フコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法
【課題】藻類から高純度のＦＣＰを高収量で取得できる製造方法を提供すること。
【解決手段】
次の工程（１）〜（４）；
（１）オキナワモズクの盤状体または糸状体を細胞破砕処理してチラコイド膜を分離す
る工程
（２）得られたチラコイド膜を界面活性剤含有緩衝液で可溶化してチラコイド膜の可溶
化液を得る工程
（３）得られた可溶化液をイオン交換クロマトグラフィーに供し粗フコキサンチン−ク
ロロフィルａ／ｃタンパク質を得る工程
（４）得られた粗フコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質をゲルろ過クロマト
グラフィーまたは限外ろ過に供する工程
を含むことを特徴とするフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法。
【解決手段】
次の工程（１）〜（４）；
（１）オキナワモズクの盤状体または糸状体を細胞破砕処理してチラコイド膜を分離す
る工程
（２）得られたチラコイド膜を界面活性剤含有緩衝液で可溶化してチラコイド膜の可溶
化液を得る工程
（３）得られた可溶化液をイオン交換クロマトグラフィーに供し粗フコキサンチン−ク
ロロフィルａ／ｃタンパク質を得る工程
（４）得られた粗フコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質をゲルろ過クロマト
グラフィーまたは限外ろ過に供する工程
を含むことを特徴とするフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法に関し、更に詳細には、オキナワモズクの盤状体または糸状体を原料とし、高純度のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質を高収量で得ることが可能なフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フコキサンチン-クロロフィルａ／ｃタンパク質(以下、「ＦＣＰ」ということがある)は、フコキサンチンとクロロフィルが結合した、光合成初期過程において光エネルギーを受容して反応中心に伝達する周辺アンテナ色素-タンパク複合体であり、主として褐藻・珪藻類の光合成膜（チラコイド膜）内に存在する。
【０００３】
このような光合成タンパク質に結合する光合成色素は、近年太陽電池に用いる増感色素としての応用が検討されており、最近では光合成タンパク質そのものをも太陽電池として応用する可能性が検討されてきている。また、ＦＣＰを構成するフコキサンチンには、種々の生理活性が見出されており、体内摂取による抗腫瘍効果（特許文献１）や神経細胞保護効果（特許文献２）、血糖値上昇抑制効果（特許文献３）等が報告されている。フコキサンチンは、生体内ではＦＣＰに結合した状態で安定に存在しており、単離したＦＣＰから容易に分離することができるため、ＦＣＰはフコキサンチンを製造するための中間原料としても有用である。
【０００４】
しかしながら、これまでＦＣＰについて、珪藻類であるキクロテラ・メネギニアーナ（Cyclotella meneghiniana）やジャイアントケルプ（Ｍacrocystis pyrifera）から単離されたという報告があるのみであり（非特許文献１〜３）、ＦＣＰを多量に高純度で分離・精製する方法については、ほとんど検討されていないのが実情であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−１５８１５６号公報
【特許文献２】特開２００１−３３５４８０号公報
【特許文献３】特開２００７−２９７３７０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Supramolecular Assembly of Fucoxanthin-Chlorophyll-Protein Complexes Isolated from a Brown Alga,Petalonia fascia.Electron Microscopic Studies,Tetzuya Katoh and Tomoko Ehara,Plant Cell Physiol.1990,31(4),439-447
【非特許文献２】Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States ,Claudia Bu¨chel, Biochemistry 2003, 42, 13027-13034
【非特許文献３】Subunit Composition and Pigmentation of Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involved in Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding,Anja Beer, Kathi Gundermann, Janet Beckmann, and Claudia Bu¨chel, Biochemistry 2006, 45, 13046-13053
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、藻類から高純度のＦＣＰを高収量で取得できる分離・精製方法の確立が望まれており、本発明は、そのようなＦＣＰの製造方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究をした結果、沖縄原種の褐藻類であるオキナワモズク(Cladosiphon okamuranus)について、藻体の前駆体である盤状体または糸状体は、成熟藻体に比べて単位重量当たりのチラコイド膜量が多く、またチラコイド膜を可溶化し、これをイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過カラムクロマトグラフィーで精製することによって、高純度のＦＣＰを高収量で得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
次の工程（１）〜（４）；
（１）オキナワモズクの盤状体または糸状体を細胞破砕処理してチラコイド膜を分離す
る工程
（２）得られたチラコイド膜を界面活性剤含有緩衝液で可溶化してチラコイド膜の可溶
化液を得る工程
（３）得られた可溶化液をイオン交換クロマトグラフィーに供し粗フコキサンチン−ク
ロロフィルａ／ｃタンパク質を得る工程
（４）得られた粗フコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質をゲルろ過クロマト
グラフィーまたは限外ろ過に供する工程
を含むことを特徴とするフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の製造方法によれば、生体における構造を維持した高純度のＦＣＰを高収量で得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１におけるイオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図２】実施例１におけるゲルろ過クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図３】比較例１においてチラコイド膜の可溶化液をショ糖密度勾配超遠心分離した写真（ａ）および各バンドの吸収スペクトル（ｂ）である。
【図４】比較例１におけるイオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図５】比較例２においてチラコイド膜の可溶化液をショ糖密度勾配超遠心分離した写真（ａ）および各バンドの吸収スペクトル（ｂ）である。
【図６】比較例２におけるゲルろ過クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図７】試験例１における各精製ＦＣＰの吸収スペクトルである。
【図８】試験例１における各精製ＦＣＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図である。
【図９】試験例２におけるゲルろ過ＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図１０】試験例２におけるゲルろ過ＨＰＬＣにより溶出時間と分子量をプロットした図である。
【図１１】試験例３におけるＣＮ−ＰＡＧＥ泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明においては、原料の褐藻類として、ナガマツモ科（Chordaceae）のオキナワモズク（Cladosiphon okamuranus）を使用する。また、オキナワモズクは、成熟体から遊走子の放出、遊走子から盤状体または糸状体の発生、盤状体または糸状体の着床による直立体の形成、直立体から成熟体への成長という生育サイクルを有するが、本発明ではこのうちの、盤状体または糸状体を用いる。なお、盤状体または糸状体は、上記生育サイクルのうちの遊走子と直立体の中間に位置するものであり、別名で呼ばれることもがあるが、本発明においてはこれらの何れも含む。
