ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬
【課題】ＰＭＷＳ症候群の原因となる新規なブタサーコウイルス株、その検出試薬および検出方法、ワクチン接種方法、ワクチン、これらワクチンおよび試薬の製造方法を提供する。
【解決手段】離乳後多機能萎縮症候群（post-weaning multisystemic syndrome：PMWS）の農場から得られた肺または神経節標本から単離した新規なブタサーコウイルス（circovirus）株と、この株の精製物、その無毒化または不活性化ワクチン、組換え生ワクチン、プラスミドワクチンおよびサブユニットワクチンと、診断試薬および診断方法。さらに、インビトロ発現ベクターのサブユニットの製造に用いられるＤＮＡ断片またはウイルスまたはプラスミド型のインビトロ発現ベクターに組み込まれる配列としてのＤＮＡ断片。
【解決手段】離乳後多機能萎縮症候群（post-weaning multisystemic syndrome：PMWS）の農場から得られた肺または神経節標本から単離した新規なブタサーコウイルス（circovirus）株と、この株の精製物、その無毒化または不活性化ワクチン、組換え生ワクチン、プラスミドワクチンおよびサブユニットワクチンと、診断試薬および診断方法。さらに、インビトロ発現ベクターのサブユニットの製造に用いられるＤＮＡ断片またはウイルスまたはプラスミド型のインビトロ発現ベクターに組み込まれる配列としてのＤＮＡ断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＭＷＳ症候群（ブタ多機能萎縮症候群:Porcine Multisystemic Wasting Syndrome）（離乳後多機能萎縮症候群:Post-weaning Multisystemic Wasting Syndromeともいわれる）の原因となる新規なブタサーコウイルス（ＰＣＶ,Porcine Circo Virus)株と、その検出試薬および検出方法と、ワクチン接種方法と、ワクチンと、これらワクチンおよび試薬の製造方法とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）はブタ腎臓細胞株ＰＫ／１５中に無毒病原性汚染物質として最初に見い出された。このウイルスＰＣＶはチキン貧血症ウイルス（ＣＡＶ、Chicken Anaemia Virus）および嘴・羽症候群ウイルス（ＰＢＦＤＶ、Pscittacine Beak and Feather Disease Virus)とともにサーコウイルス群（Circoviridae）に分類された。これらのウイルスはエンベロプのない小さなウイルス（１５〜２４ｎｍ）で、その共通な特徴は１．７６〜２．３１ｋｂの環状一本鎖のＤＮＡからなるゲノムを含む点にある。このゲノムは約３０ｋＤａのポリペプチドをコード化すると考えられていた（非特許文献１）が、最近の研究で、複雑な転写がわかってきた（非特許文献２）。さらに、上記３種類のサーコウイルス（circovirus）はそのヌクレオチド配列に有意な相同性はなく、また、共通の抗原決定基もない。
【０００３】
ＰＫ／１５細胞由来のＰＣＶは病原性ではないと考えられる。この配列は（非特許文献３）が明らかにしている。ＰＣＶ株が病原性で、ＰＭＷＳ症候群と関連があるかもしれないと考えられるようになったのはほんの最近のことである（非特許文献４、５）。Nayer達はブタＰＣＶのＤＮＡがＰＭＷＳ症候群を示すことをＰＣＲ法を用いて見い出した。しかし、野生型ＰＣＶ株は単離または精製されていない。
【０００４】
カナダ、米国およびフランスで見られるＰＭＷＳ症候群の臨床的な特徴は、体重を徐々に失い、頻呼吸症、呼吸困難および黄疸等を発症することである。病理的な面では、リンパ性または肉芽種性浸潤、リンパ節腫脹、まれには肝炎およびリンパ性または肉芽種性腎炎を発症する（非特許文献６〜１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Todd et al., Arch Virol 1991, 117; 129-135
【非特許文献２】Meehan B. M. et al., 1997,78; 221-227
【非特許文献３】"B. M. Meehan et al., J. Gen. Virol 1997 (78) 221-227"
【非特許文献４】Gupi P. S. Nayar et al., Can.Vet. J, Vol. 38, 1997: 385-387
【非特許文献５】Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501
【非特許文献６】Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501；
【非特許文献７】La Semaine Veterinaire 1996 (834)、
【非特許文献８】La Semaine Veterinaire No. 26；
【非特許文献９】La Semaine Veterinaire 1997 (857)：５４；
【非特許文献１０】Gupi P. S. Nayar et al., Can.Vet. J, Vol. 38, 1997: 385-387
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願人は、カナダ、米国（カリフォルニア）およびフランス（ブリタニー）の農場から得た肺または神経節の標本から５つの新規なＰＣＶ株（以下、本発明のサーコウイルス（circovirus）という）を単離することに成功した。これらのウイルスはＰＭＷＳ症候群のブタの病変部に検出されるが、健康なブタには検出されない。
【０００７】
本出願人はさらに、これらの４種の株（カナダおよび米国の株）と２種のフランスの株のゲノムの配列決定した。これらの株はヌクレオチドレベルで互いに非常に強い相同性（９６％以上超）を示す、一方、ＰＫ／１５株ははるかに弱い相同性（約７６％）しか示さない。従って、新規のタイプのブタサーコウイルス （circovirus）を代表するものと考えられ、ＰＫ／１５に代表されるタイプＩ（第Ｉ群）に対して、本発明の新規な株はタイプＩＩ（第ＩＩ群）とよぶことにする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の対象は単離または精製物の形をした上記定義の第ＩＩ群のブタサーコウイルス（circovirus）にある。
本発明はさらに、生理標本または組織標本、特にＰＭＷＳ症候群のブタの病変部の標本から実施例に記載した方法で単離可能なブタのサーコウイルス（circovirus）、特にＩＩ型サーコウイルスを提供する。
【０００９】
本発明の対象はＥＣＡＣＣ（European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom）に寄託された下記の５種の株の精製物にある：
１９９７年１０月２日木曜日寄託：
寄託番号第Ｖ９７１００２１９号（以下、Ｉｍｐ．１００８ＰＣＶという）
寄託番号第Ｖ９７１００２１８号（以下、Ｉｍｐ．１０１０ＰＣＶという）
寄託番号第Ｖ９７１００２１７号（以下、Ｉｍｐ．９９９ＰＣＶという）
１９９８年１月１６日金曜日寄託：
寄託番号第Ｖ９８０１１６０８号（以下、Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５という）
寄託番号第Ｖ９８０１１６０９号（以下、Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１という）
【００１０】
本発明はさらに、病気のブタから単離したブタサーコウイルス（circovirus）および／または本発明株と有意な血清学的類似性を有するサーコウイルスおよび／またはＰＫ／１５のＰＣＶとハイブリダイゼーションが全く無く、厳密な条件下で本発明株とのクロスハイブリダイゼーションを有するサーコウイルスに関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１株のゲノムのＤＮＡ配列
【図２】図１の続き
【図３】Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５株のゲノムのＤＮＡ配列
【図４】図３の続き
【図５】Ｉｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
【図６】図５の続き
【図７】Ｉｍｐ．１０１０株のゲノムのＤＮＡ配列
【図８】図７の続き
【図９】PCV PK/15株の配列と図１〜８の４つの配列との整列化
【図１０】図９の続き
【図１１】図１０の続き
【図１２】図１１の続き
【図１３】１９９７年１０月３日のフランスの最初の出願におけるＩｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
【図１４】図１３の続き
【図１５】PK/15株の配列と図１３、１４の配列との整列化
【図１６】図１５の続き
【図１７】図１６の続き
【図１８】図１７の続き
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ウイルス性株の増殖、特に全抗原（例えばウイルス）および／またはサブユニット（例えばポリペプチド）の製造は、ＰＭＷＳ症候群のブタの病変部の生理学標本または組織標本から単離されたウイルス株、特にブタ腎臓株細胞を汚染されていない細胞株（特にＰＣＶ、ペスチウイルス、ブタアデノウイルスおよびブタパルボウイルスに汚染されていないＰＫ／１５細胞）で増殖するのが有利である。
これらの単離株がＰＫ／１５細胞での培養で非常に生産的であり、ウイルスまたは抗原の製造、特に不活性化ワクチンの製造に有利であるということは驚くべきことであり、予想できなかったことである。
【００１３】
従って、本発明の他の対象は本発明のサーコウイルス（circovirus）または病変部細胞、特にＰＭＷＳ症候群のブタの細胞株の生理学標本または組織標本から単離される任意のブタサーコウイルスの少なくとも１つに感染された細胞をインビトロで培養した細胞株、特にＰＫ／１５細胞で継代した後に単離されるサーコウイルス（circovirus）の調製方法にある。
【００１４】
本発明のさらに別の対象は上記の培養抽出物または上澄み（必要に応じて一般的な方法でさらに精製されていてもよい）と、一般にインビトロの培養から得られる任意の抗原製剤にある。
【００１５】
本発明のさらに別の対象は免疫抗原性の有効成分と、少なくとも１つの上記定義の抗原を含むワクチンにある。
【００１６】
本発明のさらに別の対象は、無毒化した生全ワクチンをベースとする免疫抗原性の有効成分またはこの有効成分を精製して得られるワクチンにある。この無毒化は通常の方法、例えば細胞での継代、好ましくはブタ細胞、特にＰＫ／１５細胞等の株細胞での継代（特に５０〜１５０、特に１００回の継代）で行なわれる。これらのワクチンは一般に獣医学上許容される賦形剤または希釈液と、さらには必要に応じて添加される獣医学上許容される補助剤およびフリーズドライ安定剤とを含むことができる。
上記の抗原製剤およびワクチンは１０3〜１０6のＴＣＩＤ５０を有するのが好ましい。
【００１７】
本発明のさらに別の対象は、不活化した本発明のサーコウイルス抗原をベースにした免疫抗原性有効成分またはワクチンにある。このワクチンは獣医学上許容される賦形剤または希釈液、さらには必要に応じて添加される獣医学上許容される補助剤を含むことができる。
【００１８】
本発明のサーコウイルス（断片の形でもよい）は当業者に公知の方法で不活性化される。この不活性化は化学的方法、例えば抗原をホルムアルデヒド（ホルマリン）、パラフォルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミンまたはその誘導体等の試薬で処理して行なうことができる。好ましい不活性化法は試薬、特にエチレンイミンまたはβ−プロピオラクトンで処理する方法である。
【００１９】
本発明の不活性化ワクチンにはアジュバンドを加え、当業者に公知の方法でエマルジョンの形、例えば油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョン等の乳剤の形にするのが好ましい。一般的なアジュバンド化合物を有効成分に添加してアジュバンド処理することもできる。
【００２０】
使用可能な補剤（アジュバンド）としては例えば水酸化アルミニウム、サポニン（例えば非特許文献１１参照）、Avridine（商標登録）（非特許文献１２参照）、DDA（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、非特許文献１３参照）、ポリホスファゼン（非特許文献１４参照）、さらには有機油、スクアラン（例えばＳＰＴ乳剤、非特許文献１５参照）、スクアレーン（例えばＭＦ５９、非特許文献１６参照）をベースとする水中油乳剤または代謝可能な油をベースとする油中水乳剤（好ましくは特許文献１、２に記載の乳剤を挙げることができる。補剤の組み合わせ、例えば乳剤AvrＩＤine（商標登録）またはDDAとの組み合せた選択することもできる。
これらのワクチンは１０6〜１０8のＴＣＩＤ５０を有するのが好ましい。
【００２１】
【非特許文献１１】Quillja saponinまたはQuil A；"Vaccin Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Michael F. Powel と Mark J. Newman編、Plennum Press, New-York and London, p.210"
【非特許文献１２】Vaccine Design p. 148
【非特許文献１３】Vaccine Design p. 157
【非特許文献１４】Vaccine Design p. 204
【非特許文献１５】Vaccine Design p. 147
【非特許文献１６】Vaccine Design p. 183
【特許文献１】国際特許第WO-A-９４−２００７１号公報
【特許文献２】米国特許第５，４２２，１０９号明細書
【００２２】
生ワクチン補剤は不活性化ワクチン用のものから選択するこができる。乳剤が好ましい。不活性化ワクチン用のものには特許文献３に記載のものも加えることができる。
【特許文献３】国際特許第WO-A-９４−１６６８１号公報
【００２３】
凍結安定剤としては例えばＳＰＧＡ（非特許文献１７）、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストランまたはグルコース等の炭水化物、アルブミンまたはカゼイン等のプロテイン、これらの化合物の誘導体またはアルカリ金属燐酸塩等の緩衝剤を挙げることができる。
【非特許文献１７】Bovarnik et al., J. Bacteriology 59, 509, 950
【００２４】
本件出願人は配列ＩＤ番号１〜４(必要な場合にはさらに配列ＩＤ番号６)で識別される４つの単離株のゲノムを得た。
【００２５】
本発明のさらに他の対象はこれらの配列の一部または全てを含むＤＮＡ断片にある。本発明がこれと均等な配列すなわち上記配列の株の特徴または上記配列によりコードされるポリペプチドの機能を変更しない配列も含むものであるということは当然である。また、コードの欠失(degenerescence)により変化した配列も含むということは理解できよう。
【００２６】
本発明はさらに、厳密な条件下で上記配列と混成可能であり、および／または、上記定義の第ＩＩ群に属する本発明株と高い相同性を有するという意味で均等な配列も含むものである。
【００２７】
これらの配列およびその断片は適当なベクターを用いてインビトロまたはインビボでポリペプチドの発現に有利に用いることができる。
【００２８】
特に、これに使用可能な本発明のＤＮＡ断片を形成する読み取り枠はタイプＩＩのサーコウイルスのゲノム配列で同定されている。本発明は、少なくともこれらの読み取り枠（対応するアミノ酸配列）の一つを含む全てのポリペプチドに関するものである。特に、本発明は主としてＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１０またはＯＲＦ１３で構成されるプロテインに関するものである。
【００２９】
