フィラグリン産生促進剤
【課題】 フィラグリン産生促進作用とエモリエント作用を併せ持つフィラグリン産生促進剤を提供すること。
【解決手段】γ−オリザノールを０．５〜３質量％含有する米糠油を有効成分として含有するフィラグリン産生促進剤。
【解決手段】γ−オリザノールを０．５〜３質量％含有する米糠油を有効成分として含有するフィラグリン産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィラグリン産生促進剤に関し、より詳細には、エモリエント作用を有するとともに、フィラグリン遺伝子の発現を増強し角層中のフィラグリン産生量を増加させることによって、優れた保湿効果が得られ、肌荒れや乾燥肌を有効に改善し得るフィラグリン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は大きく分けて、表皮、真皮、皮下組織の３層よりなる。表皮の最外層には角層が形成され、角層保湿機能によって体内の水分の蒸発を防止し角層水分量が維持されている。しかし、紫外線照射や刺激物質の侵入などの外部刺激を受けた場合や、加齢や内分泌、遺伝的な素因などの内的要因によって保湿機能が低下し、角層中のアミノ酸、ピロリドンカルボン酸、尿素などの天然保湿因子（ＮＭＦ）が減少すると、乾燥肌、肌荒れなどを引き起こす。
【０００３】
このため、皮膚外用剤には種々の保湿剤が配合されており、例えば、天然保湿因子（ＮＭＦ）を補充するため、アミノ酸、尿素などのヒューメクタントが用いられている。また、ワックスやラノリンなどの油性物質がエモリエントとして配合され、米糠油などの植物性油分も用いられている（特許文献１〜３参照）。エモリエントは、その閉塞性により皮膚からの水分蒸散を防止してうるおいを保持し、皮膚を柔軟にする作用を有するものである。
【０００４】
一方、近年、皮膚の保湿機能に関与する物質としてフィラグリンが注目されている。フィラグリンは、表皮の顆粒細胞に存在するケラヒトアリン顆粒の成分で分子量約４０ｋＤａの塩基性蛋白質であり、角質細胞が下層から上層へと移行する過程でアミノ酸にまで分解され、これが天然保湿因子として機能する。またフィラグリンは種々の皮膚疾患に関与しており、アトピー性皮膚炎や尋常性魚鱗癬では、フィラグリンの遺伝子異常が認められることが報告されている（非特許文献１）。このため、フィラグリンの産生を促進する成分についても検討が行われており、例えば、マタタビ、ノニ、檸条、油茶などの植物の水性溶媒抽出物がフィラグリンの産生を促進することが報告されている（特許文献４〜６参照）。しかし、フィラグリン産生促進作用とヒューメクタントあるいはエモリエントの両者の作用を併せ持つ成分はこれまでほとんど知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−３３５４６３号公報
【特許文献２】特開２００２−２９９６２号公報
【特許文献３】特開２００３−２８２２号公報
【特許文献４】特開２０１０−１２０８７６号公報
【特許文献５】特開２０１０−９００９３号公報
【特許文献６】特開２０１０−８３７８６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】今山修平:"スキンケアを科学する", 南山堂,pp. 145-146 (2008-5)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、エモリエント作用を兼ね備えたフィラグリン産生促進剤を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、従来公知の米糠油はエモリエント効果を有するのみであるが、特定の脂質組成を有する米糠油は、さらにフィラグリンの産生を促進する効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、γ−オリザノールを０．５〜３質量％含有する米糠油を有効成分として含有するフィラグリン産生促進剤である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のフィラグリン産生促進剤は、フィラグリン遺伝子の発現を増強し、フィラグリン量を増加させることによって、角層中に十分な天然保湿成分を維持するとともに、角層の表面を閉塞して水分の蒸散を防ぐことにより、優れた保湿効果が得られ、乾燥肌や肌荒れを改善することができる。また、アトピー性皮膚炎や尋常性魚鱗癬の症状を改善することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、各試料の所定濃度添加によるフィラグリン遺伝子のmRNA発現量を示す図である。
