及び非特許文献３４）である。
【００２１】
ダイアボディはポリペプチドの多量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ）であり、各々ポリペプチドは、免疫グロブリンの軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ，Ｌ鎖）の結合性領域を含む第一ドメインと、免疫グロブリンの重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，Ｈ鎖）の結合性領域を含む第二ドメインとから成る。この二つのドメインは、（例えば、ペプチドリンカーによって）連結されているが、相互に結合して（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）抗原結合部を形成することはできない。抗原結合部は、多量体内の一つのポリペプチドから成る第一ドメインと、多量体内のもう一つのポリペプチドから成る第二ドメインとの結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によって形成される（特許文献１３）。
【００２２】
二重特異性抗体を使用する場合、これらは、従来の二重特異性抗体であっても良い。これらは、種々の方法で製造される（非特許文献３５）；例えば、化学的に調製又はハイブリッド融合細胞腫から調製することができる。或いは、これら二重特異性抗体は、上述の二重特異性抗体断片のいずれかであっても良い。完全な抗体よりむしろ、ｓｃＦｖ二量体又はダイヤボディを使用するのが好ましい場合もある。ダイヤボディ及びｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用し、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ，抗個特異的抗原）反応の影響を潜在的に減少させながら、Ｆｃ領域なしで構成し得る。二重特異性抗体の他の形態には、非特許文献３６に記載の単鎖「ヤーヌシンズ（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）」が含まれる。
【００２３】
二重特異性の完全抗体とは対照的に、二重特異性抗体のダイヤボディは、特に有用である場合もある。なぜなら、これらダイヤボディは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）中で容易に構築され表現されるからである。適切な結合特異性のダイヤボディ（及び抗体断片等の他の多くのポリペプチド）は、ライブラリからファージ表示（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）を使用しながら、容易に選択することができる（特許文献１３）。もし、ダイヤボディの一つの腕（ａｒｍ）が、例えば、抗原Ｘに向けられた特異性で一定に保持されるなら、そのとき、他方の腕は変化し、適切な特異性の抗体が選ばれる所にライブラリが造られる。
【００２４】
抗原結合性ドメイン
抗原結合性ドメインとは、抗原の一部又は全部に特異的に結合して相補的である領域から成る抗体の一部をいう。抗原が大きい所では、抗体はその抗原の特定の部分（この部分はエピトープと呼ばれる）に結合するだけであろう。抗原結合性ドメインは、一種以上の抗体可変ドメインによって供給されるだろう。抗原結合性ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とから成るのが好ましい。
【００２５】
特異性
特異性とは、特異性結合ペアの一方のメンバが、その特異性結合のパートナに比べて、他の分子に対するいかなる有意な結合性をも示さない状況をいう。この用語はまた、例えば、抗原のひとつのメンバによって運ばれる特定のエピトープに対して、抗原結合性ドメインが特異的である場合にも適用できる。この場合、抗原結合性ドメインを運ぶ特異性結合メンバは、そのエピトープを運ぶ種々の抗原に結合することができるだろう。
【００２６】
機能的同等変異体
機能的同等変異体とは、他の分子（親）とは構造的に相違しているが、幾つかの重要な相同を残しており、また、親分子の生物機能（例えば、特定の抗原又はエピトープと結合する能力）の少なくとも幾つかをも残している分子（変異体）をいう。変異体は、断片、誘導体又は突然変異体の形態で存在することがある。変異体、誘導体又は突然変異体は、一種以上のアミノ酸の付加、欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、置換若しくは挿入；又は他の分子の連結による親分子の変性によって得られることがある。これらの変化は、ヌクレオチド又は蛋白のレベルで行われることがある。例えば、コード化されたポリペプチドは、Ｆａｂ断片であることがある。このＦａｂ断片は、そのとき、もう一つの源からのＦｃ尾部に連結される。代替的には、酵素、フラワーセイン（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｉｎ）等のマーカーが連結されることがある。
【特許文献１】欧州特許第０，３４４，１３４Ｂ１号明細書
【特許文献２】国際公開第９２／０１０４７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９２／２０７９１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９３／０６２１３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９３／１１２３６号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９３／１９１７２号パンフレット
【特許文献７】欧州特許出願公開第１８４１８７号明細書
【特許文献８】英国特許出願公開第２１８８６３８号明細書
【特許文献９】欧州特許出願公開第２３９４００号明細書
【特許文献１０】欧州特許出願公開第０１２０６９４号明細書
【特許文献１１】欧州特許出願公開第０１２５０２３号明細書
【特許文献１２】国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号
【特許文献１３】国際公開第９４／１３８０４号パンフレット
【非特許文献１】Ｊｕｗｅｉｄら著、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９２年、５２巻、ｐ．５１４４〜５１５３
【非特許文献２】Ｊａｉｎ．Ｒ．著、Ｓｃｉ．Ａｍ．、１９９４年、２７１巻、ｐ．５８〜６５
【非特許文献３】Ａｌｉｔａｌｏら著、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８２年、３７巻、ｐ．１１１〜１５８
【非特許文献４】Ｙａｍａｄａ著、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８３年、５２巻、ｐ．７６１〜７９９
【非特許文献５】Ｈｙｎｅｓ著、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９８５年、ｌ巻、ｐ．６７〜９０
【非特許文献６】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ著、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８年、５７巻、ｐ．３７５〜４１３
【非特許文献７】Ｏｗｅｎｓら著、Ｏｘｆ．Ｓｕｒｖ．Ｅｕｃａｒｙｏｔ．Ｇｅｎｅｓ、１９８６年、３巻、ｐ．１４１〜１６０
【非特許文献８】Ｚａｒｄｉら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８７年、６巻、ｐ．２３３７〜２３４２
【非特許文献９】Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９８６年、１０３巻、ｐ．１６７１〜１６７７
【非特許文献１０】Ｂｏｒｓｉら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８７年、１０４巻、ｐ．５９５〜６００
【非特許文献１１】Ｖａｒｔｉｏら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８７年、８８巻、ｐ．４１９〜４３０
【非特許文献１２】Ｂａｒｏｎｅら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８９年、８巻、ｐ．１０７９〜１０８５
【非特許文献１３】Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９８９年、１０８巻、ｐ．１１３９〜１１４８
【非特許文献１４】Ｏｙａｍａら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９年、ｐ．１０３３１〜１０３３４
【非特許文献１５】Ｏｙａｍａら著、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９０年、５０巻、ｐ．１０７５〜１０７８
【非特許文献１６】Ｂｏｒｓｉら著、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、１９９２年、１９９巻、ｐ．９８〜１０５
【非特許文献１７】Ｎｏｒｔｏｎ及びＨｙｎｅｓ著、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８７年、７巻、ｐ．４２９７〜４３０７
【非特許文献１８】Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８７年、６巻、ｐ．２５７３〜２５８０
【非特許文献１９】Ｇｕｔｍａｎ及びＫｏｒｎｂｌｉｈｔｔ著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、１９８７年、８４巻、ｐ．７１７９〜７１８２
【非特許文献２０】Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８５年、４巻、ｐ．１７５５
【非特許文献２１】Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９８９年、１０９巻、ｐ．９０３〜９１４
【非特許文献２２】Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔら著、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９８９年、１０６巻、ｐ．３７５〜３８８
【非特許文献２３】Ｌａｉｔｉｎｅｎら著、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９１年、６４巻、ｐ．３７５〜３８８
【非特許文献２４】Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９４年、５９巻、ｐ．６１２〜６１８
【非特許文献２５】Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９８６年、１０３巻、ｐ．２６３７〜２６４７
【非特許文献２６】Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、ｐ．２４６８９〜２４６９２
【非特許文献２７】Ｐｅｔｅｒｓら著、Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９５年、３巻、ｐ．６７〜８９
【非特許文献２８】Ｓｃｈｒｏｆｆら著、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８５年、４５巻、ｐ．８７９〜８８５
【非特許文献２９】ＤｅＪａｇｅｒら著、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１９８８年、２９巻、ｐ．３７７
【非特許文献３０】Ｎｉｓｓｉｍら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９４年、１３巻、ｐ．６９２〜６９８
【非特許文献３１】Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら著、Ｎａｔｕｒｅ、１９８９年、３４１巻、ｐ．５４４〜５４６
【非特許文献３２】Ｂｉｒｄら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８年、２４２巻、ｐ．４２３〜４２６
【非特許文献３３】Ｈｕｓｔｏｎら著、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９８８年、８５巻、ｐ．５８７９〜５８８３
【非特許文献３４】Ｈｏｌｌｉｇｅｒら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３年、９０巻、ｐ．６４４４〜６４４８
【非特許文献３５】Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．著、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３年、４巻、ｐ．４４６〜４４９
【非特許文献３６】Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら著、Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９１年、１０巻、ｐ．３６５５〜３６５９
【非特許文献３７】Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ著、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１年、３４９巻、ｐ．２９３〜２９９
【非特許文献３８】Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ Ｉ．Ｍ．ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９２年、２２７巻、ｐ．７７６〜７９８
【非特許文献３９】Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ Ｊ．Ａ．ら著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９１年、４７巻、ｐ．６５９〜６６４
【非特許文献４０】Ｂａｇｓｈａｗｅ Ｋ．Ｄ．ら著、Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１９９１年、４巻、ｐ．９１５〜９２２
【非特許文献４１】Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９１年、９巻、ｐ．５４５〜５５１
【非特許文献４２】Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．著、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９３年、４巻、ｐ．５７３〜５７６
【非特許文献４３】Ｔｒｉｌｌ Ｊ．Ｊ．ら著、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９５年、６巻、ｐ．５５３〜５６０
【非特許文献４４】分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），実験マニュアル（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）：第２版，サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 出版
【非特許文献４５】分子生物学における短い実験記録（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版，オスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等編集，ジョン・ウィリー（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ）及びサンズ（Ｓｏｎｓ）、１９９２年
【非特許文献４６】Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒら著、Ｃｅｌｌ、１９８１年、２６巻、ｐ．２５９〜２６７
【非特許文献４７】Ｍａｒｋｓら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９１年、２２２巻、ｐ．５８１〜５９７
【非特許文献４８】Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９１年、１９巻、ｐ．４１３３〜４１３７
【非特許文献４９】Ｇｉｂｓｏｎ ＴＪ、博士論文、１９８４年、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ
【非特許文献５０】Ｈａｗｋｉｎｓら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９２年、２２６巻、ｐ．８８９〜８９６
【非特許文献５１】Ｃｒｏｔｈｅｒｓ及びＭｅｔｚｇｅｒ著、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７２年、９巻、ｐ．３４１〜３５７
【非特許文献５２】Ｍａｒｋｓら著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２年、１０巻、ｐ．７７９〜７８３
【非特許文献５３】Ｌｏｗら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９６年、２６０巻、ｐ．３５９〜３６８
【非特許文献５４】Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９４年、１３巻、ｐ．３２４５〜３２６０
【非特許文献５５】Ｖａｕｇｈａｎら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９６年、１４巻、ｐ．３０９〜３１４
【非特許文献５６】Ｂｏｒｓｉら著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９１年、１９２巻、ｐ．３７２〜３７９
【非特許文献５７】Ｓａｇｉｎａｔｉら著、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９２年、２０５巻、ｐ．５４５〜５４９
【非特許文献５８】Ｓｉｒｉら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９１年、１９巻、ｐ．５２５〜５３１
【非特許文献５９】Ｂｒｏｗｎら著、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９３年、１４２巻、ｐ．７９３〜８０１
【非特許文献６０】Ｋａｃｚｍａｒｅｋら著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９４年、５８巻、ｐ．１１〜１６
【非特許文献６１】Ｆｏｌｌｉら著、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９４年、５４巻、ｐ．２６４３〜２６４９
【非特許文献６２】ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．及びＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ）、１９９０年、”Ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ．”、３４８巻、ｐ．５５２〜５５４
【非特許文献６３】Ｐａｃｋら著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９３年、１１巻、ｐ．１２７１〜１２７７
【非特許文献６４】Ｎｅｒｉら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６年、１４巻、ｐ．３８５〜３９０
【非特許文献６５】Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版）
【非特許文献６６】Ｂｏｒｓｉら著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９２年、５２巻、ｐ．６８８〜６９２
【非特許文献６７】Ｊｏｎｓｓｏｎ著、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９１年、１１巻、ｐ．６２０〜６２７
【非特許文献６８】Ｎｅｒｉら著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９６年、２０巻、ｐ．７０８〜７１３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明によると、フィブロネクチン（ＦＮ）のＥＤ−Ｂ胎児ドメインに対して特異性のある特異性結合メンバが提供される。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明による特異性結合メンバは，ＥＤ−Ｂドメインに直接結合する。一つの具体例において、特異性結合メンバは、蛋白分解酵素サーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）でＦＮを処理した後、ＥＤ−Ｂを含有するＦＮの一つに、又はいかなるものにも、又は全部に結合する。更なる具体例において、特異性結合メンバは、ＩＩＩ型相同の繰返しを含有するＦＮの一つに、又はいかなるものにも、又は全部に結合する。これら繰返しには、ＥＤ−Ｂドメインが含まれる。既知のＦＮは、二つの論文（非特許文献１３及び２６）の中に確認される。「ＥＤ−Ｂを含有する全ＦＮ」への言及は、これらの論文中で、ＥＤ−Ｂを含有していると確認される全ＦＮへの言及として理解されても良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
特異性結合メンバは、ヒトＥＤ−Ｂと結合するのが好ましく、また、マウス、ラット及び／又はニワトリのような、他の少なくとも一種のＢ＋ＦＮと結合するのが好ましい。特異性結合ペアメンバは、ヒト・フィブロネクチンＥＤ−Ｂにも；動物モデル中のｓｂｂメンバのテスト及び分析が可能な、マウス・フィブロネクチンＥＤ−Ｂ等の非ヒト・フィブロネクチンＥＤ−Ｂにも結合し得るのが好ましい。
【００３０】
本発明による特異性結合ペアメンバは、本明細書のどこかで検討され公式に入手できる沈積済み抗体ＢＣ−１と競うことなく、フィブロネクチンＥＤ−Ｂに結合する。ＢＣ−１は、ヒトＢ＋イソ型に対してまさに特異的である。本発明による特異性結合ペアメンバは、ＢＣ−１と同一のエピトープには結合しない。
【００３１】
本発明による特異性結合メンバのＢ＋ＦＮへの結合は、ＥＤ−Ｂドメインによって抑制されることがある。
【００３２】
本発明の一つの面において、結合ドメインは、精製済み単量体として測定されるとき、ＥＤ−Ｂ ＦＮに対して６×１０−８Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００３３】
本発明の一つの面において、結合ドメインは、フィブロネクチンＥＤ−ＢをＮ−グリカナーゼ（Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ）で前処理しないで、フィブロネクチンＥＤ−Ｂと反応する（即ち、結合することができる）。
【００３４】
本発明による特異性結合ペアメンバは、分離体として、又は精製された形で、即ち、他の特異性結合ペアメンバ（例えば、抗体又は抗体断片）を含有していない製剤の状態、又はフィブロネクチンＥＤ−Ｂと結合することのできる他の特異性結合ペアメンバを含有していない状態で提供されることがある。本発明による特異性結合メンバは、実質的に純粋な形で提供されるのが好ましい。それらは、伝統的な融合細胞腫技術を使って得られた抗体と縛りつけるよりむしろ、単一クローンからのものという意味で『単クローン』であるのかも知れない。検討した通り、本発明による特異性結合ペアメンバは、バクテリオファージ表示技術（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び／又は組換えによる表現（例えば、細菌細胞、ホスト細胞）を使用して得られることがある。フィブロネクチンＥＤ−Ｂに直接結合する、単クローンの特異性結合ペアメンバについては、従来全く開示されていない。
【００３５】
この特異性結合メンバは、抗体から成るのが好ましい。特異性結合メンバは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等の抗体断片の形態のポリペプチド配列から成ることがある。Ｆａｂ、Ｆａｂ”、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆａｃｂ、ダイアボディ等の、抗体断片の他のタイプが利用されることもある（非特許文献３７及び特許文献１３）。特異性結合メンバは、完全抗体の形であることがある。完全抗体は、抗体イソ型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ）の形のいずれか、及びイソ型亜綱（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）の形のいずれかであることがある。
【００３６】
抗体は、あらゆる起源、例えば、ヒト、マウス、ヒツジ、ウサギのものでよい。他の誘導は当業者には明らかである。抗体は、ヒト起源が好ましい。「ヒト」は、ヒトのｃＤＮＡ、蛋白又はペプチドライブラリから部分的に又は完全に誘導される抗体を意味する。この用語は、抗体分子にヒト特性を与えて、その分子にヒト免疫系の防衛をバイパスさせるために変性された、非ヒト起源のヒト化されたペプチド及び蛋白を意味する。
【００３７】
特異性結合メンバは、設計された抗体［例えば、明示されている（ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ）フィブロネクチンＥＤ−Ｂに対して一つの結合腕（即ち、特異性ドメイン）、及び異なる特異性に対する他の腕、又は二価若しくは多価の分子を有する、二重特異性抗体分子（又は、Ｆ（ａｂ’）２等の断片）］の形態であることもある。
【００３８】
特異性結合メンバは、抗体配列の他に、他のアミノ酸（例えば、ペプチド若しくはポリペプチドを形成するもの、又は抗原に結合する能力の他にもう一つの機能特性をその分子に与えるもの）を含むことがある。例えば、特異性結合メンバは、標識、酵素又はそれらの断片等を含む。
【００３９】
結合ドメインは、胚芽細胞系列分節（ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔ）又は再配列された遺伝子分節（ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔ）によってコード化されたＶＨドメインの一部又は全部から成ることがある。結合ドメインは、ＶＬカッパ（κ）ドメイン又はＶＬラムダ（λ）ドメインの一部又は全部から成ることがある。
【００４０】
結合ドメインは、ＶＨ１、ＶＨ３又はＶＨ４の胚芽細胞系列遺伝子配列、又はその再配列形から成ることがある。
【００４１】
本発明による特異性結合メンバは、ヒト・胚芽細胞系列ＤＰ４７由来の重鎖可変領域（「ＶＨ」ドメイン）（それの配列は、図１ａに示す；残基は１〜９８）から成ることがある。「ＤＰ」命名法は、非特許文献３８に記載されている。ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓであってもよい。ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｕであってもよい。このように、本発明による特異性結合メンバの結合ドメインは、ＣＧＳ１及びＣＧＳ２について図１ａに示されるアミノ酸配列から成るＶＨドメインを含有することがある。
【００４２】
結合ドメインは、ヒト・胚芽細胞系列ＤＰ１６由来の軽鎖可変領域（「ＶＬ」ドメイン）（それの配列は、コドン１〜９０として図１ｂに示す）から成ることがある。
【００４３】
ＶＬドメインは、ＣＤＲ３配列 Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌから成ることがある。ＶＬドメインは、ＣＤＲ３配列 Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌから成ることがある。
【００４４】
本発明の特異性結合メンバは、図１に示される配列と機能的に同等の変異体から成ることがある。例えば、本明細書に開示される特性が保持されるという条件で、一種以上のアミノ酸が挿入され、削除され、置換され又は追加された。例えば、特異性結合メンバがＥＤ−Ｂに結合するという条件で、ＣＤＲ３配列は、変性されることがある；或いは、一つ以上の変化が外郭構造領域に生じることがある；或いは、外郭構造がもう一つの外郭構造若しくは変性形態と置き換えられることがある。
