フラビウイルス感染症ワクチンおよびフラビウイルス感染症ワクチン用アジュバント
【課題】フラビウイルス感染症ワクチン用アジュバントおよびそれを用いた効果的且つ安全な１回接種用フラビウイルス感染症ワクチンの提供。
【解決手段】安全なフラビウイルス抗原、およびポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子または水酸化アルミニウムゲルを効果的なアジュバントとして含有するフラビウイルス感染症ワクチン、並びにポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるフラビウイルス感染症ワクチン用アジュバント。
【解決手段】安全なフラビウイルス抗原、およびポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子または水酸化アルミニウムゲルを効果的なアジュバントとして含有するフラビウイルス感染症ワクチン、並びにポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるフラビウイルス感染症ワクチン用アジュバント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビウイルス感染症ワクチンおよびフラビウイルス感染症ワクチン用免疫助成剤（アジュバント）を含有する１回接種用のフラビウイルス感染症ワクチンに関する。詳しくは、アジュバントとして生分解性γ−ＰＧＡナノ粒子（γ−ＰＧＡ−ＮＰ）または水酸化アルミニウムゲルを用いて感染防御免疫能を増強し、１回接種することで複数回接種した場合と同程度にフラビウイルス感染症を予防するためのフラビウイルス感染症ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルスは、１本鎖のプラス鎖ＲＮＡをゲノム（約１１ｋｂ）とするＲＮＡウイルスである。このウイルスには、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、およびセントルイス脳炎ウイルスが含まれる。フラビウイルスは、脊椎動物に広く存在し、その多くは蚊やダニを介して伝播する。脊椎動物への感染の多くは不顕性であるが、まれに、脳炎などによって特徴付けられる中枢神経系の病気に代表される重篤な病気を引き起こすことがある。世界的には毎年非常に多くの臨床例および死亡例が報告されており、近年の日本においてはフラビウイルス感染症の患者は少なくなったものの、海外の感染地域からの日本上陸が強く懸念されており、感染の蔓延を予防する方策が強く求められている。
【０００３】
フラビウイルスの感染を予防するために、有効なワクチンの開発が急務である。
日本脳炎（以下、ＪＥともいう）を例に採ると、財団法人阪大微生物病研究会は、北京１株からホルマリン不活化マウス脳由来ＪＥワクチン（以下、ＪＥワクチン、ＪＥワクチンビケンともいう）を製造し、主に日本で配給している。当該研究会はまた、日本脳炎ウイルス（以下、ＪＥＶともいう）中山株からの、別のマウス脳由来ＪＥワクチン（ＪＥ−ＶＡＸ）も製造した。ＪＥ−ＶＡＸは商業的に配給されており、国際的に広く利用可能である（非特許文献１）。
国際的には、ＪＥ−ＶＡＸワクチンの推奨される投与スケジュールは、０、７、および３０日目のそれぞれに計３回の接種であり、最初のシリーズ後に、さらに追加免疫のワクチン接種をする必要があるが最適な時期は充分に解決されていない。
日本において、子供のＪＥワクチンの接種は法律で義務付けられている。最初の一連の免疫は、９０ヶ月齢までに３回のワクチン接種、ならびに９歳から１２歳までの間に単回の追加免疫接種が必要とされている。日本政府は、ＪＥＶに対する免疫性を維持するために、更に付加的な定期的追加免疫を推奨している。このように現行の日本脳炎ワクチンの問題点は、複数回の基礎免疫、さらに追加免疫を要することは不便かつ不快であり、ＪＥの突然の大流行やＪＥＶ感染のリスクが高い地域への急な旅行のような緊急の状況で短期間でＪＥ予防を殆ど与えないことである。それゆえ、ＪＥＶに対する有効な１回接種用ワクチンの開発が非常に必要とされている。
しかし、これらフラビウイルス感染症ワクチンにおいては有用なアジュバントは、未だ開発されていない。
【０００４】
ワクチンにおける使用のために数多くのアジュバントが評価されてきた。しかしながら、殆どが認容出来ない毒性レベルを有し、日本で一般に臨床使用される唯一のアジュバントはアルミニウムベースのミネラル塩（アルミニウムアジュバント；ａｌｕｍ）である。
γ−ＰＧＡは、伝統的日本食である納豆の天然成分であり、納豆菌の特定の株によって産生される細菌の被膜エキソポリマーである（非特許文献２〜５）。本発明者等は、生分解性（γ−ＰＧＡ）−グラフト−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−ＰＡＥ）コポリマー（γ−ＰＧＡナノ粒子［γ−ＰＧＡ−ＮＰ］）を作り出し、γ−ＰＧＡ−ＮＰは、天然起源、水溶性、生分解性、且つ安全であるため、医療用途にたいへん適しており、薬物送達、組織工学において、ならびに感熱性ポリマーとしての用途を提案している。
【非特許文献１】Ｋｕｒａｎｅ Ｉ．他，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０００；１８ Ｓｕｐｐｌ ２：ｐ３３−３５
【非特許文献２】Ａｋａｇｉ Ｔ．他，Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｂｉｏｓｃｉ，２００５；５（７）：ｐ５９８−６０２
【非特許文献３】Ａｋａｇｉ Ｔ．他，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２００５；１０８（２−３）：ｐ２２６−２３６
【非特許文献４】Ａｋａｇｉ Ｔ．他，Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ，２００６；１７（８）：ｐ８７５−９２
【非特許文献５】Ａｋａｇｉ Ｔ．他，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００７；２８（２３）：ｐ３４２７−３４３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、安全且つ効果的なフラビウイルス感染症ワクチン用アジュバントを含有する１回接種で感染防御可能なフラビウイルス感染症ワクチンの提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、日本脳炎ワクチンのように基礎免疫に際して複数回接種を要するフラビウイルスワクチンについて１回接種で数回接種と同程度の免疫防御能を得ることができる１回接種法の開発を目指している。また、ワクチン製造の安全性を向上するために日本脳炎ウイルスを不使用とする安全な次世代ワクチンの開発も必要である。そこで、既存の日本脳炎ワクチン、或いは日本脳炎ウイルスを使用せずに製造可能でワクチン効果を有する日本脳炎中空粒子（ＪＥ−ＶＬＰ）あるいはウエストナイル中空粒子を用いて、アジュバント併用による１回接種用ワクチン開発を開始した。アジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲルと納豆菌由来のγ−ＰＧＡをＬ−エチルアラニンエチルエステルで部分疎水修飾させ両親媒化することにより作製したγ−ＰＧＡ−ＮＰを用いた。フラビウイルスワクチンにアジュバントとして当該ナノ粒子を加えることにより、１回接種で充分な感染防御免疫を誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
【０００７】
［１］フラビウイルス感染症を予防するためのフラビウイルス抗原、およびアジュバントを含有するフラビウイルス感染症ワクチン。
［２］アジュバントがポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子である、上記［１］記載のワクチン。
［３］アジュバントが水酸化アルミニウムゲルである、上記［１］記載のワクチン。
［４］水酸化アルミニウムゲルが炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製されたものである、上記［３］記載のワクチン。
［５］１回接種することでフラビウイルス感染症を予防するためのワクチンである、上記［１］〜［４］いずれかに記載のワクチン。
［６］フラビウイルスが日本脳炎ウイルスおよび／またはウエストナイルウイルスである、上記［１］〜［５］いずれかに記載のワクチン。
［７］フラビウイルス抗原がフラビウイルス様中空粒子である、上記［１］〜［６］いずれかに記載のワクチン。
［８］フラビウイルス抗原がウイルス全粒子である、上記［１］〜［６］いずれかに記載のワクチン。
［９］ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである、上記［２］、［５］〜［８］いずれかに記載のワクチン。
［１０］ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである、上記［２］、［５］〜［９］いずれかに記載のワクチン。
［１１］ポリアミノ酸が両親媒化されている、上記［２］、［５］〜［１０］いずれかに記載のワクチン。
［１２］ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体である、上記［２］、［５］〜［１１］いずれかに記載のワクチン。
［１３］ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるフラビウイルス感染症ワクチン用アジュバント。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のアジュバントは、フラビウイルス感染症ワクチン用の効果的且つ安全なアジュバントである。γ−ＰＧＡ−ＮＰまたは水酸化アルミニウムゲルをアジュバントとするフラビウイルス抗原を含有する本発明のフラビウイルス感染症ワクチンは、従来のプレーンワクチンを複数回接種した場合と同程度の充分な感染防御免疫を１回接種することで誘導することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、フラビウイルス感染症を予防するためのフラビウイルス抗原、およびアジュバントを含有するフラビウイルス感染症ワクチンを提供する。
【００１０】
詳細には本発明は、フラビウイルス抗原、およびポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子を含有するフラビウイルス感染症ワクチンを提供する。該ワクチンは１回接種で充分な効果を有するため、その使用は１回接種が好ましい。
【００１１】
本発明はまた、フラビウイルス抗原、および水酸化アルミニウムゲルを含有するフラビウイルス感染症ワクチンを提供する。該ワクチンは１回接種で充分な効果を有するため、その使用は１回接種が好ましい。
【００１２】
本発明においてフラビウイルスとは、フラビウイルス科フラビウイルス属に属するウイルスであり、例えば、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、およびセントルイス脳炎ウイルスなどが挙げられる。特に好ましくは、日本脳炎ウイルスまたはウエストナイルウイルスである。フラビウイルスの亜型は、特に限定されず、これまで単離された亜型であっても将来単離される亜型であってもよい。
