ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子
本発明は、ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ）のタンパク質、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡ調節配列を提供する。さらに、本発明は、ブタ動物、組織、および臓器、ならびに機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの発現を欠くこのような動物、組織、および臓器由来の細胞および細胞株を含む。このような動物、組織、臓器、および細胞を、研究および医学的治療法（異種移植が含まれる）ならびに産業上の家畜飼育操作で使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００３年６月６日提出の米国特許出願番号６０／４７６，３９６号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ）のタンパク質、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡ調節配列を提供する。さらに、本発明は、ブタ動物、組織、および臓器、ならびに機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの発現を欠くこのような動物、組織、および臓器由来の細胞および細胞株を含む。このような動物、組織、臓器、および細胞を、研究および医学的治療法（異種移植が含まれる）ならびに産業上の家畜飼育操作で使用することができる。さらに、異種移植で使用するためのブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く臓器、組織、および細胞の調製方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
許容可能なヒトドナー臓器が利用不可能であること、宿主対移植片拒絶による長期成功率の低さ、ならびに感染症および癌の深刻なリスクは、組織および臓器移植分野が現在直面している主な課題である。許容可能な臓器に対する需要が供給を超えているので、多くの患者は毎年利用可能になる臓器を待っている間に死亡している。この需要を満たす一助とするために、研究は同種間移植の代替法の開発に焦点が当てられている。透析は腎不全患者が利用可能であり、人工心臓モデルが試験されており、臓器不全を補助または置換するための他の機械系が開発されている。しかし、このようなアプローチは非常に高価である。透析装置を頻繁且つ定期的に利用することが必要であるので、このような治療を受ける患者の自由および生活の質が非常に制限される。
【０００４】
異種移植片移植は、ヒト移植のための人工臓器に代わる潜在的に魅力的なものである。非ヒト臓器の潜在的なプールは事実上限られている。ブタは、最も可能性が高い異種移植臓器の供給源と考えられている。ブタの供給は豊富にあり、交配プログラムが十分に確立されており、その臓器のサイズおよび生理学的性質はヒトに適合可能である。したがって、ブタ臓器での異種移植は、臨床的移植に利用可能な臓器の不足に対する潜在的な解決法を提供する。
【０００５】
このような異種間組織の宿主拒絶は、依然としてこの分野における主な懸念である。異種移植に対する免疫学的障壁は、恐れられており、且つ依然として恐れられている。第１の免疫学的ハードルは、「超急性拒絶」（ＨＡＲ）である。ＨＡＲは、外来組織に結合する予め形成された高力価の天然の抗体の遍在と定義される。ドナー臓器内皮上の標的エピトープに対するこれらの天然の抗体の結合は、ＨＡＲにおける開始事象と考えられる。この結合の後、レシピエントの血液でのドナー臓器の灌流から数分以内に、血小板およびフィブリンが沈殿し、最終的にドナー臓器が間質の浮腫および出血を起こし、その全てによってレシピエントで臓器不全が起こる（Ｓｔｒａｈａｎら（１９９６）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １，ｐｐ．３４−４１）。
【０００６】
類人猿または旧世界ザル（例えば、ヒヒ）からヒトへのいくつかの著名な異種移植は、拒絶することなく何ヵ月間も許容される。しかし、このような試みは、多数の免疫学的要因によって最終的に失敗している。ＨＡＲを抑制するための強い免疫抑制を使用した場合でさえも、移植片内皮上の異種補体の活性化を制御するための移植片組織内の補体調節タンパク質（ＣＲＰ）の不全に一部起因する軽度の先天性免疫応答により、最終的に移植臓器が破壊される（Ｓｔａｒｚｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１４１，２１３−４４（１９９４））。ヒトへの異種移植に許容可能な臓器のプールを開発する目的で、研究者は、ヒトＣＲＰを産生する動物を操作している（霊長類における異種移植片破壊を遅延させるが消失しないことが証明されているアプローチ）（ＭｃＣｕｒｒｙら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１，４２３−２７（１９９５）；Ｂａｃｈら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１７，３７９−８４（１９９６））。
【０００７】
補体媒介攻撃に加えて、調和しない異種移植片のヒトによる拒絶は、共通の抗原（多数の糖タンパク質および糖脂質のガラクトース−α（１，３）−ガラクトース（ｇａｌ−α−ｇａｌ）末端残基）によって媒介されるようである（Ｇａｌｉｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４，１３６９−７３（１９８７）；Ｃｏｏｐｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１４１，３１−５８（１９９４）；Ｇａｌｉｌｉら，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，１５，１５５−１７１（１９９３）；Ｓａｎｄｒｉｎら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｒｅｖ．，８，１３４（１９９４））。この抗原は、ヒトＡ、Ｂ、およびＯ型血液抗原と化学的に関連し、多数の寄生虫ならびに細菌およびウイルスなどの感染因子に存在する。ほとんどの哺乳動物組織もこの抗原を含むが、旧世界ザル、類人猿、およびヒトは注目すべき例外である（Ｊｏｚｉａｓｓｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１４２９０−９７（１９８９）を参照のこと）。このような炭水化物エピトープを持たない個体は、エピトープに特異的な天然に存在する抗体（ＩｇＭおよびＩｇＧ）を豊富に産生する。多くのヒトは、ｇａｌ−α−ｇａｌ炭水化物決定基に対して特異性を有する有意なレベルの循環ＩｇＧを示す（Ｇａｌｉｌｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６２，５７３−８２（１９８５）；Ｇａｌｉｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４，１３６９−７３（１９８７））。α−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−ＧＴ）酵素は、ｇａｌ−α−ｇａｌ部分の形成を触媒する。研究は、異種組織の細胞表面上でのｇａｌ−α−ｇａｌ部分の発現を減少または消失するためのこの酵素の調整または消失に焦点が当てられている。
【０００８】
ブタ由来のα−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の消失は、ブタからヒトへの異種移植に対する最も有意なハードルの１つと長い間考えられている。ブタゲノム中の２つの対立遺伝子はα−ＧＴ遺伝子をコードする。ブタにおけるα−ＧＴ遺伝子の１対立遺伝子ノックアウトが２００２年に報告された（ＤａｉらＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：２５１（２００２）；Ｌａｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５：１０８９（２００２））。
【０００９】
最近、α−ＧＴ遺伝子の二重対立遺伝子ノックアウト（ｄｏｕｂｌｅ ａｌｌｅｌｉｃ ｋｎｏｃｋｏｕｔ）が行われた（Ｐｈｅｌｐｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９：ｐｐ．４１１−４１４（２００３））。Ｒｅｖｉｖｉｃｏｒ Ｉｎｃ．のＷＯ ２００４／０２８２４３は、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，３−ＧＴ）の全発現を欠くブタ動物、組織、臓器、細胞、および細胞株を記載している。したがって、α１，３−ＧＴの機能的発現を欠く動物、組織、臓器、細胞、および細胞を、異種移植および他の医学的目的のために使用することができる。
【００１０】
Ｉｍｍｅｒｇｅ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．のＰＣＴ特許出願ＷＯ２００４／０１６７４２号は、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼヌル細胞、ＧＧＴＡ−１ヌル細胞の選択方法、それから産生されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼヌルブタ（生存可能なＧＧＴＡ−１ヌルブタと呼ばれる）、このようなブタの作製方法、および異種移植のための細胞、組織、および臓器の使用方法を記載している。
【００１１】
ｇａｌ−α−ｇａｌ以外の最も初期の公知の異種抗原の１つは、Ｈｎａｇａｎｕｔｉｕ Ｄｅｉｃｈｅｒ抗体が認識し、且つ血清疾患と長期的に関連するエピトープである。エピトープは、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）（炭水化物のシアル酸ファミリーのメンバー）として同定された。炭水化物のうち、シアル酸は豊富且つ遍在する。シアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃｙｌ）およびその誘導体に使用される総称である。Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）およびＮ−グリコリルノイラミン酸（ｎｅｕ５Ｇｃ）は、シアル酸の最も豊富な誘導体のうちの２つである。
【００１２】
Ｎｅｕ５Ｇｃエピトープは、複合糖質のグリカン鎖中の末端に存在する。この露呈した位置のために、例えば、炎症反応、免疫細胞の成熟、分化プロセス、ホルモン結合、病原体結合、および毒素結合の場合の細胞認識で重要な役割を果たす（Ｖａｒｋｉ，Ａ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２，ｐｐ．２５−４０（１９９２））。
【００１３】
Ｎｅｕ５Ｇｃを含む複合糖質はヒトで免疫原性を示す。健常なヒトでは、Ｎｅｕ５Ｇｃは検出可能でないが、Ｎｅｕ５Ｇｃはほとんどの哺乳動物で豊富に存在する。人におけるＮｅｕ５Ｇｃの欠如は、機能酵素の形成を防止するヒト遺伝子におけるエクソンの欠失に起因する（Ｃｈｏｕ，Ｈ．Ｈ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９５，ｐｐ．１１７５１−１１７５６（１９９８）；Ｉｒｉｅ，Ａ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，ｐｐ．１５８６６−１５８７１（１９９８））。したがって、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有複合糖質は抗原として作用し、抗体の形成を誘導することができる。歴史的に、この抗体はＨａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ（ＨＤ）抗原および抗体と呼ばれる（Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ，Ｍ．，ＣＲ Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．（Ｐａｒｉｓ），９１，ｐ．１４５７（１９２４）；Ｄｅｉｃｈｅｒ，Ｈ．，Ｚ．Ｈｙｇ．，１０６，ｐ．５６１（１９２６））。Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗原は、多数のヒト腫瘍（結腸癌、網膜芽腫、黒色腫、および乳癌）およびニワトリ腫瘍組織で検出可能である（Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｈ．らＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４５，ｐｐ．３７９６−３８０２（１９８５））。腫瘍中の抗原量は非常に少ないにもかかわらず（通常、全量が１％未満のシアル酸、しばしば０．０１から０．１％までの範囲）、Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗体の形成を誘導することができる（Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ，Ｔ．ら，Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９５，ｐｐ．２３１−２３５（１９９１））。この免疫反応は、ヒトへのＮｅｕ５Ｇｃ含有ブタ臓器の異種移植に対する潜在的な障壁である。
【００１４】
Ｎｅｕ５Ｇｃエピトープは、Ｎｅｕ５ＡｃのＮ−アセチル部分への水酸基の付加によって形成される。ヒドロキシル化を触媒する酵素は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼである。したがって、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の発現は、細胞表面上のＮｅｕ５Ｇｃエピトープの存在を決定する。哺乳動物におけるＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの精製研究により、シトクロムｂ５およびシトクロムｂ５レダクターゼに依存する可溶性細胞質オキシゲナーゼであることが示された（Ｋａｗａｎｏ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，ｐｐ．９０２４−９０２９（１９９４）；Ｓｃｈｎｅｃｋｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｐ．ら，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，１１，ｐｐ．１９４−２０３（１９９４）；Ｓｃｈｌｅｎｚｋａ，Ｗ．ら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，４，ｐｐ．６７５−６８３（１９９４）；Ｋｏｚｕｔｓｕｍｉ，Ｙ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１０８，ｐｐ．７０４−７０６（１９９０）；およびＳｈａｗ，Ｌ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１９，ｐｐ．１００１−１０１１（１９９４））。
【００１５】
Ｎｅｕ５Ｇｃの別の重要な特徴は、細胞に侵入させる病原体の接着分子として作用することである（Ｋｅｌｍ，Ｓ．およびＳｃｈａｕｅｒ，Ｒ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ，１７９，ｐｐ．１３７−２４０（１９９７））。これにより、一定の家畜で疾患および経済的損失を被る。詳細には、Ｋ９９線毛を有する腸管毒素原性大腸菌は、腸内吸収細胞および粘膜分泌細胞に結合したＮｕｅ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１’セラミド［ＧＭ３（Ｎｅｕ５Ｇｃ）］などのガングリオシド中のＮｅｕ５Ｇｃ、Ｎ−グリコシルシアロパラグロボシド、およびＧＭ２（Ｎｅｕ５Ｇｃ）への結合によって新生仔ブタに感染し、潜在的に致死的下痢を引き起こす（Ｍａｌｙｋｈ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３７０，ｐｐ．６０１−６０７（２００３）；Ｋｙｏｇａｓｈｉｍａ，Ｍ．ら（１９９３）；Ｔｅｎｅｂｅｒｇ，Ｓ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅａｅｒｓ，２６３，ｐｐ．１０−１４（１９９０）；Ｉｓｏｂｅ，Ｔ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３６，ｐｐ．３５−４０（１９９６）；Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｍ．およびＣａｒｉｓｔｅｄｔ，Ｉ．，Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３６，ｐｐ．１６０９−１６１４（１９９０）；Ｋｉｎｇ，Ｔ．Ｐ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ６ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｐｉｇｓ，ｐｐ．２９０−２９３（１９９４））。ブタロタウイルスは、ＧＭ３（Ｎｅｕ５Ｇｃ）への結合によって新生ブタに感染して下痢を引き起こす。ブタ伝染性胃腸炎コロナウイルスは、α２，３結合Ｎｅｕ５Ｇｃを含む複合糖質への侵入によってブタに感染する（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｂら，．Ｌ Ｖｉｒｏｌ．，７０，ｐｐ．５６３４−５６３７（１９９６））。
【００１６】
マウスの肝臓およびブタの顎下腺からＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼが均一に単離され、特徴づけられている（Ｋａｗａｎｏ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，ｐｐ．９０２４−９０２９（１９９４）；Ｓｃｈｎｅｃｋｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｐ．ら，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，１１，ｐｐ．１９４−２０３（１９９４）；ａｎｄ，Ｓｃｈｌｅｎｚｋａ，Ｗ．ら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，４，ｐｐ．６７５−６８３（１９９４））。
【００１７】
Ｓｃｈｌｅｎｚｋａら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．６７５−６８３（１９９４））は、イオン交換クロマトグラフィ、固定化トリアジン色素を使用したクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、およびゲル濾過を使用して、ブタ顎下腺から酵素を精製した。Ｓｃｈｎｅｃｋｅｎｂｕｒｇｅｒら（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．１９４−２０３（１９９４））は、マウス肝臓からＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼを単離した。ブタ顎下腺およびマウス肝臓由来のＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼは共に分子量６５ｋＤａの可溶性単量体である。ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃおよびシトクロムｂ５とのその触媒的相互作用は、互いに類似している。これらの酵素の活性は、イオン含有補欠分子団に依存するようである。
【００１８】
ＪＰ−Ａ０６１１３８３８は、マウスＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼのタンパク質およびＤＮＡ配列ならびにこのヒドロキシラーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体を記載している。
【００１９】
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｈｅｉｍＧＭＢＨのＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／０３２００Ａ１は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの部分ｃＤＮＡを開示している。この出願は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のエクソン８の中央から始まるｃＤＮＡ配列を開示している（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｙ１５０１０としてさらに開示されている）。
【００２０】
Ｍａｒｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．５１５７−５１６６（２００１））は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの全長アミノ酸配列を開示している。
【００２１】
ＲＢＣ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０８８３５１号は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの部分ｃＤＮＡ配列およびゲノム配列（エクソン７〜１１および各エクソン周囲の部分ゲノム配列）を開示している。さらに、任意選択的に、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子および／または補体タンパク質の挿入などの他のゲノム修飾と組み合わせたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼエピトープを欠くブタ細胞および動物の作製方法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム配列および調節配列を提供することである。
【００２３】
本発明の目的は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の全長ｃＤＮＡおよび新規の変異型を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子をコードする新規の核酸配列およびアミノ酸配列を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠損した細胞、組織、および／または臓器を提供することである。
【００２６】
本発明の別の目的は、機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く動物（特にブタ）を作製することである。
【００２７】
本発明のなおさらなる目的は、必要とするヒトレシピエントへの非ヒト臓器の異種移植で使用するためのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠損した細胞、組織、および／または臓器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
（発明の要旨）
ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列、ペプチド配列、およびゲノム機構を決定した。今日まで、部分ｃＤＮＡおよびゲノム配列のみが同定されている。本発明は、新規のブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼのタンパク質、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ変異型、およびゲノムＤＮＡ配列を提供する。さらに、本発明は、ブタ動物、組織、および臓器、ならびに機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの発現を欠くこのような動物、組織、および臓器由来の細胞および細胞株を含む。このような動物、組織、臓器、および細胞を、研究および医学的治療法（異種移植が含まれる）で使用することができる。さらに、異種移植で使用するためのブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く臓器、組織、および細胞の調製方法を提供する。
【００２９】
本発明の１つの態様は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの全長ｃＤＮＡを提供する。全長ｃＤＮＡを、表１（配列番号１）に示し、全長ペプチド配列を表２（配列番号２）で提供する。全長ｃＤＮＡの開始コドンはエクソン４の３’部分に存在し、終止コドンはエクソン１７の３’部分で見出される。配列番号１および２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。さらに、配列番号１または２の少なくとも１０、１５、１７、２０、２５、または３０個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含むヌクレオチド配列およびペプチド配列も提供する。任意選択的にストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリッド形成する任意のヌクレオチド配列およびそれに相同なヌクレオチドをさらに提供する。
【００３０】