【００１３】
上記盤状体または糸状体（以下、「盤状体等」ということがある）は、天然由来のものであってもよいが、人工的に培養されたものを使用することが好ましく、特に盤状体等の種苗を直立体を形成させない条件で培養、増加されたものを利用することにより、多量に盤状体等を得ることができるので好ましい。
【００１４】
上記の直立体を形成させない条件での培養は、オキナワモズクの盤状体等の種苗を、培養容器へ着床させない条件で培養することにより行われ、例えば、連続攪拌培養したり、着床しにくい材料で形成した培養容器中で培養すれば良い。
【００１５】
具体的に、連続攪拌により直立体を形成させずに培養する場合は、攪拌子や攪拌機による機械攪拌や、通気等による攪拌を行い、培養液全体を攪拌しながら培養すれば良い。なお、フラスコ等で培養を行う場合には、攪拌と同時に炭酸供給が行えるため通気による攪拌が好ましく、培養タンク等で培養を行う場合には効率の点から機械攪拌が好ましい。攪拌条件は容器の大きさ等により適宜変化するが、例えば、培養容器として５ｌの容量の平底フラスコを用い、通気による攪拌を行う場合には、培養容器内に空気を０．１ｌ／分〜１０ｌ／分、好ましくは１ｌ／分〜５ｌ／分で導入すれば良い。
【００１６】
上記培養の際に用いる培養液は、オキナワモズクの盤状体等を培養することができるものであれば特に制限されないが、滅菌された人工海水または海水に、窒素、リン酸等を含む栄養塩、ホウ素、マンガン等の微量元素、ＥＤＴＡ等のキレート剤、ビタミンＢ群等の栄養素等（以下、これらを「栄養成分」という）を添加した培養液が好ましく、特に前記栄養成分の内、栄養塩、微量元素およびキレート化合物を添加した培養液が好ましい。これらの栄養成分は０．０１〜１０質量％、好ましくは０．１〜１質量％（以下、単に「％」という）の濃度で培養液に存在することが好ましい。これらの栄養成分は、例えば、ＫＷ−２１（第一製網製）の商品名で市販されている藻類培養液を用いることができ、これを上記濃度で添加すれば良い。
【００１７】
また、この培養は恒温条件下で行うことが好ましく、具体的には培養容器を恒温槽等で１５℃〜３５℃、好ましくは２０℃〜３０℃の温度に保ち培養を行えば良い。
【００１８】
更に、この培養は光照射条件下で行うことが好ましく、具体的には５００ルクス〜３０,０００ルクス、好ましくは４,０００ルクス〜１０,０００ルクスの照度、８Ｌ：１６Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄ、好ましくは１２Ｌ：１２Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄの光周期で照射を行えば良い。
【００１９】
上記した培養方法により、オキナワモズクの盤状体等のみを繰り返し、増殖させて培養することができる。なお、盤状体等は、培養容器中に着床すると、すぐに直立体を形成し、成熟体にまで成長してしまうので、盤状体等を着床させることは盤状体等を多く得るためには適さない。
【００２０】
上記の培養方法に使用するオキナワモズクの盤状体等の種苗は、例えば、次のようにして得ることができる。すなわち、まず、単子嚢を形成していない母藻を数本程度と、盤状体等が着床することのできる物質（以下、「着床担体」という）とを共に滅菌海水に入れ、恒温条件で培養し、遊走子から変化した盤状体または糸状体を着床担体に着床させる。
【００２１】
ここで着床担体としては、ガラス、アクリル、プラスチック、ポリカーボネート、繊維、岩石、砂等が好ましく、特にガラス板（スライドガラス）、アクリル板が好ましい。また、滅菌海水は海水または人工海水をオートクレーブあるいはろ過することにより得られる。この滅菌海水には、上記盤状体等の培養と同様に、栄養素、微量元素、キレート剤およびビタミン類等の栄養成分を適宜添加することができる。
【００２２】
盤状体等が着床担体に着床するまでの培養は、上記盤状体等の培養と同様の条件で行えば良い。また、前記培養と同時に、盤状体等が着床担体に着床できる程度に通気等の攪拌を行っても良い。
【００２３】
次いで、盤状体等が着床した着床担体を取りだし、滅菌海水で洗浄した後、上記盤状体等の培養と同様の条件で再度培養する。
【００２４】
上記盤状体等が着床した着床担体の培養においては、培養２、３日後から１日おきに平筆よる洗浄を行う。この洗浄に用いる水としては、滅菌海水および水道水が使用されるが、水道水での洗浄は１０秒以内で行うことが好ましい。
【００２５】
上記盤状体等が着床した着床担体の培養開始後８日〜１０日の十分に成長した盤状体等を、検鏡（１００倍）により雑藻の少ない部分を選んで掻き取って盤状体等の種苗とすることができる。また、必要により上記で掻き取った盤状体等を試験管に入れて滅菌海水を使用して３回程度ピペッティングで洗浄し、その後、寒天平板（海水に０．５〜１０％の寒天と０．０１〜１０％の栄養成分（藻類培養液）を添加した寒天培地）に塗りつけて、温度１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃、照度５００〜３０,０００ルクス、好ましくは４,０００〜１０,０００ルクス、光周期８Ｌ：１６Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄ、好ましくは１２Ｌ：１２Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄの条件下で培養しても良い。この培養から２０〜３０日後、寒天平板に増殖してきた盤状体等のうち、雑藻が混入していないコロニーを選択し、これを掻き取って盤状体等の種苗とすることができる。
【００２６】
上記のようにして得られたオキナワモズクの盤状体等は、成熟藻体と比べて単位重量当たりのチラコイド膜量が多く、また硬い皮膜がないためチラコイド膜を抽出しやすく、疎水性であるＦＣＰを生体条件を保ったまま取り出すことが可能である。
【００２７】
次に上記オキナワモズクの盤状体等の細胞を破砕してチラコイド膜を分離する。細胞破砕方法としては、例えば、物理的処理、化学的処理、酵素的処理、加熱処理、自己消化、浸透圧溶解、原形質溶解等を挙げることができる。これらの中でも物理的処理が好ましく、具体的には、高圧ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー、フレンチプレス等による処理、あるいはこれらの組み合わせを例示できる。これらの中でも、直接物理的にタンパク質を破壊する恐れが無く、最もマイルドな処理方法であるためフレンチプレスが好ましく、その圧力は通常100〜180ＭＰａ程度であり、好ましくは140〜160ＭＰａである。フレンチプレス処理にあたっては、盤状体等を予め水、緩衝液等で５〜１０倍程度に希釈することにより、チラコイド膜の収率を向上させることができる。
【００２８】
細胞破砕処理においては、0〜10℃程度の低温下で行うことにより、ＦＣＰの変性を抑制しながら、内在性のプロテアーゼによるＦＣＰの分解を抑制することができる。特にクロロフィルa分解酵素の活性は非常に強いため、EDTAを添加して活性を抑制しているが、低温下でのすばやい処置を取る他に効き目は無い。プロテアーゼ阻害剤を使用した場合、同時に添加する塩によってＦＣＰ中の色素の結合安定性に影響を及ぼすおそれがある上、このクロロフィルa分解酵素の活性は特に落ちないため、これを加えることは好ましくない。また、希釈倍率が低く、破砕処理溶液の粘性が高くなると処理中に熱を発生し、低温条件を保つことが困難となり、望ましくない。
【００２９】
得られた破砕物を遠心分離等の固液分離手段に供することにより、チラコイド膜を分離することができる。例えば、破砕物を12,000ｇで20分遠心分離に供し、細胞壁等を沈下させる一方、チラコイド膜を含有する上清を分離することができる。さらに、上清を75,000 ｇ、60分超遠心分離処理すると、粗チラコイド膜が沈下する。この沈殿をさらに40,000ｇ、20分程度超遠心分離に供することにより、低い分子量の不純物を除き、チラコイド膜を濃縮した沈殿が得られる。
【００３０】
次いで、分離したチラコイド膜を界面活性剤含有緩衝液で可溶化させる。緩衝液は、特に限定されるものではないが、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｍｅｓ緩衝液等が好適に使用できる。またｐＨは、一般的に6〜8の範囲が好ましく、さらに7.5付近が好ましい。緩衝剤の濃度は、通常10〜50ｍＭ程度が適当である。界面活性剤としては、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、オクチルスクロース、トリトンＸ−１００（登録商標）等の非イオン性界面活性剤が使用できるが、中でもＤＤＭがＦＣＰの変性を抑制しつつ、チラコイド膜からＦＣＰを選択的に可溶化できることから好ましい。界面活性剤の濃度は、それぞれに固有のｃｍｃ(臨界ミセル濃度)で決められる。濃度が高いほうが可溶化能も高いが蛋白質の分解を招く場合があるため、なるべく低く保つ最適化が好ましい。また、界面活性剤の濃度はチラコイド膜の濃度にも依存するため、ｃｍｃとチラコイド膜の濃度に応じて適宜設定される。例えば、チラコイド膜をクロロフィル濃度0.25mg/mLで添加し界面活性剤としてＤＤＭを使用する場合、ＤＤＭ濃度は、０．４〜０．６ｗ／ｖ％程度が好適である。このようにしてチラコイド膜を界面活性剤含有緩衝液に添加し、0〜4℃、20分程度インキュベートすることにより、チラコイド膜を可溶化できる。