【００１３】
本発明のワクチンに含まれるフラビウイルス抗原とは、前記フラビウイルスを構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなく、Ｍタンパク質およびＥタンパク質をはじめとするウイルスサブユニットでもよく、ウイルス全粒子でもよい。あるいは、フラビウイルス抗原は、フラビウイルスを使用せずに製造可能でワクチン効果を有すると報告されているフラビウイルス様中空粒子（以下、ＶＬＰともいう）であってもよい。免疫原性の観点から、ＶＬＰまたは全ウイルス粒子が好ましい。全ウイルス粒子に関しては、ホルマリン等により不活化された全ウイルス粒子が安全性の観点からより好ましい。本発明のフラビウイルス感染症ワクチンに含まれるフラビウイルス抗原は、１種または２種以上を適宜選択して用いることができる。また、複数の亜型に由来する１種の抗原を用いてもよい。
【００１４】
上記フラビウイルス抗原が日本脳炎ウイルス抗原の場合、その製法は以下のようになる。
抗原がウイルス全粒子の場合、例えば、日本脳炎ワクチンビケンの製法と同様に、日本脳炎ウイルスに感染したマウスの脳乳剤を硫酸プロタミンで処理し、ウイルスを分離、精製し、これをホルマリンで不活化した後、超遠心法で精製しＴＣＭ−１９９で希釈するなどすればよい。あるいは、例えば国際公開ＷＯ００／２０５６５号に開示されたようにして、日本脳炎ウイルスを細胞株に感染させて培養する方法を用いてもよい。
抗原がＶＬＰの場合は、例えば特開２００４−６５１１８号公報に開示された方法に従って、日本脳炎ウイルスゲノムＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを発現ベクターに組み込んで動物細胞を形質転換し、形質転換体を培養してＶＬＰを得ることができる。
【００１５】
ウエストナイルウイルス抗原も、上記の日本脳炎ウイルス抗原に準じて製造することが可能である。即ち、抗原がウイルス全粒子の場合、例えば、ウエストナイルウイルスに感染したマウスの脳乳剤を硫酸プロタミンで処理し、ウイルスを分離、精製し、これをホルマリンで不活化した後、超遠心法で精製しＴＣＭ−１９９で希釈するなどすればよい。あるいは、国際公開ＷＯ００／２０５６５号に開示された方法に準じて、ウエストナイルウイルスを細胞株に感染させて培養する方法を用いても良い。
また、抗原がウエストナイルウイルスＶＬＰの場合は、ウエストナイルウイルスのアミノ酸配列（例、ＮＹ９９−ｆｌａｍｉｎｇｏ３８２−９９株：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１９６８３５）をもとにして、ウエストナイルウイルスのｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターを動物細胞に導入し、得られた形質転換細胞を培養することにより、その培地中にウエストナイルウイルスＶＬＰを分泌させることが可能である。ＮＹ９９−ｆｌａｍｉｎｇｏ３８２−９９株以外の変異ウエストナイルウイルス株としては、例えば、Ebel, G.D.ら, Am. J. Trop. Med. Hyg., 71(4): 493-500, 2004の「Table I」に記載のもの等が挙げられ、該表中に示される各Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．の配列を入手して、対応する領域を決定することにより、容易に変異ウエストナイルウイルス株のＶＬＰを得ることができる。
日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス以外のフラビウイルス抗原についても、上記の方法に準じて製造することが可能である。
【００１６】
本発明においてアジュバントとは、抗原とともに用いられると、抗原に対する免疫応答を非特異的に高め、抗原に対する細胞性免疫や抗体生産を増強したり、長時間留まらせたりという役割を果たして、具体的には、抗原に吸着する性質を持つ無機物（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバンなど）や抗原水溶液を包んで乳濁液にする性質を持つ油乳剤（例えば、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバントなど）などである。本発明に使用されるアジュバントは上記目的を達成し得る限り制限されないが、フラビウイルス抗原とともに用いることにより１回接種で充分な感染防御免疫誘導効果を与えることから、ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子および水酸化アルミニウムゲルが好ましい。
【００１７】
１つの実施態様において、本発明のワクチンは、上記フラビウイルス抗原以外に、ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子を含む。
【００１８】
前記「生分解性ナノ粒子」とは、ポリアミノ酸を主成分とし、生体内で酵素等の作用を受け、所定の時間経過後に粒子の崩壊およびポリアミノ酸骨格がアミノ酸のモノマーまたはオリゴマーに分解可能な粒子をいう。
【００１９】
本発明における生分解性ナノ粒子の「主成分」とは、ナノ粒子を構成する骨格をいう。
【００２０】
本発明における生分解性ナノ粒子の形状は特に限定されるものではないが、一般的には球状である。球状の粒子のサイズは通常１０ｎｍ〜１００μｍ程度であり、好ましくは１０ｎｍ〜５００ｎｍである。このようなサイズにすることによって、単位重量当りの粒子表面積増加に伴うフラビウイルス抗原の固定化量の増加、抗原提示細胞への抗原の取り込み促進、それに伴うＣＴＬの活性化、抗体産生の誘導などの効果が生じる。
【００２１】
前記粒子の形状は、顕微鏡にて観察し、確認することができる。前記粒子のサイズは、ナノ粒子の水分散液を動的光散乱により測定した平均粒子径をいう。なお、球状以外の形状のナノ粒子のサイズは、球状のナノ粒子に準じて求めることができる。
【００２２】
前記生分解性ナノ粒子の骨格となるポリアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸または人工アミノ酸の重合体であってもよい。安全性または毒性の面から、天然に存在するアミノ酸からなるポリアミノ酸が好ましいが、その由来は天然物であっても合成品であってもよい。天然に存在するアミノ酸としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンまたはアスパラギンが好ましい。また、アミノ酸はＬ−体であってもＤ−体であってもよい。ポリアミノ酸中にＬ−体とＤ−体が所定の割合で含まれていてもよい。
【００２３】
天然に存在するアミノ酸からなるポリアミノ酸としては、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）またはポリアスパラギンが好ましい。所期の目的を達成し、ナノ粒子に様々な特性を付与するためには、前記ポリアミノ酸の修飾体、それらの誘導体またはそれらの混合物も本発明の好ましいポリアミノ酸に含まれる。特に好ましいポリアミノ酸は、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体またはそれらの混合物である。
【００２４】
「修飾アミノ酸」、「アミノ酸誘導体」、ポリアミノ酸の「修飾体」および「誘導体」という用語は、当該分野において通常使用される意味を有するものとする。ポリアミノ酸の「修飾体」および「誘導体」の例としては、構成アミノ酸の一部を別のアミノ酸としたもの、構成アミノ酸の利用可能な官能基を用いて修飾したもの等があげられる。具体的には、ポリ（γ−グルタミン酸）のペプチド鎖中に１種またはそれ以上の他のアミノ酸、その修飾体もしくは誘導体を導入したもの、グラフト共重合体となっているもの、またはポリ（ε−リジン）の構成アミノ酸リジンの利用可能なα−位の一部をメチル化したもの等があげられる。
【００２５】
ポリアミノ酸の「混合物」とは、２種以上のアミノ酸を構成成分とするものであり、前記例示したポリアミノ酸、それらの修飾体およびそれらの誘導体を構成するアミノ酸から２種以上選択することが好ましい。
【００２６】
好ましい「修飾体」または「誘導体」の例として、ポリアミノ酸が両親媒化されるように、ポリアミノ酸を修飾または誘導したものがあげられる。例えば、親水性ポリアミノ酸の側鎖に疎水性アミノ酸を導入して、所望の親水性−疎水性のバランスとすることもできる。ポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体であるポリアミノ酸が好適な具体例としてあげられる。かかるポリアミノ酸は、分子内および分子間の疎水性基の会合によりナノ粒子化が容易である点からも好ましい。
【００２７】
ポリアミノ酸は、アミノ酸以外の構成成分、例えば、糖質、脂質等を含んでいてもよい。好ましいポリアミノ酸は、構成成分の５０重量％以上がアミノ酸である。
【００２８】
ポリアミノ酸においてすべての構成アミノ酸間の結合は、同一種類のものであってもよく、異なる種類のものであってもよい。例えば、すべての構成アミノ酸がペプチド結合によって結合したものであってもよく、部分的または全体的にペプチド結合以外の結合またはリンカーによりアミノ酸が結合したものであってもよい。ペプチド結合以外の結合としては、エステル結合、エーテル結合等があげられ、リンカーとしては、グルタルアルデヒド、ジイソシアネート等があげられるが、これらに限定されない。さらに、ポリアミノ酸の官能基間において架橋されていてもよい。架橋することにより、ポリアミノ酸の物性を変化させ、所望のアジュバント特性を得ることも可能である。架橋剤としては、カルボジイミド、ジグリシジルエステル等があげられるが、これらに限定されない。
【００２９】
ポリアミノ酸の分子量は、特に限定されるものではないが、所望の粘度や溶解度に応じて変更されうる。分子量は、通常１０００〜５００万の範囲である。好ましくは５０００〜２００万の範囲である。前記分子量は、水溶液もしくは有機溶媒中でゲルろ過クロマトグラフィーにより測定された値である。
【００３０】
ポリアミノ酸の製造は、化学合成法、発酵法などの公知の方法を適宜選択して行うことができる。ポリアミノ酸のナノ粒子化は、公知の方法により行うことができる。例えば、液中乾燥法、噴霧乾燥法、球形晶析法、溶媒置換法（沈殿・透析法）、直接超音波分散法を用いることができる。例えば、ポリ（γ−グルタミン酸）またはポリ（ε−リジン）からなる生分解性ナノ粒子は、溶媒置換法により製造することができる。このような方法を適宜選択または組み合わせて、生分解性ナノ粒子の材料、構成成分、分子量、サイズ、電荷その他のパラメータを目的に応じたものとすることができる。
【００３１】
別の実施態様において、本発明のワクチンは、上記フラビウイルス抗原以外に、水酸化アルミニウムゲルを含む。
【００３２】
本発明のワクチンに用いられる水酸化アルミニウムゲルは、ワクチンに添加して抗原の免疫原性を高める作用を有する限り、いかなる水酸化アルミニウムゲルであってもよい。例えば、水酸化アルミニウムゲルは、自体公知の方法により製造することが可能であり、水酸化アルミニウムゲル「Aluminum Hydroxide Gel (A-8222)」（SIGMA製）、「Alhydrogel (2%）) （Brenntag Biosector製）などの市販品を使用してもよい。
