フェニル酪酸誘導体又はその塩
【課題】優れたＮＥＰ阻害活性を有する新規化合物の提供。
【解決手段】下記式（１）
（式中、Ｒ1は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基を示し、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基又は炭素数６〜１２のアラルキル基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
【解決手段】下記式（１）
（式中、Ｒ1は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基を示し、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基又は炭素数６〜１２のアラルキル基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェニル酪酸誘導体又はその塩及び当該化合物を有効成分とする中性エンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
中性エンドペプチダーゼ（以下、ＮＥＰともいう）は基質特異性が低く、種々のペプチド類の分解を通じた様々な生体への作用を有することが知られている。
【０００３】
このため別名も多く、例えば鎮痛作用をもつオピオノイドの一種であるエンケファリンを基質とすることからエンケファリナーゼとも呼ばれ、その阻害剤は鎮痛剤、抗うつ剤として応用できる。
また、サブスタンスＰ、ブラジキニン、ニューロテンシン等の神経ペプチド、エンドセリン等を分解することや、キニン、アンジオテンシン等のナトリウム利尿性ペプチドを基質とすることが知られていることから、ＮＥＰ阻害剤は、高血圧治療剤、利尿剤、ナトリウム排泄増加剤として応用できる。
【０００４】
また、当該ＮＥＰ阻害剤は、足や腕等の発毛を効果的に抑制することができ、発毛抑制剤として応用できること（特許文献１）や、皮膚の老化によって生じるしわ、たるみの形成やハリの減少等の外観変化を防止又は改善でき、皮膚老化防止剤（特許文献２）等として応用できることが報告されている。
【０００５】
そして、ショウキョウ、加水分解アーモンド、ワレモコウ等の植物又はその抽出物がＮＥＰ阻害作用を有することが知られている（特許文献３）。
一方、合成ＮＥＰ阻害剤としては、例えば、分子内にペプチド結合を有するマロン酸アミド誘導体（特許文献１）やヒドロキサム酸誘導体（特許文献４）等が報告されている。
さらに、特許文献５には、特定のジペプチド化合物にエンケファリナーゼ活性低下作用があることが記載されている。
しかしながら、従来の合成ＮＥＰ阻害剤は、ＮＥＰ阻害活性の点で十分満足できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−３５１７１６号公報
【特許文献２】特開２００１−１０９４８号公報
【特許文献３】特開２００１−３３５４９５号公報
【特許文献４】特開昭５８−７７８５２号公報
【特許文献５】特開昭５８−３２８５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、優れたＮＥＰ阻害活性を有する新規化合物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らは、斯かる実情に鑑み検討をしたところ、ペプチド結合を有しない下記式（１）で表されるフェニル酪酸誘導体が、優れたＮＥＰ阻害活性を有することを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記式（１）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、Ｒ1は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基を示し、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基又は炭素数６〜１２のアラルキル基を示す。）
で表される化合物又はその塩を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、上記の化合物又はその塩を有効成分とする中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のフェニル酪酸誘導体又はその塩は、優れたＮＥＰ阻害活性を有し、簡便かつ効率よく製造できる。従って、本発明のフェニル酪酸誘導体又はその塩は、皮膚老化防止・改善、発毛抑制、鎮痛、高血圧改善、利尿作用又はナトリウム排泄増加等のための、ヒト又は動物用の医薬品、医薬部外品、化粧料等として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜フェニル酪酸誘導体＞
式（１）中、Ｒ1は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基を示す。
当該Ｒ1において、「炭素数６〜１２のアリール基」としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられるが、ＮＥＰ阻害活性の点から、フェニル基が好ましい。
また、上記Ｒ1に置換していてもよい基としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子；ヒドロキシ基；メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等の炭素数１〜４のアルコキシ基；ニトロ基；シアノ基；アミノ基；カルボキシ基等が挙げられる。これら置換基の数は、１又はそれ以上であり得、置換基を２以上有する場合、当該置換基は同一でも異なっていてもよい。
【００１５】
式（１）中、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基又は炭素数６〜１２のアラルキル基を示す。
当該Ｒ2及びＲ3で示される炭素数１〜２０のアルキル基としては、炭素数１〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられるが、炭素数１〜１４のアルキル基が好ましく、炭素数１〜８のアルキル基がより好ましく、炭素数１〜４のアルキル基がさらに好ましい。
当該炭素数１〜２０のアルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基等が挙げられるが、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましい。
【００１６】
上記炭素数６〜１２のアラルキル基としては、炭素数６〜１０のアラルキル基が好ましく、炭素数６〜８のアラルキル基がより好ましい。
当該炭素数６〜１２のアラルキル基の具体例としては、例えば、ベンジル基、フェニルエチル基、ナフチルメチル基等が挙げられる。
【００１７】
また、上記Ｒ2及びＲ3としては、ＮＥＰ阻害活性の点から、共に水素原子であるのが好ましい。
【００１８】
なお、式（１）で表される化合物又はその塩（以下、本発明化合物（１）ともいう）は、少なくとも２以上のキラル中心を有するため、例えば、Ｓ体、Ｒ体、ＳＳ体、ＲＲ体、ＲＳ体等の異性体が存在し得るが、本発明においては、これらのいずれでもよく、ラセミ体等の混合物であってもよい。
【００１９】
また、式（１）で表される化合物の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の鉱酸塩；乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、亜鉛塩等の両性金属塩等が挙げられる。
なお、本発明化合物（１）は水和物等の溶媒和物の形態であってもよい。
【００２０】
＜本発明化合物（１）の製造方法＞
本発明化合物（１）は、次の反応に従い製造できる。すなわち、化合物（２）のカルボキシ基を保護して化合物（３）とし（工程１）、保護基Ｒ4を酸性条件下で脱離させて、化合物（４）を得る（工程２）。これと、カルボキシ基を保護したヒドロキシフェニル酪酸化合物（５）とを反応させて化合物（６）を得て（工程３）、この化合物（６）の保護基Ｒ5及びＲ6を脱離させ、必要な場合に適宜エステル化することにより（工程４）、本発明化合物（１）を製造できる。
【００２１】
【化２】
【００２２】
（式中、Ｒ4はアミノ保護基を示し、Ｒ5及びＲ6はそれぞれ独立してカルボキシ保護基を示す。Ｒ1〜Ｒ3は前記と同じ。）
【００２３】
＜工程１＞
工程１は、化合物（２）のカルボキシ基を保護基Ｒ5で保護して化合物（３）を得る工程である。
式中、Ｒ4で示されるアミノ保護基としては、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基等のカルバメート系保護基が好ましく、反応効率の点から、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基がより好ましい。
【００２４】