１つの実施形態では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの新規の変異型をコードする核酸配列およびペプチド配列を提供する（表３〜８、図２）。配列番号３は、エクソン１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５ａ、１６、１７、および１８を含む遺伝子の変異型（変異型１）のｃＤＮＡを示す。配列番号５は、エクソン１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１２ａを含む遺伝子の変異型（変異型２）のｃＤＮＡを示す。配列番号７は、エクソン１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１１ａを含む遺伝子の変異型（変異型３）のｃＤＮＡを示す。配列番号４、６、および８は、それぞれ変異型１、変異型２、および変異型３のアミノ酸配列を示す。配列番号３〜８と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。さらに、配列番号３〜８の少なくとも１０、１５、１７、２０、２５、または３０個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含むヌクレオチド配列およびペプチド配列も提供する。任意選択的にストリンジェントな条件下で配列番号３、５、および７とハイブリッド形成する任意のヌクレオチド配列ならびにそれに相同なヌクレオチドをさらに提供する。
【００３１】
さらなる実施形態は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を示す核酸配列を提供する（表９、図１）。配列番号１０〜２８は、それぞれエクソン１、４〜１１、１１ａ、１２、１２ａ、１３〜１５、１５ａ、１６〜１８を示し、配列番号２９〜４５は、それぞれイントロン１ａ、１ｂ、４〜１５、１５ａ、１６、および１７を示す。配列番号９は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の５’非翻訳領域を示す。配列番号４６（表１０）は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃヒドロキシラーゼのゲノムＤＮＡおよび調節配列を示す。
【００３２】
別の実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム配列を、配列番号４７に示す。配列番号４７は、５’ＵＴＲ、エクソン１、およびエクソン１（表１１）３’に存在するイントロン配列の一部を含む５’連続ゲノム配列を示す。
【００３３】
別の実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム配列を、配列番号４８に示す。配列番号４８は、エクソン４に対して５’方向に、エクソン４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７、イントロン７、エクソン８、イントロン８、エクソン９、イントロン９、エクソン１０、イントロン１０、エクソン１１、イントロン１１、エクソン１２、イントロン１２、エクソン１３、イントロン１３、エクソン１４、イントロン１４、エクソン１５、イントロン１５、エクソン１６、イントロン１６、エクソン１７、イントロン１７、およびエクソン１８でイントロン配列を含む連続ゲノム配列を示す（表１２）。さらに、配列番号４８の少なくとも２７７５、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、または１０，０００個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列ならびに配列番号４８と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム配列を、配列番号４９に示す。配列番号４９は、エクソン４に対して５’方向に、エクソン４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７、イントロン７、およびエクソン８でイントロン配列を含む連続ゲノム配列を示す。さらに、配列番号４９の少なくとも１７５０、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、または２００００個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列ならびに配列番号４９と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列を提供する。
【００３５】
別の実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム配列を、配列番号５０に示す。配列番号５０は、エクソン１２、イントロン１２、エクソン１３、イントロン１３、エクソン１４、イントロン１４、エクソン１５、イントロン１５、エクソン１６、イントロン１６、エクソン１７、イントロン１７、およびエクソン１８を含む連続ゲノム配列を示す。配列番号５０の少なくとも１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、または２０、０００個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列ならびに配列番号５０と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列を提供する。
【００３６】
さらなる実施形態では、配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。さらに、配列番号９〜４５、４６、４７、および４８の少なくとも１０、１５、１７、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、または１０００個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列およびペプチド配列も提供する。任意選択的にストリンジェントな条件下で配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０とハイブリッド形成する任意のヌクレオチド配列ならびにこれらに相同なヌクレオチドをさらに提供する。
【００３７】
本発明の別の態様は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃヒドロキシラーゼをコードするｃＤＮＡまたはその変異型を含む核酸構築物を提供する。これらのｃＤＮＡ配列は、配列番号１〜８またはその任意のフラグメントに由来し得る。構築物は、１つまたは１つを超える内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。構築物はまた、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得るか、構築物はプロモーターを含まなくてよい。別の実施形態では、宿主ゲノムへの挿入がランダムまたはターゲティングされている核酸配列を含む核酸構築物を提供する。核酸配列に加えて、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子配列、開始配列および／またはエンハンサー配列、ポリＡテール配列、および／または原核生物および／または真核生物の宿主細胞で構築物を発現させる核酸配列など）を含み得る。
【００３８】
別の実施形態では、体細胞中の相同組換えを行うことができる核酸ターゲティングベクター構築物も提供する。これらのターゲティングベクターを、相同組換えを介してＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子をターゲティングするために哺乳動物細胞に形質転換することができる。１つの実施形態では、ターゲティングベクターは、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼのゲノム配列に相同な３’組換えアームおよび５’組換えアームを含み得る。相同なＤＮＡ配列には、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ配列と少なくとも１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、２ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１０ｋｂｐ、１５ｋｂｐ、２０ｋｂｐ、または５０ｋｂｐが相同な配列が含まれ得る。別の実施形態では、相同ＤＮＡ配列には、１つまたは複数のイントロンおよび／またはエクソン配列が含まれ得る。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のイントロン５およびイントロン６に相同であり得る（例えば、図６〜８を参照のこと）。別の特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃのイントロン５、エクソン６の５５ｂｐ部分、およびイントロン６と相同であることができ、エクソン６の５５ｂｐ部分に対して３’方向にてインフレームで増強緑色蛍光タンパク質配列を含む（例えば、図１０〜１１を参照のこと）。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃヒドロキシラーゼのｃＤＮＡまたはゲノム配列（配列番号１、３、５、７、９〜４５、４７、または４８など）とハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。好ましい実施形態では、プライマーは、ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、または４８とハイブリッド形成する。別の実施形態は、配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、または４８などのブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ核酸配列とハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブは、本発明のポリヌクレオチドとハイブリッド形成する少なくとも１４塩基、２０塩基、好ましくは３０塩基、または５０塩基を有し得る。プローブまたはプライマーは、少なくとも１４ヌクレオチド長であり得るが、好ましい実施形態では、少なくとも１５、２０、２５、２８、または３０ヌクレオチド長である。
【００４０】
本発明の別の態様では、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子を欠く哺乳動物細胞を提供する。相同組換えの結果としてこれらの細胞を得ることができる。特に、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の不活化により、機能的Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗原の発現能力が低下した細胞を産生することができる。
【００４１】
本発明の実施形態では、得られたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ酵素がもはやＨａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗原を作製することができないように本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがってＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の対立遺伝子を不活化する。１つの実施形態では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子をＲＮＡに転写することができるが、タンパク質に翻訳することができない。別の実施形態では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を、不活性な短縮形態に転写することができる。このような短縮ＲＮＡは、翻訳することができないか、非機能的タンパク質に翻訳することができる。別の実施形態では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を遺伝子が転写しないような方法で不活化することができる。さらなる実施形態では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を転写し、その後非機能的タンパク質に翻訳することができる。
【００４２】
本発明のさらなる態様では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生されたゲノムターゲティング事象を介して不活化されたブタ動物を提供する。本発明の別の態様では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の両対立遺伝子が遺伝子ターゲティング事象を介して不活化されたブタ動物を提供する。相同組換えを介して遺伝子をターゲティングすることができる。他の実施形態では、遺伝子を破壊することができる（すなわち、遺伝コードの一部を変化させ、それにより遺伝子のそのセグメントの転写および／または翻訳に影響を与えることができる）。例えば、欠失（「ノックアウト」）技術または挿入（「ノックイン」）技術によって遺伝子を破壊することができる。既存配列の転写を調整する所望のタンパク質または調節配列のさらなる遺伝子を挿入することができる。
【００４３】
本発明の別の態様では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の１つの対立遺伝子、任意選択的に両対立遺伝子を欠くブタ細胞を、クローン化トランスジェニック動物を産生するための除核卵母細胞への核導入のためのドナー細胞として使用することができる。あるいは、胚幹細胞中でブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼノックアウトを作製し、その後子孫の産生に使用することができる。本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生した機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の１つの対立遺伝子を欠く子孫を交配して、メンデル型遺伝子によって両対立遺伝子の機能性を欠く子孫をさらに産生することができる。異種移植ストラテジーで使用するために、細胞、組織、および／または臓器をこれらの動物から回収することができる。Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗原は、Ｎｅｕ５Ｇｃエピトープに起因する移植細胞、組織、または臓器の免疫拒絶を軽減させることができる。
【００４４】
あるいは、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生したＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子を欠く動物は、腸管毒素原性感染および疾患（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ感染、ロタウイルス感染、および胃腸炎コロナウイルスなど）に対する感受性が低いか耐性を示し得る。このような動物を、例えば、商業的飼育で使用することができる。
【００４５】
本発明の１つの態様では、本発明の任意の態様にしたがった方法によってブタを調製することができる。遺伝子操作ブタを、移植療法のための組織および／または臓器供給源として使用することができる。この様式で調製したブタ胚またはそれから発生した細胞株も細胞移植療法で使用することができる。したがって、本発明のさらなる態様では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼを欠く胚または動物から調製されたブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼを欠く遺伝子操作細胞のブタへの投与を含む治療方法を提供する。本発明のこの態様は、薬物におけるこのような細胞の使用（例えば、細胞移植療法）および移植のための細胞または組織移植片の調製におけるこのような胚由来の細胞の使用にまで及ぶ。細胞を、組織または臓器（例えば、心臓、肺、腎臓、膵臓、角膜、神経（例えば、脳、中枢神経系、脊髄）、皮膚）に組織化することができるか、細胞は、島細胞、血球（例えば、血球（すなわち、赤血球、白血球））または造血幹細胞もしくは他の幹細胞（例えば、骨髄）であり得る。
【００４６】
本発明の別の態様では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ欠損ブタは他の異種抗原（例えば、ブタｉＧｂ３シンターゼ（例えば、を米国特許出願６０／５１７，５２４号を参照のこと）および／またはブタＦｏｒｓｓｍａｎシンターゼ（例えば、米国特許出願６０／５６８，９２２号を参照のこと）など）をコードする遺伝子も欠く。別の実施形態では、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生されたα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠くブタ細胞を提供する。別の実施形態では、ブタ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ノックアウト細胞を、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物によって産生されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子をノックアウトするようにさらに修飾する。さらに、任意選択的に不都合な免疫応答に関連する１つまたは複数のさらなる遺伝子を欠く本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ欠損ブタを補体阻害タンパク質（例えば、ＣＤ５９、ＤＡＦ、および／またはＭＣＰなど）を発現するように修飾することができ、ＭＣＰをＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の発現を消失するようにさらに修飾することができる。これらの動物を、移植療法のための組織および／または臓器の供給源として使用することができる。これらの動物を、移植療法のための組織および／または臓器の供給源として使用することができる。この様式で調製したブタ胚またはそれから発生した細胞株も細胞移植療法で使用することができる。
【００４７】
（発明の説明）
本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の消失により、Ｎｅｕ５Ｇｃエピトープに対するヒトの免疫応答を減少し、異種移植に対する免疫学的障壁を除去することができる。本発明は、全長ｃＤＮＡおよびペプチドをコードする新規の核酸配列に関する。遺伝子のゲノム機構、イントロン配列、および調節領域に関する情報も提供する。１つの態様では、本発明は、配列番号１、３、５、または７の１つをコードする単離および実質的に精製されたｃＤＮＡ分子またはそのフラグメントを提供する。本発明の別の態様では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロラーゼ遺伝子の全長ゲノムを含むＤＮＡ配列を、配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０またはそのフラグメントに提供する。別の態様では、配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、または５０由来のブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃヒドロキシラーゼｃＤＮＡまたはゲノム配列の増幅のためのプライマーを提供する。さらに、配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０またはそのフラグメント由来のＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ核酸配列を同定するためのプローブを提供する。配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０またはそのフラグメントによって示されるＤＮＡを使用して、機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠くブタを構築物ことができる。したがって、本発明はまた、機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠くブタ染色体および本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生された機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼタンパク質を欠くトランスジェニックブタを提供する。このようなブタを、ヒトへの異種移植のための組織供給源として使用することができる。別の実施形態では、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物によって産生されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ欠損ブタは、異種移植における不都合な免疫応答に関連する他の遺伝子（例えば、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、ｉＧｂ３シンターゼ遺伝子、またはＦＳＭシンターゼ遺伝子など）も欠く。別の実施形態では、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼおよび／または異種移植における不都合な免疫応答に関連する他の遺伝子を欠くブタは、補体阻害因子（例えば、ＣＤ５９、ＤＡＦ、および／またはＭＣＰなど）を発現する。
【００４８】
（定義）
「標的ＤＮＡ配列」は、相同組換えによって修飾されるＤＮＡ配列である。標的ＤＮＡは、動物細胞の任意のオルガネラ（核およびミトコンドリアが含まれる）中に存在することができ、インタクトな遺伝子、エクソンもしくはイントロン、調節配列、または遺伝子間の任意の領域であり得る。
【００４９】
「ターゲティングＤＮＡ配列」は、所望の配列修飾を含むＤＮＡ配列である。ターゲティングＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡと実質的に同質遺伝子的であり得る。
【００５０】
「相同ＤＮＡ配列または相同ＤＮＡ」は、基準ＤＮＡ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のＤＮＡ配列である。相同配列は、ストリンジェントな条件下で標的配列とハイブリッド形成し、ストリンジェントな条件には、配列が少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％または９８％同一である場合にハイブリッド形成が起こる条件が含まれる。
【００５１】
「同質遺伝子または実質的に同質遺伝子のＤＮＡ配列」は、基準ＤＮＡ配列と同一であるかほぼ同一であるＤＮＡ配列である。用語「実質的に同質遺伝子的な」は、基準ＤＮＡ配列と少なくとも約９７〜９９％同一、好ましくは基準ＤＮＡ配列と少なくとも約９９．５〜９９．９％同一、一定の用途では基準ＤＮＡ配列と１００％同一のＤＮＡをいう。
【００５２】
「相同組換え」は、配列相同性に基づいたＤＮＡ組換えプロセスをいう。
【００５３】
「遺伝子ターゲティング」は、一方が染色体上に存在し、他方が染色体上に存在しない２つのＤＮＡ配列間の相同組換えをいう。
【００５４】
「非相同または無作為な組み込み」は、ＤＮＡが相同組換えに関与しないゲノムに組み込まれる任意のプロセスをいう。
【００５５】
「選択マーカー遺伝子」は、その発現により遺伝子を含む細胞が同定される遺伝子である。選択マーカーは、この遺伝子を含まない細胞の成長を防止または遅延させる培地上で細胞を増殖させるものであり得る。例には、抗生物質耐性遺伝子および生物を選択された代謝産物に対して成長させる遺伝子が含まれる。あるいは、この遺伝子は、細胞への容易に同定される表現型の付与によって形質転換体の目視によるスクリーニングを容易にすることができる。このような同定可能な表現型は、例えば、発光もしくは着色化合物の産生または細胞周囲の培地中の検出可能な変化であり得る。
【００５６】
用語「連続する」は、本明細書中でその標準的な意味（すなわち、途切れないまたは連続的な）で使用される。
【００５７】
用語「ブタ」は、任意のブタ種（Ｌａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅ、Ｌａｎｄｒａｃｅ、Ｍｅｉｓｈａｎ、Ｍｉｎｉｐｉｇが含まれる）をいう。
【００５８】
用語「卵母細胞」は、卵形成の最終産物であり、且つ前駆体形態がそれぞれ卵原細胞、一次卵母細胞および二次卵母細胞でもある成熟動物の卵を説明する。
【００５９】
用語「フラグメント」は、ヌクレオチドまたはペプチド配列の一部または部分配列を意味する。
【００６０】
用語「誘導体」および「アナログ」は、このようなヌクレオチドまたはペプチドと本質的に同一の生物機能または生物活性を保持するヌクレオチド配列またはペプチド配列を意味する。例えば、アナログには、活性成熟ポリペプチドを産生するためのプロタンパク質部分の切断によって活性化することができるプロタンパク質が含まれる。
【００６１】
本明細書中で提供したＤＮＡ（デオキシリボ核酸）配列を、塩基アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）によって示す。
【００６２】
本明細書中で提供したアミノ酸配列を、以下の略語で示す。
【００６３】
【表１】
「トランスフェクション」は、宿主細胞へのＤＮＡの移入をいう。細胞は、自然にはＤＮＡを取り込まない。したがって、種々の技術的「トリック」を使用して、遺伝子導入を容易にする。多数のトランスフェクション法（例えば、ＣａＰＯ４およびエレクトロポレーション）が当業者に公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。宿主細胞のトランスフェクションは、首尾の良いトランスフェクションの指標である。
【００６４】
（Ｉ．ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の完全なｃＤＮＡ配列および変異型）
本発明の１つの態様は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の新規の全長核酸ｃＤＮＡ配列を提供する（図２、表１、配列番号１）。本発明の別の態様は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の推定アミノ酸ペプチド配列を提供する（表２、配列番号２）。全長ｃＤＮＡのＡＴＧ開始コドンはエクソン４の３’部分に存在し、終止コドンＴＡＧはエクソン１７の３’部分で見出される。配列番号１または２と少なくとも９０、９５、９８、または９９％相同な核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。さらに、配列番号１または２の少なくとも１０、１５、１７、２０、または２５個の連続核酸またはアミノ酸を含むヌクレオチド配列およびペプチド配列も提供する。配列番号１〜２のフラグメント、誘導体、およびアナログをさらに提供する。配列番号１〜２のフラグメントには、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、５０００、または１０，０００個のヌクレオチドを含む任意の連続する核酸配列またはペプチド配列が含まれ得る。