インビトロのサブユニットを発現するための発現手段としてはE. coliまたはバキュロウイルス（特許文献３）を用いるのが好ましい。
【特許文献３】米国特許第４，７４５，０５１号明細書
【００３０】
上記の単数または複数のコード配列またはその断片をバキュロウイルスゲノム（例えばAutographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV）に組み込み、次いで、それを昆虫細胞、例えばSpodoptera fruigiperda Sf9（寄託番号ATCC CRL 1711）で増殖される。また、イースト（例えば酵母)またはほ乳類細胞（例えばCHO、BHK）等の真核細胞でサブユニットを製造することもできる。
【００３１】
本発明のさらに他の対象は、これらの発現手段によってインビトロで製造され、必要に応じて一般的な方法で精製されたポリペプチドにある。本発明のさらに他の対象は、このようにして得られた少なくとも１つのポリペプチドまたはその断片を獣医学上許容される賦形剤または希釈液(必要に応じて獣医学上許容される補助剤をさらに含むことができる)中に含むサブユニットワクチンにある。
【００３２】
組み換え生ワクチンの製造時にインビボ発現させるには単数または複数のコード化配列またはその断片を単数または複数のポリペプチドを発現できる条件下で適当な発現ベクターに挿入する。適切なベクターとしては好ましくはブタで増殖可能でブタに対しては非病原性の生ウイルスを当業者に周知の方法で使用することができる。特に、アウジェスキー病ウイルス、ブタアデノウイルス等のブタヘルペスウイルス、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ブタポックスウイルス等を用いることができる（特許文献４〜７）。
【特許文献４】国際特許第WO-A-９０−１１０９２号公報
【特許文献５】国際特許第WO-A-９３−１９８１３号公報
【特許文献６】国際特許第WO-A-９４−２１７９７号公報
【特許文献７】国際特許第WO-A-９５−２０６６０号公報
【００３３】
従って、本発明の他の対象は、このようにして精製されたベクターと、組み換え生ワクチンまたはプラスミドワクチン（ポリヌクレオチドまたはＤＮＡワクチン）にある。これらのワクチンは獣医学上許容される賦形剤または希釈液を含むことができる。
本発明のワクチン（無毒化、不活性化、サブユニット、組み換えおよびプラスミド生ワクチン）は本発明の一つまたは複数（２、３つ）のサーコウイルスから成る一つまたは複数の有効成分（抗原）を含むことができる。
【００３４】
本発明の上記各種ワクチンはブタの他の病原体に対するワクチンと組み合わせることができる。特にＰＭＳＷ症候群に関連する病原体に対するワクチンと組み合わせることができる。本発明のワクチン、特に不活性化ワクチンはブタの他の病原体に対応する他のワクチン価を含むことができる。これらのブタの他の病原体の中では好ましくはＰＲＲＳ（Porcine Reproductory and Respiratory Syndrome :ブタ生殖器および呼吸器症候群）（特許文献８〜１０および非特許文献１８を参照）および／またはMycoplasma hyopneumonia（特許文献１１〜１３および非特許文献１９を参照）を挙げることができる。他の重要なワクチン価の中ではアクチノバシラス胸膜肺炎菌、E. coli、ブタ萎縮鼻炎（porcine Atrophic Rhinitis）、仮性狂犬病（アウジェスキー病）、ブタコレラ、ブタインフルエンザを挙げることができる。
【００３５】
【特許文献８】国際特許第WO-A-９３−０７８９８号公報
【特許文献９】国際特許第WO-A-９４−１８３１１号公報
【特許文献１０】フランス国特許第２，７０９，９６６号公報
【非特許文献１８】"C. Chareyre 他、IPVS Congress,Birmingham, England, 5-9 July 1998, p. 139の議事録"
【特許文献１１】欧州特許第５９７，８５２号
【特許文献１２】第５５０，４７７号
【特許文献１３】第５７１，６４８号
【非特許文献１９】"第１５回IPVS CongressのO. Martinon 達、p. 157, 284, 285およびG. Reynaud達、p. 150"
【００３６】
本発明のさらに他の対象は、本発明のサーコウイルスに対してブタの免疫反応を誘発する方法、特にブタに有効なワクチン接種方法にある。
このワクチン接種方法では上記ワクチンを一回または複数回にわたってブタに投与する。同じワクチン接種プロトコルで複数種の前記ワクチンを組み合わせることも可能である。
このワクチンは大人のブタだけでなく、若いブタまたは妊娠中の雌に対して投与することができる。妊娠中の雌にワクチン接種することによって新生児に受動免疫（母親抗体：maternal antibody）を与えることができる。
【００３７】
本発明はさらに、本発明のブタサーコウイルスの存在を診断する方法を提供する。従って、本発明の他の対象は診断テストと下記試薬を用いたテスト方法にある。
互いに異なるサーコウイルスの配列が分かると共通の配列を定義でき、公知の全てのブタサーコウイルスを識別できる試薬を製造することができる。
当業者は特定の診断を実施するために対応するＰＫ／１５サーコウイルスの配列とほとんどまたは全く相同性を示さない領域に対応する配列の断片を選択することができる。
【００３８】
配列を並べることによって当業者は所望の試薬を選択することができる。
第１の試薬は上記ＤＮＡ配列およびその断片で構成され、それは周知のハイブリッド法またはＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）法によってプローブまたはプライマーとして用いられる。
第２の試薬は上記ウイルスの配列によってコードされたポリペプチドまたはベクター（前記参照）を用いて発現されたまたは公知のペプチド合成法によって化学的に合成されたポリペプチドで構成される。
第３および第４の試薬はウイルス、ポリペプチドまたは断片、抽出物またはＤＮＡ配列でコードされたものから一般的な方法で製造可能なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体からなる。
【００３９】
上記の第２、第３および第４の試薬は本発明の対象である診断法で用いることができる。この診断法では検査するブタから得られた生理学的液体標本（血液、血漿、血清等）または組織標本（神経節、肝臓、肺、腎臓等）中に本発明のサーコウイルスに特有な抗原の存在を調べて抗原自体を検出するか、この抗原に対する抗体を検出する。
【００４０】
本発明の抗原および抗体は公知の任意の臨床診断法で用いることができるが、
上記の抗原および抗体を獣医、ブリーダーまたは動物の飼い主が直接現場で使用可能な方法で用いるのが好ましい。臨床技術および現場技術を有する当業者は上記の抗原および／または抗体を試薬として用いることができる。
【００４１】
本発明で用いるのに好ましい診断法はウェスタンブロット法、免疫抗体法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）および免疫クロマトグラフィーである。
免疫クロマトグラフィー法に関しては特に非特許文献２０と特許文献１４〜２９を参照することができる。
【００４２】
【非特許文献２０】"Robert F. Zulk et al., Clin. Chem. 31/7, 1144-1150 (1985) "
【特許文献１４】国際特許第WO-A-８８−０８５３４号公報
【特許文献１５】国際特許第WO-A-９１−１２５２８号公報
【特許文献１６】欧州特許第２９１，１７６号公報
【特許文献１７】欧州特許第２９９，４２８号公報
【特許文献１８】欧州特許第２９１，１９４号公報
【特許文献１９】欧州特許第２８４，２３２号公報
【特許文献２０】米国特許第５，１２０，６４３号明細書
【特許文献２１】米国特許第５，０３０，５５８号明細書
【特許文献２２】米国特許第５，２６６，４９７号明細書
【特許文献２３】米国特許第４，７４０，４６８号明細書
【特許文献２４】米国特許第５，２６６，４９７号明細書
【特許文献２５】米国特許第４，８５５，２４０号明細書
【特許文献２６】米国特許第５，４５１，５０４号明細書
【特許文献２７】米国特許第５，１４１，８５０号明細書
【特許文献２８】米国特許第５，２３２，８３５号明細書
【特許文献２９】米国特許第５，２３８，６５２号明細書
【００４３】
標本中に特有な抗体は間接法、競合法または置換法によって検出するのが好ましい。そのためには抗原自体を診断試薬として用いるか、抗体の認識を保持する抗原断片を診断試薬として用いる。標識化はペルオキシダーゼを用いた標識化または特殊な標識化、好ましくはコロイド性金を用いた標識化が有利である。
標本中の抗原自体をこの抗原に特有な標識化した抗体を用いて検出することもできる。標識化は上記のものが有利である。
競合法または置換法または抗原自体の検出に用いられる抗原に特有な抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナール抗体、これら抗体の断片、好ましくはFabまたはF(ab)'2断片であるである。
【００４４】
本発明はさらに、上記抗体を生理学的液体標本または組織標本中の抗原の検出またはこれら標本または試験片中に存在する抗体の検出のための診断試薬として使用可能な本発明抗原に特有のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の製造方法に関するものである。本発明はものでさらに、これらの抗体の免疫機能を有する断片、特にF(ab)およびF(ab)'2断片は本発明に含まれる。
抗体は一般的な方法で製造することができる。特に非特許文献２１または非特許文献２２を参照することができる。これらの内容は本件明細書の一部を成す。
特に、抗原またはその断片の少なくとも１つで免疫化されたネズミの脾臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合（この方法自体は公知）することができる。
【００４５】
【非特許文献２１】"Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, USA"
【非特許文献２２】"J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Inc.,"
【００４６】
本発明の他の対象は上記抗原に特有なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、特にネズミまたはウサギの抗体の純粋または部分的に純粋な製剤或いは粗原料からなる製剤にある。
【００４７】
本発明では上記のＤＮＡ配列を基にした所望のエピトープ（ワクチン用エピトープまたは診断用エピトープ）を決めることができる。本発明のサーコウイルスのゲノムのＤＮＡ配列から、エピトープを決めることができる。当業者は公知の方法、例えば適切なコンピュータプログラムまたはPEPSCANを用いてエピトープを求めることができる。このエピトープはプロテインの免疫優性領域であり、プロテインの表面に露出した領域である。このエピトープは抗体によって認識され、診断の分野において診断目的の抗体の調製または診断試薬として用いられる対応するペプチドの製造に用いられる。
少なくともエピトープは８〜９個のアミノ酸を有するペプチドである。一般には最小でも１３〜２５個のアミノ酸が好ましい。
【００４８】
当業者は一つまたは複数の上記技術および利用可能なその他の技術を用いて診断用のペプチドまたは抗体で用いるエピトープを見付けることができる。
従って、本発明の他の対象はこの抗原および／またはこの抗原に特有なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む診断キットにある。これらは特に、前記の診断技術による診断キットである。
【００４９】
以下、下記の図を参照して本発明の実施例をさらに詳細に説明する。しかし、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
配列ＩＤリスト
配列ＩＤ番号１ ＝ Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号２ ＝ Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号３ ＝ Ｉｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号４ ＝ Ｉｍｐ．１０１０株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号５ ＝ PK/15株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号６ ＝ １９９７年１０月３日のフランスの最初の出願におけるＩｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
【実施例】
【００５０】
実施例１
ブタサーコウイルス（circovirus）株の培養および分離
組織標本はフランス、カナダおよび米国で子豚の肺およびリンパ節から集めた。これらの子豚は離乳後多機能萎縮症候群に典型的な臨床的徴候を示したものである。ウイルスを単離するため組織標本は死体解剖直後に−７０℃で冷凍した。
ウイルス単離のために無菌の乳鉢と乳棒を用いて無菌の砂で組織を粉砕し、イール（Earl）塩 （EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Workingham, UK）、ペニシリン（１００IU/ml）およびストレプトマイシン（１００μｍ／ｍｌ）を含む最小培地（ＭＥＭ−ＳＡ培地）中に約１５％の組織標本を含む懸濁液を調製した。粉砕物をＭＥＭ−ＳＡに溶解し、+４℃、３０００ｇで３０分間、遠心分離にかけて上澄みを回収した。
【００５１】
細胞培地の接種前に、１００μｌのクロロホルムを２ｍｌの各上澄みに添加し、室温で１０分間混合した。この混合物を超遠心分離管に移し、１０分間３０００ｇで遠心分離して上澄みを回収した。次いで、この上澄みをウイルス分離実験で種菌として用いた。
全てのウイルス単離研究はブタサーコウイルス(ＰＣＶ)、ペスチウイルス、ブタアデノウイルスおよびブタパルヴォウイルスに感染していないことが分かっているＰＫ／１５細胞培地で実施した（非特許文献２３）。
【非特許文献２３】Allan G. et al., Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64
【００５２】
ブタサーコウイルスの単離は下記方法によって実施した：
ＰＫ／１５細胞の単一層をトリプシン処理（トリプシン−versene混合物）によって集密的な培養から解離し、最終濃度が約４００，０００細胞/１ｍｌであるペスチウイルス（=ＭＥＭ−Ｇ培地）に感染していない１５％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ−ＳＡ培地に溶解した。次に、この細胞懸濁液の１０ｍｌの部分標本を２ｍｌの前記接種材料の部分標本と混合し、最終混合物を２つの２５ｃｍ2ファルコンフラスコに６ｍｌの容積に分取した。+３７℃で１８時間、１０％のＣｏ２を含む雰囲気下で培養した。
【００５３】
培養後、半集密的な単一層を３００ｍＭのＤ−グルコサミン（Cat # G48175、Sigma-Aldrich株式会社、Poole, UK）で処理し（非特許文献２４）、さらに３７℃で４８〜７２時間培養を続けた。この最終培養に続いて、２つのファルコンの１方を３回凍結／融解サイクルにかけた。残りのファルコンのＰＫ／１５細胞はトリプシン−versene溶液で処理し、２０ｍｌのＭＥＭ−Ｇ培地中に再懸濁し、４００，０００細胞／ｍｌ濃度で７５ｃｍ2ファルコン中に接種した。新しく接種されたフラスコは凍結／融解サイクル後に得られた対応する可溶化液５ｍｌを添加して「超感染」させた。
【非特許文献２４】Tischr I. et al., Arch. Virol., 1987 96 39-57
【００５４】
実施例２
免疫抗体法または切片上ハイブリッド形成法によるブタサーコウイルスを検出するためのするための細胞培地標本の調製