【００３１】
得られたチラコイド膜の可溶化液を、イオン交換クロマトグラフィーに供する。用いるイオン交換樹脂としては、弱陰イオン交換樹脂が好ましい。弱陰イオン交換樹脂としては、DEAE-Sepharose Fast Flow(GEヘルスケア社製)、DE52（ワットマン社製）などの市販品がある。溶離液のｐＨは、一般的にｐＨ6〜8であればよい。溶離液は、ＦＣＰを安定化して保存するのに最適な緩衝液と界面活性剤濃度を選択することが好ましく、この観点から上記チラコイド膜の可溶化で使用可能な緩衝剤および界面活性剤を用い得るが、界面活性剤濃度はより低くすることが好適である。ＤＤＭを使用する場合は、０．０３〜０．０７５ｗ／ｖ％の範囲が好ましい。
【００３２】
イオン交換クロマトグラフィーにあたっては、イオン強度を経時的に変化させて溶離液に濃度勾配をつけることが好ましい。例えば、ＮａＣｌを用いて、リニア型、カーブ型、ステップワイズ型などの任意の変化方法によってイオン強度を経時的に変化させることができる。また、溶離液の流速は、一般的に0.5〜1.5ｍＬ／分程度であるが、カラムにパックされるゲルの最大圧力を考慮して適宜設定すればよい。このような分離条件により、粗ＦＣＰのピークが明確に分離されたクロマトグラムを得ることができ、当該ピークの分画を分離回収することにより、粗ＦＣＰが得られる。
【００３３】
得られた粗ＦＣＰは、さらにゲルろ過クロマトグラフィーまたは限外ろ過に供し精製される。ゲルろ過材としてはデキストラン系、アガロース系、セルロース系、アクリルアミド系等の一般的なものを使用できるが、約20〜500kDａの分子量を有する物質を分画できるゲルが好ましく、例えば、Superdex200PG(GEヘルスケア社製)等が好適に用いられ得る。溶離液は、イオン交換クロマトグラフィーと同様である。流速はカラムの径に合わせて中圧を保つ流速であることが望ましく、例えば、Hi Load 26/60 superdex 200PG であれば1.5〜2.0ｍＬ／分程度が分離がよい。一方、分子量分画としてゲルろ過クロマトグラフィーと同様の原理を持つ限外ろ過によっても精製が可能である。限外ろ過の素材としては酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリアクリロニトリル、セラミック等が利用でき、構造としては中空糸膜、スパイラル膜、平膜等の一般的なものが利用できるが、約20〜500kDａの分子量を有する物質を分画できるポアサイズが好ましく、例えば旭化成ラボモジュール AHP-1010、旭化成ラボモジュール SIP-1013等を組み合わせて使用することにより目的の分子量の蛋白質を選択的に取得できる。
【００３４】
以上のようにして得られるＦＣＰは、クロロフィルおよびフコキサンチンが安定に結合して生体条件を維持しているとともに、他の精製方法と比較して純度が高いものである。ＦＣＰは、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が５４〜５６ｋＤａであり、約１８．２ｋＤａと約１７．５ｋＤａのサブユニットから構成される。また、ＦＣＰはＮ末端にSer-Phe-Glu-Ser-Glu-Ile-Gly-Ala-Glnのアミノ酸配列を含み、ＦＣＰ遺伝子由来のアミノ酸配列が報告されている唯一の褐藻類であるケルプ（Ｍacrocystis pyrifera）由来のＦＣＰタンパク5種類とホモロジーが認められる。
【実施例】
【００３５】
以下に、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００３６】
参 考 例 １
オキナワモズク盤状体の培養：
（盤状体種苗の調製）
天然産のオキナワモズクを母藻とし、これを滅菌海水（海水を９０〜１００℃に加熱後冷却したもの）でよく洗浄後、検鏡して単子嚢が形成されていないことを確認して１０ｃｍにカットした。カットして得られた３本の母藻を滅菌海水を満たした５００ｍｌビーカーにスライドガラスと共に入れ、盤状体がスライドガラス上に着床できる程度の弱通気下、２５℃の恒温槽（ＮＬＲ３５０：サンヨー製）中、光照射条件下で培養した。光照射条件は、照度５,０００ルクス、光周期１２Ｌ：１２Ｄとした。培養２４時間後に盤状体が着床したスライドガラスを取りだし、滅菌海水で洗浄したあと、滅菌海水に藻類培養液（ＫＷ２１：第一製網（株）製）を０．２５ｍｌ／ｌの濃度で添加した培地を満たした２００ｍｌコニカルビーカーに移して培養を開始した。
【００３７】
コニカルビーカーでの培養３日後から１日おきにナイロン平筆（ＦＭＦ−１５：（株）アサヒペン製）を用いて洗浄を行った。洗浄に用いる洗浄用水には滅菌海水と水道水を使用した。水道水での洗浄は流水にして１０秒以内で行うようにした。培養から８日〜１０日後の十分成長した盤状体は、検鏡（１００倍）により雑藻の少ない部分を選んでカミソリで掻き取った。この盤状体を試験管に入れて滅菌海水を使用してピペッティングで３回洗浄した。洗浄後、寒天平板（海水に１．０％の寒天と０．１％の藻類培養液を添加した寒天培地）に塗りつけて恒温槽を用いて、温度２３℃、照度４,０００ルクス、光周期１２Ｌ：１２Ｄの条件下で培養した。培養から２０〜３０日後、寒天平板に盤状体が増殖してきたので、雑藻が混入していないコロニーを選択してとり、別の寒天平板に移植してオキナワモズクの盤状体種苗を調製した。
【００３８】
（盤状体の培養）
藻類培養液（ＫＷ２１：第一製網（株）製）を０．１％添加したろ過海水を１２０℃で１５分間オートクレーブしたものを培養液とした。この培養液４ｌを５ｌの平底フラスコに入れ、これに実施例１で調製したオキナワモズク盤状体種苗を５ｇ加え、空気を４．６ｌ／分で導入し、温度２３℃、照度４,０００ルクス、光周期１２Ｌ：１２Ｄの条件下で１週間培養した。１週間培養後、盤状体は１７．５ｇとなり、培養開始時の３．５倍の重量となった。また、検鏡の結果、盤状体の大きさの変化はほとんど認められなかったことから、この重量の増加は盤状体の成長によるものでなく、盤状体の増殖によるものであった。また、培養液中に直立体の形成は認められなかった。
【００３９】
実 施 例 １
ＦＣＰの分離・精製：
（細胞破砕処理）
参考例１で得られたオキナワモズクの盤状体をMes buffer (pH 6.5)(10mM MES/KOH pH 6.5, 2 mM KCl, 5 mM EDTA)で１０倍に希釈してホモジナイズした後、４℃、１５０ＭＰａでフレンチプレス破砕した。破砕物を遠心分離（１２,０００ｇ、２０分、４℃）して上清を分取した。上清を超遠心分離処理（７５,０００ｇ、６０分、４℃）し、沈殿をホモジナイズ後、さらに超遠心分離処理（４０,０００ｇ、２０分、４℃）し、沈殿としてチラコイド膜を得た。
【００４０】
（チラコイド膜の可溶化）
得られた沈殿を10mM b-dodecyl maltoside(DDM)含有10mM Mes buffer (pH 6.5)に、クロロフィルａ濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、４℃で２０分間インキュベートした。
【００４１】
（イオン交換クロマトグラフィー）
得られた可溶化液について、以下の条件によりイオン交換クロマトグラフィーを行った。結果を図１に示す。図１中のIは、遊離色素、IIは粗ＦＣＰ、IIIは光化学系複合体のピークである。IIのピークを分取して粗ＦＣＰを得た。
カラム：DEAE-sepharose Fast Flow(GEヘルスケア社製)
溶離液：0-0.75M NaCl, 0.03% DDM,2mM KCl, 25mM Tris-HCl pH7.4(NaCl濃度:0〜20
分(0M)+20〜100分(0→0.2M)+100〜120分(0.2→0.75M)
流 速：2.0ml/min.
検 出：フォトダイオードアレイ, 250-700nm
【００４２】
（ゲルろ過クロマトグラフィー）
得られた画分について、下記条件によるゲルろ過クロマトグラフィーに供した。結果を図２に示す。図に示すピークを分取して精製ＦＣＰを得た。
カラム：Hi Load 26/60 superdex 200PG(GEヘルスケア社製)
溶離液：0.03% DDM, 2mM KCl, 25mM Tris-HCl pH7.4
流 速：2.0ml/min.
検 出：UV,254nm
【００４３】
比 較 例 １
実施例１と同様にして得たチラコイド膜の可溶化液について、ショ糖密度勾配超遠心分離により分画を行った。ショ糖密度勾配の条件は10%-20%-30%-40%で行い、２００,０００ｇ,１６時間超遠心分離を行った。結果を図３に示す。得られた分画のうち、band2を分取し、以下の条件によるイオン交換クロマトグラフィーに供した。結果を図４に示す。ＩＶのピークを分取し、精製ＦＣＰを得た。
カラム：DEAE Sepharose Fast Flow(GEヘルスケア社製)
溶離液：0-0.75M NaCl, 0.03% DDM,2mM KCl, 25mM Tris-HCl pH7.4(NaCl濃度:0〜20
分(0M)+20〜100分(0→0.2M)+100〜120分(0.2→0.75M)
流 速：2.0ml/min.