【００６５】
【表１Ａ−１】
【００６６】
【表１Ａ−２】
【００６７】
【表１Ａ−３】
【００６８】
【表１Ａ−４】
【００６９】
【表２−１】
【００７０】
【表２−２】
（変異型）
本発明の別の態様は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子転写物の３つの新規の変異型の新規の核酸ｃＤＮＡ配列を提供する（図２、表３、５、および７、配列番号３、５、および７）。配列番号３は、エクソン１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５ａ、１６、１７、および１８を含む遺伝子の変異型（変異型１）のｃＤＮＡを示す。エクソン１５ａは、通常はイントロン１５（エクソン１６の約４６０ｂｐ上流）中で認められる潜在性のエクソンである。変異型１の開始コドンはエクソン４中に存在し、終止コドンはエクソン１７中に存在する。配列番号５は、エクソン１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１２ａを含む遺伝子の変異型（変異型２）のｃＤＮＡを示す。エクソン１２ａは、イントロン１２の部分配列から保持された潜在性のエクソンである（配列番号２１を参照のこと）。変異型２の開始コドンはエクソン４中に存在し、終止コドンはエクソン１２ａ中に存在する。配列番号７は、エクソン１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１１ａを含む遺伝子の変異型（変異型３）のｃＤＮＡを示す。エクソン１１ａは、イントロン１１の部分配列から保持された潜在性のエクソンである（配列番号１９を参照のこと）。変異型３の開始コドンはエクソン４中に存在し、終止コドンはエクソン１１ａ中に存在する。本発明の別の態様は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子転写物の３つの新規の変異型の新規の推定アミノ酸ペプチド配列を提供する。配列番号４、６、および８は、それぞれ変異型１、変異型２、および変異型３のアミノ酸配列を示す。配列番号３〜８と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。さらに、配列番号３〜８の少なくとも１０、１５、１７、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、または１０００個の連続するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含むヌクレオチド配列およびペプチド配列も提供する。配列番号３〜８のフラグメント、誘導体、およびアナログをさらに提供する。配列番号３〜８のフラグメントには、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、１７ｂｐ、２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、５ｋｂｐ、または１０ｋｐｂを含む任意の連続核酸配列またはペプチド配列が含まれ得る。
【００７１】
【表３−１】
【００７２】
【表３−２】
【００７３】
【表３−３】
【００７４】
【表３−４】
【００７５】
【表４】
【００７６】
【表５−１】
【００７７】
【表５−２】
【００７８】
【表６】
【００７９】
【表７−１】
【００８０】
【表７−２】
【００８１】
【表７−３】
【００８２】
【表８】
本発明の他の態様では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃヒドロキシラーゼをコードするｃＤＮＡまたはその変異型を含む核酸構築物を提供する。これらのｃＤＮＡ配列は、配列番号１、３、５、または７であり得るか、配列番号２、４、６、もしくは８またはその任意のフラグメントに由来し得る。構築物は、１つまたは１つを超える内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。構築物はまた、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得るか、構築物はプロモーターを含まなくてよい。別の実施形態では、宿主ゲノムへの挿入がランダムまたはターゲティングされている核酸配列を含む核酸構築物を提供する。核酸配列に加えて、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子配列、開始配列および／またはエンハンサー配列、ポリＡテール配列、および／または原核生物および／または真核生物の宿主細胞で構築物を発現させる核酸配列など）を含み得る。適切なベクターおよび選択マーカーを以下に記載する。発現構築物は、転写開始、終結、および／またはリボゾーム結合部位のための部位をさらに含み得る。構築物は、任意の原核細胞または真核細胞（酵母細胞、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞、および／または植物細胞が含まれるが、これらに限定されない）で発現することができる。
【００８３】
このような構築物で使用するためのプロモーターには、λファージＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｈｏＡプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、ＰＧＫＩプロモーター、ＧＡＬＩプロモーター、ＧＡＬＩＯ遺伝子プロモーター、ＣＹＣｉプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＴＲＰＩプロモーター、ＡＤＨＩプロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ホルグリムアルデヒド（ｆｏｒｇｌｙｍａｌｄｅｈｙｄｅ）リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキソキナーゼプロモーター、ピルビン酸デカルボキシラーゼプロモーター、ホスホフルクロキナーゼプロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、ホスホグルコースイソメラーゼプロモーター、グルコキナーゼα接合因子フェロモンプロモーター、ＰＲＢＩプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤＩプロモーター、メタロチオネインプロモーター、および／またはアデノウイルスおよびワクシニアウイルス由来などの哺乳動物ウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。他のプロモーターが当業者に公知である。
【００８４】
（ＩＩ．ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム配列）
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ機構を示す核酸配列（図１、表９）も提供する。配列番号１０〜２８は、それぞれエクソン１、４〜１１、１１ａ、１２、１２ａ、１３〜１５、１５ａ、および１６〜１８を示す。エクソン１１ａ、１２ａ、および１５ａは、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの一定の変異転写物で保持される潜在的エクソンである。配列番号２９〜４５は、エクソン１とエクソン４との間のイントロン配列（以後それぞれイントロン１ａおよびイントロン１ｂ）、４〜１５、１５ａ、１６、および１７を示す。イントロン１５ａは、潜在的エクソン１５ａに続くイントロン１５の３’下流部分である。配列番号９は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の５’非翻訳領域を示す。ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を示す核酸配列（表１０、配列番号４６）も提供する。さらに、５’ＵＴＲ、エクソン１、およびエクソン１とエクソン４との間に存在するイントロン配列の一部（イントロン１ａ）を含む５’連続ゲノム配列を示す連続ゲノム配列（配列番号４７、表１１）を提供する。エクソン１とエクソン４からエクソン１８との間に存在するイントロン配列（イントロン１ｂ）を含む連続ゲノム配列（配列番号４８、表１２）も提供する。配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。さらに、配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、５０００、または１０，０００個の連続ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含むヌクレオチド配列およびペプチド配列ならびにこれらと少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同な任意のヌクレオチド配列も提供する。配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０のフラグメント、誘導体、およびアナログをさらに提供する。配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０のフラグメントには、任意の連続核酸配列もしくはペプチド配列または少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、１７ｂｐ、２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、５ｋｂｐ、もしくは１０ｋｐｂが含まれ得る。
【００８５】
さらに、ゲノム配列の推定転写因子結合部位の形態の調節領域を同定した（図４を参照のこと）。これらの結合部位は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼゲノムの５’ＵＴＲおよびエクソン１に存在し、転写因子（例えば、ＥＴＳＦ、ＭＺＦ１、ＳＦ１、ＣＭＹＢ、ＭＥＦ２、ＴＡＴＡ、ＭＥＦ２、ＮＭＰ４、ＣＡＡＴ、ＡＰ１、ＢＲＮ２、ＳＡＴＢ１、ＡＴＦ、ＧＡＴ１、ＵＳＦ、ＷＨＮ、ＮＭＰ４、ＺＦ５、ＮＦＫＢ、ＺＢＰ８９、ＭＯＫ２、ＺＦ５、ＮＦＹ、およびＭＹＣＭＡＸなど）の結合部位が含まれる。
【００８６】
【表９−１】
【００８７】
【表９−２】
【００８８】
【表９−３】
【００８９】
【表９−４】
【００９０】
【表９−５】
【００９１】
【表９−６】
【００９２】
【表９−７】
【００９３】
【表９−８】
【００９４】
【表９−９】
【００９５】
【表９−１０】
【００９６】
【表９−１１】
【００９７】
【表９−１２】
【００９８】
【表９−１３】
【００９９】
【表９−１４】
【０１００】
【表９−１５】
【０１０１】
【表９−１６】
【０１０２】
【表９−１７】
【０１０３】
【表９−１８】
【０１０４】
【表９−１９】
【０１０５】
【表９−２０】
【０１０６】
【表９−２１】
【０１０７】
【表９−２２】
【０１０８】
【表９−２３】
【０１０９】
【表９−２４】
【０１１０】
【表９−２５】
【０１１１】
【表９−２６】
【０１１２】
【表９−２７】
【０１１３】
【表９−２８】
【０１１４】
【表１０−１】
【０１１５】
【表１０−２】
【０１１６】
【表１０−３】
【０１１７】
【表１０−４】
【０１１８】
【表１０−５】
【０１１９】
【表１０−６】
【０１２０】
【表１０−７】
【０１２１】
【表１０−８】
【０１２２】
【表１０−９】
【０１２３】
【表１０−１０】
【０１２４】
【表１０−１１】
【０１２５】
【表１０−１２】
【０１２６】
【表１０−１３】
【０１２７】
【表１０−１４】
【０１２８】
【表１０−１５】
【０１２９】
【表１０−１６】
【０１３０】
【表１０−１７】
【０１３１】
【表１０−１８】
【０１３２】
【表１０−１９】
【０１３３】
【表１０−２０】
【０１３４】
【表１０−２１】
【０１３５】
【表１０−２２】
【０１３６】
【表１１】
【０１３７】
【表１２−１】
【０１３８】
【表１２−２】
【０１３９】
【表１２−３】
【０１４０】
【表１２−４】
【０１４１】
【表１２−５】
【０１４２】
【表１２−６】
【０１４３】
【表１２−７】
【０１４４】
【表１２−８】
【０１４５】
【表１２−９】
【０１４６】
【表１２−１０】
【０１４７】
【表１２−１１】
【０１４８】
【表１２−１２】
【０１４９】
【表１２−１３】
【０１５０】
【表１２−１４】
【０１５１】
【表１２−１５】
【０１５２】
【表１２−１６】
【０１５３】
【表１２−１７】
【０１５４】
【表１２−１８】
【０１５５】
【表１２−１９】
【０１５６】
【表１２−２０】
【０１５７】
【表１２−２１】
【０１５８】
【表１３−１】
【０１５９】
【表１３−２】
【０１６０】
【表１３−３】
【０１６１】
【表１３−４】
【０１６２】
【表１３−５】
【０１６３】
【表１３−６】
【０１６４】
【表１３−７】
【０１６５】
【表１３−８】
【０１６６】
【表１３−９】
【０１６７】
【表１３−１０】
配列番号４９は、エクソン４に対して５’方向に、エクソン４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７、イントロン７、およびエクソン８を含む連続ゲノム配列を示す（表１３）。さらに、配列番号４９の少なくとも１７５０、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、または２００００個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列ならびに配列番号４９と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列を提供する。
【０１６８】
【表１４−１】
【０１６９】
【表１４−２】
【０１７０】
【表１４−３】
【０１７１】
【表１４−４】
【０１７２】
【表１４−５】
【０１７３】
【表１４−６】
【０１７４】
【表１４−７】
【０１７５】
【表１４−８】
【０１７６】
【表１４−９】
【０１７７】
【表１４−１０】
【０１７８】
【表１４−１１】
【０１７９】
【表１４−１２】
配列番号５０は、エクソン１２、イントロン１２、エクソン１３、イントロン１３、エクソン１４、イントロン１４、エクソン１５、イントロン１５、エクソン１６、イントロン１６、エクソン１７、イントロン１７、およびエクソン１８を含む連続ゲノム配列を示す。さらに、配列番号５０の少なくとも１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、または２０、０００個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列ならびに配列番号５０と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列を提供する。
【０１８０】
（ＶＩＩＩ．オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー）
本発明は、さらに、上記配列（配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０）とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを提供する。配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０ならびにそのフラグメントと相同であり得るオリゴヌクレオチドを提供する。ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０ならびにそのフラグメントとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドも提供する。ストリンジェントな条件は、配列が少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または少なくとも約９８％相同である場合のみハイブリッド形成する条件を記載する。あるいは、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０ならびにそのフラグメントとハイブリッド形成する少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、７５、または１００塩基を有し得る。このようなオリゴヌクレオチドを、本明細書中に提供した配列を検出するためのプライマーおよびプローブとして使用することができる。プローブまたはプライマーは、少なくとも１４ヌクレオチド長であり得るが、好ましい実施形態では、少なくとも１５、２０、２５、２８、３０、または３５ヌクレオチド長である。
【０１８１】
上記配列を考えると、当業者は、標準的なアルゴリズムを使用して、配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０ならびにそのフラグメント中に含まれる配列と相同なオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを構築することができる。相補的対合の規則は周知である：シトシン（「Ｃ」）は常にグアニン（「Ｇ」）と対合し、チミン（「Ｔ」）またはウラシル（「Ｕ」）は常にアデニン（「Ａ」）と対合する。プライマーまたはプローブと十分にハイブリッド形成して対応する相補配列を認識することができる限り、プライマーまたはプローブは標的核酸配列と１００％相補的である必要はないと認識される。一般に、一定の程度の対ミスマッチを許容することができる。
【０１８２】
プライマーのハイブリッド形成領域として使用されるオリゴヌクレオチド配列を、プローブのハイブリッド形成領域として使用することもできる。プローブとして使用するためのプライマー配列の適合性は、プライマーのハイブリッド形成特性に依存する。同様に、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することができる。
【０１８３】
これらの特定の実施形態では、例えば、５’または３’末端のいずれかへの標的配列に相補的であるか標的配列に相補的ではないヌクレオチドの付加によって特定のプライマーおよびプローブを調製することができることが当業者に明らかである。プライマー組成物を標的配列上の伸長開始点として作用する限り、およびプライマーおよびプローブが上記配列番号内に含まれる少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含む限り、このような組成物は本発明の範囲内である。
【０１８４】
本明細書中のプローブおよびプライマーを、考慮すべき要因であるが、排他的でも決定的でもない以下の基準によって選択することができる。プローブおよびプライマーを、配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０ならびにそのフラグメントで同定されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ核酸配列領域から選択する。プローブおよびプライマーは、試験に悪影響を与えると予想される他の遺伝子配列との相同性を欠く。プローブまたはプライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは、そのＤＮＡポリメラーゼの一部はＫｌｅｎｏｗフラグメントと呼ばれる）などの増幅酵素による伸長を妨害することができる増幅核酸中での二次構造形成を欠く。増幅培地中での約１５重量％まで、好ましくは５〜１０重量％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および／または３０〜４０℃の漸増増幅温度の使用によってこれを行うことができる。
【０１８５】
好ましくは、プローブまたはプライマーは、式アデニン（Ａ）＋チミン（Ｔ）＋シトシン（Ｃ）＋グアニン（Ｇ）／シトシン（Ｃ）＋グアニン（Ｇ）によって測定したところ、約５０％のグアニンおよびシトシンヌクレオチドを含むべきである。好ましくは、プローブまたはプライマーは、ハイブリッドの安定性が減少し得るプライマーの３’末端に複数の連続したアデニン残基およびチミン残基を含まない。
【０１８６】
本発明のプローブおよびプライマーは、約１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、または２８ヌクレオチド長（詳細には、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドが含まれる）であり得る。本発明で使用されるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および修飾ヌクレオチド（そのハイブリッド形成特性が本質的に変化しない修飾基を含むイノシンまたはヌクレオチドなど）であり得る。プローブおよびプライマー配列を、本明細書を通して５’末端から３’末端の方向で一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして示す。このようなまたはその相補的形態またはそのＲＮＡ形態（ＴがＵに置換されている）で任意のプローブを使用することができる。
【０１８７】
本発明のプローブおよびプライマーを、対応するヌクレオチド配列を含むインサートを含む組換えプラスミドのクローニング、任意選択的に適切なヌクレアーゼの使用時のクローン化プラスミドからの後者の切断およびその回収（例えば、分子量による分画）によって調製することができる。本発明のプローブおよびプライマーを、例えば、従来のホスホトリエステル法もしくはホスホジエステル法またはその自動化実施形態によって化学合成することも出きる。１つのこのような自動化実施形態では、出発材料としてジエチルホスホラミダイトを使用し、Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−１８６２（１９８１）に記載のように合成することができる。修飾固相上での１つのオリゴヌクレオチド合成方法は、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。生物学的供給源（制限エンドヌクレアーゼ消化物など）から単離したプローブまたはプライマーを使用することも可能である。
【０１８８】
プライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ Ｓ．，Ｎａｉｂｕｎｐｉ Ｇａｋｋａｉ Ｚａｓｓｈｉ．４３（６）：５２７−３２（１９６７））、アルキルホスホロチオエート（Ｍｉｌｌｅｒ Ｐ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８（２３）：５１３４−４３（１９７９）、ペプチド核酸（Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｐ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（５０３７）：１４９７−５００（１９９１）；Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｐ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ−Ａｃｉｄｓ−Ｒｅｓ．２１（２）：１９７−２００（１９９３））、モルホリノ核酸、固定核酸、偽環状オリゴ核酸塩基、２’−０，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸などのヌクレオチドアナログも含み得るか、挿入剤（Ａｓｓｅｌｉｎｅ Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１１）：３２９７−３０１（１９８４））を含み得る。
【０１８９】
所望の特徴を有するプローブおよびプライマーのデザインのために、当業者に公知の以下の有用なガイドラインを適用することができる。ハイブリッド形成反応の範囲および特異性は多数の要因に影響を受け、１つまたは複数のこれらの要因の操作により、特定のプローブの正確な感度および特異性（その標的に完全に相補的であるかどうか）が決定される。本明細書中でさらに説明される種々のアッセイ条件の重要性および影響は、当業者に公知である。
【０１９０】
標的核酸ハイブリッドに対するプローブおよびプライマーの安定性は、アッセイ条件に適合するように選択すべきである。長いＡＴリッチな配列の回避、ＧＣ塩基対でのハイブリッドの終結、および／または適切なＴｍでのプローブのデザインによってこれを行うことができる。プローブの開始点および終点を、その長さおよびＧＣ率によってＴｍが最終アッセイが行われる温度よりも約２〜１０℃高くなるように選択すべきである。Ｇ−Ｃ塩基対がさらなる水素結合によってＡ−Ｔ塩基対と比較して熱安定性が高いので、プローブの塩基組成は有意である。したがって、より高いＧ−Ｃ含量の相補核酸を含むハイブリッド形成は、より高い温度で安定である。プローブデザイン時にプローブが使用されるイオン強度およびインキュベーション温度などの条件も考慮すべきである。反応混合物のイオン強度が増加するにつれてハイブリッド形成が増加し、イオン強度の増加と共にハイブリッドの熱安定性が増加することが公知である。水素結合を破壊するホルムアミド、尿素、ＤＩＶＩＳＯ、およびアルコールなどの化学試薬は、ハイブリッド形成のストリンジェンシーを増加させる。このような試薬による水素結合の不安定化によりＴｍが非常に減少し得る。一般に、所与の二重鎖の融解温度より５℃低い温度で約１０〜５０塩基長の合成オリゴヌクレオチドプローブの最適なハイブリッド形成が起こる。至適温度未満でのインキュベーションによりミスマッチ塩基配列がハイブリッド形成するので、特異性が減少し得る。高ストリンジェンシー条件下のみでハイブリッド形成するプローブを有することが望ましい。高ストリンジェンシー条件下のみで高相補核酸ハイブリッドが形成され、相補性が十分でないハイブリッドは形成されない。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーにより、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間に必要な相補性が決定される。標的核酸と形成されたハイブリッドと非標的核酸と形成されたハイブリッドとの間の安定性の相違を最大にするなどのためにストリンジェンシーの程度を選択する。この場合、１塩基対の変化を検出する必要があり、非常に高いストリンジェンシー条件が必要である。