５ｍｌの容積の「超感染」した懸濁液を回収し、無菌で脱脂したカバーガラスを含む直径５５ｍｍのペトリ皿中に接種した。フラスコ中およびカバーガラス上で+３７℃で培養し、実施例１に記載のグルコサミンで処理した。カバーガラス上での培養はグルコサミン処理後２４〜４８時間で回収し、室温で１０分間アセトンを用いて、または４時間緩衝剤処理した１０％のホルムアルデヒドを用いて固定した。この固定後、全てのカバーガラスをシリカゲル上で−７０℃で貯蔵してから、ハイブリッド形成の研究および細胞免疫の研究に使用した。
【００５５】
実施例３
ハイブリッド形成法(in situ)によるＰＣＶ配列の検出法
ハイブリッド形成法(in situ)は病気のブタから集めた組織に対して実施し、ホルムアルデヒドで固定し、ウイルス単離（実施例２参照）用に接種した細胞培地の調整で用い、カバーガラスに固定した。
ＰＫ／１５ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）および感染性ニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡＶ）に対応する完全なゲノムプローブを用いた。１．７キロの塩基ペア（kbp）の挿入断片の形にクローン化されたＰＣＶゲノムの複製型を含むプラスミドpPCVI（Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circovirus, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227）をＰＣＶ固有ＤＮＡ源として用いた。２．３ｋｂｐの鳥サーコウイルスＣＡＶの複製型を含む鳥プラスミドpCAAIを負対照として用いた。２つのプラスミドのグリセロール源をアルカリ法（非特許文献２５）によってプラスミドの製造および精製で用い、これらはプローブ調製用のテンプレートとして用いた。ＰＣＶおよびＣＡＶの完全なゲノムを表すサーコウイルスプローブはメーカ推薦の方法で市販の非放射性ラベリングキット（"DIG DNA Labelling Kit"、Boehringer Mannheim, Lewis, UK）を用いて上記精製プラスミド（各プローブに１μｇ）およびヘキサヌクレオチドプライマーから製造した。
【非特許文献２５】Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, ColdSpringHarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988
【００５６】
ハイブリッド形成法(in situ)で使用する前に、プローブをジゴキシジェニンで標識化し、容積５０〜１００μｌの純水に溶解した。
パラフィンに包み、ホルムアルデヒドで固定した病気のブタの組織標本と、ホルムアルデヒドで固定した感染細胞培地の製剤を下記方法でＰＣＶ核酸検出のために調製した：
５μｍ厚の切片をパラフィンに包まれた組織塊から切り出し、濃度を次第に薄くしたアルコール溶液中で再水和した。ホルムアルデヒドで固定した組織切片および細胞培地を１５分間および５分間それぞれ５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝剤（ｐＨ７．６）を用いた０．５％のプロテナーゼＫ溶液中で+３７℃で培養した。次に、スライドガラスを加圧滅菌した蒸留水中の１％グリシン溶液中に３０秒配置し、０．０１ＭのＰＢＳ緩衝剤（燐酸緩衝食塩水）（ｐＨ７．２）で２度洗浄し、最後に無菌蒸留水で５分間洗浄した。スライドガラスを最後に外気で乾燥し、プローブと接触させた。
【００５７】
各組織／プローブ製剤を清潔な脱脂カバーガラスで被覆し、+９０℃の炉内に１０分間配置した後、氷塊と１分間接触させ、最後に+３７℃で１８時間培養した。次に、調整物を２Ｘクエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）緩衝剤（ｐＨ７．０）に短時間含浸した後、２ＸのＳＳＣ緩衝剤中で５分間、２回洗浄し、最後にＰＢＳ緩衝剤中で５分間、２回洗浄した。
洗浄後、調整物を０．１Ｍのマレイン酸、０．１５ＭのＮａＣＬ（ｐＨ７．５）（マレイン緩衝剤）の溶液中に１０分間含浸し、マレイン緩衝剤中の遮断試薬の１％溶液（Cat # 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK）中で+３７℃で２０分間培養した。
【００５８】
次に、調整物を遮断緩衝剤で希釈された抗ジゴキシジェニンモノクローナル性抗体（Boehringer Mannheim）の１／２５０溶液中で+３７℃で１時間培養し、ＰＢＳ中で洗浄し、最後に抗ネズミ免疫グロブリン抗体を用いて+３７℃で３０分間培養した。調整物をＰＢＳで洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ作用を室温で２０分間、ＰＢＳ中の０．５％水酸化ペルオキシド溶液で処理して遮断した。調整物を再度ＰＢＳ中で洗浄し、使用直前に調製した３−アミノ−９−ジエチルカルバゾル（ＡＥＣ）基質（CambrＩＤge Bioscience, CambrＩＤge, UK）で処理した。
最後に水道水で洗浄した後、調整物をヘマトキシリンで逆染色し、水道水で"青色化"して固定液（GVA Mount, CambrＩＤge Bioscience, CambrＩＤge, UK）で顕微鏡のカバーガラスに固定した。対照実験には無関係な負プローブ（ＣＡＶ）と正プローブ（ＰＣＶ）を病気のブタおよび病気ではないブタから得られた標本で使用することが含まれる。
【００５９】
実施例４
免疫抗体法によるＰＣＶの検出法
アセトンを用いて固定した全ての細胞倍地の最初のスクリーニングを貯蔵した大人のブタ血清の１／１００希釈を用いた間接免疫抗体法（ＩＩＦ）で実施した。この貯蔵血清は北アイルランドの２５匹の大人の雌ブタからの血清を含み、ＰＣＶ：ブタパルボウイルス、ブタアデノウイルスおよびＰＲＲウイルスを含む広範囲のブタのウイルスに対する抗体を含むことで知られている。血清（ＰＢＳで希釈）を細胞培地と+３７℃で１時間接触させた後、ＰＢＳ中で２回洗浄してＩＩＦを実施した。細胞培地をイソチオシアン酸フルオレセインに結合したＰＢＳで１／８０に希釈したウサギの抗ブタ免疫グロブリン抗体を用いて１時間染色し、ＰＢＳで洗浄し、グリセロール緩衝剤に固定し、紫外線下で顕微鏡観察した。
【００６０】
実施例５
病気のブタの組織における切片上ハイブリッド形成結果
フランス、カナダおよびカリフォルニアの多機能性萎縮病変を有する子豚から集めた組織から調製したＰＣＶゲノムプローブを用いた切片上ハイブリッド形成法から、研究された複数の病変部に病変部に関連するＰＣＶ核酸の存在が示された。これに対してＰＣＶゲノムプローブを病気でないブタから集めた組織に用い時またはＣＡＶプローブを病気のブタの組織に用いた時には何の徴候も見られなかった。ＰＣＶ核酸の存在はサイトプラズムおよびカリフォルニアの子豚の肺の病変部を浸潤する多数の単核細胞の核に認められた。ＰＣＶ核酸の存在は肺細胞、気管支および細気管支の上皮細胞および細動脈、細静脈およびリンパ管の内皮細胞にも見られた。
【００６１】
病気のフランスのブタではＰＣＶ核酸の存在は多数の濾胞性リンパ細胞のサイトプラズマおよびリンパ節の同様な毛細血管内の単核細胞に検出された。また、ＰＣＶ核酸は一次的合胞体にも検出された。これらの検出結果から、カリフォルニアのブタの肺、フランスのブタの腸間膜リンパ節およびカナダのブタの器官の標本を新規なブタサーコウイルス株の単離用に選択した。
【００６２】
実施例６
新規なブタサーコウイルス株の細胞培養結果と、免疫抗体法による検出
多機能性萎縮症候群の臨床的徴候を示すフランスの子豚（Imp. 1008株）、カリフォルニアの子豚（Imp. 999株）およびカナダの子豚（Imp. 1010株）から集めた標本を培養した細胞培地には細胞変性作用（ＣＰＥ）は全く見られなかった。しかし、アセトンを用いて固定した後、貯蔵されたブタのポリクローン化した血清を用いて培養した細胞培地から得られた製剤を免疫標識化することによって、カリフォルニアの子豚（Imp. 999株）の肺、フランスの子豚（Imp. 1008株）の縦隔リンパ節およびカナダの子豚（Imp. 1010株）の器官を用いて培養した培地中の多数の細胞に核蛍光が現れた。
【００６３】
実施例７
ブタサーコウイルスのゲノムＤＮＡの抽出
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）の新規な株の複製型を７２〜７６時間の培養後に回収した感染したＰＫ／１５細胞培地（実施例１参照）（７５ｃｍ2ファルコン１０個）を用いて調製し、ＣＡＶの複製型のクローン化で記載したグルコサミンで処理した（非特許文献２６）。この複製型の２本鎖ＤＮＡはHirt法（非特許文献２７）の変形法で抽出した(非特許文献２８に記載)。
【００６４】
【非特許文献２６】Todd. D. et al., Dot blot hybrＩＤization assay for chicken anaemia agent using a cloned DNA probe. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, 933-939
【非特許文献２７】Hirt B. Selective extraction of polyoma virus DNA from infected cell cultures, J. Mol. Biol. 1967, 36, 365-369
【非特許文献２８】Molitor T. W. et al. Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replicative form DNA of two virus isolates, Virology, 1984, 137, 241-254
【００６５】
実施例８
ブタサーコウイルス Imp.999株のゲノムの複製型の制限地図
Hirt法で抽出されたＤＮＡ（１〜５μｇ）をメーカの推薦する方法に従ってＳ１ヌクレアーゼ（Amersham）で処理し、各種制限酵素(Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK)で消化し、消化物をTodd達が記載の方法（非特許文献２９）で、臭化エチジウムの存在下、１．５％のアガロースゲル上で電気泳動で分離した。Imp.999株の培地から抽出したＤＮＡは独特のEcoRI部位、２つのSacI部位を有し、PstI部位は全く持たない。従って、この制限プロフィールは、逆にPstI部位を有し、EcoRI部位を全く持たないＰＣＶのＰＫ／１５株（非特許文献３０）が示す制限プロフィールとは異なっている。
【非特許文献２９】Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990, 71, 819-823
【非特許文献３０】Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus） DNA: affinities with plant circovirus, 1997, 78, 221-227
【００６６】
実施例９
ブタサーコウイルス Imp.999株のゲノムのクローン化
制限酵素EcoRIを有するＰＣＶ Imp.999株の２本鎖複製型の消化で生じた約１．８ｋｂｐの制限断片を市販のQiagen kit（QIAEXII Gel Extraction Kit, Cat # 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, UK）を用いて１．５％アガロースゲル（実施例３参照）上で電気泳動で分離した。次に、このEcoRI−EcoRI制限断片を標準クローン化法（非特許文献３１）によって予め同じ制限酵素を用いて消化し、脱リン酸したベクターpGEM-7（Promega, Medical Supply Company, Dublin, Ireland）と結合した。得られたプラスミドを標準的方法によってEscherichia coli JM109宿主株（Stratagene, La Jolla, USA）に変換した。同じく、ＰＣＶ Imp.999株のEcoRI−EcoRI制限断片をベクターpBlueScript SK+（Stratagene, La Jolla, USA）のEcoRI部位にクローン化した。各宿主株に対して得られたクローンの中から所望の大きさの断片を有する少なくとも２つのクローンを選択した。次に、得られたクローンを培養し、Imp.999株の完全なゲノムを含むプラスミドを標準的なプラスミド調製および精製法によって少容量（２ｍｌ）または大容量（２５０ｍｌ）に精製した。
【非特許文献３１】Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, ColdSpringHarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988
【００６７】
実施例１０
ＰＣＶ Imp.999株のゲノムＤＮＡの配列（２本鎖複製型）
２つのEcoRI Imp.999のクローン配列（クローンpGEM-7/2およびpGEM-7/8）をメーカー推薦の方法で配列キット"AmpliTaq DNA polymerase FS"（Cat # 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, UK）および"Applied BioSystems AB1373A automatic sequencing apparatus"を用いてSangerのジデオキシヌクレオチド法で決定した。最初の配列反応はM13「前方」および「後方」自在プライマーを用いて実施した。続く配列反応は「ＤＮＡ歩行」法によって実施した。その後の配列に必要なオリゴヌクレオチドはLife Technology（Inchinnan Business Park, Paisley, UK）によって合成された。
【００６８】
得られた配列は集め、MacDNASIS version 3.2のソフトウェア（Cat # 22020101, Appligene, Durham, UK）を用いて分析した。各種の読み取り枠を"National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD, USA)サーバーで入手可能なBLAST algorithmを用いて解析した。
クローンpGEM-7/8（配列ＩＤ番号６）から最初に得られた完全な配列（EcoRI-EcoRI）は図１３、１４に表してある。この配列はEcoRI部位のＧの後に任意に始まり、ヌクレオチドに関してはいくつか不安定な部分を有している。
次いで、この配列が最適化された。配列ＩＤ番号３（図９〜１４）はこの株の配列を全て表しており、EcoRI部位の始めすなわち最初のヌクレオチドとしてＧから任意に始まる。
【００６９】
同様の方法本発明の他の３つの分離株の配列を得た（配列ＩＤ番号１、２、４および図１〜４および図７、８参照）。これら４つの株のゲノムの大きさは下記の通りである：
Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１ １７６７個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５ １７６７個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．９９９ １７６８個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１０ １７６８個のヌクレオチド
【００７０】
実施例１１
ＰＣＶ Imp.999株の配列の分析
Imp.999株から得られた配列をGenBankのデータバンクに収容された配列との相同性テストで用いた結果、検出された有意な相同性はＰＫ／１５株の配列（寄託番号Y09921）（図９〜１２参照）と約７６％の相同性であった。
データバンク（NCBIサーバーのBLAST X algorithm）を用いた６つのフェーズでの配列の翻訳の相同性テストでは、アミノ酸レベルで、GenBank U49186配列でコードされるプラント（GenBank番号1841515）のサーコウイルスに類似のＢＢＴＢウイルスの理論的レプリカーゼに対応する読み取り枠と９４％の相同性を示すということが分かった。
