フコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法
【課題】褐藻類からフコキサンチンおよびフコステロールをより高収量で取得することが可能な製造方法を提供すること。
【解決手段】
ハバノリおよびモズクよりなる群から選ばれた褐藻類の盤状体または糸状体の溶媒による抽出物からフコキサンチンおよび／またはフコステロールを分離することを特徴とするフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【解決手段】
ハバノリおよびモズクよりなる群から選ばれた褐藻類の盤状体または糸状体の溶媒による抽出物からフコキサンチンおよび／またはフコステロールを分離することを特徴とするフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法に関し、更に詳細には、ハバノリまたはモズクの盤状体または糸状体を原料とし、高収量のフコキサンチンおよび／またはフコステロールを得ることが可能なこれらの化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
褐藻類はカロテノイドの１種であるフコキサンチンやステロールの１種であるフコステロール等の機能性成分を有している。フコキサンチンは下記構造を有する既知の物質であり、その効果としては体内摂取による抗腫瘍効果（特許文献１）や神経細胞保護効果（特許文献２）、血糖値上昇抑制効果（特許文献３）等が報告されている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
一方、フコステロールは下記構造を有する既知の物質であり、その効果としては体内摂取による抗動脈硬化作用（特許文献４）やコレステロール低減作用、血栓予防作用等が一般的に知られている。
【０００５】
【化２】
【０００６】
従来、これらフコキサンチンやフコステロールを製造するにあたっては、ナガマツモ科（Chordaceae）のオキナワモズク（Cladosiphon okamuranus）の成熟体や盤状体・糸状体が原料として使用されていた。しかしながら、成熟体におけるこれらの機能性成分の含有量は少なく、また、盤状体や糸状体でも、含有量は成熟体に比べて高いものの実用的に十分な量とはいえず、また培養も難しいという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−１５８１５６号公報
【特許文献２】特開２００１−３３５４８０号公報
【特許文献３】特開２００７−２９７３７０号公報
【特許文献４】特開２００５−１０４８８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、フコキサンチンおよびフコステロールをより高収量で取得することが可能な製造方法の開発が求められており、本発明は、そのような製造方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究をした結果、原料の褐藻類としてカヤノモリ科（Scytosiphonaceae）のハバノリ（Petalonia binghamiae）またはモズク科（Spermatochnaceae）のモズク（Nemacystus decipiens）の盤状体または糸状体を使用すると、培養による増体量が大きく、またフコキサンチンおよびフコステロールの含有量を高め得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明はハバノリ（Petalonia binghamiae）およびモズク（Nemacystus decipiens）よりなる群から選ばれた褐藻類の盤状体または糸状体の抽出物からフコキサンチンおよび／またはフコステロールを分離することを特徴とするフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の製造方法によれば、培養により、褐藻類を著しく増体させるとともに、褐藻類中のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの含有量を高めることができるため、より経済的に高収量のフコキサンチンおよび／またはフコステロールを製造することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明においては、原料の褐藻類として、カヤノモリ科（Scytosiphonaceae）のハバノリ（Petalonia binghamiae）またはモズク科（Spermatochnaceae）のモズク（Nemacystus decipiens）が用いられる。また、これらの褐藻類は、成熟体から遊走子の放出、遊走子から盤状体または糸状体の発生、盤状体または糸状体の着床による直立体の形成、直立体から成熟体への成長という生育サイクルのうちの、盤状体または糸状体を用いる。なお、盤状体または糸状体は、上記生育サイクルのうちの遊走子と直立体の中間に位置するものであり、別名で呼ばれることもがあるが、本発明においてはこれらの何れも含む。
【００１３】
上記盤状体または糸状体は、天然由来のものであってもよいが、人工的に培養されたものを使用することが好ましく、特に盤状体または糸状体の種苗を直立体を形成させない条件で培養、増加されたものを利用することにより、多量に盤状体または糸状体を得ることができるので好ましい。
【００１４】
上記の直立体を形成させない条件での培養は、褐藻類の盤状体または糸状体の種苗を、培養容器へ着床させない条件で培養することにより行われ、例えば、連続攪拌培養したり、着床しにくい材料で形成した培養容器中で培養すれば良い。
【００１５】
より具体的には、連続攪拌により直立体を形成させずに培養する場合は、攪拌子や攪拌機による機械攪拌や、通気等による攪拌を行い、培養液全体を攪拌しながら培養すれば良い。攪拌条件は容器の大きさ等により適宜変化するが、例えば、培養容器として１Ｌの容量の平底フラスコを用い、通気による攪拌を行う場合には、培養容器内に空気を１．０Ｌ／分〜２．５Ｌ／分、好ましくは１．５Ｌ／分〜２．３Ｌ／分で導入すれば良い。
【００１６】
上記培養の際に用いる培養液は、褐藻類の盤状体または糸状体を培養することができるものであれば特に制限されないが、滅菌された人工海水または海水に、窒素源およびリン源等の栄養成分を含有したものであることが好ましい。窒素源としては、硝酸塩、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、尿酸等が例示できる。このうち、褐藻類中のフコキサンチンおよびフコステロールの含有量を向上できるため、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩を添加することが好ましい。リン源としては、グリセロリン酸２ナトリウム、β−グリセロリン酸ナトリウム等の有機リン酸塩、リン酸３ナトリウム、リン酸３カリウム等の無機リン酸塩が例示できる。これらのうち、無機リン酸塩がフコキサンチンおよびフコステロールの含有量を向上できるため好ましい。窒素源の添加量は、窒素が好ましくは４００〜１６００μＭ、より好ましくは７００〜９００μＭとなる量である。一方、リン源の添加量は、リンが好ましくは１５〜６０μＭ、より好ましくは２０〜４０μＭとなる量である。培地中に添加可能なその他の栄養成分としては、ビタミンＢ１２、ビオチン、チアミンが例示できる。これらの栄養成分を含有する培養液として、例えば公知のＰＥＳＩ培地（Ｍａｓａｋａｚｕ Ｔａｔｅｗａｋｉ、Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｒｕｓｔａｃｅｏｕｓ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ ｗｉｔｈ ｕｎｉｌｏｃｕｌａｒ ｓｐｏｒａｎｇｉａ ｉｎ Ｓｃｙｔｏｓｉｐｈｏｎ ｌｏｍｅｎｔａｒｉａ、Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ
６（１）１９６６．）等を使用することができ、また、ＫＷ−２１（第一製網製）の商品名で市販されている藻類培養液を用いることもできる。これらの培養液を窒素源およびリン源が上記濃度となるよう添加すれば良い。
【００１７】
また、この培養は恒温条件下で行うことが好ましい。ハバノリは、通常１２〜２９℃、好ましくは１５〜２５℃、より好ましくは２０〜２５℃の温度である。一方、モズクは、通常１２〜３０℃、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは１５〜２５℃である。この範囲であると、増体量が大きく、またフコキサンチンおよびフコステロールの含有量が高くなる。