検 出：フォトダイオードアレイ, 250-700nm
【００４４】
比 較 例 ２
実施例１と同様にして得たチラコイド膜の可溶化液について、ショ糖密度勾配超遠心分離により分画を行った。ショ糖密度勾配の条件は10%-20%-30%-40%で行い、２００,０００ｇ,１６時間超遠心分離を行った。結果を図５に示す。得られた分画のうち、band2を分取し、以下の条件によるゲルろ過クロマトグラフィーに供した。結果を図６に示す。図６に示されるピークを分取し、精製ＦＣＰを得た。
カラム：Hi Load 26/60 superdex 200PG(GEヘルスケア社製)
溶離液：0.03% DDM, 2mM KCl, 25mM Tris-HCl pH7.4
流 速：2.0ml/min.
検 出：UV,254nm
【００４５】
試 験 例 １
FCPの光合成活性および純度の評価：
実施例１および比較例１〜２で得られた精製ＦＣＰを緩衝液(0.03% DDM, 25mM Tris-HCl pH7.4)で溶解し、分光光度計により、それぞれの吸収スペクトルを測定した。結果を図７に示す（Ａ：比較例１、Ｂ：実施例１、Ｃ：比較例２）。フコキサンチンの結合は、クロロフィルｃと比べて弱いと考えられるが、結合したフコキサンチンを示す５３０ｎｍの吸光度とクロロフィルｃを示す４３７ｎｍにおける吸光度の比（Ａ５３０／Ａ４３７）によって、ＦＣＰが生体条件を維持した状態で分離されているか否か評価し得る。図７より、実施例１（Ｂ）と比較例１（Ａ）は、Ａ５３０／Ａ４３７が０．３となり、０．２５である比較例２（Ｃ）と比べて、より色素の結合が安定に維持された状態で分離されていることが示された。また、それぞれの精製ＦＣＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢ染色したところ、ＦＣＰを構成するサブユニットの１７〜１８ｋＤａ付近のバンド以外の場所には、実施例１（Ｂ）では何も検出されなかった。以上より、実施例１の精製ＦＣＰが、生体条件を維持した状態で、かつ高純度であることが示された。
【００４６】
さらに、比較例２（Ｃ）のバンドについてＰＶＤＦ膜に転写後、アミドブラック染色を行ったところ、１８．２ｋＤａ,１７．５ｋＤａの２本のバンドが確認され、ＦＣＰのサブユニットは１８．２ｋＤａ,１７．５ｋＤａの２種類存在することが示唆された。
【００４７】
試 験 例 ２
ゲルろ過ＨＰＬＣによるＦＣＰの分析：
実施例１および比較例１〜２で得られた精製ＦＣＰについて以下の条件によりゲルろ過ＨＰＬＣによる分析を行った。結果を図９および１０に示す。図９より、比較例１および２の精製ＦＣＰ（ＦＣＰ−ＡおよびＣ）では、不純物と考えられるピークがみられるのに対し、実施例１の精製ＦＣＰ（Ｂ）では、この不純物のピークは全く無くなり、純度が高いことが示された。また図１０より、ＦＣＰの分子量は約５５ｋＤａであり、３量体を形成していることが示された。
（ゲルろ過ＨＰＬＣ条件）
カラム：TOSOH TSKgel G4000PWXL
溶離液：0.075% DDM, 2mM KCl, 25mM Tris-HCl pH7.4
流 速：1.0ml/min.
検 出：フォトダイオードアレイ, 250-700nm
【００４８】
試 験 例 ３
界面活性剤の検討：
オキナワモズク盤状体より調製したチラコイド膜(4.5μｇクロロフィルa：チラコイド膜の濃度は、メタノールで抽出して660nmの吸光度を測定し、クロロフィルa濃度を決定してクロロフィルaのグラム数あたりで算出)を遠沈し、上澄み液を除去したものに、懸濁液を加えて懸濁し、全体で30マイクロリットルの溶液にした。これに下記（I）〜（IV）の界面活性剤溶液を10マイクロリットル加えて氷上で10分間攪拌した。これを一度遠心して上澄みを取りだし可溶化液とした。（1）、（2）はそれぞれ界面活性剤溶液(I)、(II)を用いて一度可溶化した残渣を同じ界面活性剤溶液で再度可溶化したものである。（3）〜（6）はそれぞれ界面活性剤溶液(I)〜(IV)を用いて可溶化したものである。これらの可溶化液を懸濁液で二倍希釈したものを10マイクロリットルずつ電気泳動用ゲルのウェルにロードした。Clear Native PAGE(文献参照：Advantages and limitations of clear-native PAGE, Ilka Wittig and Hermann Schagger, Proteomics 2005, 5,4338-4346)と呼ばれる非破壊条件のポリアクリルアミド電気泳動を行なった。標品として分子量マーカー(Invitrogen社製,NativeMark、図11中ではＭの表示)の他、単離したFCP(図11中ではＦの表示)を同時に泳動した。得られたゲルをクマシブリリアントブルー染色したものを図11に示した。
【００４９】
懸濁液：25%(v/v)Grycerol,50mM Tris-HCl pH 70, 10mM MgCl2, 120mM 6-Amino
hexanoic acid
界面活性剤溶液：(I) 10％(w/v) DDM aq.
(II) 5% (v/v) Triton X-100 aq.
(III) 5% (v/v) LDAO (Lauryldimethylamine-oxide) aq.
(IV) 5% (w/v) LDS (Lithium dodecyl sulfate) aq.
電気泳動条件：
ゲル：BioRad社製レディーゲルＪ（5-15％）
アノード液：25ｍＭTris-HCl pH 7.0
カソード液：50mM Tricine, 7.5mM Tris,0.05% Triton X-100, 0.05% DOC(Deoxycholic acid)
定電流：4mA
温度：4度
【００５０】
ＦＣＰのバンドが最もはっきり検出できたのは、ＤＤＭで一回可溶化した（3）のみであった。ＤＤＭで二回目可溶化した(1)にはＦＣＰのバンドはほとんど出ておらず、ＤＤＭによる一回の可溶化でＦＣＰはほぼ全て可溶化されてきたことが示された。Triton X-100での可溶化では、一回目(4)、二回目(2)共に、ＦＣＰよりも分子量の大きい光化学系という他の光合成タンパクが可溶化されてきているが、可溶化されたＦＣＰの量は非常に少なかった。ＬＤＡＯ(5)、ＬＤＳ(6)での可溶化では、共にＦＣＰの部分にはバンドが無く、より分子量の低いところに濃いバンドが現れていることより、ＦＣＰがサブユニットまで分解されてしまっていることが示唆される。このため、光合成機能を保った状態での可溶化には強すぎる可溶化剤であることが示された。これらの結果を総合すると、ＤＤＭが最適であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、オキナワモズクの盤状体等から、高純度のＦＣＰを高収量で得ることができる。したがって、健康食品や医薬品等に用い得るフコキサンチンの原料や太陽電池の増感色素の製造方法として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法に関し、更に詳細には、オキナワモズクの盤状体または糸状体を原料とし、高純度のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質を高収量で得ることが可能なフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フコキサンチン-クロロフィルａ／ｃタンパク質(以下、「ＦＣＰ」ということがある)は、フコキサンチンとクロロフィルが結合した、光合成初期過程において光エネルギーを受容して反応中心に伝達する周辺アンテナ色素-タンパク複合体であり、主として褐藻・珪藻類の光合成膜（チラコイド膜）内に存在する。
【０００３】
このような光合成タンパク質に結合する光合成色素は、近年太陽電池に用いる増感色素としての応用が検討されており、最近では光合成タンパク質そのものをも太陽電池として応用する可能性が検討されてきている。また、ＦＣＰを構成するフコキサンチンには、種々の生理活性が見出されており、体内摂取による抗腫瘍効果（特許文献１）や神経細胞保護効果（特許文献２）、血糖値上昇抑制効果（特許文献３）等が報告されている。フコキサンチンは、生体内ではＦＣＰに結合した状態で安定に存在しており、単離したＦＣＰから容易に分離することができるため、ＦＣＰはフコキサンチンを製造するための中間原料としても有用である。
【０００４】