ＰＣＶ Imp.999株から得られた配列と有意な相同性を示すものはデータバンクに収容された他の配列にはなかった。
多機能萎縮症候群の臨床的徴候を示すカリフォルニアの子豚から得られた病変部を用いて培養されたImp.999株から得られた配列のには解析から、この単分離ウイルスが新規なブタサーコウイルス株であることが明らかになった。
【００７１】
実施例１２
配列の比較分析
新規な４つのＰＣＶ株のヌクレオチド配列とＰＣＶのＰＫ／１５株の配列（図９〜１２）とを整列比較した。新規な４つの株と公知のＰＫ／１５株とに関する相同性マトリクスを作成した。結果は下記の通りである：
１：Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１
２：Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５
３：Ｉｍｐ．９９９
４：Ｉｍｐ．１０１０
５：ＰＫ／１５
【００７２】
【表１】
【００７３】
２つのフランス株Imp. 1011-48121とImp. 1011-48285の相同性は９９％以上（０．９９７７）である。２つの北米株Imp. 999とImp. 1010の相同性も９９％以上（０．９９４９）以上である。フランス株と北米株との相同性はわずかに９６％以上である。
これら全ての株とＰＫ／１５株との相同性は７５〜７６％の値に落ちる。
このことから、本発明の株はＰＫ／１５株に代表される種類とは異なる新規なブタサーコウイルスの代表であると言える。ＰＫ／１５がタイプＩを表すのに対し、ＰＭＷＳ症候群を示すブタから単離されたこの新規な株をタイプＩＩのブタサーコウイルスとよぶことにする。このタイプＩＩに属する株は実際には非常に離れた地理的領域から単離されたにもかかわらず、驚くべきヌクレオチド配列の相同性を示す。
【００７４】
実施例１３
新規なＰＣＶ株のゲノムによってコードされるプロテインの分析
Imp.1010単離株のヌクレオチド配列は多機能性萎縮症候群に関する他のサーコウイルス株を代表するものと考えられる。この配列をBLASTX algorithm（非特許文献３２）と、ソフトウェアMacVector 6.0（Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, UK）のプログラムとを組み合わせを用いて詳細に分析した。この配列（環状ゲノム）上には２０個のアミノ酸より大きいサイズの読み取り枠（またはＯＲＦ）が１３個検出できた。この１３個のＯＲＦは下記の通りである：
【非特許文献３２】Altschl et al. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410
【００７５】
【表２】
【００７６】
各ＯＲＦの開始位置および終了位置は株１０１０のゲノムの図７、８に表された配列（配列ＩＤ番号４）を参照する。ＯＲＦ１〜１３の端部は株９９９と同一である。これらは下記ＯＲＦ３と１３を除き、株１０１１−４８１２１および１０１１−４８２８５とも同一である：
ＯＲＦ３ １４３２−１５３９、センス、１０８ｎｔ、３５ａａ
ＯＲＦ１３ ３１４−１３７７、アンチセンス、７０５ｎｔ、２３４ａａ
これら１３のＯＲＦの内で４つがクローン化ウイルスＰＣＶ ＰＫ／１５のゲノム上に位置する類似のＯＲＦと有意な相同性を有する。多機能性萎縮症候群に関連するサーコウイルス単離株全てのゲノム上に存在する読み取り枠をそれぞれ分析した。これら４つのＯＲＦは下記の通り：
【００７７】
【表３】
【００７８】
各ＯＲＦの始めと終わりの位置は図７、８に表された配列（配列ＩＤ番号４）を参照する。ＯＲＦの大きさ（ヌクレオチド=ｎｔで）は終止コドンを含む。
ＰＣＶ Imp. 1010とＰＣＶ ＰＫ−１５の単離株のゲノム機構の比較からから、２つのウイルスのゲノムに保存された４つのＯＲＦが同定できた。下記の表は観察された相同性の程度を表す：
【００７９】
【表４】
【００８０】
最大の相同性はＯＲＦ４ Imp. 1010とＯＲＦ１ ＰＫ−１５との間に見られた（８６％相同性）。このプロテインはおそらくウイルスのＤＮＡ複製に含まれ、ウイルスの複製に必須であるため、このことは予想されることである（非特許文献３３）。
ＯＲＦ１３ Imp. 1010とＯＲＦ２ ＰＫ−１５との間の配列同一性は余り強くない（６６．４％の同一性）が、この２つのＯＲＦはそれぞれ、鳥サーコウイルスＣＡＶ（非特許文献３４）の主構造プロテインのＮ−末端領域と同一な良く保存されたＮ−末端基本領域を有している。さらに、ＯＲＦ７ Imp. 1010とＯＲＦ３ ＰＫ−１５との間と、ＯＲＦ１０ Imp. 1010とＯＲＦ４ ＰＫ−１５との間に大きな違いが見られた。ＰＣＶ ＰＫ−１５のＯＲＦ３とＯＲＦ４と比較すると、それぞれにImp. 1010分離株のＯＲＦ７とＯＲＦ１０のＣ−末端領域に欠失がある。最大の配列相同性はＯＲＦ７／ＯＲＦ３（重複部分の水準において６１．５％の相同性）とＯＲＦ１０／ＯＲＦ４（重複部分の水準において８３％の相同性）のＮ−末端領域の水準において見られる。
【非特許文献３３】Meehan et al., Gen. Virol. 1997,78; 221-227；Mankertz et al. J. Gen. Virol. 1998. 79. 381-384
【非特許文献３４】Meehan et al., Arch. Virol. 1992, 124. 301-319
【００８１】
ブタサーコウイルスのゲノム構造はゲノムが極端に高密度であるため非常に複雑であるように見える。主構造プロテインはおそらくブタサーコウイルスゲノムの同じ鎖上に位置する複数の読み取り枠間のスプライシングに由来するものである。従って、上記の表に記載の全ての読み取り枠（ＯＲＦ１〜ＯＲＦ１３）でタイプＩＩのブタサーコウイルスにコードされた抗原プロテインの全てまたは一部を表すことができ、これらは特有の病気および／またはワクチン接種に使用可能な抗原である。本発明はこれらのＯＲＦを少なくとも１つ含む全てのプロテインに関するものである。本発明は主としてＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１０またはＯＲＦ１３で構成されるプロテインに関するものである。
【００８２】
実施例１４
新規な株からクローンされたＰＣＶゲノムの感染特性
Imp. 999単離株の完全なゲノム（複製型）を含むプラスミドpGEM-7/8をMeehan B. 達に記載の方法によってＰＫ／１５細胞に形質移入した（非特許文献３５）。未感染のＰＫ／１５細胞に形質移入した後の最初の継代に対して実施された免疫抗体法の分析（実施例４参照）から、クローンpGEM-7/8のプラスミドは感染性ＰＣＶウイルスを誘導することが示された。感染性ＰＣＶの遺伝物質を含むクローンが利用可能になったことによってウイルス性ゲノムに任意の有用な処置をして無毒化ワクチンまたは組み換えワクチンを製造し、或いは診断キット用抗原を製造することができ、変成ＰＣＶウイルス（ブタで無毒化または欠失）を製造することができるようになった。
【非特許文献３５】Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome gragments. Arch. Virol. 1992, 124. 301-319
【００８３】
実施例１５
インビトロ培養によるＰＣＶ抗原の製造
感染していないＰＫ／１５細胞の培養およびウイルス処置を実施例１と同じ方法で実施した。感染細胞を３７℃で４日間培養後、トリプシン処理し、回収し、命名した。次の継代は１ｍｌにつき４００，０００個の感染細胞を接種した。
【００８４】
実施例１６
ウイルス性抗原の不活化
ウイルス培養の最後に、感染した細胞を回収し、超音波（Branson Sonifier）またはロータースタータータイプのコロイドミル（UltraTurrax, IKA）を用いて溶解した。次に、懸濁液を３７００ｇで３０分間、遠心分離した。このウイルス懸濁液を+３７℃で１８時間、０．１％エチレンイミンで、或いは、+２８℃で２４時間、β−プロピオラクトンで不活化した。ウイルス価が不十分な場合にはウイルス懸濁液を３００kDaのメンブレン（Millipore PTMK300）を用いた限外濾過で濃縮した。不活化ウイルス懸濁液は+５℃で貯蔵した。
【００８５】
実施例１７
有機油をベースにしたワクチン乳剤の製造
下記処方でワクチンを調製した：
不活化ブタサーコウイルス懸濁液 ： ２５０ｍｌ
MondanＩＤe（商標登録）ISA 70（SEPPIC) : ７５０ｍｌ
水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソン・タービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。
一回のワクチン投与量は約１０7.5のTCＩＤ50を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は０．５ｍｌ、筋肉経路の投与量は２ｍｌである。
【００８６】
実施例１８
代謝可能な油ベースのワクチン乳剤の製造
下記処方でワクチンを調製した：
不活化ブタサーコウイルス懸濁液： ２００ｍｌ
Dehymuls HRE 7（Henkel) : ６０ｍｌ
Radia 7204（Oleofina) : ７４０ｍｌ
水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソン・タービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。
一回のワクチン投与量は約１０7.5のTCＩＤ50を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は０．５ｍｌ、筋肉内経路の投与量は２ｍｌである。
【００８７】
実施例１９
過免疫血清（ＰＣＶ−Ｔ）、ＰＫ／１５から調製されたモノクローナル抗体Ｆ９９およびカナダ株から調製された過免疫血清（ＰＣＶ−Ｃ）で汚染されたアメリカおよびフランスのＰＣＶウイルス株およびＰＫ／１５の間接免疫抗体法の結果
【００８８】
【表５】
* 間接的免疫抗体法で正の反応を示した血清またはモノクローナル抗体の最後の希釈液の逆数。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＭＷＳ症候群（ブタ多機能萎縮症候群:Porcine Multisystemic Wasting Syndrome）（離乳後多機能萎縮症候群:Post-weaning Multisystemic Wasting Syndromeともいわれる）の原因となる新規なブタサーコウイルス（ＰＣＶ,Porcine Circo Virus)株と、その検出試薬および検出方法と、ワクチン接種方法と、ワクチンと、これらワクチンおよび試薬の製造方法とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）はブタ腎臓細胞株ＰＫ／１５中に無毒病原性汚染物質として最初に見い出された。このウイルスＰＣＶはチキン貧血症ウイルス（ＣＡＶ、Chicken Anaemia Virus）および嘴・羽症候群ウイルス（ＰＢＦＤＶ、Pscittacine Beak and Feather Disease Virus)とともにサーコウイルス群（Circoviridae）に分類された。これらのウイルスはエンベロプのない小さなウイルス（１５〜２４ｎｍ）で、その共通な特徴は１．７６〜２．３１ｋｂの環状一本鎖のＤＮＡからなるゲノムを含む点にある。このゲノムは約３０ｋＤａのポリペプチドをコード化すると考えられていた（非特許文献１）が、最近の研究で、複雑な転写がわかってきた（非特許文献２）。さらに、上記３種類のサーコウイルス（circovirus）はそのヌクレオチド配列に有意な相同性はなく、また、共通の抗原決定基もない。
【０００３】
ＰＫ／１５細胞由来のＰＣＶは病原性ではないと考えられる。この配列は（非特許文献３）が明らかにしている。ＰＣＶ株が病原性で、ＰＭＷＳ症候群と関連があるかもしれないと考えられるようになったのはほんの最近のことである（非特許文献４、５）。Nayer達はブタＰＣＶのＤＮＡがＰＭＷＳ症候群を示すことをＰＣＲ法を用いて見い出した。しかし、野生型ＰＣＶ株は単離または精製されていない。
【０００４】
カナダ、米国およびフランスで見られるＰＭＷＳ症候群の臨床的な特徴は、体重を徐々に失い、頻呼吸症、呼吸困難および黄疸等を発症することである。病理的な面では、リンパ性または肉芽種性浸潤、リンパ節腫脹、まれには肝炎およびリンパ性または肉芽種性腎炎を発症する（非特許文献６〜１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Todd et al., Arch Virol 1991, 117; 129-135
【非特許文献２】Meehan B. M. et al., 1997,78; 221-227
【非特許文献３】"B. M. Meehan et al., J. Gen. Virol 1997 (78) 221-227"
【非特許文献４】Gupi P. S. Nayar et al., Can.Vet. J, Vol. 38, 1997: 385-387
【非特許文献５】Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501
【非特許文献６】Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501；
【非特許文献７】La Semaine Veterinaire 1996 (834)、
【非特許文献８】La Semaine Veterinaire No. 26；
【非特許文献９】La Semaine Veterinaire 1997 (857)：５４；
【非特許文献１０】Gupi P. S. Nayar et al., Can.Vet. J, Vol. 38, 1997: 385-387
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願人は、カナダ、米国（カリフォルニア）およびフランス（ブリタニー）の農場から得た肺または神経節の標本から５つの新規なＰＣＶ株（以下、本発明のサーコウイルス（circovirus）という）を単離することに成功した。これらのウイルスはＰＭＷＳ症候群のブタの病変部に検出されるが、健康なブタには検出されない。
【０００７】
本出願人はさらに、これらの４種の株（カナダおよび米国の株）と２種のフランスの株のゲノムの配列決定した。これらの株はヌクレオチドレベルで互いに非常に強い相同性（９６％以上超）を示す、一方、ＰＫ／１５株ははるかに弱い相同性（約７６％）しか示さない。従って、新規のタイプのブタサーコウイルス （circovirus）を代表するものと考えられ、ＰＫ／１５に代表されるタイプＩ（第Ｉ群）に対して、本発明の新規な株はタイプＩＩ（第ＩＩ群）とよぶことにする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の対象は単離または精製物の形をした上記定義の第ＩＩ群のブタサーコウイルス（circovirus）にある。
本発明はさらに、生理標本または組織標本、特にＰＭＷＳ症候群のブタの病変部の標本から実施例に記載した方法で単離可能なブタのサーコウイルス（circovirus）、特にＩＩ型サーコウイルスを提供する。
【０００９】
本発明の対象はＥＣＡＣＣ（European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom）に寄託された下記の５種の株の精製物にある：
１９９７年１０月２日木曜日寄託：
寄託番号第Ｖ９７１００２１９号（以下、Ｉｍｐ．１００８ＰＣＶという）
寄託番号第Ｖ９７１００２１８号（以下、Ｉｍｐ．１０１０ＰＣＶという）
寄託番号第Ｖ９７１００２１７号（以下、Ｉｍｐ．９９９ＰＣＶという）
１９９８年１月１６日金曜日寄託：
寄託番号第Ｖ９８０１１６０８号（以下、Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５という）
寄託番号第Ｖ９８０１１６０９号（以下、Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１という）
