フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）マルチマーを検出する方法およびシステム
フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）マルチマーの電気泳動移動度分布を分析する方法は、複数のｖＷＦマルチマーを含むサンプル媒体を生成することを含む。サンプル媒体に電界を印加することによって、ｖＷＦマルチマーをサンプル媒体中の電気泳動度によって電気泳動的に分離して、分離されたｖＷＦマルチマーを生成する。サンプル媒体中の分離されたｖＷＦマルチマーに光を照射して散乱光を発生する。散乱光は検出され、分離されたｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度分布は検出された散乱光から決定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年７月７日に出願された、米国仮出願番号６０／４８５，５２６の優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、分光分析法、詳細には電気泳動スペクトル解析法についての方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）は多分散多重結合血漿糖蛋白であり、初期の血小板粘着および凝固第ＶＩＩＩ因子の輸送に関与する。ｖＷＦマルチマーが大きければ大きいほど、血小板粘着の促進により効果的であるため、ｖＷＦマルチマーの粒度(size)分布はその機能に重大な影響を及ぼす。しかし、超巨大マルチマーが存在すると、自発的血小板凝集および粘着が発生し、血栓症状態を生じる。
【０００４】
最近の研究では、ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ ＴｈｒｏｍｂｏＳｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ １ ｍｏｔｉｆ（トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ））、肝臓内で主として合成されるプロテアーゼは、そのＡ２ドメイン内でｖＷＦの蛋白質分解を担うことが明らかになった。ＡＤＡＭＴＳ１３の不足は切断されていない超巨大ｖＷＦマルチマーが存在する状態、正常な血漿では一般に観察されない状態を引き起こす［Ｌｅｖｙ，Ｇ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１３：４８８−４９４（２００１）］。さらに、これらの研究は、このメタロプロテアーゼの抑制および活性のレベルは血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の患者の診断および治療に有効であることを提示している［Ｍａｎｎｕｃｃｉ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，９８：２７３０−３５（２００１）］。これらはＡＤＡＭＴＳ１３異常のいくつかの異なる病状発現である。先天性ＴＴＰでは、ＡＤＡＭＴＳ１３が量的に不足していることが判明している。後天性ＴＴＰでは、ＩｇＧ自己抗体は、ＡＤＡＭＴＳ１３を抑制するように形成されている。後天性ＴＴＰ／ＨＵＳ（溶血性尿毒症症候群）の他の形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は変動する濃度で存在している。例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３の不足は、子供の大腸菌感染、骨髄移植における肝静脈閉塞症およびさまざまな薬物毒性によって生じる。
【０００５】
ｖＷＦは日常的な診断での血液検査には現れないため、ｖＷＦの検査室診断および細分類は困難であった。したがって、医師は、各患者に対する最高およびもっとも安全な治療を確立するため、特定のｖＷＦ変種を決定するための特殊な診断血液検査を指示しなければならない。
【０００６】
現在、ｖＷＦ異常の診断についてはいくつかの種類の分析方法が存在する。このような分析での使用においては、正しい診断のために、ｖＷＦ抗原を特定しなければならない。これらの分析は、高親和性抗体に対する放射標識抗原および非標識抗原の競合結合を含む放射標識免疫検定法（ＲＩＡ）、抗原−抗体反応を測定する酵素−基質相互作用の呈色反応生成物を用いる酵素免疫測定法（ＥＩＡ）および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）［米国特許５，２０２，２６４を参照］、およびＦｖ領域でラテックス粒子に結合する抗体を利用、かつ血液のサンプルに存在する抗原との相互作用に対するＦａｂ領域を示すラテックス免疫測定法（ＬＩＡ）［米国特許第５，５８５，２７８号を参照］などのさまざまな分析方法を含む。
【０００７】
上述の免疫学的検定法は簡単で幅広く使用されているが、いくつかの欠点を持つ。上述の免疫学的検定法は標識抗体を必要とするが、それらは極めて高価であり、放射性標識を使用する場合、本質的な危険を伴う。これに加えて、抗原との蛋白の非特異結合の発生、抗体複合体の形成、および一般的に使用されるさまざまな種類の固体支持体の存在は、バックグラウンドノイズを増加し、感度を低減し、その結果、偽陽性判定がなされることになる［Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８８］。
【０００８】
従来は、病状に関するｖＷＦの異常性はさらに確認され、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ電気泳動を用いてｖＷＦの多重結合構造および粒度分布分析により細分類される。原則的には、４０程度の異なる分子量のポリマーは、５００，０００および２０００万Ｍｒの上限分子量のダイマーに基づいて可能である。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ電気泳動を用いたｖＷＦマルチマーの粒度分布の現在の評価では、１０から１５の明らかに大きな電気泳動易動度を示す。この従来および現在の方法を用いて、抗原の電気泳動的に分離される亜種のエピトープを検出し、電気泳動移動度によるマルチマーのスペクトル分布結果を得る。公知の分子量基準の電気泳動法により、抗体が生成される各抗原の結合の分子量の決定が可能になる［Ｃｏｌｍａｎ ＲＷ．Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，４th ｅｄｉｔｉｏｎ； ｐｐ ８２５−８３７］。この方法の欠点は、高コスト、分析の完了に通常３〜５日を要すること、マルチマーの識別のための放射線、蛍光または化学ルミネセンスを用いた抗ｖＷＦ抗体を標識付けするレポータグループの必要性、および超巨大分子量のマルチマーの分解能の低減を含む。
【０００９】
さらに、ｖＷＦに関する疾患は非特異的出血症状の持続性の診断問題を含む。血漿ｖＷＦ濃度の正常値の範囲が広いため、ｖＷＦ：ＲＣＯ（リストセチン補助因子）およびｖＷＦ：Ａｇに対する低い値が存在する場合、ｖＷＦに対する現在の診断試験は値が限定される。さらに困難なことは、出血回数がｖＷＦレベルに比べてさらに広い通常変動を有するという事実である。したがって、以前の公知の試験では、ｖＷＦ関連の疾患の正確で信頼できる診断に不可欠である高い精度を実現できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現在、低コストで効率が高く、医師、研究室および患者に有利な詳細な分子情報を提供する診断試験に対する強い要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の実施形態によれば、ｖＷＦマルチマーを物理的に特性決定する方法およびシステムが提供される。ｖＷＦマルチマーの分布、濃度、拡散係数および粒度が決定される。例えば、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布が決定される。電気泳動移動度の分布は、例えば、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの粒度、濃度、拡散係数、重量および分布の計算に使用される。
【００１２】
本発明の特定の実施形態においては、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）マルチマーの電気泳動移動度の分布を分析する方法は、複数のｖＷＦマルチマーを含むサンプル媒体を生成することを含む。分離されたｖＷＦマルチマーを生成するために、ｖＷＦマルチマーは、サンプル媒体に電界を印加して、サンプル媒体中で電気泳動移動度によって電気泳動的に分離される。サンプル媒体中で分離されたｖＷＦマルチマーに光を照射して散乱光を発生する。散乱光は検出され、分離したｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布は検出された散乱光から決定される。
【００１３】
特定の実施形態においては、ｖＷＦ異常および／または疾患は電気泳動移動度の分布に基づいて特定される。ｖＷＦ異常および／または疾患はＩ型ｖＷＦ疾患、ＩＩ型ｖＷＦ疾患、ＩＩＩ型ｖＷＦ疾患、亜種ＩＩＡ型ｖＷＦ疾患、亜種ＩＩＢ型ｖＷＦ疾患、亜種ＩＩＭ型ｖＷＦ疾患、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）から成るグループから選択される。例えば、電気泳動移動度の分布は、一連のｖＷＦ異常および／または疾患に対応するパラメータを比較する。パラメータは、一連のｖＷＦ異常および／または疾患に対応する複数のスペクトルに基づいている。特定の実施形態においては、ＡＤＡＭＴＳ異常および／または疾患は、電気泳動移動度の分布に基づいて特定される。
【００１４】
特定の実施形態においては、サンプル媒体の光子相関分光（ＰＣＳ）スペクトルが生成され、分子の粒度分布はサンプルのＰＣＳスペクトルに基づいて決定される。ｖＷＦ異常および／または疾患は分子の粒度分布および電気泳動移動度の分布に基づいて特定される。したがって、電気泳動および非電気泳動の分光分析法を組み合わせて、サンプル媒体中にｖＷＦ異常が存在するかどうかを決定できる。
【００１５】
電気泳動移動度の分布の決定は電気泳動準弾性光散乱分析法により実行される。例えば、位相シフトは測定された自己相関関数から散乱光において検出される。ドップラーシフトは入射光と比較した散乱光において検出できる。次に、散乱粒子の電気泳動移動度が計算される。
【００１６】
光源はコヒーレント光源である。サンプル媒体は容器で提供され、電気泳動的な分離工程が容器内のサンプル媒体を用いて実行される。露出工程および検出工程は両方とも、容器内の溶液を用いて実行される。特定の実施形態では、容器はキャピラリーゾーンを画定するかまたは含み、例えばキャピラリーゾーン電気泳動法により、サンプル媒体中のｖＷＦ異常および／または疾患のキャピラリー分光分析決定を促進する。
【００１７】
特定の実施形態においては、電気泳動的に分離する工程、露出工程および検出工程は、合計時間が５分未満、例えば１分未満で実行される。
【００１８】
決定された電気泳動移動度の分布は１０００万、２０００万またはそれ以上までの分子量を有するｖＷＦマルチマーを含む。
【００１９】
特定の実施形態においては、サンプル媒体を生成する工程は、血漿サンプルを準備し、血漿サンプルからｖＷＦを精製してサンプル媒体を生成することにより実行される。フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）マルチマーは人体のフォンビルブランド因子マルチマーである。
【００２０】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル媒体中のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）分解酵素の存在を決定する方法は、ある一定量のｖＷＦマルチマーを含むサンプル媒体を生成することを含む。酵素がサンプル内に存在する場合、ｖＷＦ分解酵素を含む疑いのある標本をサンプル媒体に加えて、サンプル媒体中の高分子量のｖＷＦマルチマーを分解させる。ｖＷＦマルチマーは、サンプル媒体に電界を印加して、サンプル媒体中で電気泳動移動度により電気泳動的に分離され、分離されたｖＷＦマルチマーが生成される。サンプル媒体における分離されたｖＷＦマルチマーに光を照射して散乱光を発生する。散乱光は検出され、分離されたｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布は検出された分散光から決定される。ｖＷＦ分解酵素が存在するかどうかは電気泳動移動度の分布から決定される。
【００２１】
特定の実施形態においては、サンプル媒体の光子相関分光（ＰＣＳ）スペクトルが生成される。分子の粒度分布はサンプル媒体のＰＣＳスペクトルに基づいて決定される。ｖＷＦ分解酵素が存在するかどうかは分子の粒度分布および電気泳動移動度の分布から決定される。ｖＷＦ分解酵素はＡＤＡＭＴＳ１３であり得る。
【００２２】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル媒体中のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）マルチマーの電気泳動移動度分布を分析するシステムは、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）分光計を含み、このＥＱＥＬＳは、ｖＷＦマルチマーを電気泳動的に分離し、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーについてのＥＱＥＬＳスペクトルを生成するように構成されたＥＱＥＬＳコントローラを備える。ＥＱＥＬＳ分析器はＥＱＥＬＳ分光計と通信する。ＥＱＥＬＳ分析器は、ＥＱＥＬＳスペクトルから分離されたｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布を決定するように構成される。システムは使用して、ここで述べたさまざまな工程を実行するために使用される。特定の実施形態では、ＥＱＥＬＳ分光計はさらに、サンプル媒体の光子相関分光（ＰＣＳ）スペクトルを発生するように構成される。例えば、ＥＱＥＬＳ分光計における電界はＰＣＳ分光分析法に対してはアクティブにされなくても良い。ＥＱＥＬＳ分析器はさらにサンプル媒体のＰＣＳスペクトルに基づいて分子の粒度分布を決定するように構成される。
【００２３】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布の特性を検出する方法は、サンプル媒体にエネルギーを供給して、エネルギーの相互作用出力を生成する。サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布および／または粒度分布はエネルギーの相互作用出力に基づいて決定される。
【００２４】
例えば、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの存在、欠損および／または相対量はｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布および／または粒度分布に基づいて決定される。供給エネルギーはサンプル媒体への照射光エネルギーを含む。ｖＷＦマルチマーの粒度分布は光子相関分光法（ＰＣＳ）の静的光散乱、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）および／またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）の動的光散乱を用いて決定される。
【００２５】
サンプル媒体は、血漿またはその成分および／または希釈緩衝食塩液を含む。エネルギーの相互作用出力は、電気泳動または非電気泳動（ＰＣＳ）状態下で生成される。
【００２６】
サンプル媒体は被検者から得られる血漿サンプルにある一定量の高分子量ｖＷＦを追加することにより生成できる。血漿サンプル中のｖＷＦ代謝酵素の存在または欠損はサンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて決定される。ｖＷＦ代謝酵素はＡＤＡＭＴＳ１３および／または内皮からのｖＷＦの放出においてｖＷＦを代謝する酵素を含む。１７６，０００Ｍｒの分子量を有するｖＷＦ代謝生成物フラグメントの存在または欠損はｖＷＦ代謝酵素の存在または欠損を決定するために測定される。被検者に対する診断は、被検者から得られる血漿サンプル中のｖＷＦ代謝酵素の存在または欠損に基づいて決定できる。被検者の診断は１７６，０００Ｍｒの分子量を有するｖＷＦ代謝生成物フラグメントの存在または欠損に基づいて決定できる。例えば、血漿サンプル中のｖＷＦ代謝酵素の不足に関連する生理状態の存在または欠損、または感受性は、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて決定される。血漿サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３の不足に関連する生理状態の存在または欠損、または感受性は、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて決定される。生理状態は、ＴＴＰ、ＨＵＳ、ＴＴＰ／ＨＵＳから成るグループから選択される病状、内皮の異常作用がｖＷＦを放出する病状、急性冠動脈症候群、糖尿病、高血圧、月経過多および／または腎不全、を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、被検者は被検者内のｖＷＦ代謝酵素の存在を増加するのに効果的な治療薬および／または処理を施される。ｖＷＦの電気泳動移動度および／または粒度分布は、治療薬および／または処理を施される前の被検者から取られた第１サンプルおよび治療薬を投与された後の被検者から取られた第２サンプルから決定される。治療薬および／または処理の効果は、第１および第２サンプルからｖＷＦの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて評価される。治療薬は、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３、合成ＡＤＡＭＴＳ１３、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体、および合成ＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体から成るグループから選択されたＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼの、潜在的に治療に効果的な量を含む。ｖＷＦ代謝酵素はＡＤＡＭＴＳ１３を含む。
【００２８】
本発明の別の実施形態によれば、ＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または不足に関連する病状または生理的状態を発生する危険性を有するかまたは危険性がある被検者を特定する方法は、生理学的なサンプルであって、その中に正常な被験者にはＡＤＡＭＴＳ１３が存在するタイプの生理学的なサンプルを被検者から取得すること、サンプル媒体を提供する高分子量（ＨＭＷ）ｖＷＦのある一定量を生理学的なサンプルに追加すること、サンプル媒体に静的および／または動的光散乱分光分析を実行して、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＶｖＷＦの分解に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布を決定すること、およびｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて、ＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または不足に関連する病状または生理状態の危険性を有するかまたは危険性がある被検者を特定することを含む。
【００２９】
静的および／または動的光散乱分光法は、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）、光子相関分光法（ＰＣＳ）および／またはキャピラリーゾーン電気泳動法（ＣＺＥ）を用いて実行される。
【００３０】
ｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布および／または粒度分布が１７６，０００Ｍｒの分子量を有するｖＷＦフラグメントを含むかどうかも決定できる。サンプル媒体は、例えばクロマトグラフによる精製を利用して精製できる。
【００３１】
サンプル媒体は試薬を含み、この試薬は、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーに結合し、またそれらに結合したときにＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーの移動性特性を変更して、電気泳動移動度および粒度分布を高精度で決定できる。試薬はＢｏｔｒｉｃｅｔｉｎを含む。
【００３２】
本発明の別の実施形態によれば、ｖＷＦを代謝するのに効果的な酵素の欠損または不足に関連する病状または生理状態を伴う被検者を治療する方法は、酵素の欠損または不足を抑制する治療薬を被検者に投与すること、治療薬の投与後に酵素が正常な被検者に存在する種類の生理的学サンプルを被検者から取得すること、ある一定量のＨＭＷｖＷＦを生理学的サンプルに追加すること、酵素によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布を決定するためにサンプル媒体に対して静的および／または動的光散乱分光分析を実行すること、およびｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて治療薬の有効性または無効性を決定することを含む。
【００３３】
治療薬は被検者における酵素の量を潜在的に増加する作用薬を含む。コラーゲン結合分析はｖＷＦマルチマーの特性決定のために使用される。ｖＷＦの不完全結合凝集第ＶＩＩＩ因子はｖＷＦ Ｎｏｒｍａｎｄｙ分析を用いて特性決定される。さらに、ＨＭＷｖＷＦマルチマーおよび超巨大ｖＷＦマルチマーに対するｖＷＦも特性決定される。病状または生理状態は、ｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて、敗血症、急性冠動脈症候群、静脈閉塞症、薬物中毒および急性炎症から成るグループから選択された、病状または生理状態を含めて診断される。
【００３４】
本発明の別の実施形態によれば、ｖＷＦの代謝を調整する酵素の欠損または不足に関連する病状または生理状態を有するかまたは発生する危険性がある被検者を特定するシステムが提供される。システムは、生理学的サンプルであって、正常な被験者ではＡＤＡＭＴＳ１３が存在するタイプの生理学的サンプルを被検者から取得する方法、一定量の高分子量（ＨＭＷ）ｖＷＦを生理学的サンプルに加えてサンプル媒体を生成する方法、サンプル媒体に静的および／または動的光散乱分光分析を実行してＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＷｖＷＦの分解に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布を決定する方法、およびｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいてＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または不足に関連する病状または生理状態を有するかまたは発生する危険性がある被検者を特定する方法、を含む。
【００３５】
別の実施形態によれば、被検者のｖＷＦ代謝を調整する酵素の欠損または不足の迅速な決定のための分析キットが提供される。キットは、生理学的サンプルであって、正常な被験者では酵素が存在するタイプのある一定量の生理学的サンプルを被検者から取得し、かつ生理学的サンプルに追加するある一定量のＨＭＷｖＷＦ取得する手段を含み、この手段により、ＥＱＥＬＳ（電気泳動の準弾性光散乱）、ＰＣＳ（光子相関分光法）等を含む静的および／または動的光散乱分光分析法のためのサンプル媒体、または酵素によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および粒度分布ＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）分析のためのサンプル媒体を生成し、これにより被検者における酵素の欠損または不足を決定できる。
【００３６】
特に、本発明の分析は、フォンビルブランド病、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）／溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）等を含む（ただし、これらに限定されない）ｖＷＦおよび／またはＡＤＡＭＴＳ１３に関連する疾患に対する被検対象、特に人間の被検者または他の哺乳類の被検対象をスクリーニングするのに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下に、添付図面を参照して本発明を詳細に説明し、本発明の好ましい実施形態を示す。しかし、本発明はさまざまな多様な形態で実現可能であり、ここに記述した実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本発明を詳細および完全に説明するものであり、当業者に本発明の範囲を完全に伝達するために提供される。同一参照符合は全体に渡って同一要素を指す。それぞれの図において要素は縮尺通りには描かれず、詳細を示すために拡大されている。
【００３８】
本明細書における本発明の詳細な説明で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明を限定することを目的としない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲に用いられるとおり、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈において特に指定しない限り、複数形も同様に含むものである。
【００３９】
本発明の実施形態は、ｖＷＦおよびｖＷＦ−代謝因子を含む媒体中の（例えば、生理学的サンプル中あるいは生理学的サンプルまたはその成分を含む溶液中の）、ＡＤＡＭＴＳ１３などのｖＷＦおよびｖＷＦ−代謝因子を迅速に特性決定する方法を提供する。ｖＷＦは分子量を変化させる一連のマルチマーとして血漿内に存在する高分子血漿糖蛋白である。さまざまな分光分析法を利用して、サンプル中のｖＷＦマルチマーを分析し、例えば、サンプル内のマルチマーの電気泳動移動度、分子量分布、分子粒度分布および／または拡散係数に基づいて、サンプルを特性決定できる。
【００４０】
本発明の実施形態は電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）分光分析に関して説明されているが、他の電気泳動相互スペクトル分析法（すなわち、電気泳動範囲で生物学的な粒子がスペクトルを生成するエネルギー媒体と相互に作用する分析法）および／または非電気泳動法も利用できることは理解されるであろう。電気泳動法を使用しない分光分析法は光子相関分光分析法（ＰＣＳ）を含む。
【００４１】
さらに、本発明の実施形態は励起光ビームに関して説明されているが、電磁エネルギー、音響エネルギー、超音波エネルギーまたは他の適切なエネルギー媒体を含む、他のエネルギー媒体も使用できる。例えば、電磁エネルギーは、可視光線、赤外線、紫外線および／またはＸ線の範囲などの、いずれかの適切なスペクトル範囲から使用できる。例えば、約２００ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する化学線は、電気泳動法においてｖＷＦマルチマーとの相互作用に対してエネルギー媒体として使用される。可視光線は、弾性光散乱および準弾性光散乱を含む光散乱分析法において使用される。紫外線は、例えば、毛細管流れ内の生物粒子に照射される紫外線のエネルギー源として紫外線レーザーを有する、キャピラリー電気泳動システムにおいて使用される。したがって、任意の適切なエネルギー源および対応するエネルギー媒体を使用できる。
【００４２】
特定の実施形態においては、サンプルから得られるスペクトル特性を用いて、高分子量ｖＷＦの分解、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および血栓性血小板減少性紫斑病／溶血性尿毒症症候群（ＴＴＰ／ＨＵＳ）などの、さまざまな状態を診断する。これらの状態の治療もまた、例えば、治療前および治療後に取得したスペクトルの比較により評価される。さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３を含むｖＷＦ代謝作用薬などの、ｖＷＦマルチマーと相互作用する薬剤は、ここに説明される分光分析法を使用して評価される。例えば、薬剤をサンプルに追加する前および追加後にｖＷＦからのスペクトルを収集することにより、ｖＷＦマルチマーへの薬剤の影響を比較できる。
【００４３】
本発明を実行することによりサンプルを収集される被検者は、医療および診断目的のための人間の被検者、ならびに、他の動物の被検対象、特に、犬、猫、鼠、豚、馬、羊、牛、猿等の、獣医学および薬剤開発の目的のため哺乳類の被検対象を含む。
【００４４】
フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）は公知であり、例えば、米国特許第６，５３１，５７７号、第６，５１８，４８２号、第６，４６５，６２４号、第６，４１０，２３７号、第６，１０３，６９３号および第６，０４０，１４３号に記載されており、上記特許の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。本発明で用いられるｖＷＦは天然または組み換え型であり、天然ｖＷＦは診断目的のため被検者から収集されるかまたは治療組成の調製のため被検者から収集される。
【００４５】
ＡＤＡＭＴＳ１３（（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ ｔｙｐｅ）、 ｗｉｔｈ ＴｈｒｏｍｂｏＳｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ １ ｍｏｔｉｆ）トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（レプロリジンタイプ））は公知であり、例えば、Ｇ．Ａｎｔｏｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．７０，２５７−２６２（２００３），Ｒ．Ｓｃｈｎｅｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０１，１８４５−１８５０（２００３），Ａ．Ａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７１，３１８−３２２（２００２），Ｓ．Ｃａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ２８３，４９−６２（２００２），Ｘ．Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，およびＪ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６，４１０５９−４１０６３（２００１）に記載されている。本発明の実施形態により使用されるＡＤＡＭＴＳ１３または他のＡＤＡＭＴＳ酵素は天然または組み換え型であり、天然酵素は診断目的のため被検者から収集されるかまたは治療組成の調製のため被検者から収集される。
【００４６】
本発明の実施形態を用いて、高分子量ｖＷＦマルチマーおよび超巨大ｖＷＦマルチマーを検出できる。通常の範囲のｖＷＦマルチマーの重量は５００，０００〜２０，０００，０００である。１０００万から２０００万の分子量は「高分子量」（ＨＭＷ）のマルチマーと見なされる。ここに使用されている通り、ｖＷＦに関する用語「超巨大マルチマー」は２０００万Ｍｒより大きな分子量を有するフォンビルブランド因子マルチマーを意味する。超巨大マルチマーは２０００万より大きなモノマーを含み、１００，０００，０００と同程度の重さであることもあり、本明細書では、「高分子量マルチマー」または「ＨＭＷ」などの状態に含まれる。
【００４７】
以下の説明の背景として、次にさまざまなスペクトル技法を説明する。
【００４８】
動的光散乱（ＤＬＳ）は、不均一な（粒子を含む）媒体に照射される光の粒子介在散乱および特定の散乱角における散乱ベクトルの時間自己相関関数の測定を含む。散乱強度および自己相関関数から、粒径（流体力学の半径）、形状因子および／または粒子を含む媒体の粒子の他の特性を決定する。動的光散乱はまた光子相関分光分析（ＰＣＳ）と称される。
【００４９】
電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）は、サンプルに電界を印加して媒体中の粒子を特性決定する動的光散乱法であり、この方法は電気泳動を利用して、粒子は印加された電界内での粒子の運動により、粒子の特性を決定する。キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は高電界を用いて、電気浸透により細管を通り駆動される粒子の移動を誘導する。次に、粒子は粒度および粒子の表面電荷に関して特性決定される。これらの技法はｖＷＦマルチマーを含む媒体中のｖＷＦマルチマーの特性決定のために使用でき、これら技法では重畳する電界を利用して、これらマルチマーを容易に電気泳動分析できる。溶液中のマルチマーの電気泳動移動度はマルチマーの粒度、マルチマーの総電荷および重畳電界の強度に依存する。
