フルクタン生合成の操作および植物バイオマスの増強
本発明は、植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物であって、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む遺伝的構築物に関する。本発明はまた、植物におけるフルクタン生合成の改変に関し、特に、光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作する方法に関する。本発明はまた、植物バイオマスの増加に関し、特に、植物におけるシュートおよび／または根の生長を含むバイオマス収量および／または収量安定性を増強する方法に関する。本発明はまた、生化学的経路の生産性を増強する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物におけるフルクタン生合成の改変に関し、特に、光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作する方法ならびに関連する核酸および構築物に関する。
【０００２】
本発明はまた、植物バイオマスの増加に関し、特に、植物におけるシュートおよび／または根の生長を含むバイオマス収量および／または収量安定性を増強する方法ならびに関連する核酸および構築物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
フルクタンは水溶性炭水化物の一種であり、その主要機能は、植物生長のために容易に利用できるエネルギー貯蔵を提供することである。フルクタンは、寒冷および乾燥耐性、分げつ生存率の上昇、持続性の増強、切断または被食後の良好な再生長、ストレスからの回復の改善、早春における生長ならびに栄養価の上昇等、草本における様々な有利な特徴に関連する。
【０００４】
草本および穀類におけるフルクタン合成および代謝は複雑である。フルクタンは、スクロースと結合した直鎖または分岐フルクトース鎖からなる。植物フルクタンの鎖長は、３から最大数百個のフルクトースユニットに及ぶ。異なる種類のフルクタンは、存在する結合の種類に基づいて識別することができる。ペレニアルライグラス（ｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｒｙｅｇｒａｓｓ）において、３種類のフルクタンが同定された。すなわちイヌリン、イヌリンネオシリーズおよびレバンネオシリーズであり、このフルクタンプロファイルには４種類のフルクトシルトランスフェラーゼ（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒｓｅ）（ＦＴ）酵素が関与する。酵素１−ＳＳＴ（スクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ）はフルクタン生合成における最初のステップを触媒し、一方、残りの酵素は成長中のフルクトース鎖を伸長させる（１−ＦＦＴ：フルクタン：フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ、６Ｇ−ＦＦＴ：６−グルコースフルクトシルトランスフェラーゼおよび６−ＳＦＴ：スクロース：フルクトース６−フルクトシルトランスフェラーゼ）。酵素１−ＦＥＨまたは６−ＦＥＨ（フルクトエキソヒドロラーゼ（ｆｒｕｃｔｏｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））は、フルクトース分子を遊離させることによりフルクタン鎖長を短縮する。
【０００５】
細菌は、高分子量フルクタンポリマーを合成するために１−ＳＳＴおよび１−ＦＦＴ活性の両方を含む単一のＦＴ酵素のみを利用する。大部分の細菌フルクトシルトランスフェラーゼは、フルクトース分子のβ−２，６結合によって特徴付けられるレバン型フルクタンを産生するが（レバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ））、一部の細菌からはイヌリン型フルクタン（β−２，１結合）を産生するイヌロスクラーゼ（ｉｎｕｌｏｓｕｃｒａｓｅ）が単離されている。
【０００６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＳａｃＢ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＳａｃＢ遺伝子およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来のＦＴＦ遺伝子を含む、少なくとも３種類の細菌レバンスクラーゼがトランスジェニック植物において発現した。これら細菌レバンスクラーゼの植物における発現は、ＤＰ数千の非常に高分子量のフルクタンの合成をもたらす（総説として非特許文献１を参照）。
【０００７】
フルクタンは、１５％の植物種における主要な非構造炭水化物を表し、飼料の質に重要な役割を果たす。高フルクタン食を摂取する反芻家畜は、動物能力の改善を示す。
【０００８】
草本において、ＦＴ遺伝子発現の遺伝子操作により、フルクタンのレベルおよび組成は茎および葉鞘で増加した。
【０００９】
しかし、経路内酵素の活性を操作することによる生化学的経路の操作は、その道筋において様々な酵素およびそれらの基質が相互作用し得るため、困難なものとなるであろう。
【００１０】
このため、特に植物における生化学的経路を操作するための改良法があることが望ましい。例えば、Ｌｏｌｉｕｍ属、Ｆｅｓｔｕｃａ属およびＢｒａｃｈｉａｒｉａ属等の飼料草の種；サトウキビその他の草本；ならびにソルガムおよびコムギやトウモロコシ等、他の穀類を含む植物におけるフルクタン生合成を操作する方法があり、これにより例えば、
・牧草地の生産性の改善、動物の生産性の改善および／または環境汚染の抑制をもたらす、牧草品質および／または収量が改善された飼料草、
・バイオエタノール生産用等のバイオマス収量が増強されたスイッチグラス、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ属、ソルガム（穀物、飼料およびエネルギー用ソルガム）、サトウキビおよびエネルギー用サトウキビ等、バイオエネルギー用草本および作物、
・穀物および／またはバイオマス収量が増加したコムギ、イネ、トウモロコシ、オオムギ等、穀類
の生産を促進することが望ましい。
【００１１】
フルクタン生合成経路に関与する数種の酵素をコードする核酸配列が特定の植物種で単離された。例えば、本出願人らの国際出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５号明細書は、Ｌｏｌｉｕｍ属およびＦｅｓｔｕｃａ属由来のフルクトシルトランスフェラーゼホモログについて記載している。しかし、依然として、植物におけるフルクタン生合成の改変に有用な、また植物体（ｐｌａｎｔ）の様々な部分におけるフルクタン蓄積を遺伝子操作するための材料が必要である。
【００１２】
国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２００９／００１２１１号明細書は、植物におけるフルクタン生合成の改変に有用な構築物について記載する。しかし、それら構築物は、好ましくは２以上のフルクタン生合成酵素の翻訳融合体をコードする融合遺伝子を含み、該遺伝子は、好ましくは植物フルクタン生合成遺伝子に相当する融合体を作り出す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃａｉｒｎｓ ＡＪ． Ｆｒｕｃｔａｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ． Ｊ Ｅｘｐｔ Ｂｉｏｌ（２００３）５４：５４９〜６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、先行技術に関連する問題または欠点の１または複数を克服、または少なくとも軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本出願人らは、細菌ＦＴ酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む構築物を用いて、光合成細胞におけるフルクタン生合成経路を空間的にリプログラミングすることにより、植物、例えば飼料草を栄養的に増強することおよび／または植物バイオマスを増加させることが可能であることを見出した。このプロセスを用いることによって、家畜によって先ず食べられる植物器官であり、通常フルクタンを蓄積できない葉身におけるフルクタン蓄積を駆動することが可能となる。このため、フルクタン、特に高い重合度を示すフルクタン（「高ＤＰフルクタン」）の蓄積は、草食動物がより利用しやすい栄養を提供する。フルクタンは茎および葉鞘に蓄積するが、葉フルクタンはＣＯ２同化が生長より優勢な期間においてのみ生成される。スクロースが合成される光合成細胞でフルクタン遺伝子を発現させることによって飼料草を栄養的に増強し、これによりフルクタン蓄積を葉身で優先的に駆動し、これを摂食する家畜にさらなるエネルギーを提供することができる。
【００１６】
飼料草におけるフルクタンは、反芻動物に食べさせる食餌におけるすぐに利用できるエネルギーに大いに貢献する。反芻胃における発酵過程は、大量のすぐに利用できるエネルギーを必要とする。反芻胃におけるすぐに利用できるエネルギーの改善は、反芻胃の消化効率を上昇させることができる。反芻胃消化における効率の上昇は、反芻動物に与えた飼料タンパク質のミルクまたは肉への変換の改善および窒素性廃棄物の減少をもたらす。
【００１７】
本出願人らは、寿命延長のために光合成細胞をリプログラミングすることにより、例えば葉の老化を遅延させることにより本発明の方法を促進することができ、植物バイオマスの増加に役立つことも見出した。
【００１８】
本出願人らは、細菌ＦＴ遺伝子をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む構築物が、２以上のフルクタン生合成酵素の翻訳融合体をコードする融合遺伝子を含む構築物よりも優れた結果を示し得ることを見出した。例えば１−ＳＳＴおよび１−ＦＦＴ活性の両方を含む細菌ＦＴ遺伝子の使用は、別々の遺伝子を融合するよりも技術的な困難が少なくなり、融合遺伝子を含む構築物と比べてより容易に植物に導入されるおよび／またはより良く機能する構築物をもたらすことができる。
【００１９】
例えば、例えば１−ＳＳＴおよび１−ＦＦＴ活性の両方を含む細菌ＦＴ遺伝子を発現することにより、植物ゲノムに独立的に組み込まれたこれら遺伝子の発現パターンの差に関連する課題を軽減し、その結果スクロース分子を、低い重合度（「低ＤＰフルクタン」）および高い重合度（「高ＤＰフルクタン」）を示すフルクタンに直接的に変換することができる。さらに、ＦＴタンパク質は、効率的なフルクタン生合成の代謝チャネルを形成することができる。
【００２０】
光合成細胞において低および高ＤＰフルクタンの蓄積をもたらす光合成細胞におけるＦＴ遺伝子の発現は、光合成抑制機構からの解放をもたらし、太陽エネルギーの獲得およびＣＯ２固定の増加を促進することができる。
【００２１】
このため、本出願人らは、光合成細胞の寿命延長のためのリプログラミングおよびフルクタン生合成の増強は太陽エネルギーの獲得を促進し、シュートおよび／または根の生長等、植物バイオマスの生産を増加させることを見出した。
【００２２】
さらに、低および高ＤＰフルクタンの蓄積は寒冷および乾燥等、非生物的ストレスに対する植物の耐性に関連づけられてきたため、また、根の生長増強および葉の老化遅延は植物の乾燥ストレス耐性に関係づけられてきたため、光合成細胞の寿命延長のためのリプログラミングおよびフルクタン生合成の増強は、収量安定性および植物の非生物的ストレス耐性を促進する。
【００２３】
したがって、本発明はその一態様において、植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作する方法であって、細菌フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含む方法を提供する。
【００２４】
「フルクタン生合成の操作」とは、一般に、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物におけるフルクタン生合成の増加を意味する。しかし、一部の適用では、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物においてフルクタン生合成を低減させる、あるいは改変することが望ましいであろう。例えば、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物のフルクタン生合成経路における特定の酵素の活性を増加または減少させることが望ましいであろう。
【００２５】
「光合成細胞」とは、光合成が行われる植物細胞を意味する。このような細胞は一般にクロロフィル色素を含む、あるいは緑色細胞として公知のものである。大部分の光合成細胞は、植物の葉に含まれる。好ましくは、本発明の遺伝的構築物は、維管束鞘細胞で発現し、より好ましくは葉肉および／または柔組織維管束鞘細胞で発現する。
【００２６】
「有効量」とは、前記植物またはそこから派生する植物体、植物種子もしくは他の植物部分において同定可能な表現型形質を生じるのに十分な量を意味する。このような量は、当業者であれば、植物の種類、投与経路その他の関連性のある要因を考慮に入れて容易に決定することができる。このような当業者は、適切な投与量および投与方法を容易に決定することができる。例えば、その開示全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用するＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒを参照。
【００２７】
「遺伝的構築物」とは、組換え核酸分子を意味する。
【００２８】
「プロモーター」とは、作動的に連結した核酸配列の転写を導くのに十分な核酸配列を意味する。
【００２９】
「作動的に連結した」とは、核酸（複数可）とプロモーター等の調節配列が、例えば転写活性化因子タンパク質等の適切な分子が前記調節配列に結合する場合、適切な条件下で前記核酸の発現を可能にする仕方で連結していることを意味する。好ましくは、作動的に連結したプロモーターは、関連する核酸の上流にある。
【００３０】
「上流」とは、核酸に沿って３’→５’方向を意味する。
【００３１】
「核酸」とは、遺伝情報を運ぶことができるヌクレオチド鎖を意味する。この用語は一般に、遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは変異体、および／またはその表現型に影響を及ぼす生物ゲノム内の他の配列を言う。用語「核酸」は、１本鎖または２本鎖であり、必要に応じて合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基、合成核酸およびそれらの組合せを含むＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ等）およびＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ等）を含む。
【００３２】
「細菌フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）酵素をコードする核酸」または「細菌フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子」とは、フルクトシル部分をスクロース含有サッカライドからアクセプター分子に転移することによりオリゴフルクタンおよび／またはポリフルクタンの合成を触媒する、細菌に通常存在する酵素をコードする核酸を意味する。細菌ＦＴ酵素は、レバンスクラーゼ活性を含む、および／またはレバン型フルクタンを産生することができる。細菌ＦＴ酵素は、イヌロスクラーゼ活性を含む、および／またはイヌリン型フルクタンを産生することができる。好ましい細菌ＦＴは、スクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＳＳＴ）およびフルクタン：フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＦＦＴ）酵素活性の両方を含む。ＳａｃＢ、ＬｓｃまたはＦＴＦ遺伝子を用いてもよい。ＳａｃＢまたはＬｓｃ遺伝子が特に好ましい。
【００３３】
プロモーターに関する「機能的に活性な断片または変異体」とは、断片または変異体（アナログ、誘導体または突然変異体等）がそこに作動的に連結した核酸の転写を導くことができることを意味する。このような変異体は、自然発生的な対立遺伝子変異体および非自然発生的な変異体を含む。その改変が断片または変異体の機能欠失活性をもたらすことのない限りにおいて、１または複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および誘導体化が企図される。好ましくは、機能的に活性な断片または変異体は、該断片または変異体が対応する上述の配列の関連性のある部分に対して少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９８％の同一性を有する。好ましくは、断片は、少なくとも２０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドのサイズを有する。
【００３４】
細菌ＦＴ酵素をコードする核酸に関する「機能的に活性な」とは、本発明の方法により、例えばフルクタン生合成経路に関与することができる酵素に翻訳されることにより、断片または変異体（アナログ、誘導体または突然変異体等）が植物におけるフルクタン生合成を操作できることを意味する。このような変異体は、自然発生的な対立遺伝子変異体および非自然発生的な変異体を含む。その改変が断片または変異体の機能欠失活性をもたらさない限りにおいて、１または複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および誘導体化が企図される。好ましくは、機能的に活性な断片または変異体は、該断片または変異体が対応する上述の配列の関連性のある部分に対して少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９８％の同一性を有する。このような機能的に活性な変異体および断片は、例えば保存された核酸変化を有する機能的に活性な変異体および断片を含む。
【００３５】
「保存された核酸変化」とは、遺伝暗号の縮重による、コードされているタンパク質におけるアミノ酸保存をもたらす核酸置換を意味する。このような機能的に活性な変異体および断片は、例えば対応するアミノ酸配列における１または複数の残基に保存されたアミノ酸置換をもたらす核酸変化を有する機能的に活性な変異体および断片も含む。
【００３６】
「保存されたアミノ酸置換」とは、同一クラス内の別の１アミノ酸によるアミノ酸置換を意味し、クラスは次の通りである。
【００３７】
非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ
電荷なし、極性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ
他の保存されたアミノ酸置換を次の通り行ってもよい。
【００３８】
芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ
プロトンドナー：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ
プロトンアクセプター：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
特に好ましい断片および変異体は、１または複数の保存されたスクロース結合／加水分解ドメインを含む。このようなドメインの例を図１に示すが、これはＬＤＶＷＤＳＷＰ、ＱＥＷＳＧＳＡ、ＬＲＤＰＨおよびＤＥＩＥＲを含む。
【００３９】
特に好ましい断片および変異体は触媒コアを含む。「触媒コア」とは、保存されたスクロース結合および／または加水分解ドメインを含む、シグナルペプチドならびにＮおよびＣ末端可変領域を除いたポリペプチドの内部領域を意味する。触媒コアの例を図１に示すが、これはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＳａｃＢタンパク質のアミノ酸残基６５〜４６８を含む。
【００４０】
特に好ましい断片および変異体は、シグナルペプチドを欠く断片および変異体を含む。「シグナルペプチド」とは、Ｎ末端シグナル配列を意味する。シグナルペプチドの例を図１に示すが、これはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＳａｃＢタンパク質のアミノ酸１〜２７を含む。
【００４１】
特に好ましい断片および変異体は、単子葉植物および双子葉植物の翻訳開始等、植物に適応したコドン使用を有する。
【００４２】
特に好ましい断片および変異体は、潜在性スプライス部位および／またはＲＮＡ不安定化配列エレメントが不活性化または除去されている。
【００４３】
好ましくは、細菌ＦＴをコードする核酸は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ等、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属からなる群より選択された細菌種由来の遺伝子（単数または複数）から単離される、あるいはそれに相当する。さらにより好ましくは、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＳａｃＢ遺伝子、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来のＬｓｃ遺伝子またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来のＦＴＦ遺伝子から単離される、あるいはそれに相当する。
【００４４】
特に好ましい一実施形態において、ＳａｃＢ遺伝子は、図２に示されている配列および図３に示されているポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００４５】
特に好ましい一実施形態において、Ｌｓｃ遺伝子は、図４に示されている配列および図５に示されているポリペプチド配列をコードする核酸配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００４６】
細菌レバンスクラーゼを発現するトランスジェニック植物が報告されており、一部の事例では発達異常の表現型を提示する。本出願人らは理論に制約されることを望まないが、この現象はレバンスクラーゼ酵素およびフルクタンポリマーの不適切な区画化に起因し得る。トランスジェニックタバコおよびジャガイモ植物における細菌ＳａｃＢ遺伝子のサイトゾルにおける発現は、植物の発達に特に破壊的な影響を与えることを示した（Ｃａｉｍｉら、１９９７年）。しかし、液胞ターゲティングシグナルと融合した細菌フルクトシルトランスフェラーゼを発現する植物は、植物の発達に認識可能な効果を及ぼすことなくフルクタンを蓄積する（Ｅｂｓｋａｍｐら、１９９４年、Ｙｅら、２００１年）。
【００４７】
発達異常の表現型を生じる可能性を低減させるため、細菌ＦＴ遺伝子を改変してそのターゲティングシグナル配列を変化させ、細菌ＦＴタンパク質を高フルクタンレベルの存在する区画に方向付けることができる。
【００４８】
より具体的には、細菌ＦＴ遺伝子のＮ−シグナルペプチドが除去され、細胞内ターゲティング配列、好ましくは液胞ターゲティング配列に置き換えられたキメラ配列を作製することができる。
【００４９】
好ましい一実施形態において、液胞ターゲティング配列は、サツマイモのＳＰＯＲ５３１等、プレプロスポラミンタンパク質をコードする遺伝子に由来する、あるいはそれに相当し得る。
【００５０】
特に好ましい一実施形態において、液胞ターゲティング配列は、図６において太字・下線で示されている配列および図７において太字・下線で示されているポリペプチドをコードする核酸配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含むことができる。
【００５１】
特に好ましい一実施形態において、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸は、ＳＰＯＲ：ＳａｃＢキメラ配列となることができる。好ましくは、ＳＰＯＲ：ＳａｃＢキメラ配列は、図８に示されている配列および図９に示されているポリペプチド配列をコードする核酸配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００５２】
特に好ましい一実施形態において、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸は、ＳＰＯＲ：Ｌｓｃキメラ配列となることができる。好ましくは、ＳＰＯＲ：Ｌｓｃキメラ配列は、図９に示されている配列および図１２に示されているポリペプチド配列をコードする核酸配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００５３】
特に好ましい一実施形態において、遺伝的構築物は、図８と図１１に示されている配列および図９と図１２に示されているポリペプチドをコードする核酸配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００５４】
別の好ましい一実施形態において、細菌ＦＴ遺伝子のＮ−シグナルペプチドが除去されて１−ＳＳＴ等、フルクトシルトランスフェラーゼ酵素の膜貫通ドメインに置き換えられたキメラ配列を作成することができる。
【００５５】
特に好ましい一実施形態において、膜貫通ドメインは、図１５において太字・斜字体で示されている配列および図１６において太字・斜字体で示されているポリペプチドをコードする核酸配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００５６】
特に好ましい一実施形態において、遺伝的構築物は、図１７と図２０に示されている配列および図１８と図２１に示されているポリペプチドをコードする核酸配列ならびにその機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００５７】
「キメラ配列」とは、元々は別々のタンパク質をコードしていた２以上の連結された核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む融合遺伝子を発現することによる、組換えにより産生されたハイブリッドを意味する。
【００５８】
「融合遺伝子」とは、融合タンパク質が好ましくは翻訳融合体として発現することが可能となる仕方で２以上の核酸が連結されたことを意味する。これは通常、第一のタンパク質をコードする核酸配列から終止コドンを除去し、次に第二のタンパク質の核酸配列をインフレームで付け加えることを含む。続いて、細胞により融合遺伝子を単一のタンパク質として発現させる。タンパク質は、両方のオリジナルタンパク質の完全配列、またはそのいずれかもしくは両者の機能的に活性な断片もしくは変異体を含むよう遺伝子操作されていてよい。
【００５９】
遺伝的構築物は、連結された２核酸間のリンカーをコードする核酸配列を含んでいてもよい。「リンカー」は、融合タンパク質内の２個の隣接する活性断片の間に配置された、あるいはそれらに接続された任意の化学合成炭水化物・脂質・ポリペプチド分子（またはそれらの組合せ）である。本発明の好ましいリンカーは、アミノ酸の結合によって２個の活性断片と接続した１または複数のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖等、可動性リンカーである。例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーが、融合タンパク質内の２個の活性断片間に配置されてよい。
【００６０】
本発明の構築物および方法に用いられるプロモーターは、構成的、組織特異的または誘導性プロモーターとなることができる。好ましい一実施形態において、プロモーターは光調節プロモーター（ｌｉｇｈｔ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、より好ましくは光合成プロモーターとなることができる。「光調節プロモーター」とは、光刺激に応答して遺伝子発現を媒介することができるプロモーターを意味する。「光合成プロモーター」とは、植物における光合成経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を媒介することができるプロモーターを意味する。
【００６１】
成熟葉身は、葉鞘および茎よりも少量のフルクタンが蓄積する。葉身におけるフルクタンレベルを特異的に上昇させるため、光合成細胞においてフルクタン生合成遺伝子を協調的に発現させる戦略的アプローチが考案された。本出願人らは理論に制約されることを望まないが、光調節または光合成プロモーターの使用は次の利点を提供することができる。
【００６２】
・光合成プロモーターは、葉身、茎の上部および外側を含む大きな細胞群（＞５５％の細胞）における活性を有する。
【００６３】
・それは、スクロース産生細胞（葉肉および柔組織維管束鞘細胞）における活性を有する。
【００６４】
・その発現パターンは、スクロース蓄積と時間的および空間的に重複する。
【００６５】
・フルクトシルトランスフェラーゼ（Ｆｒｕｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性はソースからスクロースを除去し、これにより光合成におけるフィードバック抑制を妨げ、ＣＯ２固定の増加を促進する。
【００６６】
特に好ましい光調節プロモーターは、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ（ｏｘｙｇｔｅｎａｓｅ）−スモールサブユニット（ＲｂｃＳ）プロモーターおよびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）プロモーターならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体を含む。
【００６７】
光調節プロモーターは、単子葉植物［トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、飼料草（例えば、Ｆｅｓｔｕｃａ属、Ｌｏｌｉｕｍ属、Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ属、Ｐａｓｐａｌｕｍ属、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ属）、バイオエネルギー用草本（例えば、スイッチグラス、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ属）等］、双子葉植物（シロイヌナズナ、ダイズ、キャノーラ、ワタ、アルファルファおよびタバコ等）および裸子植物を含む、任意の適切な植物種に由来することができる。
【００６８】
単子葉植物の形質転換のため、好ましくは、光調節プロモーターは単子葉植物種、より具体的にはＴｒｉｔｉｃｕｍ属またはＬｏｌｉｕｍ属の種、さらにより具体的にはＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍまたはＬｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅから単離される、あるいはそれらに由来するプロモーターに相当する。
【００６９】
双子葉植物の形質転換のため、好ましくは、光調節プロモーターは双子葉植物種、より具体的にはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属の種、さらにより具体的にはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａから単離される、あるいはそれらに由来するプロモーターに相当する。
【００７０】
特に好ましい一実施形態において、ＲｂｃＳプロモーターは、図２３〜２６のいずれか一図において小文字・斜字体で示されている配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００７１】
特に好ましい別の一実施形態において、ＲｂｃＳプロモーターは、図２９〜３６のいずれか一図において小文字・斜字体で示されている配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００７２】
本発明の遺伝的構築物は、任意の適切な技法により植物に導入することができる。本発明の遺伝的構築物を植物細胞に組み入れるための技法（例えば形質導入、トランスフェクション、形質転換または遺伝子ターゲティング）は、当業者にとって周知のものである。このような技法は、アグロバクテリウムを介した導入、根粒菌を介した導入、組織、細胞およびプロトプラストへのエレクトロポレーション、プロトプラスト融合、生殖器官への注入、未熟胚への注入、細胞、組織、カルス、未熟胚および成熟胚への高速噴射による導入、遺伝子銃による形質転換、Ｗｈｉｓｋｅｒｓ形質転換ならびにそれらの組合せを含む。技法の選択は、主として形質転換される植物の種類に依存し、当業者であれば容易に決定することができる。
【００７３】
本発明の遺伝的構築物を組み入れる細胞を後述の通り選択し、次に本技術分野で周知の技法を用いて適切な培地で培養して形質転換植物を再生することができる。温度やｐＨその他の培養条件は、当業者であれば明らかであろう。その結果生じた植物に、本技術分野で周知の方法を用いて有性生殖か無性生殖のいずれかを行わせて、形質転換植物の後代を作出することができる。
【００７４】
本発明の方法は、単子葉植物［草本（例えば、ペレニアルライグラス、ヒロハノウシノケグサ（ｔａｌｌ ｆｅｓｃｕｅ）、イタリアンライグラス（Ｉｔａｌｉａｎ ｒｙｅｇｒａｓｓ）、オオウシノケグサ（ｒｅｄ ｆｅｓｃｕｅ）、クサヨシ（ｒｅｅｄ ｃａｎａｒｙｇｒａｓｓ）、ビッグブルーステム（ｂｉｇ ｂｌｕｅｓｔｅｍ）、コードグラス（ｃｏｒｄｇｒａｓｓ）、ネピアグラス（ｎａｐｉｅｒｇｒａｓｓ）、ワイルドライ（ｗｉｌｄｒｙｅ）、ワイルドシュガーケーン（ｗｉｌｄ ｓｕｇａｒｃａｎｅ）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ属、スイッチグラスを含む飼料草およびバイオエネルギー用草本）、コーンすなわちトウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、ライムギ、カラスムギ）およびエネルギー用作物（例えば、エネルギー用サトウキビ、エネルギー用ソルガム）等］、双子葉植物［シロイヌナズナ、タバコ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ジャガイモ、キャッサバ、クローバ（例えば、シロツメクサ、ムラサキツメクサ、ジモグリツメクサ（ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｃｌｏｖｅｒ））、アブラナ科野菜（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｂｒａｓｓｉｃａ）、レタス、ホウレンソウ等］および裸子植物を含む、種々の植物に適用することができる。
【００７５】
本発明のさらに別の一態様において、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結した光調節プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物が提供される。
【００７６】
好ましい一実施形態において、本発明に係る遺伝的構築物はベクターとなることができる。
【００７７】
「ベクター」とは、遺伝子材料の標的細胞への導入に用いられる遺伝的構築物を意味する。
【００７８】
ベクターは、任意の適切な種類のものとなることができ、ウイルスまたは非ウイルス性となることができる。ベクターは発現ベクターとなることができる。このようなベクターは、染色体、非染色体および合成核酸配列、例えば植物ウイルスの誘導体、細菌プラスミド、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓから得られたＴｉプラスミドの誘導体、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓから得られたＲｉプラスミドの誘導体、ファージＤＮＡ、酵母人工染色体、細菌人工染色体、バイナリー細菌人工染色体ならびにプラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクターを含む。しかし、複製可能あるいは植物細胞に組み込み可能または機能する限りにおいて、その他のベクターを用いてもよい。
【００７９】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態において、遺伝的構築物はターミネーターをさらに含むことができ、前記プロモーター、遺伝子およびターミネーターは、作動可能に連結している。
【００８０】
プロモーター、遺伝子およびターミネーターは、任意の適切な種類のものとなることができ、標的植物細胞で機能するのであれば、その標的植物細胞に対して内在性であっても外来性であってもよい。
【００８１】
本発明の遺伝的構築物に用いることができる種々のターミネーターもまた、当業者にとって周知のものである。ターミネーターは、プロモーター配列と同じ遺伝子に由来してよいし、異なる遺伝子に由来してもよい。特に適切なターミネーターは、（ＣａＭＶ）３５ＳポリＡ等、ポリアデニル化シグナルならびにノパリン合成酵素（ｎｏｓ）およびオクトピン合成酵素（ｏｃｓ）遺伝子由来の他のターミネーターである。
【００８２】
プロモーター、遺伝子およびターミネーターに加えて、遺伝的構築物は、核酸の発現に必要なさらに別のエレメント、例えばベクター骨格、複製起点（ｏｒｉ）、多重クローニング部位、スペーサー配列、エンハンサー、イントロン（トウモロコシユビキチンＵｂｉイントロン等）、抗生物質抵抗性遺伝子および他の選択マーカー遺伝子［ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺伝子、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒまたはｐａｔ）遺伝子］ならびにレポーター遺伝子（ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ｇｕｓＡ）等）等］を様々な組合せで含むことができる。遺伝的構築物は、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含むこともできる。遺伝的構築物は、発現を増幅するための適切な配列を含むこともできる。
【００８３】
特に、遺伝的構築物は、上文に記す通り、連結された２核酸の間にリンカーをコードする核酸配列をさらに含むことができる。
【００８４】
当業者であれば、遺伝的構築物の様々な構成要素が、前記核酸の発現をもたらすよう作動可能に連結していることを理解できるであろう。本発明の遺伝的構築物の構成要素を作動可能に連結するための技法は、当業者にとって周知のものである。このような技法は、例えば１または複数の制限酵素部位を含む合成リンカー等、リンカーの使用を含む。
【００８５】
好ましくは、遺伝的構築物は実質的に精製または単離されている。「実質的に精製された」とは、遺伝的構築物が、本発明の核酸またはプロモーターの由来する生物の自然発生的なゲノムにおいては、該核酸またはプロモーターに隣接する遺伝子を含まないことを意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自己複製プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物ゲノムＤＮＡに組み入れられた、あるいは他の配列から独立した別々の分子（例えば、ｃＤＮＡまたはＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されたゲノムもしくはｃＤＮＡ断片）として存在する遺伝的構築物を含む。これは、追加的ポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である遺伝的構築物も含む。好ましくは、実質的に精製された遺伝的構築物は、少なくとも約９０％の純度、より好ましくは少なくとも約９５％の純度、さらにより好ましくは少なくとも約９８％の純度である。
