フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
プロトンリレー系に関与するアミノ酸残基で改変された変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが開示される。この変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、オキシダーゼ活性が低下し、その一方そのデヒドロゲナーゼ活性は実質的に維持される。本発明はまた、糖化タンパク質を測定するためのアッセイ装置やアッセイ法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化アルブミン、フルクトシルペプチド、ＨｂＡ１ｃおよびフルクトシルバリン（ＦＶ）などの糖化タンパク質の測定用キットおよびセンサーに使用するためのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（フルクトシルアミンオキシダーゼとも呼ばれる）に関する。より詳細には、本発明はオキシダーゼ活性の減少した変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質は、タンパク質上のアミノ基および糖の還元末端との間の共有結合を介して非酵素的に生成され、アマドリ化合物とも言われる。血中において、グルコースはヘモグロビンのβ−鎖のＮ−末端でバリンと結合し、糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン；ＨｂＡｌｃ）を生成する。ヘモグロビンに対するＨｂＡｌｃの存在比は、正常な健常個体と比較して糖尿病患者においてより高く、ＨｂＡｌｃの血中濃度は、過去数週間の血糖値を反映することが知られている。したがって、ＨｂＡｌｃの血中濃度は、糖尿病の診断のための臨床試験において、また糖尿病患者の血糖コントロールにおいて非常に重要である。血中のＨｂＡｌｃ濃度は、フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンに特異性を有する酵素を用いて測定することが可能である。
【０００３】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、様々な種類の株から単離されており、糖化アルブミン、ＨｂＡｌｃおよびフルクトシルアミノ酸などの糖化タンパク質がそのような酵素を用いて分析できることが示唆されている（特開昭６１−２６８１７８号公報；特開昭６１−２８０２９７号公報；特開平０３−１５５７８０号公報；特開平０５−１９２１９３号公報；特開平０７−２８９２５３号公報；特開平０８−１５４６７２号公報；特開２００１−９５５９８号公報；特開２００３−７９３８６号公報；特開２００３−２３５５８５号公報；Agric. Biol. Chem., 53(1), 103-110, 1989；Agric. Biol. Chem., 55(2), 333-338, 1991；J. Biol. Chem., 269(44), 27297-27301, 1994；Appl. Environ. Microbiol., 61(12), 4487-4489, 1995；Biosci. Biotech. Biochem., 59(3), 487-491, 1995；J. Biol. Chem., 270(1), 218-224, 1995；J. Biol. Chem., 271(51), 32803-32809, 1996；およびJ. Biol. Chem., 272(6), 3437-3443, 1997）。
【０００４】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、フルクトシルアミノ酸が酸化され、２−ケト−Ｄ−グルコースおよび対応するアミノ酸を生成する反応を触媒するＦＡＤ依存性酵素であり、ＦＡＤの還元型（ＦＡＤＨ２）の生成を伴う。ＦＡＤＨ２は、次に電子アクセプターに電子を伝達し、その酸化型に変換される。酸素の存在下で、ＦＡＤＨ２は人工電子アクセプター（アソメディエーター（asmediators）または電子メディエーターとも言う）に対してよりもむしろ酸素分子に優先的に電子を伝達する。したがって、フルクトシルアミノ酸を、メディエーターを用いてフルクトシルアミノ酸オキシダーゼによりアッセイする場合、アッセイの結果は、反応系における溶存酸素レベルに大きく影響を受ける。そのような不利益は、人工電子アクセプターを利用するポイント・オブ・ケア検査装置による血液試料の臨床検査において特に指摘される。人工電子メディエーターを用いる酵素センサーストリップに使用される酵素は、酸素に対して低い活性を有することが望まれる。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、酵素、特にその活性が溶存酸素レベルによりほとんど影響を受けないフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供することである。
【発明の概要】
【０００６】
一般的に言えば、本願の発明者らは、酵素、より詳細にはその活性が溶存酸素レベルによりほとんど影響を受けないフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供することができる。より具体的には、これは、その野生型において優先的にオキシダーゼ活性を示す酵素のオキシダーゼ活性を減少させることにより、好ましくは同時に酵素のデヒドロゲナーゼ活性を増加させることにより達成される。以下により詳細に説明するように、これは野生型酵素を変異させることにより達成されている。
【０００７】
本発明者らは、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの種々の変異体を製造し、驚くべきことに、特定の種類の変異体が、デヒドロゲナーゼ活性、詳細には、色素媒介（dye-mediated）デヒドロゲナーゼ活性を実質的に保持しながら減少したオキシダーゼ活性を示すことを見出した。
【０００８】
本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列の５６位に対応する位置で、アミノ酸残基Ａｓｎを、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換することにより改変された変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。
【０００９】
好ましい実施態様において、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して減少されたオキシダーゼ活性を有し、好ましくは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して増加されたデヒドロゲナーゼ活性を有する。好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの３０％以下のオキシダーゼ活性を有し、そしてまた、好ましくは野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの５０％以上のデヒドロゲナーゼ活性を有する。また好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して増加したデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【００１０】
別の好ましい実施態様において、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１〜１６からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、配列番号１記載のアミノ酸配列の５６位に対応する位置のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基により置換されているアミノ酸配列を有する。好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１記載のアミノ酸配列であって、５６位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。より好ましくは、配列番号１の位置１０９−１２４のアミノ酸配列：Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕが、配列：Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａで置き換えられている。また好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号２記載のアミノ酸配列であって、４７位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。また好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号３記載のアミノ酸配列であって、５２位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。また好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号７記載のアミノ酸配列であって、５６位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。より好ましくは、配列番号７の位置６１−７２のアミノ酸配列Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒが、配列：Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａで置き換えられている。
【００１１】
別の側面では、本発明は、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
また別の側面では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１３】
さらに別の側面では、本発明は、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法であって、試料を本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させること、およびフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより酸化された糖化タンパク質の量を測定することを含む方法を提供する。
【００１５】
なお別の側面において、本発明は、ＨｂＡ１ｃをアッセイするための方法であって、試料中のＨｂＡ１ｃを消化してフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを生成すること、該フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させること、および酸化されたフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの量を測定することを含む方法を提供する。
【００１６】
別の側面において、本発明は、試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするための装置であって、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび電子移動メディエーターを含む装置を提供する。
【００１７】
また別の側面において、本発明は、試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするためのキットであって、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび電子移動メディエーターを含むキットを提供する。
【００１８】
別の側面において、本発明は、電極に固定化されている本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを有する酵素電極を提供する。
【００１９】
別の側面において、本発明は、作用電極として本発明の酵素電極を含むフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするための酵素センサーを提供する。
【００２０】
また別の側面において、本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列であって、配列番号１の６１−７２位のアミノ酸配列：Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａが、配列：Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。なお別の側面において、本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列であって、配列番号１の１０９−１２４位のアミノ酸配列：Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕが、配列：Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。また別の側面において、本発明は、配列番号７記載のアミノ酸配列であって、配列番号７の６１−７２位のアミノ酸配列：Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒが、配列：Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。また別の側面において、本発明は、配列番号７記載のアミノ酸配列であって、配列番号１の１０９−１２６位のアミノ酸配列：Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａが、配列：Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の変異されたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、糖尿病状態の診断やコントロールにおいて臨床的に有用なヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）などの糖化タンパク質の測定に使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】いくつかの真核性ＦＡＯＤのＮ−末端付近のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２】フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの反応系を示す。
【図３】精製されたＮ１−１ ＦＡＯＤ Ｎ４７Ａ変異体のオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【図４】粗ＰｎＦＰＯＸ野生型およびＡｓｎ５６変異体のオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【図５】ＰｎＦＰＯＸ Ａｓｎ５６変異体の速度論的パラメーターを示す。
【図６】精製されたＰｎＦＰＯＸ Ｎ５６Ａ変異体のオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【図７】精製されたアマドリアーゼII野生型およびＮ５２Ａ変異体のオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【図８】精製されたアマドリアーゼII野生型およびＮ５２Ａ変異体の速度論的パラメーターを示す。
【図９】ＰｎＦＰＯＸ Ｎ５６Ａまたは野生型ＦＡＯＤを有する電極を用いるＦＶ濃度のアッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）は、様々な真核性および原核性株に存在するということが知られている。表１は、今までに単離された、または予測されたＦＡＯＤのいくつかの例を示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
真核性ＦＡＯＤは、基質特異性により、（ｉ）α−フルクトシルアミノ酸優先（ＦＡＯＤ−Ｐ、ＦＡＯＤ−Ｕ、ＦＡＯＸ−Ｅ、ＦＰＯＸ−Ｃ、およびＰｎＦＰＯＸ）、（ii）ε−フルクトシルアミノ酸優先（ＦＡＯＤ−Ｆ、ＦＡＯＤ−Ａ、アマドリアーゼＩ、およびＦＡＯＤ−Ａｏ１）、および（iii）α−およびε−糖化アミノ酸両方に類似の活性（アマドリアーゼII、ＦＡＯＤ−Ａｏ２、およびＮ１−１ ＦＡＯＤ）に分類することができる。一般に、α−フルクトシルアミノ酸に活性なＦＡＯＤは、α−フルクトシルバリンおよびＨｂＡ１ｃのアッセイにおいて有用となり、ε−フルクトシルアミノ酸に活性なＦＡＯＤは、ε−フルクトシルリジンおよび糖化アルブミンのアッセイにおいて有用となる。当業者は、酵素に変異を導入することにより、α−またはε−フルクトシルアミノ酸に対するその優先性を変えることができるということを理解するものである。
【００２６】
本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列（ＰｎＦＰＯＸ）の５６位に対応する位置で、アミノ酸残基ＡｓｎをＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換することにより改変された変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。
【００２７】
本明細書において使用される用語、タンパク質の「変異体」は、表示される位置でタンパク質上の１つまたは複数のアミノ酸残基に置換を含む変異型タンパク質を意味する。用語変異体はまた、そのような変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも使用される。
【００２８】
本明細書において使用される語句「対応する位置」は、デフォルトパラメーターを有するＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩのソフトウェアＡｌｉｇｎＸ（インビトロジェン製；Lu, G., and Moriyama, E.N. (2004) Vector NTI, a balanced all-in-one sequence analysis suite. Brief Bioinform 5, 378-88参照）を用いて、参照アミノ酸配列のアミノ酸残基と位置合わせされる照会（query）アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置を意味する。したがって、「配列番号１記載のアミノ酸配列の５６位に対応する位置のＡｓｎ残基」は、照会アミノ酸配列が、デフォルトパラメーターを有するＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩのＡｌｉｇｎＸを用いて配列番号１とアラインメントされる場合に、配列番号１のＡｓｎ５６と位置合わせされる照会アミノ酸配列におけるＡｓｎ残基を意味する。配列番号１自体のＡｓｎ４７もこの用語により包含されることに留意すべきである。
【００２９】