【００３３】
前記水酸化アルミニウムゲルは、炭酸ナトリウム及び硫酸アルミニウムカリウムを原料として調製されたものであることが好ましい。原料となる炭酸ナトリウム及び硫酸アルミニウムカリウムは、水酸化アルミニウムゲルを調製するために通常用いられる試薬を限定なく使用することが出来る。硫酸アルミニウムカリウムは、カリミョウバンとも称される硫酸アルミニウムカリウム１２水和物ＡｌＫ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏが好適に用いられる。
【００３４】
炭酸ナトリウム及び硫酸アルミニウムカリウムを原料として、本発明で使用される水酸化アルミニウムゲルは例えば以下のようにして調製される。炭酸ナトリウム（１４３．１ｇ）を９Ｌの生理食塩水に溶解し、濾過し、炭酸ナトリウム溶液を調製する。硫酸アルミニウムカリウム１２水和物（カリミョウバン）（３１６．０ｇ）を９Ｌの生理食塩水に溶解し、濾過し、硫酸アルミニウムカリウム溶液を調製する。得られた炭酸ナトリウム溶液及び硫酸アルミニウムカリウム溶液を混合し、撹拌すれば水酸化アルミニウムゲルが得られ、これを洗浄することにより本発明のアジュバント（水酸化アルミアジュバント）として使用することができる。
【００３５】
本発明のフラビウイルス感染症ワクチンは、前記フラビウイルス抗原が前記生分解性ナノ粒子内に包含されていてもよく、前記フラビウイルス抗原が前記生分解性ナノ粒子表面に固定されていてもよい。
【００３６】
本発明のワクチンに含まれるフラビウイルス抗原と生分解性ナノ粒子との比は、抗原の種類やナノ粒子の特性により一概には規定できないが、例えば、フラビウイルス抗原としてＶＬＰ、および生分解性ナノ粒子としてポリ（γ−グルタミン酸）を用いた場合、重量比で１：１〜１：１０００が例示され、好ましくは１：１０〜１：２００である。
【００３７】
また、本発明のフラビウイルス感染症ワクチンは、前記フラビウイルス抗原と前記アジュバントとしての水酸化アルミニウムゲルとを混合することにより製造することができる。
【００３８】
本発明のワクチンに含まれるフラビウイルス抗原と水酸化アルミニウムゲルの比は、抗原の種類などにより一概には規定できないが、例えば、フラビウイルス抗原としてＶＬＰを用いた場合、重量比で１：１０〜１：５００が例示され、好ましくは１：３０〜１：２００である。
【００３９】
さらに、本発明のワクチンは、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。前記医薬として許容されうる担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体を限定なく使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液およびそれらの組合せがあげられる。また、これに乳化剤、保存剤（例、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤および不活化剤（例、ホルマリン）等が適宜配合される。
【００４０】
本発明のワクチンは、全身に投与されてもよく、局所投与でもよい。全身投与の場合、筋肉内、皮下、皮内、静脈内、腹腔内等への投与があげられ、投与方法としては、注射または点滴などがあげられる。
【００４１】
本発明のワクチンの投与対象は、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類、鳥類等があげられる。
【００４２】
本発明のワクチンは、ワクチンの投与様式に適合した形態を有することが好ましく、例えば、注射可能な形態として、溶液、懸濁液または乳化液が挙げられる。あるいは、液体溶液、懸濁液または乳化液に供せられる形態として、凍結乾燥製剤等の固体形態が挙げられる。
【００４３】
本発明のワクチンを用いて、フラビウイルス感染症を予防またはその症状を軽減することができる。本発明は、有効免疫感作量の本発明のワクチンを対象に投与する工程を含むフラビウイルス感染症の予防または軽減方法を提供する。
【００４４】
ワクチンの投与方法としては、前記例示した通りである。投与量は、対象の年齢、性別、体重等を考慮して決められるが、抗原としてＶＬＰを用いた場合、通常５μｇ〜１００μｇを１回または２回以上投与することができる。本発明のワクチンは、１回接種で充分な感染防御効果を有することから１回接種が推奨される。複数回投与する場合、１〜２週間の間隔をあけて投与することが好ましい。抗原としてウイルス全粒子を用いた場合、ＶＬＰ換算で投与量を設定すればよい。前記ＶＬＰの重量は蛋白窒素定量法により蛋白定量した値である。
【実施例】
【００４５】
以下、試験例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの試験例により何ら限定されるものではない。
【００４６】
以下の試験例は以下のようにして行った。
マウスは、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー社、浜松、日本）の４週齢を使用した。
ＪＥＶ北京１株をウイルス中和抗体価アッセイに使用し、ＪａＴＨ−１６０株をマウスのチャレンジ実験に使用した。
ＪＥワクチンビケン（ＪＥワクチン）、および水酸化アルミアジュバント（Ｌｏｔ Ｎｏ.：ＭＡＨ０６０１）は、財団法人阪大微生物病研究会、観音寺研究所（ＢＩＫＥＮ、観音寺、日本）で調製されたものを使用した。
ＪＥ−ＶＬＰは、ＪＥＶ ｃＤＮＡ高発現Ｊ１２＃２６細胞株（特開２００４−６５１１８号公報）の培養上清から精製した。
【００４７】
γ−ＰＧＡ−ＮＰは、γ−ＰＧＡ（平均分子量Ｍｎ＝３８０，０００、明治製菓株式会社、東京、日本）を用いて既報に従ってγ−ＰＧＡ疎水性誘導体からなるナノ粒子を国立大学法人大阪大学にて調製した（Ａｋａｇｉ Ｔ．他，Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｂｉｏｓｃｉ，２００５；５（７）：ｐ５９８−６０２、Ｋａｎｅｋｏ Ｔ．他，Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅｒ，２００５；１７：ｐ２４８４−８６、およびＭａｔｓｕｓａｋｉ Ｍ．他，Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２００４；３３：ｐ３９８−９９を参照）。γ−ＰＧＡ−グラフト−Ｌ−Ｐｈｅからなるナノ粒子を沈殿および透析によって調製した。最初に、γ−ＰＧＡ−グラフト−Ｌ−Ｐｈｅ（１０ｍｇ）を１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、同量の生理食塩水を添加して半透明の溶液を得た。その後、溶液をセルロース膜チューブ（分子量５０，０００のカットオフ）で蒸留水に対して透析し、有機溶媒を除去した。透析した溶液を凍結乾燥した。以下の試験例において、５３％グラフト化されたγ−ＰＧＡ−グラフト−Ｌ−Ｐｈｅを使用した。
【００４８】
ワクチン接種に関して、マウスへの投与量は、抗原量として試験例４を除きＪＥワクチンおよびＪＥ−ＶＬＰについては各１μｇ、アジュバントとして水酸化アルミアジュバントおよびγ−ＰＧＡ−ＮＰについては各１００μｇであり、投与方法は腹腔内注射とした。
ウイルスチャレンジとして、免疫マウス群を、最初のワクチン接種の１５日後に、３×１０５ＰＦＵ（２０×ＬＤ５０）のＪＥＶのＪａＴＨ−１６０株の腹腔内注射で接種した。ＪＥＶチャレンジと同時に、既報に従って、マウスに１０μｌのＰＢＳを脳内接種して血液脳関門を破壊させた（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＡＫ．他，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００１；１９（３１）：ｐ４５５７−４５６５、およびＫｏｊｉｍａ Ａ．他，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００３；７７（１６）：ｐ８７４５−８７５５参照）。
【００４９】
血清サンプル中の中和抗体の試験は次のようにして行った。
１回接種群のマウスからの血清を最初の免疫から１５日後に採取し、既報に従って、ウイルス中和抗体の試験をした（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＡＫ．他，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００１；１９（３１）：ｐ４５５７−４５６５、およびＫｏｊｉｍａ Ａ他，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００３；７７（１６）：ｐ８７４５−８７５５参照）。中和抗体価は、コントロールウェルに対してウェルあたりの平均プラーク数を５０％減少させる希釈血清の逆数で表される。
【００５０】
フィッシャーの直接確率検定をＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社，カリー，ノースカロライナ州）を使用して行い、ウイルスチャレンジ試験における群間の差を評価した。他の試験でのデータを分析するために、パラメトリックなウェルチｔ検定を使用した。＜０．０５のｐ値を有意と見なした。
【００５１】
試験例１ ＪＥワクチンを１回あるいは２回接種後の致死性ＪＥＶによるチャレンジ試験と中和抗体価
（１）ＪＥワクチンの１回または２回接種による致死性ＪＥＶチャレンジ試験でのマウスの防御（図１）
（Ａ）ＪＥワクチンまたはコントロール群としてＰＢＳを、０日目および７日目にマウスの腹腔内に２回接種した。１５日目に、マウスをＪＥＶに感染させた。ウイルスチャレンジから２０日後までの生残率推移を調べた（図１Ａ）。
（Ｂ）ＪＥワクチンまたはＰＢＳを、０日目にマウスの腹腔内に１回接種した。１５日目に、マウスをＪＥＶに感染させた。感染後２０日目まで毎日、生残率推移を調べた（図１Ｂ）。
２回免疫群のマウスの全てがＪＥＶチャレンジ後生き延びたが（図１Ａ）、一方で１回接種群の５０％しか生き延びなかった（図１Ｂ）。
（２）ＪＥワクチンで１回または２回免疫したマウスの血清中の抗ＪＥＶ中和抗体価（図２）
マウスに、（１）で説明したようにして、１回もしくは２回、ＰＢＳ、またはＪＥワクチンを含むＰＢＳ溶液を腹腔内注射にて免疫を行った。最初の免疫から１５日後、マウス血清を回収し、抗ＪＥＶ中和抗体価を調べた。
結果は図２に示すように、ＪＥワクチンで１回免疫したマウスの血清における中和抗体価は、２回免疫したマウスの血清におけるそれよりも有意に低かった。
【００５２】
試験例２ アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥワクチンをマウスに１回接種した時のチャレンジ試験と中和抗体価（図３、４）