Ｒ5で示されるカルボキシ保護基としては、カルボン酸エステルのエステル残基が好適に挙げられ、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の低級アルキル基；ビニル基、アリル基等の低級アルケニル基；ベンジル基等のアラルキル基等が挙げられるが、反応効率の点から、アラルキル基が好ましい。当該アラルキル基で保護する場合、アラルキルアルコールやアラルキルハライドを用いればよい。
【００２５】
また、本工程は、脱水縮合剤等の存在下で行うのが好ましく、当該脱水縮合剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド等が挙げられる。当該脱水縮合剤の使用量としては、化合物（２）に対して、１〜３モル当量程度が好ましい。
【００２６】
また、上記脱水縮合剤を使用する場合は、反応効率の点から、４−ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、４−メチルモルホリン等の第三級アミン；炭酸カリウム等の炭酸のアルカリ金属塩；酢酸ナトリウム等の有機酸のアルカリ金属塩等の塩基触媒存在下で行うのが好ましい。
【００２７】
また、上記反応は、溶媒存在下で反応させるのが好ましく、当該溶媒としては、例えば、酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ヘキサン等の無極性溶媒；テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド等の極性非プロトン性溶媒；これらの混合溶媒等が挙げられる。
上記反応の反応時間としては、３０分〜２４時間が好ましく、反応温度としては、−２０〜１００℃が好ましい。
【００２８】
上記反応は、円滑な保護反応促進の点から、不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。不活性ガスは、特に限定されないが、例えば、アルゴンガス、窒素ガス、ヘリウムガス等が挙げられる。
【００２９】
なお、原料である化合物（２）は、公知の反応により適宜合成することができ、市販品を用いることもできる。
【００３０】
＜工程２＞
工程２は、化合物（３）の保護基Ｒ4を酸性条件下で脱離させて、化合物（４）を得る工程である。
当該反応は、ギ酸、塩酸、トリフルオロ酢酸、p−トルエンスルホン酸、硫酸等の酸性化合物存在下で反応させるのが好ましい。
また、上記反応は、溶媒存在下、溶媒非存在下いずれでも行うことができる。反応時間としては、３０分〜２４時間が好ましく、反応温度としては、−２０〜１００℃が好ましい。
【００３１】
＜工程３＞
工程３は、化合物（４）と化合物（５）とを反応させて化合物（６）を得る工程である。
【００３２】
上記反応は、求核反応の条件に従って行えばよく、通常、強酸化合物、或いは当該化合物の無水物やハロゲン化物の存在下で行われる。当該強酸化合物としては、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸；臭化水素、塩化水素等のハロゲン化水素等が挙げられる。当該強酸化合物の使用量としては、化合物（５）に対して、１〜２モル当量程度が好ましい。
【００３３】
また、上記反応は、反応効率の点から、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン等の第三級アミン；水素化ナトリウム等のアルカリ金属水素化物；炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属の炭酸水素塩等の塩基触媒存在下で行うのが好ましい。
【００３４】
また、上記反応は、溶媒存在下で反応させるのが好ましく、当該溶媒としては、例えば、酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ヘキサン等の無極性溶媒；テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド等の極性非プロトン性溶媒；これらの混合溶媒等が挙げられる。
上記反応の反応時間としては、３０分〜１２０時間が好ましく、反応温度としては、−１００〜１００℃が好ましい。
【００３５】
上記反応は、反応効率の点から、不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。不活性ガスは、特に限定されないが、例えば、アルゴンガス、窒素ガス、ヘリウムガス等が挙げられる。
【００３６】
なお、化合物（５）は、対応するヒドロキシフェニル酪酸化合物のカルボキシ基を保護することにより得ればよい。
【００３７】
＜工程４＞
前記工程４において、化合物（６）の保護基Ｒ2及びＲ3の脱離反応は、カルボキシ保護基の脱離に用いられる方法、例えば加水分解、還元等の慣用の方法を挙げることができる。
加水分解は、塩基またはルイス酸等の酸の存在下で実施するのが好ましく、好適な塩基としては、例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属、炭酸塩または炭酸水素塩、トリアルキルアミン、ヒドラジン、ピコリン等を挙げることができる。また、ルイス酸（例えば塩化アルミニウム、三塩化チタン、四塩化錫等）等を用いる場合は、カチオン捕捉剤（例えばアニソール、フェノール等）の存在下で行うのが好ましい。
還元反応は、化学還元および触媒還元等の慣用の方法で行われる。化学還元に用いられる好適な還元剤としては、例えば、Ｎａ／ＮＨ3（Ｉ）、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化シアノホウ素ナトリウム等の水素化物、錫、亜鉛等の金属が挙げられ、触媒還元に使用される好適な触媒としては、白金触媒、パラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ、Ｐｄ（ＯＨ）2／Ｃ、Ｐｄ／ｂｌａｃｋ）、ニッケル触媒等を挙げることができる。
このうち、Ｈ2及びＰｄ／Ｃ触媒存在下、Ｎａ／ＮＨ3（Ｉ）存在下等の還元条件下で反応させるのが好ましい。Ｐｄ／Ｃ触媒を使用する場合、当該触媒の使用量としては、０．１〜１００質量％程度が好ましい。
【００３８】
また、上記反応は、溶媒存在下で反応させるのが好ましく、当該溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン等の極性非プロトン性溶媒；水、メタノール、エタノール、酢酸等の極性プロトン溶媒；塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ジエチルエーテルなどの無極性溶媒；又はこれらの混合溶媒等が挙げられる。
上記反応の反応時間としては、３０分〜２４時間が好ましく、反応温度としては、０〜１００℃が好ましい。
【００３９】
上記反応において、各反応生成物の単離は、必要に応じて、有機合成化学で常用される精製法、例えば、ろ過、洗浄、乾燥、再結晶、遠心分離、各種溶媒による抽出、中和、クロマトグラフィー等の通常の手段を適宜組み合わせて行えばよい。なお、化合物（３）、（４）及び（６）については、単離せずに次の反応に付すこともできる。
【００４０】
＜ＮＥＰ阻害剤＞
上記工程１〜４により得られる、新規な本発明化合物（１）又はその塩は、後記実施例に示すように、優れたＮＥＰ阻害活性を有する。従って、本発明化合物（１）又はその塩は、ＮＥＰ阻害剤として使用することができ、また、当該ＮＥＰ阻害剤を製造するために使用できる。
【００４１】
そして、前述のとおり、ＮＥＰ活性阻害剤は、皮膚老化防止・改善、発毛抑制、鎮痛、高血圧改善、利尿作用及びナトリウム排泄増加等の効果を発揮し得ることから、本発明化合物（１）又はその塩は、皮膚老化防止・改善剤、発毛抑制剤、鎮痛剤、高血圧改善剤、利尿剤又はナトリウム排泄増加剤ともなり得、皮膚老化防止・改善、発毛抑制、鎮痛、高血圧改善、利尿作用又はナトリウム排泄増加等のための、ヒト又は動物用の医薬品、医薬部外品、化粧料等として使用できる。
【００４２】
本発明のＮＥＰ阻害剤等を医薬品として使用する場合、任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、経口、経腸、経粘膜、注射、点滴、経皮等が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、徐放性製剤、懸濁液、エマルジョン剤、内服液、糖衣錠、丸剤、細粒剤、シロップ剤、エリキシル剤等が挙げられる。非経口投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉注射剤等の注射剤；液剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、パップ剤、エアゾール剤、ローション剤、ファンデーション等の皮膚外用剤；坐剤、吸入薬、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
【００４３】
また、斯かる製剤では、本発明化合物（１）又はその塩と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、流動性促進剤、吸収助剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定化剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤等が挙げられる。
