フローサイトメトリーと多重ＨＰＶ遺伝子型同定を併用する統合試験法
臨床的に得られた子宮頚部上皮細胞集団から、タンパク質バイオマーカー表現型と特定のＨＰＶ遺伝子型データを共に収集することが可能な、２つの部分からなる試験法が開示されている。形質転換関連多重タンパク質バイオマーカーの存在は、細胞ソーティングのゲーティング基準として作用し、その後、ソーティングで捕捉された細胞から個々のＨＰＶ型を検出し同定するのに十分な感度を有するＰＣＲプロトコールが適用される。ワークフローは、常法によりＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｃｙｔｙｃ）に固定された細胞を扱うように最適化されており、パップテストが行われた後に保存された試料に残っている残留細胞に対して実施することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国政府の権利
本開示の試験法および方法は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）と結んだ契約第Ｒ２１ ＣＡ１２５３７０号に基づき、政府の支援によってなされたものである。米国政府は本出願に対して一定の権利を有し得る。
【０００２】
臨床由来の子宮頚部上皮細胞の集団から、タンパク質バイオマーカー表現型およびＨＰＶ遺伝子型の双方のデータを収集することができる、２つの部分からなる分析法を開示する。
【背景技術】
【０００３】
子宮頚癌は、最も一般的な形態の悪性腫瘍として、全世界の女性の発生率および死亡率の両方で乳癌に次いで第２位である。スクリーニングのための子宮頚部細胞診（パップスメアテスト、または「パップテスト」）を全人口レベルで行うことにより、米国および他の先進工業国においては、子宮頚癌の罹患率および死亡率が劇的に低下してきている。パップテストの成功にもかかわらず、子宮頚部病変の細胞診は、細胞診で悪性度の低い異常を有する患者において、臨床的悪性度の非常に高い病変に対する特異性が低いという厄介な問題に悩まされている。その結果、毎年４００万人を超える女性が、悪性度の高い異形成または癌である可能性を除外するために、さらなる評価を必要とする細胞診を受けている。殆どの場合、さらなる評価を行っても、軽度細胞診異常患者に潜在する高度病変は確認されない。高リスク型ヒトパピローマウイルスの簡単な検出は、患者の分類には重要な役割を果たし得るが、検出それ自体は、いくつかの細胞診にとって有用ではなかった。具体的に言えば、高リスクＨＰＶの単なる検出では、最初の感染と発病の間に長い時間のずれ（１０年以下）があるために、潜在している高悪性度の病変を予測できない。さらに、予後は高リスクＨＰＶの型によっても異なり得ることが、いくつかの研究で示されているが、現在の商業的に利用できる高リスクＨＰＶ用試験では、個々のＨＰＶの型は特定されない。
【０００４】
子宮頸管粘膜の前癌病変の細胞診は、パパニコロウ標本の細胞学的検査（パップスメアテスト）によって検出される子宮頸管粘膜の前癌病変を含む。細胞学的所見は、ベセスダシステムにより、正常／良性の反応性変化（正常／ＢＲＣ）、扁平上皮細胞異常および腺細胞異常として分類される。扁平上皮細胞異常は、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）への感染および／または軽度の異形成の証拠を含む軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、ならびに中等度の異形成（ＣＩＮ２）および高度の異形成／上皮内癌（ＣＩＮ３）を含む高度上皮内病変（ＨＳＩＬ）を含む。改訂ベセスダ２００１システムでは、ＡＳＣＵＳの一般カテゴリーが２つの新しい診断カテゴリー：「異型扁平上皮細胞−意義不明」（ＡＳＣ−ＵＳ）および「異型扁平上皮細胞−ＨＳＩＬを除外できない」（ＡＳＣ−Ｈ）に置き換えられた。以前は反応プロセスを示唆するＡＳＣＵＳに分類されたであろう症例は、新分類システムでは良性細胞変化のカテゴリーに含まれる。ＬＳＩＬとＨＳＩＬの分類は、以前のベセスダ分類システムと相対的には不変のままであるが、浸潤癌が疑われる特徴を有する症例を報告するために、ＨＳＩＬのサブカテゴリーが追加された。子宮頸管内腺性粘膜の潜在的な前癌病変もまた、子宮頚癌細胞診の標本で認識することができる。改訂２００１ベセスダシステムの細胞学的分類では、腺癌より軽度の腺細胞異常は、異型腺細胞（ＡＧＣ）、特定不能な子宮頸管内、子宮内膜または「腺細胞」（ＡＧＣ ＮＯＳ）；異型腺細胞、腫瘍性を示唆する子宮頸管内細胞または「腺細胞」（ＡＧＣ「腫瘍性示唆」）、および子宮頸管上皮内腺癌（ＡＩＳ）に分類される。
【０００５】
パパニコロウテストは癌の有効なスクリーニング手段である。しかしながら、その成功にもかかわらず、診断細胞病理学の実施は、軽度の細胞学的異常を示す症例において、臨床的に重大な潜在病変に対する特異性の低さから限られている。米国では、毎年、４００万を超える症例がＡＳＣ−ＵＳ、ＡＳＣ−Ｈ、ＬＳＩＬまたはＡＧＣと診断され、子宮頚部生検で発見される臨床的に重大な高度病変を有する部分集団患者群を同定するために、さらなる評価を必要としている（表１）。しかしながら、殆どの症例で、さらなる評価が軽度細胞学的異常を示した患者の高度扁平上皮病変または腺病変を同定することはない。細胞診でＡＳＣ（特定不能）と診断された患者は、子宮頚部生検により５〜１７％の潜在的ＣＩＮ２／３を有し、ＡＳＣ−Ｈとの診断は、コルポ診生検でＣＩＮ２／３である可能性が２４〜９４％であることが示されている。コルポ診検査を勧められたＬＳＩＬの症例では、高度子宮頸管異形成（ＣＩＮ２または３）が２５％に見られ、ＣＩＮ１が４５％に見られたが、２５％を超えるＬＳＩＬ症例で異型性は見られなかった。ＡＧＣの細胞診も、子宮頸管粘膜の臨床的に重大な潜在的病変の存在については明白に示さない。ＡＧＣと診断された症例では、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３またはＡＩＳのリスクが９〜４１％であることがわかっているが、ＡＧＣ症例の大半は、扁平上皮粘膜または腺性粘膜のいずれかの臨床的に重大な病変について生検による確認がなされていない。
【０００６】
【表１】
【０００７】
パップテストの成績に関する上の統計が、女性１００，０００人当たりの死亡率が世界の先進工業地域の３〜７倍である開発途上国で実施されていないという問題に対処するものでないことは言うまでもない。現在の実施に伴う他の問題点は、臨床医が大量の標本を素早く読むようにプレッシャーをかけられていることである。細胞検査技師はスライド１枚当たり約４〜５分の速さで、すなわち、８時間に１００枚のスライドをスクリーニングすることができる。言い換えれば、細胞検査技師は、４ないし５分間で、１枚のスライド上の５０，０００〜３００，０００個の細胞を可視化し、陽性標本中の僅かに１０〜５０個の異型細胞を同定する必要がある。スクリーニングした全標本中の約９０％が陰性である。したがって、スクリーニングする人の時間とエネルギーの大部分は健康な細胞を見ることに費やされる。疲れと単調さによりスクリーニング者の鋭敏さが損なわれ、その結果、数少ない陽性細胞は見落とされ易くなる。
【０００８】
分子レベルでの子宮頚癌の検出は、ＨＰＶの発癌遺伝子Ｅ６およびＥ７の検出と、ｐ１６ＩＮＫ４ａ過剰発現の検出を含む。すなわち、ヒトパピローマウイルスは、子宮頚癌の発症リスクによって約２００の型に分類されている。１６型および１８型のＨＰＶは、最も流行性の高い「高リスク」型であり、子宮頚癌の７０％を占め、残りの症例は殆ど全てが、あまり一般的でない他の高リスク型ＨＰＶに陽性である。ＨＰＶゲノムは２つの主要な発癌遺伝子Ｅ６およびＥ７を含む。Ｅ６タンパク質はｐ５３に結合し、ユビキチン介在プロセスによりその分解を誘導する。Ｅ７タンパク質はＲｂおよび関連タンパク質に結合し、これらを不安定化する。これらの作用が一緒になって、分化角化細胞中で細胞周期進行およびウイルスＤＮＡ複製が促進される。前癌子宮頸管病変および子宮頚癌では、ヒトパピローマウイルスＤＮＡが宿主ゲノムへ組込まれることによって、ウイルスのＥ２オープンリーディングフレームが破壊され、ＨＰＶ発癌遺伝子Ｅ６およびＥ７の無秩序な過剰発現が生じ得る。
【０００９】
Ｒｂ遺伝子機能を喪失した癌では、ｐ１６ＩＮＫ４ａが過剰に発現し、数種類の癌でｐＲｂとｐ１６ＩＮＫ４ａの間に逆相関性があることが確立されている。大部分の正常な細胞では、ｐ１６ＩＮＫ４ａの発現はｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでは低いことが知られている。ＨＰＶ感染期間中、ＨＰＶのＥ７タンパク質の発現は、Ｒｂに結合し、ユビキチン−プロテアソーム経路で分解されるようにすることにより、Ｒｂを不活性化する。したがって、ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現は、確立された子宮頚癌細胞系統と、１６型および１８型ＨＰＶにより不死化されたヒトの子宮膣部細胞の両方に観測される。さらに、ＨＰＶ感染によるｐ１６ＩＮＫ４ａのアップレギュレーションは、高リスク型ＨＰＶと低リスク型ＨＰＶで異なることが示されており、最も強力なアップレギュレーションは、低リスクＨＰＶ６より高リスク型ＨＰＶ１６に見られる。
【００１０】
ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質は、次に示すように、免疫組織化学的および免疫細胞化学的マーカーとして子宮頚癌を検出するために使用されている。いくつかの研究は、高度子宮頸部異形成および浸潤癌のほぼ１００％でｐ１６ＩＮＫ４ａレベルが非常に高く、一方、同じ抗体を使用した正常な子宮頚部上皮ではｐ１６ＩＮＫ４ａ−陽性染色が全く見られなかったことを示している。さらに、ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現とＲｂの発現の低下は、子宮頚部異形成の発生と相関している。最近の研究では、ｍｃｍ５もまた子宮頚部上皮内腫瘍および癌の存在のマーカーであり得るが、軽度異形成病変やある正常な増殖性扁平細胞でも発現し得ることが示されている。子宮頚部の病理学的状態の重篤度を追跡する定量的な方法で二重陽性細胞を検出するために、免疫学的染色法およびフローサイトメトリーを使用して、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｍｃｍ５を併用し得ることが実証されている。
【００１１】
分子レベルでの子宮頚癌の検出（他のタンパク質バイオマーカー）が、フローサイトメトリーによる癌細胞タンパク質バイオマーカーの検出と定量化を含むいくつかの研究で、実証されている。フローサイトメトリーで一般に検出される癌バイオマーカーは、ｋｉ６７、ＰＣＮＡ、サイクリン−Ｄ１およびサイクリン−Ｂ１、ならびにｐ１６ＩＮＫ４ａを含む。これらの癌バイオマーカーの殆どは、主に、肺、結腸および乳癌組織で検出された。しかしながら、最近の結果は、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｍｃｍ５およびサイクリンＤ１の発現の増加が、子宮頚癌の検体でも検出されることを示している。この方法論は現在ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｍｃｍ５、およびＰＣＮＡで開発中であるが、検出手順は、形質転換した子宮頸部上皮細胞内での発現が実証されているバイオマーカーであればいかなるものに対しても、理論的に互換性がある。
【００１２】
子宮頚癌におけるヒトパピローマウイルスの役割が解き明かされるにつれて、ウイルスの他の遺伝子系統への分岐が、宿主細胞の形質転換、ひいては病気の進行の程度の変化をもたらしていることが明らかになってきた。ＨＰＶの５種類の遺伝子型：１６、１８、３１、３３および４５が、最も流行性の強い高リスクの形態であることが認識されている。これらの中で、１６型は全子宮頚癌の約半数に現れるが、ＨＰＶ１８は子宮頚癌の約２０％を占めるに過ぎないにもかかわらず、一貫して最悪の予後をもたらすようであることは広く認識されている。癌の実際の症例に加えて他の子宮頚部の病変（ＡＳＣＵＳ、ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬ）を考慮すると、１６型および１８型のＨＰＶの頻度は、両者が有する高い相対的リスクを反映する形で、病変のクラスにより明らかに変化することが、病気の重篤度のＨＰＶ型に対する依存性を検出する代替の方法によって示されている。したがって、患者のＨＰＶ遺伝子型データと病理学的重篤度のデータの組み合わせは、ＨＰＶ型が、細胞異常が始まった症例の予後に対する有用な情報であることを示している。これまでの問題は、高リスクＨＰＶの感染と癌の発病までの約１０年間の潜伏期間が、それ自身のＨＰＶ型データが予後の観点で解釈されるのを妨げていることである。
【００１３】
Ｄｉｇｅｎｅ ＨＰＶ ＨＣ２テスト（Ｑｉａｇｅｎ）は、１３の高リスク型ＨＰＶに対するＲＮＡプローブの混合物を使用するが、陽性の試験結果は、最終的にはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに対するジェネリックな抗体によって検出され、いかなるＨＰＶ型が存在するかは示さない。さらに、ＨＣ２テストは、検体の妥当性に対する内部標準を欠くことによって制限されている。研究の場では様々なＰＣＲストラテジーが採用されてきたが、これらには、通常、増幅物を縮重プライマーと結合させ、その後、特定の多重ＰＣＲプライマーと第２の反応を行わせるネストＰＣＲ反応が含まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ＨＰＶ遺伝子型を予後とより関連するツールとするための、ＨＰＶ型データと、形質転換に関連したタンパク質バイオマーカーの検出との組み合わせを開示する。特に、細胞ソーティングによって標的細胞を単離した後、１回の増幅反応を必要とするだけの、非常に高い感度と特異性を組み合わせた試験法を開示する。
【００１５】
一実施形態では、フローサイトメトリーと多重ＨＰＶ遺伝子型同定法を組み合わせた、２つの部分からなる統合試験法が開示される。タンパク質バイオマーカー表現型と特定のＨＰＶ遺伝子型が、１つの臨床試料の同じ細胞集団について評価される。この目的は、子宮頚部初期病変の検出とキャラクタリゼーションの全体的な精度と特異性を改善することにある。本試験法は、従来のＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｃｙｔｙｃ）で固定した試料にも適合し、したがって、初めに、正常子宮頚部の洗浄物の１部として収集された残留細胞に適用することができる。高速の細胞ソーティングは、形質転換を集団的に示すことが報告されている多重タンパク質バイオマーカーの過剰発現に陽性の細胞を回収する。回収されると、これらの同じ細胞は、縮重ＨＰＶプライマーによる予備増幅を必要とせずに、多重反応で動作するように注意深く設計された一組のＰＣＲプライマーを使用して、高リスクＨＰＶ遺伝子型が調べられる。最後に、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）キャピラリー電気泳動プラットフォームを使用して、増幅フラグメントのサイズを自動的に検出することにより、個々のＨＰＶ型を検出することができる。
【００１６】
また、以下のオリゴヌクレオチド配列およびそれらの逆相補配列を開示するが、配列は慣例により５’から３’結合の方向に記載されている。
配列１ ＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列２ ＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列３ ＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列４ ＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列５ ＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列６ ＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列７ ＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列８ ＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列９ ＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列１０ ＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列１１ ＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列１２ ＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列１３ ＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列１４ ＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列１５ ＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列１６ ＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