（Ａ）アジュバントを含む群としてＪＥワクチン＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ、コントロール群としてＪＥワクチン、ＰＢＳ、水酸化アルミアジュバント、γ−ＰＧＡ−ＮＰ（１００μｇ）をマウスの腹腔内に１回接種を行った。免疫から１５日後に、マウスをＪＥＶに感染させた。感染から２０日後までの生存率推移を調べた。図３のウイルスチャレンジ試験結果に示すように、ＪＥＶチャレンジから２０日後、ＪＥワクチン＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰの両群共にマウスの生存率は１００％であった。ＪＥワクチンと比べてＪＥワクチン＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰのアジュバント添加群の１回接種は著しく生存率を高めることが分かった。
（Ｂ）アジュバントを含む群としてＪＥワクチン＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ、コントロール群としてＪＥワクチン、ＰＢＳ、水酸化アルミアジュバント、γ−ＰＧＡ−ＮＰ（１００μｇ）をマウスの腹腔内に１回接種を行った。免疫から１５日後、マウス血清を採取し、抗ＪＥＶ中和抗体価を調べた。
図４に示すように、ＪＥワクチン、ＪＥワクチン＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ群の中和抗体価はそれぞれ1.765、3.155、3.163であった。ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ群の中和抗体価は、ＪＥワクチンに比べて有意に高かった。
【００５３】
試験例３ アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰをマウスに１回接種した時のチャレンジ試験と中和抗体価（図５、６）
（Ａ）アジュバントを含む群としてＪＥ−ＶＬＰ＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥ−ＶＬＰ＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ、ＪＥ−ＶＬＰ、コントロール群としてＰＢＳ、水酸化アルミアジュバント、γ−ＰＧＡ−ＮＰ（１００μｇ）をマウスの腹腔内に１回接種を行った。免疫から１５日後に、マウスをＪＥＶに感染させ、２０日後までの生存率推移を調べた。
図５に示すように、ＪＥ-ＶＬＰ群の生存率は４０％であり、アジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰ＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥ−ＶＬＰ＋γ−ＰＧＡ−ＮＰの両群の生存率は、９４％であった。
（Ｂ）アジュバントを含む群としてＪＥ−ＶＬＰ＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥ−ＶＬＰ＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ、ＪＥ−ＶＬＰ、コントロール群としてＰＢＳ、水酸化アルミアジュバント、γ−ＰＧＡ−ＮＰをマウスの腹腔内に１回接種を行った。免疫から１５日後、マウス血清を採取し、抗ＪＥＶ中和抗体価を調べた。
図６に示すように、１回接種後のＪＥ−ＶＬＰ＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥ−ＶＬＰ＋γ−ＰＧＡ−ＮＰの両群の中和抗体価は、アジュバントなしのＪＥワクチンの２回接種(図２)の中和抗体価と同程度であり、ＪＥワクチンおよびＪＥ-ＶＬＰにそれぞれ水酸化アルミアジュバントを加えることで、１回接種で充分な感染防御能を誘導することが確認された。
アジュバントありの１回接種後の両群の中和抗体価は、アジュバントなしの２回接種後中和抗体価レベルであり、生残率も９４％以上となった。ＪＥ−ＶＬＰにアルミアジュバントを加えることにより、１回接種で十分な感染防御免疫を誘導することが確認され、γ−ＰＧＡ−ＮＰをアジュバントにした場合でも同等の効果が得られた。
したがって、ＪＥ−ＶＬＰと、γ−ＰＧＡ−ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントとの組み合わせによりＪＥワクチンの１回接種法が構築できる可能性が示唆された。
【００５４】
試験例４ アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰをマウスに２回接種した時のチャレンジ試験と中和抗体価（図７-Ａ、図７-Ｂ、図８）
ＪＥ−ＶＬＰ（０．１μｇ、１μｇ）を、単独またはアルミアジュバントもしくはγ−ＰＧＡ−ＮＰのいずれかと懸濁した状態で、マウスにそれぞれ１週間間隔で２回腹腔内接種し、初回接種から１５日後に、３０×ＬＤ５０量のＪＥＶを腹腔内感染し、マウスをＪＥＶに感染させ、２０日後までの生存率推移を調べた。図７-Ａ、図７-Ｂは２回接種後の生残率（生存率）推移を示した。
ＪＥ−ＶＬＰ（０．１μｇ、０．３μｇ、１μｇ）を、単独またはアルミアジュバントもしくはγ−ＰＧＡ−ＮＰのいずれかと懸濁した状態で、初回接種から２週間後の血清中の中和抗体価を測定した。図８は、それぞれ２回接種後の中和抗体価を示した。
ＪＥ−ＶＬＰ＋水酸化アルミアジュバントとの組み合わせワクチンについて、ＪＥ−ＶＬＰの接種量が１μｇの場合の中和抗体価が２．３２であったのと比べて、０．３μｇでは１．６９、０．１μｇでは１．６９であった。
一方、ＪＥ−ＶＬＰ＋γ−ＰＧＡ−ＮＰとの組み合わせワクチンについては、ＪＥ−ＶＬＰの接種量が１μｇの中和抗体価２．３２と比べると、０．３μｇでは３．０５、０．１μｇでは２．９１であった。
【００５５】
また、１μｇのＪＥワクチンのみの場合と比較すると、０．１μｇのＪＥ−ＶＬＰ＋水酸化アルミアジュバントでは、それぞれの中和抗体価は３．６３、３．５６と抗原量が１／１０にもかかわらず同等レベルであった。０．１μｇのＪＥ−ＶＬＰ＋γ−ＰＧＡ−ＮＰの中和抗体価は２．９１とほぼ同レベルであった。
このことから、本発明の１回接種用ワクチンでは抗原量を減らしても、充分なワクチン効果が得られることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＪＥワクチンの１回または２回接種後の致死性ＪＥＶチャレンジ時のマウスの生残率を示す図である。マウス（ｎ＝１０）、○：ＪＥワクチンを１μｇ含むＰＢＳ溶液４００μｌ、●：ＰＢＳ溶液４００μｌ
【図２】ＪＥワクチンで１回または２回接種後のマウスの血清中の抗ＪＥＶ中和抗体価を示す図である。マウス（ｎ=５）、平均値、＊：ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｄ．：検出不可
【図３】アジュバントとして水酸化アルミアジュバントまたはγ−ＰＧＡ−ＮＰを加えたＪＥワクチンを１回接種後のマウスにおける致死性ＪＥＶチャレンジ時の生存率推移を示している。 ●：ＰＢＳ、ｎ＝３１、 ■：alum＝水酸化アルミアジュバント、ｎ＝３５、 ◆：ＰＧＡ-ＮＰｓ＝γ−ＰＧＡ−ＮＰ、ｎ＝３５、 ○：ＪＥ vaccine＝ＪＥワクチン、ｎ＝３１、 □：ＪＥ vaccine＋alum＝ＪＥワクチン＋水酸化アルミアジュバント、ｎ＝２０、 ◇：ＪＥ vaccine＋γ-ＰＧＡ-ＮＰｓ＝ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ、ｎ＝３３、＊：ｐ＜０．０５
【図４】アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥワクチンをマウスに１回接種した時の中和抗体価である。平均値、＊：ｐ＜０．０５．Ｎ．Ｄ．：検出不可
【図５】アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰをマウスに１回接種後のマウスにおける致死性ＪＥＶチャレンジ時の生存率推移を示している。
【図６】アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰをマウスに１回接種した時の中和抗体価を示す図である。
【図７−Ａ】アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰ（１μｇ）をマウスに２回接種した時のマウスにおける致死性ＪＥＶチャレンジ時の生存率推移を示している。
【図７−Ｂ】アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰ（０．１μｇ）をマウスに２回接種した時のマウスにおける致死性ＪＥＶチャレンジ時の生残率推移を示している。
【図８】アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰ（０．１μｇ、０．３μｇ、１μｇ）をマウスに２回接種した時の中和抗体価を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビウイルス感染症ワクチンおよびフラビウイルス感染症ワクチン用免疫助成剤（アジュバント）を含有する１回接種用のフラビウイルス感染症ワクチンに関する。詳しくは、アジュバントとして生分解性γ−ＰＧＡナノ粒子（γ−ＰＧＡ−ＮＰ）または水酸化アルミニウムゲルを用いて感染防御免疫能を増強し、１回接種することで複数回接種した場合と同程度にフラビウイルス感染症を予防するためのフラビウイルス感染症ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルスは、１本鎖のプラス鎖ＲＮＡをゲノム（約１１ｋｂ）とするＲＮＡウイルスである。このウイルスには、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、およびセントルイス脳炎ウイルスが含まれる。フラビウイルスは、脊椎動物に広く存在し、その多くは蚊やダニを介して伝播する。脊椎動物への感染の多くは不顕性であるが、まれに、脳炎などによって特徴付けられる中枢神経系の病気に代表される重篤な病気を引き起こすことがある。世界的には毎年非常に多くの臨床例および死亡例が報告されており、近年の日本においてはフラビウイルス感染症の患者は少なくなったものの、海外の感染地域からの日本上陸が強く懸念されており、感染の蔓延を予防する方策が強く求められている。
【０００３】
フラビウイルスの感染を予防するために、有効なワクチンの開発が急務である。
日本脳炎（以下、ＪＥともいう）を例に採ると、財団法人阪大微生物病研究会は、北京１株からホルマリン不活化マウス脳由来ＪＥワクチン（以下、ＪＥワクチン、ＪＥワクチンビケンともいう）を製造し、主に日本で配給している。当該研究会はまた、日本脳炎ウイルス（以下、ＪＥＶともいう）中山株からの、別のマウス脳由来ＪＥワクチン（ＪＥ−ＶＡＸ）も製造した。ＪＥ−ＶＡＸは商業的に配給されており、国際的に広く利用可能である（非特許文献１）。
国際的には、ＪＥ−ＶＡＸワクチンの推奨される投与スケジュールは、０、７、および３０日目のそれぞれに計３回の接種であり、最初のシリーズ後に、さらに追加免疫のワクチン接種をする必要があるが最適な時期は充分に解決されていない。
日本において、子供のＪＥワクチンの接種は法律で義務付けられている。最初の一連の免疫は、９０ヶ月齢までに３回のワクチン接種、ならびに９歳から１２歳までの間に単回の追加免疫接種が必要とされている。日本政府は、ＪＥＶに対する免疫性を維持するために、更に付加的な定期的追加免疫を推奨している。このように現行の日本脳炎ワクチンの問題点は、複数回の基礎免疫、さらに追加免疫を要することは不便かつ不快であり、ＪＥの突然の大流行やＪＥＶ感染のリスクが高い地域への急な旅行のような緊急の状況で短期間でＪＥ予防を殆ど与えないことである。それゆえ、ＪＥＶに対する有効な１回接種用ワクチンの開発が非常に必要とされている。
