ブタサーコウイルスおよびパルボウイルスワクチン
【課題】ＰＭＷＳ症候群（ブタ多機能萎縮症候群、離乳後多機能萎縮症候群ともいわれる）に対するワクチンを提供。
【解決手段】互いに独立して無毒化した生の全抗原、不活性化した生の全抗原、サブユニット抗原、組み換え生ベクターおよびＤＮＡベクターから成る群の中から選択された、ブタサーコウイルス抗原およびブタパルボウイルス抗原を含ブタ多機能性萎縮症候群（ＰＭＷＳ）に対する抗原性製剤およびワクチンと個別包装したワクチン接種キット。
【解決手段】互いに独立して無毒化した生の全抗原、不活性化した生の全抗原、サブユニット抗原、組み換え生ベクターおよびＤＮＡベクターから成る群の中から選択された、ブタサーコウイルス抗原およびブタパルボウイルス抗原を含ブタ多機能性萎縮症候群（ＰＭＷＳ）に対する抗原性製剤およびワクチンと個別包装したワクチン接種キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＭＷＳ症候群（ブタ多機能萎縮症候群:Porcine Multisystemic Wasting Syndrome）（離乳後多機能萎縮症候群:Post-weaning Multisystemic Wasting Syndromeともいわれる）に対するワクチンに関するものである。
以下では各種文献を引用し、各種文献を参照するが、これらの文献の全てを実際に本発明に関する従来例であると認めらたものではない。本明細書に引用した全ての文献およびそれらで引用された全ての文献の内容は本明細書の一部を成す。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＶ（ブタサーコウイルス、procine circoviridae）はブタ腎臓細胞株ＰＫ／１５中に無毒病原性汚染物質として最初に見い出された。このウイルスＰＣＶはチキン貧血症ウイルス（ＣＡＶ、Chicken Anaemia Virus）および嘴・羽症候群ウイルス（ＰＢＦＤＶ、Pscittacine Beak and Feather Disease Virus）とともにサーコウイルス群（Circoviridae）に分類された。これらのウイルスはエンベロプのない小さなウイルス（１５〜２４ｎｍ）で、その共通な特徴は１．７６〜２．３１ｋｂの環状一本鎖のＤＮＡからなるゲノムを含む点にある。このゲノムは約３０ｋＤａのポリペプチドをコード化すると考えられていた（非特許文献１）が、最近の研究でさらに複雑な転写がわかってきた（非特許文献２）。しかも、上記３種類のサーコウイルス（circovirus）はそのヌクレオチド配列に有意な相同性はなく、また、共通の抗原決定基もない。
【０００３】
上記ＰＫ／１５細胞由来のＰＣＶは病原性ではないと考えられる。この配列は非特許文献３が明らかにしている。ＰＣＶ株が病原性で、ＰＭＷＳ症候群と関連があるかもしれないと考えられるようになったのはほんの最近のことである（非特許文献４および非特許文献５）。Nayer達はＰＣＲ法を用いてＰＭＷＳ症候群を示すブタ中にＰＣＶのＤＮＡを見い出した。
【０００４】
カナダ、米国およびフランスで見られるＰＭＷＳ症候群の臨床的な特徴は、体重を徐々に失い、頻呼吸症、呼吸困難および黄疸等を発症することである。病理的な面ではリンパ性または肉芽種性浸潤、リンパ節腫脹、まれには肝炎およびリンパ性または肉芽種性腎炎を発症する（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Todd et al., Arch Virol 1991, 117; 129-135
【非特許文献２】Meehan B. M. et al., 1997,78; 221-227
【非特許文献３】B. M. Meehan et al., J. Gen. Virol 1997 (78) 221-227
【非特許文献４】Gupi P. S. Nayar et al., Can. Vet. J, Vol. 38, 1997: 385-387
【非特許文献５】Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501
【非特許文献６】Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501；
【非特許文献７】La Semaine Veterinaire 1996 (834)、
【非特許文献８】La Semaine Veterinaire No. 26；
【非特許文献９】La Semaine Veterinaire 1997 (857)：５４；
【非特許文献１０】Gupi P. S. Nayar et al., Can. Vet. J, Vol. 38, 1997: 385-387
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願人は、カナダ、米国（カリフォルニア）およびフランス（ブリタニー）の農場から得た肺または神経節の標本から５つの新規なＰＣＶ株を単離することに成功した。これらのウイルスはＰＭＷＳ症候群のブタの病変部に検出されるが、健康なブタには検出されない。
【０００７】
本出願人はさらに、これらの４種の株（カナダおよび米国の株）と２種のフランスの株のゲノムの配列決定した。これらの株はヌクレオチドレベルで互いに非常に強い相同性（９６％以上）を示す、一方、ＰＫ／１５株ははるかに弱い相同性（約７６％）しか示さない。従って、新規のタイプのブタサーコウイルス （circovirus）を代表するものと考えられ、ＰＫ／１５に代表されるタイプＩ（第Ｉ群）に対して、本発明の新規な株はタイプＩＩ（第ＩＩ群）とよぶことにする。
【０００８】
５種の株の精製物はブダペスト条約に従ってＥＣＡＣＣ（European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom）に寄託された下記の精製物である：
１９９７年１０月２日木曜日寄託：
寄託番号第Ｖ９７１００２１９号（以下、Ｉｍｐ．１００８ＰＣＶという）
寄託番号第Ｖ９７１００２１８号（以下、Ｉｍｐ．１０１０ＰＣＶという）
寄託番号第Ｖ９７１００２１７号（以下、Ｉｍｐ．９９９ＰＣＶという）
１９９８年１月１６日金曜日寄託：
寄託番号第Ｖ９８０１１６０８号（以下、Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５という）
寄託番号第Ｖ９８０１１６０９号（以下、Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１という）
本出願人はブタ多機能性萎縮症候群の実験的再生試験から、ブタパルボウイルスとブタサーコウイルスとを組合せたものは病気を悪化させるということを見い出した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明の対象はブタパルボウイルスワクチンと、ブタサーコウイルス、特にタイプＩまたはタイプＩＩ、好ましくはタイプＩＩのワクチンとを組合せて用いるブタのワクチン接種方法にある。これはブタサーコウイルスワクチンとブタパルボウイルスとの二価のワクチンをブタへワクチン接種するか、これらを同時に併用してブタにワクチン接種するということを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１株のゲノムのＤＮＡ配列
【図２】図１の続き
【図３】図２の続き
【図４】図３の続き
【図５】Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５株のゲノムのＤＮＡ配列
【図６】図５の続き
【図７】図６の続き
【図８】図７の続き
【図９】Ｉｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
【図１０】図９の続き
【図１１】図１０の続き
【図１２】図１１の続き
【図１３】Ｉｍｐ．１０１０株のゲノムのＤＮＡ配列
【図１４】図１３の続き
【図１５】図１４の続き
【図１６】図１５の続き
【図１７】PCV PK/15株の配列と図１〜１６の４つの配列との整列化
【図１８】図１７の続き
【図１９】図１８の続き
【図２０】図１９の続き
【図２１】図２０の続き
【図２２】図２１の続き
【図２３】図２２の続き
【図２４】図２３の続き
【図２５】図２４の続き
【図２６】図２５の続き
【発明を実施するための形態】
【００１１】
パルボウイルス対照株はＶＲ−７４２の参照番号でＡＴＣＣの収集株からアクセス可能なＮＡＤＬ−２株である。ブタパルボウイルスに対するワクチン接種は当業者に周知であり、ブタパルボウイルスに対するワクチンは市販されている。その一例としてはParvovax（登録商標）を挙げることができる［メリアル（MERIAL）から供給されるブタパルボウイルスに対する不活性化ワクチン］。また非特許文献１１、非特許文献１２を参照されたい。
【非特許文献１１】P.VannierおよびA.Laval.、Point.Vet.1993年、25(151)、53〜60頁
【非特許文献１２】G.Florent達の第9回ブタ獣医学会会議の議事録（1986年7月15〜18日、スペイン、バルセロナ）
【００１２】
ＤＮＡワクチンに関しては例えばWO-A98 03658を参照することができる。
従って、本発明の対象は少なくとも１種のブタサーコウイルス抗原（好ましくはタイプＩＩのサーコウイルス）と、少なくとも１種のブタパルボウイルス抗原とからなるＰＭＷＳ症候群に対する抗原性製剤（調整物）にある。本発明で用いるブタサーコウイルス抗原（好ましくはタイプＩＩのサーコウイルス）およびブタパルボウイルス抗原は無毒化した生の全抗原、不活性化した生の全抗原、サブユニット抗原、組み換え生ベクターおよびＤＮＡベクターから成る群の中から互いに独立して選択することができる。本発明の組合せ物は他の任意の適当な抗原または抗原性製剤を一緒に用いることができるということは理解できよう。所定の組合せに対して同じ形を用いる必要がないことも理解できよう。本発明の抗原性製剤は周知の方法で獣医学上許容されるビヒクルまたは賦形剤（さらに必要な場合には獣医学上許容されるアジュバント）をさらに含むことができる。
【００１３】
本発明のさらに他の対象は、有効量の上記サーコウイルス＋パルボウイルス抗原性製剤と、獣医学上許容されるビヒクルまたは賦形剤（さらに必要な場合には獣医学上許容されるアジュバント）とからなるＰＭＷＳ症候群に対するワクチンにある。免疫抗原性組成物は免疫抗原性反応を誘発するが、この反応は保護的なものであることは必ずしも保護的でない場合もある。ワクチン組成物は保護的反応を誘発する。従って、「免疫抗原性組成物」には「ワクチン組成物」が含まれる（前者の用語は保護的組成物であるので）。
【００１４】
本発明のさらに他の対象は、ブタサーコウイルスに対する抗原性製剤または免疫抗原性組成物またはワクチン、およびブタパルボウイルスに対する抗原性製剤または免疫抗原性組成物またはワクチンを含む個別包装した免疫抗原性またはワクチン接種キットにある。このキットは抗原性製剤、免疫抗原性組成物およびワクチンで記載の各種特徴を有することができる。
【００１５】
本発明のさらに他の対象は、ブタサーコウイルスに対する免疫抗原性組成物またはワクチンと、ブタパルボウイルスに対する免疫抗原性組成物またはワクチンとを投与するか、各ウイルスに特有な各抗原性製剤を同一処方中に含む２価の免疫抗原性組成物またはワクチンを投与するＰＭＷＳ症候群に対する免疫化またはワクチン接種の方法にある。この免疫化またはワクチン接種方法では特に上記のワクチンを用いる。
【００１６】
本発明のさらに他の対象は、ＰＭＷＳ症候群予防用医薬組成物の製造における、パルボウイルスに対する抗原性製剤または免疫抗原性組成物またはワクチンとブタサーコウイルスに対する抗原性製剤または免疫抗原性組成物またはワクチンとを組合せた使用にある。
サーコウイルス抗原性製剤の製造用サーコウイルスは細胞株、特にＰＫ／１５細胞の継代で得ることができる。この培養上澄みまたは抽出物を抗原性製剤としては用いることができ、必要に応じて標準的な方法によって精製することができる。
【００１７】
無毒化した抗原性製剤および無毒化した免疫抗原性組成物またはワクチンでの無毒化は通常の方法、例えば細胞の継代、好ましくはブタ細胞、特にＰＫ／１５細胞株の継代（特に５０〜１５０、特に１００回の継代）で行うことができる。この免疫抗原性組成物およびワクチンは一般に獣医学上許容される媒体または希釈液を含むことができ、必要に応じてさらに獣医学上許容されるアジュバントおよびフリーズドライ安定剤を含むことができる。
本発明の抗原性製剤、免疫抗原性組成物およびワクチンは上記の無毒化ウイルスを103〜107ＴＣＩＤ５０含むのが好ましい。
【００１８】
本発明の抗原性製剤、免疫抗原性組成物およびワクチンは無毒化した生全ワクチンをベースとする免疫抗原性組成物およびワクチンにすることができる。無毒化した免疫抗原性組成物およびワクチンは獣医学上許容される媒体または希釈液を含むことができ、必要に応じてさらに獣医学上許容されるアジュバントを含むことができる。
【００１９】
本発明のサーコウイルス（断片の形でもよい）は当業者に公知の方法で不活性化される。この不活性化は化学的方法、例えば抗原をホルムアルデヒド（ホルマリン）、パラフォルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミンまたはその誘導体等の試薬で処理して行なうことができる。好ましい不活性化法は試薬、特にエチレンイミンまたはβ−プロピオラクトンで処理する方法である。
本発明の不活性化抗原性製剤および不活性化免疫抗原性組成物およびワクチンにはアジュバントを加え、当業者に公知の方法でエマルジョンの形、例えば油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョン等の乳剤の形にするのが好ましい。一般的なアジュバント化合物を有効成分に添加してアジュバント処理することもできる。
【００２０】
使用可能なアジュバントとしては例えば水酸化アルミニウム、サポニン（例えばQuillja saponinまたはQuil A；"Vaccin Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Michael F. Powel と Mark J. Newman編、Plennum Press, New-York and London, p.210"参照）、Avridine（商標登録）（Vaccine Design p. 148参照）、DDA（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Vaccine Design p. 157参照）、ポリホスファゼン（Vaccine Design p. 204参照）、さらには有機油、スクアラン（例えばＳＰＴ乳剤、Vaccine Design p. 147参照）、スクアレーン（例えばＭＦ５９、Vaccine Design p. 183参照）をベースとする水中油乳剤または代謝可能な油をベースとする油中水乳剤（好ましくは国際特許第WO-A-94-20071号による）および米国特許第5,422,109号に記載の乳剤を挙げることができる。アジュバントの組み合わせ、例えば乳剤Avridine（商標登録）またはDDAとの組み合せを選択することもできる。
本発明の抗原性製剤、免疫抗原性組成物およびワクチンは上記の不活性化全ウイルスを105〜108のＴＣＩＤ５０含むのが好ましい。
【００２１】
上記の生ワクチン用のアジュバントは不活性化ワクチン用のものから選択するこができる。乳剤が好ましい。不活性化ワクチン用のものには国際特許第WO-A-94-16681号に記載のものも加えることができる。