【００４５】
本明細書に開示される抗体の抗原結合ドメインのＶＬドメイン若しくはＶＨドメイン由来の一種以上のＣＤＲのものは、いわゆる「ＣＤＲ−移植」で使用されることがある。「ＣＤＲ−移植」では、特許文献９に開示されるように、第一抗体の一種以上のＣＤＲ配列は、その抗体のものでない配列（例えば、もう一つの抗体の配列）の外郭構造の内部に置かれる。ＣＧＳ１及びＣＧＳ２のためのＣＤＲ配列は、図１ａ及び図１ｂに示す。
【００４６】
本発明による特異性結合メンバは、フィブロネクチンＥＤ−Ｂへの結合に関し、本明細書に記載のｓｃＦｖ又は抗体と競合するものであることがある。複数の結合メンバ間の競合は、生体外で容易に分析されることがある。例えば、報告者の特異性分子を一つの結合メンバ（これは、識別されていない他の結合メンバの存在下に検出され得る）と識別して、同一エピトープ又はオーバーラップしているエピトープと結合する特異性結合メンバを同定し得るようにすることによって、容易に分析されることがある。
【００４７】
本発明による特異性結合メンバは、特異性結合メンバをそれのエピトープに結合させる又は結合するがままにしておく過程を含む方法で使用することがある。結合は、哺乳動物（例えば、ヒト、又はマウス等のげっ歯動物）に特異性結合メンバを投与した結果として生じることがある。
【００４８】
本発明は、腫瘍に対する診断薬として使用するための、上記のように特異性結合メンバを使用する方法を提供する。以下に記載する動物をモデルとした実験的証拠によって、本発明による結合メンバは生体内位置決定を行う上で有効であることが示される。
【００４９】
本発明による好ましい特異性結合メンバには、ヒト・腫瘍に結合するもの（例えば、クリオスタット分節で、浸潤性の脈管形成性現象型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を示すもの）；胚腫瘍に結合するもの（例えば、クリオスタット分節で）が含まれる。結合は、免疫細胞化学による染色法によって証明されることがある。
【００５０】
好ましい具体例において、特異性結合メンバは、テナシン、細胞外マトリックス蛋白質には結合しない、又は有意には結合しない。
【００５１】
もう一つの好ましい具体例において、特異性結合メンバは、正常なヒト皮膚（例えば、クリオスタット分節で、及び／又は免疫細胞化学による染色法を用いて実証されるように）には結合しない、又は有意には結合しない。
【００５２】
本発明による特異性結合メンバの更なる具体例は、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、卵巣、子宮、膀胱、膵臓、副腎、骨格筋、心臓、肺、甲状腺及び脳から選ばれる一種以上の正常組織には結合しない、又は有意には結合しない（例えば、クリオスタット分節で、及び／又は免疫細胞化学による染色法を用いて実証されるように）。
【００５３】
ＥＤ−Ｂのための特異性結合メンバは、生体内の標的剤（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として使用されることがある。この標的剤は、フィブロネクチンＥＤ−Ｂを表現する 腫瘍又はフィブロネクチンＥＤ−Ｂと結合した腫瘍の存在又は位置を特異的に実証するのに使用されることがある。それは、造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として使用されることがある。本発明は、フィブロネクチンＥＤ−Ｂ表現を表現する、又はフィブロネクチンＥＤ−Ｂ表現と結合した細胞又は腫瘍の存在を決定する方法を提供する。この方法は、供給された特異性結合メンバに細胞を接触させ、次いで、その細胞に対する特異性結合メンバの結合を決定する過程を含む。その方法は、本体から除去された細胞の試験サンプルについて、生体内又は生体外で行われることがある。
【００５４】
細胞サンプルに関する抗体の反応性は、あらゆる適切な手段によって決定されることがある。個々のリポーター分子を用いて識別することも可能である。そのリポーター分子は、直接的又は間接的に検出可能な、好ましくは測定可能な信号を発生することがある。リポーター分子の連結は、直接的又は間接的、共有結合的（例えば、ペプチド結合による）、或いは非共有結合的であることがある。ペプチド結合による連結は、抗体とリポーター分子とをコード化する遺伝子融合の組換え表現の結果として行われることがある。
【００５５】
一つの好ましい態様は、スペクトル的に分離された吸収特性又は放出特性を有する個々の蛍光色素、蛍光物質又はレーザー色素と、各抗体との共有結合によることがある。適した蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、及びテキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）が含まれる。適した色素産生色素には、ジアミノベンジジンが含まれる。
【００５６】
他のリポーターには、着色され、磁性若しくは常磁性であるラテックス・ビーズ（ｌａｔｅｘ ｂｅａｄｓ）等の粒状物質又は高分子コロイド粒子；及び直接的又は間接的に検出可能な信号を発生して、可視的に観察することが可能であり、電子化により検出することが可能であり、さもなければ記録することが可能である生物活性剤又は化学的活性剤が含まれる。これらの分子は、例えば、顕色若しくは変色し又は電気特性を変化させる反応に、触媒作用を及ぼす酵素であってもよい。これらは、分子的に励起され、エネルギー状態間における電子遷移が特徴的なスペクトル吸収又はスペクトル発光を生じることがある。これらには、バイオセンサーと連結して使用される化学的構成要素（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）が含まれる。ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジン、及びアルカリリン酸分解酵素の検出システムが採用されることがある。
【００５７】
結合を決定する態様は、本発明の特徴ではなく、当業者は、彼等の好み及び通常の知識に従って、適切な態様を選ぶことができる。
【００５８】
個々の抗体−リポーター連結によって発生する信号は、細胞サンプル中における、関連する抗体結合の定量的な絶対データ又は相対データを得るのに使用されることがある（標準及び試験）。加えて、プロピジウムヨウ化物（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）等の一般的核染料は、サンプル中の全細胞の個体数を数えるのに使用されることがある。１２５Ｉ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ等の放射性ヌクレオチドが抗体に付着したとき、もし、その抗体が正常組織よりむしろ腫瘍の中に優先的に局在化していれば、腫瘍組織中の放射性ラベルの存在は、ガンマカメラを使用して、検知し定量化し得る。得られる腫瘍像の質（ｑｕａｌｉｔｙ）は、信号対雑音比に直接相関している。
【００５９】
抗体は、新たに血管が新生した腫瘍を追跡するための診断剤として利用されることがある。また、抗体は、細胞毒剤を運ぶため又は新たな血管内の凝固を引き起こすために、（例えば、変性された形で）採用されることもある。かくして、成長している腫瘍に対する酸素及び栄養素の補給を断って、腫瘍治療の間接的形態を形成する。
【００６０】
本発明は、治療試薬として使用するための、上述の特異性結合メンバの使用方法をも提供する。そのとき、その特異性結合メンバは、例えば、融合蛋白として結合され、化合され又は設計されて、作用因子機能が与えられる。本発明の特異性結合メンバは、重要な抗体を表現する腫瘍又はその抗体と結合した腫瘍に至る毒素、放射能、Ｔ細胞、キラー細胞又は他の分子を標的とするのに使用される。
【００６１】
従って、本発明の更なる面は、与えられた特異性結合メンバを投与することから成る処置方法；そのような特異性結合メンバから成る薬剤組成物；及び投与のための薬剤の製造過程において（例えば、薬学的に許容できる賦形剤を用いて特異性結合メンバを調製することから成る、薬剤組成物又は医薬品組成物の製法において）、特異性結合メンバを使用する方法を提供する。
【００６２】
本発明によると、提供される組成物は、個体に投与されることがある。投与は、「治療的に有効な量」であるのが好ましい。これは、患者に効果が現れるのに十分な量である。そのような効果は、少なくとも一つの症状の少なくとも回復であることがある。実際の投与量と、投与の割合及び時間−クール（ｃｏｕｒｓｅ）とは、治療されているものの性質（ｎａｔｕｒｅ）及び激しさ（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）に依存する。投与量の決定等の治療の処方箋は、一般の診療医及び他の医師の責任による。抗体の適切な投与量は、当業において周知である。非特許文献３９及び４０を参照。
【００６３】
組成物は、単独で又は他の治療法と組合わせ、治療される容態によるが、同時に又は逐次的に投与することがある。
【００６４】
本発明による薬剤組成物、及び本発明により使用するための薬剤組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、キャリア、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の物質を含有することがある。そのような物質は、非毒性であるべきであり、また、有効成分の効能を妨げてはいけない。キャリア又は他の物質の正確な性質は、投与の経路に依存する。経路は、経口であることもあり、注射（例えば、静脈注射）によることもある。
【００６５】
経口のための薬剤組成物、錠剤、カプセル、粉末又は液体の形態であることがある。錠剤は、ゼラチン、佐剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）等の固形キャリアを含有することがある。液体の薬剤組成物は、一般的には、水、石油、動物油、植物油、鉱油合成油等の液体キャリアを含有する。生理的塩類溶液；ブドウ糖若しくは他のサッカライド溶液；又はエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコールが含まれることがある。
【００６６】
静脈注射剤、又は苦痛の位置での注射剤のためには、有効成分は、非経口的に許容される水溶液の形態であろう。この水溶液は、発熱因子を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射剤、リンガー液、乳酸加リンガー液等の等張性媒体を使用して、適切な溶液をうまく調製することができる。保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤は、必要に応じ、含有させてもよい。
【００６７】
本発明の特異性結合メンバは、核酸のコード化による表現によって造られることがある。特異性結合メンバの製法（この製法は、特異性結合メンバのために核酸をコード化することによる表現から成る）が本発明の一つの面であるように、与えられるあらゆる特異性結合メンバをコード化する核酸それ自体、本発明の一つの面である。表現は、適切な条件下、核酸を含有する組換えホスト細胞を培養することによって、都合よく達成されることがある。
【００６８】
核酸は、本明細書に記載の抗体抗原結合ドメインのあらゆるアミノ酸配列、又は機能的に同等のあらゆる形態をコード化することがある。一種以上のヌクレオチドの添加、置換、削除又は挿入によって、ヌクレオチド・レベルでの変化が生じることがある。この変化は、遺伝子コードの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）に依存し、アミノ酸レベルに反映されるかも知れないし、反映されないかも知れない。
【００６９】
異なるホスト細胞の一形態でのポリペプチドのクローン化及び表現のためのシステムは、周知である。適切なホスト細胞には、細菌系、哺乳動物の細胞系、酵母菌系及びバクロウィルス系が含まれる。非相同のポリペプチドを表現するために、当該技術において入手可能な哺乳動物・細胞系には、チャイニーズハムスターの子房細胞、ヒーラー細胞、ベビーハムスターの腎臓細胞、及びその他多数が含まれる。通常の好ましい細菌ホストは、大腸菌である。
【００７０】
大腸菌等の原核細胞中の抗体断片及び抗体の表現は、当業ではうまく確立されている。報告としては、例えば非特許文献４１を参照。培養における真核細胞中の表現もまた、特異性結合メンバを製造するための一つの選択肢として（最近の報告を参照（例えば、非特許文献４２及び４３）、当業者は入手することができる。
【００７１】
適切な調節配列；プロモーター配列；ターミネーター配列；ポリアデニル化配列；エンハンサー配列；マーカー遺伝子；及び適切な他の配列を含有する適切なベクターを選択することができる、又は組み立てることができる。ベクターは、適切な、プラスミド、ウィルス性のもの（例えば、ファージ）又はファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）であることがある。更なる詳細については、例えば、非特許文献４４を参照。核酸を操作するための多数の技術及び実験記録（例えば、核酸構成体の調製；突然変異生成；配列すること；細胞中へのＤＮＡの導入と遺伝子表現；及び蛋白の分析、に関するもの）は、非特許文献４５に詳細に記載されている。サンブルック等の開示内容、及びオスベル等の開示内容は、言及することによって本明細書に取り入れる。
【００７２】
本発明の更なる面によると、本明細書に開示される核酸を含有するホスト細胞が提供される。また、更なる面によると、そのような核酸をホスト細胞の中に導入することを含む方法が提供される。この導入のためには、利用可能なあらゆる技術が採用されることがある。真核細胞のための適切な技術には、リン酸カルシウムのトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，移入）；ＤＥＡＥ−デキストラン；エレクトロポレーション；リポソーム媒介（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）トランスフェクション；及びレトロウィルス又は他のウィルス（例えば、ワクシニア、若しくは昆虫細胞に対するバクロウィルス）を用いたトランスダクションが含まれることがある。細菌細胞のための適切な技術には、塩化カルシウム転換；エレクトロポレーション；及びバクテリオファージを用いたトランスフェクションが含まれることがある。
【００７３】
導入によって、核酸からの表現が生じる又は許容される（例えば、遺伝子の表現のための条件下、ホスト細胞が培養される）結果となることがある。
【００７４】
一つの具体例によると、本発明の核酸は、ホスト細胞のゲノム（例えば、染色体）の中に組込まれる。組込みは、標準的技術に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列の封入（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）によって促進されることがある。
【００７５】
特異性結合メンバが生成された後、その特異性結合メンバは、検討された通り、例えば、本明細書に開示される方法のあらゆるもの（例えば、特異性結合メンバの他に、そのメンバの細胞への結合を決定するための一種以上の試薬を有するキット（ｋｉｔ）等の、薬剤生成物又は診断薬生成物の調製）において使用されることがある。
【００７６】
本発明及び具体例の更なる面は、当業者には明白であろう。本発明が十分に理解されるべく、次の諸例を単なる例証として提供するが、これに限定されるものではない。次の諸図面が参考となる。
【００７７】
図１は、ｓｃＦｖ ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２のＶＨ並びにＶＬの、整列したアミノ酸配列を示す。図１ａはＶＨ配列を示し、図１ｂはＶＬ配列を示す。ＣＤＲｓ（１、２及び３）を示す。両方のｓｃＦｖへの最も相同のヒト・胚芽細胞系列ＶＨは、ＶＨ３科のＤＰ４７分節である。両方のクローンのＶＬ分節はＤＰＬ６、ｓｃＦｖライブラリを造るのに使用される軽鎖である（非特許文献３０）。二つのクローンを相互に識別する残基は、下線が引いてある。
【００７８】
図２：図２Ａは、ヒトＦＮサブユニットのドメイン構造のモデルを示す。ＦＮ−プレ−ｍＲＮＡの交互スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）による、ＩＩＩＣＳ、ＥＤ−Ａ及びＥＤ−Ｂの変異領域を示す。この図はまた、ＥＤ−Ｂを含有する主要サーモリシン消化生成物の他に、内部相同をも示す（非特許文献８）。図２Ｂは、プラスマの４〜１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ＷＩ３８ＶＡ；それらのクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色済みサーモリシン消化生成物；並びに、ＢＣ−１、ＩＳＴ−６、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２で調べた免疫ブロット分析を示す。ＦＮの１μｇ／ｍｇ（レーン３）及び１０μｇ／ｍｇ（レーン４）でサーモリシンを使用した、不消化（レーン１）及び消化済みプラスマＦＮ。ＦＮの１μｇ／ｍｇ（レーン５）、５μｇ／ｍｇ（レーン６）及び１０μｇ／ｍｇ（レーン７）でサーモリシンを使用した、不消化（レーン２）及び消化済みＷＩ３８ＶＡ ＦＮ。右側の番号は、図２Ａに示される主要サーモリシン消化生成物を示す。左側の値は、キロドルトン（ｋＤ）での分子量基準（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を示す。
【００７９】
図３：図３Ａは、大腸菌に表現された融合蛋白及び組換え蛋白の中に含有されるＦＮＩＩＩ型繰返し配列；これら蛋白とＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２との反応性；並びに、これら蛋白とｍＡｂｓ ＢＣ−１及びＩＳＴ−６との反応性を示す。図３Ｂは、クーマシーブルー染色済みゲル；及び、ＣＧＳ−１、ＣＧＳ−２、ＢＣ−１、ＩＳＴ−６で調べた免疫ブロット分析を示す。レーンの番号は、図の上部のペプチド構造の番号と一致する。左側の値は、ｋＤでの分子量基準を示す。
【００８０】
図４： マウスの赤外線イメージャー；タングステン・ハロゲンランプを備えた、黒色の非蛍光性箱と；ＣＹ７赤外線蛍光物質に対して特異的な励起・放出フィルターと；コンピュータ制御の８−ビット単色ＣＣＤ−カメラとから成る、標的実験のために使用したマウス・イメージャー（ｉｍａｇｅｒ）。
【００８１】
図５：Ｂ−ＦＮに向けられた単量体のｓｃＦｃ（ＣＧＳ−１）及び二量体のｓｃＦｃ（ＣＧＳ−１）２を用いて、蛍光によって標識化された抗体断片を、標的としてのＦ９ネズミの奇形癌に向けられている。リゾチームに対して結合特異性を有する二量体ｓｃＦｃ（Ｄ１．３）２は、ネガティブ対照として使用した。
【００８２】
図６：Ｂ−ＦＮの同一エピトープに向けられた、親和性成熟のｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）及び低結合性ｓｃＦｖ（２８ＳＩ）を使用して、蛍光によって標識化された抗体断片が、Ｆ９ネズミの奇形癌に向けられている。標的化は、結像を部分的に覆い隠す黒色外皮によって４８時間覆われた、大きい腫瘍（約０．６ｇ）でも、小さい腫瘍（約０．２ｇ）でも検出された。
【００８３】
本明細書に記載の全資料は、言及することによってここに取り入れる。
【実施例】
【００８４】
諸例の目録
例１・・・ヒトＦＮのＥＤ−Ｂドメインに特異的なヒトｓｃＦｖの分離。
例２・・・ヒトＦＮのＥＤ−Ｂドメインに特異的なヒトｓｃＦｖの親和性成熟。
例３・・・ＥＤ−Ｂ含有フィブロネクチンに対する親和性成熟済みｓｃＦｖの特異性。
例４・・・ヒト及びマウスの腫瘍分節を免疫細胞化学的に染色する上で、親和性成熟済み抗ＥＤ−Ｂ ｓｃＦｖを使用する方法。
例５・・・ヒト腫瘍を生体内で標的化する上で、親和性成熟済み抗ＥＤ−Ｂ ｓｃＦｖを使用する方法。
例６・・・ヌードマウスに異種組織移植されたＦ９ネズミの奇形癌の標的化。
【００８５】
例１・・・ヒトＦＮのＥＤ−Ｂドメインに特異的なヒトｓｃＦｖの分離
ヒトｓｃＦｖファージ・ライブラリ（非特許文献３０）は、組換え抗体の選択のために使用した。ＥＤ−Ｂのイソ型の二つの異なる形態は、選択のための抗原の供給源として使用し、両方とも、イソ型は組換えヒト・蛋白であった。
【００８６】
ＩＩＩ型の繰返し２−１１（Ｂ−）及び２−１１（Ｂ＋）を含有する組換えＦＮペプチドは、大腸菌中に表現された。
【００８７】
クローンｐＦＨ１５４からのＦＮ ｃＤＮＡ（非特許文献２０）、λＦ１０及びλＦ２０（非特許文献１３）を使用して、組み立てられた。ベース（ｂａｓｅｓ）２２２９〜４７８７の中に広がるｃＤＮＡ構成体（非特許文献２０）は、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのＱＩＡ表現キットを用いて、ベクターｐＱＥ−３／５の中に挿入された（チャトワース，ＣＡ）。組換え体ＦＮ−ＩＩＩ ２−１１（Ｂ−）及び（Ｂ＋）は、セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂに結合したｍＡｂ ３Ｅ３（非特許文献４６）を使用した免疫親和性クロマトグラフィによって精製された。ＩＩＩ型相同繰返し７Ｂ８９、７８９、ＥＤ−Ｂ及びＦＮ−６を含有する組換えＦＮ断片を調製するためのＤＮＡ断片は、テンプレートとして、クローンＦＮ２−１１（Ｂ＋）及びＦＮ２−１１（Ｂ−）からのｃＤＮＡを使用しながら、Ｕ１ｔＭａ ＤＮＡポリメラーゼを使用したポリメラーゼ鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＰＣＲ）の増幅（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって生成された。プライマーは、ＱＩＡ表現キット（キアゲン）を使用して、ｐＱＥ−１２の中にＰＣＲ生成物がクローン化するように設計された。これらは、実質的に大腸菌の中に転換され、表現された。全ｃＤＮＡクローンは、シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）２．０ＤＮＡ配列キット（ＵＳＢ）を使用して配列された。
【００８８】
組換え蛋白は、製造者の使用説明書（キアゲン）に従い、ＦＮ断片のカルボキシ末端のヘキサヒスチジン標識を使用して、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によって精製した。ＥＤ−Ｂ−βＧａｌ融合蛋白は、ＥＤ−Ｂ ｃＤＮＡをλｇｔ１１バクテリオファージ・ベクターの中にクローン化して、クローンλＥＤ−Ｂを与えることによって調製された。（ＥＤ−Ｂ配列の一部を含有する）クローンλｃｈＦＮ６０は、クローン化されたニワトリ・ＦＮ ｐｃｈＦＮ６０（ノートン（Ｎｏｒｔｏｎ）等，１９８７）からの融合蛋白として誘導された。
【００８９】
ヒト・ｓｃＦｖファージライブラリを選択するために、３ラウンドのパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）が、二つの異なる組換え抗原（７Ｂ８９及びＥＤ−Ｂ）の各々に対して行われた。これら抗原は両方とも、ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸塩緩衝剤、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中の５０μｇ／ｍｌで、一晩、免疫チューブ（ナンク（Ｎｕｎｃ）；Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）の上にコーティングされた。第一抗原は、組換えＦＮ断片７Ｂ８９（この中で、ＥＤ−Ｂドメインは、隣接するＩＩＩ型相同繰返しによって、側面が接触する。）であり、これは、一晩、４℃でコーティングされた。使用された第二抗原は、カルボキシ末端のヘキサヒスチジン標識を有する組換えＥＤ−Ｂ（非特許文献８）であった。この蛋白は、リシン残基を含有していないので、第一アミノ酸の末端アミノ基は、サイト特異的な（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）共有結合による、反応性ＥＬＳＡプレートへのＥＤ−Ｂの固定に利用できる（ナンク（Ｎｕｎｃ）；コバリンク（Ｃｏｖａｌｉｎｋ）。コーティングは、一晩、室温で行った。
【００９０】
３ラウンドのパニングの後、溶離されたファージは、ＨＢ２１５１大腸菌細胞の中に感染させ、記載した通りにプレートした（非特許文献３０）。選択の各ラウンドの後、９５のアンピシリン−抵抗性単一コロニーをスクリーニングし、ＥＬＩＳＡによって抗原特異性ｓｃＦｖを同定した。パニングのために使用した抗体上に最も高いＥＬＩＳＡ信号を与えたクローンは、更なる分析のため、及び親和性成熟のために選定した。これらのクローンはまた、例４に一層詳しく記載される免疫細胞化学的染色によって、多種多様の膠芽腫及び胸部腫瘍の切断面に特異的な染色を与えることも実証された。
【００９１】
例２・・・ヒトＦＮのＥＤ−Ｂドメインに特異的なヒトｓｃＦｖの親和性成熟
（７Ｂ８９と共に選択した）クローン３５ＧＥ及び（ＥＤ−Ｂドメインのみと共に選択した）２８ＳＩは、親和性成熟のための候補抗体として選定した。親和性を改善するための手段として軽鎖を多種産生すべく、我々は、次いで、２０６＝６．４×１０７の潜在的配列の多様性という条件で、縮重したオリゴヌクレオチド及びＰＣＲを使用しながら、軽鎖ＣＤＲ３の中央の６個の残基（ＤＳＳＧＮＨ）をランダム化することに基づき（図１）、単純な親和性成熟の方策を調べた。（重鎖ＣＤＲ３に沿った）この領域は、抗原結合部位の中央に配置されている（パドラン（Ｐａｄｌａｎ），１９９４）。我々は、また、その選択を支配する静電気の影響の可能性を回避すべく、６個の残基がセリンへ伸びる直前に、アルギニン残基を変異させた。
【００９２】
「親」ｓｃＦｖ断片を表現する単一細胞コロニーからのプラスミドは、プライマー ＬＭＢ３（５’ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ３’）及びＣＤＲ３−６−ＶＬ−ＦＯＲ（５’ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＧＡＡ ＴＡＣ ＣＡＣ ＭＮＮ ＭＮＮ ＭＮＮ ＭＮＮ ＭＮＮ ＭＮＮ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＴ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ３’）（９４Ｃ［１’］−５５Ｃ［１’］−７２Ｃ［１’３０”］、２５サイクル）を用いて増幅されるＰＣＲであった（緩衝剤及び条件については、非特許文献４７を参照）。得られた生成物は、（オリジナルｓｃＦｖ遺伝子を含有するプラスミドの痕跡を除去するため）ゲル精製し、次いで、プライマー ＬＭＢ３及びＪＩ−Ｎｏｔ−ＦＯＲ（５’ ＡＴＴ ＧＣＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＧＣＣ ＴＡＧ ＧＡＣ ＧＧＴ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ３’）（９４Ｃ［１’］−５５Ｃ［１’］−７２Ｃ［１’３０”］、２５サイクル）を用いて、第二増幅段階のためのテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ，鋳型）として使用した。アガロース・ゲル上に正確な分子量の単結合として伝わる粗ＰＣＲ生成物は、スピン結合（Ｓｐｉｎ−Ｂｉｎｄ）（ＦＭＣ，ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ），ＭＥ，ＵＳＡ）を用いて、Ｎｃｏｌ／Ｎｏｔｌで二重消化され（ｄｏｕｂｌｅ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ）結さつされて（ｌｉｇａｔｅｄ）、ゲル精製されたＮｃｏｌ／Ｎｏｔｌ消化済みファージミドｐＨＥＮ１になる（非特許文献４８）ＰＣＲ混合物から直接精製した。このｐＨＥＮ１は、単消化済みベクターから二重消化済みベクターを分離するのを促進するためにダミーのＮｃｏｌ／Ｎｏｔ１挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）を含有する。このベクターは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（チャッツワース（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ），ＣＡ，米国）のプラスミド・マキシプレ・キット（ｍａｘｉ−ｐｒｅ ｋｉｔ）で調製した。消化済みプラスミド及び挿入物の約５μｇを、結さつ混合物（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ）中で使用した。
【００９３】