しかし、これらフラビウイルス感染症ワクチンにおいては有用なアジュバントは、未だ開発されていない。
【０００４】
ワクチンにおける使用のために数多くのアジュバントが評価されてきた。しかしながら、殆どが認容出来ない毒性レベルを有し、日本で一般に臨床使用される唯一のアジュバントはアルミニウムベースのミネラル塩（アルミニウムアジュバント；ａｌｕｍ）である。
γ−ＰＧＡは、伝統的日本食である納豆の天然成分であり、納豆菌の特定の株によって産生される細菌の被膜エキソポリマーである（非特許文献２〜５）。本発明者等は、生分解性（γ−ＰＧＡ）−グラフト−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−ＰＡＥ）コポリマー（γ−ＰＧＡナノ粒子［γ−ＰＧＡ−ＮＰ］）を作り出し、γ−ＰＧＡ−ＮＰは、天然起源、水溶性、生分解性、且つ安全であるため、医療用途にたいへん適しており、薬物送達、組織工学において、ならびに感熱性ポリマーとしての用途を提案している。
【非特許文献１】Ｋｕｒａｎｅ Ｉ．他，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０００；１８ Ｓｕｐｐｌ ２：ｐ３３−３５
【非特許文献２】Ａｋａｇｉ Ｔ．他，Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｂｉｏｓｃｉ，２００５；５（７）：ｐ５９８−６０２
【非特許文献３】Ａｋａｇｉ Ｔ．他，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２００５；１０８（２−３）：ｐ２２６−２３６
【非特許文献４】Ａｋａｇｉ Ｔ．他，Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ，２００６；１７（８）：ｐ８７５−９２
【非特許文献５】Ａｋａｇｉ Ｔ．他，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００７；２８（２３）：ｐ３４２７−３４３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、安全且つ効果的なフラビウイルス感染症ワクチン用アジュバントを含有する１回接種で感染防御可能なフラビウイルス感染症ワクチンの提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、日本脳炎ワクチンのように基礎免疫に際して複数回接種を要するフラビウイルスワクチンについて１回接種で数回接種と同程度の免疫防御能を得ることができる１回接種法の開発を目指している。また、ワクチン製造の安全性を向上するために日本脳炎ウイルスを不使用とする安全な次世代ワクチンの開発も必要である。そこで、既存の日本脳炎ワクチン、或いは日本脳炎ウイルスを使用せずに製造可能でワクチン効果を有する日本脳炎中空粒子（ＪＥ−ＶＬＰ）あるいはウエストナイル中空粒子を用いて、アジュバント併用による１回接種用ワクチン開発を開始した。アジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲルと納豆菌由来のγ−ＰＧＡをＬ−エチルアラニンエチルエステルで部分疎水修飾させ両親媒化することにより作製したγ−ＰＧＡ−ＮＰを用いた。フラビウイルスワクチンにアジュバントとして当該ナノ粒子を加えることにより、１回接種で充分な感染防御免疫を誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
【０００７】
［１］フラビウイルス感染症を予防するためのフラビウイルス抗原、およびアジュバントを含有するフラビウイルス感染症ワクチン。
［２］アジュバントがポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子である、上記［１］記載のワクチン。
［３］アジュバントが水酸化アルミニウムゲルである、上記［１］記載のワクチン。
［４］水酸化アルミニウムゲルが炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製されたものである、上記［３］記載のワクチン。
［５］１回接種することでフラビウイルス感染症を予防するためのワクチンである、上記［１］〜［４］いずれかに記載のワクチン。
［６］フラビウイルスが日本脳炎ウイルスおよび／またはウエストナイルウイルスである、上記［１］〜［５］いずれかに記載のワクチン。
［７］フラビウイルス抗原がフラビウイルス様中空粒子である、上記［１］〜［６］いずれかに記載のワクチン。
［８］フラビウイルス抗原がウイルス全粒子である、上記［１］〜［６］いずれかに記載のワクチン。
［９］ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである、上記［２］、［５］〜［８］いずれかに記載のワクチン。
［１０］ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである、上記［２］、［５］〜［９］いずれかに記載のワクチン。
［１１］ポリアミノ酸が両親媒化されている、上記［２］、［５］〜［１０］いずれかに記載のワクチン。
［１２］ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体である、上記［２］、［５］〜［１１］いずれかに記載のワクチン。
［１３］ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるフラビウイルス感染症ワクチン用アジュバント。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のアジュバントは、フラビウイルス感染症ワクチン用の効果的且つ安全なアジュバントである。γ−ＰＧＡ−ＮＰまたは水酸化アルミニウムゲルをアジュバントとするフラビウイルス抗原を含有する本発明のフラビウイルス感染症ワクチンは、従来のプレーンワクチンを複数回接種した場合と同程度の充分な感染防御免疫を１回接種することで誘導することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、フラビウイルス感染症を予防するためのフラビウイルス抗原、およびアジュバントを含有するフラビウイルス感染症ワクチンを提供する。
【００１０】
詳細には本発明は、フラビウイルス抗原、およびポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子を含有するフラビウイルス感染症ワクチンを提供する。該ワクチンは１回接種で充分な効果を有するため、その使用は１回接種が好ましい。
【００１１】
本発明はまた、フラビウイルス抗原、および水酸化アルミニウムゲルを含有するフラビウイルス感染症ワクチンを提供する。該ワクチンは１回接種で充分な効果を有するため、その使用は１回接種が好ましい。
【００１２】
本発明においてフラビウイルスとは、フラビウイルス科フラビウイルス属に属するウイルスであり、例えば、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、およびセントルイス脳炎ウイルスなどが挙げられる。特に好ましくは、日本脳炎ウイルスまたはウエストナイルウイルスである。フラビウイルスの亜型は、特に限定されず、これまで単離された亜型であっても将来単離される亜型であってもよい。
【００１３】
本発明のワクチンに含まれるフラビウイルス抗原とは、前記フラビウイルスを構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなく、Ｍタンパク質およびＥタンパク質をはじめとするウイルスサブユニットでもよく、ウイルス全粒子でもよい。あるいは、フラビウイルス抗原は、フラビウイルスを使用せずに製造可能でワクチン効果を有すると報告されているフラビウイルス様中空粒子（以下、ＶＬＰともいう）であってもよい。免疫原性の観点から、ＶＬＰまたは全ウイルス粒子が好ましい。全ウイルス粒子に関しては、ホルマリン等により不活化された全ウイルス粒子が安全性の観点からより好ましい。本発明のフラビウイルス感染症ワクチンに含まれるフラビウイルス抗原は、１種または２種以上を適宜選択して用いることができる。また、複数の亜型に由来する１種の抗原を用いてもよい。
【００１４】
上記フラビウイルス抗原が日本脳炎ウイルス抗原の場合、その製法は以下のようになる。
抗原がウイルス全粒子の場合、例えば、日本脳炎ワクチンビケンの製法と同様に、日本脳炎ウイルスに感染したマウスの脳乳剤を硫酸プロタミンで処理し、ウイルスを分離、精製し、これをホルマリンで不活化した後、超遠心法で精製しＴＣＭ−１９９で希釈するなどすればよい。あるいは、例えば国際公開ＷＯ００／２０５６５号に開示されたようにして、日本脳炎ウイルスを細胞株に感染させて培養する方法を用いてもよい。
抗原がＶＬＰの場合は、例えば特開２００４−６５１１８号公報に開示された方法に従って、日本脳炎ウイルスゲノムＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを発現ベクターに組み込んで動物細胞を形質転換し、形質転換体を培養してＶＬＰを得ることができる。
【００１５】
ウエストナイルウイルス抗原も、上記の日本脳炎ウイルス抗原に準じて製造することが可能である。即ち、抗原がウイルス全粒子の場合、例えば、ウエストナイルウイルスに感染したマウスの脳乳剤を硫酸プロタミンで処理し、ウイルスを分離、精製し、これをホルマリンで不活化した後、超遠心法で精製しＴＣＭ−１９９で希釈するなどすればよい。あるいは、国際公開ＷＯ００／２０５６５号に開示された方法に準じて、ウエストナイルウイルスを細胞株に感染させて培養する方法を用いても良い。
また、抗原がウエストナイルウイルスＶＬＰの場合は、ウエストナイルウイルスのアミノ酸配列（例、ＮＹ９９−ｆｌａｍｉｎｇｏ３８２−９９株：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１９６８３５）をもとにして、ウエストナイルウイルスのｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターを動物細胞に導入し、得られた形質転換細胞を培養することにより、その培地中にウエストナイルウイルスＶＬＰを分泌させることが可能である。ＮＹ９９−ｆｌａｍｉｎｇｏ３８２−９９株以外の変異ウエストナイルウイルス株としては、例えば、Ebel, G.D.ら, Am. J. Trop. Med. Hyg., 71(4): 493-500, 2004の「Table I」に記載のもの等が挙げられ、該表中に示される各Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．の配列を入手して、対応する領域を決定することにより、容易に変異ウエストナイルウイルス株のＶＬＰを得ることができる。
日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス以外のフラビウイルス抗原についても、上記の方法に準じて製造することが可能である。
【００１６】