【００１８】
更に、この培養は光照射条件下で行うことが好ましい。ハバノリは、好ましくは１０〜１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１であり、より好ましくは２０〜８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１である。一方、モズクは、好ましくは１０〜１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１であり、より好ましくは１０〜８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１である。この範囲であると、増体量が大きく、またフキキサンチンおよびフコステロールの含有量が高くなる。このような光量により、８Ｌ：１６Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄ、好ましくは１２Ｌ：１２Ｄ〜１６Ｌ：８Ｄの光周期で照射を行えば良い。
【００１９】
上記した培養方法により、褐藻類の盤状体または糸状体のみを繰り返し、増殖させて培養することができる。なお、盤状体または糸状体は、培養容器中に着床すると、すぐに直立体を形成し、成熟体にまで成長してしまうので、盤状体または糸状体を着床させることは盤状体または糸状体を多く得るためには適さない。
【００２０】
上記の培養方法に使用する褐藻類の盤状体または糸状体の種苗は、天然から採取してもよいが、例えば、次のようにして得ることもできる。すなわち、まず、単子嚢を形成していない母藻を数本程度と、盤状体または糸状体が着床することのできる着床担体とを共に滅菌海水に入れ、恒温条件で培養し、遊走子から変化した盤状体または糸状体を着床担体に着床させる。
【００２１】
ここで着床担体としては、ガラス、アクリル、プラスチック、ポリカーボネート、繊維、岩石、砂等が好ましく、特にガラス板（スライドガラス）、アクリル板が好ましい。また、滅菌海水は海水または人工海水をオートクレーブあるいはろ過することにより得られる。この滅菌海水には、上記盤状体または糸状体の培養と同様に栄養成分を適宜添加することができる。
【００２２】
盤状体または糸状体が着床担体に着床するまでの培養は、上記盤状体または糸状体の培養と同様の条件で行えば良い。また、前記培養と同時に、盤状体または糸状体が着床担体に着床できる程度に通気等の攪拌を行っても良い。
【００２３】
次いで、盤状体または糸状体が着床した着床担体を取りだし、滅菌海水で洗浄した後、上記盤状体または糸状体の培養と同様の条件で再度培養する。
【００２４】
上記盤状体または糸状体が着床した着床担体の培養においては、培養２、３日後から１日おきに平筆よる洗浄を行う。この洗浄に用いる水としては、滅菌海水および水道水が使用されるが、水道水での洗浄は１０秒以内で行うことが好ましい。
【００２５】
上記盤状体または糸状体が着床した着床担体の培養開始後８日〜１０日の十分に成長した盤状体または糸状体を、検鏡（１００倍）により雑藻の少ない部分を選んで掻き取って盤状体または糸状体の種苗とすることができる。また、必要により上記で掻き取った盤状体または糸状体を試験管に入れて滅菌海水を使用して３回程度ピペッティングで洗浄し、その後、寒天平板（海水に０．５〜１０％の寒天と０．０１〜１０％の栄養成分（藻類培養液）を添加した寒天培地）に塗りつけて、温度１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃、１０〜１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、好ましくは１０〜８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、光周期８Ｌ：１６Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄ、好ましくは１２Ｌ：１２Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄの条件下で培養しても良い。この培養から２０〜３０日後、寒天平板に増殖してきた盤状体または糸状体のうち、雑藻が混入していないコロニーを選択し、これを掻き取って盤状体または糸状体の種苗とすることができる。
【００２６】
一方、盤状体または糸状体から、フコキサンチンおよび／またはフコステロールを抽出するために使用される溶媒は、フコキサンチンおよび／またはフコステロールを抽出することのできるものであれば特に制限されないが、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、酢酸エチル等のエステル類、ヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン等の芳香属炭化水素類、クロロホルム等のハロゲン系有機溶媒、もしくはこれらの混合溶媒が好ましく、フコキサンチンおよび／またはフコステロールが食品等にも使用されることからエタノールもしくは含水エタノールがより好ましい。含水エタノールは、エタノール：水の混合比が５０：１〜１：１、好ましくは１０：１〜２：１（質量比）の範囲である。含水エタノールを用いると、クロロフィル等の不純物の含有量が少なく、フコキサンチン等の収率を向上できるために好ましい。これらの溶媒は、盤状体または糸状体に対して４：１〜１０００：１、好ましくは４：１〜２００：１の質量比で添加すれば良い。
【００２７】
上記溶媒を用いる抽出は常法により行うことができ、例えば、溶媒としてエタノールを用いる場合であれば、１５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜４０℃の温度で、０．５時間〜１．５時間、好ましくは１時間〜１．５時間抽出を行えば良い。また、抽出に当たっては、必要により、超音波、攪拌機等により攪拌を行っても良い。
【００２８】
以上のようにして得られる有機溶媒抽出物から、フコキサンチンおよび／またはフコステロールを分離、取得するには、有機溶媒抽出物をそのまま、あるいは残渣を取り除いてからＨＰＬＣ等に付し、これにより分離・精製を行えばよい。
【００２９】
斯くして得られるフコキサンチンおよび／またはフコステロールは上記したコレステロール低減作用や血栓予防作用を期待した各種健康食品や、抗腫瘍効果、神経細胞保護効果、血糖値上昇抑制効果等を目的とした医薬品等の用途に使用することができる。
【００３０】
本発明で用いるハバノリおよびモズクの糸状体等は、従来使用されているオキナワモズクと比べ、容器への附着性が弱く成熟しにくいため、容器を用いた攪拌培養を容易に行えるという利点も有する。附着性が高いと、容器壁面にコケ状に附着し、光の照射が阻害されたり、通気による攪拌培養が滞るため生産量が低下する。また、ハバノリおよびモズクの糸状体等はオキナワモズクと比べて真水に強く、夾雑物を真水処理して洗い流すことができるため培養がより容易である。
【実施例】
【００３１】
以下に、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００３２】
実 施 例 １
ハバノリ糸状体の培養（１）：水温の影響
下記表１の組成のＰＥＳＩ培養液を２％添加したろ過海水を１２１℃４０分間オートクレーブしたものを培養液とした。この培養液９００ｍｌを１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．２ｇ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ （以下、ｄ．ｗ．））加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、温度１５、２０、２５、３０℃の４条件により、光量８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後乾燥重量を測定した。
【００３３】
【表１】
【００３４】
実 施 例 ２
ハバノリ糸状体の培養（２）：光量の影響
実施例１と同じ組成のＰＥＳＩ培養液を２％添加したろ過海水を１２１℃４０分間オートクレーブしたものを培養液とした。この培養液９００ｍｌを１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．２ｇ ｄ．ｗ）加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、光量１０、２０、４０、８０、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、水温２５℃、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後乾燥重量を測定した。