図１は、いくつかの真核性ＦＡＯＤ（ペニシリウム・ヤンシネルム（Penicillum janthinelum）ＡＫＵ３４１３由来のＦＡＯＤ−Ｐ、ウロクラディウム・エスピー（Ulocladium sp.）ＪＳ−１０３由来のＦＡＯＤ−Ｕ、ユーペニシリウム・テレヌム（Eupenicillum terrenum）ＡＴＣＣ １８５４７由来のＦＰＯＸ−Ｅ、コニオカエタ・エスピー（Coniochaeta sp.）ＮＩＳＬ ９３３０由来のＦＰＯＸ−Ｃ、ファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）由来のＰｎＦＰＯＸ、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）ＮＢＲＣ ９９７２由来のＦＡＯＤ−Ｆ、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）ＧＰ１由来のＦＡＯＤ−Ａ、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）由来のアマドリアーゼＩ、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）由来のＦＡＯＤ−Ａｏ１、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）由来のアマドリアーゼII、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）由来のＦＡＯＤ−Ａｏ２およびピチア・エスピー（Pichia sp.）Ｎ１−１由来のＮ１−１ ＦＡＯＤ）のＮ−末端付近の保存された領域内のアミノ酸配列のアラインメントを示す。これらのＦＡＯＤの全配列は、配列番号１〜１２に記載されている。アラインメントは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｓｕｉｔｅ６．０のＡｌｉｇｎＸアプリケーションを用いて作製された。矢印はＮ１−１ ＦＡＯＤのＡｓｎ４７に対応する残基を示す。括弧中の数字は、配列番号により表される各アミノ酸配列における、図１の一番左の「Ｐ」の位置を示す。当業者は、Ｂｌａｓｔなどの別のアラインメントソフトウェアプログラムが、同じまたは実質的に同じアラインメントを提供するであろう事を理解するものである。
【００３０】
図１から、Ｎ１−１ ＦＡＯＤのＡｓｎ４７を含む領域におけるアミノ酸配列が、真核性ＦＡＯＤのあいだで高度に保存されているということがわかる。したがって、当業者は、配列アラインメント用の任意の市販のソフトウェアプログラムを用いて保存された領域内のＮ１−１ ＦＡＯＤのＡｓｎ４７に対応するＡｓｎ残基を容易に同定することができ、また、変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、そのＡｓｎ残基上に修飾を導入することにより容易に製造されることを理解することができる。
【００３１】
別の好ましい実施態様において、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１〜１５からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、配列番号１記載のアミノ酸配列の５６位に対応する位置でアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。
【００３２】
好ましい実施態様において、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１記載のアミノ酸配列（ＰｎＦＰＯＸ）であって、５６位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。好ましくは、Ａｓｎ残基はＡｌａで置換される。別の好ましい実施態様においては、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号２記載のアミノ酸配列（Ｎ１−１）であって、４７位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。なお別の好ましい実施態様において、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号３記載のアミノ酸配列（アマドリアーゼII）であって、５２位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。
【００３３】
本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、デヒドロゲナーゼ活性を実質的に保持しながら減少されたオキシダーゼ活性を示す。図２は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの反応スキームを説明する。
【００３４】
本明細書において、「オキシダーゼ活性」は、酸素を電子アクセプターとして利用しながらフルクトシルアミノ酸の酸化を触媒し、２−ケト−Ｄ−グルコースと対応するアミノ酸を生成する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの酵素活性（Ｖｍａｘ）である。オキシダーゼ活性は、本技術分野において既知の任意の方法、例えば、４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（４−アミノアンチピリン／Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン二ナトリウム塩／西洋ワサビペルオキシダーゼ）などのＨ2Ｏ2検出用試薬やＰｔ電極により、生成したＨ2Ｏ2の量を測定することによりアッセイすることができる。本明細書において、相対的または定量的活性という文脈では、オキシダーゼ活性は、具体的には、２５℃で、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０、１．５ｍＭ ＴＯＤＢ、２Ｕ／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および１．５ｍＭ ４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）において生成されたＨ2Ｏ2の量により測定される、単位時間当たり酸化された基質（フルクトシルアミノ酸）のモル量と定義される。キノンイミン色素の生成は、５４６ｎｍで分光光度法により測定することができる。
【００３５】
本明細書において、「デヒドロゲナーゼ活性」は、酸素以外の電子メディエーターを電子アクセプターとして利用しながらフルクトシルアミノ酸の酸化を触媒し、２−ケト−Ｄ−グルコースと対応するアミノ酸を生成する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの酵素活性（Ｖｍａｘ）である。デヒドロゲナーゼ活性は、たとえば、ｍＰＭＳ／ＤＣＩＰ（メチル硫酸１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム／２，６−ジクロロインドフェノール）、ｃＰＥＳ（トリフルオロ−酢酸−１−（３−カルボキシ−プロポキシ）−５−エチル−フェナジニウム、ＮＡ ＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）３−メトキシ−ニトロソアニリン塩酸塩、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリンおよびＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリン）などを用いてメディエーターに移動した電子の量を測定することによりアッセイすることができる。
【００３６】
本明細書において、相対的または定量的活性という文脈では、デヒドロゲナーゼ活性は、具体的には、２５℃で、１０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）、０．６ｍＭ ＤＣＩＰ、および６ｍＭ メトキシＰＭＳ（ｍＰＭＳ）においてメディエーターに移動された電子の量により測定される、単位時間当たり酸化された基質（フルクトシルアミノ酸）のモル量と定義される。
【００３７】
本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、デヒドロゲナーゼ活性を実質的に保持しながら、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して減少されたオキシダーゼ活性を有する。
【００３８】
好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの５０％以下のオキシダーゼ活性を有する。より好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらにより好ましくは２０％以下、最も好ましくは１５％以下のオキシダーゼ活性を有する。また、好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの５０％以上のデヒドロゲナーゼ活性を有する。より好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは１００％以上、最も好ましくは１００％より高いデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【００３９】
野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにおいて、オキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性は、比率、デヒドロゲナーゼ活性／オキシダーゼ活性が、約０．８〜１．２の間と同程度にある。アッセイ系に溶存酸素が存在する場合、基質の酸化により生じた電子は、酸素に優先的に移動することになる。したがって、電子メディエーターの存在下で測定される酵素活性は、溶存酸素濃度によって大きな影響を受けることになる。対照的に、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、約２．０以上、好ましくは４．０以上、より好ましくは１０以上、さらにより好ましくは２０以上、最も好ましくは４０以上の比率、デヒドロゲナーゼ活性／オキシダーゼ活性を有する。デヒドロゲナーゼ活性がオキシダーゼ活性を上回るので、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの酵素活性は、溶存酸素濃度の影響をほとんど受けないものとなる。これは、血液試料による臨床診断におけるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの利用において好都合なものである。
【００４０】
別の側面において、本発明は、１つまたは複数のループ領域が改変または変異されているフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。ＰｎＦＰＯＸは、フルクトシルヘキサペプチドに対してＦＶＨと比較して１％未満の活性レベルのオキシダーゼ活性を示す。一方、ＦＰＯＸ−Ｃは、活性を示さない。他方、ＦＰＯＸ−Ｃは、Ｐ．ｎＦＰＯＸよりもＦＶＨに対してより高い活性を示す。両オキシダーゼのアミノ酸配列の比較から、ＦＡＯＤとＦＰＯＸとのあいだの有意差は、それらのループ領域に見られる。
【００４１】
ループ１領域
ＰｎＦＰＯＸ （６１）Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａ（７２）（配列番号：１３）
ＦＰＯＸ−Ｃ （６１）Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ（７２）（配列番号：１４）
【００４２】
ループ２領域
ＰｎＦＰＯＸ （１０９）Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ（１２４）（配列番号：１５）
ＦＰＯＸ−Ｃ （１０９）Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａ（１２６）（配列番号：１６）
【００４３】
ループ１領域（１２ａａ）では、５つのアミノ酸残基がＰｎＦＰＯＸとＦＰＯＸ−Ｃとで異なる。ループ２領域（１６ａａ）では、２つのアミノ酸挿入と７つのアミノ酸置換が見られる。
【００４４】
驚くべきことに、ＰｎＦＰＯＸとＦＰＯＸ−Ｃとのループ領域が互に交換されているいくつかのキメラループ変異体が改善された活性を示すことが見出された。下記の実施例８に示されているように、ループ２領域がＦＰＯＸ−Ｃループ２領域により置き換えられているＰｎＦＰＯＸは、野生型ＰｎＦＰＯＸよりもＦＶ、ＦＶＨおよびフルクトシルヘキサペプチド（Ｆ−ＨＰ）に対してより高いオキシダーゼ活性を示す。ループ１領域がＰｎＦＰＯＸループ１領域により置き換えられているＦＰＯＸ−Ｃは、野生型ＦＰＯＸ−Ｃにおいては検出されない、Ｆ−ＨＰに対してオキシダーゼ活性を示す。加えて、Ｎ５６Ａ変異を有するキメラループ変異体も、ＰｎＦＰＯＸおよびＦＰＯＸ−Ｃ由来のＮ５６Ａ変異体において観察されるように、減少したオキシダーゼ活性と増加したデヒドロゲナーゼ活性を示す。特に好ましいキメラループ変異体は、ループ２領域がＦＰＯＸ−Ｃのループ２領域で置換されており、かつＡｓｎ５６がＡｌａで置換されているＰｎＦＰＯＸである。別の特に好ましいキメラループ変異体は、ループ１領域がＰｎＦＰＯＸのループ１領域で置換されており、かつＡｓｎ５６がＡｌａで置換されているＦＰＯＸ−Ｃである。これらの結果は、ＰｎＦＰＯＸ由来のループ１領域とＦＰＯＸ−Ｃ由来のループ２領域の組合せが、フルクトシルバリンおよびフルクトシルバリルヒスチジンならびにフルクトシルヘキサペプチドに対してより高い活性を提供するということを示唆する。
【００４５】
別の側面において、本発明は、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、公共のデータベースから容易に得ることができる。野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、ＰＣＲまたは他の既知の技術を用いて各生物のゲノムからクローニングすることができる。変異は、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ突然変異誘発法または本技術分野において周知の任意の他の技術により導入することができる。変異されるべきＡｓｎ残基は、本技術分野において利用可能な配列アラインメントのための任意のソフトウェアを用いて同定することができる。あるいは、変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、一連の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより製造してもよいし、または完全に合成してもよい。
【００４６】
変異されたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、変異体遺伝子を適切な発現ベクターに挿入し、そのベクターを大腸菌（E. coli）細胞などの適切な宿主細胞に導入することにより製造することができる。形質転換体を培養し、その形質転換体において発現されたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを、細胞または培養培地から回収することができる。
【００４７】
かくして得られた組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、本技術分野において公知の任意の精製技術、たとえばイオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析沈殿、溶媒沈殿、免疫沈降、ゲル電気泳動、等電電気泳動および透析などにより精製することができる。
【００４８】
したがって、本発明は、変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、そのようなベクターで形質転換された宿主細胞、ならびに該形質転換体を培養し、変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを培養物から回収および精製することにより、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを製造する方法も包含する。
【００４９】
本発明はまた、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法も包含する。その方法は、試料を本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させること、およびフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより酸化された糖化タンパク質の量を測定することを含む。本発明によりアッセイされる糖化タンパク質は、たとえば、フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃ、フルクトシルヘキサペプチド、糖化アルブミンおよび他のフルクトシルアミノ酸である。なお別の側面において、本発明は、試料中のＨｂＡ１ｃを消化してフルクトシルバリンを生成すること、そのフルクトシルバリンを本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させること、および酸化されたフルクトシルバリンの量を測定することを含むＨｂＡ１ｃをアッセイするための方法を提供する。
【００５０】
別の側面において、本発明は、試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃ、フルクトシルヘキサペプチドまたは糖化アルブミンをアッセイするための装置であって、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび電子移動メディエーターを含む装置を提供する。
【００５１】
アッセイ装置は、任意の従来の市販されている血糖値をモニターするための電流測定バイオセンサーのテストストリップと同様の構造を有することができる。そのような装置の１つの例は、絶縁基材上に配置された２つの電極（作用電極と参照または対電極）、試薬ポートおよび試料受け（receiver）を有する。試薬ポートは、本発明の変異されたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびメディエーターを含む。血液試料などの試料が試料受けに添加されると、試料に含まれるフルクトシルアミノ酸がフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと反応し、電流が生じ、試料中のフルクトシルアミノ酸の量を示す。酵素基質の測定に適した電気化学センサーの典型的な例は、たとえば国際公開第２００４／１１３９００号および米国特許第５，９９７，８１７号明細書から公知である。電気化学センサーの代わりとして、光学的検出技術も使用可能なはずである。典型的には、そのような光学装置は、酵素、電子移動メディエーターおよび指示薬を含む試薬系において起こる色の変化にもとづくものである。色の変化は、蛍光、吸光、緩和（remission）測定を用いて定量することができる。酵素基質の測定に適した光学装置の典型的な例が、たとえば米国特許第７，００８，７９９号明細書、米国特許第６，０３６，９１９号明細書および米国特許第５，３３４，５０８号明細書から公知である。
【００５２】
なお別の側面において、本発明は、試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするためのキットであって、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび電子移動メディエーターを含むキットを提供する。
【００５３】
フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定のためのキットは、本発明の酵素を用いて構築することが可能である。本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼに加えて、キットは、測定に必要な緩衝液、適切なメディエーター、および必要ならばペルオキシダーゼなどの酵素、較正曲線の作製のためのフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンまたはそれらの誘導体の標準溶液、および使用説明書を含有する。本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、多様な形態、たとえば凍結乾燥試薬として、または適切なストレージソリューションの溶液として提供してもよい。
【００５４】
本発明の酵素を用いて、糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドアッセイキットを構築することも可能である。糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドは、酵素的にまたは化学的に消化され、フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジンおよびフルクトシルヘキサペプチドといったフルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドを生じ、それが今度は本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いて定量される。このようにして、糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドがアッセイ可能である。したがって、糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドのための本発明のアッセイキットは、フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定のための前記キットにさらに加水分解するための試薬またはプロテアーゼを含有することができる。