【図２】実施例２において、製造例１の米糠油の所定濃度添加によるフィラグリンタンパク産生量を示す図である。
【図３】実施例２において、製造例１の米糠油の所定濃度添加によるスポット画像である。
【図４】実施例３においてヘアレスマウス背部のフィラグリンを蛍光免疫染色した顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のフィラグリン産生促進剤は、米糠から抽出された米糠油を有効成分とするものであるが、従来公知の米糠油はγ−オリザノールの含有量が０．０１〜０．２質量％（以下、単に「％」で示す）程度であるのに対し、本発明では、γ−オリザノール含有量が０．５〜３％、好ましくは１〜２％の範囲であるγ−オリザノール高含有米糠油を用いる。また従来公知の米糠油は、植物ステロール含有量が０．１〜０．９％程度であるが、本発明では植物ステロールを１〜５％、好ましくは１．５〜２．５％含有するものを用いることが好適である。植物ステロールとしては、β−シトステロール、スティグマステロール、カンペステロールなどが含まれる。その他、ビタミンＥを０．０２〜０．１％、トコトリエノールを０．０２〜０．１％含有することが好ましい。
【００１３】
上記のような組成を有する米糠油は、米糠から、脱ガム処理、脱ロウ処理、蒸留脱酸処理、脱色処理、脱臭処理を経て製造される。従来公知の製造方法では、通常アルカリ脱酸処理を行うが、本発明に用いる米糠油の製造にあたってはこの処理を行わないことを特徴とする。アルカリ脱酸処理を行わないことにより、上記のようにγ−オリザノールや植物ステロール含有量の高いものが得られる。
【００１４】
より具体的には、まず原料の米糠から油性成分を抽出し、極性の高い脂質成分のガム質を除去する。次いで脱ガム処理後の油性成分に溶剤を加え均一に溶解し、低温で濾過し融点の低いエステル油であるロウ物質を凝固物として除去する。次いで蒸留することにより油性成分中の遊離脂肪酸を除去した後、ろ過剤を用いて脱色し、さらに脱臭処理を行うことによって、本発明に用いる米糠油を製造することができる。
【００１５】
本発明のフィラグリン産生促進剤は、かくして得られた米糠油を有効成分とするものであるが、皮膚外用剤として使用する場合、製剤安定性の観点から米糠油を０．１〜１００％、好ましくは１〜１０％配合すればよい。
【００１６】
本発明のフィラグリン産生促進剤には、通常化粧料や医薬品、医薬部外品に用いられるその他の成分を配合することができる。このような任意成分としては、ビタミン類、色素類、無機塩類、油性基剤、界面活性剤、防腐剤、香料等が挙げられる。ビタミン類としては、レチノール、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、アスコルビン酸、コレカルシフェロール、カルニチン、オロット酸などがある。色素類としては、赤色１０６号、青色１号、だいだい色２０５号、黄色２０２号の(１)、黄色２０３号、緑色３号などがある。無機塩類としては、硫酸ナトリウム、炭素水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アルミニウム、炭酸マグネシウム、塩化カリウム、ミョウバンなどがある。油性基剤としては、液状ラノリン、ホホバ油、米胚芽油、オリーブ油、マカデミアンナッツ油、スクワラン、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、ミリスチン酸イソプロピル、ワセリン、流動パラフィンなどがある。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ラウリン酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレングリコールモノステアレートなどが挙げられる。アトピー性皮膚炎または尋常性魚鱗癬の予防・治療剤とする場合の適用量は、対象者の年齢、性別、症状、疾患の程度等に応じて適宜選定されるが、通常、１日当たり０．０１〜１０ｇ程度適用すればよい。