【００３５】
実 施 例 ３
ハバノリ糸状体の培養（３）：培養液組成の影響
実施例１と同じ組成および濃度のＰＥＳＩ培養液（試験区１）と、この組成において窒素源を硝酸ナトリウムから硫酸アンモニウムに代えたもの（試験区２）、リン源をグリセロリン酸２ナトリウムからリン酸３ナトリウムに代えたもの（試験区３）、窒素、リン源ともに硫酸アンモニウム、リン酸３ナトリウムに代えたもの（試験区４）、の４種類の培養液を作成した。培養液９００ｍｌをそれぞれ１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．２ｇ ｄ．ｗ）加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、水温２５℃、光量８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後乾燥重量を測定した。
【００３６】
実 施 例 ４
ハバノリ糸状体からのフコキサンチンおよびフコステロールの製造：
（フコキサンチンおよびフコステロールの抽出）
実施例１ないし３で得られたハバノリ糸状体を凍結乾燥し、２００倍容のメタノールにて４０℃で１時間抽出を行なった。抽出液は残渣を除去した後、減圧下にて溶媒を留去し、残留物を一定量のメタノールに再溶解し、分析用サンプルとした。下記方法により、フコキサンチンおよびフコステロールを測定した。結果を乾燥重量と併せて表２に示す。
【００３７】
（フコキサンチンの定量方法）
フコキサンチンはＨＰＬＣにより定量を行った。カラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ２２−ＡＲ−ＩＩ（ナカライテスク製、内径４．６ｘ２５０ｍｍ）を用い、移動相はアセトニトリル／水の混合液（８０：２０）を用いた。フコキサンチンの検出は波長４５０ｎｍの吸収で行い、流速は１．５ｍｌ／ｍｉｎで分析を行った。
【００３８】
（フコステロールの定量方法）
フコステロールはＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフ質量分析装置）により定量を行った。カラムはＪ＆Ｗ社製ＤＢ−５ＭＳ（内径０．２５ｍｍｘ３０ｍ、膜厚０．２５ｍ）を用い、キャリアガスとしてヘリウムを用いた。フコステロールの検出はＳＩＭモードでフコステロール由来フラグメントイオンｍ／ｚ＝３１４で行った。
【００３９】
【表２】
【００４０】
２０、２５℃条件下では、培養開始時の２倍の重量となった。また検鏡の結果、糸状体が伸長していたことから、この重量の増加は糸状体の生長によるものであった。培養液中に直立体の形成は認められなかった。さらにフコキサンチン含量およびフコステロール含量は水温が高くなるほど含量が多くなった。
【００４１】
また、光量が強くなるほど増体量が大きく、２０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では培養開始時の２倍、４０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では２．５倍、８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では３．５倍、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では４倍の重量となった。また検鏡の結果、糸状体が伸長していたことから、この重量の増加は糸状体の生長によるものであった。培養液中に直立体の形成は認められなかった。フコキサンチン含量については、極端に光量の強い１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で含量が少なくなった。
【００４２】
さらに培養液の組成については、試験区１で０．５６ｇ ｄ．ｗ．、試験区２で０．６４ｇ ｄ．ｗ．、試験区３で０．５７ｇ ｄ．ｗ．、試験区４で０．５６ｇ ｄ．ｗ．となり、全ての条件で約３倍の重量となった。また検鏡の結果、糸状体が伸長していたことから、この重量の増加は糸状体の生長によるものであった。培養液中に直立体の形成は認められなかった。さらにフコキサンチン含量について、試験区１では２．３１ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．であるのに対し、試験区２で３．２０ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ、試験区３で３．８５ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区４で４．５３ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．となり、窒素源、リン源として硫酸アンモニウム、リン酸３ナトリウムを用いると、相加的に含量が多くなった。フコステロール含量は試験区１で２．６８ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区２で３．０７ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区３で３．２２ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区４で３．８０ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．となり、窒素源、リン源として硫酸アンモニウム、リン酸３ナトリウムを用いると、相加的に含量が多くなった。
【００４３】
実 施 例 ５
モズク糸状体の培養（１）：水温の影響
実施例１の組成のＰＥＳＩ培養液を２％添加したろ過海水を１２１℃４０分間オートクレーブしたものを培養液とした。この培養液９００ｍｌを１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．２ ｇ ｄ．ｗ．）加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、温度１５、２０、２５、３０℃の４条件、それ以外の条件として光量８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後、乾燥重量を測定した。
【００４４】
実 施 例 ６
モズク糸状体の培養（２）：光量の影響
実施例１の組成のＰＥＳＩ培養液を２％添加したろ過海水を１２１℃４０分間オートクレーブしたものを培養液とした。この培養液９００ｍｌを１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．２ ｇ ｄ．ｗ）加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、光量０、１０、２０、４０、８０、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、それ以外の条件として水温２５℃、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後、乾燥重量を測定した。
【００４５】
実 施 例 ７
モズク糸状体の培養（３）：培養液組成の影響
実施例１と同じ組成・濃度のＰＥＳＩ培養液（試験区１）と、組成中の窒素源を硝酸ナトリウムから硫酸アンモニウムに代えたもの（試験区２）、リン源をグリセロリン酸２ナトリウムからリン酸３ナトリウムに代えたもの（試験区３）、窒素、リン源ともに硫酸アンモニウム、リン酸３ナトリウムに代えたもの（試験区４）、の４種類の培養液を作成した。作成した培養液９００ｍｌをそれぞれ１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．２ｇ ｄ．ｗ）加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、水温２５℃、光量８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後乾燥重量を測定した。
【００４６】
実 施 例 ８
モズク糸状体からのフコキサンチンおよびフコステロールの製造：
（フコキサンチンおよびフコステロールの抽出）