【００５５】
別の側面において、本発明は、電極上に固定化された本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを有する酵素電極を提供する。
【００５６】
別の側面において、本発明は、作用電極として本発明の酵素電極を含む、フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするための酵素センサーを提供する。
【００５７】
試料中のフルクトシルアミノ酸の濃度は、酵素反応により生じた電子の量を測定することにより決定することができる。本技術分野においては、炭素電極、金属電極、および白金電極などの様々なセンサー系が知られている。本発明の変異されたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、電極上に固定される。固定化のための手段の例としては、架橋、高分子マトリックスへの封入、透析膜による被覆、光架橋性ポリマー、電気伝導性ポリマー、酸化−還元ポリマー、およびそれらの任意の組合せなどが挙げられる。
【００５８】
測定が電流測定系において行なわれる場合、固定化された酵素を備えた炭素電極、金電極または白金電極が作用電極として、対電極（白金電極など）および参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に使用される。電極は、メディエーターを含有する緩衝液中に挿入され、所定の温度に保たれる。所定の電圧を作用電極に適用し、その後試料を添加、そして電流の増加した値を測定する。アッセイに使用されるメディエーターの例としては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、ルテニウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどが挙げられる。通常、１つの作用電極と１つの対電極または偽−参照電極とのいわゆる二電極系も使用することが可能である。
【００５９】
さらに、フルクトシルアミノ酸は、炭素電極、金電極、または白金電極を用いる電流測定系において、固定化された電子メディエーターを用いてアッセイすることもできる。酵素は、作用電極を作製するために吸着または共有結合により高分子マトリックスにおいてフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどの電子メディエーターと一緒に電極上に固定化される。この作用電極が対電極（白金電極など）および参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と一緒に緩衝液中に挿入され、所定の温度に保たれる。所定の電圧を作用電極に適用し、その後試料を添加、そして電流の増加した値を測定する。
【００６０】
糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドの測定のためのセンサーを作製するために、フルクトシルアミノ酸の測定用の前記センサーは、複合センサーを構築するためにさらに固定化されたプロテイナーゼ（プロテアーゼなど）を含む膜と組み合わせられる。複数の酵素の組合せによる連続反応にもとづくそのような複合センサーの構造は、本技術分野において周知である。たとえば、Anthony P. F. Tuner, Isao Karube and George S. Wilsonによる「バイオセンサー−基礎と応用」（“Biosensor-Fundamental and Applications”）、オクスフォード大学出版、１９８７年を参照。
【００６１】
本明細書において引用した全ての特許文献および参考文献の内容は、参照により本明細書中に完全に組み込まれる。
【実施例】
【００６２】
本発明は、以下の実施例により詳細に説明されるが、本発明はそれらの実施例に限定されるべきものではない。
【００６３】
実施例１
Ｎ１−１ ＦＡＯＤ変異体の製造および特徴付
【００６４】
単量体サルコシンオキシダーゼ（ＭＳＯＸ）の構造機能相関の研究により、ＦＡＤから酸素への電子移動に関与するプロトンリレー系（ＰＲＳ）が、Ｔｈｒ４８およびＬｙｓ２６５と４つのＨ2Ｏ分子とを含んでなるということを明らかにした（Trickey et al, Structure, 7, 331-345, 1999）。ピチア・エスピー（Pichia sp.）Ｎ１−１株由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（Ｎ１−１ ＦＡＯＤ、配列番号：２）の活性部位は、ＭＳＯＸと、特にプロトンリレー系を担うと予測される保存された残基において高い相同性を有する。
【００６５】
Ｎ１−１ ＦＡＯＤの予測構造モデルを、ＭＳＯＸ構造を用いて構築し、アミノ酸残基Ａｓｎ４４、Ｓｅｒ４６、Ａｓｎ４７、Ｌｙｓ４８およびＬｙｓ２６９がＦＡＤからのプロトンと電子の移動に関与していると予測した。単一または二重突然変異をＮ１−１ ＦＡＯＤの電子アクセプターアベイラビリティーを改変する目的でそれらのアミノ酸残基に導入した。
【００６６】
Ｎ１−１ ＦＡＯＤ単一変異体の発現ベクターを、Ｎ１−１ ＦＡＯＤ野生型遺伝子を鋳型として、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）法（ストラタジーン（stratagene））を用いて部位特異的突然変異誘発法により作製した。Ａｓｎ４４、Ｓｅｒ４６、Ａｓｎ４７、Ｌｙｓ４８またはＬｙｓ２６９で変異を導入するためにプライマーを設計した。増幅産物は、ＤｐｎＩにより消化し、大腸菌（E. coli）ＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌ カナマイシン）において３７℃で一晩インキュベートした。クローンの変異された配列を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにおいて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ ｖ３．０を用いて確認した。次に、抽出したプラスミドを、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化し、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化したｐＥＴ２８（ａ）ベクターにライゲートした。ライゲーション混合物で形質転換した大腸菌（E. Coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌ カナマイシン）において３７℃で一晩インキュベートした。二重変異体は、同じ方法を用いてプライマーの組合せにより作製した。
【００６７】
Ｎ１−１ ＦＡＯＤ変異体の発現ベクターをもつ大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地１５０ｍｌにおいて３７℃で培養した。Ａ６６０値が０．６に達した後、０．３ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、２５℃でさらに５時間インキュベートした。細胞を遠心分離により回収し、０．８５％ ＮａＣｌ水溶液で二回洗浄した。その後、細胞を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ）ｐＨ７．０に再懸濁し、超音波ホモジナイザーにより溶菌した。ライセートを１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を５０，０００ｒｐｍ、４℃で６０分間遠心分離し、その後上清を１０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）に対して透析した。オキシダーゼ活性は、２５℃、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０中で、基質（０．２、０．５、０．７５、１、２、５ｍＭ ｆ−αＶａｌまたは５ｍＭ ｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓ）の存在下で、１．５ｍＭ ＴＯＤＢ、２Ｕ／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および１．５ｍＭ ４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）でアッセイした。キノンイミン色素の生成を分光光度計により５４６ｎｍで測定した。デヒドロゲナーゼ活性は、２５℃、１０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）において、基質（０．２、０．５、１、２、５ｍＭ ｆ−αＶａｌまたは５ｍＭ ｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓ）の存在下で、０．６ｍＭ ＤＣＩＰおよび６ｍＭ メトキシＰＭＳ（ｍＰＭＳ）でアッセイした。
【００６８】
ほとんどのケースで、オキシダーゼ活性は完全にまたは実質的に消失したが、Ｎ４７Ａ、Ｓ４６Ａ、Ｋ４８ＡおよびＮ４４Ａなどのいくつかの変異体は、相対的に高い活性を示した。なかでもＮ４７Ａは、最も目立った特徴を示した。Ｎ４７Ａのオキシダーゼ活性は野生型の活性の約２０％に減少したが、Ｎ４７Ａのデヒドロゲナーゼ活性は野生型の活性の６０％よりも高いままであった。結果として、Ｎ４７Ａは、オキシダーゼ活性よりも約４倍高いデヒドロゲナーゼ活性を示した。Ｎ４７Ａのこの特徴は、人工電子アクセプターと共にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いるセンサーストリップに有益なはずである。野生型Ｎ１−１ ＦＡＯＤおよびＮ４７Ａ変異体の粗調製物の速度論的パラメーターを表２に示す。
【００６９】
【表２】
【００７０】
実施例２
Ｎ１−１野生型およびＮ４７Ａ変異体ＦＡＯＤの精製
【００７１】
組換えＦＡＯＤは、次のように精製した。最初に、酵素を含有する水溶性画分を組換え大腸菌（Escherichia coli.）から調製した。発現ベクターを含む大腸菌を７ＬのＬＢ培地（３７℃、１０Ｌ醗酵槽で、５０μｇ／ｍｌ アンピシリン）において培養し、その後発現をＩＰＴＧ（最終濃度：０．３ｍＭ）により約ＯＤ660＝０．７で誘導し、培養温度を３０℃まで下げた。細胞を１００ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）中に懸濁し、フレンチプレスを用いて４回破壊した。上清液を超遠心分離（４０，０００ｇ、９０分）に付し、上清を１０ｍＭのＰＰｂ（ｐＨ７．０）に対して４℃で一晩透析し水溶性画分を調製した。
【００７２】
この水溶性画分を、さらに液体クロマトグラフィーに付し、精製酵素を調製した。酵素をさらに陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−５ＰＷ）で精製した。水溶性画分を、１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＤＥＡＥ−５ＰＷ（５．０ｍｍI.D.×５ｃｍ、東ソー（Tosoh））に吸着させた。カラム体積の３倍量の１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）による平衡化の後、ＦＡＯＤを、０．７ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）で溶出した。流速は１ｍｌ／分に設定し、溶出液を１分毎に回収した。２８０ｎｍの吸収波長を溶出液のモニターに使用した。
【００７３】
活性画分を、３５％硫酸アンモニウムを用いて分離し、上清液を疎水性クロマトグラフィーに付した。活性画分を、３５％硫酸アンモニウムを含有する１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ６．５）で平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラム、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｈｅ（１ｍｌ、ファルマシア（Pharmacia））に吸着させた。カラム体積の３倍量の、３５％硫酸アンモニウムを含有する１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ６．５）による平衡化の後、ＦＡＯＤを、１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ６．５）で溶出した。流速は２ｍｌ／分に設定し、溶出液を１分毎に回収した。活性画分を、４５％硫酸アンモニウムで分離し、その後沈殿を、１％マンノースおよび１００μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液に対して４℃で６時間透析した。それをさらに、１００μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ８．０）に対して４℃で６時間透析した。透析した試料を次の陰イオン交換クロマトグラフィーに用いた。
【００７４】
その試料を、１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム、Ｂｉｏａｓｉｔ Ｑ（４．６ｍｍI.D.×５ｃｍ、東ソー）に吸着させた。カラム体積の３倍量の１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ８．０）による平衡化の後、ＦＡＯＤを、０．３ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）で溶出した。流速は１ｍｌ／分に設定し、溶出液を１分毎に回収した。活性画分を１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）に対して４℃で一晩透析した。試料の精製度をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより調べた。試料をＰｈａｓｔ Ｇｅｌ ８−２５を用いる電気泳動に付し、ゲルを銀で染色した。試料調製、電気泳動および染色は、Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）に添付のマニュアルにしたがって行なった。
【００７５】
精製した酵素のオキシダーゼおよびデヒドロゲナーゼ活性は、実施例１のように測定し、図３に示した。速度論的パラメーターは、表３に示す。
【００７６】
【表３】
【００７７】
実施例３
ＰｎＦＰＯＸ変異体の製造
【００７８】
ファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＰｎＦＰＯＸ、配列番号：１）由来の変異体を製造し、特徴付けした。
【００７９】
Ｎ１−１ ＦＡＯＤとＰｎＦＰＯＸとのアラインメント（図１）および実施例１および２の結果にもとづき、Ａｓｎ５６がＦＡＤからのプロトンおよび電子の移動に関与すると予測した。ＰｎＦＡＯＤの電子アクセプターのアベイラビリティーを改変することを目的にＡｓｎ５６に種々の変異が導入された。
【００８０】
変異は、実施例１のように部位特異的突然変異誘発法を用いて導入され、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、野生型または変異体ＰｎＦＰＯＸを含有する発現ベクターで形質転換した。培養した細胞を１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０に再懸濁し、超音波処理により溶菌した。ライセートを１０，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を５０，０００ｒｐｍ、４℃で６０分間遠心分離した。オキシダーゼおよびデヒドロゲナーゼ活性を実施例１のように測定した。
【００８１】
粗ＰｎＦＰＯＸ野生型およびＡｓｎ５６変異体の活性は、図４にまとめる。比較的高いオキシダーゼ活性（野生型の４１％）を示したＡｓｎ５６Ｓｅｒを除き、Ａｓｎ５６変異体のほとんどは、それらのオキシダーゼ活性を劇的に減少させた（＜野生型の２０％）。なかでも、いくつかの変異体（Ａｓｎ５６Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ）は、比較的高いデヒドロゲナーゼ活性を示し（＞野生型の６０％）、Ａｓｎ５６ＣｙｓおよびＡｓｎ５６Ｍｅｔでは野生型より高かった。Ａｓｎ５６変異体の速度論的パラメーターは、図５にまとめる。Ａｓｎ５６ＭｅｔおよびＡｓｎ５６Ｖａｌは、Ａｓｎ５６Ａｌａよりも高い、Ｖｍａｘデヒドロゲナーゼ（Ｂ）／Ｖｍａｘオキシダーゼ（Ａ）を示した。Ａｓｎ５６Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびＰｒｏは、オキシダーゼおよびデヒドロゲナーゼの両方の活性を失った。
【００８２】
実施例４
ＰｎＦＰＯＸＮ５６Ａ変異体の精製
【００８３】
ｐＥＰＮ（ｐＥＴ２８ａ−ＰｎＦＰＯＸ）−Ｎ５６Ａで形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）を、５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含有するＬＢ培地（２Ｌ）において３７℃で好気的に培養した。Ａ６６０ｎｍ値が０．６に達した後、細胞を０．３ｍＭ ＩＰＴＧにより誘発し、２５℃で５．５時間インキュベーションを続けた。細胞を遠心分離により回収し、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０に再懸濁し、フレンチプレス（１，０００ｋｇ／ｃｍ2）に３回かけて溶菌した。ライセートを１０，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を５０，０００ｒｐｍ、４℃で６０分間遠心分離した。その後上清を、２５μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ８．０に対して透析し、粗酵素溶液をさらに精製した。
【００８４】
硫酸アンモニウムを透析した上清に３５％飽和まで添加し、その後形成した沈殿を１５，０００ｇで２０分間遠心分離によりペレットとした。硫酸アンモニウムを６５％飽和まで添加した上清を、１５，０００ｇで２０分間遠心分離した。得られた沈殿を、２５μＭ ＦＡＤおよび１％マンノースを含有する１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ８．０に溶解し、同緩衝液に対して４℃で透析し、その後、２５μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ８．０に対して透析した。透析した酵素溶液を、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ８．０で平衡化した、ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ カラム（ＧＥ ヘルスケア（Healthcare））に適用した。活性な素通り（flow-through）画分を回収し、ＦＡＯＤ活性を示さない吸着されたタンパク質を、１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。活性な素通り画分を回収し、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０に対して透析した。透析した酵素溶液を、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇ カラム（ＧＥ ヘルスケア）に適用した。ゲルろ過クロマトグラフィーを同緩衝液で行なった。活性画分を回収し、精製した酵素溶液を１００μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０に対して透析し、４℃で保管した。その精製酵素の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、濃度は、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（バイオ−ラッド（Bio-Rad）、ＣＡ、米国）を用いて測定した。結果を表４に示す。
