フィブロネクチン：増殖因子キメラ
ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦなどの増殖因子と、フィブロネクチンまたは少なくとも、増殖因子受容体およびフィブロネクチンのインテグリン受容体結合ドメインの双方と結合してそれらを活性化することができるフィブロネクチンのドメインとを含む、単離されたタンパク質複合体が提供される。これらのタンパク質複合体は、増殖因子とフィブロネクチン配列がリンカー配列によって連結されている合成タンパク質を含む。また、創傷治癒、組織工学、皮膚置換や皮膚補充などの美容および治療処置、ならびに火傷の処置などの治療処置において、細胞の遊走および／または増殖を刺激または誘導するための、これらのタンパク質複合体の使用が提供される。他の実施形態において、本発明は、特に乳癌に関して、癌細胞転移の阻害を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖因子受容体およびフィブロネクチンのインテグリン受容体の双方と結合してそれらを活性化することができる各ドメインを有するタンパク質複合体に関する。特定の実施形態において、本発明は、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）またはケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）受容体結合ドメインなどの増殖因子と、フィブロネクチン（ＦＮ）のインテグリン受容体結合ドメインとを含むキメラタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、細胞遊走を刺激するタンパク質複合体、ならびに細胞の遊走および／または増殖を促進または誘導する組成物および方法に関する。これらの組成物および方法は、上皮細胞の遊走ならびに／または増殖が必要とされる、創傷治癒、組織工学、皮膚置換や皮膚補充などの美容および治療処置、ならびに火傷の処置において用途を有する。他の実施形態において、本発明は、特に乳癌に関して、癌細胞転移の防止または阻害に関する本発明により提供される処置を提供する。
【背景技術】
【０００２】
過形成、ＤＮＡ合成、分化、細胞周期の進行、およびアポトーシスの阻害を含む広範な細胞プロセスに関与する多くのペプチド増殖因子が知られており、これにはインスリン様増殖因子（ＩＧＦ、例えば、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）（非特許文献１；非特許文献２）、ＥＧＦ（非特許文献３）、ｂＦＧＦ（非特許文献４）、およびＫＧＦ（非特許文献５）が含まれる。これらの効果は、それらの同族チロシンキナーゼ連結型細胞表面受容体、すなわち、それぞれＩ型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、ＥＧＦ受容体、ｂＦＧＦ受容体およびＫＧＦ受容体との結合により媒介される。ＩＧＦはまた、ＩＧＦＢＰと呼ばれる特異的結合タンパク質ファミリー（その主要な役割は遊離型のＩＧＦと結合し、それにより、それらの半減期、特異性および活性を適度に保つことである）によって厳格に調節される（非特許文献６）。
【０００３】
フィブロネクチンは、全ての脊椎動物に見られる高分子量の接着性糖タンパク質である。フィブロネクチンは、細胞接着、細胞形態および表面構造に役割を果たす。その主要な機能は、発生、組織修復および創傷治癒、細胞増殖の調節ならびに分化の際の細胞遊走への関与であると思われる（非特許文献７〜９）。フィブロネクチン多型は、単一のフィブロネクチン一次転写物中の３つの領域（ＥＤ−Ａ、ＥＤ−ＢおよびＩＩＩＣＳ）における選択的スプライシングパターンによるものである（非特許文献１０〜１２）。フィブロネクチンの厳密な組成は、組織種および／または細胞の状態によって異なる。ヒトでは、おそらく２０の異なる形態のフィブロネクチンが存在し、ほとんどがある特定の３つのモジュールの選択的スプライシングから生じる（非特許文献１３）。フィブロネクチンスプライシング変異体の発現は、発生段階に応じて調節され、かつ、組織特異的であることが明らかである。
【０００４】
フィブロネクチンは、ヘパリン、コラーゲンおよびヒアルロン酸を含む複数の細胞外分子と結合する能力を有する。フィブロネクチンは、細胞外マトリックスの種々の成分と、また、細胞表面の膜結合型フィブロネクチン受容（インテグリン）と結合することによって、細胞と細胞の相互作用、および細胞の細胞外マトリックスとの相互作用を組織化する。
【０００５】
しかしながら、細胞の遊走および／または増殖などの生物学的応答の刺激に関する、増殖因子とフィブロネクチン、およびタンパク質複合体に存在するそれらの個々のドメインの相対寄与はまだ捕らえどころがない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】JonesおよびClemmons, 1995, Endocrine Rev. 16 3
【非特許文献２】WoodおよびYee, 2000, J. Mammary Gland Biology and Neoplasia 5 1
【非特許文献３】Heldinら, 1981, Science 4 1122
【非特許文献４】Tarabolettiら, 1997, Cell Growth. Differ. 8 471
【非特許文献５】Marcheseら, 1990, J. Cell Physiol. 144 326
【非特許文献６】Clemmons, 1998, Mol. Cell. Endocrinol. 140 19
【非特許文献７】AlitaloおよびVaheri, 1982, Adv. Cancer Res. 37 111
【非特許文献８】Yamada, 1983, Annu. Rev. Biochem. 62 761
【非特許文献９】Hynes, 1985, Annu. Rev. Cell Biol. 1 67
【非特許文献１０】Petersenら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 137
【非特許文献１１】Schwarzbauerら, 1983, Cell 35 421
【非特許文献１２】Komblihttら, 1984, Nucleic Acids Res. 12 5853
【非特許文献１３】PottsおよびCampbell, 1994, Curr. Opin. Cell Biol. 6 648
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦなどの増殖因子とＦＮとを含む合成キメラの形態にあるタンパク質複合体が、同族増殖因子受容体およびＦＮ結合インテグリン受容体と結合してそれらを相乗的に同時に活性化することにより、細胞の遊走および／または増殖を刺激することを発見した。
【０００８】
よって、本発明は、広義には、増殖因子ドメインの受容体結合ドメインと、少なくとも、インテグリン受容体と結合することができるフィブロネクチンのドメインとを含む単離されたタンパク質複合体を対象とし、この単離されたタンパク質複合体は、増殖因子とインテグリン受容体を同時に活性化し、それにより生物学的応答を惹起することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様において、本発明は、
（ｉ）増殖因子または少なくとも、同族増殖因子受容体と結合することができる増殖因子のドメイン；および
（ｉｉ）フィブロネクチン、または少なくともフィブロネクチンのインテグリン結合ドメインを含むフィブロネクチンの断片
のアミノ酸配列を含む合成キメラタンパク質の形態にある、単離されたタンパク質複合体を提供する。
【００１０】
好ましくは、上記態様によれば、増殖因子はＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦである。
好ましくは、インテグリン受容体はα１またはα４インテグリンである。
【００１１】
本発明のこの態様はまた、合成キメラタンパク質中の、フィブロネクチンの１つ以上の付加的断片のアミノ酸配列も意図する。
本発明のこの態様はまた、その範囲内に、上記（ｉ）および（ｉｉ）に相当するアミノ酸配列の、ならびにフィブロネクチンの１つ以上の付加的断片に相当するアミノ酸配列の、アミノ酸欠失、付加、置換および／または突然変異も含む。
【００１２】
第２の態様において、本発明は、第１の態様の単離されたタンパク質複合体をコードする単離された核酸を提供する。
第３の態様において、本発明は、発現ベクターにおいて１つ以上の調節配列に作動可能に連結された第２の態様の単離された核酸を含む、遺伝子構築物を提供する。
【００１３】
好ましくは、遺伝子構築物は発現構築物である。
第４の態様において、本発明は、第３の態様の遺伝子構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００１４】
第５の態様において、本発明は、第１の態様の単離されたタンパク質複合体と、薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
本発明のこの態様はまた、合成タンパク質を発現する第４の態様の宿主細胞を含む医薬組成物も意図する。
【００１５】
第６の態様において、本発明は、第１の態様の合成タンパク質に特異的な抗体を提供する。
第７の態様において、本発明は、合成タンパク質を用いて、増殖因子受容体とインテグリン受容体の双方に結合させるステップを含む、細胞遊走を促進する方法を提供する。
【００１６】
好ましくは、増殖因子受容体はＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦ受容体、ｂＦＧＦ受容体、またはＫＧＦ受容体である。
好ましくは、インテグリン受容体はα１またはα４インテグリンである。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明のこの態様は、上皮／ケラチノサイト／線維芽細胞の遊走および／または増殖の促進または誘導による、哺乳類、好ましくはヒトにおける創傷治癒の助長に関する。
【００１８】
好ましくは、合成タンパク質は本発明の第１の態様によるものである。
第８の態様において、本発明は、増殖因子とフィブロネクチンとを含む複合体によって、増殖因子受容体とインテグリン受容体の双方の結合を防止、阻害、または他の方法で低減するステップを含む、細胞の遊走および／または増殖を防止する方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、増殖因子受容体はＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦ受容体、ｂＦＧＦ受容体またはＫＧＦ受容体である。
好ましくは、前記インテグリン受容体はα１またはα４インテグリンである。
【００２０】
好ましい実施形態において、本発明のこの態様は、哺乳類、好ましくはヒトにおける転移性癌細胞の遊走および／または増殖の防止または阻害に関する。
本発明のこの態様により意図される特定の例は、乳癌転移の防止または阻害である。
【００２１】
また、第７および第８の態様の方法は、予防的処置法および治療的処置法を包含し得ることが理解されるであろう。
第９の態様において、本発明は、
（ｉ）増殖因子とフィブロネクチンを含むタンパク質複合体のアゴニストであるか；または
（ｉｉ）増殖因子とフィブロネクチンを含むタンパク質複合体のアンタゴニストである
分子を生成するための、第１の態様の単離されたタンパク質複合体の使用を提供する。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、
（ｉ）ＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−ＩＩ：ＦＮ、ＥＧＦ：ＦＮ、ｂＦＧＦ：ＦＮ、ＫＧＦ：ＦＮ、もしくはＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ：ＦＮタンパク質複合体のアゴニストであるか；または
（ｉｉ）ＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−ＩＩ：ＦＮ、ＥＧＦ：ＦＮ、ｂＦＧＦ：ＦＮ、ＧＦ：ＦＮ、もしくはＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ：ＦＮタンパク質複合体のアンタゴニストである
分子を生成するための、第１の態様の合成タンパク質の使用を提供する。
【００２３】
本発明のこの態様に従って生成されたアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、創傷治癒、組織工学、皮膚再生の促進、および／または癌細胞転移もしくは皮膚の過増殖性障害（例えば、瘢痕形成および乾癬）の防止に著しい効果を奏し得る。
【００２４】
第１０の態様において、本発明は、第１の態様の単離されたタンパク質複合体を含む生体材料を提供する。
特定の実施形態では、生体材料は、本発明の単離されたタンパク質複合体を、好適には含浸、または被覆、あるいは他の方法により含ませた外科用インプラント、人工補綴物、スキャフォールド、創傷用または火傷用包帯などであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】ヒトフィブロネクチン（配列番号１）のアミノ酸配列。
【図１Ｂ】成熟ＩＧＦ−Ｉ（配列番号２）のアミノ酸配列。
【図１Ｃ】成熟ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）のアミノ酸配列。
【図１Ｄ】成熟ＥＧＦ（配列番号４）のアミノ酸配列。
【図１Ｅ】成熟ｂＦＧＦ（配列番号５）のアミノ酸配列。
【図１Ｆ】成熟ＫＧＦ（配列番号６）のアミノ酸配列。
【図１Ｇ】好ましいリンカー配列（配列番号７〜１２）のアミノ酸配列。
【図２】ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰおよびＦＮタンパク質複合体は乳癌細胞遊走を刺激する。ＩＧＦＢＰ−３または−５の存在下、予め結合させたＦＮ（１μｇｍＬ）および漸増濃度のＩＧＦ−Ｉで被覆したトランスウェル（Transwell）（登録商標）に、ＭＣＦ−１０Ａ細胞を播種した。これらの細胞を５時間遊走させた。その後、各処理に応答して膜を通り抜ける細胞の数を、ＦＮ単独（ＳＦＭ）で遊走した細胞に対するパーセンテージとして表した。３回の実験（各反復実験において４ウェルで処理を試験した）からＭＣＦ−１０データをプールする。エラーバーはＳＥＭを示す。ＳＦＭ＝無血清培地。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦなどの増殖因子とＦＮとを含む合成キメラが、応答性細胞により発現されるそれらの同族増殖因子受容体およびＦＮ結合インテグリン受容体と結合し、これらを介して細胞遊走に対して生物学的効果を発揮するという発見から生まれたものである。より詳しくは、この二重の結合事象は細胞の遊走および増殖を相乗的に刺激する。これらの安定で生物学的に活性の一本鎖キメラ分子は、少なくとも、その同族受容体と結合することができる増殖因子の最小のドメインまたは領域を、ＦＮのインテグリン結合ドメインを少なくとも含む、ＦＮの１つ以上のＩＩＩ型ドメインと組み合わせて含む。
【００２７】
この発見により、本発明者らは、少なくとも、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦの、例えば、それらの同族受容体と結合することができる最小のドメインまたは領域を、ＦＮのインテグリン結合ドメインと組み合わせて含む単離されたタンパク質複合体を提供するに至った。さらにより詳しくは、これらのドメインを含む単一の連続するタンパク質が作製され得る。
【００２８】
単一の合成タンパク質の形態にあるこのようなタンパク質複合体は、それらの同族受容体およびＦＮ結合インテグリン受容体と配位結合または共結合し、従って、細胞の遊走および／または増殖ならびに創傷治癒の促進に有用な薬剤である。同様に、同族受容体およびＦＮ結合インテグリン受容体の共結合の防止は、癌細胞転移を防止するために使用可能である。
【００２９】
本明細書を通じ、特に断りのない限り、「含む」は、排除ではなく包含を意図して用いられ、従って、示された整数または整数群は１つ以上の示されていない整数または整数群を含み得る。
【００３０】
特に増殖因子受容体結合ドメインおよびインテグリン結合ドメインに関して、このようなドメインは、そのドメインのアミノ酸配列を、所望であれば他の付加的アミノ酸とともに含む。
【００３１】
このようなドメインは、１０個以下、好ましくは５個以下、またはより好ましくは４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個の付加的アミノ酸を伴って、そのドメインのアミノ酸配列から「本質的になる」場合があることも理解されるであろう。
【００３２】
また、このようなドメインは、付加的アミノ酸を伴わずに、そのドメインのアミノ酸配列から「本質的になる」場合があることも理解されるであろう。
本発明の目的では、「単離された」とは、その天然状態から取り出された、またはそうでなければ、人間の操作を施された材料を意味する。単離された材料は、その天然状態において通常付随する成分を実質的もしくは本質的に含まないものであり得るか、またはその天然状態において通常付随する成分を伴っているが、操作されて人為的状態となったものであり得る。単離された材料は、天然型、化学合成型または組換え型であり得る。
【００３３】
本明細書において「合成」とは、天然には存在せず、人間の技術介入によって作出されたことを意味する。合成タンパク質および核酸に関して、これは、当技術分野で十分に理解されているような組換え、化学合成またはコンビナトリアル技術によって生成された分子を包含する。
【００３４】
「タンパク質」とは、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当技術分野で十分に理解されているような天然または非天然アミノ酸、Ｄ−またはＬ−アミノ酸であり得る。「タンパク質」とはまた、当技術分野で慣用されるような「糖タンパク質」および「リポタンパク質」などの用語も含み、包含する。
【００３５】
「ペプチド」とは、５０個未満のアミノ酸を有するタンパク質である。
「ポリペプチド」とは、５０個以上のアミノ酸を有するタンパク質である。
以上に記載されるように、本発明は、１つの特定の態様において、
（ｉ）増殖因子、または少なくとも、同族増殖因子受容体と結合することができる増殖因子のドメイン；および
（ｉｉ）フィブロネクチン、または少なくともフィブロネクチンのインテグリン結合ドメインを含むフィブロネクチンの断片
のアミノ酸配列を含む合成キメラタンパク質の形態にある、単離されたタンパク質複合体を提供する。
【００３６】
本明細書において「キメラタンパク質」とは、連続するアミノ酸配列、すなわち、フィブロネクチンのインテグリン受容体結合ドメイン、任意でフィブロネクチンの付加的ドメイン、および増殖因子または少なくとも増殖因子の受容体結合ドメインに由来するアミノ酸を含む。
【００３７】
本明細書において「増殖因子」とは、in vitroおよび／またはin vivoにおいて細胞の増殖、分化、生存および／または遊走を調節し得る生物学的に活性のタンパク質である。
増殖因子の例としては、限定するものではないが、ＩＧＦ（JonesおよびClemmons, 1995, Endocrine Rev. 16 3; WoodおよびYee, 2000, J. Mammary Gland Biology and Neoplasia 5 1; Keissら, 1994, Hormone Research 41 66）（例えば、ＩＧＦ−Ｉ（UniProtKB/Swiss-Prot: #P05019、成熟タンパク質は全長配列のアミノ酸残基４９〜１１８を含む）およびＩＧＦ−ＩＩ（UniProtKB/Swiss-Prot: #P01344、成熟タンパク質は全長配列のアミノ酸残基２５〜９１を含む））、ＶＥＧＦ（Neufeldら, 1999, FASEB J. 13 9-22）、ＰＤＧＦ（Heldin, 1992, EMBO J. 11 4251-4259）、ＥＧＦ（Heldinら, 1981, Science 4 1122-1123; UniProtKB/Swiss-Prot: #P01133、成熟タンパク質は全長配列のアミノ酸残基９７１〜１０２３を含む）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ; Nurcombeら, 2000, J. Biol. Chem. 275 30009-30018）、ｂＦＧＦ（Tarabolettiら, 1997, Cell Growth. Differ. 8 471-479; UniProtKB/Swiss-Prot: #P09038、成熟タンパク質は全長配列のアミノ酸残基１４３〜２８８を含む）、オステオポンチン（Namら, 2000, Endocrinol. 141 1100）、トロンボスポンジン−１（Namら, 2000, 前掲）、テネイシン−Ｃ（Araiら, 1996, J. Biol. Chem. 271 6099）、ＰＡＩ−１（Namら, 1997, Endocrinol. 138 2972）、プラスミノーゲン（Campbellら, 1998, Am. J. Physiol. 275 E321）、フィブリノーゲン（Campbellら, 1999, J. Biol. Chem 274 30215）、フィブリン（Campbellら, 1999,前掲）、トランスフェリン（Weinzimerら, 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 1806）、およびＫＧＦ（Marcheseら, 1990, J. Cell Physiol. 144 326-32; UniProtKB/Swiss-Prot: #P21781、成熟タンパク質は全長配列のアミノ酸残基３２〜１９４を含む）が挙げられる。
【００３８】
本発明の合成キメラタンパク質の形態にある単離されたタンパク質複合体は、増殖因子、または少なくとも、同族増殖因子受容体と結合することができる増殖因子のドメインを含む。
【００３９】
ここで「ドメイン」とは、少なくとも、同族増殖因子受容体と結合することができる増殖因子の部分または領域を意味する。限定するものではないが、一般に、同族増殖因子受容体は細胞により発現され、少なくとも増殖因子のドメインによる同族増殖因子受容体の結合または連結は、細胞の増殖、分化、生存および／または遊走などの細胞応答を惹起する。
【００４０】
特にＩＧＦ−Ｉに関して、該ドメインは好適には、ロイシン残基でないアミノ酸残基２４を含む。
一般に、該残基はチロシンである。
【００４１】
特にＩＧＦ−ＩＩに関して、該ドメインは好適には、ロイシン残基でないアミノ酸残基２７を含む。
一般に、該残基はチロシンである。
【００４２】
特にＩＧＦ−Ｉに関して、一実施形態では、該ドメインはＩＧＦ−Ｉの残基１〜７０からなる。