配列１７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列１８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列１９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列２０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列２１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列２２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列２３ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列２４ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列２５ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列２６ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列２７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列２８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列２９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列３０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列３１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列３２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
【００１７】
他の一実施形態では、常法により固定し、免疫学的に染色した子宮頚部細胞集団を細胞ソーティングすることにより、１種以上のタンパク質バイオマーカーが過剰発現している細胞を捕捉し、その後、ヒトパピローマウイルスの含有量を直接調べるシーケンシャルな方法が開示される。この方法は、分類上は階層的方法であり、特定の遺伝子型が、タンパク質バイオマーカー表現型について既にキャラクタライズされている細胞の亜集団に起因するものであることがわかる。この方法で、子宮頚部の病気の複合リスク因子を個々に示す細胞が検出される。このことは、タンパク質バイオマーカーが示す病気の状態の兆候と特定の高リスクＨＰＶ型の存在を共に含む細胞系統の存在を明確に示している。特定の理論に縛られずに言うならば、細胞ソーティングは、特に、１）子宮頚部細胞集団におけるバイオマーカーの過剰発現の発生を比例的に定量化する希少事象検出法として、また２）異常細胞のみをＨＰＶ試験に流す予備選別ワークフローとしての働きをする。開示した方法では、フローサイトメトリーによる細胞ソーティングのゲーティング基準は、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｍｃｍ５、ＰＣＮＡおよび子宮頚部上皮細胞の形質転換に関係する他の任意のタンパク質バイオマーカー（これらに限定されない）を含むセット中の、任意の２種のタンパク質の過剰発現を示す細胞を単離するように設定することができる。
【００１８】
一実施形態では、細胞ソーティングで捕捉された細胞から直接、多重ＰＣＲ増幅を１回実施することにより、個々の高リスクＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、４５および／または５２を特異的検出し同定するために、配列１７〜３２の中の任意または全ての配列が使用される。さらに、本請求項では、その後、自動キャピラリー電気泳動法で標的アンプリコンを分離することにより、個々のＨＰＶ型が同定される。
【００１９】
一実施形態では、細胞ソーティングで捕捉された細胞から多重ＰＣＲ増幅を１回実施することにより、個々の高リスクＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、４５および／または５２を特異的に検出し同定するために、蛍光色素を末端に標識した配列１〜１６の中の任意または全ての配列が使用される。本請求項では、その後、自動キャピラリー電気泳動法で標的アンプリコンを分離することにより、個々のＨＰＶ型が同定される。あるいは、本請求項では、個々のＨＰＶ型は、サイズが十分に異なる標的アンプリコンによって表されるので、検出は標準のアガロースゲル電気泳動法で行うことができる。
【００２０】
一実施形態では、ＨＰＶの検出および同定の感度と特異性は、通常、ｑＰＣＲで使用する基準に従って最適化されたサーモサイクリングプログラムを使用することにより促進されるが、その場合、≧３５サイクルでは、非常に短いインキュベーション時間内に、変性およびアニーリング／伸長をそれぞれ行う２サイクルの工程があるのみである。
【００２１】
上記の方法により決定された、タンパク質バイオマーカー表現型対ＨＰＶ型の行列に基づいて、臨床予後の計画を構築する方法が開示される。この場合、タンパク質バイオマーカー表現型には、具体的には、検出された特定のタンパク質バイオマーカーと、細胞集団におけるそれらの割合（細胞ソーティングプロセスで自動カウントされた陽性ソーティングイベント対陰性ソーティングイベントから決定される）が共に含まれる。上記試験法から得られた個々の臨床検体の複合化されたタンパク質およびＨＰＶ型の同定と、病歴からの病理学データが一つに集められ、細かく分類された、試験結果対予想される病気の転帰を示す連想行列が作られる。
【００２２】
他の利点および特徴は、添付の図面とともに以下の詳細な説明を読めば明らかになるであろう。
【００２３】
開示の方法および装置をより完全に理解するには、添付の図面でより詳細に説明されている実施形態を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、開示の試験法の細胞ソーティング工程を示すフロー図である。
【図２−１】図２は、開示の試験法のＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動工程を示すフロー図である。
【図２−２】図２は、開示の試験法のＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動工程を示すフロー図である。
【図２−３】図２は、開示の試験法のＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動工程を示すフロー図である。
【図２−４】図２は、開示の試験法のＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動工程を示すフロー図である。
【図３】図３は、ヒトタンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＭＣＭ５に対する抗体を用いる免疫蛍光染色法のシグナル強度によってキャラクタライズされた臨床的に正常な子宮頚部細胞を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒトタンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＭＣＭ５に対する抗体を用いる免疫蛍光染色法のシグナル強度によってキャラクタライズされた軽度扁平上皮内病変細胞を示すグラフである。
【図５】図５は、ヒトタンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＭＣＭ５に対する抗体を用いる免疫蛍光染色法のシグナル強度によってキャラクタライズされた高度扁平上皮内病変細胞を示すグラフである。
【図６】図６は、ヒトタンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＭＣＭ５に対する抗体を用いる免疫蛍光染色法のシグナル強度によってキャラクタライズされたＨｅＬａ細胞を示すグラフである。
【図７】図７は、図３〜６に示した試料について、試料のクラスによるシグナルの種類の割合を示すグラフである。
【図８】図８は、予備分取した細胞からＨＰＶを検出する開示の方法が、高い感度および特異性を有することを示す試験結果である。
【図９−１】図９は、蛍光標識プライマーを用いた多重ＰＣＲからの蛍光標識ＨＰＶアンプリコンの検出を、自動キャピラリー電気泳動プラットフォームを使用して行うという概念の実証を示す試験結果である。
【図９−２】図９は、蛍光標識プライマーを用いた多重ＰＣＲからの蛍光標識ＨＰＶアンプリコンの検出を、自動キャピラリー電気泳動プラットフォームを使用して行うという概念の実証を示す試験結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
図面は必ずしも尺度通りではなく、また、開示した実施形態が、図面で、しかも部分図で説明されていることがあることは理解すべきである。ある場合には、開示した方法および装置を理解するために必ずしも必要ではない詳細、あるいは他の詳細の理解を困難にするような詳細は省略されていることもある。言うまでもなく、本開示が本明細書で説明している特定の実施形態に限定されないことは理解すべきである。
【００２６】
臨床的に得られた子宮頚部上皮細胞集団から、タンパク質バイオマーカー表現型と特定のＨＰＶ遺伝子型データを共に収集することが可能な、２つの部分からなる試験法を開示する。データは階層的に収集される。形質転換関連多重タンパク質バイオマーカーの存在は、細胞ソーティングのゲーティング基準として作用し、その後、ソーティングで捕捉された細胞から個々のＨＰＶ型を検出し同定するのに十分な感度を有するＰＣＲプロトコールが適用される。ワークフローは、常法によりＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｃｙｔｙｃ）に固定された細胞を扱うように最適化されており、パップテストが行われた後に保存された試料に残っている残留細胞に対して実施することができる。
【００２７】
タンパク質バイオマーカーのデータは、陽性ソーティングイベント対陰性ソーティングイベントをカウントすることにより、細胞集団において比例的に定量化する。したがって、臨床検体のバイオマーカーデータは、全体の染色強度を表す単一の値ではなく、細胞集団の割合を反映する１つの値であり、そこでは、個々の細胞が２種以上のバイオマーカーのそれぞれの閾値強度を超えている。陽性ソーティングイベントに対するゲーティング基準は、使用するタンパク質バイオマーカーに対する所望のシグナル強度の組み合わせとして設定することができる。バイオマーカーは、蛍光標識抗体を使用して固定細胞を免疫染色する従来の方法により検出され、それには、子宮頚部上皮細胞の形質転換に関連することが報告されている、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｍｃｍ５などのタンパク質や、他の悪性腫瘍の進行に関連する、ＰＣＮＡ、ｃａＰＣＮＡ、ｍｃｍ２などの他のタンパク質（これらに限定されない）が含まれる。ゲーティング基準を満たした細胞は、０．２ｍｌのＰＣＲウェル（個別のチューブか、または９６ウェルＰＣＲプレートのいずれか）に直接分取される。
【００２８】
ＨＰＶの検出および同定は、さらなる試料を調製せず、分取した細胞を直接テンプレートとして用い、さらなる試料は調製しない多重ＰＣＲ法により行う。この反応では、３つの一般的基準に従って注意深く設計されたプライマー対を使用する。
【００２９】
プライマー対は、ＨＰＶ型の分離株の中で多型であることが知られている位置によって、アニーリングサイトがカバーされないように設計した。各ＨＰＶ型に対して、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された、Ｅ６および／またはＥ７遺伝子の配列を含む全ての利用可能な分離株を使用して、それら２つの遺伝子のそれぞれに対して個別の配列アライメントを作成した。仮想的にアミノ酸配列へ変換した後、オープンリーディングフレームのアライメントを行うために、ＣｌｕｓｔａｌＸなどの配列アライメントツールを使用して、アライメントを行った。ギャップを、アミノ酸の位置の相同のアライメントを最大限保持するように、ギャップを手動で挿入し、その後、ＤＮＡ版のアライメントされた配列にギャップを挿入した。連続するＥ６−Ｅ７クエリ配列が、プライマー設計用ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＳＭ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などのプライマー設計ツールに提示されたなら、ＨＰＶ型内で多型性を示す配列位置を、「除外領域」として記載し、標識を付した。最適な速度論的特性を有する潜在プライマーサイトの数が限られるときは、プライマーは、５’側半分のプライマー配列でのみ１つの多型サイトをカバーすることが許容した。これにより、３’末端の安定性は維持され、また全体の感度への影響も無視し得るであろう。表４Ａおよび４Ｂに、遺伝子Ｅ６およびＥ７の型内配列（ｗｉｔｈｉｎ−ｔｙｐｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）アライメントを作成するために使用した全ＨＰＶ配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を示す。最後に、単一のＨＰＶ型については、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＳＭに提示するクエリ配列を、Ｅ６の５’末端からＥ７の３’末端までのウイルスゲノムをカバーする連続したフラグメントから構成した。各ＨＰＶ型では、このフラグメントを、その型に対して提示された参照用全ゲノム配列から採取した。ＨＰＶ５２では、多型性を検出するための分離株を利用できないので、Ｅ７は設計クエリから除外した。それぞれの型で使用した全ゲノム参照配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を、表４Ａおよび４Ｂの各列にトップアクセッション番号として示す。ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＳＭは、各クエリについて５０の潜在的プライマー対を返すように指示されているため、最終的な多重プライマーは、ＨＰＶ型それぞれのアニーリングサイトで配列分岐を最大化するプライマー対を選び取ることによって構築することができた。
【００３０】
プライマーは全て、速度論的特性が可能な限り類似するように設計した。Ｔｍ値を、摂氏４度の範囲内に制限し、対応対の２つのプライマーの間では２度以下の差を許容した。プライマー長は２２〜２５ヌクレオチドの範囲であり、全１６中の１３が２４ヌクレオチドの長さである。（配列１７〜３２は、単に配列１〜１６に１８ｍｅｒおよび１９ｍｅｒのユニバーサルプライミング配列を付加したものである−下記の本発明の好ましい検出に関する実施形態を参照）。ＧＣ％は４８％〜５４％の範囲である。３’末端安定性のスコアは、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＳＭで使用のアルゴリズムでは、約３〜７である。配列１〜１６が使用される場合、全ての標的アンプリコンは３００ｂｐ未満である。配列１７〜３２では、全ての標的アンプリコンは３５０ｂｐ未満である。Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＦＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの高性能組換ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせた場合、ｑＰＣＲで使用するプログラムを模倣する厳密なサーモサイクリングパラメータを使用することができる。この第２の設計の見地は、感度と特異性を同時に高め、多重化した状況において、個々のＨＰＶ型を検出し同定するシングルＰＣＲを成功裡に使用することに寄与する。
【００３１】