【００１０】
本発明はさらに、病気のブタから単離したブタサーコウイルス（circovirus）および／または本発明株と有意な血清学的類似性を有するサーコウイルスおよび／またはＰＫ／１５のＰＣＶとハイブリダイゼーションが全く無く、厳密な条件下で本発明株とのクロスハイブリダイゼーションを有するサーコウイルスに関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１株のゲノムのＤＮＡ配列
【図２】図１の続き
【図３】Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５株のゲノムのＤＮＡ配列
【図４】図３の続き
【図５】Ｉｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
【図６】図５の続き
【図７】Ｉｍｐ．１０１０株のゲノムのＤＮＡ配列
【図８】図７の続き
【図９】PCV PK/15株の配列と図１〜８の４つの配列との整列化
【図１０】図９の続き
【図１１】図１０の続き
【図１２】図１１の続き
【図１３】１９９７年１０月３日のフランスの最初の出願におけるＩｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
【図１４】図１３の続き
【図１５】PK/15株の配列と図１３、１４の配列との整列化
【図１６】図１５の続き
【図１７】図１６の続き
【図１８】図１７の続き
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ウイルス性株の増殖、特に全抗原（例えばウイルス）および／またはサブユニット（例えばポリペプチド）の製造は、ＰＭＷＳ症候群のブタの病変部の生理学標本または組織標本から単離されたウイルス株、特にブタ腎臓株細胞を汚染されていない細胞株（特にＰＣＶ、ペスチウイルス、ブタアデノウイルスおよびブタパルボウイルスに汚染されていないＰＫ／１５細胞）で増殖するのが有利である。
これらの単離株がＰＫ／１５細胞での培養で非常に生産的であり、ウイルスまたは抗原の製造、特に不活性化ワクチンの製造に有利であるということは驚くべきことであり、予想できなかったことである。
【００１３】
従って、本発明の他の対象は本発明のサーコウイルス（circovirus）または病変部細胞、特にＰＭＷＳ症候群のブタの細胞株の生理学標本または組織標本から単離される任意のブタサーコウイルスの少なくとも１つに感染された細胞をインビトロで培養した細胞株、特にＰＫ／１５細胞で継代した後に単離されるサーコウイルス（circovirus）の調製方法にある。
【００１４】
本発明のさらに別の対象は上記の培養抽出物または上澄み（必要に応じて一般的な方法でさらに精製されていてもよい）と、一般にインビトロの培養から得られる任意の抗原製剤にある。
【００１５】
本発明のさらに別の対象は免疫抗原性の有効成分と、少なくとも１つの上記定義の抗原を含むワクチンにある。
【００１６】
本発明のさらに別の対象は、無毒化した生全ワクチンをベースとする免疫抗原性の有効成分またはこの有効成分を精製して得られるワクチンにある。この無毒化は通常の方法、例えば細胞での継代、好ましくはブタ細胞、特にＰＫ／１５細胞等の株細胞での継代（特に５０〜１５０、特に１００回の継代）で行なわれる。これらのワクチンは一般に獣医学上許容される賦形剤または希釈液と、さらには必要に応じて添加される獣医学上許容される補助剤およびフリーズドライ安定剤とを含むことができる。
上記の抗原製剤およびワクチンは１０3〜１０6のＴＣＩＤ５０を有するのが好ましい。
【００１７】
本発明のさらに別の対象は、不活化した本発明のサーコウイルス抗原をベースにした免疫抗原性有効成分またはワクチンにある。このワクチンは獣医学上許容される賦形剤または希釈液、さらには必要に応じて添加される獣医学上許容される補助剤を含むことができる。
【００１８】
本発明のサーコウイルス（断片の形でもよい）は当業者に公知の方法で不活性化される。この不活性化は化学的方法、例えば抗原をホルムアルデヒド（ホルマリン）、パラフォルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミンまたはその誘導体等の試薬で処理して行なうことができる。好ましい不活性化法は試薬、特にエチレンイミンまたはβ−プロピオラクトンで処理する方法である。
【００１９】
本発明の不活性化ワクチンにはアジュバンドを加え、当業者に公知の方法でエマルジョンの形、例えば油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョン等の乳剤の形にするのが好ましい。一般的なアジュバンド化合物を有効成分に添加してアジュバンド処理することもできる。
【００２０】
使用可能な補剤（アジュバンド）としては例えば水酸化アルミニウム、サポニン（例えば非特許文献１１参照）、Avridine（商標登録）（非特許文献１２参照）、DDA（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、非特許文献１３参照）、ポリホスファゼン（非特許文献１４参照）、さらには有機油、スクアラン（例えばＳＰＴ乳剤、非特許文献１５参照）、スクアレーン（例えばＭＦ５９、非特許文献１６参照）をベースとする水中油乳剤または代謝可能な油をベースとする油中水乳剤（好ましくは特許文献１、２に記載の乳剤を挙げることができる。補剤の組み合わせ、例えば乳剤AvrＩＤine（商標登録）またはDDAとの組み合せた選択することもできる。
これらのワクチンは１０6〜１０8のＴＣＩＤ５０を有するのが好ましい。
【００２１】
【非特許文献１１】Quillja saponinまたはQuil A；"Vaccin Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Michael F. Powel と Mark J. Newman編、Plennum Press, New-York and London, p.210"
【非特許文献１２】Vaccine Design p. 148
【非特許文献１３】Vaccine Design p. 157
【非特許文献１４】Vaccine Design p. 204
【非特許文献１５】Vaccine Design p. 147
【非特許文献１６】Vaccine Design p. 183
【特許文献１】国際特許第WO-A-９４−２００７１号公報
【特許文献２】米国特許第５，４２２，１０９号明細書
【００２２】
生ワクチン補剤は不活性化ワクチン用のものから選択するこができる。乳剤が好ましい。不活性化ワクチン用のものには特許文献３に記載のものも加えることができる。
【特許文献３】国際特許第WO-A-９４−１６６８１号公報
【００２３】
凍結安定剤としては例えばＳＰＧＡ（非特許文献１７）、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストランまたはグルコース等の炭水化物、アルブミンまたはカゼイン等のプロテイン、これらの化合物の誘導体またはアルカリ金属燐酸塩等の緩衝剤を挙げることができる。
【非特許文献１７】Bovarnik et al., J. Bacteriology 59, 509, 950
【００２４】
本件出願人は配列ＩＤ番号１〜４(必要な場合にはさらに配列ＩＤ番号６)で識別される４つの単離株のゲノムを得た。
【００２５】
本発明のさらに他の対象はこれらの配列の一部または全てを含むＤＮＡ断片にある。本発明がこれと均等な配列すなわち上記配列の株の特徴または上記配列によりコードされるポリペプチドの機能を変更しない配列も含むものであるということは当然である。また、コードの欠失(degenerescence)により変化した配列も含むということは理解できよう。
【００２６】
本発明はさらに、厳密な条件下で上記配列と混成可能であり、および／または、上記定義の第ＩＩ群に属する本発明株と高い相同性を有するという意味で均等な配列も含むものである。
【００２７】
これらの配列およびその断片は適当なベクターを用いてインビトロまたはインビボでポリペプチドの発現に有利に用いることができる。
【００２８】
特に、これに使用可能な本発明のＤＮＡ断片を形成する読み取り枠はタイプＩＩのサーコウイルスのゲノム配列で同定されている。本発明は、少なくともこれらの読み取り枠（対応するアミノ酸配列）の一つを含む全てのポリペプチドに関するものである。特に、本発明は主としてＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１０またはＯＲＦ１３で構成されるプロテインに関するものである。
【００２９】
インビトロのサブユニットを発現するための発現手段としてはE. coliまたはバキュロウイルス（特許文献３）を用いるのが好ましい。
【特許文献３】米国特許第４，７４５，０５１号明細書
【００３０】
上記の単数または複数のコード配列またはその断片をバキュロウイルスゲノム（例えばAutographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV）に組み込み、次いで、それを昆虫細胞、例えばSpodoptera fruigiperda Sf9（寄託番号ATCC CRL 1711）で増殖される。また、イースト（例えば酵母)またはほ乳類細胞（例えばCHO、BHK）等の真核細胞でサブユニットを製造することもできる。
【００３１】
本発明のさらに他の対象は、これらの発現手段によってインビトロで製造され、必要に応じて一般的な方法で精製されたポリペプチドにある。本発明のさらに他の対象は、このようにして得られた少なくとも１つのポリペプチドまたはその断片を獣医学上許容される賦形剤または希釈液(必要に応じて獣医学上許容される補助剤をさらに含むことができる)中に含むサブユニットワクチンにある。
【００３２】
組み換え生ワクチンの製造時にインビボ発現させるには単数または複数のコード化配列またはその断片を単数または複数のポリペプチドを発現できる条件下で適当な発現ベクターに挿入する。適切なベクターとしては好ましくはブタで増殖可能でブタに対しては非病原性の生ウイルスを当業者に周知の方法で使用することができる。特に、アウジェスキー病ウイルス、ブタアデノウイルス等のブタヘルペスウイルス、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ブタポックスウイルス等を用いることができる（特許文献４〜７）。
【特許文献４】国際特許第WO-A-９０−１１０９２号公報
【特許文献５】国際特許第WO-A-９３−１９８１３号公報
【特許文献６】国際特許第WO-A-９４−２１７９７号公報
【特許文献７】国際特許第WO-A-９５−２０６６０号公報
【００３３】
従って、本発明の他の対象は、このようにして精製されたベクターと、組み換え生ワクチンまたはプラスミドワクチン（ポリヌクレオチドまたはＤＮＡワクチン）にある。これらのワクチンは獣医学上許容される賦形剤または希釈液を含むことができる。
本発明のワクチン（無毒化、不活性化、サブユニット、組み換えおよびプラスミド生ワクチン）は本発明の一つまたは複数（２、３つ）のサーコウイルスから成る一つまたは複数の有効成分（抗原）を含むことができる。
【００３４】
本発明の上記各種ワクチンはブタの他の病原体に対するワクチンと組み合わせることができる。特にＰＭＳＷ症候群に関連する病原体に対するワクチンと組み合わせることができる。本発明のワクチン、特に不活性化ワクチンはブタの他の病原体に対応する他のワクチン価を含むことができる。これらのブタの他の病原体の中では好ましくはＰＲＲＳ（Porcine Reproductory and Respiratory Syndrome :ブタ生殖器および呼吸器症候群）（特許文献８〜１０および非特許文献１８を参照）および／またはMycoplasma hyopneumonia（特許文献１１〜１３および非特許文献１９を参照）を挙げることができる。他の重要なワクチン価の中ではアクチノバシラス胸膜肺炎菌、E. coli、ブタ萎縮鼻炎（porcine Atrophic Rhinitis）、仮性狂犬病（アウジェスキー病）、ブタコレラ、ブタインフルエンザを挙げることができる。
【００３５】
【特許文献８】国際特許第WO-A-９３−０７８９８号公報
【特許文献９】国際特許第WO-A-９４−１８３１１号公報
【特許文献１０】フランス国特許第２，７０９，９６６号公報
【非特許文献１８】"C. Chareyre 他、IPVS Congress,Birmingham, England, 5-9 July 1998, p. 139の議事録"
【特許文献１１】欧州特許第５９７，８５２号
【特許文献１２】第５５０，４７７号
【特許文献１３】第５７１，６４８号
【非特許文献１９】"第１５回IPVS CongressのO. Martinon 達、p. 157, 284, 285およびG. Reynaud達、p. 150"
【００３６】
本発明のさらに他の対象は、本発明のサーコウイルスに対してブタの免疫反応を誘発する方法、特にブタに有効なワクチン接種方法にある。
このワクチン接種方法では上記ワクチンを一回または複数回にわたってブタに投与する。同じワクチン接種プロトコルで複数種の前記ワクチンを組み合わせることも可能である。
このワクチンは大人のブタだけでなく、若いブタまたは妊娠中の雌に対して投与することができる。妊娠中の雌にワクチン接種することによって新生児に受動免疫（母親抗体：maternal antibody）を与えることができる。
【００３７】
本発明はさらに、本発明のブタサーコウイルスの存在を診断する方法を提供する。従って、本発明の他の対象は診断テストと下記試薬を用いたテスト方法にある。
互いに異なるサーコウイルスの配列が分かると共通の配列を定義でき、公知の全てのブタサーコウイルスを識別できる試薬を製造することができる。
当業者は特定の診断を実施するために対応するＰＫ／１５サーコウイルスの配列とほとんどまたは全く相同性を示さない領域に対応する配列の断片を選択することができる。
【００３８】
配列を並べることによって当業者は所望の試薬を選択することができる。
第１の試薬は上記ＤＮＡ配列およびその断片で構成され、それは周知のハイブリッド法またはＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）法によってプローブまたはプライマーとして用いられる。
第２の試薬は上記ウイルスの配列によってコードされたポリペプチドまたはベクター（前記参照）を用いて発現されたまたは公知のペプチド合成法によって化学的に合成されたポリペプチドで構成される。
第３および第４の試薬はウイルス、ポリペプチドまたは断片、抽出物またはＤＮＡ配列でコードされたものから一般的な方法で製造可能なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体からなる。
【００３９】
上記の第２、第３および第４の試薬は本発明の対象である診断法で用いることができる。この診断法では検査するブタから得られた生理学的液体標本（血液、血漿、血清等）または組織標本（神経節、肝臓、肺、腎臓等）中に本発明のサーコウイルスに特有な抗原の存在を調べて抗原自体を検出するか、この抗原に対する抗体を検出する。
【００４０】
本発明の抗原および抗体は公知の任意の臨床診断法で用いることができるが、
上記の抗原および抗体を獣医、ブリーダーまたは動物の飼い主が直接現場で使用可能な方法で用いるのが好ましい。臨床技術および現場技術を有する当業者は上記の抗原および／または抗体を試薬として用いることができる。
【００４１】
本発明で用いるのに好ましい診断法はウェスタンブロット法、免疫抗体法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）および免疫クロマトグラフィーである。
免疫クロマトグラフィー法に関しては特に非特許文献２０と特許文献１４〜２９を参照することができる。
【００４２】
【非特許文献２０】"Robert F. Zulk et al., Clin. Chem. 31/7, 1144-1150 (1985) "
【特許文献１４】国際特許第WO-A-８８−０８５３４号公報