【００５０】
したがって、本発明の実施形態は、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）および／または、光子相関分光法（ＰＣＳ）と称される動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて実行される。さらに、他のエネルギーの相互作用法も使用される。用語「準弾性」は、ここに説明されている分光分析法における光子と粒子の間の相互作用を説明するために使用される（このような相互作用は完全に弾性ではないためである）。すなわち、光子が散乱粒子に衝突すると、比較的小量のエネルギーを失う。
【００５１】
ここに説明されている技法で使用される入射光は、一般にコヒーレントである。コヒーレント光は、一般的に、光または光子として定義され、全て、「同相」である本質的同一波長を有する。コヒーレント光はレーザーから得られる。したがって、入射光は変化しないコヒーレント光を用いて、散乱粒子を照射する。インコヒーレント光を使用することもできる。
【００５２】
ここで使用されているとおり、散乱光は、対象物からの非弾性（準弾性を含む）または弾性散乱を指す。光子は一般的に、電界および磁界の直交配列から生じる波の属性を有する。光散乱においては、光が粒子に当たるとき、電界により粒子内の電子が上下に運動する。電子の振動運動により第２の電界が形成される。この電界は散乱光を形成する。散乱光は、入射光により引き起こされた散乱粒子の電子振動運動から生じる光を含む。
【００５３】
入射光の光子が散乱粒子と衝突すると、光子は少量のエネルギーを失い、その結果、入射光の周波数がわずかに低下する。入射光と比較される散乱光のこの「位相シフト」（ドップラーシフトとも称される）は測定の基本である。周波数シフトは、光検出器で散乱光と非散乱光を混合することにより検出される。「ビート」結果およびビート周波数の大きさは一般に散乱粒子の移動度に比例する。ＥＱＥＬＳの場合、ビート周波数の大きさは粒子の電気泳動移動度に比例する。対照的に、ＰＣＳまたはＱＥＬＳでは、粒子運動はその拡散係数に比例する。
【００５４】
ここで使用される電気泳動移動度は重畳電界の効果により生じる浮遊荷電粒子に生じる運動を指し、この運動は粒子に対する溶剤の粘性抵抗と釣り合う。電気泳動移動度は、大きさ、重量および分布の計算のため使用される。なお、粒径は一般にその拡散係数と等価である。
【００５５】
あらゆる特定理論に拘束されないで、粒子がＤｅｂｙｅ Ｈｕｃｋｌｅ距離に比べて大きい場合、表面電荷は一般に粒子の動きを決定する。Ｄｅｂｙｅ Ｈｕｃｋｌｅ距離は浮遊粒子の帯電表面全体に渡って形成された溶剤の対イオン層により画定され、その層の厚みは粒子の表面電荷の大きさおよび浮遊溶液のイオン強度に依存する。
【００５６】
自己相関関数は多数の粒子（集団）の相対位置の相関を求めるための統計力学法であり、例えば、一般式を有する。
【数１】
ここで、τは時間増分、Ｉは散乱強度、およびｔは時間である。特定の実施形態では、自己相関関数の時間依存性を用いて、散乱粒子の集団の時間経過に伴う運動を決定する。
【００５７】
マルチマーの分子量の決定に対する電気泳動移動度の計算は次のとおり実行される。特定の実施形態においては、試験結果は（１）周波数シフト、（２）ゼータ電位および／または（３）電気泳動移動度を含む定量表示のいくつかの異なる形式で示される。データもまた、（１）拡散係数、（２）固有の寸法および／または（３）分子量および／または粒度、を含む形式で提示できる。後者の２つの量は各マルチマーの拡散係数から計算される。各マルチマーの拡散係数は次のとおり決定される。移動度スペクトルにおける各マルチマーが分子量に対して均一である場合（電気泳動法により得られるものと同様に）、スペクトルの各帯域の形状または線形状はローレンツ形でなければならない。ローレンツ形の線形状は次のとおり記述される。
【数２】
【００５８】
特定のマルチマーを表す、個々の帯域の１／２幅はＳ2Ｄであり、グラフ化することにより、それぞれの１／２の幅に対するｓｉｎ2（θ）Ｄを決定できる。したがって、電気泳動移動度分布は計算されたおよび／または表示された電気泳動移動度分布から直接決定され、および／または直接表示されるか、あるいは、上に説明されているとおり別の定量表示から間接的に決定および／または表示できる。
【００５９】
本発明の実施形態はＡＤＡＭＴＳ１３のようなｖＷＦマルチマーおよびｖＷＦ代謝因子を検出および分析する迅速な方法を提供する。本発明の実施形態はＴＴＰおよびＴＴＰ／ＨＵＳの診断および／またはこのような状態の治療の効果を監視するのに使用される。本発明の実施形態により分析される多重結合ｖＷＦ種は、分子量、分子配列、分子構造、および／またはアミノ酸シーケンスにおいて相互に異なる分子形態のｖＷＦをさまざまに含む。
【００６０】
本発明の実施形態は、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、および光子相関分光法（ＰＣＳ）と称される動的光散乱法（ＤＬＳ）を含むさまざまな技法により、溶液中に浮遊するｖＷＦマルチマーおよび／または溶液内のＡＤＡＭＴＳ１３などのｖＷＦ代謝因子を評価するのに適する。
【００６１】
各ｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度は、例えば、本発明の例示の実施形態において以下に記載されるとおり、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）により決定される。
【００６２】
典型的なＥＱＥＬＳ分光計１０は図１に示されている。分光計１０は、サンプル２０に光線を照射するレーザー１４を含む。サンプル２０は、サンプル２０に電界を提供する２つの電極２８の間に配置される。サンプル２０中の荷電粒子は、電界を印加されたために運動する。例えば、サンプル２０はｖＷＦサンプルなどの対象粒子が溶液内に存在するかまたは浮遊しているサンプル媒体を含む。例えば、サンプル媒体は、血漿、血漿生成物、蛋白質、核酸、細胞、細胞生成物、多糖類等を含む。サンプル２０中の粒子運動はレーザー１４により提供される一般的なコヒーレント光から準弾性散乱により検出される。入射光子の一部はサンプル２０中の運動粒子に衝突する。この衝突が発生すると、光子から少量のエネルギーが放出され、結果として、散乱光の周波数がわずかに低下する。この散乱光は検出器２６により検出される。
【００６３】
図１に示されているとおり、分光計１０は、ＥＱＥＬＳ信号分析器２２を含むプロセッサ１２に接続されている。プロセッサ１２は分光計１０からの信号を受け取り、この信号はＥＱＥＬＳ信号分析器２２により分析される。例えば、検出器２６により検出された散乱光は分析され、わずかな周波数シフトの大きさが決定される。この周波数シフトは、一般にサンプル２０中の粒子運動の速度に比例し、ドップラーシフトとして検出される。信号分析器２２はヘテロダイン法によりドップラーシフトを測定し、ヘテロダイン法では、周波数シフトされない光を散乱光と混合して「ビート」を生成する。この信号は自己相関関数として測定され、次にフーリエ変換して、解釈のためにパワースペクトルを求める。
【００６４】
特定の実施形態では、ＥＱＥＬＳ分光計１０を用いて、サンプル２０中に含まれるＡＤＡＭＴＳ１３などの、ｖＷＦマルチマーおよび／またはｖＷＦ代謝因子を検出および／または特性決定する。ＥＱＥＬＳ分光計１０からのスペクトルは、高分子量ｖＷＦ、ＴＴＰおよび／またはＴＴＰ／ＨＵＳの低下などのさまざまな状態の診断に使用される。ＥＱＥＬＳ分光計からのスペクトルは治療前および治療後に比較され、所定の治療における治療上の値を評価する。
【００６５】
特定の実施形態において、ＥＱＥＬＳ分光計１０を用いて、サンプル媒体中にｖＷＦマルチマーを含むサンプル２０に対するＥＱＥＬＳスペクトルを検出する。ＥＱＥＬＳスペクトルは既知のスペクトルのデータベースと比較される。上記既知のスペクトルのそれぞれは、正常なｖＷＦまたはｖＷＦに関するさまざまな異常または疾患などの、既知の複数のｖＷＦ状態の１つに対応する。媒体中のｖＷＦマルチマーは比較に基づいて特性決定される。
【００６６】
別の特定の実施形態においては、ＥＱＥＬＳ分光計１０を用いて、ＡＤＡＭＴＳ１３などのｖＷＦ代謝因子を評価または特性決定する。
【００６７】
図２は、本発明の実施形態によるシステム、方法、およびコンピュータプログラム生成物を示す、データ処理システムの典型的な実施形態のブロック図である。データ処理システム１１０は、分光計１２５およびメモリ１１４と通信するプロセッサ１２０を含む。分光計１２５に使用される典型的なＥＱＥＬＳシステムは図１に示されている。しかし、他の種類の分光計、例えばＰＣＳ、ＤＬＳ、ＥＱＥＬＳ分光計またはＣＺＥ装置なども使用できることは理解されるであろう。図２に示されているとおり、分光計１２５はサンプル修正システム１３５を含む。サンプル修正システム１３５は、ｖＷＦ代謝因子（例えばＡＤＡＭＴＳ１３）または治療薬などの物質をサンプルに追加することなどにより、分光計内のサンプルを修正するように構成される。
【００６８】
特定の実施形態においては、分光計１２５および／またはサンプル修正システム１３５は省略される。例えば、サンプルは手動で修正できるか、または、スペクトルはサンプル修正システム１３５によりサンプルを修正することなく、本発明の実施形態により得ることができる。特定の実施形態では、分光計１２５は省略され、別の分光計から取得されたスペクトルはデータ処理システム１１０に提供されて、分析される。
【００６９】
サンプル修正システム１３５はサンプルを修正できるが、この修正は、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３などｖＷＦ代謝作用薬の追加、溶液の追加、サンプル媒体のｐＨの変更、サンプル媒体の温度の変更、サンプル媒体のイオン強度の変更、対象粒子の結合特性を変更する薬剤の追加、および／または対象のｖＷＦ粒子に対する合成薬剤の追加によりなされる。結合剤の例は、抗体、細胞、微生物、リガンド、蛋白質、ペプチド、核酸、多糖類、脂質、リポ蛋白、ハプテン、および薬剤化合物を含む。サンプル精製は、各種の親和性（免疫のまたはリガンドの）方法のいずれかにより達成される。サンプルに結合する抗体またはペプチドはカラムマトリクスまたはミクロビーズと共有結合できる。次にサンプルは親和剤により結合され、所望の溶液に移される。サンプルは、その後、親和剤から抽出され特性決定される。
【００７０】
プロセッサ１２０はアドレス／データバス１４８を介してメモリ１１４と通信する。プロセッサ１２０は任意の市販または特注のカスタムマイクロプロセッサである。メモリ１１４は、データ処理システム１１０の機能を実行するために使用されるソフトウェアおよびデータを含むメモリデバイスの全体的な階層の見本である。メモリ１１４は、次の種類のデバイス、すなわちキャッシュ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、ＳＲＡＭおよびＤＲＡＭを含むが、これには限定しない。
【００７１】
図２に示されているとおり、メモリ１１４はデータ処理システム１１０内で使用されるソフトウェアおよびデータのいくつかのカテゴリ、すなわち、オペレーティングシステム１５２、アプリケーションプログラム１５４、入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイスドライバ１５８およびデータ１５６を含む。データ１５６は、分光計１２５からの既知のスペクトルのプロファイル１４４および／またはスペクトルのデータ１４６のデータベースを含む。既知のスペクトルのプロファイル１４４および／またはスペクトルのデータ１４６のデータベースはサンプルを識別または特性決定するために使用される。例えば、既知の状態を有するｖＷＦサンプルからのスペクトルは診断のためのパラメータを決定するために使用される。このようなパラメータ内の範囲に入るスペクトルは、同一または類似の状態を潜在的に有すると診断される。例えば、ある特定のフォンビルブランド病の状態は低濃度の高分子量（ＨＭＷ）ｖＷＦマルチマーを有する。
【００７２】
当業者には明らかなとおり、オペレーティングシステム１５２は、例えば、ニューヨーク州アーモンク市のＩＢＭ社のＯＳ／２、ＡＩＸ、ＯＳ／３９０またはＳｙｓｔｅｍ３９０、ワシントン州レドモンド市のマイクロソフト社のＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＣＥ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＮＴ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ９５、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ９８、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ２０００またはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＸＰ、Ｕｎｉｘ（登録商標）またはＬｉｎｕｘまたはＦｒｅｅＤＳＤ、Ｐａｌｍ社のＰａｌｍ ＯＳ、アップルコンピュータのＭａｃ ＯＳ、Ｌａｖ Ｖｉｅｗ、または独自のオペレーティングシステムなどの、データ処理システムにおける使用に適した任意のオペレーティングシステムである。Ｉ／Ｏデバイスドライバ１５８は通常、デバイス、例えば、Ｉ／Ｏデータポート、データストレージ１５６およびメモリ１１４および／または分光計１２５の特定の構成要素と通信するアプリケーションプログラム１５４により、オペレーティングシステム１５２を介してアクセスされるソフトウェアルーチンを含む。アプリケーションプログラム１５４はデータ処理システム１１０のさまざまな機能を実現するプログラムの例であり、好ましくは本発明の実施形態による操作をサポートする少なくとも１つのアプリケーションを含む。データ１５６は、アプリケーションプログラム１５４、オペレーティングシステム１５２、Ｉ／Ｏデバイスドライバ１５８およびメモリ１１４に属する他のソフトウェアプログラムにより使用される静的および動的データを表す。
【００７３】
本発明は、例えば、図２においては、アプリケーションプログラムであるスペクトルプロファイル分析モジュール１６０によって示されているが、当業者には明らかなように、本発明の教示の恩恵を受けつつ、別の構成も利用できる。例えば、スペクトルプロファイル分析モジュール１６０はさらに、オペレーティングシステム１５２、Ｉ／Ｏデバイスドライバ１５８またはデータ処理システム１１０の別のこのような論理部分に組み込むことができる。したがって、本発明は図２の構成に制限されると解釈されるべきではなく、ここに説明されるオペレーションを実行する能力のある任意の構成を含むものとする。
【００７４】
Ｉ／Ｏデータポートを用いて、データ処理システム１１０と分光計１２５または別のコンピュータシステムまたはネットワーク（例えばインターネット）の間に、またはプロセッサにより制御される他の装置に情報を転送する。これらのコンポーネントは、ここに記載されたとおりに作動するために、本発明により構成される多くの従来のデータ処理システムで使用されるような従来のコンポーネントである。
【００７５】
本発明は分光計１２５に関して上に説明されているが、電気泳動分光計および／またはサンプルが電界内に位置しない分光計を含む、さまざまな種類の分光計および分光分析法を利用できることは理解されるべきである。例えば、ＥＱＥＬＳ、ＰＣＳまたはＤＬＳ分光計は分光計１２５に使用される。さらに、他の技法を用いて、サンプルにエネルギーを供給し、サンプルからエネルギー相互作用の出力を収集できる。
【００７６】
図１および２に図示されているような、本発明の実施形態による光散乱分析をベースとする技法は、運動粒子から散乱した光と粒子に照射された入射光との間の周波数差を基にしている。散乱光の極めて少ない周波数シフトは直接測定できないため、ヘテロダイン方法を用いて、散乱光を参照光またはシフトされない光と混合する［Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊｒ．，ＣＳ．Ｌａｓｅｒ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．Ｄｏｖｅｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９４］。シフト光および非シフト光の間の周波数差は「ビート」を発生する。ビート周波数は散乱光の周波数シフトの大きさに関連し、この周波数シフトはさらに、散乱する粒子、例えばｖＷＦ粒子の移動度に関連する。電気泳動効果は、使用される電気泳動法に依存する均一な電界（約数ボルト／ｃｍから約３０，０００ボルト／ｃｍ）を重畳することにより得られる。電界はパルス化され、その極性はサンプルの極性を避けるために交番する。固定角度（θs）における動く粒子からの散乱強度（Ｉs）は２次領域自己相関関数Ｇ2Lhet（τ）としてヘテロダイン法における発振強度として観測され、式１により与えられる［Ｂｅｒｎ，ＢＪ．Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ，ＮＹ．１９７６］。
【数３】
ここで、ＩLは参照光ビームの強度（局部発振器）であり、Ｉsは散乱光の強度であり、ｖdは散乱粒子の速度であり、Ｄは拡散係数であり、τは時間増分である。Ｋは、下記の式により定義される散乱ベクトルである。
【数４】
ここで、ｎは屈折率であり、λは入射光の波長である。この式で１つの重要な量は粒子の運動から生じる信号のドップラーシフトＫ・ｖdである。測定された自己相関関数のフーリエ変換は、粒子の電気泳動移動度が計算されるパワースペクトルを提供する［Ｗａｒｅ，ＢＲ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．Ａｄｖ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｉｅｎｃｅ ４：１−４４，１９７４］。
【００７７】
サンプル媒体の温度、イオン強度、ｐＨおよび導電率（図１のサンプル２０など）は制御できる。温度の小さな変化は導電率の変化により検出され、試験を通して監視できる。ジュール加熱はパルス幅および電界周波数の調整により制御できる。熱レンズは入射レーザー電力を制御することで避けられる。電気浸透は（γ−グリシドキシプロピル）−トリメトキシシランを用いて最初に散乱細胞をコーティングし、７０℃で乾燥し、メチルセルロースによるコーティング、および７０℃での再乾燥を行うことにより最小化される。電気浸透アーチファクトの有無は、散乱体積を横切る平坦な電気泳動プロファイルにより確認される。別の方法は、メチルセルロースを用いてキュベットのコーティング工程を削除すること、および固定境界での移動度を測定すること、または別の細胞設計を使用することである。スネルの法則の補正は全ての散乱角度に対してなされる。ｖＷＦの動電学的特性はＤｅｂｙｅ−Ｈｕｃｋｅｌ等式の領域内にある、この領域では、表面電荷および摩擦力の両方が電界内での運動に重要である。例えば、ｖＷＦマルチマーの電荷および摩擦の特性の両方は、移動度スペクトルに寄与する［Ｐｔｈｉｃａ ＢＡ．細胞接着の物理化学（Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ．）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．８，１２３−１４０，１９６１］。
【００７８】
いずれの特定理論にも拘束されないで、ＥＱＥＬＳ技法を用いるさまざまなｖＷＦ種の間の分解能および区別の基本は、一般に、さまざまなｖＷＦマルチマー種の電気泳動移動度における相違である。電気泳動移動度は電界の影響下での帯電した粒子種の運動である。
【００７９】
ＤＬＳまたはＰＣＳ技法（図１および２に関して説明したＥＱＥＬＳ技法の代用とすることができる）を用いた場合などの、電気泳動移動度を発生する電界が存在しない場合、ｖＷＦ種はなおも熱効果から発生する運動を受ける。例えばブラウン運動、対流性流れおよび／または拡散効果を含む、このような運動の大きさは、溶剤の状態、溶質の濃度、および散乱粒子の分子の大きさにより決定される。したがって、ＥＱＥＬＳを用いて、ｖＷＦマルチマー間の差を区別し決定し、および／または存在するマルチマーの数を決定するが、ＰＣＳまたはＤＬＳもまたさまざまなｖＷＦマルチマー種の拡散係数の差に基づいてｖＷＦマルチマーを検出する。
【００８０】
このように、ＰＣＳは、サンプルに電界を印加しない点においてＥＱＥＬＳとは異なる。拡散するｖＷＦ種の運動の大きさの差は、例えばレーザーまたは他の光源により生成されるような、入射光子と拡散する種の相互作用から生じるドップラーシフトの大きさの差から検出される。急速に移動または拡散する種は、大きなドップラーシフトを発生し、より遅く拡散する種はより小さなドップラーシフトを発生する。そうでない場合、検出方法はＥＱＥＬＳに対して使用される方法に対応する。
【００８１】
ＰＣＳはｖＷＦマルチマーの分析に対する平行移動拡散係数を決定する正確な方法を提供する。さらに、拡散係数が測定される迅速性により、ＰＣＳを高分子の結合を監視する有効な方法にする。ＥＱＥＬＳはｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度分布の決定に使用される。
【００８２】
説明の目的で、ＥＱＥＬＳ技法は、屈折率一致タンクに含まれるサンプル細胞を使用し、０．１℃の許容差内で制御される屈折性一致流体および温度としてトルエンを使用することにより実行される。散乱放射線は、定義された散乱角度で配置される光電管により測定される。次に、ｚ−平均平行移動拡散係数は、崩壊定数Γの傾きに対するｓｉｎ2（θs／２）（ここでΓ＝Ｋ2Ｄ、Ｋは散乱ベクトルである）として、強度正規化された光子カウント自己相関関数から得られる。分子の大きさは流体力学的径として表され、アインシュタインの式により定義されるＤから計算される。指数的サンプリング技法に基づいて、分子の粒度分布（例えば、ｖＷＦマルチマーの大きさの変化）はＰＣＳ自己相関関数から導かれる。フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）は５００，０００〜２，０００万の範囲の変動する分子量の高分子糖蛋白として、１０μｇ／ｍＬにおける正常な血漿中を循環する。ｖＷＦマルチマーは内皮細胞および巨核球の両方内で合成されるｖＷＦモノマーで構成される。「前処理ｖＷＦモノマー」とも言われる、２８１３アミノ酸（３６０，０００ Ｍｒ．）発生期ｖＷＦモノマーは、２２アミノ酸シグナルペプチド、７４１プロペプチド（ｖＷＦ抗原ＩＩとも呼ばれる１００，０００ Ｍｒ、７４１アミノ酸）および成熟ｖＷＦモノマーで構成される。
【００８３】
成熟モノマーは２０５０アミノ酸を含み、２６０，０００のＭｒを有する。小胞体では、負に帯電した成熟したｖＷＦモノマーはカルボキシル基の末端に位置する特定のジスルフィド結合配列を介して二量化する。ゴルジ装置では、結果として得た生じたダイマーは、モノマーのＤ３ドメインに位置する特定のジスルフィド結合の第２セットを介してｖＷＦマルチマーを形成するために、次々に重合する。結果として、大きなポリマーが形成される。プロペプチドは内皮細胞および血小板のα−微粒のＷｅｉｂｅｌ Ｐａｌａｄｅ体に成熟したｖＷＦモノマーを取り込むのに必要である。その後、プロペプチドは、ｆｕｒｉｎ、サブチリシン様酵素により切断される。
【００８４】
マルチマーの粒度、およびマルチマーの著しい多分散性は、ＡＤＡＭＴＳ１３によりＡ２ドメイン内での蛋白分解に少なくとも部分的に起因する。
【００８５】
電子顕微鏡検査によるｖＷＦダイマーの画像化は、約１４５ｎｍの全体固有寸法を与える線維鎖（３４ｎｍ）により中央のドメイン（５ｎｍ）に接続される２つの球状ドメイン（２６×２．６ｎｍ）を含む構造を示す。ダイマーのｖＷＦの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像では、５ｎｍのロッドにより接続される３８ｎｍの中央ドメインに接続される７３ｎｍの２つの側面ドメインを示す。両方の方法による固有寸法は正確に一致する。球状のｖＷＦのＡＦＭは最大７７４ｎｍの広がったマルチマーを有する１４６ｎｍの主軸の寸法を示す。球状配列は３５ダイン／ｃｍ2を上回る機械的なせん断力で直線配列への伸長を受ける。このモデルは、しばしば、「毛糸の玉」と称され、ｖＷＦの正常な生物学的機能の現在の概念に良く適合する。機械的せん断力は、小さな「毛糸の玉」から伸長した状態への変形を引き起こすのに極めて重要である。
【００８６】
ｖＷＦモノマー組織について、ドメイン構造および機能に関して、ｖＷＦモノマー自体は以下の構造的ドメイン（ＮＨ2）、Ｄ’−Ｄ３−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｂ１−Ｂ２−Ｃ１−Ｃ２（ＣＯ2Ｈ）に配列される。ドメインは反復同族関係の領域として定義される。未だに完全に特定されていないが、生物学的機能とドメインとの関係はいくつかのドメインに対して解明されている。
【００８７】
ドメインＤ’およびＤ３について、ｖＷＦの重要な機能の１つは凝集第ＶＩＩＩ因子の輸送であり、凝集第ＶＩＩＩ因子はｖＷＦが血漿にさらされると発生し、凝集第ＶＩＩＩ因子を結合する。この輸送機能に加えて、第ＶＩＩＩ因子は、ｖＷＦに結合されている間は、活性蛋白質Ｃまたは活性凝集因子Ｘ（ＦＸａ）により蛋白質分解から保護されている。結合部位はｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメイン内で残基７８−９６に精製される。ｖＷＦ（Ｋd＝０．２５ｎＭ）による凝集第ＶＩＩＩ因子の非共有結合は、ｖＷＦにおけるＤ’およびＤ３ドメインと凝集第ＶＩＩＩ因子におけるＡ３ドメイン（ｖＷＦ（８１−８３）のＡ３ドメインと混同してはならない）との相互作用により発生する。凝集第ＶＩＩＩ因子Ａ３ドメインにおけるＡｒｇ1689の分断はｖＷＦから凝集第ＶＩＩＩ因子を解放する。残基１９、２８、５３、５４および９１でｖＷＦ領域を結合する凝集第ＶＩＩＩ因子における変種は、ｖＷＦへの凝集第ＶＩＩＩ因子の正常な結合を妨げ、大量出血を引き起こし、血友病と誤診される場合があり、ｖＷＦ Ｎｏｒｍａｎｄｙと称される。血小板表面への凝集第ＶＩＩＩ因子の輸送メカニズムは未だに明らかではない。
【００８８】
ドメインＡ１については、ドメインＡ１およびＡ３は、インテグリンのＩドメイン、細胞外基質の補体成分およびｒａｓ−ｐ２１ジヌクレオチド結合部位を含む大きなスーパーファミリーを有する構造類似性を共有する。正極性に帯電したＡ１ドメインはアミノ酸残基４９７および７１６の間に配置され、１８４アミノ酸のかなり大きなループを生成するＣｙｓ５０９−Ｃｙｓ６９５の間にジスルフィド・ブリッジを有する。
【００８９】
ドメインＡ１はドメインＡ２およびＡ３と共に、ｖＷＦと血管壁に配置されるコラーゲンと血小板表面に配置されるＧＰＩb／Ｖ／ＩＸとの間の相互作用を仲介する。Ａ１反復は血小板ＧＰＩbの結合部位を含む。ＧＰＩbはそれぞれ、モル比２：２：１：２でＧＰ Ｉｂα、ＧＰ Ｉｂβ、ＧＰ ＶおよびＧＰ ＩＸから成る複合体として存在する。ｖＷＦはＧＰＩb／Ｖ／ＩＸを構成的に結合しないが、ｖＷＦは分子の伸長を通して活性化を必要とする。
【００９０】
Ａ１ドメインによるＧＰＩbの結合は、ドメインＡ３と非線維コラーゲンの間の相互作用により調整されるＡ１ドメインにおける配置変化を含むと考えられる。配置変化の正確な詳細は明らかでない。Ａ１ドメイン結晶構造の分析によると、および白血球のインテグリンのａ−副単位（Ｉドメインとも称されるαＭ、β２およびαLβ２）からのデータを用いた推定によると、埋没塩橋の分断はインテグリンのＩドメインとして前部上表面から下方のα７螺旋１０Ａの電荷の再分布および変位の原因となる。Ｉドメインの場合、この膨張形状は高い親和性リガンド結合に関連し、ｖＷＦ Ａ１のこの膨張形状はＧＰ Ｉb結合に関連すると推定される。Ａ３ドメインのコラーゲンおよび／または大きい機械的せん断力との相互作用は、この配置変化を起動すると思われる。Ａ１ドメインはさらに、ＶＩ型コラーゲンの第２結合部位、およびスルファチド、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）、ボトロセチン(Botricetin)およびヘパリンの結合部位を含む。
【００９１】
Ａ２ドメインはアミノ酸部位７１７から９０９により定義される。このｖＷＦドメインは、血漿ＡＤＡＭＴＳ１３により分裂され、かつＷＦマルチマー粒度の調整に関与すると考えられるＴｙｒ８４２とＭｅｔ８４３間の部位を含む。ＡＤＡＭＴＳ１３による分割の後、ｖＷＦダイマーは１７６Ｋdおよび１４０Ｋdの質量を有する２つのフラグメントになる。活性化のためカルシウムまたは亜鉛のどちらかを必要とするＡＤＡＭＴＳ１３は、ｖＷＦが機械的せん断力あるいはコラーゲンまたは他の蛋白質との後の相互作用のいずれかにより、広げられる及び伸長されない限り、ｖＷＦに対して作用しない。Ａ２ドメインの削除はマルチマーの分裂を防止する。
【００９２】
負に帯電したＡ３ドメインはアミノ酸９１０から１１１１まで伸長する。このドメインはＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの結合部位を含み、アミノ酸１０１８から１１１４までの間に配置される。ＩＶ型およびＶＩ型コラーゲンの結合部位は公知ではないが、Ａ１またはＡ３ドメインのいずれにも現れない。Ａ１およびＡ３の一部から成るキメラのドメインを含む独立した組み換えＡ−ドメインと、Ａ１またはＡ３のどちらかを削除されたｖＷＦ分子上とに基づいて、主コラーゲン結合部位はＡ３ドメインに配置されている。独立した組み換えＡ３ドメインは１．８×１０-6ＭのＫdを伴うＩ型コラーゲンに結合する。
【００９３】
コラーゲンの結合およびｖＷＦ介在血小板付着のメカニズムは複雑であり、複数の工程を含み、コラーゲンの型により変化する。白血球インテグリン（ＬＦＡ−１）内で見られるＩドメインとは対照的に、ｖＷＦのＡ１またはＡ３ドメインのいずれにも金属結合部位は存在しない。Ｉドメインの特性であり、２つの両親媒性螺旋により挟まれた中央の平行なβシートにより形成される、ジヌクレオチド結合折曲部の主題はｖＷＦ Ａ−ドメインに存在し、それぞれ、ＧＰ Ｉbおよびコラーゲンの結合部位であると見なされる。Ａ−ドメインおよびＡ３−ドメインは、詳細には、経験的に観測される疎水性領域を含むことができる。
【００９４】
ｖＷＦは、初期の血小板付着および血小板への凝集剤第ＶＩＩＩ因子の輸送という、２つの主機能を有する。内皮下基底膜および血管の外膜組織に位置するさまざまなコラーゲンは、ｖＷＦの特定の対象物として特定されるが、Ｉ型およびＩＩＩ型の線維コラーゲン、ＶＩ型の細線維コラーゲン、およびＩＶ型の非線維コラーゲンは最も重要である。大きい機械的なせん断力はｖＷＦを引き伸ばされた分子に物理的に変形させて、血小板付着における機能を高める。ｖＷＦの活性化における機械的なせん断力の重要性が問題とされてきた一方で、コラーゲン結合の重要性は、モノクローナル抗体によるＡ３ドメインの遮断によるコラーゲン結合の阻止により生体内の動脈性の血小板血栓形成を防ぐことを示す、ヒヒの研究により強調されてきた。
【００９５】
コラーゲン、ｖＷＦ、血小板の間の初期の相互作用は血小板付着の初期工程としてのみ役立つ。他のリガンド（おそらくα2β1）が強固な付着に役立つことは明らかである。大きいせん断力の下で、内皮下のｖＷＦは血小板付着の最大５０％の割合を占める。
【００９６】
Ａ３ドメインによるコラーゲン結合はＡ１ドメインでの配置変化を誘発するものとして発生し、血小板表面での構成性分泌糖蛋白質Ｉｂ／Ｖ／ＩＸ（ＧＰＩb／Ｖ／ＩＸ）に結合する部位を露出させる。このシークエンスはアシアロ−ｖＷＦの結合、ｖＷＦ−血小板付着、リストセチンおよびボトロセチン両方の結合を阻止するため、ＧＰＩbの主結合部位はｖＷＦ残基５１４−５４２内に存在する。リストセチンまたはボトロセチンのｖＷＦ結合はＧＰＩb／Ｖ／ＶＸとの結合を強化するが、負に帯電したまたは芳香性のポリマーはＧＰＩbとの結合を阻止する。ＧＰＩbがｖＷＦに結合すると、信号変換が発生し、血小板の活性化が生じる。血小板の活性化によって、次に、血小板拡大、凝集、不可逆性血小板付着およびトロンビン生成を調整する、αIIbβ3へのｖＷＦまたはフィブリノゲン結合が生じる。大きいせん断力の状況下で、血小板の凝集は、αIIbβ3へのｖＷＦ結合を通して調整される。
【００９７】
ｖＷＦマルチマーの粒度および濃度の分布における異常は、先天性または後天性の原因から発生する。ＨＭＷマルチマーは血小板粘着の主メディエータであるため、ＨＭＷマルチマーの損失は特に重大である。Ｉ型ｖＷＤは最も一般的な型のｖＷＤであり、全てのマルチマー粒度の濃度を低下させる。ＩＩ型ｖＷＤでは、ＨＭＷマルチマーは減少するかまたは存在しない。ＩＩ型ＢｖＷＤでは、ｖＷＦマルチマーはＧＰＩb／Ｖ／ＩＸ混合物に対親和力を低下させるが、これは、蛋白質分解に対するｖＷＦの脆弱性を増加するＡ１−ドメインにおけるマルチマーから生じる。Ａ２−ドメインにおける大多数の変種はＩＩＡ型のｖＷＤを生成し、この場合、残基Ｔｙｒ８４２−Ｍｅｔ８４３の間の分裂がｖＷＦを分解し、ＨＭＷｖＷＦマルチマーの損失を招く。例えば本明細書に記載されたスペクトル技法を使用して決定されたサンプル中の、分子粒度および重量分布、電気泳動移動度分布、および／またはｖＷＦの粒度分布は、これらの条件および他の条件を特定する。
【００９８】
ｖＷＦに関連する臨床上の病状に関しては、フォンビルブランド病は、ｖＷＦにおけるさまざまな定量的および／または定性的な欠陥によりそれぞれ特性決定される、多数の疾患の変形体を伴う、臨床的に異質な疾患である。３つの主な疾患の型（型Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）および４つの亜型（ＩＩＡ、ＩＩＢ，ＩＩＭ、ＩＩＤ）がある。ｖＷＤは通常診断の血液検査では現れないため、ｖＷＤの検査室診断および細分類は困難である。したがって、医師は、各患者に対する最高および最も安全な治療を確立するため、特定のｖＷＦ変種を決定するための特殊な診断血液検査を指示しなければならない。
【００９９】