別の実施形態では、該ドメインはＩＧＦ−Ｉの残基４〜７０からなる。
【００４３】
また、本発明の単離されたタンパク質複合体の別の成分は、フィブロネクチンの少なくともインテグリン結合ドメインであることも理解されるであろう。
好ましくは、インテグリン受容体はα１またはα４インテグリンである。
【００４４】
特定の理論に束縛されるものではないが、合成キメラタンパク質は、増殖因子の同族受容体およびフィブロネクチンのインテグリン受容体と共結合し、それらを共に活性化させ、それにより、細胞遊走を刺激し、誘導し、増大させ、または他の態様で促進することができる、ということが提示される。
【００４５】
本発明のキメラタンパク質の利点は、化学合成または組換え手段によって容易に生成されること、また、非共有結合で結合されたオリゴ−タンパク質複合体に必要とされるタンパク質−タンパク質相互作用の維持に頼らないので、in vivoにおいてより安定であると予測されることにある。
【００４６】
これに関して、ＩＧＦ−Ｉの受容体結合ドメインを含む単離されたタンパク質複合体にはＩＧＦＢＰも含まれるが、上記の作用様式によれば、ＩＧＦＢＰは好ましくはＩＧＦ−Ｉ／ＦＮ合成キメラ中に存在しない、ということが提示される。
【００４７】
他の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦと、ＦＮまたは少なくともＦＮのインテグリン結合ドメインを含むＦＮの断片とを含む合成キメラタンパク質の形態にあるものなどの単離されたタンパク質複合体を提供する。
【００４８】
好ましくは、インテグリン受容体はα１またはα４インテグリン受容体である。
ここで、「断片」とは、フィブロネクチンのドメイン、部分配列または部分を意味する。断片は好ましくは、成熟フィブロネクチン配列の５００個未満、４００個未満、３００個未満またはより好ましくは、約８０〜２８０個の連続するアミノ酸を構成する。フィブロネクチンの複数の断片も意図される。
【００４９】
フィブロネクチンのインテグリン結合ドメインは、好適には、ＲＧＤ配列を含む。ＲＧＤ配列は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン８〜１０（フィブロネクチン配列のアミノ酸１２６６〜１５３６）に位置する。より具体的には、ＲＧＤ配列は、フィブロネクチン配列のアミノ酸１４４７〜１５３６で定義されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１０に存在するが、第２のインテグリン結合部位はより大きな８〜１０ドメイン領域にわたって存在し得る。
【００５０】
よって、１つの特定の実施形態では、合成キメラは、ＲＧＤ配列を含むフィブロネクチン断片を含み、ここで、該断片はフィブロネクチンアミノ酸配列のアミノ酸１４４７〜１５３６のうち少なくとも６個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、もしくは全てからなるか、またはそれを含む。
【００５１】
別の特定の実施形態では、合成キメラは、ＲＧＤ配列を含むフィブロネクチン断片を含み、該断片は、フィブロネクチンアミノ酸配列のアミノ酸１２６６〜１５３６のうち少なくとも６個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも２６０個、もしくは全てのアミノ酸配列からなるか、またはそれを含む。
【００５２】
さらに別の特定の実施形態では、合成キメラは、上記実施形態によるＲＧＤ配列を含むフィブロネクチン断片を含み、ここで、該合成キメラは、フィブロネクチンアミノ酸配列の少なくとも１０個、２０個、５０個、１００個、２００個、３００個、５００個、８００個または１０００個のアミノ酸、例えば、残基１２６６のＮ末端および／または残基１５３６のＣ末端をさらに含む。よって、該合成キメラは、フィブロネクチンＩ型および／またはＩＩ型ドメイン、例えば、フィブロネクチンアミノ酸配列のアミノ酸５０〜２７３のうち少なくとも６個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、もしくは全てからなるか、またはそれを含むフィブロネクチン断片を含み得る。
【００５３】
さらに別の実施形態では、合成キメラは、フィブロネクチンアミノ酸配列のアミノ酸１１７３〜１５３６のうち少なくとも６個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、または全てのアミノ酸配列からなるか、またはそれを含むフィブロネクチン断片を含む。
【００５４】
以上のフィブロネクチン配列のナンバリングは図１に示されているフィブロネクチン配列を参照して付されることが理解されるであろう。このフィブロネクチン配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢタンパク質データベースから、タンパク質受託番号Ｐ０２７５１として得られる。フィブロネクチンドメインおよび領域は表Ｉに示されている。
【００５５】
好ましくは、フィブロネクチンまたはインテグリン結合ドメインを含む断片を含む合成キメラは、ＩＧＦＢＰアミノ酸配列を含まない。
好ましくは、上記のような合成キメラタンパク質は、増殖因子配列とフィブロネクチンアミノ酸配列の間に連続して位置する「リンカー配列」をさらに含む。
【００５６】
一実施形態では、リンカー配列は１つ以上のグリシン残基と１つ以上のセリン残基を含む。
リンカー配列の特定の例は、Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ（配列番号７）；Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ３（配列番号８）；（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３（配列番号９）；および（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）４（配列番号１０）から選択され得るが、これらに限定されない。
【００５７】
別の実施形態では、リンカー配列は、プラスミン切断認識部位（Sakiyama-Elbert ら, 2001, FASEB 15 1300）、例えば、配列：
Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｐｒｏ（配列番号１１）
に従うものを含む。
【００５８】
さらに別の実施形態では、リンカー配列は、コラゲナーゼ−３切断認識部位（KimおよびHealy, 2003, Biomacromolecules 4 1214）、例えば、配列：
Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｙｓ（配列番号１２）
に従うものを含む。
【００５９】
本発明はまた、本発明の合成キメラタンパク質の生物学的に活性の断片の使用および／または本明細書で例示される特定の増殖因子受容体結合ドメインとインテグリン結合ドメインの生物学的に活性の断片の使用に及ぶ。
【００６０】
一実施形態では、「生物学的に活性の断片」は、それが由来するタンパク質の生物活性の１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上を有する。
【００６１】
別の実施形態では、「生物学的に活性の断片」は、それが由来するタンパク質の連続するアミノ酸配列の１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上を有する。
【００６２】
また、本発明の変異型タンパク質複合体も意図される。
典型的には、タンパク質に関して、「変異型」タンパク質は、１つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されたものである。当技術分野では、いくつかのアミノ酸を、そのタンパク質の活性の性質を変化させることなく、幅広い類似の特性を有する他のアミノ酸に変化させ得ることが十分に理解されている（保存的置換）。
【００６３】
参照配列、例えば、増殖因子、増殖因子の受容体結合ドメイン、フィブロネクチンのインテグリン結合ドメイン、ＩＧＦＢＰ、または合成キメラタンパク質に存在する１つ以上の対応する残基の１つ以上のアミノ酸残基が、本発明の単離されたタンパク質複合体の生物活性を実質的に変化させることなく、改変もしくは欠失、または付加的配列を付加され得ることが理解されるであろう。
【００６４】
一実施形態では、タンパク質変異体は、参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％または８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００６５】
好ましくは、配列同一性は、参照配列の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％、９８％、または実質的に全長にわたって評価される。
【００６６】
配列同一性％を求めるために、アミノ酸および／またはヌクレオチド配列の最適なアライメントを、コンピュータによるアルゴリズム（IntelligeneticsによるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, WI, USA のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）の実行によって、または目視検査と選択された種々の方法のいずれかにより作成された最良の（すなわち、比較ウィンドウにおいて最高の相同性％となる）アライメントによって行ってもよい。また、例えばAltschulら, 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389により開示されているものなどのＢＬＡＳＴ系プログラムも挙げられる。
【００６７】
別の例において、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳ（登録商標）コンピュータプログラム（ウィンドウズ（登録商標）版バージョン２．５；日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社、米国カリフォルニア州サンフランシスコから入手可能）により計算される「一致パーセンテージ」を意味すると理解され得る。
【００６８】
配列解析の詳細な記述は、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubelら編（John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999）のユニット１９．３に見出すことができる。
本発明はまた、増殖因子の受容体結合ドメイン、フィブロネクチンのインテグリン結合ドメインまたはそれを含む単離されたタンパク質複合体の誘導体も意図する。
【００６９】
本明細書において本発明の「誘導体」タンパク質は、例えば、他の化学部分の付加、他の化学部分との抱合もしくは複合体形成によって、または当技術分野で十分に理解されている翻訳後修飾法によって変更されている。
【００７０】
アミノ酸の「付加」は、ポリペプチドまたは変異体と他のポリペプチドまたはタンパク質との融合を含み得る。他のタンパク質は、例えばタンパク質の精製を助けるものであり得る。例えば、これらには、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：green fluorescent protein）、プロテインＡ、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：glutathione S-transferase）が含まれる。
【００７１】
本発明により意図されるその他の誘導体としては、限定するものではないが、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成の際の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組み込み、ならびに本発明のポリペプチド、断片および変異体にコンフォメーション拘束をかける架橋剤および他の方法の使用が挙げられる。本発明により意図される側鎖修飾の例としては、無水酢酸によるアシル化、無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化、メチルアセトイミデートによるアミド化、シアネートによるアミノ基のカルバモイル化、ピリドキサール−５−リン酸によるリシンのピリドキシル化とその後のＮａＢＨ４による還元、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化とその後のＮａＢＨ４による還元、および２、４、６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ：2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid）によるアミノ基のトリニトロベンジル化によるものなどのアミノ基の修飾が挙げられる。
【００７２】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素形成によるカルボジイミドの活性化とその後の、例えば対応するアミドへの誘導体化によって修飾され得る。
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬で複素環式縮合生成物を形成することによって修飾され得る。
【００７３】
スルフヒドリル基は、システイン酸への過ギ酸酸化、４−クロロマーキュリフェニルスルホン酸、４−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、塩化フェニル水銀および他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成、他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成、マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、およびアルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル化などの方法によって修飾され得る。
【００７４】
トリプトファン残基は、例えば、臭化２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルもしくはハロゲン化スルホニルによるインドール環のアルキル化、またはＮ−ブロモスクシンイミドによる酸化によって修飾され得る。
【００７５】
チロシン残基は、テトラニトロメタンを用いたニトロ化による３−ニトロチロシン誘導体の形成によって修飾され得る。
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ジエチルピロカーボネートによるＮ−カルボエトキシル化によって、またはヨード酢酸誘導体によるアルキル化によって修飾され得る。
【００７６】
ペプチド合成の際に非天然アミノ酸および誘導体を組み込む例としては、限定するものではないが、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用が挙げられる。
【００７７】
タンパク質の化学誘導体化に好適な方法の例は、CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coliganら編, John Wiley & Sons NY（1995-2001）の第１５章に示されている。
単離されたタンパク質複合体、およびその個々のタンパク質成分（断片、変異体、誘導体およびホモログを含む）は、当業者に公知の任意の好適な手順によって作製され得る。
【００７８】
一実施形態では、本発明のタンパク質は化学合成によって生成される。化学合成技術は当技術分野で周知であるが、好適な方法論の例として、当業者はCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coliganら編, John Wiley & Sons NY（1995-2001）の第１８章を参照してもよい。
【００７９】
別の実施形態では、タンパク質は組換えタンパク質として作製され得る。
組換えタンパク質の生成は当技術分野で周知であるが、当業者は、例えばSambrookら, MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Press, 1989）の特に第１６章および第１７章；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubelら編（John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999）の特に第１０章および第１６章；ならびにCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coliganら編（John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999）の特に第１章、第５章および第６章に記載されているような標準的プロトコールを参照してもよい。
【００８０】
一実施形態では、組換えタンパク質は、
（ｉ）発現ベクターにおいて１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結された当該タンパク質をコードする核酸を含む発現構築物を作製するステップ；
（ｉｉ）宿主細胞をその発現構築物でトランスフェクションまたは形質転換するステップ；および
（ｉｉｉ）宿主細胞内で組換えタンパク質を発現させるステップ
を含む方法によって産生される。
【００８１】
「発現ベクター」は、プラスミドなどの自己複製する染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
「作動可能に連結された」または「作動可能に接続された」とは、調節ヌクレオチド配列（複数可）が、その核酸の転写、またはその核酸によりコードされているタンパク質の翻訳を開始、調節、または他の方法で制御するように、本発明の組換え核酸に対して配置されていることを意味する。
【００８２】
調節ヌクレオチド配列は一般に、発現に用いる宿主細胞に適当なものである。当技術分野では様々な宿主細胞に対して多種の適当な発現ベクターおよび好適な調節配列が知られている。
【００８３】
典型的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、限定するものではないが、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボゾーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、スプライシング供与／受容配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられる。
【００８４】
構成プロモーター（ＣＭＶ、ＲＳＶ、アデノウイルス、ＳＶ４０、およびヒト延長因子プロモーターなど）および誘導／抑制プロモーター（ｔｅｔ−抑制プロモーターおよびＩＰＴＧ誘導プロモーター、メタロチオネイン誘導プロモーターまたはエクジソン誘導プロモーターなど）が当技術分野で周知であり、本発明により意図される。また、プロモーターは２つ以上のプロモーターの要素を併せ持つハイブリッドプロモーターであってもよいことが理解されるだろう。
【００８５】
また、発現構築物は融合相手（一般に、発現ベクターにより提供される）を含んでもよく、これにより、本発明の組換えタンパク質は融合相手との融合ポリペプチドとして発現される。融合相手の主要な利点は、それらが融合タンパク質の同定および／または精製を助けるということである。
【００８６】
融合相手の周知の例としては、限定するものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ：maltose binding protein）、およびヘキサヒスチジン（ＨＩＳ６）が挙げられ、これらはアフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製のためには、アフィニティークロマトグラフィーの適切なマトリックスはそれぞれグルタチオン結合樹脂、アミロース結合樹脂、およびニッケル結合樹脂またはコバルト結合樹脂である。このようなマトリックスの多くは、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）（（ＨＩＳ６）融合相手を用いる場合に有用）およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムなどの「キット」の形態で入手可能である。
【００８７】
いくつかの場合では、融合相手は、因子Ｘａまたはトロンビンなどのプロテアーゼ切断部位も持ち、適切なプロテアーゼに本発明の融合タンパク質を部分的に消化させ、それにより、そこから本発明の組換えポリペプチドを遊離させることができる。その後、遊離したタンパク質を、これに続くクロマトグラフィー分離によって融合相手から単離することができる。
【００８８】
本発明による融合相手はまた、その範囲内に「エピトープタグ」も含み、これは通常、特異的抗体が入手可能な短いペプチド配列である。特異的モノクローナル抗体が容易に入手可能なエピトープタグの周知の例としては、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素およびＦＬＡＧタグが挙げられる。
【００８９】
発現に好適な宿主細胞は、例えば、大腸菌（Escherichia coli）（例えばＤＨ５）、酵母細胞、バキュロウイルス発現系とともに用いられるＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ、ＣＶ−１、ＮＩＨ ３Ｔ３、および２９３細胞などの原核細胞または真核細胞であり得るが、これらに限定されない。
【００９０】
発現構築物はまた、形質転換宿主細胞に選択薬剤に対する耐性を付与する１つ以上の選択マーカーヌクレオチド配列も含み得る。形質転換細菌の選択のために有用な選択マーカーとしてはｂｌａ、ｋａｎＲおよびｔｅｔＲが含まれ、一方、形質転換真核細胞は、ハイグロマイシン、Ｇ４１８およびピューロマイシンなどのマーカーによって選択され得るが、これらに限定されない。
【００９１】
宿主細胞への遺伝物質の導入に関して「形質転換する」および「トランスフェクションする」とは、一般に、宿主細胞への遺伝物質の導入を表すために用いられる。宿主細胞に外来の遺伝物質を導入するためには、限定するものではないが、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション、リポフェクタミン、リポフェクチンおよび他の親油性薬剤による送達、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、ならびにプロトプラスト融合を含む多くの周知の方法がある。