本発明においてアジュバントとは、抗原とともに用いられると、抗原に対する免疫応答を非特異的に高め、抗原に対する細胞性免疫や抗体生産を増強したり、長時間留まらせたりという役割を果たして、具体的には、抗原に吸着する性質を持つ無機物（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバンなど）や抗原水溶液を包んで乳濁液にする性質を持つ油乳剤（例えば、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバントなど）などである。本発明に使用されるアジュバントは上記目的を達成し得る限り制限されないが、フラビウイルス抗原とともに用いることにより１回接種で充分な感染防御免疫誘導効果を与えることから、ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子および水酸化アルミニウムゲルが好ましい。
【００１７】
１つの実施態様において、本発明のワクチンは、上記フラビウイルス抗原以外に、ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子を含む。
【００１８】
前記「生分解性ナノ粒子」とは、ポリアミノ酸を主成分とし、生体内で酵素等の作用を受け、所定の時間経過後に粒子の崩壊およびポリアミノ酸骨格がアミノ酸のモノマーまたはオリゴマーに分解可能な粒子をいう。
【００１９】
本発明における生分解性ナノ粒子の「主成分」とは、ナノ粒子を構成する骨格をいう。
【００２０】
本発明における生分解性ナノ粒子の形状は特に限定されるものではないが、一般的には球状である。球状の粒子のサイズは通常１０ｎｍ〜１００μｍ程度であり、好ましくは１０ｎｍ〜５００ｎｍである。このようなサイズにすることによって、単位重量当りの粒子表面積増加に伴うフラビウイルス抗原の固定化量の増加、抗原提示細胞への抗原の取り込み促進、それに伴うＣＴＬの活性化、抗体産生の誘導などの効果が生じる。
【００２１】
前記粒子の形状は、顕微鏡にて観察し、確認することができる。前記粒子のサイズは、ナノ粒子の水分散液を動的光散乱により測定した平均粒子径をいう。なお、球状以外の形状のナノ粒子のサイズは、球状のナノ粒子に準じて求めることができる。
【００２２】
前記生分解性ナノ粒子の骨格となるポリアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸または人工アミノ酸の重合体であってもよい。安全性または毒性の面から、天然に存在するアミノ酸からなるポリアミノ酸が好ましいが、その由来は天然物であっても合成品であってもよい。天然に存在するアミノ酸としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンまたはアスパラギンが好ましい。また、アミノ酸はＬ−体であってもＤ−体であってもよい。ポリアミノ酸中にＬ−体とＤ−体が所定の割合で含まれていてもよい。
【００２３】
天然に存在するアミノ酸からなるポリアミノ酸としては、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）またはポリアスパラギンが好ましい。所期の目的を達成し、ナノ粒子に様々な特性を付与するためには、前記ポリアミノ酸の修飾体、それらの誘導体またはそれらの混合物も本発明の好ましいポリアミノ酸に含まれる。特に好ましいポリアミノ酸は、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体またはそれらの混合物である。
【００２４】
「修飾アミノ酸」、「アミノ酸誘導体」、ポリアミノ酸の「修飾体」および「誘導体」という用語は、当該分野において通常使用される意味を有するものとする。ポリアミノ酸の「修飾体」および「誘導体」の例としては、構成アミノ酸の一部を別のアミノ酸としたもの、構成アミノ酸の利用可能な官能基を用いて修飾したもの等があげられる。具体的には、ポリ（γ−グルタミン酸）のペプチド鎖中に１種またはそれ以上の他のアミノ酸、その修飾体もしくは誘導体を導入したもの、グラフト共重合体となっているもの、またはポリ（ε−リジン）の構成アミノ酸リジンの利用可能なα−位の一部をメチル化したもの等があげられる。
【００２５】
ポリアミノ酸の「混合物」とは、２種以上のアミノ酸を構成成分とするものであり、前記例示したポリアミノ酸、それらの修飾体およびそれらの誘導体を構成するアミノ酸から２種以上選択することが好ましい。
【００２６】
好ましい「修飾体」または「誘導体」の例として、ポリアミノ酸が両親媒化されるように、ポリアミノ酸を修飾または誘導したものがあげられる。例えば、親水性ポリアミノ酸の側鎖に疎水性アミノ酸を導入して、所望の親水性−疎水性のバランスとすることもできる。ポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体であるポリアミノ酸が好適な具体例としてあげられる。かかるポリアミノ酸は、分子内および分子間の疎水性基の会合によりナノ粒子化が容易である点からも好ましい。
【００２７】
ポリアミノ酸は、アミノ酸以外の構成成分、例えば、糖質、脂質等を含んでいてもよい。好ましいポリアミノ酸は、構成成分の５０重量％以上がアミノ酸である。
【００２８】
ポリアミノ酸においてすべての構成アミノ酸間の結合は、同一種類のものであってもよく、異なる種類のものであってもよい。例えば、すべての構成アミノ酸がペプチド結合によって結合したものであってもよく、部分的または全体的にペプチド結合以外の結合またはリンカーによりアミノ酸が結合したものであってもよい。ペプチド結合以外の結合としては、エステル結合、エーテル結合等があげられ、リンカーとしては、グルタルアルデヒド、ジイソシアネート等があげられるが、これらに限定されない。さらに、ポリアミノ酸の官能基間において架橋されていてもよい。架橋することにより、ポリアミノ酸の物性を変化させ、所望のアジュバント特性を得ることも可能である。架橋剤としては、カルボジイミド、ジグリシジルエステル等があげられるが、これらに限定されない。
【００２９】
ポリアミノ酸の分子量は、特に限定されるものではないが、所望の粘度や溶解度に応じて変更されうる。分子量は、通常１０００〜５００万の範囲である。好ましくは５０００〜２００万の範囲である。前記分子量は、水溶液もしくは有機溶媒中でゲルろ過クロマトグラフィーにより測定された値である。
【００３０】
ポリアミノ酸の製造は、化学合成法、発酵法などの公知の方法を適宜選択して行うことができる。ポリアミノ酸のナノ粒子化は、公知の方法により行うことができる。例えば、液中乾燥法、噴霧乾燥法、球形晶析法、溶媒置換法（沈殿・透析法）、直接超音波分散法を用いることができる。例えば、ポリ（γ−グルタミン酸）またはポリ（ε−リジン）からなる生分解性ナノ粒子は、溶媒置換法により製造することができる。このような方法を適宜選択または組み合わせて、生分解性ナノ粒子の材料、構成成分、分子量、サイズ、電荷その他のパラメータを目的に応じたものとすることができる。
【００３１】
別の実施態様において、本発明のワクチンは、上記フラビウイルス抗原以外に、水酸化アルミニウムゲルを含む。
【００３２】
本発明のワクチンに用いられる水酸化アルミニウムゲルは、ワクチンに添加して抗原の免疫原性を高める作用を有する限り、いかなる水酸化アルミニウムゲルであってもよい。例えば、水酸化アルミニウムゲルは、自体公知の方法により製造することが可能であり、水酸化アルミニウムゲル「Aluminum Hydroxide Gel (A-8222)」（SIGMA製）、「Alhydrogel (2%）) （Brenntag Biosector製）などの市販品を使用してもよい。
【００３３】
前記水酸化アルミニウムゲルは、炭酸ナトリウム及び硫酸アルミニウムカリウムを原料として調製されたものであることが好ましい。原料となる炭酸ナトリウム及び硫酸アルミニウムカリウムは、水酸化アルミニウムゲルを調製するために通常用いられる試薬を限定なく使用することが出来る。硫酸アルミニウムカリウムは、カリミョウバンとも称される硫酸アルミニウムカリウム１２水和物ＡｌＫ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏが好適に用いられる。
【００３４】
炭酸ナトリウム及び硫酸アルミニウムカリウムを原料として、本発明で使用される水酸化アルミニウムゲルは例えば以下のようにして調製される。炭酸ナトリウム（１４３．１ｇ）を９Ｌの生理食塩水に溶解し、濾過し、炭酸ナトリウム溶液を調製する。硫酸アルミニウムカリウム１２水和物（カリミョウバン）（３１６．０ｇ）を９Ｌの生理食塩水に溶解し、濾過し、硫酸アルミニウムカリウム溶液を調製する。得られた炭酸ナトリウム溶液及び硫酸アルミニウムカリウム溶液を混合し、撹拌すれば水酸化アルミニウムゲルが得られ、これを洗浄することにより本発明のアジュバント（水酸化アルミアジュバント）として使用することができる。
【００３５】
本発明のフラビウイルス感染症ワクチンは、前記フラビウイルス抗原が前記生分解性ナノ粒子内に包含されていてもよく、前記フラビウイルス抗原が前記生分解性ナノ粒子表面に固定されていてもよい。
【００３６】
本発明のワクチンに含まれるフラビウイルス抗原と生分解性ナノ粒子との比は、抗原の種類やナノ粒子の特性により一概には規定できないが、例えば、フラビウイルス抗原としてＶＬＰ、および生分解性ナノ粒子としてポリ（γ−グルタミン酸）を用いた場合、重量比で１：１〜１：１０００が例示され、好ましくは１：１０〜１：２００である。
【００３７】
また、本発明のフラビウイルス感染症ワクチンは、前記フラビウイルス抗原と前記アジュバントとしての水酸化アルミニウムゲルとを混合することにより製造することができる。
【００３８】
本発明のワクチンに含まれるフラビウイルス抗原と水酸化アルミニウムゲルの比は、抗原の種類などにより一概には規定できないが、例えば、フラビウイルス抗原としてＶＬＰを用いた場合、重量比で１：１０〜１：５００が例示され、好ましくは１：３０〜１：２００である。
【００３９】
さらに、本発明のワクチンは、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。前記医薬として許容されうる担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体を限定なく使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液およびそれらの組合せがあげられる。また、これに乳化剤、保存剤（例、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤および不活化剤（例、ホルマリン）等が適宜配合される。
【００４０】
本発明のワクチンは、全身に投与されてもよく、局所投与でもよい。全身投与の場合、筋肉内、皮下、皮内、静脈内、腹腔内等への投与があげられ、投与方法としては、注射または点滴などがあげられる。
【００４１】
本発明のワクチンの投与対象は、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類、鳥類等があげられる。
【００４２】
本発明のワクチンは、ワクチンの投与様式に適合した形態を有することが好ましく、例えば、注射可能な形態として、溶液、懸濁液または乳化液が挙げられる。あるいは、液体溶液、懸濁液または乳化液に供せられる形態として、凍結乾燥製剤等の固体形態が挙げられる。
【００４３】