血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）はｖＷＦマルチマーの分布およびＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む病状である。血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）は発生率は低いが、若年成人および若い女性にはより一般的な、潜在的に致死的な病気である。ＴＴＰの診断は、熱、腎不全、変動的な精神状態、微小血管症性溶血性貧血（ＭＡＨＡ）および血小板減少症の、古典的な５徴候により確定される。関連のある溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７に感染した子供によりしばしば見られ、より高い腎機能障害を伴うが、神経系への介入は少ない。先天性および後天性の両方の病気の形態で現れる。後天性のＴＴＰは、感染（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７からの志賀赤痢菌毒素またはＡＩＤＳ）、ＳＬＥなど自己免疫性疾患、骨髄移植（ＢＭＴ）、妊娠、慢性の免疫抑制、敗血症および、チクロピジン、シクロスポリン、マイトマイシンＣおよびキニーネといった薬品を含む、多くのさまざまな臨床的状態から発生する。
【０１００】
したがって、ＴＴＰは、血漿交換輸血（ＰＬＥＸ）以外の場合には８０％を超える致命率の、多様な病因の症候群である。ＰＬＥＸを用いても、１５％〜２０％の範囲の死亡率が一般的である。ＰＬＥＸの効果は正常血漿の注入による不足しているｖＷＦ分裂プロテアーゼ（ｖＷＦＣＰ）の交換、および、場合によっては、ＩｇＧ型免疫グロブリンなど抑止自己抗体の除去を含むと考えられる。慢性再発性ＴＴＰが超巨大ｖＷＦマルチマー（ＵＬｖＷＦ）と関連するという観察報告は、これらのＵＬｖＷＦマルチマーは血小板により容易に結合されるため、「デポリメラーゼ」調整マルチマー粒度はＴＴＰに存在しないことを示している。血漿プロテアーゼ（ｖＷＦＣＰ）はｖＷＦの分裂に有効であり、ＴＴＰにおいて、ｖＷＦはＴｙｒ1605−Ｍｅｔ1606間のｖＷＦのＡ２ドメインで分裂される。ｖＷＦＣＰによるｖＷＦの分裂はｖＷＦのせん断力による伸長によって促進される。
【０１０１】
先天性のＴＴＰ患者はＡＤＡＭＴＳ１３に変種を有すると見られてきた。ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）系統群の各要素は細胞外基質付着蛋白質の代謝において顕著な役割を果たす。ＡＤＡＭＴ系統群は、コラーゲン結合におけるその推定可能な作用を繰り返すトロンボスポンジン−１の追加分を有する。ＡＤＡＭＴＳ系統群の各要素の機能は多様であるが、全ての系統群の要素は、細胞外基質付着蛋白質を処理する膜固着プロテアーゼである。ＡＤＡＭＴＳ１３はｖＷＦの分裂を調整し、これはＴＴＰにとって極めて重要である。蛋白質分解作用はｖＷＦＣＰの活性化および／または止血の他の構成要素を含む。
【０１０２】
ＡＤＡＭＴＳ１３の遺伝形質は常染色体劣性である。ＡＤＡＭＴＳ１３は、シグナルペプチド、４１ａａプロペプチド、ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ様ドメイン、メタロプロテイナーゼドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、トロンボスポンジン−１反復、ＲＤＧシークエンス（その後に７つの付加されたトロンボスポンジン−１ドメインおよび２ＣＵＢ−ドメインが続く）を有するＣｙｓ−ｒｉｃｈスペーサードメインを含む、１４２７アミノ酸残基糖蛋白質である。計算された１５４ｋのＭｒ（非グリコシル化）は血漿から分離した１９０ｋ Ｍr（グリコシル化）ｖＷＦＣＰとよく一致合致する。ＡＤＡＭＴＳ１３は、その短いプロペプチド（わずかに４１の残基長）およびＣＵＢ−ドメインの存在により、ＡＤＡＭＴＳ系統群の他の要素から区別される。ＣＵＢドメインはＡＤＡＭＴＳ１３に固有であり、コラーゲン結合部位を含む。細胞基質結合はトロンボスポンジンドメインによって生じると仮定される。初期蛋白は、おそらくｆｕｒｉｎによるゴルジ体または細胞表面のいずれかにおいて活性化を要求する酵素原であると考えられる。ＰＬＥＸ後に注入された血漿内に含まれるＡＤＡＭＴＳ１３のｔ1/2は、明確には公知ではないが、ＰＬＥＸ処理された２名のＴＴＰ患者に３．３日および２．１日で測定した。３％未満の機能活性度の低下は、臨床的有意性を表すために必要であることを示している。先天性および突発性ＴＴＰを伴うＡＤＡＭＴＳ１３の機能的または先天性不足のいずれかの関連性は、ＴＴＰ患者の約５０％に対して間違いなく確立されたように見える。
【０１０３】
低レベルのＡＤＡＭＴＳ１３およびＨＭＷマルチマーはまた、病状、およびＶＯＤ、急性膵炎、妊娠、尿毒症、特発性血小板血症、炎症および肝硬変症などの、ＴＴＰ以外の生理状態に存在する。本発明は、本発明の特定の実施形態におけるＴＴＰ、ＨＵＳおよびＴＴＰ／ＨＵＳに関して説明されているが、このような病状は本発明の適用性に関して説明しているものであり、本発明は、例えば急性冠動脈症候群などの、例えば異常な内皮機能がｖＷＦの放出を介在する病状などのｖＷＦの異常生成を含む、さまざまな病状および生理学的な状態の症状の疾患、治療および／または回復を含む、ことは理解されるであろう。したがって、本発明の分析方法は、同様に、これらの病状および／または生理学的状況の潜在的な存在が、診断上で決定されるかまたは禁忌されるという用途を含む。
【０１０４】
したがって、本発明は、ｖＷＦマルチマーの検出および特性決定、および／またはＡＤＡＭＴＳ１３などの因子によるｖＷＦの分解の迅速な分析方法を提供するものであり、このＡＤＡＭＴＳ１３は、ｖＷＦおよび／または分解薬剤に関連するか、指示されるか、または禁忌される病状または生理学的な状況の診断および治療に関する有用性を有する。
【０１０５】
本発明の迅速な分析方法は、限定されることなく、静的光散乱法および動的光散乱法を利用する方法を含み、これら光散乱法には、ＥＱＥＬＳ（電気泳動の準弾性光散乱）、ＰＣＳ（光子相関分光法）他またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）技法を含み、または、ｖＷＦ種および／または分解薬剤を含むか、または存在に影響されやすい媒体にエネルギーを照射することによりエネルギー相互作用スペクトルを生成し、および、エネルギー相互作用スペクトルからこのような種および／または作用薬の存在、不足または特性を決定することにより、ｖＷＦおよび／または分解薬剤を検出および／または特性決定する他の方法、を含む。
【０１０６】
エネルギーの相互作用スペクトルは一般に、任意の適切な種類であり、このスペクトルには、エネルギー散乱スペクトル、エネルギー吸光度スペクトル、エネルギー伝送スペクトルまたはこのような種および／または薬剤を含むエネルギー／粒子相互作用を示す、任意の他のスペクトルを含む。エネルギー相互作用は、電気泳動状態または非電気泳動状態下で発生し、エネルギー源は、限定されることなく、電磁エネルギー、音響エネルギー、超音波エネルギーまたは任意の他の適切なエネルギー媒体を含む、所望の相互作用スペクトルを生成するのに有効な任意の適切な種類である。電磁エネルギーの場合、エネルギーは、可視光線、赤外線、紫外線およびＸ線スペクトル類など、適切なスペクトル類である。特定の実施形態では、化学線が、サンプルにおけるｖＷＦおよび／または代謝作用薬（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）粒子との相互作用のためのエネルギー媒体として使用され、このような化学線は、例えば、約２００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の波長を有する。本発明の各種の実施形態は、弾性光散乱および準弾性光散乱を含む光散乱技法など、可視光線放射を使用する。別の実施形態は、毛管流れ内の粒子に照射される紫外線放射のエネルギー源として紫外線レーザーを有するキャピラリー電気泳動方法およびシステムなどのように、紫外線放射を使用する。したがって、任意の適切なエネルギー検出源および対応するエネルギー媒体は、本発明の幅広い実施に使用されることが認識されるであろう。さまざまな好ましい実施形態においては、可視光レーザーは、ＥＱＥＬＳ（電気泳動の準弾性光散乱）、ＰＣＳ（光子相関分光法）等またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）技法を含む、静的光散乱法および動的光散乱法を実行するためのエネルギー検出源として利用される。
【０１０７】
エネルギー相互作用スペクトルからのｖＷＦ種および／または関連する薬剤の決定（例えば、検出、特性決定）は、このような決定のための任意の適切なソフトウェア、システム、分析技法、アルゴリズムなどを用いる適正な方法でなされる。エネルギー相互作用スペクトル方法の説明として、ＥＱＥＬＳを主に参照して説明した実例の決定方法は、例えば、２００４年５月４日に出願された同時係属の米国特許出願第（欠番）号、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ／ｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ［代理人整理番号５４７０−４０４］に説明されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
被検者を、ＴＴＰ疾患およびいずれかの他の病状が進行する危険性のある患者と特定でき、これら疾患により内皮の異常機能を引き起こし、その結果、ＡＤＡＭＴＳ１３、および／またはこのような被検者から得られる生理学的サンプル中のｖＷＦ種の存在、不足または特性と相関関係のある、代謝因子の欠損または不足に関連するｖＷＦまたは生理状態を発生させる。生理学的サンプル中のｖＷＦ種の存在、不足または特性（例えばスペクトル分析により決定される）が決定される。ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはいずれかのｖＷＦ代謝因子の欠損または不足は相関的に決定できる。
【０１０９】
内皮の異常機能を引き起こすことにより、ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはｖＷＦのいずれかの代謝因子の欠損または不足に関連するｖＷＦまたは生理状態を発生する、ＴＴＰ疾患またはいずれかの他の病状を有する患者を治療できる。ＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または不足を抑制する治療薬は、このような患者に投与され、治療薬の効果は、治療薬の投与後の患者から取得される生理学的サンプル中のｖＷＦ種の存在、不足または特性により、決定される。生理学的サンプル内のｖＷＦ種の存在、不足または特性は、ＥＱＥＬＳ（電気泳動の準弾性光散乱）、ＰＣＳ（光子相関分光法）他またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）技法または他のエネルギー相互作用スペクトル技法を含む、静的光散乱法および動的光散乱法により、さまざまな特定の実施形態において決定される。
【０１１０】
ＴＰＰ疾患または、ＡＤＡＭＴＳ１３および／または任意のｖＷＦの代謝因子の欠損または不足に関連するｖＷＦまたは生理状態を発生する内皮の異常機能を引き起こすいずれかの他の病状の患者の治療は、有効な量のＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼの治療的な投与を含み、このようなプロテアーゼは、例えば、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３、合成ＡＤＡＭＴＳ１３、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体、ならびに、２００３年４月１７日に発行された米国特許公報第２００３／００７３１１６号により詳細に記載されいるとおり、合成ＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体から選択される。上記特許の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
ｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および粒度分布は分析できる。複数のｖＷＦマルチマーを含む媒体を生成できる。エネルギーはサンプル媒体中のｖＷＦに照射され、エネルギーの相互作用の出力は照射されたエネルギーに応じて生成される。媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および粒度分布は、エネルギーの相互作用の出力から決定される。
【０１１２】
エネルギーは、例えば光エネルギーを含み、したがって、エネルギーの相互作用の出力は散乱光出力を含む。エネルギーの相互作用は、電気泳動または非電気泳動状態下で、このような方法の所定の最終用途における要望通りに発生できる。このような散乱光出力を処理して、自己相関関数から散乱光の位相シフト、ｖＷＦマルチマーに照射される入射光に関連する散乱光のドップラーシフト、ｖＷＦマルチマー移動度（電気泳動状態を与えられた場合の電気泳動移動度）、およびｖＷＦマルチマーの分子量分布を決定できる。正常な範囲のｖＷＦマルチマー重量は５００，０００〜２０，０００，０００の範囲である。１０００万〜２０００万の重量は通常高いと見なされ、超巨大マルチマー重量は２０００万より大きく、場合によっては１億にもなる。
【０１１３】
散乱光出力処理工程は、５分未満、１分未満またはそれより短い、極めて迅速な方法で実行される。サンプルはチャンバ内に収容され、それらは、例えばＥＱＥＬＳ装置の電気泳動チャンバまたはＣＺＥシステムのキャピラリーチャンバである。
【０１１４】
ｖＷＦマルチマーを含む媒体は、例えば、希釈食塩水、患者の血漿、（例えばクロマトグラフで精製された）精製された血漿、または他の生理学的な流体または試薬液を含む。
【０１１５】
通常または処理された血漿のｖＷＦは、ゲル透過クロマトグラフィーまたは親和性方法を含むさまざまな種類の方法の１つを使用してさらに精製される。親和性方法は、クロマトグラフィマトリックス、微粒子等に付着する、ｖＷＦ上の特定の結合部位に誘導される抗体、ペプチド（コラーゲンフラグメント等）、または炭水化物（すなわちヘパリン等）、を使用する免疫沈降法または免疫親和法である。基質に結合されるｖＷＦは、好ましくない物質を除去するために適切な緩衝液で洗浄され、洗浄緩衝液から戻され、適切な溶離緩衝液に再び懸濁される。微粒子は除去され、ｖＷＦを含む上澄み液が除去される。ｖＷＦ溶液は、その後、脱塩され、分析緩衝液に移される。
【０１１６】
ｖＷＦ代謝酵素（例えばＡＤＡＭＴＳ１３）は患者のサンプル、例えば、患者の血漿サンプル内で特性決定される。ある一定量の高分子量ｖＷＦが患者のサンプルに導入される。エネルギーは、高分子量ｖＷＦが加えられた患者のサンプルに照射される。エネルギーの相互作用の出力が生成され、高分子量ｖＷＦの分解が発生したかどうかは、エネルギーの相互作用の出力から決定される。
【０１１７】
ＨＭＷｖＷＦ増加患者サンプルへのエネルギー照射するおよびエネルギーの相互作用の出力応答の生成には、ＥＱＥＬＳ（電気泳動の準弾性光散乱）、ＰＣＳ（光子相関分光法）他またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）技法または他のエネルギー相互作用スペクトル技法を含む、静的光散乱法および動的光散乱法が挙げられる。
【０１１８】
ｖＷＦ代謝酵素に対する患者サンプルを特性決定する方法は、さらに、分解が発生している場合、ＡＤＡＭＴＳ１３による分解の確認マーカとして、固有の１７６，０００Ｍｒ分解フラグメントの存在の決定を含む。この分解フラグメントはＡＤＡＭＴＳ１３について特定であるため、このようなフラグメントに対応する移動度は、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＷｖＷＦの分解が進行に伴い発生する。
【０１１９】
ＨＭＷｖＷＦの分解が発生していないと決定されると、この結果は、サンプルを採取された患者がＡＤＡＭＴＳ１３酵素不足であることを示す。
【０１２０】
ＡＤＡＭＴＳ１３などのｖＷＦ代謝酵素を特性決定する上記の方法を用いて、患者サンプル中の、治療薬および／または治療養生法の治療の有効性を分析する。
【０１２１】
液状媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布および／または粒度分布を決定できる。エネルギーを媒体に照射し、エネルギーの相互作用の出力を生成する。エネルギーの相互作用の出力を用いて、媒体中のｖＷＦマルチマーの存在、不足または電気泳動移動度分布特性を決定できる。
【０１２２】
エネルギー照射およびエネルギー相互作用出力の決定技法は、ＥＱＥＬＳ（電気泳動準弾性光散乱法）、ＰＣＳ（光子相関分光分析法）等またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）を含む静的光散乱法および動的光散乱法などの技法であってもよい。媒体内のｖＷＦマルチマーの有無はスペクトル解析によって決定できる。例えば、ｖＷＦ代謝酵素不足を有する患者の高分子量ｖＷＦなどの、特定の状態で予測される特性を求めるために、スペクトルを、特定の状態を有する既知のスペクトルと比較するかまたは分析できる。媒体自体は血漿または血漿成分および／または希釈緩衝食塩水、他の試薬、他の生理学的サンプル等を含んでもよい。媒体は、（ｉ）被験者から得られる血漿サンプルや（ｉｉ）所定の量の高分子量ｖＷＦを含んでもよい。被験者内のｖＷＦ代謝酵素は、電気泳動度分布および／または粒度分布に基づいて決定されるように、サンプル中の高分子量ｖＷＦの分解量に基づいて分析できる。
【０１２３】
被験者から得られる血漿サンプル中のｖＷＦ代謝酵素の有無に起因する、媒体中のｖＷＦマルチマーの特性を決定できる。ｖＷＦ代謝酵素はＡＤＡＭＴＳ１３を含んでもよく、ｖＷＦ代謝酵素の有無に起因する媒体中のｖＷＦマルチマーの特性は、分子量が１７６，０００ＭｒのｖＷＦ代謝反応生成物フラグメントの有無として決定できる。
【０１２４】
被験者の診断は、被験者から得られる血漿サンプルのｖＷＦ代謝酵素の有無から決定できる。例えば、診断は分子量が１７６，０００ＭｒのｖＷＦ代謝反応生成物フラグメントの有無によって確立できる。あるいは、診断は、被験者から得られる血漿サンプルのｖＷＦ代謝酵素の不足に関連する生理状態に対する感受性の有無に関する結論、例えば被験者から得られる血漿サンプルのＡＤＡＭＴＳ１３の不足に伴う生理状態に対する感受性の有無の結論であってもよい。
【０１２５】
特定の実施形態では、分析方法は被験者に治療薬を投与するのに合わせて実施できる。治療薬は、被験者のｖＷＦ分解酵素の存在を増すために実際有効であるか、または潜在的に有効と特定された薬剤である。分析により決定がなされる前および／または後に、そのような治療薬の投与を実行して、投与効果を決定できる。治療薬は任意の適切な種類であってもよく、例えば、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３、合成ＡＤＡＭＴＳ１３、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体、合成ＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体からなるグループから選択されるＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼであってもよい。治療薬はさらに、それらの効力が被験者のｖＷＦ代謝酵素の存在を増加すると評価される何らかの治療薬を含むこともできる。この場合には、他の何らかの治療薬の効力に関して、被験者内のＡＤＡＭＴＳ１３などのｖＷＦ代謝酵素の存在を増す薬剤の効果を決定するために、分析による決定を実行する。
【０１２６】
被験者は、ＡＤＡＭＴＳ１３の不在または不足および／またはｖＷＦのいずれかの代謝酵素に関連する病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあると特定できる。ＡＤＡＭＴＳ１３が正常な被験者に存在する種類の生理学的サンプルを被験者から得ることができる。所定量のＨＭＷｖＷＦを生理学的サンプルに加えることもできる。所定量のＨＭＷｖＷＦが加えられた生理学的サンプルを、ＥＱＥＬＳ（電気泳動準弾性光散乱法）、ＰＣＳ（光子相関分光分析法）等またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）を含む静的光散乱法および動的光散乱法などの方法によって処理して、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度および粒度分布を決定できる。その後、被験者は、ｖＷＦマルチマーの電気泳動度および粒度分布に基づいて、ＡＤＡＭＴＳ１３の不在または不足および／またはｖＷＦのいずれかの代謝酵素に関連する病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあると特定される。
【０１２７】
生理学的サンプルは血漿または（クロマトグラフィー精製等によって）精製後の血漿を含んでもよい。生理学的サンプルはさらに試薬を含んでもよい。試薬は、（ｉ）ＡＤＡＭＴＳ１３の代謝および／またはｖＷＦのいずれかの代謝剤に起因するＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーと結合でき、および／または（ｉｉ）電気泳動度分布のＥＱＥＬＳ決定を向上させるために、ＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーと結合しているときに、ＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーの移動特性を変化させることができる。そのような試薬の一例としてボトロセチンがある。
【０１２８】
上記の方法は、分子量が１７６，０００Ｍｒで、ｖＷＦフラグメントを含むかまたは含まないため、高分子量のｖＷＦ上のＡＤＡＭＴＳ１３の蛋白分解作用に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布を決定するために実行できる。
【０１２９】
ＥＱＥＬＳを利用するときは、光が生理学的サンプルを照射し、散乱光出力を生じる。散乱光出力を処理して、（ｉ）照射光に対する散乱光出力の散乱光シフトおよびドップラーシフト、および（ｉｉ）ＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＷｖＷＦの分解で生じるｖＷＦマルチマーの移動度、を決定できる。
【０１３０】
上述の方法は、ＴＴＰ、ＨＵＳ、ＴＴＰ／ＨＵＳおよび急性冠動脈症候群、糖尿病、高血圧、月経過多、腎不全など、ｖＷＦを放出する内皮の異常機能の原因となるあらゆる病状の診断にも有用である。
【０１３１】
ＴＴＰ、ＨＵＳおよびＴＴＰ／ＨＵＳなどのｖＷＦを代謝するのに有効な酵素が欠損または不足していることに関連する病状または生理状態の患者を治療でき、および／または治療の有効性を決定できる。患者には酵素の欠損または不足を抑制する治療薬を投与できる。酵素が正常な被験者に存在する種類の生理学的サンプルを得ることもできる。所定量のＨＭＷｖＷＦを生理学的サンプルに加え、その後ＥＱＥＬＳ（電気泳動準弾性光散乱法）、ＰＣＳ（光子相関分光法）等またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）を含む静的光散乱法および／または動的光散乱法などによって処理して、酵素によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度と粒度分布とを決定できる。その後、治療薬の効果の有無を、ｖＷＦマルチマーの電気泳動度と粒度分布に基づいて決定できる。
【０１３２】
そのような治療方法は、分子量が１７６，０００ＭｒのｖＷＦフラグメントを含むかまたは含まないため、ｖＷＦマルチマーの電気泳動度と粒度分布とを決定する処理を含むことができる。
【０１３３】
そうでない場合、治療方法は、上述の診断方法で記載したように、例えば生理学的サンプルに対して、病状および生理状態などの同様の態様を含むことができる。酵素はＡＤＡＭＴＳ１３を含んでもよく、治療薬は患者の酵素の量の増加に効果的な薬剤を含むことができる。
【０１３４】
図１および図２に示すシステムなどの、本明細書で述べる種々の手術を実行するシステムも提供できる。
【０１３５】
被験者を、ｖＷＦの分解を調整する酵素の欠損または不足に関連する病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあると特定するシステムは、酵素が正常な被験者に存在するタイプの生理学的サンプルを被験者から得る手段、および生理学的サンプルに所定量のＨＭＷｖＷＦを加える手段とを備えることができる。これらの手段は生理学的サンプルが収集される容器またはガラス瓶を含むことができ、容器またはガラス瓶は特定量のＨＭＷｖＷＦを収容する。サンプルは静脈穿刺、組織診、組織培養、細胞内容物、組み換えプロセスなどから得ることもできる。
【０１３６】
システムは、さらに、所定量のＨＭＷｖＷＦが加えられた生理学的サンプルを処理するよう配置されたサンプル処理装置を備えることもできる。サンプル処理装置は、ＥＱＥＬＳ（電気泳動準弾性光散乱法）、ＰＣＳ（光子相関分光法）等またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）を利用する分光計などの静的光散乱および／または動的光散乱分光計を含む。結果として生じるスペクトルは、例えば、自動ソフトウェアを用いて分析し、（ｉ）酵素によってＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度と粒度分布を決定し、および／または（ｉｉ）ｖＷＦマルチマーの電気泳動度と粒度分布に基づいて、酵素の欠損または不足に関連する病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあると被験者を特定するのに有用な相関出力を得る、ことができる。
【０１３７】
ＥＱＥＬＳ、ＰＣＳ等またはＣＺＥなど、本明細書で記載した静的光散乱法および動的光散乱技法は、市場で入手可能な、その構造および操作が本発明の種々の態様または実施形態の実現に容易に適用可能な処理装置であってもよい。例えば図２に関して述べたように、一般用のプログラム可能なコンピュータシステム、マイクロプロセッサ、レジスタ、記憶装置、出力表示装置および端子などの、任意の適切なハードウェアおよびソフトウェア部品およびアセンブリを機能的に配置して、本明細書で記載した電気泳動度および／または粒度分布分析を実行でき、および／またはそのような電気泳動分布の決定に基づいて出力を提供できる。
【０１３８】
本発明の別の実施形態は、被験者のｖＷＦの分解を調整する酵素の欠損または不足を迅速に決定する分析キットに関する。キットは、酵素が正常な被験者に存在する種類の所定量の生理学的サンプルを被験者から収集することを含む。キットはまた、所定量の生理学的サンプルに加えるための所定量のＨＭＷｖＷＦも含むことにより、酵素によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度および粒度分布を分析するＥＱＥＬＳ（電気泳動準弾性光散乱法）、ＰＣＳ（光子相関分光法）等またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）を含む静的光散乱法および動的光散乱法用の分析サンプルを生成し、それによって、被験者の酵素の欠損または不足を決定できる。さらにキットを使用して、ｖＷＦマルチマー分布を得ることができ、および／またはコラーゲン結合、ｖＷＦ抗原、第ＶＩＩＩ因子結合などを検出できる。
【０１３９】
生理学的試料は、分析手順で使用されるまで、容器、ガラス瓶または生理学的試料を収容して保存するための容器などの適切な手段であればいずれの手段によって収集してもよい。所定量のＨＭＷｖＷＦを第２容器またはガラス瓶に収容してもよく、そこから高分子量のｖＷＦが生理学的試料を保管する容器またはガラス瓶に収容してもよい（逆でもよい）。
【０１４０】
分析キットはさらに、迅速な決定を実行するための指示書を備え、および／または（ｉ）ＨＭＷｖＷＦおよび／または酵素によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーに結合し、（ｉｉ）それに結合されるとＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーの移動度特性を変化させる、試薬を含むことができる。ボトロセチンはそのような試薬の一例である。
【０１４１】
本発明の特定の実施形態においては、精製されたｖＷＦマルチマー分布分析が用いられる。例えば約１０μ未満の最小量のサンプルがｖＷＦ構造の分析に必要とされる。分析は、クエン酸デキストロース溶液（ＡＣＤ）ガラス瓶に集められた血液全体を遠心分離によって得られる人の血漿からの初期ｖＷＦ精製を用いて実行できる。患者の血漿はＣＬ−４Ｂを用いたクロマトグラフィーカラムに供給され、ｖＷＦを含む空間容積が集められる。代わりに、ｖＷＦを吸収するために免疫親水性のマイクロビーズが用いることもでき、ｖＷＦをビーズから溶出できる。高分子量（ＨＭＷ）のｖＷＦマルチマーは空間容量の主要部で見られ、後端部の低分子量（ＬＭＷ）のｖＷＦマルチマーが後に続く。ｖＷＦの一部が集められ、溜められ、分析される。最終的に作用する緩衝液は、例えば、ｐＨが７．４のとき、４０ｍＭのＮａＣｌと６．５ｍＭのトリスと５ｍＭのクエン酸ナトリウムとを含んでもよいが、緩衝液の組成、濃度およびｐＨはそのような技法を一般的に実現する際に大幅に変更してもよいことは理解されよう。作用する溶液は作用緩衝液でさらに希釈され、最終的に所望のｖＷＦ濃度（例えば、溶液の５から約２０μｇのｖＷＦ／ｍｌの範囲）を得る。
【０１４２】
血漿からの初期のｖＷＦ精製を必要としない別の方式として、血漿ｖＷＦマルチマーの分布分析は、ｖＷＦマルチマーの移動度を固有に修正して、ｖＷＦマルチマーを、高濃度で存在するアルブミン、免疫グロブリンおよびフィブリノゲンなどの他の血漿蛋白質と区別できるように、ｖＷＦを固有に結合する試薬を加えることを含む。特に、そのような分析技法の実施形態で有用なｖＷＦ移動度修正薬剤としては、そのような移動度修正に効果的な方法でｖＷＦマルチマーと結合するボトロセチン、アンツーラン、トリカルボン酸、コラーゲン、ヘパリンおよびモノクローナル抗体が挙げられる。
【０１４３】
図３は変質していない状態における正常なｖＷＦの電気泳動準弾性光散乱スペクトルの結果を示している。ｖＷＦの濃度は２０μｇ／ｍＬで、スペクトル捕集時間は２０秒であった。横軸は（μ−ｃｍ）／（ｖｏｌｔ−ｓｅｃ）の標準単位でのｖＷＦマルチマーの移動度を示す。縦軸は各ｖＷＦマルチマーの相対的な強度を示す。相対強度はｖＷＦマルチマーの濃度とヘテロダイン比との両方によって決定される。ヘテロダイン比とは散乱光と非散乱光との混合効率である。各マルチマーの濃度はサンプル中のｖＷＦの全濃度の生成物と、特定のマルチマーに対する曲線の下の面積に対する散乱包絡線下の全面積の比とから決定できる。各マルチマーの帯域の不均一性は、１／２高さでの帯域幅に対するＫのグラフから算定できる。さらに、個々のマルチマーに対応する帯域数の増加がＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法の電気泳動ゲルを用いて観察されるｖＷＦマルチマー帯域数の低減に対して示されている（図３の挿入画で示される）。
【０１４４】
本発明の分析方法のさまざまな実施形態の利点は、従来の分析と比較して、巨大分子の形状、大きさおよび分子量に関する情報を得るために予備的な過程を必要としないことである。
【０１４５】
ｖＷＦの電気泳動スペクトルを得ることにより、ｖＷＦマルチマーの多分散特性の結果として複数帯域スペクトルを得るができる。さまざまな大きさのｖＷＦマルチマーに一般に対応する複数帯域を、ジチオスレイトールを用いるｖＷＦマルチマーの解重合によって１つの主帯域に低減して、ｖＷＦマルチマーを形成する構成モノマーを接続するジスルフィド結合を分離できる。
【０１４６】
図４ａおよび図４ｂは、Ｚ平均粒径分布、すなわちサンプル内に存在する特定の大きさのマルチマーの数に対して描かれた粒径を示している。Ｚ平均は本発明を実現する際には平均の大きさをパラメータ化することが好ましい。この理由は、Ｚ平均は高分子量の種を強調し、それによって分解能を大幅に向上し、最大のｖＷＦマルチマー形状の物理的な詳細を提供する。
【０１４７】
本発明のｖＷＦの特性決定方法を有効に利用して、イオン強度、ｐＨ、温度および疎水性の効果によってｖＷＦの分子特性を決定できることは理解されるであろう。
【０１４８】
本発明の別の実施形態においては、サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３の存在、活性度および濃度を決定するために分析法、すなわちＡＤＡＭＴＳ１３電気泳動準弾性光散乱分析法を提供する。そのような実施形態の１つにおいては、高分子量のｖＷＦ（ＨＭＷｖＷＦ）マルチマーは機能、分子量および濃度に関して分離され、特性決定される。その後、患者サンプルは標準的なＨＭＷｖＷＦと混合される。正常なＨＭＷｖＷＦが分解しない場合、その試験は、患者はＡＤＡＭＴＳ１３が不足していることを示している。その後、正常な標準血漿と共にこの分析が繰り返される。このように、正常なＡＤＡＭＴＳ１３レベルと比較した不足率が算出される。ＨＭＷｖＷＦマルチマーの分解損失に加え、分析によって、結果を確認するための別のマーカとして、１７６，０００Ｍｒの固有のｖＷＦ分解フラグメントの存在を観察できる。
【０１４９】
一般に、少量の標準的な高分子量ｖＷＦが少量の患者の血漿に加えられる。その後、ｖＷＦが分解しているかどうかを判断するために試験され、分解している場合、固有のｖＷＦフラグメント（１７６，０００）が生成される。このフラグメントに対応する移動度はＡＤＡＭＴＳ１３による分解が進むにつれて大きくなる。分解していない場合、その結果から患者は酵素が不足していることがわかる。この分析は、以下のＴＴＰ／ＨＵＳ治療を含む、ＴＴＰ／ＨＵＳなどを診断する多数の用途にとって大きな価値がある。