【００８６】
用語「単離された」は、材料がその元々の環境（例えば、自然発生的であれば自然環境）から取り分けられたことを意味する。例えば、生きた植物に存在する自然発生的な核酸は単離されていないが、同じ核酸でも、自然システムにおいて共存している材料の一部または全部から分離された核酸は単離されている。このような核酸はベクターの一部であってよい、および／またはこのような核酸は組成物の一部であってよく、このようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないという点において、これは依然として単離されている。
【００８７】
形質転換された宿主細胞を選抜するための表現型形質を提供するための選択マーカー遺伝子を使用する代わりとして、形質転換細胞における遺伝的構築物の存在は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロットハイブリダイゼーション解析、組織化学的アッセイ（例えば、ＧＵＳアッセイ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ノーザンブロットおよびウエスタンブロットハイブリダイゼーション解析等、本技術分野で周知の他の技法により決定することができる。
【００８８】
本出願人は、本発明の方法が、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物において増強されたバイオマスをもたらし得ることも見出した。これにより、この増強されたバイオマスは、形質転換植物を同定するための選抜ツールとして用いることができる。この構成は、後にこのようなマーカーを除去（そしてマーカーなし植物の作製のため）することが困難である場合、一部の状況において、形質転換体選抜のための抗生物質抵抗性または他のマーカーを含む必要がないという利点がある。
【００８９】
「バイオマス増強」または「増強されたバイオマス」とは、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物におけるシュートおよび／または根の生長を含むバイオマス収量の増強、増加または安定性増加を意味する。例えば、合計葉面積、累積葉面積、葉の生長動態（すなわち、経時的な葉の数）、シュートの数、分げつの数、根の数、根の質量もしくは重量、シュートの質量もしくは重量、根の長さ、シュートの長さ、走根の長さ、塊茎の数、塊茎の重量、花の数、果実の数、種子の数、種子の重量、果実の重量、開花している植物体のパーセンテージおよび花１個当たりまたは作付面積当たりの種子収量からなる群より選択された１または複数の生長特徴は、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物において増強され、増加され、またはより安定的となることができる。
【００９０】
この技法は、実質的に遺伝的に均一または遺伝的に同一である、あるいは形質転換前のバイオマスとの表現型の差が小さいことを示す植物に特に適用できる。
【００９１】
したがって、本発明のさらに別の一態様において、植物におけるバイオマスを増強する方法であって、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結（ｌｉｋｅｄ）したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含む方法が提供される。好ましくは、プロモーターは光調節プロモーターである。
【００９２】
本発明の方法、核酸および遺伝的構築物は、他の遺伝的操作方法または他の導入核酸もしくは遺伝的構築物と組み合わせて用いて、これにより形質を積み重ねることができる。このため、積み重ねられた遺伝子（または積み重ねされた形質）を有するトランスジェニック植物体、植物細胞、植物種子または他の植物部分が作出される。例えば、本発明の技術は、除草剤抵抗性技術（例えば、グルホシネート、グリホサート）、害虫抵抗性技術（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）または老化遅延技術と組み合わせることができる。核酸または遺伝的構築物は、上文に記す通り、任意の適切な技法により植物に導入することができ、同時発生的に、連続的にまたは別々に導入することができる。
【００９３】
本発明のさらになお別の一態様において、植物におけるバイオマスを増強する方法であって、有効量の
（ａ）植物の光合成細胞においてフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物であって、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む遺伝的構築物と、
（ｂ）植物の老化を操作することができる遺伝的構築物と、
を植物に導入するステップを含む方法が提供される。
【００９４】
遺伝的構築物は、上文に記す通り任意の適切な技法により植物に導入することができ、同時発生的に、連続的にまたは別々に導入することができる。
【００９５】
好ましくは、フルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物は、上文に記す通りである。
【００９６】
好ましくは、植物の老化を操作することができる遺伝的構築物は、植物の光合成細胞の老化を操作することができる。
【００９７】
好ましくは、老化を操作することができる遺伝的構築物は、サイトカイニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したｍｙｂ遺伝子プロモーターもしくは改変されたｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはそれらの機能的に活性な断片もしくは変異体を含む。
【００９８】
適切な遺伝的構築物またはベクターは、その開示全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２号明細書および米国特許出願第１１／７８９，５２６号明細書に記載されている。
【００９９】
「老化を操作する」は一般に、非形質転換対照植物と比べた形質転換植物または形質転換植物の細胞もしくは器官、例えば光合成細胞における老化の遅延に関する。しかし、一部の適用では、植物における老化を促進、あるいは改変することが望ましいであろう。老化は、例えばアンチセンス遺伝子を利用することによって促進、あるいは改変することができる。
【０１００】
ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、任意の適切な種類のものとなることができる。好ましくは、ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、ｍｙｂ３２遺伝子プロモーターである。好ましくは、ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、より好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａに由来する。最も好ましくは、ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、国際出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２号明細書の配列番号１に示されている配列ならびにその機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含む。
【０１０１】
適切なプロモーターは、その開示全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用するＬｉら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ＭＹＢ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ＰＧＲ９９〜１３８）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１２１巻：３１３（１９９９年）に記載されている。
【０１０２】
「改変されたｍｙｂ遺伝子プロモーター」とは、前記プロモーターにおける１または複数の根特異的モチーフおよび／または花粉特異的モチーフを欠失するよう、あるいは不活性化するよう改変された、ｍｙｂ遺伝子に通常関連するプロモーターを意味する。
【０１０３】
好ましくは、改変されたｍｙｂ遺伝子プロモーターは、改変されたｍｙｂ３２遺伝子プロモーターである。好ましくは、改変されたｍｙｂ遺伝子プロモーターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、あるいはより好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａに由来するｍｙｂ遺伝子プロモーターから改変される。
【０１０４】
本発明に従って改変できる適切なプロモーターは、その開示全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用するＬｉら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ＭＹＢ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ（ＰＧＲ９９〜１３８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１２１巻：３１３（１９９９年）に記載されている。
【０１０５】
「根特異的モチーフ」とは、植物の根において任意の関連遺伝子の発現を導く、３〜７ヌクレオチド、好ましくは４〜６ヌクレオチド、より好ましくは５ヌクレオチドの配列を意味する。
【０１０６】
好ましくは、根特異的モチーフは、コンセンサス配列ＡＴＡＴＴまたはＡＡＴＡＴを含む。
【０１０７】
「花粉特異的モチーフ」とは、植物の花粉において関連遺伝子の発現を導く、３〜７ヌクレオチド、好ましくは４〜６ヌクレオチド、より好ましくは４または５ヌクレオチドの配列を意味する。
【０１０８】
好ましくは、花粉特異的モチーフは、ＴＴＴＣＴ、ＡＧＡＡＡ、ＴＴＣＴおよびＡＧＡＡからなる群より選択されたコンセンサス配列を含む。
【０１０９】
根または花粉特異的モチーフは、モチーフ内の１または複数のヌクレオチドを付加、欠失、置換または誘導体化することによって不活性化し、これにより好ましいコンセンサス配列を持たないようにすることができる。
【０１１０】
好ましくは、改変されたｍｙｂ遺伝子プロモーターは、米国特許出願第１１／７８９，５２６号明細書の配列番号２、３および４に示されている配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
「サイトカイニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子」とは、カイネチン、ゼアチンおよびベンジルアデニン等、サイトカイニンの合成に関与する酵素をコードする遺伝子、例えば、ｓｈｏ遺伝子（例えば、ペチュニア由来の）等、イソペンチル（ｉｓｏｐｅｎｔｙｌ）トランスフェラーゼ（ｉｐｔ）またはｉｐｔ様遺伝子をコードする遺伝子を意味する。好ましくは、遺伝子は、イソペンテニル（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ）トランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子またはｓｈｏ遺伝子である。好ましい一実施形態において、遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、より好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；Ｌｏｔｕｓ属、より好ましくはＬｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ；およびＰｅｔｕｎｉａ属、より好ましくはＰｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａからなる群より選択された種に由来する。
【０１１２】
最も好ましくは、遺伝子は、米国特許出願第１１／７８９，５２６号明細書の配列番号５、７および９に示されている配列、米国特許出願第１１／７８９，５２６号明細書の配列番号６、８および１０に示されているポリペプチドをコードする配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含む。
【０１１３】
本発明はまた、形質転換植物を選抜する方法であって、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップと、バイオマスが増強された植物を選抜するステップとを含む方法も提供する。好ましくは、プロモーターは光調節プロモーターである。
【０１１４】
本発明のさらに別の一態様において、本発明に係る遺伝的構築物またはベクターを含み、非形質転換対照植物と比べてフルクタン生合成特徴が改変された、またはバイオマスが増強されたトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分が提供される。
【０１１５】
「改変されたフルクタン生合成特徴」とは、形質転換植物が、非形質転換対照植物と比べてフルクタン生合成の増加を示すことおよび／またはより高レベルの可溶性炭水化物を含むことを意味する。
【０１１６】
好ましい一実施形態において、バイオマスが増強されたトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分は、非形質転換対照植物と比べてバイオマスが少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３５％、より好ましくは少なくとも約５０％増加する。
【０１１７】
例えば、非形質転換対照植物と比べてバイオマスが約１５％から５００％の間、より好ましくは約２５％から３００％の間、より好ましくは約３５％から２００％の間、より好ましくは約５０％から１００％の間増加していてもよい。
【０１１８】
好ましい一実施形態において、フルクタン生合成特徴が改変されたトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分は、非形質転換対照植物と比べて可溶性炭水化物が少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３５％、より好ましくは少なくとも約５０％増加する。
【０１１９】
例えば、非形質転換対照植物と比べて可溶性炭水化物が約１５％から５００％の間、より好ましくは約２５％から３００％の間、より好ましくは約３５％から２００％の間、より好ましくは約５０％から１００％の間増加する。
【０１２０】
好ましくは、トランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分は、本発明に係る方法によって作出される。
【０１２１】
本発明はまた、本発明の植物細胞に由来し、本発明の遺伝的構築物またはベクターを含むトランスジェニック植物体、植物種子または他の植物部分も提供する。
【０１２２】
本発明はまた、本発明の植物に由来し、本発明の遺伝的構築物またはベクターを含むトランスジェニック植物体、植物種子または他の植物部分も提供する。
【０１２３】
好ましくは、トランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分は、Ｌｏｌｉｕｍ属の種、より好ましくはＬｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍである。
【０１２４】
好ましくは、トランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分は、穀物類、より好ましくはＴｒｉｔｉｃｕｍ属の種、より好ましくはコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）である。
【０１２５】
例えば、本発明は、草食動物の栄養改善のための、葉身におけるフルクタンが増加し、活発に生長し、非生物的ストレスに対しより高い耐性を有するトランスジェニック−ペレニアルライグラス植物の作出を可能にする。
【０１２６】
本発明はまた、例えばバイオ燃料生産または動物の食餌に利用可能な炭水化物の質量増加のための、フルクタンが増加し、活発に生長し、非生物的ストレスに対する耐性を有するトランスジェニックコムギ植物の作出も可能にする。
【０１２７】
「植物細胞」とは、半透膜によって仕切られた、色素体を含む任意の自己増殖細胞を意味する。このような細胞は、さらなる増殖が望ましい場合、細胞壁も必要とする。本明細書における植物細胞は、藻類、ラン藻、種子懸濁培養物、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２８】
「トランスジェニック」とは、技巧的手法によって細胞に挿入され、その細胞から発生した生物のゲノムの一部となったＤＮＡ配列を含む、任意の細胞を意味する。本明細書において、トランスジェニック生物は一般にトランスジェニック植物であり、ＤＮＡ（導入遺伝子）は、技巧的手法によって核または色素体ゲノムのいずれかに挿入される。
【０１２９】
次に、添付の実施例および図面を参照することにより本発明をさらに十分に説明する。なお、次の記述は具体例としてのものであるに過ぎず、決して上述の本発明の一般性を限定するものと考えるべきではないことを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られたＳａｃＢタンパク質、ＧＨ６８ファミリーメンバーの略図である。示されている４個の異なる領域は、Ｎ末端シグナル配列、Ｎ末端可変領域、触媒コアおよびＣ末端可変領域である。触媒三連構造（Ｄ８６、Ｄ２４７およびＥ３４２）およびスクロース結合（Ｗ８５、Ｗ１６３およびＲ２４６）を含むアミノ酸残基。
【図２】図２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られたＳａｃＢ遺伝子（レバンスクラーゼ）のヌクレオチド配列を示す図である。Ｎ末端シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を太字で示す。
【図３】図３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られたＳａｃＢタンパク質（レバンスクラーゼ）のアミノ酸配列を示す図である。Ｎ末端シグナルペプチドを太字で示す。
【図４】図４は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ ５３３から得られたＬｓｃ遺伝子（イヌロスクラーゼ）のヌクレオチド配列を示す図である。Ｎ末端シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を太字で示す。
【図５】図５は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ ５３３から得られたＬｓｃタンパク質（イヌロスクラーゼ）のアミノ酸配列を示す図である。Ｎ末端シグナルペプチドを太字で示す。
【図６】図６は、Ｉ．ｂａｔａｔａｓから得られたプレプロスポラミンタンパク質であるＳＰＯＲ５３１のヌクレオチド配列を示す図である。液胞ターゲティングシグナル配列を太字・下線で示す。
【図７】図７は、Ｉ．ｂａｔａｔａｓから得られたプレプロスポラミンタンパク質であるＳＰＯＲ５３１のアミノ酸配列を示す図である。液胞ターゲティングシグナル配列を太字・下線で示す。
【図８】図８は、ＳＰＯＲ：ＳａｃＢキメラヌクレオチド配列を示す図である。ＳａｃＢのＮ末端シグナル配列をＳＰＯＲの液胞ターゲティングシグナル（太字・下線で示す）に置き換えてある。
【図９】図９は、ＳＰＯＲ：ＳａｃＢキメラタンパク質配列を示す図である。ＳａｃＢのＮ末端シグナル配列をＳＰＯＲの液胞ターゲティングシグナル（太字・下線で示す）に置き換えてある。
【図１０】図１０は、膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／を用いたＳＰＯＲ−ＳａｃＢ融合タンパク質の二次構造予測を示す図である。
【図１１】図１１は、ＳＰＯＲ：Ｌｓｃキメラヌクレオチド配列を示す図である。ＬｓｃのＮ末端シグナル配列をＳＰＯＲの液胞ターゲティングシグナル（太字・下線で示す）に置き換えてある。
【図１２】図１２は、ＳＰＯＲ：Ｌｓｃキメラタンパク質配列を示す図である。ＬｓｃのＮ末端シグナル配列をＳＰＯＲの液胞ターゲティングシグナル（太字・下線で示す）に置き換えてある。
【図１３】図１３は、膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／を用いたＳＰＯＲ−Ｌｓｃ融合タンパク質の二次構造予測を示す図である。
【図１４】図１４は、膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／を用いたＬｐ１−ＳＳＴの二次構造予測を示す図である。
【図１５】図１５は、Ｌ．ｐｅｒｅｎｎｅから得られたＬｐ１−ＳＳＴヌクレオチド配列を示す図である。Ｌｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメインのコード配列を太字・斜字体で示す。
【図１６】図１６は、Ｌ．ｐｅｒｅｎｎｅから得られたＬｐ１−ＳＳＴタンパク質配列を示す図である。Ｌｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメインを太字・斜字体で示す。
【図１７】図１７は、Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢキメラヌクレオチド配列を示す図である。ＳａｃＢのＮ末端シグナルのコード配列をＬｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメインのコード配列（太字・斜字体で示す）に置き換えてある。
【図１８】図１８は、Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢキメラタンパク質配列を示す図である。ＳａｃＢのＮ末端シグナル配列をＬｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメイン（太字・斜字体で示す）に置き換えてある。
【図１９】図１９は、膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／を用いたＬｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ融合タンパク質の二次構造予測を示す図である。
【図２０】図２０は、Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃキメラヌクレオチド配列を示す図である。ＬｓｃのＮ末端シグナルのコード配列をＬｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメインのコード配列（太字・斜字体で示す）に置き換えてある。
【図２１】図２１は、Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃキメラタンパク質配列を示す図である。ＬｓｃのＮ末端シグナル配列をＬｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメイン（太字・斜字体で示す）に置き換えてある。
【図２２】図２２は、膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／を用いたＬｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ融合タンパク質の二次構造予測を示す図である。
【図２３−１】図２３は、ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２３−２】図２３は、ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２４−１】図２４は、ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２４−２】図２４は、ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２５−１】図２５は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２５−２】図２５は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２６−１】図２６は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２６−２】図２６は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２７】図２７は、Ｇａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。
【図２８Ａ】図２８は、双子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ；Ｂ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ；Ｃ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ、およびＤ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ。
【図２８Ｂ】図２８は、双子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ；Ｂ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ；Ｃ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ、およびＤ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ。
【図２８Ｃ】図２８は、双子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ；Ｂ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ；Ｃ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ、およびＤ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ。
【図２８Ｄ】図２８は、双子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ；Ｂ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ；Ｃ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ、およびＤ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ。
【図２９】図２９は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３０−１】図３０は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３０−２】図３０は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３１−１】図３１は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３１−２】図３１は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３２−１】図３２は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３２−２】図３２は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３３−１】図３３は、ＴａＲｂｃＳｐ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３３−２】図３３は、ＴａＲｂｃＳｐ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３４−１】図３４は、ＴａＲｂｃＳｐ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３４−２】図３４は、ＴａＲｂｃＳｐ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３５−１】図３５は、ＴａＲｂｃＳｐ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３５−２】図３５は、ＴａＲｂｃＳｐ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３６−１】図３６は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３６−２】図３６は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３６−３】図３６は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３７】図３７は、Ｇａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクター、ｐＢＳ：ｕｂｉ：：ｂａｒ：：ＮＯＳを示す図である。
【図３８】図３８は、単子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ、およびＢ．ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ
【図３９】図３９は、単子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ、およびＢ．ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ
【図４０】図４０は、単子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ、およびＢ．ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ
【図４１】図４１は、単子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ、およびＢ．ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ
【図４２】図４２は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの葉肉由来プロトプラストの単離を示す図である。Ａ）〜Ｂ）４〜６週目のｉｎ ｖｉｔｒｏ葉材料の解剖、前酵素消化；Ｃ）４〜６週目のｉｎ ｖｉｔｒｏ葉材料の消化、１６時間のインキュベーション；Ｄ）プロトプラスト懸濁液の回収；Ｅ）プロトプラスト豊富界面の分離；Ｆ）〜Ｇ）インタクトな葉緑体豊富プロトプラスト
【図４３】図４３は、一過性発現解析のためのＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの葉肉由来プロトプラストの単離を示す図である。Ａ）〜Ｂ）インタクトな葉緑体豊富プロトプラスト；Ｃ）液体濃縮培地におけるプロトプラストの培養；Ｄ）生存プロトプラスト、単離４８時間後
【図４４】図４４は、安定的な形質転換のためのＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの葉肉由来プロトプラストの単離を示す図である。Ａ）〜Ｂ）インタクトな葉緑体豊富プロトプラスト；Ｃ）プロトプラストを包埋したｓｅａ ｐｌａｑｕｅアガロースプラグ、０日目；Ｄ）生存プロトプラスト、単離および包埋６日後；Ｅ）〜Ｆ）包埋され、解放されたプロトプラスト由来の微小カルス、単離および包埋４週間後
【図４５】図４５は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの葉肉プロトプラスト由来の微小カルスからシュートの再生を示す図である。Ａ）液体成長培地Ａに解放された微小カルス、単離および包埋６〜７週間後；Ｂ〜Ｃ）固形成長培地におけるカルスの増殖；Ｄ）〜Ｅ）葉肉プロトプラスト由来のカルスからシュートの誘導および再生；Ｆ）再生シュートから根の発達；Ｇ）〜Ｈ）ガラス温室内に封じ込めた植物体の生長および発達
【図４６】図４６は、非形質転換プロトプラスト生存率の評価を示す図である。単離４８時間後。
【図４７】図４７は、ＰＥＧ形質転換プロトプラストの生存率の評価を示す図である。単離およびトランスフェクション４８時間後。
【図４８】図４８は、タバコリーフディスクのアグロバクテリウムを介した形質転換を示す図である。Ａ）形質転換リーフディスクの共存培養、０日目；Ｂ）ステージ１シュートの開始、共存培養３日後
【図４９−１】図４９は、タバコ形質転換リーフディスクにおけるｇｆｐ発現の検出を示す図である。Ａ）非形質転換リーフディスク、白色光；Ｂ）非形質転換リーフディスク、ｇｆｐ２フィルター；Ｃ）非形質転換リーフディスク、ｇｆｐ３フィルター；Ｄ）＆Ｇ）Ｔｕｒｂｏ ｇｆｐ形質転換リーフディスク、白色光；Ｅ）＆Ｈ）Ｔｕｒｂｏ ｇｆｐ形質転換リーフディスク、ｇｆｐ２フィルター；Ｆ）＆Ｉ）Ｔｕｒｂｏ ｇｆｐ形質転換リーフディスク、ｇｆｐ３フィルター。
【図４９−２】図４９は、タバコ形質転換リーフディスクにおけるｇｆｐ発現の検出を示す図である。Ａ）非形質転換リーフディスク、白色光；Ｂ）非形質転換リーフディスク、ｇｆｐ２フィルター；Ｃ）非形質転換リーフディスク、ｇｆｐ３フィルター；Ｄ）＆Ｇ）Ｔｕｒｂｏ ｇｆｐ形質転換リーフディスク、白色光；Ｅ）＆Ｈ）Ｔｕｒｂｏ ｇｆｐ形質転換リーフディスク、ｇｆｐ２フィルター；Ｆ）＆Ｉ）Ｔｕｒｂｏ ｇｆｐ形質転換リーフディスク、ｇｆｐ３フィルター。
【図５０】図５０は、ＲＴ−ＰＣＲ試料および対照の電気泳動を示す図である。レーン１および１３：１ｋｂ＋ＤＮＡラダーレーン２：トランスフェクトしたプロトプラスト１（試料９Ａ）から得られたｍＲＮＡの逆転写によって生成したｃＤＮＡ（２μＬ）から、遺伝子特異的プライマーによるｓａｃＢ転写産物の増幅レーン３：ｃＤＮＡ（１μＬ）からｓａｃＢ転写産物の増幅（試料９Ａ）レーン４：逆転写酵素なしで行った対照反応（試料９Ａ）レーン５：鋳型なしで行った対照反応（ｓａｃＢプライマー）レーン６：トランスフェクトしたプロトプラスト１（試料１２Ａ）から得られたｍＲＮＡの逆転写によって生成したｃＤＮＡ（２μＬ）から、遺伝子特異的プライマーによるｓａｃＢ転写産物の増幅レーン７：ｃＤＮＡ（１μＬ）からｓａｃＢ転写産物の増幅（試料１２Ａ）レーン８：逆転写酵素なしで行った対照反応（試料１２Ａ）レーン９：非トランスフェクトプロトプラストから得られたｍＲＮＡの逆転写によって生成したｃＤＮＡ（２μＬ）から、遺伝子特異的プライマーによる１８Ｓ転写産物の増幅レーン１０：非トランスフェクトプロトプラストから得られたｍＲＮＡの逆転写によって生成したｃＤＮＡ（１μＬ）から、遺伝子特異的プライマーによる１８Ｓ転写産物の増幅レーン１１：逆転写酵素なしで行った対照反応（非トランスフェクトプロトプラスト）レーン１２：鋳型なしで行った対照反応（１８Ｓプライマー）。
【発明を実施するための形態】
【０１３１】
（実施例１）
細菌フルクタン生合成遺伝子の単離
図１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られたＳａｃＢタンパク質の略図を提示する。示されている４個の異なる領域は、Ｎ末端シグナル配列、Ｎ末端可変領域、触媒コアおよびＣ末端可変領域である。構造的には、細菌イヌロスクラーゼおよびレバンスクラーゼの多くは、Ｎ末端シグナルペプチド、触媒三連構造を共有する。この配列は配列改変の際に除去される。スクロース結合に関与する残基は触媒コア配列内部に位置するが、これは改変の際に手をつけずにおく。
【０１３２】
細菌レバンスクラーゼ（ＳａｃＢ）およびイヌロスクラーゼ（Ｌｓｃ）のヌクレオチドおよびタンパク質配列をそれぞれ図２〜５に提供する。しかし、植物形質転換のため、細菌レバンスクラーゼおよびイヌロスクラーゼ配列は次の仕方によっても改変される。
【０１３３】
・細菌Ｎ−シグナルペプチドの除去、
・翻訳開始等、コドン使用の単子葉植物および双子葉植物への適応、
・潜在性スプライス部位およびＲＮＡ不安定化配列エレメントの除去、
・単子葉植物および双子葉植物の液胞ターゲティング配列ならびに植物１−ＳＳＴ特異的膜貫通ドメイン等、推定細胞内ターゲティング配列を用いてコード配列をさらに改変する。
【０１３４】
これらの変化の概略を次の実施例に記す。
【０１３５】
（実施例２）
細菌フルクタン生合成遺伝子の改変
細菌ＦＴ遺伝子の特異的細胞区画へのターゲティング
細菌ＦＴ遺伝子をサイトゾルから離れてスクロースおよびフルクタンの両方が蓄積する区画に方向付けるため、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）のプレプロスポラミンタンパク質（ＳＰＯＲ５３１）由来の推定液胞ターゲティング配列を用いてＳａｃＢおよびＬｓｃのコード配列を改変する。スポラミン前駆体のプロペプチドは、スポラミンの液胞へのターゲティングに必要とされる（Ｈａｔｔｏｒｉら、１９８５年）。スポラミンの液胞ターゲティング情報はアミノ末端プロペプチドにコードされ、これは図５および図６に示されている。
【０１３６】
配列改変は、ＳａｃＢおよびＬｓｃ細菌フルクタン（ｆｕｃｔａｎ）生合成遺伝子の両方からＮ−シグナルペプチドを除去すること、およびＳＰＯＲ５３１液胞ターゲティングシグナルを付加することに関与する（それぞれ図７〜８および図１０〜１１）。
【０１３７】
膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／を用いた細胞内局在の予測および改変されたタンパク質のトポロジーは、液胞ターゲティングシグナルによって誘発された膜貫通局在を示す（図９および図１２）。
【０１３８】
細菌ＦＴ遺伝子へのＬｐ１−ＳＳＴタンパク質由来膜貫通ドメインの付加
ＳＯＳＵＩソフトウェアは、Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ １−ＳＳＴ遺伝子の二次構造を予測するためにも用いた。Ｎ末端に膜貫通ドメインを示唆するこの構造を図１３に示す。膜貫通ドメインコード配列およびタンパク質配列をそれぞれ図１４および図１５に示す。
【０１３９】
配列改変は、ＳａｃＢおよびＬｓｃ細菌フルクタン生合成遺伝子の両方からＮ−シグナルペプチドを除去すること、およびＬｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメインを付加することに関与する（それぞれ図１６〜１７および図１９〜２０）。膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩを用いて、ＳａｃＢおよびＬｓｃの改変された配列の細胞内（ｓｕｂｓｅｌｌｕｌａｒ）局在およびタンパク質トポロジーを評価し、それらの予測二次構造をそれぞれ図１８および図２１に提示する。
【０１４０】
（実施例３）
双子葉植物における安定的な形質転換のためのベクターの作製
発現構築物の合成
双子葉植物に形質転換するための、光合成（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｉｃ）プロモーター、実施例２に示されている改変された細菌フルクタン生合成遺伝子およびＮＯＳターミネーター配列を利用した発現構築物を人工合成する。
【０１４１】
光合成プロモーターの使用はフルクタンを蓄積する組織において遺伝子を発現させ、一方改変された配列はタンパク質を特異的植物細胞区画に標的化させる。
【０１４２】
リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ−スモールサブユニット（ＲｂｃＳ）は、高等植物における十分に特徴付けられた光調節遺伝子である。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ−スモールサブユニット（ＡｔＲｂｃＳ）プロモーター配列の１７００ｂｐ断片は、以前にクローニングされている。発現ベクターで用いるため、ＡｔＲｂｃＳプロモーター由来のＴＡＴＡシグナルを含む、より短い断片を増幅するためのプライマーを設計する。