実施例５ないし７で得られたモズク糸状体を凍結乾燥し、２００倍容のメタノールにて４０℃で１時間抽出を行なった。抽出液は残渣を除去した後、減圧下にて溶媒を留去し、残留物を一定量のメタノールに再溶解し、分析用サンプルとした。実施例４と同様の方法により、フコキサンチンおよびフコステロールを測定した。結果を乾燥重量と併せて表３に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
水温について、１週間培養後、１５℃で０．３９ｇ ｄ．ｗ．、２０℃で０．５３ｇ ｄ．ｗ．、２５℃で０．５８ｇ ｄ．ｗ．、３０℃で０．５５ｇ ｄ．ｗ．となり、１５℃以外の水温で約２．８倍の増重が認められた。また検鏡の結果、糸状体が伸長していたことから、この重量の増加は糸状体の生長によるものであった。培養液中に直立体の形成は認められなかった。またフコキサンチン含量およびフコステロール含量は水温が低くなるほど含量が多くなった。
【００４９】
また光量が強くなるほど増重した。２０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では培養開始時の２．３倍、４０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では２．７倍、８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では３倍、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では３．１倍の重量となった。検鏡の結果、糸状体が伸長していたことから、この重量の増加は糸状体の生長によるものであった。培養液中に直立体の形成は認められなかった。さらにフコキサンチン含量およびフコステロール含量については、低光量の１０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で含量が最も多くなった。
【００５０】
さらに培養液については、試験区１で０．４２ｇ ｄ．ｗ．、試験区２で０．４５ｇ ｄ．ｗ．、試験区３で０．４６ｇ ｄ．ｗ．、試験区４で０．５０ｇ ｄ．ｗ．となり、窒素源、リン源として硫酸アンモニウム、リン酸３ナトリウムを用いることにより、増体量が大きくなった。また検鏡の結果、糸状体が伸長していたことから、この重量の増加は糸状体の生長によるものであった。培養液中に直立体の形成は認められなかった。さらにフコキサンチン含量について、試験区１では０．３４ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．であるのに対し、試験区２で０．９４ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区３で１．３１ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区４で０．８６ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．となり、リン源をリン酸３ナトリウムに代えたもので含量が最も多くなった。フコステロール含量は試験区１では０．４４ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．であるのに対し、試験区２で１．２４ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区３で１．０１ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区４で１．０３ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．となり、窒素源、リン源として硫酸アンモニウム、リン酸３ナトリウムを用いると含量が多くなった。
【００５１】
比 較 例 １
オキナワモズク糸状体の培養：光量の影響
実施例１の組成のＰＥＳＩ培養液を２％添加したろ過海水を１２１℃４０分間オートクレーブしたものを培養液とした。この培養液９００ｍｌを１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．１３ｇ ｄ．ｗ）加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、光量０、１０、２０、４０、８０、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、それ以外の条件として水温２５℃、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後、乾燥重量を測定した。
【００５２】
【表４】
【００５３】
増体量は最大でも２．５倍にとどまり、ハバノリやモズクと比べて小さいものであった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によれば、褐藻類からフコキサンチンおよびフコステロールを高収量で得ることができるため、健康食品や医薬品等に用いる原料の製造方法として極めて有用である。
以 上
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法に関し、更に詳細には、ハバノリまたはモズクの盤状体または糸状体を原料とし、高収量のフコキサンチンおよび／またはフコステロールを得ることが可能なこれらの化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
褐藻類はカロテノイドの１種であるフコキサンチンやステロールの１種であるフコステロール等の機能性成分を有している。フコキサンチンは下記構造を有する既知の物質であり、その効果としては体内摂取による抗腫瘍効果（特許文献１）や神経細胞保護効果（特許文献２）、血糖値上昇抑制効果（特許文献３）等が報告されている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
一方、フコステロールは下記構造を有する既知の物質であり、その効果としては体内摂取による抗動脈硬化作用（特許文献４）やコレステロール低減作用、血栓予防作用等が一般的に知られている。
【０００５】
【化２】
【０００６】
従来、これらフコキサンチンやフコステロールを製造するにあたっては、ナガマツモ科（Chordaceae）のオキナワモズク（Cladosiphon okamuranus）の成熟体や盤状体・糸状体が原料として使用されていた。しかしながら、成熟体におけるこれらの機能性成分の含有量は少なく、また、盤状体や糸状体でも、含有量は成熟体に比べて高いものの実用的に十分な量とはいえず、また培養も難しいという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−１５８１５６号公報
【特許文献２】特開２００１−３３５４８０号公報
【特許文献３】特開２００７−２９７３７０号公報
【特許文献４】特開２００５−１０４８８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、フコキサンチンおよびフコステロールをより高収量で取得することが可能な製造方法の開発が求められており、本発明は、そのような製造方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究をした結果、原料の褐藻類としてカヤノモリ科（Scytosiphonaceae）のハバノリ（Petalonia binghamiae）またはモズク科（Spermatochnaceae）のモズク（Nemacystus decipiens）の盤状体または糸状体を使用すると、培養による増体量が大きく、またフコキサンチンおよびフコステロールの含有量を高め得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明はハバノリ（Petalonia binghamiae）およびモズク（Nemacystus decipiens）よりなる群から選ばれた褐藻類の盤状体または糸状体の抽出物からフコキサンチンおよび／またはフコステロールを分離することを特徴とするフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の製造方法によれば、培養により、褐藻類を著しく増体させるとともに、褐藻類中のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの含有量を高めることができるため、より経済的に高収量のフコキサンチンおよび／またはフコステロールを製造することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明においては、原料の褐藻類として、カヤノモリ科（Scytosiphonaceae）のハバノリ（Petalonia binghamiae）またはモズク科（Spermatochnaceae）のモズク（Nemacystus decipiens）が用いられる。また、これらの褐藻類は、成熟体から遊走子の放出、遊走子から盤状体または糸状体の発生、盤状体または糸状体の着床による直立体の形成、直立体から成熟体への成長という生育サイクルのうちの、盤状体または糸状体を用いる。なお、盤状体または糸状体は、上記生育サイクルのうちの遊走子と直立体の中間に位置するものであり、別名で呼ばれることもがあるが、本発明においてはこれらの何れも含む。