最後に、１６、１８、３１、３３、４５および５２型ＨＰＶについて、連続するＥ６およびＥ７オープンリーディングフレームの多重配列アライメントを構築した。配列を、再び、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託された参照用全ゲノム配列からＨＰＶ型毎に採取した。アライメントを、最初、ＧｅｎｅＤｏｃ２．６．００２でリーディングフレームを翻訳し、その後、アミノ酸配列のアライメントをＣｌｕｓｔａｌＸで作成することにより行った。このようにして、全てのギャップがフレームに導入され、進化的に相同な位置はよりアライメントされ易い。その後、ギャップ挿入とＧｅｎｅＤｏｃのスライド機能により、アミノ酸アライメントに合うように、ヌクレオチド配列を手動でアライメントした。各ＨＰＶ型に対するプライマー対を、６つのアライメントされた全配列の間でアニーリングサイトとの相同領域とを比較することにより選択した。他のＨＰＶ型から最も分岐したアニーリングサイトをカバーするプライマー対は、各プライマーの３’末端近辺の配列分岐に特別な注意を払って選択した。同時に、全ＨＰＶ型に対する標的アンプリコンが互いに少なくとも７ｂｐだけ異なるように、プライマー対を選択した。表２に配列１〜１６を、それらの実際のプライマー名および主要な特性と共に示す。表３に、配列１７〜３２を単にそれらのプライマー名および標的アンプリコン長とともに示す。
【００３２】
多重ＰＣＲからのアンプリコンの最終的な検出は、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）などの自動パラレルキャピラリー電気泳動プラットフォームを使用して行う。ＰＣＲマスターミックスは、ユニバーサルプライマーとして働く２種の蛍光染料標識オリゴヌクレオチドを含有する。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、それぞれ、配列１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１の５’末端に共通の１８ヌクレオチド配列と、配列１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２の５’末端に共通の１９ヌクレオチド配列に対して相補的である。ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｓｔａｒｔ ＫｉｔのＰＣＲマスターミックスと共に配列１７〜３２を使用すると、最初の約３サイクルはＨＰＶ型に特異的なプライマーが標的の増幅を支配し、その後、色素標識ユニバーサルプライマーによるプライミング支配へと移行する速度論的交代が可能になる。その後、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＤＮＡＳｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｋｉｔ−４００を使用する標準のフラグメント分析により、検出と分析が行われる。
【００３３】
末端に直接蛍光色素を標識した配列１〜１６を使用して多重ＰＣＲを行い、その後、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）などの自動パラレルキャピラリー電気泳動プラットフォームにより、アンプリコンの検出を行ってもよい。この代替法は、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｓｔａｒｔ ＫｉｔのＰＣＲマスターミックスに含まれるユニバーサルプライマーの使用を必要としない。あるいは、アンプリコンは、アガロースゲル電気泳動を用いる標準フラグメントサイズ分析により検出してもよい。ゲル溶解性は、５０％Ｓｙｎｅｒｇｅｌ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、従来の分子生物学グレードのアガロースを組み合わせることにより促進される。Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＦＸ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用に対して、試験性能は下記のサーモサイクリングプロトコールに従って最適化される：
工程１ ９５℃で２分間の初期変性／細胞溶解
工程２ ９５℃で１５秒間
工程３ ６２℃で５秒間
工程４ ７２℃で５秒間
工程５ 工程２へ、３９×
工程６ ４℃に保持
【００３４】
【表２】
【００３５】
開始＝各ＨＰＶ型に対するプライマー設計の標的として使用した参照配列内の５’開始位置。逆方向プライマーは、参照配列内のアニーリングサイトが逆の相補体であり、したがって、開始位置は参照配列に対してアニーリングサイトの３’末端となる。ＥＳ＝末端安定性。ＰＰ＝ペアペナルティ。ＰＳ＝生成物サイズ。ＥＳおよびＰＰはＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＳＭ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により報告されている値である。
【００３６】
【表３】
【００３７】
開始＝表２のように、各ＨＰＶ型に対するプライマー設計の標的として使用した参照配列内の５’開始位置。ユニバーサルプライミング配列を追加すれば、Ｇｅｎｏｍｅ Ｌａｂ ＧｅＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、この試験に標的アンプリコンの自動検出を組み込むことが特に可能となる。
【００３８】
【表４】
【００３９】
表４Ａに示したそれぞれの場合において、先頭に記載したアクセッション番号は、各ＨＰＶ型の完全なゲノム配列である。それぞれの場合におけるプライマー設計のためのクエリ配列は、完全なゲノム配列内からコピーした、連続したＥ６〜Ｅ７配列である。ＣｌｕｓｔａｌＸを使用して、ある型内のＥ６およびＥ７遺伝子に対して別々のアライメントを作成した。続いて、ある型内の分離株の間で観察された全ての可変サイトを、可能であるものについてはプライマー設計から除外した。可変サイトが避けられない場合は、それらの５’末端近傍の１つ以下の可変サイトをカバーするプライマーを選択した。
【００４０】
【表５】
【００４１】
表４Ｂに示したそれぞれの場合において、先頭に記載したアクセッション番号は各ＨＰＶ型の完全なゲノム配列である。Ｅ６およびＥ７配列の使用、およびアライメントの作成は、表４Ａと同様である。ＨＰＶ５２の場合は、遺伝子Ｅ６のみが複数の分離株で示されたので、プライマーの設計はＥ６に限った。
【００４２】
ｐ１６およびｍｃｍ５への免疫染色を使用して、臨床検体から異形成細胞をフローサイトメトリーにより検出する方法を開示する。フローサイトメトリーは、臨床検体の細胞形態学的分類を辿る方法によって、ｐ１６およびｍｃｍ５の過剰発現に対する二重陽性を検出することができる。正常、ＬＳＩＬおよびＨＳＩＬとして分類された臨床検体の細胞集団およびＨｅＬａ細胞について分析した。図１〜５は全細胞集団についてのフローサイトメトリーの結果を示す。全ての細胞をＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｃｙｔｙｃ、９０％ＭｅＯＨ／１０％Ｈ２Ｏ）中に固定した。細胞をｐ１６／ＦＩＴＣおよびｍｃｍ５／ＡＰＣ抗体と共にインキュベートした。細胞試料を前方／側方散乱ダイヤグラムに基づいてゲートした（図２〜５の左上パネル）。ゲートした細胞のｐ１６およびｍｃｍ５の濃度を分析した。デュアルパラメータダイヤグラム（図２〜５の右上パネル）は、いずれかのマーカーに対して陰性または陽性の細胞の割合を示す。それぞれの個別のマーカーに対する陽性細胞の割合は、図２〜５の左下および右下パネルに示されている。各種組織に対し３つの独立した実験を行った。各種組織内で各種シグナルを示す細胞の割合を図６に要約する。
【００４３】
図８に、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５の、高感度で、かつ高特異的な多重ＰＣＲ検出を示す。３プレックスのＰＣＲプライマー対による原理の証明が示されている。ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５について、それぞれ２７２ｂｐ、２４７ｂｐおよび８０ｂｐのアンプリコンを生成するように、プライマーを設計した。全てのアンプリコンはＥ６およびＥ７オープンリーディングフレームの連続領域内に収まる。設計ストラテジーは、非特異的増幅を避けながら、それぞれの型の中で確実な検出を行うことに明確な焦点を置いた。各ＨＰＶ型において、臨床分離株の間で多型性を検出するために、ＮＣＢＩ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅデータベースから選択した分離株の、Ｅ６およびＥ７の多重配列アライメントを行った。表４Ａおよび４Ｂは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のアライメントを行うために使用した全ての分離株のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号を含む。ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＳＭ（ＩＤＴ）を使用してプライマーを設計した。この設計アプリケーションは標的配列中の位置を除外することができ、多型サイトのアニーリングへの影響を確実に排除する。プライマー対を、ＧＣ％、Ｔｍおよび３’末端安定性が可能な限り類似するようにプライマー対を選択し、その結果、多重反応内の別々のＨＰＶ型に対して類似の検出感度が得られた。最後に、任意の標的ＨＰＶ型と他のものの間で大きく分化した、Ｅ６〜Ｅ７内の位置をカバーするプライマーセットを選択した。表５に、この３プレックスで使用したプライマリー対に対するＴｍおよびアンプリコンサイズを示す。
【００４４】
【表６】
【００４５】
ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５の統合遺伝子複製物をそれぞれ含有する、ＨｅＬａ、ＳｉＨａおよびＭＳ７５１の細胞系統を使用して、ＨＰＶ１６／１８／４５の３プレックスの特異性と感度を試験した。臨床検体がＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｃｙｔｙｃ）で固定されている場合に通常行われるように、まず、細胞を９０％メタノール中に固定した。細胞を、ｐ１６／ＦＩＴＣおよびｍｃｍ５／ＡＰＣ抗体と共にインキュベートし、上記のように分取した。分取した細胞の全部を９０％メタノールに再度懸濁させた。懸濁液は、１マイクロリットル当たり単一の型の細胞が２０個、および１マイクロリットル当たり各型の細胞が２０個となるようにした。分取細胞を、１μｌの細胞懸濁液アリコットを０．２ｍｌのＰＣＲチューブに加えることにより、ＰＣＲテンプレートとして直接使用し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ）中で加熱せずに乾燥させた。ＰＣＲマスターミックスのアリコット２５μｌを乾燥細胞の上に直接加えた。並行して、細胞物質から増幅人工産物を除外するための正のコントロールとして、同一の細胞系統から精製したゲノムＤＮＡを使用して同一セットの増幅を行った。正のコントロール反応は、１０ｎｇの１種類のＤＮＡ（レーン１２〜１７）または１０ｎｇのそれぞれの種類のＤＮＡ（レーン１８〜１９）を含有するものであった。図７は、ＨＰＶの検出が高い特異性および特異性を有することを示す。第１に、約２０個の各細胞系統を個別に見ると（レーン４〜９）、３組の多重プライマー対が、ＨＰＶの型に対して、それぞれの場合に予想される正しい標的サイズのアンプリコンを生成するのみである。第２に、それらの反応の全てにおいて、ヒトゲノム物質から非特異的に増幅した結果として、設計外のアンプリコンは生成されていない。第３に、３種の細胞系統を全て混合すると、３プレックスは、同じ目視強度を有する３つのＨＰＶ型全てを検出することができ、標的の増幅効率は反応中に複数のＨＰＶ型が存在しても妨害されないことを示している。精製した細胞系統のゲノムＤＮＡを使用した反応では、同一のアンプリコンセットを生成し、同一の相対強度を示しており、したがって、他の細胞由来の物質が増幅人工産物を生成していることはない。最後に、多数回のサイクルが感度を増加させるか否かを見るために、これらの試験では、４０サイクルを繰り返すサーモサイクリングプログラムを使用した。４０回のサイクル後でもこれらの明確な結果が得られることは、プライマー設計が強固な特異性を有することを示している。
【００４６】
図７では：レーン１、２５ｂｐのＤＮＡステップラダー（Ｐｒｏｍｅｇａ）；レーン２〜３、無テンプレートコントロール−−疑似テンプレートとして１μｌのＨ２Ｏを添加した２５μｌのＰＣＲマスターミックスのアリコット；レーン４〜９各細胞系統に個別に適用した３プレックスのプライマーセットの複製対（各反応は、免疫染色およびソーティングプロセスをパスした約２０個の細胞を含む。）；レーン１０〜１１−−３種の細胞系統全ての混合物に適用した３プレックスのプライマーセットの２つの複製物（約２０個の各系統の細胞）；レーン（１２〜１９）−−レーン４〜１１と同じパターンのテンプレートタイプを再現するために使用した、３種の細胞系統から精製したゲノムＤＮＡ；単一種類の細胞の反応（レーン１２〜１７）は各細胞系統からのゲノムＤＮＡを１０ｎｇ含有したが、レーン１８および１９は、１０ｎｇの各ＤＮＡタイプの混合テンプレートから増幅した２つの複製物を示す。ゲルは１×のＴＡＥ中に１．２５％のアガロース、１．２５％のＳｙｎｅｒｇｅｌ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加えたものである。分離は７０Ｖで約３０分間行った。ゲルを臭化エチジウムでポストステインした。
【００４７】
キャピラリー電気泳動プラットフォームによるアンプリコン検出原理の証明が、同じ３プレックスのプライマーにユニバーサルプライマーの相補的配列を付加したキメラ版を使用して示されている。これらのキメラ型プライマーは請求項１の配列１７、１８、２１、２２、２９および３０に対応する。これらのプライマーは、ＨｅＬａ、ＳｉＨａおよびＭＳ７５１細胞から精製した、溶液１μｌ当たり各１０ｎｇのＤＮＡ混合物からなるテンプレートを標的とした。増幅は、キメラ型プライマーの５’末端に相補的な、順方向および逆方向のユニバーサルプライマーを含むＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）に含まれる５×ＰＣＲ緩衝溶液を使用して行った。逆方向ユニバーサルプライマーは、５’末端にＷｅｌｌＲＥＤ Ｄ４、すなわち、６７０ｎｍに放射ピークを有する近赤外蛍光色素を標識している。陽性の検出試行と、テンプレートＤＮＡの代わりに水を加えた無テンプレートコントロール条件の両方用に、３回の複製反応を実施した。３相のサーマルサイクリングプログラムを使用して、このＰＣＲの化学を利用するときにシーケンシャルに行う３つの異なるアニーリング条件を決定した（３つのアニーリングイベントの説明については図２の左側を参照）。サーマルサイクリングプログラムは以下の通りである：
１ ９５℃で１０分間
２ ９４℃で１５秒間
３ ６５℃で２０秒間
４ ７２℃で３０秒間
５ ２へ。２×
６ ９４℃で１５秒間
７ ７２℃で１分間
８ ６へ。４×
９ ９４℃で３０秒間
１０ ５５℃で３０秒間
１１ ７０℃で１分間
１２ ９へ。３４×
１３ ４℃に保持
サーマルサイクリングに続いて、０．５μｌのＰＣＲ反応物に３９μｌのＧｅＸＰ Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）および０．５μｌのＤＮＡ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ−４００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を加えることにより、フラグメント分析用の試料を生成した。陽性の検出試行と無テンプレートコントロールの両者の各複製物用として、フラグメント分離試料を調製した。フラグメントの分離と検出は、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ用の装置制御ソフトウェアに収録の「Ｆｒａｇ−３」メソッドを使用して行った。図９は、検出が成功した電気泳動図のピークを示しており、これらのピークはＨＰＶ１６、１８および４５について予想されたアンプリコンサイズに特有のものである。３つのピークの全ては無テンプレートコントロールでは出現しない。
【００４８】
若干の実施形態についてのみ記載してきたが、当業者であれば上の記載から代替および修正を行い得ることは明らかであろう。これらと他の代替は等価であり、本開示の精神と範囲の中にあると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
米国政府の権利
本開示の試験法および方法は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）と結んだ契約第Ｒ２１ ＣＡ１２５３７０号に基づき、政府の支援によってなされたものである。米国政府は本出願に対して一定の権利を有し得る。