【００８５】
【表４】
【００８６】
Ｎ５６Ａ変異体ＦＡＯＤのオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性を測定した。変異体ＦＡＯＤのＳＶ曲線および速度論的パラメーターは、図６および表５にそれぞれ示す。図６において、左のグラフは０〜５ｍＭの基質濃度における活性を示し、右のグラフは基質濃度０〜２ｍＭの拡大図である。Ｎ５６Ａ変異体は、両基質に対して有意に増加したデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【００８７】
【表５】
【００８８】
実施例５
アマドリアーゼII ＦＡＯＤ変異体の製造と特徴付
【００８９】
アマドリアーゼII（配列番号：３）由来の変異体を製造し特徴付けを行なった。Ｎ１−１ ＦＡＯＤとアマドリアーゼIIとのアラインメント（図１）および実施例１〜４の結果にもとづき、Ａｓｎ５２がＦＡＤからのプロトンおよび電子の移動に関与すると予測した。Ａｓｎ５２Ａｌａ変異を有する変異体を、実施例１に記載された方法にしたがって製造した。
【００９０】
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、アマドリアーゼII野生型またはＮ５２Ａ変異体を含有する発現ベクターで形質転換した。培養した細胞を回収し、１０ｍｌの１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０に再懸濁し、フレンチプレス（１，０００ｋｇ／ｃｍ2）に２回かけて溶菌した。ライセートを１０，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を５０，０００ｒｐｍ、４℃で６０分間遠心分離した。その後、上清を２５μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ８．０に対して透析し、粗酵素溶液を製造した。粗酵素溶液を、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ カラム（ＧＥ ヘルスケア））、およびゲルろ過クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇ カラム（ＧＥ ヘルスケア））により精製した。
【００９１】
ＦＡＯＤ活性を、基質としてのｆ−αＶａｌと共に４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（オキシダーゼ活性）およびＰＭＳ／ＤＣＩＰ（デヒドロゲナーゼ活性）を用いてアッセイした。結果を図７に示す。
【００９２】
精製したアマドリアーゼII野生型およびＡｓｎ５２Ａｌａの速度論的パラメーターは図８にまとめる。変異体Ｎ５２Ａは、オキシダーゼ活性よりも約２倍高いデヒドロゲナーゼ活性を示した。
【００９３】
実施例６
バイオセンサーの構築
【００９４】
ＰｎＦＰＯＸ野生型またはＮ５６Ａ ＰｎＦＰＯＸいずれかの４０ｍＵ／５μｌ溶液を、２％ＡＷＰ溶液と混合した。混合物５μｌを再利用可能な金電極（表面積：７ｍｍ2）に適用し、３０℃で３０分間乾燥させた。電極を、ＵＶ−光で１分間照射し、固定化された野生型またはＮ５６Ａ ＦＰＯＸを有する電極を製造した。電極を、２ｍＭニトロソアニリン（ＮＡ；国際公開第２００４／１１３９００号のｐ．３３ｆｆ．より公知）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液２ｍｌに浸漬した。その後、＋２００ｍＶ対Ａｇ／ＡｇＣｌを適用し、電流をモニターした。定常状態電流が観測された場合、異なる濃度のＦＶを含む試料溶液を反応混合物に添加し、電流の増加をモニターした。酸素の非存在下での酵素活性を測定するために、Ａｒガスで反応チャンバー内を連続的に不活化した。
【００９５】
図９は、酸素存在下または非存在下（Ａｒガス下）における、ＦＶ濃度とＰｎＦＰＯＸ Ｎ５６Ａまたは野生型酵素を有する電極の電流増加との相関関係を示す。電気化学反応に対する酸素の影響が観察されるが、酸素の存在の影響は野生型を用いた場合よりも少なかった。これらの結果は、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性は、溶存酸素レベルによる影響を受けにくいということを示唆した。
【００９６】
実施例７
ＦＰＯＸ−Ｃ変異体の製造および特徴付
【００９７】
Ａｓｎ５２Ａｌａ変異を有するＦＰＯＸ−Ｃ（配列番号：７）由来の変異体を、実施例５と同様の方法で製造した。その粗酵素調製物を、さらに精製することなく、酵素活性アッセイに使用した。ＦＡＯＤ活性を、基質としての１ｍＭ ｆ−αＶａｌまたは１ｍＭ ｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓのいずれかと共に４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（Ｏｘ：オキシダーゼ活性）およびＰＭＳ／ＤＣＩＰ（ＤＨ：デヒドロゲナーゼ活性）を用いてアッセイした。結果を以下の表６に示す。
【００９８】
【表６】
【００９９】
変異体ＦＰＯＸ−Ｃ Ｎ５２Ａは、ｆ−αＶａｌおよびｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓの両方に対してオキシダーゼ活性よりも非常に高いデヒドロゲナーゼ活性を示した。
【０１００】
実施例８
ループ変異体の製造および特徴付
【０１０１】
ＰｎＦＰＯＸは、フルクトシルヘキサペプチドに対して、ＦＶＨと比較して１％未満のレベルでオキシダーゼ活性を示すが、ＦＰＯＸ−Ｃは活性を示さない。他方、ＦＰＯＸ−Ｃは、ＦＶＨに対してＰ．ｎ ＦＰＯＸよりもより高い活性を示す。両オキシダーゼのアミノ酸配列の比較から、ＦＡＯＤとＦＰＯＸとの間の有意な相違は、それらのループ領域に見られる。
【０１０２】
ループ１領域
ＰｎＦＰＯＸ （６１）Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａ（７２）（配列番号：１３）
ＦＰＯＸ−Ｃ （６１）Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ（７２）（配列番号：１４）
【０１０３】
ループ２領域
ＰｎＦＰＯＸ （１０９）Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ（１２４）（配列番号：１５）
ＦＰＯＸ−Ｃ （１０９）Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａ（１２６）（配列番号：１６）
【０１０４】
ループ１領域（１２ａａ）では、５つのアミノ酸残基がＰｎＦＰＯＸとＦＰＯＸ−Ｃとで異なる。ループ２領域（１６ａａ）では、２つのアミノ酸挿入と７つのアミノ酸置換が見られる。
【０１０５】
１ＰｎＦＰＯＸとＦＰＯＸ−Ｃとのループ領域が互に交換されているキメラループ変異体、ならびにそのＮ５６Ａ変異体を製造した。上記に示した部分アミノ酸配列にもとづき、８種類の変異体を製造した。
【０１０６】
Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ１ＥｘＣ（すなわち、ループ１領域がＦＰＯＸ−Ｃ由来のループ１領域に置換されているＰｎ ＦＰＯＸ）
Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ１ＥｘＣ／Ｎ５６Ａ（すなわち、ループ１領域がＦＰＯＸ−Ｃ由来のループ１領域に置換されているＰｎ ＦＰＯＸのＮ５６Ａ変異体）
Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣ（すなわち、ループ２領域がＦＰＯＸ−Ｃ由来のループ２領域に置換されているＰｎ ＦＰＯＸ）
Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣ／Ｎ５６Ａ（すなわち、ループ２領域がＦＰＯＸ−Ｃ由来のループ２領域に置換されているＰｎ ＦＰＯＸのＮ５６Ａ変異体）
ＦＰＯＸ−Ｃ／Ｌ１ＥｘＰｎ（すなわち、ループ１領域がＰｎ ＦＰＯＸ由来のループ１領域に置換されているＦＰＯＸ−Ｃ）
ＦＰＯＸ−Ｃ／Ｌ１ＥｘＰｎ／Ｎ５６Ａ（すなわち、ループ１領域がＰｎ ＦＰＯＸ由来のループ１領域に置換されているＦＰＯＸ−ＣのＮ５６Ａ変異体）
ＦＰＯＸ−Ｃ／Ｌ２ＥｘＰｎ（すなわち、ループ２領域がＰｎ ＦＰＯＸ由来のループ２領域に置換されているＦＰＯＸ−Ｃ）
ＦＰＯＸ−Ｃ／Ｌ２ＥｘＰｎ／Ｎ５６Ａ（すなわち、ループ２領域がＰｎ ＦＰＯＸ由来のループ２領域に置換されているＦＰＯＸ−ＣのＮ５６Ａ変異体）
【０１０７】
変異の導入および粗酵素の製造は、実施例１および５に記載されているように行なった。ＦＡＯＤ活性を、基質としての１ｍＭ ｆ−αＶａｌ、１ｍＭ ｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓまたは５ｍＭフルクトシルヘキサペプチド（Ｆ−ＨＰ）のいずれかと共に４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（Ｏｘ：オキシダーゼ活性）およびＰＭＳ／ＤＣＩＰ（ＤＨ：デヒドロゲナーゼ活性）を用いてアッセイした。
【０１０８】
Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ１ＥｘＣおよびＰｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣは、野生型Ｐ．ｎ．ＦＰＯＸと比較してｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓに対して高い酸化活性を示した。ＦＰＯＸ−Ｃ／Ｌ１ＥｘＰｎは、野生型ＦＰＯＸ−Ｃにおいては観察されないＦ−ＨＰへの活性を示した。興味深いことに、Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣは、Ｆ−ＨＰに対して活性を増加させたが、Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ１ＥｘＣは、Ｆ−ＨＰに対して活性をほとんど失った。これらの結果は、Ｆ−ＨＰに対するＰ．ｎ．ＦＰＯＸ活性の改善が、ループ領域の改変によりさらに改善できたことを示した。
【０１０９】
これらのループ変異体へのＮ５６Ａ変異の導入は、オキシダーゼ活性の減少とデヒドロゲナーゼ活性の増加をもたらした。Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ１ＥｘＣ／Ｎ５６ＡおよびＰｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣ／Ｎ５６Ａの両方が、ｆ−αＶａｌに対してそれらのオキシダーゼ活性と比較してより高いデヒドロゲナーゼ活性を示した。Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣ／Ｎ５６Ａのｆ−αＶａｌに対するデヒドロゲナーゼ活性は、Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｎ５６Ａと比較して際立った増加を示し、ＦＰＯＸ−Ｃ／Ｎ５６Ａのものよりもより高かった。
【０１１０】
Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ１ＥｘＣ／Ｎ５６ＡおよびＰｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣ／Ｎ５６Ａの両方が、ｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓに対してそれらのオキシダーゼ活性と比較してより高いデヒドロゲナーゼ活性を示した。最も高いデヒドロゲナーゼ活性は、Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣ／Ｎ５６Ａにおいて観察され、これはＦＰＯＸ−Ｃ／Ｎ５６Ａのものとほとんど同じである。
【０１１１】
代表的な結果を以下の表７に示す。
【０１１２】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化アルブミン、フルクトシルペプチド、ＨｂＡ１ｃおよびフルクトシルバリン（ＦＶ）などの糖化タンパク質の測定用キットおよびセンサーに使用するためのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（フルクトシルアミンオキシダーゼとも呼ばれる）に関する。より詳細には、本発明はオキシダーゼ活性の減少した変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質は、タンパク質上のアミノ基および糖の還元末端との間の共有結合を介して非酵素的に生成され、アマドリ化合物とも言われる。血中において、グルコースはヘモグロビンのβ−鎖のＮ−末端でバリンと結合し、糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン；ＨｂＡｌｃ）を生成する。ヘモグロビンに対するＨｂＡｌｃの存在比は、正常な健常個体と比較して糖尿病患者においてより高く、ＨｂＡｌｃの血中濃度は、過去数週間の血糖値を反映することが知られている。したがって、ＨｂＡｌｃの血中濃度は、糖尿病の診断のための臨床試験において、また糖尿病患者の血糖コントロールにおいて非常に重要である。血中のＨｂＡｌｃ濃度は、フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンに特異性を有する酵素を用いて測定することが可能である。
【０００３】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、様々な種類の株から単離されており、糖化アルブミン、ＨｂＡｌｃおよびフルクトシルアミノ酸などの糖化タンパク質がそのような酵素を用いて分析できることが示唆されている（特開昭６１−２６８１７８号公報；特開昭６１−２８０２９７号公報；特開平０３−１５５７８０号公報；特開平０５−１９２１９３号公報；特開平０７−２８９２５３号公報；特開平０８−１５４６７２号公報；特開２００１−９５５９８号公報；特開２００３−７９３８６号公報；特開２００３−２３５５８５号公報；Agric. Biol. Chem., 53(1), 103-110, 1989；Agric. Biol. Chem., 55(2), 333-338, 1991；J. Biol. Chem., 269(44), 27297-27301, 1994；Appl. Environ. Microbiol., 61(12), 4487-4489, 1995；Biosci. Biotech. Biochem., 59(3), 487-491, 1995；J. Biol. Chem., 270(1), 218-224, 1995；J. Biol. Chem., 271(51), 32803-32809, 1996；およびJ. Biol. Chem., 272(6), 3437-3443, 1997）。
【０００４】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、フルクトシルアミノ酸が酸化され、２−ケト−Ｄ−グルコースおよび対応するアミノ酸を生成する反応を触媒するＦＡＤ依存性酵素であり、ＦＡＤの還元型（ＦＡＤＨ２）の生成を伴う。ＦＡＤＨ２は、次に電子アクセプターに電子を伝達し、その酸化型に変換される。酸素の存在下で、ＦＡＤＨ２は人工電子アクセプター（アソメディエーター（asmediators）または電子メディエーターとも言う）に対してよりもむしろ酸素分子に優先的に電子を伝達する。したがって、フルクトシルアミノ酸を、メディエーターを用いてフルクトシルアミノ酸オキシダーゼによりアッセイする場合、アッセイの結果は、反応系における溶存酸素レベルに大きく影響を受ける。そのような不利益は、人工電子アクセプターを利用するポイント・オブ・ケア検査装置による血液試料の臨床検査において特に指摘される。人工電子メディエーターを用いる酵素センサーストリップに使用される酵素は、酸素に対して低い活性を有することが望まれる。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、酵素、特にその活性が溶存酸素レベルによりほとんど影響を受けないフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供することである。
【発明の概要】
【０００６】
一般的に言えば、本願の発明者らは、酵素、より詳細にはその活性が溶存酸素レベルによりほとんど影響を受けないフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供することができる。より具体的には、これは、その野生型において優先的にオキシダーゼ活性を示す酵素のオキシダーゼ活性を減少させることにより、好ましくは同時に酵素のデヒドロゲナーゼ活性を増加させることにより達成される。以下により詳細に説明するように、これは野生型酵素を変異させることにより達成されている。
【０００７】
本発明者らは、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの種々の変異体を製造し、驚くべきことに、特定の種類の変異体が、デヒドロゲナーゼ活性、詳細には、色素媒介（dye-mediated）デヒドロゲナーゼ活性を実質的に保持しながら減少したオキシダーゼ活性を示すことを見出した。
【０００８】
本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列の５６位に対応する位置で、アミノ酸残基Ａｓｎを、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換することにより改変された変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。
【０００９】
好ましい実施態様において、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して減少されたオキシダーゼ活性を有し、好ましくは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して増加されたデヒドロゲナーゼ活性を有する。好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの３０％以下のオキシダーゼ活性を有し、そしてまた、好ましくは野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの５０％以上のデヒドロゲナーゼ活性を有する。また好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して増加したデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【００１０】