【００９２】
本発明は、本発明の合成キメラタンパク質（その変異体およびホモログを含む）をコードする単離された核酸を提供する。
本明細書において「核酸」とは、一本鎖または二本鎖ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ＲＮＡｉならびにＤＮＡ（ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む）を表す。
【００９３】
「ポリヌクレオチド」は８０個以上の連続するヌクレオチドを有する核酸であり、「オリゴヌクレオチド」は８０個未満の連続するヌクレオチドを有する。
「プローブ」は、例えばノーザンブロット法またはサザンブロット法で相補配列を検出するために適宜標識された一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。
【００９４】
「プライマー」は通常、相補核酸「鋳型」とアニーリングすることができ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）などのＤＮＡポリメラーゼの作用により鋳型依存的様式で延長され得る一本鎖オリゴヌクレオチド（好ましくは、１５〜５０個の連続するヌクレオチドを有する）である。
【００９５】
本発明の合成核酸は、当技術分野で公知のように、化学合成アプローチによって、または核酸配列増幅技術を利用する組換え法によって、またはこれらの組合せによって生成してもよい。
【００９６】
化学的に合成されたプライマーおよびオリゴヌクレオチド、本発明に従って有用な合成装置および関連技術は、典型的にはほとんどの研究室で入手可能であるか、または市販で購入することができる。
【００９７】
好適な核酸増幅技術は当業者に周知であり、例えばAusubelら、前掲の第１５章に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ligase chain reaction）；例えば米国特許第５，４２２，２５２号に記載されているような鎖置換増幅法（ＳＤＡ：strand displacement amplification）；例えばLiuら, 1996, J. Am. Chem. Soc. 118 1587、国際公開第ＷＯ９２／０１８１３号および国際公開第ＷＯ９７／１９１９３号に記載されているようなローリングサークル複製（ＲＣＲ：rolling circle replication）；例えばSooknananら, 1994, Biotechniques 17 1077に記載されているような核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ：nucleic acid sequence-based amplification）；および例えばTyagiら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 5395に記載されているようなＱ−βレプリカーゼ増幅が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
好ましい核酸配列増幅技術はＰＣＲである。
本明細書において「増幅産物」とは、核酸増幅技術によって作製された核酸産物を指す。
【００９９】
本発明の核酸の生成および発現においてはまた、コドン配列の冗長性が利用可能であり、これにより、本明細書に例示された核酸は、それによってコードされているアミノ酸配列を変化させることなく容易に改変され得ることが理解されるであろう。
【０１００】
特定の実施形態では、核酸は、当技術分野で周知のように、組換え発現に用いる宿主細胞の好ましい「コドン使用頻度」に従って至適化することができる。これは、優先的なコドン使用頻度がタンパク質発現に影響を及ぼす特定の生物またはその細胞において、最適な発現のために核酸を効果的に「仕立てる（tailor）」ことができる。
【０１０１】
従って、本発明は、本明細書に例示される核酸と相同な合成核酸を含む。
一実施形態では、核酸ホモログは、本明細書に記載される合成キメラタンパク質構築物のいずれか１つをコードする核酸と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１０２】
好ましくは、配列同一性は、本発明のコード核酸の少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９５％または有利には実質的に全長にわたって評価される。
【０１０３】
別の実施形態では、核酸ホモログは、本明細書に記載される合成キメラタンパク質構築物のいずれか１つをコードする核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。
【０１０４】
「ハイブリダイズ」および「ハイブリダイゼーション」は、本明細書において、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を作り出す、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列の対合を表すために用いられる。ハイブリダイズ配列は、当技術分野で周知のように、相補的プリンとピリミジンの間の塩基対合を介して生じる。
【０１０５】
これに関して、修飾されたプリン（例えば、イノシン、メチルイノシンおよびメチルアデノシン）および修飾されたピリミジン（チオウリジンおよびメチルシトシン）も塩基対合に関わり得ることが理解されるであろう。
【０１０６】
本明細書において「ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイゼーション中の温度およびイオン強度条件、ならびにある特定の有機溶媒および／または界面活性剤の有無を指す。ストリンジェンシーが高いほど、ハイブリダイズするヌクレオチド配列間に必要とされる相補性程度が高くなる。
【０１０７】
「ストリンジェント条件」は、高頻度の相補塩基を有する核酸のみがハイブリダイズする条件を表す。
本明細書において高ストリンジェンシーという場合には、
（ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションには、少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩、４２℃での洗浄には、少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩；
（ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションには、１％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、６５℃を超える温度での約１時間の洗浄には、（ａ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；または（ｂ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ；ならびに
（ｉｉｉ）６８℃またはそれ以上での約２０分の洗浄には、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
を含み、包含する。
【０１０８】
一般に、洗浄は、Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％−１２℃で行われる。一般に、二重鎖ＤＮＡのＴｍは、不一致塩基の数が１％増すごとに１℃低下する。
上記のことにもかかわらず、Ausubelら、前掲の第２．９章および第２．１０章の、特に２．９．１〜２．９．２０頁に記載されているようなストリンジェント条件が当技術分野で周知である。
【０１０９】
本発明はまた、本発明の合成キメラタンパク質（キメラタンパク質、またはその断片、変異体および／もしくは誘導体を含む）に対する抗体も意図する。本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。抗体の産生、精製および使用に適用可能な周知のプロトコールは、例えば、Coligan ら, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY（John Wiley & Sons NY, 1991-1994）の第２章ならびにHarlow, E.およびLane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に見出せる。
【０１１０】
一般に、本発明の抗体は、本発明のポリペプチド、断片、変異体または誘導体と結合またはコンジュゲートする。例えば、これらの抗体はポリクローナル抗体を含み得る。このような抗体は、例えば、本発明のポリペプチド、断片、変異体または誘導体を産生種（マウスまたはウサギを含み得る）に注射してポリクローナル抗血清を得ることによって作製され得る。ポリクローナル抗体を産生する方法は当業者に周知である。使用可能なプロトコールの例は、例えば、Coliganら, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, 前掲、ならびにHarlowおよびLane, 1988, 前掲に記載されている。
【０１１１】
産生種で得られるポリクローナル抗血清の代わりに、例えばKohlerおよびMilstein（1975, Nature 256, 495）により記載されているような標準法を用いて、または例えばColiganら, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, 前掲に記載されているような、最近のその改変法によって、本発明の１つ以上のポリペプチド、断片、変異体または誘導体を接種した産生種に由来する脾細胞またはその他の抗体産生細胞を不死化することにより、モノクローナル抗体を産生してもよい。
【０１１２】
本発明はまた、上記に言及したポリクローナルまたはモノクローナル抗体のＦｃ断片またはＦａｂ断片を含む抗体も、その範囲内に含む。あるいは、抗体は、本発明のタンパク質に対する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）を含み得る。このようなｓｃＦｖは、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、欧州特許第２３９，４００号またはWinterおよびMilstein（1991, Nature 349 293）による論文にそれぞれ記載されている方法に従って作製され得る。
【０１１３】
この抗体または抗体フラグメントに標識が結合されていてもよい。
標識は色素原、触媒、酵素、蛍光団、化学発光分子、ユウロピウム（Ｅｕ３４）などのランタニドイオン、放射性同位元素、および直接的可視標識（direct visual label）を含む群から選択し得る。直接的可視標識の場合、コロイド金属粒子もしくは非金属粒子、色素粒子、酵素もしくは基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、またはシグナル生成分子を含有するその他の小胞などを使用し得る。
【０１１４】
多数の有用な酵素が米国特許第４，３６６，２４１号、同第４，８４３，０００号および同第４，８４９，３３８号に開示されている。本発明で有用な酵素標識としては、アルカリ性ホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。酵素標識は単独で、または第２の酵素と組み合わせて液相で使用し得る。
【０１１５】
例として、蛍光団は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＬ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）およびＲ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）であり得るが、これらに限定されない。
【０１１６】
本発明はまた、本発明の単離されたタンパク質複合体（その変異体および誘導体を含む）を含む医薬組成物も提供する。
このような単離されたタンパク質複合体は、本発明の合成キメラタンパク質を含むいずれの形態であってもよいが、これに限定されない。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、細胞遊走、組織再生および創傷治癒を促進するか、またはそうでなければ助長するために使用してもよい。あるいは、医薬組成物は、第２の部位への腫瘍細胞遊走を防止または阻害することにより腫瘍転移を防ぐために投与してもよい。
【０１１８】
該組成物は必要に応じて治療的処置または予防的処置で使用することができる。例えば、医薬組成物は、皮膚修復、創傷治癒、火傷治癒およびその他の皮膚科処置に治療製剤または美容製剤の形態で適用することができる。
【０１１９】
これに関して、医薬組成物は生体材料、生体高分子、ヒドロキシアパタイトもしくはその誘導体などの無機材料、外科用インプラント、人工補綴物、創傷用もしくは火傷用包帯、圧迫、包帯などと会合させて、またはそれらの成分として（医薬組成物を、好適には、含浸、被覆、または他の方法で含ませて）投与することができる。
【０１２０】
好適には、医薬組成物は適当な薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
好ましくは、薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤は、哺乳類、より好ましくはヒトへの投与に好適なものである。
【０１２１】
「薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤」とは、全身投与において安全に使用可能な固体または液体の増量剤、希釈剤または封入物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当技術分野で周知の様々な担体を使用することができる。これらの担体は、糖類、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張生理食塩水、ならびに塩酸塩、臭化物および硫酸塩を含む無機酸塩、そして酢酸塩、プロピオン酸塩およびマロン酸塩などの有機酸塩といった塩類、ならびにパイロジェンフリー水を含む群から選択され得る。
【０１２２】
薬学上許容される担体、希釈剤および賦形剤を記載している有用な参照文献は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991）である。
本発明の組成物を患者に提供するには、安全な投与経路であればいずれを用いてもよい。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、口内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内および経皮などが使用可能である。
【０１２３】
投与形には、錠剤、分散液、懸濁液、注射液、溶液、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、エアゾールおよび経皮パッチなどが含まれる。これらの投与形にはまた、そのために特に設計された徐放性デバイスの注入もしくは移植、またはこの様式で付加的に働くように改変された他の形態のインプラントも含まれる。治療薬の徐放性は、治療薬を例えばアクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにある種のセルロース誘導体（ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）を含む疎水性ポリマーで被覆することによって達成することができる。さらに、徐放性は他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを用いることによって達成することもできる。
【０１２４】
上記組成物は投与剤形に適合した様式で、薬学上有効な量で投与することができる。本発明において、患者に投与される用量は、適当な期間にわたって患者において有益な応答を達成するに十分なものでなければならない。投与される薬剤の量は処置される対象（その年齢、性別、体重および健康状態を含む）、医師の判断による要因によって異なる。
【０１２５】
創傷治癒用の医薬組成物に関しては、特に、米国特許第５，９３６，０６４号および国際公開第９９／６２５３６号が参照される。
本発明の医薬組成物はまた、ウイルスベクター（ワクシニアなど）などの発現ベクターおよび遺伝子療法において有用なウイルスベクターを含み得る。後者には、Braun-Falcoら（1999, Gene Ther. 6 432）に記載されているようなアデノウイルスおよびアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、Buchshacherら（2000, Blood 95 2499）に記載されているものなどのレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター、ならびに単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来するベクターが含まれる。内分泌遺伝子療法に有用なウイルスベクターの概論はStoneら（2000, J. Endocrinol. 164 103）に示されている。
【０１２６】
本発明ではまた、米国特許第５，９５８，７６４号に記載されているものなど、遺伝子発現を表皮細胞に標的化する特定の発現ベクター、また、米国特許第５，９６２，４２７号に記載されているものなど、in vivo創傷治癒用の特定の発現ベクターも使用可能である。
【０１２７】
本発明は、本発明の単離されたタンパク質複合体（合成キメラタンパク質を含む）を用いた処置方法を提供する。これらの方法は、哺乳類、より詳しくはヒトの治療的処置および／または予防的処置を特に目的とする。
【０１２８】
しかしながら、本発明による治療的使用はまた、ペット動物および伴侶動物、労役動物（ウマ、ラクダおよびグレーハウンドなど）家畜、実験動物ならびに異種移植用の細胞、器官および組織の供給源として用いられる動物といった哺乳類にも適用可能である。
【０１２９】
本発明はまた、本発明の単離されたタンパク質複合体（合成キメラタンパク質を含む）が皮膚の質または皮膚の外観を改善するまたは向上させるために投与される、美容的処置の方法も意図する。
【０１３０】
このような処置は、異常な皮膚細胞増殖から起こる乾癬および肥厚性瘢痕形成などの皮膚障害の予防または改善を含み得る。
あるいは、二次的な部位への腫瘍細胞遊走を遮断することにより腫瘍転移が防止または阻害される処置方法も意図される。さらに、細胞増殖を遮断することにより癌を処置する方法も意図される。
【０１３１】
特定の実施形態では、治療的処置および／または予防的処置は、本発明の単離されたタンパク質複合体（合成キメラタンパク質を含む）を、生体材料、生体高分子、ヒドロキシアパタイトなどの無機材料、外科用インプラント、人工補綴物、創傷用もしくは火傷用包帯、圧迫、包帯などと会合させて、またはそれらの成分として（単離されたタンパク質複合体を、好適には、含浸、または被覆、あるいは他の方法で含ませて）用い得る。
【０１３２】
このような方法は、以上に定義した医薬組成物の投与を含み、米国特許第６，０９０，７９０号に記載されているものなどの特定の組織部位へのマイクロニードル注射、米国特許第６，０５４，１２２号に記載されているものなどの創傷、火傷もしくは潰瘍に適用される局所用クリーム、ローションもしくは密封包帯、または国際公開第９９／４７０７０号に記載されているものなどの、組成物を放出するインプラントの方式によってもよい。
【０１３３】
これに関しては、例えば米国特許第５，９２９，０４０号および同第５，９６２，４２７号に示されている方法に従って、遺伝子療法を適用することもできる。
また、例えば所望の増殖因子発現を遺伝的に操作することにより、皮膚代用を作製するために皮膚細胞を遺伝的に改変し得る方法も存在する（Suppら, 2000, J. Invest. Dermatol. 114 5）。この分野の総説の一例がBevanら（Biotechnol. Gent. Eng.Rev. 16 231）に示されている。
【０１３４】
また、国際公開第９９／１１７８９号に示されているものなど、レシピエントにトランスフェクションまたは形質転換された細胞を「接種する」ことも意図される。
これらの方法は細胞遊走を刺激し、それにより、創傷および火傷の治癒、潰瘍などの皮膚損傷部の修復、例えば自己皮膚のin vitro培養による組織置換および移植、腎臓および肺などの内部器官の再上皮化、ならびに損傷した神経組織の修復を助長する、または進行させるために使用可能である。
【０１３５】
皮膚置換療法は当技術分野では周知のものとなっており、例えばKeheら（1999, Arch. Dermatol. Res. 291 600）に記載されているような上皮細胞／ケラチノサイト系の同時培養物の使用、または初代（通常、自己の）表皮細胞、皮膚細胞および／またはケラチノサイトのin vitro培養を採用してもよい。これらの技術ではまた、操作された生体材料および合成ポリマー「スキャフォールド」を用いてもよい。
【０１３６】
この分野の総説の例が、TerskikhおよびVasiliev（1999, Int. Rev. Cytol. 188 41）ならびにEaglesteinおよびFalanga（1998, Cutis 62 1）に示されている。
より詳しくは、頭蓋顔面手術に有用な代用口腔粘膜の作製が、Izumiら（2000, J. Dent. Res. 79 798）に記載されている。胎児ケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞は、Fauzaら（J. Pediatr. Surg. 33 357）に記載されているものなど、皮膚損傷部を処置する目的で、移植用の皮膚を作製するためにin vitroで増殖させることができるが、in vitroにおいてヒアルロン酸由来生体材料上で培養された皮膚および表皮要素からの皮膚置換は火傷の処置に有用である可能性があることが示されている（Zacchiら, 1998, J. Biomed. Mater. Res. 40 187）。
【０１３７】
また、例えばSheridanら（2000, J. Control Release 14 91）およびFauzaら（1998, 前掲）に記載されているように、代用皮膚の操作を助けるためのポリマースキャフォールドも意図され、それは創傷および火傷に皮膚細胞を送達するための薬剤としてのマイクロスフェアである（LaFranceおよびArmstrong, 1999, Tissue Eng. 5 153）。
【０１３８】