【００４４】
上記製剤中の本発明化合物（１）又はその塩の含有量としては、製剤全質量の０．０００１〜４０質量％が好ましく、０．０１〜２０質量％がより好ましい。
また、上記製剤の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、本発明化合物（１）又はその塩として１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、３〜３０ｍｇ／ｋｇが好ましい。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００４５】
本発明のＮＥＰ阻害剤等を医薬部外品や化粧料として用いる場合は、洗浄剤、メイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の医薬部外品や化粧料は、本発明化合物（１）又はその塩を単独で、又は医薬部外品、皮膚化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤（例えば、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、ビタミン類、脂肪代謝促進作用又は脱共役蛋白質発現促進作用が知られている薬物或いは天然物）、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製できる。
当該医薬部外品、化粧料中の本発明化合物（１）又はその塩の含有量としては、０．０００１〜１０質量％が好ましく、０．００１〜５質量％がより好ましい。
【００４６】
本発明のＮＥＰ阻害剤等を外用する場合、その使用量は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮層面１ｃｍ2当たり１〜２０ｍｇ、液状の場合、同じく１〜２０ｍｇ使用するのが好ましい。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を具体的に説明する。
＜ＮＭＲスペクトル＞
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、特記しない限り、重水素化溶媒中の残存プロトンピークを内部標準として用い、Ｂｒｕｋｅｒ製ＡＶＡＮＣＥIII(６００MHz)にて測定をした。
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、特記しない限り、溶媒ピークを内部標準として用い、Ｂｒｕｋｅｒ製ＡＶＡＮＣＥIII(１５０MHz)にて測定をした。
＜ＩＲスペクトル＞
ＩＲスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｎｅにて測定した。
【００４８】
合成例 化合物5の合成
下記の合成経路に従い、3-(4-ビフェニルイル)-N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-アラニンを原料として、N-[1-(S)-カルボキシ-3-フェニルプロピル]-L-4,4'-ビフェニルアラニン（化合物5）を合成した。
【００４９】
【化３】
【００５０】
１）化合物1の合成
窒素雰囲気下、3-(4-ビフェニルイル)-N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-アラニン1.01g（2.97 mmol）をクロロホルム 20mLにて溶解させた後、氷冷下、ベンジルアルコール 0.39 mL（3.77 mmol）、4-ジメチルアミノピリジン 36.8 mg（0.301 mmol）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩0.63 g（3.26 mmol）をそれぞれ加え、氷冷下1.5時間撹拌した。TLCにて反応終了を確認した後、濃縮した。残渣に酢酸エチル（30 mL）を加え、飽和塩化アンモニウム水溶液（30 mL）、飽和重曹水（30 mL）で中和し、飽和食塩水（30 mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。濃縮後、得られた淡黄色油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｎ（球状、中性、40-50μm）、関東化学製）（ヘキサン／酢酸エチル＝5/1、シリカゲル40g）で精製して、白色固体の化合物1を1.20g（収率94%）を得た。
【００５１】
1H-NMR(CDCl3) δ：1.42(9H, s), 3.11(1H, dd, J = 5.8, 13.7Hz), 3.16(1H, dd, J =5.7, 13.7Hz), 4.67(1H, ddd, J =5.7, 5.8, 8.1Hz), 5.03(1H, d, J =8.1Hz), 5.11(1H, d, J =12.2Hz), 5.19(1H, d, J =12.2Hz), 7.08-7.12(2H, m), 7.28-7.36(6H, m), 7.42-7.49(4H, m), 7.54-7.57(2H, m) (ppm)
13C-NMR(CDCl3) δ：28.4, 38.1, 54.6, 67.3, 80.1, 127.2, 127.37, 127.38, 128.6, 128.7, 128.9, 129.9, 135.0, 135.3, 140.0, 140.9, 155.2, 171.9(ppm)
【００５２】
２）化合物2の合成
1.21g(2.80 mmol)の化合物1にギ酸 25 mLを加え、室温で15時間撹拌した。TLCにて反応終了を確認した後、濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=100/0→90/10、YAMAZEN Hi-Flash column L）で精製し、白色固体の化合物2を1.10g（収率 定量的）を得た。
【００５３】
1H-NMR(CD3OD) δ：3.22(2H, dd, J =2.5, 7.0Hz), 4.32(1H, t, J= 7.0Hz), 5.20(1H, d, J =12.0Hz), 5.25(1H, d, J =12.0Hz), 7.23-7.26(2H, m), 7.28-7.37(6H, m), 7.42-7.46(2H, m), 7.54-7.61(4H, m), 8.31(1H, brs)(ppm)
13C-NMR(CD3OD) δ： 37.7, 55.3, 69.1, 127.9, 128.57, 128.60, 129.7, 129.8, 129.9, 134.5, 136.3, 141.8, 142.0, 167.3, 170.7(ppm)
【００５４】
３）化合物3の合成
(R)-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸1.00 g（5.58 mmol）にトルエン 25 mLを加え、60℃にて1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン0.917mL（6.13 mmol）、ベンジルブロミド 0.733 mL（6.13 mmol）を加え、一昼夜攪拌した。TLCで反応終了を確認後、ジエチルエーテル（30mL）、水（10mL）を加え、分液し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル=100/0→80/20、YAMAZEN Hi-Flash column L）で精製し、白色固体の化合物3 を1.46 g（収率97%）を得た。
【００５５】
1H-NMR(CDCl3) δ：7.33-7.40(5H, m), 7.25-7.29(2H, m), 7.14-7.20(3H, m), 5.19(1H, d, J =12.1Hz), 5.17(1H, d, J =12.1Hz), 4.24(1H, ddd, J =4.0, 5.4, 7.6Hz), 2.83(1H, d, J =5.4Hz), 2.76(1H, ddd, J =6.7, 9.9, 13.7Hz), 2.68(1H, ddd, J =5.3, 10.1, 13.7Hz), 2.13(1H, dddd, J =4.0, 6.7, 10.1, 17.2Hz), 1.96(1H, dddd, J =5.3, 7.6, 9.9, 17.2Hz)(ppm)
13C-NMR(CDCl3) δ：175.2, 141.2, 135.2, 128.84, 128.79, 128.71, 128.58, 128.55, 126.2, 69.9, 67.6, 36.1, 31.0(ppm)
【００５６】
４）化合物4の合成