【０１９１】
標的核酸配列の長さ（したがって、プローブ配列の長さ）も重要であり得る。いくつかの場合、所望のハイブリッド形成特性を有するプローブおよびプライマーが得られる特定の領域由来の種々の位置および長さのいくつかの配列が存在し得る。他の場合、ある配列が１塩基しか異ならない別の配列よりも有意に良好であり得る。
【０１９２】
完全に相補的ではない核酸をハイブリッド形成することが可能であるが、主に完全に相補的な塩基の最も長いストレッチによりハイブリッドの安定性が決定される。異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを使用することができるが、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは約１４塩基長と３０塩基長との間であり、標的核酸配列と完全に相補的な配列で十分なストレッチを有する。
【０１９３】
ハイブリッド形成に対して抑制的である強固な内部構造を形成することが公知の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の領域はあまり好ましくない。同様に、広範な自己相補性を有するプローブは回避すべきである。上記で説明するように、ハイブリッド形成は、水素結合した二本鎖を形成する相補核酸の２つの一本鎖の会合である。２つの鎖のうちの１つの全体または一部がハイブリッドに関与する場合、新規のハイブリッドの形成への関与が低下し得ると予想される。十分な自己相補性が存在する場合、１つのプローブ型の分子内で形成された分子内および分子間ハイブリッドが存在し得る。このような構造を、慎重なプローブデザインによって回避することができる。目的の配列の大部分が一本鎖であるようなプローブのデザインにより、ハイブリッド形成の比率および範囲が非常に増加し得る。この相互作用型を検索するためにコンピュータプログラムを利用可能である。しかし、一定の例では、この相互作用型を回避することができない。
【０１９４】
特異的プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブに特異的な配列を、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ核酸配列を増幅および検出することができるポリメラーゼ連鎖反応で使用することができる。
【０１９５】
（ＩＶ．ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の遺伝子ターゲティング）
遺伝子ターゲティングにより、動物細胞ゲノムの選択的操作が可能である。この技術を使用して、部位特異的様式および正確な様式で特定のＤＮＡ配列をターゲティングおよび修飾することができる。修飾のために異なるＤＮＡ配列型（調節領域、コード領域、および遺伝子間のＤＮＡ領域が含まれる）をターゲティングすることができる。調節領域の例には、プロモーター領域、エンハンサー領域、ターミネーター領域、およびイントロンが含まれる。これらの調節領域の修飾により、遺伝子発現のタイミングおよびレベルを変化させることができる。細胞内のタンパク質を変化、増強、または消失させるためにコード領域を修飾することができる。イントロンおよびエクソンならびに遺伝子間領域は、修飾に適切な標的である。
【０１９６】
ＤＮＡ配列の修飾には、いくつかの型（挿入、欠失、置換、またはその任意の組み合わせが含まれる）が存在し得る。修飾の特定の例は、遺伝子産物の発現を破壊するヌクレオチド配列の部位特異的に相互作用による遺伝子の不活化（すなわち、「ノックアウト」）である。例えば、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の１つの破壊アプローチは、ターゲティングＤＮＡと標的ＤＮＡとの間の相同組換えによって選択マーカーを標的遺伝子のコード領域に挿入することができるように選択マーカーをターゲティングＤＮＡに挿入することである。例えば、図３、１２、および１３を参照のこと。この方法では、例えば、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子配列が破壊され、コードされた酵素が機能しなくなる。
【０１９７】
（相同組換え）
相同組換えによって内因性遺伝子が部位特異的に修飾されるので、ゲノムを新規に変化するように操作することができる。最初の相同組換え工程は、ヘテロ二重鎖ＤＮＡを含む中間体組換え構造を形成するための相補配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ鎖とのＤＮＡ二重鎖の対合を含むＤＮＡ鎖交換である（例えば、Ｒａｄｄｉｎｇ，Ｃ．Ｍ．（１９８２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１６：４０５；米国特許第４，８８８，２７４号を参照のこと）。ヘテロ二重鎖ＤＮＡは、いくつかの形態（１つの相補鎖がＤＮＡ二重鎖に侵入した三重鎖形態を含む３つのＤＮＡ鎖が含まれる）を取ることができ（Ｈｓｉｅｈら，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ４：１９５１（１９９０）；Ｒａｏら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：２９８４））、２つの相補ＤＮＡ鎖がＤＮＡ二重鎖と対合する場合、古典的なＨｏｌｌｉｄａｙ組換え連結構造およびΧ構造（Ｈｏｌｌｉｄａｙ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．５：２８２（１９６４））または二重Ｄループ（“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ Ｌｏｏｐ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．０７／７５５，４６２，ｆｉｌｅｄ Ｓｅｐ．４，１９９１）を形成することができる。一旦形成されると、ヘテロ二重鎖構造を、侵入したＤＮＡ鎖の全部または一部がレシピエントＤＮＡ二重鎖にスプライシングされる鎖の破壊および交換、レシピエントＤＮＡ二重鎖の付加または置換によって解明することができる。あるいは、ヘテロ二重鎖構造によって遺伝子を変換することができ、テンプレートとして侵入鎖を使用したミスマッチ塩基の修復によって侵入鎖の配列がレシピエントＤＮＡ二重鎖に移行される（Ｇｅｎｅｓ，第３版（１９８７）Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｌｏｐｅｚら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５６４３（１９８７））。破壊および再連結機構または遺伝子変換機構のいずれかにより、相同対合連結部でのヘテロ二重鎖ＤＮＡの形成は、あるＤＮＡから別のＤＮＡへの遺伝子配列情報を伝達するように作用することができる。
【０１９８】
ＤＮＡ分子間の遺伝子配列情報を伝達する相同組換え（遺伝子変換および古典的な鎖の破壊／再連結）の能力により、ターゲティングされた相同組換えが遺伝子工学および遺伝子操作における強力な方法となる。
【０１９９】
相同組換えでは、組み込まれるＤＮＡが実質的に相同なＤＮＡ配列を含むゲノム中の部位と相互作用して組み込まれる。非相同性の（「無作為」または「不正の」）組み込みでは、組み込まれるＤＮＡはゲノム中の相同配列で見出されないが、他の場所（多数の潜在的な位置）に組み込まれる。一般に、高等真核細胞を使用した研究によって、相同組換えの頻度は無作為な組み込みの頻度よりもはるかに低いことが明らかとなった。これらの頻度の比は、相同組換えを介した相互作用に依存する「遺伝子ターゲティング」（すなわち、ゲノム中での外因性「ターゲティングＤＮＡ」と対応する「標的ＤＮＡ」との間の組換え）と直接関連する。
【０２００】
多数の論文に哺乳動物細胞における相同組換えの使用が記載されている。これらの論文の例は、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：３１５３−３１５７，１９８４；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら，ＭｏＬ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．５：７１４−７２０，１９８５；Ｓｍｉｔｈｉｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２３４，１９８５；Ｗａｋｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．８：２０８０−２０８９，１９８５；Ａｙａｒｅｓら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１１：３７５−３８８，１９８５；Ａｙａｒｅｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．７：１６５６−１６６２，１９８６；Ｓｏｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６８２０−６８２４，１９８７；ＴｈｏｍａｓらＣｅｌｌ ４４：４１９−４２８，１９８６；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２，１９８７；Ｎａｎｄｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３８４５−３８４９，１９８８；およびＭａｎｓｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２，１９８８；ＥｖａｎｓおよびＫａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９４：１４６−１５４，１９８１；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５７６−５７８，１９８７；ＴｈｏｍａおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２，４９８７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｃｅｌｌ ５６：３１６−３２１，１９８９である。
【０２０１】
本発明は、線維芽細胞などの細胞中でブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化するために相同組換えを使用する。ＤＮＡは、機能的酵素の発現およびＨａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗原分子の産生を防止するために、天然の遺伝子の少なくとも一方、任意選択的には両方のコピーが変化した特定の対立遺伝子に遺伝子の少なくとも一部を含み得る。変化は、挿入、欠失、置換、またはその組み合せであり得る。変化がたった１つの遺伝子のコピーが不活化する導入である場合、標的遺伝子の１つの非変異コピーを有する細胞が増幅され、変化が第１の変化と同一でも異なっていてもよく（通常異なっている）、且つ欠失または置換が含まれる第２のターゲティング工程に供することができ、最初に移入された変化の少なくとも一部が重複し得る。この第２のターゲティング工程では、同一の相同性アームを有するが、異なる哺乳動物選択マーカーを含むターゲティングベクターを使用することができる。得られた形質転換体を、機能的標的抗原の非存在についてスクリーニングし、野生型標的遺伝子の非存在を確認するために細胞のＤＮＡをさらにスクリーニングすることができる。あるいは、変異にヘテロ接合性を示す宿主の交配によって表現型に関するホモ接合性を達成することができる。
【０２０２】
遺伝子操作することができるブタ細胞を、種々の異なる臓器および組織（脳、心臓、肺、腺、脳、目、胃、脾臓、すい臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、鼻、口、唇、歯茎、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、幽門、甲状腺、胸腺、腎上体、骨、軟骨、腱、靭帯、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、副腎、卵巣、輸卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節、およびリンパ管などであるが、これらに限定されない）から得ることができる。本発明の１つの実施形態では、ブタ細胞は、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴ）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋肉細胞、リン酸細胞（□ｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｅｌｌ）、卵丘細胞、上皮細胞、内皮細胞、ランゲルハンス島細胞、血球、血液前駆細胞、骨細胞、骨前駆細胞、神経幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、ケラチノサイト、臍静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、線維芽細胞、肝臓星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クップフェル細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球、白血球、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、有毛細胞、気泡細胞、腎細胞、網膜細胞、桿状体細胞、錐状体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、記憶細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、筋細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、腟上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、尿細管周囲細胞、セルトリ細胞、ルテイン細胞、頸部細胞、子宮内膜細胞、乳房細胞、濾胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、および破骨細胞からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。
【０２０３】
１つの別の実施形態では、胚幹細胞を使用することができる。胚幹細胞株を使用することができるか、胚幹細胞株をブタ動物などの宿主から新たに得ることができる。細胞を、適切な線維芽細胞支持細胞層で成長させるか、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下で成長させることができる。好ましい実施形態では、ブタ細胞は線維芽細胞であり得るが、１つの特定の実施形態では、ブタ細胞は胎児線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、発育中の胎児および成体動物から大量に得ることができので、好ましい体細胞型である。
【０２０４】
これらの細胞を急速な倍加時間で容易に増殖することができ、遺伝子ターゲティング手順で使用するためにクローンで増殖することができる。
【０２０５】
（ターゲティングベクター）
ターゲティングした対立遺伝子でホモ接合性の細胞を、標的対立遺伝子に相同であり、且つマーカー遺伝子を含むＤＮＡの細胞への移入および組み込まれた構築物を含む細胞の選択によって産生することができる。標的対立遺伝子で標的ベクター中の相同ＤＮＡを染色体ＤＮＡで組換える（例えば、図３、１２、および１３を参照のこと）。マーカー遺伝子の両端を、相同ＤＮＡ配列、３’組換えアーム、および５’組換えアームと隣接させることができる（例えば、図１１を参照のこと）。ターゲティンベクターの構築方法は当該分野で記載されており、例えば、Ｄａｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：２５１−２５５，２００２；ＷＯ ００／５１４２４を参照のこと。
【０２０６】
標的対立遺伝子での相同組換えのために種々の構築物を調製することができる。通常、構築物には、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、２ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１０ｋｂｐ、１５ｋｂｐ、２０ｋｂｐ、または５０ｋｂｐの標的対立遺伝子と相同な配列が含まれ得る。配列には、任意のブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の任意の連続配列が含まれ得る（配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０またはその任意の組み合わせもしくはフラグメントの少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、５０００、または１０，０００個の連続ヌクレオチドが含まれる）。配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０のフラグメントには、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、１７ｂｐ、２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、５ｋｂｐ、または１０ｋｐｂを含む任意の連続核酸配列またはペプチド配列が含まれ得る。
【０２０７】
標的ＤＮＡ配列の相同性の範囲の決定に種々の検討材料（例えば、標的対立遺伝子のサイズ、配列の利用可能性、標的対立遺伝子における二重重複事象の相対的効率、および標的配列の他の配列との類似性など）が関与し得る。
【０２０８】
ターゲティングＤＮＡには、実質的に同質遺伝子のＤＮＡが修飾すべきゲノム中の対応する標的配列での所望の配列修飾物と隣接した配列が含まれ得る。実質的に同質遺伝子の配列は、対応する標的配列（所望の配列修飾を除く）を少なくとも約９５％、９７〜９８％、９９．０〜９９．５％、９９．６〜９９．９％、または１００％同一であり得る。ターゲティングＤＮＡおよび標的ＤＮＡは、好ましくは、１００％同一である少なくとも７５、１５０、または５００塩基対のＤＮＡストレッチを共有することができる。したがって、ターゲティングＤＮＡは、ターゲティングされる細胞株と密接に関連する細胞に由来し得るか、ターゲティングＤＮＡはターゲティングされる細胞と同一の細胞株または動物の細胞に由来し得る。
【０２０９】
内因性標的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼを修飾するようにＤＮＡ構築物をデザインすることができる。構築物のターゲティングのための相同配列は、得られる遺伝子産物の機能を破壊するようにデザインされた１つまたは複数の欠失、挿入、置換、またはその組み合わせを有し得る。１つの実施形態では、変化は、読み取り枠中で標的遺伝子の上流配列と融合した選択マーカー遺伝子の挿入であり得る。
【０２１０】
適切な選択マーカーには、ｔｋ遺伝子（チミジンキナーゼ）などの一定の培地基質で成長する能力を付与する遺伝子またはＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）で成長する能力を付与するｈｐｒｔ遺伝子（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）；ＭＡＸ培地（ミコフェノール酸）で成長させる細菌ｇｐｔ遺伝子（グアニン／キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｓｏｎｇ，Ｋ−Ｙ．らＰｒｏｃ．Ｎｅｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：６８２０−６８２４（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），Ｃｈａｐｔｅｒ １６を参照のこと。選択マーカーの他の例には、抗生物質などの化合物に体する耐性を付与する遺伝子、選択された基質で成長する能力を付与する遺伝子、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）などの発光物質などの検出可能なシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。広範な種々のこのようなマーカーが公知且つ利用可能であり、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．，およびＰ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））；およびハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：６８９５−６９１１（１９８３），およびＴｅ Ｒｉｅｌｅ，Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：６４９−６５１（１９９０））などの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。他の選択マーカー遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、およびその誘導体が含まれる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、フォスフィノスリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに耐性を付与する複数の選択マーカーを利用可能である。
【０２１１】
抗生物質耐性遺伝子およびネガティブ選択因子の組み込み方法は、当業者に熟知されている（例えば、ＷＯ ９９／１５６５０；米国特許第６，０８０，５７６号；米国特許第６．１３６，５６６号；Ｎｉｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：３４３−３４９（１９９３）；およびＹｏｓｈｉｄａら，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４：２７７−２８７（１９９５）を参照のこと）。
【０２１２】
本発明で有用なさらなる選択マーカー遺伝子は、例えば、以下の米国特許に記載されている：６，３１９，６６９；６，３１６，１８１；６，３０３，３７３；６，２９１，１７７；６，２８４，５１９；６，２８４，４９６；６，２８０，９３４；６，２７４，３５４；６，２７０，９５８；６，２６８，２０１；６，２６５，５４８；６，２６１，７６０；６，２５５，５５８；６，２５５，０７１；６，２５１，６７７；６，２５１，６０２；６，２５１，５８２；６，２５１，３８４；６，２４８，５５８；６，２４８，５５０；６，２４８，５４３；６，２３２，１０７；６，２２８，６３９；６，２２５，０８２；６，２２１，６１２；６，２１８，１８５；６，２１４，５６７；６，２１４，５６３；６，２１０，９２２；６，２１０，９１０；６，２０３，９８６；６，１９７，９２８；６，１８０，３４３；６，１７２，１８８；６，１５３，４０９；６，１５０，１７６；６，１４６，８２６；６，１４０，１３２；６，１３６，５３９；６，１３６，５３８；６，１３３，４２９；６，１３０，３１３；６，１２４，１２８；６，１１０，７１１；６，０９６，８６５；６，０９６，７１７；６，０９３，８０８；６，０９０，９１９；６，０８３，６９０；６，０７７，７０７；６，０６６，４７６；６，０６０，２４７；６，０５４，３２１；６，０３７，１３３；６，０２７，８８１；６，０２５，１９２；６，０２０，１９２；６，０１３，４４７；６，００１，５５７；５，９９４，０７７；５，９９４，０７１；５，９９３，７７８；５，９８９，８０８；５，９８５，５７７；５，９６８，７７３；５，９６８，７３８；５，９５８，７１３；５，９５２，２３６；５，９４８，８８９；５，９４８，６８１；５，９４２，３８７；５，９３２，４３５；５，９２２，５７６；５，９１９，４４５；および５，９１４，２３３。
【０２１３】
選択マーカーの組み合わせも使用することができる。例えば、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼをターゲティングするために、ｎｅｏ遺伝子（上記で考察のようにそれ自体のプロモーターを含むか含まない）を、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子に相同なＤＮＡ配列にクローン化することができる。マーカーの組み合わせを使用するために、ターゲティングＤＮＡの外側に存在するようにＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をクローン化することができる（所望ならば、別の選択マーカーを反対側に位置づけることができる）。ターゲティングされるべき細胞へのＤＮＡ構築物の移入後、適切な抗生物質に対して細胞を選択することができる。この特定の例では、Ｇ４１８およびガンシクロビルに耐性を示す細胞は、ｎｅｏ遺伝子がＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子に組換えられているが、二重重複領域の外側に存在することによりｔｋ遺伝子が失われている相同組換えによって惹起されている可能性が最も高い。
【０２１４】
欠失は、少なくとも約５０ｂｐ、より通常には少なくとも約１００ｂｐ、一般に、せいぜい約２０ｋｂｐであり得るが、欠失は、通常、少なくとも１つまたは複数のエクソンの一部を含むコード領域の一部、１つまたは複数のイントロンの一部を含むことができ、隣接非コード領域（特に、５’非コード領域（転写調節領域））の一部を含んでいても含んでいなくても良い。したがって、相同領域は、コード領域を超えて５’非コード領域または３’非コード領域に及び得る。挿入は、一般に１０ｋｂｐを超えず、通常５ｋｂｐを超えず、一般に少なくとも５０ｂｐ、より通常には少なくとも２００ｂｐであり得る。
【０２１５】
相同領域には、フレームシフトが起こる場合または鍵となるアミノ酸が変化した場合に標的遺伝子をさらに不活化することができるか、機能障害対立遺伝子などを修正することができる変異が含まれ得る。通常、変異は、約５％を超えない相同隣接配列のわずかな変化であり得る。