結さつ混合物はフェノールで一回抽出し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２５：１）で一回抽出し、次いで、キャリアとしてグリコーゲンを用いてエタノール沈降（ボーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ），Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）させ、次いで、高速真空で乾燥させた。ペレットは、水２０μｌ中に再び懸濁させ、次いで、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）のＴＧ１大腸菌細胞（非特許文献４９）中でエレクトロポレーションさせた（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ）。我々は、グリセロールのストックを使用するときは、形質転換細胞１０９／μｇのタイター（ｔｉｔｒｅ）を有するエレクトロコンピテント細胞を典型的に使用した。或いは、新たに調製したエレクトロコンピテントを有する形質転換細胞１０１０／μｇ）のタイター（ｔｉｔｒｅ）を有するエレクトロコンピテント細胞を典型的に使用した。これによって、本明細書に概説する手順により、１０７を越えるクローンが産生された。
【００９４】
次いで、成熟ライブラリは、ニッシム・ライブラリ（非特許文献３０）に関し、ファージ粒子を産生すべく処理した。このファージ粒子は、抗原として７Ｂ８９（１０μｇ／ｍｌ）を使用している免疫チューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ）上の選定１ラウンドのために使用し、次いで、動的選定（ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）（非特許文献５０）の１ラウンドを行った。この選定過程は、選定の第一ラウンドからのミルク−ＰＢＳ（２％ＭＰＢＳ）中で５分間、ビオチニル化７Ｂ８９（１０ｎＭ）をファージ懸濁液（約１０１２ｔ．ｕ．）で培養し、次いで、非ビオチニル化７Ｂ８９（１μＭ）を添加し、次いで、３０分間、競合を続行させることによって行った。次いで、２％ＭＰＢＳ中に予ブロックされた（ｐｒｅｂｌｏｃｋｅｄ）、ストレプトアビジンでコーティングした動力ビード（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（Ｄｙｎａｌ：Ｍ４８０）１００μｌを、反応混合物に添加し、２分間混合し、次いで、磁石上で捕獲し、次いで、（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）とＰＢＳとで交互に１０回洗浄した。ファージは、トリエチルアミン０．５ｍｌ、１００ｍＭを用いてビードから溶離した。次いで、この溶液は、０．２５ｍｌ、１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４で中和し、次いで、ＨＢ２１５１細胞（非特許文献３０）を急激に成長させて感染させるのに使用した。９５のアンピシリン−抵抗性単一コロニーは、ｓｃＦＶ含有の上澄み液（非特許文献３０）を生成するのに使用した。この上澄み液は、最良のバインダーを同定すべく、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学及びＢＩＡコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）によってスクリーニングを行った。次いで、この上澄み液は、ｐＤＮ２６８表現ベクター（ネリ（Ｎｅｒｉ）等，１９９６）のＳｆｉｌ／Ｎｏｔｌサイトの間でサブクローン化した。このベクターは、ＳｃＦＶのＣ−末端に、リン酸化が可能な標識、ＦＬＡＧエピトープ及びヘキサヒスチジン標識を付加する。
【００９５】
ｐＤＮ２６８中でサブクローン化した関連抗体の単クローンは、アンピシリン１００ｍｇ／ｌ及びグルコース０．１％を含有する２ｘＴＹ中、３７℃で成長した。細胞培養が、ＯＤ６００＝０．８に到達したとき、ＩＰＴＧを最終濃度がｍＭになるまで添加し、成長は３０℃で１６〜２０時間の間続けた。遠心分離（ＧＳ−３ Ｓｏｒｖａｌｌ ｒｏｔｅｒ，７０００ｒｐｍ、３０分間）を行った後、上澄み液を瀘過し、濃縮し、次いで、ミニセッテ（フィルトロン）接線流れ装置（Ｍｉｎｉｓｅｔｔｅ（Ｆｉｌｔｒｏｎ）ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、負荷緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（リン酸塩５０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ ５００ｍＭ、イミダゾール２０ｍＭ）の中で交換した。得られた溶液は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（キアゲン）の上に負荷させ、負荷緩衝液５０ｍｌで洗浄し、次いで、溶離緩衝液（リン酸塩５０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ ５００ｍＭ、イミダゾール２０ｍＭ）で溶離した。精製した抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ），１９７０）によって分析し、４℃のＰＢＳに対して透析した。多価ｓｃＦｖ断片は、結合活性効果に基づき、ＢＩＡコア上で人工的に優れた結合を示すことがあるということが知られている（非特許文献３０及び５１）ので、精製済みｓｃＦｖ製剤は、Ｓ−７５コラム搭載のＦＰＬＣ装置（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用い、ゲル濾過によって更に処理した。ＦＰＬＣ−精製済み単量体断片の抗体濃度は、分光測定器によって、ｓｃＦｖ溶液１ｍｇ／ｍｌについて１．４ユニットの２８０ｎｍでの吸光度を想定して、決定した。
【００９６】
ＰＢＳにおける０．１〜１μＭの範囲の種々の濃度での、一価のｓｃＦｖの結合を、ＢＩＡコア機器（ファルマシア・バイオセンサー）上で、次の抗原を使用しながら測定した。（ｉ）ストレプトアビジンをコーティングしたチツプ上に固定された、ビオチニル化済み組換えＦＮ断片７Ｂ８９の１０００レゾナンス・ユニット（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔｓ）（ＲＵ）。これは、ｓｃＦｖの２５０ＲＵによって特異的に結合する；（ｉｉ）Ｎ−末端アミノ基で化学的に固定された、組換えＥＤ−Ｂの２００ＲＵ。これは、ｓｃＦｖの６００ＲＵによって特異的に結合する；（ｉｉｉ）ＥＤ−Ｂに富むフィブロネクチンＷＩ３８ＶＡの３５００ＲＵ（例３を参照）。これは、ｓｃＦｖの１５０ＲＵによって特異的に結合する。データの動的分析は、製造者インストラクションに従って行った。抗体含有上澄み液のＢＩＡコア定性分析に基づいて、各ｓｃＦｖクローンの一つの親和性成熟済みバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）、即ち、７８Ｂ９断片を有する選定からのクローンＣＧＳ−１、及びＥＤ−Ｂ組換えＦＮ断片を有する選定からのＣＧＳ−２を選定した。会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、ｓｃＦｖとオリジナル・クローン２８ＳＩ両方の、計算による平衡解離定数（Ｋｄ）と共に、表１に示す。クローンのＣＧＳ−１もＣＧＳ−２も、ナノモルの範囲のＫｄを有するが、クローンＣＧＳ−２は、センサー・チップ上で試験した３種の蛋白全てに関し、（１１０ｎＭから改善されて）１ｎＭのＫｄを与え（表１）、その親クローンを越えて最良の改善を示した。この改善は、主として、単量体抗体の製剤で測定された（示さず）一層緩慢な動的解離定数（１０−４Ｓ−１以下）による。
【００９７】
成熟方法は、大部分に共通しているように思われ、マルトース結合蛋白；シトクロムＣ；マウス・エンドグリン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）の細胞外ドメイン（Ｄ．Ｎ．，Ｌ．
Ｗｙｄｅｒ，Ｒ．Ｋｌｅｍｅｎｚ）；サイトメガロウィルス（Ａ．Ｐ．，Ｇ．
Ｎｅｒｉ，Ｒ．Ｂｏｔｔｉ，Ｐ．Ｎ．）；核腫瘍マーカーＨＭＧＩ−Ｃ蛋白（Ａ．Ｐ．，Ｐ．Ｓｏｌｄａｎｉ，Ｖ．Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ，Ｐ．Ｎ．）；及び卵巣腫瘍マーカーの胎盤アルカリホスファターゼ（Ｄｅｏｎａｒａｉｎ及びＡ．Ａ．Ｅｐｅｎｅｔｏｓ）に対する親和性改善済み抗体を産生した。従って、この成熟方法は、少なくとも他の成熟方法（非特許文献５２及び５３）と同程度に有効であるように思え、しかも、非常に大きいファージ抗体ライブラリ（非特許文献５４及び５５）から誘導されたものと類似の親和性を有する抗体を産生する。
【００９８】
親和性成熟済みクローンＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２は、ヒト・胚芽細胞系列の抗体Ｖ遺伝子のデータベース（Ｖ−ＢＡＳＥ）に配列し整列し、次いで、マクベクター（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）ソフトウェアを用いて翻訳した。両クローンのＶＨ遺伝子は、ヒト・胚芽細胞系列ＤＰ４７（ＶＨ３）にほとんど相同であり、各クローンの他に、異なるＶＨ ＣＤＲ３配列を有した（図１）。両クローンのＶＬ遺伝子は、ニッシム等に記載のヒト・合成ｓｃＦｖ全範囲（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の構造に使用されるＤＰＬ１６胚芽細胞系列であった。ＶＬ ＣＤＲ３配列は、任意の順序に配列された残基の６個から４個が、互いに相違した（図１ｂ）。
【００９９】
【表１】
【０１００】
例３・・・ＥＤ−Ｂ含有フィブロネクチンに対する親和性成熟済みｓｃＦｖｓの特異性
二つの親和性成熟済みｓｃＦｖｓ、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２の免疫反応性は、初期にＥＬＩＳＡによって評価し、次いで、ｍＡｂ ＢＣ−１、及びｍＡｂＩＳＴ−６と直接比較した。ｍＡｂ ＢＣ−１は、Ｂ−ＦＮイソ型を認識し、ｍＡｂ ＩＳＴ−６は、ＥＤ−Ｂを欠いているＦＮイソ型を認識するのみである（非特許文献１３及び２６）。これらｍＡｂの特性は、以前報告された（非特許文献１３及び２６）。その後、サーモリシン処理によって誘導されたＦＮ断片と組換え融合蛋白との大きいパネルを使用して、特異性の正確な分析が行われた。
【０１０１】
ＥＬＩＳＡ及び免疫ブロット分析のために使用した抗原は、次の通りに調製した。ＦＮは、ヒト・プラスマ；及び以前報告されたＷＩ３８ＶＡ１３細胞系列の調整済み媒体（非特許文献８）から精製した。精製したＦＮは、非特許文献１３によって報告されたように、サーモリシン（プロテアーゼ Ｘ型；シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて消化した。天然のＦＮ １１０ｋＤ（Ｂ−）及び天然のＦＮ １２０ｋＤ（Ｂ＋）の断片（図２参照）は、以前報告されたように（非特許文献５６）、ＦＮ消化物から精製した。テナシン−Ｃの大きいイソ型は、非特許文献５７によって報告されたように精製した。組換え蛋白は、例１に記載の通りに表現し、精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン・ブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）は、非特許文献１３によって報告されたように、実施した。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡに使用された全抗原は、ＰＢＳで５０〜１００μｇ／ｍｌに希釈し、免疫−プレート・ウェル（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｐｌａｔｅｗｅｌｌｓ）（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）の上に４℃で一晩コーティングした。非結合抗原は、ＰＢＳで除去し、次いで、プレートは、ウシ由来血清アルブミン（ＢＳＡ）３％（ｗ／ｖ）含有するＰＢＳを用いて、３７℃で２時間の間、ブロックした。この後、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。次いで、抗体は、３７℃で１．５時間の間、結合させた：ｓｃＦｖｓは、標識配列（ＦＬＡＧ標識に対してはｍＡｂ Ｍ２［Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ］；又はｍｙｃ標識に対しては９Ｅ１０［ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ］）に向けられた抗血清を用い、前もって温置した。試験を行った対照抗体は、ｍＡｂｓ ＢＣ−１及びＩＳＴ−６であった。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、プレートは、ヤギの抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏ−ＳＰＡ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌａｎ，イタリア）を（ＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡで）１：２０００に希釈し、ビオチニル化して、３７℃で１時間の間、培養した。洗浄を繰り返し、次いで、ストレプトアビジンービオチニル化したアルカリ・ホスファターゼ複合体（Ｂｉｏ−ＳＰＡ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌａｎ，イタリア）を、３７℃で１時間の間、添加した（ＭｇＣｌ２ ２ｍＭを含有するＰＢＳＴに１：８００で希釈された）。反応は、ジエタノールアミン１０％、ｐＨ９．８中で、ホスファターゼ基質の錠剤（Ｓｉｇｍａ）を使用して進め、光学的濃度は、４０５ｎｍで読み取った。結果は、次の表２に示す。
【０１０３】
【表２】
【０１０４】
ｓｃＦｖ及び単クローン抗体と、フィブロネクチン誘導抗原との免疫反応性は、ＥＬＩＳＡによって測定した。測定値は、バックグランド信号を減じた後の、４０５ｎｍで測定したＯＤを示す。データは、４回の実験の平均であり、これらデータは、最大１０％の標準偏差を示す。
【０１０５】
実験に用いたフィブロネクチンの異なる形態の素性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、次の通りである：即ち、プラスマ ＦＮ＝ヒト・プラスマフィブロネクチン；ＷＩ３８−ＶＡ ＦＮ：ＳＶ４Ｏ−転換済み線維芽細胞の上澄み液からのプラスマフィブロネクチン（非特許文献８）；ｎ１１０ｋＤ＝ＥＤ−Ｂを含有しない、ＦＮドメイン４で処理したサーモリシン；ｎ１２０ｋＤ＝ＥＤ−Ｂを含有した、ＦＮドメイン４で処理したサーモリシン；ｒｅｃＦＮ７Ｂ８９＝隣接するＩＩＩ型ＦＮ相同繰り返しによって側面に位置するＥＤ−Ｂドメイン；ｒｅｃＦＮ７８９＝ＥＤ−Ｂドメインを有する、ＩＩＩ型ＦＮ相同の繰り返し；ｒｅｃＥＤ−Ｂ＝組換えＥＤ−Ｂ単独；ｒｅｃＦＮ６＝組換えＦＮドメイン６。
【０１０６】
ＣＧＳ−１もＣＧＳ−２も、ＥＤ−Ｂ配列を含有する、天然のＦＮ断片の全て又は組換えＦＮ断片の全ての他に、組換えＥＤ−Ｂペプチドを認識した。しかし、それらは、ＥＤ−Ｂを欠くＦＮ断片のいずれにも結合しなかった。また、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２は、テナシン（これは、１５個のＩＩＩ型相同繰り返しを含む：非特許文献５８）；及びプラスマ ＦＮ（これは、サーモリシン消化生成物（非特許文献８）中に、検出可能なレベルのＥＤ−Ｂ配列を含有していない）と反応しなかった。対照的に、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２は、ＳＶ４０−転換済み細胞系列ＷＩ３８ＶＡから精製したＦＮと強く反応した。精製済みＦＮ及びその細胞系列から調製した全ＲＮＡを使用した、サーモリシン消化及びＳ１ヌクレアーゼの実験によって示されるように（非特許文献８；Ｂｏｒｓｉ等，１９９２）、この細胞からのＦＮ分子約７０〜９０％には、ＥＤ−Ｂが含まれる。可溶性組換えＥＤ−Ｂを使用して、ＷＩ３８ＶＡ細胞上のＦに対するＣＧＳ−１及び／又はＣＧＳ−２の結合を抑制することによって、ＦＮのＥＤ−Ｂ成分に対するｓｃＦｖの特異性を更に実証した（データは示していない）。
【０１０７】
データによると、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２のみが、ＥＤ−Ｂドメインを含有するＦＮ誘導体と特異的に反応することが確認される。それらは双方とも、組換えＥＤ−Ｂの場合を除き、ｍＡｂ ＢＣ−１と同様の反応性を示す。組換えＥＤ−Ｂは、ＢＣ−１によって認識されていない。ｍＡｂ対照に関連して得られたＥＬＩＳＡ信号の強度は、ＥＤ−Ｂ含有抗原に対する二つのｓｃＦｖの高い特異性を反映する。
【０１０８】
ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２の特異性は、プラスマ及びＷＩ３８ＶＡの細胞からのＦＮと、それらのサーモリシン消化物とを使用しながら、免疫ブロット分析により調べた。サーモリシン消化によると、ＷＩ３８ＶＡ細胞からのＦＮ（その大部分はＥＤ−Ｂを含有する）は、（ＥＤ−Ｂを含有する）１２０ｋＤ断片と、ＥＤ−Ｂを欠く僅かな１１０ｋＤ断片とを生成する（図２Ａ；非特許文献８）。１２０ｋＤドメインの更なる消化は、二つの断片：即ち、そのカルボキシ末端にほぼ完全なＥＤ−Ｂ配列を有する８５ｋＤ断片；及び３５ｋＤ配列を生成する（図２Ａ；非特許文献８）。
【０１０９】
図２Ｂの左側には、免疫ブロット分析によって分析した蛋白断片のクーマシー染色済みゲルがある。プラスマＦＮ（レーン１）と、蛋白のサーモリシン消化物（１１０ｋＤ蛋白を含有するレーン３，消化済み１１０ｋＤ蛋白を含有するレーン４）とは、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２によって認識されなかった。対照的に、ＷＩ３８ＶＡ細胞からの、ＥＤ−Ｂに富むＦＮは、元のまま及びサーモリシン消化を増大した後の両方において、両方のｓｃＦｖ断片によって認識された。ＣＧＳ−１によって特異的に認識し得た、最も小さいＦＮ−誘導断片は、（ほとんど全てがＩＩＩ型の繰り返し２〜１１による）１２０ｋＤ蛋白であり、一方、ＣＧＳ−２は、ＥＤ−ＢのＮ−末端の他に、繰り返し２〜７による８５ｋＤ断片を認識し得た（図２Ｂ；非特許文献８）。これらの結果は、二つのｓｃＦｖが反応性であり、ＥＤ−Ｂ配列内のエピトープを識別することを示す。８５ｋＤドメインに対するＣＧＳ−２の結合は、このクローンのためのエピトープがＥＤ−Ｂのアミノ末端に存在することを示す。対照的に、１２０ｋＤドメインが８５ｋＤへ消化されるときの、ＣＧＳ−１の結合の損失は、それによって、ＥＤ−Ｂ分子のカルボキシ末端の方に向いて一層多く配置されたエピトープが認識されることを実証する。
【０１１０】
ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２の優れた特異性は、ＥＤ−Ｂ配列を持った又は持たない融合蛋白及び組換えＦＮ断片を用いた免疫ブロット分析によって更に研究した。ＦＮ融合蛋白は、非特許文献１３によって記述されている通りに調製した。これらの実験結果は図３に示す；ヒト・ＦＮのドメインの構造の概略図関連は、非特許文献２６を参照。得られた結合のプルフィルによると、精製済みＦＮと蛋白分解の分割生成物とに関する免疫ブロット分析及びＥＬＩＳＡによって従来見いだされていたものが、本質的に確認される。即ち、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２は、ＥＤ−Ｂ含有ＦＮ断片（レーン２及び４）と強い反応性があったが、ＥＤ−Ｂを欠くＦＮ配列（レーン１及び３）には反応性を全く示さなかった。ＣＧＳ−１は、ヒト・ＥＤ−Ｂ融合蛋白（レーン５）ともニワトリ・ＥＤ−Ｂ融合蛋白（レーン６）とも反応しなかったが、ＣＧＳ−２は、両方の断片と強く反応した（図３）。この結果は、ＣＧＳ−１によって認識されたＥＤ−Ｂ含有ＦＮ中のエピトープの、ある立体配座上の制約を反映しているのかも知れない。例えば、エピトープが、変性に敏感であり、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分断される（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）とき、正確には現出されず、ニトロセルロース等の固形支持体に転写されるということは起こり得る。
【０１１１】
まとめて考えると、これらの結果によると、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２は、互いに異なり且つＥＤ−Ｂ構造（これは、ｍＡｂ ＢＣ−１によって認識される）と異なる領域で、ＥＤ−Ｂ含有ＦＮに強く且つ特異的に結合することが実証される。
【０１１２】
例４・・・ヒト及びマウスの腫瘍を免疫細胞化学的に染色する上で親和性成熟済み抗ＥＤ−Ｂ ｓｃＦｖｓを使用する方法
ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２はいずれも、種々の正常で新生のヒト・組織中に、ＥＤ−Ｂ含有ＦＮ分子を免疫局在化する（ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｓｅ）ために使用されてきた。Ｂ−ＦＮイソ型は、皮膚創傷の治癒の間、マクロファージ及び線維芽細胞の中に表現されることが知られていたので、正常組織には皮膚が選ばれた（非特許文献８及び非特許文献５９）。選定された二つのヒト・腫瘍は、従来、抗フィブロネクチンｍＡｂで染色する特異性のために分析されてきた。この腫瘍の血管内の内皮細胞は、Ｂ−ＦＮイソ型の表現を含む血管形成過程が増加して、高度に増殖性の状態にあるため、膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）の多形は詳細に研究されてきた（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ等，１９９４）。更に、正常で増殖性で新生のヒト・胸組織の多様のパネルを用いた研究によって、血管形成とＢ−ＦＮ表現の間の相互関係に関する一層の証拠が提供された（非特許文献６０）。
【０１１３】
本明細書に記載の諸実験のために、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２の免疫組織化学的染色は、ｍＡｂ ＢＣ−１（これは、Ｂ−ＦＮイソ型を認識する）の免疫組織化学的染色；及び既知の全ＦＮイソ型変異体（ＩＳＴ−４）に反応する、又はＥＤ−Ｂを欠くＦＮイソ型（ＩＳＴ−６）のみに反応することが知られている他のｍＡｂの免疫組織化学的染色と比較した。これら対照抗体の全ての特徴は、従来報告されている（非特許文献１３及び２６）。
【０１１４】
正常で新生の組織は、手術中に採取されるサンプルから得た。組織の調製及び固定が、ＦＮ含有分子の正確で感度のよい検出のために重要であることは既に実証されていた（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ等，１９９４）。免疫組織化学のために、５μｍ厚さのクリオスタット分節（ｃｒｙｏｓｔａｔ ｓｅｃｔｉｏｎｓ）は、空気乾燥され、冷アセトン中に１０分間、固定された。免疫染色は、ストレプトアビジン−ビオチン・アルカリ・ホスファターゼ複合体染色キット（Ｂｉｏ−ＳＰＡ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌａｎ，イタリア）と、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−リン酸塩と、ファースト・レッド（Ｆａｓｔ Ｒｅｄ）ＴＲ（Ｓｉｇｍａ）とを用いて行った。ギル・ヘマトキシリン（Ｇｉｌｌ’ｓ ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）は、対比染色として使用した。次いで、従来、「Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ等，１９９４」によって報告されているように、グリセロゲル（ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ）（Ｄａｋｅ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）中に固定した。実験で特異性を更に分析するため、組織のポジティブ染色（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）が得られる所で、抗体を組換えＥＤ−Ｂドメインで培養し、次いで、従来記述された通りに検出することによって、ＥＤ−Ｂに対する特異性を実証した。
【０１１５】
これらの全実験結果によって、ＣＧＳ−１もＣＧＳ−２も、ｍＡｂ ＢＣ−１と同一の組織構造と反応することが分かった。ＣＧＳ−１、ＣＧＳ−２及びＢＣ−１を用い、皮膚で得られた染色パターンは、真皮（ｄｅｒｍｉｓ）中に表現されたＦＮからのＥＤ−Ｂは存在しないことを反映している。浸潤性管の癌分節の染色において、ＣＧＳ−１、ＣＧＳ−２及びＢＣ−１は、制限された染色分布を示し、新生細胞と基質（ｓｔｒｏｍａ）との間の境界に限定した。このことは、全ＦＮは腫瘍基質全体に均一に分布しているが、Ｂ−ＦＮの表現は、ある領域に限定されていて、しかも、従来、ｍＡｂ ＢＣ−１を用いて（非特許文献６０）、浸潤性管の癌の中に（ケースの９５％で）うまく局在化させられたのはこれらの領域であるという事実と一致する。
【０１１６】
膠芽腫の多様な癌のＢＣ−１を染色することにおける従来の発見が、確認された。非特許文献２４は、糸球体様脈管構造の染色の典型的なパターンを観察していたが、我々の実験では、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２は、定性的には同一の結果を与えることが分かった。
【０１１７】
しかし、ＣＧＳ−１とＣＧＳ−２とｍＡｂ ＢＣ−１との間には、重要な相違が存在する。即ち、ＢＣ−１は厳密にヒト・特異性であるのに、二つのヒト・ｓｃＦｖはニワトリ及びマウスのＢ−ＦＮの両方に結合することが実証された。ＣＧＳ−２はニワトリ・胚芽と反応し（データは示さず）、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２はマウス・腫瘍と反応した。
【０１１８】
マウスＦ９の奇形癌の分節上の血管構造のＣＧＳ−１染色も示した。対照的に、試験を行った全ての正常マウス組織（肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、卵巣、子宮、膀胱、膵臓、副腎、骨格筋、心臓、肺、甲状腺及び脳）は、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２とネガティブ染色反応を示した（データは示さず）。そのＦ９奇形癌分節中で染色された構造は、組換えＥＤ−Ｂドメインを使用して、得られた染色を完全に抑制することによって、ＥＤ−Ｂ特異性であることが分かった（データは示さず）。
【０１１９】
例５・・・ヒト腫瘍を生体内で標的化する上で、親和性成熟済み抗ＥＤ−Ｂ ｓｃＦｖを使用する方法
ヒト・メラノーマの細胞系列ＳＫＭＥＬ−２８は、一つの側腹部の皮下に１×１０７の細胞／マウスを注射することにより、６〜１０週間の老齢ヌードマウス（Ｂａｌｂ−ｃ又はＭＦ−１；Ｈａｒｌａｎ ＵＫ）中の異種組織移植済み腫瘍を成長させるのに使用した。腫瘍を有するマウスは、腫瘍が直径約１ｃｍに達したとき、ＰＢＳのｓｃＦｖ１−Ｃｙ１溶液１ｍｇ／ｍｌの１００μｌを用いて、尾部の静脈に注射した。
【０１２０】