【００１７】
また本発明の皮膚外用剤は、例えば化粧料、外用医薬品または医薬部外品等として利用することができ、またその形態としては、特に限定されるものではないがローション、スプレー、エアゾールスプレー、クリーム、清拭剤、上がり湯用組成物、入浴剤などが例示できる。
【実施例】
【００１８】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００１９】
製 造 例 １
米糠油の調製：
原料の米糠の抽出油にスチーム混和し、遠心分離によって水相に含まれるガム質を除去した。次いで脱ガム処理後の米糠にｎ−ヘキサンを加え均一に溶解し、０℃以下の低温で冷却濾過しロウ物質を凝固物として除去した。次いでｎ−ヘキサンを留去し、真空蒸留することにより脱酸処理した後、活性白土のろ布濾過によって脱色し、さらに真空加熱をして脱臭処理を行って米糠油を得た。得られた米糠油の脂質の組成について、液体クロマトグラフィーにより分析した。結果を表１に示す。市販品（コメヌカ油；築野食品工業株式会社）の組成も表１に併せて示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
実 施 例 １
フィラグリン遺伝子の発現強度の評価(リアルタイムＰＣＲ法)：
製造例１で得られた米糠油によるフィラグリン遺伝子の発現強度への影響を評価した。ヒト表皮角化細胞を1×104個/wellの細胞密度にて、角化細胞増殖培地（TOYOBO）を用いて96 well plateに播種した。24時間培養後、所定の濃度の試料を含む角化細胞基礎培地に交換し48時間培養した（試料は100%エタノールに所定の濃度となるように溶解し、これを角化細胞基礎培地で100倍希釈して調整した）。細胞は、CellAmp Direct RNA Prep kit（TAKARA Bio）を用いてtotal RNAを抽出し、Primescript RT Master mixを用いてcDNAを合成した。Filaggrin (HA127836, TAKARA Bio)およびGAPDH(HA067812,TAKARA Bio)のプライマーを用いて、LightCycler 480 Realtime System(Roche社)によりmRNA発現量を求めた。同様にして、市販品の米糠油（コメヌカ油；築野食品工業株式会社）、イソプロピルパルミテート、トリカプリル・カプリン酸グリセリド、スクワランについても評価した。結果を図１に示す。
【００２２】
米糠油のフィラグリン遺伝子の発現強度は、市販品の米糠油と比較すると明らかに高い値を示しフィラグリンの遺伝子量は有意に増加している。また、化粧品などに使用される一般的な油性物質において、フィラグリン遺伝子の発現は、認められなかった。
【００２３】
実 施 例 ２
フィラグリンタンパク産生量の評価(Dot-blot法)：
製造例１で得られた米糠油によるフィラグリンタンパクの産生量への影響を評価した。表皮細胞を1.0×10４cells/wellの細胞密度にてKG2培地(クラボウ)を用いて96穴培養プレートに播種した。24時間培養後、所定の濃度の試料を含むウシ脳下垂体抽出物未含有KG2培地に交換し、72時間培養した(試料は100%エタノールに所定の濃度となるように溶解し、これをウシ脳下垂体抽出物未含有KG2培地に100倍希釈して調製した)。細胞はPBS(-)にて洗浄したのち、0.5%TritonX-100(2mMPMSF含有)を加え、超音波処理を行って細胞を破砕した。細胞破砕液をニトロセルロース膜に一定量プロッティングし、一晩乾燥した。乾燥後の転写膜を1%BSAinPBSに浸漬し、室温にて1時間ブロッキングを行った。その後、PBS(-)にて洗浄し、抗ヒトfilaggrin抗体(Anti-Filaggrin(ARGENE))を1:4000の希釈濃度で転写膜上に添加した。室温で1時間反応させた後、PBSにて洗浄した。その後、ヒストファインシンプルステインMAX-PO(M)(ニチレイ)を1:100の希釈濃度で転写膜上に添加し、室温で1時間反応させた。