【００１３】
上記盤状体または糸状体は、天然由来のものであってもよいが、人工的に培養されたものを使用することが好ましく、特に盤状体または糸状体の種苗を直立体を形成させない条件で培養、増加されたものを利用することにより、多量に盤状体または糸状体を得ることができるので好ましい。
【００１４】
上記の直立体を形成させない条件での培養は、褐藻類の盤状体または糸状体の種苗を、培養容器へ着床させない条件で培養することにより行われ、例えば、連続攪拌培養したり、着床しにくい材料で形成した培養容器中で培養すれば良い。
【００１５】
より具体的には、連続攪拌により直立体を形成させずに培養する場合は、攪拌子や攪拌機による機械攪拌や、通気等による攪拌を行い、培養液全体を攪拌しながら培養すれば良い。攪拌条件は容器の大きさ等により適宜変化するが、例えば、培養容器として１Ｌの容量の平底フラスコを用い、通気による攪拌を行う場合には、培養容器内に空気を１．０Ｌ／分〜２．５Ｌ／分、好ましくは１．５Ｌ／分〜２．３Ｌ／分で導入すれば良い。
【００１６】
上記培養の際に用いる培養液は、褐藻類の盤状体または糸状体を培養することができるものであれば特に制限されないが、滅菌された人工海水または海水に、窒素源およびリン源等の栄養成分を含有したものであることが好ましい。窒素源としては、硝酸塩、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、尿酸等が例示できる。このうち、褐藻類中のフコキサンチンおよびフコステロールの含有量を向上できるため、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩を添加することが好ましい。リン源としては、グリセロリン酸２ナトリウム、β−グリセロリン酸ナトリウム等の有機リン酸塩、リン酸３ナトリウム、リン酸３カリウム等の無機リン酸塩が例示できる。これらのうち、無機リン酸塩がフコキサンチンおよびフコステロールの含有量を向上できるため好ましい。窒素源の添加量は、窒素が好ましくは４００〜１６００μＭ、より好ましくは７００〜９００μＭとなる量である。一方、リン源の添加量は、リンが好ましくは１５〜６０μＭ、より好ましくは２０〜４０μＭとなる量である。培地中に添加可能なその他の栄養成分としては、ビタミンＢ１２、ビオチン、チアミンが例示できる。これらの栄養成分を含有する培養液として、例えば公知のＰＥＳＩ培地（Ｍａｓａｋａｚｕ Ｔａｔｅｗａｋｉ、Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｒｕｓｔａｃｅｏｕｓ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ ｗｉｔｈ ｕｎｉｌｏｃｕｌａｒ ｓｐｏｒａｎｇｉａ ｉｎ Ｓｃｙｔｏｓｉｐｈｏｎ ｌｏｍｅｎｔａｒｉａ、Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ
６（１）１９６６．）等を使用することができ、また、ＫＷ−２１（第一製網製）の商品名で市販されている藻類培養液を用いることもできる。これらの培養液を窒素源およびリン源が上記濃度となるよう添加すれば良い。
【００１７】
また、この培養は恒温条件下で行うことが好ましい。ハバノリは、通常１２〜２９℃、好ましくは１５〜２５℃、より好ましくは２０〜２５℃の温度である。一方、モズクは、通常１２〜３０℃、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは１５〜２５℃である。この範囲であると、増体量が大きく、またフコキサンチンおよびフコステロールの含有量が高くなる。
【００１８】
更に、この培養は光照射条件下で行うことが好ましい。ハバノリは、好ましくは１０〜１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１であり、より好ましくは２０〜８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１である。一方、モズクは、好ましくは１０〜１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１であり、より好ましくは１０〜８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１である。この範囲であると、増体量が大きく、またフキキサンチンおよびフコステロールの含有量が高くなる。このような光量により、８Ｌ：１６Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄ、好ましくは１２Ｌ：１２Ｄ〜１６Ｌ：８Ｄの光周期で照射を行えば良い。
【００１９】
上記した培養方法により、褐藻類の盤状体または糸状体のみを繰り返し、増殖させて培養することができる。なお、盤状体または糸状体は、培養容器中に着床すると、すぐに直立体を形成し、成熟体にまで成長してしまうので、盤状体または糸状体を着床させることは盤状体または糸状体を多く得るためには適さない。
【００２０】
上記の培養方法に使用する褐藻類の盤状体または糸状体の種苗は、天然から採取してもよいが、例えば、次のようにして得ることもできる。すなわち、まず、単子嚢を形成していない母藻を数本程度と、盤状体または糸状体が着床することのできる着床担体とを共に滅菌海水に入れ、恒温条件で培養し、遊走子から変化した盤状体または糸状体を着床担体に着床させる。
【００２１】
ここで着床担体としては、ガラス、アクリル、プラスチック、ポリカーボネート、繊維、岩石、砂等が好ましく、特にガラス板（スライドガラス）、アクリル板が好ましい。また、滅菌海水は海水または人工海水をオートクレーブあるいはろ過することにより得られる。この滅菌海水には、上記盤状体または糸状体の培養と同様に栄養成分を適宜添加することができる。
【００２２】
盤状体または糸状体が着床担体に着床するまでの培養は、上記盤状体または糸状体の培養と同様の条件で行えば良い。また、前記培養と同時に、盤状体または糸状体が着床担体に着床できる程度に通気等の攪拌を行っても良い。
【００２３】
次いで、盤状体または糸状体が着床した着床担体を取りだし、滅菌海水で洗浄した後、上記盤状体または糸状体の培養と同様の条件で再度培養する。
【００２４】
上記盤状体または糸状体が着床した着床担体の培養においては、培養２、３日後から１日おきに平筆よる洗浄を行う。この洗浄に用いる水としては、滅菌海水および水道水が使用されるが、水道水での洗浄は１０秒以内で行うことが好ましい。
【００２５】
上記盤状体または糸状体が着床した着床担体の培養開始後８日〜１０日の十分に成長した盤状体または糸状体を、検鏡（１００倍）により雑藻の少ない部分を選んで掻き取って盤状体または糸状体の種苗とすることができる。また、必要により上記で掻き取った盤状体または糸状体を試験管に入れて滅菌海水を使用して３回程度ピペッティングで洗浄し、その後、寒天平板（海水に０．５〜１０％の寒天と０．０１〜１０％の栄養成分（藻類培養液）を添加した寒天培地）に塗りつけて、温度１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃、１０〜１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、好ましくは１０〜８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、光周期８Ｌ：１６Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄ、好ましくは１２Ｌ：１２Ｄ〜２４Ｌ：０Ｄの条件下で培養しても良い。この培養から２０〜３０日後、寒天平板に増殖してきた盤状体または糸状体のうち、雑藻が混入していないコロニーを選択し、これを掻き取って盤状体または糸状体の種苗とすることができる。