ＣＹ７による組換え抗体の標識化は、ＰＢＳ（１ｍｇ／ｍｌ）の抗体溶液１ｍ１に「１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ＝９．３」１００μｌと、「ＣＹ７−ｂｉｓ−Ｏｓｕ（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｃａｔ．Ｎｒ．ＰＡ１７０００；ＤＭＳＯ中２ｍｇ／ｍｌ）」２００μｌを添加することによって達成した。室温で、３０分後、「１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ＝７．４」１００μｌをその混合物に添加し、次いで、標識化された抗体は、ＰＢＳと平衡状態に置いた、使い捨てＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，米国）を使用して、未反応染料から分離した。溶離した生の抗体断片は、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−１０チューブ（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，米国）を用いて、約１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。達成された標識化比は、通常、１モルのＣＹ７：１モルの抗体に近い。これは、抗体溶液１ｍｇ／ｍｌは２８０ｎｍで１．４単位の吸収を与え、７４７ｎｍでのＣＹ７のモル吸光係数は２００，０００（Ｍ−１ｃｍ−１）であると想定し、また、２８０ｎｍでのＣＹ７吸収を無視し、ｌｃｍキュベットを用い分光器によって評価した。標識化した後の、抗体サンプルの免疫反応性は、抗原カラム上の親和性−クロマトグラフ法によるバンド−シフト（Ｎｅｒｉ等，１９９６）によって；又はＢＩＡコア分析によって確認した。マウスは、酸素／フルオロエタンの混合物の吸入による麻酔の下、一定時間間隔で、ホーム・ビルト（ｈｏｍｅ−ｂｕｉｌｔ）マウス−イメージャー（ｍｏｕｓｅ−ｉｍａｇｅｒ）を用いてイメージした。結果の再現性を確実なものとすべく、各サンプルに対し、２〜８匹の動物を研究した。操作手順は、Ｄ．ネリ（Ｎｅｒｉ）に発行されたＵＫプロジェクト・ライセンス（Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｃｅｎｃｅ）「腫瘍の標的化（Ｔｕｍｏｕｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」（ＵＫ ＰＰＬ ８０／１０５６）に従って行った。
【０１２１】
非特許文献６１の光検出装置の改造型として、赤外線蛍光物質ＣＹ７が使用できる赤外線マウス・イメージャーを造った。赤外線照射を選定し、一層優れた組織貫通を得た。ＣＹ７（＞７６ｎｍ）の蛍光は、人には見えず、コンピューター制御のＣＣＤ−カメラを使用する必要がある。このマウス・イメージャーは、黒に塗装され、光が入らないようにした箱を有した。この箱には、１００Ｗタングステン・ハロゲン・ランプを備え、ＣＹ７（クローマ社（Ｃｈｒｏｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ，米国；６７３〜７４８ｎｍ）のために特別に設計した直径５０ｍｍの励起フィルターを備えた。得られた照射線は、５×１０ｃｍの大きさの領域全体に渡り、ほぼ均一であった。マウスはイメージングのためにその中に置いた。蛍光は、Ｃ−マウント・レンズと５０ｍｍ放出フィルター（クローマ社，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ，米国；７６５〜８５５ｎｍ）を備えた、８ビットのモノクロのプルニックス（Ｐｕｌｎｉｘ）ＣＣＤカメラによって検出し、次いで、イメージ（Ｉｍａｇｅ）ＤＯＫ装置（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｌｔｄ．，リバプール、ＵＫ）に接続した。この装置は、フレーム・グラバー（ｆｒａｍｅ−ｇｒａｂｂｅｒ）と、配列イメージを捕獲し集積化を行うためのソフトウェアとを備えたコンピューターから成る。それぞれ５０ｍｓで捕捉された配列のイメージは、典型的には、平均化プロセスに使用した。これの番号は、一つの動物の一連の画像では一定に保持し、異なる時点で標的化されている腫瘍が直接比較できるようにした。次いで、ＴＩＦＦフォーマットでの画像は、プログラム・グラフィック・コンバーターを使用して、ＰＩＣＴファイルに変換し、次いで、パワー・マッキントッシュ７１００／６６コンピューターを用いて、精巧に仕上げた。
【０１２２】
この装置のデザインの概略図は、図４に示す。
【０１２３】
これらの実験によって、両方のｓｃＦｖは、巨視的レベルに視覚化されたとき、腫瘍に局在化していることが実証された。
【０１２４】
二つの抗ＥＤＢ ｓｃＦｖを用いて、成長している腫瘍の新生血管形成を標的化する巨視的実証は、次のように詳述される。
【０１２５】
一つの側腹部に、異種組織移植されたＳＫＭＥＬ−２８のヒト・メラノーマ、又はマウスＦ９奇形癌を有する、ヌードマウス及び／又はＳＣＩＤマウスは、ＦＬＡＧ標識（ｔａｇ）を有する標識化されていないｓｃＦｖ断片、又はビオチニル化されたｓｃＦｖ断片を用いて注射した。
【０１２６】
マウスは、注射の後、異なる時点で犠牲となり、腫瘍及び非腫瘍の分節を得た。次いで、これら分節は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｋｏｄａｋ，１８１）又はストレプトアビジン−ベースの検出試薬を使用し、従来の免疫組織化学プロトコールで染色した。最適標的化は、一般に注射の１２時間後に得られた。ＣＧＳ１もＣＧＳ２も、異種組織移植されたヒト・腫瘍、及びマウスの奇形癌の両方の新生血管に結合することが実証された。
【０１２７】
例６・・・ヌードマウスに異種組織移植されたＦ９ネズミの奇形癌の標的化
我々は、ネズミＦ９の奇形癌細胞４×１０６を皮下注射することによって、ヌードマウスの側腹部で固形腫瘍を成長させた。この腫瘍は、マウス内で非常に急速に成長し、注射後、約１週間で１ｃｍに達し、高度に血管が新生した。抗体の標的化をイメージすべく、我々は、非特許文献６１の光検出手順の改造型を使用した。この改造型は、上記に詳述する通り（図４参照）、種々の時点でイメージされた同一動物に関する腫瘍標的化及び抗体の排除を可能にする。
【０１２８】
腫瘍に標的化し、抗体の検出を容易にするため、表現ベクターＰＧＩＮ５０のＳｆｉｌ／Ｎｏｔｌ部位における抗体をサブクローン化することによって、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−１）、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）及び抗リゾチーム ｓｃＦｖ（Ｄ１．３）（非特許文献６２）に、ホモ二量体化標識（非特許文献６３）を追加した。このベクターは、ｐＤ２６８（非特許文献６４）の誘導体である。この中で、標識のＨｉｓ６配列は、配列：ＧＧＣ ＬＴＤ ＴＬＱ ＡＦＴ ＤＱＬ ＥＤＥ ＫＳＡ ＬＱＴ ＥＩＡ ＨＬＬ ＫＥＫ ＥＫＬ ＥＦＩ ＬＡＡ Ｈによって置換される。これは、共有の抗体断片のホモ二量体化のためのＦｏｓ蛋白の両親媒性のらせんと、システイン残基とを含む（Ａｂａｔｅ等，１９９０）。完全な共有の二量体化は、達成されなかった。抗体断片約３０〜５０％は、共有結合した二量体から成った。
【０１２９】
抗体断片は、雌鶏、卵のリゾチーム（Ｄ１．３）又は７Ｂ８９（抗ＥＤ−Ｂ抗体；Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ等，１９９６）をＣＮＢｒ活性化されたセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，米国）にカップリングすることによって得たカラムのアフィニティ・クロマトグラフィによって精製した。上澄み液は、アフィニティ支持体の上に供給し、次いで、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ＋０．５ＭＮａＣｌで洗浄し、次いで、１００ｍＭのＥｔ３Ｎで溶離した。次いで、抗体は、ＰＢＳに対して透析して分離した。
【０１３０】
抗体は上述の通り、標識化し、次いで、ＰＢＳの１ｍｇ／ｍｌ ｓｃＦｖ１−Ｃｙ７１溶液１００μｌで、腫瘍を有するマウスの尾部の静脈に注射した。このとき、腫瘍は、直径約１ｃｍに達していた。
【０１３１】
図５に示す通り、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−１）は、３日間以下の間、腫瘍上に局在化した（この期間に腫瘍からの急速なクリアランスもあったが）。しかし、大たい骨の、ある染色も存在した。ＣＧＳ−１の腫瘍への標的化の実施は、Ｃ末端に、システイン残基を含有する両親媒性のらせんを導入して、抗体の二量体化（非特許文献６３）を促進することによって、顕著に改善された。実際、二量体のｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）２の局在化は、２４〜７２時間、有意には減少しないように思えた。対照的に、ネガティブ対照（二量体の抗体ｓｃＦｖ（Ｄ１．３）２、抗リゾチーム抗体）は、急速なクリアランスを示し、腫瘍又は大たい骨の検出可能な局在化は全く見られなかった。
【０１３２】
ｓｃＦｖ（２８ＳＩ）は、６時間で腫瘍ターゲッティングをわずかに示した（図示せず）。しかし、２４時間又はそれ以降において、全く検出できなかった（図６）。親和性の成熟は、ターゲッティングを著しく改善することとなった。このように、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）は、単量体（図６）としてであろうと、二量体（図示せず）としてであろうと、小さいＦ９腫瘍及び大きいＦ９腫瘍を有効に標的化した。２日後、腫瘍１ｇ当り抗体の注射投与量％は、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）単量体では約２、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）二量体では３〜４であることが分かった。腫瘍に運ばれたｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）による投与量もまた、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−１）によるものより大きく（図５及び６）、それらの各々親和性と相互関係がある（表１）。しかし、ｓｃＦｖ（２８ＳＩ）もｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）も、蛋白質分割しないように思え、また肝臓の取り込みが大きいことを示す（図６）ところが、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−１）抗体は、有意に一層安定であり、肝臓の取り込みが一層小さいことを示す（図５）。
【０１３３】
【表３】
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
【表５】
【０１３６】
【表６】
【０１３７】
【表７】
【０１３８】
【表８】
【０１３９】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１ａ】ｓｃＦｖ ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２のＶＨの、整列したアミノ酸配列であって、ＣＤＲｓ（１、２及び３）を示す。
【図１ｂ】ｓｃＦｖ ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２のＶＬの、整列したアミノ酸配列であって、ＣＤＲｓ（１、２及び３）を示す。
【図２Ａ】ヒトＦＮサブユニットのドメイン構造のモデルを示す。
【図２Ｂ】プラスマの４〜１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ＷＩ３８ＶＡ；それらのクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色済みサーモリシン消化生成物；並びに、ＢＣ−１、ＩＳＴ−６、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２で調べた免疫ブロット分析を示す。
【図３Ａ】大腸菌に表現された融合蛋白及び組換え蛋白の中に含有されるＦＮＩＩＩ型繰返し配列；これら蛋白とＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２との反応性；並びに、これら蛋白とｍＡｂｓ ＢＣ−１及びＩＳＴ−６との反応性を示す。
【図３Ｂ】クーマシーブルー染色済みゲル；及び、ＣＧＳ−１、ＣＧＳ−２、ＢＣ−１、ＩＳＴ−６で調べた免疫ブロット分析を示す。
【図４】マウスの赤外線イメージャー；タングステン・ハロゲンランプを備えた、黒色の非蛍光性箱と；ＣＹ７赤外線蛍光物質に対して特異的な励起・放出フィルターと；コンピュータ制御の８−ビット単色ＣＣＤ−カメラとから成る、標的実験のために使用したマウス・イメージャー（ｉｍａｇｅｒ）である。
【図５】Ｂ−ＦＮに向けられた単量体のｓｃＦｃ（ＣＧＳ−１）及び二量体のｓｃＦｃ（ＣＧＳ−１）２を用いて、蛍光によって標識化された抗体断片を、標的としてのＦ９ネズミの奇形癌に向けられている。
【図６】Ｂ−ＦＮの同一エピトープに向けられた、親和性成熟のｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）及び低結合性ｓｃＦｖ（２８ＳＩ）を使用して、蛍光によって標識化された抗体断片が、Ｆ９ネズミの奇形癌に向けられている。
【技術分野】
【０００１】
背景
本発明は、フィブロネクチン、ＥＤ−Ｂ（これはまた、免疫細胞学と生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍を標的にすることとの両方によって実証されている通り、成長している腫瘍の新生血管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）において滲出する）の胎児イソ型（ｆｏｅｔａｌ ｉｓｏｆｏｒｍ）のための特殊な結合剤に関する。本発明はまた、かかる特殊な結合剤に係る物質及び方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍治療の現行技術の大抵のものの第一の狙いは、腫瘍のできるだけ多くの構成細胞を殺すことにある。化学療法及び放射線療法を用いて経験してきた成功が限られているのは、治療の特殊性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，専門性）が比較的欠如していること、及び正常組織に及ぼす有毒性副作用の傾向があることと関係がある。腫瘍のための治療の選択性を改善し得る一つの方法は、結合タンパク質を通して、腫瘍へ物質（ａｇｅｎｔ，活性物質）を運ぶことである。この結合タンパク質は通常、腫瘍の表面上に滲出した標識抗原（ｍａｒｋｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ）のための特殊性を有する、抗体結合ドメイン（ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，結合領域）から成る。俗に「マジック弾（ｍａｇｉｃ ｂｕｌｌｅｔｓ）」と呼ばれている、標的にされた腫瘍のかかる形態は、げっ歯類（ｒｏｄｅｎｔｓ）からの単クローン性抗体（ｍＡｂｓ）によって、主に実証されてきた。ｍＡｂは、細胞表面上に滲出したいわゆる腫瘍関連抗原に対して特異性がある。そのようなｍＡｂは、細胞毒部分（例えば、毒素又は薬物）へ化学的に結合していても良いし、或いは組換え融合蛋白質として産生しても良い。ここに、ｍＡｂを記号化した遺伝子と毒素とは一緒に連結され、縦列に滲出される。
【０００３】
「マジック弾」のアプローチは、ヒト・癌の治療において重要であり有効であり、リンパ起始（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒｉｇｉｎ）の腫瘍を標的にする場合に最も注目されている（ここに、悪性細胞は循環中の治効量に最も影響を受けやすい）が、このアプローチには限界がある。しかし、固体腫瘍の治療は、全細胞塊の微小部分（腫瘍の最も外側の周辺の細胞が支配的である）のみが循環中の治療的免疫接合（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）にさらされるという点で、重大な臨床的問題を残している；これらの周辺標的は、腫瘍内部に対していわゆる「結合部障壁（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｂａｒｒｉｅｒ）」を形成する（非特許文献１）。腫瘍内部における組織の構造は、一般的に線維支質を有し、あまりにも稠密であり、腫瘍細胞に密に包み込まれているため、抗体の大きさ範囲の分子は浸透することができない。更に、腫瘍は、リンパ排液が欠如しているため、大きな間隙圧力を有することが知られている。腫瘍はまた、外因性分子の流入を妨げる。腫瘍内への治療薬の取込みに影響を及ぼす諸因子に関する最近の報告については、非特許文献２を参照。
【０００４】
腫瘍関連抗原を標的にすることによって固形腫瘍を治療することには明らかに限界があるものの、これらの腫瘍は、抗体を治療するために代替的な抗原を標的にするという共通の特徴を有するのである。一旦、腫瘍がある大きさを越えて成長したとき、腫瘍は一般的に、成長を支えるための十分な酸素と養分とを、独立した血液供給に依存する。もし、この血液供給を妨げるか、又は遮ることができるのなら、過程において、現実的に何千もの腫瘍細胞を餓死させることができる。腫瘍が成長するにつれて、腫瘍は、隣接した毛管内皮細胞に作用する脈管由来諸因子の別種の配列を生じさせ、それらを誘導して（ｉｎｄｕｃｉｎｇ）増殖し移動しながら、スウィッチを受けて脈管由来表現型になる。これらの新たに形成された血管の構造は、正常組織の秩序のある構造とは著しく対照的に、出口のない末端（ｂｌｉｎｄ ｅｎｄｉｎｇｓ）と漏出の増大に通じる穿孔とを有し、高度に崩壊している。血管形成の誘導は、ある細胞表面の抗原の表現のアップレギュレーション（ｕｐｒｅｇｌａｔｉｏｎ）によって成し遂げられ、それらの多くは正常組織の脈管構造に共通している。
【０００５】
腫瘍の新生血管形成に特有な抗原を識別することは、血管を標的にすることによる、固形腫瘍の一般的療法を開発する上での主要な限定因子（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）であった。本発明の主題である抗原は、かかる問題に直接向いている。
【０００６】
腫瘍が進行している間、周囲組織の細胞外マトリックスは、二つの主要過程、即ち、（１）正常組織の細胞外マトリックス成分のタンパク分解の低下、及び（２）腫瘍細胞と、腫瘍誘導された（ｔｕｍｏｕｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ）シトキンによって活性化された支質細胞とによる、細胞外マトリックス成分のドゥノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成によって、再構築される。これらの二つの過程は、安定な状態で、「腫瘍細胞外マトリックス（ｔｕｍｏｒａｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）」を生じさせる。この腫瘍細胞外マトリックスは、腫瘍の進行にとって一層適した環境を与え、しかも定性的かつ定量的に正常組織のそれと全く異なっている。このマトリックスの諸成分の中には、テナシン及びフィブロネクチン（ＦＮ）のイソ型が多量存在する。これらの蛋白質のイソ型としての記述（ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）から、それらの構造上の大きな異質性が認識される。この構造上の異質性は、転写レベル、転写後レベル及び翻訳後レベルでもたらされる。本発明の主題は、フィブロネクチンのイソ型の一種の、いわゆるＢ＋イソ型（Ｂ−ＦＮ）である。
【０００７】
フィブロネクチン（ＦＮ）は、細胞外マトリックス及び体液の多機能性高分子量の糖蛋白成分である。これらの成分は、正常細胞の定着（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ）及び維持、細胞移動、うっ血、血栓症、創傷の治癒、腫瘍原性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）転換等、多くの異なる生物過程に関与している（報告に関しては、非特許文献３〜６；ハイネス，１９９０；非特許文献７を参照）。ＦＮｓの構造上の相違は、ＦＮ一次転写物の三つの領域（ＥＤ−Ａ、ＥＤ−Ｂ及びＩＩＩＣＳ）によってもたらされ（非特許文献５及び８）、少なくとも２０種の異なるイソ型が生じる。これらイソ型の幾つかは、腫瘍及び正常組織では区別して表現される。ＦＮ−プレ−ｍＲＮＡのスプライシングパターンは、進行中のものに特異的な組織態様に調整されるだけではなく、移動済み細胞及び悪性疾患の中で調整解除されることが知られている（非特許文献８〜１６）。実際、ＥＤ−Ａ、ＥＤ−Ｂ及びＩＩＩＣＳの配列を有するＦＮイソ型は、大部分、正常細胞中よりも移動済み細胞及び悪性腫瘍細胞の中に表現される。特に、ＥＤ−Ｂ配列（Ｂ＋イソ型）を有するＦＮイソ型は、創傷治癒の間だけではなく、胎児組織及び腫瘍組織の中に高度に表現される。しかし、成人の正常組織中では表現が制限される（非特許文献１３及び１７〜２３）。Ｂ＋ＦＮの分子は、成熟した血管中では検知できないが、正常な発育（例えば、子宮内膜の発育）、病の進行（例えば、糖尿病性の網膜障害の）及び腫瘍の進行の状態にある脈管由来の血管中では、アップレギュレーションとなる（非特許文献２４）。
【０００８】
ＥＤ−Ｂ配列は、単エクソンによってコード化された完全型ＩＩＩ−相同（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）の繰り返しであり、９１種のアミノ酸から成る。細胞型特異性結合部を有する、代替的スプライシングされたＩＩＩＣＳイソ型とは対照的に、Ａ＋イソ型及びＢ＋イソ型の生物機能は、まだ推測の域を出ていない（非特許文献２５）。
【０００９】
Ｂ＋イソ型の存在自体は、腫瘍誘導された新生抗原を構成する。しかし、加えるに、ＥＤ−Ｂ表現は、ＩＩＩ型の繰り返し７以内の、正常に潜在する（ｎｏｒｍａｌｌｙ ｃｒｙｐｔｉｃ）抗原を露出する（前のＥＤ−Ｂ）；このエピトープはＦＮ分子欠乏ＥＤ−Ｂの中に露出されないので、ＥＤ−Ｂ表現は直接的にも間接的にも新生抗原の表現を誘導することとなる。この潜在的抗原の部位は、ＢＣ−１と呼ばれる単クローン性抗体（ｍＡｂ）の標的を形成する（非特許文献２６）。このｍＡｂの特異性と生物諸特性は、特許文献１に記載されており、イギリス（ＵＫ），ソールズベリー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ），ポートンダウン（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ），動物細胞培養欧州共同体（ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に委託されている融合細胞腫（番号８８０４２１０１）から入手することができる。ｍＡｂは、成熟した血管内皮への交差反応性なしで、腫瘍の脈管由来の血管を一局部に止めるのに使用され成功してきており、抗体を使用して血管を標的にするためのＦＮイソ型の可能性を説明している。
【００１０】
しかし、ＢＣ−１ ｍＡｂの特異性に対する幾つかの注意点が残っている。ＢＣ−１がＢ＋イソ型を直接的に認識しないという事実により、幾つかの組織において、ＢＣ−１によって認識されるエピトープはＥＤ−Ｂが存在しなくても暴露され（ｕｎｍａｓｋｅｄ）、その結果、不要なＢＣ−１の交差反応性へ間接的に導き得るかどうかという疑問が生じた。また、ＢＣ−１は、ヒト・Ｂ＋イソ型には厳密に特異的であり、生物分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）及びＢＣ−１の腫瘍局在化に関する、動物の研究はできないということを意味する。Ｂ＋イソ型を有する組換え融合蛋白に対する多クローン性抗体は生成されてきた（非特許文献２７）が、それら抗体は、エピトープを暴露するためのＮ−グリカナーゼ（Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ）で処理されたＦＮと反応するのみである。
【００１１】
マウス・単クローン性抗体を使用する上での更なる一般的問題は、ヒト・抗マウス抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ＨＡＭＡ）の反応である（非特許文献２８及び２９）。ＨＡＭＡ反応は、治療量の減量に役立つ、投与済み抗体の中和から、アレルギー反応、血清病及び腎臓障害まで、ある範囲の効果を有する。
【００１２】
組換えＥＤ−Ｂと反応する多クローン性抗血清は確認されてきた（上記を参照）が、マウスの免疫化の結果として生じるＢＣ−１と同一の特異性を有するｍＡｂの分離は、一般的に困難であることが分かった。なぜなら、ヒト及びマウスのＥＤ−Ｂ蛋白は、ほぼ１００％の配列相同を示すからである。従って、ヒト・蛋白は、それへの免疫反応を備えていないマウスにとっては自己抗原であるように見えるかも知れない。実際、何十年にも渡るこの分野の徹底した研究において、ＥＤ−Ｂを直接的に認識するものは何もなく、単ｍＡｂのみがＢ＋ＦＮイソ型（ＢＣ−１）に対する間接的反応性を有するものとして認定されてきた。ＢＣ−１の特異性は、ＥＤ−Ｂ自体の部分のためというよりむしろ、潜在的エピトープのために、ＥＤ−Ｂの結果として暴露されるということは間違いなく意義がある。
ＥＤ−Ｂは、マウスＦＮが恐らく欠けていて、マウスの免疫系による「自己」と見られないものと思われる。
【００１３】
本発明は、以前使用されたものに対する代替的方法を使用して実現された。ここでは、フィブロネクチン又はＥＤ−Ｂによる従来の免疫化は必要でない：ＥＤ−Ｂイソ型に対する特異性を有する抗体は、線維状バクテリオファージの表面に表示される、ヒト・抗体の種々の領域のライブラリ（ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）から単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）として得られてきた（非特許文献３０及び特許文献２〜６をも参照）。
【００１４】
ＥＤ−Ｂを有する組換えＦＮ−断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）と、組換えＥＤ−Ｂ自体との両者の上に直接選択することにより、特異性ｓｃＦｖが分離され得ることを、我々は、抗体ファージライブラリ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ）を使用することによって見いだした。このとき、これら抗体は固形表面の上に被覆される（「パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」）。抗原のこれら同一源もまた、「二代雑種第二子世代（ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」のｓｃＦｖを生成するのに使用され成功し、「親和力成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」の過程で、親クローンに関する諸特性が改善されてきた。分離されたｓｃＦｖは、Ｎ−グリカナーゼで前処理をしないで、ヒト・ＦＮのＢ＋イソ型と強く且つ特異的に反応することを我々は見いだした。
【００１５】
抗腫瘍の適用において、本発明によって提供されるヒト・抗体抗原結合ドメインは、ＨＡＭＡ反応を受けないという利点を有する。また、本明細書中に例証される通り、これら結合ドメインは、生体外でも生体内でも、腫瘍組織の免疫組織化学分析において有用である。これらの用途及び他の用途は、本明細書中で更に論じられ、当業者には容易に理解できる。
【００１６】
術語
特異的結合メンバ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒ）
特異性結合メンバとは、相互に対して結合特異性を有する一対の分子のメンバをいう。特異性結合ペアメンバは、自然界で得られるが、全部又は一部を合成によって生成することができる。一対の分子の一つのメンバは、その表面上に、領域又はキャビティ（ｃａｖｉｔｙ，空洞）を有する。この領域又はキャビティは、その一対の分子の他のメンバに特異的に結合し、それ故に、その極性空隙機構に対して相補的である。このように、ペアメンバは相互に特異的に結合する特性を有する。特異性結合メンバのタイプの例は、抗原−抗体、ビオチンーアビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質である。
【００１７】
抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）
抗体とは、自然界に存在し、又は一部若しくは全部を合成によって生成される免疫グロブリンをいう。この術語には、結合ドメインを有するあらゆるポリペプチド又は蛋白質も含まれる。この結合ドメインは、抗体の結合ドメインであるか、又は抗体の結合ドメインと同種のものである。これらは、自然源から得ることができるが、一部又は全部を合成によって生成することができる。抗体の例は、免疫グロブリンのイソ型（ｉｓｏｔｙｐｅｓ）及びこれらイソ型の亜綱（ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ）；Ｆａｂ，ｓｃＦｖ，Ｆｖ，ｄＡｂ，Ｆｄ等の抗原結合ドメインから成る断片；並びにダイヤボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）である。
【００１８】