PBS(-)にて洗浄後、Lumi-Light Western Blotting Substrate(Roche)を転写膜上に添加し、1分後にライトキャプチャー(ATTO株式会社)を用いてスポット画像を得た。得られたスポット画像の各スポットの輝度をCS Analyzer Version2.0(ATTO株式会社)を用いて定量した。Filaggrin産生量の変化は、filaggrin由来の発光輝度の定量値を同時に定量したタンパク量にて除することにより補正し、試料未処理細胞(コントロール)の補正値を100とした百分率、Index(%)で表した。それぞれのfilaggrin産生量変化は、Student t検定をもちいて有意差検定を行い、コントロールとの差を評価した。結果を図２に示す。またスポット画像を図３に示す。
【００２４】
製造例１の米糠油において、フィラグリンの遺伝子レベルでの発現を確認できたため、発現するタンパク産生量を測定した結果、米糠油の添加濃度に対して依存的にタンパク産生量の増加を確認できた。この米糠油は、フィラグリンタンパクの産生促進作用を有することが示唆される。
【００２５】
実 施 例 ３
ヘアレスマウスを用いたフィラグリン産生の蛍光免疫染色：
8週齢のHos:HR-1マウスを用いて、背部皮膚に製造例１で得られた米糠油150μLを１日１回、2週間反復塗布した。試験終了時に皮膚を採取し、速やかに凍結させ、4%CMC包埋し、凍結切片をFilaggrin polyclonal antibody(Covance Research Products)で蛍光免疫染色を施した。結果を図４に示す。
【００２６】
製造例１の米糠油を反復塗布したヘアレスマウス表皮の有棘層から顆粒層付近において、蛍光色を呈することが確認された。この米糠油は、フィラグリン産生促進作用を有することが確認された。
【００２７】
実 施 例 ４
皮膚外用ローションの調製：
下記処方の皮膚外用ローションを下記製法により製造した。
（処方）
製造例１の米糠油 ０．８％
ＰＯＥ（１５）セチルエーテル ５％
濃グリセリン ５％
フェノキシエタノール ０．３％
ジプロピレングリコール １％
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１％
精製水 残部
（製法）
精製水以外の成分を加熱混合し、均一溶解後、精製水を溶解原料へゆっくりと撹拌しながら投入し、皮膚外用ローションを得る。
【００２８】
実 施 例 ５
入浴剤の調製：
下記処方の入浴剤を下記製法により製造した。
（処方）
製造例１の米糠油 ３０％
モノステアリン酸ソルビタン ４％
ＰＯＥ(２０)オレイルエーテル ３％
香料 ０．９％
１，３−ブチレングリコール ５％
フェノキシエタノール ０．３％
メチルパラベン ０．３％
ブチルパラベン ０．１％
精製水 残部
（製法）
精製水以外の成分を加熱混合し、均一溶解後、加熱された精製水を溶解原料へゆっ
くりと撹拌しながら投入し、乳化物が得られたら冷却をし、入浴剤を得る。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明のフィラグリン産生促進剤は、フィラグリン遺伝子の発現を増強し、表皮細胞中のフィラグリン産生量を有意に増加させるとともに、角層表面を閉塞して水分蒸散を抑制するエモリエント作用によって、優れた保湿効果が得られるものである。したがって、入浴剤や化粧料等の皮膚外用剤として有用なものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィラグリン産生促進剤に関し、より詳細には、エモリエント作用を有するとともに、フィラグリン遺伝子の発現を増強し角層中のフィラグリン産生量を増加させることによって、優れた保湿効果が得られ、肌荒れや乾燥肌を有効に改善し得るフィラグリン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は大きく分けて、表皮、真皮、皮下組織の３層よりなる。表皮の最外層には角層が形成され、角層保湿機能によって体内の水分の蒸発を防止し角層水分量が維持されている。しかし、紫外線照射や刺激物質の侵入などの外部刺激を受けた場合や、加齢や内分泌、遺伝的な素因などの内的要因によって保湿機能が低下し、角層中のアミノ酸、ピロリドンカルボン酸、尿素などの天然保湿因子（ＮＭＦ）が減少すると、乾燥肌、肌荒れなどを引き起こす。