【０２１６】
当該分野で公知の方法にしたがって構築物を調製することができ、種々のフラグメントを１つにし、適切なベクターに移入し、クローン化し、分析し、その後所望の構築物を達成するまでさらに操作することができる（例えば、図５〜１１を参照のこと）。制限分析、切り出し、プローブの同定を行うために配列に種々の修飾を行うことができる。所望ならばサイレント変異を移入することができる。種々の段階で、制限分析、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応を使用した増幅、プライマー修復、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発などを使用することができる。
【０２１７】
原核生物複製系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉによって認識可能な供給源）を含む細菌ベクターを使用して構築物を調製することができ、各段階で、構築物をクローン化および分析することができる。標的細胞への移入前に除去することができるマーカー（挿入のために使用されるマーカーと同一または異なる）を使用することができる。一旦構築物を含むベクターが完成すると、細菌配列の欠失、線状化、相同配列への短い欠失の移入などによってさらに操作することができる。最終的操作後、構築物を細胞に移入することができる。
【０２１８】
ＤＮＡ構築物を宿主細胞に侵入させるために使用することができる技術には、リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈、核へのＤＮＡの微量注入、エレクトロポレーション、インタクトな細胞との細菌プロトプラストの融合、トランスフェクション、または当業者に公知の任意の他の技術が含まれる。ＤＮＡは、一本鎖もしくは二本鎖、線状もしくは環状、弛緩もしくはスーパーコイル状のＤＮＡであり得る。哺乳動物細胞の種々のトランスフェクション技術については、例えば、Ｋｅｏｗｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８５，ｐｐ．５２７−５３７（１９９０）を参照のこと。
【０２１９】
本発明は、さらに、上記で広範に記載されている１つまたは複数の配列を含む組換え構築物を含む（例えば、表９〜１２）。構築物は、本発明の配列が正方向または逆方向で挿入されたプラスミドベクターまたはウイルスベクターなどのベクターを含む。構築物は、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターが含まれる）も含み得る。多数の適切なベクターおよびプロモーターは当業者に公知であり、市販されている。例として以下のベクターを提供する：ｐＢｓ、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨｌ８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳｖ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰｖ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍｉａｃｉａ）。また、宿主中で複製可能且つ生存可能な限り、任意の他のプラスミドおよびベクターを使用することができる。当該分野で公知且つ市販されているベクター（およびその変異型または誘導体）を、本発明の方法で使用するために本発明にしたがって１つまたは複数の組換え部位を含むように操作することができる。このようなベクターを、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、およびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓから入手することができる。目的の他のベクターには、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、およびｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、およびｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨＩ １０、およびｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、およびｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）、およびｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ Ａ、Ｂ、およびＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、およびｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏｒｐ．）、ならびにその変異型または誘導体などの真核生物発現ベクターが含まれる。
【０２２０】
本発明での使用に適切な他のベクターには、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファージミド、ＹＡＣ’ｓ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ’ｓ（細菌人工染色体）、ＰＩ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉファージ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（ｑｕａｇａｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０、およびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにその変異型または誘導体が含まれる。レンチウイルスベクター（例えば、ＷＯ ０３／０５９９２３；ＴｉｓｃｏｒｎｉａらＰＮＡＳ１００：１８４４−１８４８（２００３）を参照のこと）などのウイルスベクターを使用することもできる。
【０２２１】
さらなる目的のベクターには、ｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＬＥＸ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＳｅｃＴａｇ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡ０８１５、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺＡ、ｐＰＩＣＺＢ、ｐＰＩＣＺＣ、ｐＧＡＰＺＡ、ｐＧＡＰＺＢ、ｐＧＡＰＺＣ、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ｐＳｉｎＨｉｓ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＶｇＲＸＲ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＹＥＳ２、ｐＺＥｒＯ１．１、ｐＺＥｒＯ−２．１、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＳｅ、ＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ｐＲＥＰ８、ｐＲＥＰ９、ｐＲＥＰ １０、ｐＣＥＰ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＣＲ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ、およびｐＣＲＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；λＥｘＣｅｌｌ、λｇｔｌｌ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−１λＴ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐＳＬ１１８０、ｐＮＥＯ、およびｐＵＣ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＳＣＲＥＥＮ−１ｂ（＋）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、ｐＣＩＴＥ−４ａｂｃ（＋）、ｐＯＣＵＳ−２、ｐＴＡｇ、ｐＥＴ−３２ＬＩＣ、ｐＥＴ−３０ＬＩＣ、ｐＢＡＣ−２ｃｐ ＬＩＣ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、λＳＣＲＥＥＮ−１、λＢｌｕｅＳＴＡＲ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−７ａｂｃ、ｐＥＴ９ａｂｃｄ、ｐＥＴｌｌａｂｃｄ、ｐＥＴ１２ａｂｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７ｂ−ｐＥＴ−１７ｘｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ− ３２ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＢＡＣ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ−１、ｐＢＡＣ４ｘ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ−１、ｐＢＡＣ−３ｃｐ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ、ｐＢＡＣｓｕｒｆ−１、ｐｌｇ、Ｓｉｇｎａｌｐｌｇ、ｐＹＸ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ−Ｎｅｏ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ−Ｈｙｇ、およびＳｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ−Ｇｐｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）；ｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＧＢＴ９、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤ ＧＬ、ｐＧＡＤ ＧＨ、ｐＧＡＤ１０、ｐＧｉｌｄａ、ｐＥＺＭ３、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−Ｎ、ｐＥＧＦＰ−Ｃ、ｐＥＢＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧＦＰ、ｐ６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒａｌ、ｐＳＥＡＰ２−プロモーター、ｐＳＥＡＰ２−エンハンサー、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐβｇａｌ−プロモーター、ｐβｇａｌ−エンハンサー、ｐＣＭＶ、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、ｐＴＫ−Ｈｙｇ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳｉ１ｈｙｇ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＣＡＴ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＬＵＣ、ｐＰＵＲ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＹＥＸ４Ｔ−１／２／３、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＡｃＵＷ３１、ＢａｃＰＡＫ６、ｐＴｒｉｐｌＥｘ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、ｐＷＥ１５、およびλＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ ＋／−、ｐＢｌｕｃｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ ＋／−、ｐＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＢＤ−ＧＡＬ４ Ｃａｍ、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔ、Ｌａｍｂｄａ ＦＩＸ ＩＩ、Ｌａｍｂｄａ ＤＡＳＨ、Ｌａｍｂｄａ ＥＭＢＬ３、Ｌａｍｂｄａ ＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣｏｓ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｇｔ Ａｍｐ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｄｉｒｅｃｔ ｐＢＳ ＋／−、ｐＢＣ ＫＳ ＋／−、ｐＢＣ ５Ｋ ＋／−、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＣＡＬ−ｎ、ｐＣＡＬ−ｃ、ｐＣＡＬ−ｋｃ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−１１ａｂｃｄ、ｐＳＰＵＴＫ、ｐＥＳＰ−Ｉ、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ、ｐＯＰＩ３ ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、ｐＭＣ１ｎｅｏ Ｐｏｌｙ Ａ、ｐＯＧ４４、ｐＯＧ４５、ｐＦＲＴβＧＡＬ、ｐＮＥＯβＧＡＬ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、およびｐＲＳ４１６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が含まれる。
【０２２２】
さらなるベクターには、例えば、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤＩ−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＯＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ．、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳＴｒｐ、およびその変異型または誘導体が含まれる。
【０２２３】
また、宿主中で複製可能且つ生存可能である限り、当該分野で公知の任意の他のプラスミドおよびベクターを使用することができる。
【０２２４】
（相同組換えされた細胞の選択）
次いで、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の発現をノックアウトするために相同組換えを行った細胞を、適切に組み込まれた細胞を同定するために適切に選択された培地中で成長させることができる。次いで、所望の表現型を示す細胞を、制限分析、エレクトロポレーション、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応、または当該分野で公知の別の技術によってさらに分析することができる。標的遺伝子部位で適切な挿入を示すフラグメントの同定によって、標的遺伝子を不活化するか修飾するために相同組換えを行った細胞を同定することができる。
【０２２５】
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子に挿入した選択マーカー遺伝子の存在により、宿主ゲノムへの標的構築物の組み込みが確立される。次いで、所望の表現型を示す細胞を、制限分析、エレクトロポレーション、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応、モノクローナル抗体アッセイ、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）、または相同または非相同組換えが起こるかどうかを確立するためにＤＮＡを分析するための当該分野で公知の任意の他の技術もしくは方法によってさらに分析することができる。挿入のためのプローブの使用およびその後の構築物の隣接領域を超えて及ぶＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の存在のためのインサートに隣接する５’領域および３’領域の配列決定または欠失が組み込まれている場合の欠失の存在の同定によってこれを決定することができる。構築物内の配列に相補的であり、且つ構築物の外側および標的対立遺伝子の配列と相補的であるプライマーを使用することもできる。この方法では、相同組換えが起こった場合に相補鎖中に存在する両プライマーを有するＤＮＡ二重鎖のみを得ることができる。プライマー配列または予想されるサイズの配列の存在の証明によって、相同組換えの発生が支持される。
【０２２６】
相同組換え事象のスクリーニングのために使用されるポリメラーゼ連鎖反応は、例えば、ＫｉｍおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８８８７−８９０３，１９８８；およびＪｏｙｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６，１９８９に記載されている。
【０２２７】
相同組換え事象の別のスクリーニング方法には、例えば、Ｍａｌｙｋｈら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８０，４８−５８（２００１），Ｍａｌｙｋｈら，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１５，８８５−８９３（１９９８）に記載のブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼおよび／またはＮｅｕ５Ｇｃに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用が含まれる。
【０２２８】
相同組換え事象による機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ発現を欠くブタ細胞のさらなる特徴づけには、サザン分析、ノーザンブロット分析、特異的レクチン結合アッセイ、および／または配列分析、例えば、Ｙ．Ｍａｌｙｋｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３７０：６０１−６０７（２００３）；Ｙ．ＭａｌｙｋｈらＥｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８０：４８−５８（２００１）；Ｙ．ＭａｌｙｋｈらＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１５：８８５−８９３（１９９８）に記載の抗Ｎｅｕ５Ｇｃまたは抗ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ抗体アッセイの使用が含まれるが、これらに限定されない。一般に、Ａ．ＳｈａｒｍａらＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７５（４）：４３０−４３６（２００３）を参照のこと。
【０２２９】
第１ラウンドのターゲティングから得た細胞株は、ターゲティングされた対立遺伝子とヘテロ接合性である可能性がある。両対立遺伝子が修飾されたホモ接合性を多数の方法で達成することができる。１つのアプローチは、１つのコピーが修飾された多数の細胞を成長させ、その後これらの細胞を異なる選択マーカーを使用して残存するブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ対立遺伝子の別ラウンドのターゲティングに供することである。あるいは、伝統的なメンデルの遺伝的特徴にしたがった修飾対立遺伝子に対してヘテロ接合性の動物の交配によってホモ接合体を得ることができる。いくつかの状況では、２つの異なる修飾対立遺伝子を有することが望ましい。連続ラウンドの遺伝子ターゲティングまたはヘテロ接合体（それぞれ１つの所望の修飾対立遺伝子を保有する）の交配によってこれを行うことができる。
【０２３０】
（ＶＩＩＩ．異種移植の免疫学的障壁を克服するためのさらなる遺伝子の遺伝子操作）
本発明の１つの態様では、非機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子に対してホモ接合性の細胞を、さらなる遺伝子操作に供することができる。例えば、宿主に異なる遺伝子の能力を置換、交換、または提供するために、内因性ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ対立遺伝子が非機能的になっているホモ接合性宿主にさらなる遺伝子の能力を移入することができる。同系遺伝子接合体化（ｈｏｍｏｇｅｎｏｔｉｚａｔｉｏｎ）後にマーカー遺伝子を除去することができる。場合によって拡大された配列を有し、元の構築物のマーカー遺伝子部分が欠失された実質的に相同なＤＮＡを含む構築物の移入により、標的対立遺伝子との相同組換えを得ることができる。組み込みのためのマーカー遺伝子の組み合わせの使用により、ポジティブ選択および他のネガティブ選択を行い、除去工程でマーカー遺伝子が保持された細胞を選択することができる。
【０２３１】
１つの実施形態では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子およびα（１，３）ＧＴ遺伝子を欠くブタ細胞を提供する。本発明にしたがって機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼを欠く動物を産生し、その後この動物由来の細胞を使用してα（１，３）ＧＴ遺伝子をノックアウトすることができる。ホモ接合性α（１，３）ＧＴネガティブブタが最近報告されている（Ｐｈｅｌｐｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３；ＷＯ ０４／０２８２４３）。あるいは、これらのα（１，３）ＧＴノックアウト動物由来の細胞を使用して、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化するようにさらに修飾することができる。
【０２３２】
別の実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠き、且つヒト補体阻害タンパク質を産生するブタ細胞も提供する。本発明にしたがって機能的ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く動物を産生し、この動物由来の細胞をヒト補体阻害タンパク質（ＣＤ５９（Ｐｈｉｌｂｒｉｃｋ，Ｗ．Ｍ．ら（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：８７−９２で報告されたｃＤＮＡ）、ヒト崩壊促進因子（ｈｕｍａｎ ｄｅｃａｙ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（ＤＡＦ）（Ｍｅｄｏｆら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２００７で報告されたｃＤＮＡ）、およびヒト膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）（Ｌｕｂｌｉｎ，Ｄ．ら（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１８１−１９４で報告されたｃＤＮＡ）などであるが、これらに限定されない）を発現するようにさらに修飾することができる。
【０２３３】
別の実施形態では、ヒト補体阻害タンパク質を産生するトランスジェニックブタ由来の細胞を使用して、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化するようにさらに修飾することができる。ヒト補体阻害タンパク質を産生するトランスジェニックブタは当該分野で公知である（例えば、米国特許第６，１６６，２８８号を参照のこと）。
【０２３４】
さらなる実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子およびブタＦｏｒｓｓｍａｎシンターゼ（ＦＳＭ）遺伝子を欠くブタ細胞を提供する。本発明にしたがって機能的ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く動物を産生し、その後この動物由来の細胞を、ｇａｌ−α−ｇａｌエピトープの産生に関与し、且つ異種移植拒絶で役割を果たすブタＦＳＭシンターゼ遺伝子をノックアウトするためにさらに修飾することができる。ブタＦＳＭシンターゼ遺伝子は最近同定された（米国特許出願６０／５６８，９２２号を参照のこと）。あるいは、これらのＦＳＭシンターゼ遺伝子ノックアウト動物由来の細胞を使用して、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化するようにさらに修飾することができる。
【０２３５】
なおさらなる実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子およびブタイソグロボシド（ｉｓｏｇｌｏｂｏｓｉｄｅ）３シンターゼ遺伝子を欠くブタ細胞を提供する。本発明にしたがって機能的ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く動物を産生し、その後この動物由来の細胞を、ブタｉＧｂ３シンターゼ遺伝子をノックアウトするために使用することができる。ブタｉＧｂ３シンターゼ遺伝子は最近報告されている（米国特許出願第６０／５１７，５２４号）。あるいは、これらのブタｉＧｂ３シンターゼ遺伝子ノックアウト動物由来の細胞を使用して、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化するようにさらに修飾することができる。
【０２３６】