【０１５０】
本発明の別の実施形態においては、ＥＬＳを用いたコラーゲン結合分析を提供する。この分析において、ｖＷＦはゲル浸透クロマトグラフ分析分離法を用いて患者から分離される。Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、ＶＩ型などの標準的なコラーゲンの型がこの方法の標準として用いられる。特定のコラーゲンの増加量が患者のｖＷＦサンプルに滴定される。結合中に変化が観察され、コラーゲン濃度に対して区分される。その後これらの結果が単一状態の結合モデルに適合される。結合不足の強度は算出された結合定数の異常性に反映される。分析によって、実際にコラーゲンを結合する特定のｖＷＦマルチマーを決定することもできる。
【０１５１】
本発明の別の実施形態においては、ＥＱＥＬＳを用いたｖＷＦノルマンディー分析法を提供する。ｖＷＦにおける少なくとも８点の突然変異が特定され、その結果凝固第ＶＩＩＩ因子の結合が不足する。ｖＷＦのＮｏｒｍａｎｄｙ分析法によって、そのような第ＶＩＩＩ因子の結合が不足した変異を有する患者を迅速に特定することができる。分析は患者から分離された正常なＨＭＷｖＷＦと精製された凝固第ＶＩＩＩ因子とを必要とする。精製された凝固第ＶＩＩＩ因子はｖＷＦ溶液に滴定され、凝固第ＶＩＩＩ因子の移動度の変化が観察される。このデータから結合定数が先の分析のように算出される。結合定数の分散は凝固第ＶＩＩＩ因子の結合不足の強度の尺度となる。
【０１５２】
ｖＷＦ抗原の測定は試料中に存在するｖＷＦの量に関係する。抗ｖＷＦ抗原はマイクロビーズと電子対を共有するように結合でき、マイクロビーズの電気泳動度の変化はｖＷＦ結合として観察できる。ビーズの電気泳動度の変化の程度はサンプル中に存在するｖＷＦの量にほぼ比例する。
【０１５３】
別の実施形態においては、本発明は内皮活性化の検出または損傷分析を提供する。内皮活性化および内皮損傷は、（ウィルス性、細菌性または菌性の）敗血症、急性冠動脈症候群、肝静脈閉塞病、医薬調整内皮反応、急性炎症などの多数の臨床状況において高い重要性を有する生理学的現象である。この分析では、ｖＷＦが患者から精製され、高分子量のｖＷＦマルチマーに対しておよび巨大ｖＷＦマルチマーに対して試験される。
【０１５４】
図５、図６および図７のデータによると、ｖＷＦが疎水性の環境にあるとき、伸張が生じる。図５に示されるように、イオン強度が低いとｖＷＦでの荷電グループに対して利用できる対イオン遮蔽がほとんどない。したがって、分子の低い拡散係数によって証明されるように、分子は拡大する。イオン強度が増すと、ｖＷＦの表面電荷の良好な選別が利用でき、ｖＷＦは大きな拡散係数によって証明されるように、より小型の形状をとることができる。
【０１５５】
図６に示されるように、温度変化は疎水性の結合に影響を与える。温度が低いと、ｖＷＦがより小型でより小さい流体力学上の直径を有する。温度が上昇すると、拡散係数は下がる。これはｖＷＦがより拡大されていることを示し、はるかに大きな流体力学上の直径によって確認される。
【０１５６】
図７を参照すると、溶媒の極性が弱くなるにつれて、誘電率は高くなる。大きいサイズの直鎖アルカンアルコールを加えることによって、ｖＷＦはその拡散係数の増加で示されるように、より小型になる。したがって、ｖＷＦの分子形状は溶媒の条件によって変わり得る。
【０１５７】
本発明の具体化におけるｖＷＦの検出および特性決定は、活性化された拡大状態においてｖＷＦを有利に利用する。この拡大状態は、ｖＷＦが生体内で循環すると仮定される、「毛玉」状態と時には称される小型で非活性の状態とは反対である。非活性状態の極めて小さい形態と比べて分子寸法がはるかに大きいため、拡大された活性状態は好ましい。
【０１５８】
したがって、本発明を、本明細書において種々の例示的な態様、特徴、および実施形態を参照して述べられてきたが、本発明はこれらに限定されることなく、むしろ、本明細書の開示に基づいて当業者に提示されるように、他の変形形態、修正形態および代替実施形態にまで拡大し、それらを包含することは理解されよう。したがって、本明細書の後に記載された特許請求の範囲は広く解釈され、本発明の精神および範囲内のそのような変形形態、修正形態および代替実施形態の全てを含むと解釈されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】本発明の実施形態による電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）分光計のブロック図である。
【図２】本発明の実施形態によるデータ処理システムのブロック図である。
【図３】非変性状態下での正常なｖＷＦを含むＥＱＥＬＳ試験における電気泳動スペクトル結果のグラフであり、サンプルにおける各ｖＷＦマルチマーの相対強度はマルチマー移動度の関数として示されており、単位は（μ−ｃｍ）／（ボルト−秒）で、比較のため同一のｖＷＦサンプルのＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ電気泳動ゲルを挿入している。
【図４ａ】ｖＷＦマルチマーのｚ平均の粒径分布のグラフであり、粒径はサンプル中のこのような粒径のマルチマーの数の関数として示されている。
【図４ｂ】ｖＷＦマルチマーのｚ平均の粒径分布のグラフであり、粒径はサンプルのこのような粒径のマルチマーの数の関数として示されている。
【図５】ＰＣＳにより決定されたｖＷＦの散乱に対するイオン強度の影響を示すグラフである。
【図６】本明細書に記載される分光分析法に基づく、ｖＷＦの分子形状に対する温度の影響を示すグラフである。
【図７】本明細書に記載される分光分析法に基づく、ｖＷＦの分子形状に対する溶媒極性の影響を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年７月７日に出願された、米国仮出願番号６０／４８５，５２６の優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、分光分析法、詳細には電気泳動スペクトル解析法についての方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）は多分散多重結合血漿糖蛋白であり、初期の血小板粘着および凝固第ＶＩＩＩ因子の輸送に関与する。ｖＷＦマルチマーが大きければ大きいほど、血小板粘着の促進により効果的であるため、ｖＷＦマルチマーの粒度(size)分布はその機能に重大な影響を及ぼす。しかし、超巨大マルチマーが存在すると、自発的血小板凝集および粘着が発生し、血栓症状態を生じる。
【０００４】
最近の研究では、ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ ＴｈｒｏｍｂｏＳｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ １ ｍｏｔｉｆ（トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ））、肝臓内で主として合成されるプロテアーゼは、そのＡ２ドメイン内でｖＷＦの蛋白質分解を担うことが明らかになった。ＡＤＡＭＴＳ１３の不足は切断されていない超巨大ｖＷＦマルチマーが存在する状態、正常な血漿では一般に観察されない状態を引き起こす［Ｌｅｖｙ，Ｇ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１３：４８８−４９４（２００１）］。さらに、これらの研究は、このメタロプロテアーゼの抑制および活性のレベルは血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の患者の診断および治療に有効であることを提示している［Ｍａｎｎｕｃｃｉ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，９８：２７３０−３５（２００１）］。これらはＡＤＡＭＴＳ１３異常のいくつかの異なる病状発現である。先天性ＴＴＰでは、ＡＤＡＭＴＳ１３が量的に不足していることが判明している。後天性ＴＴＰでは、ＩｇＧ自己抗体は、ＡＤＡＭＴＳ１３を抑制するように形成されている。後天性ＴＴＰ／ＨＵＳ（溶血性尿毒症症候群）の他の形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は変動する濃度で存在している。例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３の不足は、子供の大腸菌感染、骨髄移植における肝静脈閉塞症およびさまざまな薬物毒性によって生じる。
【０００５】
ｖＷＦは日常的な診断での血液検査には現れないため、ｖＷＦの検査室診断および細分類は困難であった。したがって、医師は、各患者に対する最高およびもっとも安全な治療を確立するため、特定のｖＷＦ変種を決定するための特殊な診断血液検査を指示しなければならない。
【０００６】
現在、ｖＷＦ異常の診断についてはいくつかの種類の分析方法が存在する。このような分析での使用においては、正しい診断のために、ｖＷＦ抗原を特定しなければならない。これらの分析は、高親和性抗体に対する放射標識抗原および非標識抗原の競合結合を含む放射標識免疫検定法（ＲＩＡ）、抗原−抗体反応を測定する酵素−基質相互作用の呈色反応生成物を用いる酵素免疫測定法（ＥＩＡ）および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）［米国特許５，２０２，２６４を参照］、およびＦｖ領域でラテックス粒子に結合する抗体を利用、かつ血液のサンプルに存在する抗原との相互作用に対するＦａｂ領域を示すラテックス免疫測定法（ＬＩＡ）［米国特許第５，５８５，２７８号を参照］などのさまざまな分析方法を含む。
【０００７】
上述の免疫学的検定法は簡単で幅広く使用されているが、いくつかの欠点を持つ。上述の免疫学的検定法は標識抗体を必要とするが、それらは極めて高価であり、放射性標識を使用する場合、本質的な危険を伴う。これに加えて、抗原との蛋白の非特異結合の発生、抗体複合体の形成、および一般的に使用されるさまざまな種類の固体支持体の存在は、バックグラウンドノイズを増加し、感度を低減し、その結果、偽陽性判定がなされることになる［Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８８］。
【０００８】
従来は、病状に関するｖＷＦの異常性はさらに確認され、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ電気泳動を用いてｖＷＦの多重結合構造および粒度分布分析により細分類される。原則的には、４０程度の異なる分子量のポリマーは、５００，０００および２０００万Ｍｒの上限分子量のダイマーに基づいて可能である。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ電気泳動を用いたｖＷＦマルチマーの粒度分布の現在の評価では、１０から１５の明らかに大きな電気泳動易動度を示す。この従来および現在の方法を用いて、抗原の電気泳動的に分離される亜種のエピトープを検出し、電気泳動移動度によるマルチマーのスペクトル分布結果を得る。公知の分子量基準の電気泳動法により、抗体が生成される各抗原の結合の分子量の決定が可能になる［Ｃｏｌｍａｎ ＲＷ．Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，４th ｅｄｉｔｉｏｎ； ｐｐ ８２５−８３７］。この方法の欠点は、高コスト、分析の完了に通常３〜５日を要すること、マルチマーの識別のための放射線、蛍光または化学ルミネセンスを用いた抗ｖＷＦ抗体を標識付けするレポータグループの必要性、および超巨大分子量のマルチマーの分解能の低減を含む。
【０００９】
さらに、ｖＷＦに関する疾患は非特異的出血症状の持続性の診断問題を含む。血漿ｖＷＦ濃度の正常値の範囲が広いため、ｖＷＦ：ＲＣＯ（リストセチン補助因子）およびｖＷＦ：Ａｇに対する低い値が存在する場合、ｖＷＦに対する現在の診断試験は値が限定される。さらに困難なことは、出血回数がｖＷＦレベルに比べてさらに広い通常変動を有するという事実である。したがって、以前の公知の試験では、ｖＷＦ関連の疾患の正確で信頼できる診断に不可欠である高い精度を実現できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現在、低コストで効率が高く、医師、研究室および患者に有利な詳細な分子情報を提供する診断試験に対する強い要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の実施形態によれば、ｖＷＦマルチマーを物理的に特性決定する方法およびシステムが提供される。ｖＷＦマルチマーの分布、濃度、拡散係数および粒度が決定される。例えば、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布が決定される。電気泳動移動度の分布は、例えば、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの粒度、濃度、拡散係数、重量および分布の計算に使用される。
【００１２】
本発明の特定の実施形態においては、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）マルチマーの電気泳動移動度の分布を分析する方法は、複数のｖＷＦマルチマーを含むサンプル媒体を生成することを含む。分離されたｖＷＦマルチマーを生成するために、ｖＷＦマルチマーは、サンプル媒体に電界を印加して、サンプル媒体中で電気泳動移動度によって電気泳動的に分離される。サンプル媒体中で分離されたｖＷＦマルチマーに光を照射して散乱光を発生する。散乱光は検出され、分離したｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布は検出された散乱光から決定される。
【００１３】
特定の実施形態においては、ｖＷＦ異常および／または疾患は電気泳動移動度の分布に基づいて特定される。ｖＷＦ異常および／または疾患はＩ型ｖＷＦ疾患、ＩＩ型ｖＷＦ疾患、ＩＩＩ型ｖＷＦ疾患、亜種ＩＩＡ型ｖＷＦ疾患、亜種ＩＩＢ型ｖＷＦ疾患、亜種ＩＩＭ型ｖＷＦ疾患、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）から成るグループから選択される。例えば、電気泳動移動度の分布は、一連のｖＷＦ異常および／または疾患に対応するパラメータを比較する。パラメータは、一連のｖＷＦ異常および／または疾患に対応する複数のスペクトルに基づいている。特定の実施形態においては、ＡＤＡＭＴＳ異常および／または疾患は、電気泳動移動度の分布に基づいて特定される。
【００１４】
特定の実施形態においては、サンプル媒体の光子相関分光（ＰＣＳ）スペクトルが生成され、分子の粒度分布はサンプルのＰＣＳスペクトルに基づいて決定される。ｖＷＦ異常および／または疾患は分子の粒度分布および電気泳動移動度の分布に基づいて特定される。したがって、電気泳動および非電気泳動の分光分析法を組み合わせて、サンプル媒体中にｖＷＦ異常が存在するかどうかを決定できる。
【００１５】
電気泳動移動度の分布の決定は電気泳動準弾性光散乱分析法により実行される。例えば、位相シフトは測定された自己相関関数から散乱光において検出される。ドップラーシフトは入射光と比較した散乱光において検出できる。次に、散乱粒子の電気泳動移動度が計算される。
【００１６】
光源はコヒーレント光源である。サンプル媒体は容器で提供され、電気泳動的な分離工程が容器内のサンプル媒体を用いて実行される。露出工程および検出工程は両方とも、容器内の溶液を用いて実行される。特定の実施形態では、容器はキャピラリーゾーンを画定するかまたは含み、例えばキャピラリーゾーン電気泳動法により、サンプル媒体中のｖＷＦ異常および／または疾患のキャピラリー分光分析決定を促進する。
【００１７】
特定の実施形態においては、電気泳動的に分離する工程、露出工程および検出工程は、合計時間が５分未満、例えば１分未満で実行される。
【００１８】
決定された電気泳動移動度の分布は１０００万、２０００万またはそれ以上までの分子量を有するｖＷＦマルチマーを含む。
【００１９】
特定の実施形態においては、サンプル媒体を生成する工程は、血漿サンプルを準備し、血漿サンプルからｖＷＦを精製してサンプル媒体を生成することにより実行される。フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）マルチマーは人体のフォンビルブランド因子マルチマーである。
【００２０】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル媒体中のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）分解酵素の存在を決定する方法は、ある一定量のｖＷＦマルチマーを含むサンプル媒体を生成することを含む。酵素がサンプル内に存在する場合、ｖＷＦ分解酵素を含む疑いのある標本をサンプル媒体に加えて、サンプル媒体中の高分子量のｖＷＦマルチマーを分解させる。ｖＷＦマルチマーは、サンプル媒体に電界を印加して、サンプル媒体中で電気泳動移動度により電気泳動的に分離され、分離されたｖＷＦマルチマーが生成される。サンプル媒体における分離されたｖＷＦマルチマーに光を照射して散乱光を発生する。散乱光は検出され、分離されたｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布は検出された分散光から決定される。ｖＷＦ分解酵素が存在するかどうかは電気泳動移動度の分布から決定される。
【００２１】
特定の実施形態においては、サンプル媒体の光子相関分光（ＰＣＳ）スペクトルが生成される。分子の粒度分布はサンプル媒体のＰＣＳスペクトルに基づいて決定される。ｖＷＦ分解酵素が存在するかどうかは分子の粒度分布および電気泳動移動度の分布から決定される。ｖＷＦ分解酵素はＡＤＡＭＴＳ１３であり得る。
【００２２】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル媒体中のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）マルチマーの電気泳動移動度分布を分析するシステムは、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）分光計を含み、このＥＱＥＬＳは、ｖＷＦマルチマーを電気泳動的に分離し、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーについてのＥＱＥＬＳスペクトルを生成するように構成されたＥＱＥＬＳコントローラを備える。ＥＱＥＬＳ分析器はＥＱＥＬＳ分光計と通信する。ＥＱＥＬＳ分析器は、ＥＱＥＬＳスペクトルから分離されたｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布を決定するように構成される。システムは使用して、ここで述べたさまざまな工程を実行するために使用される。特定の実施形態では、ＥＱＥＬＳ分光計はさらに、サンプル媒体の光子相関分光（ＰＣＳ）スペクトルを発生するように構成される。例えば、ＥＱＥＬＳ分光計における電界はＰＣＳ分光分析法に対してはアクティブにされなくても良い。ＥＱＥＬＳ分析器はさらにサンプル媒体のＰＣＳスペクトルに基づいて分子の粒度分布を決定するように構成される。
【００２３】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布の特性を検出する方法は、サンプル媒体にエネルギーを供給して、エネルギーの相互作用出力を生成する。サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布および／または粒度分布はエネルギーの相互作用出力に基づいて決定される。
【００２４】
例えば、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの存在、欠損および／または相対量はｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布および／または粒度分布に基づいて決定される。供給エネルギーはサンプル媒体への照射光エネルギーを含む。ｖＷＦマルチマーの粒度分布は光子相関分光法（ＰＣＳ）の静的光散乱、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）および／またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）の動的光散乱を用いて決定される。
【００２５】
サンプル媒体は、血漿またはその成分および／または希釈緩衝食塩液を含む。エネルギーの相互作用出力は、電気泳動または非電気泳動（ＰＣＳ）状態下で生成される。
【００２６】
サンプル媒体は被検者から得られる血漿サンプルにある一定量の高分子量ｖＷＦを追加することにより生成できる。血漿サンプル中のｖＷＦ代謝酵素の存在または欠損はサンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて決定される。ｖＷＦ代謝酵素はＡＤＡＭＴＳ１３および／または内皮からのｖＷＦの放出においてｖＷＦを代謝する酵素を含む。１７６，０００Ｍｒの分子量を有するｖＷＦ代謝生成物フラグメントの存在または欠損はｖＷＦ代謝酵素の存在または欠損を決定するために測定される。被検者に対する診断は、被検者から得られる血漿サンプル中のｖＷＦ代謝酵素の存在または欠損に基づいて決定できる。被検者の診断は１７６，０００Ｍｒの分子量を有するｖＷＦ代謝生成物フラグメントの存在または欠損に基づいて決定できる。例えば、血漿サンプル中のｖＷＦ代謝酵素の不足に関連する生理状態の存在または欠損、または感受性は、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて決定される。血漿サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３の不足に関連する生理状態の存在または欠損、または感受性は、サンプル媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて決定される。生理状態は、ＴＴＰ、ＨＵＳ、ＴＴＰ／ＨＵＳから成るグループから選択される病状、内皮の異常作用がｖＷＦを放出する病状、急性冠動脈症候群、糖尿病、高血圧、月経過多および／または腎不全、を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、被検者は被検者内のｖＷＦ代謝酵素の存在を増加するのに効果的な治療薬および／または処理を施される。ｖＷＦの電気泳動移動度および／または粒度分布は、治療薬および／または処理を施される前の被検者から取られた第１サンプルおよび治療薬を投与された後の被検者から取られた第２サンプルから決定される。治療薬および／または処理の効果は、第１および第２サンプルからｖＷＦの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて評価される。治療薬は、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３、合成ＡＤＡＭＴＳ１３、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体、および合成ＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体から成るグループから選択されたＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼの、潜在的に治療に効果的な量を含む。ｖＷＦ代謝酵素はＡＤＡＭＴＳ１３を含む。
【００２８】
本発明の別の実施形態によれば、ＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または不足に関連する病状または生理的状態を発生する危険性を有するかまたは危険性がある被検者を特定する方法は、生理学的なサンプルであって、その中に正常な被験者にはＡＤＡＭＴＳ１３が存在するタイプの生理学的なサンプルを被検者から取得すること、サンプル媒体を提供する高分子量（ＨＭＷ）ｖＷＦのある一定量を生理学的なサンプルに追加すること、サンプル媒体に静的および／または動的光散乱分光分析を実行して、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＶｖＷＦの分解に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布を決定すること、およびｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて、ＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または不足に関連する病状または生理状態の危険性を有するかまたは危険性がある被検者を特定することを含む。
【００２９】
静的および／または動的光散乱分光法は、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）、光子相関分光法（ＰＣＳ）および／またはキャピラリーゾーン電気泳動法（ＣＺＥ）を用いて実行される。
【００３０】
ｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布および／または粒度分布が１７６，０００Ｍｒの分子量を有するｖＷＦフラグメントを含むかどうかも決定できる。サンプル媒体は、例えばクロマトグラフによる精製を利用して精製できる。
【００３１】
サンプル媒体は試薬を含み、この試薬は、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーに結合し、またそれらに結合したときにＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーの移動性特性を変更して、電気泳動移動度および粒度分布を高精度で決定できる。試薬はＢｏｔｒｉｃｅｔｉｎを含む。
【００３２】
本発明の別の実施形態によれば、ｖＷＦを代謝するのに効果的な酵素の欠損または不足に関連する病状または生理状態を伴う被検者を治療する方法は、酵素の欠損または不足を抑制する治療薬を被検者に投与すること、治療薬の投与後に酵素が正常な被検者に存在する種類の生理的学サンプルを被検者から取得すること、ある一定量のＨＭＷｖＷＦを生理学的サンプルに追加すること、酵素によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布を決定するためにサンプル媒体に対して静的および／または動的光散乱分光分析を実行すること、およびｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて治療薬の有効性または無効性を決定することを含む。
【００３３】
治療薬は被検者における酵素の量を潜在的に増加する作用薬を含む。コラーゲン結合分析はｖＷＦマルチマーの特性決定のために使用される。ｖＷＦの不完全結合凝集第ＶＩＩＩ因子はｖＷＦ Ｎｏｒｍａｎｄｙ分析を用いて特性決定される。さらに、ＨＭＷｖＷＦマルチマーおよび超巨大ｖＷＦマルチマーに対するｖＷＦも特性決定される。病状または生理状態は、ｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいて、敗血症、急性冠動脈症候群、静脈閉塞症、薬物中毒および急性炎症から成るグループから選択された、病状または生理状態を含めて診断される。
【００３４】
本発明の別の実施形態によれば、ｖＷＦの代謝を調整する酵素の欠損または不足に関連する病状または生理状態を有するかまたは発生する危険性がある被検者を特定するシステムが提供される。システムは、生理学的サンプルであって、正常な被験者ではＡＤＡＭＴＳ１３が存在するタイプの生理学的サンプルを被検者から取得する方法、一定量の高分子量（ＨＭＷ）ｖＷＦを生理学的サンプルに加えてサンプル媒体を生成する方法、サンプル媒体に静的および／または動的光散乱分光分析を実行してＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＷｖＷＦの分解に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布を決定する方法、およびｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および／または粒度分布に基づいてＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または不足に関連する病状または生理状態を有するかまたは発生する危険性がある被検者を特定する方法、を含む。
【００３５】
別の実施形態によれば、被検者のｖＷＦ代謝を調整する酵素の欠損または不足の迅速な決定のための分析キットが提供される。キットは、生理学的サンプルであって、正常な被験者では酵素が存在するタイプのある一定量の生理学的サンプルを被検者から取得し、かつ生理学的サンプルに追加するある一定量のＨＭＷｖＷＦ取得する手段を含み、この手段により、ＥＱＥＬＳ（電気泳動の準弾性光散乱）、ＰＣＳ（光子相関分光法）等を含む静的および／または動的光散乱分光分析法のためのサンプル媒体、または酵素によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および粒度分布ＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）分析のためのサンプル媒体を生成し、これにより被検者における酵素の欠損または不足を決定できる。
【００３６】
特に、本発明の分析は、フォンビルブランド病、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）／溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）等を含む（ただし、これらに限定されない）ｖＷＦおよび／またはＡＤＡＭＴＳ１３に関連する疾患に対する被検対象、特に人間の被検者または他の哺乳類の被検対象をスクリーニングするのに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下に、添付図面を参照して本発明を詳細に説明し、本発明の好ましい実施形態を示す。しかし、本発明はさまざまな多様な形態で実現可能であり、ここに記述した実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本発明を詳細および完全に説明するものであり、当業者に本発明の範囲を完全に伝達するために提供される。同一参照符合は全体に渡って同一要素を指す。それぞれの図において要素は縮尺通りには描かれず、詳細を示すために拡大されている。
【００３８】
本明細書における本発明の詳細な説明で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明を限定することを目的としない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲に用いられるとおり、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈において特に指定しない限り、複数形も同様に含むものである。
【００３９】
本発明の実施形態は、ｖＷＦおよびｖＷＦ−代謝因子を含む媒体中の（例えば、生理学的サンプル中あるいは生理学的サンプルまたはその成分を含む溶液中の）、ＡＤＡＭＴＳ１３などのｖＷＦおよびｖＷＦ−代謝因子を迅速に特性決定する方法を提供する。ｖＷＦは分子量を変化させる一連のマルチマーとして血漿内に存在する高分子血漿糖蛋白である。さまざまな分光分析法を利用して、サンプル中のｖＷＦマルチマーを分析し、例えば、サンプル内のマルチマーの電気泳動移動度、分子量分布、分子粒度分布および／または拡散係数に基づいて、サンプルを特性決定できる。
【００４０】
本発明の実施形態は電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）分光分析に関して説明されているが、他の電気泳動相互スペクトル分析法（すなわち、電気泳動範囲で生物学的な粒子がスペクトルを生成するエネルギー媒体と相互に作用する分析法）および／または非電気泳動法も利用できることは理解されるであろう。電気泳動法を使用しない分光分析法は光子相関分光分析法（ＰＣＳ）を含む。
【００４１】
さらに、本発明の実施形態は励起光ビームに関して説明されているが、電磁エネルギー、音響エネルギー、超音波エネルギーまたは他の適切なエネルギー媒体を含む、他のエネルギー媒体も使用できる。例えば、電磁エネルギーは、可視光線、赤外線、紫外線および／またはＸ線の範囲などの、いずれかの適切なスペクトル範囲から使用できる。例えば、約２００ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する化学線は、電気泳動法においてｖＷＦマルチマーとの相互作用に対してエネルギー媒体として使用される。可視光線は、弾性光散乱および準弾性光散乱を含む光散乱分析法において使用される。紫外線は、例えば、毛細管流れ内の生物粒子に照射される紫外線のエネルギー源として紫外線レーザーを有する、キャピラリー電気泳動システムにおいて使用される。したがって、任意の適切なエネルギー源および対応するエネルギー媒体を使用できる。
【００４２】
特定の実施形態においては、サンプルから得られるスペクトル特性を用いて、高分子量ｖＷＦの分解、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および血栓性血小板減少性紫斑病／溶血性尿毒症症候群（ＴＴＰ／ＨＵＳ）などの、さまざまな状態を診断する。これらの状態の治療もまた、例えば、治療前および治療後に取得したスペクトルの比較により評価される。さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３を含むｖＷＦ代謝作用薬などの、ｖＷＦマルチマーと相互作用する薬剤は、ここに説明される分光分析法を使用して評価される。例えば、薬剤をサンプルに追加する前および追加後にｖＷＦからのスペクトルを収集することにより、ｖＷＦマルチマーへの薬剤の影響を比較できる。