別の好ましい実施態様において、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１〜１６からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、配列番号１記載のアミノ酸配列の５６位に対応する位置のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基により置換されているアミノ酸配列を有する。好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１記載のアミノ酸配列であって、５６位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。より好ましくは、配列番号１の位置１０９−１２４のアミノ酸配列：Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕが、配列：Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａで置き換えられている。また好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号２記載のアミノ酸配列であって、４７位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。また好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号３記載のアミノ酸配列であって、５２位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。また好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号７記載のアミノ酸配列であって、５６位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。より好ましくは、配列番号７の位置６１−７２のアミノ酸配列Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒが、配列：Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａで置き換えられている。
【００１１】
別の側面では、本発明は、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
また別の側面では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１３】
さらに別の側面では、本発明は、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法であって、試料を本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させること、およびフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより酸化された糖化タンパク質の量を測定することを含む方法を提供する。
【００１５】
なお別の側面において、本発明は、ＨｂＡ１ｃをアッセイするための方法であって、試料中のＨｂＡ１ｃを消化してフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを生成すること、該フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させること、および酸化されたフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの量を測定することを含む方法を提供する。
【００１６】
別の側面において、本発明は、試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするための装置であって、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび電子移動メディエーターを含む装置を提供する。
【００１７】
また別の側面において、本発明は、試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするためのキットであって、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび電子移動メディエーターを含むキットを提供する。
【００１８】
別の側面において、本発明は、電極に固定化されている本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを有する酵素電極を提供する。
【００１９】
別の側面において、本発明は、作用電極として本発明の酵素電極を含むフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするための酵素センサーを提供する。
【００２０】
また別の側面において、本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列であって、配列番号１の６１−７２位のアミノ酸配列：Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａが、配列：Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。なお別の側面において、本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列であって、配列番号１の１０９−１２４位のアミノ酸配列：Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕが、配列：Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。また別の側面において、本発明は、配列番号７記載のアミノ酸配列であって、配列番号７の６１−７２位のアミノ酸配列：Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒが、配列：Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。また別の側面において、本発明は、配列番号７記載のアミノ酸配列であって、配列番号１の１０９−１２６位のアミノ酸配列：Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａが、配列：Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の変異されたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、糖尿病状態の診断やコントロールにおいて臨床的に有用なヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）などの糖化タンパク質の測定に使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】いくつかの真核性ＦＡＯＤのＮ−末端付近のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２】フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの反応系を示す。
【図３】精製されたＮ１−１ ＦＡＯＤ Ｎ４７Ａ変異体のオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【図４】粗ＰｎＦＰＯＸ野生型およびＡｓｎ５６変異体のオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【図５】ＰｎＦＰＯＸ Ａｓｎ５６変異体の速度論的パラメーターを示す。
【図６】精製されたＰｎＦＰＯＸ Ｎ５６Ａ変異体のオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【図７】精製されたアマドリアーゼII野生型およびＮ５２Ａ変異体のオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【図８】精製されたアマドリアーゼII野生型およびＮ５２Ａ変異体の速度論的パラメーターを示す。
【図９】ＰｎＦＰＯＸ Ｎ５６Ａまたは野生型ＦＡＯＤを有する電極を用いるＦＶ濃度のアッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）は、様々な真核性および原核性株に存在するということが知られている。表１は、今までに単離された、または予測されたＦＡＯＤのいくつかの例を示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
真核性ＦＡＯＤは、基質特異性により、（ｉ）α−フルクトシルアミノ酸優先（ＦＡＯＤ−Ｐ、ＦＡＯＤ−Ｕ、ＦＡＯＸ−Ｅ、ＦＰＯＸ−Ｃ、およびＰｎＦＰＯＸ）、（ii）ε−フルクトシルアミノ酸優先（ＦＡＯＤ−Ｆ、ＦＡＯＤ−Ａ、アマドリアーゼＩ、およびＦＡＯＤ−Ａｏ１）、および（iii）α−およびε−糖化アミノ酸両方に類似の活性（アマドリアーゼII、ＦＡＯＤ−Ａｏ２、およびＮ１−１ ＦＡＯＤ）に分類することができる。一般に、α−フルクトシルアミノ酸に活性なＦＡＯＤは、α−フルクトシルバリンおよびＨｂＡ１ｃのアッセイにおいて有用となり、ε−フルクトシルアミノ酸に活性なＦＡＯＤは、ε−フルクトシルリジンおよび糖化アルブミンのアッセイにおいて有用となる。当業者は、酵素に変異を導入することにより、α−またはε−フルクトシルアミノ酸に対するその優先性を変えることができるということを理解するものである。
【００２６】
本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列（ＰｎＦＰＯＸ）の５６位に対応する位置で、アミノ酸残基ＡｓｎをＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換することにより改変された変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。
【００２７】
本明細書において使用される用語、タンパク質の「変異体」は、表示される位置でタンパク質上の１つまたは複数のアミノ酸残基に置換を含む変異型タンパク質を意味する。用語変異体はまた、そのような変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも使用される。
【００２８】
本明細書において使用される語句「対応する位置」は、デフォルトパラメーターを有するＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩのソフトウェアＡｌｉｇｎＸ（インビトロジェン製；Lu, G., and Moriyama, E.N. (2004) Vector NTI, a balanced all-in-one sequence analysis suite. Brief Bioinform 5, 378-88参照）を用いて、参照アミノ酸配列のアミノ酸残基と位置合わせされる照会（query）アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置を意味する。したがって、「配列番号１記載のアミノ酸配列の５６位に対応する位置のＡｓｎ残基」は、照会アミノ酸配列が、デフォルトパラメーターを有するＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩのＡｌｉｇｎＸを用いて配列番号１とアラインメントされる場合に、配列番号１のＡｓｎ５６と位置合わせされる照会アミノ酸配列におけるＡｓｎ残基を意味する。配列番号１自体のＡｓｎ４７もこの用語により包含されることに留意すべきである。
【００２９】
図１は、いくつかの真核性ＦＡＯＤ（ペニシリウム・ヤンシネルム（Penicillum janthinelum）ＡＫＵ３４１３由来のＦＡＯＤ−Ｐ、ウロクラディウム・エスピー（Ulocladium sp.）ＪＳ−１０３由来のＦＡＯＤ−Ｕ、ユーペニシリウム・テレヌム（Eupenicillum terrenum）ＡＴＣＣ １８５４７由来のＦＰＯＸ−Ｅ、コニオカエタ・エスピー（Coniochaeta sp.）ＮＩＳＬ ９３３０由来のＦＰＯＸ−Ｃ、ファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）由来のＰｎＦＰＯＸ、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）ＮＢＲＣ ９９７２由来のＦＡＯＤ−Ｆ、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）ＧＰ１由来のＦＡＯＤ−Ａ、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）由来のアマドリアーゼＩ、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）由来のＦＡＯＤ−Ａｏ１、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）由来のアマドリアーゼII、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）由来のＦＡＯＤ−Ａｏ２およびピチア・エスピー（Pichia sp.）Ｎ１−１由来のＮ１−１ ＦＡＯＤ）のＮ−末端付近の保存された領域内のアミノ酸配列のアラインメントを示す。これらのＦＡＯＤの全配列は、配列番号１〜１２に記載されている。アラインメントは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｓｕｉｔｅ６．０のＡｌｉｇｎＸアプリケーションを用いて作製された。矢印はＮ１−１ ＦＡＯＤのＡｓｎ４７に対応する残基を示す。括弧中の数字は、配列番号により表される各アミノ酸配列における、図１の一番左の「Ｐ」の位置を示す。当業者は、Ｂｌａｓｔなどの別のアラインメントソフトウェアプログラムが、同じまたは実質的に同じアラインメントを提供するであろう事を理解するものである。
【００３０】
図１から、Ｎ１−１ ＦＡＯＤのＡｓｎ４７を含む領域におけるアミノ酸配列が、真核性ＦＡＯＤのあいだで高度に保存されているということがわかる。したがって、当業者は、配列アラインメント用の任意の市販のソフトウェアプログラムを用いて保存された領域内のＮ１−１ ＦＡＯＤのＡｓｎ４７に対応するＡｓｎ残基を容易に同定することができ、また、変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、そのＡｓｎ残基上に修飾を導入することにより容易に製造されることを理解することができる。
【００３１】
別の好ましい実施態様において、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１〜１５からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、配列番号１記載のアミノ酸配列の５６位に対応する位置でアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。
【００３２】
好ましい実施態様において、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号１記載のアミノ酸配列（ＰｎＦＰＯＸ）であって、５６位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。好ましくは、Ａｓｎ残基はＡｌａで置換される。別の好ましい実施態様においては、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号２記載のアミノ酸配列（Ｎ１−１）であって、４７位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。なお別の好ましい実施態様において、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、配列番号３記載のアミノ酸配列（アマドリアーゼII）であって、５２位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する。
【００３３】
本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、デヒドロゲナーゼ活性を実質的に保持しながら減少されたオキシダーゼ活性を示す。図２は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの反応スキームを説明する。
【００３４】
本明細書において、「オキシダーゼ活性」は、酸素を電子アクセプターとして利用しながらフルクトシルアミノ酸の酸化を触媒し、２−ケト−Ｄ−グルコースと対応するアミノ酸を生成する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの酵素活性（Ｖｍａｘ）である。オキシダーゼ活性は、本技術分野において既知の任意の方法、例えば、４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（４−アミノアンチピリン／Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン二ナトリウム塩／西洋ワサビペルオキシダーゼ）などのＨ2Ｏ2検出用試薬やＰｔ電極により、生成したＨ2Ｏ2の量を測定することによりアッセイすることができる。本明細書において、相対的または定量的活性という文脈では、オキシダーゼ活性は、具体的には、２５℃で、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０、１．５ｍＭ ＴＯＤＢ、２Ｕ／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および１．５ｍＭ ４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）において生成されたＨ2Ｏ2の量により測定される、単位時間当たり酸化された基質（フルクトシルアミノ酸）のモル量と定義される。キノンイミン色素の生成は、５４６ｎｍで分光光度法により測定することができる。
【００３５】
本明細書において、「デヒドロゲナーゼ活性」は、酸素以外の電子メディエーターを電子アクセプターとして利用しながらフルクトシルアミノ酸の酸化を触媒し、２−ケト−Ｄ−グルコースと対応するアミノ酸を生成する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの酵素活性（Ｖｍａｘ）である。デヒドロゲナーゼ活性は、たとえば、ｍＰＭＳ／ＤＣＩＰ（メチル硫酸１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム／２，６−ジクロロインドフェノール）、ｃＰＥＳ（トリフルオロ−酢酸−１−（３−カルボキシ−プロポキシ）−５−エチル−フェナジニウム、ＮＡ ＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）３−メトキシ−ニトロソアニリン塩酸塩、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリンおよびＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリン）などを用いてメディエーターに移動した電子の量を測定することによりアッセイすることができる。
【００３６】
本明細書において、相対的または定量的活性という文脈では、デヒドロゲナーゼ活性は、具体的には、２５℃で、１０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）、０．６ｍＭ ＤＣＩＰ、および６ｍＭ メトキシＰＭＳ（ｍＰＭＳ）においてメディエーターに移動された電子の量により測定される、単位時間当たり酸化された基質（フルクトシルアミノ酸）のモル量と定義される。
【００３７】
本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、デヒドロゲナーゼ活性を実質的に保持しながら、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して減少されたオキシダーゼ活性を有する。
【００３８】
好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの５０％以下のオキシダーゼ活性を有する。より好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらにより好ましくは２０％以下、最も好ましくは１５％以下のオキシダーゼ活性を有する。また、好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの５０％以上のデヒドロゲナーゼ活性を有する。より好ましくは、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは１００％以上、最も好ましくは１００％より高いデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【００３９】