【００２６】
一方、盤状体または糸状体から、フコキサンチンおよび／またはフコステロールを抽出するために使用される溶媒は、フコキサンチンおよび／またはフコステロールを抽出することのできるものであれば特に制限されないが、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、酢酸エチル等のエステル類、ヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン等の芳香属炭化水素類、クロロホルム等のハロゲン系有機溶媒、もしくはこれらの混合溶媒が好ましく、フコキサンチンおよび／またはフコステロールが食品等にも使用されることからエタノールもしくは含水エタノールがより好ましい。含水エタノールは、エタノール：水の混合比が５０：１〜１：１、好ましくは１０：１〜２：１（質量比）の範囲である。含水エタノールを用いると、クロロフィル等の不純物の含有量が少なく、フコキサンチン等の収率を向上できるために好ましい。これらの溶媒は、盤状体または糸状体に対して４：１〜１０００：１、好ましくは４：１〜２００：１の質量比で添加すれば良い。
【００２７】
上記溶媒を用いる抽出は常法により行うことができ、例えば、溶媒としてエタノールを用いる場合であれば、１５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜４０℃の温度で、０．５時間〜１．５時間、好ましくは１時間〜１．５時間抽出を行えば良い。また、抽出に当たっては、必要により、超音波、攪拌機等により攪拌を行っても良い。
【００２８】
以上のようにして得られる有機溶媒抽出物から、フコキサンチンおよび／またはフコステロールを分離、取得するには、有機溶媒抽出物をそのまま、あるいは残渣を取り除いてからＨＰＬＣ等に付し、これにより分離・精製を行えばよい。
【００２９】
斯くして得られるフコキサンチンおよび／またはフコステロールは上記したコレステロール低減作用や血栓予防作用を期待した各種健康食品や、抗腫瘍効果、神経細胞保護効果、血糖値上昇抑制効果等を目的とした医薬品等の用途に使用することができる。
【００３０】
本発明で用いるハバノリおよびモズクの糸状体等は、従来使用されているオキナワモズクと比べ、容器への附着性が弱く成熟しにくいため、容器を用いた攪拌培養を容易に行えるという利点も有する。附着性が高いと、容器壁面にコケ状に附着し、光の照射が阻害されたり、通気による攪拌培養が滞るため生産量が低下する。また、ハバノリおよびモズクの糸状体等はオキナワモズクと比べて真水に強く、夾雑物を真水処理して洗い流すことができるため培養がより容易である。
【実施例】
【００３１】
以下に、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００３２】
実 施 例 １
ハバノリ糸状体の培養（１）：水温の影響
下記表１の組成のＰＥＳＩ培養液を２％添加したろ過海水を１２１℃４０分間オートクレーブしたものを培養液とした。この培養液９００ｍｌを１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．２ｇ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ （以下、ｄ．ｗ．））加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、温度１５、２０、２５、３０℃の４条件により、光量８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後乾燥重量を測定した。
【００３３】
【表１】
【００３４】
実 施 例 ２
ハバノリ糸状体の培養（２）：光量の影響
実施例１と同じ組成のＰＥＳＩ培養液を２％添加したろ過海水を１２１℃４０分間オートクレーブしたものを培養液とした。この培養液９００ｍｌを１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．２ｇ ｄ．ｗ）加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、光量１０、２０、４０、８０、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、水温２５℃、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後乾燥重量を測定した。
【００３５】
実 施 例 ３
ハバノリ糸状体の培養（３）：培養液組成の影響
実施例１と同じ組成および濃度のＰＥＳＩ培養液（試験区１）と、この組成において窒素源を硝酸ナトリウムから硫酸アンモニウムに代えたもの（試験区２）、リン源をグリセロリン酸２ナトリウムからリン酸３ナトリウムに代えたもの（試験区３）、窒素、リン源ともに硫酸アンモニウム、リン酸３ナトリウムに代えたもの（試験区４）、の４種類の培養液を作成した。培養液９００ｍｌをそれぞれ１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．２ｇ ｄ．ｗ）加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、水温２５℃、光量８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後乾燥重量を測定した。
【００３６】
実 施 例 ４
ハバノリ糸状体からのフコキサンチンおよびフコステロールの製造：
（フコキサンチンおよびフコステロールの抽出）
実施例１ないし３で得られたハバノリ糸状体を凍結乾燥し、２００倍容のメタノールにて４０℃で１時間抽出を行なった。抽出液は残渣を除去した後、減圧下にて溶媒を留去し、残留物を一定量のメタノールに再溶解し、分析用サンプルとした。下記方法により、フコキサンチンおよびフコステロールを測定した。結果を乾燥重量と併せて表２に示す。
【００３７】
（フコキサンチンの定量方法）
フコキサンチンはＨＰＬＣにより定量を行った。カラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ２２−ＡＲ−ＩＩ（ナカライテスク製、内径４．６ｘ２５０ｍｍ）を用い、移動相はアセトニトリル／水の混合液（８０：２０）を用いた。フコキサンチンの検出は波長４５０ｎｍの吸収で行い、流速は１．５ｍｌ／ｍｉｎで分析を行った。
【００３８】
（フコステロールの定量方法）
フコステロールはＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフ質量分析装置）により定量を行った。カラムはＪ＆Ｗ社製ＤＢ−５ＭＳ（内径０．２５ｍｍｘ３０ｍ、膜厚０．２５ｍ）を用い、キャリアガスとしてヘリウムを用いた。フコステロールの検出はＳＩＭモードでフコステロール由来フラグメントイオンｍ／ｚ＝３１４で行った。
【００３９】
【表２】
【００４０】
２０、２５℃条件下では、培養開始時の２倍の重量となった。また検鏡の結果、糸状体が伸長していたことから、この重量の増加は糸状体の生長によるものであった。培養液中に直立体の形成は認められなかった。さらにフコキサンチン含量およびフコステロール含量は水温が高くなるほど含量が多くなった。
【００４１】
また、光量が強くなるほど増体量が大きく、２０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では培養開始時の２倍、４０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では２．５倍、８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では３．５倍、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では４倍の重量となった。また検鏡の結果、糸状体が伸長していたことから、この重量の増加は糸状体の生長によるものであった。培養液中に直立体の形成は認められなかった。フコキサンチン含量については、極端に光量の強い１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で含量が少なくなった。
【００４２】