【０００２】
臨床由来の子宮頚部上皮細胞の集団から、タンパク質バイオマーカー表現型およびＨＰＶ遺伝子型の双方のデータを収集することができる、２つの部分からなる分析法を開示する。
【背景技術】
【０００３】
子宮頚癌は、最も一般的な形態の悪性腫瘍として、全世界の女性の発生率および死亡率の両方で乳癌に次いで第２位である。スクリーニングのための子宮頚部細胞診（パップスメアテスト、または「パップテスト」）を全人口レベルで行うことにより、米国および他の先進工業国においては、子宮頚癌の罹患率および死亡率が劇的に低下してきている。パップテストの成功にもかかわらず、子宮頚部病変の細胞診は、細胞診で悪性度の低い異常を有する患者において、臨床的悪性度の非常に高い病変に対する特異性が低いという厄介な問題に悩まされている。その結果、毎年４００万人を超える女性が、悪性度の高い異形成または癌である可能性を除外するために、さらなる評価を必要とする細胞診を受けている。殆どの場合、さらなる評価を行っても、軽度細胞診異常患者に潜在する高度病変は確認されない。高リスク型ヒトパピローマウイルスの簡単な検出は、患者の分類には重要な役割を果たし得るが、検出それ自体は、いくつかの細胞診にとって有用ではなかった。具体的に言えば、高リスクＨＰＶの単なる検出では、最初の感染と発病の間に長い時間のずれ（１０年以下）があるために、潜在している高悪性度の病変を予測できない。さらに、予後は高リスクＨＰＶの型によっても異なり得ることが、いくつかの研究で示されているが、現在の商業的に利用できる高リスクＨＰＶ用試験では、個々のＨＰＶの型は特定されない。
【０００４】
子宮頸管粘膜の前癌病変の細胞診は、パパニコロウ標本の細胞学的検査（パップスメアテスト）によって検出される子宮頸管粘膜の前癌病変を含む。細胞学的所見は、ベセスダシステムにより、正常／良性の反応性変化（正常／ＢＲＣ）、扁平上皮細胞異常および腺細胞異常として分類される。扁平上皮細胞異常は、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）への感染および／または軽度の異形成の証拠を含む軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、ならびに中等度の異形成（ＣＩＮ２）および高度の異形成／上皮内癌（ＣＩＮ３）を含む高度上皮内病変（ＨＳＩＬ）を含む。改訂ベセスダ２００１システムでは、ＡＳＣＵＳの一般カテゴリーが２つの新しい診断カテゴリー：「異型扁平上皮細胞−意義不明」（ＡＳＣ−ＵＳ）および「異型扁平上皮細胞−ＨＳＩＬを除外できない」（ＡＳＣ−Ｈ）に置き換えられた。以前は反応プロセスを示唆するＡＳＣＵＳに分類されたであろう症例は、新分類システムでは良性細胞変化のカテゴリーに含まれる。ＬＳＩＬとＨＳＩＬの分類は、以前のベセスダ分類システムと相対的には不変のままであるが、浸潤癌が疑われる特徴を有する症例を報告するために、ＨＳＩＬのサブカテゴリーが追加された。子宮頸管内腺性粘膜の潜在的な前癌病変もまた、子宮頚癌細胞診の標本で認識することができる。改訂２００１ベセスダシステムの細胞学的分類では、腺癌より軽度の腺細胞異常は、異型腺細胞（ＡＧＣ）、特定不能な子宮頸管内、子宮内膜または「腺細胞」（ＡＧＣ ＮＯＳ）；異型腺細胞、腫瘍性を示唆する子宮頸管内細胞または「腺細胞」（ＡＧＣ「腫瘍性示唆」）、および子宮頸管上皮内腺癌（ＡＩＳ）に分類される。
【０００５】
パパニコロウテストは癌の有効なスクリーニング手段である。しかしながら、その成功にもかかわらず、診断細胞病理学の実施は、軽度の細胞学的異常を示す症例において、臨床的に重大な潜在病変に対する特異性の低さから限られている。米国では、毎年、４００万を超える症例がＡＳＣ−ＵＳ、ＡＳＣ−Ｈ、ＬＳＩＬまたはＡＧＣと診断され、子宮頚部生検で発見される臨床的に重大な高度病変を有する部分集団患者群を同定するために、さらなる評価を必要としている（表１）。しかしながら、殆どの症例で、さらなる評価が軽度細胞学的異常を示した患者の高度扁平上皮病変または腺病変を同定することはない。細胞診でＡＳＣ（特定不能）と診断された患者は、子宮頚部生検により５〜１７％の潜在的ＣＩＮ２／３を有し、ＡＳＣ−Ｈとの診断は、コルポ診生検でＣＩＮ２／３である可能性が２４〜９４％であることが示されている。コルポ診検査を勧められたＬＳＩＬの症例では、高度子宮頸管異形成（ＣＩＮ２または３）が２５％に見られ、ＣＩＮ１が４５％に見られたが、２５％を超えるＬＳＩＬ症例で異型性は見られなかった。ＡＧＣの細胞診も、子宮頸管粘膜の臨床的に重大な潜在的病変の存在については明白に示さない。ＡＧＣと診断された症例では、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３またはＡＩＳのリスクが９〜４１％であることがわかっているが、ＡＧＣ症例の大半は、扁平上皮粘膜または腺性粘膜のいずれかの臨床的に重大な病変について生検による確認がなされていない。
【０００６】
【表１】
【０００７】
パップテストの成績に関する上の統計が、女性１００，０００人当たりの死亡率が世界の先進工業地域の３〜７倍である開発途上国で実施されていないという問題に対処するものでないことは言うまでもない。現在の実施に伴う他の問題点は、臨床医が大量の標本を素早く読むようにプレッシャーをかけられていることである。細胞検査技師はスライド１枚当たり約４〜５分の速さで、すなわち、８時間に１００枚のスライドをスクリーニングすることができる。言い換えれば、細胞検査技師は、４ないし５分間で、１枚のスライド上の５０，０００〜３００，０００個の細胞を可視化し、陽性標本中の僅かに１０〜５０個の異型細胞を同定する必要がある。スクリーニングした全標本中の約９０％が陰性である。したがって、スクリーニングする人の時間とエネルギーの大部分は健康な細胞を見ることに費やされる。疲れと単調さによりスクリーニング者の鋭敏さが損なわれ、その結果、数少ない陽性細胞は見落とされ易くなる。
【０００８】
分子レベルでの子宮頚癌の検出は、ＨＰＶの発癌遺伝子Ｅ６およびＥ７の検出と、ｐ１６ＩＮＫ４ａ過剰発現の検出を含む。すなわち、ヒトパピローマウイルスは、子宮頚癌の発症リスクによって約２００の型に分類されている。１６型および１８型のＨＰＶは、最も流行性の高い「高リスク」型であり、子宮頚癌の７０％を占め、残りの症例は殆ど全てが、あまり一般的でない他の高リスク型ＨＰＶに陽性である。ＨＰＶゲノムは２つの主要な発癌遺伝子Ｅ６およびＥ７を含む。Ｅ６タンパク質はｐ５３に結合し、ユビキチン介在プロセスによりその分解を誘導する。Ｅ７タンパク質はＲｂおよび関連タンパク質に結合し、これらを不安定化する。これらの作用が一緒になって、分化角化細胞中で細胞周期進行およびウイルスＤＮＡ複製が促進される。前癌子宮頸管病変および子宮頚癌では、ヒトパピローマウイルスＤＮＡが宿主ゲノムへ組込まれることによって、ウイルスのＥ２オープンリーディングフレームが破壊され、ＨＰＶ発癌遺伝子Ｅ６およびＥ７の無秩序な過剰発現が生じ得る。
【０００９】
Ｒｂ遺伝子機能を喪失した癌では、ｐ１６ＩＮＫ４ａが過剰に発現し、数種類の癌でｐＲｂとｐ１６ＩＮＫ４ａの間に逆相関性があることが確立されている。大部分の正常な細胞では、ｐ１６ＩＮＫ４ａの発現はｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでは低いことが知られている。ＨＰＶ感染期間中、ＨＰＶのＥ７タンパク質の発現は、Ｒｂに結合し、ユビキチン−プロテアソーム経路で分解されるようにすることにより、Ｒｂを不活性化する。したがって、ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現は、確立された子宮頚癌細胞系統と、１６型および１８型ＨＰＶにより不死化されたヒトの子宮膣部細胞の両方に観測される。さらに、ＨＰＶ感染によるｐ１６ＩＮＫ４ａのアップレギュレーションは、高リスク型ＨＰＶと低リスク型ＨＰＶで異なることが示されており、最も強力なアップレギュレーションは、低リスクＨＰＶ６より高リスク型ＨＰＶ１６に見られる。
【００１０】
ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質は、次に示すように、免疫組織化学的および免疫細胞化学的マーカーとして子宮頚癌を検出するために使用されている。いくつかの研究は、高度子宮頸部異形成および浸潤癌のほぼ１００％でｐ１６ＩＮＫ４ａレベルが非常に高く、一方、同じ抗体を使用した正常な子宮頚部上皮ではｐ１６ＩＮＫ４ａ−陽性染色が全く見られなかったことを示している。さらに、ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現とＲｂの発現の低下は、子宮頚部異形成の発生と相関している。最近の研究では、ｍｃｍ５もまた子宮頚部上皮内腫瘍および癌の存在のマーカーであり得るが、軽度異形成病変やある正常な増殖性扁平細胞でも発現し得ることが示されている。子宮頚部の病理学的状態の重篤度を追跡する定量的な方法で二重陽性細胞を検出するために、免疫学的染色法およびフローサイトメトリーを使用して、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｍｃｍ５を併用し得ることが実証されている。
【００１１】
分子レベルでの子宮頚癌の検出（他のタンパク質バイオマーカー）が、フローサイトメトリーによる癌細胞タンパク質バイオマーカーの検出と定量化を含むいくつかの研究で、実証されている。フローサイトメトリーで一般に検出される癌バイオマーカーは、ｋｉ６７、ＰＣＮＡ、サイクリン−Ｄ１およびサイクリン−Ｂ１、ならびにｐ１６ＩＮＫ４ａを含む。これらの癌バイオマーカーの殆どは、主に、肺、結腸および乳癌組織で検出された。しかしながら、最近の結果は、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｍｃｍ５およびサイクリンＤ１の発現の増加が、子宮頚癌の検体でも検出されることを示している。この方法論は現在ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｍｃｍ５、およびＰＣＮＡで開発中であるが、検出手順は、形質転換した子宮頸部上皮細胞内での発現が実証されているバイオマーカーであればいかなるものに対しても、理論的に互換性がある。
【００１２】
子宮頚癌におけるヒトパピローマウイルスの役割が解き明かされるにつれて、ウイルスの他の遺伝子系統への分岐が、宿主細胞の形質転換、ひいては病気の進行の程度の変化をもたらしていることが明らかになってきた。ＨＰＶの５種類の遺伝子型：１６、１８、３１、３３および４５が、最も流行性の強い高リスクの形態であることが認識されている。これらの中で、１６型は全子宮頚癌の約半数に現れるが、ＨＰＶ１８は子宮頚癌の約２０％を占めるに過ぎないにもかかわらず、一貫して最悪の予後をもたらすようであることは広く認識されている。癌の実際の症例に加えて他の子宮頚部の病変（ＡＳＣＵＳ、ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬ）を考慮すると、１６型および１８型のＨＰＶの頻度は、両者が有する高い相対的リスクを反映する形で、病変のクラスにより明らかに変化することが、病気の重篤度のＨＰＶ型に対する依存性を検出する代替の方法によって示されている。したがって、患者のＨＰＶ遺伝子型データと病理学的重篤度のデータの組み合わせは、ＨＰＶ型が、細胞異常が始まった症例の予後に対する有用な情報であることを示している。これまでの問題は、高リスクＨＰＶの感染と癌の発病までの約１０年間の潜伏期間が、それ自身のＨＰＶ型データが予後の観点で解釈されるのを妨げていることである。
【００１３】
Ｄｉｇｅｎｅ ＨＰＶ ＨＣ２テスト（Ｑｉａｇｅｎ）は、１３の高リスク型ＨＰＶに対するＲＮＡプローブの混合物を使用するが、陽性の試験結果は、最終的にはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに対するジェネリックな抗体によって検出され、いかなるＨＰＶ型が存在するかは示さない。さらに、ＨＣ２テストは、検体の妥当性に対する内部標準を欠くことによって制限されている。研究の場では様々なＰＣＲストラテジーが採用されてきたが、これらには、通常、増幅物を縮重プライマーと結合させ、その後、特定の多重ＰＣＲプライマーと第２の反応を行わせるネストＰＣＲ反応が含まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ＨＰＶ遺伝子型を予後とより関連するツールとするための、ＨＰＶ型データと、形質転換に関連したタンパク質バイオマーカーの検出との組み合わせを開示する。特に、細胞ソーティングによって標的細胞を単離した後、１回の増幅反応を必要とするだけの、非常に高い感度と特異性を組み合わせた試験法を開示する。
【００１５】
一実施形態では、フローサイトメトリーと多重ＨＰＶ遺伝子型同定法を組み合わせた、２つの部分からなる統合試験法が開示される。タンパク質バイオマーカー表現型と特定のＨＰＶ遺伝子型が、１つの臨床試料の同じ細胞集団について評価される。この目的は、子宮頚部初期病変の検出とキャラクタリゼーションの全体的な精度と特異性を改善することにある。本試験法は、従来のＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｃｙｔｙｃ）で固定した試料にも適合し、したがって、初めに、正常子宮頚部の洗浄物の１部として収集された残留細胞に適用することができる。高速の細胞ソーティングは、形質転換を集団的に示すことが報告されている多重タンパク質バイオマーカーの過剰発現に陽性の細胞を回収する。回収されると、これらの同じ細胞は、縮重ＨＰＶプライマーによる予備増幅を必要とせずに、多重反応で動作するように注意深く設計された一組のＰＣＲプライマーを使用して、高リスクＨＰＶ遺伝子型が調べられる。最後に、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）キャピラリー電気泳動プラットフォームを使用して、増幅フラグメントのサイズを自動的に検出することにより、個々のＨＰＶ型を検出することができる。
【００１６】
また、以下のオリゴヌクレオチド配列およびそれらの逆相補配列を開示するが、配列は慣例により５’から３’結合の方向に記載されている。
配列１ ＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列２ ＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列３ ＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列４ ＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列５ ＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列６ ＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列７ ＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列８ ＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列９ ＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列１０ ＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列１１ ＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列１２ ＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列１３ ＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列１４ ＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列１５ ＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列１６ ＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