凍結安定剤としては例えばＳＰＧＡ（Bovarnik et al., J. Bacteriology 59, 509, 950）、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストランまたはグルコース等の炭水化物、アルブミンまたはカゼイン等のプロテイン、これらの化合物の誘導体またはアルカリ金属燐酸塩等の緩衝剤を挙げることができる。
本発明の抗原性製剤、免疫抗原性組成物およびワクチンは１種以上の本発明のサーコウイルスおよび／またはパルボウイルスを有効成分（抗原）として含むことができる。
【００２２】
本件出願人はさらに、配列ＩＤ番号１〜４で識別される４つのタイプＩＩのブタサーコウイルス単離株のゲノムを得た。株ＰＫ−１５の配列は配列ＩＤ番号５で表される。本発明はこれと均等な配列すなわち上記配列の株の特徴または上記配列によりコードされるポリペプチドの機能を変更しない配列も含むものであるということは当然である。また、コードの欠失(degenerescence)により変化した配列も含むということは理解できよう。
本発明はさらに、厳密な条件下で上記配列と混成（ハイブリッド化）が可能であり、および／または、本発明株と高い相同性を有するという意味で均等な配列も含むものである。
【００２３】
これらの配列およびその断片は適当なベクターを用いてインビトロまたはインビボでポリペプチドの有利に用いることができる。
特に、これに使用可能な本発明のＤＮＡ断片を形成するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１〜１３）はタイプＩＩのサーコウイルスのゲノム配列で同定されている。本発明は、少なくともこれらのオープンリーディングフレーム（対応するアミノ酸配列）の一つを含む全てのポリペプチドに関するものである。特に、本発明は主としてＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１０またはＯＲＦ１３で構成される蛋白に関するものである。
【００２４】
インビトロのサブユニットを発現するための発現手段としては大腸菌（E. coli）またはバキュロウイルス（米国特許第4,745,051号）を用いるのが好ましい。上記の単数または複数のコード配列またはその断片をバキュロウイルスゲノム（例えばAutographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV）に組み込み、次いで、それを昆虫細胞、例えばSpodoptera fruigiperda Sf9（寄託番号ATCC CRL 1711）で増殖させる。また、イースト（例えば酵母)またはほ乳類細胞（例えばCHO、BHK）等の真核細胞でサブユニットを製造することもできる。
【００２５】
本発明のさらに他の対象は、これらの発現手段によってインビトロで製造され、必要に応じて一般的な方法で精製されたポリペプチドのサブユニットの使用にある。サブユニット免疫抗原性組成物およびワクチンは、このようにして得られた少なくとも１つのポリペプチドまたはその断片を獣医学上許容される媒体または希釈液(必要に応じて獣医学上許容されるアジュバントをさらに含むことができる)中に含む。
【００２６】
組み換え生タイプまたはＤＮＡタイプのワクチンの免疫抗原性組成物およびワクチンの製造時にインビボ発現させるには単数または複数のコード化配列またはその断片を単数または複数のポリペプチドを発現できる条件下で適当な発現ベクターに挿入する。適切な生のベクターとしてはブタで増殖可能でブタに対しては非病原性の生ウイルスを当業者に周知の方法で使用するのが好ましい。特に、アウジェスキー病ウイルス、ブタアデノウイルス等のブタヘルペスウイルス、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ブタポックスウイルス等を用いることができる。ＤＮＡベクターをベクターとして用いることもできる（国際特許第WO-A-90-11092号、WO-A-93-19813号、WO-A-94-21797号、WO-A-95-20660号）。
【００２７】
従って、本発明の他の対象は、このようにして調製されたベクターと、組み換え生タイプまたはＤＮＡ（ポリヌクレオチド）タイプの免疫抗原性組成物またはワクチンにある。これらの調製および使用、免疫抗原性組成物およびワクチンは獣医学上許容される媒体または希釈液を含むことができる。
ＤＮＡ免疫抗原性組成物またはワクチンは、その定義上、抗原ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を組み込み且つインビボで発現する、円形のワクチンプラスミド、スーパーコイル等または線状のＤＮＡ分子であるＤＮＡベクターを含む。
組換えタイプおよびＤＮＡタイプの免疫抗原性組成物およびワクチンはアジュバントを含むことができる。
【００２８】
免疫化またはワクチン接種の組合せプログラムでは、上記のブタサーコウイルスおよびブタパルボウイルスに対する免疫化またはワクチン接種をブタの他の病原体、特にＰＭＳＷ症候群に関連する病原体に対する免疫化またはワクチン接種と組合せることができる。本発明の免疫抗原性組成物またはワクチンはブタの他の病原体に対応する他のワクチン価を含むことができる。これらのブタの他の病原体はＰＲＲＳ（Porcine Reproductory and Respiratory Syndrome:ブタ生殖器および呼吸器症候群）および／またはMycoplasma hyopneumonia、E. coli、および／または萎縮鼻炎（Atrophic Rhinitis）、および／または仮性狂犬病（アウジェスキー病）ウイルスおよび/またはブタインフルエンザおよび/またはアクチノバシラス胸膜肺炎菌および/またはブタコレラ、およびこれらの組合せの中から選択される。本発明の免疫化またはワクチン接種のプログラムおよびワクチンはサーコウイルスおよびパルボウイルスに対する免疫化またはワクチン接種と、ＰＲＲＳ（国際特許第WO-A-93-07898号、WO-A-94-18311号、フランス国特許第2,709,966号；C. Chareyre 他、第15回IPVS Congress,Birmingham, England, 5-9 July 1998, p. 139の議事録を参照）および/またはMycoplasma hyopneumonia（欧州特許第597,852号、第550,477号、第571,648号および前記の第15回IPVS CongressのO. Martinon 達、p. 157, 284, 285およびG. Reynaud達、p. 150を参照）および/またはブタインフルエンザとを組合せるのが好ましい。すなわち、任意の適当な免疫抗原性組成物またはワクチン、特に任意の市販のワクチンを用い、それと上記のブタサーコウイルスおよびブタパルボウイルスに対する免疫抗原性組成物またはワクチンとを組合せることができる。
【００２９】
従って、本発明のさらに他の対象は免疫抗原性多価組成物および多価ワクチンと、多価ワクチンキットと、免疫化またはワクチン接種の組合せプログラムで使用可能な免疫化またはワクチン接種法にある。
以下、図面を参照して本発明の実施例をさらに詳細に説明する。しかし、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１
ブタサーコウイルス（circovirus）株の培養および分離
組織標本はフランス、カナダおよび米国で子豚の肺およびリンパ節から集めた。これらの子豚は離乳後多機能萎縮症候群に典型的な臨床的徴候を示したものである。ウイルスを単離するため組織標本は死体解剖直後に−７０℃で冷凍した。
ウイルス単離のために無菌の乳鉢と乳棒を用いて無菌の砂で組織を粉砕し、イール（Earl）塩 （EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Workingham, UK）、ペニシリン（１００IU/ml）およびストレプトマイシン（１００μｍ／ｍｌ）を含む最小培地（ＭＥＭ−ＳＡ培地）中に約１５％の組織標本を含む懸濁液を調製した。粉砕物をＭＥＭ−ＳＡに溶解し、+４℃、３０００ｇで３０分間、遠心分離にかけて上澄みを回収した。
【００３１】
細胞培地の接種前に、１００μｌのクロロホルムを２ｍｌの各上澄みに添加し、室温で１０分間混合した。この混合物を超遠心分離管に移し、１０分間３０００ｇで遠心分離して上澄みを回収した。次いで、この上澄みをウイルス分離実験で種菌として用いた。
全てのウイルス単離研究はブタサーコウイルス(ＰＣＶ)、ペスチウイルス、ブタアデノウイルスおよびブタパルヴォウイルスに感染していないことが分かっているＰＫ／１５細胞培地で実施した（Allan G. et al., Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64）。
【００３２】
ブタサーコウイルスの単離は下記方法によって実施した：
ＰＫ／１５細胞の単一層をトリプシン処理（トリプシン−versene混合物）によって集密的な培養から解離し、最終濃度が約４００，０００細胞/１ｍｌであるペスチウイルス（=ＭＥＭ−Ｇ培地）に感染していない１５％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ−ＳＡ培地に溶解した。次に、この細胞懸濁液の１０ｍｌの部分標本を２ｍｌの前記接種材料の部分標本と混合し、最終混合物を２つの２５cm2ファルコンフラスコに６ｍｌの容積に分取した。+３７℃で１８時間、１０％のCO2を含む雰囲気下で培養した。
【００３３】
培養後、半集密的な単一層を３００ｍＭのＤ−グルコサミン（Cat # G48175、
Sigma-Aldrich株式会社、Poole, UK）で処理し（Tischr I. et al., Arch. Virol., 1987 96 39-57）、さらに３７℃で４８〜７２時間培養を続けた。この最終培養に続いて、２つのファルコンの１方を３回凍結／融解サイクルにかけた。残りのファルコンのＰＫ／１５細胞はトリプシン−versene溶液で処理し、２０ｍｌのＭＥＭ−Ｇ培地中に再懸濁し、４００，０００細胞／ｍｌ濃度で７５cm2ファルコン中に接種した。新しく接種されたフラスコは凍結／融解サイクル後に得られた対応する可溶化液５ｍｌを添加して「超感染」させた。
【００３４】
実施例２
免疫抗体法または切片上ハイブリッド形成法によるブタサーコウイルスを検出するためのするための細胞培地標本の調製
５ｍｌの容積の「超感染」した懸濁液を回収し、無菌で脱脂したカバーガラスを含む直径５５ｍｍのペトリ皿中に接種した。フラスコ中およびカバーガラス上で+３７℃で培養し、実施例１に記載のグルコサミンで処理した。カバーガラス上での培養はグルコサミン処理後２４〜４８時間で回収し、室温で１０分間アセトンを用いて、または４時間緩衝剤処理した１０％のホルムアルデヒドを用いて固定した。この固定後、全てのカバーガラスをシリカゲル上で−７０℃で貯蔵してから、ハイブリッド形成の研究および細胞免疫の研究に使用した。
【００３５】
実施例３
ハイブリッド形成法(in situ)によるＰＣＶ配列の検出法
ハイブリッド形成法(in situ)は病気のブタから集めた組織に対して実施し、
ホルムアルデヒドで固定し、ウイルス単離（実施例２参照）用に接種した細胞培地の調整で用い、カバーガラスに固定した。
ＰＫ／１５ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）および感染性ニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡＶ）に対応する完全なゲノムプローブを用いた。１．７キロの塩基ペア（kbp）の挿入断片の形にクローン化されたＰＣＶゲノムの複製型を含むプラスミドpPCVI（Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circovirus, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227）をＰＣＶ固有ＤＮＡ源として用いた。２．３ｋｂｐの鳥サーコウイルスＣＡＶの複製型を含む鳥プラスミドpCAAIを負対照として用いた。２つのプラスミドのグリセロール源をアルカリ法（Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988）によってプラスミドの製造および精製で用い、これらはプローブ調製用のテンプレートとして用いた。ＰＣＶおよびＣＡＶの完全なゲノムを表すサーコウイルスプローブはメーカー推薦の方法で市販の非放射性ラベリングキット（"DIG DNA Labelling Kit"、Boehringer Mannheim, Lewis, UK）を用いて上記精製プラスミド（各プローブに１μｇ）およびヘキサヌクレオチドプライマーから製造した。
【００３６】
ハイブリッド形成法(in situ)で使用する前に、プローブをジゴキシジェニンで標識化し、容積５０〜１００μｌの純水に溶解した。
パラフィンに包み、ホルムアルデヒドで固定した病気のブタの組織標本と、ホルムアルデヒドで固定した感染細胞培地の製剤を下記方法でＰＣＶ核酸検出のために調製した：
５μｍ厚の切片をパラフィンに包まれた組織塊から切り出し、濃度を次第に薄くしたアルコール溶液中で再水和した。ホルムアルデヒドで固定した組織切片および細胞培地を１５分間および５分間それぞれ５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝剤（ｐＨ７．６）を用いた０．５％のプロテナーゼＫ溶液中で+３７℃で培養した。次に、スライドガラスを加圧滅菌した蒸留水中の１％グリシン溶液中に３０秒配置し、０．０１ＭのＰＢＳ緩衝剤（燐酸緩衝食塩水）（ｐＨ７．２）で２度洗浄し、最後に無菌蒸留水で５分間洗浄した。スライドガラスを最後に外気で乾燥し、プローブと接触させた。
【００３７】
各組織／プローブ製剤を清潔な脱脂カバーガラスで被覆し、+９０℃の炉内に１０分間配置した後、氷塊と１分間接触させ、最後に+３７℃で１８時間培養した。次に、調整物を２Ｘクエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）緩衝剤（ｐＨ７．０）に短時間含浸した後、２ＸのＳＳＣ緩衝剤中で５分間、２回洗浄し、最後にＰＢＳ緩衝剤中で５分間、２回洗浄した。
洗浄後、調整物を０．１Ｍのマレイン酸、０．１５ＭのＮａＣＬ（ｐＨ７．５）（マレイン緩衝剤）の溶液中に１０分間含浸し、マレイン緩衝剤中の遮断試薬の１％溶液（Cat # 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK）中で+３７℃で２０分間培養した。
【００３８】
次に、調整物を遮断緩衝剤で希釈された抗ジゴキシジェニンモノクローナル性抗体（Boehringer Mannheim）の１／２５０溶液中で+３７℃で１時間培養し、ＰＢＳ中で洗浄し、最後に抗ネズミ免疫グロブリン抗体を用いて+３７℃で３０分間培養した。調整物をＰＢＳで洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ作用を室温で２０分間、ＰＢＳ中の０．５％水酸化ペルオキシド溶液で処理して遮断した。調整物を再度ＰＢＳ中で洗浄し、使用直前に調製した３−アミノ−９−ジエチルカルバゾル（ＡＥＣ）基質（Cambridge Bioscience, Cambridge, UK）で処理した。
最後に水道水で洗浄した後、調整物をヘマトキシリンで逆染色し、水道水で"青色化"して固定液（GVA Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, UK）で顕微鏡のカバーガラスに固定した。対照実験には無関係な負プローブ（ＣＡＶ）と正プローブ（ＰＣＶ）を病気のブタおよび病気ではないブタから得られた標本で使用することが含まれる。