【０００３】
このため、皮膚外用剤には種々の保湿剤が配合されており、例えば、天然保湿因子（ＮＭＦ）を補充するため、アミノ酸、尿素などのヒューメクタントが用いられている。また、ワックスやラノリンなどの油性物質がエモリエントとして配合され、米糠油などの植物性油分も用いられている（特許文献１〜３参照）。エモリエントは、その閉塞性により皮膚からの水分蒸散を防止してうるおいを保持し、皮膚を柔軟にする作用を有するものである。
【０００４】
一方、近年、皮膚の保湿機能に関与する物質としてフィラグリンが注目されている。フィラグリンは、表皮の顆粒細胞に存在するケラヒトアリン顆粒の成分で分子量約４０ｋＤａの塩基性蛋白質であり、角質細胞が下層から上層へと移行する過程でアミノ酸にまで分解され、これが天然保湿因子として機能する。またフィラグリンは種々の皮膚疾患に関与しており、アトピー性皮膚炎や尋常性魚鱗癬では、フィラグリンの遺伝子異常が認められることが報告されている（非特許文献１）。このため、フィラグリンの産生を促進する成分についても検討が行われており、例えば、マタタビ、ノニ、檸条、油茶などの植物の水性溶媒抽出物がフィラグリンの産生を促進することが報告されている（特許文献４〜６参照）。しかし、フィラグリン産生促進作用とヒューメクタントあるいはエモリエントの両者の作用を併せ持つ成分はこれまでほとんど知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−３３５４６３号公報
【特許文献２】特開２００２−２９９６２号公報
【特許文献３】特開２００３−２８２２号公報
【特許文献４】特開２０１０−１２０８７６号公報
【特許文献５】特開２０１０−９００９３号公報
【特許文献６】特開２０１０−８３７８６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】今山修平:"スキンケアを科学する", 南山堂,pp. 145-146 (2008-5)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、エモリエント作用を兼ね備えたフィラグリン産生促進剤を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、従来公知の米糠油はエモリエント効果を有するのみであるが、特定の脂質組成を有する米糠油は、さらにフィラグリンの産生を促進する効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、γ−オリザノールを０．５〜３質量％含有する米糠油を有効成分として含有するフィラグリン産生促進剤である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のフィラグリン産生促進剤は、フィラグリン遺伝子の発現を増強し、フィラグリン量を増加させることによって、角層中に十分な天然保湿成分を維持するとともに、角層の表面を閉塞して水分の蒸散を防ぐことにより、優れた保湿効果が得られ、乾燥肌や肌荒れを改善することができる。また、アトピー性皮膚炎や尋常性魚鱗癬の症状を改善することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、各試料の所定濃度添加によるフィラグリン遺伝子のmRNA発現量を示す図である。
【図２】実施例２において、製造例１の米糠油の所定濃度添加によるフィラグリンタンパク産生量を示す図である。
【図３】実施例２において、製造例１の米糠油の所定濃度添加によるスポット画像である。
【図４】実施例３においてヘアレスマウス背部のフィラグリンを蛍光免疫染色した顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のフィラグリン産生促進剤は、米糠から抽出された米糠油を有効成分とするものであるが、従来公知の米糠油はγ−オリザノールの含有量が０．０１〜０．２質量％（以下、単に「％」で示す）程度であるのに対し、本発明では、γ−オリザノール含有量が０．５〜３％、好ましくは１〜２％の範囲であるγ−オリザノール高含有米糠油を用いる。また従来公知の米糠油は、植物ステロール含有量が０．１〜０．９％程度であるが、本発明では植物ステロールを１〜５％、好ましくは１．５〜２．５％含有するものを用いることが好適である。植物ステロールとしては、β−シトステロール、スティグマステロール、カンペステロールなどが含まれる。その他、ビタミンＥを０．０２〜０．１％、トコトリエノールを０．０２〜０．１％含有することが好ましい。