しかしながら、これまでＦＣＰについて、珪藻類であるキクロテラ・メネギニアーナ（Cyclotella meneghiniana）やジャイアントケルプ（Ｍacrocystis pyrifera）から単離されたという報告があるのみであり（非特許文献１〜３）、ＦＣＰを多量に高純度で分離・精製する方法については、ほとんど検討されていないのが実情であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−１５８１５６号公報
【特許文献２】特開２００１−３３５４８０号公報
【特許文献３】特開２００７−２９７３７０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Supramolecular Assembly of Fucoxanthin-Chlorophyll-Protein Complexes Isolated from a Brown Alga,Petalonia fascia.Electron Microscopic Studies,Tetzuya Katoh and Tomoko Ehara,Plant Cell Physiol.1990,31(4),439-447
【非特許文献２】Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States ,Claudia Bu¨chel, Biochemistry 2003, 42, 13027-13034
【非特許文献３】Subunit Composition and Pigmentation of Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involved in Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding,Anja Beer, Kathi Gundermann, Janet Beckmann, and Claudia Bu¨chel, Biochemistry 2006, 45, 13046-13053
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、藻類から高純度のＦＣＰを高収量で取得できる分離・精製方法の確立が望まれており、本発明は、そのようなＦＣＰの製造方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究をした結果、沖縄原種の褐藻類であるオキナワモズク(Cladosiphon okamuranus)について、藻体の前駆体である盤状体または糸状体は、成熟藻体に比べて単位重量当たりのチラコイド膜量が多く、またチラコイド膜を可溶化し、これをイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過カラムクロマトグラフィーで精製することによって、高純度のＦＣＰを高収量で得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
次の工程（１）〜（４）；
（１）オキナワモズクの盤状体または糸状体を細胞破砕処理してチラコイド膜を分離す
る工程
（２）得られたチラコイド膜を界面活性剤含有緩衝液で可溶化してチラコイド膜の可溶
化液を得る工程
（３）得られた可溶化液をイオン交換クロマトグラフィーに供し粗フコキサンチン−ク
ロロフィルａ／ｃタンパク質を得る工程
（４）得られた粗フコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質をゲルろ過クロマト
グラフィーまたは限外ろ過に供する工程
を含むことを特徴とするフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の製造方法によれば、生体における構造を維持した高純度のＦＣＰを高収量で得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１におけるイオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図２】実施例１におけるゲルろ過クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図３】比較例１においてチラコイド膜の可溶化液をショ糖密度勾配超遠心分離した写真（ａ）および各バンドの吸収スペクトル（ｂ）である。
【図４】比較例１におけるイオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図５】比較例２においてチラコイド膜の可溶化液をショ糖密度勾配超遠心分離した写真（ａ）および各バンドの吸収スペクトル（ｂ）である。
【図６】比較例２におけるゲルろ過クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図７】試験例１における各精製ＦＣＰの吸収スペクトルである。
【図８】試験例１における各精製ＦＣＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図である。
【図９】試験例２におけるゲルろ過ＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図１０】試験例２におけるゲルろ過ＨＰＬＣにより溶出時間と分子量をプロットした図である。
【図１１】試験例３におけるＣＮ−ＰＡＧＥ泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明においては、原料の褐藻類として、ナガマツモ科（Chordaceae）のオキナワモズク（Cladosiphon okamuranus）を使用する。また、オキナワモズクは、成熟体から遊走子の放出、遊走子から盤状体または糸状体の発生、盤状体または糸状体の着床による直立体の形成、直立体から成熟体への成長という生育サイクルを有するが、本発明ではこのうちの、盤状体または糸状体を用いる。なお、盤状体または糸状体は、上記生育サイクルのうちの遊走子と直立体の中間に位置するものであり、別名で呼ばれることもがあるが、本発明においてはこれらの何れも含む。
【００１３】
上記盤状体または糸状体（以下、「盤状体等」ということがある）は、天然由来のものであってもよいが、人工的に培養されたものを使用することが好ましく、特に盤状体等の種苗を直立体を形成させない条件で培養、増加されたものを利用することにより、多量に盤状体等を得ることができるので好ましい。
【００１４】
上記の直立体を形成させない条件での培養は、オキナワモズクの盤状体等の種苗を、培養容器へ着床させない条件で培養することにより行われ、例えば、連続攪拌培養したり、着床しにくい材料で形成した培養容器中で培養すれば良い。
【００１５】
具体的に、連続攪拌により直立体を形成させずに培養する場合は、攪拌子や攪拌機による機械攪拌や、通気等による攪拌を行い、培養液全体を攪拌しながら培養すれば良い。なお、フラスコ等で培養を行う場合には、攪拌と同時に炭酸供給が行えるため通気による攪拌が好ましく、培養タンク等で培養を行う場合には効率の点から機械攪拌が好ましい。攪拌条件は容器の大きさ等により適宜変化するが、例えば、培養容器として５ｌの容量の平底フラスコを用い、通気による攪拌を行う場合には、培養容器内に空気を０．１ｌ／分〜１０ｌ／分、好ましくは１ｌ／分〜５ｌ／分で導入すれば良い。
【００１６】
上記培養の際に用いる培養液は、オキナワモズクの盤状体等を培養することができるものであれば特に制限されないが、滅菌された人工海水または海水に、窒素、リン酸等を含む栄養塩、ホウ素、マンガン等の微量元素、ＥＤＴＡ等のキレート剤、ビタミンＢ群等の栄養素等（以下、これらを「栄養成分」という）を添加した培養液が好ましく、特に前記栄養成分の内、栄養塩、微量元素およびキレート化合物を添加した培養液が好ましい。これらの栄養成分は０．０１〜１０質量％、好ましくは０．１〜１質量％（以下、単に「％」という）の濃度で培養液に存在することが好ましい。これらの栄養成分は、例えば、ＫＷ−２１（第一製網製）の商品名で市販されている藻類培養液を用いることができ、これを上記濃度で添加すれば良い。
【００１７】
また、この培養は恒温条件下で行うことが好ましく、具体的には培養容器を恒温槽等で１５℃〜３５℃、好ましくは２０℃〜３０℃の温度に保ち培養を行えば良い。
【００１８】