単クローン抗体及び他の抗体を利用し、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、原抗体の特異性を保持する、他の抗体又はキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）分子を生成することは可能である。そのような技法には、免疫グロブリンの不変領域又は不変領域プラス外郭構造に対する抗体の、免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコード化するＤＮＡを導入することを伴うこともある。例えば、特許文献７〜９を参照。抗体を生成する融合細胞腫又は他の細胞は、遺伝的変異（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又は他の変化を受けることもある。これらの変化によって、生成される諸抗体の結合特異性を変えても良いし変えなくても良い。
【００１９】
抗体は多くの方法によって変性することができるのであるから、用語「抗体」は、必要とされる特異性を持つ結合ドメインを有する、あらゆる特異性結合メンバ又は物質と解釈されるべきである。このように、この用語は、抗体断片、誘導体、機能的に同等の物、及び抗体の同族体を意味し、自然界で得られようと全部又は一部を合成によって得られようといずれにせよ、免疫グロブリン結合ドメインから成るあらゆるポリペプチドを含んでいる。それ故に、もう一つのポリペプチドに融合した、免疫グロブリン結合ドメイン又は同等物から成るキメラ分子が含有される。キメラ抗体のクローン化及び表現は、特許文献１０及び１１に記載されている。
【００２０】
抗体全体の断片は結合性抗原の機能を果たし得るということが示された。結合性断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１のドメインから成るＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１のドメインから成るＦｄ断片；（ｉｉｉ）単抗体のＶＬ及びＶＨのドメインから成るＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（非特許文献３１）；（ｖ）分離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、二つの連結したＦａｂ断片から成る二価の断片；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ここに、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、この二つのドメインを結合させて抗原結合部を形成させるペプチドリンカーによって連結される（非特許文献３２及び３３）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（特許文献１２）；並びに（ｉｘ）「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」、遺伝子融合によって構成される多価断片又は多重特異性断片（特許文献１３及び非特許文献３４）である。
【００２１】
ダイアボディはポリペプチドの多量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ）であり、各々ポリペプチドは、免疫グロブリンの軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ，Ｌ鎖）の結合性領域を含む第一ドメインと、免疫グロブリンの重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，Ｈ鎖）の結合性領域を含む第二ドメインとから成る。この二つのドメインは、（例えば、ペプチドリンカーによって）連結されているが、相互に結合して（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）抗原結合部を形成することはできない。抗原結合部は、多量体内の一つのポリペプチドから成る第一ドメインと、多量体内のもう一つのポリペプチドから成る第二ドメインとの結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によって形成される（特許文献１３）。
【００２２】
二重特異性抗体を使用する場合、これらは、従来の二重特異性抗体であっても良い。これらは、種々の方法で製造される（非特許文献３５）；例えば、化学的に調製又はハイブリッド融合細胞腫から調製することができる。或いは、これら二重特異性抗体は、上述の二重特異性抗体断片のいずれかであっても良い。完全な抗体よりむしろ、ｓｃＦｖ二量体又はダイヤボディを使用するのが好ましい場合もある。ダイヤボディ及びｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用し、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ，抗個特異的抗原）反応の影響を潜在的に減少させながら、Ｆｃ領域なしで構成し得る。二重特異性抗体の他の形態には、非特許文献３６に記載の単鎖「ヤーヌシンズ（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）」が含まれる。
【００２３】
二重特異性の完全抗体とは対照的に、二重特異性抗体のダイヤボディは、特に有用である場合もある。なぜなら、これらダイヤボディは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）中で容易に構築され表現されるからである。適切な結合特異性のダイヤボディ（及び抗体断片等の他の多くのポリペプチド）は、ライブラリからファージ表示（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）を使用しながら、容易に選択することができる（特許文献１３）。もし、ダイヤボディの一つの腕（ａｒｍ）が、例えば、抗原Ｘに向けられた特異性で一定に保持されるなら、そのとき、他方の腕は変化し、適切な特異性の抗体が選ばれる所にライブラリが造られる。
【００２４】
抗原結合性ドメイン
抗原結合性ドメインとは、抗原の一部又は全部に特異的に結合して相補的である領域から成る抗体の一部をいう。抗原が大きい所では、抗体はその抗原の特定の部分（この部分はエピトープと呼ばれる）に結合するだけであろう。抗原結合性ドメインは、一種以上の抗体可変ドメインによって供給されるだろう。抗原結合性ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とから成るのが好ましい。
【００２５】
特異性
特異性とは、特異性結合ペアの一方のメンバが、その特異性結合のパートナに比べて、他の分子に対するいかなる有意な結合性をも示さない状況をいう。この用語はまた、例えば、抗原のひとつのメンバによって運ばれる特定のエピトープに対して、抗原結合性ドメインが特異的である場合にも適用できる。この場合、抗原結合性ドメインを運ぶ特異性結合メンバは、そのエピトープを運ぶ種々の抗原に結合することができるだろう。
【００２６】
機能的同等変異体
機能的同等変異体とは、他の分子（親）とは構造的に相違しているが、幾つかの重要な相同を残しており、また、親分子の生物機能（例えば、特定の抗原又はエピトープと結合する能力）の少なくとも幾つかをも残している分子（変異体）をいう。変異体は、断片、誘導体又は突然変異体の形態で存在することがある。変異体、誘導体又は突然変異体は、一種以上のアミノ酸の付加、欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、置換若しくは挿入；又は他の分子の連結による親分子の変性によって得られることがある。これらの変化は、ヌクレオチド又は蛋白のレベルで行われることがある。例えば、コード化されたポリペプチドは、Ｆａｂ断片であることがある。このＦａｂ断片は、そのとき、もう一つの源からのＦｃ尾部に連結される。代替的には、酵素、フラワーセイン（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｉｎ）等のマーカーが連結されることがある。
【特許文献１】欧州特許第０，３４４，１３４Ｂ１号明細書
【特許文献２】国際公開第９２／０１０４７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９２／２０７９１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９３／０６２１３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９３／１１２３６号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９３／１９１７２号パンフレット
【特許文献７】欧州特許出願公開第１８４１８７号明細書
【特許文献８】英国特許出願公開第２１８８６３８号明細書
【特許文献９】欧州特許出願公開第２３９４００号明細書
【特許文献１０】欧州特許出願公開第０１２０６９４号明細書
【特許文献１１】欧州特許出願公開第０１２５０２３号明細書
【特許文献１２】国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号
【特許文献１３】国際公開第９４／１３８０４号パンフレット
【非特許文献１】Ｊｕｗｅｉｄら著、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９２年、５２巻、ｐ．５１４４〜５１５３
【非特許文献２】Ｊａｉｎ．Ｒ．著、Ｓｃｉ．Ａｍ．、１９９４年、２７１巻、ｐ．５８〜６５
【非特許文献３】Ａｌｉｔａｌｏら著、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８２年、３７巻、ｐ．１１１〜１５８
【非特許文献４】Ｙａｍａｄａ著、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８３年、５２巻、ｐ．７６１〜７９９
【非特許文献５】Ｈｙｎｅｓ著、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９８５年、ｌ巻、ｐ．６７〜９０
【非特許文献６】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ著、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８年、５７巻、ｐ．３７５〜４１３
【非特許文献７】Ｏｗｅｎｓら著、Ｏｘｆ．Ｓｕｒｖ．Ｅｕｃａｒｙｏｔ．Ｇｅｎｅｓ、１９８６年、３巻、ｐ．１４１〜１６０
【非特許文献８】Ｚａｒｄｉら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８７年、６巻、ｐ．２３３７〜２３４２
【非特許文献９】Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９８６年、１０３巻、ｐ．１６７１〜１６７７
【非特許文献１０】Ｂｏｒｓｉら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８７年、１０４巻、ｐ．５９５〜６００
【非特許文献１１】Ｖａｒｔｉｏら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８７年、８８巻、ｐ．４１９〜４３０
【非特許文献１２】Ｂａｒｏｎｅら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８９年、８巻、ｐ．１０７９〜１０８５
【非特許文献１３】Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９８９年、１０８巻、ｐ．１１３９〜１１４８
【非特許文献１４】Ｏｙａｍａら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９年、ｐ．１０３３１〜１０３３４
【非特許文献１５】Ｏｙａｍａら著、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９０年、５０巻、ｐ．１０７５〜１０７８
【非特許文献１６】Ｂｏｒｓｉら著、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、１９９２年、１９９巻、ｐ．９８〜１０５
【非特許文献１７】Ｎｏｒｔｏｎ及びＨｙｎｅｓ著、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８７年、７巻、ｐ．４２９７〜４３０７
【非特許文献１８】Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８７年、６巻、ｐ．２５７３〜２５８０
【非特許文献１９】Ｇｕｔｍａｎ及びＫｏｒｎｂｌｉｈｔｔ著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、１９８７年、８４巻、ｐ．７１７９〜７１８２
【非特許文献２０】Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８５年、４巻、ｐ．１７５５
【非特許文献２１】Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９８９年、１０９巻、ｐ．９０３〜９１４
【非特許文献２２】Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔら著、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９８９年、１０６巻、ｐ．３７５〜３８８
【非特許文献２３】Ｌａｉｔｉｎｅｎら著、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９１年、６４巻、ｐ．３７５〜３８８
【非特許文献２４】Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９４年、５９巻、ｐ．６１２〜６１８
【非特許文献２５】Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９８６年、１０３巻、ｐ．２６３７〜２６４７
【非特許文献２６】Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、ｐ．２４６８９〜２４６９２
【非特許文献２７】Ｐｅｔｅｒｓら著、Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９５年、３巻、ｐ．６７〜８９
【非特許文献２８】Ｓｃｈｒｏｆｆら著、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８５年、４５巻、ｐ．８７９〜８８５
【非特許文献２９】ＤｅＪａｇｅｒら著、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１９８８年、２９巻、ｐ．３７７
【非特許文献３０】Ｎｉｓｓｉｍら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９４年、１３巻、ｐ．６９２〜６９８
【非特許文献３１】Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら著、Ｎａｔｕｒｅ、１９８９年、３４１巻、ｐ．５４４〜５４６
【非特許文献３２】Ｂｉｒｄら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８年、２４２巻、ｐ．４２３〜４２６
【非特許文献３３】Ｈｕｓｔｏｎら著、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９８８年、８５巻、ｐ．５８７９〜５８８３
【非特許文献３４】Ｈｏｌｌｉｇｅｒら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３年、９０巻、ｐ．６４４４〜６４４８
【非特許文献３５】Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．著、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３年、４巻、ｐ．４４６〜４４９
【非特許文献３６】Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら著、Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９１年、１０巻、ｐ．３６５５〜３６５９
【非特許文献３７】Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ著、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１年、３４９巻、ｐ．２９３〜２９９
【非特許文献３８】Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ Ｉ．Ｍ．ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９２年、２２７巻、ｐ．７７６〜７９８
【非特許文献３９】Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ Ｊ．Ａ．ら著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９１年、４７巻、ｐ．６５９〜６６４
【非特許文献４０】Ｂａｇｓｈａｗｅ Ｋ．Ｄ．ら著、Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１９９１年、４巻、ｐ．９１５〜９２２
【非特許文献４１】Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９１年、９巻、ｐ．５４５〜５５１
【非特許文献４２】Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．著、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９３年、４巻、ｐ．５７３〜５７６
【非特許文献４３】Ｔｒｉｌｌ Ｊ．Ｊ．ら著、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９５年、６巻、ｐ．５５３〜５６０
【非特許文献４４】分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），実験マニュアル（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）：第２版，サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 出版
【非特許文献４５】分子生物学における短い実験記録（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版，オスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等編集，ジョン・ウィリー（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ）及びサンズ（Ｓｏｎｓ）、１９９２年
【非特許文献４６】Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒら著、Ｃｅｌｌ、１９８１年、２６巻、ｐ．２５９〜２６７
【非特許文献４７】Ｍａｒｋｓら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９１年、２２２巻、ｐ．５８１〜５９７
【非特許文献４８】Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９１年、１９巻、ｐ．４１３３〜４１３７
【非特許文献４９】Ｇｉｂｓｏｎ ＴＪ、博士論文、１９８４年、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ
【非特許文献５０】Ｈａｗｋｉｎｓら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９２年、２２６巻、ｐ．８８９〜８９６
【非特許文献５１】Ｃｒｏｔｈｅｒｓ及びＭｅｔｚｇｅｒ著、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７２年、９巻、ｐ．３４１〜３５７
【非特許文献５２】Ｍａｒｋｓら著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２年、１０巻、ｐ．７７９〜７８３
【非特許文献５３】Ｌｏｗら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９６年、２６０巻、ｐ．３５９〜３６８
【非特許文献５４】Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９４年、１３巻、ｐ．３２４５〜３２６０
【非特許文献５５】Ｖａｕｇｈａｎら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９６年、１４巻、ｐ．３０９〜３１４
【非特許文献５６】Ｂｏｒｓｉら著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９１年、１９２巻、ｐ．３７２〜３７９
【非特許文献５７】Ｓａｇｉｎａｔｉら著、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９２年、２０５巻、ｐ．５４５〜５４９
【非特許文献５８】Ｓｉｒｉら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９１年、１９巻、ｐ．５２５〜５３１
【非特許文献５９】Ｂｒｏｗｎら著、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９３年、１４２巻、ｐ．７９３〜８０１
【非特許文献６０】Ｋａｃｚｍａｒｅｋら著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９４年、５８巻、ｐ．１１〜１６
【非特許文献６１】Ｆｏｌｌｉら著、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９４年、５４巻、ｐ．２６４３〜２６４９
【非特許文献６２】ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．及びＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ）、１９９０年、”Ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ．”、３４８巻、ｐ．５５２〜５５４
【非特許文献６３】Ｐａｃｋら著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９３年、１１巻、ｐ．１２７１〜１２７７
【非特許文献６４】Ｎｅｒｉら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６年、１４巻、ｐ．３８５〜３９０
【非特許文献６５】Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版）
【非特許文献６６】Ｂｏｒｓｉら著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９２年、５２巻、ｐ．６８８〜６９２
【非特許文献６７】Ｊｏｎｓｓｏｎ著、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９１年、１１巻、ｐ．６２０〜６２７
【非特許文献６８】Ｎｅｒｉら著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９６年、２０巻、ｐ．７０８〜７１３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明によると、フィブロネクチン（ＦＮ）のＥＤ−Ｂ胎児ドメインに対して特異性のある特異性結合メンバが提供される。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明による特異性結合メンバは，ＥＤ−Ｂドメインに直接結合する。一つの具体例において、特異性結合メンバは、蛋白分解酵素サーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）でＦＮを処理した後、ＥＤ−Ｂを含有するＦＮの一つに、又はいかなるものにも、又は全部に結合する。更なる具体例において、特異性結合メンバは、ＩＩＩ型相同の繰返しを含有するＦＮの一つに、又はいかなるものにも、又は全部に結合する。これら繰返しには、ＥＤ−Ｂドメインが含まれる。既知のＦＮは、二つの論文（非特許文献１３及び２６）の中に確認される。「ＥＤ−Ｂを含有する全ＦＮ」への言及は、これらの論文中で、ＥＤ−Ｂを含有していると確認される全ＦＮへの言及として理解されても良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
特異性結合メンバは、ヒトＥＤ−Ｂと結合するのが好ましく、また、マウス、ラット及び／又はニワトリのような、他の少なくとも一種のＢ＋ＦＮと結合するのが好ましい。特異性結合ペアメンバは、ヒト・フィブロネクチンＥＤ−Ｂにも；動物モデル中のｓｂｂメンバのテスト及び分析が可能な、マウス・フィブロネクチンＥＤ−Ｂ等の非ヒト・フィブロネクチンＥＤ−Ｂにも結合し得るのが好ましい。
【００３０】
本発明による特異性結合ペアメンバは、本明細書のどこかで検討され公式に入手できる沈積済み抗体ＢＣ−１と競うことなく、フィブロネクチンＥＤ−Ｂに結合する。ＢＣ−１は、ヒトＢ＋イソ型に対してまさに特異的である。本発明による特異性結合ペアメンバは、ＢＣ−１と同一のエピトープには結合しない。
【００３１】
本発明による特異性結合メンバのＢ＋ＦＮへの結合は、ＥＤ−Ｂドメインによって抑制されることがある。
【００３２】
本発明の一つの面において、結合ドメインは、精製済み単量体として測定されるとき、ＥＤ−Ｂ ＦＮに対して６×１０−８Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００３３】
本発明の一つの面において、結合ドメインは、フィブロネクチンＥＤ−ＢをＮ−グリカナーゼ（Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ）で前処理しないで、フィブロネクチンＥＤ−Ｂと反応する（即ち、結合することができる）。
【００３４】
本発明による特異性結合ペアメンバは、分離体として、又は精製された形で、即ち、他の特異性結合ペアメンバ（例えば、抗体又は抗体断片）を含有していない製剤の状態、又はフィブロネクチンＥＤ−Ｂと結合することのできる他の特異性結合ペアメンバを含有していない状態で提供されることがある。本発明による特異性結合メンバは、実質的に純粋な形で提供されるのが好ましい。それらは、伝統的な融合細胞腫技術を使って得られた抗体と縛りつけるよりむしろ、単一クローンからのものという意味で『単クローン』であるのかも知れない。検討した通り、本発明による特異性結合ペアメンバは、バクテリオファージ表示技術（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び／又は組換えによる表現（例えば、細菌細胞、ホスト細胞）を使用して得られることがある。フィブロネクチンＥＤ−Ｂに直接結合する、単クローンの特異性結合ペアメンバについては、従来全く開示されていない。
【００３５】
この特異性結合メンバは、抗体から成るのが好ましい。特異性結合メンバは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等の抗体断片の形態のポリペプチド配列から成ることがある。Ｆａｂ、Ｆａｂ”、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆａｃｂ、ダイアボディ等の、抗体断片の他のタイプが利用されることもある（非特許文献３７及び特許文献１３）。特異性結合メンバは、完全抗体の形であることがある。完全抗体は、抗体イソ型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ）の形のいずれか、及びイソ型亜綱（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）の形のいずれかであることがある。
【００３６】
抗体は、あらゆる起源、例えば、ヒト、マウス、ヒツジ、ウサギのものでよい。他の誘導は当業者には明らかである。抗体は、ヒト起源が好ましい。「ヒト」は、ヒトのｃＤＮＡ、蛋白又はペプチドライブラリから部分的に又は完全に誘導される抗体を意味する。この用語は、抗体分子にヒト特性を与えて、その分子にヒト免疫系の防衛をバイパスさせるために変性された、非ヒト起源のヒト化されたペプチド及び蛋白を意味する。
【００３７】
特異性結合メンバは、設計された抗体［例えば、明示されている（ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ）フィブロネクチンＥＤ−Ｂに対して一つの結合腕（即ち、特異性ドメイン）、及び異なる特異性に対する他の腕、又は二価若しくは多価の分子を有する、二重特異性抗体分子（又は、Ｆ（ａｂ’）２等の断片）］の形態であることもある。