配列１７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列１８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列１９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列２０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列２１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列２２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列２３ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列２４ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列２５ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列２６ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列２７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列２８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列２９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列３０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列３１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列３２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
【００１７】
他の一実施形態では、常法により固定し、免疫学的に染色した子宮頚部細胞集団を細胞ソーティングすることにより、１種以上のタンパク質バイオマーカーが過剰発現している細胞を捕捉し、その後、ヒトパピローマウイルスの含有量を直接調べるシーケンシャルな方法が開示される。この方法は、分類上は階層的方法であり、特定の遺伝子型が、タンパク質バイオマーカー表現型について既にキャラクタライズされている細胞の亜集団に起因するものであることがわかる。この方法で、子宮頚部の病気の複合リスク因子を個々に示す細胞が検出される。このことは、タンパク質バイオマーカーが示す病気の状態の兆候と特定の高リスクＨＰＶ型の存在を共に含む細胞系統の存在を明確に示している。特定の理論に縛られずに言うならば、細胞ソーティングは、特に、１）子宮頚部細胞集団におけるバイオマーカーの過剰発現の発生を比例的に定量化する希少事象検出法として、また２）異常細胞のみをＨＰＶ試験に流す予備選別ワークフローとしての働きをする。開示した方法では、フローサイトメトリーによる細胞ソーティングのゲーティング基準は、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｍｃｍ５、ＰＣＮＡおよび子宮頚部上皮細胞の形質転換に関係する他の任意のタンパク質バイオマーカー（これらに限定されない）を含むセット中の、任意の２種のタンパク質の過剰発現を示す細胞を単離するように設定することができる。
【００１８】
一実施形態では、細胞ソーティングで捕捉された細胞から直接、多重ＰＣＲ増幅を１回実施することにより、個々の高リスクＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、４５および／または５２を特異的検出し同定するために、配列１７〜３２の中の任意または全ての配列が使用される。さらに、本請求項では、その後、自動キャピラリー電気泳動法で標的アンプリコンを分離することにより、個々のＨＰＶ型が同定される。
【００１９】
一実施形態では、細胞ソーティングで捕捉された細胞から多重ＰＣＲ増幅を１回実施することにより、個々の高リスクＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、４５および／または５２を特異的に検出し同定するために、蛍光色素を末端に標識した配列１〜１６の中の任意または全ての配列が使用される。本請求項では、その後、自動キャピラリー電気泳動法で標的アンプリコンを分離することにより、個々のＨＰＶ型が同定される。あるいは、本請求項では、個々のＨＰＶ型は、サイズが十分に異なる標的アンプリコンによって表されるので、検出は標準のアガロースゲル電気泳動法で行うことができる。
【００２０】
一実施形態では、ＨＰＶの検出および同定の感度と特異性は、通常、ｑＰＣＲで使用する基準に従って最適化されたサーモサイクリングプログラムを使用することにより促進されるが、その場合、≧３５サイクルでは、非常に短いインキュベーション時間内に、変性およびアニーリング／伸長をそれぞれ行う２サイクルの工程があるのみである。
【００２１】
上記の方法により決定された、タンパク質バイオマーカー表現型対ＨＰＶ型の行列に基づいて、臨床予後の計画を構築する方法が開示される。この場合、タンパク質バイオマーカー表現型には、具体的には、検出された特定のタンパク質バイオマーカーと、細胞集団におけるそれらの割合（細胞ソーティングプロセスで自動カウントされた陽性ソーティングイベント対陰性ソーティングイベントから決定される）が共に含まれる。上記試験法から得られた個々の臨床検体の複合化されたタンパク質およびＨＰＶ型の同定と、病歴からの病理学データが一つに集められ、細かく分類された、試験結果対予想される病気の転帰を示す連想行列が作られる。
【００２２】
他の利点および特徴は、添付の図面とともに以下の詳細な説明を読めば明らかになるであろう。
【００２３】
開示の方法および装置をより完全に理解するには、添付の図面でより詳細に説明されている実施形態を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、開示の試験法の細胞ソーティング工程を示すフロー図である。
【図２−１】図２は、開示の試験法のＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動工程を示すフロー図である。
【図２−２】図２は、開示の試験法のＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動工程を示すフロー図である。
【図２−３】図２は、開示の試験法のＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動工程を示すフロー図である。
【図２−４】図２は、開示の試験法のＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動工程を示すフロー図である。
【図３】図３は、ヒトタンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＭＣＭ５に対する抗体を用いる免疫蛍光染色法のシグナル強度によってキャラクタライズされた臨床的に正常な子宮頚部細胞を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒトタンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＭＣＭ５に対する抗体を用いる免疫蛍光染色法のシグナル強度によってキャラクタライズされた軽度扁平上皮内病変細胞を示すグラフである。
【図５】図５は、ヒトタンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＭＣＭ５に対する抗体を用いる免疫蛍光染色法のシグナル強度によってキャラクタライズされた高度扁平上皮内病変細胞を示すグラフである。
【図６】図６は、ヒトタンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＭＣＭ５に対する抗体を用いる免疫蛍光染色法のシグナル強度によってキャラクタライズされたＨｅＬａ細胞を示すグラフである。
【図７】図７は、図３〜６に示した試料について、試料のクラスによるシグナルの種類の割合を示すグラフである。
【図８】図８は、予備分取した細胞からＨＰＶを検出する開示の方法が、高い感度および特異性を有することを示す試験結果である。
【図９−１】図９は、蛍光標識プライマーを用いた多重ＰＣＲからの蛍光標識ＨＰＶアンプリコンの検出を、自動キャピラリー電気泳動プラットフォームを使用して行うという概念の実証を示す試験結果である。
【図９−２】図９は、蛍光標識プライマーを用いた多重ＰＣＲからの蛍光標識ＨＰＶアンプリコンの検出を、自動キャピラリー電気泳動プラットフォームを使用して行うという概念の実証を示す試験結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
図面は必ずしも尺度通りではなく、また、開示した実施形態が、図面で、しかも部分図で説明されていることがあることは理解すべきである。ある場合には、開示した方法および装置を理解するために必ずしも必要ではない詳細、あるいは他の詳細の理解を困難にするような詳細は省略されていることもある。言うまでもなく、本開示が本明細書で説明している特定の実施形態に限定されないことは理解すべきである。
【００２６】
臨床的に得られた子宮頚部上皮細胞集団から、タンパク質バイオマーカー表現型と特定のＨＰＶ遺伝子型データを共に収集することが可能な、２つの部分からなる試験法を開示する。データは階層的に収集される。形質転換関連多重タンパク質バイオマーカーの存在は、細胞ソーティングのゲーティング基準として作用し、その後、ソーティングで捕捉された細胞から個々のＨＰＶ型を検出し同定するのに十分な感度を有するＰＣＲプロトコールが適用される。ワークフローは、常法によりＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｃｙｔｙｃ）に固定された細胞を扱うように最適化されており、パップテストが行われた後に保存された試料に残っている残留細胞に対して実施することができる。
【００２７】
タンパク質バイオマーカーのデータは、陽性ソーティングイベント対陰性ソーティングイベントをカウントすることにより、細胞集団において比例的に定量化する。したがって、臨床検体のバイオマーカーデータは、全体の染色強度を表す単一の値ではなく、細胞集団の割合を反映する１つの値であり、そこでは、個々の細胞が２種以上のバイオマーカーのそれぞれの閾値強度を超えている。陽性ソーティングイベントに対するゲーティング基準は、使用するタンパク質バイオマーカーに対する所望のシグナル強度の組み合わせとして設定することができる。バイオマーカーは、蛍光標識抗体を使用して固定細胞を免疫染色する従来の方法により検出され、それには、子宮頚部上皮細胞の形質転換に関連することが報告されている、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｍｃｍ５などのタンパク質や、他の悪性腫瘍の進行に関連する、ＰＣＮＡ、ｃａＰＣＮＡ、ｍｃｍ２などの他のタンパク質（これらに限定されない）が含まれる。ゲーティング基準を満たした細胞は、０．２ｍｌのＰＣＲウェル（個別のチューブか、または９６ウェルＰＣＲプレートのいずれか）に直接分取される。
【００２８】
ＨＰＶの検出および同定は、さらなる試料を調製せず、分取した細胞を直接テンプレートとして用い、さらなる試料は調製しない多重ＰＣＲ法により行う。この反応では、３つの一般的基準に従って注意深く設計されたプライマー対を使用する。
【００２９】
プライマー対は、ＨＰＶ型の分離株の中で多型であることが知られている位置によって、アニーリングサイトがカバーされないように設計した。各ＨＰＶ型に対して、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された、Ｅ６および／またはＥ７遺伝子の配列を含む全ての利用可能な分離株を使用して、それら２つの遺伝子のそれぞれに対して個別の配列アライメントを作成した。仮想的にアミノ酸配列へ変換した後、オープンリーディングフレームのアライメントを行うために、ＣｌｕｓｔａｌＸなどの配列アライメントツールを使用して、アライメントを行った。ギャップを、アミノ酸の位置の相同のアライメントを最大限保持するように、ギャップを手動で挿入し、その後、ＤＮＡ版のアライメントされた配列にギャップを挿入した。連続するＥ６−Ｅ７クエリ配列が、プライマー設計用ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＳＭ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などのプライマー設計ツールに提示されたなら、ＨＰＶ型内で多型性を示す配列位置を、「除外領域」として記載し、標識を付した。最適な速度論的特性を有する潜在プライマーサイトの数が限られるときは、プライマーは、５’側半分のプライマー配列でのみ１つの多型サイトをカバーすることが許容した。これにより、３’末端の安定性は維持され、また全体の感度への影響も無視し得るであろう。表４Ａおよび４Ｂに、遺伝子Ｅ６およびＥ７の型内配列（ｗｉｔｈｉｎ−ｔｙｐｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）アライメントを作成するために使用した全ＨＰＶ配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を示す。最後に、単一のＨＰＶ型については、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＳＭに提示するクエリ配列を、Ｅ６の５’末端からＥ７の３’末端までのウイルスゲノムをカバーする連続したフラグメントから構成した。各ＨＰＶ型では、このフラグメントを、その型に対して提示された参照用全ゲノム配列から採取した。ＨＰＶ５２では、多型性を検出するための分離株を利用できないので、Ｅ７は設計クエリから除外した。それぞれの型で使用した全ゲノム参照配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を、表４Ａおよび４Ｂの各列にトップアクセッション番号として示す。ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＳＭは、各クエリについて５０の潜在的プライマー対を返すように指示されているため、最終的な多重プライマーは、ＨＰＶ型それぞれのアニーリングサイトで配列分岐を最大化するプライマー対を選び取ることによって構築することができた。
【００３０】
プライマーは全て、速度論的特性が可能な限り類似するように設計した。Ｔｍ値を、摂氏４度の範囲内に制限し、対応対の２つのプライマーの間では２度以下の差を許容した。プライマー長は２２〜２５ヌクレオチドの範囲であり、全１６中の１３が２４ヌクレオチドの長さである。（配列１７〜３２は、単に配列１〜１６に１８ｍｅｒおよび１９ｍｅｒのユニバーサルプライミング配列を付加したものである−下記の本発明の好ましい検出に関する実施形態を参照）。ＧＣ％は４８％〜５４％の範囲である。３’末端安定性のスコアは、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＳＭで使用のアルゴリズムでは、約３〜７である。配列１〜１６が使用される場合、全ての標的アンプリコンは３００ｂｐ未満である。配列１７〜３２では、全ての標的アンプリコンは３５０ｂｐ未満である。Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＦＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの高性能組換ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせた場合、ｑＰＣＲで使用するプログラムを模倣する厳密なサーモサイクリングパラメータを使用することができる。この第２の設計の見地は、感度と特異性を同時に高め、多重化した状況において、個々のＨＰＶ型を検出し同定するシングルＰＣＲを成功裡に使用することに寄与する。
【００３１】
最後に、１６、１８、３１、３３、４５および５２型ＨＰＶについて、連続するＥ６およびＥ７オープンリーディングフレームの多重配列アライメントを構築した。配列を、再び、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託された参照用全ゲノム配列からＨＰＶ型毎に採取した。アライメントを、最初、ＧｅｎｅＤｏｃ２．６．００２でリーディングフレームを翻訳し、その後、アミノ酸配列のアライメントをＣｌｕｓｔａｌＸで作成することにより行った。このようにして、全てのギャップがフレームに導入され、進化的に相同な位置はよりアライメントされ易い。その後、ギャップ挿入とＧｅｎｅＤｏｃのスライド機能により、アミノ酸アライメントに合うように、ヌクレオチド配列を手動でアライメントした。各ＨＰＶ型に対するプライマー対を、６つのアライメントされた全配列の間でアニーリングサイトとの相同領域とを比較することにより選択した。他のＨＰＶ型から最も分岐したアニーリングサイトをカバーするプライマー対は、各プライマーの３’末端近辺の配列分岐に特別な注意を払って選択した。同時に、全ＨＰＶ型に対する標的アンプリコンが互いに少なくとも７ｂｐだけ異なるように、プライマー対を選択した。表２に配列１〜１６を、それらの実際のプライマー名および主要な特性と共に示す。表３に、配列１７〜３２を単にそれらのプライマー名および標的アンプリコン長とともに示す。
【００３２】