【０１４３】
改変された細菌フルクタン生合成遺伝子のための新たな予測配列は、植物における発現のためにコドン使用を変更させ、潜在性スプライス部位およびＲＮＡ不安定化配列エレメントを除去しつつ人工合成し、植物細胞におけるその性能を最適化する。
【０１４４】
図２３〜２６は、それぞれ発現カセットＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ、ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳおよびＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳを表し、これらはまだコドン最適化または不安定化エレメントの除去を行っていない。
【０１４５】
シロイヌナズナ光合成プロモーターによって駆動される改変された細菌ＦＴ遺伝子を含む双子葉植物形質転換のための構築物の作製
各合成発現カセットを、Ｇａｔｅｗａｙ法に使用可能なｐＤＯＮＯＲベクター内に配置して、植物の形質転換用の最終的な目的ベクターに組み換える。
【０１４６】
３５Ｓｐ：ｈｐｈ：３５Ｓｔ選択マーカーカセットを含む、Ｇａｔｅｗａｙ法に使用可能な目的ベクターを作製した。ｐＰＺＰ２００＿３５Ｓｐ＿ｈｐｈ＿３５Ｓｔ＿Ｒ４／Ｒ３（図２７）。
【０１４７】
Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ組換え反応は、次の双子葉植物の形質転換用のｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを作製する。
ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ（図２８Ａ）
ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ（図２８Ｂ）
ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ（図２８ｃ）
ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ（図２８ｄ）
（実施例４）
単子葉植物における安定的な形質転換のためのベクターの作製
発現構築物の合成
単子葉植物の形質転換用の、パンコムギ光合成プロモーター（ＴａＲｂｃｓｐ）、実施例２に示されている改変された細菌フルクタン生合成遺伝子およびＴａＲｂｃＳターミネーター配列を利用した発現構築物を人工合成する。光合成プロモーターの使用はフルクタンを蓄積する組織において遺伝子を発現させ、一方改変された配列はタンパク質を特異的植物細胞区画に標的化させる。
【０１４８】
パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）のＴａＲｂｃＳ調節配列（プロモーターおよびターミネーター）は、以前にクローニングされている（Ｚｅｎｇら、１９９５年；Ｓａｓａｎｕｍａ、２００１年）。発現ベクターで用いるため、ＴａＲｂｃＳ遺伝子（ＮＣＢＩ受託番号ＡＢ０４２０６９）由来のＴＡＴＡシグナルを含む、以前に発表された配列から得られた６９５ｂｐプロモーター断片を増幅する。
【０１４９】
改変された細菌フルクタン生合成遺伝子のための新たな予測配列を、植物における発現のためにコドン使用を変更させ、潜在性スプライス部位およびＲＮＡ不安定化配列エレメントを除去しつつ人工合成して、植物細胞におけるその性能を最適化する。
【０１５０】
上に概略されている方法を用いて発現カセットを合成し、フルクタン生合成遺伝子およびＬＸＲ（商標）技術の両方を含むトランスジェニック植物を作出する。ＬＸＲ（商標）技術は、ＡｔＭＹＢ３２遺伝子プロモーター制御下における葉老化遅延のための１種類の候補遺伝子（ＩＰＴ）を含む発現カセットに基づく。発現カセットＡｔＭＹＢ３ｐ：：ＩＰＴ：：３５Ｓｔは、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２号明細書に記載されている。トランスジェニックＬＸＲ（商標）植物の表現型は、植物の加齢に関連する葉の黄化およびクロロフィル喪失の減少を含み、これは光合成能の上昇を導き、分げつ化および植物バイオマスの改善をもたらす。
【０１５１】
２種の技術の統合は、光合成プロモーター活性化の拡大によるフルクタンの発現上昇をもたらし、植物における生産性の範囲を増加させることにより種々の適用の効力に有意な影響を与えることができる。
【０１５２】
図２９〜３６は、それぞれ発現カセットＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ、ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ、ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ、ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳおよびＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓを表し、これらはまだコドン最適化または不安定化エレメントを除去されていない。
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属の光合成プロモーターによって駆動される改変された細菌ＦＴ遺伝子を含む単子葉植物形質転換のための構築物の作製
各合成発現カセットを、Ｇａｔｅｗａｙ法に使用可能なｐＤＯＮＯＲベクター内に配置して、植物の形質転換用の最終的な目的ベクターに組み換える。
【０１５３】
Ｕｂｉ：：ｂａｒ：：ＮＯＳ選択マーカーカセットを含む、Ｇａｔｅｗａｙ法に使用可能な目的ベクターを作製した。ｐＢＳ：：Ｕｂｉ：：ｂａｒ：：ＮＯＳ＿Ｒ４／Ｒ３（図３７）。Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ組換え反応は、次の単子葉植物の形質転換用のｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを作製する。
ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ（図３８Ａ）
ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ（図Ｂ）；
ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ（図３９Ａ）
ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ（図３９Ｂ）
ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ（図４０Ａ）
ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ（図Ｂ）
ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ（図４１Ａ）
ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ（図４１Ｂ）
（実施例５）
双子葉植物用構築物 − Ｎ．ｔａｂａｃｕｍプロトプラストおよびＡ．ｔｈａｌｉａｎａ
直接送達バージョン（プロトプラストにおける一過性発現）ならびにシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）およびタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）への安定的な送達のためのバイナリー形質転換ベクターバージョンの、次の構築物を作製した。
１．ＡｔＲｂｃＳ：：１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ＊
２．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ＊
３．ＡｔＲｂｃＳ：：１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ＊
４．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ＊
＊細菌レバンスクラーゼおよびイヌロスクラーゼ配列は、次の仕方で改変する：
・細菌Ｎ−シグナルペプチドの除去、
・翻訳開始等、コドン使用の単子葉植物および双子葉植物への適応、
・潜在性スプライス部位およびＲＮＡ不安定化配列エレメントの除去、
・単子葉植物および双子葉植物の液胞ターゲティング配列ならびに植物１−ＳＳＴおよびＦＦＴ特異的膜貫通ドメイン等、推定細胞内ターゲティング配列を用いてコード配列をさらに改変する。
【０１５４】
（実施例６）
ポリエチレングリコールを介したタバコ葉肉由来プロトプラストの形質転換
本実施例は、上文に記載されている発現カセットのタバコプロトプラストへの送達を説明する（図４２〜４５を参照）。
【０１５５】
Ｉ．直接遺伝子導入のための葉肉由来プロトプラストの単離
Ａ．葉肉由来プロトプラストを得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏシュート培養物の消化
酵素溶液
Ｋ４培地［０．３Ｍではなく０．４Ｍスクロースを含むＫ３培地］に溶解した１．０％（ｗ／ｖ）セルラーゼ「Ｏｎｏｚｕｋａ」Ｒ１０および１．０％（ｗ／ｖ）Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｒ１０。酵素標品の混入デンプンをペレット化させるため、スピンダウンする（Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機、ＳＳ３４ローター；７，０００ｒｐｍで１０分間）。ＫＯＨでｐＨ５．６に調整し、濾過滅菌（０．２μｍ孔径）する。４℃で長くて３〜４週間保存する。
【０１５６】
材料
・固形ＭＳ培地とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍシュート培養物の入った４００ｍｌ培養容器
・９０×２０ｍｍ滅菌ペトリ皿
・ピンセット
・メス
・滅菌メス刃；＃１１または＃２２ 。
【０１５７】
溶液
・酵素溶液；Ｋ４培地に溶解した１％セルラーゼおよび１％マセロザイム
・滅菌水 。
【０１５８】
手順
１．プレート底部をたっぷりと覆うのに十分な量の酵素溶液（１５ｍｌで十分と思われる）を滅菌９０×２０ｍｍペトリ皿にデカントする。
２．４〜６週目のシュート培養物から健常で十分に開いた葉を２〜４枚、空の９０×２０ｍｍペトリ皿に移す。
３．１枚の葉の背軸面を上にして、周囲の葉組織の断裂を最小限に抑えつつ鋭利な滅菌刃を確実に用いて慎重に主脈を除去する。これを残り３枚の葉に繰り返す。１回当たり少量の葉材料（最大４枚）を取り扱い、層流による乾燥効果を最小限に抑える。
４．半分にした葉を穏やかに積み重ね、鋭利な滅菌刃を用いて１〜２ｍｍ片にスライスする。
５．葉切片を酵素溶液の入ったペトリ皿に慎重に移す（背軸面を下に）。皿をＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で封じ、１６〜１８時間、２５℃、暗所で振盪せずに一晩インキュベートする。
【０１５９】
Ｂ．葉肉由来プロトプラストの単離
材料
・滅菌５ｍｌピペット
・滅菌１０ｍｌピペット
・ピペットボーイ
・滅菌したプロトプラスト濾過ユニット：１００ｍｌガラスビーカー上に載せた１００μｍステンレス鋼メッシュ篩
・滅菌１４ｍｌプラスチック製丸底遠心チューブ
・Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機
・ウォーターバス 。
【０１６０】
培地
・消化中のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ葉の入った９０×２０ｍｍ滅菌ペトリ皿（複数可）
・０．６％Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロースを含む、１：１混合のＫ３：Ｈ固形培地 。
【０１６１】
溶液
・オートクレーブしたＷ５溶液
・オートクレーブしたＫ３溶液 。
【０１６２】
手順
６．一晩消化した標本を穏やかに撹拌して酵素溶液中にプロトプラストを遊離させる。
【０１６３】
撹拌は穏やかに、だが徹底的に行い、左右に（水平に）動かして行うこと。
７．プレートをやや傾け、消化中の懸濁液（酵素溶液および植物デブリ）を移し易くする。１０ｍｌ滅菌ピペットを用いて消化中の懸濁液を滅菌したプロトプラスト濾過ユニットに移し、プロトプラスト懸濁液を植物デブリから分離する。
８．濾過ユニットを穏やかにタップして篩内にたまった余分な液体を出す。
９．プロトプラスト懸濁液を穏やかに混合し、１４ｍｌ滅菌プラスチック製丸底遠心チューブに分配し、約８ｍｌまで（最大９ｍｌ）充填する。
１０．懸濁液を再分配して均一な容量分配を得る（最大９ｍｌ）。
１１．各懸濁液に１．５ｍｌのＷ５溶液を慎重に重層する。
Ｗ５溶液を分注し易くするため、懸濁液の入ったチューブを傾けて置き、ピペットチップをチューブ開口部近くの壁面に触れさせ、その後懸濁液面のすぐ上までゆっくりと下げる。一滴ずつ加えながら、ピペットチップが可能な限り懸濁液面に近づいた状態を確実に維持しつつＷ５溶液をゆっくりと分注する。これを正確に行えば、プロトプラスト懸濁液の撹拌、ひいてはＷ５溶液との混合は最小限となるであろう。
１２．慎重に蓋をし、チューブを５分間、７０ｇで遠心分離する（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機、スイングアウトローター、４００ｒｐｍ）。プロトプラストは、界面に浮遊している筈である。
１３．プロトプラストの入ったチューブを直立に維持し、滅菌５ｍｌピペットをプロトプラスト層のすぐ上のポイントまで慎重に下げて、下相を可能な限り取らないよう界面におけるプロトプラストを採取する。
Ｗ５溶液も同時に採取される。
１４．プロトプラストを採取し、「１本」の新しい１４ｍｌ遠心チューブに移す。プロトプラスト採取が完了したら、ピペッティングで穏やかに吸って吐くことによりプロトプラスト懸濁液を穏やかに混合する。
１５．プロトプラスト懸濁液の１００μｌアリコートを取り分け、９００μｌのＷ５溶液の入ったチューブに移すことにより、プロトプラスト収量を決定する。血球計算板でプロトプラストを計数し、１ｍｌ当たりのプロトプラスト数を決定する。
１６．１ｍｌ当たり約１×１０６（最大１．５×１０５）個のプロトプラストを得るのに必要な全容量を算出する。新しい１４ｍｌ丸底遠心チューブにプロトプラスト懸濁液を分配し、等容量が得られたことを確実にする。
１７．１０ｍｌピペットを用いて、プロトプラストの入った各チューブを全容量最大１０ｍｌまでＷ５溶液で充填する。プロトプラストが乱れるのを最小限に抑えるため、充填の際チューブ壁に沿わせてＷ５溶液を散布する。
１８．蓋をし、蓋閉めしたチューブを穏やかに１回反転することによってプロトプラストを再懸濁する。
１９．プロトプラストをペレット化し［７０ｇ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機、４００ｒｐｍ）５分間でスピンする］、その後Ｗ５溶液を全て除去して純粋なプロトプラスト懸濁液を残す。
２０．穏やかに振盪することによりプロトプラスト懸濁液を再懸濁する。
２１．プロトプラストの入った各チューブを全容量５ｍｌまでＷ５溶液で充填し、室温で最短で１時間、最長で４時間インキュベートする。
２２．１〜４時間のインキュベーション時間の間に、単離プロトプラストに直接遺伝子導入するための調製物に次の構成要素を構成する。
【０１６４】
・４０％ＰＥＧ溶液を−２０℃保存から取り出し、室温で保存する。直接遺伝子導入に進む３０分前に、ＰＥＧ溶液を温水の入ったビーカー内でインキュベートする。
【０１６５】
・Ｋ３：Ｈ固形培地を電子レンジで融解させる。完全に融解したら、使用準備が整うまで４０℃のウォーターバス内に置く。
【０１６６】
ＩＩ．ポリエチレングリコールを用いたプロトプラストへの直接遺伝子導入
ＤＮＡ形質転換
１００％（ｖ／ｖ）エタノールで沈殿および洗浄することによりプラスミドＤＮＡを滅菌し、層流フード内で乾かす［７０％エタノールにおけるプラスミドＤＮＡの沈殿も可能であるが、ＤＮＡペレットは乾かすのにさらに時間がかかる］。一過性形質転換のため、終濃度０．７μｇ／μｌになるようＤＮＡペレットを３０μｌの滅菌再蒸留水に再懸濁する。ＤＮＡの物理的構造は、一過性のためにはスーパーコイルとなるべきであり、安定的な形質転換のためには直鎖化するべきである（対象遺伝子の外側で）。形質転換プラスミドＤＮＡにキャリアーＤＮＡ（例えば、魚精子ＤＮＡ）を添加すると、通常、より良好で安定的な形質転換頻度が得られる。安定的な形質転換のため、上に示す通り１０μｇの直鎖化プラスミドＤＮＡおよび４０μｇの剪断した魚精子ＤＮＡを共沈殿し、乾かし、３０μｌの滅菌再蒸留水に溶解する。
【０１６７】
形質転換バッファー
１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）および０．５Ｍマンニトール。蒸留水に溶解した後、ＫＯＨでｐＨ５．８に調整し、オートクレーブする。４℃で保存する。
【０１６８】
ＰＥＧ溶液
０．４Ｍマンニトールおよび０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２中の４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００。ＰＥＧを０．４Ｍマンニトールおよび０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２に溶解する（これら２種の構成要素の終濃度は、ＰＥＧの容量のため低くなる）。ｐＨ８〜９に調整し、オートクレーブする（ｐＨはこの溶液中で安定化するのに数時間、例えば一晩かかり、オートクレーブ後にｐＨ６〜７に下がる）。
【０１６９】
材料
・滅菌１ｍｌピペット
・滅菌５ｍｌピペット
・滅菌１０ｍｌピペット
・ピペットボーイ
・滅菌１４ｍｌプラスチック製丸底遠心チューブ
・Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機
・ウォーターバス
・５０×１０ｍｍペトリ皿 。
【０１７０】
培地
・単離プロトプラスト懸濁液、ペレット化の入った１４ｍｌ丸底遠心チューブ
・０．６％Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロースを含む１：１混合のＫ３：Ｈ固形培地 。
【０１７１】
溶液
・オートクレーブしたＷ５溶液
・オートクレーブしたＫ３溶液
・オートクレーブしたＨ溶液
・４０％ＰＥＧ溶液
・形質転換バッファー
・３０μｌの滅菌再蒸留水に溶解した１０μｇの形質転換ＤＮＡ 。
【０１７２】
手順
１．プロトプラストをペレット化し［７０ｇ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機、４００ｒｐｍ）で５分間スピンする］、その後Ｗ５溶液を全て除去し、純粋なプロトプラスト懸濁液を残す。
２．１ｍｌピペットを用いて、３００μｌ（約７滴）の形質転換バッファーを単離プロトプラストの入った各１４ｍｌ丸底遠心チューブに加える（滴下する）。
３．チューブ底を穏やかにタップすることによってペレットを慎重に再懸濁する。
４．各プロトプラスト懸濁液に１０μｇ（３０μｌ）の形質転換ＤＮＡを加え、その後３００μｌ（１ｍｌピペットを分注に用いる場合、約７滴）の予熱したＰＥＧ溶液を加える。チューブ底を穏やかにタップすることによってプロトプラスト懸濁液を混合する。
形質転換バッファーへのプロトプラスト再懸濁と形質転換ＤＮＡおよびＰＥＧの添加との間の時間間隔は、最短を維持しなければならない。
５．形質転換混合物を１５分間、室温で撹拌せずにインキュベートする。
６．１０ｍｌピペットを用いて、次の間隔で１０ｍｌのＷ５溶液を各チューブに徐々に加える。
【０１７３】
・１ｍｌ（約１２滴）を各チューブに滴下する。全チューブを穏やかに反転して混合する。
【０１７４】
・１ｍｌ（約１２滴）を各チューブに滴下する。全チューブを穏やかに反転して混合する。
【０１７５】
・１ｍｌ（約１２滴）を各チューブに滴下する。全チューブを穏やかに反転して混合する。
【０１７６】
・２ｍｌを穏やかな流れとして各チューブに加える。全チューブを穏やかに反転して混合する。
【０１７７】
・２ｍｌを穏やかな流れとして各チューブに加える。全チューブを穏やかに反転して混合する。
【０１７８】
・３ｍｌを穏やかな流れとして各チューブに加える。全チューブを穏やかに反転して混合する。
【０１７９】
分注し易くするため、分注前に、各チューブを必要容量のＷ５溶液で充填するのに各間隔で必要とされる合計容量を１０ｍｌピペットで採取する。各間隔でこれを繰り返す。
７．プロトプラストをペレット化し［７０ｇ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機、４００ｒｐｍ）で１０分間スピンする］、その後全Ｗ５溶液を除去し、純粋なプロトプラスト懸濁液を残す。次に進む前に、全チューブ底を１回タップする。
【０１８０】
一過性形質転換用手順
８．合計容量が最大５ｍｌとなるよう、等容量のＫ３培地およびＨ培地（各溶液２．５ｍｌ）にプロトプラストペレットを再懸濁する。
９．液体Ｋ３：Ｈ＋プロトプラスト懸濁液の混合液を５０×１０ｍｍペトリ皿の中央にゆっくりと移す。
１０．全皿をＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で封じ、一過性発現解析に進む前にプロトプラストを２４〜７２時間、薄明かりの下で２４℃にて培養する。
【０１８１】
安定的な形質転換用手順
１１．次の「パートＩＩＩ．葉肉由来プロトプラストの培養および植物体の再生」に続ける。
【０１８２】
ＩＩＩ．葉肉由来プロトプラストの培養および植物体の再生
ステップ１＆２のため、プロトプラストの入った各チューブは、一度に１チューブで取り扱わなければならない。
【０１８３】
材料
・滅菌１ｍｌピペット
・滅菌５ｍｌピペット
・滅菌１０ｍｌピペット
・ピペットボーイ
・Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機
・ウォーターバス
・５０×１０ｍｍペトリ皿
・オートクレーブしたステンレス鋼製スパチュラ
培地
・単離プロトプラスト懸濁液、ペレット化の入った１４ｍｌ丸底遠心チューブ
・０．６％Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロースを含む１：１混合のＫ３：Ｈ固形培地、４０℃
・オートクレーブしたＫ３溶液
・２０ｍｌのＡ培地の入った２５０ｍｌ培養容器
・固形ＭＳ Ｍｏｒｐｈｏ培地の入った１２ウェルＣｏｓｔａｒ（登録商標）プレート
・固形ＭＳ Ｍｏｒｐｈｏ培地の入った２５０ｍｌ培養容器
・固形ＭＳ培地の入った２５０ｍｌ培養容器 。
【０１８４】
手順
１．プロトプラストペレットの近くに０．５ｍｌのＫ３培地を加えて、プロトプラストを再懸濁する。
２．Ｋ３＋プロトプラスト懸濁液の混合液を５０×１０ｍｍペトリ皿の中央にゆっくりと移す。
３．次に進む前に、プロトプラストの入った全チューブに対しステップ１および２を繰り返す。
４．一度に１プレートで、予熱した０．６％Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロースを含む１：１混合のＫ３：Ｈ培地を５ｍｌ加える。穏やかな旋回運動でプレートを１回だけ振盪して培地中のプロトプラスト懸濁液を均等に分布させる。全プレートに対しこれを繰り返す。
５．培地が固形化するまで（外気温に依存して１０〜３０分間）、プレートを放置し手をつけない。
６．全皿をＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で封じ、プロトプラストを２４時間、完全な暗所で２４℃にて培養し、続いて６日間連続的な薄明かり（５μｍｏｌ・ｍ−２ｓ１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）の下で培養すると、最初の、そして複数の細胞分裂が行われる。
７．滅菌スパチュラを用いて、プロトプラストを含むｓｅａ ｐｌａｑｕｅアガロースプラグを四分円に分割し、適切な抗生物質を添加した２０ｍｌのＡ培地の入った２５０ｍｌプラスチック製培養容器内に置く（２５０ｍｌ容器につき１個の四分円）。ロータリーシェーカー上で８０ｒｐｍ、１．２５ｃｍ ｔｈｒｏｗ、２４℃、連続的な薄明かりでインキュベートする。
８．２週間毎に液体Ａ培地＋適切な抗生物質を交換し、プロトプラスト由来コロニーの生長をモニターする。
９．プロトプラスト由来コロニーが直径約２〜３ｍｍになったとき（液体Ａ培地中で５〜６週間インキュベーション）、コロニーをＭＳ Ｍｏｒｐｈｏ固形培地の入った２４ウェルＣｏｓｔａｒ（登録商標）プレートの個々のウェルに移す。
１０．プレート（複数可）を１〜２週間、２４℃で連続的な薄明かり（５μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）の下でインキュベートすると、カルスは増殖して直径８〜１０ｍｍのサイズに達する。
１１．プロトプラスト由来カルスが直径約１〜２ｃｍになったとき、カルスを固形ＭＳ Ｍｏｒｐｈｏ培地の入った個々の２５０ｍｌ培養容器に移す。容器を２４℃で１６時間・明／８時間・暗条件下（２０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）でインキュベートする。１〜２週間以内に、複数のシュートを目視できるようになる。
１２．長さ３〜４ｃｍのシュートを固形ＭＳ培地の入った２５０ｍｌ培養容器に移し、根形成を助長する。容器を２４℃、１６時間・明／８時間・暗条件下（２０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）でインキュベートする。３週間以内に、根形成の徴候を目視できるようになる。
１３．確立された根システムを備える小植物を、タバコ葉肉プロトプラストの供給源としてのｉｎ ｖｉｔｒｏ植物培養物として維持する。
【０１８５】
（実施例７）
エバンスブルー染色を用いたタバコプロトプラスト生存率の評価
図４６および図４７を参照。
【０１８６】
背景情報
・エバンスブルー染色（ＥＶＢ；６，６’−［（３，３’−ジメチル１［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）ビス（アゾ）ビス［４−アミノ−５−ヒドロキシ−１，３−ナフタレンジスルホン酸］四ナトリウム塩）
・非蛍光色素
・作用方法：生細胞は、エバンスブルーを排除する能力を細胞膜に保持し、その本来の色を保つ。塩または浸透圧ストレスにより損傷を受けた細胞は、エバンスブルーを排除することができず紺青に染色され、検鏡により容易に識別できる。
【０１８７】
・調製方法：４００ｍｇ／ｌ原液（溶媒：０．６５Ｍマンニトール）
・染色方法：エバンスブルー原液を等容量のプロトプラスト懸濁液に加えて穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートし、その後顕微鏡で可視化する。
【０１８８】
・検出方法：Ｌｅｉｃａ ＭＺＦＬ ＩＩＩ光学解剖顕微鏡
（実施例８）
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍプロトプラストにおける遺伝子発現解析
実験目標：トランスフェクトしたタバコプロトプラストにおけるクローニングした遺伝子ＡｔＲｂｃＳ：：１−ＳＳＴ−ＳａｃＢおよびＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢの発現をＲＴ−ＰＣＲを用いて試験した。
【０１８９】
材料と方法：３プレートのプロトプラストの命名
ｉ）トランスフェクトしたプロトプラスト（試料９Ａ）：ＡｔＲｂｃＳ：：１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ
ｉｉ）トランスフェクトしたプロトプラスト（試料１２Ａ）：ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ
ｉｉｉ）非トランスフェクトプロトプラスト 。
【０１９０】
発現解析に関与するステップ：
１．プライマー設計およびＰＣＲの最適化
２．全ＲＮＡの単離
３．ＲＴ反応
４．ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ
プライマー設計およびＰＣＲ産物の同一性：ビーコン設計ソフトウェア（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）および遺伝子バンクにおいて利用できる遺伝子配列を用いてプライマー対を設計して対象遺伝子を増幅した。その結果生じるＰＣＲ産物のサイズが２００〜２５０ｂｐの範囲になるよう遺伝子特異的プライマーを選択した。融解曲線解析およびゲル電気泳動に基づくサイズによりＰＣＲ産物を同定した。
全ＲＮＡ単離：１処理当たり１×１０６個のプロトプラストからＰＲＯＭＥＧＡ製のＳＶ全ＲＮＡ単離システムにより全ＲＮＡを単離する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｔｂｓ／ｔｍ０４８／ｔｍ０４８．ｐｄｆ
【０１９１】
【表１】
逆転写酵素反応
ＱＩＡＧＥＮ ＲＴキットを用いてＲＴ反応を行った。プライマーミックス（ＱＩＡＧＥＮ）を用いることにより４通りのＲＴ反応を行った（９、１２、対照およびＷＴタバコＲＮＡ）。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ１．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｃｒ／ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＰｃｒＳｙｓｔｅｍｓ／ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＲｅｖＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ．ａｓｐｘ＃Ｔａｂｓ＝ｔ２
上述の試料それぞれの複製物を、遺伝子特異的プライマーを用いたＲＴ反応に付した。具体的には、試料９Ａおよび１２ＡはｓａｃＢリバースプライマーを用いて、対照（非トランスフェクト）試料は１８Ｓリバースプライマーで転写した。
【０１９２】
ＰＣＲ
反応を次の通りセットアップした。
２×ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ） １０μＬ
ｃＤＮＡ鋳型 ２．０μＬ
フォワードプライマー（１０μＭ） ０．５μＬ
リバースプライマー（１０μＭ） ０．５μＬ
ヌクレアーゼを含まない水 ７．０μＬ 。
【０１９３】
反応サイクルは次の通りである。
ステップ１：９５℃ ２分間
ステップ２：９５℃ ３０秒間
ステップ３：５５℃ ３０秒間
ステップ４：７２℃ ６０秒間
ステップ２から２５サイクル（１８Ｓ）、あるいはステップ２から３５サイクル（ｓａｃＢ）
ステップ５：４℃ ホールド 。
【０１９４】
１×ＴＢＥバッファー中で１％（ｗ／ｖ）アガロースにより電気泳動し、ＳＹＢＲ（５０μＬ／Ｌ）で染色した後、ＵＶ光の下で反応産物を可視化する。
【０１９５】
トランスフェクトしたプロトプラストｃＤＮＡ試料（９および１２）の両方でｓａｃＢ転写産物の検出が示され、一方、非トランスフェクトプロトプラストｃＤＮＡ試料から１８Ｓを増幅することによって、用いた方法を検証した（図５０）。
【０１９６】
光調節プロモーターの制御下におけるキメラｓａｃＢ遺伝子の発現をトランスフェクトしたプロトプラストにおいて観察した。産物は、ＲＴなし対照および鋳型なし対照では観察されなかった。ｓａｃＢ遺伝子発現は、試料９Ａおよび１２Ａに用いたベクターでトランスフェクトしたプロトプラストにおいて検出することができた。
【０１９７】
（実施例９）
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介したタバコリーフディスクの形質転換
本実施例は、上文に記載の発現カセットを用いて遺伝子操作したバイナリーベクターを運ぶアグロバクテリウムを用いたタバコリーフディスクの安定的な形質転換を説明する（図４８および図４９を参照）。
【０１９８】
序文
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介したリーフディスク形質転換の利用は、トランスジェニック植物を作出する効率的な方法である。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、植物に感染して細菌ＤＮＡを植物ゲノムに組み入れるための遺伝的機構を含む天然の双子葉植物病原体である。この能力の結果、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを、例えば特定の対象ＤＮＡをタバコに組み入れるためのクローニング媒体として採用することができる。
【０１９９】
この方法は、タバコにおけるモデルシステムの作製に用いて、対象遺伝子のｃＤＮＡ異種クローンの機能を評価することができる。
【０２００】
材料および化学薬品
装置および器具
水平流の層流フード（シリーズＨＷＳ１８０、ＣＬＹＤＥ−ＡＰＡＣ、Ｅｖａｎｓ Ｄｅａｋｉｎ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．の一部門、ウッドビルノース、南オーストラリア州５０１２、オーストラリア）、ロータリーシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ型ＲＣ−４０６、Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ、ＣＨ−４１０３ボットミンゲン、スイス）、スイングアウトローターを備える卓上遠心分離機（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００）、ピンセット（先曲がり（ｂｅｎｄ）、ｃａｔ ｎｏ．２１０８／１６０、Ｃｒｏｗｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロウビル、ビクトリア州３１７８、オーストラリア）、滅菌外科手術用メス刃（サイズ１１、ｃａｔ ｎｏ．１８３８、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｕｐｐｌｙ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、ミルペラ（Ｍｉｌｐｅｒｒａ）ＤＣ、ニューサウスウェールズ州１８９１、オーストラリア）を備えるメス柄（Ｎｏ３、ｃａｔ ｎｏ．ＳＨＮ３、Ｃｒｏｗｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロウビル、ビクトリア州３１７８、オーストラリア）を用いた。
【０２０１】
原液
全培地に必要なマクロ成分、ミクロ成分およびビタミンは、それらを添加する際に有用となるよう、濃縮ストック（マクロ成分ストック：１０倍濃縮；ミクロ成分およびビタミンストック：１００倍濃縮）として調製する必要がある。ミクロ成分以外の全ストックは、室温で調製する。ミクロ成分ストックの調製は、混合前に構成要素の加熱を必要とする。Ｎａ２−ＥＤＴＡおよびＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏは、混合前にそれぞれ４００ｍＬの蒸留水（全容量１０００ｍＬに対し）に溶解する必要がある。溶解した溶液を混合し、溶液が黄色に変色するまでｃａ．６０℃で加熱する。残りの構成要素を添加する前に溶液を冷ます。溶液を蒸留水で１０００ｍＬとする。全ストックを４℃で保存する。ホルモン［２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）およびカイネチン］を１Ｍ ＫＯＨに溶解し、蒸留水で希釈して１００ｍｇ／リットル濃縮ストックを調製する。
【０２０２】
培地
それらの個々の原料を終濃度で用いた培地の組成を別表１に示す：ＭＳミクロ、ＭＳマクロ、Ｂ５ビタミン、Ｌａｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地、洗浄培地、ＰＣ培地、ＳＥＬ培地、ＲＭ培地およびＳＥＭ培地。
【０２０３】
化学薬品
２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、活性炭、チメンチン（同じ濃度のセフォタキシムに代替可能）、ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）、ゼアチン、ＡｇＮＯ３、リファンピシン、寒天（Ｄｉｆｃｏ、Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ、ｃａｔ．ｎｏ：０１４０−０１）はゲル化剤とし用いる。他の化学薬品（ＰＥＧ４０００、Ｔｗｅｅｎ８０、ＫＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２）は、ＢＤＨから購入し、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ））はＳｉｇｍａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ−８２５０）から、カナマイシン硫酸塩はＳｉｇｍａから、ハイグロマイシンＢはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから、Ｃａ（ＯＣｌ）２（ほぼ６５％）およびホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ）は、Ｒｏｔｈ ａｎｄ Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎからそれぞれ購入される。スクロースはＦｌｕｋａ（ｃａｔ．ｎｏ：８４１００）から購入した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）「Ｍ」（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎ（商標）、グリニッジ、コネチカット州０６８３６、米国）は、封密用テープとして用いた。滅菌使い捨て瓶上型フィルター（０．２μｍ ｖａｃｕｃａｐ９０；ｃａｔ．ｎｏ．４６２２、Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、チェルトナム、ビクトリア州３１９２、オーストラリア）および使い捨てフィルターユニット（０．２μｍ；ｃａｔ．ｎｏ．１６５３４、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ、３７０７０ゲッティンゲン、ドイツ）をフィルター滅菌に用いた。滅菌使い捨てピペット：１ｍＬ＿（ＴＲＰ（登録商標）；ｃａｔ．ｎｏ．９４００１）、５ｍＬ＿（ＴＲＰ（登録商標）；ｃａｔ．ｎｏ．９４００５）および１０ｍｌ＿（ＴＲＰ（登録商標）；ｃａｔ．ｎｏ．９４０１０）は全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｔｙ． Ｌｔｄ．、モルグレイブ、３１７０オーストラリア製であり、ねじ蓋付き滅菌プラスチック製遠心チューブ（１４ｍＬ、ＴＲＰ（登録商標）；ｃａｔ．ｎｏ．９１０１６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、モルグレイブ、３１７０オーストラリア）、滅菌プラスチック製ペトリ皿（９０×１４ｍｍ；ｃａｔ．ｎｏ．８２．９９２３．４８４および６０×１４ｍｍ、ｃａｔ．ｎｏ．８３．１８０１．０１１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ（登録商標）Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、テクノロジーパーク、南オーストラリア州５０９５、オーストラリアならびに９０×２０ｍｍ；ｃａｔ．ｎｏ．６６４１６０、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ、７２６３６フリッケンハウゼン、ドイツ）およびオートクレーブ可能培養容器（２５０ｍＬ、ｃａｔ．ｎｏ．７５．９９２２．５１９、Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ、テクノロジーパーク、南オーストラリア州５０９５、オーストラリア）を用いた。