【００３８】
特異性結合メンバは、抗体配列の他に、他のアミノ酸（例えば、ペプチド若しくはポリペプチドを形成するもの、又は抗原に結合する能力の他にもう一つの機能特性をその分子に与えるもの）を含むことがある。例えば、特異性結合メンバは、標識、酵素又はそれらの断片等を含む。
【００３９】
結合ドメインは、胚芽細胞系列分節（ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔ）又は再配列された遺伝子分節（ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔ）によってコード化されたＶＨドメインの一部又は全部から成ることがある。結合ドメインは、ＶＬカッパ（κ）ドメイン又はＶＬラムダ（λ）ドメインの一部又は全部から成ることがある。
【００４０】
結合ドメインは、ＶＨ１、ＶＨ３又はＶＨ４の胚芽細胞系列遺伝子配列、又はその再配列形から成ることがある。
【００４１】
本発明による特異性結合メンバは、ヒト・胚芽細胞系列ＤＰ４７由来の重鎖可変領域（「ＶＨ」ドメイン）（それの配列は、図１ａに示す；残基は１〜９８）から成ることがある。「ＤＰ」命名法は、非特許文献３８に記載されている。ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓであってもよい。ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｕであってもよい。このように、本発明による特異性結合メンバの結合ドメインは、ＣＧＳ１及びＣＧＳ２について図１ａに示されるアミノ酸配列から成るＶＨドメインを含有することがある。
【００４２】
結合ドメインは、ヒト・胚芽細胞系列ＤＰ１６由来の軽鎖可変領域（「ＶＬ」ドメイン）（それの配列は、コドン１〜９０として図１ｂに示す）から成ることがある。
【００４３】
ＶＬドメインは、ＣＤＲ３配列 Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌから成ることがある。ＶＬドメインは、ＣＤＲ３配列 Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌから成ることがある。
【００４４】
本発明の特異性結合メンバは、図１に示される配列と機能的に同等の変異体から成ることがある。例えば、本明細書に開示される特性が保持されるという条件で、一種以上のアミノ酸が挿入され、削除され、置換され又は追加された。例えば、特異性結合メンバがＥＤ−Ｂに結合するという条件で、ＣＤＲ３配列は、変性されることがある；或いは、一つ以上の変化が外郭構造領域に生じることがある；或いは、外郭構造がもう一つの外郭構造若しくは変性形態と置き換えられることがある。
【００４５】
本明細書に開示される抗体の抗原結合ドメインのＶＬドメイン若しくはＶＨドメイン由来の一種以上のＣＤＲのものは、いわゆる「ＣＤＲ−移植」で使用されることがある。「ＣＤＲ−移植」では、特許文献９に開示されるように、第一抗体の一種以上のＣＤＲ配列は、その抗体のものでない配列（例えば、もう一つの抗体の配列）の外郭構造の内部に置かれる。ＣＧＳ１及びＣＧＳ２のためのＣＤＲ配列は、図１ａ及び図１ｂに示す。
【００４６】
本発明による特異性結合メンバは、フィブロネクチンＥＤ−Ｂへの結合に関し、本明細書に記載のｓｃＦｖ又は抗体と競合するものであることがある。複数の結合メンバ間の競合は、生体外で容易に分析されることがある。例えば、報告者の特異性分子を一つの結合メンバ（これは、識別されていない他の結合メンバの存在下に検出され得る）と識別して、同一エピトープ又はオーバーラップしているエピトープと結合する特異性結合メンバを同定し得るようにすることによって、容易に分析されることがある。
【００４７】
本発明による特異性結合メンバは、特異性結合メンバをそれのエピトープに結合させる又は結合するがままにしておく過程を含む方法で使用することがある。結合は、哺乳動物（例えば、ヒト、又はマウス等のげっ歯動物）に特異性結合メンバを投与した結果として生じることがある。
【００４８】
本発明は、腫瘍に対する診断薬として使用するための、上記のように特異性結合メンバを使用する方法を提供する。以下に記載する動物をモデルとした実験的証拠によって、本発明による結合メンバは生体内位置決定を行う上で有効であることが示される。
【００４９】
本発明による好ましい特異性結合メンバには、ヒト・腫瘍に結合するもの（例えば、クリオスタット分節で、浸潤性の脈管形成性現象型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を示すもの）；胚腫瘍に結合するもの（例えば、クリオスタット分節で）が含まれる。結合は、免疫細胞化学による染色法によって証明されることがある。
【００５０】
好ましい具体例において、特異性結合メンバは、テナシン、細胞外マトリックス蛋白質には結合しない、又は有意には結合しない。
【００５１】
もう一つの好ましい具体例において、特異性結合メンバは、正常なヒト皮膚（例えば、クリオスタット分節で、及び／又は免疫細胞化学による染色法を用いて実証されるように）には結合しない、又は有意には結合しない。
【００５２】
本発明による特異性結合メンバの更なる具体例は、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、卵巣、子宮、膀胱、膵臓、副腎、骨格筋、心臓、肺、甲状腺及び脳から選ばれる一種以上の正常組織には結合しない、又は有意には結合しない（例えば、クリオスタット分節で、及び／又は免疫細胞化学による染色法を用いて実証されるように）。
【００５３】
ＥＤ−Ｂのための特異性結合メンバは、生体内の標的剤（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として使用されることがある。この標的剤は、フィブロネクチンＥＤ−Ｂを表現する 腫瘍又はフィブロネクチンＥＤ−Ｂと結合した腫瘍の存在又は位置を特異的に実証するのに使用されることがある。それは、造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として使用されることがある。本発明は、フィブロネクチンＥＤ−Ｂ表現を表現する、又はフィブロネクチンＥＤ−Ｂ表現と結合した細胞又は腫瘍の存在を決定する方法を提供する。この方法は、供給された特異性結合メンバに細胞を接触させ、次いで、その細胞に対する特異性結合メンバの結合を決定する過程を含む。その方法は、本体から除去された細胞の試験サンプルについて、生体内又は生体外で行われることがある。
【００５４】
細胞サンプルに関する抗体の反応性は、あらゆる適切な手段によって決定されることがある。個々のリポーター分子を用いて識別することも可能である。そのリポーター分子は、直接的又は間接的に検出可能な、好ましくは測定可能な信号を発生することがある。リポーター分子の連結は、直接的又は間接的、共有結合的（例えば、ペプチド結合による）、或いは非共有結合的であることがある。ペプチド結合による連結は、抗体とリポーター分子とをコード化する遺伝子融合の組換え表現の結果として行われることがある。
【００５５】
一つの好ましい態様は、スペクトル的に分離された吸収特性又は放出特性を有する個々の蛍光色素、蛍光物質又はレーザー色素と、各抗体との共有結合によることがある。適した蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、及びテキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）が含まれる。適した色素産生色素には、ジアミノベンジジンが含まれる。
【００５６】
他のリポーターには、着色され、磁性若しくは常磁性であるラテックス・ビーズ（ｌａｔｅｘ ｂｅａｄｓ）等の粒状物質又は高分子コロイド粒子；及び直接的又は間接的に検出可能な信号を発生して、可視的に観察することが可能であり、電子化により検出することが可能であり、さもなければ記録することが可能である生物活性剤又は化学的活性剤が含まれる。これらの分子は、例えば、顕色若しくは変色し又は電気特性を変化させる反応に、触媒作用を及ぼす酵素であってもよい。これらは、分子的に励起され、エネルギー状態間における電子遷移が特徴的なスペクトル吸収又はスペクトル発光を生じることがある。これらには、バイオセンサーと連結して使用される化学的構成要素（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）が含まれる。ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジン、及びアルカリリン酸分解酵素の検出システムが採用されることがある。
【００５７】
結合を決定する態様は、本発明の特徴ではなく、当業者は、彼等の好み及び通常の知識に従って、適切な態様を選ぶことができる。
【００５８】
個々の抗体−リポーター連結によって発生する信号は、細胞サンプル中における、関連する抗体結合の定量的な絶対データ又は相対データを得るのに使用されることがある（標準及び試験）。加えて、プロピジウムヨウ化物（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）等の一般的核染料は、サンプル中の全細胞の個体数を数えるのに使用されることがある。１２５Ｉ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ等の放射性ヌクレオチドが抗体に付着したとき、もし、その抗体が正常組織よりむしろ腫瘍の中に優先的に局在化していれば、腫瘍組織中の放射性ラベルの存在は、ガンマカメラを使用して、検知し定量化し得る。得られる腫瘍像の質（ｑｕａｌｉｔｙ）は、信号対雑音比に直接相関している。
【００５９】
抗体は、新たに血管が新生した腫瘍を追跡するための診断剤として利用されることがある。また、抗体は、細胞毒剤を運ぶため又は新たな血管内の凝固を引き起こすために、（例えば、変性された形で）採用されることもある。かくして、成長している腫瘍に対する酸素及び栄養素の補給を断って、腫瘍治療の間接的形態を形成する。
【００６０】
本発明は、治療試薬として使用するための、上述の特異性結合メンバの使用方法をも提供する。そのとき、その特異性結合メンバは、例えば、融合蛋白として結合され、化合され又は設計されて、作用因子機能が与えられる。本発明の特異性結合メンバは、重要な抗体を表現する腫瘍又はその抗体と結合した腫瘍に至る毒素、放射能、Ｔ細胞、キラー細胞又は他の分子を標的とするのに使用される。
【００６１】
従って、本発明の更なる面は、与えられた特異性結合メンバを投与することから成る処置方法；そのような特異性結合メンバから成る薬剤組成物；及び投与のための薬剤の製造過程において（例えば、薬学的に許容できる賦形剤を用いて特異性結合メンバを調製することから成る、薬剤組成物又は医薬品組成物の製法において）、特異性結合メンバを使用する方法を提供する。
【００６２】
本発明によると、提供される組成物は、個体に投与されることがある。投与は、「治療的に有効な量」であるのが好ましい。これは、患者に効果が現れるのに十分な量である。そのような効果は、少なくとも一つの症状の少なくとも回復であることがある。実際の投与量と、投与の割合及び時間−クール（ｃｏｕｒｓｅ）とは、治療されているものの性質（ｎａｔｕｒｅ）及び激しさ（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）に依存する。投与量の決定等の治療の処方箋は、一般の診療医及び他の医師の責任による。抗体の適切な投与量は、当業において周知である。非特許文献３９及び４０を参照。
【００６３】
組成物は、単独で又は他の治療法と組合わせ、治療される容態によるが、同時に又は逐次的に投与することがある。
【００６４】
本発明による薬剤組成物、及び本発明により使用するための薬剤組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、キャリア、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の物質を含有することがある。そのような物質は、非毒性であるべきであり、また、有効成分の効能を妨げてはいけない。キャリア又は他の物質の正確な性質は、投与の経路に依存する。経路は、経口であることもあり、注射（例えば、静脈注射）によることもある。
【００６５】
経口のための薬剤組成物、錠剤、カプセル、粉末又は液体の形態であることがある。錠剤は、ゼラチン、佐剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）等の固形キャリアを含有することがある。液体の薬剤組成物は、一般的には、水、石油、動物油、植物油、鉱油合成油等の液体キャリアを含有する。生理的塩類溶液；ブドウ糖若しくは他のサッカライド溶液；又はエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコールが含まれることがある。
【００６６】
静脈注射剤、又は苦痛の位置での注射剤のためには、有効成分は、非経口的に許容される水溶液の形態であろう。この水溶液は、発熱因子を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射剤、リンガー液、乳酸加リンガー液等の等張性媒体を使用して、適切な溶液をうまく調製することができる。保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤は、必要に応じ、含有させてもよい。
【００６７】
本発明の特異性結合メンバは、核酸のコード化による表現によって造られることがある。特異性結合メンバの製法（この製法は、特異性結合メンバのために核酸をコード化することによる表現から成る）が本発明の一つの面であるように、与えられるあらゆる特異性結合メンバをコード化する核酸それ自体、本発明の一つの面である。表現は、適切な条件下、核酸を含有する組換えホスト細胞を培養することによって、都合よく達成されることがある。
【００６８】
核酸は、本明細書に記載の抗体抗原結合ドメインのあらゆるアミノ酸配列、又は機能的に同等のあらゆる形態をコード化することがある。一種以上のヌクレオチドの添加、置換、削除又は挿入によって、ヌクレオチド・レベルでの変化が生じることがある。この変化は、遺伝子コードの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）に依存し、アミノ酸レベルに反映されるかも知れないし、反映されないかも知れない。
【００６９】
異なるホスト細胞の一形態でのポリペプチドのクローン化及び表現のためのシステムは、周知である。適切なホスト細胞には、細菌系、哺乳動物の細胞系、酵母菌系及びバクロウィルス系が含まれる。非相同のポリペプチドを表現するために、当該技術において入手可能な哺乳動物・細胞系には、チャイニーズハムスターの子房細胞、ヒーラー細胞、ベビーハムスターの腎臓細胞、及びその他多数が含まれる。通常の好ましい細菌ホストは、大腸菌である。
【００７０】
大腸菌等の原核細胞中の抗体断片及び抗体の表現は、当業ではうまく確立されている。報告としては、例えば非特許文献４１を参照。培養における真核細胞中の表現もまた、特異性結合メンバを製造するための一つの選択肢として（最近の報告を参照（例えば、非特許文献４２及び４３）、当業者は入手することができる。
【００７１】
適切な調節配列；プロモーター配列；ターミネーター配列；ポリアデニル化配列；エンハンサー配列；マーカー遺伝子；及び適切な他の配列を含有する適切なベクターを選択することができる、又は組み立てることができる。ベクターは、適切な、プラスミド、ウィルス性のもの（例えば、ファージ）又はファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）であることがある。更なる詳細については、例えば、非特許文献４４を参照。核酸を操作するための多数の技術及び実験記録（例えば、核酸構成体の調製；突然変異生成；配列すること；細胞中へのＤＮＡの導入と遺伝子表現；及び蛋白の分析、に関するもの）は、非特許文献４５に詳細に記載されている。サンブルック等の開示内容、及びオスベル等の開示内容は、言及することによって本明細書に取り入れる。
【００７２】
本発明の更なる面によると、本明細書に開示される核酸を含有するホスト細胞が提供される。また、更なる面によると、そのような核酸をホスト細胞の中に導入することを含む方法が提供される。この導入のためには、利用可能なあらゆる技術が採用されることがある。真核細胞のための適切な技術には、リン酸カルシウムのトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，移入）；ＤＥＡＥ−デキストラン；エレクトロポレーション；リポソーム媒介（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）トランスフェクション；及びレトロウィルス又は他のウィルス（例えば、ワクシニア、若しくは昆虫細胞に対するバクロウィルス）を用いたトランスダクションが含まれることがある。細菌細胞のための適切な技術には、塩化カルシウム転換；エレクトロポレーション；及びバクテリオファージを用いたトランスフェクションが含まれることがある。
【００７３】
導入によって、核酸からの表現が生じる又は許容される（例えば、遺伝子の表現のための条件下、ホスト細胞が培養される）結果となることがある。
【００７４】
一つの具体例によると、本発明の核酸は、ホスト細胞のゲノム（例えば、染色体）の中に組込まれる。組込みは、標準的技術に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列の封入（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）によって促進されることがある。
【００７５】
特異性結合メンバが生成された後、その特異性結合メンバは、検討された通り、例えば、本明細書に開示される方法のあらゆるもの（例えば、特異性結合メンバの他に、そのメンバの細胞への結合を決定するための一種以上の試薬を有するキット（ｋｉｔ）等の、薬剤生成物又は診断薬生成物の調製）において使用されることがある。
【００７６】
本発明及び具体例の更なる面は、当業者には明白であろう。本発明が十分に理解されるべく、次の諸例を単なる例証として提供するが、これに限定されるものではない。次の諸図面が参考となる。
【００７７】
図１は、ｓｃＦｖ ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２のＶＨ並びにＶＬの、整列したアミノ酸配列を示す。図１ａはＶＨ配列を示し、図１ｂはＶＬ配列を示す。ＣＤＲｓ（１、２及び３）を示す。両方のｓｃＦｖへの最も相同のヒト・胚芽細胞系列ＶＨは、ＶＨ３科のＤＰ４７分節である。両方のクローンのＶＬ分節はＤＰＬ６、ｓｃＦｖライブラリを造るのに使用される軽鎖である（非特許文献３０）。二つのクローンを相互に識別する残基は、下線が引いてある。
【００７８】
図２：図２Ａは、ヒトＦＮサブユニットのドメイン構造のモデルを示す。ＦＮ−プレ−ｍＲＮＡの交互スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）による、ＩＩＩＣＳ、ＥＤ−Ａ及びＥＤ−Ｂの変異領域を示す。この図はまた、ＥＤ−Ｂを含有する主要サーモリシン消化生成物の他に、内部相同をも示す（非特許文献８）。図２Ｂは、プラスマの４〜１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ＷＩ３８ＶＡ；それらのクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色済みサーモリシン消化生成物；並びに、ＢＣ−１、ＩＳＴ−６、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２で調べた免疫ブロット分析を示す。ＦＮの１μｇ／ｍｇ（レーン３）及び１０μｇ／ｍｇ（レーン４）でサーモリシンを使用した、不消化（レーン１）及び消化済みプラスマＦＮ。ＦＮの１μｇ／ｍｇ（レーン５）、５μｇ／ｍｇ（レーン６）及び１０μｇ／ｍｇ（レーン７）でサーモリシンを使用した、不消化（レーン２）及び消化済みＷＩ３８ＶＡ ＦＮ。右側の番号は、図２Ａに示される主要サーモリシン消化生成物を示す。左側の値は、キロドルトン（ｋＤ）での分子量基準（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を示す。
【００７９】
図３：図３Ａは、大腸菌に表現された融合蛋白及び組換え蛋白の中に含有されるＦＮＩＩＩ型繰返し配列；これら蛋白とＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２との反応性；並びに、これら蛋白とｍＡｂｓ ＢＣ−１及びＩＳＴ−６との反応性を示す。図３Ｂは、クーマシーブルー染色済みゲル；及び、ＣＧＳ−１、ＣＧＳ−２、ＢＣ−１、ＩＳＴ−６で調べた免疫ブロット分析を示す。レーンの番号は、図の上部のペプチド構造の番号と一致する。左側の値は、ｋＤでの分子量基準を示す。
【００８０】
図４： マウスの赤外線イメージャー；タングステン・ハロゲンランプを備えた、黒色の非蛍光性箱と；ＣＹ７赤外線蛍光物質に対して特異的な励起・放出フィルターと；コンピュータ制御の８−ビット単色ＣＣＤ−カメラとから成る、標的実験のために使用したマウス・イメージャー（ｉｍａｇｅｒ）。
【００８１】
図５：Ｂ−ＦＮに向けられた単量体のｓｃＦｃ（ＣＧＳ−１）及び二量体のｓｃＦｃ（ＣＧＳ−１）２を用いて、蛍光によって標識化された抗体断片を、標的としてのＦ９ネズミの奇形癌に向けられている。リゾチームに対して結合特異性を有する二量体ｓｃＦｃ（Ｄ１．３）２は、ネガティブ対照として使用した。
【００８２】
図６：Ｂ−ＦＮの同一エピトープに向けられた、親和性成熟のｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）及び低結合性ｓｃＦｖ（２８ＳＩ）を使用して、蛍光によって標識化された抗体断片が、Ｆ９ネズミの奇形癌に向けられている。標的化は、結像を部分的に覆い隠す黒色外皮によって４８時間覆われた、大きい腫瘍（約０．６ｇ）でも、小さい腫瘍（約０．２ｇ）でも検出された。
【００８３】
本明細書に記載の全資料は、言及することによってここに取り入れる。
【実施例】
【００８４】
諸例の目録
例１・・・ヒトＦＮのＥＤ−Ｂドメインに特異的なヒトｓｃＦｖの分離。
例２・・・ヒトＦＮのＥＤ−Ｂドメインに特異的なヒトｓｃＦｖの親和性成熟。
例３・・・ＥＤ−Ｂ含有フィブロネクチンに対する親和性成熟済みｓｃＦｖの特異性。
例４・・・ヒト及びマウスの腫瘍分節を免疫細胞化学的に染色する上で、親和性成熟済み抗ＥＤ−Ｂ ｓｃＦｖを使用する方法。
例５・・・ヒト腫瘍を生体内で標的化する上で、親和性成熟済み抗ＥＤ−Ｂ ｓｃＦｖを使用する方法。
例６・・・ヌードマウスに異種組織移植されたＦ９ネズミの奇形癌の標的化。
【００８５】
例１・・・ヒトＦＮのＥＤ−Ｂドメインに特異的なヒトｓｃＦｖの分離
ヒトｓｃＦｖファージ・ライブラリ（非特許文献３０）は、組換え抗体の選択のために使用した。ＥＤ−Ｂのイソ型の二つの異なる形態は、選択のための抗原の供給源として使用し、両方とも、イソ型は組換えヒト・蛋白であった。
【００８６】
ＩＩＩ型の繰返し２−１１（Ｂ−）及び２−１１（Ｂ＋）を含有する組換えＦＮペプチドは、大腸菌中に表現された。
【００８７】
クローンｐＦＨ１５４からのＦＮ ｃＤＮＡ（非特許文献２０）、λＦ１０及びλＦ２０（非特許文献１３）を使用して、組み立てられた。ベース（ｂａｓｅｓ）２２２９〜４７８７の中に広がるｃＤＮＡ構成体（非特許文献２０）は、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのＱＩＡ表現キットを用いて、ベクターｐＱＥ−３／５の中に挿入された（チャトワース，ＣＡ）。組換え体ＦＮ−ＩＩＩ ２−１１（Ｂ−）及び（Ｂ＋）は、セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂに結合したｍＡｂ ３Ｅ３（非特許文献４６）を使用した免疫親和性クロマトグラフィによって精製された。ＩＩＩ型相同繰返し７Ｂ８９、７８９、ＥＤ−Ｂ及びＦＮ−６を含有する組換えＦＮ断片を調製するためのＤＮＡ断片は、テンプレートとして、クローンＦＮ２−１１（Ｂ＋）及びＦＮ２−１１（Ｂ−）からのｃＤＮＡを使用しながら、Ｕ１ｔＭａ ＤＮＡポリメラーゼを使用したポリメラーゼ鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＰＣＲ）の増幅（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって生成された。プライマーは、ＱＩＡ表現キット（キアゲン）を使用して、ｐＱＥ−１２の中にＰＣＲ生成物がクローン化するように設計された。これらは、実質的に大腸菌の中に転換され、表現された。全ｃＤＮＡクローンは、シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）２．０ＤＮＡ配列キット（ＵＳＢ）を使用して配列された。
【００８８】
組換え蛋白は、製造者の使用説明書（キアゲン）に従い、ＦＮ断片のカルボキシ末端のヘキサヒスチジン標識を使用して、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によって精製した。ＥＤ−Ｂ−βＧａｌ融合蛋白は、ＥＤ−Ｂ ｃＤＮＡをλｇｔ１１バクテリオファージ・ベクターの中にクローン化して、クローンλＥＤ−Ｂを与えることによって調製された。（ＥＤ−Ｂ配列の一部を含有する）クローンλｃｈＦＮ６０は、クローン化されたニワトリ・ＦＮ ｐｃｈＦＮ６０（ノートン（Ｎｏｒｔｏｎ）等，１９８７）からの融合蛋白として誘導された。
【００８９】
ヒト・ｓｃＦｖファージライブラリを選択するために、３ラウンドのパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）が、二つの異なる組換え抗原（７Ｂ８９及びＥＤ−Ｂ）の各々に対して行われた。これら抗原は両方とも、ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸塩緩衝剤、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中の５０μｇ／ｍｌで、一晩、免疫チューブ（ナンク（Ｎｕｎｃ）；Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）の上にコーティングされた。第一抗原は、組換えＦＮ断片７Ｂ８９（この中で、ＥＤ−Ｂドメインは、隣接するＩＩＩ型相同繰返しによって、側面が接触する。）であり、これは、一晩、４℃でコーティングされた。使用された第二抗原は、カルボキシ末端のヘキサヒスチジン標識を有する組換えＥＤ−Ｂ（非特許文献８）であった。この蛋白は、リシン残基を含有していないので、第一アミノ酸の末端アミノ基は、サイト特異的な（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）共有結合による、反応性ＥＬＳＡプレートへのＥＤ−Ｂの固定に利用できる（ナンク（Ｎｕｎｃ）；コバリンク（Ｃｏｖａｌｉｎｋ）。コーティングは、一晩、室温で行った。
【００９０】
３ラウンドのパニングの後、溶離されたファージは、ＨＢ２１５１大腸菌細胞の中に感染させ、記載した通りにプレートした（非特許文献３０）。選択の各ラウンドの後、９５のアンピシリン−抵抗性単一コロニーをスクリーニングし、ＥＬＩＳＡによって抗原特異性ｓｃＦｖを同定した。パニングのために使用した抗体上に最も高いＥＬＩＳＡ信号を与えたクローンは、更なる分析のため、及び親和性成熟のために選定した。これらのクローンはまた、例４に一層詳しく記載される免疫細胞化学的染色によって、多種多様の膠芽腫及び胸部腫瘍の切断面に特異的な染色を与えることも実証された。
【００９１】
例２・・・ヒトＦＮのＥＤ−Ｂドメインに特異的なヒトｓｃＦｖの親和性成熟
（７Ｂ８９と共に選択した）クローン３５ＧＥ及び（ＥＤ−Ｂドメインのみと共に選択した）２８ＳＩは、親和性成熟のための候補抗体として選定した。親和性を改善するための手段として軽鎖を多種産生すべく、我々は、次いで、２０６＝６．４×１０７の潜在的配列の多様性という条件で、縮重したオリゴヌクレオチド及びＰＣＲを使用しながら、軽鎖ＣＤＲ３の中央の６個の残基（ＤＳＳＧＮＨ）をランダム化することに基づき（図１）、単純な親和性成熟の方策を調べた。（重鎖ＣＤＲ３に沿った）この領域は、抗原結合部位の中央に配置されている（パドラン（Ｐａｄｌａｎ），１９９４）。我々は、また、その選択を支配する静電気の影響の可能性を回避すべく、６個の残基がセリンへ伸びる直前に、アルギニン残基を変異させた。
【００９２】