本発明のワクチンを用いて、フラビウイルス感染症を予防またはその症状を軽減することができる。本発明は、有効免疫感作量の本発明のワクチンを対象に投与する工程を含むフラビウイルス感染症の予防または軽減方法を提供する。
【００４４】
ワクチンの投与方法としては、前記例示した通りである。投与量は、対象の年齢、性別、体重等を考慮して決められるが、抗原としてＶＬＰを用いた場合、通常５μｇ〜１００μｇを１回または２回以上投与することができる。本発明のワクチンは、１回接種で充分な感染防御効果を有することから１回接種が推奨される。複数回投与する場合、１〜２週間の間隔をあけて投与することが好ましい。抗原としてウイルス全粒子を用いた場合、ＶＬＰ換算で投与量を設定すればよい。前記ＶＬＰの重量は蛋白窒素定量法により蛋白定量した値である。
【実施例】
【００４５】
以下、試験例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの試験例により何ら限定されるものではない。
【００４６】
以下の試験例は以下のようにして行った。
マウスは、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー社、浜松、日本）の４週齢を使用した。
ＪＥＶ北京１株をウイルス中和抗体価アッセイに使用し、ＪａＴＨ−１６０株をマウスのチャレンジ実験に使用した。
ＪＥワクチンビケン（ＪＥワクチン）、および水酸化アルミアジュバント（Ｌｏｔ Ｎｏ.：ＭＡＨ０６０１）は、財団法人阪大微生物病研究会、観音寺研究所（ＢＩＫＥＮ、観音寺、日本）で調製されたものを使用した。
ＪＥ−ＶＬＰは、ＪＥＶ ｃＤＮＡ高発現Ｊ１２＃２６細胞株（特開２００４−６５１１８号公報）の培養上清から精製した。
【００４７】
γ−ＰＧＡ−ＮＰは、γ−ＰＧＡ（平均分子量Ｍｎ＝３８０，０００、明治製菓株式会社、東京、日本）を用いて既報に従ってγ−ＰＧＡ疎水性誘導体からなるナノ粒子を国立大学法人大阪大学にて調製した（Ａｋａｇｉ Ｔ．他，Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｂｉｏｓｃｉ，２００５；５（７）：ｐ５９８−６０２、Ｋａｎｅｋｏ Ｔ．他，Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅｒ，２００５；１７：ｐ２４８４−８６、およびＭａｔｓｕｓａｋｉ Ｍ．他，Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２００４；３３：ｐ３９８−９９を参照）。γ−ＰＧＡ−グラフト−Ｌ−Ｐｈｅからなるナノ粒子を沈殿および透析によって調製した。最初に、γ−ＰＧＡ−グラフト−Ｌ−Ｐｈｅ（１０ｍｇ）を１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、同量の生理食塩水を添加して半透明の溶液を得た。その後、溶液をセルロース膜チューブ（分子量５０，０００のカットオフ）で蒸留水に対して透析し、有機溶媒を除去した。透析した溶液を凍結乾燥した。以下の試験例において、５３％グラフト化されたγ−ＰＧＡ−グラフト−Ｌ−Ｐｈｅを使用した。
【００４８】
ワクチン接種に関して、マウスへの投与量は、抗原量として試験例４を除きＪＥワクチンおよびＪＥ−ＶＬＰについては各１μｇ、アジュバントとして水酸化アルミアジュバントおよびγ−ＰＧＡ−ＮＰについては各１００μｇであり、投与方法は腹腔内注射とした。
ウイルスチャレンジとして、免疫マウス群を、最初のワクチン接種の１５日後に、３×１０５ＰＦＵ（２０×ＬＤ５０）のＪＥＶのＪａＴＨ−１６０株の腹腔内注射で接種した。ＪＥＶチャレンジと同時に、既報に従って、マウスに１０μｌのＰＢＳを脳内接種して血液脳関門を破壊させた（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＡＫ．他，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００１；１９（３１）：ｐ４５５７−４５６５、およびＫｏｊｉｍａ Ａ．他，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００３；７７（１６）：ｐ８７４５−８７５５参照）。
【００４９】
血清サンプル中の中和抗体の試験は次のようにして行った。
１回接種群のマウスからの血清を最初の免疫から１５日後に採取し、既報に従って、ウイルス中和抗体の試験をした（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＡＫ．他，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００１；１９（３１）：ｐ４５５７−４５６５、およびＫｏｊｉｍａ Ａ他，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００３；７７（１６）：ｐ８７４５−８７５５参照）。中和抗体価は、コントロールウェルに対してウェルあたりの平均プラーク数を５０％減少させる希釈血清の逆数で表される。
【００５０】
フィッシャーの直接確率検定をＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社，カリー，ノースカロライナ州）を使用して行い、ウイルスチャレンジ試験における群間の差を評価した。他の試験でのデータを分析するために、パラメトリックなウェルチｔ検定を使用した。＜０．０５のｐ値を有意と見なした。
【００５１】
試験例１ ＪＥワクチンを１回あるいは２回接種後の致死性ＪＥＶによるチャレンジ試験と中和抗体価
（１）ＪＥワクチンの１回または２回接種による致死性ＪＥＶチャレンジ試験でのマウスの防御（図１）
（Ａ）ＪＥワクチンまたはコントロール群としてＰＢＳを、０日目および７日目にマウスの腹腔内に２回接種した。１５日目に、マウスをＪＥＶに感染させた。ウイルスチャレンジから２０日後までの生残率推移を調べた（図１Ａ）。
（Ｂ）ＪＥワクチンまたはＰＢＳを、０日目にマウスの腹腔内に１回接種した。１５日目に、マウスをＪＥＶに感染させた。感染後２０日目まで毎日、生残率推移を調べた（図１Ｂ）。
２回免疫群のマウスの全てがＪＥＶチャレンジ後生き延びたが（図１Ａ）、一方で１回接種群の５０％しか生き延びなかった（図１Ｂ）。
（２）ＪＥワクチンで１回または２回免疫したマウスの血清中の抗ＪＥＶ中和抗体価（図２）
マウスに、（１）で説明したようにして、１回もしくは２回、ＰＢＳ、またはＪＥワクチンを含むＰＢＳ溶液を腹腔内注射にて免疫を行った。最初の免疫から１５日後、マウス血清を回収し、抗ＪＥＶ中和抗体価を調べた。
結果は図２に示すように、ＪＥワクチンで１回免疫したマウスの血清における中和抗体価は、２回免疫したマウスの血清におけるそれよりも有意に低かった。
【００５２】
試験例２ アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥワクチンをマウスに１回接種した時のチャレンジ試験と中和抗体価（図３、４）
（Ａ）アジュバントを含む群としてＪＥワクチン＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ、コントロール群としてＪＥワクチン、ＰＢＳ、水酸化アルミアジュバント、γ−ＰＧＡ−ＮＰ（１００μｇ）をマウスの腹腔内に１回接種を行った。免疫から１５日後に、マウスをＪＥＶに感染させた。感染から２０日後までの生存率推移を調べた。図３のウイルスチャレンジ試験結果に示すように、ＪＥＶチャレンジから２０日後、ＪＥワクチン＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰの両群共にマウスの生存率は１００％であった。ＪＥワクチンと比べてＪＥワクチン＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰのアジュバント添加群の１回接種は著しく生存率を高めることが分かった。
（Ｂ）アジュバントを含む群としてＪＥワクチン＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ、コントロール群としてＪＥワクチン、ＰＢＳ、水酸化アルミアジュバント、γ−ＰＧＡ−ＮＰ（１００μｇ）をマウスの腹腔内に１回接種を行った。免疫から１５日後、マウス血清を採取し、抗ＪＥＶ中和抗体価を調べた。
図４に示すように、ＪＥワクチン、ＪＥワクチン＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ群の中和抗体価はそれぞれ1.765、3.155、3.163であった。ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ群の中和抗体価は、ＪＥワクチンに比べて有意に高かった。
【００５３】
試験例３ アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰをマウスに１回接種した時のチャレンジ試験と中和抗体価（図５、６）
（Ａ）アジュバントを含む群としてＪＥ−ＶＬＰ＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥ−ＶＬＰ＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ、ＪＥ−ＶＬＰ、コントロール群としてＰＢＳ、水酸化アルミアジュバント、γ−ＰＧＡ−ＮＰ（１００μｇ）をマウスの腹腔内に１回接種を行った。免疫から１５日後に、マウスをＪＥＶに感染させ、２０日後までの生存率推移を調べた。
図５に示すように、ＪＥ-ＶＬＰ群の生存率は４０％であり、アジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰ＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥ−ＶＬＰ＋γ−ＰＧＡ−ＮＰの両群の生存率は、９４％であった。
（Ｂ）アジュバントを含む群としてＪＥ−ＶＬＰ＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥ−ＶＬＰ＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ、ＪＥ−ＶＬＰ、コントロール群としてＰＢＳ、水酸化アルミアジュバント、γ−ＰＧＡ−ＮＰをマウスの腹腔内に１回接種を行った。免疫から１５日後、マウス血清を採取し、抗ＪＥＶ中和抗体価を調べた。
図６に示すように、１回接種後のＪＥ−ＶＬＰ＋水酸化アルミアジュバント、ＪＥ−ＶＬＰ＋γ−ＰＧＡ−ＮＰの両群の中和抗体価は、アジュバントなしのＪＥワクチンの２回接種(図２)の中和抗体価と同程度であり、ＪＥワクチンおよびＪＥ-ＶＬＰにそれぞれ水酸化アルミアジュバントを加えることで、１回接種で充分な感染防御能を誘導することが確認された。
アジュバントありの１回接種後の両群の中和抗体価は、アジュバントなしの２回接種後中和抗体価レベルであり、生残率も９４％以上となった。ＪＥ−ＶＬＰにアルミアジュバントを加えることにより、１回接種で十分な感染防御免疫を誘導することが確認され、γ−ＰＧＡ−ＮＰをアジュバントにした場合でも同等の効果が得られた。
したがって、ＪＥ−ＶＬＰと、γ−ＰＧＡ−ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントとの組み合わせによりＪＥワクチンの１回接種法が構築できる可能性が示唆された。