【０２０４】
植物材料
Ａ）Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ１の滅菌シュート培養物を利用することができる。これは、次亜塩素酸塩溶液［１．４％（ｗ／ｖ）Ｃａ（ＯＣｌ）２、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０］中で１５分間表面滅菌し、滅菌蒸留水中で３〜４回リンスした後、０．８％（ｗ／ｖ）寒天で固形化した半分に薄めたＭＳ培地（別表１）上に発芽のため播種した、対応する種子から確立する。２〜３枚の葉をつけたシュートを切り出し、２５０ｍＬ培養容器内の０．８％（ｗ／ｖ）寒天で固形化したＭＳ培地上で２５℃、１６ｈ／ｄ明期（２０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）で培養する。根の生えたシュートを、６週間の間隔で使用前に茎切断として数回継代培養する。
Ｂ）ガラス温室で育成したＮ．ｔｏｂａｃｕｍを利用してもよいが、後述［Ｉ．Ｂ）］の通り葉の表面滅菌が必要である。植え付けが深過ぎないこと、また湿り気が十分であることを確実にしつつ、種子を滅菌土壌に植える。１６ｈ／ｄ明期（２０ｕｍｏｌｍ“２ｓ”１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）条件下、２５℃で培養し、Ｏｓｍｏｃｏｔｅスローリリース肥料を用いて施肥する。
Ｃ）リーフディスク形質転換に利用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株はＡＧＬ１である。
【０２０５】
Ｉ．タバコリーフディスクをベクターｐＢｉｎｈｐｈ２００で形質転換するためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの調製
形質転換したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１の前培養をタバコ形質転換日の２日前に開始し、滅菌条件が維持されていることを確実にする（ｐＢｉｎｈｐｈ２００のＩＤカードについては別表２を参照）。
１．−７０℃で凍結したグリセロール細菌ストックの表面を接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）用ループで掻き取り、滅菌チューブ内の２ｍＬのＬＢ（２０ｍｇ／ｍＬリファンピシン＋１０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含む）に接種する。２４時間、２８℃、１５０ｒｐｍでインキュベートする。
２．４ｍＬのＬＢ＋抗生物質（１２ｍＬ滅菌チューブ内）に０．２５ｍＬの前記２４時間前培養物を接種する。６〜７時間、２８℃でインキュベートする。
３．２５ｍＬの抗生物質なしＬＢ（１５０ｍＬ滅菌フラスコ内）に０．０２５ｍｌの前記６〜７時間前培養物を接種し、一晩２８℃、１５０ｒｐｍでインキュベートする。
４．２５ｍｌの前記一晩前培養物に２５ｍｌのＬＢを加え、２８℃でさらに９０分間、１５０ｒｐｍで培養を継続する。
５．５０ｍｌの前培養物を遠心チューブに移し、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ卓上遠心分離機において１２分間、２，０００ｒｐｍ、室温でスピンする。
６．上清を除去し、ペレットを２０ｍＬのＷＭに穏やかに再懸濁する。ＯＤ６００を測定する。細菌懸濁液にさらにＷＭを加え、最終ＯＤ６００を０．４５とする。この調製物をステップＩＩＩ）の１に用いる。
【０２０６】
ＩＩ．リーフディスクの調製
Ａ）タバコシュート培養物を用いたリーフディスクの調製
１．層流において、ＭＳ培地上で培養したタバコ植物体から４〜６枚の葉を収集する。葉をＷＭの入った１．５×９ｃｍペトリ皿に置く。メスを用いて主脈を除去し、葉組織をほぼ１ｃｍ２四方に切る。この時点で、組織またはリーフディスクは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＧＬ１）による形質転換の準備が整った。ディスクは１時間以内に形質転換しなければならない。
Ｂ）非滅菌タバコ組織を用いたリーフディスクの調製
１．ガラス温室で育成したタバコ植物体から４枚の若い葉（ほぼ８ｃｍの長さ）を収集する。
２．葉を７０％エタノールの入った滅菌ビーカー内に置き、アルミホイルで覆い、円軌道シェーカー（Ｂｉｏ−Ｌｉｎｅ円軌道シェーカー、Ｅｄｗａｒｄｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）上で１分間、穏やかに旋回させる。
３．７０％エタノールを除去し、１％Ｃａ（ＯＣｌ）２に交換する。組織を８分間旋回させる。葉を滅菌水中で少なくとも３回洗浄する。
４．層流において主脈を除去し、残りの葉組織をほぼ１ｃｍ２四方に切る。調製したディスクをＷＭの入った１．５×９ｃｍペトリ皿内に置く。この時点でディスクは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＧＬ１）による形質転換の準備が整った。
【０２０７】
ＩＩＩ．リーフディスクとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのインキュベーションおよび共存培養
１．ＷＭ（リーフディスク調製における最後のステップのもの）をアグロバクテリウム培養物に交換し、１〜２分間インキュベートする。
２．細菌懸濁液を除去し、外植片をＷＭで短時間リンスする。ＰＣ培地上に播く前に、滅菌ナプキンで外植片を拭き取る。３日間共存培養するため、育成室（１６ｈ／ｄ明期（２０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）条件、２５℃）内に置く。
【０２０８】
ＩＶ．アグロバクテリウムを介した形質転換後のリーフディスクの前再生
１．外植片（５／プレート）をＳＥＬ培地に移し、育成室にさらに７日間戻しておく。
【０２０９】
Ｖ．再生
１．外植片（５／プレート）をＲＭに移し、育成室に戻す。シュート形成は３〜６週間以内に起こるであろう。４週間後に外植片を新しいＲＭに移す。
２．カルスが大きくなり過ぎたら、特に培地に接触していないシュートがある場合、メスを用いてカルスを分割する。できるだけ多くのシュートを選抜に曝露させる。
【０２１０】
ＶＩ．シュートの伸長および根の発達
１．選抜８週間後、あるいは選抜中の非形質転換対照外植片が死滅したとき、緑色のシュート（５／プレート）を９×２ｃｍペトリ皿内のＳＥＭ培地（ＩＢＡ（１ｍｇ／Ｌ）を含む）に移す。４〜５週間で根が出てくる筈である。
【０２１１】
ＶＩＩ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ小植物発達
１．根が出たら、根の生えた小植物を組織培養容器内のＳＥＭ培地に移す。
【０２１２】
参考文献
Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｃ．Ｎ．Ｊｒ．、Ａｄａｎｇ、Ｍ．Ｊ．、Ａｌｌ、Ｊ．Ｎ．、Ｒａｙｎｅｒ、Ｐ．Ｌ．、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ、Ｓ．およびＰａｒｒｏｔｔ、Ｗ．Ａ．（１９９６年）Ｉｎｓｅｃｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｄｏｓａｇｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｃａｎｏｌａ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｃｒｙｌＡｃ ｇｅｎｅ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１１２巻：１１５〜１２０頁 。
【０２１３】
別表
【０２１４】
【表２】
【０２１５】
【表３】
【０２１６】
【表４】
【０２１７】
【表５】
（実施例１０）
同じ発現カセットで改変したバイナリーベクターを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いたフローラルディップ法によるシロイヌナズナ（ＡＲＡＢＩＤＰＯＳＩＳ）の安定的な形質転換
電気的形質転換受容性のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞の調製
実験手順
１．−８０℃凍結グリセロールストックから、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＧＬ１株）を２０ｍｇ／Ｌリファンピシンおよび１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＭＧＬ寒天上に画線培養し、２７℃で２日間インキュベートする。
２．５ｍｌのＭＧＬを５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブ内で測定し、リファンピシン２０ｍｇ／Ｌおよびアンピシリン１００ｍｇ／Ｌの終濃度となるよう加える。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＧＬ１のシングルコロニーを接種する。
３．１５０ｒｐｍの円軌道シェーカー上の傾いた試験管立てにおいて（ｃａ．３０度）２７℃で２４時間インキュベートする。
４．夕方、２０ｍｇ／Ｌリファンピシンおよび１００ｍｇ／Ｌアンピシリン（ａｍｐｌｉｃｉｌｌｉｎ）（５００ｍｌフラスコ内）を含む１００ｍｌのＭＧＬに、５００μｌの一晩培養物を接種する。
５．２７℃で一晩、１５０ｒｐｍの円軌道シェーカー上で０．４〜０．６（最大０．６）の間のＯＤ６００が得られるまでインキュベートする。過増殖した場合は下のコメントを参照。
６．オートクレーブしたＪＡ１０遠心チューブに細胞を移し、氷上で１０分間冷やす。
７．ＪＡ１０ローターを用いて１０分間、９０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離する。
８．培養に用いた５００ｍｌフラスコに注ぐことによって、上清を慎重に廃棄する（ペレットは非常に安定的というわけではない）。
９．２０ｍｌの氷冷１０％グリセロールをＪＡ１０遠心チューブ内のペレットに加え、ボルテックス撹拌することによりペレットを再懸濁する。
１０．懸濁液をＪＡ２０遠心チューブに注ぎ、ＪＡ２０ローターを用いて１０分間、１００００ｒｐｍ、４℃でスピンする。
１１．５００ｍｌフラスコに注ぐことにより上清を廃棄する。
１２．１５ｍｌの氷冷１０％グリセロールをペレットに加え、ピペッティングにより再懸濁する。ＪＡ２０ローターにおいて１０分間、１００００ｒｐｍ、４℃で遠心分離する。
１３．ステップ１１および１２を２回繰り返す。
１４．ペレットを１ｍｌの氷冷１０％グリセロールに再懸濁し（ピペットまたはボルテックスによる）、滅菌マイクロチューブに移す。
１５．微量遠心管において３分間、１３０００ｒｐｍ、４℃でスピンする
１６．最後に、ペレットを１ｍｌの１０％氷冷グリセロールに再懸濁する。
１７．標識された１．７ｍｌマイクロチューブに５０μｌバッチのアリコートを作成し、液体窒素中でスナップ凍結する。
１８．液体窒素からチューブを取り出し、コンピテント細胞を−８０℃で保存する。
【０２１８】
コメント
Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細菌培養物を取り扱う間、ゴム手袋を着用する。全細菌廃棄物を５００ｍｌフラスコ内に集め、オートクレーブする。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの１００ｍｌ培養物が過増殖したら、２０ｍｇ／Ｌリファンピシンを含む新しいＭＧＬ培地で１／３〜１／４希釈し、さらに１〜２時間インキュベートする。
【０２１９】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのエレクトロポレーションによる形質転換
実験手順
１．ジーンパルサーキュベットホルダーを氷上で予冷する。
２．コンピテントアグロバクテリウム（ＡＧＬ１）細胞のアリコートを−８０℃から取り出し、氷上で解凍する。
３．ジーンパルサー背面のメインスイッチを入れる。電圧を２．５ｋＶに調整し（ディスプレイ上に「２．５」と記録されるまで「ｒａｉｓｅ」ボタンを使う）、静電容量２５μＦＤおよび抵抗６００Ωにする。
４．５０μｌ以上の容量の解凍した細胞に０．１μｇのＤＮＡを加える。
５．ピペッティングにより混合し、細胞／ＤＮＡ混合液を予冷した０．２ｃｍ ｇａｐジーンパルサーキュベットに移す。
６．両方の電極に細胞が触れるよう、細胞をキュベット底面に慎重にタップまたは振盪する。
７．キュベットの外側をティッシュペーパーで乾かし、キュベットをキュベットホルダー内に置く。キュベット上の切れ込みは正確な方向付けを確実にする。キュベットがチャンバー底の接触点の間に収容されるまでキュベットホルダーをチャンバー内にスライドさせる。
８．ビープ音がするまで両方の赤いボタンを押すことによって細胞にパルスを与える。この機械は、充電の間はＣＨＧを表示し、放電の際にビープ音を出す。細胞を戻して１分間氷上に置いて回復を助ける。
９．ガラス製注入器を用いて１ｍｌのＬＢ培地をキュベット内の細胞に加える。
１０．懸濁液を吸って吐いて混合し、滅菌１５ｍｌチューブに移す。
１１．傾いた試験管立て（ｃａ．３０度）を用いて１５０ｒｐｍの円軌道シェーカー上で１〜２時間、２７℃でインキュベートする。
１２．９ｍｌのＬＢを細胞懸濁液に加えて徹底的に混合し、２０ｍｇ／Ｌリファンピシンおよび適切な抗生物質（例えば、ｐＰＺＰシリーズのベクターに対しては１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン）を含むＬＢプレート上にこの培養物１００μｌを播く。この懸濁液１００μｌを９００μｌのＬＢブロスの入った１．７ｍｌマイクロチューブに移し、徹底的に混合し、適切な抗生物質を含む別のＬＢプレート上にその１００μｌを播く。上述の懸濁液から１００μｌを取り分け、新しい１．７ｍｌマイクロチューブ内に置き、９００μｌのＬＢブロスを加える。徹底的に混合し、その１００μｌを適切な抗生物質を含む別のＬＢプレート上に播く。
１３．プレートをパラフィルムで封じ、大きなシングルコロニーが目視できるようになるまで２７℃で２〜３日間インキュベートする。
【０２２０】
形質転換アグロバクテリウムの保存
実験手順
１．５０ｍｌ滅菌チューブ内で２０ｍｇ／Ｌリファンピシンおよび適切な選抜抗生物質（すなわち、ｐＺＰシリーズに対しては１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、ｐＢｉｎシリーズに対しては５０ｍｇ／Ｌカナマイシン）を含む５ｍｌのＬＢブロスにシングルコロニーを接種する。翌日に増殖の程度を密接にモニターできるよう、この操作は早朝に行うとよい。
２．チューブを暗所において２７℃で２４〜３６時間、２５０ｒｐｍで振盪しつつインキュベートする。インキュベーションの最初の２４時間の後、培養物の増殖を定期的に観察する。細胞が活発に増殖したら（非常に目に見える）インキュベーションをやめる。濁りの最初の徴候が見えた直後に、急速な増殖が行われるであろう。増殖時間は、個々の株および形質転換体に依存する。
３．各培養物をチェックして、ＡＧＬ１が望ましいバイナリーベクターを含むことを立証するべきである。この操作は、セクション５．２に記されているプロトコールを用いて行う。
４．キュベット内に培養物の５００μｌアリコートを作成する。適切な抗生物質を含む５００μｌのＬＢブロスでブランク作成して、各読み込み値の間からＯＤ６００読み込み値を測定する。
５．ＯＤ６００読み込み値が０．８から１．０の間の範囲となるまで培養物を増殖させる。
６．滅菌１５ｍｌチューブ内に、５．０ｍｌの培養物および５．０ｍｌの保存ストックを加える。ステップ７に進む前に徹底的に混合する。
７．しっかりと標識した滅菌クリオチューブ内に５００μｌのアリコートを作成する。液体窒素中でスナップ凍結する前に全チューブを反転する。必要とされるまで−８０℃で保存する。ＰＣＲ陰性であることが示された場合、全ストックを廃棄する。
【０２２１】
アグロバクテリウムのＰＣＲ解析
１．１μｌのアグロバクテリウム培養物を滅菌ＰＣＲチューブ内の９μｌの滅菌ＭＱ Ｈ２Ｏに加える。
２．細胞を９８℃で５分間インキュベートする。チューブを氷に移す。
３．１０μｌの調製済２×ＰＣＲマスターミックスを加える。１０μｌの２×ＰＣＲマスターミックスは、次のものを含む。
１０×Ｄｙｎａｚｙｍｅバッファー ２μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ １．０μｌ
１０μＭフォワードプライマー（１０μＭ） １．０μｌ
１０μＭリバースプライマー（１０μＭ） １．０μｌ
Ｄｙｎａｚｙｍｅ ＩＩポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒｉｓｅ） １μｌ
ＭＱ水 ３μｌ
４．陽性対照（５０ｎｇのオリジナルプラスミドＤＮＡ）および陰性対照（鋳型ＤＮＡなし）を含む。標準ＰＣＲ条件用いて合計３５サイクル行う。
【０２２２】
１．９５℃、３分間
２．９４℃、３０秒間
３．５５℃、３０秒間
４．７２℃、１分間
５．７２℃、１０分間
ステップ２〜４を合計３５回繰り返す。
５．ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで解析する。
【０２２３】
コメント
アグロバクテリウムを取り扱う間、手袋を着用する。あらゆる細菌およびＤＮＡ廃棄物を集めてオートクレーブする。ジーンパルサーキュベットは再使用可能である。蓋は７０％ＥｔＯＨに浸し、キュベットは水を張って閉鎖した入れ物の中でオートクレーブしてアグロバクテリウムを除去する。その後、キュベットは７０％ＥｔＯＨ中に保存し、乾かした後に再使用することができる。
【０２２４】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのｉｎ ｐｌａｎｔａ形質転換
実験手順
植物材料の調製
１．実生用方形ケース（ｐｕｎｎｅｔ）に種子栽培ミックスを充填し、盛り土を形成する。２層の防鳥ネットで覆い、ゴムバンドで各端を固定する。トレイに張った水の中に方形ケースを入れることによって、土壌を水で満たす。方形ケース当たりほぼ４０体の植物を得るのに十分な種子を播く。
２．方形ケースを４℃に２〜３日間置くことにより、種子を春化処理する。方形ケースを２２℃、蛍光灯（連続照明、５５μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１）下の育成チャンバーに移し、１週間に１回、Ｍｉｒａｃｌｅ−ＧｒｏまたはＡｑｕａｓｏｌを与える。
３．一次花序（ｂｏｌｔ）が現れたら摘心し、二次花序を概ね２〜１０ｃｍの丈になるまで生長させる（概ね４〜６日間かかり、植物体は多数の未開花の花蕾をつけ、長角果（ｓｉｌｉｑｕｅ）は殆どない筈である）。ピンセットを用いて長角果または開花した花を全て慎重に取り除く。気孔が開くよう浸潤前に植物に十分に水をやる。浸潤前に土壌を水で飽和させて細菌溶液が土壌に吸収されるのを最小限に抑える。
４．ＬＷＳに詳細を入力し、バーコードを作成する。ＬＷＳバーコード詳細によって方形ケースを標識する。
【０２２５】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの調製
１．朝に、適切な選抜抗生物質（すなわち、ｐＰＺＰベクターに対し１００ｍｇ／ｍｌのスペクチノマイシン）を含む２００ｍｌのＬＢ培地に、アグロバクテリウム保存ストック（セクション５．１）の単一のスターター培養物５００μｌを接種する。２５０ｒｐｍの円軌道シェーカー上で２４時間、２７℃でインキュベートする。およそ２個の方形ケースの植物を浸潤させるには２００ｍｌの培養物で十分である。
２．一晩培養した培養物を５００ｍｌ遠心分離ボトルにおいて５５００ｇ、室温、１５分間遠心分離して細胞をペレット化させる。可能な限り液体を除去しつつ上清を廃棄する。ＯＤ６００読み込み値が約０．７〜０．９となるようペレットを浸潤培地（別表１を参照）に再懸濁する。
【０２２６】
アグロ浸潤
１．アグロバクテリウム溶液の半量を２５０ｍｌ容器内に置く。
２．方形ケースを逆さにし、ロゼット葉を含む植物体全体を細菌溶液に浸漬し、穏やかに振盪して気泡を追い出す。植物を２分間共培養する。
３．方形ケースを取り出して短時間水を抜くが、植物の周りの薄い水膜はそのままにしておく。植物をプラスチックフィルムで覆って湿度を維持し、育成室に戻して直射光を避ける。廃液をオートクレーブし、正しい処分のための化学廃棄物ドラム缶に捨てる。
４．Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの全方形ケースに対してステップ１〜３を繰り返して形質転換する。
５．詳細をＬＷＳに入力し、バーコードを作成する。個々の方形ケースをＬＷＳバーコード詳細で標識する。
６．翌日、鉢の覆いを取って直射光に戻し置く。植物が十分に発達した長角果をつけるまで植物に水をやる。
【０２２７】
種子採取
１．植物が完全に乾ききったら、長角果をつけた茎を取ってこれを紙袋の中に入れ、１週間３７℃で乾かしておく。袋をＬＷＳバーコードで標識する。乾いた長角果を紙袋の中で押しつぶす。この操作は長角果を粉々にして種子を遊離させる。
２．２００ミクロンの篩を新しいＡ４用紙１枚の上に置き、そこに種子および押しつぶされた長角果を移し入れる。篩を穏やかにタップし、その下にある用紙の上に種子を落とす。篩の中に残った植物材料を廃棄する。植物材料の大部分が除去されるまでこのプロセスを繰り返す（注記：植物材料は次のステップにおける汚染源となり得る）。種子を１．７ｍｌマイクロチューブ内に入れ、ＬＷＳバーコード詳細で標識する。チューブを小型のマニラ封筒の中に置き、ＬＷＳバーコードで標識する。このバーコードは、元々の形質転換事象と関連することに留意する。
３．種子を４℃保存に移す前に、種子を−２０℃で２４時間保存する。
【０２２８】
陽性Ｔ１トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ植物の選抜
種子の表面滅菌
１．層流フードで作業しつつ、滅菌する種子（１５０×１５ｍｍプレートにつき、４０ｍｇ＝ほぼ２０００個の種子）を２．０ｍｌマイクロチューブ内に置く。
２．１０００μｌの７０％エタノールを加え、２分間放置する。
３．エタノールを除去し、１０００μｌの種子滅菌用溶液（４％塩素：水：５％ＳＤＳがそれぞれ８：１５：１の比率）を加えてボルテックス撹拌によって徹底的に混合する。
４．Ｒａｔｅｋ「観覧車（ｆｅｒｒｉｓ ｗｈｅｅｌ）」上にチューブを置き、種子と溶液を確実に混合し、１０分間放置する。
５．層流において滅菌用溶液を除去して滅菌水に交換する。チューブ（複数可）をボルテックス撹拌し、ベンチトップ遠心分離機で３０秒間スピンして種子を沈降させる。水を除去し、さらに１ｍｌの滅菌水に交換する。種子洗浄ステップは、目視できる泡が出なくなるまで繰り返すべきである（少なくとも４回）。最後の洗浄の後、約２００μｌの水を残して種子を浸す。
【０２２９】
Ｔ１形質転換体の選抜
１．適切な選抜抗生物質（例えば、ＰＺＰ２００シリーズに対し８ｍｇ／Ｌのハイグロマイシン）を含む選抜発芽培地（ＳＧＭ）を用いて１５０×１５ｍｍプレートを調製する。チメンチン（２５０ｍｇ／Ｌ）を入れて、アグロバクテリウムの増殖を阻害する。各プレート当たり約１２５ｍｌのＳＧＭが必要とされる。
２．層流フード内で作業しつつ、ＳＧＭ寒天プレートの表面にわたって平行に滅菌メスをすべらせる（図４を参照）。この操作は種子を広げるのに役立つ。
３．先端を切り取った滅菌１ｍｌチップを用いて、滅菌種子をピペットで取ってプレート上に置く。滅菌使い捨て延展器（ｓｐｒｅａｄｅｒ）を用いて種子を分布させる。
４．種子を４℃で２日間低温処理し、次に連続的な蛍光灯（５５μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１）下、２２℃で育成する。
５．推定形質転換体は、６〜８葉ステージになったら土壌に移すことができる。ピンセット１本を用いて、根を確実にインタクトに保ちつつ植物を組織培養培地から慎重に取り出す。ＡＲＡＳＹＳＴＥＭを用いて湿ったｉｎ−ｖｉｔｒｏ混合土壌に移植する（別表２の図５を参照）。プラスチックチューブで覆う。新しいＬＷＳバーコードを作成し、チューブを標識する。数日間チューブの上端をプラスチックラップで覆い、回復を助ける。
【０２３０】
導入遺伝子組み込みの立証：ゲノムＤＮＡソースとしてのアルカリ処理した葉組織
推定形質転換体を土壌に移して３日後、次のプロトコールを用いて個々の植物体を導入遺伝子の存在に関して分子的に特徴付けることができる。
１．試験するアルカリ処理した葉組織それぞれに対し、１×ＰＣＲバッファーミックスを調製する（詳細は後述を参照）。
２．１．７ｍｌマイクロチューブ内で、２００μｌの０．２５Ｍ ＮａＯＨを小型の若い葉（Ｔ１植物から採取）に加える。
３．チューブを沸騰水に２分間浸漬する。注記：煮沸の間に蓋がはじけ開くのを防ぐため、蓋をマイクロチューブ蓋ロックで固定する、あるいは蓋を細針で刺し通すこと。
４．煮沸後、チューブを水から取り出して、２００μｌの０．２５Ｍ ＨＣｌおよび１００μｌの０．２５％（ｖ／ｖ）ｉｇｅｐａｌ［０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０］を加える。チューブを沸騰水にさらに４分間浸漬する。
５．アルカリ処理した葉のごく一部（ほぼ２ｍｍ２）を取り出し、予め調製したＰＣＲミックス中に置く。
【０２３１】
１０×ＰＣＲ反応バッファー（Ｍｇ（ＳＯ４）・７Ｈ２Ｏ含有） ５．０ｍｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ １．０μｌ
１０μＭフォワードプライマー １．０μｌ
１０μＭリバースプライマー １．０μｌ
ＰＷＯ ＤＮＡポリメラーゼ １．０μｌ
ＭＱ Ｈ２Ｏ ４１．５μｌ
６．標準ＰＣＲ条件を用いて３５サイクルを行う。
【０２３２】
１．９５℃、３分間
２．９４℃、３０秒間
３．５５℃、３０秒間
４．７２℃、１分間
５．７２℃、１０分間
ステップ２〜４を合計３５回繰り返す。
７．ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで解析する。
【０２３３】
注記：初回にアルカリ処理した葉組織を用いてインサートが増幅されない場合、組織をさらに２分間再度煮沸して導入遺伝子のＰＣＲ増幅を繰り返す。この第二のＰＣＲが失敗したら、Ｑｉａｇｅｎ植物ゲノムＤＮＡ抽出キットを用いて葉組織から少量のゲノムＤＮＡを抽出する。ＬＷＳをアップデートする。
【０２３４】
種子採取
１．植物が完全に乾ききったら、長角果をつけた茎を取ってこれを紙袋の中に入れ、１週間室温で乾かしておく。袋をＬＷＳバーコードで標識する。乾いた長角果を紙袋の中で押しつぶす。この操作は長角果を粉々にして種子を遊離させる。
２．２００ミクロンの篩を新しいＡ４用紙１枚の上に置き、そこに種子および押しつぶされた長角果を移し入れる。篩を穏やかにタップし、その下にある用紙の上に種子を落とす。篩の中に残った植物材料を廃棄する。植物材料の大部分が取り除かれるまでこのプロセスを繰り返す（注記：植物材料は次のステップにおける汚染源となり得る）。種子を１．７ｍｌマイクロチューブ内に入れ、ＬＷＳバーコード詳細で標識する。チューブを小型のマニラ封筒の中に置き、ＬＷＳバーコードで標識する。このバーコードは、元々の形質転換事象に関連することに留意する。
３．種子を４℃で保存する前に、Ｔ２種子を−２０℃で２４時間保存する（陽性トランスジェニックＴ２植物の選抜における真菌汚染の見込みを低減させるのに有用である）。
【０２３５】
コメント
ＡＲＡＳＹＳＴＥＭトレイ、ホルダー等を含む、アグロバクテリウムと接触したあらゆる入れ物は、市販の漂白剤および７０％エタノールを用いて徹底的に消毒しなければならない。
【０２３６】
この実験に依存し、Ｔ１植物を表現型特性評価、すなわちレポーター遺伝子解析に用いることができ、これらの系統はＴ１ステージを越えて継続する必要はないと思われる。
【０２３７】
ホモ接合型Ｔ３種子の作出
序文
詳細に後述するプロトコールは、シングルコピーの導入遺伝子を有するホモ接合型植物の選抜に用いた方法を説明する。浸潤方法を用いた導入遺伝子のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａへの組み込みは、子房の受精前に雌しべで起こる。したがって、浸潤によって産生されたあらゆる種子で導入遺伝子を有するものはＴ１であると考えられる。Ｔ１種子が発芽してＴ１植物を産生し、これは次にＴ２種子を産生する。目標は、単一のインサートを有し導入遺伝子を発現する独立したトランスジェニック植物を、構築物につき少なくとも５個体得ることである。Ｔ１種子用に作成した各ＬＷＳバーコードは、別個の形質転換事象を表す。各Ｔ１植物のＴ２種子を収集するとき、新たなＬＷＳバーコード番号を付与する。このＬＷＳバーコードは、元々の形質転換事象に関する。
【０２３８】
Ｔ３種子作出のためのＴ２形質転換体の選抜
１．層流フード内で作業しつつ、約１００個のＴ２種子を表面滅菌する（セクション７．１を参照）。
２．２５０ｍｇ／Ｌチメンチン（ｔｉｍｅｔｉｎ）および８ｍｇ／Ｌハイグロマイシン（ｐＰＺＰ２００−３５ｓ−ｈｐｈ−３５ｓｔに対する選抜剤）を含む選抜ＳＧＭ培地上に、１プレート当たり約２５個の種子を播く（合計４枚）。
３．種子を４℃で２日間低温処理し、次に連続照明（５５μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１）、２２℃の育成室に移す。
４．２週間後、ハイグロマイシンに対して抵抗性または感受性を有する植物の分離解析を行う。
５．推定形質転換体が６〜８葉ステージになったら、Ａｒａｓｙｓｔｅｍを用いて少なくとも１０個体の植物を土壌に移す。新たなＬＷＳバーコードを作成し（元々の形質転換と関連する）、各植物体をバーコードで個々に標識する。チューブをプラスチックフィルムで数日間覆って回復を助ける。
６．個々の植物それぞれが組み込まれた導入遺伝子を有することを確認するため、アルカリ処理した葉組織の方法を用いる（セクション７．３）。ＬＷＳをアップデートする。
７．植物が完全に乾ききったら、長角果をつけた茎を取ってそれを紙袋に入れ、１週間３７℃で乾かしておく。袋をＬＷＳバーコードで標識する。乾いた長角果を紙袋の中で押しつぶす。この操作は長角果を粉々にして種子を遊離させる。
８．２００ミクロンの篩を新しいＡ４用紙１枚の上に置き、そこに種子および押しつぶされた長角果を移し入れる。篩を穏やかにタップし、その下にある用紙の上に種子を落とす。篩の中に残った植物材料を廃棄する。植物材料の大部分が取り除かれるまでこのプロセスを繰り返す（注記：植物材料は次のステップにおける汚染源となり得る）。種子を１．７ｍｌマイクロチューブ内に入れ、ＬＷＳバーコード詳細で標識する。チューブを小型のマニラ封筒の中に置き、ＬＷＳバーコードで標識する。このバーコードは、元々の形質転換事象に関連することに留意すること。
９．種子を４℃保存に移す前に、種子を−２０℃で２４時間保存する（陽性トランスジェニックＴ３植物の選抜における真菌汚染の見込みの減少に役立つ）。
【０２３９】
分離解析
１．ハイグロマイシンに対して抵抗性または感受性のいずれかを有する各系統から得られたＴ２植物の総数を採点する。
２．Ｔ−ＤＮＡが１遺伝子座に挿入されている場合、抵抗性植物の感受性植物に対する比率は３：１となる筈である。Ｔ−ＤＮＡ遺伝子座が２遺伝子座に挿入されている場合、抵抗性植物の感受性植物に対する比率は１５：１となる筈である。Ｔ−ＤＮＡが３以上の遺伝子座に挿入されている場合、抵抗性植物の感受性植物に対する比率は＞１５：１となる筈である。
３．カイ２乗（χ２）統計検定を用いて、分離データが特定の仮説にどの程度適合するか決定する。
４．導入遺伝子のシングルコピーを含むことをカイ２乗解析が示すトランスジェニック系統の育成を継続する。
５．ＬＷＳをアップデートする。
導入遺伝子組み込みの立証：ゲノムＤＮＡソースとしてのアルカリ処理した葉組織
１．各Ｔ２植物につき小型の葉を１枚収集する。
２．アルカリ処理した葉のプロトコール（セクション７．３）に従い、導入遺伝子の存在を決定する。
３．ＬＷＳをアップデートする。
【０２４０】
ホモ接合型Ｔ３系統の選抜
１．単一の導入遺伝子挿入を含むことを示すＴ２トランスジェニック系統の育成を継続する。
２．Ｔ２種子を採取し（セクション８．２）、ＬＷＳをアップデートして新たなバーコードを作成する。
３．ほぼ４０個のＴ３種子をＳＧＭ上で発芽させる。
４．２週間後、ハイグロマイシンに対し抵抗性または感受性のいずれかを有する各系統由来のＴ３植物の総数を採点する。
５．ホモ接合型Ｔ３系統は、感受性植物の不在によって示されるであろう。
６．推定形質転換体が６〜８葉ステージになったら、Ａｒａｓｙｓｔｅｍを用いて少なくとも２０個体の植物を土壌に移す。新たなＬＷＳバーコードを作成し、各植物を個々にバーコードで標識する。チューブをプラスチックフィルムで数日間覆い回復を助ける。
７．系統の単一挿入がホモ接合型であることをさらに検証するため、アルカリ処理した葉組織の方法を用いて（セクション７．３）、全植物が導入遺伝子を含むことを確認する。ＬＷＳをアップデートする。
８．推定ホモ接合型系統から十分な材料を収集してサザンハイブリダイゼーションを行い、導入遺伝子の組み込み数を確認する。ＬＷＳをアップデートする。
９．セクション８．２に記されているプロトコールに従って、種子をＴ３ホモ接合型系統から収集する。
【０２４１】
【化１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物におけるフルクタン生合成の改変に関し、特に、光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作する方法ならびに関連する核酸および構築物に関する。
【０００２】
本発明はまた、植物バイオマスの増加に関し、特に、植物におけるシュートおよび／または根の生長を含むバイオマス収量および／または収量安定性を増強する方法ならびに関連する核酸および構築物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
フルクタンは水溶性炭水化物の一種であり、その主要機能は、植物生長のために容易に利用できるエネルギー貯蔵を提供することである。フルクタンは、寒冷および乾燥耐性、分げつ生存率の上昇、持続性の増強、切断または被食後の良好な再生長、ストレスからの回復の改善、早春における生長ならびに栄養価の上昇等、草本における様々な有利な特徴に関連する。
【０００４】
草本および穀類におけるフルクタン合成および代謝は複雑である。フルクタンは、スクロースと結合した直鎖または分岐フルクトース鎖からなる。植物フルクタンの鎖長は、３から最大数百個のフルクトースユニットに及ぶ。異なる種類のフルクタンは、存在する結合の種類に基づいて識別することができる。ペレニアルライグラス（ｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｒｙｅｇｒａｓｓ）において、３種類のフルクタンが同定された。すなわちイヌリン、イヌリンネオシリーズおよびレバンネオシリーズであり、このフルクタンプロファイルには４種類のフルクトシルトランスフェラーゼ（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒｓｅ）（ＦＴ）酵素が関与する。酵素１−ＳＳＴ（スクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ）はフルクタン生合成における最初のステップを触媒し、一方、残りの酵素は成長中のフルクトース鎖を伸長させる（１−ＦＦＴ：フルクタン：フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ、６Ｇ−ＦＦＴ：６−グルコースフルクトシルトランスフェラーゼおよび６−ＳＦＴ：スクロース：フルクトース６−フルクトシルトランスフェラーゼ）。酵素１−ＦＥＨまたは６−ＦＥＨ（フルクトエキソヒドロラーゼ（ｆｒｕｃｔｏｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））は、フルクトース分子を遊離させることによりフルクタン鎖長を短縮する。
【０００５】
細菌は、高分子量フルクタンポリマーを合成するために１−ＳＳＴおよび１−ＦＦＴ活性の両方を含む単一のＦＴ酵素のみを利用する。大部分の細菌フルクトシルトランスフェラーゼは、フルクトース分子のβ−２，６結合によって特徴付けられるレバン型フルクタンを産生するが（レバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ））、一部の細菌からはイヌリン型フルクタン（β−２，１結合）を産生するイヌロスクラーゼ（ｉｎｕｌｏｓｕｃｒａｓｅ）が単離されている。
【０００６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＳａｃＢ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＳａｃＢ遺伝子およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来のＦＴＦ遺伝子を含む、少なくとも３種類の細菌レバンスクラーゼがトランスジェニック植物において発現した。これら細菌レバンスクラーゼの植物における発現は、ＤＰ数千の非常に高分子量のフルクタンの合成をもたらす（総説として非特許文献１を参照）。
【０００７】
フルクタンは、１５％の植物種における主要な非構造炭水化物を表し、飼料の質に重要な役割を果たす。高フルクタン食を摂取する反芻家畜は、動物能力の改善を示す。
【０００８】
草本において、ＦＴ遺伝子発現の遺伝子操作により、フルクタンのレベルおよび組成は茎および葉鞘で増加した。
【０００９】
しかし、経路内酵素の活性を操作することによる生化学的経路の操作は、その道筋において様々な酵素およびそれらの基質が相互作用し得るため、困難なものとなるであろう。
【００１０】
このため、特に植物における生化学的経路を操作するための改良法があることが望ましい。例えば、Ｌｏｌｉｕｍ属、Ｆｅｓｔｕｃａ属およびＢｒａｃｈｉａｒｉａ属等の飼料草の種；サトウキビその他の草本；ならびにソルガムおよびコムギやトウモロコシ等、他の穀類を含む植物におけるフルクタン生合成を操作する方法があり、これにより例えば、
・牧草地の生産性の改善、動物の生産性の改善および／または環境汚染の抑制をもたらす、牧草品質および／または収量が改善された飼料草、
・バイオエタノール生産用等のバイオマス収量が増強されたスイッチグラス、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ属、ソルガム（穀物、飼料およびエネルギー用ソルガム）、サトウキビおよびエネルギー用サトウキビ等、バイオエネルギー用草本および作物、
・穀物および／またはバイオマス収量が増加したコムギ、イネ、トウモロコシ、オオムギ等、穀類
の生産を促進することが望ましい。
【００１１】
フルクタン生合成経路に関与する数種の酵素をコードする核酸配列が特定の植物種で単離された。例えば、本出願人らの国際出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５号明細書は、Ｌｏｌｉｕｍ属およびＦｅｓｔｕｃａ属由来のフルクトシルトランスフェラーゼホモログについて記載している。しかし、依然として、植物におけるフルクタン生合成の改変に有用な、また植物体（ｐｌａｎｔ）の様々な部分におけるフルクタン蓄積を遺伝子操作するための材料が必要である。
【００１２】