【００３９】
実施例４
免疫蛍光抗体法によるＰＣＶの検出法
アセトンを用いて固定した全ての細胞倍地の最初のスクリーニングを貯蔵した大人のブタ血清の１／１００希釈を用いた間接免疫蛍光抗体法（ＩＩＦ）で実施した。この貯蔵血清は北アイルランドの２５匹の大人の雌ブタからの血清を含み、ＰＣＶ：ブタパルボウイルス、ブタアデノウイルスおよびＰＲＲウイルスを含む広範囲のブタのウイルスに対する抗体を含むことで知られている。血清（ＰＢＳで希釈）を細胞培地と+３７℃で１時間接触させた後、ＰＢＳ中で２回洗浄してＩＩＦを実施した。細胞培地をイソチオシアン酸フルオレセインに結合したＰＢＳで１／８０に希釈したウサギの抗ブタ免疫グロブリン抗体を用いて１時間染色し、ＰＢＳで洗浄し、グリセロール緩衝剤に固定し、紫外線下で顕微鏡観察した。
【００４０】
実施例５
病気のブタの組織における切片上ハイブリッド形成結果
フランス、カナダおよびカリフォルニアの多機能性萎縮病変を有する子豚から集めた組織から調製したＰＣＶゲノムプローブを用いた切片上ハイブリッド形成法から、研究された複数の病変部に病変部に関連するＰＣＶ核酸の存在が示された。これに対してＰＣＶゲノムプローブを病気でないブタから集めた組織に用い時またはＣＡＶプローブを病気のブタの組織に用いた時には何の徴候も見られなかった。ＰＣＶ核酸の存在はサイトプラズムおよびカリフォルニアの子豚の肺の病変部を浸潤する多数の単核細胞の核に認められた。ＰＣＶ核酸の存在は肺細胞、気管支および細気管支の上皮細胞および細動脈、細静脈およびリンパ管の内皮細胞にも見られた。
【００４１】
病気のフランスのブタではＰＣＶ核酸の存在は多数の濾胞性リンパ細胞のサイトプラズマおよびリンパ節の同様な毛細血管内の単核細胞に検出された。また、ＰＣＶ核酸は一次的合胞体にも検出された。これらの検出結果から、カリフォルニアのブタの肺、フランスのブタの腸間膜リンパ節およびカナダのブタの器官の標本を新規なブタサーコウイルス株の単離用に選択した。
【００４２】
実施例６
新規なブタサーコウイルス株の細胞培養結果と、免疫蛍光抗体法による検出
多機能性萎縮症候群の臨床的徴候を示すフランスの子豚（Imp. 1008株）、カリフォルニアの子豚（Imp. 999株）およびカナダの子豚（Imp. 1010株）から集めた標本を培養した細胞培地には細胞変性作用（ＣＰＥ）は全く見られなかった。しかし、アセトンを用いて固定した後、貯蔵されたブタのポリクローン化した血清を用いて培養した細胞培地から得られた製剤を免疫標識化することによって、カリフォルニアの子豚（Imp. 999株）の肺、フランスの子豚（Imp. 1008株）の縦隔リンパ節およびカナダの子豚（Imp. 1010株）の器官を用いて培養した培地中の多数の細胞に核蛍光が現れた。
【００４３】
実施例７
ブタサーコウイルスのゲノムＤＮＡの抽出
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）の新規な株の複製型を７２〜７６時間の培養後に回収した感染したＰＫ／１５細胞培地（実施例１参照）（７５cm2ファルコン１０個）を用いて調製し、ＣＡＶの複製型のクローン化で記載したグルコサミンで処理した（Todd. D. et al., Dot blot hybridization assay for chicken anaemia agent using a cloned DNA probe. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, 933-939）。この複製型の２本鎖ＤＮＡはHirt法（Hirt B. Selective extraction of polyoma virus DNA from infected cell cultures, J. Mol. Biol. 1967, 36, 365-369）の変形法で抽出した(Molitor T. W. et al. Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replicative form DNA of two virus isolates, Virology, 1984, 137, 241-254)に記載)。
【００４４】
実施例８
ブタサーコウイルス Imp.999株のゲノムの複製型の制限地図
Hirt法で抽出されたＤＮＡ（１〜５μｇ）をメーカの推薦する方法に従ってＳ１ヌクレアーゼ（Amersham）で処理し、各種制限酵素(Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK)で消化し、消化物をTodd達が記載の方法（Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990, 71, 819-823）で、臭化エチジウムの存在下、１．５％のアガロースゲル上で電気泳動で分離した。Imp.999株の培地から抽出したＤＮＡは独特のEcoRI部位、２つのSacI部位を有し、PstI部位は全く持たない。従って、この制限プロフィールは、逆にPstI部位を有し、EcoRI部位を全く持たないＰＣＶのＰＫ／１５株（Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus） DNA: affinities with plant circovirus, 1997, 78, 221-227）が示す制限プロフィールとは異なっている。
【００４５】
実施例９
ブタサーコウイルス Imp.999株のゲノムのクローン化
制限酵素EcoRIを有するＰＣＶ Imp.999株の２本鎖複製型の消化で生じた約１．８ｋｂｐの制限断片を市販のQiagen kit（QIAEXII Gel Extraction Kit, Cat # 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, UK）を用いて１．５％アガロースゲル（実施例３参照）上で電気泳動で分離した。次に、このEcoRI−EcoRI制限断片を標準クローン化法（Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988）によって予め同じ制限酵素を用いて消化し、脱リン酸したベクターpGEM-7（Promega, Medical Supply Company, Dublin, Ireland）と結合した。得られたプラスミドを標準的方法によってEscherichia coli JM109宿主株（Stratagene, La Jolla, USA）に変換した。同じく、ＰＣＶ Imp.999株のEcoRI−EcoRI制限断片をベクターpBlueScript SK+（Stratagene, La Jolla, USA）のEcoRI部位にクローン化した。各宿主株に対して得られたクローンの中から所望の大きさの断片を有する少なくとも２つのクローンを選択した。次に、得られたクローンを培養し、Imp.999株の完全なゲノムを含むプラスミドを標準的なプラスミド調製および精製法によって少容量（２ｍｌ）または大容量（２５０ｍｌ）に精製した。
【００４６】
実施例１０
ＰＣＶ Imp.999株のゲノムＤＮＡの配列（２本鎖複製型）
２つのEcoRI Imp.999のクローン配列（クローンpGEM-7/2およびpGEM-7/8）をメーカー推薦の方法で配列キット"AmpliTaq DNA polymerase FS"（Cat # 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, UK）および"Applied BioSystems AB1373A automatic sequencing apparatus"を用いてSangerのジデオキシヌクレオチド法で決定した。最初の配列反応はM13「前方」および「後方」自在プライマーを用いて実施した。続く配列反応は「ＤＮＡ歩行」法によって実施した。その後の配列に必要なオリゴヌクレオチドはLife Technology（Inchinnan Business Park, Paisley, UK）によって合成された。
【００４７】
得られた配列を集め、MacDNASIS version 3.2のソフトウェア（Cat # 22020101, Appligene, Durham, UK）を用いて分析した。各種のオープンリーディングフレームを"National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD, USA)サーバーで入手可能なBLAST algorithmを用いて解析した。
完全な配列（EcoRI-EcoRI）は配列ＩＤ番号３（図９〜図１２）に表してある。この配列はこの株の配列を全て表しており、EcoRI部位の始めすなわち最初のヌクレオチドとしてＧから任意に始まる。
【００４８】
同様の方法で本発明の他の３つの分離株の配列を得た（配列ＩＤ番号１、２、
４および図１〜図４、図５〜図８、図１３〜図１６参照）。これら４つの株のゲノムの大きさは下記の通りである：
Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１ １７６７個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５ １７６７個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．９９９ １７６８個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１０ １７６８個のヌクレオチド
【００４９】
実施例１１
ＰＣＶ Imp.999株の配列の分析
Imp.999株から得られた配列をGenBankのデータバンクに収容された配列との相同性テストで用いた結果、検出された有意な相同性はＰＫ／１５株の配列（寄託番号Y09921）（図１７〜２６参照）と約７６％の相同性があった。
データバンク（NABIサーバーのBLAST X algorithm）を用いた６つのフェーズでの配列の翻訳の相同性テストでは、アミノ酸レベルで、GenBank U49186配列でコードされるプラント（GenBank番号1841515）のサーコウイルスに類似のＢＢＴＢウイルスの理論的レプリカーゼに対応するオープンリーディングフレームと９４％の相同性を示すということが分かった。
ＰＣＶ Imp.999株から得られた配列と有意な相同性を示すものはデータバンクに収容された他の配列にはなかった。
多機能萎縮症候群の臨床的徴候を示すカリフォルニアの子豚から得られた病変部を用いて培養されたImp.999株から得られた配列のには解析から、この単分離ウイルスが新規なブタサーコウイルス株であることが明らかになった。
【００５０】
実施例１２
配列の比較分析
新規な４つのＰＣＶ株のヌクレオチド配列とＰＣＶのＰＫ／１５株の配列（図１７〜２６）とを整列比較した。新規な４つの株と公知のＰＫ／１５株とに関する相同性マトリクスを作成した。結果は下記の通りである：
１：Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１
２：Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５
３：Ｉｍｐ．９９９
４：Ｉｍｐ．１０１０
５：ＰＫ／１５
【００５１】
【表１】
【００５２】
２つのフランス株Imp. 1011-48121とImp. 1011-48285の相同性は９９％以上（０．９９７７）である。２つの北米株Imp. 999とImp. 1010の相同性も９９％以上（０．９９４９）以上である。フランス株と北米株との相同性はわずかに９６％以上である。
これら全ての株とＰＫ／１５株との相同性は７５〜７６％の値に落ちる。
このことから、本発明の株はＰＫ／１５株に代表される種類とは異なる新規なブタサーコウイルスの代表であると言える。ＰＫ／１５がタイプＩを表すのに対し、ＰＭＷＳ症候群を示すブタから単離されたこの新規な株をタイプＩＩのブタサーコウイルスとよぶことにする。このタイプＩＩに属する株は実際には非常に離れた地理的領域から単離されたにもかかわらず、驚くべきヌクレオチド配列の相同性を示す。
【００５３】
実施例１３
新規なＰＣＶ株のゲノムによってコードされる蛋白の分析
Imp.1010単離株のヌクレオチド配列は多機能性萎縮症候群に関する他のサーコウイルス株を代表するものと考えられる。この配列をBLASTX algorithm（Altschl et al. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410）と、ソフトウェアMacVector 6.0（Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, UK）のプログラムとを組み合わせを用いて詳細に分析した。この配列（環状ゲノム）上には２０個のアミノ酸より大きいサイズのオープンリーディングフレーム（またはＯＲＦ）が１３個検出できた。この１３個のＯＲＦは下記の通りである：
【００５４】
【表２】
【００５５】
各ＯＲＦの開始位置および終了位置は株１０１０のゲノムの図１３〜図１６に表された配列（配列ＩＤ番号４）を参照する。ＯＲＦ１〜１３の端部は株９９９と同一である。これらは下記ＯＲＦ３と１３を除き、株１０１１−４８１２１および１０１１−４８２８５とも同一である：
ＯＲＦ３ １４３２−１５３９、センス、１０８ｎｔ、３５ａａ
ＯＲＦ３ ３１４−１３７７、アンチセンス、７０５ｎｔ、２３４ａａ
これら１３のＯＲＦの内で４つがクローン化ウイルスＰＣＶ ＰＫ／１５のゲノム上に位置する類似のＯＲＦと有意な相同性を有する。多機能性萎縮症候群に関連するサーコウイルス単離株全てのゲノム上に存在するオープンリーディングフレームをそれぞれ分析した。これら４つのＯＲＦは下記の通り：
【００５６】
【表３】
【００５７】
各ＯＲＦの始めと終わりの位置は図１３〜図１６に表された配列（配列ＩＤ番号４）を参照する。ＯＲＦの大きさ（ヌクレオチド=ｎｔで）は終止コドンを含む。
ＰＣＶ Imp. 1010とＰＣＶ ＰＫ−１５の単離株のゲノム機構の比較から、
２つのウイルスのゲノムに保存された４つのＯＲＦが同定できた。下記の表は観察された相同性の程度を表す：
【００５８】
【表４】
【００５９】
最大の相同性はＯＲＦ４ Imp. 1010とＯＲＦ１ ＰＫ−１５との間に見られた（８６％相同性）。このプロテインはおそらくウイルスのＤＮＡ複製に含まれ、ウイルスの複製に必須であるため、このことは予想されることである（Meehan et al., Gen. Virol. 1997,78; 221-227；Mankertz et al. J. Gen. Virol. 1998. 79. 381-384）。
ＯＲＦ１３ Imp. 1010とＯＲＦ２ ＰＫ−１５との間の配列同一性は余り強くない（６６．４％の同一性）が、この２つのＯＲＦはそれぞれ、鳥サーコウイルスＣＡＶ（Meehan et al., Arch. Virol. 1992, 124. 301-319）の主構造プロテインのＮ−末端領域と同一な良く保存されたＮ−末端基本領域を有している。さらに、ＯＲＦ７ Imp. 1010とＯＲＦ３ ＰＫ−１５との間と、ＯＲＦ１０ Imp. 1010とＯＲＦ４ ＰＫ−１５との間に大きな違いが見られた。ＰＣＶ ＰＫ−１５のＯＲＦ３とＯＲＦ４と比較すると、それぞれにImp. 1010分離株のＯＲＦ７とＯＲＦ１０のＣ−末端領域に欠失がある。最大の配列相同性はＯＲＦ７／ＯＲＦ３（重複部分の水準において６１．５％の相同性）とＯＲＦ１０／ＯＲＦ４（重複部分の水準において８３％の相同性）のＮ−末端領域の水準において見られる。