さらに培養液の組成については、試験区１で０．５６ｇ ｄ．ｗ．、試験区２で０．６４ｇ ｄ．ｗ．、試験区３で０．５７ｇ ｄ．ｗ．、試験区４で０．５６ｇ ｄ．ｗ．となり、全ての条件で約３倍の重量となった。また検鏡の結果、糸状体が伸長していたことから、この重量の増加は糸状体の生長によるものであった。培養液中に直立体の形成は認められなかった。さらにフコキサンチン含量について、試験区１では２．３１ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．であるのに対し、試験区２で３．２０ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ、試験区３で３．８５ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区４で４．５３ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．となり、窒素源、リン源として硫酸アンモニウム、リン酸３ナトリウムを用いると、相加的に含量が多くなった。フコステロール含量は試験区１で２．６８ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区２で３．０７ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区３で３．２２ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区４で３．８０ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．となり、窒素源、リン源として硫酸アンモニウム、リン酸３ナトリウムを用いると、相加的に含量が多くなった。
【００４３】
実 施 例 ５
モズク糸状体の培養（１）：水温の影響
実施例１の組成のＰＥＳＩ培養液を２％添加したろ過海水を１２１℃４０分間オートクレーブしたものを培養液とした。この培養液９００ｍｌを１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．２ ｇ ｄ．ｗ．）加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、温度１５、２０、２５、３０℃の４条件、それ以外の条件として光量８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後、乾燥重量を測定した。
【００４４】
実 施 例 ６
モズク糸状体の培養（２）：光量の影響
実施例１の組成のＰＥＳＩ培養液を２％添加したろ過海水を１２１℃４０分間オートクレーブしたものを培養液とした。この培養液９００ｍｌを１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．２ ｇ ｄ．ｗ）加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、光量０、１０、２０、４０、８０、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、それ以外の条件として水温２５℃、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後、乾燥重量を測定した。
【００４５】
実 施 例 ７
モズク糸状体の培養（３）：培養液組成の影響
実施例１と同じ組成・濃度のＰＥＳＩ培養液（試験区１）と、組成中の窒素源を硝酸ナトリウムから硫酸アンモニウムに代えたもの（試験区２）、リン源をグリセロリン酸２ナトリウムからリン酸３ナトリウムに代えたもの（試験区３）、窒素、リン源ともに硫酸アンモニウム、リン酸３ナトリウムに代えたもの（試験区４）、の４種類の培養液を作成した。作成した培養液９００ｍｌをそれぞれ１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．２ｇ ｄ．ｗ）加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、水温２５℃、光量８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後乾燥重量を測定した。
【００４６】
実 施 例 ８
モズク糸状体からのフコキサンチンおよびフコステロールの製造：
（フコキサンチンおよびフコステロールの抽出）
実施例５ないし７で得られたモズク糸状体を凍結乾燥し、２００倍容のメタノールにて４０℃で１時間抽出を行なった。抽出液は残渣を除去した後、減圧下にて溶媒を留去し、残留物を一定量のメタノールに再溶解し、分析用サンプルとした。実施例４と同様の方法により、フコキサンチンおよびフコステロールを測定した。結果を乾燥重量と併せて表３に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
水温について、１週間培養後、１５℃で０．３９ｇ ｄ．ｗ．、２０℃で０．５３ｇ ｄ．ｗ．、２５℃で０．５８ｇ ｄ．ｗ．、３０℃で０．５５ｇ ｄ．ｗ．となり、１５℃以外の水温で約２．８倍の増重が認められた。また検鏡の結果、糸状体が伸長していたことから、この重量の増加は糸状体の生長によるものであった。培養液中に直立体の形成は認められなかった。またフコキサンチン含量およびフコステロール含量は水温が低くなるほど含量が多くなった。
【００４９】
また光量が強くなるほど増重した。２０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では培養開始時の２．３倍、４０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では２．７倍、８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では３倍、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１では３．１倍の重量となった。検鏡の結果、糸状体が伸長していたことから、この重量の増加は糸状体の生長によるものであった。培養液中に直立体の形成は認められなかった。さらにフコキサンチン含量およびフコステロール含量については、低光量の１０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で含量が最も多くなった。
【００５０】
さらに培養液については、試験区１で０．４２ｇ ｄ．ｗ．、試験区２で０．４５ｇ ｄ．ｗ．、試験区３で０．４６ｇ ｄ．ｗ．、試験区４で０．５０ｇ ｄ．ｗ．となり、窒素源、リン源として硫酸アンモニウム、リン酸３ナトリウムを用いることにより、増体量が大きくなった。また検鏡の結果、糸状体が伸長していたことから、この重量の増加は糸状体の生長によるものであった。培養液中に直立体の形成は認められなかった。さらにフコキサンチン含量について、試験区１では０．３４ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．であるのに対し、試験区２で０．９４ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区３で１．３１ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区４で０．８６ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．となり、リン源をリン酸３ナトリウムに代えたもので含量が最も多くなった。フコステロール含量は試験区１では０．４４ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．であるのに対し、試験区２で１．２４ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区３で１．０１ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．、試験区４で１．０３ｍｇ／ｇ ｄ．ｗ．となり、窒素源、リン源として硫酸アンモニウム、リン酸３ナトリウムを用いると含量が多くなった。
【００５１】
比 較 例 １
オキナワモズク糸状体の培養：光量の影響
実施例１の組成のＰＥＳＩ培養液を２％添加したろ過海水を１２１℃４０分間オートクレーブしたものを培養液とした。この培養液９００ｍｌを１Ｌの平底フラスコに入れ、３０μｍメッシュで濾過した糸状体を市販の脱水機で６分間脱水したものを１ｇ（乾燥重量：０．１３ｇ ｄ．ｗ）加え、空気を２．３Ｌ／分で導入し、光量０、１０、２０、４０、８０、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、それ以外の条件として水温２５℃、光周期１２Ｌ：１２Ｄ下で１週間培養した。培養後、乾燥重量を測定した。