窒素雰囲気下、0.65 g（2.41 mmol）の化合物3にジクロロメタン 20mLを加え、-78℃条件下、トリエチルアミン 0.80ｍL（5.7mmol）、トリフルオロメタンスルホン酸無水物 0.45 mL（2.67mmol）を加え、1時間撹拌した。TLCで反応終了を確認した後、0.41g（1.10 mmol）の化合物2にジクロロメタン4mL、トリエチルアミン 0.16 mL（1.11mmol）を加えて撹拌させた溶液を、-78℃条件下、上記の反応系に滴下した。フラスコに残った化合物2をジクロロメタン（1mL）で溶解させ、反応系に加えた。徐々に室温まで上昇させながら、68時間撹拌させた。TLCにて反応終了を確認した後、濃縮し、残渣を酢酸エチル（20mL）で抽出、飽和食塩水（20mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した後、得られた褐色油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル/メタノール=100/0→0/100→0/90/10、YAMAZEN Hi-Flash column 2L）で精製し、淡黄色油状の化合物4を0.20g（収率32%）で得た。
【００５７】
1H-NMR(CD3CN) δ：1.75-1.82(1H, m), 1.84-1.91(1H, m), 2.57(2H, t, J =7.9Hz), 2.91(1H, dd, J =7.0, 13.5Hz), 2.97(1H, dd, J =7.3, 13.5Hz), 3.32(1H, d, J =7.4, 7.4Hz), 3.62(1H, dd, J =7.1, 7.1Hz), 5.00(1H, d, J = 12.3Hz), 5.03(1H, d, J =12.3Hz), 5.07(2H, s), 7.10-7.64(24H, m)(ppm)
13C-NMR(CD3CN) δ：32.3, 35.8, 39.8, 60.0, 62.1, 67.12, 67.13, 126.9, 127.7, 127.8, 128.3, 29.1, 129.17, 129.22, 129.26, 129.31, 129.39, 129.42, 129.5, 129.9, 130.8, 137.0, 137.3, 137.7, 140.1, 141.5, 142.6, 174.4, 174.8（ppm）
【００５８】
５）化合物5の合成
アルゴン雰囲気下、31.1mg（0.0533 mmol）の化合物4にジメチルホルムアミド 1.6mL、10％ Pd/C 3.8mgを加えた後、室温、水素雰囲気下にて4時間激しく撹拌した。TLCで反応終了を確認後、セライトろ過にてPd/Cを除き、ジメチルスルホキシド（10ｍL）でろ物を十分に洗浄した。得られたろ液に水（20mL）を加えて凍結乾燥させた。得られた残渣にメタノール（3mL）を加え、60℃にて加熱、撹拌した後、桐山ろ過にてろ物を回収後、メタノールで洗浄し、白色固体の化合物5を5.2 mg（収率28%）で得た。
【００５９】
1H-NMR(DMSO-d6) δ：1.71-1.86(2H, m), 2.55-2.66(2H, m), 2.90(1H, dd, J=6.8, 13.7Hz), 2.96(1H, dd, J =6.9, 13.7Hz), 3.20(1H, dd, J =6.3, 6.3Hz), 3.49(1H, dd, J=6.8, 6.9Hz), 7.14-7.19(2H, m), 7.24-7.28(2H, m), 7.31(2H. d, J =7.1Hz), 7.33-7.37(1H, m), 7.43-7.47(2H, m), 7.56-7.60(2H, m), 7.63-7.66(2H, m)(ppm)
13C-NMR(DMSO-d6) δ：31.3, 34.6, 38.3, 58.7, 60.9, 125.8, 126.47, 126.54, 127.3, 128.35, 128.38, 129.0, 129.8, 137.1, 138.2, 140.0, 141.6, 174.4, 175.0（ppm）
【００６０】
IR(cm-1, ATR)：3030, 2929, 2863, 1720, 1595, 1488, 1453, 1388, 1356, 1287, 1243, 751, 695
【００６１】
試験例１ 培養ヒト線維芽細胞由来の中性エンドペプチダーゼ（NEP）活性阻害試験
Cell System社より市販されている正常ヒト線維芽細胞を用いて、10％牛胎児血清を含むDME培地で継体培養し、以下の試験に供した。試験方法は、The Journal of Biological Chemistry, 266(34), 23041-23047(1991)に記載の方法を参照した。
【００６２】
ラバーポリスマンを用いてシャーレから剥がした細胞を、リン酸緩衝食塩水中に浮遊させ、低速の遠心分離器を使って細胞を集めた後、同生理食塩水で3回洗浄した。得られた細胞を0.1％ Triton X-100／0.2Ｍ Tris-HClバッファー（pH 8.0）に浮遊させ、超音波粉砕し、MESバッファー（ｐH 6.5）で適宜希釈した溶液をヒト線維芽細由来酵素液とした。酵素活性測定の基質には、10ｍＭグルタリル−Ala−Ala−Phe−4−メトキシ−２−ナフチルアミンを用いた。酵素液100μＬに対し、下記表に示す濃度の上記合成例で得た化合物5（１μＬ）と、基質（2μＬ）とを添加し、37℃にて１時間反応させた。その後、ホスホラミドン（Phosphoramidon）を最終濃度１μＭとなるように添加して、基質分解反応を停止させた。なお、ヒト線維芽細由来酵素液に含まれるNEPは、Ala-Phe結合を切断して基質を分解する。
そして、上記の反応系にロイシンアミノペプチダーゼ（Leucine aminopeptidase）を最終濃度が0.50mU／mLとなるように添加し、37℃で1時間反応させた。これにより、NEP分解産物がロイシンアミノペプチダーゼによってさらに切断、分解され、4−メトキシ−2−ナフチルアミンを生じる。
生成した４−メトキシ−２−ナフチルアミンについて、蛍光分光光度計（Wallac 1420 ARVOsx、パーキンエルマー社製）で励起波長340nm、蛍光波長425nmにて蛍光強度を測定した。
【００６３】
一方、コントロールとして、上記酵素反応系において、化合物5の代わりにジメチルスルホキシドを同量加えた以外は上記と同様にして試料を作成し、反応を行い、蛍光強度を測定した。
【００６４】
得られた測定値をもとに、以下の式からNEP活性阻害率を算出した。結果を表１に示す。
【００６５】
NEP活性阻害率（％）＝１００−｛（評価サンプル添加時の４−メトキシ−２−ナフチルアミンの蛍光強度）／（コントロール添加時の４−メトキシ−２−ナフチルアミンの蛍光強度）｝×１００
【００６６】
【表１】
【００６７】
処方例１ 皮膚老化改善用ローションの調製
下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製する。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製する。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、ローションを得る。
【００６８】
【表２】
【００６９】
処方例２ 皮膚老化改善用クリームの調製
下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製する。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製する。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、乳化後、冷却して、クリームを得る。
【００７０】
【表３】
【００７１】
処方例３ エアゾールの調製
下記Ａの成分を均一に混合して容器に入れ、Ｂの液化石油ガス（噴射剤）を常法により容器に充填してエアゾールを製造する。
【００７２】
【表４】
【００７３】
処方例４ 皮膚老化改善用パック剤の調製
下記の組成のパック剤を常法により調製する。
【００７４】
【表５】
【００７５】
処方例５ ファンデーションの調製
下記の組成のファンデーションを常法により調製する。
【００７６】
【表６】
【００７７】
処方例６ 皮膚老化改善用化粧水の調製
下記の組成の化粧水を常法により調製する。
【００７８】
【表７】
【００７９】
処方例７ 皮膚老化改善用ジェルの調製
下記の組成のジェルを常法により調製する。
【００８０】
【表８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェニル酪酸誘導体又はその塩及び当該化合物を有効成分とする中性エンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
中性エンドペプチダーゼ（以下、ＮＥＰともいう）は基質特異性が低く、種々のペプチド類の分解を通じた様々な生体への作用を有することが知られている。
【０００３】
このため別名も多く、例えば鎮痛作用をもつオピオノイドの一種であるエンケファリンを基質とすることからエンケファリナーゼとも呼ばれ、その阻害剤は鎮痛剤、抗うつ剤として応用できる。
また、サブスタンスＰ、ブラジキニン、ニューロテンシン等の神経ペプチド、エンドセリン等を分解することや、キニン、アンジオテンシン等のナトリウム利尿性ペプチドを基質とすることが知られていることから、ＮＥＰ阻害剤は、高血圧治療剤、利尿剤、ナトリウム排泄増加剤として応用できる。