【特許文献１５】国際特許第WO-A-９１−１２５２８号公報
【特許文献１６】欧州特許第２９１，１７６号公報
【特許文献１７】欧州特許第２９９，４２８号公報
【特許文献１８】欧州特許第２９１，１９４号公報
【特許文献１９】欧州特許第２８４，２３２号公報
【特許文献２０】米国特許第５，１２０，６４３号明細書
【特許文献２１】米国特許第５，０３０，５５８号明細書
【特許文献２２】米国特許第５，２６６，４９７号明細書
【特許文献２３】米国特許第４，７４０，４６８号明細書
【特許文献２４】米国特許第５，２６６，４９７号明細書
【特許文献２５】米国特許第４，８５５，２４０号明細書
【特許文献２６】米国特許第５，４５１，５０４号明細書
【特許文献２７】米国特許第５，１４１，８５０号明細書
【特許文献２８】米国特許第５，２３２，８３５号明細書
【特許文献２９】米国特許第５，２３８，６５２号明細書
【００４３】
標本中に特有な抗体は間接法、競合法または置換法によって検出するのが好ましい。そのためには抗原自体を診断試薬として用いるか、抗体の認識を保持する抗原断片を診断試薬として用いる。標識化はペルオキシダーゼを用いた標識化または特殊な標識化、好ましくはコロイド性金を用いた標識化が有利である。
標本中の抗原自体をこの抗原に特有な標識化した抗体を用いて検出することもできる。標識化は上記のものが有利である。
競合法または置換法または抗原自体の検出に用いられる抗原に特有な抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナール抗体、これら抗体の断片、好ましくはFabまたはF(ab)'2断片であるである。
【００４４】
本発明はさらに、上記抗体を生理学的液体標本または組織標本中の抗原の検出またはこれら標本または試験片中に存在する抗体の検出のための診断試薬として使用可能な本発明抗原に特有のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の製造方法に関するものである。本発明はものでさらに、これらの抗体の免疫機能を有する断片、特にF(ab)およびF(ab)'2断片は本発明に含まれる。
抗体は一般的な方法で製造することができる。特に非特許文献２１または非特許文献２２を参照することができる。これらの内容は本件明細書の一部を成す。
特に、抗原またはその断片の少なくとも１つで免疫化されたネズミの脾臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合（この方法自体は公知）することができる。
【００４５】
【非特許文献２１】"Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, USA"
【非特許文献２２】"J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Inc.,"
【００４６】
本発明の他の対象は上記抗原に特有なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、特にネズミまたはウサギの抗体の純粋または部分的に純粋な製剤或いは粗原料からなる製剤にある。
【００４７】
本発明では上記のＤＮＡ配列を基にした所望のエピトープ（ワクチン用エピトープまたは診断用エピトープ）を決めることができる。本発明のサーコウイルスのゲノムのＤＮＡ配列から、エピトープを決めることができる。当業者は公知の方法、例えば適切なコンピュータプログラムまたはPEPSCANを用いてエピトープを求めることができる。このエピトープはプロテインの免疫優性領域であり、プロテインの表面に露出した領域である。このエピトープは抗体によって認識され、診断の分野において診断目的の抗体の調製または診断試薬として用いられる対応するペプチドの製造に用いられる。
少なくともエピトープは８〜９個のアミノ酸を有するペプチドである。一般には最小でも１３〜２５個のアミノ酸が好ましい。
【００４８】
当業者は一つまたは複数の上記技術および利用可能なその他の技術を用いて診断用のペプチドまたは抗体で用いるエピトープを見付けることができる。
従って、本発明の他の対象はこの抗原および／またはこの抗原に特有なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む診断キットにある。これらは特に、前記の診断技術による診断キットである。
【００４９】
以下、下記の図を参照して本発明の実施例をさらに詳細に説明する。しかし、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
配列ＩＤリスト
配列ＩＤ番号１ ＝ Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号２ ＝ Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号３ ＝ Ｉｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号４ ＝ Ｉｍｐ．１０１０株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号５ ＝ PK/15株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号６ ＝ １９９７年１０月３日のフランスの最初の出願におけるＩｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
【実施例】
【００５０】
実施例１
ブタサーコウイルス（circovirus）株の培養および分離
組織標本はフランス、カナダおよび米国で子豚の肺およびリンパ節から集めた。これらの子豚は離乳後多機能萎縮症候群に典型的な臨床的徴候を示したものである。ウイルスを単離するため組織標本は死体解剖直後に−７０℃で冷凍した。
ウイルス単離のために無菌の乳鉢と乳棒を用いて無菌の砂で組織を粉砕し、イール（Earl）塩 （EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Workingham, UK）、ペニシリン（１００IU/ml）およびストレプトマイシン（１００μｍ／ｍｌ）を含む最小培地（ＭＥＭ−ＳＡ培地）中に約１５％の組織標本を含む懸濁液を調製した。粉砕物をＭＥＭ−ＳＡに溶解し、+４℃、３０００ｇで３０分間、遠心分離にかけて上澄みを回収した。
【００５１】
細胞培地の接種前に、１００μｌのクロロホルムを２ｍｌの各上澄みに添加し、室温で１０分間混合した。この混合物を超遠心分離管に移し、１０分間３０００ｇで遠心分離して上澄みを回収した。次いで、この上澄みをウイルス分離実験で種菌として用いた。
全てのウイルス単離研究はブタサーコウイルス(ＰＣＶ)、ペスチウイルス、ブタアデノウイルスおよびブタパルヴォウイルスに感染していないことが分かっているＰＫ／１５細胞培地で実施した（非特許文献２３）。
【非特許文献２３】Allan G. et al., Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64
【００５２】
ブタサーコウイルスの単離は下記方法によって実施した：
ＰＫ／１５細胞の単一層をトリプシン処理（トリプシン−versene混合物）によって集密的な培養から解離し、最終濃度が約４００，０００細胞/１ｍｌであるペスチウイルス（=ＭＥＭ−Ｇ培地）に感染していない１５％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ−ＳＡ培地に溶解した。次に、この細胞懸濁液の１０ｍｌの部分標本を２ｍｌの前記接種材料の部分標本と混合し、最終混合物を２つの２５ｃｍ2ファルコンフラスコに６ｍｌの容積に分取した。+３７℃で１８時間、１０％のＣｏ２を含む雰囲気下で培養した。
【００５３】
培養後、半集密的な単一層を３００ｍＭのＤ−グルコサミン（Cat # G48175、Sigma-Aldrich株式会社、Poole, UK）で処理し（非特許文献２４）、さらに３７℃で４８〜７２時間培養を続けた。この最終培養に続いて、２つのファルコンの１方を３回凍結／融解サイクルにかけた。残りのファルコンのＰＫ／１５細胞はトリプシン−versene溶液で処理し、２０ｍｌのＭＥＭ−Ｇ培地中に再懸濁し、４００，０００細胞／ｍｌ濃度で７５ｃｍ2ファルコン中に接種した。新しく接種されたフラスコは凍結／融解サイクル後に得られた対応する可溶化液５ｍｌを添加して「超感染」させた。
【非特許文献２４】Tischr I. et al., Arch. Virol., 1987 96 39-57
【００５４】
実施例２
免疫抗体法または切片上ハイブリッド形成法によるブタサーコウイルスを検出するためのするための細胞培地標本の調製
５ｍｌの容積の「超感染」した懸濁液を回収し、無菌で脱脂したカバーガラスを含む直径５５ｍｍのペトリ皿中に接種した。フラスコ中およびカバーガラス上で+３７℃で培養し、実施例１に記載のグルコサミンで処理した。カバーガラス上での培養はグルコサミン処理後２４〜４８時間で回収し、室温で１０分間アセトンを用いて、または４時間緩衝剤処理した１０％のホルムアルデヒドを用いて固定した。この固定後、全てのカバーガラスをシリカゲル上で−７０℃で貯蔵してから、ハイブリッド形成の研究および細胞免疫の研究に使用した。
【００５５】
実施例３
ハイブリッド形成法(in situ)によるＰＣＶ配列の検出法
ハイブリッド形成法(in situ)は病気のブタから集めた組織に対して実施し、ホルムアルデヒドで固定し、ウイルス単離（実施例２参照）用に接種した細胞培地の調整で用い、カバーガラスに固定した。
ＰＫ／１５ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）および感染性ニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡＶ）に対応する完全なゲノムプローブを用いた。１．７キロの塩基ペア（kbp）の挿入断片の形にクローン化されたＰＣＶゲノムの複製型を含むプラスミドpPCVI（Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circovirus, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227）をＰＣＶ固有ＤＮＡ源として用いた。２．３ｋｂｐの鳥サーコウイルスＣＡＶの複製型を含む鳥プラスミドpCAAIを負対照として用いた。２つのプラスミドのグリセロール源をアルカリ法（非特許文献２５）によってプラスミドの製造および精製で用い、これらはプローブ調製用のテンプレートとして用いた。ＰＣＶおよびＣＡＶの完全なゲノムを表すサーコウイルスプローブはメーカ推薦の方法で市販の非放射性ラベリングキット（"DIG DNA Labelling Kit"、Boehringer Mannheim, Lewis, UK）を用いて上記精製プラスミド（各プローブに１μｇ）およびヘキサヌクレオチドプライマーから製造した。
【非特許文献２５】Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, ColdSpringHarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988
【００５６】
ハイブリッド形成法(in situ)で使用する前に、プローブをジゴキシジェニンで標識化し、容積５０〜１００μｌの純水に溶解した。
パラフィンに包み、ホルムアルデヒドで固定した病気のブタの組織標本と、ホルムアルデヒドで固定した感染細胞培地の製剤を下記方法でＰＣＶ核酸検出のために調製した：
５μｍ厚の切片をパラフィンに包まれた組織塊から切り出し、濃度を次第に薄くしたアルコール溶液中で再水和した。ホルムアルデヒドで固定した組織切片および細胞培地を１５分間および５分間それぞれ５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝剤（ｐＨ７．６）を用いた０．５％のプロテナーゼＫ溶液中で+３７℃で培養した。次に、スライドガラスを加圧滅菌した蒸留水中の１％グリシン溶液中に３０秒配置し、０．０１ＭのＰＢＳ緩衝剤（燐酸緩衝食塩水）（ｐＨ７．２）で２度洗浄し、最後に無菌蒸留水で５分間洗浄した。スライドガラスを最後に外気で乾燥し、プローブと接触させた。
【００５７】
各組織／プローブ製剤を清潔な脱脂カバーガラスで被覆し、+９０℃の炉内に１０分間配置した後、氷塊と１分間接触させ、最後に+３７℃で１８時間培養した。次に、調整物を２Ｘクエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）緩衝剤（ｐＨ７．０）に短時間含浸した後、２ＸのＳＳＣ緩衝剤中で５分間、２回洗浄し、最後にＰＢＳ緩衝剤中で５分間、２回洗浄した。
洗浄後、調整物を０．１Ｍのマレイン酸、０．１５ＭのＮａＣＬ（ｐＨ７．５）（マレイン緩衝剤）の溶液中に１０分間含浸し、マレイン緩衝剤中の遮断試薬の１％溶液（Cat # 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK）中で+３７℃で２０分間培養した。
【００５８】
次に、調整物を遮断緩衝剤で希釈された抗ジゴキシジェニンモノクローナル性抗体（Boehringer Mannheim）の１／２５０溶液中で+３７℃で１時間培養し、ＰＢＳ中で洗浄し、最後に抗ネズミ免疫グロブリン抗体を用いて+３７℃で３０分間培養した。調整物をＰＢＳで洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ作用を室温で２０分間、ＰＢＳ中の０．５％水酸化ペルオキシド溶液で処理して遮断した。調整物を再度ＰＢＳ中で洗浄し、使用直前に調製した３−アミノ−９−ジエチルカルバゾル（ＡＥＣ）基質（CambrＩＤge Bioscience, CambrＩＤge, UK）で処理した。
最後に水道水で洗浄した後、調整物をヘマトキシリンで逆染色し、水道水で"青色化"して固定液（GVA Mount, CambrＩＤge Bioscience, CambrＩＤge, UK）で顕微鏡のカバーガラスに固定した。対照実験には無関係な負プローブ（ＣＡＶ）と正プローブ（ＰＣＶ）を病気のブタおよび病気ではないブタから得られた標本で使用することが含まれる。
【００５９】
実施例４
免疫抗体法によるＰＣＶの検出法
アセトンを用いて固定した全ての細胞倍地の最初のスクリーニングを貯蔵した大人のブタ血清の１／１００希釈を用いた間接免疫抗体法（ＩＩＦ）で実施した。この貯蔵血清は北アイルランドの２５匹の大人の雌ブタからの血清を含み、ＰＣＶ：ブタパルボウイルス、ブタアデノウイルスおよびＰＲＲウイルスを含む広範囲のブタのウイルスに対する抗体を含むことで知られている。血清（ＰＢＳで希釈）を細胞培地と+３７℃で１時間接触させた後、ＰＢＳ中で２回洗浄してＩＩＦを実施した。細胞培地をイソチオシアン酸フルオレセインに結合したＰＢＳで１／８０に希釈したウサギの抗ブタ免疫グロブリン抗体を用いて１時間染色し、ＰＢＳで洗浄し、グリセロール緩衝剤に固定し、紫外線下で顕微鏡観察した。
【００６０】
実施例５
病気のブタの組織における切片上ハイブリッド形成結果
フランス、カナダおよびカリフォルニアの多機能性萎縮病変を有する子豚から集めた組織から調製したＰＣＶゲノムプローブを用いた切片上ハイブリッド形成法から、研究された複数の病変部に病変部に関連するＰＣＶ核酸の存在が示された。これに対してＰＣＶゲノムプローブを病気でないブタから集めた組織に用い時またはＣＡＶプローブを病気のブタの組織に用いた時には何の徴候も見られなかった。ＰＣＶ核酸の存在はサイトプラズムおよびカリフォルニアの子豚の肺の病変部を浸潤する多数の単核細胞の核に認められた。ＰＣＶ核酸の存在は肺細胞、気管支および細気管支の上皮細胞および細動脈、細静脈およびリンパ管の内皮細胞にも見られた。
【００６１】
病気のフランスのブタではＰＣＶ核酸の存在は多数の濾胞性リンパ細胞のサイトプラズマおよびリンパ節の同様な毛細血管内の単核細胞に検出された。また、ＰＣＶ核酸は一次的合胞体にも検出された。これらの検出結果から、カリフォルニアのブタの肺、フランスのブタの腸間膜リンパ節およびカナダのブタの器官の標本を新規なブタサーコウイルス株の単離用に選択した。
【００６２】
実施例６