野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにおいて、オキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性は、比率、デヒドロゲナーゼ活性／オキシダーゼ活性が、約０．８〜１．２の間と同程度にある。アッセイ系に溶存酸素が存在する場合、基質の酸化により生じた電子は、酸素に優先的に移動することになる。したがって、電子メディエーターの存在下で測定される酵素活性は、溶存酸素濃度によって大きな影響を受けることになる。対照的に、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、約２．０以上、好ましくは４．０以上、より好ましくは１０以上、さらにより好ましくは２０以上、最も好ましくは４０以上の比率、デヒドロゲナーゼ活性／オキシダーゼ活性を有する。デヒドロゲナーゼ活性がオキシダーゼ活性を上回るので、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの酵素活性は、溶存酸素濃度の影響をほとんど受けないものとなる。これは、血液試料による臨床診断におけるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの利用において好都合なものである。
【００４０】
別の側面において、本発明は、１つまたは複数のループ領域が改変または変異されているフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提供する。ＰｎＦＰＯＸは、フルクトシルヘキサペプチドに対してＦＶＨと比較して１％未満の活性レベルのオキシダーゼ活性を示す。一方、ＦＰＯＸ−Ｃは、活性を示さない。他方、ＦＰＯＸ−Ｃは、Ｐ．ｎＦＰＯＸよりもＦＶＨに対してより高い活性を示す。両オキシダーゼのアミノ酸配列の比較から、ＦＡＯＤとＦＰＯＸとのあいだの有意差は、それらのループ領域に見られる。
【００４１】
ループ１領域
ＰｎＦＰＯＸ （６１）Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａ（７２）（配列番号：１３）
ＦＰＯＸ−Ｃ （６１）Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ（７２）（配列番号：１４）
【００４２】
ループ２領域
ＰｎＦＰＯＸ （１０９）Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ（１２４）（配列番号：１５）
ＦＰＯＸ−Ｃ （１０９）Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａ（１２６）（配列番号：１６）
【００４３】
ループ１領域（１２ａａ）では、５つのアミノ酸残基がＰｎＦＰＯＸとＦＰＯＸ−Ｃとで異なる。ループ２領域（１６ａａ）では、２つのアミノ酸挿入と７つのアミノ酸置換が見られる。
【００４４】
驚くべきことに、ＰｎＦＰＯＸとＦＰＯＸ−Ｃとのループ領域が互に交換されているいくつかのキメラループ変異体が改善された活性を示すことが見出された。下記の実施例８に示されているように、ループ２領域がＦＰＯＸ−Ｃループ２領域により置き換えられているＰｎＦＰＯＸは、野生型ＰｎＦＰＯＸよりもＦＶ、ＦＶＨおよびフルクトシルヘキサペプチド（Ｆ−ＨＰ）に対してより高いオキシダーゼ活性を示す。ループ１領域がＰｎＦＰＯＸループ１領域により置き換えられているＦＰＯＸ−Ｃは、野生型ＦＰＯＸ−Ｃにおいては検出されない、Ｆ−ＨＰに対してオキシダーゼ活性を示す。加えて、Ｎ５６Ａ変異を有するキメラループ変異体も、ＰｎＦＰＯＸおよびＦＰＯＸ−Ｃ由来のＮ５６Ａ変異体において観察されるように、減少したオキシダーゼ活性と増加したデヒドロゲナーゼ活性を示す。特に好ましいキメラループ変異体は、ループ２領域がＦＰＯＸ−Ｃのループ２領域で置換されており、かつＡｓｎ５６がＡｌａで置換されているＰｎＦＰＯＸである。別の特に好ましいキメラループ変異体は、ループ１領域がＰｎＦＰＯＸのループ１領域で置換されており、かつＡｓｎ５６がＡｌａで置換されているＦＰＯＸ−Ｃである。これらの結果は、ＰｎＦＰＯＸ由来のループ１領域とＦＰＯＸ−Ｃ由来のループ２領域の組合せが、フルクトシルバリンおよびフルクトシルバリルヒスチジンならびにフルクトシルヘキサペプチドに対してより高い活性を提供するということを示唆する。
【００４５】
別の側面において、本発明は、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、公共のデータベースから容易に得ることができる。野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、ＰＣＲまたは他の既知の技術を用いて各生物のゲノムからクローニングすることができる。変異は、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ突然変異誘発法または本技術分野において周知の任意の他の技術により導入することができる。変異されるべきＡｓｎ残基は、本技術分野において利用可能な配列アラインメントのための任意のソフトウェアを用いて同定することができる。あるいは、変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、一連の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより製造してもよいし、または完全に合成してもよい。
【００４６】
変異されたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、変異体遺伝子を適切な発現ベクターに挿入し、そのベクターを大腸菌（E. coli）細胞などの適切な宿主細胞に導入することにより製造することができる。形質転換体を培養し、その形質転換体において発現されたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを、細胞または培養培地から回収することができる。
【００４７】
かくして得られた組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、本技術分野において公知の任意の精製技術、たとえばイオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析沈殿、溶媒沈殿、免疫沈降、ゲル電気泳動、等電電気泳動および透析などにより精製することができる。
【００４８】
したがって、本発明は、変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、そのようなベクターで形質転換された宿主細胞、ならびに該形質転換体を培養し、変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを培養物から回収および精製することにより、本発明の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを製造する方法も包含する。
【００４９】
本発明はまた、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法も包含する。その方法は、試料を本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させること、およびフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより酸化された糖化タンパク質の量を測定することを含む。本発明によりアッセイされる糖化タンパク質は、たとえば、フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃ、フルクトシルヘキサペプチド、糖化アルブミンおよび他のフルクトシルアミノ酸である。なお別の側面において、本発明は、試料中のＨｂＡ１ｃを消化してフルクトシルバリンを生成すること、そのフルクトシルバリンを本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させること、および酸化されたフルクトシルバリンの量を測定することを含むＨｂＡ１ｃをアッセイするための方法を提供する。
【００５０】
別の側面において、本発明は、試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃ、フルクトシルヘキサペプチドまたは糖化アルブミンをアッセイするための装置であって、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび電子移動メディエーターを含む装置を提供する。
【００５１】
アッセイ装置は、任意の従来の市販されている血糖値をモニターするための電流測定バイオセンサーのテストストリップと同様の構造を有することができる。そのような装置の１つの例は、絶縁基材上に配置された２つの電極（作用電極と参照または対電極）、試薬ポートおよび試料受け（receiver）を有する。試薬ポートは、本発明の変異されたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびメディエーターを含む。血液試料などの試料が試料受けに添加されると、試料に含まれるフルクトシルアミノ酸がフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと反応し、電流が生じ、試料中のフルクトシルアミノ酸の量を示す。酵素基質の測定に適した電気化学センサーの典型的な例は、たとえば国際公開第２００４／１１３９００号および米国特許第５，９９７，８１７号明細書から公知である。電気化学センサーの代わりとして、光学的検出技術も使用可能なはずである。典型的には、そのような光学装置は、酵素、電子移動メディエーターおよび指示薬を含む試薬系において起こる色の変化にもとづくものである。色の変化は、蛍光、吸光、緩和（remission）測定を用いて定量することができる。酵素基質の測定に適した光学装置の典型的な例が、たとえば米国特許第７，００８，７９９号明細書、米国特許第６，０３６，９１９号明細書および米国特許第５，３３４，５０８号明細書から公知である。
【００５２】
なお別の側面において、本発明は、試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするためのキットであって、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび電子移動メディエーターを含むキットを提供する。
【００５３】
フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定のためのキットは、本発明の酵素を用いて構築することが可能である。本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼに加えて、キットは、測定に必要な緩衝液、適切なメディエーター、および必要ならばペルオキシダーゼなどの酵素、較正曲線の作製のためのフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンまたはそれらの誘導体の標準溶液、および使用説明書を含有する。本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、多様な形態、たとえば凍結乾燥試薬として、または適切なストレージソリューションの溶液として提供してもよい。
【００５４】
本発明の酵素を用いて、糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドアッセイキットを構築することも可能である。糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドは、酵素的にまたは化学的に消化され、フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジンおよびフルクトシルヘキサペプチドといったフルクトシルアミノ酸またはフルクトシルペプチドを生じ、それが今度は本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いて定量される。このようにして、糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドがアッセイ可能である。したがって、糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドのための本発明のアッセイキットは、フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定のための前記キットにさらに加水分解するための試薬またはプロテアーゼを含有することができる。
【００５５】
別の側面において、本発明は、電極上に固定化された本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを有する酵素電極を提供する。
【００５６】
別の側面において、本発明は、作用電極として本発明の酵素電極を含む、フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするための酵素センサーを提供する。
【００５７】
試料中のフルクトシルアミノ酸の濃度は、酵素反応により生じた電子の量を測定することにより決定することができる。本技術分野においては、炭素電極、金属電極、および白金電極などの様々なセンサー系が知られている。本発明の変異されたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、電極上に固定される。固定化のための手段の例としては、架橋、高分子マトリックスへの封入、透析膜による被覆、光架橋性ポリマー、電気伝導性ポリマー、酸化−還元ポリマー、およびそれらの任意の組合せなどが挙げられる。
【００５８】
測定が電流測定系において行なわれる場合、固定化された酵素を備えた炭素電極、金電極または白金電極が作用電極として、対電極（白金電極など）および参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に使用される。電極は、メディエーターを含有する緩衝液中に挿入され、所定の温度に保たれる。所定の電圧を作用電極に適用し、その後試料を添加、そして電流の増加した値を測定する。アッセイに使用されるメディエーターの例としては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、ルテニウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどが挙げられる。通常、１つの作用電極と１つの対電極または偽−参照電極とのいわゆる二電極系も使用することが可能である。
【００５９】
さらに、フルクトシルアミノ酸は、炭素電極、金電極、または白金電極を用いる電流測定系において、固定化された電子メディエーターを用いてアッセイすることもできる。酵素は、作用電極を作製するために吸着または共有結合により高分子マトリックスにおいてフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどの電子メディエーターと一緒に電極上に固定化される。この作用電極が対電極（白金電極など）および参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と一緒に緩衝液中に挿入され、所定の温度に保たれる。所定の電圧を作用電極に適用し、その後試料を添加、そして電流の増加した値を測定する。
【００６０】
糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドの測定のためのセンサーを作製するために、フルクトシルアミノ酸の測定用の前記センサーは、複合センサーを構築するためにさらに固定化されたプロテイナーゼ（プロテアーゼなど）を含む膜と組み合わせられる。複数の酵素の組合せによる連続反応にもとづくそのような複合センサーの構造は、本技術分野において周知である。たとえば、Anthony P. F. Tuner, Isao Karube and George S. Wilsonによる「バイオセンサー−基礎と応用」（“Biosensor-Fundamental and Applications”）、オクスフォード大学出版、１９８７年を参照。
【００６１】
本明細書において引用した全ての特許文献および参考文献の内容は、参照により本明細書中に完全に組み込まれる。
【実施例】
【００６２】
本発明は、以下の実施例により詳細に説明されるが、本発明はそれらの実施例に限定されるべきものではない。
【００６３】
実施例１
Ｎ１−１ ＦＡＯＤ変異体の製造および特徴付
【００６４】
単量体サルコシンオキシダーゼ（ＭＳＯＸ）の構造機能相関の研究により、ＦＡＤから酸素への電子移動に関与するプロトンリレー系（ＰＲＳ）が、Ｔｈｒ４８およびＬｙｓ２６５と４つのＨ2Ｏ分子とを含んでなるということを明らかにした（Trickey et al, Structure, 7, 331-345, 1999）。ピチア・エスピー（Pichia sp.）Ｎ１−１株由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（Ｎ１−１ ＦＡＯＤ、配列番号：２）の活性部位は、ＭＳＯＸと、特にプロトンリレー系を担うと予測される保存された残基において高い相同性を有する。
【００６５】
Ｎ１−１ ＦＡＯＤの予測構造モデルを、ＭＳＯＸ構造を用いて構築し、アミノ酸残基Ａｓｎ４４、Ｓｅｒ４６、Ａｓｎ４７、Ｌｙｓ４８およびＬｙｓ２６９がＦＡＤからのプロトンと電子の移動に関与していると予測した。単一または二重突然変異をＮ１−１ ＦＡＯＤの電子アクセプターアベイラビリティーを改変する目的でそれらのアミノ酸残基に導入した。
【００６６】
Ｎ１−１ ＦＡＯＤ単一変異体の発現ベクターを、Ｎ１−１ ＦＡＯＤ野生型遺伝子を鋳型として、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）法（ストラタジーン（stratagene））を用いて部位特異的突然変異誘発法により作製した。Ａｓｎ４４、Ｓｅｒ４６、Ａｓｎ４７、Ｌｙｓ４８またはＬｙｓ２６９で変異を導入するためにプライマーを設計した。増幅産物は、ＤｐｎＩにより消化し、大腸菌（E. coli）ＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌ カナマイシン）において３７℃で一晩インキュベートした。クローンの変異された配列を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにおいて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ ｖ３．０を用いて確認した。次に、抽出したプラスミドを、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化し、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化したｐＥＴ２８（ａ）ベクターにライゲートした。ライゲーション混合物で形質転換した大腸菌（E. Coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌ カナマイシン）において３７℃で一晩インキュベートした。二重変異体は、同じ方法を用いてプライマーの組合せにより作製した。
【００６７】
Ｎ１−１ ＦＡＯＤ変異体の発現ベクターをもつ大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地１５０ｍｌにおいて３７℃で培養した。Ａ６６０値が０．６に達した後、０．３ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、２５℃でさらに５時間インキュベートした。細胞を遠心分離により回収し、０．８５％ ＮａＣｌ水溶液で二回洗浄した。その後、細胞を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ）ｐＨ７．０に再懸濁し、超音波ホモジナイザーにより溶菌した。ライセートを１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を５０，０００ｒｐｍ、４℃で６０分間遠心分離し、その後上清を１０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）に対して透析した。オキシダーゼ活性は、２５℃、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０中で、基質（０．２、０．５、０．７５、１、２、５ｍＭ ｆ−αＶａｌまたは５ｍＭ ｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓ）の存在下で、１．５ｍＭ ＴＯＤＢ、２Ｕ／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および１．５ｍＭ ４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）でアッセイした。キノンイミン色素の生成を分光光度計により５４６ｎｍで測定した。デヒドロゲナーゼ活性は、２５℃、１０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）において、基質（０．２、０．５、１、２、５ｍＭ ｆ−αＶａｌまたは５ｍＭ ｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓ）の存在下で、０．６ｍＭ ＤＣＩＰおよび６ｍＭ メトキシＰＭＳ（ｍＰＭＳ）でアッセイした。