【０００４】
また、当該ＮＥＰ阻害剤は、足や腕等の発毛を効果的に抑制することができ、発毛抑制剤として応用できること（特許文献１）や、皮膚の老化によって生じるしわ、たるみの形成やハリの減少等の外観変化を防止又は改善でき、皮膚老化防止剤（特許文献２）等として応用できることが報告されている。
【０００５】
そして、ショウキョウ、加水分解アーモンド、ワレモコウ等の植物又はその抽出物がＮＥＰ阻害作用を有することが知られている（特許文献３）。
一方、合成ＮＥＰ阻害剤としては、例えば、分子内にペプチド結合を有するマロン酸アミド誘導体（特許文献１）やヒドロキサム酸誘導体（特許文献４）等が報告されている。
さらに、特許文献５には、特定のジペプチド化合物にエンケファリナーゼ活性低下作用があることが記載されている。
しかしながら、従来の合成ＮＥＰ阻害剤は、ＮＥＰ阻害活性の点で十分満足できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−３５１７１６号公報
【特許文献２】特開２００１−１０９４８号公報
【特許文献３】特開２００１−３３５４９５号公報
【特許文献４】特開昭５８−７７８５２号公報
【特許文献５】特開昭５８−３２８５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、優れたＮＥＰ阻害活性を有する新規化合物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らは、斯かる実情に鑑み検討をしたところ、ペプチド結合を有しない下記式（１）で表されるフェニル酪酸誘導体が、優れたＮＥＰ阻害活性を有することを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記式（１）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、Ｒ1は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基を示し、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基又は炭素数６〜１２のアラルキル基を示す。）
で表される化合物又はその塩を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、上記の化合物又はその塩を有効成分とする中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のフェニル酪酸誘導体又はその塩は、優れたＮＥＰ阻害活性を有し、簡便かつ効率よく製造できる。従って、本発明のフェニル酪酸誘導体又はその塩は、皮膚老化防止・改善、発毛抑制、鎮痛、高血圧改善、利尿作用又はナトリウム排泄増加等のための、ヒト又は動物用の医薬品、医薬部外品、化粧料等として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜フェニル酪酸誘導体＞
式（１）中、Ｒ1は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基を示す。
当該Ｒ1において、「炭素数６〜１２のアリール基」としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられるが、ＮＥＰ阻害活性の点から、フェニル基が好ましい。
また、上記Ｒ1に置換していてもよい基としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子；ヒドロキシ基；メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等の炭素数１〜４のアルコキシ基；ニトロ基；シアノ基；アミノ基；カルボキシ基等が挙げられる。これら置換基の数は、１又はそれ以上であり得、置換基を２以上有する場合、当該置換基は同一でも異なっていてもよい。
【００１５】
式（１）中、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基又は炭素数６〜１２のアラルキル基を示す。
当該Ｒ2及びＲ3で示される炭素数１〜２０のアルキル基としては、炭素数１〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられるが、炭素数１〜１４のアルキル基が好ましく、炭素数１〜８のアルキル基がより好ましく、炭素数１〜４のアルキル基がさらに好ましい。
当該炭素数１〜２０のアルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基等が挙げられるが、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましい。
【００１６】
上記炭素数６〜１２のアラルキル基としては、炭素数６〜１０のアラルキル基が好ましく、炭素数６〜８のアラルキル基がより好ましい。
当該炭素数６〜１２のアラルキル基の具体例としては、例えば、ベンジル基、フェニルエチル基、ナフチルメチル基等が挙げられる。
【００１７】
また、上記Ｒ2及びＲ3としては、ＮＥＰ阻害活性の点から、共に水素原子であるのが好ましい。
【００１８】
なお、式（１）で表される化合物又はその塩（以下、本発明化合物（１）ともいう）は、少なくとも２以上のキラル中心を有するため、例えば、Ｓ体、Ｒ体、ＳＳ体、ＲＲ体、ＲＳ体等の異性体が存在し得るが、本発明においては、これらのいずれでもよく、ラセミ体等の混合物であってもよい。
【００１９】
また、式（１）で表される化合物の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の鉱酸塩；乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、亜鉛塩等の両性金属塩等が挙げられる。
なお、本発明化合物（１）は水和物等の溶媒和物の形態であってもよい。
【００２０】
＜本発明化合物（１）の製造方法＞
本発明化合物（１）は、次の反応に従い製造できる。すなわち、化合物（２）のカルボキシ基を保護して化合物（３）とし（工程１）、保護基Ｒ4を酸性条件下で脱離させて、化合物（４）を得る（工程２）。これと、カルボキシ基を保護したヒドロキシフェニル酪酸化合物（５）とを反応させて化合物（６）を得て（工程３）、この化合物（６）の保護基Ｒ5及びＲ6を脱離させ、必要な場合に適宜エステル化することにより（工程４）、本発明化合物（１）を製造できる。
【００２１】
【化２】
【００２２】
（式中、Ｒ4はアミノ保護基を示し、Ｒ5及びＲ6はそれぞれ独立してカルボキシ保護基を示す。Ｒ1〜Ｒ3は前記と同じ。）
【００２３】
＜工程１＞
工程１は、化合物（２）のカルボキシ基を保護基Ｒ5で保護して化合物（３）を得る工程である。
式中、Ｒ4で示されるアミノ保護基としては、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基等のカルバメート系保護基が好ましく、反応効率の点から、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基がより好ましい。
【００２４】
Ｒ5で示されるカルボキシ保護基としては、カルボン酸エステルのエステル残基が好適に挙げられ、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の低級アルキル基；ビニル基、アリル基等の低級アルケニル基；ベンジル基等のアラルキル基等が挙げられるが、反応効率の点から、アラルキル基が好ましい。当該アラルキル基で保護する場合、アラルキルアルコールやアラルキルハライドを用いればよい。
【００２５】
また、本工程は、脱水縮合剤等の存在下で行うのが好ましく、当該脱水縮合剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド等が挙げられる。当該脱水縮合剤の使用量としては、化合物（２）に対して、１〜３モル当量程度が好ましい。
【００２６】
また、上記脱水縮合剤を使用する場合は、反応効率の点から、４−ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、４−メチルモルホリン等の第三級アミン；炭酸カリウム等の炭酸のアルカリ金属塩；酢酸ナトリウム等の有機酸のアルカリ金属塩等の塩基触媒存在下で行うのが好ましい。
【００２７】
また、上記反応は、溶媒存在下で反応させるのが好ましく、当該溶媒としては、例えば、酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ヘキサン等の無極性溶媒；テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド等の極性非プロトン性溶媒；これらの混合溶媒等が挙げられる。
上記反応の反応時間としては、３０分〜２４時間が好ましく、反応温度としては、−２０〜１００℃が好ましい。
【００２８】
上記反応は、円滑な保護反応促進の点から、不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。不活性ガスは、特に限定されないが、例えば、アルゴンガス、窒素ガス、ヘリウムガス等が挙げられる。