国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２００９／００１２１１号明細書は、植物におけるフルクタン生合成の改変に有用な構築物について記載する。しかし、それら構築物は、好ましくは２以上のフルクタン生合成酵素の翻訳融合体をコードする融合遺伝子を含み、該遺伝子は、好ましくは植物フルクタン生合成遺伝子に相当する融合体を作り出す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃａｉｒｎｓ ＡＪ． Ｆｒｕｃｔａｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ． Ｊ Ｅｘｐｔ Ｂｉｏｌ（２００３）５４：５４９〜６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、先行技術に関連する問題または欠点の１または複数を克服、または少なくとも軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本出願人らは、細菌ＦＴ酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む構築物を用いて、光合成細胞におけるフルクタン生合成経路を空間的にリプログラミングすることにより、植物、例えば飼料草を栄養的に増強することおよび／または植物バイオマスを増加させることが可能であることを見出した。このプロセスを用いることによって、家畜によって先ず食べられる植物器官であり、通常フルクタンを蓄積できない葉身におけるフルクタン蓄積を駆動することが可能となる。このため、フルクタン、特に高い重合度を示すフルクタン（「高ＤＰフルクタン」）の蓄積は、草食動物がより利用しやすい栄養を提供する。フルクタンは茎および葉鞘に蓄積するが、葉フルクタンはＣＯ２同化が生長より優勢な期間においてのみ生成される。スクロースが合成される光合成細胞でフルクタン遺伝子を発現させることによって飼料草を栄養的に増強し、これによりフルクタン蓄積を葉身で優先的に駆動し、これを摂食する家畜にさらなるエネルギーを提供することができる。
【００１６】
飼料草におけるフルクタンは、反芻動物に食べさせる食餌におけるすぐに利用できるエネルギーに大いに貢献する。反芻胃における発酵過程は、大量のすぐに利用できるエネルギーを必要とする。反芻胃におけるすぐに利用できるエネルギーの改善は、反芻胃の消化効率を上昇させることができる。反芻胃消化における効率の上昇は、反芻動物に与えた飼料タンパク質のミルクまたは肉への変換の改善および窒素性廃棄物の減少をもたらす。
【００１７】
本出願人らは、寿命延長のために光合成細胞をリプログラミングすることにより、例えば葉の老化を遅延させることにより本発明の方法を促進することができ、植物バイオマスの増加に役立つことも見出した。
【００１８】
本出願人らは、細菌ＦＴ遺伝子をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む構築物が、２以上のフルクタン生合成酵素の翻訳融合体をコードする融合遺伝子を含む構築物よりも優れた結果を示し得ることを見出した。例えば１−ＳＳＴおよび１−ＦＦＴ活性の両方を含む細菌ＦＴ遺伝子の使用は、別々の遺伝子を融合するよりも技術的な困難が少なくなり、融合遺伝子を含む構築物と比べてより容易に植物に導入されるおよび／またはより良く機能する構築物をもたらすことができる。
【００１９】
例えば、例えば１−ＳＳＴおよび１−ＦＦＴ活性の両方を含む細菌ＦＴ遺伝子を発現することにより、植物ゲノムに独立的に組み込まれたこれら遺伝子の発現パターンの差に関連する課題を軽減し、その結果スクロース分子を、低い重合度（「低ＤＰフルクタン」）および高い重合度（「高ＤＰフルクタン」）を示すフルクタンに直接的に変換することができる。さらに、ＦＴタンパク質は、効率的なフルクタン生合成の代謝チャネルを形成することができる。
【００２０】
光合成細胞において低および高ＤＰフルクタンの蓄積をもたらす光合成細胞におけるＦＴ遺伝子の発現は、光合成抑制機構からの解放をもたらし、太陽エネルギーの獲得およびＣＯ２固定の増加を促進することができる。
【００２１】
このため、本出願人らは、光合成細胞の寿命延長のためのリプログラミングおよびフルクタン生合成の増強は太陽エネルギーの獲得を促進し、シュートおよび／または根の生長等、植物バイオマスの生産を増加させることを見出した。
【００２２】
さらに、低および高ＤＰフルクタンの蓄積は寒冷および乾燥等、非生物的ストレスに対する植物の耐性に関連づけられてきたため、また、根の生長増強および葉の老化遅延は植物の乾燥ストレス耐性に関係づけられてきたため、光合成細胞の寿命延長のためのリプログラミングおよびフルクタン生合成の増強は、収量安定性および植物の非生物的ストレス耐性を促進する。
【００２３】
したがって、本発明はその一態様において、植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作する方法であって、細菌フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含む方法を提供する。
【００２４】
「フルクタン生合成の操作」とは、一般に、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物におけるフルクタン生合成の増加を意味する。しかし、一部の適用では、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物においてフルクタン生合成を低減させる、あるいは改変することが望ましいであろう。例えば、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物のフルクタン生合成経路における特定の酵素の活性を増加または減少させることが望ましいであろう。
【００２５】
「光合成細胞」とは、光合成が行われる植物細胞を意味する。このような細胞は一般にクロロフィル色素を含む、あるいは緑色細胞として公知のものである。大部分の光合成細胞は、植物の葉に含まれる。好ましくは、本発明の遺伝的構築物は、維管束鞘細胞で発現し、より好ましくは葉肉および／または柔組織維管束鞘細胞で発現する。
【００２６】
「有効量」とは、前記植物またはそこから派生する植物体、植物種子もしくは他の植物部分において同定可能な表現型形質を生じるのに十分な量を意味する。このような量は、当業者であれば、植物の種類、投与経路その他の関連性のある要因を考慮に入れて容易に決定することができる。このような当業者は、適切な投与量および投与方法を容易に決定することができる。例えば、その開示全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用するＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒを参照。
【００２７】
「遺伝的構築物」とは、組換え核酸分子を意味する。
【００２８】
「プロモーター」とは、作動的に連結した核酸配列の転写を導くのに十分な核酸配列を意味する。
【００２９】
「作動的に連結した」とは、核酸（複数可）とプロモーター等の調節配列が、例えば転写活性化因子タンパク質等の適切な分子が前記調節配列に結合する場合、適切な条件下で前記核酸の発現を可能にする仕方で連結していることを意味する。好ましくは、作動的に連結したプロモーターは、関連する核酸の上流にある。
【００３０】
「上流」とは、核酸に沿って３’→５’方向を意味する。
【００３１】
「核酸」とは、遺伝情報を運ぶことができるヌクレオチド鎖を意味する。この用語は一般に、遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは変異体、および／またはその表現型に影響を及ぼす生物ゲノム内の他の配列を言う。用語「核酸」は、１本鎖または２本鎖であり、必要に応じて合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基、合成核酸およびそれらの組合せを含むＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ等）およびＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ等）を含む。
【００３２】
「細菌フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）酵素をコードする核酸」または「細菌フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子」とは、フルクトシル部分をスクロース含有サッカライドからアクセプター分子に転移することによりオリゴフルクタンおよび／またはポリフルクタンの合成を触媒する、細菌に通常存在する酵素をコードする核酸を意味する。細菌ＦＴ酵素は、レバンスクラーゼ活性を含む、および／またはレバン型フルクタンを産生することができる。細菌ＦＴ酵素は、イヌロスクラーゼ活性を含む、および／またはイヌリン型フルクタンを産生することができる。好ましい細菌ＦＴは、スクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＳＳＴ）およびフルクタン：フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＦＦＴ）酵素活性の両方を含む。ＳａｃＢ、ＬｓｃまたはＦＴＦ遺伝子を用いてもよい。ＳａｃＢまたはＬｓｃ遺伝子が特に好ましい。
【００３３】
プロモーターに関する「機能的に活性な断片または変異体」とは、断片または変異体（アナログ、誘導体または突然変異体等）がそこに作動的に連結した核酸の転写を導くことができることを意味する。このような変異体は、自然発生的な対立遺伝子変異体および非自然発生的な変異体を含む。その改変が断片または変異体の機能欠失活性をもたらすことのない限りにおいて、１または複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および誘導体化が企図される。好ましくは、機能的に活性な断片または変異体は、該断片または変異体が対応する上述の配列の関連性のある部分に対して少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９８％の同一性を有する。好ましくは、断片は、少なくとも２０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドのサイズを有する。
【００３４】
細菌ＦＴ酵素をコードする核酸に関する「機能的に活性な」とは、本発明の方法により、例えばフルクタン生合成経路に関与することができる酵素に翻訳されることにより、断片または変異体（アナログ、誘導体または突然変異体等）が植物におけるフルクタン生合成を操作できることを意味する。このような変異体は、自然発生的な対立遺伝子変異体および非自然発生的な変異体を含む。その改変が断片または変異体の機能欠失活性をもたらさない限りにおいて、１または複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および誘導体化が企図される。好ましくは、機能的に活性な断片または変異体は、該断片または変異体が対応する上述の配列の関連性のある部分に対して少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９８％の同一性を有する。このような機能的に活性な変異体および断片は、例えば保存された核酸変化を有する機能的に活性な変異体および断片を含む。
【００３５】
「保存された核酸変化」とは、遺伝暗号の縮重による、コードされているタンパク質におけるアミノ酸保存をもたらす核酸置換を意味する。このような機能的に活性な変異体および断片は、例えば対応するアミノ酸配列における１または複数の残基に保存されたアミノ酸置換をもたらす核酸変化を有する機能的に活性な変異体および断片も含む。
【００３６】
「保存されたアミノ酸置換」とは、同一クラス内の別の１アミノ酸によるアミノ酸置換を意味し、クラスは次の通りである。
【００３７】
非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ
電荷なし、極性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ
他の保存されたアミノ酸置換を次の通り行ってもよい。
【００３８】
芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ
プロトンドナー：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ
プロトンアクセプター：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
特に好ましい断片および変異体は、１または複数の保存されたスクロース結合／加水分解ドメインを含む。このようなドメインの例を図１に示すが、これはＬＤＶＷＤＳＷＰ、ＱＥＷＳＧＳＡ、ＬＲＤＰＨおよびＤＥＩＥＲを含む。
【００３９】
特に好ましい断片および変異体は触媒コアを含む。「触媒コア」とは、保存されたスクロース結合および／または加水分解ドメインを含む、シグナルペプチドならびにＮおよびＣ末端可変領域を除いたポリペプチドの内部領域を意味する。触媒コアの例を図１に示すが、これはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＳａｃＢタンパク質のアミノ酸残基６５〜４６８を含む。
【００４０】
特に好ましい断片および変異体は、シグナルペプチドを欠く断片および変異体を含む。「シグナルペプチド」とは、Ｎ末端シグナル配列を意味する。シグナルペプチドの例を図１に示すが、これはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＳａｃＢタンパク質のアミノ酸１〜２７を含む。
【００４１】
特に好ましい断片および変異体は、単子葉植物および双子葉植物の翻訳開始等、植物に適応したコドン使用を有する。
【００４２】
特に好ましい断片および変異体は、潜在性スプライス部位および／またはＲＮＡ不安定化配列エレメントが不活性化または除去されている。
【００４３】
好ましくは、細菌ＦＴをコードする核酸は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ等、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属からなる群より選択された細菌種由来の遺伝子（単数または複数）から単離される、あるいはそれに相当する。さらにより好ましくは、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＳａｃＢ遺伝子、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来のＬｓｃ遺伝子またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来のＦＴＦ遺伝子から単離される、あるいはそれに相当する。
【００４４】
特に好ましい一実施形態において、ＳａｃＢ遺伝子は、図２に示されている配列および図３に示されているポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００４５】
特に好ましい一実施形態において、Ｌｓｃ遺伝子は、図４に示されている配列および図５に示されているポリペプチド配列をコードする核酸配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００４６】
細菌レバンスクラーゼを発現するトランスジェニック植物が報告されており、一部の事例では発達異常の表現型を提示する。本出願人らは理論に制約されることを望まないが、この現象はレバンスクラーゼ酵素およびフルクタンポリマーの不適切な区画化に起因し得る。トランスジェニックタバコおよびジャガイモ植物における細菌ＳａｃＢ遺伝子のサイトゾルにおける発現は、植物の発達に特に破壊的な影響を与えることを示した（Ｃａｉｍｉら、１９９７年）。しかし、液胞ターゲティングシグナルと融合した細菌フルクトシルトランスフェラーゼを発現する植物は、植物の発達に認識可能な効果を及ぼすことなくフルクタンを蓄積する（Ｅｂｓｋａｍｐら、１９９４年、Ｙｅら、２００１年）。
【００４７】
発達異常の表現型を生じる可能性を低減させるため、細菌ＦＴ遺伝子を改変してそのターゲティングシグナル配列を変化させ、細菌ＦＴタンパク質を高フルクタンレベルの存在する区画に方向付けることができる。
【００４８】
より具体的には、細菌ＦＴ遺伝子のＮ−シグナルペプチドが除去され、細胞内ターゲティング配列、好ましくは液胞ターゲティング配列に置き換えられたキメラ配列を作製することができる。
【００４９】
好ましい一実施形態において、液胞ターゲティング配列は、サツマイモのＳＰＯＲ５３１等、プレプロスポラミンタンパク質をコードする遺伝子に由来する、あるいはそれに相当し得る。
【００５０】
特に好ましい一実施形態において、液胞ターゲティング配列は、図６において太字・下線で示されている配列および図７において太字・下線で示されているポリペプチドをコードする核酸配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含むことができる。
【００５１】
特に好ましい一実施形態において、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸は、ＳＰＯＲ：ＳａｃＢキメラ配列となることができる。好ましくは、ＳＰＯＲ：ＳａｃＢキメラ配列は、図８に示されている配列および図９に示されているポリペプチド配列をコードする核酸配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００５２】
特に好ましい一実施形態において、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸は、ＳＰＯＲ：Ｌｓｃキメラ配列となることができる。好ましくは、ＳＰＯＲ：Ｌｓｃキメラ配列は、図９に示されている配列および図１２に示されているポリペプチド配列をコードする核酸配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００５３】
特に好ましい一実施形態において、遺伝的構築物は、図８と図１１に示されている配列および図９と図１２に示されているポリペプチドをコードする核酸配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００５４】
別の好ましい一実施形態において、細菌ＦＴ遺伝子のＮ−シグナルペプチドが除去されて１−ＳＳＴ等、フルクトシルトランスフェラーゼ酵素の膜貫通ドメインに置き換えられたキメラ配列を作成することができる。
【００５５】
特に好ましい一実施形態において、膜貫通ドメインは、図１５において太字・斜字体で示されている配列および図１６において太字・斜字体で示されているポリペプチドをコードする核酸配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００５６】
特に好ましい一実施形態において、遺伝的構築物は、図１７と図２０に示されている配列および図１８と図２１に示されているポリペプチドをコードする核酸配列ならびにその機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００５７】
「キメラ配列」とは、元々は別々のタンパク質をコードしていた２以上の連結された核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む融合遺伝子を発現することによる、組換えにより産生されたハイブリッドを意味する。
【００５８】
「融合遺伝子」とは、融合タンパク質が好ましくは翻訳融合体として発現することが可能となる仕方で２以上の核酸が連結されたことを意味する。これは通常、第一のタンパク質をコードする核酸配列から終止コドンを除去し、次に第二のタンパク質の核酸配列をインフレームで付け加えることを含む。続いて、細胞により融合遺伝子を単一のタンパク質として発現させる。タンパク質は、両方のオリジナルタンパク質の完全配列、またはそのいずれかもしくは両者の機能的に活性な断片もしくは変異体を含むよう遺伝子操作されていてよい。
【００５９】
遺伝的構築物は、連結された２核酸間のリンカーをコードする核酸配列を含んでいてもよい。「リンカー」は、融合タンパク質内の２個の隣接する活性断片の間に配置された、あるいはそれらに接続された任意の化学合成炭水化物・脂質・ポリペプチド分子（またはそれらの組合せ）である。本発明の好ましいリンカーは、アミノ酸の結合によって２個の活性断片と接続した１または複数のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖等、可動性リンカーである。例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーが、融合タンパク質内の２個の活性断片間に配置されてよい。
【００６０】
本発明の構築物および方法に用いられるプロモーターは、構成的、組織特異的または誘導性プロモーターとなることができる。好ましい一実施形態において、プロモーターは光調節プロモーター（ｌｉｇｈｔ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、より好ましくは光合成プロモーターとなることができる。「光調節プロモーター」とは、光刺激に応答して遺伝子発現を媒介することができるプロモーターを意味する。「光合成プロモーター」とは、植物における光合成経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を媒介することができるプロモーターを意味する。
【００６１】
成熟葉身は、葉鞘および茎よりも少量のフルクタンが蓄積する。葉身におけるフルクタンレベルを特異的に上昇させるため、光合成細胞においてフルクタン生合成遺伝子を協調的に発現させる戦略的アプローチが考案された。本出願人らは理論に制約されることを望まないが、光調節または光合成プロモーターの使用は次の利点を提供することができる。
【００６２】
・光合成プロモーターは、葉身、茎の上部および外側を含む大きな細胞群（＞５５％の細胞）における活性を有する。
【００６３】
・それは、スクロース産生細胞（葉肉および柔組織維管束鞘細胞）における活性を有する。
【００６４】
・その発現パターンは、スクロース蓄積と時間的および空間的に重複する。
【００６５】
・フルクトシルトランスフェラーゼ（Ｆｒｕｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性はソースからスクロースを除去し、これにより光合成におけるフィードバック抑制を妨げ、ＣＯ２固定の増加を促進する。
【００６６】
特に好ましい光調節プロモーターは、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ（ｏｘｙｇｔｅｎａｓｅ）−スモールサブユニット（ＲｂｃＳ）プロモーターおよびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）プロモーターならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体を含む。
【００６７】
光調節プロモーターは、単子葉植物［トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、飼料草（例えば、Ｆｅｓｔｕｃａ属、Ｌｏｌｉｕｍ属、Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ属、Ｐａｓｐａｌｕｍ属、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ属）、バイオエネルギー用草本（例えば、スイッチグラス、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ属）等］、双子葉植物（シロイヌナズナ、ダイズ、キャノーラ、ワタ、アルファルファおよびタバコ等）および裸子植物を含む、任意の適切な植物種に由来することができる。
【００６８】
単子葉植物の形質転換のため、好ましくは、光調節プロモーターは単子葉植物種、より具体的にはＴｒｉｔｉｃｕｍ属またはＬｏｌｉｕｍ属の種、さらにより具体的にはＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍまたはＬｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅから単離される、あるいはそれらに由来するプロモーターに相当する。
【００６９】
双子葉植物の形質転換のため、好ましくは、光調節プロモーターは双子葉植物種、より具体的にはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属の種、さらにより具体的にはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａから単離される、あるいはそれらに由来するプロモーターに相当する。
【００７０】
特に好ましい一実施形態において、ＲｂｃＳプロモーターは、図２３〜２６のいずれか一図において小文字・斜字体で示されている配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００７１】
特に好ましい別の一実施形態において、ＲｂｃＳプロモーターは、図２９〜３６のいずれか一図において小文字・斜字体で示されている配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択された配列を含む。
【００７２】
本発明の遺伝的構築物は、任意の適切な技法により植物に導入することができる。本発明の遺伝的構築物を植物細胞に組み入れるための技法（例えば形質導入、トランスフェクション、形質転換または遺伝子ターゲティング）は、当業者にとって周知のものである。このような技法は、アグロバクテリウムを介した導入、根粒菌を介した導入、組織、細胞およびプロトプラストへのエレクトロポレーション、プロトプラスト融合、生殖器官への注入、未熟胚への注入、細胞、組織、カルス、未熟胚および成熟胚への高速噴射による導入、遺伝子銃による形質転換、Ｗｈｉｓｋｅｒｓ形質転換ならびにそれらの組合せを含む。技法の選択は、主として形質転換される植物の種類に依存し、当業者であれば容易に決定することができる。
【００７３】
本発明の遺伝的構築物を組み入れる細胞を後述の通り選択し、次に本技術分野で周知の技法を用いて適切な培地で培養して形質転換植物を再生することができる。温度やｐＨその他の培養条件は、当業者であれば明らかであろう。その結果生じた植物に、本技術分野で周知の方法を用いて有性生殖か無性生殖のいずれかを行わせて、形質転換植物の後代を作出することができる。
【００７４】
本発明の方法は、単子葉植物［草本（例えば、ペレニアルライグラス、ヒロハノウシノケグサ（ｔａｌｌ ｆｅｓｃｕｅ）、イタリアンライグラス（Ｉｔａｌｉａｎ ｒｙｅｇｒａｓｓ）、オオウシノケグサ（ｒｅｄ ｆｅｓｃｕｅ）、クサヨシ（ｒｅｅｄ ｃａｎａｒｙｇｒａｓｓ）、ビッグブルーステム（ｂｉｇ ｂｌｕｅｓｔｅｍ）、コードグラス（ｃｏｒｄｇｒａｓｓ）、ネピアグラス（ｎａｐｉｅｒｇｒａｓｓ）、ワイルドライ（ｗｉｌｄｒｙｅ）、ワイルドシュガーケーン（ｗｉｌｄ ｓｕｇａｒｃａｎｅ）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ属、スイッチグラスを含む飼料草およびバイオエネルギー用草本）、コーンすなわちトウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、ライムギ、カラスムギ）およびエネルギー用作物（例えば、エネルギー用サトウキビ、エネルギー用ソルガム）等］、双子葉植物［シロイヌナズナ、タバコ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ジャガイモ、キャッサバ、クローバ（例えば、シロツメクサ、ムラサキツメクサ、ジモグリツメクサ（ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｃｌｏｖｅｒ））、アブラナ科野菜（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｂｒａｓｓｉｃａ）、レタス、ホウレンソウ等］および裸子植物を含む、種々の植物に適用することができる。
【００７５】
本発明のさらに別の一態様において、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結した光調節プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物が提供される。
【００７６】
好ましい一実施形態において、本発明に係る遺伝的構築物はベクターとなることができる。
【００７７】
「ベクター」とは、遺伝子材料の標的細胞への導入に用いられる遺伝的構築物を意味する。
【００７８】
ベクターは、任意の適切な種類のものとなることができ、ウイルスまたは非ウイルス性となることができる。ベクターは発現ベクターとなることができる。このようなベクターは、染色体、非染色体および合成核酸配列、例えば植物ウイルスの誘導体、細菌プラスミド、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓから得られたＴｉプラスミドの誘導体、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓから得られたＲｉプラスミドの誘導体、ファージＤＮＡ、酵母人工染色体、細菌人工染色体、バイナリー細菌人工染色体ならびにプラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクターを含む。しかし、複製可能あるいは植物細胞に組み込み可能または機能する限りにおいて、その他のベクターを用いてもよい。
【００７９】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態において、遺伝的構築物はターミネーターをさらに含むことができ、前記プロモーター、遺伝子およびターミネーターは、作動可能に連結している。
【００８０】
プロモーター、遺伝子およびターミネーターは、任意の適切な種類のものとなることができ、標的植物細胞で機能するのであれば、その標的植物細胞に対して内在性であっても外来性であってもよい。
【００８１】
本発明の遺伝的構築物に用いることができる種々のターミネーターもまた、当業者にとって周知のものである。ターミネーターは、プロモーター配列と同じ遺伝子に由来してよいし、異なる遺伝子に由来してもよい。特に適切なターミネーターは、（ＣａＭＶ）３５ＳポリＡ等、ポリアデニル化シグナルならびにノパリン合成酵素（ｎｏｓ）およびオクトピン合成酵素（ｏｃｓ）遺伝子由来の他のターミネーターである。
【００８２】
プロモーター、遺伝子およびターミネーターに加えて、遺伝的構築物は、核酸の発現に必要なさらに別のエレメント、例えばベクター骨格、複製起点（ｏｒｉ）、多重クローニング部位、スペーサー配列、エンハンサー、イントロン（トウモロコシユビキチンＵｂｉイントロン等）、抗生物質抵抗性遺伝子および他の選択マーカー遺伝子［ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺伝子、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒまたはｐａｔ）遺伝子］ならびにレポーター遺伝子（ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ｇｕｓＡ）等）等］を様々な組合せで含むことができる。遺伝的構築物は、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含むこともできる。遺伝的構築物は、発現を増幅するための適切な配列を含むこともできる。
【００８３】
特に、遺伝的構築物は、上文に記す通り、連結された２核酸の間にリンカーをコードする核酸配列をさらに含むことができる。
【００８４】
当業者であれば、遺伝的構築物の様々な構成要素が、前記核酸の発現をもたらすよう作動可能に連結していることを理解できるであろう。本発明の遺伝的構築物の構成要素を作動可能に連結するための技法は、当業者にとって周知のものである。このような技法は、例えば１または複数の制限酵素部位を含む合成リンカー等、リンカーの使用を含む。
【００８５】
好ましくは、遺伝的構築物は実質的に精製または単離されている。「実質的に精製された」とは、遺伝的構築物が、本発明の核酸またはプロモーターの由来する生物の自然発生的なゲノムにおいては、該核酸またはプロモーターに隣接する遺伝子を含まないことを意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自己複製プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物ゲノムＤＮＡに組み入れられた、あるいは他の配列から独立した別々の分子（例えば、ｃＤＮＡまたはＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されたゲノムもしくはｃＤＮＡ断片）として存在する遺伝的構築物を含む。これは、追加的ポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である遺伝的構築物も含む。好ましくは、実質的に精製された遺伝的構築物は、少なくとも約９０％の純度、より好ましくは少なくとも約９５％の純度、さらにより好ましくは少なくとも約９８％の純度である。
【００８６】
用語「単離された」は、材料がその元々の環境（例えば、自然発生的であれば自然環境）から取り分けられたことを意味する。例えば、生きた植物に存在する自然発生的な核酸は単離されていないが、同じ核酸でも、自然システムにおいて共存している材料の一部または全部から分離された核酸は単離されている。このような核酸はベクターの一部であってよい、および／またはこのような核酸は組成物の一部であってよく、このようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないという点において、これは依然として単離されている。
【００８７】
形質転換された宿主細胞を選抜するための表現型形質を提供するための選択マーカー遺伝子を使用する代わりとして、形質転換細胞における遺伝的構築物の存在は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロットハイブリダイゼーション解析、組織化学的アッセイ（例えば、ＧＵＳアッセイ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ノーザンブロットおよびウエスタンブロットハイブリダイゼーション解析等、本技術分野で周知の他の技法により決定することができる。
【００８８】
本出願人は、本発明の方法が、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物において増強されたバイオマスをもたらし得ることも見出した。これにより、この増強されたバイオマスは、形質転換植物を同定するための選抜ツールとして用いることができる。この構成は、後にこのようなマーカーを除去（そしてマーカーなし植物の作製のため）することが困難である場合、一部の状況において、形質転換体選抜のための抗生物質抵抗性または他のマーカーを含む必要がないという利点がある。
【００８９】
「バイオマス増強」または「増強されたバイオマス」とは、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物におけるシュートおよび／または根の生長を含むバイオマス収量の増強、増加または安定性増加を意味する。例えば、合計葉面積、累積葉面積、葉の生長動態（すなわち、経時的な葉の数）、シュートの数、分げつの数、根の数、根の質量もしくは重量、シュートの質量もしくは重量、根の長さ、シュートの長さ、走根の長さ、塊茎の数、塊茎の重量、花の数、果実の数、種子の数、種子の重量、果実の重量、開花している植物体のパーセンテージおよび花１個当たりまたは作付面積当たりの種子収量からなる群より選択された１または複数の生長特徴は、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物において増強され、増加され、またはより安定的となることができる。
【００９０】
この技法は、実質的に遺伝的に均一または遺伝的に同一である、あるいは形質転換前のバイオマスとの表現型の差が小さいことを示す植物に特に適用できる。
【００９１】
したがって、本発明のさらに別の一態様において、植物におけるバイオマスを増強する方法であって、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結（ｌｉｋｅｄ）したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含む方法が提供される。好ましくは、プロモーターは光調節プロモーターである。
【００９２】
本発明の方法、核酸および遺伝的構築物は、他の遺伝的操作方法または他の導入核酸もしくは遺伝的構築物と組み合わせて用いて、これにより形質を積み重ねることができる。このため、積み重ねられた遺伝子（または積み重ねされた形質）を有するトランスジェニック植物体、植物細胞、植物種子または他の植物部分が作出される。例えば、本発明の技術は、除草剤抵抗性技術（例えば、グルホシネート、グリホサート）、害虫抵抗性技術（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）または老化遅延技術と組み合わせることができる。核酸または遺伝的構築物は、上文に記す通り、任意の適切な技法により植物に導入することができ、同時発生的に、連続的にまたは別々に導入することができる。
【００９３】
本発明のさらになお別の一態様において、植物におけるバイオマスを増強する方法であって、有効量の
（ａ）植物の光合成細胞においてフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物であって、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む遺伝的構築物と、
（ｂ）植物の老化を操作することができる遺伝的構築物と、
を植物に導入するステップを含む方法が提供される。
【００９４】
遺伝的構築物は、上文に記す通り任意の適切な技法により植物に導入することができ、同時発生的に、連続的にまたは別々に導入することができる。
【００９５】
好ましくは、フルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物は、上文に記す通りである。
【００９６】
好ましくは、植物の老化を操作することができる遺伝的構築物は、植物の光合成細胞の老化を操作することができる。
【００９７】
好ましくは、老化を操作することができる遺伝的構築物は、サイトカイニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したｍｙｂ遺伝子プロモーターもしくは改変されたｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはそれらの機能的に活性な断片もしくは変異体を含む。
【００９８】
適切な遺伝的構築物またはベクターは、その開示全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２号明細書および米国特許出願第１１／７８９，５２６号明細書に記載されている。
【００９９】
「老化を操作する」は一般に、非形質転換対照植物と比べた形質転換植物または形質転換植物の細胞もしくは器官、例えば光合成細胞における老化の遅延に関する。しかし、一部の適用では、植物における老化を促進、あるいは改変することが望ましいであろう。老化は、例えばアンチセンス遺伝子を利用することによって促進、あるいは改変することができる。
【０１００】
ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、任意の適切な種類のものとなることができる。好ましくは、ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、ｍｙｂ３２遺伝子プロモーターである。好ましくは、ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、より好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａに由来する。最も好ましくは、ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、国際出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２号明細書の配列番号１に示されている配列ならびにその機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含む。
【０１０１】