多重ＰＣＲからのアンプリコンの最終的な検出は、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）などの自動パラレルキャピラリー電気泳動プラットフォームを使用して行う。ＰＣＲマスターミックスは、ユニバーサルプライマーとして働く２種の蛍光染料標識オリゴヌクレオチドを含有する。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、それぞれ、配列１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１の５’末端に共通の１８ヌクレオチド配列と、配列１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２の５’末端に共通の１９ヌクレオチド配列に対して相補的である。ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｓｔａｒｔ ＫｉｔのＰＣＲマスターミックスと共に配列１７〜３２を使用すると、最初の約３サイクルはＨＰＶ型に特異的なプライマーが標的の増幅を支配し、その後、色素標識ユニバーサルプライマーによるプライミング支配へと移行する速度論的交代が可能になる。その後、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＤＮＡＳｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｋｉｔ−４００を使用する標準のフラグメント分析により、検出と分析が行われる。
【００３３】
末端に直接蛍光色素を標識した配列１〜１６を使用して多重ＰＣＲを行い、その後、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）などの自動パラレルキャピラリー電気泳動プラットフォームにより、アンプリコンの検出を行ってもよい。この代替法は、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｓｔａｒｔ ＫｉｔのＰＣＲマスターミックスに含まれるユニバーサルプライマーの使用を必要としない。あるいは、アンプリコンは、アガロースゲル電気泳動を用いる標準フラグメントサイズ分析により検出してもよい。ゲル溶解性は、５０％Ｓｙｎｅｒｇｅｌ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、従来の分子生物学グレードのアガロースを組み合わせることにより促進される。Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＦＸ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用に対して、試験性能は下記のサーモサイクリングプロトコールに従って最適化される：
工程１ ９５℃で２分間の初期変性／細胞溶解
工程２ ９５℃で１５秒間
工程３ ６２℃で５秒間
工程４ ７２℃で５秒間
工程５ 工程２へ、３９×
工程６ ４℃に保持
【００３４】
【表２】
【００３５】
開始＝各ＨＰＶ型に対するプライマー設計の標的として使用した参照配列内の５’開始位置。逆方向プライマーは、参照配列内のアニーリングサイトが逆の相補体であり、したがって、開始位置は参照配列に対してアニーリングサイトの３’末端となる。ＥＳ＝末端安定性。ＰＰ＝ペアペナルティ。ＰＳ＝生成物サイズ。ＥＳおよびＰＰはＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＳＭ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により報告されている値である。
【００３６】
【表３】
【００３７】
開始＝表２のように、各ＨＰＶ型に対するプライマー設計の標的として使用した参照配列内の５’開始位置。ユニバーサルプライミング配列を追加すれば、Ｇｅｎｏｍｅ Ｌａｂ ＧｅＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、この試験に標的アンプリコンの自動検出を組み込むことが特に可能となる。
【００３８】
【表４】
【００３９】
表４Ａに示したそれぞれの場合において、先頭に記載したアクセッション番号は、各ＨＰＶ型の完全なゲノム配列である。それぞれの場合におけるプライマー設計のためのクエリ配列は、完全なゲノム配列内からコピーした、連続したＥ６〜Ｅ７配列である。ＣｌｕｓｔａｌＸを使用して、ある型内のＥ６およびＥ７遺伝子に対して別々のアライメントを作成した。続いて、ある型内の分離株の間で観察された全ての可変サイトを、可能であるものについてはプライマー設計から除外した。可変サイトが避けられない場合は、それらの５’末端近傍の１つ以下の可変サイトをカバーするプライマーを選択した。
【００４０】
【表５】
【００４１】
表４Ｂに示したそれぞれの場合において、先頭に記載したアクセッション番号は各ＨＰＶ型の完全なゲノム配列である。Ｅ６およびＥ７配列の使用、およびアライメントの作成は、表４Ａと同様である。ＨＰＶ５２の場合は、遺伝子Ｅ６のみが複数の分離株で示されたので、プライマーの設計はＥ６に限った。
【００４２】
ｐ１６およびｍｃｍ５への免疫染色を使用して、臨床検体から異形成細胞をフローサイトメトリーにより検出する方法を開示する。フローサイトメトリーは、臨床検体の細胞形態学的分類を辿る方法によって、ｐ１６およびｍｃｍ５の過剰発現に対する二重陽性を検出することができる。正常、ＬＳＩＬおよびＨＳＩＬとして分類された臨床検体の細胞集団およびＨｅＬａ細胞について分析した。図１〜５は全細胞集団についてのフローサイトメトリーの結果を示す。全ての細胞をＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｃｙｔｙｃ、９０％ＭｅＯＨ／１０％Ｈ２Ｏ）中に固定した。細胞をｐ１６／ＦＩＴＣおよびｍｃｍ５／ＡＰＣ抗体と共にインキュベートした。細胞試料を前方／側方散乱ダイヤグラムに基づいてゲートした（図２〜５の左上パネル）。ゲートした細胞のｐ１６およびｍｃｍ５の濃度を分析した。デュアルパラメータダイヤグラム（図２〜５の右上パネル）は、いずれかのマーカーに対して陰性または陽性の細胞の割合を示す。それぞれの個別のマーカーに対する陽性細胞の割合は、図２〜５の左下および右下パネルに示されている。各種組織に対し３つの独立した実験を行った。各種組織内で各種シグナルを示す細胞の割合を図６に要約する。
【００４３】
図８に、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５の、高感度で、かつ高特異的な多重ＰＣＲ検出を示す。３プレックスのＰＣＲプライマー対による原理の証明が示されている。ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５について、それぞれ２７２ｂｐ、２４７ｂｐおよび８０ｂｐのアンプリコンを生成するように、プライマーを設計した。全てのアンプリコンはＥ６およびＥ７オープンリーディングフレームの連続領域内に収まる。設計ストラテジーは、非特異的増幅を避けながら、それぞれの型の中で確実な検出を行うことに明確な焦点を置いた。各ＨＰＶ型において、臨床分離株の間で多型性を検出するために、ＮＣＢＩ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅデータベースから選択した分離株の、Ｅ６およびＥ７の多重配列アライメントを行った。表４Ａおよび４Ｂは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のアライメントを行うために使用した全ての分離株のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号を含む。ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＳＭ（ＩＤＴ）を使用してプライマーを設計した。この設計アプリケーションは標的配列中の位置を除外することができ、多型サイトのアニーリングへの影響を確実に排除する。プライマー対を、ＧＣ％、Ｔｍおよび３’末端安定性が可能な限り類似するようにプライマー対を選択し、その結果、多重反応内の別々のＨＰＶ型に対して類似の検出感度が得られた。最後に、任意の標的ＨＰＶ型と他のものの間で大きく分化した、Ｅ６〜Ｅ７内の位置をカバーするプライマーセットを選択した。表５に、この３プレックスで使用したプライマリー対に対するＴｍおよびアンプリコンサイズを示す。
【００４４】
【表６】
【００４５】
ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５の統合遺伝子複製物をそれぞれ含有する、ＨｅＬａ、ＳｉＨａおよびＭＳ７５１の細胞系統を使用して、ＨＰＶ１６／１８／４５の３プレックスの特異性と感度を試験した。臨床検体がＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｃｙｔｙｃ）で固定されている場合に通常行われるように、まず、細胞を９０％メタノール中に固定した。細胞を、ｐ１６／ＦＩＴＣおよびｍｃｍ５／ＡＰＣ抗体と共にインキュベートし、上記のように分取した。分取した細胞の全部を９０％メタノールに再度懸濁させた。懸濁液は、１マイクロリットル当たり単一の型の細胞が２０個、および１マイクロリットル当たり各型の細胞が２０個となるようにした。分取細胞を、１μｌの細胞懸濁液アリコットを０．２ｍｌのＰＣＲチューブに加えることにより、ＰＣＲテンプレートとして直接使用し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ）中で加熱せずに乾燥させた。ＰＣＲマスターミックスのアリコット２５μｌを乾燥細胞の上に直接加えた。並行して、細胞物質から増幅人工産物を除外するための正のコントロールとして、同一の細胞系統から精製したゲノムＤＮＡを使用して同一セットの増幅を行った。正のコントロール反応は、１０ｎｇの１種類のＤＮＡ（レーン１２〜１７）または１０ｎｇのそれぞれの種類のＤＮＡ（レーン１８〜１９）を含有するものであった。図７は、ＨＰＶの検出が高い特異性および特異性を有することを示す。第１に、約２０個の各細胞系統を個別に見ると（レーン４〜９）、３組の多重プライマー対が、ＨＰＶの型に対して、それぞれの場合に予想される正しい標的サイズのアンプリコンを生成するのみである。第２に、それらの反応の全てにおいて、ヒトゲノム物質から非特異的に増幅した結果として、設計外のアンプリコンは生成されていない。第３に、３種の細胞系統を全て混合すると、３プレックスは、同じ目視強度を有する３つのＨＰＶ型全てを検出することができ、標的の増幅効率は反応中に複数のＨＰＶ型が存在しても妨害されないことを示している。精製した細胞系統のゲノムＤＮＡを使用した反応では、同一のアンプリコンセットを生成し、同一の相対強度を示しており、したがって、他の細胞由来の物質が増幅人工産物を生成していることはない。最後に、多数回のサイクルが感度を増加させるか否かを見るために、これらの試験では、４０サイクルを繰り返すサーモサイクリングプログラムを使用した。４０回のサイクル後でもこれらの明確な結果が得られることは、プライマー設計が強固な特異性を有することを示している。
【００４６】
図７では：レーン１、２５ｂｐのＤＮＡステップラダー（Ｐｒｏｍｅｇａ）；レーン２〜３、無テンプレートコントロール−−疑似テンプレートとして１μｌのＨ２Ｏを添加した２５μｌのＰＣＲマスターミックスのアリコット；レーン４〜９各細胞系統に個別に適用した３プレックスのプライマーセットの複製対（各反応は、免疫染色およびソーティングプロセスをパスした約２０個の細胞を含む。）；レーン１０〜１１−−３種の細胞系統全ての混合物に適用した３プレックスのプライマーセットの２つの複製物（約２０個の各系統の細胞）；レーン（１２〜１９）−−レーン４〜１１と同じパターンのテンプレートタイプを再現するために使用した、３種の細胞系統から精製したゲノムＤＮＡ；単一種類の細胞の反応（レーン１２〜１７）は各細胞系統からのゲノムＤＮＡを１０ｎｇ含有したが、レーン１８および１９は、１０ｎｇの各ＤＮＡタイプの混合テンプレートから増幅した２つの複製物を示す。ゲルは１×のＴＡＥ中に１．２５％のアガロース、１．２５％のＳｙｎｅｒｇｅｌ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加えたものである。分離は７０Ｖで約３０分間行った。ゲルを臭化エチジウムでポストステインした。
【００４７】
キャピラリー電気泳動プラットフォームによるアンプリコン検出原理の証明が、同じ３プレックスのプライマーにユニバーサルプライマーの相補的配列を付加したキメラ版を使用して示されている。これらのキメラ型プライマーは請求項１の配列１７、１８、２１、２２、２９および３０に対応する。これらのプライマーは、ＨｅＬａ、ＳｉＨａおよびＭＳ７５１細胞から精製した、溶液１μｌ当たり各１０ｎｇのＤＮＡ混合物からなるテンプレートを標的とした。増幅は、キメラ型プライマーの５’末端に相補的な、順方向および逆方向のユニバーサルプライマーを含むＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）に含まれる５×ＰＣＲ緩衝溶液を使用して行った。逆方向ユニバーサルプライマーは、５’末端にＷｅｌｌＲＥＤ Ｄ４、すなわち、６７０ｎｍに放射ピークを有する近赤外蛍光色素を標識している。陽性の検出試行と、テンプレートＤＮＡの代わりに水を加えた無テンプレートコントロール条件の両方用に、３回の複製反応を実施した。３相のサーマルサイクリングプログラムを使用して、このＰＣＲの化学を利用するときにシーケンシャルに行う３つの異なるアニーリング条件を決定した（３つのアニーリングイベントの説明については図２の左側を参照）。サーマルサイクリングプログラムは以下の通りである：
１ ９５℃で１０分間
２ ９４℃で１５秒間
３ ６５℃で２０秒間
４ ７２℃で３０秒間
５ ２へ。２×
６ ９４℃で１５秒間
７ ７２℃で１分間
８ ６へ。４×
９ ９４℃で３０秒間
１０ ５５℃で３０秒間
１１ ７０℃で１分間
１２ ９へ。３４×
１３ ４℃に保持
サーマルサイクリングに続いて、０．５μｌのＰＣＲ反応物に３９μｌのＧｅＸＰ Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）および０．５μｌのＤＮＡ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ−４００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を加えることにより、フラグメント分析用の試料を生成した。陽性の検出試行と無テンプレートコントロールの両者の各複製物用として、フラグメント分離試料を調製した。フラグメントの分離と検出は、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＧｅＸＰ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ用の装置制御ソフトウェアに収録の「Ｆｒａｇ−３」メソッドを使用して行った。図９は、検出が成功した電気泳動図のピークを示しており、これらのピークはＨＰＶ１６、１８および４５について予想されたアンプリコンサイズに特有のものである。３つのピークの全ては無テンプレートコントロールでは出現しない。
【００４８】
若干の実施形態についてのみ記載してきたが、当業者であれば上の記載から代替および修正を行い得ることは明らかであろう。これらと他の代替は等価であり、本開示の精神と範囲の中にあると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮頚部細胞試料における高リスクＨＰＶ遺伝子型の検出方法であって、
子宮洗浄またはパップテストから前記試料を収集する工程；
前記試料の細胞を多重バイオマーカーを標的とする蛍光標識抗体により固定する工程；
１種以下のバイオマーカーが陽性の細胞から、多重バイオマーカー陽性細胞を分離する工程；
前記多重バイオマーカー陽性細胞にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）マスターミックスを適用する工程であって、前記マスターミックスは複数のＰＣＲプライマーを含み、前記ＰＣＲプライマーは、１６、１８、３１、３３、４５および５３からなる群から選択される少なくとも１種のＨＰＶ型の遺伝子Ｅ６およびＥ７の少なくとも１方の型内配列（ｗｉｔｈｉｎ−ｔｙｐｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を形成するオリゴヌクレオチド配列を含む工程；
１回の多重ＰＣＲ増幅を実施して、複数の増幅末端標識アンプリコンを生成する工程；および
電気泳動法により、前記複数の増幅末端標識アンプリコンのＨＰＶ型を同定する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド配列が、