本発明は、ＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−ＩＩ：ＦＮ、ＥＧＦ：ＦＮ、ｂＦＧＦ：ＦＮ、ＫＧＦ：ＦＮ、またはＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ：ＦＮ複合体などの増殖因子とフィブロネクチンとを含む複合体のアゴニストまたはアンタゴニストを同定、スクリーニング、設計またはそうでなければ作出するための、本発明の単離されたタンパク質複合体（合成キメラタンパク質を含む）の使用を意図する。このような薬剤は「ミメティック（mimetic）」であり得る。「ミメティック」とは、本明細書において、タンパク質またはペプチドの特定の機能的領域を模倣するように設計された分子を指して用いられ、その範囲内に、当技術分野で十分に理解されている「アゴニスト」、「類似体」および「アンタゴニスト」という用語を含む。
【０１３９】
一実施形態では、ＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−ＩＩ：ＦＮ、ＥＧＦ：ＦＮ、ｂＦＧＦ：ＦＮ、ＫＧＦ：ＦＮ、またはＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ：ＦＮ複合体により、同族増殖因子受容体およびＦＮ受容体の結合を模倣するアゴニストが作出される。このような分子は、創傷治癒および皮膚再生などに必要とされるような細胞遊走の刺激剤としての有用性を持ち得る。
【０１４０】
別の実施形態では、ＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−ＩＩ：ＦＮ、ＥＧＦ：ＦＮ、ｂＦＧＦ：ＦＮ、ＫＧＦ：ＦＮ、またはＩＧＦＩＩ：ＩＧＦＢＰ：ＦＮ複合体により、同族増殖因子受容体およびインテグリン受容体の結合を防止または阻害するアンタゴニストが作出される。このような分子は細胞遊走および／または細胞増殖の阻害剤として（それにより有用な抗腫瘍薬となる）、また、異常な細胞増殖から起こる乾癬および肥厚性瘢痕形成などの皮膚障害の処置において有用性を持ち得る。
【０１４１】
上記ミメティック、アゴニスト、アンタゴニスト、および類似体は、所望の生物活性および半減期を備えたペプチド、ポリペプチドまたはその他の有機分子、好ましくは、小有機分子であり得る。
【０１４２】
コンピュータによる構造データベース検索は、ミメティックを同定するための手順としての利用が増えてきている。原則としてミメティックを同定するのに好適といえるデータベース検索法は、国際公開第９４／１８２３２号（ＨＩＶ抗原ミメティックの作出を対象とする）、米国特許第５，７５２，０１９号および同第９７／４１５２６号（ＥＰＯミメティックの同定を対象とする）に見出せる。
【０１４３】
他の方法には、分子の相互作用を同定する様々な生物物理学的技術が含まれる。これらは、例えばＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−ＩＩ：ＦＮ、ＥＧＦ：ＦＮ、ｂＦＧＦ：ＦＮ、ＫＧＦ：ＦＮ、またはＩＧＦ−ＩＧＦＢＰ−ＦＮ複合体の形成に影響を及ぼすかどうかに従って候補分子をスクリーニングすることを考慮したものである。競合的放射性リガンド結合アッセイ（関連の方法としてはUptonら, 1999, 前掲を参照）、分析的超遠心分離、微量熱量測定、表面プラズモン共鳴、および光学バイオセンサーに基づく方法などの有用であり得る技術に適用可能な方法が、CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coliganら編（John Wiley & Sons, 1997）の第２０章に示されている。
【０１４４】
当業者は以下の非限定例を参照すれば、本発明をより容易に理解し、実施することができる。
（実施例）
実施例１
ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰおよびＦＮは細胞遊走を刺激する
ＩＧＦＢＰ−３または−５の存在下、予め結合させたＦＮ（１μｇ／ｍＬ）および漸増濃度のＩＧＦ−Ｉで被覆したトランスウェル（Transwell）（登録商標）にＭＣＦ−１０Ａ細胞を播種した。これらの細胞を５時間遊走させた。その後、各処理に応答して膜を通り抜ける細胞の数を、ＦＮ単独（ＳＦＭ）で遊走した細胞に対するパーセンテージとして表した。３回の実験（各反復実験において４ウェルで処理を試験した）からＭＣＦ−１０データをプールし、図２に示す。エラーバーはＳＥＭを示す。ＳＦＭ＝無血清培地。ＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ−３：ＦＮおよびＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ−５：ＦＮは、ＦＮ単独の対照ウェルよりも有意に高い遊走を刺激することができた（応答はＦＮ対照ウェルの、それぞれ１５３．７＋／−７．３％、１９２．５＋／−６．８％および１８７．５＋／−６．５％）（ｐ＜０．０５）。また、ＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ−３：ＦＮおよびＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ−５：ＦＮ処置に対するＭＣＦ７−１０Ａ細胞の応答は、ＦＮとＩＧＦＢＰまたはＩＧＦ−Ｉのいずれか一方とのみを含む場合に得られた応答よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。このデータは、トリマーＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ−３／５：ＦＮ複合体が存在する場合に最大応答が生じることを示す。このことは、ＦＮと結合したＩＧＦ−Ｉを含むキメラがＦＮ結合インテグリンおよび同族増殖因子受容体を活性化することを示唆する。
実施例２
合成キメラフィブロネクチン：増殖因子タンパク質
ここでは、ＦＮ：増殖因子（例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＫＧＦ）キメラの形態の本発明の合成キメラタンパク質の例を示す。
【０１４５】
合成キメラタンパク質は、増殖因子と融合したあらゆる全長または末端切断型ＦＮ（アミノ酸残基の修飾を含むまたは含まない）を含む。さらに、ＦＮおよび増殖因子は種々のペプチドリンカーと融合されていてもされていなくてもよい。
【０１４６】
種々の長さのＦＮタンパク質が、全長成熟型ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦもしくはＫＧＦタンパク質、または少なくとも、同族増殖因子受容体と結合することができるＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦもしくはＫＧＦタンパク質のドメインと結合している一連のキメラ発現構築物を設計する。各場合において、ＦＮセグメントは好ましくは、例えばＧｌｙ４ Ｓｅｒ（配列番号７）リンカー、Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ３（配列番号８）リンカー、（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３（配列番号９）リンカー、または（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）４（配列番号１０）リンカーなどのリンカーを介して、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ配列に連結される。
【０１４７】
合成キメラタンパク質の例としては、限定するものではないが：
Ａ）ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｂ）ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８〜９［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｃ）ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８〜１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｄ）ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン９［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｅ）ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン９〜１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｆ）ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＧＦ）；
Ｇ）ＦＮ Ｉ型ドメイン１〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｈ）ＦＮ Ｉ型ドメイン１〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８〜９［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｉ）ＦＮ Ｉ型ドメイン１〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８〜１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｊ）ＦＮ Ｉ型ドメイン１〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン９［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｋ）ＦＮ Ｉ型ドメイン１〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン９〜１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｌ）ＦＮ Ｉ型ドメイン１〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｍ）ＦＮ Ｉ型ドメイン４〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｎ）ＦＮ Ｉ型ドメイン４〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８〜９［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｏ）ＦＮ Ｉ型ドメイン４〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８〜１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｐ）ＦＮ Ｉ型ドメイン４〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン９［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｑ）ＦＮ Ｉ型ドメイン４〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン９〜１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｒ）ＦＮ Ｉ型ドメイン４〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）
が挙げられる。
【０１４８】
ヒトＦＮ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＫＧＦ遺伝子ＤＮＡ配列（それぞれ配列番号１〜６）は、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）での発現のためにコドンを至適化することができる。次に、そのコード配列を、キメラの精製を助けるためにポリヒスチジン親和性タグを組み込んだ発現ベクター（例えば、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ発現ベクター（Invitrogen））にクローニングすることができる。上述のようなアミノ酸リンカーをコードするヌクレオチド配列を、部位特異的突然変異誘発ＰＣＲによって挿入することができる。リンカー配列のＣ末端へのＡｓｎの付加を用いれば、Ａｓｎ−Ｇｌｙモチーフ（ここで、Ｇｌｙは増殖因子タンパク質の最初のアミノ酸である）を作出することができる。このモチーフは、ヒドロキシルアミンにより誘導される、これらのキメラからの増殖因子タンパク質の切断を可能とする。
【０１４９】
得られる構築物は、リンカーによって全長成熟型ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦもしくはＫＧＦタンパク質、または少なくとも、同族増殖因子受容体と結合することができるＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦもしくはＫＧＦタンパク質のドメインに連結された種々の長さのＦＮタンパク質をコードする。全ての構築物のＤＮＡ配列を確認して、目的ＤＮＡ配列の忠実度が維持されていることを確かめることができる。
【０１５０】
このｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓベクター中のクローンを用いてＳｆ９昆虫細胞をトランスフェクションすることができ、免疫ブロット法により評価すると、馴化培地中に一時的に発現された分泌タンパク質が検出される。簡単に述べると、サンプルを還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、セミドライ転写法を用いてタンパク質をニトロセルロース膜に転写する。この膜をポリクローナル抗ＦＮ抗体で調べた後、増強化学発光を用いて標的タンパク質種を可視化する。
【０１５１】
キメラタンパク質の精製は、製造者の説明書に従って行うＮｉ−ＮＴＡスーパーフローアガロース（QIAGEN、オーストラリア）アフィニティークロマトグラフィーに基づく。精製プロセス中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびポリクローナル抗ＦＮ抗体（Calbiochem）を用いたウエスタンブロット解析によってキメラタンパク質をモニタリングする。
【０１５２】
細胞の遊走および／または増殖に対する合成キメラタンパク質の効果を調べるためには、ＭＣＦ−１０Ａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ならびに単離されたヒト上皮細胞、ケラチノサイトおよび線維芽細胞などの細胞を使用することができる。例えば、細胞遊走はトランスウェル（Transwell）（登録商標）遊走アッセイを用いて評価することができ、細胞増殖は当業者に周知の細胞増殖アッセイを用いて測定することができる。
【０１５３】
本明細書を通じ、その目的は、いずれか１つの実施形態または特定の特徴の集合体に本発明を限定することなく、本発明の好ましい実施形態を示すことであった。よって、当業者には、本開示に鑑みて、本発明の範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態に種々の改変および変更を行うことができることが理解されるであろう。
【０１５４】
本明細書に参照されているコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許および科学文献は全て、参照により本明細書に組み入れる。
【０１５５】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖因子受容体およびフィブロネクチンのインテグリン受容体の双方と結合してそれらを活性化することができる各ドメインを有するタンパク質複合体に関する。特定の実施形態において、本発明は、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）またはケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）受容体結合ドメインなどの増殖因子と、フィブロネクチン（ＦＮ）のインテグリン受容体結合ドメインとを含むキメラタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、細胞遊走を刺激するタンパク質複合体、ならびに細胞の遊走および／または増殖を促進または誘導する組成物および方法に関する。これらの組成物および方法は、上皮細胞の遊走ならびに／または増殖が必要とされる、創傷治癒、組織工学、皮膚置換や皮膚補充などの美容および治療処置、ならびに火傷の処置において用途を有する。他の実施形態において、本発明は、特に乳癌に関して、癌細胞転移の防止または阻害に関する本発明により提供される処置を提供する。
【背景技術】
【０００２】
過形成、ＤＮＡ合成、分化、細胞周期の進行、およびアポトーシスの阻害を含む広範な細胞プロセスに関与する多くのペプチド増殖因子が知られており、これにはインスリン様増殖因子（ＩＧＦ、例えば、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）（非特許文献１；非特許文献２）、ＥＧＦ（非特許文献３）、ｂＦＧＦ（非特許文献４）、およびＫＧＦ（非特許文献５）が含まれる。これらの効果は、それらの同族チロシンキナーゼ連結型細胞表面受容体、すなわち、それぞれＩ型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、ＥＧＦ受容体、ｂＦＧＦ受容体およびＫＧＦ受容体との結合により媒介される。ＩＧＦはまた、ＩＧＦＢＰと呼ばれる特異的結合タンパク質ファミリー（その主要な役割は遊離型のＩＧＦと結合し、それにより、それらの半減期、特異性および活性を適度に保つことである）によって厳格に調節される（非特許文献６）。
【０００３】
フィブロネクチンは、全ての脊椎動物に見られる高分子量の接着性糖タンパク質である。フィブロネクチンは、細胞接着、細胞形態および表面構造に役割を果たす。その主要な機能は、発生、組織修復および創傷治癒、細胞増殖の調節ならびに分化の際の細胞遊走への関与であると思われる（非特許文献７〜９）。フィブロネクチン多型は、単一のフィブロネクチン一次転写物中の３つの領域（ＥＤ−Ａ、ＥＤ−ＢおよびＩＩＩＣＳ）における選択的スプライシングパターンによるものである（非特許文献１０〜１２）。フィブロネクチンの厳密な組成は、組織種および／または細胞の状態によって異なる。ヒトでは、おそらく２０の異なる形態のフィブロネクチンが存在し、ほとんどがある特定の３つのモジュールの選択的スプライシングから生じる（非特許文献１３）。フィブロネクチンスプライシング変異体の発現は、発生段階に応じて調節され、かつ、組織特異的であることが明らかである。
【０００４】
フィブロネクチンは、ヘパリン、コラーゲンおよびヒアルロン酸を含む複数の細胞外分子と結合する能力を有する。フィブロネクチンは、細胞外マトリックスの種々の成分と、また、細胞表面の膜結合型フィブロネクチン受容（インテグリン）と結合することによって、細胞と細胞の相互作用、および細胞の細胞外マトリックスとの相互作用を組織化する。
【０００５】
しかしながら、細胞の遊走および／または増殖などの生物学的応答の刺激に関する、増殖因子とフィブロネクチン、およびタンパク質複合体に存在するそれらの個々のドメインの相対寄与はまだ捕らえどころがない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】JonesおよびClemmons, 1995, Endocrine Rev. 16 3
【非特許文献２】WoodおよびYee, 2000, J. Mammary Gland Biology and Neoplasia 5 1
【非特許文献３】Heldinら, 1981, Science 4 1122
【非特許文献４】Tarabolettiら, 1997, Cell Growth. Differ. 8 471
【非特許文献５】Marcheseら, 1990, J. Cell Physiol. 144 326
【非特許文献６】Clemmons, 1998, Mol. Cell. Endocrinol. 140 19
【非特許文献７】AlitaloおよびVaheri, 1982, Adv. Cancer Res. 37 111
【非特許文献８】Yamada, 1983, Annu. Rev. Biochem. 62 761
【非特許文献９】Hynes, 1985, Annu. Rev. Cell Biol. 1 67
【非特許文献１０】Petersenら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 137
【非特許文献１１】Schwarzbauerら, 1983, Cell 35 421
【非特許文献１２】Komblihttら, 1984, Nucleic Acids Res. 12 5853
【非特許文献１３】PottsおよびCampbell, 1994, Curr. Opin. Cell Biol. 6 648
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦなどの増殖因子とＦＮとを含む合成キメラの形態にあるタンパク質複合体が、同族増殖因子受容体およびＦＮ結合インテグリン受容体と結合してそれらを相乗的に同時に活性化することにより、細胞の遊走および／または増殖を刺激することを発見した。
【０００８】
よって、本発明は、広義には、増殖因子ドメインの受容体結合ドメインと、少なくとも、インテグリン受容体と結合することができるフィブロネクチンのドメインとを含む単離されたタンパク質複合体を対象とし、この単離されたタンパク質複合体は、増殖因子とインテグリン受容体を同時に活性化し、それにより生物学的応答を惹起することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様において、本発明は、
（ｉ）増殖因子または少なくとも、同族増殖因子受容体と結合することができる増殖因子のドメイン；および
（ｉｉ）フィブロネクチン、または少なくともフィブロネクチンのインテグリン結合ドメインを含むフィブロネクチンの断片
のアミノ酸配列を含む合成キメラタンパク質の形態にある、単離されたタンパク質複合体を提供する。
【００１０】
好ましくは、上記態様によれば、増殖因子はＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦである。
好ましくは、インテグリン受容体はα１またはα４インテグリンである。
【００１１】
本発明のこの態様はまた、合成キメラタンパク質中の、フィブロネクチンの１つ以上の付加的断片のアミノ酸配列も意図する。