【００２９】
なお、原料である化合物（２）は、公知の反応により適宜合成することができ、市販品を用いることもできる。
【００３０】
＜工程２＞
工程２は、化合物（３）の保護基Ｒ4を酸性条件下で脱離させて、化合物（４）を得る工程である。
当該反応は、ギ酸、塩酸、トリフルオロ酢酸、p−トルエンスルホン酸、硫酸等の酸性化合物存在下で反応させるのが好ましい。
また、上記反応は、溶媒存在下、溶媒非存在下いずれでも行うことができる。反応時間としては、３０分〜２４時間が好ましく、反応温度としては、−２０〜１００℃が好ましい。
【００３１】
＜工程３＞
工程３は、化合物（４）と化合物（５）とを反応させて化合物（６）を得る工程である。
【００３２】
上記反応は、求核反応の条件に従って行えばよく、通常、強酸化合物、或いは当該化合物の無水物やハロゲン化物の存在下で行われる。当該強酸化合物としては、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸；臭化水素、塩化水素等のハロゲン化水素等が挙げられる。当該強酸化合物の使用量としては、化合物（５）に対して、１〜２モル当量程度が好ましい。
【００３３】
また、上記反応は、反応効率の点から、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン等の第三級アミン；水素化ナトリウム等のアルカリ金属水素化物；炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属の炭酸水素塩等の塩基触媒存在下で行うのが好ましい。
【００３４】
また、上記反応は、溶媒存在下で反応させるのが好ましく、当該溶媒としては、例えば、酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ヘキサン等の無極性溶媒；テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド等の極性非プロトン性溶媒；これらの混合溶媒等が挙げられる。
上記反応の反応時間としては、３０分〜１２０時間が好ましく、反応温度としては、−１００〜１００℃が好ましい。
【００３５】
上記反応は、反応効率の点から、不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。不活性ガスは、特に限定されないが、例えば、アルゴンガス、窒素ガス、ヘリウムガス等が挙げられる。
【００３６】
なお、化合物（５）は、対応するヒドロキシフェニル酪酸化合物のカルボキシ基を保護することにより得ればよい。
【００３７】
＜工程４＞
前記工程４において、化合物（６）の保護基Ｒ2及びＲ3の脱離反応は、カルボキシ保護基の脱離に用いられる方法、例えば加水分解、還元等の慣用の方法を挙げることができる。
加水分解は、塩基またはルイス酸等の酸の存在下で実施するのが好ましく、好適な塩基としては、例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属、炭酸塩または炭酸水素塩、トリアルキルアミン、ヒドラジン、ピコリン等を挙げることができる。また、ルイス酸（例えば塩化アルミニウム、三塩化チタン、四塩化錫等）等を用いる場合は、カチオン捕捉剤（例えばアニソール、フェノール等）の存在下で行うのが好ましい。
還元反応は、化学還元および触媒還元等の慣用の方法で行われる。化学還元に用いられる好適な還元剤としては、例えば、Ｎａ／ＮＨ3（Ｉ）、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化シアノホウ素ナトリウム等の水素化物、錫、亜鉛等の金属が挙げられ、触媒還元に使用される好適な触媒としては、白金触媒、パラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ、Ｐｄ（ＯＨ）2／Ｃ、Ｐｄ／ｂｌａｃｋ）、ニッケル触媒等を挙げることができる。
このうち、Ｈ2及びＰｄ／Ｃ触媒存在下、Ｎａ／ＮＨ3（Ｉ）存在下等の還元条件下で反応させるのが好ましい。Ｐｄ／Ｃ触媒を使用する場合、当該触媒の使用量としては、０．１〜１００質量％程度が好ましい。
【００３８】
また、上記反応は、溶媒存在下で反応させるのが好ましく、当該溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン等の極性非プロトン性溶媒；水、メタノール、エタノール、酢酸等の極性プロトン溶媒；塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ジエチルエーテルなどの無極性溶媒；又はこれらの混合溶媒等が挙げられる。
上記反応の反応時間としては、３０分〜２４時間が好ましく、反応温度としては、０〜１００℃が好ましい。
【００３９】
上記反応において、各反応生成物の単離は、必要に応じて、有機合成化学で常用される精製法、例えば、ろ過、洗浄、乾燥、再結晶、遠心分離、各種溶媒による抽出、中和、クロマトグラフィー等の通常の手段を適宜組み合わせて行えばよい。なお、化合物（３）、（４）及び（６）については、単離せずに次の反応に付すこともできる。
【００４０】
＜ＮＥＰ阻害剤＞
上記工程１〜４により得られる、新規な本発明化合物（１）又はその塩は、後記実施例に示すように、優れたＮＥＰ阻害活性を有する。従って、本発明化合物（１）又はその塩は、ＮＥＰ阻害剤として使用することができ、また、当該ＮＥＰ阻害剤を製造するために使用できる。
【００４１】
そして、前述のとおり、ＮＥＰ活性阻害剤は、皮膚老化防止・改善、発毛抑制、鎮痛、高血圧改善、利尿作用及びナトリウム排泄増加等の効果を発揮し得ることから、本発明化合物（１）又はその塩は、皮膚老化防止・改善剤、発毛抑制剤、鎮痛剤、高血圧改善剤、利尿剤又はナトリウム排泄増加剤ともなり得、皮膚老化防止・改善、発毛抑制、鎮痛、高血圧改善、利尿作用又はナトリウム排泄増加等のための、ヒト又は動物用の医薬品、医薬部外品、化粧料等として使用できる。
【００４２】
本発明のＮＥＰ阻害剤等を医薬品として使用する場合、任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、経口、経腸、経粘膜、注射、点滴、経皮等が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、徐放性製剤、懸濁液、エマルジョン剤、内服液、糖衣錠、丸剤、細粒剤、シロップ剤、エリキシル剤等が挙げられる。非経口投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉注射剤等の注射剤；液剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、パップ剤、エアゾール剤、ローション剤、ファンデーション等の皮膚外用剤；坐剤、吸入薬、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
【００４３】
また、斯かる製剤では、本発明化合物（１）又はその塩と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、流動性促進剤、吸収助剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定化剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤等が挙げられる。
【００４４】
上記製剤中の本発明化合物（１）又はその塩の含有量としては、製剤全質量の０．０００１〜４０質量％が好ましく、０．０１〜２０質量％がより好ましい。
また、上記製剤の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、本発明化合物（１）又はその塩として１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、３〜３０ｍｇ／ｋｇが好ましい。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００４５】
本発明のＮＥＰ阻害剤等を医薬部外品や化粧料として用いる場合は、洗浄剤、メイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の医薬部外品や化粧料は、本発明化合物（１）又はその塩を単独で、又は医薬部外品、皮膚化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤（例えば、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、ビタミン類、脂肪代謝促進作用又は脱共役蛋白質発現促進作用が知られている薬物或いは天然物）、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製できる。
当該医薬部外品、化粧料中の本発明化合物（１）又はその塩の含有量としては、０．０００１〜１０質量％が好ましく、０．００１〜５質量％がより好ましい。
【００４６】