【００１３】
上記のような組成を有する米糠油は、米糠から、脱ガム処理、脱ロウ処理、蒸留脱酸処理、脱色処理、脱臭処理を経て製造される。従来公知の製造方法では、通常アルカリ脱酸処理を行うが、本発明に用いる米糠油の製造にあたってはこの処理を行わないことを特徴とする。アルカリ脱酸処理を行わないことにより、上記のようにγ−オリザノールや植物ステロール含有量の高いものが得られる。
【００１４】
より具体的には、まず原料の米糠から油性成分を抽出し、極性の高い脂質成分のガム質を除去する。次いで脱ガム処理後の油性成分に溶剤を加え均一に溶解し、低温で濾過し融点の低いエステル油であるロウ物質を凝固物として除去する。次いで蒸留することにより油性成分中の遊離脂肪酸を除去した後、ろ過剤を用いて脱色し、さらに脱臭処理を行うことによって、本発明に用いる米糠油を製造することができる。
【００１５】
本発明のフィラグリン産生促進剤は、かくして得られた米糠油を有効成分とするものであるが、皮膚外用剤として使用する場合、製剤安定性の観点から米糠油を０．１〜１００％、好ましくは１〜１０％配合すればよい。
【００１６】
本発明のフィラグリン産生促進剤には、通常化粧料や医薬品、医薬部外品に用いられるその他の成分を配合することができる。このような任意成分としては、ビタミン類、色素類、無機塩類、油性基剤、界面活性剤、防腐剤、香料等が挙げられる。ビタミン類としては、レチノール、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、アスコルビン酸、コレカルシフェロール、カルニチン、オロット酸などがある。色素類としては、赤色１０６号、青色１号、だいだい色２０５号、黄色２０２号の(１)、黄色２０３号、緑色３号などがある。無機塩類としては、硫酸ナトリウム、炭素水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アルミニウム、炭酸マグネシウム、塩化カリウム、ミョウバンなどがある。油性基剤としては、液状ラノリン、ホホバ油、米胚芽油、オリーブ油、マカデミアンナッツ油、スクワラン、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、ミリスチン酸イソプロピル、ワセリン、流動パラフィンなどがある。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ラウリン酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレングリコールモノステアレートなどが挙げられる。アトピー性皮膚炎または尋常性魚鱗癬の予防・治療剤とする場合の適用量は、対象者の年齢、性別、症状、疾患の程度等に応じて適宜選定されるが、通常、１日当たり０．０１〜１０ｇ程度適用すればよい。
【００１７】
また本発明の皮膚外用剤は、例えば化粧料、外用医薬品または医薬部外品等として利用することができ、またその形態としては、特に限定されるものではないがローション、スプレー、エアゾールスプレー、クリーム、清拭剤、上がり湯用組成物、入浴剤などが例示できる。
【実施例】
【００１８】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００１９】
製 造 例 １
米糠油の調製：
原料の米糠の抽出油にスチーム混和し、遠心分離によって水相に含まれるガム質を除去した。次いで脱ガム処理後の米糠にｎ−ヘキサンを加え均一に溶解し、０℃以下の低温で冷却濾過しロウ物質を凝固物として除去した。次いでｎ−ヘキサンを留去し、真空蒸留することにより脱酸処理した後、活性白土のろ布濾過によって脱色し、さらに真空加熱をして脱臭処理を行って米糠油を得た。得られた米糠油の脂質の組成について、液体クロマトグラフィーにより分析した。結果を表１に示す。市販品（コメヌカ油；築野食品工業株式会社）の組成も表１に併せて示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