新規なブタサーコウイルス株の細胞培養結果と、免疫抗体法による検出
多機能性萎縮症候群の臨床的徴候を示すフランスの子豚（Imp. 1008株）、カリフォルニアの子豚（Imp. 999株）およびカナダの子豚（Imp. 1010株）から集めた標本を培養した細胞培地には細胞変性作用（ＣＰＥ）は全く見られなかった。しかし、アセトンを用いて固定した後、貯蔵されたブタのポリクローン化した血清を用いて培養した細胞培地から得られた製剤を免疫標識化することによって、カリフォルニアの子豚（Imp. 999株）の肺、フランスの子豚（Imp. 1008株）の縦隔リンパ節およびカナダの子豚（Imp. 1010株）の器官を用いて培養した培地中の多数の細胞に核蛍光が現れた。
【００６３】
実施例７
ブタサーコウイルスのゲノムＤＮＡの抽出
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）の新規な株の複製型を７２〜７６時間の培養後に回収した感染したＰＫ／１５細胞培地（実施例１参照）（７５ｃｍ2ファルコン１０個）を用いて調製し、ＣＡＶの複製型のクローン化で記載したグルコサミンで処理した（非特許文献２６）。この複製型の２本鎖ＤＮＡはHirt法（非特許文献２７）の変形法で抽出した(非特許文献２８に記載)。
【００６４】
【非特許文献２６】Todd. D. et al., Dot blot hybrＩＤization assay for chicken anaemia agent using a cloned DNA probe. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, 933-939
【非特許文献２７】Hirt B. Selective extraction of polyoma virus DNA from infected cell cultures, J. Mol. Biol. 1967, 36, 365-369
【非特許文献２８】Molitor T. W. et al. Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replicative form DNA of two virus isolates, Virology, 1984, 137, 241-254
【００６５】
実施例８
ブタサーコウイルス Imp.999株のゲノムの複製型の制限地図
Hirt法で抽出されたＤＮＡ（１〜５μｇ）をメーカの推薦する方法に従ってＳ１ヌクレアーゼ（Amersham）で処理し、各種制限酵素(Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK)で消化し、消化物をTodd達が記載の方法（非特許文献２９）で、臭化エチジウムの存在下、１．５％のアガロースゲル上で電気泳動で分離した。Imp.999株の培地から抽出したＤＮＡは独特のEcoRI部位、２つのSacI部位を有し、PstI部位は全く持たない。従って、この制限プロフィールは、逆にPstI部位を有し、EcoRI部位を全く持たないＰＣＶのＰＫ／１５株（非特許文献３０）が示す制限プロフィールとは異なっている。
【非特許文献２９】Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990, 71, 819-823
【非特許文献３０】Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus） DNA: affinities with plant circovirus, 1997, 78, 221-227
【００６６】
実施例９
ブタサーコウイルス Imp.999株のゲノムのクローン化
制限酵素EcoRIを有するＰＣＶ Imp.999株の２本鎖複製型の消化で生じた約１．８ｋｂｐの制限断片を市販のQiagen kit（QIAEXII Gel Extraction Kit, Cat # 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, UK）を用いて１．５％アガロースゲル（実施例３参照）上で電気泳動で分離した。次に、このEcoRI−EcoRI制限断片を標準クローン化法（非特許文献３１）によって予め同じ制限酵素を用いて消化し、脱リン酸したベクターpGEM-7（Promega, Medical Supply Company, Dublin, Ireland）と結合した。得られたプラスミドを標準的方法によってEscherichia coli JM109宿主株（Stratagene, La Jolla, USA）に変換した。同じく、ＰＣＶ Imp.999株のEcoRI−EcoRI制限断片をベクターpBlueScript SK+（Stratagene, La Jolla, USA）のEcoRI部位にクローン化した。各宿主株に対して得られたクローンの中から所望の大きさの断片を有する少なくとも２つのクローンを選択した。次に、得られたクローンを培養し、Imp.999株の完全なゲノムを含むプラスミドを標準的なプラスミド調製および精製法によって少容量（２ｍｌ）または大容量（２５０ｍｌ）に精製した。
【非特許文献３１】Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, ColdSpringHarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988
【００６７】
実施例１０
ＰＣＶ Imp.999株のゲノムＤＮＡの配列（２本鎖複製型）
２つのEcoRI Imp.999のクローン配列（クローンpGEM-7/2およびpGEM-7/8）をメーカー推薦の方法で配列キット"AmpliTaq DNA polymerase FS"（Cat # 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, UK）および"Applied BioSystems AB1373A automatic sequencing apparatus"を用いてSangerのジデオキシヌクレオチド法で決定した。最初の配列反応はM13「前方」および「後方」自在プライマーを用いて実施した。続く配列反応は「ＤＮＡ歩行」法によって実施した。その後の配列に必要なオリゴヌクレオチドはLife Technology（Inchinnan Business Park, Paisley, UK）によって合成された。
【００６８】
得られた配列は集め、MacDNASIS version 3.2のソフトウェア（Cat # 22020101, Appligene, Durham, UK）を用いて分析した。各種の読み取り枠を"National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD, USA)サーバーで入手可能なBLAST algorithmを用いて解析した。
クローンpGEM-7/8（配列ＩＤ番号６）から最初に得られた完全な配列（EcoRI-EcoRI）は図１３、１４に表してある。この配列はEcoRI部位のＧの後に任意に始まり、ヌクレオチドに関してはいくつか不安定な部分を有している。
次いで、この配列が最適化された。配列ＩＤ番号３（図９〜１４）はこの株の配列を全て表しており、EcoRI部位の始めすなわち最初のヌクレオチドとしてＧから任意に始まる。
【００６９】
同様の方法本発明の他の３つの分離株の配列を得た（配列ＩＤ番号１、２、４および図１〜４および図７、８参照）。これら４つの株のゲノムの大きさは下記の通りである：
Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１ １７６７個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５ １７６７個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．９９９ １７６８個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１０ １７６８個のヌクレオチド
【００７０】
実施例１１
ＰＣＶ Imp.999株の配列の分析
Imp.999株から得られた配列をGenBankのデータバンクに収容された配列との相同性テストで用いた結果、検出された有意な相同性はＰＫ／１５株の配列（寄託番号Y09921）（図９〜１２参照）と約７６％の相同性であった。
データバンク（NCBIサーバーのBLAST X algorithm）を用いた６つのフェーズでの配列の翻訳の相同性テストでは、アミノ酸レベルで、GenBank U49186配列でコードされるプラント（GenBank番号1841515）のサーコウイルスに類似のＢＢＴＢウイルスの理論的レプリカーゼに対応する読み取り枠と９４％の相同性を示すということが分かった。
ＰＣＶ Imp.999株から得られた配列と有意な相同性を示すものはデータバンクに収容された他の配列にはなかった。
多機能萎縮症候群の臨床的徴候を示すカリフォルニアの子豚から得られた病変部を用いて培養されたImp.999株から得られた配列のには解析から、この単分離ウイルスが新規なブタサーコウイルス株であることが明らかになった。
【００７１】
実施例１２
配列の比較分析
新規な４つのＰＣＶ株のヌクレオチド配列とＰＣＶのＰＫ／１５株の配列（図９〜１２）とを整列比較した。新規な４つの株と公知のＰＫ／１５株とに関する相同性マトリクスを作成した。結果は下記の通りである：
１：Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１
２：Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５
３：Ｉｍｐ．９９９
４：Ｉｍｐ．１０１０
５：ＰＫ／１５
【００７２】
【表１】
【００７３】
２つのフランス株Imp. 1011-48121とImp. 1011-48285の相同性は９９％以上（０．９９７７）である。２つの北米株Imp. 999とImp. 1010の相同性も９９％以上（０．９９４９）以上である。フランス株と北米株との相同性はわずかに９６％以上である。
これら全ての株とＰＫ／１５株との相同性は７５〜７６％の値に落ちる。
このことから、本発明の株はＰＫ／１５株に代表される種類とは異なる新規なブタサーコウイルスの代表であると言える。ＰＫ／１５がタイプＩを表すのに対し、ＰＭＷＳ症候群を示すブタから単離されたこの新規な株をタイプＩＩのブタサーコウイルスとよぶことにする。このタイプＩＩに属する株は実際には非常に離れた地理的領域から単離されたにもかかわらず、驚くべきヌクレオチド配列の相同性を示す。
【００７４】
実施例１３
新規なＰＣＶ株のゲノムによってコードされるプロテインの分析
Imp.1010単離株のヌクレオチド配列は多機能性萎縮症候群に関する他のサーコウイルス株を代表するものと考えられる。この配列をBLASTX algorithm（非特許文献３２）と、ソフトウェアMacVector 6.0（Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, UK）のプログラムとを組み合わせを用いて詳細に分析した。この配列（環状ゲノム）上には２０個のアミノ酸より大きいサイズの読み取り枠（またはＯＲＦ）が１３個検出できた。この１３個のＯＲＦは下記の通りである：
【非特許文献３２】Altschl et al. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410
【００７５】
【表２】
【００７６】
各ＯＲＦの開始位置および終了位置は株１０１０のゲノムの図７、８に表された配列（配列ＩＤ番号４）を参照する。ＯＲＦ１〜１３の端部は株９９９と同一である。これらは下記ＯＲＦ３と１３を除き、株１０１１−４８１２１および１０１１−４８２８５とも同一である：
ＯＲＦ３ １４３２−１５３９、センス、１０８ｎｔ、３５ａａ
ＯＲＦ１３ ３１４−１３７７、アンチセンス、７０５ｎｔ、２３４ａａ
これら１３のＯＲＦの内で４つがクローン化ウイルスＰＣＶ ＰＫ／１５のゲノム上に位置する類似のＯＲＦと有意な相同性を有する。多機能性萎縮症候群に関連するサーコウイルス単離株全てのゲノム上に存在する読み取り枠をそれぞれ分析した。これら４つのＯＲＦは下記の通り：
【００７７】
【表３】
【００７８】
各ＯＲＦの始めと終わりの位置は図７、８に表された配列（配列ＩＤ番号４）を参照する。ＯＲＦの大きさ（ヌクレオチド=ｎｔで）は終止コドンを含む。
ＰＣＶ Imp. 1010とＰＣＶ ＰＫ−１５の単離株のゲノム機構の比較からから、２つのウイルスのゲノムに保存された４つのＯＲＦが同定できた。下記の表は観察された相同性の程度を表す：
【００７９】
【表４】
【００８０】
最大の相同性はＯＲＦ４ Imp. 1010とＯＲＦ１ ＰＫ−１５との間に見られた（８６％相同性）。このプロテインはおそらくウイルスのＤＮＡ複製に含まれ、ウイルスの複製に必須であるため、このことは予想されることである（非特許文献３３）。
ＯＲＦ１３ Imp. 1010とＯＲＦ２ ＰＫ−１５との間の配列同一性は余り強くない（６６．４％の同一性）が、この２つのＯＲＦはそれぞれ、鳥サーコウイルスＣＡＶ（非特許文献３４）の主構造プロテインのＮ−末端領域と同一な良く保存されたＮ−末端基本領域を有している。さらに、ＯＲＦ７ Imp. 1010とＯＲＦ３ ＰＫ−１５との間と、ＯＲＦ１０ Imp. 1010とＯＲＦ４ ＰＫ−１５との間に大きな違いが見られた。ＰＣＶ ＰＫ−１５のＯＲＦ３とＯＲＦ４と比較すると、それぞれにImp. 1010分離株のＯＲＦ７とＯＲＦ１０のＣ−末端領域に欠失がある。最大の配列相同性はＯＲＦ７／ＯＲＦ３（重複部分の水準において６１．５％の相同性）とＯＲＦ１０／ＯＲＦ４（重複部分の水準において８３％の相同性）のＮ−末端領域の水準において見られる。
【非特許文献３３】Meehan et al., Gen. Virol. 1997,78; 221-227；Mankertz et al. J. Gen. Virol. 1998. 79. 381-384
【非特許文献３４】Meehan et al., Arch. Virol. 1992, 124. 301-319
【００８１】
ブタサーコウイルスのゲノム構造はゲノムが極端に高密度であるため非常に複雑であるように見える。主構造プロテインはおそらくブタサーコウイルスゲノムの同じ鎖上に位置する複数の読み取り枠間のスプライシングに由来するものである。従って、上記の表に記載の全ての読み取り枠（ＯＲＦ１〜ＯＲＦ１３）でタイプＩＩのブタサーコウイルスにコードされた抗原プロテインの全てまたは一部を表すことができ、これらは特有の病気および／またはワクチン接種に使用可能な抗原である。本発明はこれらのＯＲＦを少なくとも１つ含む全てのプロテインに関するものである。本発明は主としてＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１０またはＯＲＦ１３で構成されるプロテインに関するものである。
【００８２】
実施例１４
新規な株からクローンされたＰＣＶゲノムの感染特性
Imp. 999単離株の完全なゲノム（複製型）を含むプラスミドpGEM-7/8をMeehan B. 達に記載の方法によってＰＫ／１５細胞に形質移入した（非特許文献３５）。未感染のＰＫ／１５細胞に形質移入した後の最初の継代に対して実施された免疫抗体法の分析（実施例４参照）から、クローンpGEM-7/8のプラスミドは感染性ＰＣＶウイルスを誘導することが示された。感染性ＰＣＶの遺伝物質を含むクローンが利用可能になったことによってウイルス性ゲノムに任意の有用な処置をして無毒化ワクチンまたは組み換えワクチンを製造し、或いは診断キット用抗原を製造することができ、変成ＰＣＶウイルス（ブタで無毒化または欠失）を製造することができるようになった。
【非特許文献３５】Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome gragments. Arch. Virol. 1992, 124. 301-319
【００８３】
実施例１５
インビトロ培養によるＰＣＶ抗原の製造