【００４３】
本発明を実行することによりサンプルを収集される被検者は、医療および診断目的のための人間の被検者、ならびに、他の動物の被検対象、特に、犬、猫、鼠、豚、馬、羊、牛、猿等の、獣医学および薬剤開発の目的のため哺乳類の被検対象を含む。
【００４４】
フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）は公知であり、例えば、米国特許第６，５３１，５７７号、第６，５１８，４８２号、第６，４６５，６２４号、第６，４１０，２３７号、第６，１０３，６９３号および第６，０４０，１４３号に記載されており、上記特許の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。本発明で用いられるｖＷＦは天然または組み換え型であり、天然ｖＷＦは診断目的のため被検者から収集されるかまたは治療組成の調製のため被検者から収集される。
【００４５】
ＡＤＡＭＴＳ１３（（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ ｔｙｐｅ）、 ｗｉｔｈ ＴｈｒｏｍｂｏＳｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ １ ｍｏｔｉｆ）トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（レプロリジンタイプ））は公知であり、例えば、Ｇ．Ａｎｔｏｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．７０，２５７−２６２（２００３），Ｒ．Ｓｃｈｎｅｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０１，１８４５−１８５０（２００３），Ａ．Ａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７１，３１８−３２２（２００２），Ｓ．Ｃａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ２８３，４９−６２（２００２），Ｘ．Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，およびＪ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６，４１０５９−４１０６３（２００１）に記載されている。本発明の実施形態により使用されるＡＤＡＭＴＳ１３または他のＡＤＡＭＴＳ酵素は天然または組み換え型であり、天然酵素は診断目的のため被検者から収集されるかまたは治療組成の調製のため被検者から収集される。
【００４６】
本発明の実施形態を用いて、高分子量ｖＷＦマルチマーおよび超巨大ｖＷＦマルチマーを検出できる。通常の範囲のｖＷＦマルチマーの重量は５００，０００〜２０，０００，０００である。１０００万から２０００万の分子量は「高分子量」（ＨＭＷ）のマルチマーと見なされる。ここに使用されている通り、ｖＷＦに関する用語「超巨大マルチマー」は２０００万Ｍｒより大きな分子量を有するフォンビルブランド因子マルチマーを意味する。超巨大マルチマーは２０００万より大きなモノマーを含み、１００，０００，０００と同程度の重さであることもあり、本明細書では、「高分子量マルチマー」または「ＨＭＷ」などの状態に含まれる。
【００４７】
以下の説明の背景として、次にさまざまなスペクトル技法を説明する。
【００４８】
動的光散乱（ＤＬＳ）は、不均一な（粒子を含む）媒体に照射される光の粒子介在散乱および特定の散乱角における散乱ベクトルの時間自己相関関数の測定を含む。散乱強度および自己相関関数から、粒径（流体力学の半径）、形状因子および／または粒子を含む媒体の粒子の他の特性を決定する。動的光散乱はまた光子相関分光分析（ＰＣＳ）と称される。
【００４９】
電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）は、サンプルに電界を印加して媒体中の粒子を特性決定する動的光散乱法であり、この方法は電気泳動を利用して、粒子は印加された電界内での粒子の運動により、粒子の特性を決定する。キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は高電界を用いて、電気浸透により細管を通り駆動される粒子の移動を誘導する。次に、粒子は粒度および粒子の表面電荷に関して特性決定される。これらの技法はｖＷＦマルチマーを含む媒体中のｖＷＦマルチマーの特性決定のために使用でき、これら技法では重畳する電界を利用して、これらマルチマーを容易に電気泳動分析できる。溶液中のマルチマーの電気泳動移動度はマルチマーの粒度、マルチマーの総電荷および重畳電界の強度に依存する。
【００５０】
したがって、本発明の実施形態は、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）および／または、光子相関分光法（ＰＣＳ）と称される動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて実行される。さらに、他のエネルギーの相互作用法も使用される。用語「準弾性」は、ここに説明されている分光分析法における光子と粒子の間の相互作用を説明するために使用される（このような相互作用は完全に弾性ではないためである）。すなわち、光子が散乱粒子に衝突すると、比較的小量のエネルギーを失う。
【００５１】
ここに説明されている技法で使用される入射光は、一般にコヒーレントである。コヒーレント光は、一般的に、光または光子として定義され、全て、「同相」である本質的同一波長を有する。コヒーレント光はレーザーから得られる。したがって、入射光は変化しないコヒーレント光を用いて、散乱粒子を照射する。インコヒーレント光を使用することもできる。
【００５２】
ここで使用されているとおり、散乱光は、対象物からの非弾性（準弾性を含む）または弾性散乱を指す。光子は一般的に、電界および磁界の直交配列から生じる波の属性を有する。光散乱においては、光が粒子に当たるとき、電界により粒子内の電子が上下に運動する。電子の振動運動により第２の電界が形成される。この電界は散乱光を形成する。散乱光は、入射光により引き起こされた散乱粒子の電子振動運動から生じる光を含む。
【００５３】
入射光の光子が散乱粒子と衝突すると、光子は少量のエネルギーを失い、その結果、入射光の周波数がわずかに低下する。入射光と比較される散乱光のこの「位相シフト」（ドップラーシフトとも称される）は測定の基本である。周波数シフトは、光検出器で散乱光と非散乱光を混合することにより検出される。「ビート」結果およびビート周波数の大きさは一般に散乱粒子の移動度に比例する。ＥＱＥＬＳの場合、ビート周波数の大きさは粒子の電気泳動移動度に比例する。対照的に、ＰＣＳまたはＱＥＬＳでは、粒子運動はその拡散係数に比例する。
【００５４】
ここで使用される電気泳動移動度は重畳電界の効果により生じる浮遊荷電粒子に生じる運動を指し、この運動は粒子に対する溶剤の粘性抵抗と釣り合う。電気泳動移動度は、大きさ、重量および分布の計算のため使用される。なお、粒径は一般にその拡散係数と等価である。
【００５５】
あらゆる特定理論に拘束されないで、粒子がＤｅｂｙｅ Ｈｕｃｋｌｅ距離に比べて大きい場合、表面電荷は一般に粒子の動きを決定する。Ｄｅｂｙｅ Ｈｕｃｋｌｅ距離は浮遊粒子の帯電表面全体に渡って形成された溶剤の対イオン層により画定され、その層の厚みは粒子の表面電荷の大きさおよび浮遊溶液のイオン強度に依存する。
【００５６】
自己相関関数は多数の粒子（集団）の相対位置の相関を求めるための統計力学法であり、例えば、一般式を有する。
【数１】
ここで、τは時間増分、Ｉは散乱強度、およびｔは時間である。特定の実施形態では、自己相関関数の時間依存性を用いて、散乱粒子の集団の時間経過に伴う運動を決定する。
【００５７】
マルチマーの分子量の決定に対する電気泳動移動度の計算は次のとおり実行される。特定の実施形態においては、試験結果は（１）周波数シフト、（２）ゼータ電位および／または（３）電気泳動移動度を含む定量表示のいくつかの異なる形式で示される。データもまた、（１）拡散係数、（２）固有の寸法および／または（３）分子量および／または粒度、を含む形式で提示できる。後者の２つの量は各マルチマーの拡散係数から計算される。各マルチマーの拡散係数は次のとおり決定される。移動度スペクトルにおける各マルチマーが分子量に対して均一である場合（電気泳動法により得られるものと同様に）、スペクトルの各帯域の形状または線形状はローレンツ形でなければならない。ローレンツ形の線形状は次のとおり記述される。
【数２】
【００５８】
特定のマルチマーを表す、個々の帯域の１／２幅はＳ2Ｄであり、グラフ化することにより、それぞれの１／２の幅に対するｓｉｎ2（θ）Ｄを決定できる。したがって、電気泳動移動度分布は計算されたおよび／または表示された電気泳動移動度分布から直接決定され、および／または直接表示されるか、あるいは、上に説明されているとおり別の定量表示から間接的に決定および／または表示できる。
【００５９】
本発明の実施形態はＡＤＡＭＴＳ１３のようなｖＷＦマルチマーおよびｖＷＦ代謝因子を検出および分析する迅速な方法を提供する。本発明の実施形態はＴＴＰおよびＴＴＰ／ＨＵＳの診断および／またはこのような状態の治療の効果を監視するのに使用される。本発明の実施形態により分析される多重結合ｖＷＦ種は、分子量、分子配列、分子構造、および／またはアミノ酸シーケンスにおいて相互に異なる分子形態のｖＷＦをさまざまに含む。
【００６０】
本発明の実施形態は、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、および光子相関分光法（ＰＣＳ）と称される動的光散乱法（ＤＬＳ）を含むさまざまな技法により、溶液中に浮遊するｖＷＦマルチマーおよび／または溶液内のＡＤＡＭＴＳ１３などのｖＷＦ代謝因子を評価するのに適する。
【００６１】
各ｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度は、例えば、本発明の例示の実施形態において以下に記載されるとおり、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）により決定される。
【００６２】
典型的なＥＱＥＬＳ分光計１０は図１に示されている。分光計１０は、サンプル２０に光線を照射するレーザー１４を含む。サンプル２０は、サンプル２０に電界を提供する２つの電極２８の間に配置される。サンプル２０中の荷電粒子は、電界を印加されたために運動する。例えば、サンプル２０はｖＷＦサンプルなどの対象粒子が溶液内に存在するかまたは浮遊しているサンプル媒体を含む。例えば、サンプル媒体は、血漿、血漿生成物、蛋白質、核酸、細胞、細胞生成物、多糖類等を含む。サンプル２０中の粒子運動はレーザー１４により提供される一般的なコヒーレント光から準弾性散乱により検出される。入射光子の一部はサンプル２０中の運動粒子に衝突する。この衝突が発生すると、光子から少量のエネルギーが放出され、結果として、散乱光の周波数がわずかに低下する。この散乱光は検出器２６により検出される。
【００６３】
図１に示されているとおり、分光計１０は、ＥＱＥＬＳ信号分析器２２を含むプロセッサ１２に接続されている。プロセッサ１２は分光計１０からの信号を受け取り、この信号はＥＱＥＬＳ信号分析器２２により分析される。例えば、検出器２６により検出された散乱光は分析され、わずかな周波数シフトの大きさが決定される。この周波数シフトは、一般にサンプル２０中の粒子運動の速度に比例し、ドップラーシフトとして検出される。信号分析器２２はヘテロダイン法によりドップラーシフトを測定し、ヘテロダイン法では、周波数シフトされない光を散乱光と混合して「ビート」を生成する。この信号は自己相関関数として測定され、次にフーリエ変換して、解釈のためにパワースペクトルを求める。
【００６４】
特定の実施形態では、ＥＱＥＬＳ分光計１０を用いて、サンプル２０中に含まれるＡＤＡＭＴＳ１３などの、ｖＷＦマルチマーおよび／またはｖＷＦ代謝因子を検出および／または特性決定する。ＥＱＥＬＳ分光計１０からのスペクトルは、高分子量ｖＷＦ、ＴＴＰおよび／またはＴＴＰ／ＨＵＳの低下などのさまざまな状態の診断に使用される。ＥＱＥＬＳ分光計からのスペクトルは治療前および治療後に比較され、所定の治療における治療上の値を評価する。
【００６５】
特定の実施形態において、ＥＱＥＬＳ分光計１０を用いて、サンプル媒体中にｖＷＦマルチマーを含むサンプル２０に対するＥＱＥＬＳスペクトルを検出する。ＥＱＥＬＳスペクトルは既知のスペクトルのデータベースと比較される。上記既知のスペクトルのそれぞれは、正常なｖＷＦまたはｖＷＦに関するさまざまな異常または疾患などの、既知の複数のｖＷＦ状態の１つに対応する。媒体中のｖＷＦマルチマーは比較に基づいて特性決定される。
【００６６】
別の特定の実施形態においては、ＥＱＥＬＳ分光計１０を用いて、ＡＤＡＭＴＳ１３などのｖＷＦ代謝因子を評価または特性決定する。
【００６７】
図２は、本発明の実施形態によるシステム、方法、およびコンピュータプログラム生成物を示す、データ処理システムの典型的な実施形態のブロック図である。データ処理システム１１０は、分光計１２５およびメモリ１１４と通信するプロセッサ１２０を含む。分光計１２５に使用される典型的なＥＱＥＬＳシステムは図１に示されている。しかし、他の種類の分光計、例えばＰＣＳ、ＤＬＳ、ＥＱＥＬＳ分光計またはＣＺＥ装置なども使用できることは理解されるであろう。図２に示されているとおり、分光計１２５はサンプル修正システム１３５を含む。サンプル修正システム１３５は、ｖＷＦ代謝因子（例えばＡＤＡＭＴＳ１３）または治療薬などの物質をサンプルに追加することなどにより、分光計内のサンプルを修正するように構成される。
【００６８】
特定の実施形態においては、分光計１２５および／またはサンプル修正システム１３５は省略される。例えば、サンプルは手動で修正できるか、または、スペクトルはサンプル修正システム１３５によりサンプルを修正することなく、本発明の実施形態により得ることができる。特定の実施形態では、分光計１２５は省略され、別の分光計から取得されたスペクトルはデータ処理システム１１０に提供されて、分析される。
【００６９】
サンプル修正システム１３５はサンプルを修正できるが、この修正は、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３などｖＷＦ代謝作用薬の追加、溶液の追加、サンプル媒体のｐＨの変更、サンプル媒体の温度の変更、サンプル媒体のイオン強度の変更、対象粒子の結合特性を変更する薬剤の追加、および／または対象のｖＷＦ粒子に対する合成薬剤の追加によりなされる。結合剤の例は、抗体、細胞、微生物、リガンド、蛋白質、ペプチド、核酸、多糖類、脂質、リポ蛋白、ハプテン、および薬剤化合物を含む。サンプル精製は、各種の親和性（免疫のまたはリガンドの）方法のいずれかにより達成される。サンプルに結合する抗体またはペプチドはカラムマトリクスまたはミクロビーズと共有結合できる。次にサンプルは親和剤により結合され、所望の溶液に移される。サンプルは、その後、親和剤から抽出され特性決定される。
【００７０】
プロセッサ１２０はアドレス／データバス１４８を介してメモリ１１４と通信する。プロセッサ１２０は任意の市販または特注のカスタムマイクロプロセッサである。メモリ１１４は、データ処理システム１１０の機能を実行するために使用されるソフトウェアおよびデータを含むメモリデバイスの全体的な階層の見本である。メモリ１１４は、次の種類のデバイス、すなわちキャッシュ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、ＳＲＡＭおよびＤＲＡＭを含むが、これには限定しない。
【００７１】
図２に示されているとおり、メモリ１１４はデータ処理システム１１０内で使用されるソフトウェアおよびデータのいくつかのカテゴリ、すなわち、オペレーティングシステム１５２、アプリケーションプログラム１５４、入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイスドライバ１５８およびデータ１５６を含む。データ１５６は、分光計１２５からの既知のスペクトルのプロファイル１４４および／またはスペクトルのデータ１４６のデータベースを含む。既知のスペクトルのプロファイル１４４および／またはスペクトルのデータ１４６のデータベースはサンプルを識別または特性決定するために使用される。例えば、既知の状態を有するｖＷＦサンプルからのスペクトルは診断のためのパラメータを決定するために使用される。このようなパラメータ内の範囲に入るスペクトルは、同一または類似の状態を潜在的に有すると診断される。例えば、ある特定のフォンビルブランド病の状態は低濃度の高分子量（ＨＭＷ）ｖＷＦマルチマーを有する。
【００７２】
当業者には明らかなとおり、オペレーティングシステム１５２は、例えば、ニューヨーク州アーモンク市のＩＢＭ社のＯＳ／２、ＡＩＸ、ＯＳ／３９０またはＳｙｓｔｅｍ３９０、ワシントン州レドモンド市のマイクロソフト社のＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＣＥ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＮＴ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ９５、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ９８、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ２０００またはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＸＰ、Ｕｎｉｘ（登録商標）またはＬｉｎｕｘまたはＦｒｅｅＤＳＤ、Ｐａｌｍ社のＰａｌｍ ＯＳ、アップルコンピュータのＭａｃ ＯＳ、Ｌａｖ Ｖｉｅｗ、または独自のオペレーティングシステムなどの、データ処理システムにおける使用に適した任意のオペレーティングシステムである。Ｉ／Ｏデバイスドライバ１５８は通常、デバイス、例えば、Ｉ／Ｏデータポート、データストレージ１５６およびメモリ１１４および／または分光計１２５の特定の構成要素と通信するアプリケーションプログラム１５４により、オペレーティングシステム１５２を介してアクセスされるソフトウェアルーチンを含む。アプリケーションプログラム１５４はデータ処理システム１１０のさまざまな機能を実現するプログラムの例であり、好ましくは本発明の実施形態による操作をサポートする少なくとも１つのアプリケーションを含む。データ１５６は、アプリケーションプログラム１５４、オペレーティングシステム１５２、Ｉ／Ｏデバイスドライバ１５８およびメモリ１１４に属する他のソフトウェアプログラムにより使用される静的および動的データを表す。
【００７３】
本発明は、例えば、図２においては、アプリケーションプログラムであるスペクトルプロファイル分析モジュール１６０によって示されているが、当業者には明らかなように、本発明の教示の恩恵を受けつつ、別の構成も利用できる。例えば、スペクトルプロファイル分析モジュール１６０はさらに、オペレーティングシステム１５２、Ｉ／Ｏデバイスドライバ１５８またはデータ処理システム１１０の別のこのような論理部分に組み込むことができる。したがって、本発明は図２の構成に制限されると解釈されるべきではなく、ここに説明されるオペレーションを実行する能力のある任意の構成を含むものとする。
【００７４】
Ｉ／Ｏデータポートを用いて、データ処理システム１１０と分光計１２５または別のコンピュータシステムまたはネットワーク（例えばインターネット）の間に、またはプロセッサにより制御される他の装置に情報を転送する。これらのコンポーネントは、ここに記載されたとおりに作動するために、本発明により構成される多くの従来のデータ処理システムで使用されるような従来のコンポーネントである。
【００７５】
本発明は分光計１２５に関して上に説明されているが、電気泳動分光計および／またはサンプルが電界内に位置しない分光計を含む、さまざまな種類の分光計および分光分析法を利用できることは理解されるべきである。例えば、ＥＱＥＬＳ、ＰＣＳまたはＤＬＳ分光計は分光計１２５に使用される。さらに、他の技法を用いて、サンプルにエネルギーを供給し、サンプルからエネルギー相互作用の出力を収集できる。
【００７６】
図１および２に図示されているような、本発明の実施形態による光散乱分析をベースとする技法は、運動粒子から散乱した光と粒子に照射された入射光との間の周波数差を基にしている。散乱光の極めて少ない周波数シフトは直接測定できないため、ヘテロダイン方法を用いて、散乱光を参照光またはシフトされない光と混合する［Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊｒ．，ＣＳ．Ｌａｓｅｒ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．Ｄｏｖｅｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９４］。シフト光および非シフト光の間の周波数差は「ビート」を発生する。ビート周波数は散乱光の周波数シフトの大きさに関連し、この周波数シフトはさらに、散乱する粒子、例えばｖＷＦ粒子の移動度に関連する。電気泳動効果は、使用される電気泳動法に依存する均一な電界（約数ボルト／ｃｍから約３０，０００ボルト／ｃｍ）を重畳することにより得られる。電界はパルス化され、その極性はサンプルの極性を避けるために交番する。固定角度（θs）における動く粒子からの散乱強度（Ｉs）は２次領域自己相関関数Ｇ2Lhet（τ）としてヘテロダイン法における発振強度として観測され、式１により与えられる［Ｂｅｒｎ，ＢＪ．Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ，ＮＹ．１９７６］。
【数３】
ここで、ＩLは参照光ビームの強度（局部発振器）であり、Ｉsは散乱光の強度であり、ｖdは散乱粒子の速度であり、Ｄは拡散係数であり、τは時間増分である。Ｋは、下記の式により定義される散乱ベクトルである。
【数４】
ここで、ｎは屈折率であり、λは入射光の波長である。この式で１つの重要な量は粒子の運動から生じる信号のドップラーシフトＫ・ｖdである。測定された自己相関関数のフーリエ変換は、粒子の電気泳動移動度が計算されるパワースペクトルを提供する［Ｗａｒｅ，ＢＲ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．Ａｄｖ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｉｅｎｃｅ ４：１−４４，１９７４］。
【００７７】
サンプル媒体の温度、イオン強度、ｐＨおよび導電率（図１のサンプル２０など）は制御できる。温度の小さな変化は導電率の変化により検出され、試験を通して監視できる。ジュール加熱はパルス幅および電界周波数の調整により制御できる。熱レンズは入射レーザー電力を制御することで避けられる。電気浸透は（γ−グリシドキシプロピル）−トリメトキシシランを用いて最初に散乱細胞をコーティングし、７０℃で乾燥し、メチルセルロースによるコーティング、および７０℃での再乾燥を行うことにより最小化される。電気浸透アーチファクトの有無は、散乱体積を横切る平坦な電気泳動プロファイルにより確認される。別の方法は、メチルセルロースを用いてキュベットのコーティング工程を削除すること、および固定境界での移動度を測定すること、または別の細胞設計を使用することである。スネルの法則の補正は全ての散乱角度に対してなされる。ｖＷＦの動電学的特性はＤｅｂｙｅ−Ｈｕｃｋｅｌ等式の領域内にある、この領域では、表面電荷および摩擦力の両方が電界内での運動に重要である。例えば、ｖＷＦマルチマーの電荷および摩擦の特性の両方は、移動度スペクトルに寄与する［Ｐｔｈｉｃａ ＢＡ．細胞接着の物理化学（Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ．）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．８，１２３−１４０，１９６１］。
【００７８】
いずれの特定理論にも拘束されないで、ＥＱＥＬＳ技法を用いるさまざまなｖＷＦ種の間の分解能および区別の基本は、一般に、さまざまなｖＷＦマルチマー種の電気泳動移動度における相違である。電気泳動移動度は電界の影響下での帯電した粒子種の運動である。
【００７９】
ＤＬＳまたはＰＣＳ技法（図１および２に関して説明したＥＱＥＬＳ技法の代用とすることができる）を用いた場合などの、電気泳動移動度を発生する電界が存在しない場合、ｖＷＦ種はなおも熱効果から発生する運動を受ける。例えばブラウン運動、対流性流れおよび／または拡散効果を含む、このような運動の大きさは、溶剤の状態、溶質の濃度、および散乱粒子の分子の大きさにより決定される。したがって、ＥＱＥＬＳを用いて、ｖＷＦマルチマー間の差を区別し決定し、および／または存在するマルチマーの数を決定するが、ＰＣＳまたはＤＬＳもまたさまざまなｖＷＦマルチマー種の拡散係数の差に基づいてｖＷＦマルチマーを検出する。
【００８０】
このように、ＰＣＳは、サンプルに電界を印加しない点においてＥＱＥＬＳとは異なる。拡散するｖＷＦ種の運動の大きさの差は、例えばレーザーまたは他の光源により生成されるような、入射光子と拡散する種の相互作用から生じるドップラーシフトの大きさの差から検出される。急速に移動または拡散する種は、大きなドップラーシフトを発生し、より遅く拡散する種はより小さなドップラーシフトを発生する。そうでない場合、検出方法はＥＱＥＬＳに対して使用される方法に対応する。
【００８１】
ＰＣＳはｖＷＦマルチマーの分析に対する平行移動拡散係数を決定する正確な方法を提供する。さらに、拡散係数が測定される迅速性により、ＰＣＳを高分子の結合を監視する有効な方法にする。ＥＱＥＬＳはｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度分布の決定に使用される。
【００８２】
説明の目的で、ＥＱＥＬＳ技法は、屈折率一致タンクに含まれるサンプル細胞を使用し、０．１℃の許容差内で制御される屈折性一致流体および温度としてトルエンを使用することにより実行される。散乱放射線は、定義された散乱角度で配置される光電管により測定される。次に、ｚ−平均平行移動拡散係数は、崩壊定数Γの傾きに対するｓｉｎ2（θs／２）（ここでΓ＝Ｋ2Ｄ、Ｋは散乱ベクトルである）として、強度正規化された光子カウント自己相関関数から得られる。分子の大きさは流体力学的径として表され、アインシュタインの式により定義されるＤから計算される。指数的サンプリング技法に基づいて、分子の粒度分布（例えば、ｖＷＦマルチマーの大きさの変化）はＰＣＳ自己相関関数から導かれる。フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）は５００，０００〜２，０００万の範囲の変動する分子量の高分子糖蛋白として、１０μｇ／ｍＬにおける正常な血漿中を循環する。ｖＷＦマルチマーは内皮細胞および巨核球の両方内で合成されるｖＷＦモノマーで構成される。「前処理ｖＷＦモノマー」とも言われる、２８１３アミノ酸（３６０，０００ Ｍｒ．）発生期ｖＷＦモノマーは、２２アミノ酸シグナルペプチド、７４１プロペプチド（ｖＷＦ抗原ＩＩとも呼ばれる１００，０００ Ｍｒ、７４１アミノ酸）および成熟ｖＷＦモノマーで構成される。
【００８３】
成熟モノマーは２０５０アミノ酸を含み、２６０，０００のＭｒを有する。小胞体では、負に帯電した成熟したｖＷＦモノマーはカルボキシル基の末端に位置する特定のジスルフィド結合配列を介して二量化する。ゴルジ装置では、結果として得た生じたダイマーは、モノマーのＤ３ドメインに位置する特定のジスルフィド結合の第２セットを介してｖＷＦマルチマーを形成するために、次々に重合する。結果として、大きなポリマーが形成される。プロペプチドは内皮細胞および血小板のα−微粒のＷｅｉｂｅｌ Ｐａｌａｄｅ体に成熟したｖＷＦモノマーを取り込むのに必要である。その後、プロペプチドは、ｆｕｒｉｎ、サブチリシン様酵素により切断される。
【００８４】
マルチマーの粒度、およびマルチマーの著しい多分散性は、ＡＤＡＭＴＳ１３によりＡ２ドメイン内での蛋白分解に少なくとも部分的に起因する。
【００８５】
電子顕微鏡検査によるｖＷＦダイマーの画像化は、約１４５ｎｍの全体固有寸法を与える線維鎖（３４ｎｍ）により中央のドメイン（５ｎｍ）に接続される２つの球状ドメイン（２６×２．６ｎｍ）を含む構造を示す。ダイマーのｖＷＦの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像では、５ｎｍのロッドにより接続される３８ｎｍの中央ドメインに接続される７３ｎｍの２つの側面ドメインを示す。両方の方法による固有寸法は正確に一致する。球状のｖＷＦのＡＦＭは最大７７４ｎｍの広がったマルチマーを有する１４６ｎｍの主軸の寸法を示す。球状配列は３５ダイン／ｃｍ2を上回る機械的なせん断力で直線配列への伸長を受ける。このモデルは、しばしば、「毛糸の玉」と称され、ｖＷＦの正常な生物学的機能の現在の概念に良く適合する。機械的せん断力は、小さな「毛糸の玉」から伸長した状態への変形を引き起こすのに極めて重要である。
【００８６】
ｖＷＦモノマー組織について、ドメイン構造および機能に関して、ｖＷＦモノマー自体は以下の構造的ドメイン（ＮＨ2）、Ｄ’−Ｄ３−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｂ１−Ｂ２−Ｃ１−Ｃ２（ＣＯ2Ｈ）に配列される。ドメインは反復同族関係の領域として定義される。未だに完全に特定されていないが、生物学的機能とドメインとの関係はいくつかのドメインに対して解明されている。
【００８７】
ドメインＤ’およびＤ３について、ｖＷＦの重要な機能の１つは凝集第ＶＩＩＩ因子の輸送であり、凝集第ＶＩＩＩ因子はｖＷＦが血漿にさらされると発生し、凝集第ＶＩＩＩ因子を結合する。この輸送機能に加えて、第ＶＩＩＩ因子は、ｖＷＦに結合されている間は、活性蛋白質Ｃまたは活性凝集因子Ｘ（ＦＸａ）により蛋白質分解から保護されている。結合部位はｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメイン内で残基７８−９６に精製される。ｖＷＦ（Ｋd＝０．２５ｎＭ）による凝集第ＶＩＩＩ因子の非共有結合は、ｖＷＦにおけるＤ’およびＤ３ドメインと凝集第ＶＩＩＩ因子におけるＡ３ドメイン（ｖＷＦ（８１−８３）のＡ３ドメインと混同してはならない）との相互作用により発生する。凝集第ＶＩＩＩ因子Ａ３ドメインにおけるＡｒｇ1689の分断はｖＷＦから凝集第ＶＩＩＩ因子を解放する。残基１９、２８、５３、５４および９１でｖＷＦ領域を結合する凝集第ＶＩＩＩ因子における変種は、ｖＷＦへの凝集第ＶＩＩＩ因子の正常な結合を妨げ、大量出血を引き起こし、血友病と誤診される場合があり、ｖＷＦ Ｎｏｒｍａｎｄｙと称される。血小板表面への凝集第ＶＩＩＩ因子の輸送メカニズムは未だに明らかではない。
【００８８】
ドメインＡ１については、ドメインＡ１およびＡ３は、インテグリンのＩドメイン、細胞外基質の補体成分およびｒａｓ−ｐ２１ジヌクレオチド結合部位を含む大きなスーパーファミリーを有する構造類似性を共有する。正極性に帯電したＡ１ドメインはアミノ酸残基４９７および７１６の間に配置され、１８４アミノ酸のかなり大きなループを生成するＣｙｓ５０９−Ｃｙｓ６９５の間にジスルフィド・ブリッジを有する。
【００８９】
ドメインＡ１はドメインＡ２およびＡ３と共に、ｖＷＦと血管壁に配置されるコラーゲンと血小板表面に配置されるＧＰＩb／Ｖ／ＩＸとの間の相互作用を仲介する。Ａ１反復は血小板ＧＰＩbの結合部位を含む。ＧＰＩbはそれぞれ、モル比２：２：１：２でＧＰ Ｉｂα、ＧＰ Ｉｂβ、ＧＰ ＶおよびＧＰ ＩＸから成る複合体として存在する。ｖＷＦはＧＰＩb／Ｖ／ＩＸを構成的に結合しないが、ｖＷＦは分子の伸長を通して活性化を必要とする。
【００９０】
Ａ１ドメインによるＧＰＩbの結合は、ドメインＡ３と非線維コラーゲンの間の相互作用により調整されるＡ１ドメインにおける配置変化を含むと考えられる。配置変化の正確な詳細は明らかでない。Ａ１ドメイン結晶構造の分析によると、および白血球のインテグリンのａ−副単位（Ｉドメインとも称されるαＭ、β２およびαLβ２）からのデータを用いた推定によると、埋没塩橋の分断はインテグリンのＩドメインとして前部上表面から下方のα７螺旋１０Ａの電荷の再分布および変位の原因となる。Ｉドメインの場合、この膨張形状は高い親和性リガンド結合に関連し、ｖＷＦ Ａ１のこの膨張形状はＧＰ Ｉb結合に関連すると推定される。Ａ３ドメインのコラーゲンおよび／または大きい機械的せん断力との相互作用は、この配置変化を起動すると思われる。Ａ１ドメインはさらに、ＶＩ型コラーゲンの第２結合部位、およびスルファチド、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）、ボトロセチン(Botricetin)およびヘパリンの結合部位を含む。
【００９１】
Ａ２ドメインはアミノ酸部位７１７から９０９により定義される。このｖＷＦドメインは、血漿ＡＤＡＭＴＳ１３により分裂され、かつＷＦマルチマー粒度の調整に関与すると考えられるＴｙｒ８４２とＭｅｔ８４３間の部位を含む。ＡＤＡＭＴＳ１３による分割の後、ｖＷＦダイマーは１７６Ｋdおよび１４０Ｋdの質量を有する２つのフラグメントになる。活性化のためカルシウムまたは亜鉛のどちらかを必要とするＡＤＡＭＴＳ１３は、ｖＷＦが機械的せん断力あるいはコラーゲンまたは他の蛋白質との後の相互作用のいずれかにより、広げられる及び伸長されない限り、ｖＷＦに対して作用しない。Ａ２ドメインの削除はマルチマーの分裂を防止する。
【００９２】