配列１ ＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列２ ＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列３ ＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列４ ＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列５ ＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列６ ＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列７ ＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列８ ＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列９ ＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列１０ ＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列１１ ＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列１２ ＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列１３ ＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列１４ ＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列１５ ＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列１６ ＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
配列１７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列１８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列１９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列２０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列２１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列２２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列２３ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列２４ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列２５ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列２６ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列２７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列２８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列２９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列３０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列３１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列３２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
およびこれらの逆方向相補配列からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド配列が、
配列１ ＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列２ ＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列３ ＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列４ ＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列５ ＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列６ ＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列７ ＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列８ ＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列９ ＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列１０ ＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列１１ ＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列１２ ＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列１３ ＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列１４ ＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列１５ ＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列１６ ＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
およびこれらの逆方向相補配列からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド配列が、
配列１７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列１８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列１９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列２０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列２１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列２２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列２３ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列２４ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列２５ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列２６ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列２７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列２８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列２９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列３０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列３１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列３２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
およびこれらの逆方向相補配列からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多重バイオマーカー陽性細胞の分離工程が、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｍｃｍ５、および子宮頚部上皮細胞形質転換に関連する他の任意のタンパク質バイオマーカーからなる群から選択される任意の２種のタンパク質の過剰表現を示す細胞の分離を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記電気泳動法が、ゲル電気泳動法である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記電気泳動法が、キャピラリー電気泳動法である請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅末端標識アンプリコンのサーモサイクリング工程をさらに含む請求項１に記載の方法であって、前記サーモサイクリング工程が複数回の繰り返しサイクルを含み、各サイクルが変性工程およびアニーリング／伸長工程を含む方法。
【請求項９】
前記サーモサイクリング工程が、約３５回未満のサイクルを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１回の多重ＰＣＲを実施して、複数の増幅末端標識アンプリコンを生成する前記工程が、変性ＨＰＶプライマーによる予備増幅を行わずに実施される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞ソーティングで使用される前記蛍光標識抗体が、形質転換、癌の発生、癌の進行、または癌の浸潤と機能的関係を有することが知られている、ＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦ、ＨＩＦ−１α、ＩＧＦＢＰ−３、Ｐ−カドヘリン、ＭＣＭ７、ｐ１６ＩＮＫ４ａまたはＭＣＭ５など（これらに限定されない）の２種以上のタンパク質バイオマーカーに向けられる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
１６、１８、３１、４５および５３からなる群から選択される少なくとも１種のＨＰＶ型の遺伝子Ｅ６およびＥ７の少なくとも一方の型内配列（ｗｉｔｈｉｎ−ｔｙｐｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を生成するオリゴヌクレオチド配列であって、
配列１ ＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列２ ＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列３ ＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列４ ＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列５ ＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列６ ＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列７ ＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列８ ＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列９ ＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列１０ ＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列１１ ＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列１２ ＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列１３ ＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列１４ ＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列１５ ＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列１６ ＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
配列１７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列１８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列１９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列２０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列２１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列２２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列２３ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列２４ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列２５ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列２６ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列２７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列２８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列２９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列３０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列３１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列３２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
およびこれらの逆方向相補配列からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列。
【請求項１２】
請求項１１のオリゴヌクレオチド配列を含むＰＣＲプライマー。
【請求項１３】
請求項１２の少なくとも１種のＰＣＲプライマーを含むＰＣＲマスターミックス。
【請求項１】
子宮頚部細胞試料における高リスクＨＰＶ遺伝子型の検出方法であって、
子宮洗浄またはパップテストから前記試料を収集する工程；
前記試料の細胞を多重バイオマーカーを標的とする蛍光標識抗体により固定する工程；
１種以下のバイオマーカーが陽性の細胞から、多重バイオマーカー陽性細胞を分離する工程；
前記多重バイオマーカー陽性細胞にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）マスターミックスを適用する工程であって、前記マスターミックスは複数のＰＣＲプライマーを含み、前記ＰＣＲプライマーは、１６、１８、３１、３３、４５および５３からなる群から選択される少なくとも１種のＨＰＶ型の遺伝子Ｅ６およびＥ７の少なくとも１方の型内配列（ｗｉｔｈｉｎ−ｔｙｐｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を形成するオリゴヌクレオチド配列を含む工程；
１回の多重ＰＣＲ増幅を実施して、複数の増幅末端標識アンプリコンを生成する工程；および
電気泳動法により、前記複数の増幅末端標識アンプリコンのＨＰＶ型を同定する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド配列が、