【００５４】
試験例４ アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰをマウスに２回接種した時のチャレンジ試験と中和抗体価（図７-Ａ、図７-Ｂ、図８）
ＪＥ−ＶＬＰ（０．１μｇ、１μｇ）を、単独またはアルミアジュバントもしくはγ−ＰＧＡ−ＮＰのいずれかと懸濁した状態で、マウスにそれぞれ１週間間隔で２回腹腔内接種し、初回接種から１５日後に、３０×ＬＤ５０量のＪＥＶを腹腔内感染し、マウスをＪＥＶに感染させ、２０日後までの生存率推移を調べた。図７-Ａ、図７-Ｂは２回接種後の生残率（生存率）推移を示した。
ＪＥ−ＶＬＰ（０．１μｇ、０．３μｇ、１μｇ）を、単独またはアルミアジュバントもしくはγ−ＰＧＡ−ＮＰのいずれかと懸濁した状態で、初回接種から２週間後の血清中の中和抗体価を測定した。図８は、それぞれ２回接種後の中和抗体価を示した。
ＪＥ−ＶＬＰ＋水酸化アルミアジュバントとの組み合わせワクチンについて、ＪＥ−ＶＬＰの接種量が１μｇの場合の中和抗体価が２．３２であったのと比べて、０．３μｇでは１．６９、０．１μｇでは１．６９であった。
一方、ＪＥ−ＶＬＰ＋γ−ＰＧＡ−ＮＰとの組み合わせワクチンについては、ＪＥ−ＶＬＰの接種量が１μｇの中和抗体価２．３２と比べると、０．３μｇでは３．０５、０．１μｇでは２．９１であった。
【００５５】
また、１μｇのＪＥワクチンのみの場合と比較すると、０．１μｇのＪＥ−ＶＬＰ＋水酸化アルミアジュバントでは、それぞれの中和抗体価は３．６３、３．５６と抗原量が１／１０にもかかわらず同等レベルであった。０．１μｇのＪＥ−ＶＬＰ＋γ−ＰＧＡ−ＮＰの中和抗体価は２．９１とほぼ同レベルであった。
このことから、本発明の１回接種用ワクチンでは抗原量を減らしても、充分なワクチン効果が得られることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＪＥワクチンの１回または２回接種後の致死性ＪＥＶチャレンジ時のマウスの生残率を示す図である。マウス（ｎ＝１０）、○：ＪＥワクチンを１μｇ含むＰＢＳ溶液４００μｌ、●：ＰＢＳ溶液４００μｌ
【図２】ＪＥワクチンで１回または２回接種後のマウスの血清中の抗ＪＥＶ中和抗体価を示す図である。マウス（ｎ=５）、平均値、＊：ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｄ．：検出不可
【図３】アジュバントとして水酸化アルミアジュバントまたはγ−ＰＧＡ−ＮＰを加えたＪＥワクチンを１回接種後のマウスにおける致死性ＪＥＶチャレンジ時の生存率推移を示している。 ●：ＰＢＳ、ｎ＝３１、 ■：alum＝水酸化アルミアジュバント、ｎ＝３５、 ◆：ＰＧＡ-ＮＰｓ＝γ−ＰＧＡ−ＮＰ、ｎ＝３５、 ○：ＪＥ vaccine＝ＪＥワクチン、ｎ＝３１、 □：ＪＥ vaccine＋alum＝ＪＥワクチン＋水酸化アルミアジュバント、ｎ＝２０、 ◇：ＪＥ vaccine＋γ-ＰＧＡ-ＮＰｓ＝ＪＥワクチン＋γ−ＰＧＡ−ＮＰ、ｎ＝３３、＊：ｐ＜０．０５
【図４】アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥワクチンをマウスに１回接種した時の中和抗体価である。平均値、＊：ｐ＜０．０５．Ｎ．Ｄ．：検出不可
【図５】アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰをマウスに１回接種後のマウスにおける致死性ＪＥＶチャレンジ時の生存率推移を示している。
【図６】アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰをマウスに１回接種した時の中和抗体価を示す図である。
【図７−Ａ】アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰ（１μｇ）をマウスに２回接種した時のマウスにおける致死性ＪＥＶチャレンジ時の生存率推移を示している。
【図７−Ｂ】アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰ（０．１μｇ）をマウスに２回接種した時のマウスにおける致死性ＪＥＶチャレンジ時の生残率推移を示している。
【図８】アジュバントとしてγ-ＰＧＡ-ＮＰまたは水酸化アルミアジュバントを添加したＪＥ−ＶＬＰ（０．１μｇ、０．３μｇ、１μｇ）をマウスに２回接種した時の中和抗体価を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラビウイルス感染症を予防するためのフラビウイルス抗原、およびアジュバントを含有するフラビウイルス感染症ワクチン。
【請求項２】
アジュバントがポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子である、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
アジュバントが水酸化アルミニウムゲルである、請求項１記載のワクチン。
【請求項４】
水酸化アルミニウムゲルが炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製されたものである、請求項３記載のワクチン。
【請求項５】
１回接種することでフラビウイルス感染症を予防するためのワクチンである、請求項１〜４いずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
フラビウイルスが日本脳炎ウイルスおよび／またはウエストナイルウイルスである、請求項１〜５いずれかに記載のワクチン。
【請求項７】
フラビウイルス抗原がフラビウイルス様中空粒子である、請求項１〜６いずれかに記載のワクチン。
【請求項８】
フラビウイルス抗原がウイルス全粒子である、請求項１〜６いずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである、請求項２、５〜８いずれかに記載のワクチン。
【請求項１０】
ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである、請求項２、５〜９いずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】
ポリアミノ酸が両親媒化されている、請求項２、５〜１０いずれかに記載のワクチン。
【請求項１２】
ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体である、請求項２、５〜１１いずれかに記載のワクチン。
【請求項１３】
ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるフラビウイルス感染症ワクチン用アジュバント。
【請求項１】
フラビウイルス感染症を予防するためのフラビウイルス抗原、およびアジュバントを含有するフラビウイルス感染症ワクチン。
【請求項２】
アジュバントがポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子である、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
アジュバントが水酸化アルミニウムゲルである、請求項１記載のワクチン。
【請求項４】
水酸化アルミニウムゲルが炭酸ナトリウムと硫酸アルミニウムカリウムから調製されたものである、請求項３記載のワクチン。
【請求項５】
１回接種することでフラビウイルス感染症を予防するためのワクチンである、請求項１〜４いずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
フラビウイルスが日本脳炎ウイルスおよび／またはウエストナイルウイルスである、請求項１〜５いずれかに記載のワクチン。
【請求項７】
フラビウイルス抗原がフラビウイルス様中空粒子である、請求項１〜６いずれかに記載のワクチン。
【請求項８】
フラビウイルス抗原がウイルス全粒子である、請求項１〜６いずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである、請求項２、５〜８いずれかに記載のワクチン。
【請求項１０】
ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである、請求項２、５〜９いずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】
ポリアミノ酸が両親媒化されている、請求項２、５〜１０いずれかに記載のワクチン。
【請求項１２】
ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体である、請求項２、５〜１１いずれかに記載のワクチン。
【請求項１３】
ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるフラビウイルス感染症ワクチン用アジュバント。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−Ａ】
【図７−Ｂ】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−Ａ】
【図７−Ｂ】
【図８】
【公開番号】特開２００９−１４９５８３（Ｐ２００９−１４９５８３Ａ）
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３３０１５１（Ｐ２００７−３３０１５１）
【出願日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年１０月２３日日本ウイルス学会主催の第５５回日本ウイルス学会学術集会（平成１９年１０月１日第５５回日本ウイルス学会学術集会 プログラム・抄録集において要旨を掲載）及び平成１９年１２月９日日本ワクチン学会主催の第１１回日本ワクチン学会学術集会（平成１９年１１月１１日第１１回日本ワクチン学会学術集会 プログラム・抄録集において要旨を掲載）において、文書をもって発表
【出願人】（５０５３１４０２２）独立行政法人医薬基盤研究所 (17)
【出願人】（５９１２２２２４５）国立感染症研究所長 (48)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（０００１７３６９２）財団法人阪大微生物病研究会 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年１０月２３日日本ウイルス学会主催の第５５回日本ウイルス学会学術集会（平成１９年１０月１日第５５回日本ウイルス学会学術集会 プログラム・抄録集において要旨を掲載）及び平成１９年１２月９日日本ワクチン学会主催の第１１回日本ワクチン学会学術集会（平成１９年１１月１１日第１１回日本ワクチン学会学術集会 プログラム・抄録集において要旨を掲載）において、文書をもって発表
【出願人】（５０５３１４０２２）独立行政法人医薬基盤研究所 (17)
【出願人】（５９１２２２２４５）国立感染症研究所長 (48)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（０００１７３６９２）財団法人阪大微生物病研究会 (23)
【Ｆターム（参考）】
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