本発明のこの態様はまた、その範囲内に、上記（ｉ）および（ｉｉ）に相当するアミノ酸配列の、ならびにフィブロネクチンの１つ以上の付加的断片に相当するアミノ酸配列の、アミノ酸欠失、付加、置換および／または突然変異も含む。
【００１２】
第２の態様において、本発明は、第１の態様の単離されたタンパク質複合体をコードする単離された核酸を提供する。
第３の態様において、本発明は、発現ベクターにおいて１つ以上の調節配列に作動可能に連結された第２の態様の単離された核酸を含む、遺伝子構築物を提供する。
【００１３】
好ましくは、遺伝子構築物は発現構築物である。
第４の態様において、本発明は、第３の態様の遺伝子構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００１４】
第５の態様において、本発明は、第１の態様の単離されたタンパク質複合体と、薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
本発明のこの態様はまた、合成タンパク質を発現する第４の態様の宿主細胞を含む医薬組成物も意図する。
【００１５】
第６の態様において、本発明は、第１の態様の合成タンパク質に特異的な抗体を提供する。
第７の態様において、本発明は、合成タンパク質を用いて、増殖因子受容体とインテグリン受容体の双方に結合させるステップを含む、細胞遊走を促進する方法を提供する。
【００１６】
好ましくは、増殖因子受容体はＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦ受容体、ｂＦＧＦ受容体、またはＫＧＦ受容体である。
好ましくは、インテグリン受容体はα１またはα４インテグリンである。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明のこの態様は、上皮／ケラチノサイト／線維芽細胞の遊走および／または増殖の促進または誘導による、哺乳類、好ましくはヒトにおける創傷治癒の助長に関する。
【００１８】
好ましくは、合成タンパク質は本発明の第１の態様によるものである。
第８の態様において、本発明は、増殖因子とフィブロネクチンとを含む複合体によって、増殖因子受容体とインテグリン受容体の双方の結合を防止、阻害、または他の方法で低減するステップを含む、細胞の遊走および／または増殖を防止する方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、増殖因子受容体はＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦ受容体、ｂＦＧＦ受容体またはＫＧＦ受容体である。
好ましくは、前記インテグリン受容体はα１またはα４インテグリンである。
【００２０】
好ましい実施形態において、本発明のこの態様は、哺乳類、好ましくはヒトにおける転移性癌細胞の遊走および／または増殖の防止または阻害に関する。
本発明のこの態様により意図される特定の例は、乳癌転移の防止または阻害である。
【００２１】
また、第７および第８の態様の方法は、予防的処置法および治療的処置法を包含し得ることが理解されるであろう。
第９の態様において、本発明は、
（ｉ）増殖因子とフィブロネクチンを含むタンパク質複合体のアゴニストであるか；または
（ｉｉ）増殖因子とフィブロネクチンを含むタンパク質複合体のアンタゴニストである
分子を生成するための、第１の態様の単離されたタンパク質複合体の使用を提供する。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、
（ｉ）ＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−ＩＩ：ＦＮ、ＥＧＦ：ＦＮ、ｂＦＧＦ：ＦＮ、ＫＧＦ：ＦＮ、もしくはＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ：ＦＮタンパク質複合体のアゴニストであるか；または
（ｉｉ）ＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−ＩＩ：ＦＮ、ＥＧＦ：ＦＮ、ｂＦＧＦ：ＦＮ、ＧＦ：ＦＮ、もしくはＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ：ＦＮタンパク質複合体のアンタゴニストである
分子を生成するための、第１の態様の合成タンパク質の使用を提供する。
【００２３】
本発明のこの態様に従って生成されたアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、創傷治癒、組織工学、皮膚再生の促進、および／または癌細胞転移もしくは皮膚の過増殖性障害（例えば、瘢痕形成および乾癬）の防止に著しい効果を奏し得る。
【００２４】
第１０の態様において、本発明は、第１の態様の単離されたタンパク質複合体を含む生体材料を提供する。
特定の実施形態では、生体材料は、本発明の単離されたタンパク質複合体を、好適には含浸、または被覆、あるいは他の方法により含ませた外科用インプラント、人工補綴物、スキャフォールド、創傷用または火傷用包帯などであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】ヒトフィブロネクチン（配列番号１）のアミノ酸配列。
【図１Ｂ】成熟ＩＧＦ−Ｉ（配列番号２）のアミノ酸配列。
【図１Ｃ】成熟ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号３）のアミノ酸配列。
【図１Ｄ】成熟ＥＧＦ（配列番号４）のアミノ酸配列。
【図１Ｅ】成熟ｂＦＧＦ（配列番号５）のアミノ酸配列。
【図１Ｆ】成熟ＫＧＦ（配列番号６）のアミノ酸配列。
【図１Ｇ】好ましいリンカー配列（配列番号７〜１２）のアミノ酸配列。
【図２】ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰおよびＦＮタンパク質複合体は乳癌細胞遊走を刺激する。ＩＧＦＢＰ−３または−５の存在下、予め結合させたＦＮ（１μｇｍＬ）および漸増濃度のＩＧＦ−Ｉで被覆したトランスウェル（Transwell）（登録商標）に、ＭＣＦ−１０Ａ細胞を播種した。これらの細胞を５時間遊走させた。その後、各処理に応答して膜を通り抜ける細胞の数を、ＦＮ単独（ＳＦＭ）で遊走した細胞に対するパーセンテージとして表した。３回の実験（各反復実験において４ウェルで処理を試験した）からＭＣＦ−１０データをプールする。エラーバーはＳＥＭを示す。ＳＦＭ＝無血清培地。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦなどの増殖因子とＦＮとを含む合成キメラが、応答性細胞により発現されるそれらの同族増殖因子受容体およびＦＮ結合インテグリン受容体と結合し、これらを介して細胞遊走に対して生物学的効果を発揮するという発見から生まれたものである。より詳しくは、この二重の結合事象は細胞の遊走および増殖を相乗的に刺激する。これらの安定で生物学的に活性の一本鎖キメラ分子は、少なくとも、その同族受容体と結合することができる増殖因子の最小のドメインまたは領域を、ＦＮのインテグリン結合ドメインを少なくとも含む、ＦＮの１つ以上のＩＩＩ型ドメインと組み合わせて含む。
【００２７】
この発見により、本発明者らは、少なくとも、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦの、例えば、それらの同族受容体と結合することができる最小のドメインまたは領域を、ＦＮのインテグリン結合ドメインと組み合わせて含む単離されたタンパク質複合体を提供するに至った。さらにより詳しくは、これらのドメインを含む単一の連続するタンパク質が作製され得る。
【００２８】
単一の合成タンパク質の形態にあるこのようなタンパク質複合体は、それらの同族受容体およびＦＮ結合インテグリン受容体と配位結合または共結合し、従って、細胞の遊走および／または増殖ならびに創傷治癒の促進に有用な薬剤である。同様に、同族受容体およびＦＮ結合インテグリン受容体の共結合の防止は、癌細胞転移を防止するために使用可能である。
【００２９】
本明細書を通じ、特に断りのない限り、「含む」は、排除ではなく包含を意図して用いられ、従って、示された整数または整数群は１つ以上の示されていない整数または整数群を含み得る。
【００３０】
特に増殖因子受容体結合ドメインおよびインテグリン結合ドメインに関して、このようなドメインは、そのドメインのアミノ酸配列を、所望であれば他の付加的アミノ酸とともに含む。
【００３１】
このようなドメインは、１０個以下、好ましくは５個以下、またはより好ましくは４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個の付加的アミノ酸を伴って、そのドメインのアミノ酸配列から「本質的になる」場合があることも理解されるであろう。
【００３２】
また、このようなドメインは、付加的アミノ酸を伴わずに、そのドメインのアミノ酸配列から「本質的になる」場合があることも理解されるであろう。
本発明の目的では、「単離された」とは、その天然状態から取り出された、またはそうでなければ、人間の操作を施された材料を意味する。単離された材料は、その天然状態において通常付随する成分を実質的もしくは本質的に含まないものであり得るか、またはその天然状態において通常付随する成分を伴っているが、操作されて人為的状態となったものであり得る。単離された材料は、天然型、化学合成型または組換え型であり得る。
【００３３】
本明細書において「合成」とは、天然には存在せず、人間の技術介入によって作出されたことを意味する。合成タンパク質および核酸に関して、これは、当技術分野で十分に理解されているような組換え、化学合成またはコンビナトリアル技術によって生成された分子を包含する。
【００３４】
「タンパク質」とは、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当技術分野で十分に理解されているような天然または非天然アミノ酸、Ｄ−またはＬ−アミノ酸であり得る。「タンパク質」とはまた、当技術分野で慣用されるような「糖タンパク質」および「リポタンパク質」などの用語も含み、包含する。
【００３５】
「ペプチド」とは、５０個未満のアミノ酸を有するタンパク質である。
「ポリペプチド」とは、５０個以上のアミノ酸を有するタンパク質である。
以上に記載されるように、本発明は、１つの特定の態様において、
（ｉ）増殖因子、または少なくとも、同族増殖因子受容体と結合することができる増殖因子のドメイン；および
（ｉｉ）フィブロネクチン、または少なくともフィブロネクチンのインテグリン結合ドメインを含むフィブロネクチンの断片
のアミノ酸配列を含む合成キメラタンパク質の形態にある、単離されたタンパク質複合体を提供する。
【００３６】
本明細書において「キメラタンパク質」とは、連続するアミノ酸配列、すなわち、フィブロネクチンのインテグリン受容体結合ドメイン、任意でフィブロネクチンの付加的ドメイン、および増殖因子または少なくとも増殖因子の受容体結合ドメインに由来するアミノ酸を含む。
【００３７】
本明細書において「増殖因子」とは、in vitroおよび／またはin vivoにおいて細胞の増殖、分化、生存および／または遊走を調節し得る生物学的に活性のタンパク質である。
増殖因子の例としては、限定するものではないが、ＩＧＦ（JonesおよびClemmons, 1995, Endocrine Rev. 16 3; WoodおよびYee, 2000, J. Mammary Gland Biology and Neoplasia 5 1; Keissら, 1994, Hormone Research 41 66）（例えば、ＩＧＦ−Ｉ（UniProtKB/Swiss-Prot: #P05019、成熟タンパク質は全長配列のアミノ酸残基４９〜１１８を含む）およびＩＧＦ−ＩＩ（UniProtKB/Swiss-Prot: #P01344、成熟タンパク質は全長配列のアミノ酸残基２５〜９１を含む））、ＶＥＧＦ（Neufeldら, 1999, FASEB J. 13 9-22）、ＰＤＧＦ（Heldin, 1992, EMBO J. 11 4251-4259）、ＥＧＦ（Heldinら, 1981, Science 4 1122-1123; UniProtKB/Swiss-Prot: #P01133、成熟タンパク質は全長配列のアミノ酸残基９７１〜１０２３を含む）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ; Nurcombeら, 2000, J. Biol. Chem. 275 30009-30018）、ｂＦＧＦ（Tarabolettiら, 1997, Cell Growth. Differ. 8 471-479; UniProtKB/Swiss-Prot: #P09038、成熟タンパク質は全長配列のアミノ酸残基１４３〜２８８を含む）、オステオポンチン（Namら, 2000, Endocrinol. 141 1100）、トロンボスポンジン−１（Namら, 2000, 前掲）、テネイシン−Ｃ（Araiら, 1996, J. Biol. Chem. 271 6099）、ＰＡＩ−１（Namら, 1997, Endocrinol. 138 2972）、プラスミノーゲン（Campbellら, 1998, Am. J. Physiol. 275 E321）、フィブリノーゲン（Campbellら, 1999, J. Biol. Chem 274 30215）、フィブリン（Campbellら, 1999,前掲）、トランスフェリン（Weinzimerら, 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 1806）、およびＫＧＦ（Marcheseら, 1990, J. Cell Physiol. 144 326-32; UniProtKB/Swiss-Prot: #P21781、成熟タンパク質は全長配列のアミノ酸残基３２〜１９４を含む）が挙げられる。
【００３８】
本発明の合成キメラタンパク質の形態にある単離されたタンパク質複合体は、増殖因子、または少なくとも、同族増殖因子受容体と結合することができる増殖因子のドメインを含む。
【００３９】
ここで「ドメイン」とは、少なくとも、同族増殖因子受容体と結合することができる増殖因子の部分または領域を意味する。限定するものではないが、一般に、同族増殖因子受容体は細胞により発現され、少なくとも増殖因子のドメインによる同族増殖因子受容体の結合または連結は、細胞の増殖、分化、生存および／または遊走などの細胞応答を惹起する。
【００４０】
特にＩＧＦ−Ｉに関して、該ドメインは好適には、ロイシン残基でないアミノ酸残基２４を含む。
一般に、該残基はチロシンである。
【００４１】
特にＩＧＦ−ＩＩに関して、該ドメインは好適には、ロイシン残基でないアミノ酸残基２７を含む。
一般に、該残基はチロシンである。
【００４２】
特にＩＧＦ−Ｉに関して、一実施形態では、該ドメインはＩＧＦ−Ｉの残基１〜７０からなる。
別の実施形態では、該ドメインはＩＧＦ−Ｉの残基４〜７０からなる。
【００４３】
また、本発明の単離されたタンパク質複合体の別の成分は、フィブロネクチンの少なくともインテグリン結合ドメインであることも理解されるであろう。
好ましくは、インテグリン受容体はα１またはα４インテグリンである。
【００４４】
特定の理論に束縛されるものではないが、合成キメラタンパク質は、増殖因子の同族受容体およびフィブロネクチンのインテグリン受容体と共結合し、それらを共に活性化させ、それにより、細胞遊走を刺激し、誘導し、増大させ、または他の態様で促進することができる、ということが提示される。
【００４５】
本発明のキメラタンパク質の利点は、化学合成または組換え手段によって容易に生成されること、また、非共有結合で結合されたオリゴ−タンパク質複合体に必要とされるタンパク質−タンパク質相互作用の維持に頼らないので、in vivoにおいてより安定であると予測されることにある。
【００４６】
これに関して、ＩＧＦ−Ｉの受容体結合ドメインを含む単離されたタンパク質複合体にはＩＧＦＢＰも含まれるが、上記の作用様式によれば、ＩＧＦＢＰは好ましくはＩＧＦ−Ｉ／ＦＮ合成キメラ中に存在しない、ということが提示される。
【００４７】
他の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦと、ＦＮまたは少なくともＦＮのインテグリン結合ドメインを含むＦＮの断片とを含む合成キメラタンパク質の形態にあるものなどの単離されたタンパク質複合体を提供する。
【００４８】
好ましくは、インテグリン受容体はα１またはα４インテグリン受容体である。
ここで、「断片」とは、フィブロネクチンのドメイン、部分配列または部分を意味する。断片は好ましくは、成熟フィブロネクチン配列の５００個未満、４００個未満、３００個未満またはより好ましくは、約８０〜２８０個の連続するアミノ酸を構成する。フィブロネクチンの複数の断片も意図される。
【００４９】
フィブロネクチンのインテグリン結合ドメインは、好適には、ＲＧＤ配列を含む。ＲＧＤ配列は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン８〜１０（フィブロネクチン配列のアミノ酸１２６６〜１５３６）に位置する。より具体的には、ＲＧＤ配列は、フィブロネクチン配列のアミノ酸１４４７〜１５３６で定義されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１０に存在するが、第２のインテグリン結合部位はより大きな８〜１０ドメイン領域にわたって存在し得る。
【００５０】
よって、１つの特定の実施形態では、合成キメラは、ＲＧＤ配列を含むフィブロネクチン断片を含み、ここで、該断片はフィブロネクチンアミノ酸配列のアミノ酸１４４７〜１５３６のうち少なくとも６個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、もしくは全てからなるか、またはそれを含む。
【００５１】
別の特定の実施形態では、合成キメラは、ＲＧＤ配列を含むフィブロネクチン断片を含み、該断片は、フィブロネクチンアミノ酸配列のアミノ酸１２６６〜１５３６のうち少なくとも６個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも２６０個、もしくは全てのアミノ酸配列からなるか、またはそれを含む。
【００５２】
さらに別の特定の実施形態では、合成キメラは、上記実施形態によるＲＧＤ配列を含むフィブロネクチン断片を含み、ここで、該合成キメラは、フィブロネクチンアミノ酸配列の少なくとも１０個、２０個、５０個、１００個、２００個、３００個、５００個、８００個または１０００個のアミノ酸、例えば、残基１２６６のＮ末端および／または残基１５３６のＣ末端をさらに含む。よって、該合成キメラは、フィブロネクチンＩ型および／またはＩＩ型ドメイン、例えば、フィブロネクチンアミノ酸配列のアミノ酸５０〜２７３のうち少なくとも６個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、もしくは全てからなるか、またはそれを含むフィブロネクチン断片を含み得る。
【００５３】
さらに別の実施形態では、合成キメラは、フィブロネクチンアミノ酸配列のアミノ酸１１７３〜１５３６のうち少なくとも６個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、または全てのアミノ酸配列からなるか、またはそれを含むフィブロネクチン断片を含む。
【００５４】
以上のフィブロネクチン配列のナンバリングは図１に示されているフィブロネクチン配列を参照して付されることが理解されるであろう。このフィブロネクチン配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢタンパク質データベースから、タンパク質受託番号Ｐ０２７５１として得られる。フィブロネクチンドメインおよび領域は表Ｉに示されている。
【００５５】
好ましくは、フィブロネクチンまたはインテグリン結合ドメインを含む断片を含む合成キメラは、ＩＧＦＢＰアミノ酸配列を含まない。
好ましくは、上記のような合成キメラタンパク質は、増殖因子配列とフィブロネクチンアミノ酸配列の間に連続して位置する「リンカー配列」をさらに含む。
【００５６】
一実施形態では、リンカー配列は１つ以上のグリシン残基と１つ以上のセリン残基を含む。
リンカー配列の特定の例は、Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ（配列番号７）；Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ３（配列番号８）；（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３（配列番号９）；および（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）４（配列番号１０）から選択され得るが、これらに限定されない。
【００５７】
別の実施形態では、リンカー配列は、プラスミン切断認識部位（Sakiyama-Elbert ら, 2001, FASEB 15 1300）、例えば、配列：
Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｐｒｏ（配列番号１１）
に従うものを含む。
【００５８】
さらに別の実施形態では、リンカー配列は、コラゲナーゼ−３切断認識部位（KimおよびHealy, 2003, Biomacromolecules 4 1214）、例えば、配列：
Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｙｓ（配列番号１２）
に従うものを含む。
【００５９】
本発明はまた、本発明の合成キメラタンパク質の生物学的に活性の断片の使用および／または本明細書で例示される特定の増殖因子受容体結合ドメインとインテグリン結合ドメインの生物学的に活性の断片の使用に及ぶ。
【００６０】
一実施形態では、「生物学的に活性の断片」は、それが由来するタンパク質の生物活性の１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上を有する。
【００６１】
別の実施形態では、「生物学的に活性の断片」は、それが由来するタンパク質の連続するアミノ酸配列の１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上を有する。
【００６２】
また、本発明の変異型タンパク質複合体も意図される。
典型的には、タンパク質に関して、「変異型」タンパク質は、１つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されたものである。当技術分野では、いくつかのアミノ酸を、そのタンパク質の活性の性質を変化させることなく、幅広い類似の特性を有する他のアミノ酸に変化させ得ることが十分に理解されている（保存的置換）。
【００６３】