【００６０】
ブタサーコウイルスのゲノム構造はゲノムが極端に高密度であるため非常に複雑であるように見える。主構造プロテインはおそらくブタサーコウイルスゲノムの同じ鎖上に位置する複数のオープンリーディングフレーム間のスプライシングに由来するものである。従って、上記の表に記載の全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１〜ＯＲＦ１３）でタイプＩＩのブタサーコウイルスにコードされた抗原プロテインの全てまたは一部を表すことができ、これらは特有の病気および／またはワクチン接種に使用可能な抗原である。本発明はこれらのＯＲＦを少なくとも１つ含む全てのプロテインに関するものである。本発明は主としてＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１０またはＯＲＦ１３で構成されるプロテインに関するものである。
【００６１】
実施例１４
新規な株からクローンされたＰＣＶゲノムの感染特性
Imp. 999単離株の完全なゲノム（複製型）を含むプラスミドpGEM-7/8をMeehan B. 達に記載の方法によってＰＫ／１５細胞に形質移入した（Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome gragments. Arch. Virol. 1992, 124. 301-319）。未感染のＰＫ／１５細胞に形質移入した後の最初の継代に対して実施された免疫抗体法の分析（実施例４参照）から、クローンpGEM-7/8のプラスミドは感染性ＰＣＶウイルスを誘導することが示された。感染性ＰＣＶの遺伝物質を含むクローンが利用可能になったことによってウイルス性ゲノムに任意の有用な処置をして無毒化ワクチンまたは組み換えワクチンを製造し、或いは診断キット用抗原を製造することができ、変成ＰＣＶウイルス（ブタで無毒化または欠失）を製造することができるようになった。
【００６２】
実施例１５
インビトロ培養によるＰＣＶ抗原の製造
感染していないＰＫ／１５細胞の培養およびウイルス処置を実施例１と同じ方法で実施した。感染細胞を３７℃で４日間培養後、トリプシン処理し、回収し、命名した。次の継代は１ｍｌにつき４００，０００個の感染細胞を接種した。
【００６３】
実施例１６
ウイルス性抗原の不活化
ウイルス培養の最後に、感染した細胞を回収し、超音波（Branson Sonifier）またはロータースタータータイプのコロイドミル（UltraTurrax, IKA）を用いて溶解した。次に、懸濁液を３７００ｇで３０分間、遠心分離した。このウイルス懸濁液を+３７℃で１８時間、０．１％エチレンイミンで、或いは、+２８℃で２４時間、竈−プロピオラクトンで不活化した。ウイルス価が不十分な場合にはウイルス懸濁液を３００kDaのメンブレン（Millipore PTMK300）を用いた限外濾過で濃縮した。不活化ウイルス懸濁液は+５℃で貯蔵した。
【００６４】
実施例１７
有機油をベースにしたワクチン乳剤の製造
下記処方でワクチンを調製した：
不活化ブタサーコウイルス懸濁液 ： ２５０ｍｌ
Mondanide（商標登録）ISA 70（SEPPIC) : ７５０ｍｌ
水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソンμタービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。
一回のワクチン投与量は約107.5のＴＣＩＤ50を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は０．５ｍｌ、筋肉経路の投与量は２ｍｌである。
このワクチンはParvovax（登録商標）ワクチンと組合せて多機能性萎縮症候群を防ぐためのワクチン接種プログラムで用いられる。
【００６５】
実施例１８
代謝可能な油ベースのワクチン乳剤の製造
下記処方でワクチンを調製した：
不活化ブタサーコウイルス懸濁液： ２００ｍｌ
Dehymuls HRE 7（Henkel) : ６０ｍｌ
Radia 7204（Oleofina) : ７４０ｍｌ
水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソンμタービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。
一回のワクチン投与量は約107.5のＴＣＩＤ５０を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は０．５ｍｌ、筋肉内経路の投与量は２ｍｌである。
このワクチンはParvovax（登録商標）ワクチンと組合せて多機能性萎縮症候群を防ぐためのワクチン接種プログラムで用いられる。
【００６６】
実施例１９
過免疫血清（ＰＣＶ−Ｔ）、ＰＫ／１５から調製されたモノクローナル抗体Ｆ９９およびカナダ株から調製された過免疫血清（ＰＣＶ−Ｃ）で汚染されたアメリカおよびフランスのＰＣＶウイルス株およびＰＫ／１５の間接免疫抗体法の結果
【００６７】
【表５】
* 間接的免疫抗体法で正の反応を示した血清またはモノクローナル抗体の最後の希釈液の逆数。
【００６８】
実施例２０
ブタ多機能性萎縮症候群の実験的産生−プロトコル１
帝王切開で生まれ、隔離飼育器に入れた生後３日の純粋隔離群の子豚にＰＣＶウイルス溶液を接種した。タイプＩＩのＰＣＶには病気のブタから得られたリンパ節ホモジネートから得られたＩｍｐ．１０１０単離株およびウイルスを用いた。５つの群を作った。〔表６〕の１．５ｍｌのウイルス溶液を生後３日の全ての子豚に口鼻経路で接種した。
【００６９】
【表６】
【００７０】
抗原投与実験の結果
５週間の観察期間中に、Ｂ群の１匹の子豚に有意な消耗が見られたほかは臨床的徴候が見られなかった。死体解剖ではＡ群、Ｂ群、Ｃ群の子豚にリンパ節、特に顎下、気管支、腸間膜、腸骨および大腿の神経節の過形成（Ｄ群、Ｅ群の子豚の２〜１０倍のサイズ）が見られた。この過形成は単球およびマクロファージの浸潤によって皮質領がかなり拡大することに関係がある。
Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の子豚には気管支リンパ組織の過形成も見られる。
各Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の１匹の子豚に肺炎が認められる。
有意な消耗が見られるＢ群の子豚、およびＡ群の１匹の子豚には胃潰瘍が認められる。
【００７１】
さらに、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の全ての子豚には胃腸の筋層に筋肉炎が認められる。
Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の大部分の子豚には心筋炎、リンパ球の多巣性肝炎、マクロファージおよび好酸球の浸潤、ならびに皮質および延髄の間質性腎炎が認められる。
Ｃ群の１匹の子豚は肝臓の表面に明らかな播種性の病巣があり、通常よりもサイズが大きい。
Ｄ群およびＥ群の子豚に病変は認められなかった。
Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の子豚の器官からサーコウイルスを単離した。
【００７２】
実施例２１
ブタ多機能萎縮症候群の実験的再産生−プロトコル２、３
出生後に母親から隔離した通常飼育の子豚にタイプＩＩのＰＣＶウイルス、ブタパルボウイルスまたはこれら２つのウイルスの混合物ウイルス溶液を接種した。
タイプＩＩのＰＣＶウイルスにはＩｍｐ．１０１０およびＩｍｐ．１０１１単離株（株４８１２１）を用いた。
ＰＰＶウイルスにはカナダの単離株Ｉｍｐ．１００５を用いる。このウイルスは周知な他のブタパルボウイルス株（ＰＰＶ株ＮＡＤＬ−２およびKresse株）の配列と同一の１つの配列（配列決定されたゲノムの１／３）を有する。
２つの実験的プロトコルを実施した。
【００７３】
プロトコル２
生後３日の子豚からなる３つの群を作成した。全ての子豚に〔表７〕の１ｍｌのウイルス溶液を口鼻経路で接種した。
【００７４】
【表７】
【００７５】
抗原投与実験の結果
Ａ群：接種の２１日後に２匹の子豚が死んだ。２４日後に１匹の子豚を無痛屠殺した。
Ｂ群：接種の２３日後に１匹の子豚が死んだ。２４日後に１匹の子豚を無痛屠殺した。
感染後に死んだ子豚の死体解剖では有意な巨視的病変の存在が示された：胸膜腔中の体液の存在、肺浮腫、腎臓の出血、腎臓上のピン頭形の淡い色の病変、肝臓の壊死がみられた。これらの病変はフィールドでみられる病変と同一である。
屠殺した子豚の死亡解剖では巨視的病変はみられなかった。
【００７６】
感染後に死んだＡ群およびＢ群の子豚およびこれら２つの群の屠殺した子豚から取り出した器官に対して行った組織学試験ではフィールドの子豚で見られるブタ多機能萎縮症候群の病変の典型的かつ完全なパターンがみられた：肝臓の壊死、リンパ節の壊死、膵臓の壊死、腎臓の焦点壊死および激しい出血、肺中の合胞体の存在、核封入体の存在を伴う肝細胞の激しい壊死。
これら全ての病変（死んだブタまたは犠牲のブタ）で大量のＰＣＶ抗原が発見されたが、これらの同じ病変にＰＰＶ抗原の存在を示すことができなかったことは注目すべきである。
Ｃ群の対照子豚からは病変を検出できなかった。
【００７７】
プロトコル３
生後４週間の子豚からなる４つの群を作成した。全ての子豚に〔表８〕の１ｍｌのウイルス溶液を口鼻経路で接種した。
【００７８】
【表８】
【００７９】
抗原投与実験の結果
各実験群（Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群）の１匹の「対照」ブタおよび２匹のブタを接種の２週間後に無痛屠殺し、死体解剖した。Ｄ群（ＰＣＶ＋ＰＰＶ同時感染）の２匹の子豚に有意な免疫組織学的病変が認められた。これらの病変にブタパルボウイルスの存在を示すことはできなかったが、Ｄ群の全ての子豚にブタパルボウイルスに関連するセロコンバージョンが認められたことは注目すべきである。
対照子豚および他の群の子豚には巨視的または組織学的病変を検出することはできなかった。
【００８０】
従って、ＰＣＶ＋ＰＰＶの組合せによってブタ多機能萎縮症候群の典型的な組織学的病変を再生することができるように思われる。
これら２つの実験的プロトコルから、ＰＣＶ＋ＰＰＶ混合物としてＰＣＶのみを接種することによってブタ多機能萎縮症候群を多かれ少なかれ大量に再生できるが、病変からはブタサーコウイルスしか検出できないことが理解できる。逆に、ＰＰＶのみに実験的に感染させることによって（プロトコル３のＢ群）、巨視的および組織学的病変を誘発させることはできない。しかし、ＰＶＣの存在下では、生後４週間の子豚に病変の出現が認められた（プロトコル３のＤ群）。
【００８１】
[配列表]
配列ＩＤ番号１ ＝ Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号２ ＝ Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号３ ＝ Ｉｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号４ ＝ Ｉｍｐ．１０１０株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号５ ＝ ＰＫ／１５株のゲノムのＤＮＡ配列
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＭＷＳ症候群（ブタ多機能萎縮症候群:Porcine Multisystemic Wasting Syndrome）（離乳後多機能萎縮症候群:Post-weaning Multisystemic Wasting Syndromeともいわれる）に対するワクチンに関するものである。
以下では各種文献を引用し、各種文献を参照するが、これらの文献の全てを実際に本発明に関する従来例であると認めらたものではない。本明細書に引用した全ての文献およびそれらで引用された全ての文献の内容は本明細書の一部を成す。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＶ（ブタサーコウイルス、procine circoviridae）はブタ腎臓細胞株ＰＫ／１５中に無毒病原性汚染物質として最初に見い出された。このウイルスＰＣＶはチキン貧血症ウイルス（ＣＡＶ、Chicken Anaemia Virus）および嘴・羽症候群ウイルス（ＰＢＦＤＶ、Pscittacine Beak and Feather Disease Virus）とともにサーコウイルス群（Circoviridae）に分類された。これらのウイルスはエンベロプのない小さなウイルス（１５〜２４ｎｍ）で、その共通な特徴は１．７６〜２．３１ｋｂの環状一本鎖のＤＮＡからなるゲノムを含む点にある。このゲノムは約３０ｋＤａのポリペプチドをコード化すると考えられていた（非特許文献１）が、最近の研究でさらに複雑な転写がわかってきた（非特許文献２）。しかも、上記３種類のサーコウイルス（circovirus）はそのヌクレオチド配列に有意な相同性はなく、また、共通の抗原決定基もない。
【０００３】
上記ＰＫ／１５細胞由来のＰＣＶは病原性ではないと考えられる。この配列は非特許文献３が明らかにしている。ＰＣＶ株が病原性で、ＰＭＷＳ症候群と関連があるかもしれないと考えられるようになったのはほんの最近のことである（非特許文献４および非特許文献５）。Nayer達はＰＣＲ法を用いてＰＭＷＳ症候群を示すブタ中にＰＣＶのＤＮＡを見い出した。
【０００４】
カナダ、米国およびフランスで見られるＰＭＷＳ症候群の臨床的な特徴は、体重を徐々に失い、頻呼吸症、呼吸困難および黄疸等を発症することである。病理的な面ではリンパ性または肉芽種性浸潤、リンパ節腫脹、まれには肝炎およびリンパ性または肉芽種性腎炎を発症する（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Todd et al., Arch Virol 1991, 117; 129-135
【非特許文献２】Meehan B. M. et al., 1997,78; 221-227
【非特許文献３】B. M. Meehan et al., J. Gen. Virol 1997 (78) 221-227
【非特許文献４】Gupi P. S. Nayar et al., Can. Vet. J, Vol. 38, 1997: 385-387
【非特許文献５】Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501
【非特許文献６】Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501；
【非特許文献７】La Semaine Veterinaire 1996 (834)、
【非特許文献８】La Semaine Veterinaire No. 26；
【非特許文献９】La Semaine Veterinaire 1997 (857)：５４；
【非特許文献１０】Gupi P. S. Nayar et al., Can. Vet. J, Vol. 38, 1997: 385-387
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願人は、カナダ、米国（カリフォルニア）およびフランス（ブリタニー）の農場から得た肺または神経節の標本から５つの新規なＰＣＶ株を単離することに成功した。これらのウイルスはＰＭＷＳ症候群のブタの病変部に検出されるが、健康なブタには検出されない。