負に帯電したＡ３ドメインはアミノ酸９１０から１１１１まで伸長する。このドメインはＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの結合部位を含み、アミノ酸１０１８から１１１４までの間に配置される。ＩＶ型およびＶＩ型コラーゲンの結合部位は公知ではないが、Ａ１またはＡ３ドメインのいずれにも現れない。Ａ１およびＡ３の一部から成るキメラのドメインを含む独立した組み換えＡ−ドメインと、Ａ１またはＡ３のどちらかを削除されたｖＷＦ分子上とに基づいて、主コラーゲン結合部位はＡ３ドメインに配置されている。独立した組み換えＡ３ドメインは１．８×１０-6ＭのＫdを伴うＩ型コラーゲンに結合する。
【００９３】
コラーゲンの結合およびｖＷＦ介在血小板付着のメカニズムは複雑であり、複数の工程を含み、コラーゲンの型により変化する。白血球インテグリン（ＬＦＡ−１）内で見られるＩドメインとは対照的に、ｖＷＦのＡ１またはＡ３ドメインのいずれにも金属結合部位は存在しない。Ｉドメインの特性であり、２つの両親媒性螺旋により挟まれた中央の平行なβシートにより形成される、ジヌクレオチド結合折曲部の主題はｖＷＦ Ａ−ドメインに存在し、それぞれ、ＧＰ Ｉbおよびコラーゲンの結合部位であると見なされる。Ａ−ドメインおよびＡ３−ドメインは、詳細には、経験的に観測される疎水性領域を含むことができる。
【００９４】
ｖＷＦは、初期の血小板付着および血小板への凝集剤第ＶＩＩＩ因子の輸送という、２つの主機能を有する。内皮下基底膜および血管の外膜組織に位置するさまざまなコラーゲンは、ｖＷＦの特定の対象物として特定されるが、Ｉ型およびＩＩＩ型の線維コラーゲン、ＶＩ型の細線維コラーゲン、およびＩＶ型の非線維コラーゲンは最も重要である。大きい機械的なせん断力はｖＷＦを引き伸ばされた分子に物理的に変形させて、血小板付着における機能を高める。ｖＷＦの活性化における機械的なせん断力の重要性が問題とされてきた一方で、コラーゲン結合の重要性は、モノクローナル抗体によるＡ３ドメインの遮断によるコラーゲン結合の阻止により生体内の動脈性の血小板血栓形成を防ぐことを示す、ヒヒの研究により強調されてきた。
【００９５】
コラーゲン、ｖＷＦ、血小板の間の初期の相互作用は血小板付着の初期工程としてのみ役立つ。他のリガンド（おそらくα2β1）が強固な付着に役立つことは明らかである。大きいせん断力の下で、内皮下のｖＷＦは血小板付着の最大５０％の割合を占める。
【００９６】
Ａ３ドメインによるコラーゲン結合はＡ１ドメインでの配置変化を誘発するものとして発生し、血小板表面での構成性分泌糖蛋白質Ｉｂ／Ｖ／ＩＸ（ＧＰＩb／Ｖ／ＩＸ）に結合する部位を露出させる。このシークエンスはアシアロ−ｖＷＦの結合、ｖＷＦ−血小板付着、リストセチンおよびボトロセチン両方の結合を阻止するため、ＧＰＩbの主結合部位はｖＷＦ残基５１４−５４２内に存在する。リストセチンまたはボトロセチンのｖＷＦ結合はＧＰＩb／Ｖ／ＶＸとの結合を強化するが、負に帯電したまたは芳香性のポリマーはＧＰＩbとの結合を阻止する。ＧＰＩbがｖＷＦに結合すると、信号変換が発生し、血小板の活性化が生じる。血小板の活性化によって、次に、血小板拡大、凝集、不可逆性血小板付着およびトロンビン生成を調整する、αIIbβ3へのｖＷＦまたはフィブリノゲン結合が生じる。大きいせん断力の状況下で、血小板の凝集は、αIIbβ3へのｖＷＦ結合を通して調整される。
【００９７】
ｖＷＦマルチマーの粒度および濃度の分布における異常は、先天性または後天性の原因から発生する。ＨＭＷマルチマーは血小板粘着の主メディエータであるため、ＨＭＷマルチマーの損失は特に重大である。Ｉ型ｖＷＤは最も一般的な型のｖＷＤであり、全てのマルチマー粒度の濃度を低下させる。ＩＩ型ｖＷＤでは、ＨＭＷマルチマーは減少するかまたは存在しない。ＩＩ型ＢｖＷＤでは、ｖＷＦマルチマーはＧＰＩb／Ｖ／ＩＸ混合物に対親和力を低下させるが、これは、蛋白質分解に対するｖＷＦの脆弱性を増加するＡ１−ドメインにおけるマルチマーから生じる。Ａ２−ドメインにおける大多数の変種はＩＩＡ型のｖＷＤを生成し、この場合、残基Ｔｙｒ８４２−Ｍｅｔ８４３の間の分裂がｖＷＦを分解し、ＨＭＷｖＷＦマルチマーの損失を招く。例えば本明細書に記載されたスペクトル技法を使用して決定されたサンプル中の、分子粒度および重量分布、電気泳動移動度分布、および／またはｖＷＦの粒度分布は、これらの条件および他の条件を特定する。
【００９８】
ｖＷＦに関連する臨床上の病状に関しては、フォンビルブランド病は、ｖＷＦにおけるさまざまな定量的および／または定性的な欠陥によりそれぞれ特性決定される、多数の疾患の変形体を伴う、臨床的に異質な疾患である。３つの主な疾患の型（型Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）および４つの亜型（ＩＩＡ、ＩＩＢ，ＩＩＭ、ＩＩＤ）がある。ｖＷＤは通常診断の血液検査では現れないため、ｖＷＤの検査室診断および細分類は困難である。したがって、医師は、各患者に対する最高および最も安全な治療を確立するため、特定のｖＷＦ変種を決定するための特殊な診断血液検査を指示しなければならない。
【００９９】
血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）はｖＷＦマルチマーの分布およびＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む病状である。血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）は発生率は低いが、若年成人および若い女性にはより一般的な、潜在的に致死的な病気である。ＴＴＰの診断は、熱、腎不全、変動的な精神状態、微小血管症性溶血性貧血（ＭＡＨＡ）および血小板減少症の、古典的な５徴候により確定される。関連のある溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７に感染した子供によりしばしば見られ、より高い腎機能障害を伴うが、神経系への介入は少ない。先天性および後天性の両方の病気の形態で現れる。後天性のＴＴＰは、感染（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７からの志賀赤痢菌毒素またはＡＩＤＳ）、ＳＬＥなど自己免疫性疾患、骨髄移植（ＢＭＴ）、妊娠、慢性の免疫抑制、敗血症および、チクロピジン、シクロスポリン、マイトマイシンＣおよびキニーネといった薬品を含む、多くのさまざまな臨床的状態から発生する。
【０１００】
したがって、ＴＴＰは、血漿交換輸血（ＰＬＥＸ）以外の場合には８０％を超える致命率の、多様な病因の症候群である。ＰＬＥＸを用いても、１５％〜２０％の範囲の死亡率が一般的である。ＰＬＥＸの効果は正常血漿の注入による不足しているｖＷＦ分裂プロテアーゼ（ｖＷＦＣＰ）の交換、および、場合によっては、ＩｇＧ型免疫グロブリンなど抑止自己抗体の除去を含むと考えられる。慢性再発性ＴＴＰが超巨大ｖＷＦマルチマー（ＵＬｖＷＦ）と関連するという観察報告は、これらのＵＬｖＷＦマルチマーは血小板により容易に結合されるため、「デポリメラーゼ」調整マルチマー粒度はＴＴＰに存在しないことを示している。血漿プロテアーゼ（ｖＷＦＣＰ）はｖＷＦの分裂に有効であり、ＴＴＰにおいて、ｖＷＦはＴｙｒ1605−Ｍｅｔ1606間のｖＷＦのＡ２ドメインで分裂される。ｖＷＦＣＰによるｖＷＦの分裂はｖＷＦのせん断力による伸長によって促進される。
【０１０１】
先天性のＴＴＰ患者はＡＤＡＭＴＳ１３に変種を有すると見られてきた。ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）系統群の各要素は細胞外基質付着蛋白質の代謝において顕著な役割を果たす。ＡＤＡＭＴ系統群は、コラーゲン結合におけるその推定可能な作用を繰り返すトロンボスポンジン−１の追加分を有する。ＡＤＡＭＴＳ系統群の各要素の機能は多様であるが、全ての系統群の要素は、細胞外基質付着蛋白質を処理する膜固着プロテアーゼである。ＡＤＡＭＴＳ１３はｖＷＦの分裂を調整し、これはＴＴＰにとって極めて重要である。蛋白質分解作用はｖＷＦＣＰの活性化および／または止血の他の構成要素を含む。
【０１０２】
ＡＤＡＭＴＳ１３の遺伝形質は常染色体劣性である。ＡＤＡＭＴＳ１３は、シグナルペプチド、４１ａａプロペプチド、ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ様ドメイン、メタロプロテイナーゼドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、トロンボスポンジン−１反復、ＲＤＧシークエンス（その後に７つの付加されたトロンボスポンジン−１ドメインおよび２ＣＵＢ−ドメインが続く）を有するＣｙｓ−ｒｉｃｈスペーサードメインを含む、１４２７アミノ酸残基糖蛋白質である。計算された１５４ｋのＭｒ（非グリコシル化）は血漿から分離した１９０ｋ Ｍr（グリコシル化）ｖＷＦＣＰとよく一致合致する。ＡＤＡＭＴＳ１３は、その短いプロペプチド（わずかに４１の残基長）およびＣＵＢ−ドメインの存在により、ＡＤＡＭＴＳ系統群の他の要素から区別される。ＣＵＢドメインはＡＤＡＭＴＳ１３に固有であり、コラーゲン結合部位を含む。細胞基質結合はトロンボスポンジンドメインによって生じると仮定される。初期蛋白は、おそらくｆｕｒｉｎによるゴルジ体または細胞表面のいずれかにおいて活性化を要求する酵素原であると考えられる。ＰＬＥＸ後に注入された血漿内に含まれるＡＤＡＭＴＳ１３のｔ1/2は、明確には公知ではないが、ＰＬＥＸ処理された２名のＴＴＰ患者に３．３日および２．１日で測定した。３％未満の機能活性度の低下は、臨床的有意性を表すために必要であることを示している。先天性および突発性ＴＴＰを伴うＡＤＡＭＴＳ１３の機能的または先天性不足のいずれかの関連性は、ＴＴＰ患者の約５０％に対して間違いなく確立されたように見える。
【０１０３】
低レベルのＡＤＡＭＴＳ１３およびＨＭＷマルチマーはまた、病状、およびＶＯＤ、急性膵炎、妊娠、尿毒症、特発性血小板血症、炎症および肝硬変症などの、ＴＴＰ以外の生理状態に存在する。本発明は、本発明の特定の実施形態におけるＴＴＰ、ＨＵＳおよびＴＴＰ／ＨＵＳに関して説明されているが、このような病状は本発明の適用性に関して説明しているものであり、本発明は、例えば急性冠動脈症候群などの、例えば異常な内皮機能がｖＷＦの放出を介在する病状などのｖＷＦの異常生成を含む、さまざまな病状および生理学的な状態の症状の疾患、治療および／または回復を含む、ことは理解されるであろう。したがって、本発明の分析方法は、同様に、これらの病状および／または生理学的状況の潜在的な存在が、診断上で決定されるかまたは禁忌されるという用途を含む。
【０１０４】
したがって、本発明は、ｖＷＦマルチマーの検出および特性決定、および／またはＡＤＡＭＴＳ１３などの因子によるｖＷＦの分解の迅速な分析方法を提供するものであり、このＡＤＡＭＴＳ１３は、ｖＷＦおよび／または分解薬剤に関連するか、指示されるか、または禁忌される病状または生理学的な状況の診断および治療に関する有用性を有する。
【０１０５】
本発明の迅速な分析方法は、限定されることなく、静的光散乱法および動的光散乱法を利用する方法を含み、これら光散乱法には、ＥＱＥＬＳ（電気泳動の準弾性光散乱）、ＰＣＳ（光子相関分光法）他またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）技法を含み、または、ｖＷＦ種および／または分解薬剤を含むか、または存在に影響されやすい媒体にエネルギーを照射することによりエネルギー相互作用スペクトルを生成し、および、エネルギー相互作用スペクトルからこのような種および／または作用薬の存在、不足または特性を決定することにより、ｖＷＦおよび／または分解薬剤を検出および／または特性決定する他の方法、を含む。
【０１０６】
エネルギーの相互作用スペクトルは一般に、任意の適切な種類であり、このスペクトルには、エネルギー散乱スペクトル、エネルギー吸光度スペクトル、エネルギー伝送スペクトルまたはこのような種および／または薬剤を含むエネルギー／粒子相互作用を示す、任意の他のスペクトルを含む。エネルギー相互作用は、電気泳動状態または非電気泳動状態下で発生し、エネルギー源は、限定されることなく、電磁エネルギー、音響エネルギー、超音波エネルギーまたは任意の他の適切なエネルギー媒体を含む、所望の相互作用スペクトルを生成するのに有効な任意の適切な種類である。電磁エネルギーの場合、エネルギーは、可視光線、赤外線、紫外線およびＸ線スペクトル類など、適切なスペクトル類である。特定の実施形態では、化学線が、サンプルにおけるｖＷＦおよび／または代謝作用薬（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）粒子との相互作用のためのエネルギー媒体として使用され、このような化学線は、例えば、約２００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の波長を有する。本発明の各種の実施形態は、弾性光散乱および準弾性光散乱を含む光散乱技法など、可視光線放射を使用する。別の実施形態は、毛管流れ内の粒子に照射される紫外線放射のエネルギー源として紫外線レーザーを有するキャピラリー電気泳動方法およびシステムなどのように、紫外線放射を使用する。したがって、任意の適切なエネルギー検出源および対応するエネルギー媒体は、本発明の幅広い実施に使用されることが認識されるであろう。さまざまな好ましい実施形態においては、可視光レーザーは、ＥＱＥＬＳ（電気泳動の準弾性光散乱）、ＰＣＳ（光子相関分光法）等またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）技法を含む、静的光散乱法および動的光散乱法を実行するためのエネルギー検出源として利用される。
【０１０７】
エネルギー相互作用スペクトルからのｖＷＦ種および／または関連する薬剤の決定（例えば、検出、特性決定）は、このような決定のための任意の適切なソフトウェア、システム、分析技法、アルゴリズムなどを用いる適正な方法でなされる。エネルギー相互作用スペクトル方法の説明として、ＥＱＥＬＳを主に参照して説明した実例の決定方法は、例えば、２００４年５月４日に出願された同時係属の米国特許出願第（欠番）号、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ／ｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ［代理人整理番号５４７０−４０４］に説明されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
被検者を、ＴＴＰ疾患およびいずれかの他の病状が進行する危険性のある患者と特定でき、これら疾患により内皮の異常機能を引き起こし、その結果、ＡＤＡＭＴＳ１３、および／またはこのような被検者から得られる生理学的サンプル中のｖＷＦ種の存在、不足または特性と相関関係のある、代謝因子の欠損または不足に関連するｖＷＦまたは生理状態を発生させる。生理学的サンプル中のｖＷＦ種の存在、不足または特性（例えばスペクトル分析により決定される）が決定される。ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはいずれかのｖＷＦ代謝因子の欠損または不足は相関的に決定できる。
【０１０９】
内皮の異常機能を引き起こすことにより、ＡＤＡＭＴＳ１３および／またはｖＷＦのいずれかの代謝因子の欠損または不足に関連するｖＷＦまたは生理状態を発生する、ＴＴＰ疾患またはいずれかの他の病状を有する患者を治療できる。ＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または不足を抑制する治療薬は、このような患者に投与され、治療薬の効果は、治療薬の投与後の患者から取得される生理学的サンプル中のｖＷＦ種の存在、不足または特性により、決定される。生理学的サンプル内のｖＷＦ種の存在、不足または特性は、ＥＱＥＬＳ（電気泳動の準弾性光散乱）、ＰＣＳ（光子相関分光法）他またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）技法または他のエネルギー相互作用スペクトル技法を含む、静的光散乱法および動的光散乱法により、さまざまな特定の実施形態において決定される。
【０１１０】
ＴＰＰ疾患または、ＡＤＡＭＴＳ１３および／または任意のｖＷＦの代謝因子の欠損または不足に関連するｖＷＦまたは生理状態を発生する内皮の異常機能を引き起こすいずれかの他の病状の患者の治療は、有効な量のＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼの治療的な投与を含み、このようなプロテアーゼは、例えば、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３、合成ＡＤＡＭＴＳ１３、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体、ならびに、２００３年４月１７日に発行された米国特許公報第２００３／００７３１１６号により詳細に記載されいるとおり、合成ＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体から選択される。上記特許の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
ｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および粒度分布は分析できる。複数のｖＷＦマルチマーを含む媒体を生成できる。エネルギーはサンプル媒体中のｖＷＦに照射され、エネルギーの相互作用の出力は照射されたエネルギーに応じて生成される。媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度および粒度分布は、エネルギーの相互作用の出力から決定される。
【０１１２】
エネルギーは、例えば光エネルギーを含み、したがって、エネルギーの相互作用の出力は散乱光出力を含む。エネルギーの相互作用は、電気泳動または非電気泳動状態下で、このような方法の所定の最終用途における要望通りに発生できる。このような散乱光出力を処理して、自己相関関数から散乱光の位相シフト、ｖＷＦマルチマーに照射される入射光に関連する散乱光のドップラーシフト、ｖＷＦマルチマー移動度（電気泳動状態を与えられた場合の電気泳動移動度）、およびｖＷＦマルチマーの分子量分布を決定できる。正常な範囲のｖＷＦマルチマー重量は５００，０００〜２０，０００，０００の範囲である。１０００万〜２０００万の重量は通常高いと見なされ、超巨大マルチマー重量は２０００万より大きく、場合によっては１億にもなる。
【０１１３】
散乱光出力処理工程は、５分未満、１分未満またはそれより短い、極めて迅速な方法で実行される。サンプルはチャンバ内に収容され、それらは、例えばＥＱＥＬＳ装置の電気泳動チャンバまたはＣＺＥシステムのキャピラリーチャンバである。
【０１１４】
ｖＷＦマルチマーを含む媒体は、例えば、希釈食塩水、患者の血漿、（例えばクロマトグラフで精製された）精製された血漿、または他の生理学的な流体または試薬液を含む。
【０１１５】
通常または処理された血漿のｖＷＦは、ゲル透過クロマトグラフィーまたは親和性方法を含むさまざまな種類の方法の１つを使用してさらに精製される。親和性方法は、クロマトグラフィマトリックス、微粒子等に付着する、ｖＷＦ上の特定の結合部位に誘導される抗体、ペプチド（コラーゲンフラグメント等）、または炭水化物（すなわちヘパリン等）、を使用する免疫沈降法または免疫親和法である。基質に結合されるｖＷＦは、好ましくない物質を除去するために適切な緩衝液で洗浄され、洗浄緩衝液から戻され、適切な溶離緩衝液に再び懸濁される。微粒子は除去され、ｖＷＦを含む上澄み液が除去される。ｖＷＦ溶液は、その後、脱塩され、分析緩衝液に移される。
【０１１６】
ｖＷＦ代謝酵素（例えばＡＤＡＭＴＳ１３）は患者のサンプル、例えば、患者の血漿サンプル内で特性決定される。ある一定量の高分子量ｖＷＦが患者のサンプルに導入される。エネルギーは、高分子量ｖＷＦが加えられた患者のサンプルに照射される。エネルギーの相互作用の出力が生成され、高分子量ｖＷＦの分解が発生したかどうかは、エネルギーの相互作用の出力から決定される。
【０１１７】
ＨＭＷｖＷＦ増加患者サンプルへのエネルギー照射するおよびエネルギーの相互作用の出力応答の生成には、ＥＱＥＬＳ（電気泳動の準弾性光散乱）、ＰＣＳ（光子相関分光法）他またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）技法または他のエネルギー相互作用スペクトル技法を含む、静的光散乱法および動的光散乱法が挙げられる。
【０１１８】
ｖＷＦ代謝酵素に対する患者サンプルを特性決定する方法は、さらに、分解が発生している場合、ＡＤＡＭＴＳ１３による分解の確認マーカとして、固有の１７６，０００Ｍｒ分解フラグメントの存在の決定を含む。この分解フラグメントはＡＤＡＭＴＳ１３について特定であるため、このようなフラグメントに対応する移動度は、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＷｖＷＦの分解が進行に伴い発生する。
【０１１９】
ＨＭＷｖＷＦの分解が発生していないと決定されると、この結果は、サンプルを採取された患者がＡＤＡＭＴＳ１３酵素不足であることを示す。
【０１２０】
ＡＤＡＭＴＳ１３などのｖＷＦ代謝酵素を特性決定する上記の方法を用いて、患者サンプル中の、治療薬および／または治療養生法の治療の有効性を分析する。
【０１２１】
液状媒体中のｖＷＦマルチマーの電気泳動移動度の分布および／または粒度分布を決定できる。エネルギーを媒体に照射し、エネルギーの相互作用の出力を生成する。エネルギーの相互作用の出力を用いて、媒体中のｖＷＦマルチマーの存在、不足または電気泳動移動度分布特性を決定できる。
【０１２２】
エネルギー照射およびエネルギー相互作用出力の決定技法は、ＥＱＥＬＳ（電気泳動準弾性光散乱法）、ＰＣＳ（光子相関分光分析法）等またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）を含む静的光散乱法および動的光散乱法などの技法であってもよい。媒体内のｖＷＦマルチマーの有無はスペクトル解析によって決定できる。例えば、ｖＷＦ代謝酵素不足を有する患者の高分子量ｖＷＦなどの、特定の状態で予測される特性を求めるために、スペクトルを、特定の状態を有する既知のスペクトルと比較するかまたは分析できる。媒体自体は血漿または血漿成分および／または希釈緩衝食塩水、他の試薬、他の生理学的サンプル等を含んでもよい。媒体は、（ｉ）被験者から得られる血漿サンプルや（ｉｉ）所定の量の高分子量ｖＷＦを含んでもよい。被験者内のｖＷＦ代謝酵素は、電気泳動度分布および／または粒度分布に基づいて決定されるように、サンプル中の高分子量ｖＷＦの分解量に基づいて分析できる。
【０１２３】
被験者から得られる血漿サンプル中のｖＷＦ代謝酵素の有無に起因する、媒体中のｖＷＦマルチマーの特性を決定できる。ｖＷＦ代謝酵素はＡＤＡＭＴＳ１３を含んでもよく、ｖＷＦ代謝酵素の有無に起因する媒体中のｖＷＦマルチマーの特性は、分子量が１７６，０００ＭｒのｖＷＦ代謝反応生成物フラグメントの有無として決定できる。
【０１２４】
被験者の診断は、被験者から得られる血漿サンプルのｖＷＦ代謝酵素の有無から決定できる。例えば、診断は分子量が１７６，０００ＭｒのｖＷＦ代謝反応生成物フラグメントの有無によって確立できる。あるいは、診断は、被験者から得られる血漿サンプルのｖＷＦ代謝酵素の不足に関連する生理状態に対する感受性の有無に関する結論、例えば被験者から得られる血漿サンプルのＡＤＡＭＴＳ１３の不足に伴う生理状態に対する感受性の有無の結論であってもよい。
【０１２５】
特定の実施形態では、分析方法は被験者に治療薬を投与するのに合わせて実施できる。治療薬は、被験者のｖＷＦ分解酵素の存在を増すために実際有効であるか、または潜在的に有効と特定された薬剤である。分析により決定がなされる前および／または後に、そのような治療薬の投与を実行して、投与効果を決定できる。治療薬は任意の適切な種類であってもよく、例えば、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３、合成ＡＤＡＭＴＳ１３、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体、合成ＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体からなるグループから選択されるＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼであってもよい。治療薬はさらに、それらの効力が被験者のｖＷＦ代謝酵素の存在を増加すると評価される何らかの治療薬を含むこともできる。この場合には、他の何らかの治療薬の効力に関して、被験者内のＡＤＡＭＴＳ１３などのｖＷＦ代謝酵素の存在を増す薬剤の効果を決定するために、分析による決定を実行する。
【０１２６】
被験者は、ＡＤＡＭＴＳ１３の不在または不足および／またはｖＷＦのいずれかの代謝酵素に関連する病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあると特定できる。ＡＤＡＭＴＳ１３が正常な被験者に存在する種類の生理学的サンプルを被験者から得ることができる。所定量のＨＭＷｖＷＦを生理学的サンプルに加えることもできる。所定量のＨＭＷｖＷＦが加えられた生理学的サンプルを、ＥＱＥＬＳ（電気泳動準弾性光散乱法）、ＰＣＳ（光子相関分光分析法）等またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）を含む静的光散乱法および動的光散乱法などの方法によって処理して、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度および粒度分布を決定できる。その後、被験者は、ｖＷＦマルチマーの電気泳動度および粒度分布に基づいて、ＡＤＡＭＴＳ１３の不在または不足および／またはｖＷＦのいずれかの代謝酵素に関連する病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあると特定される。
【０１２７】
生理学的サンプルは血漿または（クロマトグラフィー精製等によって）精製後の血漿を含んでもよい。生理学的サンプルはさらに試薬を含んでもよい。試薬は、（ｉ）ＡＤＡＭＴＳ１３の代謝および／またはｖＷＦのいずれかの代謝剤に起因するＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーと結合でき、および／または（ｉｉ）電気泳動度分布のＥＱＥＬＳ決定を向上させるために、ＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーと結合しているときに、ＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーの移動特性を変化させることができる。そのような試薬の一例としてボトロセチンがある。
【０１２８】
上記の方法は、分子量が１７６，０００Ｍｒで、ｖＷＦフラグメントを含むかまたは含まないため、高分子量のｖＷＦ上のＡＤＡＭＴＳ１３の蛋白分解作用に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布を決定するために実行できる。
【０１２９】
ＥＱＥＬＳを利用するときは、光が生理学的サンプルを照射し、散乱光出力を生じる。散乱光出力を処理して、（ｉ）照射光に対する散乱光出力の散乱光シフトおよびドップラーシフト、および（ｉｉ）ＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＷｖＷＦの分解で生じるｖＷＦマルチマーの移動度、を決定できる。
【０１３０】
上述の方法は、ＴＴＰ、ＨＵＳ、ＴＴＰ／ＨＵＳおよび急性冠動脈症候群、糖尿病、高血圧、月経過多、腎不全など、ｖＷＦを放出する内皮の異常機能の原因となるあらゆる病状の診断にも有用である。
【０１３１】
ＴＴＰ、ＨＵＳおよびＴＴＰ／ＨＵＳなどのｖＷＦを代謝するのに有効な酵素が欠損または不足していることに関連する病状または生理状態の患者を治療でき、および／または治療の有効性を決定できる。患者には酵素の欠損または不足を抑制する治療薬を投与できる。酵素が正常な被験者に存在する種類の生理学的サンプルを得ることもできる。所定量のＨＭＷｖＷＦを生理学的サンプルに加え、その後ＥＱＥＬＳ（電気泳動準弾性光散乱法）、ＰＣＳ（光子相関分光法）等またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）を含む静的光散乱法および／または動的光散乱法などによって処理して、酵素によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度と粒度分布とを決定できる。その後、治療薬の効果の有無を、ｖＷＦマルチマーの電気泳動度と粒度分布に基づいて決定できる。
【０１３２】
そのような治療方法は、分子量が１７６，０００ＭｒのｖＷＦフラグメントを含むかまたは含まないため、ｖＷＦマルチマーの電気泳動度と粒度分布とを決定する処理を含むことができる。
【０１３３】
そうでない場合、治療方法は、上述の診断方法で記載したように、例えば生理学的サンプルに対して、病状および生理状態などの同様の態様を含むことができる。酵素はＡＤＡＭＴＳ１３を含んでもよく、治療薬は患者の酵素の量の増加に効果的な薬剤を含むことができる。
【０１３４】
図１および図２に示すシステムなどの、本明細書で述べる種々の手術を実行するシステムも提供できる。
【０１３５】
被験者を、ｖＷＦの分解を調整する酵素の欠損または不足に関連する病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあると特定するシステムは、酵素が正常な被験者に存在するタイプの生理学的サンプルを被験者から得る手段、および生理学的サンプルに所定量のＨＭＷｖＷＦを加える手段とを備えることができる。これらの手段は生理学的サンプルが収集される容器またはガラス瓶を含むことができ、容器またはガラス瓶は特定量のＨＭＷｖＷＦを収容する。サンプルは静脈穿刺、組織診、組織培養、細胞内容物、組み換えプロセスなどから得ることもできる。
【０１３６】
システムは、さらに、所定量のＨＭＷｖＷＦが加えられた生理学的サンプルを処理するよう配置されたサンプル処理装置を備えることもできる。サンプル処理装置は、ＥＱＥＬＳ（電気泳動準弾性光散乱法）、ＰＣＳ（光子相関分光法）等またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）を利用する分光計などの静的光散乱および／または動的光散乱分光計を含む。結果として生じるスペクトルは、例えば、自動ソフトウェアを用いて分析し、（ｉ）酵素によってＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度と粒度分布を決定し、および／または（ｉｉ）ｖＷＦマルチマーの電気泳動度と粒度分布に基づいて、酵素の欠損または不足に関連する病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあると被験者を特定するのに有用な相関出力を得る、ことができる。
【０１３７】
ＥＱＥＬＳ、ＰＣＳ等またはＣＺＥなど、本明細書で記載した静的光散乱法および動的光散乱技法は、市場で入手可能な、その構造および操作が本発明の種々の態様または実施形態の実現に容易に適用可能な処理装置であってもよい。例えば図２に関して述べたように、一般用のプログラム可能なコンピュータシステム、マイクロプロセッサ、レジスタ、記憶装置、出力表示装置および端子などの、任意の適切なハードウェアおよびソフトウェア部品およびアセンブリを機能的に配置して、本明細書で記載した電気泳動度および／または粒度分布分析を実行でき、および／またはそのような電気泳動分布の決定に基づいて出力を提供できる。
【０１３８】
本発明の別の実施形態は、被験者のｖＷＦの分解を調整する酵素の欠損または不足を迅速に決定する分析キットに関する。キットは、酵素が正常な被験者に存在する種類の所定量の生理学的サンプルを被験者から収集することを含む。キットはまた、所定量の生理学的サンプルに加えるための所定量のＨＭＷｖＷＦも含むことにより、酵素によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度および粒度分布を分析するＥＱＥＬＳ（電気泳動準弾性光散乱法）、ＰＣＳ（光子相関分光法）等またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）を含む静的光散乱法および動的光散乱法用の分析サンプルを生成し、それによって、被験者の酵素の欠損または不足を決定できる。さらにキットを使用して、ｖＷＦマルチマー分布を得ることができ、および／またはコラーゲン結合、ｖＷＦ抗原、第ＶＩＩＩ因子結合などを検出できる。
【０１３９】
生理学的試料は、分析手順で使用されるまで、容器、ガラス瓶または生理学的試料を収容して保存するための容器などの適切な手段であればいずれの手段によって収集してもよい。所定量のＨＭＷｖＷＦを第２容器またはガラス瓶に収容してもよく、そこから高分子量のｖＷＦが生理学的試料を保管する容器またはガラス瓶に収容してもよい（逆でもよい）。
【０１４０】
分析キットはさらに、迅速な決定を実行するための指示書を備え、および／または（ｉ）ＨＭＷｖＷＦおよび／または酵素によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーに結合し、（ｉｉ）それに結合されるとＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーの移動度特性を変化させる、試薬を含むことができる。ボトロセチンはそのような試薬の一例である。
【０１４１】