実 施 例 １
フィラグリン遺伝子の発現強度の評価(リアルタイムＰＣＲ法)：
製造例１で得られた米糠油によるフィラグリン遺伝子の発現強度への影響を評価した。ヒト表皮角化細胞を1×104個/wellの細胞密度にて、角化細胞増殖培地（TOYOBO）を用いて96 well plateに播種した。24時間培養後、所定の濃度の試料を含む角化細胞基礎培地に交換し48時間培養した（試料は100%エタノールに所定の濃度となるように溶解し、これを角化細胞基礎培地で100倍希釈して調整した）。細胞は、CellAmp Direct RNA Prep kit（TAKARA Bio）を用いてtotal RNAを抽出し、Primescript RT Master mixを用いてcDNAを合成した。Filaggrin (HA127836, TAKARA Bio)およびGAPDH(HA067812,TAKARA Bio)のプライマーを用いて、LightCycler 480 Realtime System(Roche社)によりmRNA発現量を求めた。同様にして、市販品の米糠油（コメヌカ油；築野食品工業株式会社）、イソプロピルパルミテート、トリカプリル・カプリン酸グリセリド、スクワランについても評価した。結果を図１に示す。
【００２２】
米糠油のフィラグリン遺伝子の発現強度は、市販品の米糠油と比較すると明らかに高い値を示しフィラグリンの遺伝子量は有意に増加している。また、化粧品などに使用される一般的な油性物質において、フィラグリン遺伝子の発現は、認められなかった。
【００２３】
実 施 例 ２
フィラグリンタンパク産生量の評価(Dot-blot法)：
製造例１で得られた米糠油によるフィラグリンタンパクの産生量への影響を評価した。表皮細胞を1.0×10４cells/wellの細胞密度にてKG2培地(クラボウ)を用いて96穴培養プレートに播種した。24時間培養後、所定の濃度の試料を含むウシ脳下垂体抽出物未含有KG2培地に交換し、72時間培養した(試料は100%エタノールに所定の濃度となるように溶解し、これをウシ脳下垂体抽出物未含有KG2培地に100倍希釈して調製した)。細胞はPBS(-)にて洗浄したのち、0.5%TritonX-100(2mMPMSF含有)を加え、超音波処理を行って細胞を破砕した。細胞破砕液をニトロセルロース膜に一定量プロッティングし、一晩乾燥した。乾燥後の転写膜を1%BSAinPBSに浸漬し、室温にて1時間ブロッキングを行った。その後、PBS(-)にて洗浄し、抗ヒトfilaggrin抗体(Anti-Filaggrin(ARGENE))を1:4000の希釈濃度で転写膜上に添加した。室温で1時間反応させた後、PBSにて洗浄した。その後、ヒストファインシンプルステインMAX-PO(M)(ニチレイ)を1:100の希釈濃度で転写膜上に添加し、室温で1時間反応させた。PBS(-)にて洗浄後、Lumi-Light Western Blotting Substrate(Roche)を転写膜上に添加し、1分後にライトキャプチャー(ATTO株式会社)を用いてスポット画像を得た。得られたスポット画像の各スポットの輝度をCS Analyzer Version2.0(ATTO株式会社)を用いて定量した。Filaggrin産生量の変化は、filaggrin由来の発光輝度の定量値を同時に定量したタンパク量にて除することにより補正し、試料未処理細胞(コントロール)の補正値を100とした百分率、Index(%)で表した。それぞれのfilaggrin産生量変化は、Student t検定をもちいて有意差検定を行い、コントロールとの差を評価した。結果を図２に示す。またスポット画像を図３に示す。
【００２４】
製造例１の米糠油において、フィラグリンの遺伝子レベルでの発現を確認できたため、発現するタンパク産生量を測定した結果、米糠油の添加濃度に対して依存的にタンパク産生量の増加を確認できた。この米糠油は、フィラグリンタンパクの産生促進作用を有することが示唆される。
【００２５】
実 施 例 ３
ヘアレスマウスを用いたフィラグリン産生の蛍光免疫染色：
8週齢のHos:HR-1マウスを用いて、背部皮膚に製造例１で得られた米糠油150μLを１日１回、2週間反復塗布した。試験終了時に皮膚を採取し、速やかに凍結させ、4%CMC包埋し、凍結切片をFilaggrin polyclonal antibody(Covance Research Products)で蛍光免疫染色を施した。結果を図４に示す。