配列１ ＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列２ ＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列３ ＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列４ ＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列５ ＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列６ ＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列７ ＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列８ ＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列９ ＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列１０ ＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列１１ ＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列１２ ＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列１３ ＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列１４ ＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列１５ ＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列１６ ＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
配列１７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列１８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列１９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列２０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列２１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列２２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列２３ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列２４ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列２５ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列２６ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列２７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列２８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列２９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列３０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列３１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列３２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
およびこれらの逆方向相補配列からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド配列が、
配列１ ＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列２ ＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列３ ＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列４ ＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列５ ＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列６ ＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列７ ＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列８ ＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列９ ＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列１０ ＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列１１ ＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列１２ ＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列１３ ＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列１４ ＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列１５ ＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列１６ ＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
およびこれらの逆方向相補配列からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド配列が、
配列１７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列１８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列１９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列２０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列２１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列２２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列２３ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列２４ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列２５ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列２６ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列２７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列２８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列２９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列３０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列３１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列３２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
およびこれらの逆方向相補配列からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多重バイオマーカー陽性細胞の分離工程が、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｍｃｍ５、および子宮頚部上皮細胞形質転換に関連する他の任意のタンパク質バイオマーカーからなる群から選択される任意の２種のタンパク質の過剰表現を示す細胞の分離を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記電気泳動法が、ゲル電気泳動法である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記電気泳動法が、キャピラリー電気泳動法である請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅末端標識アンプリコンのサーモサイクリング工程をさらに含む請求項１に記載の方法であって、前記サーモサイクリング工程が複数回の繰り返しサイクルを含み、各サイクルが変性工程およびアニーリング／伸長工程を含む方法。
【請求項９】
前記サーモサイクリング工程が、約３５回未満のサイクルを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１回の多重ＰＣＲを実施して、複数の増幅末端標識アンプリコンを生成する前記工程が、変性ＨＰＶプライマーによる予備増幅を行わずに実施される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞ソーティングで使用される前記蛍光標識抗体が、形質転換、癌の発生、癌の進行、または癌の浸潤と機能的関係を有することが知られている、ＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦ、ＨＩＦ−１α、ＩＧＦＢＰ−３、Ｐ−カドヘリン、ＭＣＭ７、ｐ１６ＩＮＫ４ａまたはＭＣＭ５など（これらに限定されない）の２種以上のタンパク質バイオマーカーに向けられる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
１６、１８、３１、４５および５３からなる群から選択される少なくとも１種のＨＰＶ型の遺伝子Ｅ６およびＥ７の少なくとも一方の型内配列（ｗｉｔｈｉｎ−ｔｙｐｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を生成するオリゴヌクレオチド配列であって、
配列１ ＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列２ ＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列３ ＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列４ ＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列５ ＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列６ ＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列７ ＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列８ ＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列９ ＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列１０ ＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列１１ ＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列１２ ＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列１３ ＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列１４ ＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列１５ ＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列１６ ＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
配列１７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴ
配列１８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣ
配列１９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴ
配列２０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
配列２１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＧＴ
配列２２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
配列２３ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡ
配列２４ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧ
配列２５ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ
配列２６ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＧ
配列２７ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧ
配列２８ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴ
配列２９ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ
配列３０ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡ
配列３１ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＣＴ
配列３２ ＧＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧ
およびこれらの逆方向相補配列からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列。
【請求項１２】
請求項１１のオリゴヌクレオチド配列を含むＰＣＲプライマー。
【請求項１３】
請求項１２の少なくとも１種のＰＣＲプライマーを含むＰＣＲマスターミックス。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【公表番号】特表２０１３−５２１０００（Ｐ２０１３−５２１０００Ａ）
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５６２６２（Ｐ２０１２−５５６２６２）
【出願日】平成２３年３月４日（２０１１．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２７１８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０９７０５
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５９８０６３２０３）パーデュー・リサーチ・ファウンデーション (59)
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月４日（２０１１．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２７１８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０９７０５
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５９８０６３２０３）パーデュー・リサーチ・ファウンデーション (59)
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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