別の実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子、α（１，３）ＧＴ遺伝子、ＦＳＭシンターゼ遺伝子、およびブタｉＧｂ３シンターゼ遺伝子を欠くブタ細胞を提供する。本発明にしたがって機能的ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く動物を産生し、その後この動物由来の細胞を、α（１，３）ＧＴ遺伝子、ＦＳＭシンターゼ遺伝子、およびブタｉＧｂ３シンターゼ遺伝子をノックアウトするために使用することができる。ホモ接合性α（１，３）ＧＴネガティブブタは最近報告されている（Ｐｈｅｌｐｓらｓｕｐｒａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３；ＷＯ ０４／０２８２４３）。あるいは、これらのα（１，３）ＧＴノックアウト動物由来の細胞を使用して、ブタｉＧｂ３シンターゼ遺伝子、ブタＦＳＭシンターゼ遺伝子、およびＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化し、さらに、ヒト補チア阻害タンパク質（ＣＤ５９、ヒト崩壊促進因子（ＤＡＦ）、およびヒト膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）などが含まれるが、これらに限定されない）を発現するようにさらに修飾することができる。
【０２３７】
（ＶＩＩＩ．遺伝子操作動物の産生）
本発明は、ブタ全能性幹細胞の遺伝子操作によるＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ発現を欠くトランスジェニックブタの産生方法を提供する。１つの実施形態では、（ａ）動物中の１つまたは複数の標的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ核酸ゲノム配列の同定、（ｂ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ核酸ゲノム配列をターゲティングする１つまたは複数の相同組換えベクターの調製、（ｃ）動物の複数の全能性細胞のゲノムへの１つまたは複数のターゲティングベクターの挿入およびそれによる複数のトランスジェニック全能性細胞の産生、（ｄ）動物の四倍体胚盤胞を得ること、（ｅ）四倍体胚盤胞への複数の全能性細胞の挿入およびそれによるトランスジェニック胚の産生、（ｆ）レシピエント雌動物への胚の導入、および（ｇ）雌動物中で胚を成長させて出産させることによって動物を産生することができる。トランスジェニックブタを作製するための本明細書中に記載のトランスジェニック動物の産生方法は、一般に、米国特許第６，４９２，５７５号に記載されている。
【０２３８】
別の実施形態では、全能性細胞は、胚幹（ＥＳ）細胞であり得る。胚盤胞からのＥＳ細胞の単離、ＥＳ細胞株の確立、およびその後のその培養を、例えば、Ｄｏｅｔｃｈｍａｎｎら，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．８７：２７−４５（１９８５）；Ｌｉら，Ｃｅｌｌ ６９：９１５−９２６（１９９２）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．“Ｔｅｔｒａｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８７）；ＷｕｒｓｔおよびＪｏｙｎｅｒ，”Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９３）；Ｈｏｇｅｎら，“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”Ｈｏｇａｎ，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＣｏｓｔａｎｔｉｎｉおよびＬａｃｙ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）；およびＷａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：７４１−７４４（１９９２）に記載の従来の方法によって行う。例えば、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を変化させるためのターゲティングベクターでの胚幹細胞の形質転換後、細胞を適切な培地（例えば、ウシ胎児血清増強ＤＭＥＭなど）中の支持細胞層にプレートすることができる。構築物を含む細胞を、選択培地の使用によって検出することができ、十分なコロニー成長期間後、コロニーを選別し、相同組換えの発生について分析することができる。構築物の配列内および配列外であるが標的対立遺伝子に存在するプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応を使用することができる。次いで、相同組換えを示すコロニーを、胚操作および胚盤胞注射のために使用することができる。胚盤胞を、過剰排卵雌から得ることができる。次いで、胚幹細胞をトリプシン処理し、修飾細胞を胚盤胞を含む液滴に添加することができる。少なくとも１つの修飾胚幹細胞を、胚盤胞の胞胚腔に注射することができる。注射後、少なくとも１つの胚盤胞を、偽妊娠雌の各子宮角に戻すことができる。次いで、雌を出産させ、得られた同腹子を構築物を含む変異細胞についてスクリーニングした。形質転換ＥＳ細胞と異なる比率の胚盤胞を選択する。胚盤胞およびＥＳ細胞の異なる表現型の提供により、キメラ子孫を容易に検出することができ、次いで、修飾ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の存在を探索するために遺伝子型同定を行うことができる。
【０２３９】
本発明のさらなる実施形態では、全能性細胞は、胚生殖（ＥＧ）細胞であり得る。胚生殖細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養およびトランスフェクトすることができ、その後にキメラの体細胞系列および生殖細胞系列に寄与する、ＥＳ細胞と機能的に等価な未分化の細胞である（Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６１：６２６−６２８（１９９４））。ＥＧ細胞は、成長因子（白血病抑制因子、スチール因子（ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ）、塩基性線維芽細胞成長因子）と組み合わせた始原生殖細胞（配偶子の先祖）の培養によって誘導される（Ｍａｔｓｕｉら，Ｃｅｌｌ ７０：８４１−８４７（１９９２）；Ｒｅｓｎｉｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：５５０−５５１（１９９２））。Ｄｏｎｏｖａｎら，“Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ，”Ｌ．Ｍ．Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ編，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９７）などに記載の当業者に公知の方法を使用して、ＥＧ細胞を培養することができる。
【０２４０】
例えば、Ｊａｍｅｓら，Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．Ｃａｍｂ．６０：１８５−１９４（１９９２）；ＮａｇｙおよびＲｏｓｓａｎｔ，“Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９３）；またはＫｕｂｉａｋおよびＴａｒｋｏｗｓｋｉ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５７：５６１−５６６（１９８５）に記載の天然の接合子の産生および発生または２つの細胞胚の電気融合およびその後の培養によって本発明で使用するための四倍体胚盤胞を得ることができる。
【０２４１】
例えば、Ｗａｎｇら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２４３７−２４５０（１９９１）に記載の当該分野で公知の任意の方法によって、胚盤胞へのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の移入を行うことができる。
【０２４２】
「複数」の全能性細胞は、１つを超える任意の数の細胞を含み得る。例えば、本発明で使用される全能性細胞数は、約２〜約３０細胞、約５〜約２０細胞、または約５〜約１０細胞であり得る。１つの実施形態では、１つの細胞懸濁液から採取した約５〜１０個のＥＳ細胞を、顕微操作装置中の保持ピペットによって固定された胚盤胞に注射する。次いで、当該分野で公知の方法（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．“Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８７）を参照のこと）によって、胚を少なくとも３時間（場合により一晩）インキュベート後、雌レシピエント動物に移入する。次いで、雌動物中で胚を成長させて出産させることができる。
【０２４３】
（クローン化トランスジェニック子孫を産生するための体細胞核導入）
本発明は、体細胞核導入による機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠くブタのクローニング方法を提供する。一般に、広範な種々の哺乳動物クローニング方法が現在急速に開発および報告されており、所望の結果を達成する任意の方法を本発明で使用することができる。このような方法の非限定的な例を以下に記載する。例えば、ドナー核の供給源として使用すべき所望の分化ブタ細胞を得る工程と、ブタから卵母細胞を得る工程と、卵母細胞を除核する工程と、除核卵母細胞に所望の分化細胞または細胞核を導入する工程と（例えば、ＮＴ単位を形成するための融合または注射による）、得られたＮＴ単位を活性化する工程と、ＮＴ単位が胎児に成長するように宿主ブタに培養したＮＴ単位を導入する工程とを含む核導入プロセスによってブタを産生することができる。
【０２４４】
核導入技術または核移植技術は当該分野で公知である（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４３：１８１（１９９５）；Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）；Ｋｅｅｆｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）；Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：６１４３−６１４７（１９９３）；ＷＯ ９４／２６８８４；ＷＯ ９４／２４２７４，ＷＯ ９０／０３４３２，米国特許第４，９４４，３８４号および同第５，０５７，４２０号）。１つの非限定的な例では、除核卵母細胞への挿入前にドナー染色体またはドナー細胞が再プログラミングされた哺乳動物のクローニング方法を記載したＣｏｌｌａｓらの米国特許出願番号２００３／００４６７２２号などに記載の方法などの方法を提供する。本発明は、染色体、核、または細胞の卵母細胞の挿入または融合方法も記載する。
【０２４５】
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を変化させるように修飾したドナー細胞核を、レシピエントブタ卵母細胞に導入する。この方法の使用は、特定のドナー細胞型に制限されない。ドナー細胞は、Ｗｉｌｍｕｔら，Ｎａｔｕｒｅ ３８５ ８１０（１９９７）；Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ ３８０ ６４−６６（１９９６）；またはＣｉｂｅｌｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０ １２５６−１２５８（１９９８）などに記載のものであり得る。正常な核型の全細胞（核導入で首尾よく使用することができる胚細胞、胎児および成体の体細胞が含まれる）を、原理上は使用することができる。胎児線維芽細胞は、特に有用なドナー細胞クラスである。一般に適切な核導入方法は、Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ４３ １８１（１９９５），Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３８ ２６４−２６７（１９９４），Ｋｅｅｆｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５０ ９３５−９３９（１９９４），Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６１４３−６１４７（１９９３），ＷＯ−Ａ−９４２６８８４，ＷＯ−Ａ−９４２４２７４，ＷＯ−Ａ−９８０７８４１，ＷＯ−Ａ−９００３４３２，米国特許第４，９９４，３８４号および同第５，０５７，４２０号に記載されている。分化または少なくとも部分的に分化したドナー細胞も使用することができる。ドナー細胞は培養中および静止期でもあり得るが、必ずしもそうではない。休止期の核ドナー細胞は、静止期に入るように誘導されるかｉｎ ｖｉｖｏで休止状態で存在し得る細胞である。先行技術の方法は、クローニング手順で胚細胞型も使用している（Ｃａｍｐｂｅｌｌら（Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８，１９９６）およびＳｔｉｃｅら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２０ ５４：１００−１１０，１９９６）。
【０２４６】
体細胞核ドナー細胞を、種々の異なる臓器および組織（皮膚、間葉、肺、膵臓、心臓、腸、胃、膀胱、血管、腎臓、尿道、生殖器、および胚、胎児、または成体動物の全部または一部の脱凝集調製物）から得ることができる。本発明の適切な実施形態では、核ドナー細胞は、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴ）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋細胞、グラヌロース細胞、卵丘細胞、上皮細胞、または内皮細胞からなる群から選択される。別の実施形態では、核細胞は、胚幹細胞である。好ましい実施形態では、ドナー細胞として線維芽細胞を使用することができる。
【０２４７】
本発明の別の実施形態では、本発明の核ドナー細胞は、動物の生殖細胞である。胚、胎児、または成体期の動物種の任意の生殖細胞を、核ドナー細胞として使用することができる。適切な実施形態では、核ドナー細胞は胚生殖細胞である。
【０２４８】
受容細胞との連携を確実にするために、細胞周期の任意の時期（ＧＯ、ＧＩ、Ｇ２、Ｓ、Ｍ）で核ドナー細胞を停止することができる。当該分野で公知の任意の方法を使用して、細胞周期を操作することができる。細胞周期を制御する方法には、培養細胞の接触阻害によって誘導されたＧＯ期静止、血清または他の必須栄養素の除去によって誘導されたＧＯ期静止、老化によって誘導されたＧＯ期静止、特定の成長因子の添加によって誘導されたＧＯ期静止、熱ショック、高圧、もしくは化学物質、ホルモン、成長因子、もしくは他の物質での他の処理などの物理的もしくは化学的手段によって誘導されたＧＯもしくはＧＩ期静止；任意の複製点手順で妨害する化学物質での処理によるＳ期の制御；蛍光標示式細胞分取、有糸分裂の除去、微小管破壊剤、有糸分裂の進行を破壊する任意の化学物質での処理を使用した選択によるＭ期の制御が含まれるが、これらに限定されない（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ，．“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）も参照のこと）。
【０２４９】
卵母細胞の単離方法は当該分野で周知である。本質的に、これは、ブタの卵巣または生殖器官からの卵母細胞の単離を含み得る。ブタ卵母細胞の容易に利用可能な供給源は、食肉処理場の材料である。遺伝子工学、核導入、およびクローニングなどの技術の組み合わせのために、卵母細胞は遺伝学的に成熟していなければならず、その後にこれらの細胞を核導入のためのレシピエント細胞として使用することができ、これらの細胞を精子細胞による受精によって胚に発生することができる。このプロセスは、一般に、哺乳動物の卵巣（例えば、食肉処理場で得たウシ卵巣）からの未熟な（第Ｉ減数分裂前期（ｐｒｏｐｈａｓｅ Ｉ））卵母細胞の回収、卵母細胞が第ＩＩ減数分裂中期に達するまで（この場合、ウシ卵母細胞は一般に吸引後１８〜２４時間で起こる）の受精または除核前の成熟培地での卵母細胞の成熟を必要とする。この期間は、「成熟期」として公知である。
【０２５０】
第ＩＩ減数分裂中期の卵母細胞は、レシピエント卵母細胞であり得るが、この段階で卵母細胞は移入された核をそのままで受精精子で処理するために「活性化する」ことができるか、十分に活性化することができると考えられる。ｉｎ ｖｉｖｏで成熟した第ＩＩ減数分裂中期の卵母細胞は、核導入技術で首尾よく使用されている。本質的に第ＩＩ減数分裂中期の卵母細胞を、発情期またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）もしくは類似のホルモンの注射から３５〜４８時間後または３９〜４１時間後に非過剰排卵または過剰排卵ブタのいずれかから外科的に回収することができる。
【０２５１】
約１０〜４０時間、好ましくは約１６〜１８時間の範囲の定期成熟後、卵母細胞を除核することができる。除核前に卵母細胞を除去し、卵丘細胞の除去前に適切な培地（１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含むＨＥＣＭなど）に入れることができる。次いで、裸の卵母細胞を極体についてスクリーニングし、次いで、極体の存在によって決定した選択された第ＩＩ減数分裂中期の卵母細胞を核導入に使用する。除核を以下に示す。
【０２５２】
米国特許第４，９９４，３８４号などに記載の公知の方法によって除核を行うことができる。例えば、第ＩＩ減数分裂中期の卵母細胞を、即時除核のために任意選択的に７．５ｍｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含むＨＥＣＭに入れるか、適切な培地（例えば、ＣＲ１ａａ＋１０％発情期ウシ精子などの胚培養培地）に入れ、その後、好ましくはせいぜい２４時間後、より好ましくは１６〜１８時間後に除核することができる。
【０２５３】
極体および隣接細胞質を除去するために、マイクロピペットを使用した顕微鏡手術で除核することができる。次いで、首尾よく除核された卵母細胞を同定するために、卵母細胞をスクリーニングすることができる。卵母細胞の１つのスクリーニング方法は、卵母細胞を１ｍｇ／ｍｌの３３３４２Ｈｏｅｃｈｓｔ色素を含むＨＥＣＭで染色し、その後に１０秒未満の紫外線照射下で卵母細胞を視覚化することである。次いで、首尾よく除核された卵母細胞を、適切な培養培地（ＣＲ１ａａ＋１０％精子）に入れることができる。
【０２５４】
次いで、除核卵母細胞と同種の１つの哺乳動物細胞を、ＮＴ単位を産生するために使用される除核卵母細胞の卵黄周囲腔に導入することができる。当該分野で公知の方法にしたがって、哺乳動物の細胞および除核卵母細胞を使用してＮＴ単位を産生することができる。例えば、エレクトロポレーションによって細胞を融合することができる。原形質膜の一過性破壊に十分な電気パルスの印加によって電気融合を行う。膜が急速に再形成されるので、原形質膜のこの破壊は非常に短時間である。したがって、２つの隣接する膜の破壊が誘導され、再形成時に脂質二重層が混合する場合、２つの細胞間に小さなチャネルを開けることができる。このような小さな開口部の熱力学的不安定性のために、２つの細胞が１つになるまで拡大する。例えば、Ｐｒａｔｈｅｒらの米国特許第４，９９７，３８４号を参照のこと。種々の電気融合培地（例えば、スクロース、マンニトール、ソルビトール、およびリン酸緩衝化溶液）を使用することができる。融合誘導因子としてＳｅｎｄａｉウイルスを使用して融合を行うこともできる（Ｇｒａｈａｍ，Ｗｉｓｔｅｒ Ｉｎｏｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｎｏｇｒ．，９，１９，１９６９）。また、エレクトロポレーション融合を使用するよりもむしろ核を卵母細胞に直接注射することができる。例えば、ＣｏｌｌａｓおよびＢａｒｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）を参照のこと。融合後、得られた融合ＮＴ単位を、活性化まで適切な培地（例えば、ＣＲ１ａａ培地）に入れる。典型的には、その後短時間で（例えば、２４時間後または約４〜９時間後）活性化を行うことができる。
【０２５５】
所望の結果が達成される任意の方法によってＮＴ単位を活性化することができる。このような方法には、例えば、本質的にＮＴ単位への冷温または実質的に冷温ショックの印加による生物学的温度未満でのＮＴ単位の培養が含まれる。胚が通常曝露される生理学的温度条件と比較して低温である室温でのＮＴ単位の培養によってこれを最も都合良く行うことができる。あるいは、公知の活性化剤の適用によって活性化することができる。例えば、受精時の精子による卵母細胞の貫通は、融合前の卵母細胞を活性化して、核導入後により多数の生存可能な認識および複数の遺伝的に同一のブタが得られることを示した。また、電気的および化学的ショックなどの処理を使用して、融合後にＮＴ胚を活性化することができる。例えば、Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈらの米国特許第５，４９６，７２０号を参照のこと。さらに、卵母細胞中の２価の陽イオンレベルの増加および卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化の減少によって同時または連続的に活性化を行うことができる。一般に、卵母細胞の細胞質への２価の陽イオン（例えば、イオノフォアの形態のマグネシウム、ストロンチウム、バリウム、またはカルシウム）の移入によってこれを行うことができる。２価の陽イオンレベルの他の増加方法には、電気ショック、エタノールでの処理、およびケージ化キレート剤での処理が含まれる。公知の方法（例えば、キナーゼインヒビター（例えば、６−ジメチル−アミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリン、およびスフィンゴシンなどのセリン−トレオニンキナーゼインヒビター）の添加）によってリン酸化を減少させることができる。あるいは、卵母細胞へのリン酸塩（例えば、リン酸塩２Ａおよびリン酸塩２Ｂ）の移入によって細胞タンパク質のリン酸化を阻害することができる。
【０２５６】
次いで、細胞コロニーの作製まで適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ培養培地で活性化ＮＴ単位を培養することができる。胚の培養および成熟に適切な培養培地は、当該分野で周知である。胚の培養および維持に使用することができる公知の培地の例には、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、組織培養培地−１９９（ＴＣＭ−１９９）＋１０％ウシ胎児血清、タイロード−アルブミン−乳酸−ピルビン酸（ＴＡＬＰ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｅａｇｌｅ培地、およびＷｈｉｔｔｅｎ培地が含まれる。
【０２５７】
その後、培養ＮＴ単位を洗浄し、好ましくは適切なコンフルエントの支持細胞層を含むウェルプレート中に含まれる適切な培地に入れることができる。適切な支持細胞層には、例として、線維芽細胞および上皮細胞が含まれる。ＮＴ単位がレシピエント雌への導入に適切なサイズに到達するまで、または細胞コロニーを産生するために使用することができる細胞を得るために、ＮＴ単位を支持細胞層上で培養する。好ましくは、少なくとも約２〜４００個の細胞、より好ましくは約４〜１２８個の細胞、最も好ましくは少なくとも約５０個の細胞までこれらのＮＴ単位を培養することができる。
【０２５８】
次いで、活性化ＮＴ単位を、雌ブタの卵管に導入することができる（胚移植）。１つの実施形態では、雌ブタは、発情期同調レシピエント未経産ブタ（ｇｉｌｔ）であり得る。交配未経産ブタ（ｌａｒｇｅ ｗｈｉｔｅ／Ｄｕｒｏｃ／Ｌａｎｄｒａｃｅ）（２８０〜４８０ｌｂｓ）を使用することができる。未経産ブタを、飼料と混合した１８〜２０ｍｇのＲｅｇｕＭａｔｅ（Ａｌｔｒｅｎｏｇｅｓｔ，Ｈｏｅｃｈｓｔ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ）の経口投与によってレシピエント動物と同調させることができる。Ｒｅｇｕ−Ｍａｔｅを、１４日間連続して与えることができる。次いで、最後のＲｅｇｕ−Ｍａｔｅ処置から約１５０時間後に１０００単位のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ，Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＤＥ）をｉ．ｍ．投与することができる。ｈＣＧ注射から約２２〜２６時間後に胚移植を行うことができる。１つの実施形態では、妊娠出産させて生きた子孫を誕生させることができる。別の実施形態では、早期に出産を終了させて、胚細胞を採取することができる。
【０２５９】
本発明における胚移植方法およびレシピエント動物の管理は、胚移植産業で使用される標準的な手順である。同期導入は、本発明の成功で重要である（すなわち、ＮＴ胚の時期をレシピエント雌の発情周期と同調させる）。例えば、Ｓｉｅｄｅｌ，Ｇ．Ｅ．，Ｊｒ．“Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｗｉｔｈ ｃａｔｔｌｅ”ｉｎ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（１９８１）Ｌ．Ｍａｓｔｒｏｉａｎｎｉ，Ｊｒ．およびＪ．Ｄ．Ｂｉｇｇｅｒｓ編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐａｇｅ ３２３を参照のこと。
【０２６０】
（ＶＩＩＩ．ブタ動物、臓器、組織、細胞、および細胞株）
本発明は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の両対立遺伝子が不活化された生きたブタを提供する。本発明はまた、異種移植に有用なこのようなブタ由来の臓器、組織、および細胞を提供する。
【０２６１】
１つの実施形態では、機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの任意の発現を欠くブタから得たブタ臓器、組織、および／または精製もしくは実質的に純粋な細胞もしくは細胞株を提供する。