感染していないＰＫ／１５細胞の培養およびウイルス処置を実施例１と同じ方法で実施した。感染細胞を３７℃で４日間培養後、トリプシン処理し、回収し、命名した。次の継代は１ｍｌにつき４００，０００個の感染細胞を接種した。
【００８４】
実施例１６
ウイルス性抗原の不活化
ウイルス培養の最後に、感染した細胞を回収し、超音波（Branson Sonifier）またはロータースタータータイプのコロイドミル（UltraTurrax, IKA）を用いて溶解した。次に、懸濁液を３７００ｇで３０分間、遠心分離した。このウイルス懸濁液を+３７℃で１８時間、０．１％エチレンイミンで、或いは、+２８℃で２４時間、β−プロピオラクトンで不活化した。ウイルス価が不十分な場合にはウイルス懸濁液を３００kDaのメンブレン（Millipore PTMK300）を用いた限外濾過で濃縮した。不活化ウイルス懸濁液は+５℃で貯蔵した。
【００８５】
実施例１７
有機油をベースにしたワクチン乳剤の製造
下記処方でワクチンを調製した：
不活化ブタサーコウイルス懸濁液 ： ２５０ｍｌ
MondanＩＤe（商標登録）ISA 70（SEPPIC) : ７５０ｍｌ
水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソン・タービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。
一回のワクチン投与量は約１０7.5のTCＩＤ50を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は０．５ｍｌ、筋肉経路の投与量は２ｍｌである。
【００８６】
実施例１８
代謝可能な油ベースのワクチン乳剤の製造
下記処方でワクチンを調製した：
不活化ブタサーコウイルス懸濁液： ２００ｍｌ
Dehymuls HRE 7（Henkel) : ６０ｍｌ
Radia 7204（Oleofina) : ７４０ｍｌ
水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソン・タービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。
一回のワクチン投与量は約１０7.5のTCＩＤ50を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は０．５ｍｌ、筋肉内経路の投与量は２ｍｌである。
【００８７】
実施例１９
過免疫血清（ＰＣＶ−Ｔ）、ＰＫ／１５から調製されたモノクローナル抗体Ｆ９９およびカナダ株から調製された過免疫血清（ＰＣＶ−Ｃ）で汚染されたアメリカおよびフランスのＰＣＶウイルス株およびＰＫ／１５の間接免疫抗体法の結果
【００８８】
【表５】
* 間接的免疫抗体法で正の反応を示した血清またはモノクローナル抗体の最後の希釈液の逆数。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タイプＩＩのブタサーコウイルス（circovirus）の精製物。
【請求項２】
ＥＣＡＣＣに下記寄託番号で寄託された精製物から成る群の中から選択されるブタサーコウイルスの精製物：
寄託番号第Ｖ９７１００２１９号
寄託番号第Ｖ９７１００２１８号
寄託番号第Ｖ９７１００２１７号
寄託番号第Ｖ９８０１１６０８号
寄託番号第Ｖ９８０１１６０９号。
【請求項３】
ＰＭＷＳ症候群のブタの生理標本または組織標本、特に病変部から分離されるブタサーコウイルスに感染したインビトロ細胞培地の細胞で産成され、単離されたブタサーコウイルスの精製物。
【請求項４】
ブタの腎臓株細胞で産成され、単離される請求項３に記載のブタサーコウイルスの精製物。
【請求項５】
ＰＣＶに汚染されていないＰＫ／１５細胞で産成され、単離される請求項４に記載のブタサーコウイルスの精製物。
【請求項６】
請求項１のサーコウイルスに感染した細胞のインビトロ細胞培地から集められた培養抽出物または上澄み。
【請求項７】
請求項１に記載のサーコウイルスに感染した細胞のインビトロの細胞培地から集められた抗原製剤。
【請求項８】
抗原としてブタサーコウイルスを含む請求項７に記載の抗原製剤を含むワクチンまたは請求項６に記載の培養の上澄みまたは抽出物。
【請求項９】
無毒化した生の全抗原を獣医学上許容される賦形剤または希釈液中（必要に応じて獣医学上許容される補助剤およびフリーズドライ安定剤をさらに含むことができる）に含む請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
抗原が不活性化されており、ワクチンが獣医学上許容される賦形剤または希釈液（必要に応じて獣医学上許容される補助剤を含むことができる）を含む請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
下記配列群の中から選択される配列を含むＤＮＡ断片：
配列ＩＤ番号：１
配列ＩＤ番号：２
配列ＩＤ番号：３
配列ＩＤ番号：４
配列ＩＤ番号：６
【請求項１２】
ＯＲＦ１〜１３から成る群の中から選択されるＯＲＦを含むＤＮＡ断片。
【請求項１３】
ＯＲＦ４，７，１０および１３から成る群の中から選択されるＯＲＦを含む請求項１２に記載のＤＮＡ断片。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ断片でコード化されたポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列または断片がゲノム中に組み込まれ、インビトロで発現可能なインビトロ発現ベクター。
【請求項１６】
E. coliおよびバキュロウイルスの中から選択される請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
必要に応じて精製された、請求項１５または１６に記載の発現ベクターによって製造されたポリペプチド。
【請求項１８】
獣医学上許容される賦形剤または希釈液（必要に応じて獣医学上許容される補助剤をさらに含むことができる）中に請求項１４または１７に記載のポリペプチドを少なくとも１つ含むサブユニットワクチン。
【請求項１９】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載ＤＮＡ配列または断片がゲノム中に組み込まれ、インビボで発現可能なインビボ発現ベクター。
【請求項２０】
ブタには病原性ではなく、ブタで増殖可能な生ウイルスとプラスミドの中から選択される請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
ウイルス性ベクターがアウジェスキー病ウイルス、ブタアデノウイルス等のブタヘルペスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ブタポックスウイルス等のポックスウイルスから選択される請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
獣医学上許容される賦形剤または希釈液中に請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む生ワクチンまたはプラスミド。
【請求項２３】
請求項１〜４に定義の複数のブタサーコウイルスの抗原を含む請求項８〜１０、１８および２２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２４】
ブタの他の病原体に対応する少なくとも１つの他のワクチン価を有する請求項８〜１０、１８、２２、２３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２５】
ＰＲＲＳ、Mycoplasma hyopneumonia、アクチノバシラス胸膜肺炎菌、E. coli、ブタ萎縮鼻炎、仮性狂犬病、ブタコレラ、ブタインフルエンザから成る群の中から選択される少なくとも１つの他のワクチン価を有する請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
ＰＲＲＳおよびMycoplasma hyopneumoniaから成る群の中から選択される少なくとも１つの他のワクチン価を有する請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２７】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の配列の全てまたは一部を含むプローブまたはプライマー。
【請求項２８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のサーコウイルス、請求項１４または１７に記載のポリペプチド、またはこれらの断片から調製されるモノクローナル抗原またはポリクローナル抗原。
【請求項２９】
テストするブタの生理学的液体標本または組織標本で抗原の存在をテストし、抗原自体またはこの抗原に対する抗体を検出するブタサーコウイルスの検出方法。
【請求項１】
タイプＩＩのブタサーコウイルス（circovirus）の精製物。
【請求項２】
ＥＣＡＣＣに下記寄託番号で寄託された精製物から成る群の中から選択されるブタサーコウイルスの精製物：
寄託番号第Ｖ９７１００２１９号
寄託番号第Ｖ９７１００２１８号
寄託番号第Ｖ９７１００２１７号
寄託番号第Ｖ９８０１１６０８号
寄託番号第Ｖ９８０１１６０９号。
【請求項３】
ＰＭＷＳ症候群のブタの生理標本または組織標本、特に病変部から分離されるブタサーコウイルスに感染したインビトロ細胞培地の細胞で産成され、単離されたブタサーコウイルスの精製物。
【請求項４】
ブタの腎臓株細胞で産成され、単離される請求項３に記載のブタサーコウイルスの精製物。
【請求項５】
ＰＣＶに汚染されていないＰＫ／１５細胞で産成され、単離される請求項４に記載のブタサーコウイルスの精製物。
【請求項６】
請求項１のサーコウイルスに感染した細胞のインビトロ細胞培地から集められた培養抽出物または上澄み。
【請求項７】
請求項１に記載のサーコウイルスに感染した細胞のインビトロの細胞培地から集められた抗原製剤。
【請求項８】
抗原としてブタサーコウイルスを含む請求項７に記載の抗原製剤を含むワクチンまたは請求項６に記載の培養の上澄みまたは抽出物。
【請求項９】
無毒化した生の全抗原を獣医学上許容される賦形剤または希釈液中（必要に応じて獣医学上許容される補助剤およびフリーズドライ安定剤をさらに含むことができる）に含む請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
抗原が不活性化されており、ワクチンが獣医学上許容される賦形剤または希釈液（必要に応じて獣医学上許容される補助剤を含むことができる）を含む請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
下記配列群の中から選択される配列を含むＤＮＡ断片：
配列ＩＤ番号：１
配列ＩＤ番号：２
配列ＩＤ番号：３
配列ＩＤ番号：４
配列ＩＤ番号：６
【請求項１２】
ＯＲＦ１〜１３から成る群の中から選択されるＯＲＦを含むＤＮＡ断片。
【請求項１３】
ＯＲＦ４，７，１０および１３から成る群の中から選択されるＯＲＦを含む請求項１２に記載のＤＮＡ断片。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ断片でコード化されたポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列または断片がゲノム中に組み込まれ、インビトロで発現可能なインビトロ発現ベクター。
【請求項１６】
E. coliおよびバキュロウイルスの中から選択される請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
必要に応じて精製された、請求項１５または１６に記載の発現ベクターによって製造されたポリペプチド。
【請求項１８】
獣医学上許容される賦形剤または希釈液（必要に応じて獣医学上許容される補助剤をさらに含むことができる）中に請求項１４または１７に記載のポリペプチドを少なくとも１つ含むサブユニットワクチン。
【請求項１９】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載ＤＮＡ配列または断片がゲノム中に組み込まれ、インビボで発現可能なインビボ発現ベクター。
【請求項２０】
ブタには病原性ではなく、ブタで増殖可能な生ウイルスとプラスミドの中から選択される請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
ウイルス性ベクターがアウジェスキー病ウイルス、ブタアデノウイルス等のブタヘルペスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ブタポックスウイルス等のポックスウイルスから選択される請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
獣医学上許容される賦形剤または希釈液中に請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む生ワクチンまたはプラスミド。
【請求項２３】
請求項１〜４に定義の複数のブタサーコウイルスの抗原を含む請求項８〜１０、１８および２２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２４】
ブタの他の病原体に対応する少なくとも１つの他のワクチン価を有する請求項８〜１０、１８、２２、２３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２５】
ＰＲＲＳ、Mycoplasma hyopneumonia、アクチノバシラス胸膜肺炎菌、E. coli、ブタ萎縮鼻炎、仮性狂犬病、ブタコレラ、ブタインフルエンザから成る群の中から選択される少なくとも１つの他のワクチン価を有する請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
ＰＲＲＳおよびMycoplasma hyopneumoniaから成る群の中から選択される少なくとも１つの他のワクチン価を有する請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２７】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の配列の全てまたは一部を含むプローブまたはプライマー。
【請求項２８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のサーコウイルス、請求項１４または１７に記載のポリペプチド、またはこれらの断片から調製されるモノクローナル抗原またはポリクローナル抗原。
【請求項２９】
テストするブタの生理学的液体標本または組織標本で抗原の存在をテストし、抗原自体またはこの抗原に対する抗体を検出するブタサーコウイルスの検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１２−１９３１７９（Ｐ２０１２−１９３１７９Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−６０６１９（Ｐ２０１２−６０６１９）
【出願日】平成２４年３月１６日（２０１２．３．１６）
【分割の表示】特願２０００−５１５０１０（Ｐ２０００−５１５０１０）の分割
【原出願日】平成１０年１０月１日（１９９８．１０．１）
【出願人】（５０３３６５６５９）
【出願人】（５００１５５３５０）クィーンズ ユニバーシティ オブ ベルファスト (5)
【出願人】（５００１５５３６１）ユニバーシティ オブ サスカチュワン (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年３月１６日（２０１２．３．１６）
【分割の表示】特願２０００−５１５０１０（Ｐ２０００−５１５０１０）の分割
【原出願日】平成１０年１０月１日（１９９８．１０．１）
【出願人】（５０３３６５６５９）
【出願人】（５００１５５３５０）クィーンズ ユニバーシティ オブ ベルファスト (5)
【出願人】（５００１５５３６１）ユニバーシティ オブ サスカチュワン (5)
【Ｆターム（参考）】
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