「親」ｓｃＦｖ断片を表現する単一細胞コロニーからのプラスミドは、プライマー ＬＭＢ３（５’ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ３’）及びＣＤＲ３−６−ＶＬ−ＦＯＲ（５’ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＧＡＡ ＴＡＣ ＣＡＣ ＭＮＮ ＭＮＮ ＭＮＮ ＭＮＮ ＭＮＮ ＭＮＮ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＴ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ３’）（９４Ｃ［１’］−５５Ｃ［１’］−７２Ｃ［１’３０”］、２５サイクル）を用いて増幅されるＰＣＲであった（緩衝剤及び条件については、非特許文献４７を参照）。得られた生成物は、（オリジナルｓｃＦｖ遺伝子を含有するプラスミドの痕跡を除去するため）ゲル精製し、次いで、プライマー ＬＭＢ３及びＪＩ−Ｎｏｔ−ＦＯＲ（５’ ＡＴＴ ＧＣＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＧＣＣ ＴＡＧ ＧＡＣ ＧＧＴ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ３’）（９４Ｃ［１’］−５５Ｃ［１’］−７２Ｃ［１’３０”］、２５サイクル）を用いて、第二増幅段階のためのテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ，鋳型）として使用した。アガロース・ゲル上に正確な分子量の単結合として伝わる粗ＰＣＲ生成物は、スピン結合（Ｓｐｉｎ−Ｂｉｎｄ）（ＦＭＣ，ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ），ＭＥ，ＵＳＡ）を用いて、Ｎｃｏｌ／Ｎｏｔｌで二重消化され（ｄｏｕｂｌｅ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ）結さつされて（ｌｉｇａｔｅｄ）、ゲル精製されたＮｃｏｌ／Ｎｏｔｌ消化済みファージミドｐＨＥＮ１になる（非特許文献４８）ＰＣＲ混合物から直接精製した。このｐＨＥＮ１は、単消化済みベクターから二重消化済みベクターを分離するのを促進するためにダミーのＮｃｏｌ／Ｎｏｔ１挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）を含有する。このベクターは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（チャッツワース（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ），ＣＡ，米国）のプラスミド・マキシプレ・キット（ｍａｘｉ−ｐｒｅ ｋｉｔ）で調製した。消化済みプラスミド及び挿入物の約５μｇを、結さつ混合物（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ）中で使用した。
【００９３】
結さつ混合物はフェノールで一回抽出し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２５：１）で一回抽出し、次いで、キャリアとしてグリコーゲンを用いてエタノール沈降（ボーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ），Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）させ、次いで、高速真空で乾燥させた。ペレットは、水２０μｌ中に再び懸濁させ、次いで、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）のＴＧ１大腸菌細胞（非特許文献４９）中でエレクトロポレーションさせた（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ）。我々は、グリセロールのストックを使用するときは、形質転換細胞１０９／μｇのタイター（ｔｉｔｒｅ）を有するエレクトロコンピテント細胞を典型的に使用した。或いは、新たに調製したエレクトロコンピテントを有する形質転換細胞１０１０／μｇ）のタイター（ｔｉｔｒｅ）を有するエレクトロコンピテント細胞を典型的に使用した。これによって、本明細書に概説する手順により、１０７を越えるクローンが産生された。
【００９４】
次いで、成熟ライブラリは、ニッシム・ライブラリ（非特許文献３０）に関し、ファージ粒子を産生すべく処理した。このファージ粒子は、抗原として７Ｂ８９（１０μｇ／ｍｌ）を使用している免疫チューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ）上の選定１ラウンドのために使用し、次いで、動的選定（ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）（非特許文献５０）の１ラウンドを行った。この選定過程は、選定の第一ラウンドからのミルク−ＰＢＳ（２％ＭＰＢＳ）中で５分間、ビオチニル化７Ｂ８９（１０ｎＭ）をファージ懸濁液（約１０１２ｔ．ｕ．）で培養し、次いで、非ビオチニル化７Ｂ８９（１μＭ）を添加し、次いで、３０分間、競合を続行させることによって行った。次いで、２％ＭＰＢＳ中に予ブロックされた（ｐｒｅｂｌｏｃｋｅｄ）、ストレプトアビジンでコーティングした動力ビード（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（Ｄｙｎａｌ：Ｍ４８０）１００μｌを、反応混合物に添加し、２分間混合し、次いで、磁石上で捕獲し、次いで、（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）とＰＢＳとで交互に１０回洗浄した。ファージは、トリエチルアミン０．５ｍｌ、１００ｍＭを用いてビードから溶離した。次いで、この溶液は、０．２５ｍｌ、１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４で中和し、次いで、ＨＢ２１５１細胞（非特許文献３０）を急激に成長させて感染させるのに使用した。９５のアンピシリン−抵抗性単一コロニーは、ｓｃＦＶ含有の上澄み液（非特許文献３０）を生成するのに使用した。この上澄み液は、最良のバインダーを同定すべく、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学及びＢＩＡコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）によってスクリーニングを行った。次いで、この上澄み液は、ｐＤＮ２６８表現ベクター（ネリ（Ｎｅｒｉ）等，１９９６）のＳｆｉｌ／Ｎｏｔｌサイトの間でサブクローン化した。このベクターは、ＳｃＦＶのＣ−末端に、リン酸化が可能な標識、ＦＬＡＧエピトープ及びヘキサヒスチジン標識を付加する。
【００９５】
ｐＤＮ２６８中でサブクローン化した関連抗体の単クローンは、アンピシリン１００ｍｇ／ｌ及びグルコース０．１％を含有する２ｘＴＹ中、３７℃で成長した。細胞培養が、ＯＤ６００＝０．８に到達したとき、ＩＰＴＧを最終濃度がｍＭになるまで添加し、成長は３０℃で１６〜２０時間の間続けた。遠心分離（ＧＳ−３ Ｓｏｒｖａｌｌ ｒｏｔｅｒ，７０００ｒｐｍ、３０分間）を行った後、上澄み液を瀘過し、濃縮し、次いで、ミニセッテ（フィルトロン）接線流れ装置（Ｍｉｎｉｓｅｔｔｅ（Ｆｉｌｔｒｏｎ）ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、負荷緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（リン酸塩５０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ ５００ｍＭ、イミダゾール２０ｍＭ）の中で交換した。得られた溶液は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（キアゲン）の上に負荷させ、負荷緩衝液５０ｍｌで洗浄し、次いで、溶離緩衝液（リン酸塩５０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ ５００ｍＭ、イミダゾール２０ｍＭ）で溶離した。精製した抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ），１９７０）によって分析し、４℃のＰＢＳに対して透析した。多価ｓｃＦｖ断片は、結合活性効果に基づき、ＢＩＡコア上で人工的に優れた結合を示すことがあるということが知られている（非特許文献３０及び５１）ので、精製済みｓｃＦｖ製剤は、Ｓ−７５コラム搭載のＦＰＬＣ装置（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用い、ゲル濾過によって更に処理した。ＦＰＬＣ−精製済み単量体断片の抗体濃度は、分光測定器によって、ｓｃＦｖ溶液１ｍｇ／ｍｌについて１．４ユニットの２８０ｎｍでの吸光度を想定して、決定した。
【００９６】
ＰＢＳにおける０．１〜１μＭの範囲の種々の濃度での、一価のｓｃＦｖの結合を、ＢＩＡコア機器（ファルマシア・バイオセンサー）上で、次の抗原を使用しながら測定した。（ｉ）ストレプトアビジンをコーティングしたチツプ上に固定された、ビオチニル化済み組換えＦＮ断片７Ｂ８９の１０００レゾナンス・ユニット（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔｓ）（ＲＵ）。これは、ｓｃＦｖの２５０ＲＵによって特異的に結合する；（ｉｉ）Ｎ−末端アミノ基で化学的に固定された、組換えＥＤ−Ｂの２００ＲＵ。これは、ｓｃＦｖの６００ＲＵによって特異的に結合する；（ｉｉｉ）ＥＤ−Ｂに富むフィブロネクチンＷＩ３８ＶＡの３５００ＲＵ（例３を参照）。これは、ｓｃＦｖの１５０ＲＵによって特異的に結合する。データの動的分析は、製造者インストラクションに従って行った。抗体含有上澄み液のＢＩＡコア定性分析に基づいて、各ｓｃＦｖクローンの一つの親和性成熟済みバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）、即ち、７８Ｂ９断片を有する選定からのクローンＣＧＳ−１、及びＥＤ−Ｂ組換えＦＮ断片を有する選定からのＣＧＳ−２を選定した。会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、ｓｃＦｖとオリジナル・クローン２８ＳＩ両方の、計算による平衡解離定数（Ｋｄ）と共に、表１に示す。クローンのＣＧＳ−１もＣＧＳ−２も、ナノモルの範囲のＫｄを有するが、クローンＣＧＳ−２は、センサー・チップ上で試験した３種の蛋白全てに関し、（１１０ｎＭから改善されて）１ｎＭのＫｄを与え（表１）、その親クローンを越えて最良の改善を示した。この改善は、主として、単量体抗体の製剤で測定された（示さず）一層緩慢な動的解離定数（１０−４Ｓ−１以下）による。
【００９７】
成熟方法は、大部分に共通しているように思われ、マルトース結合蛋白；シトクロムＣ；マウス・エンドグリン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）の細胞外ドメイン（Ｄ．Ｎ．，Ｌ．
Ｗｙｄｅｒ，Ｒ．Ｋｌｅｍｅｎｚ）；サイトメガロウィルス（Ａ．Ｐ．，Ｇ．
Ｎｅｒｉ，Ｒ．Ｂｏｔｔｉ，Ｐ．Ｎ．）；核腫瘍マーカーＨＭＧＩ−Ｃ蛋白（Ａ．Ｐ．，Ｐ．Ｓｏｌｄａｎｉ，Ｖ．Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ，Ｐ．Ｎ．）；及び卵巣腫瘍マーカーの胎盤アルカリホスファターゼ（Ｄｅｏｎａｒａｉｎ及びＡ．Ａ．Ｅｐｅｎｅｔｏｓ）に対する親和性改善済み抗体を産生した。従って、この成熟方法は、少なくとも他の成熟方法（非特許文献５２及び５３）と同程度に有効であるように思え、しかも、非常に大きいファージ抗体ライブラリ（非特許文献５４及び５５）から誘導されたものと類似の親和性を有する抗体を産生する。
【００９８】
親和性成熟済みクローンＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２は、ヒト・胚芽細胞系列の抗体Ｖ遺伝子のデータベース（Ｖ−ＢＡＳＥ）に配列し整列し、次いで、マクベクター（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）ソフトウェアを用いて翻訳した。両クローンのＶＨ遺伝子は、ヒト・胚芽細胞系列ＤＰ４７（ＶＨ３）にほとんど相同であり、各クローンの他に、異なるＶＨ ＣＤＲ３配列を有した（図１）。両クローンのＶＬ遺伝子は、ニッシム等に記載のヒト・合成ｓｃＦｖ全範囲（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の構造に使用されるＤＰＬ１６胚芽細胞系列であった。ＶＬ ＣＤＲ３配列は、任意の順序に配列された残基の６個から４個が、互いに相違した（図１ｂ）。
【００９９】
【表１】
【０１００】
例３・・・ＥＤ−Ｂ含有フィブロネクチンに対する親和性成熟済みｓｃＦｖｓの特異性
二つの親和性成熟済みｓｃＦｖｓ、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２の免疫反応性は、初期にＥＬＩＳＡによって評価し、次いで、ｍＡｂ ＢＣ−１、及びｍＡｂＩＳＴ−６と直接比較した。ｍＡｂ ＢＣ−１は、Ｂ−ＦＮイソ型を認識し、ｍＡｂ ＩＳＴ−６は、ＥＤ−Ｂを欠いているＦＮイソ型を認識するのみである（非特許文献１３及び２６）。これらｍＡｂの特性は、以前報告された（非特許文献１３及び２６）。その後、サーモリシン処理によって誘導されたＦＮ断片と組換え融合蛋白との大きいパネルを使用して、特異性の正確な分析が行われた。
【０１０１】
ＥＬＩＳＡ及び免疫ブロット分析のために使用した抗原は、次の通りに調製した。ＦＮは、ヒト・プラスマ；及び以前報告されたＷＩ３８ＶＡ１３細胞系列の調整済み媒体（非特許文献８）から精製した。精製したＦＮは、非特許文献１３によって報告されたように、サーモリシン（プロテアーゼ Ｘ型；シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて消化した。天然のＦＮ １１０ｋＤ（Ｂ−）及び天然のＦＮ １２０ｋＤ（Ｂ＋）の断片（図２参照）は、以前報告されたように（非特許文献５６）、ＦＮ消化物から精製した。テナシン−Ｃの大きいイソ型は、非特許文献５７によって報告されたように精製した。組換え蛋白は、例１に記載の通りに表現し、精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン・ブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）は、非特許文献１３によって報告されたように、実施した。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡに使用された全抗原は、ＰＢＳで５０〜１００μｇ／ｍｌに希釈し、免疫−プレート・ウェル（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｐｌａｔｅｗｅｌｌｓ）（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）の上に４℃で一晩コーティングした。非結合抗原は、ＰＢＳで除去し、次いで、プレートは、ウシ由来血清アルブミン（ＢＳＡ）３％（ｗ／ｖ）含有するＰＢＳを用いて、３７℃で２時間の間、ブロックした。この後、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。次いで、抗体は、３７℃で１．５時間の間、結合させた：ｓｃＦｖｓは、標識配列（ＦＬＡＧ標識に対してはｍＡｂ Ｍ２［Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ］；又はｍｙｃ標識に対しては９Ｅ１０［ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ］）に向けられた抗血清を用い、前もって温置した。試験を行った対照抗体は、ｍＡｂｓ ＢＣ−１及びＩＳＴ−６であった。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、プレートは、ヤギの抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏ−ＳＰＡ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌａｎ，イタリア）を（ＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡで）１：２０００に希釈し、ビオチニル化して、３７℃で１時間の間、培養した。洗浄を繰り返し、次いで、ストレプトアビジンービオチニル化したアルカリ・ホスファターゼ複合体（Ｂｉｏ−ＳＰＡ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌａｎ，イタリア）を、３７℃で１時間の間、添加した（ＭｇＣｌ２ ２ｍＭを含有するＰＢＳＴに１：８００で希釈された）。反応は、ジエタノールアミン１０％、ｐＨ９．８中で、ホスファターゼ基質の錠剤（Ｓｉｇｍａ）を使用して進め、光学的濃度は、４０５ｎｍで読み取った。結果は、次の表２に示す。
【０１０３】
【表２】
【０１０４】
ｓｃＦｖ及び単クローン抗体と、フィブロネクチン誘導抗原との免疫反応性は、ＥＬＩＳＡによって測定した。測定値は、バックグランド信号を減じた後の、４０５ｎｍで測定したＯＤを示す。データは、４回の実験の平均であり、これらデータは、最大１０％の標準偏差を示す。
【０１０５】
実験に用いたフィブロネクチンの異なる形態の素性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、次の通りである：即ち、プラスマ ＦＮ＝ヒト・プラスマフィブロネクチン；ＷＩ３８−ＶＡ ＦＮ：ＳＶ４Ｏ−転換済み線維芽細胞の上澄み液からのプラスマフィブロネクチン（非特許文献８）；ｎ１１０ｋＤ＝ＥＤ−Ｂを含有しない、ＦＮドメイン４で処理したサーモリシン；ｎ１２０ｋＤ＝ＥＤ−Ｂを含有した、ＦＮドメイン４で処理したサーモリシン；ｒｅｃＦＮ７Ｂ８９＝隣接するＩＩＩ型ＦＮ相同繰り返しによって側面に位置するＥＤ−Ｂドメイン；ｒｅｃＦＮ７８９＝ＥＤ−Ｂドメインを有する、ＩＩＩ型ＦＮ相同の繰り返し；ｒｅｃＥＤ−Ｂ＝組換えＥＤ−Ｂ単独；ｒｅｃＦＮ６＝組換えＦＮドメイン６。
【０１０６】
ＣＧＳ−１もＣＧＳ−２も、ＥＤ−Ｂ配列を含有する、天然のＦＮ断片の全て又は組換えＦＮ断片の全ての他に、組換えＥＤ−Ｂペプチドを認識した。しかし、それらは、ＥＤ−Ｂを欠くＦＮ断片のいずれにも結合しなかった。また、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２は、テナシン（これは、１５個のＩＩＩ型相同繰り返しを含む：非特許文献５８）；及びプラスマ ＦＮ（これは、サーモリシン消化生成物（非特許文献８）中に、検出可能なレベルのＥＤ−Ｂ配列を含有していない）と反応しなかった。対照的に、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２は、ＳＶ４０−転換済み細胞系列ＷＩ３８ＶＡから精製したＦＮと強く反応した。精製済みＦＮ及びその細胞系列から調製した全ＲＮＡを使用した、サーモリシン消化及びＳ１ヌクレアーゼの実験によって示されるように（非特許文献８；Ｂｏｒｓｉ等，１９９２）、この細胞からのＦＮ分子約７０〜９０％には、ＥＤ−Ｂが含まれる。可溶性組換えＥＤ−Ｂを使用して、ＷＩ３８ＶＡ細胞上のＦに対するＣＧＳ−１及び／又はＣＧＳ−２の結合を抑制することによって、ＦＮのＥＤ−Ｂ成分に対するｓｃＦｖの特異性を更に実証した（データは示していない）。
【０１０７】
データによると、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２のみが、ＥＤ−Ｂドメインを含有するＦＮ誘導体と特異的に反応することが確認される。それらは双方とも、組換えＥＤ−Ｂの場合を除き、ｍＡｂ ＢＣ−１と同様の反応性を示す。組換えＥＤ−Ｂは、ＢＣ−１によって認識されていない。ｍＡｂ対照に関連して得られたＥＬＩＳＡ信号の強度は、ＥＤ−Ｂ含有抗原に対する二つのｓｃＦｖの高い特異性を反映する。
【０１０８】
ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２の特異性は、プラスマ及びＷＩ３８ＶＡの細胞からのＦＮと、それらのサーモリシン消化物とを使用しながら、免疫ブロット分析により調べた。サーモリシン消化によると、ＷＩ３８ＶＡ細胞からのＦＮ（その大部分はＥＤ−Ｂを含有する）は、（ＥＤ−Ｂを含有する）１２０ｋＤ断片と、ＥＤ−Ｂを欠く僅かな１１０ｋＤ断片とを生成する（図２Ａ；非特許文献８）。１２０ｋＤドメインの更なる消化は、二つの断片：即ち、そのカルボキシ末端にほぼ完全なＥＤ−Ｂ配列を有する８５ｋＤ断片；及び３５ｋＤ配列を生成する（図２Ａ；非特許文献８）。
【０１０９】
図２Ｂの左側には、免疫ブロット分析によって分析した蛋白断片のクーマシー染色済みゲルがある。プラスマＦＮ（レーン１）と、蛋白のサーモリシン消化物（１１０ｋＤ蛋白を含有するレーン３，消化済み１１０ｋＤ蛋白を含有するレーン４）とは、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２によって認識されなかった。対照的に、ＷＩ３８ＶＡ細胞からの、ＥＤ−Ｂに富むＦＮは、元のまま及びサーモリシン消化を増大した後の両方において、両方のｓｃＦｖ断片によって認識された。ＣＧＳ−１によって特異的に認識し得た、最も小さいＦＮ−誘導断片は、（ほとんど全てがＩＩＩ型の繰り返し２〜１１による）１２０ｋＤ蛋白であり、一方、ＣＧＳ−２は、ＥＤ−ＢのＮ−末端の他に、繰り返し２〜７による８５ｋＤ断片を認識し得た（図２Ｂ；非特許文献８）。これらの結果は、二つのｓｃＦｖが反応性であり、ＥＤ−Ｂ配列内のエピトープを識別することを示す。８５ｋＤドメインに対するＣＧＳ−２の結合は、このクローンのためのエピトープがＥＤ−Ｂのアミノ末端に存在することを示す。対照的に、１２０ｋＤドメインが８５ｋＤへ消化されるときの、ＣＧＳ−１の結合の損失は、それによって、ＥＤ−Ｂ分子のカルボキシ末端の方に向いて一層多く配置されたエピトープが認識されることを実証する。
【０１１０】
ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２の優れた特異性は、ＥＤ−Ｂ配列を持った又は持たない融合蛋白及び組換えＦＮ断片を用いた免疫ブロット分析によって更に研究した。ＦＮ融合蛋白は、非特許文献１３によって記述されている通りに調製した。これらの実験結果は図３に示す；ヒト・ＦＮのドメインの構造の概略図関連は、非特許文献２６を参照。得られた結合のプルフィルによると、精製済みＦＮと蛋白分解の分割生成物とに関する免疫ブロット分析及びＥＬＩＳＡによって従来見いだされていたものが、本質的に確認される。即ち、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２は、ＥＤ−Ｂ含有ＦＮ断片（レーン２及び４）と強い反応性があったが、ＥＤ−Ｂを欠くＦＮ配列（レーン１及び３）には反応性を全く示さなかった。ＣＧＳ−１は、ヒト・ＥＤ−Ｂ融合蛋白（レーン５）ともニワトリ・ＥＤ−Ｂ融合蛋白（レーン６）とも反応しなかったが、ＣＧＳ−２は、両方の断片と強く反応した（図３）。この結果は、ＣＧＳ−１によって認識されたＥＤ−Ｂ含有ＦＮ中のエピトープの、ある立体配座上の制約を反映しているのかも知れない。例えば、エピトープが、変性に敏感であり、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分断される（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）とき、正確には現出されず、ニトロセルロース等の固形支持体に転写されるということは起こり得る。
【０１１１】
まとめて考えると、これらの結果によると、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２は、互いに異なり且つＥＤ−Ｂ構造（これは、ｍＡｂ ＢＣ−１によって認識される）と異なる領域で、ＥＤ−Ｂ含有ＦＮに強く且つ特異的に結合することが実証される。
【０１１２】
例４・・・ヒト及びマウスの腫瘍を免疫細胞化学的に染色する上で親和性成熟済み抗ＥＤ−Ｂ ｓｃＦｖｓを使用する方法
ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２はいずれも、種々の正常で新生のヒト・組織中に、ＥＤ−Ｂ含有ＦＮ分子を免疫局在化する（ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｓｅ）ために使用されてきた。Ｂ−ＦＮイソ型は、皮膚創傷の治癒の間、マクロファージ及び線維芽細胞の中に表現されることが知られていたので、正常組織には皮膚が選ばれた（非特許文献８及び非特許文献５９）。選定された二つのヒト・腫瘍は、従来、抗フィブロネクチンｍＡｂで染色する特異性のために分析されてきた。この腫瘍の血管内の内皮細胞は、Ｂ−ＦＮイソ型の表現を含む血管形成過程が増加して、高度に増殖性の状態にあるため、膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）の多形は詳細に研究されてきた（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ等，１９９４）。更に、正常で増殖性で新生のヒト・胸組織の多様のパネルを用いた研究によって、血管形成とＢ−ＦＮ表現の間の相互関係に関する一層の証拠が提供された（非特許文献６０）。
【０１１３】
本明細書に記載の諸実験のために、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２の免疫組織化学的染色は、ｍＡｂ ＢＣ−１（これは、Ｂ−ＦＮイソ型を認識する）の免疫組織化学的染色；及び既知の全ＦＮイソ型変異体（ＩＳＴ−４）に反応する、又はＥＤ−Ｂを欠くＦＮイソ型（ＩＳＴ−６）のみに反応することが知られている他のｍＡｂの免疫組織化学的染色と比較した。これら対照抗体の全ての特徴は、従来報告されている（非特許文献１３及び２６）。
【０１１４】
正常で新生の組織は、手術中に採取されるサンプルから得た。組織の調製及び固定が、ＦＮ含有分子の正確で感度のよい検出のために重要であることは既に実証されていた（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ等，１９９４）。免疫組織化学のために、５μｍ厚さのクリオスタット分節（ｃｒｙｏｓｔａｔ ｓｅｃｔｉｏｎｓ）は、空気乾燥され、冷アセトン中に１０分間、固定された。免疫染色は、ストレプトアビジン−ビオチン・アルカリ・ホスファターゼ複合体染色キット（Ｂｉｏ−ＳＰＡ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌａｎ，イタリア）と、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−リン酸塩と、ファースト・レッド（Ｆａｓｔ Ｒｅｄ）ＴＲ（Ｓｉｇｍａ）とを用いて行った。ギル・ヘマトキシリン（Ｇｉｌｌ’ｓ ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）は、対比染色として使用した。次いで、従来、「Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ等，１９９４」によって報告されているように、グリセロゲル（ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ）（Ｄａｋｅ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）中に固定した。実験で特異性を更に分析するため、組織のポジティブ染色（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）が得られる所で、抗体を組換えＥＤ−Ｂドメインで培養し、次いで、従来記述された通りに検出することによって、ＥＤ−Ｂに対する特異性を実証した。
【０１１５】
これらの全実験結果によって、ＣＧＳ−１もＣＧＳ−２も、ｍＡｂ ＢＣ−１と同一の組織構造と反応することが分かった。ＣＧＳ−１、ＣＧＳ−２及びＢＣ−１を用い、皮膚で得られた染色パターンは、真皮（ｄｅｒｍｉｓ）中に表現されたＦＮからのＥＤ−Ｂは存在しないことを反映している。浸潤性管の癌分節の染色において、ＣＧＳ−１、ＣＧＳ−２及びＢＣ−１は、制限された染色分布を示し、新生細胞と基質（ｓｔｒｏｍａ）との間の境界に限定した。このことは、全ＦＮは腫瘍基質全体に均一に分布しているが、Ｂ−ＦＮの表現は、ある領域に限定されていて、しかも、従来、ｍＡｂ ＢＣ−１を用いて（非特許文献６０）、浸潤性管の癌の中に（ケースの９５％で）うまく局在化させられたのはこれらの領域であるという事実と一致する。
【０１１６】
膠芽腫の多様な癌のＢＣ−１を染色することにおける従来の発見が、確認された。非特許文献２４は、糸球体様脈管構造の染色の典型的なパターンを観察していたが、我々の実験では、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２は、定性的には同一の結果を与えることが分かった。
【０１１７】
しかし、ＣＧＳ−１とＣＧＳ−２とｍＡｂ ＢＣ−１との間には、重要な相違が存在する。即ち、ＢＣ−１は厳密にヒト・特異性であるのに、二つのヒト・ｓｃＦｖはニワトリ及びマウスのＢ−ＦＮの両方に結合することが実証された。ＣＧＳ−２はニワトリ・胚芽と反応し（データは示さず）、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２はマウス・腫瘍と反応した。