【００６８】
ほとんどのケースで、オキシダーゼ活性は完全にまたは実質的に消失したが、Ｎ４７Ａ、Ｓ４６Ａ、Ｋ４８ＡおよびＮ４４Ａなどのいくつかの変異体は、相対的に高い活性を示した。なかでもＮ４７Ａは、最も目立った特徴を示した。Ｎ４７Ａのオキシダーゼ活性は野生型の活性の約２０％に減少したが、Ｎ４７Ａのデヒドロゲナーゼ活性は野生型の活性の６０％よりも高いままであった。結果として、Ｎ４７Ａは、オキシダーゼ活性よりも約４倍高いデヒドロゲナーゼ活性を示した。Ｎ４７Ａのこの特徴は、人工電子アクセプターと共にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いるセンサーストリップに有益なはずである。野生型Ｎ１−１ ＦＡＯＤおよびＮ４７Ａ変異体の粗調製物の速度論的パラメーターを表２に示す。
【００６９】
【表２】
【００７０】
実施例２
Ｎ１−１野生型およびＮ４７Ａ変異体ＦＡＯＤの精製
【００７１】
組換えＦＡＯＤは、次のように精製した。最初に、酵素を含有する水溶性画分を組換え大腸菌（Escherichia coli.）から調製した。発現ベクターを含む大腸菌を７ＬのＬＢ培地（３７℃、１０Ｌ醗酵槽で、５０μｇ／ｍｌ アンピシリン）において培養し、その後発現をＩＰＴＧ（最終濃度：０．３ｍＭ）により約ＯＤ660＝０．７で誘導し、培養温度を３０℃まで下げた。細胞を１００ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）中に懸濁し、フレンチプレスを用いて４回破壊した。上清液を超遠心分離（４０，０００ｇ、９０分）に付し、上清を１０ｍＭのＰＰｂ（ｐＨ７．０）に対して４℃で一晩透析し水溶性画分を調製した。
【００７２】
この水溶性画分を、さらに液体クロマトグラフィーに付し、精製酵素を調製した。酵素をさらに陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−５ＰＷ）で精製した。水溶性画分を、１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＤＥＡＥ−５ＰＷ（５．０ｍｍI.D.×５ｃｍ、東ソー（Tosoh））に吸着させた。カラム体積の３倍量の１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）による平衡化の後、ＦＡＯＤを、０．７ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）で溶出した。流速は１ｍｌ／分に設定し、溶出液を１分毎に回収した。２８０ｎｍの吸収波長を溶出液のモニターに使用した。
【００７３】
活性画分を、３５％硫酸アンモニウムを用いて分離し、上清液を疎水性クロマトグラフィーに付した。活性画分を、３５％硫酸アンモニウムを含有する１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ６．５）で平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラム、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｈｅ（１ｍｌ、ファルマシア（Pharmacia））に吸着させた。カラム体積の３倍量の、３５％硫酸アンモニウムを含有する１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ６．５）による平衡化の後、ＦＡＯＤを、１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ６．５）で溶出した。流速は２ｍｌ／分に設定し、溶出液を１分毎に回収した。活性画分を、４５％硫酸アンモニウムで分離し、その後沈殿を、１％マンノースおよび１００μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液に対して４℃で６時間透析した。それをさらに、１００μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ８．０）に対して４℃で６時間透析した。透析した試料を次の陰イオン交換クロマトグラフィーに用いた。
【００７４】
その試料を、１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム、Ｂｉｏａｓｉｔ Ｑ（４．６ｍｍI.D.×５ｃｍ、東ソー）に吸着させた。カラム体積の３倍量の１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ８．０）による平衡化の後、ＦＡＯＤを、０．３ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）で溶出した。流速は１ｍｌ／分に設定し、溶出液を１分毎に回収した。活性画分を１０ｍＭ ＰＰｂ（ｐＨ７．０）に対して４℃で一晩透析した。試料の精製度をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより調べた。試料をＰｈａｓｔ Ｇｅｌ ８−２５を用いる電気泳動に付し、ゲルを銀で染色した。試料調製、電気泳動および染色は、Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）に添付のマニュアルにしたがって行なった。
【００７５】
精製した酵素のオキシダーゼおよびデヒドロゲナーゼ活性は、実施例１のように測定し、図３に示した。速度論的パラメーターは、表３に示す。
【００７６】
【表３】
【００７７】
実施例３
ＰｎＦＰＯＸ変異体の製造
【００７８】
ファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＰｎＦＰＯＸ、配列番号：１）由来の変異体を製造し、特徴付けした。
【００７９】
Ｎ１−１ ＦＡＯＤとＰｎＦＰＯＸとのアラインメント（図１）および実施例１および２の結果にもとづき、Ａｓｎ５６がＦＡＤからのプロトンおよび電子の移動に関与すると予測した。ＰｎＦＡＯＤの電子アクセプターのアベイラビリティーを改変することを目的にＡｓｎ５６に種々の変異が導入された。
【００８０】
変異は、実施例１のように部位特異的突然変異誘発法を用いて導入され、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、野生型または変異体ＰｎＦＰＯＸを含有する発現ベクターで形質転換した。培養した細胞を１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０に再懸濁し、超音波処理により溶菌した。ライセートを１０，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を５０，０００ｒｐｍ、４℃で６０分間遠心分離した。オキシダーゼおよびデヒドロゲナーゼ活性を実施例１のように測定した。
【００８１】
粗ＰｎＦＰＯＸ野生型およびＡｓｎ５６変異体の活性は、図４にまとめる。比較的高いオキシダーゼ活性（野生型の４１％）を示したＡｓｎ５６Ｓｅｒを除き、Ａｓｎ５６変異体のほとんどは、それらのオキシダーゼ活性を劇的に減少させた（＜野生型の２０％）。なかでも、いくつかの変異体（Ａｓｎ５６Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ）は、比較的高いデヒドロゲナーゼ活性を示し（＞野生型の６０％）、Ａｓｎ５６ＣｙｓおよびＡｓｎ５６Ｍｅｔでは野生型より高かった。Ａｓｎ５６変異体の速度論的パラメーターは、図５にまとめる。Ａｓｎ５６ＭｅｔおよびＡｓｎ５６Ｖａｌは、Ａｓｎ５６Ａｌａよりも高い、Ｖｍａｘデヒドロゲナーゼ（Ｂ）／Ｖｍａｘオキシダーゼ（Ａ）を示した。Ａｓｎ５６Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびＰｒｏは、オキシダーゼおよびデヒドロゲナーゼの両方の活性を失った。
【００８２】
実施例４
ＰｎＦＰＯＸＮ５６Ａ変異体の精製
【００８３】
ｐＥＰＮ（ｐＥＴ２８ａ−ＰｎＦＰＯＸ）−Ｎ５６Ａで形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）を、５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含有するＬＢ培地（２Ｌ）において３７℃で好気的に培養した。Ａ６６０ｎｍ値が０．６に達した後、細胞を０．３ｍＭ ＩＰＴＧにより誘発し、２５℃で５．５時間インキュベーションを続けた。細胞を遠心分離により回収し、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０に再懸濁し、フレンチプレス（１，０００ｋｇ／ｃｍ2）に３回かけて溶菌した。ライセートを１０，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を５０，０００ｒｐｍ、４℃で６０分間遠心分離した。その後上清を、２５μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ８．０に対して透析し、粗酵素溶液をさらに精製した。
【００８４】
硫酸アンモニウムを透析した上清に３５％飽和まで添加し、その後形成した沈殿を１５，０００ｇで２０分間遠心分離によりペレットとした。硫酸アンモニウムを６５％飽和まで添加した上清を、１５，０００ｇで２０分間遠心分離した。得られた沈殿を、２５μＭ ＦＡＤおよび１％マンノースを含有する１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ８．０に溶解し、同緩衝液に対して４℃で透析し、その後、２５μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ８．０に対して透析した。透析した酵素溶液を、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ８．０で平衡化した、ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ カラム（ＧＥ ヘルスケア（Healthcare））に適用した。活性な素通り（flow-through）画分を回収し、ＦＡＯＤ活性を示さない吸着されたタンパク質を、１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。活性な素通り画分を回収し、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０に対して透析した。透析した酵素溶液を、１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇ カラム（ＧＥ ヘルスケア）に適用した。ゲルろ過クロマトグラフィーを同緩衝液で行なった。活性画分を回収し、精製した酵素溶液を１００μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０に対して透析し、４℃で保管した。その精製酵素の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、濃度は、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（バイオ−ラッド（Bio-Rad）、ＣＡ、米国）を用いて測定した。結果を表４に示す。
【００８５】
【表４】
【００８６】
Ｎ５６Ａ変異体ＦＡＯＤのオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性を測定した。変異体ＦＡＯＤのＳＶ曲線および速度論的パラメーターは、図６および表５にそれぞれ示す。図６において、左のグラフは０〜５ｍＭの基質濃度における活性を示し、右のグラフは基質濃度０〜２ｍＭの拡大図である。Ｎ５６Ａ変異体は、両基質に対して有意に増加したデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【００８７】
【表５】
【００８８】
実施例５
アマドリアーゼII ＦＡＯＤ変異体の製造と特徴付
【００８９】
アマドリアーゼII（配列番号：３）由来の変異体を製造し特徴付けを行なった。Ｎ１−１ ＦＡＯＤとアマドリアーゼIIとのアラインメント（図１）および実施例１〜４の結果にもとづき、Ａｓｎ５２がＦＡＤからのプロトンおよび電子の移動に関与すると予測した。Ａｓｎ５２Ａｌａ変異を有する変異体を、実施例１に記載された方法にしたがって製造した。
【００９０】
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、アマドリアーゼII野生型またはＮ５２Ａ変異体を含有する発現ベクターで形質転換した。培養した細胞を回収し、１０ｍｌの１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ７．０に再懸濁し、フレンチプレス（１，０００ｋｇ／ｃｍ2）に２回かけて溶菌した。ライセートを１０，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を５０，０００ｒｐｍ、４℃で６０分間遠心分離した。その後、上清を２５μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ８．０に対して透析し、粗酵素溶液を製造した。粗酵素溶液を、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ カラム（ＧＥ ヘルスケア））、およびゲルろ過クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇ カラム（ＧＥ ヘルスケア））により精製した。
【００９１】
ＦＡＯＤ活性を、基質としてのｆ−αＶａｌと共に４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（オキシダーゼ活性）およびＰＭＳ／ＤＣＩＰ（デヒドロゲナーゼ活性）を用いてアッセイした。結果を図７に示す。
【００９２】
精製したアマドリアーゼII野生型およびＡｓｎ５２Ａｌａの速度論的パラメーターは図８にまとめる。変異体Ｎ５２Ａは、オキシダーゼ活性よりも約２倍高いデヒドロゲナーゼ活性を示した。
【００９３】
実施例６
バイオセンサーの構築
【００９４】
ＰｎＦＰＯＸ野生型またはＮ５６Ａ ＰｎＦＰＯＸいずれかの４０ｍＵ／５μｌ溶液を、２％ＡＷＰ溶液と混合した。混合物５μｌを再利用可能な金電極（表面積：７ｍｍ2）に適用し、３０℃で３０分間乾燥させた。電極を、ＵＶ−光で１分間照射し、固定化された野生型またはＮ５６Ａ ＦＰＯＸを有する電極を製造した。電極を、２ｍＭニトロソアニリン（ＮＡ；国際公開第２００４／１１３９００号のｐ．３３ｆｆ．より公知）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液２ｍｌに浸漬した。その後、＋２００ｍＶ対Ａｇ／ＡｇＣｌを適用し、電流をモニターした。定常状態電流が観測された場合、異なる濃度のＦＶを含む試料溶液を反応混合物に添加し、電流の増加をモニターした。酸素の非存在下での酵素活性を測定するために、Ａｒガスで反応チャンバー内を連続的に不活化した。
【００９５】
図９は、酸素存在下または非存在下（Ａｒガス下）における、ＦＶ濃度とＰｎＦＰＯＸ Ｎ５６Ａまたは野生型酵素を有する電極の電流増加との相関関係を示す。電気化学反応に対する酸素の影響が観察されるが、酸素の存在の影響は野生型を用いた場合よりも少なかった。これらの結果は、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性は、溶存酸素レベルによる影響を受けにくいということを示唆した。
【００９６】
実施例７
ＦＰＯＸ−Ｃ変異体の製造および特徴付
【００９７】
Ａｓｎ５２Ａｌａ変異を有するＦＰＯＸ−Ｃ（配列番号：７）由来の変異体を、実施例５と同様の方法で製造した。その粗酵素調製物を、さらに精製することなく、酵素活性アッセイに使用した。ＦＡＯＤ活性を、基質としての１ｍＭ ｆ−αＶａｌまたは１ｍＭ ｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓのいずれかと共に４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（Ｏｘ：オキシダーゼ活性）およびＰＭＳ／ＤＣＩＰ（ＤＨ：デヒドロゲナーゼ活性）を用いてアッセイした。結果を以下の表６に示す。
【００９８】
【表６】
【００９９】
変異体ＦＰＯＸ−Ｃ Ｎ５２Ａは、ｆ−αＶａｌおよびｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓの両方に対してオキシダーゼ活性よりも非常に高いデヒドロゲナーゼ活性を示した。
【０１００】
実施例８
ループ変異体の製造および特徴付
【０１０１】
ＰｎＦＰＯＸは、フルクトシルヘキサペプチドに対して、ＦＶＨと比較して１％未満のレベルでオキシダーゼ活性を示すが、ＦＰＯＸ−Ｃは活性を示さない。他方、ＦＰＯＸ−Ｃは、ＦＶＨに対してＰ．ｎ ＦＰＯＸよりもより高い活性を示す。両オキシダーゼのアミノ酸配列の比較から、ＦＡＯＤとＦＰＯＸとの間の有意な相違は、それらのループ領域に見られる。
【０１０２】
ループ１領域
ＰｎＦＰＯＸ （６１）Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａ（７２）（配列番号：１３）
ＦＰＯＸ−Ｃ （６１）Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ（７２）（配列番号：１４）
【０１０３】
ループ２領域
ＰｎＦＰＯＸ （１０９）Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ（１２４）（配列番号：１５）
ＦＰＯＸ−Ｃ （１０９）Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａ（１２６）（配列番号：１６）
【０１０４】
ループ１領域（１２ａａ）では、５つのアミノ酸残基がＰｎＦＰＯＸとＦＰＯＸ−Ｃとで異なる。ループ２領域（１６ａａ）では、２つのアミノ酸挿入と７つのアミノ酸置換が見られる。
【０１０５】
１ＰｎＦＰＯＸとＦＰＯＸ−Ｃとのループ領域が互に交換されているキメラループ変異体、ならびにそのＮ５６Ａ変異体を製造した。上記に示した部分アミノ酸配列にもとづき、８種類の変異体を製造した。
【０１０６】
Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ１ＥｘＣ（すなわち、ループ１領域がＦＰＯＸ−Ｃ由来のループ１領域に置換されているＰｎ ＦＰＯＸ）
Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ１ＥｘＣ／Ｎ５６Ａ（すなわち、ループ１領域がＦＰＯＸ−Ｃ由来のループ１領域に置換されているＰｎ ＦＰＯＸのＮ５６Ａ変異体）
Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣ（すなわち、ループ２領域がＦＰＯＸ−Ｃ由来のループ２領域に置換されているＰｎ ＦＰＯＸ）
Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣ／Ｎ５６Ａ（すなわち、ループ２領域がＦＰＯＸ−Ｃ由来のループ２領域に置換されているＰｎ ＦＰＯＸのＮ５６Ａ変異体）
ＦＰＯＸ−Ｃ／Ｌ１ＥｘＰｎ（すなわち、ループ１領域がＰｎ ＦＰＯＸ由来のループ１領域に置換されているＦＰＯＸ−Ｃ）
ＦＰＯＸ−Ｃ／Ｌ１ＥｘＰｎ／Ｎ５６Ａ（すなわち、ループ１領域がＰｎ ＦＰＯＸ由来のループ１領域に置換されているＦＰＯＸ−ＣのＮ５６Ａ変異体）