【００２６】
製造例１の米糠油を反復塗布したヘアレスマウス表皮の有棘層から顆粒層付近において、蛍光色を呈することが確認された。この米糠油は、フィラグリン産生促進作用を有することが確認された。
【００２７】
実 施 例 ４
皮膚外用ローションの調製：
下記処方の皮膚外用ローションを下記製法により製造した。
（処方）
製造例１の米糠油 ０．８％
ＰＯＥ（１５）セチルエーテル ５％
濃グリセリン ５％
フェノキシエタノール ０．３％
ジプロピレングリコール １％
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１％
精製水 残部
（製法）
精製水以外の成分を加熱混合し、均一溶解後、精製水を溶解原料へゆっくりと撹拌しながら投入し、皮膚外用ローションを得る。
【００２８】
実 施 例 ５
入浴剤の調製：
下記処方の入浴剤を下記製法により製造した。
（処方）
製造例１の米糠油 ３０％
モノステアリン酸ソルビタン ４％
ＰＯＥ(２０)オレイルエーテル ３％
香料 ０．９％
１，３−ブチレングリコール ５％
フェノキシエタノール ０．３％
メチルパラベン ０．３％
ブチルパラベン ０．１％
精製水 残部
（製法）
精製水以外の成分を加熱混合し、均一溶解後、加熱された精製水を溶解原料へゆっ
くりと撹拌しながら投入し、乳化物が得られたら冷却をし、入浴剤を得る。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明のフィラグリン産生促進剤は、フィラグリン遺伝子の発現を増強し、表皮細胞中のフィラグリン産生量を有意に増加させるとともに、角層表面を閉塞して水分蒸散を抑制するエモリエント作用によって、優れた保湿効果が得られるものである。したがって、入浴剤や化粧料等の皮膚外用剤として有用なものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−オリザノールを０．５〜３質量％含有する米糠油を有効成分として含有するフィラグリン産生促進剤。
【請求項２】
米糠油が植物ステロールを１〜５質量％含有するものである請求項１記載のフィラグリン産生促進剤。
【請求項３】
皮膚外用剤である請求項１または２に記載のフィラグリン産生促進剤。
【請求項４】
入浴剤である請求項３記載のフィラグリン産生促進剤。
【請求項５】
請求項１または２に記載のフィラグリン産生促進剤を有効成分として含有するアトピー性皮膚炎の予防・治療剤。
【請求項６】
請求項１または２に記載のフィラグリン産生促進剤を有効成分として含有する尋常性魚鱗癬の予防・治療剤。
【請求項１】
γ−オリザノールを０．５〜３質量％含有する米糠油を有効成分として含有するフィラグリン産生促進剤。
【請求項２】
米糠油が植物ステロールを１〜５質量％含有するものである請求項１記載のフィラグリン産生促進剤。
【請求項３】
皮膚外用剤である請求項１または２に記載のフィラグリン産生促進剤。
【請求項４】
入浴剤である請求項３記載のフィラグリン産生促進剤。
【請求項５】
請求項１または２に記載のフィラグリン産生促進剤を有効成分として含有するアトピー性皮膚炎の予防・治療剤。
【請求項６】
請求項１または２に記載のフィラグリン産生促進剤を有効成分として含有する尋常性魚鱗癬の予防・治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−４０１１３（Ｐ２０１３−４０１１３Ａ）
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７６４９４（Ｐ２０１１−１７６４９４）
【出願日】平成２３年８月１２日（２０１１．８．１２）
【出願人】（３０８０４０６３８）株式会社バスクリン (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月１２日（２０１１．８．１２）
【出願人】（３０８０４０６３８）株式会社バスクリン (12)
【Ｆターム（参考）】
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