更に、この培養は光照射条件下で行うことが好ましく、具体的には５００ルクス〜３０,０００ルクス、好ましくは４,０００ルクス〜１０,０００ルクスの照度、８Ｌ：１６Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄ、好ましくは１２Ｌ：１２Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄの光周期で照射を行えば良い。
【００１９】
上記した培養方法により、オキナワモズクの盤状体等のみを繰り返し、増殖させて培養することができる。なお、盤状体等は、培養容器中に着床すると、すぐに直立体を形成し、成熟体にまで成長してしまうので、盤状体等を着床させることは盤状体等を多く得るためには適さない。
【００２０】
上記の培養方法に使用するオキナワモズクの盤状体等の種苗は、例えば、次のようにして得ることができる。すなわち、まず、単子嚢を形成していない母藻を数本程度と、盤状体等が着床することのできる物質（以下、「着床担体」という）とを共に滅菌海水に入れ、恒温条件で培養し、遊走子から変化した盤状体または糸状体を着床担体に着床させる。
【００２１】
ここで着床担体としては、ガラス、アクリル、プラスチック、ポリカーボネート、繊維、岩石、砂等が好ましく、特にガラス板（スライドガラス）、アクリル板が好ましい。また、滅菌海水は海水または人工海水をオートクレーブあるいはろ過することにより得られる。この滅菌海水には、上記盤状体等の培養と同様に、栄養素、微量元素、キレート剤およびビタミン類等の栄養成分を適宜添加することができる。
【００２２】
盤状体等が着床担体に着床するまでの培養は、上記盤状体等の培養と同様の条件で行えば良い。また、前記培養と同時に、盤状体等が着床担体に着床できる程度に通気等の攪拌を行っても良い。
【００２３】
次いで、盤状体等が着床した着床担体を取りだし、滅菌海水で洗浄した後、上記盤状体等の培養と同様の条件で再度培養する。
【００２４】
上記盤状体等が着床した着床担体の培養においては、培養２、３日後から１日おきに平筆よる洗浄を行う。この洗浄に用いる水としては、滅菌海水および水道水が使用されるが、水道水での洗浄は１０秒以内で行うことが好ましい。
【００２５】
上記盤状体等が着床した着床担体の培養開始後８日〜１０日の十分に成長した盤状体等を、検鏡（１００倍）により雑藻の少ない部分を選んで掻き取って盤状体等の種苗とすることができる。また、必要により上記で掻き取った盤状体等を試験管に入れて滅菌海水を使用して３回程度ピペッティングで洗浄し、その後、寒天平板（海水に０．５〜１０％の寒天と０．０１〜１０％の栄養成分（藻類培養液）を添加した寒天培地）に塗りつけて、温度１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃、照度５００〜３０,０００ルクス、好ましくは４,０００〜１０,０００ルクス、光周期８Ｌ：１６Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄ、好ましくは１２Ｌ：１２Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄの条件下で培養しても良い。この培養から２０〜３０日後、寒天平板に増殖してきた盤状体等のうち、雑藻が混入していないコロニーを選択し、これを掻き取って盤状体等の種苗とすることができる。
【００２６】
上記のようにして得られたオキナワモズクの盤状体等は、成熟藻体と比べて単位重量当たりのチラコイド膜量が多く、また硬い皮膜がないためチラコイド膜を抽出しやすく、疎水性であるＦＣＰを生体条件を保ったまま取り出すことが可能である。
【００２７】
次に上記オキナワモズクの盤状体等の細胞を破砕してチラコイド膜を分離する。細胞破砕方法としては、例えば、物理的処理、化学的処理、酵素的処理、加熱処理、自己消化、浸透圧溶解、原形質溶解等を挙げることができる。これらの中でも物理的処理が好ましく、具体的には、高圧ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー、フレンチプレス等による処理、あるいはこれらの組み合わせを例示できる。これらの中でも、直接物理的にタンパク質を破壊する恐れが無く、最もマイルドな処理方法であるためフレンチプレスが好ましく、その圧力は通常100〜180ＭＰａ程度であり、好ましくは140〜160ＭＰａである。フレンチプレス処理にあたっては、盤状体等を予め水、緩衝液等で５〜１０倍程度に希釈することにより、チラコイド膜の収率を向上させることができる。
【００２８】
細胞破砕処理においては、0〜10℃程度の低温下で行うことにより、ＦＣＰの変性を抑制しながら、内在性のプロテアーゼによるＦＣＰの分解を抑制することができる。特にクロロフィルa分解酵素の活性は非常に強いため、EDTAを添加して活性を抑制しているが、低温下でのすばやい処置を取る他に効き目は無い。プロテアーゼ阻害剤を使用した場合、同時に添加する塩によってＦＣＰ中の色素の結合安定性に影響を及ぼすおそれがある上、このクロロフィルa分解酵素の活性は特に落ちないため、これを加えることは好ましくない。また、希釈倍率が低く、破砕処理溶液の粘性が高くなると処理中に熱を発生し、低温条件を保つことが困難となり、望ましくない。
【００２９】
得られた破砕物を遠心分離等の固液分離手段に供することにより、チラコイド膜を分離することができる。例えば、破砕物を12,000ｇで20分遠心分離に供し、細胞壁等を沈下させる一方、チラコイド膜を含有する上清を分離することができる。さらに、上清を75,000 ｇ、60分超遠心分離処理すると、粗チラコイド膜が沈下する。この沈殿をさらに40,000ｇ、20分程度超遠心分離に供することにより、低い分子量の不純物を除き、チラコイド膜を濃縮した沈殿が得られる。
【００３０】
次いで、分離したチラコイド膜を界面活性剤含有緩衝液で可溶化させる。緩衝液は、特に限定されるものではないが、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｍｅｓ緩衝液等が好適に使用できる。またｐＨは、一般的に6〜8の範囲が好ましく、さらに7.5付近が好ましい。緩衝剤の濃度は、通常10〜50ｍＭ程度が適当である。界面活性剤としては、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、オクチルスクロース、トリトンＸ−１００（登録商標）等の非イオン性界面活性剤が使用できるが、中でもＤＤＭがＦＣＰの変性を抑制しつつ、チラコイド膜からＦＣＰを選択的に可溶化できることから好ましい。界面活性剤の濃度は、それぞれに固有のｃｍｃ(臨界ミセル濃度)で決められる。濃度が高いほうが可溶化能も高いが蛋白質の分解を招く場合があるため、なるべく低く保つ最適化が好ましい。また、界面活性剤の濃度はチラコイド膜の濃度にも依存するため、ｃｍｃとチラコイド膜の濃度に応じて適宜設定される。例えば、チラコイド膜をクロロフィル濃度0.25mg/mLで添加し界面活性剤としてＤＤＭを使用する場合、ＤＤＭ濃度は、０．４〜０．６ｗ／ｖ％程度が好適である。このようにしてチラコイド膜を界面活性剤含有緩衝液に添加し、0〜4℃、20分程度インキュベートすることにより、チラコイド膜を可溶化できる。
【００３１】
得られたチラコイド膜の可溶化液を、イオン交換クロマトグラフィーに供する。用いるイオン交換樹脂としては、弱陰イオン交換樹脂が好ましい。弱陰イオン交換樹脂としては、DEAE-Sepharose Fast Flow(GEヘルスケア社製)、DE52（ワットマン社製）などの市販品がある。溶離液のｐＨは、一般的にｐＨ6〜8であればよい。溶離液は、ＦＣＰを安定化して保存するのに最適な緩衝液と界面活性剤濃度を選択することが好ましく、この観点から上記チラコイド膜の可溶化で使用可能な緩衝剤および界面活性剤を用い得るが、界面活性剤濃度はより低くすることが好適である。ＤＤＭを使用する場合は、０．０３〜０．０７５ｗ／ｖ％の範囲が好ましい。
【００３２】
イオン交換クロマトグラフィーにあたっては、イオン強度を経時的に変化させて溶離液に濃度勾配をつけることが好ましい。例えば、ＮａＣｌを用いて、リニア型、カーブ型、ステップワイズ型などの任意の変化方法によってイオン強度を経時的に変化させることができる。また、溶離液の流速は、一般的に0.5〜1.5ｍＬ／分程度であるが、カラムにパックされるゲルの最大圧力を考慮して適宜設定すればよい。このような分離条件により、粗ＦＣＰのピークが明確に分離されたクロマトグラムを得ることができ、当該ピークの分画を分離回収することにより、粗ＦＣＰが得られる。
【００３３】