ＦＰＯＸ−Ｃ／Ｌ２ＥｘＰｎ（すなわち、ループ２領域がＰｎ ＦＰＯＸ由来のループ２領域に置換されているＦＰＯＸ−Ｃ）
ＦＰＯＸ−Ｃ／Ｌ２ＥｘＰｎ／Ｎ５６Ａ（すなわち、ループ２領域がＰｎ ＦＰＯＸ由来のループ２領域に置換されているＦＰＯＸ−ＣのＮ５６Ａ変異体）
【０１０７】
変異の導入および粗酵素の製造は、実施例１および５に記載されているように行なった。ＦＡＯＤ活性を、基質としての１ｍＭ ｆ−αＶａｌ、１ｍＭ ｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓまたは５ｍＭフルクトシルヘキサペプチド（Ｆ−ＨＰ）のいずれかと共に４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（Ｏｘ：オキシダーゼ活性）およびＰＭＳ／ＤＣＩＰ（ＤＨ：デヒドロゲナーゼ活性）を用いてアッセイした。
【０１０８】
Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ１ＥｘＣおよびＰｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣは、野生型Ｐ．ｎ．ＦＰＯＸと比較してｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓに対して高い酸化活性を示した。ＦＰＯＸ−Ｃ／Ｌ１ＥｘＰｎは、野生型ＦＰＯＸ−Ｃにおいては観察されないＦ−ＨＰへの活性を示した。興味深いことに、Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣは、Ｆ−ＨＰに対して活性を増加させたが、Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ１ＥｘＣは、Ｆ−ＨＰに対して活性をほとんど失った。これらの結果は、Ｆ−ＨＰに対するＰ．ｎ．ＦＰＯＸ活性の改善が、ループ領域の改変によりさらに改善できたことを示した。
【０１０９】
これらのループ変異体へのＮ５６Ａ変異の導入は、オキシダーゼ活性の減少とデヒドロゲナーゼ活性の増加をもたらした。Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ１ＥｘＣ／Ｎ５６ＡおよびＰｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣ／Ｎ５６Ａの両方が、ｆ−αＶａｌに対してそれらのオキシダーゼ活性と比較してより高いデヒドロゲナーゼ活性を示した。Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣ／Ｎ５６Ａのｆ−αＶａｌに対するデヒドロゲナーゼ活性は、Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｎ５６Ａと比較して際立った増加を示し、ＦＰＯＸ−Ｃ／Ｎ５６Ａのものよりもより高かった。
【０１１０】
Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ１ＥｘＣ／Ｎ５６ＡおよびＰｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣ／Ｎ５６Ａの両方が、ｆ−αＶａｌ−Ｈｉｓに対してそれらのオキシダーゼ活性と比較してより高いデヒドロゲナーゼ活性を示した。最も高いデヒドロゲナーゼ活性は、Ｐｎ ＦＰＯＸ／Ｌ２ＥｘＣ／Ｎ５６Ａにおいて観察され、これはＦＰＯＸ−Ｃ／Ｎ５６Ａのものとほとんど同じである。
【０１１１】
代表的な結果を以下の表７に示す。
【０１１２】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列の５６位に対応する位置でアミノ酸残基ＡｓｎをＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換することにより改変された変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項２】
野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して減少されたオキシダーゼ活性を有し、かつ野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して増加したデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項３】
野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの３０％以下のオキシダーゼ活性を有し、かつ野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの５０％以上のデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項４】
野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して増加したデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項５】
配列番号１〜１２からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、配列番号１記載のアミノ酸配列の５６位に対応する位置のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項６】
配列番号１記載のアミノ酸配列であり、５６位のアミノ酸残基Ａｎｓが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項７】
配列番号１の１０９〜１２４位でアミノ酸配列：Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕが、配列：Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａに置き換えられている請求項６記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項８】
配列番号２記載のアミノ酸配列であり、４７位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されている請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項９】
配列番号３記載のアミノ酸配列であり、５２位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されている請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項１０】
配列番号７記載のアミノ酸配列であり、５６位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されている請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項１１】
配列番号７の６１〜７２位でアミノ酸配列：Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒが、配列：Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａに置き換えられている請求項１０記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
試料中の糖化タンパク質をアッセイする方法であって、該試料を請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させること、および該フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより酸化された糖化タンパク質の量を測定することを含む方法。
【請求項１６】
試料中のＨｂＡ１ｃを消化してフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを生成すること、該フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させること、および酸化されたフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの量を測定することを含むＨｂＡ１ｃをアッセイする方法。
【請求項１７】
試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするための装置であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび電子移動メディエーターを含む装置。
【請求項１８】
試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするためのキットであって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび電子移動メディエーターを含むキット。
【請求項１９】
電極上に固定された請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを有する酵素電極。
【請求項２０】
フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするための酵素センサーであって、請求項１９記載の酵素電極を作用電極として含む酵素センサー。
【請求項２１】
配列番号１記載のアミノ酸配列であり、配列番号１の６１〜７２位のアミノ酸配列：Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａが、配列：Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項２２】
配列番号１記載のアミノ酸配列であり、配列番号１の１０９〜１２４位のアミノ酸配列：Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕが、配列：Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項２３】
配列番号７記載のアミノ酸配列であり、配列番号７の６１〜７２位のアミノ酸配列：Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒが、配列：Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項２４】
配列番号７記載のアミノ酸配列であり、配列番号１の１０９〜１２６位のアミノ酸配列：Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａが、配列：Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列の５６位に対応する位置でアミノ酸残基ＡｓｎをＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換することにより改変された変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項２】
野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して減少されたオキシダーゼ活性を有し、かつ野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して増加したデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項３】
野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの３０％以下のオキシダーゼ活性を有し、かつ野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの５０％以上のデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項４】
野生型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと比較して増加したデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項５】
配列番号１〜１２からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、配列番号１記載のアミノ酸配列の５６位に対応する位置のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項６】
配列番号１記載のアミノ酸配列であり、５６位のアミノ酸残基Ａｎｓが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列を有する請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項７】
配列番号１の１０９〜１２４位でアミノ酸配列：Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕが、配列：Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａに置き換えられている請求項６記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項８】
配列番号２記載のアミノ酸配列であり、４７位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されている請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項９】
配列番号３記載のアミノ酸配列であり、５２位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されている請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項１０】
配列番号７記載のアミノ酸配列であり、５６位のアミノ酸残基Ａｓｎが、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＳｅｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基で置換されている請求項１記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項１１】
配列番号７の６１〜７２位でアミノ酸配列：Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒが、配列：Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａに置き換えられている請求項１０記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
試料中の糖化タンパク質をアッセイする方法であって、該試料を請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させること、および該フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより酸化された糖化タンパク質の量を測定することを含む方法。
【請求項１６】
試料中のＨｂＡ１ｃを消化してフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを生成すること、該フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと接触させること、および酸化されたフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの量を測定することを含むＨｂＡ１ｃをアッセイする方法。
【請求項１７】
試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするための装置であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび電子移動メディエーターを含む装置。
【請求項１８】
試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするためのキットであって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび電子移動メディエーターを含むキット。
【請求項１９】
電極上に固定された請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを有する酵素電極。
【請求項２０】
フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、ＨｂＡ１ｃまたはフルクトシルヘキサペプチドをアッセイするための酵素センサーであって、請求項１９記載の酵素電極を作用電極として含む酵素センサー。
【請求項２１】
配列番号１記載のアミノ酸配列であり、配列番号１の６１〜７２位のアミノ酸配列：Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａが、配列：Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項２２】
配列番号１記載のアミノ酸配列であり、配列番号１の１０９〜１２４位のアミノ酸配列：Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕが、配列：Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項２３】
配列番号７記載のアミノ酸配列であり、配列番号７の６１〜７２位のアミノ酸配列：Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒが、配列：Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項２４】
配列番号７記載のアミノ酸配列であり、配列番号１の１０９〜１２６位のアミノ酸配列：Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａが、配列：Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕで置き換えられているアミノ酸配列を有する変異体フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５００７２９（Ｐ２０１３−５００７２９Ａ）
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２３２３６（Ｐ２０１２−５２３２３６）
【出願日】平成２２年８月２日（２０１０．８．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００４７０８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１５３２６
【国際公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５０１２０５１０８）エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト (285)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２日（２０１０．８．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００４７０８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１５３２６
【国際公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５０１２０５１０８）エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト (285)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【Ｆターム（参考）】
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