本発明のＮＥＰ阻害剤等を外用する場合、その使用量は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮層面１ｃｍ2当たり１〜２０ｍｇ、液状の場合、同じく１〜２０ｍｇ使用するのが好ましい。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を具体的に説明する。
＜ＮＭＲスペクトル＞
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、特記しない限り、重水素化溶媒中の残存プロトンピークを内部標準として用い、Ｂｒｕｋｅｒ製ＡＶＡＮＣＥIII(６００MHz)にて測定をした。
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、特記しない限り、溶媒ピークを内部標準として用い、Ｂｒｕｋｅｒ製ＡＶＡＮＣＥIII(１５０MHz)にて測定をした。
＜ＩＲスペクトル＞
ＩＲスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｎｅにて測定した。
【００４８】
合成例 化合物5の合成
下記の合成経路に従い、3-(4-ビフェニルイル)-N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-アラニンを原料として、N-[1-(S)-カルボキシ-3-フェニルプロピル]-L-4,4'-ビフェニルアラニン（化合物5）を合成した。
【００４９】
【化３】
【００５０】
１）化合物1の合成
窒素雰囲気下、3-(4-ビフェニルイル)-N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-アラニン1.01g（2.97 mmol）をクロロホルム 20mLにて溶解させた後、氷冷下、ベンジルアルコール 0.39 mL（3.77 mmol）、4-ジメチルアミノピリジン 36.8 mg（0.301 mmol）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩0.63 g（3.26 mmol）をそれぞれ加え、氷冷下1.5時間撹拌した。TLCにて反応終了を確認した後、濃縮した。残渣に酢酸エチル（30 mL）を加え、飽和塩化アンモニウム水溶液（30 mL）、飽和重曹水（30 mL）で中和し、飽和食塩水（30 mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。濃縮後、得られた淡黄色油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｎ（球状、中性、40-50μm）、関東化学製）（ヘキサン／酢酸エチル＝5/1、シリカゲル40g）で精製して、白色固体の化合物1を1.20g（収率94%）を得た。
【００５１】
1H-NMR(CDCl3) δ：1.42(9H, s), 3.11(1H, dd, J = 5.8, 13.7Hz), 3.16(1H, dd, J =5.7, 13.7Hz), 4.67(1H, ddd, J =5.7, 5.8, 8.1Hz), 5.03(1H, d, J =8.1Hz), 5.11(1H, d, J =12.2Hz), 5.19(1H, d, J =12.2Hz), 7.08-7.12(2H, m), 7.28-7.36(6H, m), 7.42-7.49(4H, m), 7.54-7.57(2H, m) (ppm)
13C-NMR(CDCl3) δ：28.4, 38.1, 54.6, 67.3, 80.1, 127.2, 127.37, 127.38, 128.6, 128.7, 128.9, 129.9, 135.0, 135.3, 140.0, 140.9, 155.2, 171.9(ppm)
【００５２】
２）化合物2の合成
1.21g(2.80 mmol)の化合物1にギ酸 25 mLを加え、室温で15時間撹拌した。TLCにて反応終了を確認した後、濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=100/0→90/10、YAMAZEN Hi-Flash column L）で精製し、白色固体の化合物2を1.10g（収率 定量的）を得た。
【００５３】
1H-NMR(CD3OD) δ：3.22(2H, dd, J =2.5, 7.0Hz), 4.32(1H, t, J= 7.0Hz), 5.20(1H, d, J =12.0Hz), 5.25(1H, d, J =12.0Hz), 7.23-7.26(2H, m), 7.28-7.37(6H, m), 7.42-7.46(2H, m), 7.54-7.61(4H, m), 8.31(1H, brs)(ppm)
13C-NMR(CD3OD) δ： 37.7, 55.3, 69.1, 127.9, 128.57, 128.60, 129.7, 129.8, 129.9, 134.5, 136.3, 141.8, 142.0, 167.3, 170.7(ppm)
【００５４】
３）化合物3の合成
(R)-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸1.00 g（5.58 mmol）にトルエン 25 mLを加え、60℃にて1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン0.917mL（6.13 mmol）、ベンジルブロミド 0.733 mL（6.13 mmol）を加え、一昼夜攪拌した。TLCで反応終了を確認後、ジエチルエーテル（30mL）、水（10mL）を加え、分液し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル=100/0→80/20、YAMAZEN Hi-Flash column L）で精製し、白色固体の化合物3 を1.46 g（収率97%）を得た。
【００５５】
1H-NMR(CDCl3) δ：7.33-7.40(5H, m), 7.25-7.29(2H, m), 7.14-7.20(3H, m), 5.19(1H, d, J =12.1Hz), 5.17(1H, d, J =12.1Hz), 4.24(1H, ddd, J =4.0, 5.4, 7.6Hz), 2.83(1H, d, J =5.4Hz), 2.76(1H, ddd, J =6.7, 9.9, 13.7Hz), 2.68(1H, ddd, J =5.3, 10.1, 13.7Hz), 2.13(1H, dddd, J =4.0, 6.7, 10.1, 17.2Hz), 1.96(1H, dddd, J =5.3, 7.6, 9.9, 17.2Hz)(ppm)
13C-NMR(CDCl3) δ：175.2, 141.2, 135.2, 128.84, 128.79, 128.71, 128.58, 128.55, 126.2, 69.9, 67.6, 36.1, 31.0(ppm)
【００５６】
４）化合物4の合成
窒素雰囲気下、0.65 g（2.41 mmol）の化合物3にジクロロメタン 20mLを加え、-78℃条件下、トリエチルアミン 0.80ｍL（5.7mmol）、トリフルオロメタンスルホン酸無水物 0.45 mL（2.67mmol）を加え、1時間撹拌した。TLCで反応終了を確認した後、0.41g（1.10 mmol）の化合物2にジクロロメタン4mL、トリエチルアミン 0.16 mL（1.11mmol）を加えて撹拌させた溶液を、-78℃条件下、上記の反応系に滴下した。フラスコに残った化合物2をジクロロメタン（1mL）で溶解させ、反応系に加えた。徐々に室温まで上昇させながら、68時間撹拌させた。TLCにて反応終了を確認した後、濃縮し、残渣を酢酸エチル（20mL）で抽出、飽和食塩水（20mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した後、得られた褐色油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル/メタノール=100/0→0/100→0/90/10、YAMAZEN Hi-Flash column 2L）で精製し、淡黄色油状の化合物4を0.20g（収率32%）で得た。
【００５７】
1H-NMR(CD3CN) δ：1.75-1.82(1H, m), 1.84-1.91(1H, m), 2.57(2H, t, J =7.9Hz), 2.91(1H, dd, J =7.0, 13.5Hz), 2.97(1H, dd, J =7.3, 13.5Hz), 3.32(1H, d, J =7.4, 7.4Hz), 3.62(1H, dd, J =7.1, 7.1Hz), 5.00(1H, d, J = 12.3Hz), 5.03(1H, d, J =12.3Hz), 5.07(2H, s), 7.10-7.64(24H, m)(ppm)
13C-NMR(CD3CN) δ：32.3, 35.8, 39.8, 60.0, 62.1, 67.12, 67.13, 126.9, 127.7, 127.8, 128.3, 29.1, 129.17, 129.22, 129.26, 129.31, 129.39, 129.42, 129.5, 129.9, 130.8, 137.0, 137.3, 137.7, 140.1, 141.5, 142.6, 174.4, 174.8（ppm）