本発明の特定の実施形態においては、精製されたｖＷＦマルチマー分布分析が用いられる。例えば約１０μ未満の最小量のサンプルがｖＷＦ構造の分析に必要とされる。分析は、クエン酸デキストロース溶液（ＡＣＤ）ガラス瓶に集められた血液全体を遠心分離によって得られる人の血漿からの初期ｖＷＦ精製を用いて実行できる。患者の血漿はＣＬ−４Ｂを用いたクロマトグラフィーカラムに供給され、ｖＷＦを含む空間容積が集められる。代わりに、ｖＷＦを吸収するために免疫親水性のマイクロビーズが用いることもでき、ｖＷＦをビーズから溶出できる。高分子量（ＨＭＷ）のｖＷＦマルチマーは空間容量の主要部で見られ、後端部の低分子量（ＬＭＷ）のｖＷＦマルチマーが後に続く。ｖＷＦの一部が集められ、溜められ、分析される。最終的に作用する緩衝液は、例えば、ｐＨが７．４のとき、４０ｍＭのＮａＣｌと６．５ｍＭのトリスと５ｍＭのクエン酸ナトリウムとを含んでもよいが、緩衝液の組成、濃度およびｐＨはそのような技法を一般的に実現する際に大幅に変更してもよいことは理解されよう。作用する溶液は作用緩衝液でさらに希釈され、最終的に所望のｖＷＦ濃度（例えば、溶液の５から約２０μｇのｖＷＦ／ｍｌの範囲）を得る。
【０１４２】
血漿からの初期のｖＷＦ精製を必要としない別の方式として、血漿ｖＷＦマルチマーの分布分析は、ｖＷＦマルチマーの移動度を固有に修正して、ｖＷＦマルチマーを、高濃度で存在するアルブミン、免疫グロブリンおよびフィブリノゲンなどの他の血漿蛋白質と区別できるように、ｖＷＦを固有に結合する試薬を加えることを含む。特に、そのような分析技法の実施形態で有用なｖＷＦ移動度修正薬剤としては、そのような移動度修正に効果的な方法でｖＷＦマルチマーと結合するボトロセチン、アンツーラン、トリカルボン酸、コラーゲン、ヘパリンおよびモノクローナル抗体が挙げられる。
【０１４３】
図３は変質していない状態における正常なｖＷＦの電気泳動準弾性光散乱スペクトルの結果を示している。ｖＷＦの濃度は２０μｇ／ｍＬで、スペクトル捕集時間は２０秒であった。横軸は（μ−ｃｍ）／（ｖｏｌｔ−ｓｅｃ）の標準単位でのｖＷＦマルチマーの移動度を示す。縦軸は各ｖＷＦマルチマーの相対的な強度を示す。相対強度はｖＷＦマルチマーの濃度とヘテロダイン比との両方によって決定される。ヘテロダイン比とは散乱光と非散乱光との混合効率である。各マルチマーの濃度はサンプル中のｖＷＦの全濃度の生成物と、特定のマルチマーに対する曲線の下の面積に対する散乱包絡線下の全面積の比とから決定できる。各マルチマーの帯域の不均一性は、１／２高さでの帯域幅に対するＫのグラフから算定できる。さらに、個々のマルチマーに対応する帯域数の増加がＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法の電気泳動ゲルを用いて観察されるｖＷＦマルチマー帯域数の低減に対して示されている（図３の挿入画で示される）。
【０１４４】
本発明の分析方法のさまざまな実施形態の利点は、従来の分析と比較して、巨大分子の形状、大きさおよび分子量に関する情報を得るために予備的な過程を必要としないことである。
【０１４５】
ｖＷＦの電気泳動スペクトルを得ることにより、ｖＷＦマルチマーの多分散特性の結果として複数帯域スペクトルを得るができる。さまざまな大きさのｖＷＦマルチマーに一般に対応する複数帯域を、ジチオスレイトールを用いるｖＷＦマルチマーの解重合によって１つの主帯域に低減して、ｖＷＦマルチマーを形成する構成モノマーを接続するジスルフィド結合を分離できる。
【０１４６】
図４ａおよび図４ｂは、Ｚ平均粒径分布、すなわちサンプル内に存在する特定の大きさのマルチマーの数に対して描かれた粒径を示している。Ｚ平均は本発明を実現する際には平均の大きさをパラメータ化することが好ましい。この理由は、Ｚ平均は高分子量の種を強調し、それによって分解能を大幅に向上し、最大のｖＷＦマルチマー形状の物理的な詳細を提供する。
【０１４７】
本発明のｖＷＦの特性決定方法を有効に利用して、イオン強度、ｐＨ、温度および疎水性の効果によってｖＷＦの分子特性を決定できることは理解されるであろう。
【０１４８】
本発明の別の実施形態においては、サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３の存在、活性度および濃度を決定するために分析法、すなわちＡＤＡＭＴＳ１３電気泳動準弾性光散乱分析法を提供する。そのような実施形態の１つにおいては、高分子量のｖＷＦ（ＨＭＷｖＷＦ）マルチマーは機能、分子量および濃度に関して分離され、特性決定される。その後、患者サンプルは標準的なＨＭＷｖＷＦと混合される。正常なＨＭＷｖＷＦが分解しない場合、その試験は、患者はＡＤＡＭＴＳ１３が不足していることを示している。その後、正常な標準血漿と共にこの分析が繰り返される。このように、正常なＡＤＡＭＴＳ１３レベルと比較した不足率が算出される。ＨＭＷｖＷＦマルチマーの分解損失に加え、分析によって、結果を確認するための別のマーカとして、１７６，０００Ｍｒの固有のｖＷＦ分解フラグメントの存在を観察できる。
【０１４９】
一般に、少量の標準的な高分子量ｖＷＦが少量の患者の血漿に加えられる。その後、ｖＷＦが分解しているかどうかを判断するために試験され、分解している場合、固有のｖＷＦフラグメント（１７６，０００）が生成される。このフラグメントに対応する移動度はＡＤＡＭＴＳ１３による分解が進むにつれて大きくなる。分解していない場合、その結果から患者は酵素が不足していることがわかる。この分析は、以下のＴＴＰ／ＨＵＳ治療を含む、ＴＴＰ／ＨＵＳなどを診断する多数の用途にとって大きな価値がある。
【０１５０】
本発明の別の実施形態においては、ＥＬＳを用いたコラーゲン結合分析を提供する。この分析において、ｖＷＦはゲル浸透クロマトグラフ分析分離法を用いて患者から分離される。Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、ＶＩ型などの標準的なコラーゲンの型がこの方法の標準として用いられる。特定のコラーゲンの増加量が患者のｖＷＦサンプルに滴定される。結合中に変化が観察され、コラーゲン濃度に対して区分される。その後これらの結果が単一状態の結合モデルに適合される。結合不足の強度は算出された結合定数の異常性に反映される。分析によって、実際にコラーゲンを結合する特定のｖＷＦマルチマーを決定することもできる。
【０１５１】
本発明の別の実施形態においては、ＥＱＥＬＳを用いたｖＷＦノルマンディー分析法を提供する。ｖＷＦにおける少なくとも８点の突然変異が特定され、その結果凝固第ＶＩＩＩ因子の結合が不足する。ｖＷＦのＮｏｒｍａｎｄｙ分析法によって、そのような第ＶＩＩＩ因子の結合が不足した変異を有する患者を迅速に特定することができる。分析は患者から分離された正常なＨＭＷｖＷＦと精製された凝固第ＶＩＩＩ因子とを必要とする。精製された凝固第ＶＩＩＩ因子はｖＷＦ溶液に滴定され、凝固第ＶＩＩＩ因子の移動度の変化が観察される。このデータから結合定数が先の分析のように算出される。結合定数の分散は凝固第ＶＩＩＩ因子の結合不足の強度の尺度となる。
【０１５２】
ｖＷＦ抗原の測定は試料中に存在するｖＷＦの量に関係する。抗ｖＷＦ抗原はマイクロビーズと電子対を共有するように結合でき、マイクロビーズの電気泳動度の変化はｖＷＦ結合として観察できる。ビーズの電気泳動度の変化の程度はサンプル中に存在するｖＷＦの量にほぼ比例する。
【０１５３】
別の実施形態においては、本発明は内皮活性化の検出または損傷分析を提供する。内皮活性化および内皮損傷は、（ウィルス性、細菌性または菌性の）敗血症、急性冠動脈症候群、肝静脈閉塞病、医薬調整内皮反応、急性炎症などの多数の臨床状況において高い重要性を有する生理学的現象である。この分析では、ｖＷＦが患者から精製され、高分子量のｖＷＦマルチマーに対しておよび巨大ｖＷＦマルチマーに対して試験される。
【０１５４】
図５、図６および図７のデータによると、ｖＷＦが疎水性の環境にあるとき、伸張が生じる。図５に示されるように、イオン強度が低いとｖＷＦでの荷電グループに対して利用できる対イオン遮蔽がほとんどない。したがって、分子の低い拡散係数によって証明されるように、分子は拡大する。イオン強度が増すと、ｖＷＦの表面電荷の良好な選別が利用でき、ｖＷＦは大きな拡散係数によって証明されるように、より小型の形状をとることができる。
【０１５５】
図６に示されるように、温度変化は疎水性の結合に影響を与える。温度が低いと、ｖＷＦがより小型でより小さい流体力学上の直径を有する。温度が上昇すると、拡散係数は下がる。これはｖＷＦがより拡大されていることを示し、はるかに大きな流体力学上の直径によって確認される。
【０１５６】
図７を参照すると、溶媒の極性が弱くなるにつれて、誘電率は高くなる。大きいサイズの直鎖アルカンアルコールを加えることによって、ｖＷＦはその拡散係数の増加で示されるように、より小型になる。したがって、ｖＷＦの分子形状は溶媒の条件によって変わり得る。
【０１５７】
本発明の具体化におけるｖＷＦの検出および特性決定は、活性化された拡大状態においてｖＷＦを有利に利用する。この拡大状態は、ｖＷＦが生体内で循環すると仮定される、「毛玉」状態と時には称される小型で非活性の状態とは反対である。非活性状態の極めて小さい形態と比べて分子寸法がはるかに大きいため、拡大された活性状態は好ましい。
【０１５８】
したがって、本発明を、本明細書において種々の例示的な態様、特徴、および実施形態を参照して述べられてきたが、本発明はこれらに限定されることなく、むしろ、本明細書の開示に基づいて当業者に提示されるように、他の変形形態、修正形態および代替実施形態にまで拡大し、それらを包含することは理解されよう。したがって、本明細書の後に記載された特許請求の範囲は広く解釈され、本発明の精神および範囲内のそのような変形形態、修正形態および代替実施形態の全てを含むと解釈されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】本発明の実施形態による電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）分光計のブロック図である。
【図２】本発明の実施形態によるデータ処理システムのブロック図である。
【図３】非変性状態下での正常なｖＷＦを含むＥＱＥＬＳ試験における電気泳動スペクトル結果のグラフであり、サンプルにおける各ｖＷＦマルチマーの相対強度はマルチマー移動度の関数として示されており、単位は（μ−ｃｍ）／（ボルト−秒）で、比較のため同一のｖＷＦサンプルのＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ電気泳動ゲルを挿入している。
【図４ａ】ｖＷＦマルチマーのｚ平均の粒径分布のグラフであり、粒径はサンプル中のこのような粒径のマルチマーの数の関数として示されている。
【図４ｂ】ｖＷＦマルチマーのｚ平均の粒径分布のグラフであり、粒径はサンプルのこのような粒径のマルチマーの数の関数として示されている。
【図５】ＰＣＳにより決定されたｖＷＦの散乱に対するイオン強度の影響を示すグラフである。
【図６】本明細書に記載される分光分析法に基づく、ｖＷＦの分子形状に対する温度の影響を示すグラフである。
【図７】本明細書に記載される分光分析法に基づく、ｖＷＦの分子形状に対する溶媒極性の影響を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）マルチマーの電気泳動度分布を分析する方法であって、
複数のｖＷＦマルチマーを含むサンプル媒体を生成することと、
前記サンプル媒体に電界を印加することによって、前記サンプル媒体中の電気泳動度により前記ｖＷＦマルチマーを電気泳動的に分離して、分離されたｖＷＦマルチマーを生成することと、
前記サンプル媒体中の前記分離されたｖＷＦマルチマーを光源に露出して散乱光を生成することと、
前記散乱光を検出することと、
前記分離されたｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布を前記検出された散乱光から決定することと、を含む方法。
【請求項２】
前記分離されたｖＷＦマルチマーの大きさおよび／または重量分布を前記検出された散乱光から算出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電気泳動度分布に基づいてｖＷＦ異常および／または疾患を特定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｖＷＦ異常および／または疾患は、Ｉ型ｖＷＦ病、ＩＩ型ｖＷＦ病、ＩＩＩ型ｖＷＦ病、ＩＩＡ特殊型ｖＷＦ病、ＩＩＢ特殊型ｖＷＦ病、ＩＩＭ特殊型ｖＷＦ病、血小板減少性血栓性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）からなるグループから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記特定する工程は、前記電気泳動度分布を一連のｖＷＦ異常および／または疾患に対応するパラメータと比較することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記パラメータは、前記一連のｖＷＦ異常および／または疾患に対応する複数のスペクトルに基づいている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記電気泳動度分布に基づいてＡＤＡＭＴＳ異常および／または疾患を特定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプル媒体の光子相関分光法（ＰＣＳ）スペクトルを生成することと、
前記試料のＰＣＳスペクトルに基づいて分子の粒度分布を決定することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分子の粒度分布と前記電気泳動度分布とに基づいてｖＷＦ異常および／または疾患を特定することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記決定工程は電気泳動準弾性光散乱分析によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記決定工程は、
測定された自己相関関数からの散乱光に位相シフトを検出することと、
入射光と比較した散乱光のドップラーシフトを検出することと、
その後に散乱粒子の電気泳動度を算出することと、によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記光源はコヒーレント光源である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプル媒体は容器内に供給され、前記電気泳動的に分離する工程は前記容器内の前記サンプル媒体を用いて実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプル媒体は容器内に供給され、前記露出工程と前記検出工程とは両方とも前記容器内の前記サンプル媒体を用いて実行される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記電気泳動的分離工程と、前記露出工程と、前記検出工程は合計時間が５分未満で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記電気泳動的分離工程と、前記露出工程と、前記検出工程は合計時間が１分未満で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記決定された電気泳動度分布は、分子量が１０００万以上のｖＷＦマルチマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記決定された電気泳動度分布は、分子量が２０００万以上のｖＷＦマルチマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプル媒体を生成する工程は、
血漿サンプルを生成することと、
前記血漿サンプルからｖＷＦを精製して前記サンプル媒体を生成することと、によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記フォンビルブランド因子マルチマーはヒトフォンビルブランド因子マルチマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
サンプル媒体中のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）分解酵素の存在を決定する方法であって、
ｖＷＦマルチマーの量を含むサンプル媒体を生成することと、
酵素が前記サンプル中に存在すると、前記サンプル媒体の高分子量のｖＷＦマルチマーが分解されるようにｖＷＦ分解酵素を含むと思われる試料を前記サンプル媒体に加えることと、
前記サンプル媒体に電界を印加することによって、前記サンプル媒体中で電気泳動移動度により前記ｖＷＦマルチマーを電気泳動的に分離して、分離されたｖＷＦマルチマーを生成することと、
前記サンプル媒体中の前記分離されたｖＷＦマルチマーを光源に露出して散乱光を生成することと、
前記散乱光を検出することと、
前記分離されたｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布を前記検出された散乱光から決定することと、
前記電気泳動度分布から前記ｖＷＦ分解酵素の有無を決定することと、を含む方法。
【請求項２２】
前記検出された散乱光から前記分離されたｖＷＦマルチマーの大きさおよび／または重量分布を算出することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプル媒体の光子相関分光法（ＰＣＳ）スペクトルを生成することと、
前記サンプルの前記ＰＣＳスペクトルに基づいて分子の粒度分布を決定することと、をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記分子の粒度分布と前記電気泳動度分布とに基づいて前記ｖＷＦ分解酵素の有無を決定することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｖＷＦ分解酵素はＡＤＡＭＴＳ１３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記光源はコヒーレント光源である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記決定工程は電気泳動準弾性光散乱分析によって実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプル媒体は容器内に供給され、前記電気泳動的に分離する工程は前記容器内の前記サンプル媒体を用いて実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記サンプル媒体は容器内に供給され、前記露出工程と前記検出工程とは両方とも前記容器内の前記サンプル媒体を用いて実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記電気泳動的分離工程と、前記露出工程と、前記検出工程は合計時間が５分未満で実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記電気泳動的分離工程と、前記露出工程と、前記検出工程は合計時間が１分未満で実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記決定された電気泳動度分布は、分子量が１０００万以上のｖＷＦダイマーを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記フォンビルブランド因子マルチマーはヒトフォンビルブランド因子マルチマーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
サンプル媒体中のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）マルチマーの電気泳動度分布を分析するシステムであって、前記システムは、
前記ｖＷＦマルチマーを電気泳動的に分離し、サンプル媒体のｖＷＦマルチマーに対してＥＱＥＬＳスペクトルを生成するよう構成された電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）制御器を備えたＥＱＥＬＳ分光計と、
前記ＥＱＥＬＳ分光計と通信するＥＱＥＬＳ分析器とを備え、
前記ＥＱＥＬＳ分析器は前記ＥＱＥＬＳスペクトルからの前記分離されたｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布を決定するよう構成されているシステム。
【請求項３５】
前記ＥＱＥＬＳ分析器は、前記電気泳動度分布に基づいてｖＷＦ異常および／または疾患を特定するように構成されている、請求項３４記載のシステム。
【請求項３６】
前記ＥＱＥＬＳ分析器は、さらに、前記電気泳動度分布を一連のｖＷＦ異常および／または疾患に対応するパラメータと比較するように構成されている、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３７】
前記パラメータは、前記一連ｖＷＦ異常および／または疾患に対応する複数のスペクトルに基づいている、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３８】
前記ＥＱＥＬＳ分析器は、さらに、前記電気泳動度分布に基づいてＡＤＡＭＴＳ異常および／または疾患を特定するように構成されている、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３９】
前記ＥＱＥＬＳ分光計は、さらに、サンプル媒体の光子相関分光法（ＰＣＳ）スペクトルを生成するように構成され、
前記ＥＱＥＬＳ分析器は、さらに、前記サンプルの前記ＰＣＳスペクトルに基づいて分子の粒度分布を決定するように構成されている、請求項３４に記載のシステム。
【請求項４０】
前記ＥＱＥＬＳ分析器は、前記分子の粒度分布と前記電気泳動度分布とに基づいてｖＷＦ異常および／または疾患を特定するように構成されている、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
サンプル媒体のｖＷＦマルチマーの電気泳動度および／または粒度分布を検出する方法であって、前記方法は、
前記サンプル媒体にエネルギーを照射してエネルギー相互作用出力を生成することと、
前記エネルギー相互作用出力に基づいて前記サンプル媒体のｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布および／または粒度分布を決定することと、を含む方法。
【請求項４２】
前記ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布に基づいて前記サンプル媒体の前記ｖＷＦマルチマーの有無および／または相対量を決定することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
照射するエネルギーは前記サンプル媒体上に照射する光エネルギーを含み、
前記方法は、光子相関分光法（ＰＣＳ）静的光散乱を用いてｖＷＦマルチマーの粒度分布を決定することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
照射するエネルギーは前記サンプル媒体上に照射する光エネルギーを含み、
前記方法は、電気泳動準弾性光散乱法（ＥＱＥＬＳ）および／またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）動的光散乱法を用いて、電気泳動度分布を決定することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記サンプル媒体は血漿または血漿成分を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記サンプル媒体は希釈緩衝食塩水を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記エネルギー相互作用出力は電気泳動または非電気泳動（ＰＣＳ）状態で生成される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
ある一定量の高分子量ｖＷＦを被験者から得られる血漿サンプルに加えることによって前記サンプル媒体を生成することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記サンプル媒体のｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度および／または粒度分布に基づいて、前記血漿サンプルのｖＷＦ代謝酵素の有無を決定することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ｖＷＦ代謝酵素は、内皮からｖＷＦを放出する際にｖＷＦを代謝するＡＤＡＭＴＳ１３および／または酵素を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
分子量が１７６，０００ＭｒのｖＷＦ代謝生成物フラグメントの有無を決定して、前記ｖＷＦ代謝酵素の前記有無を決定する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記被験者から得られる前記血漿サンプルの前記ｖＷＦ代謝酵素の前記有無に基づいて前記被験者の診断を行うことをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
分子量が１７６，０００Ｍｒの前記ｖＷＦ代謝生成物フラグメントの前記有無に基づいて前記被験者の診断を行うことをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記被験者の診断を行うことは、前記サンプル媒体の前記ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度および／または粒度分布に基づいて前記血漿サンプルの前記ｖＷＦ代謝酵素の不足に関連する生理状態の有無または感受性を決定することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記被験者の診断を行うことは、前記サンプル媒体の前記ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度および／または粒度分布に基づいて前記血漿サンプルのＡＤＡＭＴＳ１３の不足に伴う生理状態の有無または感受性を決定することを含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
前記生理状態は、ＴＴＰ，ＨＵＳ、ＴＴＰ／ＨＵＳ、ｖＷＦを放出する内皮の異常機能の原因となる病状、急性冠症候群、糖尿病、高血圧、月経過多および／または腎不全からなるグループから選択される病状を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記被験者の前記ｖＷＦ代謝酵素の存在を増やすのに効果的であり得る治療薬を前記被験者に投与することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
前記治療薬を投与する前に前記被験者から得られる第１サンプルと、前記治療薬を投与した後に前記被験者から得られる第２サンプルとからｖＷＦの電気泳動度および／または粒度分布を決定することと、
前記第１と第２の試料から前記電気泳動度および／または粒度分布に基づいて前記治療薬の効果を評価することと、をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記治療薬は、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３、合成ＡＤＡＭＴＳ１３、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体、合成ＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体からなるグループから選択される、治療に効果的な量のＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ｖＷＦ代謝酵素はＡＤＡＭＴＳ１３を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
被験者を、ＡＤＡＭＴＳ１３の不足または不足に伴う病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあると特定する方法であって、前記方法は、
生理学的サンプルであって、正常な被験者ではＡＤＡＭＴＳ１３が存在するタイプの生理学的サンプルを前記被験者から得ることと、
前記生理学的サンプルに、ある一定量の高分子量（ＨＭＷ）ｖＷＦを加えてサンプル媒体を生成することと、
前記サンプル媒体に静的および／または動的光散乱分光法を実施して、ＡＤＡＭＴＳ１３による前記ＨＭＷｖＷＦの分解に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布および／または粒度分布を決定することと、
ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布に基づいてＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または不足に伴う病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあるとして被験者を特定することと、を含む方法。
【請求項６２】
前記静的および／または動的光散乱分光法を実施する工程は、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）を用いて実行される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記静的および／または動的光散乱分光法を実施する工程は、光子相関分光法（ＰＣＳ）を用いて実行される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記静的および／または動的光散乱分光法を実施する工程は、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いて実行される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布が、分子量が１７６，０００ＭｒのｖＷＦフラグメントを含むかどうかを決定することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
クロマトグラフィー精製を用いて前記サンプル媒体を精製することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
前記サンプル媒体は、前記ＨＭＷｖＷＦおよび／またはＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーに結合し、それに結合されると、前記電気泳動度および粒度分布の決定を向上させるためにＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーの移動度特性を変化させる試薬をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６８】
前記試薬はボトロセチンを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ｖＷＦを代謝するのに効果的な酵素の欠損または不足に関連する病状または生理状態の被験者を検査する方法であって、前記方法は、
前記被験者に、前記酵素の欠損または不足に効力のある治療薬を投与することと、
前記治療薬を投与した後、生理学的サンプルであって、正常な被験者では前記酵素が存在するタイプの生理学的サンプルを前記被験者から得ることと、
前記生理学的サンプルにある一定量のＨＭＷｖＷＦを加えることと、
前記サンプル媒体に静的および／または動的光散乱分光法を実施して、前記酵素による前記ＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布および／または粒度分布を決定することと、
ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布に基づいて前記治療薬の効果の有無を決定することと、を含む方法。
【請求項７０】
前記静的および／または動的光散乱分光法を実施する工程は、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）を用いて実行される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記静的および／または動的光散乱分光法を実施する工程は、光子相関分光法（ＰＣＳ）を用いて実行される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記静的および／または動的光散乱分光法を実施する工程は、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いて実行される、請求項６９に記載の方法
【請求項７３】
ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布が、分子量が１７６，０００ＭｒのｖＷＦフラグメントを含むかどうかを決定することをさらに含む、請求項６９に載の方法。
【請求項７４】
前記酵素によるＨＭＷｖＷＦの代謝によって生成するｖＷＦマルチマーの移動度を決定することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記サンプル媒体は、前記ＨＭＷｖＷＦおよび／またはＡＤＡＭＴＳ１３による前記ＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーに結合し、それに結合されると、前記電気泳動度および粒度分布の決定を向上させるためにＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーの移動度特性を変化させる試薬をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記試薬はボトロセチンを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記酵素はＡＤＡＭＴＳ１３を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７８】