参照配列、例えば、増殖因子、増殖因子の受容体結合ドメイン、フィブロネクチンのインテグリン結合ドメイン、ＩＧＦＢＰ、または合成キメラタンパク質に存在する１つ以上の対応する残基の１つ以上のアミノ酸残基が、本発明の単離されたタンパク質複合体の生物活性を実質的に変化させることなく、改変もしくは欠失、または付加的配列を付加され得ることが理解されるであろう。
【００６４】
一実施形態では、タンパク質変異体は、参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％または８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００６５】
好ましくは、配列同一性は、参照配列の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％、９８％、または実質的に全長にわたって評価される。
【００６６】
配列同一性％を求めるために、アミノ酸および／またはヌクレオチド配列の最適なアライメントを、コンピュータによるアルゴリズム（IntelligeneticsによるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, WI, USA のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）の実行によって、または目視検査と選択された種々の方法のいずれかにより作成された最良の（すなわち、比較ウィンドウにおいて最高の相同性％となる）アライメントによって行ってもよい。また、例えばAltschulら, 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389により開示されているものなどのＢＬＡＳＴ系プログラムも挙げられる。
【００６７】
別の例において、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳ（登録商標）コンピュータプログラム（ウィンドウズ（登録商標）版バージョン２．５；日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社、米国カリフォルニア州サンフランシスコから入手可能）により計算される「一致パーセンテージ」を意味すると理解され得る。
【００６８】
配列解析の詳細な記述は、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubelら編（John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999）のユニット１９．３に見出すことができる。
本発明はまた、増殖因子の受容体結合ドメイン、フィブロネクチンのインテグリン結合ドメインまたはそれを含む単離されたタンパク質複合体の誘導体も意図する。
【００６９】
本明細書において本発明の「誘導体」タンパク質は、例えば、他の化学部分の付加、他の化学部分との抱合もしくは複合体形成によって、または当技術分野で十分に理解されている翻訳後修飾法によって変更されている。
【００７０】
アミノ酸の「付加」は、ポリペプチドまたは変異体と他のポリペプチドまたはタンパク質との融合を含み得る。他のタンパク質は、例えばタンパク質の精製を助けるものであり得る。例えば、これらには、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：green fluorescent protein）、プロテインＡ、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：glutathione S-transferase）が含まれる。
【００７１】
本発明により意図されるその他の誘導体としては、限定するものではないが、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成の際の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組み込み、ならびに本発明のポリペプチド、断片および変異体にコンフォメーション拘束をかける架橋剤および他の方法の使用が挙げられる。本発明により意図される側鎖修飾の例としては、無水酢酸によるアシル化、無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化、メチルアセトイミデートによるアミド化、シアネートによるアミノ基のカルバモイル化、ピリドキサール−５−リン酸によるリシンのピリドキシル化とその後のＮａＢＨ４による還元、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化とその後のＮａＢＨ４による還元、および２、４、６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ：2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid）によるアミノ基のトリニトロベンジル化によるものなどのアミノ基の修飾が挙げられる。
【００７２】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素形成によるカルボジイミドの活性化とその後の、例えば対応するアミドへの誘導体化によって修飾され得る。
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬で複素環式縮合生成物を形成することによって修飾され得る。
【００７３】
スルフヒドリル基は、システイン酸への過ギ酸酸化、４−クロロマーキュリフェニルスルホン酸、４−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、塩化フェニル水銀および他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成、他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成、マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、およびアルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル化などの方法によって修飾され得る。
【００７４】
トリプトファン残基は、例えば、臭化２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルもしくはハロゲン化スルホニルによるインドール環のアルキル化、またはＮ−ブロモスクシンイミドによる酸化によって修飾され得る。
【００７５】
チロシン残基は、テトラニトロメタンを用いたニトロ化による３−ニトロチロシン誘導体の形成によって修飾され得る。
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ジエチルピロカーボネートによるＮ−カルボエトキシル化によって、またはヨード酢酸誘導体によるアルキル化によって修飾され得る。
【００７６】
ペプチド合成の際に非天然アミノ酸および誘導体を組み込む例としては、限定するものではないが、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用が挙げられる。
【００７７】
タンパク質の化学誘導体化に好適な方法の例は、CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coliganら編, John Wiley & Sons NY（1995-2001）の第１５章に示されている。
単離されたタンパク質複合体、およびその個々のタンパク質成分（断片、変異体、誘導体およびホモログを含む）は、当業者に公知の任意の好適な手順によって作製され得る。
【００７８】
一実施形態では、本発明のタンパク質は化学合成によって生成される。化学合成技術は当技術分野で周知であるが、好適な方法論の例として、当業者はCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coliganら編, John Wiley & Sons NY（1995-2001）の第１８章を参照してもよい。
【００７９】
別の実施形態では、タンパク質は組換えタンパク質として作製され得る。
組換えタンパク質の生成は当技術分野で周知であるが、当業者は、例えばSambrookら, MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Press, 1989）の特に第１６章および第１７章；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubelら編（John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999）の特に第１０章および第１６章；ならびにCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coliganら編（John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999）の特に第１章、第５章および第６章に記載されているような標準的プロトコールを参照してもよい。
【００８０】
一実施形態では、組換えタンパク質は、
（ｉ）発現ベクターにおいて１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結された当該タンパク質をコードする核酸を含む発現構築物を作製するステップ；
（ｉｉ）宿主細胞をその発現構築物でトランスフェクションまたは形質転換するステップ；および
（ｉｉｉ）宿主細胞内で組換えタンパク質を発現させるステップ
を含む方法によって産生される。
【００８１】
「発現ベクター」は、プラスミドなどの自己複製する染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
「作動可能に連結された」または「作動可能に接続された」とは、調節ヌクレオチド配列（複数可）が、その核酸の転写、またはその核酸によりコードされているタンパク質の翻訳を開始、調節、または他の方法で制御するように、本発明の組換え核酸に対して配置されていることを意味する。
【００８２】
調節ヌクレオチド配列は一般に、発現に用いる宿主細胞に適当なものである。当技術分野では様々な宿主細胞に対して多種の適当な発現ベクターおよび好適な調節配列が知られている。
【００８３】
典型的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、限定するものではないが、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボゾーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、スプライシング供与／受容配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられる。
【００８４】
構成プロモーター（ＣＭＶ、ＲＳＶ、アデノウイルス、ＳＶ４０、およびヒト延長因子プロモーターなど）および誘導／抑制プロモーター（ｔｅｔ−抑制プロモーターおよびＩＰＴＧ誘導プロモーター、メタロチオネイン誘導プロモーターまたはエクジソン誘導プロモーターなど）が当技術分野で周知であり、本発明により意図される。また、プロモーターは２つ以上のプロモーターの要素を併せ持つハイブリッドプロモーターであってもよいことが理解されるだろう。
【００８５】
また、発現構築物は融合相手（一般に、発現ベクターにより提供される）を含んでもよく、これにより、本発明の組換えタンパク質は融合相手との融合ポリペプチドとして発現される。融合相手の主要な利点は、それらが融合タンパク質の同定および／または精製を助けるということである。
【００８６】
融合相手の周知の例としては、限定するものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ：maltose binding protein）、およびヘキサヒスチジン（ＨＩＳ６）が挙げられ、これらはアフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製のためには、アフィニティークロマトグラフィーの適切なマトリックスはそれぞれグルタチオン結合樹脂、アミロース結合樹脂、およびニッケル結合樹脂またはコバルト結合樹脂である。このようなマトリックスの多くは、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）（（ＨＩＳ６）融合相手を用いる場合に有用）およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムなどの「キット」の形態で入手可能である。
【００８７】
いくつかの場合では、融合相手は、因子Ｘａまたはトロンビンなどのプロテアーゼ切断部位も持ち、適切なプロテアーゼに本発明の融合タンパク質を部分的に消化させ、それにより、そこから本発明の組換えポリペプチドを遊離させることができる。その後、遊離したタンパク質を、これに続くクロマトグラフィー分離によって融合相手から単離することができる。
【００８８】
本発明による融合相手はまた、その範囲内に「エピトープタグ」も含み、これは通常、特異的抗体が入手可能な短いペプチド配列である。特異的モノクローナル抗体が容易に入手可能なエピトープタグの周知の例としては、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素およびＦＬＡＧタグが挙げられる。
【００８９】
発現に好適な宿主細胞は、例えば、大腸菌（Escherichia coli）（例えばＤＨ５）、酵母細胞、バキュロウイルス発現系とともに用いられるＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ、ＣＶ−１、ＮＩＨ ３Ｔ３、および２９３細胞などの原核細胞または真核細胞であり得るが、これらに限定されない。
【００９０】
発現構築物はまた、形質転換宿主細胞に選択薬剤に対する耐性を付与する１つ以上の選択マーカーヌクレオチド配列も含み得る。形質転換細菌の選択のために有用な選択マーカーとしてはｂｌａ、ｋａｎＲおよびｔｅｔＲが含まれ、一方、形質転換真核細胞は、ハイグロマイシン、Ｇ４１８およびピューロマイシンなどのマーカーによって選択され得るが、これらに限定されない。
【００９１】
宿主細胞への遺伝物質の導入に関して「形質転換する」および「トランスフェクションする」とは、一般に、宿主細胞への遺伝物質の導入を表すために用いられる。宿主細胞に外来の遺伝物質を導入するためには、限定するものではないが、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション、リポフェクタミン、リポフェクチンおよび他の親油性薬剤による送達、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、ならびにプロトプラスト融合を含む多くの周知の方法がある。
【００９２】
本発明は、本発明の合成キメラタンパク質（その変異体およびホモログを含む）をコードする単離された核酸を提供する。
本明細書において「核酸」とは、一本鎖または二本鎖ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ＲＮＡｉならびにＤＮＡ（ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む）を表す。
【００９３】
「ポリヌクレオチド」は８０個以上の連続するヌクレオチドを有する核酸であり、「オリゴヌクレオチド」は８０個未満の連続するヌクレオチドを有する。
「プローブ」は、例えばノーザンブロット法またはサザンブロット法で相補配列を検出するために適宜標識された一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。
【００９４】
「プライマー」は通常、相補核酸「鋳型」とアニーリングすることができ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）などのＤＮＡポリメラーゼの作用により鋳型依存的様式で延長され得る一本鎖オリゴヌクレオチド（好ましくは、１５〜５０個の連続するヌクレオチドを有する）である。
【００９５】
本発明の合成核酸は、当技術分野で公知のように、化学合成アプローチによって、または核酸配列増幅技術を利用する組換え法によって、またはこれらの組合せによって生成してもよい。
【００９６】
化学的に合成されたプライマーおよびオリゴヌクレオチド、本発明に従って有用な合成装置および関連技術は、典型的にはほとんどの研究室で入手可能であるか、または市販で購入することができる。
【００９７】
好適な核酸増幅技術は当業者に周知であり、例えばAusubelら、前掲の第１５章に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ligase chain reaction）；例えば米国特許第５，４２２，２５２号に記載されているような鎖置換増幅法（ＳＤＡ：strand displacement amplification）；例えばLiuら, 1996, J. Am. Chem. Soc. 118 1587、国際公開第ＷＯ９２／０１８１３号および国際公開第ＷＯ９７／１９１９３号に記載されているようなローリングサークル複製（ＲＣＲ：rolling circle replication）；例えばSooknananら, 1994, Biotechniques 17 1077に記載されているような核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ：nucleic acid sequence-based amplification）；および例えばTyagiら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 5395に記載されているようなＱ−βレプリカーゼ増幅が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
好ましい核酸配列増幅技術はＰＣＲである。
本明細書において「増幅産物」とは、核酸増幅技術によって作製された核酸産物を指す。
【００９９】
本発明の核酸の生成および発現においてはまた、コドン配列の冗長性が利用可能であり、これにより、本明細書に例示された核酸は、それによってコードされているアミノ酸配列を変化させることなく容易に改変され得ることが理解されるであろう。
【０１００】
特定の実施形態では、核酸は、当技術分野で周知のように、組換え発現に用いる宿主細胞の好ましい「コドン使用頻度」に従って至適化することができる。これは、優先的なコドン使用頻度がタンパク質発現に影響を及ぼす特定の生物またはその細胞において、最適な発現のために核酸を効果的に「仕立てる（tailor）」ことができる。
【０１０１】
従って、本発明は、本明細書に例示される核酸と相同な合成核酸を含む。
一実施形態では、核酸ホモログは、本明細書に記載される合成キメラタンパク質構築物のいずれか１つをコードする核酸と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１０２】
好ましくは、配列同一性は、本発明のコード核酸の少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９５％または有利には実質的に全長にわたって評価される。
【０１０３】
別の実施形態では、核酸ホモログは、本明細書に記載される合成キメラタンパク質構築物のいずれか１つをコードする核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。
【０１０４】
「ハイブリダイズ」および「ハイブリダイゼーション」は、本明細書において、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を作り出す、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列の対合を表すために用いられる。ハイブリダイズ配列は、当技術分野で周知のように、相補的プリンとピリミジンの間の塩基対合を介して生じる。
【０１０５】
これに関して、修飾されたプリン（例えば、イノシン、メチルイノシンおよびメチルアデノシン）および修飾されたピリミジン（チオウリジンおよびメチルシトシン）も塩基対合に関わり得ることが理解されるであろう。
【０１０６】
本明細書において「ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイゼーション中の温度およびイオン強度条件、ならびにある特定の有機溶媒および／または界面活性剤の有無を指す。ストリンジェンシーが高いほど、ハイブリダイズするヌクレオチド配列間に必要とされる相補性程度が高くなる。
【０１０７】
「ストリンジェント条件」は、高頻度の相補塩基を有する核酸のみがハイブリダイズする条件を表す。
本明細書において高ストリンジェンシーという場合には、
（ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションには、少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩、４２℃での洗浄には、少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩；
（ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションには、１％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、６５℃を超える温度での約１時間の洗浄には、（ａ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；または（ｂ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ；ならびに
（ｉｉｉ）６８℃またはそれ以上での約２０分の洗浄には、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
を含み、包含する。
【０１０８】
一般に、洗浄は、Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％−１２℃で行われる。一般に、二重鎖ＤＮＡのＴｍは、不一致塩基の数が１％増すごとに１℃低下する。
上記のことにもかかわらず、Ausubelら、前掲の第２．９章および第２．１０章の、特に２．９．１〜２．９．２０頁に記載されているようなストリンジェント条件が当技術分野で周知である。
【０１０９】