得られた粗ＦＣＰは、さらにゲルろ過クロマトグラフィーまたは限外ろ過に供し精製される。ゲルろ過材としてはデキストラン系、アガロース系、セルロース系、アクリルアミド系等の一般的なものを使用できるが、約20〜500kDａの分子量を有する物質を分画できるゲルが好ましく、例えば、Superdex200PG(GEヘルスケア社製)等が好適に用いられ得る。溶離液は、イオン交換クロマトグラフィーと同様である。流速はカラムの径に合わせて中圧を保つ流速であることが望ましく、例えば、Hi Load 26/60 superdex 200PG であれば1.5〜2.0ｍＬ／分程度が分離がよい。一方、分子量分画としてゲルろ過クロマトグラフィーと同様の原理を持つ限外ろ過によっても精製が可能である。限外ろ過の素材としては酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリアクリロニトリル、セラミック等が利用でき、構造としては中空糸膜、スパイラル膜、平膜等の一般的なものが利用できるが、約20〜500kDａの分子量を有する物質を分画できるポアサイズが好ましく、例えば旭化成ラボモジュール AHP-1010、旭化成ラボモジュール SIP-1013等を組み合わせて使用することにより目的の分子量の蛋白質を選択的に取得できる。
【００３４】
以上のようにして得られるＦＣＰは、クロロフィルおよびフコキサンチンが安定に結合して生体条件を維持しているとともに、他の精製方法と比較して純度が高いものである。ＦＣＰは、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が５４〜５６ｋＤａであり、約１８．２ｋＤａと約１７．５ｋＤａのサブユニットから構成される。また、ＦＣＰはＮ末端にSer-Phe-Glu-Ser-Glu-Ile-Gly-Ala-Glnのアミノ酸配列を含み、ＦＣＰ遺伝子由来のアミノ酸配列が報告されている唯一の褐藻類であるケルプ（Ｍacrocystis pyrifera）由来のＦＣＰタンパク5種類とホモロジーが認められる。
【実施例】
【００３５】
以下に、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００３６】
参 考 例 １
オキナワモズク盤状体の培養：
（盤状体種苗の調製）
天然産のオキナワモズクを母藻とし、これを滅菌海水（海水を９０〜１００℃に加熱後冷却したもの）でよく洗浄後、検鏡して単子嚢が形成されていないことを確認して１０ｃｍにカットした。カットして得られた３本の母藻を滅菌海水を満たした５００ｍｌビーカーにスライドガラスと共に入れ、盤状体がスライドガラス上に着床できる程度の弱通気下、２５℃の恒温槽（ＮＬＲ３５０：サンヨー製）中、光照射条件下で培養した。光照射条件は、照度５,０００ルクス、光周期１２Ｌ：１２Ｄとした。培養２４時間後に盤状体が着床したスライドガラスを取りだし、滅菌海水で洗浄したあと、滅菌海水に藻類培養液（ＫＷ２１：第一製網（株）製）を０．２５ｍｌ／ｌの濃度で添加した培地を満たした２００ｍｌコニカルビーカーに移して培養を開始した。
【００３７】
コニカルビーカーでの培養３日後から１日おきにナイロン平筆（ＦＭＦ−１５：（株）アサヒペン製）を用いて洗浄を行った。洗浄に用いる洗浄用水には滅菌海水と水道水を使用した。水道水での洗浄は流水にして１０秒以内で行うようにした。培養から８日〜１０日後の十分成長した盤状体は、検鏡（１００倍）により雑藻の少ない部分を選んでカミソリで掻き取った。この盤状体を試験管に入れて滅菌海水を使用してピペッティングで３回洗浄した。洗浄後、寒天平板（海水に１．０％の寒天と０．１％の藻類培養液を添加した寒天培地）に塗りつけて恒温槽を用いて、温度２３℃、照度４,０００ルクス、光周期１２Ｌ：１２Ｄの条件下で培養した。培養から２０〜３０日後、寒天平板に盤状体が増殖してきたので、雑藻が混入していないコロニーを選択してとり、別の寒天平板に移植してオキナワモズクの盤状体種苗を調製した。
【００３８】
（盤状体の培養）
藻類培養液（ＫＷ２１：第一製網（株）製）を０．１％添加したろ過海水を１２０℃で１５分間オートクレーブしたものを培養液とした。この培養液４ｌを５ｌの平底フラスコに入れ、これに実施例１で調製したオキナワモズク盤状体種苗を５ｇ加え、空気を４．６ｌ／分で導入し、温度２３℃、照度４,０００ルクス、光周期１２Ｌ：１２Ｄの条件下で１週間培養した。１週間培養後、盤状体は１７．５ｇとなり、培養開始時の３．５倍の重量となった。また、検鏡の結果、盤状体の大きさの変化はほとんど認められなかったことから、この重量の増加は盤状体の成長によるものでなく、盤状体の増殖によるものであった。また、培養液中に直立体の形成は認められなかった。
【００３９】
実 施 例 １
ＦＣＰの分離・精製：
（細胞破砕処理）
参考例１で得られたオキナワモズクの盤状体をMes buffer (pH 6.5)(10mM MES/KOH pH 6.5, 2 mM KCl, 5 mM EDTA)で１０倍に希釈してホモジナイズした後、４℃、１５０ＭＰａでフレンチプレス破砕した。破砕物を遠心分離（１２,０００ｇ、２０分、４℃）して上清を分取した。上清を超遠心分離処理（７５,０００ｇ、６０分、４℃）し、沈殿をホモジナイズ後、さらに超遠心分離処理（４０,０００ｇ、２０分、４℃）し、沈殿としてチラコイド膜を得た。
【００４０】
（チラコイド膜の可溶化）
得られた沈殿を10mM b-dodecyl maltoside(DDM)含有10mM Mes buffer (pH 6.5)に、クロロフィルａ濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、４℃で２０分間インキュベートした。
【００４１】
（イオン交換クロマトグラフィー）
得られた可溶化液について、以下の条件によりイオン交換クロマトグラフィーを行った。結果を図１に示す。図１中のIは、遊離色素、IIは粗ＦＣＰ、IIIは光化学系複合体のピークである。IIのピークを分取して粗ＦＣＰを得た。
カラム：DEAE-sepharose Fast Flow(GEヘルスケア社製)
溶離液：0-0.75M NaCl, 0.03% DDM,2mM KCl, 25mM Tris-HCl pH7.4(NaCl濃度:0〜20
分(0M)+20〜100分(0→0.2M)+100〜120分(0.2→0.75M)
流 速：2.0ml/min.
検 出：フォトダイオードアレイ, 250-700nm
【００４２】
（ゲルろ過クロマトグラフィー）
得られた画分について、下記条件によるゲルろ過クロマトグラフィーに供した。結果を図２に示す。図に示すピークを分取して精製ＦＣＰを得た。
カラム：Hi Load 26/60 superdex 200PG(GEヘルスケア社製)
溶離液：0.03% DDM, 2mM KCl, 25mM Tris-HCl pH7.4
流 速：2.0ml/min.
検 出：UV,254nm
【００４３】
比 較 例 １
実施例１と同様にして得たチラコイド膜の可溶化液について、ショ糖密度勾配超遠心分離により分画を行った。ショ糖密度勾配の条件は10%-20%-30%-40%で行い、２００,０００ｇ,１６時間超遠心分離を行った。結果を図３に示す。得られた分画のうち、band2を分取し、以下の条件によるイオン交換クロマトグラフィーに供した。結果を図４に示す。ＩＶのピークを分取し、精製ＦＣＰを得た。
カラム：DEAE Sepharose Fast Flow(GEヘルスケア社製)
溶離液：0-0.75M NaCl, 0.03% DDM,2mM KCl, 25mM Tris-HCl pH7.4(NaCl濃度:0〜20
分(0M)+20〜100分(0→0.2M)+100〜120分(0.2→0.75M)
流 速：2.0ml/min.
検 出：フォトダイオードアレイ, 250-700nm
【００４４】
比 較 例 ２
実施例１と同様にして得たチラコイド膜の可溶化液について、ショ糖密度勾配超遠心分離により分画を行った。ショ糖密度勾配の条件は10%-20%-30%-40%で行い、２００,０００ｇ,１６時間超遠心分離を行った。結果を図５に示す。得られた分画のうち、band2を分取し、以下の条件によるゲルろ過クロマトグラフィーに供した。結果を図６に示す。図６に示されるピークを分取し、精製ＦＣＰを得た。
カラム：Hi Load 26/60 superdex 200PG(GEヘルスケア社製)
溶離液：0.03% DDM, 2mM KCl, 25mM Tris-HCl pH7.4
流 速：2.0ml/min.