前記治療薬は、前記被験者の前記酵素の量を増加し得る薬剤を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７９】
ｖＷＦマルチマー特性に対してコラーゲン結合分析を用いることをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項８０】
ｖＷＦノルマンディー分析法を用いて、ｖＷＦの不足結合凝固第ＶＩＩＩ因子を特性決定することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項８１】
ＨＭＷｖＷＦマルチマーおよび超巨大ｖＷＦマルチマーに対してｖＷＦを特性決定することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項８２】
ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布に基づいて、敗血症、急性冠動脈症候群、静脈閉塞病、医薬毒性および急性炎症からなるグループから選択される病状または生理状態を診断することをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ｖＷＦの代謝を調整する酵素の欠損または不足に伴う病状または生理状態が現われる危険性を有するかまたはその状態にあるとして被験者を特定するシステムであって、前記システムは、
生理学的サンプルであって、正常な被験者ではＡＤＡＭＴＳ１３が存在するタイプの生理学的サンプルを前記被験者から得る手段と、
前記生理学的サンプルにある量の高分子量（ＨＭＷ）ｖＷＦを加えて、サンプル媒体を生成する手段と、
前記サンプル媒体に静的および／または動的光散乱分光法を実施して、ＡＤＡＭＴＳ１３による前記ＨＭＷｖＷＦの分解に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布および／または粒度分布を決定する手段と、
ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度および／または粒度分布に基づいてＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または不足に伴う病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあるとして被験者を特定する手段と、を備えたシステム。
【請求項８４】
前記特定手段は、前記酵素による前記ＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布および／または粒度分布を算出決定する手段を含む、請求項８４記載のシステム。
【請求項８５】
相関出力を生成して、ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布に基づいて、酵素の欠損または不足に伴う病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあるとして被験者を特定する手段をさらに備える、請求項８４に記載のシステム。
【請求項８６】
被験者のｖＷＦの代謝を調整する酵素の欠損または不足を迅速に決定するための分析キットであって、前記キットは、
被験者から、ある一定量の生理学的サンプルであって正常な被験者では前記酵素が存在するタイプの生理学的サンプルと前記生理学的サンプルに加えるためのある一定量のＨＭＷｖＷＦを得て、前記酵素による前記ＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度および粒度分布のＥＱＥＬＳ（電気泳動準弾性光散乱法）、ＰＣＳ（光子相関分光法）等、またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動法）分析を含む静的光散乱法および／または動的光散乱法のためにサンプル媒体を生成する手段を備え、
前記被験者の前記酵素の欠損または不足を決定できる分析キット。
【請求項８７】
前記迅速な決定を行うために指示書をさらに備えている、請求項８７に記載のキット。
【請求項８８】
前記ＨＭＷｖＷＦおよび／または前記酵素による前記ＨＭＷｖＷＦの分解に起因するｖＷＦマルチマーに結合し、それに結合されると、ＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーの移動度特性を変化させる試薬をさらに含む、請求項８７に記載のキット。
【請求項８９】
前記試薬はボトロセチンである、請求項８８に記載のキット。
【請求項１】
フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）マルチマーの電気泳動度分布を分析する方法であって、
複数のｖＷＦマルチマーを含むサンプル媒体を生成することと、
前記サンプル媒体に電界を印加することによって、前記サンプル媒体中の電気泳動度により前記ｖＷＦマルチマーを電気泳動的に分離して、分離されたｖＷＦマルチマーを生成することと、
前記サンプル媒体中の前記分離されたｖＷＦマルチマーを光源に露出して散乱光を生成することと、
前記散乱光を検出することと、
前記分離されたｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布を前記検出された散乱光から決定することと、を含む方法。
【請求項２】
前記分離されたｖＷＦマルチマーの大きさおよび／または重量分布を前記検出された散乱光から算出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電気泳動度分布に基づいてｖＷＦ異常および／または疾患を特定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｖＷＦ異常および／または疾患は、Ｉ型ｖＷＦ病、ＩＩ型ｖＷＦ病、ＩＩＩ型ｖＷＦ病、ＩＩＡ特殊型ｖＷＦ病、ＩＩＢ特殊型ｖＷＦ病、ＩＩＭ特殊型ｖＷＦ病、血小板減少性血栓性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）からなるグループから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記特定する工程は、前記電気泳動度分布を一連のｖＷＦ異常および／または疾患に対応するパラメータと比較することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記パラメータは、前記一連のｖＷＦ異常および／または疾患に対応する複数のスペクトルに基づいている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記電気泳動度分布に基づいてＡＤＡＭＴＳ異常および／または疾患を特定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプル媒体の光子相関分光法（ＰＣＳ）スペクトルを生成することと、
前記試料のＰＣＳスペクトルに基づいて分子の粒度分布を決定することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分子の粒度分布と前記電気泳動度分布とに基づいてｖＷＦ異常および／または疾患を特定することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記決定工程は電気泳動準弾性光散乱分析によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記決定工程は、
測定された自己相関関数からの散乱光に位相シフトを検出することと、
入射光と比較した散乱光のドップラーシフトを検出することと、
その後に散乱粒子の電気泳動度を算出することと、によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記光源はコヒーレント光源である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプル媒体は容器内に供給され、前記電気泳動的に分離する工程は前記容器内の前記サンプル媒体を用いて実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプル媒体は容器内に供給され、前記露出工程と前記検出工程とは両方とも前記容器内の前記サンプル媒体を用いて実行される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記電気泳動的分離工程と、前記露出工程と、前記検出工程は合計時間が５分未満で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記電気泳動的分離工程と、前記露出工程と、前記検出工程は合計時間が１分未満で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記決定された電気泳動度分布は、分子量が１０００万以上のｖＷＦマルチマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記決定された電気泳動度分布は、分子量が２０００万以上のｖＷＦマルチマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプル媒体を生成する工程は、
血漿サンプルを生成することと、
前記血漿サンプルからｖＷＦを精製して前記サンプル媒体を生成することと、によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記フォンビルブランド因子マルチマーはヒトフォンビルブランド因子マルチマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
サンプル媒体中のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）分解酵素の存在を決定する方法であって、
ｖＷＦマルチマーの量を含むサンプル媒体を生成することと、
酵素が前記サンプル中に存在すると、前記サンプル媒体の高分子量のｖＷＦマルチマーが分解されるようにｖＷＦ分解酵素を含むと思われる試料を前記サンプル媒体に加えることと、
前記サンプル媒体に電界を印加することによって、前記サンプル媒体中で電気泳動移動度により前記ｖＷＦマルチマーを電気泳動的に分離して、分離されたｖＷＦマルチマーを生成することと、
前記サンプル媒体中の前記分離されたｖＷＦマルチマーを光源に露出して散乱光を生成することと、
前記散乱光を検出することと、
前記分離されたｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布を前記検出された散乱光から決定することと、
前記電気泳動度分布から前記ｖＷＦ分解酵素の有無を決定することと、を含む方法。
【請求項２２】
前記検出された散乱光から前記分離されたｖＷＦマルチマーの大きさおよび／または重量分布を算出することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプル媒体の光子相関分光法（ＰＣＳ）スペクトルを生成することと、
前記サンプルの前記ＰＣＳスペクトルに基づいて分子の粒度分布を決定することと、をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記分子の粒度分布と前記電気泳動度分布とに基づいて前記ｖＷＦ分解酵素の有無を決定することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｖＷＦ分解酵素はＡＤＡＭＴＳ１３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記光源はコヒーレント光源である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記決定工程は電気泳動準弾性光散乱分析によって実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプル媒体は容器内に供給され、前記電気泳動的に分離する工程は前記容器内の前記サンプル媒体を用いて実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記サンプル媒体は容器内に供給され、前記露出工程と前記検出工程とは両方とも前記容器内の前記サンプル媒体を用いて実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記電気泳動的分離工程と、前記露出工程と、前記検出工程は合計時間が５分未満で実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記電気泳動的分離工程と、前記露出工程と、前記検出工程は合計時間が１分未満で実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記決定された電気泳動度分布は、分子量が１０００万以上のｖＷＦダイマーを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記フォンビルブランド因子マルチマーはヒトフォンビルブランド因子マルチマーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
サンプル媒体中のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）マルチマーの電気泳動度分布を分析するシステムであって、前記システムは、
前記ｖＷＦマルチマーを電気泳動的に分離し、サンプル媒体のｖＷＦマルチマーに対してＥＱＥＬＳスペクトルを生成するよう構成された電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）制御器を備えたＥＱＥＬＳ分光計と、
前記ＥＱＥＬＳ分光計と通信するＥＱＥＬＳ分析器とを備え、
前記ＥＱＥＬＳ分析器は前記ＥＱＥＬＳスペクトルからの前記分離されたｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布を決定するよう構成されているシステム。
【請求項３５】
前記ＥＱＥＬＳ分析器は、前記電気泳動度分布に基づいてｖＷＦ異常および／または疾患を特定するように構成されている、請求項３４記載のシステム。
【請求項３６】
前記ＥＱＥＬＳ分析器は、さらに、前記電気泳動度分布を一連のｖＷＦ異常および／または疾患に対応するパラメータと比較するように構成されている、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３７】
前記パラメータは、前記一連ｖＷＦ異常および／または疾患に対応する複数のスペクトルに基づいている、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３８】
前記ＥＱＥＬＳ分析器は、さらに、前記電気泳動度分布に基づいてＡＤＡＭＴＳ異常および／または疾患を特定するように構成されている、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３９】
前記ＥＱＥＬＳ分光計は、さらに、サンプル媒体の光子相関分光法（ＰＣＳ）スペクトルを生成するように構成され、
前記ＥＱＥＬＳ分析器は、さらに、前記サンプルの前記ＰＣＳスペクトルに基づいて分子の粒度分布を決定するように構成されている、請求項３４に記載のシステム。
【請求項４０】
前記ＥＱＥＬＳ分析器は、前記分子の粒度分布と前記電気泳動度分布とに基づいてｖＷＦ異常および／または疾患を特定するように構成されている、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
サンプル媒体のｖＷＦマルチマーの電気泳動度および／または粒度分布を検出する方法であって、前記方法は、
前記サンプル媒体にエネルギーを照射してエネルギー相互作用出力を生成することと、
前記エネルギー相互作用出力に基づいて前記サンプル媒体のｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布および／または粒度分布を決定することと、を含む方法。
【請求項４２】
前記ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布に基づいて前記サンプル媒体の前記ｖＷＦマルチマーの有無および／または相対量を決定することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
照射するエネルギーは前記サンプル媒体上に照射する光エネルギーを含み、
前記方法は、光子相関分光法（ＰＣＳ）静的光散乱を用いてｖＷＦマルチマーの粒度分布を決定することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
照射するエネルギーは前記サンプル媒体上に照射する光エネルギーを含み、
前記方法は、電気泳動準弾性光散乱法（ＥＱＥＬＳ）および／またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）動的光散乱法を用いて、電気泳動度分布を決定することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記サンプル媒体は血漿または血漿成分を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記サンプル媒体は希釈緩衝食塩水を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記エネルギー相互作用出力は電気泳動または非電気泳動（ＰＣＳ）状態で生成される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
ある一定量の高分子量ｖＷＦを被験者から得られる血漿サンプルに加えることによって前記サンプル媒体を生成することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記サンプル媒体のｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度および／または粒度分布に基づいて、前記血漿サンプルのｖＷＦ代謝酵素の有無を決定することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ｖＷＦ代謝酵素は、内皮からｖＷＦを放出する際にｖＷＦを代謝するＡＤＡＭＴＳ１３および／または酵素を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
分子量が１７６，０００ＭｒのｖＷＦ代謝生成物フラグメントの有無を決定して、前記ｖＷＦ代謝酵素の前記有無を決定する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記被験者から得られる前記血漿サンプルの前記ｖＷＦ代謝酵素の前記有無に基づいて前記被験者の診断を行うことをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
分子量が１７６，０００Ｍｒの前記ｖＷＦ代謝生成物フラグメントの前記有無に基づいて前記被験者の診断を行うことをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記被験者の診断を行うことは、前記サンプル媒体の前記ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度および／または粒度分布に基づいて前記血漿サンプルの前記ｖＷＦ代謝酵素の不足に関連する生理状態の有無または感受性を決定することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記被験者の診断を行うことは、前記サンプル媒体の前記ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度および／または粒度分布に基づいて前記血漿サンプルのＡＤＡＭＴＳ１３の不足に伴う生理状態の有無または感受性を決定することを含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
前記生理状態は、ＴＴＰ，ＨＵＳ、ＴＴＰ／ＨＵＳ、ｖＷＦを放出する内皮の異常機能の原因となる病状、急性冠症候群、糖尿病、高血圧、月経過多および／または腎不全からなるグループから選択される病状を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記被験者の前記ｖＷＦ代謝酵素の存在を増やすのに効果的であり得る治療薬を前記被験者に投与することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
前記治療薬を投与する前に前記被験者から得られる第１サンプルと、前記治療薬を投与した後に前記被験者から得られる第２サンプルとからｖＷＦの電気泳動度および／または粒度分布を決定することと、
前記第１と第２の試料から前記電気泳動度および／または粒度分布に基づいて前記治療薬の効果を評価することと、をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記治療薬は、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３、合成ＡＤＡＭＴＳ１３、組み換えＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体、合成ＡＤＡＭＴＳ１３の変種、変異体、フラグメントおよび融合体からなるグループから選択される、治療に効果的な量のＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ｖＷＦ代謝酵素はＡＤＡＭＴＳ１３を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
被験者を、ＡＤＡＭＴＳ１３の不足または不足に伴う病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあると特定する方法であって、前記方法は、
生理学的サンプルであって、正常な被験者ではＡＤＡＭＴＳ１３が存在するタイプの生理学的サンプルを前記被験者から得ることと、
前記生理学的サンプルに、ある一定量の高分子量（ＨＭＷ）ｖＷＦを加えてサンプル媒体を生成することと、
前記サンプル媒体に静的および／または動的光散乱分光法を実施して、ＡＤＡＭＴＳ１３による前記ＨＭＷｖＷＦの分解に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布および／または粒度分布を決定することと、
ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布に基づいてＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または不足に伴う病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあるとして被験者を特定することと、を含む方法。
【請求項６２】
前記静的および／または動的光散乱分光法を実施する工程は、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）を用いて実行される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記静的および／または動的光散乱分光法を実施する工程は、光子相関分光法（ＰＣＳ）を用いて実行される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記静的および／または動的光散乱分光法を実施する工程は、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いて実行される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布が、分子量が１７６，０００ＭｒのｖＷＦフラグメントを含むかどうかを決定することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
クロマトグラフィー精製を用いて前記サンプル媒体を精製することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
前記サンプル媒体は、前記ＨＭＷｖＷＦおよび／またはＡＤＡＭＴＳ１３によるＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーに結合し、それに結合されると、前記電気泳動度および粒度分布の決定を向上させるためにＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーの移動度特性を変化させる試薬をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６８】
前記試薬はボトロセチンを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ｖＷＦを代謝するのに効果的な酵素の欠損または不足に関連する病状または生理状態の被験者を検査する方法であって、前記方法は、
前記被験者に、前記酵素の欠損または不足に効力のある治療薬を投与することと、
前記治療薬を投与した後、生理学的サンプルであって、正常な被験者では前記酵素が存在するタイプの生理学的サンプルを前記被験者から得ることと、
前記生理学的サンプルにある一定量のＨＭＷｖＷＦを加えることと、
前記サンプル媒体に静的および／または動的光散乱分光法を実施して、前記酵素による前記ＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布および／または粒度分布を決定することと、
ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布に基づいて前記治療薬の効果の有無を決定することと、を含む方法。
【請求項７０】
前記静的および／または動的光散乱分光法を実施する工程は、電気泳動準弾性光散乱（ＥＱＥＬＳ）を用いて実行される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記静的および／または動的光散乱分光法を実施する工程は、光子相関分光法（ＰＣＳ）を用いて実行される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記静的および／または動的光散乱分光法を実施する工程は、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いて実行される、請求項６９に記載の方法
【請求項７３】
ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布が、分子量が１７６，０００ＭｒのｖＷＦフラグメントを含むかどうかを決定することをさらに含む、請求項６９に載の方法。
【請求項７４】
前記酵素によるＨＭＷｖＷＦの代謝によって生成するｖＷＦマルチマーの移動度を決定することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記サンプル媒体は、前記ＨＭＷｖＷＦおよび／またはＡＤＡＭＴＳ１３による前記ＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーに結合し、それに結合されると、前記電気泳動度および粒度分布の決定を向上させるためにＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーの移動度特性を変化させる試薬をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記試薬はボトロセチンを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記酵素はＡＤＡＭＴＳ１３を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７８】
前記治療薬は、前記被験者の前記酵素の量を増加し得る薬剤を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７９】
ｖＷＦマルチマー特性に対してコラーゲン結合分析を用いることをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項８０】
ｖＷＦノルマンディー分析法を用いて、ｖＷＦの不足結合凝固第ＶＩＩＩ因子を特性決定することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項８１】
ＨＭＷｖＷＦマルチマーおよび超巨大ｖＷＦマルチマーに対してｖＷＦを特性決定することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項８２】
ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布に基づいて、敗血症、急性冠動脈症候群、静脈閉塞病、医薬毒性および急性炎症からなるグループから選択される病状または生理状態を診断することをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ｖＷＦの代謝を調整する酵素の欠損または不足に伴う病状または生理状態が現われる危険性を有するかまたはその状態にあるとして被験者を特定するシステムであって、前記システムは、
生理学的サンプルであって、正常な被験者ではＡＤＡＭＴＳ１３が存在するタイプの生理学的サンプルを前記被験者から得る手段と、
前記生理学的サンプルにある量の高分子量（ＨＭＷ）ｖＷＦを加えて、サンプル媒体を生成する手段と、
前記サンプル媒体に静的および／または動的光散乱分光法を実施して、ＡＤＡＭＴＳ１３による前記ＨＭＷｖＷＦの分解に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布および／または粒度分布を決定する手段と、
ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度および／または粒度分布に基づいてＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または不足に伴う病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあるとして被験者を特定する手段と、を備えたシステム。
【請求項８４】
前記特定手段は、前記酵素による前記ＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度分布および／または粒度分布を算出決定する手段を含む、請求項８４記載のシステム。
【請求項８５】
相関出力を生成して、ｖＷＦマルチマーの前記電気泳動度分布および／または粒度分布に基づいて、酵素の欠損または不足に伴う病状または生理状態が発生する危険性を有するかまたはその状態にあるとして被験者を特定する手段をさらに備える、請求項８４に記載のシステム。
【請求項８６】
被験者のｖＷＦの代謝を調整する酵素の欠損または不足を迅速に決定するための分析キットであって、前記キットは、
被験者から、ある一定量の生理学的サンプルであって正常な被験者では前記酵素が存在するタイプの生理学的サンプルと前記生理学的サンプルに加えるためのある一定量のＨＭＷｖＷＦを得て、前記酵素による前記ＨＭＷｖＷＦの代謝に起因するｖＷＦマルチマーの電気泳動度および粒度分布のＥＱＥＬＳ（電気泳動準弾性光散乱法）、ＰＣＳ（光子相関分光法）等、またはＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動法）分析を含む静的光散乱法および／または動的光散乱法のためにサンプル媒体を生成する手段を備え、
前記被験者の前記酵素の欠損または不足を決定できる分析キット。
【請求項８７】
前記迅速な決定を行うために指示書をさらに備えている、請求項８７に記載のキット。
【請求項８８】
前記ＨＭＷｖＷＦおよび／または前記酵素による前記ＨＭＷｖＷＦの分解に起因するｖＷＦマルチマーに結合し、それに結合されると、ＨＭＷｖＷＦおよび／またはｖＷＦマルチマーの移動度特性を変化させる試薬をさらに含む、請求項８７に記載のキット。
【請求項８９】
前記試薬はボトロセチンである、請求項８８に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００７−５３０９１２（Ｐ２００７−５３０９１２Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１８８６７（Ｐ２００６−５１８８６７）
【出願日】平成１６年７月７日（２００４．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１７１５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００８２４１
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｌｉｎｕｘ
【出願人】（５００２８２２０９）ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月７日（２００４．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１７１５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００８２４１
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｌｉｎｕｘ
【出願人】（５００２８２２０９）ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル (14)
【Ｆターム（参考）】
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