本発明はまた、本発明の合成キメラタンパク質（キメラタンパク質、またはその断片、変異体および／もしくは誘導体を含む）に対する抗体も意図する。本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。抗体の産生、精製および使用に適用可能な周知のプロトコールは、例えば、Coligan ら, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY（John Wiley & Sons NY, 1991-1994）の第２章ならびにHarlow, E.およびLane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に見出せる。
【０１１０】
一般に、本発明の抗体は、本発明のポリペプチド、断片、変異体または誘導体と結合またはコンジュゲートする。例えば、これらの抗体はポリクローナル抗体を含み得る。このような抗体は、例えば、本発明のポリペプチド、断片、変異体または誘導体を産生種（マウスまたはウサギを含み得る）に注射してポリクローナル抗血清を得ることによって作製され得る。ポリクローナル抗体を産生する方法は当業者に周知である。使用可能なプロトコールの例は、例えば、Coliganら, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, 前掲、ならびにHarlowおよびLane, 1988, 前掲に記載されている。
【０１１１】
産生種で得られるポリクローナル抗血清の代わりに、例えばKohlerおよびMilstein（1975, Nature 256, 495）により記載されているような標準法を用いて、または例えばColiganら, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, 前掲に記載されているような、最近のその改変法によって、本発明の１つ以上のポリペプチド、断片、変異体または誘導体を接種した産生種に由来する脾細胞またはその他の抗体産生細胞を不死化することにより、モノクローナル抗体を産生してもよい。
【０１１２】
本発明はまた、上記に言及したポリクローナルまたはモノクローナル抗体のＦｃ断片またはＦａｂ断片を含む抗体も、その範囲内に含む。あるいは、抗体は、本発明のタンパク質に対する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）を含み得る。このようなｓｃＦｖは、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、欧州特許第２３９，４００号またはWinterおよびMilstein（1991, Nature 349 293）による論文にそれぞれ記載されている方法に従って作製され得る。
【０１１３】
この抗体または抗体フラグメントに標識が結合されていてもよい。
標識は色素原、触媒、酵素、蛍光団、化学発光分子、ユウロピウム（Ｅｕ３４）などのランタニドイオン、放射性同位元素、および直接的可視標識（direct visual label）を含む群から選択し得る。直接的可視標識の場合、コロイド金属粒子もしくは非金属粒子、色素粒子、酵素もしくは基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、またはシグナル生成分子を含有するその他の小胞などを使用し得る。
【０１１４】
多数の有用な酵素が米国特許第４，３６６，２４１号、同第４，８４３，０００号および同第４，８４９，３３８号に開示されている。本発明で有用な酵素標識としては、アルカリ性ホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。酵素標識は単独で、または第２の酵素と組み合わせて液相で使用し得る。
【０１１５】
例として、蛍光団は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＬ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）およびＲ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）であり得るが、これらに限定されない。
【０１１６】
本発明はまた、本発明の単離されたタンパク質複合体（その変異体および誘導体を含む）を含む医薬組成物も提供する。
このような単離されたタンパク質複合体は、本発明の合成キメラタンパク質を含むいずれの形態であってもよいが、これに限定されない。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、細胞遊走、組織再生および創傷治癒を促進するか、またはそうでなければ助長するために使用してもよい。あるいは、医薬組成物は、第２の部位への腫瘍細胞遊走を防止または阻害することにより腫瘍転移を防ぐために投与してもよい。
【０１１８】
該組成物は必要に応じて治療的処置または予防的処置で使用することができる。例えば、医薬組成物は、皮膚修復、創傷治癒、火傷治癒およびその他の皮膚科処置に治療製剤または美容製剤の形態で適用することができる。
【０１１９】
これに関して、医薬組成物は生体材料、生体高分子、ヒドロキシアパタイトもしくはその誘導体などの無機材料、外科用インプラント、人工補綴物、創傷用もしくは火傷用包帯、圧迫、包帯などと会合させて、またはそれらの成分として（医薬組成物を、好適には、含浸、被覆、または他の方法で含ませて）投与することができる。
【０１２０】
好適には、医薬組成物は適当な薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
好ましくは、薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤は、哺乳類、より好ましくはヒトへの投与に好適なものである。
【０１２１】
「薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤」とは、全身投与において安全に使用可能な固体または液体の増量剤、希釈剤または封入物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当技術分野で周知の様々な担体を使用することができる。これらの担体は、糖類、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張生理食塩水、ならびに塩酸塩、臭化物および硫酸塩を含む無機酸塩、そして酢酸塩、プロピオン酸塩およびマロン酸塩などの有機酸塩といった塩類、ならびにパイロジェンフリー水を含む群から選択され得る。
【０１２２】
薬学上許容される担体、希釈剤および賦形剤を記載している有用な参照文献は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991）である。
本発明の組成物を患者に提供するには、安全な投与経路であればいずれを用いてもよい。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、口内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内および経皮などが使用可能である。
【０１２３】
投与形には、錠剤、分散液、懸濁液、注射液、溶液、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、エアゾールおよび経皮パッチなどが含まれる。これらの投与形にはまた、そのために特に設計された徐放性デバイスの注入もしくは移植、またはこの様式で付加的に働くように改変された他の形態のインプラントも含まれる。治療薬の徐放性は、治療薬を例えばアクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにある種のセルロース誘導体（ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）を含む疎水性ポリマーで被覆することによって達成することができる。さらに、徐放性は他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを用いることによって達成することもできる。
【０１２４】
上記組成物は投与剤形に適合した様式で、薬学上有効な量で投与することができる。本発明において、患者に投与される用量は、適当な期間にわたって患者において有益な応答を達成するに十分なものでなければならない。投与される薬剤の量は処置される対象（その年齢、性別、体重および健康状態を含む）、医師の判断による要因によって異なる。
【０１２５】
創傷治癒用の医薬組成物に関しては、特に、米国特許第５，９３６，０６４号および国際公開第９９／６２５３６号が参照される。
本発明の医薬組成物はまた、ウイルスベクター（ワクシニアなど）などの発現ベクターおよび遺伝子療法において有用なウイルスベクターを含み得る。後者には、Braun-Falcoら（1999, Gene Ther. 6 432）に記載されているようなアデノウイルスおよびアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、Buchshacherら（2000, Blood 95 2499）に記載されているものなどのレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター、ならびに単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来するベクターが含まれる。内分泌遺伝子療法に有用なウイルスベクターの概論はStoneら（2000, J. Endocrinol. 164 103）に示されている。
【０１２６】
本発明ではまた、米国特許第５，９５８，７６４号に記載されているものなど、遺伝子発現を表皮細胞に標的化する特定の発現ベクター、また、米国特許第５，９６２，４２７号に記載されているものなど、in vivo創傷治癒用の特定の発現ベクターも使用可能である。
【０１２７】
本発明は、本発明の単離されたタンパク質複合体（合成キメラタンパク質を含む）を用いた処置方法を提供する。これらの方法は、哺乳類、より詳しくはヒトの治療的処置および／または予防的処置を特に目的とする。
【０１２８】
しかしながら、本発明による治療的使用はまた、ペット動物および伴侶動物、労役動物（ウマ、ラクダおよびグレーハウンドなど）家畜、実験動物ならびに異種移植用の細胞、器官および組織の供給源として用いられる動物といった哺乳類にも適用可能である。
【０１２９】
本発明はまた、本発明の単離されたタンパク質複合体（合成キメラタンパク質を含む）が皮膚の質または皮膚の外観を改善するまたは向上させるために投与される、美容的処置の方法も意図する。
【０１３０】
このような処置は、異常な皮膚細胞増殖から起こる乾癬および肥厚性瘢痕形成などの皮膚障害の予防または改善を含み得る。
あるいは、二次的な部位への腫瘍細胞遊走を遮断することにより腫瘍転移が防止または阻害される処置方法も意図される。さらに、細胞増殖を遮断することにより癌を処置する方法も意図される。
【０１３１】
特定の実施形態では、治療的処置および／または予防的処置は、本発明の単離されたタンパク質複合体（合成キメラタンパク質を含む）を、生体材料、生体高分子、ヒドロキシアパタイトなどの無機材料、外科用インプラント、人工補綴物、創傷用もしくは火傷用包帯、圧迫、包帯などと会合させて、またはそれらの成分として（単離されたタンパク質複合体を、好適には、含浸、または被覆、あるいは他の方法で含ませて）用い得る。
【０１３２】
このような方法は、以上に定義した医薬組成物の投与を含み、米国特許第６，０９０，７９０号に記載されているものなどの特定の組織部位へのマイクロニードル注射、米国特許第６，０５４，１２２号に記載されているものなどの創傷、火傷もしくは潰瘍に適用される局所用クリーム、ローションもしくは密封包帯、または国際公開第９９／４７０７０号に記載されているものなどの、組成物を放出するインプラントの方式によってもよい。
【０１３３】
これに関しては、例えば米国特許第５，９２９，０４０号および同第５，９６２，４２７号に示されている方法に従って、遺伝子療法を適用することもできる。
また、例えば所望の増殖因子発現を遺伝的に操作することにより、皮膚代用を作製するために皮膚細胞を遺伝的に改変し得る方法も存在する（Suppら, 2000, J. Invest. Dermatol. 114 5）。この分野の総説の一例がBevanら（Biotechnol. Gent. Eng.Rev. 16 231）に示されている。
【０１３４】
また、国際公開第９９／１１７８９号に示されているものなど、レシピエントにトランスフェクションまたは形質転換された細胞を「接種する」ことも意図される。
これらの方法は細胞遊走を刺激し、それにより、創傷および火傷の治癒、潰瘍などの皮膚損傷部の修復、例えば自己皮膚のin vitro培養による組織置換および移植、腎臓および肺などの内部器官の再上皮化、ならびに損傷した神経組織の修復を助長する、または進行させるために使用可能である。
【０１３５】
皮膚置換療法は当技術分野では周知のものとなっており、例えばKeheら（1999, Arch. Dermatol. Res. 291 600）に記載されているような上皮細胞／ケラチノサイト系の同時培養物の使用、または初代（通常、自己の）表皮細胞、皮膚細胞および／またはケラチノサイトのin vitro培養を採用してもよい。これらの技術ではまた、操作された生体材料および合成ポリマー「スキャフォールド」を用いてもよい。
【０１３６】
この分野の総説の例が、TerskikhおよびVasiliev（1999, Int. Rev. Cytol. 188 41）ならびにEaglesteinおよびFalanga（1998, Cutis 62 1）に示されている。
より詳しくは、頭蓋顔面手術に有用な代用口腔粘膜の作製が、Izumiら（2000, J. Dent. Res. 79 798）に記載されている。胎児ケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞は、Fauzaら（J. Pediatr. Surg. 33 357）に記載されているものなど、皮膚損傷部を処置する目的で、移植用の皮膚を作製するためにin vitroで増殖させることができるが、in vitroにおいてヒアルロン酸由来生体材料上で培養された皮膚および表皮要素からの皮膚置換は火傷の処置に有用である可能性があることが示されている（Zacchiら, 1998, J. Biomed. Mater. Res. 40 187）。
【０１３７】
また、例えばSheridanら（2000, J. Control Release 14 91）およびFauzaら（1998, 前掲）に記載されているように、代用皮膚の操作を助けるためのポリマースキャフォールドも意図され、それは創傷および火傷に皮膚細胞を送達するための薬剤としてのマイクロスフェアである（LaFranceおよびArmstrong, 1999, Tissue Eng. 5 153）。
【０１３８】
本発明は、ＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−ＩＩ：ＦＮ、ＥＧＦ：ＦＮ、ｂＦＧＦ：ＦＮ、ＫＧＦ：ＦＮ、またはＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ：ＦＮ複合体などの増殖因子とフィブロネクチンとを含む複合体のアゴニストまたはアンタゴニストを同定、スクリーニング、設計またはそうでなければ作出するための、本発明の単離されたタンパク質複合体（合成キメラタンパク質を含む）の使用を意図する。このような薬剤は「ミメティック（mimetic）」であり得る。「ミメティック」とは、本明細書において、タンパク質またはペプチドの特定の機能的領域を模倣するように設計された分子を指して用いられ、その範囲内に、当技術分野で十分に理解されている「アゴニスト」、「類似体」および「アンタゴニスト」という用語を含む。
【０１３９】
一実施形態では、ＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−ＩＩ：ＦＮ、ＥＧＦ：ＦＮ、ｂＦＧＦ：ＦＮ、ＫＧＦ：ＦＮ、またはＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ：ＦＮ複合体により、同族増殖因子受容体およびＦＮ受容体の結合を模倣するアゴニストが作出される。このような分子は、創傷治癒および皮膚再生などに必要とされるような細胞遊走の刺激剤としての有用性を持ち得る。
【０１４０】
別の実施形態では、ＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−ＩＩ：ＦＮ、ＥＧＦ：ＦＮ、ｂＦＧＦ：ＦＮ、ＫＧＦ：ＦＮ、またはＩＧＦＩＩ：ＩＧＦＢＰ：ＦＮ複合体により、同族増殖因子受容体およびインテグリン受容体の結合を防止または阻害するアンタゴニストが作出される。このような分子は細胞遊走および／または細胞増殖の阻害剤として（それにより有用な抗腫瘍薬となる）、また、異常な細胞増殖から起こる乾癬および肥厚性瘢痕形成などの皮膚障害の処置において有用性を持ち得る。
【０１４１】
上記ミメティック、アゴニスト、アンタゴニスト、および類似体は、所望の生物活性および半減期を備えたペプチド、ポリペプチドまたはその他の有機分子、好ましくは、小有機分子であり得る。
【０１４２】
コンピュータによる構造データベース検索は、ミメティックを同定するための手順としての利用が増えてきている。原則としてミメティックを同定するのに好適といえるデータベース検索法は、国際公開第９４／１８２３２号（ＨＩＶ抗原ミメティックの作出を対象とする）、米国特許第５，７５２，０１９号および同第９７／４１５２６号（ＥＰＯミメティックの同定を対象とする）に見出せる。
【０１４３】
他の方法には、分子の相互作用を同定する様々な生物物理学的技術が含まれる。これらは、例えばＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−ＩＩ：ＦＮ、ＥＧＦ：ＦＮ、ｂＦＧＦ：ＦＮ、ＫＧＦ：ＦＮ、またはＩＧＦ−ＩＧＦＢＰ−ＦＮ複合体の形成に影響を及ぼすかどうかに従って候補分子をスクリーニングすることを考慮したものである。競合的放射性リガンド結合アッセイ（関連の方法としてはUptonら, 1999, 前掲を参照）、分析的超遠心分離、微量熱量測定、表面プラズモン共鳴、および光学バイオセンサーに基づく方法などの有用であり得る技術に適用可能な方法が、CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coliganら編（John Wiley & Sons, 1997）の第２０章に示されている。
【０１４４】
当業者は以下の非限定例を参照すれば、本発明をより容易に理解し、実施することができる。
（実施例）
実施例１
ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰおよびＦＮは細胞遊走を刺激する
ＩＧＦＢＰ−３または−５の存在下、予め結合させたＦＮ（１μｇ／ｍＬ）および漸増濃度のＩＧＦ−Ｉで被覆したトランスウェル（Transwell）（登録商標）にＭＣＦ−１０Ａ細胞を播種した。これらの細胞を５時間遊走させた。その後、各処理に応答して膜を通り抜ける細胞の数を、ＦＮ単独（ＳＦＭ）で遊走した細胞に対するパーセンテージとして表した。３回の実験（各反復実験において４ウェルで処理を試験した）からＭＣＦ−１０データをプールし、図２に示す。エラーバーはＳＥＭを示す。ＳＦＭ＝無血清培地。ＩＧＦ−Ｉ：ＦＮ、ＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ−３：ＦＮおよびＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ−５：ＦＮは、ＦＮ単独の対照ウェルよりも有意に高い遊走を刺激することができた（応答はＦＮ対照ウェルの、それぞれ１５３．７＋／−７．３％、１９２．５＋／−６．８％および１８７．５＋／−６．５％）（ｐ＜０．０５）。また、ＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ−３：ＦＮおよびＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ−５：ＦＮ処置に対するＭＣＦ７−１０Ａ細胞の応答は、ＦＮとＩＧＦＢＰまたはＩＧＦ−Ｉのいずれか一方とのみを含む場合に得られた応答よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。このデータは、トリマーＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦＢＰ−３／５：ＦＮ複合体が存在する場合に最大応答が生じることを示す。このことは、ＦＮと結合したＩＧＦ−Ｉを含むキメラがＦＮ結合インテグリンおよび同族増殖因子受容体を活性化することを示唆する。
実施例２
合成キメラフィブロネクチン：増殖因子タンパク質
ここでは、ＦＮ：増殖因子（例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＫＧＦ）キメラの形態の本発明の合成キメラタンパク質の例を示す。
【０１４５】
合成キメラタンパク質は、増殖因子と融合したあらゆる全長または末端切断型ＦＮ（アミノ酸残基の修飾を含むまたは含まない）を含む。さらに、ＦＮおよび増殖因子は種々のペプチドリンカーと融合されていてもされていなくてもよい。
【０１４６】
種々の長さのＦＮタンパク質が、全長成熟型ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦもしくはＫＧＦタンパク質、または少なくとも、同族増殖因子受容体と結合することができるＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦもしくはＫＧＦタンパク質のドメインと結合している一連のキメラ発現構築物を設計する。各場合において、ＦＮセグメントは好ましくは、例えばＧｌｙ４ Ｓｅｒ（配列番号７）リンカー、Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ３（配列番号８）リンカー、（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３（配列番号９）リンカー、または（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）４（配列番号１０）リンカーなどのリンカーを介して、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ配列に連結される。
【０１４７】
合成キメラタンパク質の例としては、限定するものではないが：