【００５８】
５）化合物5の合成
アルゴン雰囲気下、31.1mg（0.0533 mmol）の化合物4にジメチルホルムアミド 1.6mL、10％ Pd/C 3.8mgを加えた後、室温、水素雰囲気下にて4時間激しく撹拌した。TLCで反応終了を確認後、セライトろ過にてPd/Cを除き、ジメチルスルホキシド（10ｍL）でろ物を十分に洗浄した。得られたろ液に水（20mL）を加えて凍結乾燥させた。得られた残渣にメタノール（3mL）を加え、60℃にて加熱、撹拌した後、桐山ろ過にてろ物を回収後、メタノールで洗浄し、白色固体の化合物5を5.2 mg（収率28%）で得た。
【００５９】
1H-NMR(DMSO-d6) δ：1.71-1.86(2H, m), 2.55-2.66(2H, m), 2.90(1H, dd, J=6.8, 13.7Hz), 2.96(1H, dd, J =6.9, 13.7Hz), 3.20(1H, dd, J =6.3, 6.3Hz), 3.49(1H, dd, J=6.8, 6.9Hz), 7.14-7.19(2H, m), 7.24-7.28(2H, m), 7.31(2H. d, J =7.1Hz), 7.33-7.37(1H, m), 7.43-7.47(2H, m), 7.56-7.60(2H, m), 7.63-7.66(2H, m)(ppm)
13C-NMR(DMSO-d6) δ：31.3, 34.6, 38.3, 58.7, 60.9, 125.8, 126.47, 126.54, 127.3, 128.35, 128.38, 129.0, 129.8, 137.1, 138.2, 140.0, 141.6, 174.4, 175.0（ppm）
【００６０】
IR(cm-1, ATR)：3030, 2929, 2863, 1720, 1595, 1488, 1453, 1388, 1356, 1287, 1243, 751, 695
【００６１】
試験例１ 培養ヒト線維芽細胞由来の中性エンドペプチダーゼ（NEP）活性阻害試験
Cell System社より市販されている正常ヒト線維芽細胞を用いて、10％牛胎児血清を含むDME培地で継体培養し、以下の試験に供した。試験方法は、The Journal of Biological Chemistry, 266(34), 23041-23047(1991)に記載の方法を参照した。
【００６２】
ラバーポリスマンを用いてシャーレから剥がした細胞を、リン酸緩衝食塩水中に浮遊させ、低速の遠心分離器を使って細胞を集めた後、同生理食塩水で3回洗浄した。得られた細胞を0.1％ Triton X-100／0.2Ｍ Tris-HClバッファー（pH 8.0）に浮遊させ、超音波粉砕し、MESバッファー（ｐH 6.5）で適宜希釈した溶液をヒト線維芽細由来酵素液とした。酵素活性測定の基質には、10ｍＭグルタリル−Ala−Ala−Phe−4−メトキシ−２−ナフチルアミンを用いた。酵素液100μＬに対し、下記表に示す濃度の上記合成例で得た化合物5（１μＬ）と、基質（2μＬ）とを添加し、37℃にて１時間反応させた。その後、ホスホラミドン（Phosphoramidon）を最終濃度１μＭとなるように添加して、基質分解反応を停止させた。なお、ヒト線維芽細由来酵素液に含まれるNEPは、Ala-Phe結合を切断して基質を分解する。
そして、上記の反応系にロイシンアミノペプチダーゼ（Leucine aminopeptidase）を最終濃度が0.50mU／mLとなるように添加し、37℃で1時間反応させた。これにより、NEP分解産物がロイシンアミノペプチダーゼによってさらに切断、分解され、4−メトキシ−2−ナフチルアミンを生じる。
生成した４−メトキシ−２−ナフチルアミンについて、蛍光分光光度計（Wallac 1420 ARVOsx、パーキンエルマー社製）で励起波長340nm、蛍光波長425nmにて蛍光強度を測定した。
【００６３】
一方、コントロールとして、上記酵素反応系において、化合物5の代わりにジメチルスルホキシドを同量加えた以外は上記と同様にして試料を作成し、反応を行い、蛍光強度を測定した。
【００６４】
得られた測定値をもとに、以下の式からNEP活性阻害率を算出した。結果を表１に示す。
【００６５】
NEP活性阻害率（％）＝１００−｛（評価サンプル添加時の４−メトキシ−２−ナフチルアミンの蛍光強度）／（コントロール添加時の４−メトキシ−２−ナフチルアミンの蛍光強度）｝×１００
【００６６】
【表１】
【００６７】
処方例１ 皮膚老化改善用ローションの調製
下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製する。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製する。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、ローションを得る。
【００６８】
【表２】
【００６９】
処方例２ 皮膚老化改善用クリームの調製
下記Ａの成分を混合した溶液Ａを調製する。これとは別に、下記Ｂの成分を混合した溶液Ｂを調製する。溶液Ａに溶液Ｂを添加して均一に撹拌混合し、乳化後、冷却して、クリームを得る。
【００７０】
【表３】
【００７１】
処方例３ エアゾールの調製
下記Ａの成分を均一に混合して容器に入れ、Ｂの液化石油ガス（噴射剤）を常法により容器に充填してエアゾールを製造する。
【００７２】
【表４】
【００７３】
処方例４ 皮膚老化改善用パック剤の調製
下記の組成のパック剤を常法により調製する。
【００７４】
【表５】
【００７５】
処方例５ ファンデーションの調製
下記の組成のファンデーションを常法により調製する。
【００７６】
【表６】
【００７７】
処方例６ 皮膚老化改善用化粧水の調製
下記の組成の化粧水を常法により調製する。
【００７８】
【表７】
【００７９】
処方例７ 皮膚老化改善用ジェルの調製
下記の組成のジェルを常法により調製する。
【００８０】
【表８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
（式中、Ｒ1は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基を示し、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基又は炭素数６〜１２のアラルキル基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ2及びＲ3が、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基である請求項１記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｒ1がフェニル基である請求項１又は２記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその塩を有効成分とする中性エンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
（式中、Ｒ1は置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基を示し、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基又は炭素数６〜１２のアラルキル基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ2及びＲ3が、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基である請求項１記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｒ1がフェニル基である請求項１又は２記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその塩を有効成分とする中性エンドペプチダーゼ阻害剤。
【公開番号】特開２０１２−６８８５（Ｐ２０１２−６８８５Ａ）
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４６０３４（Ｐ２０１０−１４６０３４）
【出願日】平成２２年６月２８日（２０１０．６．２８）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０４３６５１４６）株式会社理論創薬研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２８日（２０１０．６．２８）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０４３６５１４６）株式会社理論創薬研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
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