【０１１８】
マウスＦ９の奇形癌の分節上の血管構造のＣＧＳ−１染色も示した。対照的に、試験を行った全ての正常マウス組織（肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、卵巣、子宮、膀胱、膵臓、副腎、骨格筋、心臓、肺、甲状腺及び脳）は、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２とネガティブ染色反応を示した（データは示さず）。そのＦ９奇形癌分節中で染色された構造は、組換えＥＤ−Ｂドメインを使用して、得られた染色を完全に抑制することによって、ＥＤ−Ｂ特異性であることが分かった（データは示さず）。
【０１１９】
例５・・・ヒト腫瘍を生体内で標的化する上で、親和性成熟済み抗ＥＤ−Ｂ ｓｃＦｖを使用する方法
ヒト・メラノーマの細胞系列ＳＫＭＥＬ−２８は、一つの側腹部の皮下に１×１０７の細胞／マウスを注射することにより、６〜１０週間の老齢ヌードマウス（Ｂａｌｂ−ｃ又はＭＦ−１；Ｈａｒｌａｎ ＵＫ）中の異種組織移植済み腫瘍を成長させるのに使用した。腫瘍を有するマウスは、腫瘍が直径約１ｃｍに達したとき、ＰＢＳのｓｃＦｖ１−Ｃｙ１溶液１ｍｇ／ｍｌの１００μｌを用いて、尾部の静脈に注射した。
【０１２０】
ＣＹ７による組換え抗体の標識化は、ＰＢＳ（１ｍｇ／ｍｌ）の抗体溶液１ｍ１に「１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ＝９．３」１００μｌと、「ＣＹ７−ｂｉｓ−Ｏｓｕ（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｃａｔ．Ｎｒ．ＰＡ１７０００；ＤＭＳＯ中２ｍｇ／ｍｌ）」２００μｌを添加することによって達成した。室温で、３０分後、「１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ＝７．４」１００μｌをその混合物に添加し、次いで、標識化された抗体は、ＰＢＳと平衡状態に置いた、使い捨てＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，米国）を使用して、未反応染料から分離した。溶離した生の抗体断片は、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−１０チューブ（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，米国）を用いて、約１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。達成された標識化比は、通常、１モルのＣＹ７：１モルの抗体に近い。これは、抗体溶液１ｍｇ／ｍｌは２８０ｎｍで１．４単位の吸収を与え、７４７ｎｍでのＣＹ７のモル吸光係数は２００，０００（Ｍ−１ｃｍ−１）であると想定し、また、２８０ｎｍでのＣＹ７吸収を無視し、ｌｃｍキュベットを用い分光器によって評価した。標識化した後の、抗体サンプルの免疫反応性は、抗原カラム上の親和性−クロマトグラフ法によるバンド−シフト（Ｎｅｒｉ等，１９９６）によって；又はＢＩＡコア分析によって確認した。マウスは、酸素／フルオロエタンの混合物の吸入による麻酔の下、一定時間間隔で、ホーム・ビルト（ｈｏｍｅ−ｂｕｉｌｔ）マウス−イメージャー（ｍｏｕｓｅ−ｉｍａｇｅｒ）を用いてイメージした。結果の再現性を確実なものとすべく、各サンプルに対し、２〜８匹の動物を研究した。操作手順は、Ｄ．ネリ（Ｎｅｒｉ）に発行されたＵＫプロジェクト・ライセンス（Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｃｅｎｃｅ）「腫瘍の標的化（Ｔｕｍｏｕｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」（ＵＫ ＰＰＬ ８０／１０５６）に従って行った。
【０１２１】
非特許文献６１の光検出装置の改造型として、赤外線蛍光物質ＣＹ７が使用できる赤外線マウス・イメージャーを造った。赤外線照射を選定し、一層優れた組織貫通を得た。ＣＹ７（＞７６ｎｍ）の蛍光は、人には見えず、コンピューター制御のＣＣＤ−カメラを使用する必要がある。このマウス・イメージャーは、黒に塗装され、光が入らないようにした箱を有した。この箱には、１００Ｗタングステン・ハロゲン・ランプを備え、ＣＹ７（クローマ社（Ｃｈｒｏｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ，米国；６７３〜７４８ｎｍ）のために特別に設計した直径５０ｍｍの励起フィルターを備えた。得られた照射線は、５×１０ｃｍの大きさの領域全体に渡り、ほぼ均一であった。マウスはイメージングのためにその中に置いた。蛍光は、Ｃ−マウント・レンズと５０ｍｍ放出フィルター（クローマ社，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ，米国；７６５〜８５５ｎｍ）を備えた、８ビットのモノクロのプルニックス（Ｐｕｌｎｉｘ）ＣＣＤカメラによって検出し、次いで、イメージ（Ｉｍａｇｅ）ＤＯＫ装置（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｌｔｄ．，リバプール、ＵＫ）に接続した。この装置は、フレーム・グラバー（ｆｒａｍｅ−ｇｒａｂｂｅｒ）と、配列イメージを捕獲し集積化を行うためのソフトウェアとを備えたコンピューターから成る。それぞれ５０ｍｓで捕捉された配列のイメージは、典型的には、平均化プロセスに使用した。これの番号は、一つの動物の一連の画像では一定に保持し、異なる時点で標的化されている腫瘍が直接比較できるようにした。次いで、ＴＩＦＦフォーマットでの画像は、プログラム・グラフィック・コンバーターを使用して、ＰＩＣＴファイルに変換し、次いで、パワー・マッキントッシュ７１００／６６コンピューターを用いて、精巧に仕上げた。
【０１２２】
この装置のデザインの概略図は、図４に示す。
【０１２３】
これらの実験によって、両方のｓｃＦｖは、巨視的レベルに視覚化されたとき、腫瘍に局在化していることが実証された。
【０１２４】
二つの抗ＥＤＢ ｓｃＦｖを用いて、成長している腫瘍の新生血管形成を標的化する巨視的実証は、次のように詳述される。
【０１２５】
一つの側腹部に、異種組織移植されたＳＫＭＥＬ−２８のヒト・メラノーマ、又はマウスＦ９奇形癌を有する、ヌードマウス及び／又はＳＣＩＤマウスは、ＦＬＡＧ標識（ｔａｇ）を有する標識化されていないｓｃＦｖ断片、又はビオチニル化されたｓｃＦｖ断片を用いて注射した。
【０１２６】
マウスは、注射の後、異なる時点で犠牲となり、腫瘍及び非腫瘍の分節を得た。次いで、これら分節は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｋｏｄａｋ，１８１）又はストレプトアビジン−ベースの検出試薬を使用し、従来の免疫組織化学プロトコールで染色した。最適標的化は、一般に注射の１２時間後に得られた。ＣＧＳ１もＣＧＳ２も、異種組織移植されたヒト・腫瘍、及びマウスの奇形癌の両方の新生血管に結合することが実証された。
【０１２７】
例６・・・ヌードマウスに異種組織移植されたＦ９ネズミの奇形癌の標的化
我々は、ネズミＦ９の奇形癌細胞４×１０６を皮下注射することによって、ヌードマウスの側腹部で固形腫瘍を成長させた。この腫瘍は、マウス内で非常に急速に成長し、注射後、約１週間で１ｃｍに達し、高度に血管が新生した。抗体の標的化をイメージすべく、我々は、非特許文献６１の光検出手順の改造型を使用した。この改造型は、上記に詳述する通り（図４参照）、種々の時点でイメージされた同一動物に関する腫瘍標的化及び抗体の排除を可能にする。
【０１２８】
腫瘍に標的化し、抗体の検出を容易にするため、表現ベクターＰＧＩＮ５０のＳｆｉｌ／Ｎｏｔｌ部位における抗体をサブクローン化することによって、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−１）、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）及び抗リゾチーム ｓｃＦｖ（Ｄ１．３）（非特許文献６２）に、ホモ二量体化標識（非特許文献６３）を追加した。このベクターは、ｐＤ２６８（非特許文献６４）の誘導体である。この中で、標識のＨｉｓ６配列は、配列：ＧＧＣ ＬＴＤ ＴＬＱ ＡＦＴ ＤＱＬ ＥＤＥ ＫＳＡ ＬＱＴ ＥＩＡ ＨＬＬ ＫＥＫ ＥＫＬ ＥＦＩ ＬＡＡ Ｈによって置換される。これは、共有の抗体断片のホモ二量体化のためのＦｏｓ蛋白の両親媒性のらせんと、システイン残基とを含む（Ａｂａｔｅ等，１９９０）。完全な共有の二量体化は、達成されなかった。抗体断片約３０〜５０％は、共有結合した二量体から成った。
【０１２９】
抗体断片は、雌鶏、卵のリゾチーム（Ｄ１．３）又は７Ｂ８９（抗ＥＤ−Ｂ抗体；Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ等，１９９６）をＣＮＢｒ活性化されたセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，米国）にカップリングすることによって得たカラムのアフィニティ・クロマトグラフィによって精製した。上澄み液は、アフィニティ支持体の上に供給し、次いで、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ＋０．５ＭＮａＣｌで洗浄し、次いで、１００ｍＭのＥｔ３Ｎで溶離した。次いで、抗体は、ＰＢＳに対して透析して分離した。
【０１３０】
抗体は上述の通り、標識化し、次いで、ＰＢＳの１ｍｇ／ｍｌ ｓｃＦｖ１−Ｃｙ７１溶液１００μｌで、腫瘍を有するマウスの尾部の静脈に注射した。このとき、腫瘍は、直径約１ｃｍに達していた。
【０１３１】
図５に示す通り、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−１）は、３日間以下の間、腫瘍上に局在化した（この期間に腫瘍からの急速なクリアランスもあったが）。しかし、大たい骨の、ある染色も存在した。ＣＧＳ−１の腫瘍への標的化の実施は、Ｃ末端に、システイン残基を含有する両親媒性のらせんを導入して、抗体の二量体化（非特許文献６３）を促進することによって、顕著に改善された。実際、二量体のｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）２の局在化は、２４〜７２時間、有意には減少しないように思えた。対照的に、ネガティブ対照（二量体の抗体ｓｃＦｖ（Ｄ１．３）２、抗リゾチーム抗体）は、急速なクリアランスを示し、腫瘍又は大たい骨の検出可能な局在化は全く見られなかった。
【０１３２】
ｓｃＦｖ（２８ＳＩ）は、６時間で腫瘍ターゲッティングをわずかに示した（図示せず）。しかし、２４時間又はそれ以降において、全く検出できなかった（図６）。親和性の成熟は、ターゲッティングを著しく改善することとなった。このように、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）は、単量体（図６）としてであろうと、二量体（図示せず）としてであろうと、小さいＦ９腫瘍及び大きいＦ９腫瘍を有効に標的化した。２日後、腫瘍１ｇ当り抗体の注射投与量％は、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）単量体では約２、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）二量体では３〜４であることが分かった。腫瘍に運ばれたｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）による投与量もまた、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−１）によるものより大きく（図５及び６）、それらの各々親和性と相互関係がある（表１）。しかし、ｓｃＦｖ（２８ＳＩ）もｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）も、蛋白質分割しないように思え、また肝臓の取り込みが大きいことを示す（図６）ところが、ｓｃＦｖ（ＣＧＳ−１）抗体は、有意に一層安定であり、肝臓の取り込みが一層小さいことを示す（図５）。
【０１３３】
【表３】
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
【表５】
【０１３６】
【表６】
【０１３７】
【表７】
【０１３８】
【表８】
【０１３９】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１ａ】ｓｃＦｖ ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２のＶＨの、整列したアミノ酸配列であって、ＣＤＲｓ（１、２及び３）を示す。
【図１ｂ】ｓｃＦｖ ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２のＶＬの、整列したアミノ酸配列であって、ＣＤＲｓ（１、２及び３）を示す。
【図２Ａ】ヒトＦＮサブユニットのドメイン構造のモデルを示す。
【図２Ｂ】プラスマの４〜１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ＷＩ３８ＶＡ；それらのクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色済みサーモリシン消化生成物；並びに、ＢＣ−１、ＩＳＴ−６、ＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２で調べた免疫ブロット分析を示す。
【図３Ａ】大腸菌に表現された融合蛋白及び組換え蛋白の中に含有されるＦＮＩＩＩ型繰返し配列；これら蛋白とＣＧＳ−１及びＣＧＳ−２との反応性；並びに、これら蛋白とｍＡｂｓ ＢＣ−１及びＩＳＴ−６との反応性を示す。
【図３Ｂ】クーマシーブルー染色済みゲル；及び、ＣＧＳ−１、ＣＧＳ−２、ＢＣ−１、ＩＳＴ−６で調べた免疫ブロット分析を示す。
【図４】マウスの赤外線イメージャー；タングステン・ハロゲンランプを備えた、黒色の非蛍光性箱と；ＣＹ７赤外線蛍光物質に対して特異的な励起・放出フィルターと；コンピュータ制御の８−ビット単色ＣＣＤ−カメラとから成る、標的実験のために使用したマウス・イメージャー（ｉｍａｇｅｒ）である。
【図５】Ｂ−ＦＮに向けられた単量体のｓｃＦｃ（ＣＧＳ−１）及び二量体のｓｃＦｃ（ＣＧＳ−１）２を用いて、蛍光によって標識化された抗体断片を、標的としてのＦ９ネズミの奇形癌に向けられている。
【図６】Ｂ−ＦＮの同一エピトープに向けられた、親和性成熟のｓｃＦｖ（ＣＧＳ−２）及び低結合性ｓｃＦｖ（２８ＳＩ）を使用して、蛍光によって標識化された抗体断片が、Ｆ９ネズミの奇形癌に向けられている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された単量体として測定されるとき、６×１０−８Ｍ未満のＥＤ−Ｂに対する解離定数（Ｋｄ）を有する、フィブロネクチン（ＦＮ）の腫瘍胎児ＥＤ−Ｂドメインに対して特異的であり且つ該腫瘍胎児ドメインに直接結合するものである、分離された抗体又は抗体断片。
【請求項２】
ヒト起源の抗原結合ドメインを含む、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項３】
ＦＮを蛋白分解酵素サーモリシンで処理した後、ＥＤ−Ｂ含有ＦＮの全てに結合する、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項４】
Ｂ＋イソ型のフィブロネクチンをＮ−グリカナーゼで処理しないで、Ｂ＋イソ型のフィブロネクチンに結合する、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項５】
ＣＤＲ３配列 Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ及びヒト胚芽細胞系列ＤＰ４７（配列番号９に示す、１番目の残基であるＧｌｕから９８番目の残基であるａｒｇまで）から誘導される変異性重（ＶＨ）鎖領域を有する、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項６】
ＣＤＲ３配列 Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｕ及びヒト胚芽細胞系列ＤＰ４７（配列番号１０に示す、１番目の残基であるＧｌｕから９８番目の残基であるａｒｇまで）から誘導される変異性重（ＶＨ）鎖領域を有する、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項７】
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ ＶａｌのＣＤＲ３配列の残基及びヒト胚芽細胞系列ＤＰＬ１６（配列番号１１に示す、１番目の残基であるＳｅｒから９０番目の残基であるＳｅｒまで）から誘導される変異性軽（ＶＬ）鎖領域を有する、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項８】
Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ ＶａｌのＣＤＲ３配列の残基及びヒト胚芽細胞系列ＤＰＬ１６（配列番号１２に示す、１番目の残基であるＳｅｒから９０番目の残基であるＳｅｒまで）から誘導される変異性軽（ＶＬ）鎖領域を有する、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項９】
抗体又は抗体断片は、ｓｃＦｖ分子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項１０】
抗体又は抗体断片は、二量体のｓｃＦｖ分子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項１１】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の分離された抗体断片。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片をコード化する核酸。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片をコードするファージ。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸を用いて転換される又は移入される（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ，トランスフェクションされる）試験管内のホスト細胞。
【請求項１５】
腫瘍を標的化するための薬剤を調製するために、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片を使用する方法。
【請求項１６】
腫瘍をイメージングするための薬剤を調製するために、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片を使用する方法。
【請求項１７】
試験管内のホスト細胞中で請求項１２に記載の核酸を発現することによって、分離された抗体又は抗体断片を製造することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片の製法。
【請求項１８】
請求項１に記載の抗体又は抗体断片の製法であって、
ａ）ファージ中で発現された抗体又は抗体断片ライブラリを、フィブロネクチン蛋白から誘導したＥＤ−Ｂドメインを含む組換えフィブロネクチン断片でスクリ−ニングし、
ｂ）ホスト細菌細胞をポジティブ・クローン（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ）に感染させ、
ｃ）ポジティブ・ファージ・クローンを親和性熟成プロセスにかけ、
ｄ）工程ａ）及びｂ）を繰り返して、抗原に対する改善された親和性を有するポジティブ・ファージ・クローンを選定し、
ｅ）ホスト細胞をポジティブ・クローンに感染させ、次いで、該ホスト細胞からの抗体分子を精製する
諸工程から成り、
工程ａ）において、抗体断片がｓｃＦｖ分子である、抗体断片ライブラリをスクリーニングする上記製法。
【請求項１９】
ｓｃＦｖ分子がヒト起源の抗原結合ドメインを含む、請求項１８に記載の製法。
【請求項２０】
工程ａ）において、組換え抗原７Ｂ８９又はＥＤ−Ｂを用いてスクリーニングする、請求項１８記載の製法。
【請求項２１】
生成抗体又は生成抗体断片は、フィブロネクチン（ＦＮ）の腫瘍胎児ＥＤ−Ｂドメインに対して特異的であり且つ該腫瘍胎児ドメインに直接結合する該抗原結合ドメインを含むものであり、且つ、ポジティブ・クローンの核酸が、該核酸によってコード化された該生成抗体または生成抗体断片の試験管内のホスト細胞中での発現によって製造に用いられる、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２２】
生成抗体が完全抗体の形をとる、請求項２１に記載の製法。
【請求項２３】
生成抗体断片がｓｃＦｖ分子の形をとる、請求項２１に記載の製法。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片、及び、細胞へ該分離された抗体又は抗体断片が結合するのを決定する一種以上の試薬を含む、診断薬キット。
【請求項１】
精製された単量体として測定されるとき、６×１０−８Ｍ未満のＥＤ−Ｂに対する解離定数（Ｋｄ）を有する、フィブロネクチン（ＦＮ）の腫瘍胎児ＥＤ−Ｂドメインに対して特異的であり且つ該腫瘍胎児ドメインに直接結合するものである、分離された抗体又は抗体断片。
【請求項２】
ヒト起源の抗原結合ドメインを含む、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項３】
ＦＮを蛋白分解酵素サーモリシンで処理した後、ＥＤ−Ｂ含有ＦＮの全てに結合する、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項４】
Ｂ＋イソ型のフィブロネクチンをＮ−グリカナーゼで処理しないで、Ｂ＋イソ型のフィブロネクチンに結合する、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項５】
ＣＤＲ３配列 Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ及びヒト胚芽細胞系列ＤＰ４７（配列番号９に示す、１番目の残基であるＧｌｕから９８番目の残基であるａｒｇまで）から誘導される変異性重（ＶＨ）鎖領域を有する、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項６】
ＣＤＲ３配列 Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｕ及びヒト胚芽細胞系列ＤＰ４７（配列番号１０に示す、１番目の残基であるＧｌｕから９８番目の残基であるａｒｇまで）から誘導される変異性重（ＶＨ）鎖領域を有する、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項７】
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ ＶａｌのＣＤＲ３配列の残基及びヒト胚芽細胞系列ＤＰＬ１６（配列番号１１に示す、１番目の残基であるＳｅｒから９０番目の残基であるＳｅｒまで）から誘導される変異性軽（ＶＬ）鎖領域を有する、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項８】
Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ ＶａｌのＣＤＲ３配列の残基及びヒト胚芽細胞系列ＤＰＬ１６（配列番号１２に示す、１番目の残基であるＳｅｒから９０番目の残基であるＳｅｒまで）から誘導される変異性軽（ＶＬ）鎖領域を有する、請求項１に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項９】
抗体又は抗体断片は、ｓｃＦｖ分子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項１０】
抗体又は抗体断片は、二量体のｓｃＦｖ分子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片。
【請求項１１】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の分離された抗体断片。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片をコード化する核酸。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片をコードするファージ。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸を用いて転換される又は移入される（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ，トランスフェクションされる）試験管内のホスト細胞。
【請求項１５】
腫瘍を標的化するための薬剤を調製するために、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片を使用する方法。
【請求項１６】
腫瘍をイメージングするための薬剤を調製するために、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片を使用する方法。
【請求項１７】
試験管内のホスト細胞中で請求項１２に記載の核酸を発現することによって、分離された抗体又は抗体断片を製造することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片の製法。
【請求項１８】
請求項１に記載の抗体又は抗体断片の製法であって、
ａ）ファージ中で発現された抗体又は抗体断片ライブラリを、フィブロネクチン蛋白から誘導したＥＤ−Ｂドメインを含む組換えフィブロネクチン断片でスクリ−ニングし、
ｂ）ホスト細菌細胞をポジティブ・クローン（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ）に感染させ、
ｃ）ポジティブ・ファージ・クローンを親和性熟成プロセスにかけ、
ｄ）工程ａ）及びｂ）を繰り返して、抗原に対する改善された親和性を有するポジティブ・ファージ・クローンを選定し、
ｅ）ホスト細胞をポジティブ・クローンに感染させ、次いで、該ホスト細胞からの抗体分子を精製する
諸工程から成り、
工程ａ）において、抗体断片がｓｃＦｖ分子である、抗体断片ライブラリをスクリーニングする上記製法。
【請求項１９】
ｓｃＦｖ分子がヒト起源の抗原結合ドメインを含む、請求項１８に記載の製法。
【請求項２０】
工程ａ）において、組換え抗原７Ｂ８９又はＥＤ−Ｂを用いてスクリーニングする、請求項１８記載の製法。
【請求項２１】
生成抗体又は生成抗体断片は、フィブロネクチン（ＦＮ）の腫瘍胎児ＥＤ−Ｂドメインに対して特異的であり且つ該腫瘍胎児ドメインに直接結合する該抗原結合ドメインを含むものであり、且つ、ポジティブ・クローンの核酸が、該核酸によってコード化された該生成抗体または生成抗体断片の試験管内のホスト細胞中での発現によって製造に用いられる、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２２】
生成抗体が完全抗体の形をとる、請求項２１に記載の製法。
【請求項２３】
生成抗体断片がｓｃＦｖ分子の形をとる、請求項２１に記載の製法。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離された抗体又は抗体断片、及び、細胞へ該分離された抗体又は抗体断片が結合するのを決定する一種以上の試薬を含む、診断薬キット。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−５０２６１（Ｐ２００９−５０２６１Ａ）
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０４６８２（Ｐ２００８−２０４６８２）
【出願日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【分割の表示】特願平９−５４１８２８の分割
【原出願日】平成９年５月２３日（１９９７．５．２３）
【出願人】（５０８２０５７２９）ピロゲン ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【分割の表示】特願平９−５４１８２８の分割
【原出願日】平成９年５月２３日（１９９７．５．２３）
【出願人】（５０８２０５７２９）ピロゲン ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (1)
【Ｆターム（参考）】
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