【０００７】
本出願人はさらに、これらの４種の株（カナダおよび米国の株）と２種のフランスの株のゲノムの配列決定した。これらの株はヌクレオチドレベルで互いに非常に強い相同性（９６％以上）を示す、一方、ＰＫ／１５株ははるかに弱い相同性（約７６％）しか示さない。従って、新規のタイプのブタサーコウイルス （circovirus）を代表するものと考えられ、ＰＫ／１５に代表されるタイプＩ（第Ｉ群）に対して、本発明の新規な株はタイプＩＩ（第ＩＩ群）とよぶことにする。
【０００８】
５種の株の精製物はブダペスト条約に従ってＥＣＡＣＣ（European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom）に寄託された下記の精製物である：
１９９７年１０月２日木曜日寄託：
寄託番号第Ｖ９７１００２１９号（以下、Ｉｍｐ．１００８ＰＣＶという）
寄託番号第Ｖ９７１００２１８号（以下、Ｉｍｐ．１０１０ＰＣＶという）
寄託番号第Ｖ９７１００２１７号（以下、Ｉｍｐ．９９９ＰＣＶという）
１９９８年１月１６日金曜日寄託：
寄託番号第Ｖ９８０１１６０８号（以下、Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５という）
寄託番号第Ｖ９８０１１６０９号（以下、Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１という）
本出願人はブタ多機能性萎縮症候群の実験的再生試験から、ブタパルボウイルスとブタサーコウイルスとを組合せたものは病気を悪化させるということを見い出した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明の対象はブタパルボウイルスワクチンと、ブタサーコウイルス、特にタイプＩまたはタイプＩＩ、好ましくはタイプＩＩのワクチンとを組合せて用いるブタのワクチン接種方法にある。これはブタサーコウイルスワクチンとブタパルボウイルスとの二価のワクチンをブタへワクチン接種するか、これらを同時に併用してブタにワクチン接種するということを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１株のゲノムのＤＮＡ配列
【図２】図１の続き
【図３】図２の続き
【図４】図３の続き
【図５】Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５株のゲノムのＤＮＡ配列
【図６】図５の続き
【図７】図６の続き
【図８】図７の続き
【図９】Ｉｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
【図１０】図９の続き
【図１１】図１０の続き
【図１２】図１１の続き
【図１３】Ｉｍｐ．１０１０株のゲノムのＤＮＡ配列
【図１４】図１３の続き
【図１５】図１４の続き
【図１６】図１５の続き
【図１７】PCV PK/15株の配列と図１〜１６の４つの配列との整列化
【図１８】図１７の続き
【図１９】図１８の続き
【図２０】図１９の続き
【図２１】図２０の続き
【図２２】図２１の続き
【図２３】図２２の続き
【図２４】図２３の続き
【図２５】図２４の続き
【図２６】図２５の続き
【発明を実施するための形態】
【００１１】
パルボウイルス対照株はＶＲ−７４２の参照番号でＡＴＣＣの収集株からアクセス可能なＮＡＤＬ−２株である。ブタパルボウイルスに対するワクチン接種は当業者に周知であり、ブタパルボウイルスに対するワクチンは市販されている。その一例としてはParvovax（登録商標）を挙げることができる［メリアル（MERIAL）から供給されるブタパルボウイルスに対する不活性化ワクチン］。また非特許文献１１、非特許文献１２を参照されたい。
【非特許文献１１】P.VannierおよびA.Laval.、Point.Vet.1993年、25(151)、53〜60頁
【非特許文献１２】G.Florent達の第9回ブタ獣医学会会議の議事録（1986年7月15〜18日、スペイン、バルセロナ）
【００１２】
ＤＮＡワクチンに関しては例えばWO-A98 03658を参照することができる。
従って、本発明の対象は少なくとも１種のブタサーコウイルス抗原（好ましくはタイプＩＩのサーコウイルス）と、少なくとも１種のブタパルボウイルス抗原とからなるＰＭＷＳ症候群に対する抗原性製剤（調整物）にある。本発明で用いるブタサーコウイルス抗原（好ましくはタイプＩＩのサーコウイルス）およびブタパルボウイルス抗原は無毒化した生の全抗原、不活性化した生の全抗原、サブユニット抗原、組み換え生ベクターおよびＤＮＡベクターから成る群の中から互いに独立して選択することができる。本発明の組合せ物は他の任意の適当な抗原または抗原性製剤を一緒に用いることができるということは理解できよう。所定の組合せに対して同じ形を用いる必要がないことも理解できよう。本発明の抗原性製剤は周知の方法で獣医学上許容されるビヒクルまたは賦形剤（さらに必要な場合には獣医学上許容されるアジュバント）をさらに含むことができる。
【００１３】
本発明のさらに他の対象は、有効量の上記サーコウイルス＋パルボウイルス抗原性製剤と、獣医学上許容されるビヒクルまたは賦形剤（さらに必要な場合には獣医学上許容されるアジュバント）とからなるＰＭＷＳ症候群に対するワクチンにある。免疫抗原性組成物は免疫抗原性反応を誘発するが、この反応は保護的なものであることは必ずしも保護的でない場合もある。ワクチン組成物は保護的反応を誘発する。従って、「免疫抗原性組成物」には「ワクチン組成物」が含まれる（前者の用語は保護的組成物であるので）。
【００１４】
本発明のさらに他の対象は、ブタサーコウイルスに対する抗原性製剤または免疫抗原性組成物またはワクチン、およびブタパルボウイルスに対する抗原性製剤または免疫抗原性組成物またはワクチンを含む個別包装した免疫抗原性またはワクチン接種キットにある。このキットは抗原性製剤、免疫抗原性組成物およびワクチンで記載の各種特徴を有することができる。
【００１５】
本発明のさらに他の対象は、ブタサーコウイルスに対する免疫抗原性組成物またはワクチンと、ブタパルボウイルスに対する免疫抗原性組成物またはワクチンとを投与するか、各ウイルスに特有な各抗原性製剤を同一処方中に含む２価の免疫抗原性組成物またはワクチンを投与するＰＭＷＳ症候群に対する免疫化またはワクチン接種の方法にある。この免疫化またはワクチン接種方法では特に上記のワクチンを用いる。
【００１６】
本発明のさらに他の対象は、ＰＭＷＳ症候群予防用医薬組成物の製造における、パルボウイルスに対する抗原性製剤または免疫抗原性組成物またはワクチンとブタサーコウイルスに対する抗原性製剤または免疫抗原性組成物またはワクチンとを組合せた使用にある。
サーコウイルス抗原性製剤の製造用サーコウイルスは細胞株、特にＰＫ／１５細胞の継代で得ることができる。この培養上澄みまたは抽出物を抗原性製剤としては用いることができ、必要に応じて標準的な方法によって精製することができる。
【００１７】
無毒化した抗原性製剤および無毒化した免疫抗原性組成物またはワクチンでの無毒化は通常の方法、例えば細胞の継代、好ましくはブタ細胞、特にＰＫ／１５細胞株の継代（特に５０〜１５０、特に１００回の継代）で行うことができる。この免疫抗原性組成物およびワクチンは一般に獣医学上許容される媒体または希釈液を含むことができ、必要に応じてさらに獣医学上許容されるアジュバントおよびフリーズドライ安定剤を含むことができる。
本発明の抗原性製剤、免疫抗原性組成物およびワクチンは上記の無毒化ウイルスを103〜107ＴＣＩＤ５０含むのが好ましい。
【００１８】
本発明の抗原性製剤、免疫抗原性組成物およびワクチンは無毒化した生全ワクチンをベースとする免疫抗原性組成物およびワクチンにすることができる。無毒化した免疫抗原性組成物およびワクチンは獣医学上許容される媒体または希釈液を含むことができ、必要に応じてさらに獣医学上許容されるアジュバントを含むことができる。
【００１９】
本発明のサーコウイルス（断片の形でもよい）は当業者に公知の方法で不活性化される。この不活性化は化学的方法、例えば抗原をホルムアルデヒド（ホルマリン）、パラフォルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミンまたはその誘導体等の試薬で処理して行なうことができる。好ましい不活性化法は試薬、特にエチレンイミンまたはβ−プロピオラクトンで処理する方法である。
本発明の不活性化抗原性製剤および不活性化免疫抗原性組成物およびワクチンにはアジュバントを加え、当業者に公知の方法でエマルジョンの形、例えば油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョン等の乳剤の形にするのが好ましい。一般的なアジュバント化合物を有効成分に添加してアジュバント処理することもできる。
【００２０】
使用可能なアジュバントとしては例えば水酸化アルミニウム、サポニン（例えばQuillja saponinまたはQuil A；"Vaccin Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Michael F. Powel と Mark J. Newman編、Plennum Press, New-York and London, p.210"参照）、Avridine（商標登録）（Vaccine Design p. 148参照）、DDA（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Vaccine Design p. 157参照）、ポリホスファゼン（Vaccine Design p. 204参照）、さらには有機油、スクアラン（例えばＳＰＴ乳剤、Vaccine Design p. 147参照）、スクアレーン（例えばＭＦ５９、Vaccine Design p. 183参照）をベースとする水中油乳剤または代謝可能な油をベースとする油中水乳剤（好ましくは国際特許第WO-A-94-20071号による）および米国特許第5,422,109号に記載の乳剤を挙げることができる。アジュバントの組み合わせ、例えば乳剤Avridine（商標登録）またはDDAとの組み合せを選択することもできる。
本発明の抗原性製剤、免疫抗原性組成物およびワクチンは上記の不活性化全ウイルスを105〜108のＴＣＩＤ５０含むのが好ましい。
【００２１】
上記の生ワクチン用のアジュバントは不活性化ワクチン用のものから選択するこができる。乳剤が好ましい。不活性化ワクチン用のものには国際特許第WO-A-94-16681号に記載のものも加えることができる。
凍結安定剤としては例えばＳＰＧＡ（Bovarnik et al., J. Bacteriology 59, 509, 950）、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストランまたはグルコース等の炭水化物、アルブミンまたはカゼイン等のプロテイン、これらの化合物の誘導体またはアルカリ金属燐酸塩等の緩衝剤を挙げることができる。
本発明の抗原性製剤、免疫抗原性組成物およびワクチンは１種以上の本発明のサーコウイルスおよび／またはパルボウイルスを有効成分（抗原）として含むことができる。
【００２２】
本件出願人はさらに、配列ＩＤ番号１〜４で識別される４つのタイプＩＩのブタサーコウイルス単離株のゲノムを得た。株ＰＫ−１５の配列は配列ＩＤ番号５で表される。本発明はこれと均等な配列すなわち上記配列の株の特徴または上記配列によりコードされるポリペプチドの機能を変更しない配列も含むものであるということは当然である。また、コードの欠失(degenerescence)により変化した配列も含むということは理解できよう。
本発明はさらに、厳密な条件下で上記配列と混成（ハイブリッド化）が可能であり、および／または、本発明株と高い相同性を有するという意味で均等な配列も含むものである。
【００２３】
これらの配列およびその断片は適当なベクターを用いてインビトロまたはインビボでポリペプチドの有利に用いることができる。
特に、これに使用可能な本発明のＤＮＡ断片を形成するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１〜１３）はタイプＩＩのサーコウイルスのゲノム配列で同定されている。本発明は、少なくともこれらのオープンリーディングフレーム（対応するアミノ酸配列）の一つを含む全てのポリペプチドに関するものである。特に、本発明は主としてＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１０またはＯＲＦ１３で構成される蛋白に関するものである。
【００２４】
インビトロのサブユニットを発現するための発現手段としては大腸菌（E. coli）またはバキュロウイルス（米国特許第4,745,051号）を用いるのが好ましい。上記の単数または複数のコード配列またはその断片をバキュロウイルスゲノム（例えばAutographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV）に組み込み、次いで、それを昆虫細胞、例えばSpodoptera fruigiperda Sf9（寄託番号ATCC CRL 1711）で増殖させる。また、イースト（例えば酵母)またはほ乳類細胞（例えばCHO、BHK）等の真核細胞でサブユニットを製造することもできる。
【００２５】
本発明のさらに他の対象は、これらの発現手段によってインビトロで製造され、必要に応じて一般的な方法で精製されたポリペプチドのサブユニットの使用にある。サブユニット免疫抗原性組成物およびワクチンは、このようにして得られた少なくとも１つのポリペプチドまたはその断片を獣医学上許容される媒体または希釈液(必要に応じて獣医学上許容されるアジュバントをさらに含むことができる)中に含む。
【００２６】
組み換え生タイプまたはＤＮＡタイプのワクチンの免疫抗原性組成物およびワクチンの製造時にインビボ発現させるには単数または複数のコード化配列またはその断片を単数または複数のポリペプチドを発現できる条件下で適当な発現ベクターに挿入する。適切な生のベクターとしてはブタで増殖可能でブタに対しては非病原性の生ウイルスを当業者に周知の方法で使用するのが好ましい。特に、アウジェスキー病ウイルス、ブタアデノウイルス等のブタヘルペスウイルス、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ブタポックスウイルス等を用いることができる。ＤＮＡベクターをベクターとして用いることもできる（国際特許第WO-A-90-11092号、WO-A-93-19813号、WO-A-94-21797号、WO-A-95-20660号）。
【００２７】
従って、本発明の他の対象は、このようにして調製されたベクターと、組み換え生タイプまたはＤＮＡ（ポリヌクレオチド）タイプの免疫抗原性組成物またはワクチンにある。これらの調製および使用、免疫抗原性組成物およびワクチンは獣医学上許容される媒体または希釈液を含むことができる。
ＤＮＡ免疫抗原性組成物またはワクチンは、その定義上、抗原ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を組み込み且つインビボで発現する、円形のワクチンプラスミド、スーパーコイル等または線状のＤＮＡ分子であるＤＮＡベクターを含む。
組換えタイプおよびＤＮＡタイプの免疫抗原性組成物およびワクチンはアジュバントを含むことができる。
【００２８】