Ａ）ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｂ）ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８〜９［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｃ）ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８〜１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｄ）ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン９［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｅ）ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン９〜１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｆ）ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＧＦ）；
Ｇ）ＦＮ Ｉ型ドメイン１〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｈ）ＦＮ Ｉ型ドメイン１〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８〜９［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｉ）ＦＮ Ｉ型ドメイン１〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８〜１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｊ）ＦＮ Ｉ型ドメイン１〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン９［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｋ）ＦＮ Ｉ型ドメイン１〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン９〜１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｌ）ＦＮ Ｉ型ドメイン１〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｍ）ＦＮ Ｉ型ドメイン４〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｎ）ＦＮ Ｉ型ドメイン４〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８〜９［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｏ）ＦＮ Ｉ型ドメイン４〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン８〜１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｐ）ＦＮ Ｉ型ドメイン４〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン９［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｑ）ＦＮ Ｉ型ドメイン４〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン９〜１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）；
Ｒ）ＦＮ Ｉ型ドメイン４〜５［リンカー］ＦＮ ＩＩＩ型ドメイン１０［リンカー］増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＫＧＦ）
が挙げられる。
【０１４８】
ヒトＦＮ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＫＧＦ遺伝子ＤＮＡ配列（それぞれ配列番号１〜６）は、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）での発現のためにコドンを至適化することができる。次に、そのコード配列を、キメラの精製を助けるためにポリヒスチジン親和性タグを組み込んだ発現ベクター（例えば、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ発現ベクター（Invitrogen））にクローニングすることができる。上述のようなアミノ酸リンカーをコードするヌクレオチド配列を、部位特異的突然変異誘発ＰＣＲによって挿入することができる。リンカー配列のＣ末端へのＡｓｎの付加を用いれば、Ａｓｎ−Ｇｌｙモチーフ（ここで、Ｇｌｙは増殖因子タンパク質の最初のアミノ酸である）を作出することができる。このモチーフは、ヒドロキシルアミンにより誘導される、これらのキメラからの増殖因子タンパク質の切断を可能とする。
【０１４９】
得られる構築物は、リンカーによって全長成熟型ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦもしくはＫＧＦタンパク質、または少なくとも、同族増殖因子受容体と結合することができるＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦもしくはＫＧＦタンパク質のドメインに連結された種々の長さのＦＮタンパク質をコードする。全ての構築物のＤＮＡ配列を確認して、目的ＤＮＡ配列の忠実度が維持されていることを確かめることができる。
【０１５０】
このｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓベクター中のクローンを用いてＳｆ９昆虫細胞をトランスフェクションすることができ、免疫ブロット法により評価すると、馴化培地中に一時的に発現された分泌タンパク質が検出される。簡単に述べると、サンプルを還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、セミドライ転写法を用いてタンパク質をニトロセルロース膜に転写する。この膜をポリクローナル抗ＦＮ抗体で調べた後、増強化学発光を用いて標的タンパク質種を可視化する。
【０１５１】
キメラタンパク質の精製は、製造者の説明書に従って行うＮｉ−ＮＴＡスーパーフローアガロース（QIAGEN、オーストラリア）アフィニティークロマトグラフィーに基づく。精製プロセス中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびポリクローナル抗ＦＮ抗体（Calbiochem）を用いたウエスタンブロット解析によってキメラタンパク質をモニタリングする。
【０１５２】
細胞の遊走および／または増殖に対する合成キメラタンパク質の効果を調べるためには、ＭＣＦ−１０Ａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ならびに単離されたヒト上皮細胞、ケラチノサイトおよび線維芽細胞などの細胞を使用することができる。例えば、細胞遊走はトランスウェル（Transwell）（登録商標）遊走アッセイを用いて評価することができ、細胞増殖は当業者に周知の細胞増殖アッセイを用いて測定することができる。
【０１５３】
本明細書を通じ、その目的は、いずれか１つの実施形態または特定の特徴の集合体に本発明を限定することなく、本発明の好ましい実施形態を示すことであった。よって、当業者には、本開示に鑑みて、本発明の範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態に種々の改変および変更を行うことができることが理解されるであろう。
【０１５４】
本明細書に参照されているコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許および科学文献は全て、参照により本明細書に組み入れる。
【０１５５】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成キメラタンパク質の形態にある、単離されたタンパク質複合体であって、
（ｉ）増殖因子、または少なくとも同族増殖因子受容体と結合することができる前記増殖因子のドメイン、および
（ｉｉ）少なくともフィブロネクチン（ＦＮ）のインテグリン結合ドメインを含むＦＮの１つ以上のＩＩＩ型ドメイン
のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質複合体。
【請求項２】
前記増殖因子がインスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）およびケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）から選択される、請求項１に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項３】
前記インテグリン結合ドメインがα１インテグリン結合ドメインまたはα４インテグリン結合ドメインである、請求項１または２に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項４】
前記ＦＮの１つ以上のＩＩＩ型ドメインがＦＮ配列（配列番号１）のアミノ酸１２６６〜１５３６を含む、請求項１または２に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項５】
前記ＦＮの１つ以上のＩＩＩ型ドメインがＦＮ配列（配列番号１）のアミノ酸１４４７〜１５３６を含む、請求項１または２に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項６】
前記ＦＮの１つ以上のＩＩＩ型ドメインがＦＮ配列（配列番号１）のアミノ酸１１７３〜１５３６を含む、請求項１または２に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項７】
ＩＧＦＢＰアミノ酸配列を含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項８】
ＦＮの付加的断片をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項９】
前記ＦＮの付加的断片がＦＮ配列（配列番号１）のアミノ酸５０〜２７３を含む、請求項８に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１０】
前記ＦＮの付加的断片がＦＮ配列（配列番号１）のアミノ酸１８４〜２７３を含む、請求項８に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１１】
少なくとも１つのリンカー配列をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１２】
前記リンカー配列がプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１１に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１３】
前記リンカー配列が
（ｉ）Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ（配列番号７）、
（ｉｉ）Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ３（配列番号８）、
（ｉｉｉ）（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３（配列番号９）、
（ｉｖ）（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）４（配列番号１０）、
（ｖ）Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｐｒｏ（配列番号１１）、および
（ｖｉ）Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｙｓ（配列番号１２）
からなる群から選択される、請求項１１に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体をコードする、単離された核酸。
【請求項１５】
ベクターにおいて１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結された請求項１４に記載の単離された核酸を含む、遺伝子構築物。
【請求項１６】
前記単離された核酸がプロモーターに作動可能に連結されている発現構築物である、請求項１５に記載の遺伝子構築物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の遺伝子構築物を含む、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体と、薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体を、含浸、または被覆、あるいは他の方法で含ませた外科用インプラント、スキャフォールドまたは人工補綴物。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体を含む、創傷用または火傷用包帯。
【請求項２１】
細胞の遊走および増殖のうち少なくともいずれか一方を促進する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体を、細胞により発現された増殖因子受容体およびインテグリン受容体の双方と結合させることにより、前記細胞の遊走および増殖のうち少なくともいずれか一方を誘導し、増大させ、または他の態様で促進するステップを含む方法。
【請求項２２】
前記単離されたタンパク質複合体がin situで細胞の遊走および増殖のうち少なくともいずれか一方を促進するために動物に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
予防的にまたは治療的に、上皮細胞の遊走および増殖のうち少なくともいずれか一方を誘導し、増大させ、または他の態様で促進し、それにより、in situでの創傷治癒を助長するための、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記動物がヒトである、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記単離されたタンパク質複合体がin vitroで１つ以上の細胞または組織に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項１】
合成キメラタンパク質の形態にある、単離されたタンパク質複合体であって、
（ｉ）増殖因子、または少なくとも同族増殖因子受容体と結合することができる前記増殖因子のドメイン、および
（ｉｉ）少なくともフィブロネクチン（ＦＮ）のインテグリン結合ドメインを含むＦＮの１つ以上のＩＩＩ型ドメイン
のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質複合体。
【請求項２】
前記増殖因子がインスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）およびケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）から選択される、請求項１に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項３】
前記インテグリン結合ドメインがα１インテグリン結合ドメインまたはα４インテグリン結合ドメインである、請求項１または２に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項４】
前記ＦＮの１つ以上のＩＩＩ型ドメインがＦＮ配列（配列番号１）のアミノ酸１２６６〜１５３６を含む、請求項１または２に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項５】
前記ＦＮの１つ以上のＩＩＩ型ドメインがＦＮ配列（配列番号１）のアミノ酸１４４７〜１５３６を含む、請求項１または２に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項６】
前記ＦＮの１つ以上のＩＩＩ型ドメインがＦＮ配列（配列番号１）のアミノ酸１１７３〜１５３６を含む、請求項１または２に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項７】
ＩＧＦＢＰアミノ酸配列を含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項８】
ＦＮの付加的断片をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項９】
前記ＦＮの付加的断片がＦＮ配列（配列番号１）のアミノ酸５０〜２７３を含む、請求項８に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１０】
前記ＦＮの付加的断片がＦＮ配列（配列番号１）のアミノ酸１８４〜２７３を含む、請求項８に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１１】
少なくとも１つのリンカー配列をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１２】
前記リンカー配列がプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１１に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１３】
前記リンカー配列が
（ｉ）Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ（配列番号７）、
（ｉｉ）Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ３（配列番号８）、
（ｉｉｉ）（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３（配列番号９）、
（ｉｖ）（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）４（配列番号１０）、
（ｖ）Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｐｒｏ（配列番号１１）、および
（ｖｉ）Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｙｓ（配列番号１２）
からなる群から選択される、請求項１１に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体をコードする、単離された核酸。
【請求項１５】
ベクターにおいて１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結された請求項１４に記載の単離された核酸を含む、遺伝子構築物。
【請求項１６】
前記単離された核酸がプロモーターに作動可能に連結されている発現構築物である、請求項１５に記載の遺伝子構築物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の遺伝子構築物を含む、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体と、薬学上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体を、含浸、または被覆、あるいは他の方法で含ませた外科用インプラント、スキャフォールドまたは人工補綴物。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体を含む、創傷用または火傷用包帯。
【請求項２１】
細胞の遊走および増殖のうち少なくともいずれか一方を促進する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体を、細胞により発現された増殖因子受容体およびインテグリン受容体の双方と結合させることにより、前記細胞の遊走および増殖のうち少なくともいずれか一方を誘導し、増大させ、または他の態様で促進するステップを含む方法。
【請求項２２】
前記単離されたタンパク質複合体がin situで細胞の遊走および増殖のうち少なくともいずれか一方を促進するために動物に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
予防的にまたは治療的に、上皮細胞の遊走および増殖のうち少なくともいずれか一方を誘導し、増大させ、または他の態様で促進し、それにより、in situでの創傷治癒を助長するための、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記動物がヒトである、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記単離されたタンパク質複合体がin vitroで１つ以上の細胞または組織に投与される、請求項２１に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図２】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５１１９６０（Ｐ２０１３−５１１９６０Ａ）
【公表日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４０２３１（Ｐ２０１２−５４０２３１）
【出願日】平成２２年１１月３０日（２０１０．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１６１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６３４７７
【国際公開日】平成２３年６月３日（２０１１．６．３）
【出願人】（５９２２５３２７５）クイーンズランド ユニバーシティ オブ テクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月３０日（２０１０．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１６１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６３４７７
【国際公開日】平成２３年６月３日（２０１１．６．３）
【出願人】（５９２２５３２７５）クイーンズランド ユニバーシティ オブ テクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
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