適切なプロモーターは、その開示全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用するＬｉら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ＭＹＢ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ＰＧＲ９９〜１３８）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１２１巻：３１３（１９９９年）に記載されている。
【０１０２】
「改変されたｍｙｂ遺伝子プロモーター」とは、前記プロモーターにおける１または複数の根特異的モチーフおよび／または花粉特異的モチーフを欠失するよう、あるいは不活性化するよう改変された、ｍｙｂ遺伝子に通常関連するプロモーターを意味する。
【０１０３】
好ましくは、改変されたｍｙｂ遺伝子プロモーターは、改変されたｍｙｂ３２遺伝子プロモーターである。好ましくは、改変されたｍｙｂ遺伝子プロモーターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、あるいはより好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａに由来するｍｙｂ遺伝子プロモーターから改変される。
【０１０４】
本発明に従って改変できる適切なプロモーターは、その開示全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用するＬｉら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ＭＹＢ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ（ＰＧＲ９９〜１３８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１２１巻：３１３（１９９９年）に記載されている。
【０１０５】
「根特異的モチーフ」とは、植物の根において任意の関連遺伝子の発現を導く、３〜７ヌクレオチド、好ましくは４〜６ヌクレオチド、より好ましくは５ヌクレオチドの配列を意味する。
【０１０６】
好ましくは、根特異的モチーフは、コンセンサス配列ＡＴＡＴＴまたはＡＡＴＡＴを含む。
【０１０７】
「花粉特異的モチーフ」とは、植物の花粉において関連遺伝子の発現を導く、３〜７ヌクレオチド、好ましくは４〜６ヌクレオチド、より好ましくは４または５ヌクレオチドの配列を意味する。
【０１０８】
好ましくは、花粉特異的モチーフは、ＴＴＴＣＴ、ＡＧＡＡＡ、ＴＴＣＴおよびＡＧＡＡからなる群より選択されたコンセンサス配列を含む。
【０１０９】
根または花粉特異的モチーフは、モチーフ内の１または複数のヌクレオチドを付加、欠失、置換または誘導体化することによって不活性化し、これにより好ましいコンセンサス配列を持たないようにすることができる。
【０１１０】
好ましくは、改変されたｍｙｂ遺伝子プロモーターは、米国特許出願第１１／７８９，５２６号明細書の配列番号２、３および４に示されている配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
「サイトカイニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子」とは、カイネチン、ゼアチンおよびベンジルアデニン等、サイトカイニンの合成に関与する酵素をコードする遺伝子、例えば、ｓｈｏ遺伝子（例えば、ペチュニア由来の）等、イソペンチル（ｉｓｏｐｅｎｔｙｌ）トランスフェラーゼ（ｉｐｔ）またはｉｐｔ様遺伝子をコードする遺伝子を意味する。好ましくは、遺伝子は、イソペンテニル（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ）トランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子またはｓｈｏ遺伝子である。好ましい一実施形態において、遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、より好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；Ｌｏｔｕｓ属、より好ましくはＬｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ；およびＰｅｔｕｎｉａ属、より好ましくはＰｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａからなる群より選択された種に由来する。
【０１１２】
最も好ましくは、遺伝子は、米国特許出願第１１／７８９，５２６号明細書の配列番号５、７および９に示されている配列、米国特許出願第１１／７８９，５２６号明細書の配列番号６、８および１０に示されているポリペプチドをコードする配列ならびにそれらの機能的に活性な断片および変異体からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含む。
【０１１３】
本発明はまた、形質転換植物を選抜する方法であって、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップと、バイオマスが増強された植物を選抜するステップとを含む方法も提供する。好ましくは、プロモーターは光調節プロモーターである。
【０１１４】
本発明のさらに別の一態様において、本発明に係る遺伝的構築物またはベクターを含み、非形質転換対照植物と比べてフルクタン生合成特徴が改変された、またはバイオマスが増強されたトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分が提供される。
【０１１５】
「改変されたフルクタン生合成特徴」とは、形質転換植物が、非形質転換対照植物と比べてフルクタン生合成の増加を示すことおよび／またはより高レベルの可溶性炭水化物を含むことを意味する。
【０１１６】
好ましい一実施形態において、バイオマスが増強されたトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分は、非形質転換対照植物と比べてバイオマスが少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３５％、より好ましくは少なくとも約５０％増加する。
【０１１７】
例えば、非形質転換対照植物と比べてバイオマスが約１５％から５００％の間、より好ましくは約２５％から３００％の間、より好ましくは約３５％から２００％の間、より好ましくは約５０％から１００％の間増加していてもよい。
【０１１８】
好ましい一実施形態において、フルクタン生合成特徴が改変されたトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分は、非形質転換対照植物と比べて可溶性炭水化物が少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３５％、より好ましくは少なくとも約５０％増加する。
【０１１９】
例えば、非形質転換対照植物と比べて可溶性炭水化物が約１５％から５００％の間、より好ましくは約２５％から３００％の間、より好ましくは約３５％から２００％の間、より好ましくは約５０％から１００％の間増加する。
【０１２０】
好ましくは、トランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分は、本発明に係る方法によって作出される。
【０１２１】
本発明はまた、本発明の植物細胞に由来し、本発明の遺伝的構築物またはベクターを含むトランスジェニック植物体、植物種子または他の植物部分も提供する。
【０１２２】
本発明はまた、本発明の植物に由来し、本発明の遺伝的構築物またはベクターを含むトランスジェニック植物体、植物種子または他の植物部分も提供する。
【０１２３】
好ましくは、トランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分は、Ｌｏｌｉｕｍ属の種、より好ましくはＬｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍである。
【０１２４】
好ましくは、トランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分は、穀物類、より好ましくはＴｒｉｔｉｃｕｍ属の種、より好ましくはコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）である。
【０１２５】
例えば、本発明は、草食動物の栄養改善のための、葉身におけるフルクタンが増加し、活発に生長し、非生物的ストレスに対しより高い耐性を有するトランスジェニック−ペレニアルライグラス植物の作出を可能にする。
【０１２６】
本発明はまた、例えばバイオ燃料生産または動物の食餌に利用可能な炭水化物の質量増加のための、フルクタンが増加し、活発に生長し、非生物的ストレスに対する耐性を有するトランスジェニックコムギ植物の作出も可能にする。
【０１２７】
「植物細胞」とは、半透膜によって仕切られた、色素体を含む任意の自己増殖細胞を意味する。このような細胞は、さらなる増殖が望ましい場合、細胞壁も必要とする。本明細書における植物細胞は、藻類、ラン藻、種子懸濁培養物、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２８】
「トランスジェニック」とは、技巧的手法によって細胞に挿入され、その細胞から発生した生物のゲノムの一部となったＤＮＡ配列を含む、任意の細胞を意味する。本明細書において、トランスジェニック生物は一般にトランスジェニック植物であり、ＤＮＡ（導入遺伝子）は、技巧的手法によって核または色素体ゲノムのいずれかに挿入される。
【０１２９】
次に、添付の実施例および図面を参照することにより本発明をさらに十分に説明する。なお、次の記述は具体例としてのものであるに過ぎず、決して上述の本発明の一般性を限定するものと考えるべきではないことを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られたＳａｃＢタンパク質、ＧＨ６８ファミリーメンバーの略図である。示されている４個の異なる領域は、Ｎ末端シグナル配列、Ｎ末端可変領域、触媒コアおよびＣ末端可変領域である。触媒三連構造（Ｄ８６、Ｄ２４７およびＥ３４２）およびスクロース結合（Ｗ８５、Ｗ１６３およびＲ２４６）を含むアミノ酸残基。
【図２】図２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られたＳａｃＢ遺伝子（レバンスクラーゼ）のヌクレオチド配列を示す図である。Ｎ末端シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を太字で示す。
【図３】図３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られたＳａｃＢタンパク質（レバンスクラーゼ）のアミノ酸配列を示す図である。Ｎ末端シグナルペプチドを太字で示す。
【図４】図４は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ ５３３から得られたＬｓｃ遺伝子（イヌロスクラーゼ）のヌクレオチド配列を示す図である。Ｎ末端シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を太字で示す。
【図５】図５は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ ５３３から得られたＬｓｃタンパク質（イヌロスクラーゼ）のアミノ酸配列を示す図である。Ｎ末端シグナルペプチドを太字で示す。
【図６】図６は、Ｉ．ｂａｔａｔａｓから得られたプレプロスポラミンタンパク質であるＳＰＯＲ５３１のヌクレオチド配列を示す図である。液胞ターゲティングシグナル配列を太字・下線で示す。
【図７】図７は、Ｉ．ｂａｔａｔａｓから得られたプレプロスポラミンタンパク質であるＳＰＯＲ５３１のアミノ酸配列を示す図である。液胞ターゲティングシグナル配列を太字・下線で示す。
【図８】図８は、ＳＰＯＲ：ＳａｃＢキメラヌクレオチド配列を示す図である。ＳａｃＢのＮ末端シグナル配列をＳＰＯＲの液胞ターゲティングシグナル（太字・下線で示す）に置き換えてある。
【図９】図９は、ＳＰＯＲ：ＳａｃＢキメラタンパク質配列を示す図である。ＳａｃＢのＮ末端シグナル配列をＳＰＯＲの液胞ターゲティングシグナル（太字・下線で示す）に置き換えてある。
【図１０】図１０は、膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／を用いたＳＰＯＲ−ＳａｃＢ融合タンパク質の二次構造予測を示す図である。
【図１１】図１１は、ＳＰＯＲ：Ｌｓｃキメラヌクレオチド配列を示す図である。ＬｓｃのＮ末端シグナル配列をＳＰＯＲの液胞ターゲティングシグナル（太字・下線で示す）に置き換えてある。
【図１２】図１２は、ＳＰＯＲ：Ｌｓｃキメラタンパク質配列を示す図である。ＬｓｃのＮ末端シグナル配列をＳＰＯＲの液胞ターゲティングシグナル（太字・下線で示す）に置き換えてある。
【図１３】図１３は、膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／を用いたＳＰＯＲ−Ｌｓｃ融合タンパク質の二次構造予測を示す図である。
【図１４】図１４は、膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／を用いたＬｐ１−ＳＳＴの二次構造予測を示す図である。
【図１５】図１５は、Ｌ．ｐｅｒｅｎｎｅから得られたＬｐ１−ＳＳＴヌクレオチド配列を示す図である。Ｌｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメインのコード配列を太字・斜字体で示す。
【図１６】図１６は、Ｌ．ｐｅｒｅｎｎｅから得られたＬｐ１−ＳＳＴタンパク質配列を示す図である。Ｌｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメインを太字・斜字体で示す。
【図１７】図１７は、Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢキメラヌクレオチド配列を示す図である。ＳａｃＢのＮ末端シグナルのコード配列をＬｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメインのコード配列（太字・斜字体で示す）に置き換えてある。
【図１８】図１８は、Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢキメラタンパク質配列を示す図である。ＳａｃＢのＮ末端シグナル配列をＬｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメイン（太字・斜字体で示す）に置き換えてある。
【図１９】図１９は、膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／を用いたＬｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ融合タンパク質の二次構造予測を示す図である。
【図２０】図２０は、Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃキメラヌクレオチド配列を示す図である。ＬｓｃのＮ末端シグナルのコード配列をＬｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメインのコード配列（太字・斜字体で示す）に置き換えてある。
【図２１】図２１は、Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃキメラタンパク質配列を示す図である。ＬｓｃのＮ末端シグナル配列をＬｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメイン（太字・斜字体で示す）に置き換えてある。
【図２２】図２２は、膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／を用いたＬｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ融合タンパク質の二次構造予測を示す図である。
【図２３−１】図２３は、ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２３−２】図２３は、ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２４−１】図２４は、ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２４−２】図２４は、ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２５−１】図２５は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２５−２】図２５は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２６−１】図２６は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２６−２】図２６は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２７】図２７は、Ｇａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。
【図２８Ａ】図２８は、双子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ；Ｂ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ；Ｃ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ、およびＤ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ。
【図２８Ｂ】図２８は、双子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ；Ｂ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ；Ｃ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ、およびＤ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ。
【図２８Ｃ】図２８は、双子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ；Ｂ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ；Ｃ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ、およびＤ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ。
【図２８Ｄ】図２８は、双子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ；Ｂ．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ；Ｃ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ、およびＤ．ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ。
【図２９】図２９は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３０−１】図３０は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３０−２】図３０は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３１−１】図３１は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３１−２】図３１は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３２−１】図３２は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３２−２】図３２は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３３−１】図３３は、ＴａＲｂｃＳｐ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３３−２】図３３は、ＴａＲｂｃＳｐ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３４−１】図３４は、ＴａＲｂｃＳｐ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３４−２】図３４は、ＴａＲｂｃＳｐ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃｓｔ ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３５−１】図３５は、ＴａＲｂｃＳｐ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３５−２】図３５は、ＴａＲｂｃＳｐ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３６−１】図３６は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３６−２】図３６は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３６−３】図３６は、ＴａＲｂｃＳｐ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃｓｔ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ発現カセットのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３７】図３７は、Ｇａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクター、ｐＢＳ：ｕｂｉ：：ｂａｒ：：ＮＯＳを示す図である。
【図３８】図３８は、単子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ、およびＢ．ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ
【図３９】図３９は、単子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ、およびＢ．ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ
【図４０】図４０は、単子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ、およびＢ．ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ
【図４１】図４１は、単子葉植物形質転換用のＧａｔｅｗａｙ ｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを示す図である。Ａ．ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ、およびＢ．ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ
【図４２】図４２は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの葉肉由来プロトプラストの単離を示す図である。Ａ）〜Ｂ）４〜６週目のｉｎ ｖｉｔｒｏ葉材料の解剖、前酵素消化；Ｃ）４〜６週目のｉｎ ｖｉｔｒｏ葉材料の消化、１６時間のインキュベーション；Ｄ）プロトプラスト懸濁液の回収；Ｅ）プロトプラスト豊富界面の分離；Ｆ）〜Ｇ）インタクトな葉緑体豊富プロトプラスト
【図４３】図４３は、一過性発現解析のためのＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの葉肉由来プロトプラストの単離を示す図である。Ａ）〜Ｂ）インタクトな葉緑体豊富プロトプラスト；Ｃ）液体濃縮培地におけるプロトプラストの培養；Ｄ）生存プロトプラスト、単離４８時間後
【図４４】図４４は、安定的な形質転換のためのＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの葉肉由来プロトプラストの単離を示す図である。Ａ）〜Ｂ）インタクトな葉緑体豊富プロトプラスト；Ｃ）プロトプラストを包埋したｓｅａ ｐｌａｑｕｅアガロースプラグ、０日目；Ｄ）生存プロトプラスト、単離および包埋６日後；Ｅ）〜Ｆ）包埋され、解放されたプロトプラスト由来の微小カルス、単離および包埋４週間後
【図４５】図４５は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの葉肉プロトプラスト由来の微小カルスからシュートの再生を示す図である。Ａ）液体成長培地Ａに解放された微小カルス、単離および包埋６〜７週間後；Ｂ〜Ｃ）固形成長培地におけるカルスの増殖；Ｄ）〜Ｅ）葉肉プロトプラスト由来のカルスからシュートの誘導および再生；Ｆ）再生シュートから根の発達；Ｇ）〜Ｈ）ガラス温室内に封じ込めた植物体の生長および発達
【図４６】図４６は、非形質転換プロトプラスト生存率の評価を示す図である。単離４８時間後。
【図４７】図４７は、ＰＥＧ形質転換プロトプラストの生存率の評価を示す図である。単離およびトランスフェクション４８時間後。
【図４８】図４８は、タバコリーフディスクのアグロバクテリウムを介した形質転換を示す図である。Ａ）形質転換リーフディスクの共存培養、０日目；Ｂ）ステージ１シュートの開始、共存培養３日後
【図４９−１】図４９は、タバコ形質転換リーフディスクにおけるｇｆｐ発現の検出を示す図である。Ａ）非形質転換リーフディスク、白色光；Ｂ）非形質転換リーフディスク、ｇｆｐ２フィルター；Ｃ）非形質転換リーフディスク、ｇｆｐ３フィルター；Ｄ）＆Ｇ）Ｔｕｒｂｏ ｇｆｐ形質転換リーフディスク、白色光；Ｅ）＆Ｈ）Ｔｕｒｂｏ ｇｆｐ形質転換リーフディスク、ｇｆｐ２フィルター；Ｆ）＆Ｉ）Ｔｕｒｂｏ ｇｆｐ形質転換リーフディスク、ｇｆｐ３フィルター。
【図４９−２】図４９は、タバコ形質転換リーフディスクにおけるｇｆｐ発現の検出を示す図である。Ａ）非形質転換リーフディスク、白色光；Ｂ）非形質転換リーフディスク、ｇｆｐ２フィルター；Ｃ）非形質転換リーフディスク、ｇｆｐ３フィルター；Ｄ）＆Ｇ）Ｔｕｒｂｏ ｇｆｐ形質転換リーフディスク、白色光；Ｅ）＆Ｈ）Ｔｕｒｂｏ ｇｆｐ形質転換リーフディスク、ｇｆｐ２フィルター；Ｆ）＆Ｉ）Ｔｕｒｂｏ ｇｆｐ形質転換リーフディスク、ｇｆｐ３フィルター。
【図５０】図５０は、ＲＴ−ＰＣＲ試料および対照の電気泳動を示す図である。レーン１および１３：１ｋｂ＋ＤＮＡラダーレーン２：トランスフェクトしたプロトプラスト１（試料９Ａ）から得られたｍＲＮＡの逆転写によって生成したｃＤＮＡ（２μＬ）から、遺伝子特異的プライマーによるｓａｃＢ転写産物の増幅レーン３：ｃＤＮＡ（１μＬ）からｓａｃＢ転写産物の増幅（試料９Ａ）レーン４：逆転写酵素なしで行った対照反応（試料９Ａ）レーン５：鋳型なしで行った対照反応（ｓａｃＢプライマー）レーン６：トランスフェクトしたプロトプラスト１（試料１２Ａ）から得られたｍＲＮＡの逆転写によって生成したｃＤＮＡ（２μＬ）から、遺伝子特異的プライマーによるｓａｃＢ転写産物の増幅レーン７：ｃＤＮＡ（１μＬ）からｓａｃＢ転写産物の増幅（試料１２Ａ）レーン８：逆転写酵素なしで行った対照反応（試料１２Ａ）レーン９：非トランスフェクトプロトプラストから得られたｍＲＮＡの逆転写によって生成したｃＤＮＡ（２μＬ）から、遺伝子特異的プライマーによる１８Ｓ転写産物の増幅レーン１０：非トランスフェクトプロトプラストから得られたｍＲＮＡの逆転写によって生成したｃＤＮＡ（１μＬ）から、遺伝子特異的プライマーによる１８Ｓ転写産物の増幅レーン１１：逆転写酵素なしで行った対照反応（非トランスフェクトプロトプラスト）レーン１２：鋳型なしで行った対照反応（１８Ｓプライマー）。
【発明を実施するための形態】
【０１３１】
（実施例１）
細菌フルクタン生合成遺伝子の単離
図１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られたＳａｃＢタンパク質の略図を提示する。示されている４個の異なる領域は、Ｎ末端シグナル配列、Ｎ末端可変領域、触媒コアおよびＣ末端可変領域である。構造的には、細菌イヌロスクラーゼおよびレバンスクラーゼの多くは、Ｎ末端シグナルペプチド、触媒三連構造を共有する。この配列は配列改変の際に除去される。スクロース結合に関与する残基は触媒コア配列内部に位置するが、これは改変の際に手をつけずにおく。
【０１３２】
細菌レバンスクラーゼ（ＳａｃＢ）およびイヌロスクラーゼ（Ｌｓｃ）のヌクレオチドおよびタンパク質配列をそれぞれ図２〜５に提供する。しかし、植物形質転換のため、細菌レバンスクラーゼおよびイヌロスクラーゼ配列は次の仕方によっても改変される。
【０１３３】
・細菌Ｎ−シグナルペプチドの除去、
・翻訳開始等、コドン使用の単子葉植物および双子葉植物への適応、
・潜在性スプライス部位およびＲＮＡ不安定化配列エレメントの除去、
・単子葉植物および双子葉植物の液胞ターゲティング配列ならびに植物１−ＳＳＴ特異的膜貫通ドメイン等、推定細胞内ターゲティング配列を用いてコード配列をさらに改変する。
【０１３４】
これらの変化の概略を次の実施例に記す。
【０１３５】
（実施例２）
細菌フルクタン生合成遺伝子の改変
細菌ＦＴ遺伝子の特異的細胞区画へのターゲティング
細菌ＦＴ遺伝子をサイトゾルから離れてスクロースおよびフルクタンの両方が蓄積する区画に方向付けるため、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）のプレプロスポラミンタンパク質（ＳＰＯＲ５３１）由来の推定液胞ターゲティング配列を用いてＳａｃＢおよびＬｓｃのコード配列を改変する。スポラミン前駆体のプロペプチドは、スポラミンの液胞へのターゲティングに必要とされる（Ｈａｔｔｏｒｉら、１９８５年）。スポラミンの液胞ターゲティング情報はアミノ末端プロペプチドにコードされ、これは図５および図６に示されている。
【０１３６】
配列改変は、ＳａｃＢおよびＬｓｃ細菌フルクタン（ｆｕｃｔａｎ）生合成遺伝子の両方からＮ−シグナルペプチドを除去すること、およびＳＰＯＲ５３１液胞ターゲティングシグナルを付加することに関与する（それぞれ図７〜８および図１０〜１１）。
【０１３７】
膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩ、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／を用いた細胞内局在の予測および改変されたタンパク質のトポロジーは、液胞ターゲティングシグナルによって誘発された膜貫通局在を示す（図９および図１２）。
【０１３８】
細菌ＦＴ遺伝子へのＬｐ１−ＳＳＴタンパク質由来膜貫通ドメインの付加
ＳＯＳＵＩソフトウェアは、Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ １−ＳＳＴ遺伝子の二次構造を予測するためにも用いた。Ｎ末端に膜貫通ドメインを示唆するこの構造を図１３に示す。膜貫通ドメインコード配列およびタンパク質配列をそれぞれ図１４および図１５に示す。
【０１３９】
配列改変は、ＳａｃＢおよびＬｓｃ細菌フルクタン生合成遺伝子の両方からＮ−シグナルペプチドを除去すること、およびＬｐ１−ＳＳＴ膜貫通ドメインを付加することに関与する（それぞれ図１６〜１７および図１９〜２０）。膜タンパク質の二次構造予測ソフトウェアＳＯＳＵＩを用いて、ＳａｃＢおよびＬｓｃの改変された配列の細胞内（ｓｕｂｓｅｌｌｕｌａｒ）局在およびタンパク質トポロジーを評価し、それらの予測二次構造をそれぞれ図１８および図２１に提示する。
【０１４０】
（実施例３）
双子葉植物における安定的な形質転換のためのベクターの作製
発現構築物の合成
双子葉植物に形質転換するための、光合成（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｉｃ）プロモーター、実施例２に示されている改変された細菌フルクタン生合成遺伝子およびＮＯＳターミネーター配列を利用した発現構築物を人工合成する。
【０１４１】
光合成プロモーターの使用はフルクタンを蓄積する組織において遺伝子を発現させ、一方改変された配列はタンパク質を特異的植物細胞区画に標的化させる。
【０１４２】
リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ−スモールサブユニット（ＲｂｃＳ）は、高等植物における十分に特徴付けられた光調節遺伝子である。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ−スモールサブユニット（ＡｔＲｂｃＳ）プロモーター配列の１７００ｂｐ断片は、以前にクローニングされている。発現ベクターで用いるため、ＡｔＲｂｃＳプロモーター由来のＴＡＴＡシグナルを含む、より短い断片を増幅するためのプライマーを設計する。
【０１４３】
改変された細菌フルクタン生合成遺伝子のための新たな予測配列は、植物における発現のためにコドン使用を変更させ、潜在性スプライス部位およびＲＮＡ不安定化配列エレメントを除去しつつ人工合成し、植物細胞におけるその性能を最適化する。
【０１４４】
図２３〜２６は、それぞれ発現カセットＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ、ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳおよびＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳを表し、これらはまだコドン最適化または不安定化エレメントの除去を行っていない。
【０１４５】
シロイヌナズナ光合成プロモーターによって駆動される改変された細菌ＦＴ遺伝子を含む双子葉植物形質転換のための構築物の作製
各合成発現カセットを、Ｇａｔｅｗａｙ法に使用可能なｐＤＯＮＯＲベクター内に配置して、植物の形質転換用の最終的な目的ベクターに組み換える。
【０１４６】
３５Ｓｐ：ｈｐｈ：３５Ｓｔ選択マーカーカセットを含む、Ｇａｔｅｗａｙ法に使用可能な目的ベクターを作製した。ｐＰＺＰ２００＿３５Ｓｐ＿ｈｐｈ＿３５Ｓｔ＿Ｒ４／Ｒ３（図２７）。
【０１４７】
Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ組換え反応は、次の双子葉植物の形質転換用のｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを作製する。
ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ（図２８Ａ）
ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ（図２８Ｂ）
ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＮＯＳ（図２８ｃ）
ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＮＯＳ（図２８ｄ）
（実施例４）
単子葉植物における安定的な形質転換のためのベクターの作製
発現構築物の合成
単子葉植物の形質転換用の、パンコムギ光合成プロモーター（ＴａＲｂｃｓｐ）、実施例２に示されている改変された細菌フルクタン生合成遺伝子およびＴａＲｂｃＳターミネーター配列を利用した発現構築物を人工合成する。光合成プロモーターの使用はフルクタンを蓄積する組織において遺伝子を発現させ、一方改変された配列はタンパク質を特異的植物細胞区画に標的化させる。
【０１４８】
パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）のＴａＲｂｃＳ調節配列（プロモーターおよびターミネーター）は、以前にクローニングされている（Ｚｅｎｇら、１９９５年；Ｓａｓａｎｕｍａ、２００１年）。発現ベクターで用いるため、ＴａＲｂｃＳ遺伝子（ＮＣＢＩ受託番号ＡＢ０４２０６９）由来のＴＡＴＡシグナルを含む、以前に発表された配列から得られた６９５ｂｐプロモーター断片を増幅する。
【０１４９】
改変された細菌フルクタン生合成遺伝子のための新たな予測配列を、植物における発現のためにコドン使用を変更させ、潜在性スプライス部位およびＲＮＡ不安定化配列エレメントを除去しつつ人工合成して、植物細胞におけるその性能を最適化する。
【０１５０】
上に概略されている方法を用いて発現カセットを合成し、フルクタン生合成遺伝子およびＬＸＲ（商標）技術の両方を含むトランスジェニック植物を作出する。ＬＸＲ（商標）技術は、ＡｔＭＹＢ３２遺伝子プロモーター制御下における葉老化遅延のための１種類の候補遺伝子（ＩＰＴ）を含む発現カセットに基づく。発現カセットＡｔＭＹＢ３ｐ：：ＩＰＴ：：３５Ｓｔは、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２号明細書に記載されている。トランスジェニックＬＸＲ（商標）植物の表現型は、植物の加齢に関連する葉の黄化およびクロロフィル喪失の減少を含み、これは光合成能の上昇を導き、分げつ化および植物バイオマスの改善をもたらす。
【０１５１】
２種の技術の統合は、光合成プロモーター活性化の拡大によるフルクタンの発現上昇をもたらし、植物における生産性の範囲を増加させることにより種々の適用の効力に有意な影響を与えることができる。
【０１５２】
図２９〜３６は、それぞれ発現カセットＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ、ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ、ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ、ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳおよびＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓを表し、これらはまだコドン最適化または不安定化エレメントを除去されていない。
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属の光合成プロモーターによって駆動される改変された細菌ＦＴ遺伝子を含む単子葉植物形質転換のための構築物の作製
各合成発現カセットを、Ｇａｔｅｗａｙ法に使用可能なｐＤＯＮＯＲベクター内に配置して、植物の形質転換用の最終的な目的ベクターに組み換える。
【０１５３】
Ｕｂｉ：：ｂａｒ：：ＮＯＳ選択マーカーカセットを含む、Ｇａｔｅｗａｙ法に使用可能な目的ベクターを作製した。ｐＢＳ：：Ｕｂｉ：：ｂａｒ：：ＮＯＳ＿Ｒ４／Ｒ３（図３７）。Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ組換え反応は、次の単子葉植物の形質転換用のｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターを作製する。
ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ（図３８Ａ）
ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ（図Ｂ）；
ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ（図３９Ａ）
ＴａＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ（図３９Ｂ）
ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ（図４０Ａ）
ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ（図Ｂ）
ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ（図４１Ａ）
ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ：：ＴａＲｂｃＳ＋ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓ（図４１Ｂ）
（実施例５）
双子葉植物用構築物 − Ｎ．ｔａｂａｃｕｍプロトプラストおよびＡ．ｔｈａｌｉａｎａ
直接送達バージョン（プロトプラストにおける一過性発現）ならびにシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）およびタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）への安定的な送達のためのバイナリー形質転換ベクターバージョンの、次の構築物を作製した。
１．ＡｔＲｂｃＳ：：１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ＊
２．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ＊
３．ＡｔＲｂｃＳ：：１−ＳＳＴ−Ｌｓｃ＊
４．ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−Ｌｓｃ＊
＊細菌レバンスクラーゼおよびイヌロスクラーゼ配列は、次の仕方で改変する：
・細菌Ｎ−シグナルペプチドの除去、
・翻訳開始等、コドン使用の単子葉植物および双子葉植物への適応、
・潜在性スプライス部位およびＲＮＡ不安定化配列エレメントの除去、
・単子葉植物および双子葉植物の液胞ターゲティング配列ならびに植物１−ＳＳＴおよびＦＦＴ特異的膜貫通ドメイン等、推定細胞内ターゲティング配列を用いてコード配列をさらに改変する。
【０１５４】
（実施例６）
ポリエチレングリコールを介したタバコ葉肉由来プロトプラストの形質転換
本実施例は、上文に記載されている発現カセットのタバコプロトプラストへの送達を説明する（図４２〜４５を参照）。
【０１５５】
Ｉ．直接遺伝子導入のための葉肉由来プロトプラストの単離
Ａ．葉肉由来プロトプラストを得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏシュート培養物の消化
酵素溶液
Ｋ４培地［０．３Ｍではなく０．４Ｍスクロースを含むＫ３培地］に溶解した１．０％（ｗ／ｖ）セルラーゼ「Ｏｎｏｚｕｋａ」Ｒ１０および１．０％（ｗ／ｖ）Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｒ１０。酵素標品の混入デンプンをペレット化させるため、スピンダウンする（Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機、ＳＳ３４ローター；７，０００ｒｐｍで１０分間）。ＫＯＨでｐＨ５．６に調整し、濾過滅菌（０．２μｍ孔径）する。４℃で長くて３〜４週間保存する。
【０１５６】
材料
・固形ＭＳ培地とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍシュート培養物の入った４００ｍｌ培養容器
・９０×２０ｍｍ滅菌ペトリ皿
・ピンセット
・メス
・滅菌メス刃；＃１１または＃２２ 。
【０１５７】
溶液
・酵素溶液；Ｋ４培地に溶解した１％セルラーゼおよび１％マセロザイム
・滅菌水 。
【０１５８】
手順
１．プレート底部をたっぷりと覆うのに十分な量の酵素溶液（１５ｍｌで十分と思われる）を滅菌９０×２０ｍｍペトリ皿にデカントする。
２．４〜６週目のシュート培養物から健常で十分に開いた葉を２〜４枚、空の９０×２０ｍｍペトリ皿に移す。
３．１枚の葉の背軸面を上にして、周囲の葉組織の断裂を最小限に抑えつつ鋭利な滅菌刃を確実に用いて慎重に主脈を除去する。これを残り３枚の葉に繰り返す。１回当たり少量の葉材料（最大４枚）を取り扱い、層流による乾燥効果を最小限に抑える。
４．半分にした葉を穏やかに積み重ね、鋭利な滅菌刃を用いて１〜２ｍｍ片にスライスする。
５．葉切片を酵素溶液の入ったペトリ皿に慎重に移す（背軸面を下に）。皿をＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で封じ、１６〜１８時間、２５℃、暗所で振盪せずに一晩インキュベートする。
【０１５９】
Ｂ．葉肉由来プロトプラストの単離
材料
・滅菌５ｍｌピペット
・滅菌１０ｍｌピペット
・ピペットボーイ
・滅菌したプロトプラスト濾過ユニット：１００ｍｌガラスビーカー上に載せた１００μｍステンレス鋼メッシュ篩
・滅菌１４ｍｌプラスチック製丸底遠心チューブ
・Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機
・ウォーターバス 。
【０１６０】
培地
・消化中のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ葉の入った９０×２０ｍｍ滅菌ペトリ皿（複数可）
・０．６％Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロースを含む、１：１混合のＫ３：Ｈ固形培地 。
【０１６１】
溶液
・オートクレーブしたＷ５溶液
・オートクレーブしたＫ３溶液 。
【０１６２】
手順
６．一晩消化した標本を穏やかに撹拌して酵素溶液中にプロトプラストを遊離させる。
【０１６３】
撹拌は穏やかに、だが徹底的に行い、左右に（水平に）動かして行うこと。
７．プレートをやや傾け、消化中の懸濁液（酵素溶液および植物デブリ）を移し易くする。１０ｍｌ滅菌ピペットを用いて消化中の懸濁液を滅菌したプロトプラスト濾過ユニットに移し、プロトプラスト懸濁液を植物デブリから分離する。
８．濾過ユニットを穏やかにタップして篩内にたまった余分な液体を出す。
９．プロトプラスト懸濁液を穏やかに混合し、１４ｍｌ滅菌プラスチック製丸底遠心チューブに分配し、約８ｍｌまで（最大９ｍｌ）充填する。
１０．懸濁液を再分配して均一な容量分配を得る（最大９ｍｌ）。
１１．各懸濁液に１．５ｍｌのＷ５溶液を慎重に重層する。
Ｗ５溶液を分注し易くするため、懸濁液の入ったチューブを傾けて置き、ピペットチップをチューブ開口部近くの壁面に触れさせ、その後懸濁液面のすぐ上までゆっくりと下げる。一滴ずつ加えながら、ピペットチップが可能な限り懸濁液面に近づいた状態を確実に維持しつつＷ５溶液をゆっくりと分注する。これを正確に行えば、プロトプラスト懸濁液の撹拌、ひいてはＷ５溶液との混合は最小限となるであろう。
１２．慎重に蓋をし、チューブを５分間、７０ｇで遠心分離する（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機、スイングアウトローター、４００ｒｐｍ）。プロトプラストは、界面に浮遊している筈である。
１３．プロトプラストの入ったチューブを直立に維持し、滅菌５ｍｌピペットをプロトプラスト層のすぐ上のポイントまで慎重に下げて、下相を可能な限り取らないよう界面におけるプロトプラストを採取する。
Ｗ５溶液も同時に採取される。
１４．プロトプラストを採取し、「１本」の新しい１４ｍｌ遠心チューブに移す。プロトプラスト採取が完了したら、ピペッティングで穏やかに吸って吐くことによりプロトプラスト懸濁液を穏やかに混合する。
１５．プロトプラスト懸濁液の１００μｌアリコートを取り分け、９００μｌのＷ５溶液の入ったチューブに移すことにより、プロトプラスト収量を決定する。血球計算板でプロトプラストを計数し、１ｍｌ当たりのプロトプラスト数を決定する。
１６．１ｍｌ当たり約１×１０６（最大１．５×１０５）個のプロトプラストを得るのに必要な全容量を算出する。新しい１４ｍｌ丸底遠心チューブにプロトプラスト懸濁液を分配し、等容量が得られたことを確実にする。
１７．１０ｍｌピペットを用いて、プロトプラストの入った各チューブを全容量最大１０ｍｌまでＷ５溶液で充填する。プロトプラストが乱れるのを最小限に抑えるため、充填の際チューブ壁に沿わせてＷ５溶液を散布する。
１８．蓋をし、蓋閉めしたチューブを穏やかに１回反転することによってプロトプラストを再懸濁する。
１９．プロトプラストをペレット化し［７０ｇ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機、４００ｒｐｍ）５分間でスピンする］、その後Ｗ５溶液を全て除去して純粋なプロトプラスト懸濁液を残す。
２０．穏やかに振盪することによりプロトプラスト懸濁液を再懸濁する。
２１．プロトプラストの入った各チューブを全容量５ｍｌまでＷ５溶液で充填し、室温で最短で１時間、最長で４時間インキュベートする。
２２．１〜４時間のインキュベーション時間の間に、単離プロトプラストに直接遺伝子導入するための調製物に次の構成要素を構成する。
【０１６４】
・４０％ＰＥＧ溶液を−２０℃保存から取り出し、室温で保存する。直接遺伝子導入に進む３０分前に、ＰＥＧ溶液を温水の入ったビーカー内でインキュベートする。
【０１６５】
・Ｋ３：Ｈ固形培地を電子レンジで融解させる。完全に融解したら、使用準備が整うまで４０℃のウォーターバス内に置く。
【０１６６】
ＩＩ．ポリエチレングリコールを用いたプロトプラストへの直接遺伝子導入
ＤＮＡ形質転換
１００％（ｖ／ｖ）エタノールで沈殿および洗浄することによりプラスミドＤＮＡを滅菌し、層流フード内で乾かす［７０％エタノールにおけるプラスミドＤＮＡの沈殿も可能であるが、ＤＮＡペレットは乾かすのにさらに時間がかかる］。一過性形質転換のため、終濃度０．７μｇ／μｌになるようＤＮＡペレットを３０μｌの滅菌再蒸留水に再懸濁する。ＤＮＡの物理的構造は、一過性のためにはスーパーコイルとなるべきであり、安定的な形質転換のためには直鎖化するべきである（対象遺伝子の外側で）。形質転換プラスミドＤＮＡにキャリアーＤＮＡ（例えば、魚精子ＤＮＡ）を添加すると、通常、より良好で安定的な形質転換頻度が得られる。安定的な形質転換のため、上に示す通り１０μｇの直鎖化プラスミドＤＮＡおよび４０μｇの剪断した魚精子ＤＮＡを共沈殿し、乾かし、３０μｌの滅菌再蒸留水に溶解する。
【０１６７】
形質転換バッファー
１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）および０．５Ｍマンニトール。蒸留水に溶解した後、ＫＯＨでｐＨ５．８に調整し、オートクレーブする。４℃で保存する。
【０１６８】
ＰＥＧ溶液
０．４Ｍマンニトールおよび０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２中の４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００。ＰＥＧを０．４Ｍマンニトールおよび０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２に溶解する（これら２種の構成要素の終濃度は、ＰＥＧの容量のため低くなる）。ｐＨ８〜９に調整し、オートクレーブする（ｐＨはこの溶液中で安定化するのに数時間、例えば一晩かかり、オートクレーブ後にｐＨ６〜７に下がる）。
【０１６９】
材料
・滅菌１ｍｌピペット
・滅菌５ｍｌピペット
・滅菌１０ｍｌピペット
・ピペットボーイ
・滅菌１４ｍｌプラスチック製丸底遠心チューブ
・Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機
・ウォーターバス
・５０×１０ｍｍペトリ皿 。
【０１７０】
培地
・単離プロトプラスト懸濁液、ペレット化の入った１４ｍｌ丸底遠心チューブ
・０．６％Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロースを含む１：１混合のＫ３：Ｈ固形培地 。
【０１７１】
溶液
・オートクレーブしたＷ５溶液
・オートクレーブしたＫ３溶液
・オートクレーブしたＨ溶液
・４０％ＰＥＧ溶液
・形質転換バッファー
・３０μｌの滅菌再蒸留水に溶解した１０μｇの形質転換ＤＮＡ 。
【０１７２】
手順
１．プロトプラストをペレット化し［７０ｇ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機、４００ｒｐｍ）で５分間スピンする］、その後Ｗ５溶液を全て除去し、純粋なプロトプラスト懸濁液を残す。
２．１ｍｌピペットを用いて、３００μｌ（約７滴）の形質転換バッファーを単離プロトプラストの入った各１４ｍｌ丸底遠心チューブに加える（滴下する）。
３．チューブ底を穏やかにタップすることによってペレットを慎重に再懸濁する。
４．各プロトプラスト懸濁液に１０μｇ（３０μｌ）の形質転換ＤＮＡを加え、その後３００μｌ（１ｍｌピペットを分注に用いる場合、約７滴）の予熱したＰＥＧ溶液を加える。チューブ底を穏やかにタップすることによってプロトプラスト懸濁液を混合する。
形質転換バッファーへのプロトプラスト再懸濁と形質転換ＤＮＡおよびＰＥＧの添加との間の時間間隔は、最短を維持しなければならない。
５．形質転換混合物を１５分間、室温で撹拌せずにインキュベートする。
６．１０ｍｌピペットを用いて、次の間隔で１０ｍｌのＷ５溶液を各チューブに徐々に加える。
【０１７３】
・１ｍｌ（約１２滴）を各チューブに滴下する。全チューブを穏やかに反転して混合する。
【０１７４】
・１ｍｌ（約１２滴）を各チューブに滴下する。全チューブを穏やかに反転して混合する。
【０１７５】
・１ｍｌ（約１２滴）を各チューブに滴下する。全チューブを穏やかに反転して混合する。
【０１７６】
・２ｍｌを穏やかな流れとして各チューブに加える。全チューブを穏やかに反転して混合する。
【０１７７】
・２ｍｌを穏やかな流れとして各チューブに加える。全チューブを穏やかに反転して混合する。
【０１７８】
・３ｍｌを穏やかな流れとして各チューブに加える。全チューブを穏やかに反転して混合する。
【０１７９】
分注し易くするため、分注前に、各チューブを必要容量のＷ５溶液で充填するのに各間隔で必要とされる合計容量を１０ｍｌピペットで採取する。各間隔でこれを繰り返す。
７．プロトプラストをペレット化し［７０ｇ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機、４００ｒｐｍ）で１０分間スピンする］、その後全Ｗ５溶液を除去し、純粋なプロトプラスト懸濁液を残す。次に進む前に、全チューブ底を１回タップする。
【０１８０】
一過性形質転換用手順
８．合計容量が最大５ｍｌとなるよう、等容量のＫ３培地およびＨ培地（各溶液２．５ｍｌ）にプロトプラストペレットを再懸濁する。
９．液体Ｋ３：Ｈ＋プロトプラスト懸濁液の混合液を５０×１０ｍｍペトリ皿の中央にゆっくりと移す。
１０．全皿をＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で封じ、一過性発現解析に進む前にプロトプラストを２４〜７２時間、薄明かりの下で２４℃にて培養する。
【０１８１】
安定的な形質転換用手順
１１．次の「パートＩＩＩ．葉肉由来プロトプラストの培養および植物体の再生」に続ける。
【０１８２】
ＩＩＩ．葉肉由来プロトプラストの培養および植物体の再生
ステップ１＆２のため、プロトプラストの入った各チューブは、一度に１チューブで取り扱わなければならない。
【０１８３】
材料
・滅菌１ｍｌピペット
・滅菌５ｍｌピペット
・滅菌１０ｍｌピペット
・ピペットボーイ
・Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００卓上遠心分離機
・ウォーターバス
・５０×１０ｍｍペトリ皿
・オートクレーブしたステンレス鋼製スパチュラ
培地
・単離プロトプラスト懸濁液、ペレット化の入った１４ｍｌ丸底遠心チューブ
・０．６％Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロースを含む１：１混合のＫ３：Ｈ固形培地、４０℃
・オートクレーブしたＫ３溶液
・２０ｍｌのＡ培地の入った２５０ｍｌ培養容器
・固形ＭＳ Ｍｏｒｐｈｏ培地の入った１２ウェルＣｏｓｔａｒ（登録商標）プレート
・固形ＭＳ Ｍｏｒｐｈｏ培地の入った２５０ｍｌ培養容器
・固形ＭＳ培地の入った２５０ｍｌ培養容器 。
【０１８４】
手順
１．プロトプラストペレットの近くに０．５ｍｌのＫ３培地を加えて、プロトプラストを再懸濁する。
２．Ｋ３＋プロトプラスト懸濁液の混合液を５０×１０ｍｍペトリ皿の中央にゆっくりと移す。
３．次に進む前に、プロトプラストの入った全チューブに対しステップ１および２を繰り返す。
４．一度に１プレートで、予熱した０．６％Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロースを含む１：１混合のＫ３：Ｈ培地を５ｍｌ加える。穏やかな旋回運動でプレートを１回だけ振盪して培地中のプロトプラスト懸濁液を均等に分布させる。全プレートに対しこれを繰り返す。
５．培地が固形化するまで（外気温に依存して１０〜３０分間）、プレートを放置し手をつけない。
６．全皿をＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で封じ、プロトプラストを２４時間、完全な暗所で２４℃にて培養し、続いて６日間連続的な薄明かり（５μｍｏｌ・ｍ−２ｓ１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）の下で培養すると、最初の、そして複数の細胞分裂が行われる。
７．滅菌スパチュラを用いて、プロトプラストを含むｓｅａ ｐｌａｑｕｅアガロースプラグを四分円に分割し、適切な抗生物質を添加した２０ｍｌのＡ培地の入った２５０ｍｌプラスチック製培養容器内に置く（２５０ｍｌ容器につき１個の四分円）。ロータリーシェーカー上で８０ｒｐｍ、１．２５ｃｍ ｔｈｒｏｗ、２４℃、連続的な薄明かりでインキュベートする。
８．２週間毎に液体Ａ培地＋適切な抗生物質を交換し、プロトプラスト由来コロニーの生長をモニターする。
９．プロトプラスト由来コロニーが直径約２〜３ｍｍになったとき（液体Ａ培地中で５〜６週間インキュベーション）、コロニーをＭＳ Ｍｏｒｐｈｏ固形培地の入った２４ウェルＣｏｓｔａｒ（登録商標）プレートの個々のウェルに移す。
１０．プレート（複数可）を１〜２週間、２４℃で連続的な薄明かり（５μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）の下でインキュベートすると、カルスは増殖して直径８〜１０ｍｍのサイズに達する。
１１．プロトプラスト由来カルスが直径約１〜２ｃｍになったとき、カルスを固形ＭＳ Ｍｏｒｐｈｏ培地の入った個々の２５０ｍｌ培養容器に移す。容器を２４℃で１６時間・明／８時間・暗条件下（２０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）でインキュベートする。１〜２週間以内に、複数のシュートを目視できるようになる。
１２．長さ３〜４ｃｍのシュートを固形ＭＳ培地の入った２５０ｍｌ培養容器に移し、根形成を助長する。容器を２４℃、１６時間・明／８時間・暗条件下（２０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）でインキュベートする。３週間以内に、根形成の徴候を目視できるようになる。
１３．確立された根システムを備える小植物を、タバコ葉肉プロトプラストの供給源としてのｉｎ ｖｉｔｒｏ植物培養物として維持する。
【０１８５】
（実施例７）
エバンスブルー染色を用いたタバコプロトプラスト生存率の評価
図４６および図４７を参照。
【０１８６】
背景情報
・エバンスブルー染色（ＥＶＢ；６，６’−［（３，３’−ジメチル１［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）ビス（アゾ）ビス［４−アミノ−５−ヒドロキシ−１，３−ナフタレンジスルホン酸］四ナトリウム塩）
・非蛍光色素
・作用方法：生細胞は、エバンスブルーを排除する能力を細胞膜に保持し、その本来の色を保つ。塩または浸透圧ストレスにより損傷を受けた細胞は、エバンスブルーを排除することができず紺青に染色され、検鏡により容易に識別できる。
【０１８７】
・調製方法：４００ｍｇ／ｌ原液（溶媒：０．６５Ｍマンニトール）
・染色方法：エバンスブルー原液を等容量のプロトプラスト懸濁液に加えて穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートし、その後顕微鏡で可視化する。
【０１８８】
・検出方法：Ｌｅｉｃａ ＭＺＦＬ ＩＩＩ光学解剖顕微鏡
（実施例８）
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍプロトプラストにおける遺伝子発現解析
実験目標：トランスフェクトしたタバコプロトプラストにおけるクローニングした遺伝子ＡｔＲｂｃＳ：：１−ＳＳＴ−ＳａｃＢおよびＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢの発現をＲＴ−ＰＣＲを用いて試験した。
【０１８９】
材料と方法：３プレートのプロトプラストの命名
ｉ）トランスフェクトしたプロトプラスト（試料９Ａ）：ＡｔＲｂｃＳ：：１−ＳＳＴ−ＳａｃＢ
ｉｉ）トランスフェクトしたプロトプラスト（試料１２Ａ）：ＡｔＲｂｃＳ：：ＳＰＯＲ−ＳａｃＢ
ｉｉｉ）非トランスフェクトプロトプラスト 。
【０１９０】
発現解析に関与するステップ：
１．プライマー設計およびＰＣＲの最適化
２．全ＲＮＡの単離
３．ＲＴ反応
４．ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ
プライマー設計およびＰＣＲ産物の同一性：ビーコン設計ソフトウェア（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）および遺伝子バンクにおいて利用できる遺伝子配列を用いてプライマー対を設計して対象遺伝子を増幅した。その結果生じるＰＣＲ産物のサイズが２００〜２５０ｂｐの範囲になるよう遺伝子特異的プライマーを選択した。融解曲線解析およびゲル電気泳動に基づくサイズによりＰＣＲ産物を同定した。
全ＲＮＡ単離：１処理当たり１×１０６個のプロトプラストからＰＲＯＭＥＧＡ製のＳＶ全ＲＮＡ単離システムにより全ＲＮＡを単離する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｔｂｓ／ｔｍ０４８／ｔｍ０４８．ｐｄｆ
【０１９１】
【表１】
逆転写酵素反応
ＱＩＡＧＥＮ ＲＴキットを用いてＲＴ反応を行った。プライマーミックス（ＱＩＡＧＥＮ）を用いることにより４通りのＲＴ反応を行った（９、１２、対照およびＷＴタバコＲＮＡ）。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ１．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｃｒ／ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＰｃｒＳｙｓｔｅｍｓ／ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＲｅｖＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ．ａｓｐｘ＃Ｔａｂｓ＝ｔ２
上述の試料それぞれの複製物を、遺伝子特異的プライマーを用いたＲＴ反応に付した。具体的には、試料９Ａおよび１２ＡはｓａｃＢリバースプライマーを用いて、対照（非トランスフェクト）試料は１８Ｓリバースプライマーで転写した。
【０１９２】
ＰＣＲ
反応を次の通りセットアップした。
２×ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ） １０μＬ
ｃＤＮＡ鋳型 ２．０μＬ
フォワードプライマー（１０μＭ） ０．５μＬ
リバースプライマー（１０μＭ） ０．５μＬ
ヌクレアーゼを含まない水 ７．０μＬ 。
【０１９３】
反応サイクルは次の通りである。
ステップ１：９５℃ ２分間
ステップ２：９５℃ ３０秒間
ステップ３：５５℃ ３０秒間
ステップ４：７２℃ ６０秒間
ステップ２から２５サイクル（１８Ｓ）、あるいはステップ２から３５サイクル（ｓａｃＢ）
ステップ５：４℃ ホールド 。
【０１９４】
１×ＴＢＥバッファー中で１％（ｗ／ｖ）アガロースにより電気泳動し、ＳＹＢＲ（５０μＬ／Ｌ）で染色した後、ＵＶ光の下で反応産物を可視化する。
【０１９５】
トランスフェクトしたプロトプラストｃＤＮＡ試料（９および１２）の両方でｓａｃＢ転写産物の検出が示され、一方、非トランスフェクトプロトプラストｃＤＮＡ試料から１８Ｓを増幅することによって、用いた方法を検証した（図５０）。
【０１９６】
光調節プロモーターの制御下におけるキメラｓａｃＢ遺伝子の発現をトランスフェクトしたプロトプラストにおいて観察した。産物は、ＲＴなし対照および鋳型なし対照では観察されなかった。ｓａｃＢ遺伝子発現は、試料９Ａおよび１２Ａに用いたベクターでトランスフェクトしたプロトプラストにおいて検出することができた。
【０１９７】
（実施例９）
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介したタバコリーフディスクの形質転換
本実施例は、上文に記載の発現カセットを用いて遺伝子操作したバイナリーベクターを運ぶアグロバクテリウムを用いたタバコリーフディスクの安定的な形質転換を説明する（図４８および図４９を参照）。
【０１９８】
序文
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介したリーフディスク形質転換の利用は、トランスジェニック植物を作出する効率的な方法である。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、植物に感染して細菌ＤＮＡを植物ゲノムに組み入れるための遺伝的機構を含む天然の双子葉植物病原体である。この能力の結果、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを、例えば特定の対象ＤＮＡをタバコに組み入れるためのクローニング媒体として採用することができる。
【０１９９】
この方法は、タバコにおけるモデルシステムの作製に用いて、対象遺伝子のｃＤＮＡ異種クローンの機能を評価することができる。
【０２００】
材料および化学薬品
装置および器具
水平流の層流フード（シリーズＨＷＳ１８０、ＣＬＹＤＥ−ＡＰＡＣ、Ｅｖａｎｓ Ｄｅａｋｉｎ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．の一部門、ウッドビルノース、南オーストラリア州５０１２、オーストラリア）、ロータリーシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ型ＲＣ−４０６、Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ、ＣＨ−４１０３ボットミンゲン、スイス）、スイングアウトローターを備える卓上遠心分離機（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｏｒｂｉｔａｌ ５００）、ピンセット（先曲がり（ｂｅｎｄ）、ｃａｔ ｎｏ．２１０８／１６０、Ｃｒｏｗｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロウビル、ビクトリア州３１７８、オーストラリア）、滅菌外科手術用メス刃（サイズ１１、ｃａｔ ｎｏ．１８３８、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｕｐｐｌｙ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、ミルペラ（Ｍｉｌｐｅｒｒａ）ＤＣ、ニューサウスウェールズ州１８９１、オーストラリア）を備えるメス柄（Ｎｏ３、ｃａｔ ｎｏ．ＳＨＮ３、Ｃｒｏｗｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロウビル、ビクトリア州３１７８、オーストラリア）を用いた。
【０２０１】
原液
全培地に必要なマクロ成分、ミクロ成分およびビタミンは、それらを添加する際に有用となるよう、濃縮ストック（マクロ成分ストック：１０倍濃縮；ミクロ成分およびビタミンストック：１００倍濃縮）として調製する必要がある。ミクロ成分以外の全ストックは、室温で調製する。ミクロ成分ストックの調製は、混合前に構成要素の加熱を必要とする。Ｎａ２−ＥＤＴＡおよびＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏは、混合前にそれぞれ４００ｍＬの蒸留水（全容量１０００ｍＬに対し）に溶解する必要がある。溶解した溶液を混合し、溶液が黄色に変色するまでｃａ．６０℃で加熱する。残りの構成要素を添加する前に溶液を冷ます。溶液を蒸留水で１０００ｍＬとする。全ストックを４℃で保存する。ホルモン［２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）およびカイネチン］を１Ｍ ＫＯＨに溶解し、蒸留水で希釈して１００ｍｇ／リットル濃縮ストックを調製する。
【０２０２】
培地
それらの個々の原料を終濃度で用いた培地の組成を別表１に示す：ＭＳミクロ、ＭＳマクロ、Ｂ５ビタミン、Ｌａｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地、洗浄培地、ＰＣ培地、ＳＥＬ培地、ＲＭ培地およびＳＥＭ培地。
【０２０３】
化学薬品
２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、活性炭、チメンチン（同じ濃度のセフォタキシムに代替可能）、ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）、ゼアチン、ＡｇＮＯ３、リファンピシン、寒天（Ｄｉｆｃｏ、Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ、ｃａｔ．ｎｏ：０１４０−０１）はゲル化剤とし用いる。他の化学薬品（ＰＥＧ４０００、Ｔｗｅｅｎ８０、ＫＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２）は、ＢＤＨから購入し、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ））はＳｉｇｍａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ−８２５０）から、カナマイシン硫酸塩はＳｉｇｍａから、ハイグロマイシンＢはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから、Ｃａ（ＯＣｌ）２（ほぼ６５％）およびホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ）は、Ｒｏｔｈ ａｎｄ Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎからそれぞれ購入される。スクロースはＦｌｕｋａ（ｃａｔ．ｎｏ：８４１００）から購入した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）「Ｍ」（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎ（商標）、グリニッジ、コネチカット州０６８３６、米国）は、封密用テープとして用いた。滅菌使い捨て瓶上型フィルター（０．２μｍ ｖａｃｕｃａｐ９０；ｃａｔ．ｎｏ．４６２２、Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、チェルトナム、ビクトリア州３１９２、オーストラリア）および使い捨てフィルターユニット（０．２μｍ；ｃａｔ．ｎｏ．１６５３４、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ、３７０７０ゲッティンゲン、ドイツ）をフィルター滅菌に用いた。滅菌使い捨てピペット：１ｍＬ＿（ＴＲＰ（登録商標）；ｃａｔ．ｎｏ．９４００１）、５ｍＬ＿（ＴＲＰ（登録商標）；ｃａｔ．ｎｏ．９４００５）および１０ｍｌ＿（ＴＲＰ（登録商標）；ｃａｔ．ｎｏ．９４０１０）は全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｔｙ． Ｌｔｄ．、モルグレイブ、３１７０オーストラリア製であり、ねじ蓋付き滅菌プラスチック製遠心チューブ（１４ｍＬ、ＴＲＰ（登録商標）；ｃａｔ．ｎｏ．９１０１６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、モルグレイブ、３１７０オーストラリア）、滅菌プラスチック製ペトリ皿（９０×１４ｍｍ；ｃａｔ．ｎｏ．８２．９９２３．４８４および６０×１４ｍｍ、ｃａｔ．ｎｏ．８３．１８０１．０１１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ（登録商標）Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、テクノロジーパーク、南オーストラリア州５０９５、オーストラリアならびに９０×２０ｍｍ；ｃａｔ．ｎｏ．６６４１６０、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ、７２６３６フリッケンハウゼン、ドイツ）およびオートクレーブ可能培養容器（２５０ｍＬ、ｃａｔ．ｎｏ．７５．９９２２．５１９、Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ、テクノロジーパーク、南オーストラリア州５０９５、オーストラリア）を用いた。
【０２０４】
植物材料
Ａ）Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ１の滅菌シュート培養物を利用することができる。これは、次亜塩素酸塩溶液［１．４％（ｗ／ｖ）Ｃａ（ＯＣｌ）２、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０］中で１５分間表面滅菌し、滅菌蒸留水中で３〜４回リンスした後、０．８％（ｗ／ｖ）寒天で固形化した半分に薄めたＭＳ培地（別表１）上に発芽のため播種した、対応する種子から確立する。２〜３枚の葉をつけたシュートを切り出し、２５０ｍＬ培養容器内の０．８％（ｗ／ｖ）寒天で固形化したＭＳ培地上で２５℃、１６ｈ／ｄ明期（２０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）で培養する。根の生えたシュートを、６週間の間隔で使用前に茎切断として数回継代培養する。
Ｂ）ガラス温室で育成したＮ．ｔｏｂａｃｕｍを利用してもよいが、後述［Ｉ．Ｂ）］の通り葉の表面滅菌が必要である。植え付けが深過ぎないこと、また湿り気が十分であることを確実にしつつ、種子を滅菌土壌に植える。１６ｈ／ｄ明期（２０ｕｍｏｌｍ“２ｓ”１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）条件下、２５℃で培養し、Ｏｓｍｏｃｏｔｅスローリリース肥料を用いて施肥する。
Ｃ）リーフディスク形質転換に利用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株はＡＧＬ１である。
【０２０５】
Ｉ．タバコリーフディスクをベクターｐＢｉｎｈｐｈ２００で形質転換するためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの調製
形質転換したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１の前培養をタバコ形質転換日の２日前に開始し、滅菌条件が維持されていることを確実にする（ｐＢｉｎｈｐｈ２００のＩＤカードについては別表２を参照）。
１．−７０℃で凍結したグリセロール細菌ストックの表面を接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）用ループで掻き取り、滅菌チューブ内の２ｍＬのＬＢ（２０ｍｇ／ｍＬリファンピシン＋１０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含む）に接種する。２４時間、２８℃、１５０ｒｐｍでインキュベートする。
２．４ｍＬのＬＢ＋抗生物質（１２ｍＬ滅菌チューブ内）に０．２５ｍＬの前記２４時間前培養物を接種する。６〜７時間、２８℃でインキュベートする。
３．２５ｍＬの抗生物質なしＬＢ（１５０ｍＬ滅菌フラスコ内）に０．０２５ｍｌの前記６〜７時間前培養物を接種し、一晩２８℃、１５０ｒｐｍでインキュベートする。
４．２５ｍｌの前記一晩前培養物に２５ｍｌのＬＢを加え、２８℃でさらに９０分間、１５０ｒｐｍで培養を継続する。
５．５０ｍｌの前培養物を遠心チューブに移し、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ卓上遠心分離機において１２分間、２，０００ｒｐｍ、室温でスピンする。
６．上清を除去し、ペレットを２０ｍＬのＷＭに穏やかに再懸濁する。ＯＤ６００を測定する。細菌懸濁液にさらにＷＭを加え、最終ＯＤ６００を０．４５とする。この調製物をステップＩＩＩ）の１に用いる。
【０２０６】
ＩＩ．リーフディスクの調製
Ａ）タバコシュート培養物を用いたリーフディスクの調製
１．層流において、ＭＳ培地上で培養したタバコ植物体から４〜６枚の葉を収集する。葉をＷＭの入った１．５×９ｃｍペトリ皿に置く。メスを用いて主脈を除去し、葉組織をほぼ１ｃｍ２四方に切る。この時点で、組織またはリーフディスクは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＧＬ１）による形質転換の準備が整った。ディスクは１時間以内に形質転換しなければならない。
Ｂ）非滅菌タバコ組織を用いたリーフディスクの調製
１．ガラス温室で育成したタバコ植物体から４枚の若い葉（ほぼ８ｃｍの長さ）を収集する。
２．葉を７０％エタノールの入った滅菌ビーカー内に置き、アルミホイルで覆い、円軌道シェーカー（Ｂｉｏ−Ｌｉｎｅ円軌道シェーカー、Ｅｄｗａｒｄｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）上で１分間、穏やかに旋回させる。
３．７０％エタノールを除去し、１％Ｃａ（ＯＣｌ）２に交換する。組織を８分間旋回させる。葉を滅菌水中で少なくとも３回洗浄する。
４．層流において主脈を除去し、残りの葉組織をほぼ１ｃｍ２四方に切る。調製したディスクをＷＭの入った１．５×９ｃｍペトリ皿内に置く。この時点でディスクは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＧＬ１）による形質転換の準備が整った。
【０２０７】
ＩＩＩ．リーフディスクとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのインキュベーションおよび共存培養
１．ＷＭ（リーフディスク調製における最後のステップのもの）をアグロバクテリウム培養物に交換し、１〜２分間インキュベートする。
２．細菌懸濁液を除去し、外植片をＷＭで短時間リンスする。ＰＣ培地上に播く前に、滅菌ナプキンで外植片を拭き取る。３日間共存培養するため、育成室（１６ｈ／ｄ明期（２０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１、Ｏｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白チューブ）条件、２５℃）内に置く。
【０２０８】
ＩＶ．アグロバクテリウムを介した形質転換後のリーフディスクの前再生
１．外植片（５／プレート）をＳＥＬ培地に移し、育成室にさらに７日間戻しておく。
【０２０９】
Ｖ．再生
１．外植片（５／プレート）をＲＭに移し、育成室に戻す。シュート形成は３〜６週間以内に起こるであろう。４週間後に外植片を新しいＲＭに移す。
２．カルスが大きくなり過ぎたら、特に培地に接触していないシュートがある場合、メスを用いてカルスを分割する。できるだけ多くのシュートを選抜に曝露させる。
【０２１０】
ＶＩ．シュートの伸長および根の発達
１．選抜８週間後、あるいは選抜中の非形質転換対照外植片が死滅したとき、緑色のシュート（５／プレート）を９×２ｃｍペトリ皿内のＳＥＭ培地（ＩＢＡ（１ｍｇ／Ｌ）を含む）に移す。４〜５週間で根が出てくる筈である。
【０２１１】
ＶＩＩ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ小植物発達
１．根が出たら、根の生えた小植物を組織培養容器内のＳＥＭ培地に移す。
【０２１２】
参考文献
Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｃ．Ｎ．Ｊｒ．、Ａｄａｎｇ、Ｍ．Ｊ．、Ａｌｌ、Ｊ．Ｎ．、Ｒａｙｎｅｒ、Ｐ．Ｌ．、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ、Ｓ．およびＰａｒｒｏｔｔ、Ｗ．Ａ．（１９９６年）Ｉｎｓｅｃｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｄｏｓａｇｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｃａｎｏｌａ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｃｒｙｌＡｃ ｇｅｎｅ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１１２巻：１１５〜１２０頁 。
【０２１３】
別表
【０２１４】
【表２】
【０２１５】
【表３】
【０２１６】
【表４】
【０２１７】
【表５】
（実施例１０）
同じ発現カセットで改変したバイナリーベクターを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いたフローラルディップ法によるシロイヌナズナ（ＡＲＡＢＩＤＰＯＳＩＳ）の安定的な形質転換
電気的形質転換受容性のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞の調製
実験手順
１．−８０℃凍結グリセロールストックから、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＧＬ１株）を２０ｍｇ／Ｌリファンピシンおよび１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＭＧＬ寒天上に画線培養し、２７℃で２日間インキュベートする。
２．５ｍｌのＭＧＬを５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブ内で測定し、リファンピシン２０ｍｇ／Ｌおよびアンピシリン１００ｍｇ／Ｌの終濃度となるよう加える。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＧＬ１のシングルコロニーを接種する。
３．１５０ｒｐｍの円軌道シェーカー上の傾いた試験管立てにおいて（ｃａ．３０度）２７℃で２４時間インキュベートする。
４．夕方、２０ｍｇ／Ｌリファンピシンおよび１００ｍｇ／Ｌアンピシリン（ａｍｐｌｉｃｉｌｌｉｎ）（５００ｍｌフラスコ内）を含む１００ｍｌのＭＧＬに、５００μｌの一晩培養物を接種する。
５．２７℃で一晩、１５０ｒｐｍの円軌道シェーカー上で０．４〜０．６（最大０．６）の間のＯＤ６００が得られるまでインキュベートする。過増殖した場合は下のコメントを参照。
６．オートクレーブしたＪＡ１０遠心チューブに細胞を移し、氷上で１０分間冷やす。
７．ＪＡ１０ローターを用いて１０分間、９０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離する。
８．培養に用いた５００ｍｌフラスコに注ぐことによって、上清を慎重に廃棄する（ペレットは非常に安定的というわけではない）。
９．２０ｍｌの氷冷１０％グリセロールをＪＡ１０遠心チューブ内のペレットに加え、ボルテックス撹拌することによりペレットを再懸濁する。
１０．懸濁液をＪＡ２０遠心チューブに注ぎ、ＪＡ２０ローターを用いて１０分間、１００００ｒｐｍ、４℃でスピンする。
１１．５００ｍｌフラスコに注ぐことにより上清を廃棄する。
１２．１５ｍｌの氷冷１０％グリセロールをペレットに加え、ピペッティングにより再懸濁する。ＪＡ２０ローターにおいて１０分間、１００００ｒｐｍ、４℃で遠心分離する。
１３．ステップ１１および１２を２回繰り返す。
１４．ペレットを１ｍｌの氷冷１０％グリセロールに再懸濁し（ピペットまたはボルテックスによる）、滅菌マイクロチューブに移す。
１５．微量遠心管において３分間、１３０００ｒｐｍ、４℃でスピンする
１６．最後に、ペレットを１ｍｌの１０％氷冷グリセロールに再懸濁する。
１７．標識された１．７ｍｌマイクロチューブに５０μｌバッチのアリコートを作成し、液体窒素中でスナップ凍結する。
１８．液体窒素からチューブを取り出し、コンピテント細胞を−８０℃で保存する。
【０２１８】
コメント
Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細菌培養物を取り扱う間、ゴム手袋を着用する。全細菌廃棄物を５００ｍｌフラスコ内に集め、オートクレーブする。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの１００ｍｌ培養物が過増殖したら、２０ｍｇ／Ｌリファンピシンを含む新しいＭＧＬ培地で１／３〜１／４希釈し、さらに１〜２時間インキュベートする。
【０２１９】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのエレクトロポレーションによる形質転換
実験手順
１．ジーンパルサーキュベットホルダーを氷上で予冷する。
２．コンピテントアグロバクテリウム（ＡＧＬ１）細胞のアリコートを−８０℃から取り出し、氷上で解凍する。
３．ジーンパルサー背面のメインスイッチを入れる。電圧を２．５ｋＶに調整し（ディスプレイ上に「２．５」と記録されるまで「ｒａｉｓｅ」ボタンを使う）、静電容量２５μＦＤおよび抵抗６００Ωにする。
４．５０μｌ以上の容量の解凍した細胞に０．１μｇのＤＮＡを加える。
５．ピペッティングにより混合し、細胞／ＤＮＡ混合液を予冷した０．２ｃｍ ｇａｐジーンパルサーキュベットに移す。
６．両方の電極に細胞が触れるよう、細胞をキュベット底面に慎重にタップまたは振盪する。
７．キュベットの外側をティッシュペーパーで乾かし、キュベットをキュベットホルダー内に置く。キュベット上の切れ込みは正確な方向付けを確実にする。キュベットがチャンバー底の接触点の間に収容されるまでキュベットホルダーをチャンバー内にスライドさせる。
８．ビープ音がするまで両方の赤いボタンを押すことによって細胞にパルスを与える。この機械は、充電の間はＣＨＧを表示し、放電の際にビープ音を出す。細胞を戻して１分間氷上に置いて回復を助ける。
９．ガラス製注入器を用いて１ｍｌのＬＢ培地をキュベット内の細胞に加える。
１０．懸濁液を吸って吐いて混合し、滅菌１５ｍｌチューブに移す。
１１．傾いた試験管立て（ｃａ．３０度）を用いて１５０ｒｐｍの円軌道シェーカー上で１〜２時間、２７℃でインキュベートする。
１２．９ｍｌのＬＢを細胞懸濁液に加えて徹底的に混合し、２０ｍｇ／Ｌリファンピシンおよび適切な抗生物質（例えば、ｐＰＺＰシリーズのベクターに対しては１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン）を含むＬＢプレート上にこの培養物１００μｌを播く。この懸濁液１００μｌを９００μｌのＬＢブロスの入った１．７ｍｌマイクロチューブに移し、徹底的に混合し、適切な抗生物質を含む別のＬＢプレート上にその１００μｌを播く。上述の懸濁液から１００μｌを取り分け、新しい１．７ｍｌマイクロチューブ内に置き、９００μｌのＬＢブロスを加える。徹底的に混合し、その１００μｌを適切な抗生物質を含む別のＬＢプレート上に播く。
１３．プレートをパラフィルムで封じ、大きなシングルコロニーが目視できるようになるまで２７℃で２〜３日間インキュベートする。
【０２２０】
形質転換アグロバクテリウムの保存
実験手順
１．５０ｍｌ滅菌チューブ内で２０ｍｇ／Ｌリファンピシンおよび適切な選抜抗生物質（すなわち、ｐＺＰシリーズに対しては１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、ｐＢｉｎシリーズに対しては５０ｍｇ／Ｌカナマイシン）を含む５ｍｌのＬＢブロスにシングルコロニーを接種する。翌日に増殖の程度を密接にモニターできるよう、この操作は早朝に行うとよい。
２．チューブを暗所において２７℃で２４〜３６時間、２５０ｒｐｍで振盪しつつインキュベートする。インキュベーションの最初の２４時間の後、培養物の増殖を定期的に観察する。細胞が活発に増殖したら（非常に目に見える）インキュベーションをやめる。濁りの最初の徴候が見えた直後に、急速な増殖が行われるであろう。増殖時間は、個々の株および形質転換体に依存する。
３．各培養物をチェックして、ＡＧＬ１が望ましいバイナリーベクターを含むことを立証するべきである。この操作は、セクション５．２に記されているプロトコールを用いて行う。
４．キュベット内に培養物の５００μｌアリコートを作成する。適切な抗生物質を含む５００μｌのＬＢブロスでブランク作成して、各読み込み値の間からＯＤ６００読み込み値を測定する。
５．ＯＤ６００読み込み値が０．８から１．０の間の範囲となるまで培養物を増殖させる。
６．滅菌１５ｍｌチューブ内に、５．０ｍｌの培養物および５．０ｍｌの保存ストックを加える。ステップ７に進む前に徹底的に混合する。
７．しっかりと標識した滅菌クリオチューブ内に５００μｌのアリコートを作成する。液体窒素中でスナップ凍結する前に全チューブを反転する。必要とされるまで−８０℃で保存する。ＰＣＲ陰性であることが示された場合、全ストックを廃棄する。
【０２２１】
アグロバクテリウムのＰＣＲ解析
１．１μｌのアグロバクテリウム培養物を滅菌ＰＣＲチューブ内の９μｌの滅菌ＭＱ Ｈ２Ｏに加える。
２．細胞を９８℃で５分間インキュベートする。チューブを氷に移す。
３．１０μｌの調製済２×ＰＣＲマスターミックスを加える。１０μｌの２×ＰＣＲマスターミックスは、次のものを含む。
１０×Ｄｙｎａｚｙｍｅバッファー ２μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ １．０μｌ
１０μＭフォワードプライマー（１０μＭ） １．０μｌ
１０μＭリバースプライマー（１０μＭ） １．０μｌ
Ｄｙｎａｚｙｍｅ ＩＩポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒｉｓｅ） １μｌ
ＭＱ水 ３μｌ
４．陽性対照（５０ｎｇのオリジナルプラスミドＤＮＡ）および陰性対照（鋳型ＤＮＡなし）を含む。標準ＰＣＲ条件用いて合計３５サイクル行う。
【０２２２】
１．９５℃、３分間
２．９４℃、３０秒間
３．５５℃、３０秒間
４．７２℃、１分間
５．７２℃、１０分間
ステップ２〜４を合計３５回繰り返す。
５．ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで解析する。
【０２２３】
コメント
アグロバクテリウムを取り扱う間、手袋を着用する。あらゆる細菌およびＤＮＡ廃棄物を集めてオートクレーブする。ジーンパルサーキュベットは再使用可能である。蓋は７０％ＥｔＯＨに浸し、キュベットは水を張って閉鎖した入れ物の中でオートクレーブしてアグロバクテリウムを除去する。その後、キュベットは７０％ＥｔＯＨ中に保存し、乾かした後に再使用することができる。
【０２２４】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのｉｎ ｐｌａｎｔａ形質転換
実験手順
植物材料の調製
１．実生用方形ケース（ｐｕｎｎｅｔ）に種子栽培ミックスを充填し、盛り土を形成する。２層の防鳥ネットで覆い、ゴムバンドで各端を固定する。トレイに張った水の中に方形ケースを入れることによって、土壌を水で満たす。方形ケース当たりほぼ４０体の植物を得るのに十分な種子を播く。
２．方形ケースを４℃に２〜３日間置くことにより、種子を春化処理する。方形ケースを２２℃、蛍光灯（連続照明、５５μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１）下の育成チャンバーに移し、１週間に１回、Ｍｉｒａｃｌｅ−ＧｒｏまたはＡｑｕａｓｏｌを与える。
３．一次花序（ｂｏｌｔ）が現れたら摘心し、二次花序を概ね２〜１０ｃｍの丈になるまで生長させる（概ね４〜６日間かかり、植物体は多数の未開花の花蕾をつけ、長角果（ｓｉｌｉｑｕｅ）は殆どない筈である）。ピンセットを用いて長角果または開花した花を全て慎重に取り除く。気孔が開くよう浸潤前に植物に十分に水をやる。浸潤前に土壌を水で飽和させて細菌溶液が土壌に吸収されるのを最小限に抑える。
４．ＬＷＳに詳細を入力し、バーコードを作成する。ＬＷＳバーコード詳細によって方形ケースを標識する。
【０２２５】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの調製
１．朝に、適切な選抜抗生物質（すなわち、ｐＰＺＰベクターに対し１００ｍｇ／ｍｌのスペクチノマイシン）を含む２００ｍｌのＬＢ培地に、アグロバクテリウム保存ストック（セクション５．１）の単一のスターター培養物５００μｌを接種する。２５０ｒｐｍの円軌道シェーカー上で２４時間、２７℃でインキュベートする。およそ２個の方形ケースの植物を浸潤させるには２００ｍｌの培養物で十分である。
２．一晩培養した培養物を５００ｍｌ遠心分離ボトルにおいて５５００ｇ、室温、１５分間遠心分離して細胞をペレット化させる。可能な限り液体を除去しつつ上清を廃棄する。ＯＤ６００読み込み値が約０．７〜０．９となるようペレットを浸潤培地（別表１を参照）に再懸濁する。
【０２２６】
アグロ浸潤
１．アグロバクテリウム溶液の半量を２５０ｍｌ容器内に置く。
２．方形ケースを逆さにし、ロゼット葉を含む植物体全体を細菌溶液に浸漬し、穏やかに振盪して気泡を追い出す。植物を２分間共培養する。
３．方形ケースを取り出して短時間水を抜くが、植物の周りの薄い水膜はそのままにしておく。植物をプラスチックフィルムで覆って湿度を維持し、育成室に戻して直射光を避ける。廃液をオートクレーブし、正しい処分のための化学廃棄物ドラム缶に捨てる。
４．Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの全方形ケースに対してステップ１〜３を繰り返して形質転換する。
５．詳細をＬＷＳに入力し、バーコードを作成する。個々の方形ケースをＬＷＳバーコード詳細で標識する。
６．翌日、鉢の覆いを取って直射光に戻し置く。植物が十分に発達した長角果をつけるまで植物に水をやる。
【０２２７】
種子採取
１．植物が完全に乾ききったら、長角果をつけた茎を取ってこれを紙袋の中に入れ、１週間３７℃で乾かしておく。袋をＬＷＳバーコードで標識する。乾いた長角果を紙袋の中で押しつぶす。この操作は長角果を粉々にして種子を遊離させる。
２．２００ミクロンの篩を新しいＡ４用紙１枚の上に置き、そこに種子および押しつぶされた長角果を移し入れる。篩を穏やかにタップし、その下にある用紙の上に種子を落とす。篩の中に残った植物材料を廃棄する。植物材料の大部分が除去されるまでこのプロセスを繰り返す（注記：植物材料は次のステップにおける汚染源となり得る）。種子を１．７ｍｌマイクロチューブ内に入れ、ＬＷＳバーコード詳細で標識する。チューブを小型のマニラ封筒の中に置き、ＬＷＳバーコードで標識する。このバーコードは、元々の形質転換事象と関連することに留意する。
３．種子を４℃保存に移す前に、種子を−２０℃で２４時間保存する。
【０２２８】
陽性Ｔ１トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ植物の選抜
種子の表面滅菌
１．層流フードで作業しつつ、滅菌する種子（１５０×１５ｍｍプレートにつき、４０ｍｇ＝ほぼ２０００個の種子）を２．０ｍｌマイクロチューブ内に置く。
２．１０００μｌの７０％エタノールを加え、２分間放置する。
３．エタノールを除去し、１０００μｌの種子滅菌用溶液（４％塩素：水：５％ＳＤＳがそれぞれ８：１５：１の比率）を加えてボルテックス撹拌によって徹底的に混合する。
４．Ｒａｔｅｋ「観覧車（ｆｅｒｒｉｓ ｗｈｅｅｌ）」上にチューブを置き、種子と溶液を確実に混合し、１０分間放置する。
５．層流において滅菌用溶液を除去して滅菌水に交換する。チューブ（複数可）をボルテックス撹拌し、ベンチトップ遠心分離機で３０秒間スピンして種子を沈降させる。水を除去し、さらに１ｍｌの滅菌水に交換する。種子洗浄ステップは、目視できる泡が出なくなるまで繰り返すべきである（少なくとも４回）。最後の洗浄の後、約２００μｌの水を残して種子を浸す。
【０２２９】
Ｔ１形質転換体の選抜
１．適切な選抜抗生物質（例えば、ＰＺＰ２００シリーズに対し８ｍｇ／Ｌのハイグロマイシン）を含む選抜発芽培地（ＳＧＭ）を用いて１５０×１５ｍｍプレートを調製する。チメンチン（２５０ｍｇ／Ｌ）を入れて、アグロバクテリウムの増殖を阻害する。各プレート当たり約１２５ｍｌのＳＧＭが必要とされる。
２．層流フード内で作業しつつ、ＳＧＭ寒天プレートの表面にわたって平行に滅菌メスをすべらせる（図４を参照）。この操作は種子を広げるのに役立つ。
３．先端を切り取った滅菌１ｍｌチップを用いて、滅菌種子をピペットで取ってプレート上に置く。滅菌使い捨て延展器（ｓｐｒｅａｄｅｒ）を用いて種子を分布させる。
４．種子を４℃で２日間低温処理し、次に連続的な蛍光灯（５５μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１）下、２２℃で育成する。
５．推定形質転換体は、６〜８葉ステージになったら土壌に移すことができる。ピンセット１本を用いて、根を確実にインタクトに保ちつつ植物を組織培養培地から慎重に取り出す。ＡＲＡＳＹＳＴＥＭを用いて湿ったｉｎ−ｖｉｔｒｏ混合土壌に移植する（別表２の図５を参照）。プラスチックチューブで覆う。新しいＬＷＳバーコードを作成し、チューブを標識する。数日間チューブの上端をプラスチックラップで覆い、回復を助ける。
【０２３０】
導入遺伝子組み込みの立証：ゲノムＤＮＡソースとしてのアルカリ処理した葉組織
推定形質転換体を土壌に移して３日後、次のプロトコールを用いて個々の植物体を導入遺伝子の存在に関して分子的に特徴付けることができる。
１．試験するアルカリ処理した葉組織それぞれに対し、１×ＰＣＲバッファーミックスを調製する（詳細は後述を参照）。
２．１．７ｍｌマイクロチューブ内で、２００μｌの０．２５Ｍ ＮａＯＨを小型の若い葉（Ｔ１植物から採取）に加える。
３．チューブを沸騰水に２分間浸漬する。注記：煮沸の間に蓋がはじけ開くのを防ぐため、蓋をマイクロチューブ蓋ロックで固定する、あるいは蓋を細針で刺し通すこと。
４．煮沸後、チューブを水から取り出して、２００μｌの０．２５Ｍ ＨＣｌおよび１００μｌの０．２５％（ｖ／ｖ）ｉｇｅｐａｌ［０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０］を加える。チューブを沸騰水にさらに４分間浸漬する。
５．アルカリ処理した葉のごく一部（ほぼ２ｍｍ２）を取り出し、予め調製したＰＣＲミックス中に置く。
【０２３１】
１０×ＰＣＲ反応バッファー（Ｍｇ（ＳＯ４）・７Ｈ２Ｏ含有） ５．０ｍｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ １．０μｌ
１０μＭフォワードプライマー １．０μｌ
１０μＭリバースプライマー １．０μｌ
ＰＷＯ ＤＮＡポリメラーゼ １．０μｌ
ＭＱ Ｈ２Ｏ ４１．５μｌ
６．標準ＰＣＲ条件を用いて３５サイクルを行う。
【０２３２】
１．９５℃、３分間
２．９４℃、３０秒間
３．５５℃、３０秒間
４．７２℃、１分間
５．７２℃、１０分間
ステップ２〜４を合計３５回繰り返す。
７．ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで解析する。
【０２３３】
注記：初回にアルカリ処理した葉組織を用いてインサートが増幅されない場合、組織をさらに２分間再度煮沸して導入遺伝子のＰＣＲ増幅を繰り返す。この第二のＰＣＲが失敗したら、Ｑｉａｇｅｎ植物ゲノムＤＮＡ抽出キットを用いて葉組織から少量のゲノムＤＮＡを抽出する。ＬＷＳをアップデートする。
【０２３４】
種子採取
１．植物が完全に乾ききったら、長角果をつけた茎を取ってこれを紙袋の中に入れ、１週間室温で乾かしておく。袋をＬＷＳバーコードで標識する。乾いた長角果を紙袋の中で押しつぶす。この操作は長角果を粉々にして種子を遊離させる。
２．２００ミクロンの篩を新しいＡ４用紙１枚の上に置き、そこに種子および押しつぶされた長角果を移し入れる。篩を穏やかにタップし、その下にある用紙の上に種子を落とす。篩の中に残った植物材料を廃棄する。植物材料の大部分が取り除かれるまでこのプロセスを繰り返す（注記：植物材料は次のステップにおける汚染源となり得る）。種子を１．７ｍｌマイクロチューブ内に入れ、ＬＷＳバーコード詳細で標識する。チューブを小型のマニラ封筒の中に置き、ＬＷＳバーコードで標識する。このバーコードは、元々の形質転換事象に関連することに留意する。
３．種子を４℃で保存する前に、Ｔ２種子を−２０℃で２４時間保存する（陽性トランスジェニックＴ２植物の選抜における真菌汚染の見込みを低減させるのに有用である）。
【０２３５】
コメント
ＡＲＡＳＹＳＴＥＭトレイ、ホルダー等を含む、アグロバクテリウムと接触したあらゆる入れ物は、市販の漂白剤および７０％エタノールを用いて徹底的に消毒しなければならない。
【０２３６】
この実験に依存し、Ｔ１植物を表現型特性評価、すなわちレポーター遺伝子解析に用いることができ、これらの系統はＴ１ステージを越えて継続する必要はないと思われる。
【０２３７】
ホモ接合型Ｔ３種子の作出
序文
詳細に後述するプロトコールは、シングルコピーの導入遺伝子を有するホモ接合型植物の選抜に用いた方法を説明する。浸潤方法を用いた導入遺伝子のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａへの組み込みは、子房の受精前に雌しべで起こる。したがって、浸潤によって産生されたあらゆる種子で導入遺伝子を有するものはＴ１であると考えられる。Ｔ１種子が発芽してＴ１植物を産生し、これは次にＴ２種子を産生する。目標は、単一のインサートを有し導入遺伝子を発現する独立したトランスジェニック植物を、構築物につき少なくとも５個体得ることである。Ｔ１種子用に作成した各ＬＷＳバーコードは、別個の形質転換事象を表す。各Ｔ１植物のＴ２種子を収集するとき、新たなＬＷＳバーコード番号を付与する。このＬＷＳバーコードは、元々の形質転換事象に関する。
【０２３８】
Ｔ３種子作出のためのＴ２形質転換体の選抜
１．層流フード内で作業しつつ、約１００個のＴ２種子を表面滅菌する（セクション７．１を参照）。
２．２５０ｍｇ／Ｌチメンチン（ｔｉｍｅｔｉｎ）および８ｍｇ／Ｌハイグロマイシン（ｐＰＺＰ２００−３５ｓ−ｈｐｈ−３５ｓｔに対する選抜剤）を含む選抜ＳＧＭ培地上に、１プレート当たり約２５個の種子を播く（合計４枚）。
３．種子を４℃で２日間低温処理し、次に連続照明（５５μｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１）、２２℃の育成室に移す。
４．２週間後、ハイグロマイシンに対して抵抗性または感受性を有する植物の分離解析を行う。
５．推定形質転換体が６〜８葉ステージになったら、Ａｒａｓｙｓｔｅｍを用いて少なくとも１０個体の植物を土壌に移す。新たなＬＷＳバーコードを作成し（元々の形質転換と関連する）、各植物体をバーコードで個々に標識する。チューブをプラスチックフィルムで数日間覆って回復を助ける。
６．個々の植物それぞれが組み込まれた導入遺伝子を有することを確認するため、アルカリ処理した葉組織の方法を用いる（セクション７．３）。ＬＷＳをアップデートする。
７．植物が完全に乾ききったら、長角果をつけた茎を取ってそれを紙袋に入れ、１週間３７℃で乾かしておく。袋をＬＷＳバーコードで標識する。乾いた長角果を紙袋の中で押しつぶす。この操作は長角果を粉々にして種子を遊離させる。
８．２００ミクロンの篩を新しいＡ４用紙１枚の上に置き、そこに種子および押しつぶされた長角果を移し入れる。篩を穏やかにタップし、その下にある用紙の上に種子を落とす。篩の中に残った植物材料を廃棄する。植物材料の大部分が取り除かれるまでこのプロセスを繰り返す（注記：植物材料は次のステップにおける汚染源となり得る）。種子を１．７ｍｌマイクロチューブ内に入れ、ＬＷＳバーコード詳細で標識する。チューブを小型のマニラ封筒の中に置き、ＬＷＳバーコードで標識する。このバーコードは、元々の形質転換事象に関連することに留意すること。
９．種子を４℃保存に移す前に、種子を−２０℃で２４時間保存する（陽性トランスジェニックＴ３植物の選抜における真菌汚染の見込みの減少に役立つ）。
【０２３９】
分離解析
１．ハイグロマイシンに対して抵抗性または感受性のいずれかを有する各系統から得られたＴ２植物の総数を採点する。
２．Ｔ−ＤＮＡが１遺伝子座に挿入されている場合、抵抗性植物の感受性植物に対する比率は３：１となる筈である。Ｔ−ＤＮＡ遺伝子座が２遺伝子座に挿入されている場合、抵抗性植物の感受性植物に対する比率は１５：１となる筈である。Ｔ−ＤＮＡが３以上の遺伝子座に挿入されている場合、抵抗性植物の感受性植物に対する比率は＞１５：１となる筈である。
３．カイ２乗（χ２）統計検定を用いて、分離データが特定の仮説にどの程度適合するか決定する。
４．導入遺伝子のシングルコピーを含むことをカイ２乗解析が示すトランスジェニック系統の育成を継続する。
５．ＬＷＳをアップデートする。
導入遺伝子組み込みの立証：ゲノムＤＮＡソースとしてのアルカリ処理した葉組織
１．各Ｔ２植物につき小型の葉を１枚収集する。
２．アルカリ処理した葉のプロトコール（セクション７．３）に従い、導入遺伝子の存在を決定する。
３．ＬＷＳをアップデートする。
【０２４０】
ホモ接合型Ｔ３系統の選抜
１．単一の導入遺伝子挿入を含むことを示すＴ２トランスジェニック系統の育成を継続する。
２．Ｔ２種子を採取し（セクション８．２）、ＬＷＳをアップデートして新たなバーコードを作成する。
３．ほぼ４０個のＴ３種子をＳＧＭ上で発芽させる。
４．２週間後、ハイグロマイシンに対し抵抗性または感受性のいずれかを有する各系統由来のＴ３植物の総数を採点する。
５．ホモ接合型Ｔ３系統は、感受性植物の不在によって示されるであろう。
６．推定形質転換体が６〜８葉ステージになったら、Ａｒａｓｙｓｔｅｍを用いて少なくとも２０個体の植物を土壌に移す。新たなＬＷＳバーコードを作成し、各植物を個々にバーコードで標識する。チューブをプラスチックフィルムで数日間覆い回復を助ける。
７．系統の単一挿入がホモ接合型であることをさらに検証するため、アルカリ処理した葉組織の方法を用いて（セクション７．３）、全植物が導入遺伝子を含むことを確認する。ＬＷＳをアップデートする。
８．推定ホモ接合型系統から十分な材料を収集してサザンハイブリダイゼーションを行い、導入遺伝子の組み込み数を確認する。ＬＷＳをアップデートする。
９．セクション８．２に記されているプロトコールに従って、種子をＴ３ホモ接合型系統から収集する。
【０２４１】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作する方法であって、前記方法は、細菌フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記プロモーターが構成的、組織特異的および誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターが光調節プロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌ＦＴ酵素がスクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＳＳＴ）酵素活性およびフルクタン：フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＦＦＴ）酵素活性の両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細菌ＦＴ酵素をコードする前記核酸がＳａｃＢ、ＬｓｃおよびＦＴＦ遺伝子からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
植物における生化学的経路の生産性を増強する方法であって、前記方法は、ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含む、方法。
【請求項７】
植物におけるバイオマスを増強する方法であって、前記方法は、１または複数のフルクタン生合成酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含む、方法。
【請求項８】
形質転換植物を選抜する方法であって、前記方法は、１または複数のフルクタン生合成酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップと、バイオマスが増強された植物を選抜するステップとを含む、方法。
【請求項９】
植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物であって、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、遺伝的構築物。
【請求項１０】
前記プロモーターが構成的、組織特異的および誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項９に記載の遺伝的構築物。
【請求項１１】
前記プロモーターが光調節プロモーターである、請求項１０に記載の遺伝的構築物。
【請求項１２】
前記細菌ＦＴ酵素がスクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＳＳＴ）酵素活性およびフルクタン：フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＦＦＴ）酵素活性の両方を含む、請求項９に記載の遺伝的構築物。
【請求項１３】
細菌ＦＴ酵素をコードする前記核酸がＳａｃＢ、ＬｓｃおよびＦＴＦ遺伝子からなる群より選択される、請求項１２に記載の遺伝的構築物。
【請求項１４】
植物におけるバイオマスを増強する方法であって、有効量の
（ａ）前記植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物であって、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、遺伝的構築物と、
（ｂ）前記植物の老化を操作することができる遺伝的構築物と
を前記植物に導入するステップを含む、方法。
【請求項１５】
前記プロモーターが光調節プロモーターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
老化を操作することができる前記遺伝的構築物が、サイトカイニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したｍｙｂ遺伝子プロモーターもしくは改変されたｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはそれらの機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項９に記載の遺伝的構築物を含み、非形質転換対照植物と比べてフルクタン生合成特徴が改変された、またはバイオマスが増強されたトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分。
【請求項１８】
非形質転換対照植物と比べてバイオマスが少なくとも約５０％増加した、請求項１７に記載のトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分。
【請求項１９】
非形質転換対照植物と比べて可溶性炭水化物が少なくとも約５０％増加した、請求項１７に記載のトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分。
【請求項１】
植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作する方法であって、前記方法は、細菌フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記プロモーターが構成的、組織特異的および誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターが光調節プロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌ＦＴ酵素がスクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＳＳＴ）酵素活性およびフルクタン：フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＦＦＴ）酵素活性の両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細菌ＦＴ酵素をコードする前記核酸がＳａｃＢ、ＬｓｃおよびＦＴＦ遺伝子からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
植物における生化学的経路の生産性を増強する方法であって、前記方法は、ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含む、方法。
【請求項７】
植物におけるバイオマスを増強する方法であって、前記方法は、１または複数のフルクタン生合成酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップを含む、方法。
【請求項８】
形質転換植物を選抜する方法であって、前記方法は、１または複数のフルクタン生合成酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む有効量の遺伝的構築物を前記植物に導入するステップと、バイオマスが増強された植物を選抜するステップとを含む、方法。
【請求項９】
植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物であって、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、遺伝的構築物。
【請求項１０】
前記プロモーターが構成的、組織特異的および誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項９に記載の遺伝的構築物。
【請求項１１】
前記プロモーターが光調節プロモーターである、請求項１０に記載の遺伝的構築物。
【請求項１２】
前記細菌ＦＴ酵素がスクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＳＳＴ）酵素活性およびフルクタン：フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＦＦＴ）酵素活性の両方を含む、請求項９に記載の遺伝的構築物。
【請求項１３】
細菌ＦＴ酵素をコードする前記核酸がＳａｃＢ、ＬｓｃおよびＦＴＦ遺伝子からなる群より選択される、請求項１２に記載の遺伝的構築物。
【請求項１４】
植物におけるバイオマスを増強する方法であって、有効量の
（ａ）前記植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作することができる遺伝的構築物であって、細菌ＦＴ酵素をコードする核酸またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したプロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、遺伝的構築物と、
（ｂ）前記植物の老化を操作することができる遺伝的構築物と
を前記植物に導入するステップを含む、方法。
【請求項１５】
前記プロモーターが光調節プロモーターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
老化を操作することができる前記遺伝的構築物が、サイトカイニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは変異体に作動的に連結したｍｙｂ遺伝子プロモーターもしくは改変されたｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはそれらの機能的に活性な断片もしくは変異体を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項９に記載の遺伝的構築物を含み、非形質転換対照植物と比べてフルクタン生合成特徴が改変された、またはバイオマスが増強されたトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分。
【請求項１８】
非形質転換対照植物と比べてバイオマスが少なくとも約５０％増加した、請求項１７に記載のトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分。
【請求項１９】
非形質転換対照植物と比べて可溶性炭水化物が少なくとも約５０％増加した、請求項１７に記載のトランスジェニック植物細胞、植物体、植物種子または他の植物部分。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２０】
【図２１】
【図２３−１】
【図２３−２】
【図２４−１】
【図２４−２】
【図２５−１】
【図２５−２】
【図２６−１】
【図２６−２】
【図２９】
【図３０−１】
【図３０−２】
【図３１−１】
【図３１−２】
【図３２−１】
【図３２−２】
【図３３−１】
【図３３−２】
【図３４−１】
【図３４−２】
【図３５−１】
【図３５−２】
【図３６−１】
【図３６−２】
【図３６−３】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図５０】
【図１０】
【図１３】
【図１４】
【図１９】
【図２２】
【図２７】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２８Ｃ】
【図２８Ｄ】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４９−１】
【図４９−２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２０】
【図２１】
【図２３−１】
【図２３−２】
【図２４−１】
【図２４−２】
【図２５−１】
【図２５−２】
【図２６−１】
【図２６−２】
【図２９】
【図３０−１】
【図３０−２】
【図３１−１】
【図３１−２】
【図３２−１】
【図３２−２】
【図３３−１】
【図３３−２】
【図３４−１】
【図３４−２】
【図３５−１】
【図３５−２】
【図３６−１】
【図３６−２】
【図３６−３】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図５０】
【図１０】
【図１３】
【図１４】
【図１９】
【図２２】
【図２７】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２８Ｃ】
【図２８Ｄ】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４９−１】
【図４９−２】
【公表番号】特表２０１２−５２５１１９（Ｐ２０１２−５２５１１９Ａ）
【公表日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０７５４４（Ｐ２０１２−５０７５４４）
【出願日】平成２２年４月２７日（２０１０．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／０００４８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２４３２４
【国際公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【出願人】（５０３０８７２２３）アグリカルチャー ビクトリア サービシーズ プロプライエタリー リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２７日（２０１０．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／０００４８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２４３２４
【国際公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【出願人】（５０３０８７２２３）アグリカルチャー ビクトリア サービシーズ プロプライエタリー リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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