免疫化またはワクチン接種の組合せプログラムでは、上記のブタサーコウイルスおよびブタパルボウイルスに対する免疫化またはワクチン接種をブタの他の病原体、特にＰＭＳＷ症候群に関連する病原体に対する免疫化またはワクチン接種と組合せることができる。本発明の免疫抗原性組成物またはワクチンはブタの他の病原体に対応する他のワクチン価を含むことができる。これらのブタの他の病原体はＰＲＲＳ（Porcine Reproductory and Respiratory Syndrome:ブタ生殖器および呼吸器症候群）および／またはMycoplasma hyopneumonia、E. coli、および／または萎縮鼻炎（Atrophic Rhinitis）、および／または仮性狂犬病（アウジェスキー病）ウイルスおよび/またはブタインフルエンザおよび/またはアクチノバシラス胸膜肺炎菌および/またはブタコレラ、およびこれらの組合せの中から選択される。本発明の免疫化またはワクチン接種のプログラムおよびワクチンはサーコウイルスおよびパルボウイルスに対する免疫化またはワクチン接種と、ＰＲＲＳ（国際特許第WO-A-93-07898号、WO-A-94-18311号、フランス国特許第2,709,966号；C. Chareyre 他、第15回IPVS Congress,Birmingham, England, 5-9 July 1998, p. 139の議事録を参照）および/またはMycoplasma hyopneumonia（欧州特許第597,852号、第550,477号、第571,648号および前記の第15回IPVS CongressのO. Martinon 達、p. 157, 284, 285およびG. Reynaud達、p. 150を参照）および/またはブタインフルエンザとを組合せるのが好ましい。すなわち、任意の適当な免疫抗原性組成物またはワクチン、特に任意の市販のワクチンを用い、それと上記のブタサーコウイルスおよびブタパルボウイルスに対する免疫抗原性組成物またはワクチンとを組合せることができる。
【００２９】
従って、本発明のさらに他の対象は免疫抗原性多価組成物および多価ワクチンと、多価ワクチンキットと、免疫化またはワクチン接種の組合せプログラムで使用可能な免疫化またはワクチン接種法にある。
以下、図面を参照して本発明の実施例をさらに詳細に説明する。しかし、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１
ブタサーコウイルス（circovirus）株の培養および分離
組織標本はフランス、カナダおよび米国で子豚の肺およびリンパ節から集めた。これらの子豚は離乳後多機能萎縮症候群に典型的な臨床的徴候を示したものである。ウイルスを単離するため組織標本は死体解剖直後に−７０℃で冷凍した。
ウイルス単離のために無菌の乳鉢と乳棒を用いて無菌の砂で組織を粉砕し、イール（Earl）塩 （EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Workingham, UK）、ペニシリン（１００IU/ml）およびストレプトマイシン（１００μｍ／ｍｌ）を含む最小培地（ＭＥＭ−ＳＡ培地）中に約１５％の組織標本を含む懸濁液を調製した。粉砕物をＭＥＭ−ＳＡに溶解し、+４℃、３０００ｇで３０分間、遠心分離にかけて上澄みを回収した。
【００３１】
細胞培地の接種前に、１００μｌのクロロホルムを２ｍｌの各上澄みに添加し、室温で１０分間混合した。この混合物を超遠心分離管に移し、１０分間３０００ｇで遠心分離して上澄みを回収した。次いで、この上澄みをウイルス分離実験で種菌として用いた。
全てのウイルス単離研究はブタサーコウイルス(ＰＣＶ)、ペスチウイルス、ブタアデノウイルスおよびブタパルヴォウイルスに感染していないことが分かっているＰＫ／１５細胞培地で実施した（Allan G. et al., Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64）。
【００３２】
ブタサーコウイルスの単離は下記方法によって実施した：
ＰＫ／１５細胞の単一層をトリプシン処理（トリプシン−versene混合物）によって集密的な培養から解離し、最終濃度が約４００，０００細胞/１ｍｌであるペスチウイルス（=ＭＥＭ−Ｇ培地）に感染していない１５％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ−ＳＡ培地に溶解した。次に、この細胞懸濁液の１０ｍｌの部分標本を２ｍｌの前記接種材料の部分標本と混合し、最終混合物を２つの２５cm2ファルコンフラスコに６ｍｌの容積に分取した。+３７℃で１８時間、１０％のCO2を含む雰囲気下で培養した。
【００３３】
培養後、半集密的な単一層を３００ｍＭのＤ−グルコサミン（Cat # G48175、
Sigma-Aldrich株式会社、Poole, UK）で処理し（Tischr I. et al., Arch. Virol., 1987 96 39-57）、さらに３７℃で４８〜７２時間培養を続けた。この最終培養に続いて、２つのファルコンの１方を３回凍結／融解サイクルにかけた。残りのファルコンのＰＫ／１５細胞はトリプシン−versene溶液で処理し、２０ｍｌのＭＥＭ−Ｇ培地中に再懸濁し、４００，０００細胞／ｍｌ濃度で７５cm2ファルコン中に接種した。新しく接種されたフラスコは凍結／融解サイクル後に得られた対応する可溶化液５ｍｌを添加して「超感染」させた。
【００３４】
実施例２
免疫抗体法または切片上ハイブリッド形成法によるブタサーコウイルスを検出するためのするための細胞培地標本の調製
５ｍｌの容積の「超感染」した懸濁液を回収し、無菌で脱脂したカバーガラスを含む直径５５ｍｍのペトリ皿中に接種した。フラスコ中およびカバーガラス上で+３７℃で培養し、実施例１に記載のグルコサミンで処理した。カバーガラス上での培養はグルコサミン処理後２４〜４８時間で回収し、室温で１０分間アセトンを用いて、または４時間緩衝剤処理した１０％のホルムアルデヒドを用いて固定した。この固定後、全てのカバーガラスをシリカゲル上で−７０℃で貯蔵してから、ハイブリッド形成の研究および細胞免疫の研究に使用した。
【００３５】
実施例３
ハイブリッド形成法(in situ)によるＰＣＶ配列の検出法
ハイブリッド形成法(in situ)は病気のブタから集めた組織に対して実施し、
ホルムアルデヒドで固定し、ウイルス単離（実施例２参照）用に接種した細胞培地の調整で用い、カバーガラスに固定した。
ＰＫ／１５ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）および感染性ニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡＶ）に対応する完全なゲノムプローブを用いた。１．７キロの塩基ペア（kbp）の挿入断片の形にクローン化されたＰＣＶゲノムの複製型を含むプラスミドpPCVI（Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circovirus, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227）をＰＣＶ固有ＤＮＡ源として用いた。２．３ｋｂｐの鳥サーコウイルスＣＡＶの複製型を含む鳥プラスミドpCAAIを負対照として用いた。２つのプラスミドのグリセロール源をアルカリ法（Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988）によってプラスミドの製造および精製で用い、これらはプローブ調製用のテンプレートとして用いた。ＰＣＶおよびＣＡＶの完全なゲノムを表すサーコウイルスプローブはメーカー推薦の方法で市販の非放射性ラベリングキット（"DIG DNA Labelling Kit"、Boehringer Mannheim, Lewis, UK）を用いて上記精製プラスミド（各プローブに１μｇ）およびヘキサヌクレオチドプライマーから製造した。
【００３６】
ハイブリッド形成法(in situ)で使用する前に、プローブをジゴキシジェニンで標識化し、容積５０〜１００μｌの純水に溶解した。
パラフィンに包み、ホルムアルデヒドで固定した病気のブタの組織標本と、ホルムアルデヒドで固定した感染細胞培地の製剤を下記方法でＰＣＶ核酸検出のために調製した：
５μｍ厚の切片をパラフィンに包まれた組織塊から切り出し、濃度を次第に薄くしたアルコール溶液中で再水和した。ホルムアルデヒドで固定した組織切片および細胞培地を１５分間および５分間それぞれ５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝剤（ｐＨ７．６）を用いた０．５％のプロテナーゼＫ溶液中で+３７℃で培養した。次に、スライドガラスを加圧滅菌した蒸留水中の１％グリシン溶液中に３０秒配置し、０．０１ＭのＰＢＳ緩衝剤（燐酸緩衝食塩水）（ｐＨ７．２）で２度洗浄し、最後に無菌蒸留水で５分間洗浄した。スライドガラスを最後に外気で乾燥し、プローブと接触させた。
【００３７】
各組織／プローブ製剤を清潔な脱脂カバーガラスで被覆し、+９０℃の炉内に１０分間配置した後、氷塊と１分間接触させ、最後に+３７℃で１８時間培養した。次に、調整物を２Ｘクエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）緩衝剤（ｐＨ７．０）に短時間含浸した後、２ＸのＳＳＣ緩衝剤中で５分間、２回洗浄し、最後にＰＢＳ緩衝剤中で５分間、２回洗浄した。
洗浄後、調整物を０．１Ｍのマレイン酸、０．１５ＭのＮａＣＬ（ｐＨ７．５）（マレイン緩衝剤）の溶液中に１０分間含浸し、マレイン緩衝剤中の遮断試薬の１％溶液（Cat # 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK）中で+３７℃で２０分間培養した。
【００３８】
次に、調整物を遮断緩衝剤で希釈された抗ジゴキシジェニンモノクローナル性抗体（Boehringer Mannheim）の１／２５０溶液中で+３７℃で１時間培養し、ＰＢＳ中で洗浄し、最後に抗ネズミ免疫グロブリン抗体を用いて+３７℃で３０分間培養した。調整物をＰＢＳで洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ作用を室温で２０分間、ＰＢＳ中の０．５％水酸化ペルオキシド溶液で処理して遮断した。調整物を再度ＰＢＳ中で洗浄し、使用直前に調製した３−アミノ−９−ジエチルカルバゾル（ＡＥＣ）基質（Cambridge Bioscience, Cambridge, UK）で処理した。
最後に水道水で洗浄した後、調整物をヘマトキシリンで逆染色し、水道水で"青色化"して固定液（GVA Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, UK）で顕微鏡のカバーガラスに固定した。対照実験には無関係な負プローブ（ＣＡＶ）と正プローブ（ＰＣＶ）を病気のブタおよび病気ではないブタから得られた標本で使用することが含まれる。
【００３９】
実施例４
免疫蛍光抗体法によるＰＣＶの検出法
アセトンを用いて固定した全ての細胞倍地の最初のスクリーニングを貯蔵した大人のブタ血清の１／１００希釈を用いた間接免疫蛍光抗体法（ＩＩＦ）で実施した。この貯蔵血清は北アイルランドの２５匹の大人の雌ブタからの血清を含み、ＰＣＶ：ブタパルボウイルス、ブタアデノウイルスおよびＰＲＲウイルスを含む広範囲のブタのウイルスに対する抗体を含むことで知られている。血清（ＰＢＳで希釈）を細胞培地と+３７℃で１時間接触させた後、ＰＢＳ中で２回洗浄してＩＩＦを実施した。細胞培地をイソチオシアン酸フルオレセインに結合したＰＢＳで１／８０に希釈したウサギの抗ブタ免疫グロブリン抗体を用いて１時間染色し、ＰＢＳで洗浄し、グリセロール緩衝剤に固定し、紫外線下で顕微鏡観察した。
【００４０】
実施例５
病気のブタの組織における切片上ハイブリッド形成結果
フランス、カナダおよびカリフォルニアの多機能性萎縮病変を有する子豚から集めた組織から調製したＰＣＶゲノムプローブを用いた切片上ハイブリッド形成法から、研究された複数の病変部に病変部に関連するＰＣＶ核酸の存在が示された。これに対してＰＣＶゲノムプローブを病気でないブタから集めた組織に用い時またはＣＡＶプローブを病気のブタの組織に用いた時には何の徴候も見られなかった。ＰＣＶ核酸の存在はサイトプラズムおよびカリフォルニアの子豚の肺の病変部を浸潤する多数の単核細胞の核に認められた。ＰＣＶ核酸の存在は肺細胞、気管支および細気管支の上皮細胞および細動脈、細静脈およびリンパ管の内皮細胞にも見られた。
【００４１】
病気のフランスのブタではＰＣＶ核酸の存在は多数の濾胞性リンパ細胞のサイトプラズマおよびリンパ節の同様な毛細血管内の単核細胞に検出された。また、ＰＣＶ核酸は一次的合胞体にも検出された。これらの検出結果から、カリフォルニアのブタの肺、フランスのブタの腸間膜リンパ節およびカナダのブタの器官の標本を新規なブタサーコウイルス株の単離用に選択した。
【００４２】
実施例６
新規なブタサーコウイルス株の細胞培養結果と、免疫蛍光抗体法による検出
多機能性萎縮症候群の臨床的徴候を示すフランスの子豚（Imp. 1008株）、カリフォルニアの子豚（Imp. 999株）およびカナダの子豚（Imp. 1010株）から集めた標本を培養した細胞培地には細胞変性作用（ＣＰＥ）は全く見られなかった。しかし、アセトンを用いて固定した後、貯蔵されたブタのポリクローン化した血清を用いて培養した細胞培地から得られた製剤を免疫標識化することによって、カリフォルニアの子豚（Imp. 999株）の肺、フランスの子豚（Imp. 1008株）の縦隔リンパ節およびカナダの子豚（Imp. 1010株）の器官を用いて培養した培地中の多数の細胞に核蛍光が現れた。
【００４３】
実施例７
ブタサーコウイルスのゲノムＤＮＡの抽出
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）の新規な株の複製型を７２〜７６時間の培養後に回収した感染したＰＫ／１５細胞培地（実施例１参照）（７５cm2ファルコン１０個）を用いて調製し、ＣＡＶの複製型のクローン化で記載したグルコサミンで処理した（Todd. D. et al., Dot blot hybridization assay for chicken anaemia agent using a cloned DNA probe. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, 933-939）。この複製型の２本鎖ＤＮＡはHirt法（Hirt B. Selective extraction of polyoma virus DNA from infected cell cultures, J. Mol. Biol. 1967, 36, 365-369）の変形法で抽出した(Molitor T. W. et al. Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replicative form DNA of two virus isolates, Virology, 1984, 137, 241-254)に記載)。
【００４４】
実施例８
ブタサーコウイルス Imp.999株のゲノムの複製型の制限地図
Hirt法で抽出されたＤＮＡ（１〜５μｇ）をメーカの推薦する方法に従ってＳ１ヌクレアーゼ（Amersham）で処理し、各種制限酵素(Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK)で消化し、消化物をTodd達が記載の方法（Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990, 71, 819-823）で、臭化エチジウムの存在下、１．５％のアガロースゲル上で電気泳動で分離した。Imp.999株の培地から抽出したＤＮＡは独特のEcoRI部位、２つのSacI部位を有し、PstI部位は全く持たない。従って、この制限プロフィールは、逆にPstI部位を有し、EcoRI部位を全く持たないＰＣＶのＰＫ／１５株（Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus） DNA: affinities with plant circovirus, 1997, 78, 221-227）が示す制限プロフィールとは異なっている。