【００５２】
【表４】
【００５３】
増体量は最大でも２．５倍にとどまり、ハバノリやモズクと比べて小さいものであった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によれば、褐藻類からフコキサンチンおよびフコステロールを高収量で得ることができるため、健康食品や医薬品等に用いる原料の製造方法として極めて有用である。
以 上
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハバノリ（Petalonia binghamiae）およびモズク（Nemacystus decipiens）よりなる群から選ばれた褐藻類の盤状体または糸状体の抽出物からフコキサンチンおよび／またはフコステロールを分離することを特徴とするフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項２】
ハバノリおよびモズクよりなる群から選ばれた褐藻類の盤状体または糸状体が、褐藻類の盤状体種苗または糸状体種苗を、直立体を形成させない条件で培養、増加させて得た盤状体または糸状体である請求項第１項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項３】
培養が、通気による攪拌により行われるものである請求項第１項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項４】
褐藻類がハバノリである請求項第１項ないし第３項のいずれかの項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項５】
培養が、１５〜２５℃の温度条件下で行われるものである請求項第４項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項６】
培養が、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１以下の光照射条件下で行われるものである請求項第４項または第５項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項７】
培養が、窒素源およびリン源を含有する培養液で行われるものである請求項第４項ないし第６項のいずれかの項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項８】
窒素源がアンモニウム塩である請求項第７項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項９】
リン源が無機リン酸塩である請求項第７項または第８項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１０】
褐藻類がモズクである請求項第１項ないし第３項のいずれかの項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１１】
培養が、１５〜３０℃の温度条件下で行われるものである請求項第１０項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１２】
培養が、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１以下の光照射条件下で行われるものである請求項第１０項または第１１項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１３】
培養が、窒素源およびリン源を含有する培養液で行われるものである請求項第１０項ないし第１２項のいずれかの項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１４】
窒素源がアンモニウム塩である請求項第１３項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１５】
リン源が無機リン酸塩である請求項第１３項または第１４項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１】
ハバノリ（Petalonia binghamiae）およびモズク（Nemacystus decipiens）よりなる群から選ばれた褐藻類の盤状体または糸状体の抽出物からフコキサンチンおよび／またはフコステロールを分離することを特徴とするフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項２】
ハバノリおよびモズクよりなる群から選ばれた褐藻類の盤状体または糸状体が、褐藻類の盤状体種苗または糸状体種苗を、直立体を形成させない条件で培養、増加させて得た盤状体または糸状体である請求項第１項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項３】
培養が、通気による攪拌により行われるものである請求項第１項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項４】
褐藻類がハバノリである請求項第１項ないし第３項のいずれかの項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項５】
培養が、１５〜２５℃の温度条件下で行われるものである請求項第４項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項６】
培養が、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１以下の光照射条件下で行われるものである請求項第４項または第５項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項７】
培養が、窒素源およびリン源を含有する培養液で行われるものである請求項第４項ないし第６項のいずれかの項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項８】
窒素源がアンモニウム塩である請求項第７項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項９】
リン源が無機リン酸塩である請求項第７項または第８項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１０】
褐藻類がモズクである請求項第１項ないし第３項のいずれかの項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１１】
培養が、１５〜３０℃の温度条件下で行われるものである請求項第１０項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１２】
培養が、１６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１以下の光照射条件下で行われるものである請求項第１０項または第１１項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１３】
培養が、窒素源およびリン源を含有する培養液で行われるものである請求項第１０項ないし第１２項のいずれかの項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１４】
窒素源がアンモニウム塩である請求項第１３項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【請求項１５】
リン源が無機リン酸塩である請求項第１３項または第１４項記載のフコキサンチンおよび／またはフコステロールの製造方法。
【公開番号】特開２０１０−１６８２８４（Ｐ２０１０−１６８２８４Ａ）
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９４５６（Ｐ２００９−９４５６）
【出願日】平成２１年１月２０日（２００９．１．２０）
【出願人】（５０４４２６２１８）株式会社サウスプロダクト (15)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２０日（２００９．１．２０）
【出願人】（５０４４２６２１８）株式会社サウスプロダクト (15)
【Ｆターム（参考）】
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