検 出：UV,254nm
【００４５】
試 験 例 １
FCPの光合成活性および純度の評価：
実施例１および比較例１〜２で得られた精製ＦＣＰを緩衝液(0.03% DDM, 25mM Tris-HCl pH7.4)で溶解し、分光光度計により、それぞれの吸収スペクトルを測定した。結果を図７に示す（Ａ：比較例１、Ｂ：実施例１、Ｃ：比較例２）。フコキサンチンの結合は、クロロフィルｃと比べて弱いと考えられるが、結合したフコキサンチンを示す５３０ｎｍの吸光度とクロロフィルｃを示す４３７ｎｍにおける吸光度の比（Ａ５３０／Ａ４３７）によって、ＦＣＰが生体条件を維持した状態で分離されているか否か評価し得る。図７より、実施例１（Ｂ）と比較例１（Ａ）は、Ａ５３０／Ａ４３７が０．３となり、０．２５である比較例２（Ｃ）と比べて、より色素の結合が安定に維持された状態で分離されていることが示された。また、それぞれの精製ＦＣＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢ染色したところ、ＦＣＰを構成するサブユニットの１７〜１８ｋＤａ付近のバンド以外の場所には、実施例１（Ｂ）では何も検出されなかった。以上より、実施例１の精製ＦＣＰが、生体条件を維持した状態で、かつ高純度であることが示された。
【００４６】
さらに、比較例２（Ｃ）のバンドについてＰＶＤＦ膜に転写後、アミドブラック染色を行ったところ、１８．２ｋＤａ,１７．５ｋＤａの２本のバンドが確認され、ＦＣＰのサブユニットは１８．２ｋＤａ,１７．５ｋＤａの２種類存在することが示唆された。
【００４７】
試 験 例 ２
ゲルろ過ＨＰＬＣによるＦＣＰの分析：
実施例１および比較例１〜２で得られた精製ＦＣＰについて以下の条件によりゲルろ過ＨＰＬＣによる分析を行った。結果を図９および１０に示す。図９より、比較例１および２の精製ＦＣＰ（ＦＣＰ−ＡおよびＣ）では、不純物と考えられるピークがみられるのに対し、実施例１の精製ＦＣＰ（Ｂ）では、この不純物のピークは全く無くなり、純度が高いことが示された。また図１０より、ＦＣＰの分子量は約５５ｋＤａであり、３量体を形成していることが示された。
（ゲルろ過ＨＰＬＣ条件）
カラム：TOSOH TSKgel G4000PWXL
溶離液：0.075% DDM, 2mM KCl, 25mM Tris-HCl pH7.4
流 速：1.0ml/min.
検 出：フォトダイオードアレイ, 250-700nm
【００４８】
試 験 例 ３
界面活性剤の検討：
オキナワモズク盤状体より調製したチラコイド膜(4.5μｇクロロフィルa：チラコイド膜の濃度は、メタノールで抽出して660nmの吸光度を測定し、クロロフィルa濃度を決定してクロロフィルaのグラム数あたりで算出)を遠沈し、上澄み液を除去したものに、懸濁液を加えて懸濁し、全体で30マイクロリットルの溶液にした。これに下記（I）〜（IV）の界面活性剤溶液を10マイクロリットル加えて氷上で10分間攪拌した。これを一度遠心して上澄みを取りだし可溶化液とした。（1）、（2）はそれぞれ界面活性剤溶液(I)、(II)を用いて一度可溶化した残渣を同じ界面活性剤溶液で再度可溶化したものである。（3）〜（6）はそれぞれ界面活性剤溶液(I)〜(IV)を用いて可溶化したものである。これらの可溶化液を懸濁液で二倍希釈したものを10マイクロリットルずつ電気泳動用ゲルのウェルにロードした。Clear Native PAGE(文献参照：Advantages and limitations of clear-native PAGE, Ilka Wittig and Hermann Schagger, Proteomics 2005, 5,4338-4346)と呼ばれる非破壊条件のポリアクリルアミド電気泳動を行なった。標品として分子量マーカー(Invitrogen社製,NativeMark、図11中ではＭの表示)の他、単離したFCP(図11中ではＦの表示)を同時に泳動した。得られたゲルをクマシブリリアントブルー染色したものを図11に示した。
【００４９】
懸濁液：25%(v/v)Grycerol,50mM Tris-HCl pH 70, 10mM MgCl2, 120mM 6-Amino
hexanoic acid
界面活性剤溶液：(I) 10％(w/v) DDM aq.
(II) 5% (v/v) Triton X-100 aq.
(III) 5% (v/v) LDAO (Lauryldimethylamine-oxide) aq.
(IV) 5% (w/v) LDS (Lithium dodecyl sulfate) aq.
電気泳動条件：
ゲル：BioRad社製レディーゲルＪ（5-15％）
アノード液：25ｍＭTris-HCl pH 7.0
カソード液：50mM Tricine, 7.5mM Tris,0.05% Triton X-100, 0.05% DOC(Deoxycholic acid)
定電流：4mA
温度：4度
【００５０】
ＦＣＰのバンドが最もはっきり検出できたのは、ＤＤＭで一回可溶化した（3）のみであった。ＤＤＭで二回目可溶化した(1)にはＦＣＰのバンドはほとんど出ておらず、ＤＤＭによる一回の可溶化でＦＣＰはほぼ全て可溶化されてきたことが示された。Triton X-100での可溶化では、一回目(4)、二回目(2)共に、ＦＣＰよりも分子量の大きい光化学系という他の光合成タンパクが可溶化されてきているが、可溶化されたＦＣＰの量は非常に少なかった。ＬＤＡＯ(5)、ＬＤＳ(6)での可溶化では、共にＦＣＰの部分にはバンドが無く、より分子量の低いところに濃いバンドが現れていることより、ＦＣＰがサブユニットまで分解されてしまっていることが示唆される。このため、光合成機能を保った状態での可溶化には強すぎる可溶化剤であることが示された。これらの結果を総合すると、ＤＤＭが最適であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、オキナワモズクの盤状体等から、高純度のＦＣＰを高収量で得ることができる。したがって、健康食品や医薬品等に用い得るフコキサンチンの原料や太陽電池の増感色素の製造方法として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（１）〜（４）；
（１）オキナワモズクの盤状体または糸状体を細胞破砕処理してチラコイド膜を分離す
る工程
（２）得られたチラコイド膜を界面活性剤含有緩衝液で可溶化してチラコイド膜の可溶
化液を得る工程
（３）得られた可溶化液をイオン交換クロマトグラフィーに供し粗フコキサンチン−ク
ロロフィルａ／ｃタンパク質を得る工程
（４）得られた粗フコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質をゲルろ過クロマト
グラフィーまたは限外ろ過に供する工程
を含むことを特徴とするフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法。
【請求項２】
工程（１）における細胞破砕処理が、圧力１４０〜１６０ＭＰａのフレンチプレス処理を含むものである請求項１記載のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法。
【請求項３】
工程（２）における界面活性剤が、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）である請求項１または２に記載のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法。
【請求項４】
工程（２）における緩衝液が、Ｍｅｓ緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液である請求項１ないし３のいずれかの項記載のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法。
【請求項５】
工程（３）におけるイオン交換クロマトグラフィーが、弱陰イオン交換樹脂によるものである請求項１ないし４のいずれかの項記載のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかの項に記載の製造方法によって得られるフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質。
【請求項７】
ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が５４〜５６ｋＤａであり、１７．５ｋＤａおよび１８．２ｋＤａのサブユニットから構成されるものである請求項６記載のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質。
【請求項１】
次の工程（１）〜（４）；
（１）オキナワモズクの盤状体または糸状体を細胞破砕処理してチラコイド膜を分離す
る工程
（２）得られたチラコイド膜を界面活性剤含有緩衝液で可溶化してチラコイド膜の可溶
化液を得る工程
（３）得られた可溶化液をイオン交換クロマトグラフィーに供し粗フコキサンチン−ク
ロロフィルａ／ｃタンパク質を得る工程
（４）得られた粗フコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質をゲルろ過クロマト
グラフィーまたは限外ろ過に供する工程
を含むことを特徴とするフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法。
【請求項２】
工程（１）における細胞破砕処理が、圧力１４０〜１６０ＭＰａのフレンチプレス処理を含むものである請求項１記載のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法。
【請求項３】
工程（２）における界面活性剤が、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）である請求項１または２に記載のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法。
【請求項４】
工程（２）における緩衝液が、Ｍｅｓ緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液である請求項１ないし３のいずれかの項記載のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法。
【請求項５】
工程（３）におけるイオン交換クロマトグラフィーが、弱陰イオン交換樹脂によるものである請求項１ないし４のいずれかの項記載のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかの項に記載の製造方法によって得られるフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質。
【請求項７】
ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が５４〜５６ｋＤａであり、１７．５ｋＤａおよび１８．２ｋＤａのサブユニットから構成されるものである請求項６記載のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質。
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１１】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−５７６４９（Ｐ２０１１−５７６４９Ａ）
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１１７２１（Ｐ２００９−２１１７２１）
【出願日】平成２１年９月１４日（２００９．９．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年３月１６日 発行の「第５０回 日本植物生理学会年会 要旨集」に発表
【出願人】（５０４４２６２１８）株式会社サウスプロダクト (15)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１４日（２００９．９．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年３月１６日 発行の「第５０回 日本植物生理学会年会 要旨集」に発表
【出願人】（５０４４２６２１８）株式会社サウスプロダクト (15)
【Ｆターム（参考）】
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