【００４５】
実施例９
ブタサーコウイルス Imp.999株のゲノムのクローン化
制限酵素EcoRIを有するＰＣＶ Imp.999株の２本鎖複製型の消化で生じた約１．８ｋｂｐの制限断片を市販のQiagen kit（QIAEXII Gel Extraction Kit, Cat # 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, UK）を用いて１．５％アガロースゲル（実施例３参照）上で電気泳動で分離した。次に、このEcoRI−EcoRI制限断片を標準クローン化法（Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988）によって予め同じ制限酵素を用いて消化し、脱リン酸したベクターpGEM-7（Promega, Medical Supply Company, Dublin, Ireland）と結合した。得られたプラスミドを標準的方法によってEscherichia coli JM109宿主株（Stratagene, La Jolla, USA）に変換した。同じく、ＰＣＶ Imp.999株のEcoRI−EcoRI制限断片をベクターpBlueScript SK+（Stratagene, La Jolla, USA）のEcoRI部位にクローン化した。各宿主株に対して得られたクローンの中から所望の大きさの断片を有する少なくとも２つのクローンを選択した。次に、得られたクローンを培養し、Imp.999株の完全なゲノムを含むプラスミドを標準的なプラスミド調製および精製法によって少容量（２ｍｌ）または大容量（２５０ｍｌ）に精製した。
【００４６】
実施例１０
ＰＣＶ Imp.999株のゲノムＤＮＡの配列（２本鎖複製型）
２つのEcoRI Imp.999のクローン配列（クローンpGEM-7/2およびpGEM-7/8）をメーカー推薦の方法で配列キット"AmpliTaq DNA polymerase FS"（Cat # 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, UK）および"Applied BioSystems AB1373A automatic sequencing apparatus"を用いてSangerのジデオキシヌクレオチド法で決定した。最初の配列反応はM13「前方」および「後方」自在プライマーを用いて実施した。続く配列反応は「ＤＮＡ歩行」法によって実施した。その後の配列に必要なオリゴヌクレオチドはLife Technology（Inchinnan Business Park, Paisley, UK）によって合成された。
【００４７】
得られた配列を集め、MacDNASIS version 3.2のソフトウェア（Cat # 22020101, Appligene, Durham, UK）を用いて分析した。各種のオープンリーディングフレームを"National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD, USA)サーバーで入手可能なBLAST algorithmを用いて解析した。
完全な配列（EcoRI-EcoRI）は配列ＩＤ番号３（図９〜図１２）に表してある。この配列はこの株の配列を全て表しており、EcoRI部位の始めすなわち最初のヌクレオチドとしてＧから任意に始まる。
【００４８】
同様の方法で本発明の他の３つの分離株の配列を得た（配列ＩＤ番号１、２、
４および図１〜図４、図５〜図８、図１３〜図１６参照）。これら４つの株のゲノムの大きさは下記の通りである：
Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１ １７６７個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５ １７６７個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．９９９ １７６８個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１０ １７６８個のヌクレオチド
【００４９】
実施例１１
ＰＣＶ Imp.999株の配列の分析
Imp.999株から得られた配列をGenBankのデータバンクに収容された配列との相同性テストで用いた結果、検出された有意な相同性はＰＫ／１５株の配列（寄託番号Y09921）（図１７〜２６参照）と約７６％の相同性があった。
データバンク（NABIサーバーのBLAST X algorithm）を用いた６つのフェーズでの配列の翻訳の相同性テストでは、アミノ酸レベルで、GenBank U49186配列でコードされるプラント（GenBank番号1841515）のサーコウイルスに類似のＢＢＴＢウイルスの理論的レプリカーゼに対応するオープンリーディングフレームと９４％の相同性を示すということが分かった。
ＰＣＶ Imp.999株から得られた配列と有意な相同性を示すものはデータバンクに収容された他の配列にはなかった。
多機能萎縮症候群の臨床的徴候を示すカリフォルニアの子豚から得られた病変部を用いて培養されたImp.999株から得られた配列のには解析から、この単分離ウイルスが新規なブタサーコウイルス株であることが明らかになった。
【００５０】
実施例１２
配列の比較分析
新規な４つのＰＣＶ株のヌクレオチド配列とＰＣＶのＰＫ／１５株の配列（図１７〜２６）とを整列比較した。新規な４つの株と公知のＰＫ／１５株とに関する相同性マトリクスを作成した。結果は下記の通りである：
１：Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１
２：Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５
３：Ｉｍｐ．９９９
４：Ｉｍｐ．１０１０
５：ＰＫ／１５
【００５１】
【表１】
【００５２】
２つのフランス株Imp. 1011-48121とImp. 1011-48285の相同性は９９％以上（０．９９７７）である。２つの北米株Imp. 999とImp. 1010の相同性も９９％以上（０．９９４９）以上である。フランス株と北米株との相同性はわずかに９６％以上である。
これら全ての株とＰＫ／１５株との相同性は７５〜７６％の値に落ちる。
このことから、本発明の株はＰＫ／１５株に代表される種類とは異なる新規なブタサーコウイルスの代表であると言える。ＰＫ／１５がタイプＩを表すのに対し、ＰＭＷＳ症候群を示すブタから単離されたこの新規な株をタイプＩＩのブタサーコウイルスとよぶことにする。このタイプＩＩに属する株は実際には非常に離れた地理的領域から単離されたにもかかわらず、驚くべきヌクレオチド配列の相同性を示す。
【００５３】
実施例１３
新規なＰＣＶ株のゲノムによってコードされる蛋白の分析
Imp.1010単離株のヌクレオチド配列は多機能性萎縮症候群に関する他のサーコウイルス株を代表するものと考えられる。この配列をBLASTX algorithm（Altschl et al. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410）と、ソフトウェアMacVector 6.0（Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, UK）のプログラムとを組み合わせを用いて詳細に分析した。この配列（環状ゲノム）上には２０個のアミノ酸より大きいサイズのオープンリーディングフレーム（またはＯＲＦ）が１３個検出できた。この１３個のＯＲＦは下記の通りである：
【００５４】
【表２】
【００５５】
各ＯＲＦの開始位置および終了位置は株１０１０のゲノムの図１３〜図１６に表された配列（配列ＩＤ番号４）を参照する。ＯＲＦ１〜１３の端部は株９９９と同一である。これらは下記ＯＲＦ３と１３を除き、株１０１１−４８１２１および１０１１−４８２８５とも同一である：
ＯＲＦ３ １４３２−１５３９、センス、１０８ｎｔ、３５ａａ
ＯＲＦ３ ３１４−１３７７、アンチセンス、７０５ｎｔ、２３４ａａ
これら１３のＯＲＦの内で４つがクローン化ウイルスＰＣＶ ＰＫ／１５のゲノム上に位置する類似のＯＲＦと有意な相同性を有する。多機能性萎縮症候群に関連するサーコウイルス単離株全てのゲノム上に存在するオープンリーディングフレームをそれぞれ分析した。これら４つのＯＲＦは下記の通り：
【００５６】
【表３】
【００５７】
各ＯＲＦの始めと終わりの位置は図１３〜図１６に表された配列（配列ＩＤ番号４）を参照する。ＯＲＦの大きさ（ヌクレオチド=ｎｔで）は終止コドンを含む。
ＰＣＶ Imp. 1010とＰＣＶ ＰＫ−１５の単離株のゲノム機構の比較から、
２つのウイルスのゲノムに保存された４つのＯＲＦが同定できた。下記の表は観察された相同性の程度を表す：
【００５８】
【表４】
【００５９】
最大の相同性はＯＲＦ４ Imp. 1010とＯＲＦ１ ＰＫ−１５との間に見られた（８６％相同性）。このプロテインはおそらくウイルスのＤＮＡ複製に含まれ、ウイルスの複製に必須であるため、このことは予想されることである（Meehan et al., Gen. Virol. 1997,78; 221-227；Mankertz et al. J. Gen. Virol. 1998. 79. 381-384）。
ＯＲＦ１３ Imp. 1010とＯＲＦ２ ＰＫ−１５との間の配列同一性は余り強くない（６６．４％の同一性）が、この２つのＯＲＦはそれぞれ、鳥サーコウイルスＣＡＶ（Meehan et al., Arch. Virol. 1992, 124. 301-319）の主構造プロテインのＮ−末端領域と同一な良く保存されたＮ−末端基本領域を有している。さらに、ＯＲＦ７ Imp. 1010とＯＲＦ３ ＰＫ−１５との間と、ＯＲＦ１０ Imp. 1010とＯＲＦ４ ＰＫ−１５との間に大きな違いが見られた。ＰＣＶ ＰＫ−１５のＯＲＦ３とＯＲＦ４と比較すると、それぞれにImp. 1010分離株のＯＲＦ７とＯＲＦ１０のＣ−末端領域に欠失がある。最大の配列相同性はＯＲＦ７／ＯＲＦ３（重複部分の水準において６１．５％の相同性）とＯＲＦ１０／ＯＲＦ４（重複部分の水準において８３％の相同性）のＮ−末端領域の水準において見られる。
【００６０】
ブタサーコウイルスのゲノム構造はゲノムが極端に高密度であるため非常に複雑であるように見える。主構造プロテインはおそらくブタサーコウイルスゲノムの同じ鎖上に位置する複数のオープンリーディングフレーム間のスプライシングに由来するものである。従って、上記の表に記載の全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１〜ＯＲＦ１３）でタイプＩＩのブタサーコウイルスにコードされた抗原プロテインの全てまたは一部を表すことができ、これらは特有の病気および／またはワクチン接種に使用可能な抗原である。本発明はこれらのＯＲＦを少なくとも１つ含む全てのプロテインに関するものである。本発明は主としてＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１０またはＯＲＦ１３で構成されるプロテインに関するものである。
【００６１】
実施例１４
新規な株からクローンされたＰＣＶゲノムの感染特性
Imp. 999単離株の完全なゲノム（複製型）を含むプラスミドpGEM-7/8をMeehan B. 達に記載の方法によってＰＫ／１５細胞に形質移入した（Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome gragments. Arch. Virol. 1992, 124. 301-319）。未感染のＰＫ／１５細胞に形質移入した後の最初の継代に対して実施された免疫抗体法の分析（実施例４参照）から、クローンpGEM-7/8のプラスミドは感染性ＰＣＶウイルスを誘導することが示された。感染性ＰＣＶの遺伝物質を含むクローンが利用可能になったことによってウイルス性ゲノムに任意の有用な処置をして無毒化ワクチンまたは組み換えワクチンを製造し、或いは診断キット用抗原を製造することができ、変成ＰＣＶウイルス（ブタで無毒化または欠失）を製造することができるようになった。
【００６２】
実施例１５
インビトロ培養によるＰＣＶ抗原の製造
感染していないＰＫ／１５細胞の培養およびウイルス処置を実施例１と同じ方法で実施した。感染細胞を３７℃で４日間培養後、トリプシン処理し、回収し、命名した。次の継代は１ｍｌにつき４００，０００個の感染細胞を接種した。
【００６３】
実施例１６
ウイルス性抗原の不活化
ウイルス培養の最後に、感染した細胞を回収し、超音波（Branson Sonifier）またはロータースタータータイプのコロイドミル（UltraTurrax, IKA）を用いて溶解した。次に、懸濁液を３７００ｇで３０分間、遠心分離した。このウイルス懸濁液を+３７℃で１８時間、０．１％エチレンイミンで、或いは、+２８℃で２４時間、竈−プロピオラクトンで不活化した。ウイルス価が不十分な場合にはウイルス懸濁液を３００kDaのメンブレン（Millipore PTMK300）を用いた限外濾過で濃縮した。不活化ウイルス懸濁液は+５℃で貯蔵した。
【００６４】
実施例１７
有機油をベースにしたワクチン乳剤の製造
下記処方でワクチンを調製した：
不活化ブタサーコウイルス懸濁液 ： ２５０ｍｌ
Mondanide（商標登録）ISA 70（SEPPIC) : ７５０ｍｌ
水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソンμタービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。
一回のワクチン投与量は約107.5のＴＣＩＤ50を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は０．５ｍｌ、筋肉経路の投与量は２ｍｌである。
このワクチンはParvovax（登録商標）ワクチンと組合せて多機能性萎縮症候群を防ぐためのワクチン接種プログラムで用いられる。
【００６５】
実施例１８
代謝可能な油ベースのワクチン乳剤の製造
下記処方でワクチンを調製した：
不活化ブタサーコウイルス懸濁液： ２００ｍｌ
Dehymuls HRE 7（Henkel) : ６０ｍｌ
Radia 7204（Oleofina) : ７４０ｍｌ
水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソンμタービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。
一回のワクチン投与量は約107.5のＴＣＩＤ５０を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は０．５ｍｌ、筋肉内経路の投与量は２ｍｌである。
このワクチンはParvovax（登録商標）ワクチンと組合せて多機能性萎縮症候群を防ぐためのワクチン接種プログラムで用いられる。
【００６６】
実施例１９
過免疫血清（ＰＣＶ−Ｔ）、ＰＫ／１５から調製されたモノクローナル抗体Ｆ９９およびカナダ株から調製された過免疫血清（ＰＣＶ−Ｃ）で汚染されたアメリカおよびフランスのＰＣＶウイルス株およびＰＫ／１５の間接免疫抗体法の結果