【０２６２】
１つの実施形態では、本発明は、異種移植に有用な臓器を提供する。任意のブタ臓器（脳、心臓、肺、腺、脳、目、胃、脾臓、すい臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、鼻、口、唇、歯茎、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、幽門、甲状腺、胸腺、腎上体、骨、軟骨、腱、靭帯、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、副腎、卵巣、輸卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節、およびリンパ管が含まれるが、これらに限定されない）を使用することができる。
【０２６３】
別の実施形態では、本発明は、異種移植に有用な組織を提供する。任意のブタ組織（上皮組織、結合組織、血液組織、骨組織、軟骨組織、筋肉組織、神経組織、腺様組織、脂肪組織、疎性結合組織、骨組織、褐色脂肪組織、海綿状様骨組織、筋肉組織、軟骨細胞（ｃａｒｔａｇｉｎｏｕｓ）、海綿組織、軟骨様組織、クロム親和組織、肉様組織、弾性組織、上皮組織、脂肪組織、軟骨様組織、Ｇａｉｎｇｅｅ組織、膠様組織、肉芽組織、腸関連リンパ組織、ハーラー脈管組織、硬質（ｈａｒｄ）造血組織、未分化組織、間質細胞、被覆組織、島組織、リンパ組織、リンパ様組織、間葉組織、中腎性組織、粘液様結合細胞、多房性脂肪細胞、骨髄組織、軟組織鼻点、造腎細胞、結節組織、骨細胞、造骨組織、類骨組織、根尖周囲組織、細網組織、細毛組織、外科用ゴム敷布、骨格筋組織、平滑筋組織、および皮下組織）を使用することができる。
【０２６４】
さらなる実施形態では、本発明は、機能的α１，３ＧＴの発現を欠くブタ動物由来の細胞および細胞株を提供する。１つの実施形態では、これらの細胞または細胞株を異種移植のために使用することができる。任意のブタ組織または臓器由来の細胞（上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴ）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋細胞、リン酸細胞（□ｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｅｌｌ）、卵丘細胞、上皮細胞；内皮細胞、ランゲルハンス島細胞、膵臓インスリンを分泌する細胞、膵臓α−２細胞、膵臓β細胞、膵臓α−１細胞、血球、血液前駆細胞、骨細胞、骨前駆細胞、ニューロン幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、ケラチノサイト、臍帯静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、微小血管系内皮細胞、線維芽細胞、肝臓星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クップフェル細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球、白血球、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、有毛細胞、気泡細胞、腎細胞、網膜細胞、桿状体細胞、錐状体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、記憶細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、筋細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、腟上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、尿細管周囲細胞、セルトリ細胞、ルテイン細胞、頸部細胞、子宮内膜細胞、乳房細胞、濾胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、ドーパミン作動性細胞、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、胚幹細胞、線維芽細胞、および胎児線維芽細胞が含まれるが、これらに限定されない）を使用することができる。特定の実施形態では、機能的α−１，３−ＧＴ発現を欠くブタ由来の膵臓細胞（ランゲルハンス島細胞、インスリン分泌細胞、４８のα−２細胞、β細胞、α−１細胞が含まれる）を提供する。
【０２６５】
非生存誘導体には、これらの組織誘導体を移植で使用する前に架橋または他の化学的処理によってさらに処理することができる、酵素または化学的処理によって生存細胞を剥ぎ取られた組織が含まれる。好ましい実施形態では、誘導体には、種々の組織（皮膚、泌尿器組織、膀胱組織、または臓器粘膜下組織が含まれる）由来の細胞外基質が含まれる。また、医療機器として心臓弁および他の非生存組織を含むために生存組織を剥ぎ取られた腱、関節、および骨を提供する。
【０２６６】
（治療上の使用）
広範な種々の方法にしたがって宿主に細胞を投与することができる。好ましい投与様式は、非経口、腹腔内、静脈内、皮内、硬膜外、脊髄内、胸骨内、関節内、滑液内、くも膜下腔内、動脈内、心臓内、筋肉内、鼻腔内、皮下、眼窩内、嚢内、局所、経皮パッチ、座剤を含む直腸、膣、もしくは尿道投与、経皮、鼻噴霧、外科用インプラント、内部外科用塗布剤（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｐａｉｎｔ）、注入ポンプ、またはカテーテルである。１つの実施形態では、薬剤およびキャリアを、直接組織注射もしくはボーラス、インプラント、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、またはナノスフェアなどの持続放出処方物で投与する。
【０２６７】
開示の細胞の注入によって治療することができる障害には、正常な血球の産生および成熟の機能障害の不全に起因する疾患（すなわち、再生不良性貧血および低増殖性幹細胞障害）；造血臓器における新生物悪性疾患（例えば、白血病およびリンパ腫）；非造血臓器の広範な悪性固形腫瘍；自己免疫疾患；および遺伝病が含まれるが、これらに限定されない。このような障害には、正常な血球の産生および成熟の不全または機能障害に起因する疾患（超増殖性幹細胞障害）（薬物、照射、または感染による特発性の再生不良性貧血、汎血球減少症、顆粒球減少症、血小板減少症、赤血球欠如症、ブラックファン−ダイヤモンド症候群が含まれる）；造血性悪性腫瘍（急性リンパ芽球性（リンパ球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性悪性脊髄硬化症、多発性骨髄腫、真性多血症、原因不明の骨髄化生、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫が含まれる）；悪性固形腫瘍患者における免疫抑制（悪性黒色腫、胃癌、卵巣癌、乳癌、小細胞肺癌、網膜芽細胞種、睾丸癌、膠芽細胞腫、横紋筋肉腫、神経芽腫、ユーイング肉腫、リンホニア（ｌｙｍｐｈｏｎｉａ）が含まれる）；自己免疫疾患（関節リウマチ、１型糖尿病、慢性肝炎、多発性軟化症、全身性紅斑性狼瘡が含まれる）；遺伝性（先天性）障害（貧血（家族性、再生不良性）、ファンコーニ貧血、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損症、ホルムアミド転移酵素欠損症、レッシ−ナイハン症候群、先天性異常赤血球産生症症候群ＩＩＶ、シバッハマン−ダイヤモンド症候群、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損、ホリナミノ（ｆｏｒｉｎａｍｉｎｏ）転移酵素欠損症、レッシ−ナイハン症候群、先天性球状赤血球症、先天的性楕円赤血球症、先天性ストマトサイト増加症、先天性Ｒｈ陰性疾患、発作性夜間血色素尿症、Ｇ６ＰＤ（グルコースリン酸デヒドロゲナーゼ）変異型１、２、３、ピルビン酸キナーゼ欠損症、先天的性エリトロポイエチン感受性、欠損症、鎌状赤血球症および鎌状赤血球傾向、サラセミアα、β、γ、メトヘモグロビン血症、先天性免疫障害、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ベアリンパ球症候群、イオノフォア応答性複合型免役不全、キャップ形成異常を伴う複合型免疫不全、ヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症、顆粒球アクチン欠損症、乳児顆粒球減少症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、コストマン症候群、細網系異形成、先天性白血球機能障害症候群が含まれる）；その他（骨粗鬆症、脊髄硬化症、後天性溶血性貧血、後天性免疫不全、原発性または続発性免疫不全を発症する感染症、細菌感染（例えば、ブルセラ病、リステリア病、結核、ハンセン病）、寄生虫感染（例えば、マラリア、リーシュマニア症）、真菌感染、加齢によるリンパ系細胞組の不均衡（ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓｉｎ）および免疫機能障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｆｉｍｃｔｉｏｎｓ）を含む障害、貪食細胞障害、コストマン顆粒球減少症、慢性肉芽腫疾患、チェジアック−東症候群、好中球アクチン欠損症、好中球膜ＧＰ−１８０欠損症、代謝性貯蔵病、ムコ多糖沈着症、ムコリピドーシス、免疫機構に関与するその他の障害、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、αランチリプシン（ｌａｎｔｉｒｙｐｓｉｎ）欠損症など）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６８】
疾患または病変には、神経変性疾患、肝臓変性疾患病、腎臓変性疾患、脊髄損傷、頭部の外傷または手術、組織、臓器、または腺の変性を引き起こすウイルス感染などが含まれる。このような神経変性疾患には、ＡＩＤＳ痴呆；脱髄性疾患（多発性軟化症および急性トランスフェラーゼ脊髄炎など）；錐体外路および小脳障害（皮質脊髄系（ｅｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ ｓｙｓｔｅｍ）の損傷など）；大脳基底核障害または小脳障害；ハンティングトン舞踏病と老年舞踏病などの多動性障害；薬物油土迂生運動障害（ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬物によって誘導されるものなど）；低運動性障害（パーキンソン病など）；進行性過剰核形成（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａ−ｎｕｃｌｅｏ ｐａｌｓｙ）；小脳の構造損傷；脊髄小脳変性（脊髄性運動失調、フリートライヒ運動失調）、小脳皮質変性、多系統変性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ、およびＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）、全身性障害（ｓｙｓｔｅｒｍｉｏｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）（Ｒｕｆｓｕｍ疾患など）、βリポタンパク質欠損血症、失調症、毛細血管拡張；ミトコンドリア多システム障害；脱髄性コア障害（多発性軟化症、急性横断脊髄炎など）；運動単位障害（神経原性筋萎縮（前角細胞萎縮（筋萎縮性側索硬化症など）、幼児型脊髄性筋萎縮、および若年性脊髄性筋萎縮）など）；アルツハイマー病；中年のダウン症；びまん性レビー小体病；レビー小体型老人性痴呆；パーキンソン病、ヴェルニッケ−コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト・ヤコブ病；亜急性硬化性汎脳炎、ハレルホルデン−スパッツ疾患；ならびに拳闘家痴呆が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｅｒｋｏｗら（編）（１９８７），Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ（１５’）版），Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ．を参照のこと。
【０２６９】
（産業的飼育での使用）
本発明は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝位の一方または両方の対立遺伝子が不活化された飼育適用を目的とする生きたブタを提供する。ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの一方または両方の対立遺伝子の不活化により、人畜共通疾患、ブタにおける感染症（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ブタロタウイルス、およびブタ伝染性胃腸炎コロナウイルス）、ならびに宿主動物においてＮｅｕ５Ｇｃを使用する任意の他の人畜共通生物または腸管毒素原性生物に対するブタ動物の感受性を減少させることができる。疾患感受性の減少により、より多数の健康な動物の得る能力によって飼育操作がより経済的に実現し、腸管毒素原性生物に起因する動物の死亡が減少する。
【０２７０】
以下の実施例は例示目的で提供し、本発明を決して制限しない。
【実施例】
【０２７１】
（核酸の単離）
ＰＣＲベースの方法の組み合わせストラテジーを使用して、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を同定した。このようなＰＣＲ方は、当該分野で周知であり、例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８９；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ，およびＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０に記載されている。
【０２７２】
Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して、成体ブタ（グレートヨークシャー種）から総ＲＮＡを抽出した。ＤＮアーゼＩ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）での処理後、ポリＡ＋ＲＮＡを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ精製キット（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用して分離した。ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の５’末端または３’末端を同定するために、Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、５’または３’−ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な複製）手順を行った。転写物のエクソン−イントロン境界または５’もしくは３’隣接領域を同定するために、ＵｎｉｖｅｒｓａｌＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｅｒライブラリーキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ブタＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（登録商標）ライブラリーを構築した。ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡ５９０５８によって提供された部分的ｃＤＮＡ配列から、遺伝子特異的およびネスト化プライマー対をデザインした。
【０２７３】
（ｃＤＮＡおよびゲノムＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ配列の決定）
５’または３’ＲＡＣＥ分析：ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子構築物の５’末端および３’末端を同定するために、テンプレートとして成体ブタ脾臓から単離したポリＡ＋ＲＮＡと共にＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、５’および３’−ＲＡＣＥ手順を行った。２０ＵのＡＭＶ−ＲＴおよび１ｐｍｏｌの市販のｃＤＮＡ合成プライマーを使用して、４８℃で２時間のインキュベーションによって１μｇのポリＡ＋ＲＮＡから第１の鎖ｃＤＮＡを合成した。第２の鎖ｃＤＮＡ合成は、ＲＮアーゼＨ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＥ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼから構成される市販の酵素カクテルでの１６℃で１．５時間の全第１の鎖の反応を含んでいた。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる二本鎖ｃＤＮＡ末端の平滑末端化後、市販のＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡ Ａｄａｐｔｅｒを、精製された二本鎖ｃＤＮＡのアリコートにライゲーションした。キット中の１０ｍＭ ｔｉｃｍｅ−ＫＯＨ／０．１Ｍ ＥＤＴＡ緩衝液でのアダプターライゲーション産物の希釈により、ＰＣＲ増幅のためのｃＤＮＡを用意した。
【０２７４】
ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子転写物の５’および３’のほとんどの配列を得るために、提供されたＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ増幅プライマー組を、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ５９０５８によって提供された配列に基づいて、遺伝子特異的プライマーおよびネスト化遺伝子特異的プライマーと対合した。これらのプライマー組を、表１３に示す。この方法により、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ５９０５８中に含まれる配列に基づいたオリゴヌクレオチドプライマーを、３’方向および５’方向に配向させ、これを使用して重複ＰＣＲフラグメントを作製する。これらの重複３’および５’産物を組み合わせて、インタクトな全長ｃＤＮＡを産生する。この方法は、例えば、Ｉｎｎｉｓら，ｓｕｐｒａ；およびＦｒｏｈｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：８９９８，１９８８に記載されており、さらに、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されている。
【０２７５】
ゲノムウォーキング分析：ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ転写物のエクソン−イントロン境界または５’もしくは３’隣接領域を同定するために、ＵｎｉｖｅｒｓａｌＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（登録商標）ライブラリーキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、ブタＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（登録商標）ライブラリーを構築した。
【０２７６】
簡単に述べれば、ブタゲノムＤＮＡの５つのアリコートを、１平滑末端切断制限エンドヌクレアーゼ（Ｄｒａｌ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕｌＩ、ＳｃａＩ、またはＳｔｕＩ）で個別に消化した。フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、および制限消化フラグメントの再懸濁後、各消化アリコートの一部を、キット中にＧｅｎｏｍｕＷａｌｋｅｒアダプターとの個別のライゲーション反応で使用した。このプロセスにより、ＰＣＲベースのクローニングストラテジーで使用するための５つのライブラリーが作製された。表１３で同定したプライマー対を、ゲノムウォーキングストラテジーで使用した。ｅＬＯＮ−ＧａｓｅまたはＴａＫａＲａ ＬＡＴａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）酵素のいずれかを、全ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ実験およびゲノムＤＮＡの直接長（ｄｉｒｅｃｔ ｌｏｎｇ）ＰＣＲのために使用した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００または９７００サーモサイクラーによる全ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ実験で、製造者が推奨する熱サイクリング条件を使用した。
【０２７７】
【表１５】
増幅産物のサブクローニングおよび配列決定：ゲノムＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物、、ＧｅｎｅＷａｌｋｅｒ−ＰＣＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、および５’−３’−ＲＡＣＥを、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してゲル精製し、必要に応じて、Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中のｐＣＲＩＩベクターにサブクローン化した。ｐＣＲＩＩライゲーションインサートのプラスミドＤＮＡミニプレップを、説明書にしたがってＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した。ＡＢＩ ３７７自動化配列分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）をＴ７およびＳＰ６プロモータープライマーまたは内部インサート配列からデザインしたプライマーでプライミングしたローダミンまたはＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかと共に使用して、クローン化インサートの自動化蛍光配列決定を行った。
【０２７８】
プライマー合成：他で記載しない限り、種々のＰＣＲベースの方法でプライマーとして使用する全てのオリゴヌクレオチドを、固相合成およびホスホラミダイトヌクレオシド化学を使用したＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を使用して合成した。
【０２７９】
（転写因子結合部位の分析）
エクソン配列の２２８ｂｐおよびエクソン１の６０１ｂｐ上流を使用して、可能な転写因子結合部位の分析を行った。ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅで利用可能な「ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ」ソフトウェアを使用して、配列をスクリーニングした。配列は、以下の転写因子の結合部位を含む：ＭＺＦ１、ＥＴＳＦ、ＳＦ１、ＣＭＹＢ、ＭＥＦ２、ＮＭＰ４、ＢＲＮ２、ＡＰ１、ＧＡＴ１、ＳＡＴＢ１、ＡＴＦ、ＵＳＦ、ＷＨＮ、ＺＦ５、ＮＦκＢ、ＭＯＫ２、ＮＦＹ、ＭＹＣＭＡＸ、ＺＦ５。図４を参照のこと。
【０２８０】
ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ相同組換えターゲティングベクターの構築ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼノックアウト標的ベクター。ノックアウトのためのブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のエクソン６をターゲティングするベクターを構築することができる。第１の工程では、
【０２８１】
【化１】
などのプライマーを使用して、ターゲティングベクターの３’アームとして使用するためのイントロン６部分をＰＣＲによって増幅する（図５を参照のこと）。約３．７ｋｂの増幅されたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩを使用した制限酵素消化後にｐＣＲＩＩベクターに挿入することができる。図６を参照のこと。
【０２８２】
３’アームの挿入後、
【０２８３】
【化２】
などのプライマーを使用して、ターゲティングベクターの５’アームとして使用するためのイントロン５部分をＰＣＲによって増幅することができる（図５を参照のこと）。この最初の増幅後、それぞれ
【０２８４】
【化３】
などのプライマーと組み合わせてｐＤＨ１などのプライマーを使用してＥｃｏＮＩ制限部位を５’アームの３’部分に挿入するために連続的ＰＣＲ増幅を行うことができる（図５を参照のこと）。操作ＥｃｏＮＩ部位を含む約２．６ｋｂの増幅ＰＣＲ産物はＡｐａＩおよびＥｃｏＮＩを使用して消化した制限酵素であり、これを予め挿入した３’アームを含むｐＣＲＩＩベクターに挿入して（図７を参照のこと）、約６．３ｋｂのブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼターゲティング配列を含むターゲティングベクター（ｐＤＨΔｅｘ６）を作製することができる（図８を参照のこと）。
【０２８５】
ＥＧＦＰノックイン標的ベクター。ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のエクソン６の３’末端への増強緑色蛍光タンパク質配列のインフレーム挿入によって、ｐＤＨΔｅｘ６をさらに修飾することができる。第１の工程では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のイントロン５部分およびエクソン６部分を、
【０２８６】
【化４】
などのプライマーを使用したＰＣＲによって増幅し（図９を参照のこと）、ＭｕｎＩおよびＥｃｏＲｖでの制限酵素消化後にＥＧＦＰおよびポリＡテールを含むベクター（ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）に挿入することができる。挿入後、