【００６７】
【表５】
* 間接的免疫抗体法で正の反応を示した血清またはモノクローナル抗体の最後の希釈液の逆数。
【００６８】
実施例２０
ブタ多機能性萎縮症候群の実験的産生−プロトコル１
帝王切開で生まれ、隔離飼育器に入れた生後３日の純粋隔離群の子豚にＰＣＶウイルス溶液を接種した。タイプＩＩのＰＣＶには病気のブタから得られたリンパ節ホモジネートから得られたＩｍｐ．１０１０単離株およびウイルスを用いた。５つの群を作った。〔表６〕の１．５ｍｌのウイルス溶液を生後３日の全ての子豚に口鼻経路で接種した。
【００６９】
【表６】
【００７０】
抗原投与実験の結果
５週間の観察期間中に、Ｂ群の１匹の子豚に有意な消耗が見られたほかは臨床的徴候が見られなかった。死体解剖ではＡ群、Ｂ群、Ｃ群の子豚にリンパ節、特に顎下、気管支、腸間膜、腸骨および大腿の神経節の過形成（Ｄ群、Ｅ群の子豚の２〜１０倍のサイズ）が見られた。この過形成は単球およびマクロファージの浸潤によって皮質領がかなり拡大することに関係がある。
Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の子豚には気管支リンパ組織の過形成も見られる。
各Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の１匹の子豚に肺炎が認められる。
有意な消耗が見られるＢ群の子豚、およびＡ群の１匹の子豚には胃潰瘍が認められる。
【００７１】
さらに、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の全ての子豚には胃腸の筋層に筋肉炎が認められる。
Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の大部分の子豚には心筋炎、リンパ球の多巣性肝炎、マクロファージおよび好酸球の浸潤、ならびに皮質および延髄の間質性腎炎が認められる。
Ｃ群の１匹の子豚は肝臓の表面に明らかな播種性の病巣があり、通常よりもサイズが大きい。
Ｄ群およびＥ群の子豚に病変は認められなかった。
Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の子豚の器官からサーコウイルスを単離した。
【００７２】
実施例２１
ブタ多機能萎縮症候群の実験的再産生−プロトコル２、３
出生後に母親から隔離した通常飼育の子豚にタイプＩＩのＰＣＶウイルス、ブタパルボウイルスまたはこれら２つのウイルスの混合物ウイルス溶液を接種した。
タイプＩＩのＰＣＶウイルスにはＩｍｐ．１０１０およびＩｍｐ．１０１１単離株（株４８１２１）を用いた。
ＰＰＶウイルスにはカナダの単離株Ｉｍｐ．１００５を用いる。このウイルスは周知な他のブタパルボウイルス株（ＰＰＶ株ＮＡＤＬ−２およびKresse株）の配列と同一の１つの配列（配列決定されたゲノムの１／３）を有する。
２つの実験的プロトコルを実施した。
【００７３】
プロトコル２
生後３日の子豚からなる３つの群を作成した。全ての子豚に〔表７〕の１ｍｌのウイルス溶液を口鼻経路で接種した。
【００７４】
【表７】
【００７５】
抗原投与実験の結果
Ａ群：接種の２１日後に２匹の子豚が死んだ。２４日後に１匹の子豚を無痛屠殺した。
Ｂ群：接種の２３日後に１匹の子豚が死んだ。２４日後に１匹の子豚を無痛屠殺した。
感染後に死んだ子豚の死体解剖では有意な巨視的病変の存在が示された：胸膜腔中の体液の存在、肺浮腫、腎臓の出血、腎臓上のピン頭形の淡い色の病変、肝臓の壊死がみられた。これらの病変はフィールドでみられる病変と同一である。
屠殺した子豚の死亡解剖では巨視的病変はみられなかった。
【００７６】
感染後に死んだＡ群およびＢ群の子豚およびこれら２つの群の屠殺した子豚から取り出した器官に対して行った組織学試験ではフィールドの子豚で見られるブタ多機能萎縮症候群の病変の典型的かつ完全なパターンがみられた：肝臓の壊死、リンパ節の壊死、膵臓の壊死、腎臓の焦点壊死および激しい出血、肺中の合胞体の存在、核封入体の存在を伴う肝細胞の激しい壊死。
これら全ての病変（死んだブタまたは犠牲のブタ）で大量のＰＣＶ抗原が発見されたが、これらの同じ病変にＰＰＶ抗原の存在を示すことができなかったことは注目すべきである。
Ｃ群の対照子豚からは病変を検出できなかった。
【００７７】
プロトコル３
生後４週間の子豚からなる４つの群を作成した。全ての子豚に〔表８〕の１ｍｌのウイルス溶液を口鼻経路で接種した。
【００７８】
【表８】
【００７９】
抗原投与実験の結果
各実験群（Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群）の１匹の「対照」ブタおよび２匹のブタを接種の２週間後に無痛屠殺し、死体解剖した。Ｄ群（ＰＣＶ＋ＰＰＶ同時感染）の２匹の子豚に有意な免疫組織学的病変が認められた。これらの病変にブタパルボウイルスの存在を示すことはできなかったが、Ｄ群の全ての子豚にブタパルボウイルスに関連するセロコンバージョンが認められたことは注目すべきである。
対照子豚および他の群の子豚には巨視的または組織学的病変を検出することはできなかった。
【００８０】
従って、ＰＣＶ＋ＰＰＶの組合せによってブタ多機能萎縮症候群の典型的な組織学的病変を再生することができるように思われる。
これら２つの実験的プロトコルから、ＰＣＶ＋ＰＰＶ混合物としてＰＣＶのみを接種することによってブタ多機能萎縮症候群を多かれ少なかれ大量に再生できるが、病変からはブタサーコウイルスしか検出できないことが理解できる。逆に、ＰＰＶのみに実験的に感染させることによって（プロトコル３のＢ群）、巨視的および組織学的病変を誘発させることはできない。しかし、ＰＶＣの存在下では、生後４週間の子豚に病変の出現が認められた（プロトコル３のＤ群）。
【００８１】
[配列表]
配列ＩＤ番号１ ＝ Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号２ ＝ Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号３ ＝ Ｉｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号４ ＝ Ｉｍｐ．１０１０株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号５ ＝ ＰＫ／１５株のゲノムのＤＮＡ配列
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタサーコウイルス抗原とブタパルボウイルス抗原とを含む、ＰＭＷＳ症候群に対する抗原性製剤。
【請求項２】
タイプＩＩのブタサーコウイルス抗原を含む請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
タイプＩＩのブタサーコウイルス抗原がＥＣＡＣＣに下記寄託番号で寄託された調整品の中から成る群の中から選択される抗原である請求項２に記載の製剤：
寄託番号第Ｖ９７１００２１９号
寄託番号第Ｖ９７１００２１８号
寄託番号第Ｖ９７１００２１７号
寄託番号第Ｖ９８０１１６０８号
寄託番号第Ｖ９８０１１６０９号。
【請求項４】
ブタサーコウイルス抗原およびブタパルボウイルス抗原が、互いに独立して、無毒化した生の全抗原、不活性化した生の全抗原、サブユニット抗原、組み換え生ベクターおよびＤＮＡベクターから成る群の中から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
ブタの他の病原体に対応する他のワクチン価をさらに含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
他のワクチン価がＰＲＲＳ、Mycoplasma hyopneumonia、アクチノバシラス胸膜肺炎菌、大腸菌、ブタ萎縮鼻炎、仮性狂犬病、ブタコレラ、ブタインフルエンザおよびこれらの組合せから成る群の中から選択される請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
他のワクチン価がＰＲＲＳである請求項５に記載の製剤。
【請求項８】
有効量の請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原性製剤と、獣医学上許容されるビヒクルまたは賦形剤とからなるＰＭＷＳ症候群に対するワクチン。
【請求項９】
獣医学上許容されるアジュバントを含む請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
複数のブタサーコウイルス抗原を含む請求項８または９に記載のワクチン。
【請求項１１】
ＯＲＦ１〜１３から成る群の中から選択されるサーコウイルスのオープンリーディングフレームでコード化されたサーコウイルス抗原を含む請求項８〜１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１２】
ＯＲＦ４，７，１０および１３から成る群の中から選択されるサーコウイルスのオープンリーディングフレームでコード化されたサーコウイルス抗原を含む請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
ブタに対して病原性がなく且つブタ内で増殖可能な生ウイルスおよびＤＮＡベクターの中から選択される発現ベクターを含み、この発現ベクターがＯＲＦを含み且つＯＲＦを発現する請求項８〜１２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１４】
ウイルス性ベクターがブタヘルペスウイルス、ブタアデノウイルス、ブタポックスウイルスから成る群の中から選択されるウイルスである請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
ウイルス性ベクターがアウジェスキー病(Aujesky's disease)ウイルス、ワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ブタポックスウイルスから成る群の中から選択されるウイルスである請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
請求項８〜１５のいずれか一項に記載のブタサーコウイルスに対するワクチンとブタパルボウイルスに対するワクチンと個別包装したワクチン接種キット。
【請求項１】
ブタサーコウイルス抗原とブタパルボウイルス抗原とを含む、ＰＭＷＳ症候群に対する抗原性製剤。
【請求項２】
タイプＩＩのブタサーコウイルス抗原を含む請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
タイプＩＩのブタサーコウイルス抗原がＥＣＡＣＣに下記寄託番号で寄託された調整品の中から成る群の中から選択される抗原である請求項２に記載の製剤：
寄託番号第Ｖ９７１００２１９号
寄託番号第Ｖ９７１００２１８号
寄託番号第Ｖ９７１００２１７号
寄託番号第Ｖ９８０１１６０８号
寄託番号第Ｖ９８０１１６０９号。
【請求項４】
ブタサーコウイルス抗原およびブタパルボウイルス抗原が、互いに独立して、無毒化した生の全抗原、不活性化した生の全抗原、サブユニット抗原、組み換え生ベクターおよびＤＮＡベクターから成る群の中から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
ブタの他の病原体に対応する他のワクチン価をさらに含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
他のワクチン価がＰＲＲＳ、Mycoplasma hyopneumonia、アクチノバシラス胸膜肺炎菌、大腸菌、ブタ萎縮鼻炎、仮性狂犬病、ブタコレラ、ブタインフルエンザおよびこれらの組合せから成る群の中から選択される請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
他のワクチン価がＰＲＲＳである請求項５に記載の製剤。
【請求項８】
有効量の請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原性製剤と、獣医学上許容されるビヒクルまたは賦形剤とからなるＰＭＷＳ症候群に対するワクチン。
【請求項９】
獣医学上許容されるアジュバントを含む請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
複数のブタサーコウイルス抗原を含む請求項８または９に記載のワクチン。
【請求項１１】
ＯＲＦ１〜１３から成る群の中から選択されるサーコウイルスのオープンリーディングフレームでコード化されたサーコウイルス抗原を含む請求項８〜１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１２】
ＯＲＦ４，７，１０および１３から成る群の中から選択されるサーコウイルスのオープンリーディングフレームでコード化されたサーコウイルス抗原を含む請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
ブタに対して病原性がなく且つブタ内で増殖可能な生ウイルスおよびＤＮＡベクターの中から選択される発現ベクターを含み、この発現ベクターがＯＲＦを含み且つＯＲＦを発現する請求項８〜１２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１４】
ウイルス性ベクターがブタヘルペスウイルス、ブタアデノウイルス、ブタポックスウイルスから成る群の中から選択されるウイルスである請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
ウイルス性ベクターがアウジェスキー病(Aujesky's disease)ウイルス、ワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ブタポックスウイルスから成る群の中から選択されるウイルスである請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
請求項８〜１５のいずれか一項に記載のブタサーコウイルスに対するワクチンとブタパルボウイルスに対するワクチンと個別包装したワクチン接種キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公開番号】特開２０１０−２２２３５９（Ｐ２０１０−２２２３５９Ａ）
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０００１８（Ｐ２０１０−１０００１８）
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【分割の表示】特願２０００−５５７８５５（Ｐ２０００−５５７８５５）の分割
【原出願日】平成１１年６月２８日（１９９９．６．２８）
【出願人】（５０３３６５６５９）
【出願人】（５００１５５３５０）クィーンズ ユニバーシティ オブ ベルファスト (5)
【出願人】（５００１５５３６１）ユニバーシティ オブ サスカチュワン (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【分割の表示】特願２０００−５５７８５５（Ｐ２０００−５５７８５５）の分割
【原出願日】平成１１年６月２８日（１９９９．６．２８）
【出願人】（５０３３６５６５９）
【出願人】（５００１５５３５０）クィーンズ ユニバーシティ オブ ベルファスト (5)
【出願人】（５００１５５３６１）ユニバーシティ オブ サスカチュワン (5)
【Ｆターム（参考）】
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