【０２８７】
【化５】
などのプライマーを使用した挿入を含むｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクターでＰＣＲ増幅を行うことができる（図９を参照のこと）。ＰＣＲ増幅産物はＥｃｏＮＩおよびＭｕｎＩを使用して消化した制限酵素であり、これを予め構築したｐＤＨΔｅｘ６ターゲティングベクターに挿入することができる（図１０を参照のこと）。得られたターゲティングベクター（ｐＤＨΔｅｘ６）を図１１に例示する。
【０２８８】
（ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ欠損胎児線維芽細胞の産生）
妊娠３３日の同一妊娠の１０体の胎児から胎児線維芽細胞を単離する。頭部および内蔵の除去後、胎児をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，１ ５ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で洗浄し、２０ｍｌのＨＢＳＳに入れ、小さな手術用鋏でサイコロ状にする。組織をペレット化し、５０ｍｌ試験管中で胎児あたり４０ｍｌのＤＭＥＭおよび１００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼ（ｇｂｃｏ−ＢＲＬ）で再懸濁する。チューブを３７℃の水浴中で撹拌しながら４０分間インキュベートする。消化された組織を３〜４分間静置し、細胞豊富な上清を新たな５０ｍｌチューブに移し、ペレット化する。次いで、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１×非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および２ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを含む４０ｍｌのＤＭＥＭで再懸濁し、１０ｃｍの皿に播種する。トランスフェクションのために、１０μｇの線状化ｐＤＨΔｅｘ６ＥＧＦＰベクターを、製造者のガイドラインにしたがってリポフェクタミン２０００（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して２００万個の細胞に移入する。４８時間のトランスフェクション後、トランスフェクトした細胞を、２，０００細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに播種し、コンフルエンスまで成長させる。コンフルエンス後、細胞を、相同組換えが起こってＥＧＦＰを発現する細胞のみが選択される蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって分取する（例えば、図１３を参照のこと）。
【０２８９】
選択された細胞を、再播種し、コンフルエントまで成長させる。一旦コンフルエンスに到達すると、いくつかの小アリコートをその後の使用のために凍結させ、残りを相同組換えについてのＰＣＲおよびサザンブロットによる検証のために使用する。推定ターゲティングクローンを、ＥＧＦＰに相補的なプライマーおよびアンチセンスプライマーとしてベクターの外側の配列に相補的なプライマーを使用したエクソン６／ＥＧＦＰインサートを介したＰＣＲによってスクリーニングすることができる。ターゲティングされた対立遺伝子由来の推定バンドの存在によってポジティブクローンを同定するために、ＰＣＲ産物を、ＥＧＦＰプローブを使用したサザンブロッティングによって分析することができる。
【０２９０】
（核ドナーとして異種ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ欠損胎児線維芽細胞を使用したクローン化ブタの作製）
核導入のための細胞の調製：一般的に上記のようにブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼにヘテロ接合性を示す細胞を産生するために、ドナー細胞を遺伝子操作する。上記に詳述のように産生した核ドナーとしてＥＧＦＰ選択ブタ線維芽細胞を使用して、当該分野で周知の方法（Ｄａｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：２５１２５５，２００２；およびＰｏｌｅｊａｅｖａら，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：８６−９０，２０００）によって核導入を行うことができる。
【０２９１】
例えば、Ｉ．Ｐｏｌｅｊａｅｖａら，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：５０５（２０００）に記載のように、同期化された過剰排卵する性的に成熟したＬａｒｇｅ−ＷｈｉｔｅＸ Ｌａｎｄａｃｒｅ外部交配未経産ブタから卵母細胞を単離することができる。ドナー細胞を、血清枯渇（０．５％）によって２４時間と１２０時間との間の推定Ｇ０／Ｇ１期に同調させる。例えば、本質的にＡ．Ｃ．Ｂｏｑｕｅｓｔら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ６８：１２８３（２００２）に記載のように、卵母細胞の除核、核導入、電気融合、および電気活性化を行うことができる。再構築した胚を一晩培養し、非同期（−１日）レシピエントの卵管に導入することができる。妊娠を確認し、実時間超音波によってモニタリングすることができる。
【０２９２】
ヘテロ接合性ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ１ノックアウト（ＳＫＯ）雄ブタと雌ブタとの交配を行い、二重ノックアウト（ＤＫＯ）ブタの小集団を確立することができる。
【０２９３】
（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ欠損ブタの検証）
１ノックアウト雄ブタおよび雌ブタの交配後、二重ノックアウトブタの検証を行う。子孫由来の線維芽細胞を、１μｇの抗Ｎ−グリコシルＧＭ２モノクローナル抗体ＭＫ２−３４（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｋｏｇｙｏ，ＪＰ）と氷上で３０分間インキュベートする。ＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧを細胞および結合がＮｅｕ５ＧＣの有無を示す抗体に添加し、それにより活性なＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの有無をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって検出する。
【図面の簡単な説明】
【０２９４】
【図１】ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム機構を示す。黒塗りのバーは、それぞれ番号をつけたエクソンを示す。エクソン間のイントロンの長さは、相対距離を示す。（白抜きのボックスもいくつかの変異型で認められるエクソンを示す（図２を参照のこと）；「開始」および「終止」は、それぞれ開始コドンおよび終止コドンを示す）。図の下におおよそのスケールを示す。
【図２】ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。変異型１は、エクソン１４および１５の代わりにエクソン１５ａを含む。変異型２はエクソン１２ａを含み、変異型３はエクソン１１ａを含む。「開始」および「終止」は、それぞれ開始コドンおよび終止コドンを示す。
【図３】その対応するゲノム機構と共にターゲティングベクターの４つの非限定的な例を示す。この特定の非限定的な例における選択マーカー遺伝子は、ｅＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）である。ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃｅヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化するためにＧＦＰをＤＮＡ構築物に挿入することができる。
【図４】エクソン１（２２８ｂｐ）内に存在する転写因子結合部位および６０１ｂｐにわたるその５’隣接領域を示す。
【図５】ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子ターゲティングベクターのＤＮＡ構築のために使用することができるオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図６】プライマーｐＤＨ３およびｐＤＨ４を使用したブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子からの３’アームセグメントの産生およびベクター（ｐＣＲＩＩ）へのその挿入を示す略図である。
【図７】プライマーｐＤＨ１およびｐＤＨ２、その後ｐＤＨ２ａ、ｐＤＨ２ｂ、およびｐＤＨ２ｃを使用したブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子からの５’アームセグメントの産生および３’アームが予め挿入されたベクター（ｐＣＲＩＩ）への挿入を示す略図である。
【図８】相同組換えによってブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のエクソン６を欠失するために使用することができるターゲティングベクターを例示する図の非限定的な例である。
【図９】ノックインストラテジーで使用するための増強緑色蛍光タンパク質発現ベクターの作製で使用されるオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図１０】ポリＡシグナルを有するＥＧＦＰフラグメントのターゲティングベクターｐＤＨΔｅｘ６への挿入を例示する図である。
【図１１】ｅＧＦＰ発現のためのノックインベクターを例示する図である。
【図１２】ターゲティングカセットＤＮＡ構築物（ｐＤＨΔｅｘ６）とゲノムＤＮＡとの間でフレームシフトが起こる相同組換えを例示する図である。
【図１３】ターゲティングカセットＤＮＡ構築物（ｐＤＨΔｅｘ６）とゲノムＤＮＡとの間でフレームシフトが起こる相同組換えを例示する図である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００３年６月６日提出の米国特許出願番号６０／４７６，３９６号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ）のタンパク質、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡ調節配列を提供する。さらに、本発明は、ブタ動物、組織、および臓器、ならびに機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの発現を欠くこのような動物、組織、および臓器由来の細胞および細胞株を含む。このような動物、組織、臓器、および細胞を、研究および医学的治療法（異種移植が含まれる）ならびに産業上の家畜飼育操作で使用することができる。さらに、異種移植で使用するためのブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く臓器、組織、および細胞の調製方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
許容可能なヒトドナー臓器が利用不可能であること、宿主対移植片拒絶による長期成功率の低さ、ならびに感染症および癌の深刻なリスクは、組織および臓器移植分野が現在直面している主な課題である。許容可能な臓器に対する需要が供給を超えているので、多くの患者は毎年利用可能になる臓器を待っている間に死亡している。この需要を満たす一助とするために、研究は同種間移植の代替法の開発に焦点が当てられている。透析は腎不全患者が利用可能であり、人工心臓モデルが試験されており、臓器不全を補助または置換するための他の機械系が開発されている。しかし、このようなアプローチは非常に高価である。透析装置を頻繁且つ定期的に利用することが必要であるので、このような治療を受ける患者の自由および生活の質が非常に制限される。
【０００４】
異種移植片移植は、ヒト移植のための人工臓器に代わる潜在的に魅力的なものである。非ヒト臓器の潜在的なプールは事実上限られている。ブタは、最も可能性が高い異種移植臓器の供給源と考えられている。ブタの供給は豊富にあり、交配プログラムが十分に確立されており、その臓器のサイズおよび生理学的性質はヒトに適合可能である。したがって、ブタ臓器での異種移植は、臨床的移植に利用可能な臓器の不足に対する潜在的な解決法を提供する。
【０００５】
このような異種間組織の宿主拒絶は、依然としてこの分野における主な懸念である。異種移植に対する免疫学的障壁は、恐れられており、且つ依然として恐れられている。第１の免疫学的ハードルは、「超急性拒絶」（ＨＡＲ）である。ＨＡＲは、外来組織に結合する予め形成された高力価の天然の抗体の遍在と定義される。ドナー臓器内皮上の標的エピトープに対するこれらの天然の抗体の結合は、ＨＡＲにおける開始事象と考えられる。この結合の後、レシピエントの血液でのドナー臓器の灌流から数分以内に、血小板およびフィブリンが沈殿し、最終的にドナー臓器が間質の浮腫および出血を起こし、その全てによってレシピエントで臓器不全が起こる（Ｓｔｒａｈａｎら（１９９６）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １，ｐｐ．３４−４１）。
【０００６】
類人猿または旧世界ザル（例えば、ヒヒ）からヒトへのいくつかの著名な異種移植は、拒絶することなく何ヵ月間も許容される。しかし、このような試みは、多数の免疫学的要因によって最終的に失敗している。ＨＡＲを抑制するための強い免疫抑制を使用した場合でさえも、移植片内皮上の異種補体の活性化を制御するための移植片組織内の補体調節タンパク質（ＣＲＰ）の不全に一部起因する軽度の先天性免疫応答により、最終的に移植臓器が破壊される（Ｓｔａｒｚｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１４１，２１３−４４（１９９４））。ヒトへの異種移植に許容可能な臓器のプールを開発する目的で、研究者は、ヒトＣＲＰを産生する動物を操作している（霊長類における異種移植片破壊を遅延させるが消失しないことが証明されているアプローチ）（ＭｃＣｕｒｒｙら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１，４２３−２７（１９９５）；Ｂａｃｈら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１７，３７９−８４（１９９６））。
【０００７】
補体媒介攻撃に加えて、調和しない異種移植片のヒトによる拒絶は、共通の抗原（多数の糖タンパク質および糖脂質のガラクトース−α（１，３）−ガラクトース（ｇａｌ−α−ｇａｌ）末端残基）によって媒介されるようである（Ｇａｌｉｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４，１３６９−７３（１９８７）；Ｃｏｏｐｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１４１，３１−５８（１９９４）；Ｇａｌｉｌｉら，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，１５，１５５−１７１（１９９３）；Ｓａｎｄｒｉｎら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｒｅｖ．，８，１３４（１９９４））。この抗原は、ヒトＡ、Ｂ、およびＯ型血液抗原と化学的に関連し、多数の寄生虫ならびに細菌およびウイルスなどの感染因子に存在する。ほとんどの哺乳動物組織もこの抗原を含むが、旧世界ザル、類人猿、およびヒトは注目すべき例外である（Ｊｏｚｉａｓｓｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１４２９０−９７（１９８９）を参照のこと）。このような炭水化物エピトープを持たない個体は、エピトープに特異的な天然に存在する抗体（ＩｇＭおよびＩｇＧ）を豊富に産生する。多くのヒトは、ｇａｌ−α−ｇａｌ炭水化物決定基に対して特異性を有する有意なレベルの循環ＩｇＧを示す（Ｇａｌｉｌｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６２，５７３−８２（１９８５）；Ｇａｌｉｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４，１３６９−７３（１９８７））。α−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−ＧＴ）酵素は、ｇａｌ−α−ｇａｌ部分の形成を触媒する。研究は、異種組織の細胞表面上でのｇａｌ−α−ｇａｌ部分の発現を減少または消失するためのこの酵素の調整または消失に焦点が当てられている。
【０００８】
ブタ由来のα−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の消失は、ブタからヒトへの異種移植に対する最も有意なハードルの１つと長い間考えられている。ブタゲノム中の２つの対立遺伝子はα−ＧＴ遺伝子をコードする。ブタにおけるα−ＧＴ遺伝子の１対立遺伝子ノックアウトが２００２年に報告された（ＤａｉらＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：２５１（２００２）；Ｌａｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５：１０８９（２００２））。
【０００９】
最近、α−ＧＴ遺伝子の二重対立遺伝子ノックアウト（ｄｏｕｂｌｅ ａｌｌｅｌｉｃ ｋｎｏｃｋｏｕｔ）が行われた（Ｐｈｅｌｐｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９：ｐｐ．４１１−４１４（２００３））。Ｒｅｖｉｖｉｃｏｒ Ｉｎｃ．のＷＯ ２００４／０２８２４３は、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，３−ＧＴ）の全発現を欠くブタ動物、組織、臓器、細胞、および細胞株を記載している。したがって、α１，３−ＧＴの機能的発現を欠く動物、組織、臓器、細胞、および細胞を、異種移植および他の医学的目的のために使用することができる。
【００１０】
Ｉｍｍｅｒｇｅ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．のＰＣＴ特許出願ＷＯ２００４／０１６７４２号は、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼヌル細胞、ＧＧＴＡ−１ヌル細胞の選択方法、それから産生されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼヌルブタ（生存可能なＧＧＴＡ−１ヌルブタと呼ばれる）、このようなブタの作製方法、および異種移植のための細胞、組織、および臓器の使用方法を記載している。
【００１１】
ｇａｌ−α−ｇａｌ以外の最も初期の公知の異種抗原の１つは、Ｈｎａｇａｎｕｔｉｕ Ｄｅｉｃｈｅｒ抗体が認識し、且つ血清疾患と長期的に関連するエピトープである。エピトープは、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）（炭水化物のシアル酸ファミリーのメンバー）として同定された。炭水化物のうち、シアル酸は豊富且つ遍在する。シアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃｙｌ）およびその誘導体に使用される総称である。Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）およびＮ−グリコリルノイラミン酸（ｎｅｕ５Ｇｃ）は、シアル酸の最も豊富な誘導体のうちの２つである。
【００１２】
Ｎｅｕ５Ｇｃエピトープは、複合糖質のグリカン鎖中の末端に存在する。この露呈した位置のために、例えば、炎症反応、免疫細胞の成熟、分化プロセス、ホルモン結合、病原体結合、および毒素結合の場合の細胞認識で重要な役割を果たす（Ｖａｒｋｉ，Ａ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２，ｐｐ．２５−４０（１９９２））。
【００１３】
Ｎｅｕ５Ｇｃを含む複合糖質はヒトで免疫原性を示す。健常なヒトでは、Ｎｅｕ５Ｇｃは検出可能でないが、Ｎｅｕ５Ｇｃはほとんどの哺乳動物で豊富に存在する。人におけるＮｅｕ５Ｇｃの欠如は、機能酵素の形成を防止するヒト遺伝子におけるエクソンの欠失に起因する（Ｃｈｏｕ，Ｈ．Ｈ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９５，ｐｐ．１１７５１−１１７５６（１９９８）；Ｉｒｉｅ，Ａ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，ｐｐ．１５８６６−１５８７１（１９９８））。したがって、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有複合糖質は抗原として作用し、抗体の形成を誘導することができる。歴史的に、この抗体はＨａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ（ＨＤ）抗原および抗体と呼ばれる（Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ，Ｍ．，ＣＲ Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．（Ｐａｒｉｓ），９１，ｐ．１４５７（１９２４）；Ｄｅｉｃｈｅｒ，Ｈ．，Ｚ．Ｈｙｇ．，１０６，ｐ．５６１（１９２６））。Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗原は、多数のヒト腫瘍（結腸癌、網膜芽腫、黒色腫、および乳癌）およびニワトリ腫瘍組織で検出可能である（Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｈ．らＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４５，ｐｐ．３７９６−３８０２（１９８５））。腫瘍中の抗原量は非常に少ないにもかかわらず（通常、全量が１％未満のシアル酸、しばしば０．０１から０．１％までの範囲）、Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗体の形成を誘導することができる（Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ，Ｔ．ら，Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９５，ｐｐ．２３１−２３５（１９９１））。この免疫反応は、ヒトへのＮｅｕ５Ｇｃ含有ブタ臓器の異種移植に対する潜在的な障壁である。
【００１４】
Ｎｅｕ５Ｇｃエピトープは、Ｎｅｕ５ＡｃのＮ−アセチル部分への水酸基の付加によって形成される。ヒドロキシル化を触媒する酵素は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼである。したがって、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の発現は、細胞表面上のＮｅｕ５Ｇｃエピトープの存在を決定する。哺乳動物におけるＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの精製研究により、シトクロムｂ５およびシトクロムｂ５レダクターゼに依存する可溶性細胞質オキシゲナーゼであることが示された（Ｋａｗａｎｏ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，ｐｐ．９０２４−９０２９（１９９４）；Ｓｃｈｎｅｃｋｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｐ．ら，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，１１，ｐｐ．１９４−２０３（１９９４）；Ｓｃｈｌｅｎｚｋａ，Ｗ．ら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，４，ｐｐ．６７５−６８３（１９９４）；Ｋｏｚｕｔｓｕｍｉ，Ｙ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１０８，ｐｐ．７０４−７０６（１９９０）；およびＳｈａｗ，Ｌ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１９，ｐｐ．１００１−１０１１（１９９４））。
【００１５】
Ｎｅｕ５Ｇｃの別の重要な特徴は、細胞に侵入させる病原体の接着分子として作用することである（Ｋｅｌｍ，Ｓ．およびＳｃｈａｕｅｒ，Ｒ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ，１７９，ｐｐ．１３７−２４０（１９９７））。これにより、一定の家畜で疾患および経済的損失を被る。詳細には、Ｋ９９線毛を有する腸管毒素原性大腸菌は、腸内吸収細胞および粘膜分泌細胞に結合したＮｕｅ５Ｇｃα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１’セラミド［ＧＭ３（Ｎｅｕ５Ｇｃ）］などのガングリオシド中のＮｅｕ５Ｇｃ、Ｎ−グリコシルシアロパラグロボシド、およびＧＭ２（Ｎｅｕ５Ｇｃ）への結合によって新生仔ブタに感染し、潜在的に致死的下痢を引き起こす（Ｍａｌｙｋｈ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３７０，ｐｐ．６０１−６０７（２００３）；Ｋｙｏｇａｓｈｉｍａ，Ｍ．ら（１９９３）；Ｔｅｎｅｂｅｒｇ，Ｓ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅａｅｒｓ，２６３，ｐｐ．１０−１４（１９９０）；Ｉｓｏｂｅ，Ｔ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３６，ｐｐ．３５−４０（１９９６）；Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｍ．およびＣａｒｉｓｔｅｄｔ，Ｉ．，Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３６，ｐｐ．１６０９−１６１４（１９９０）；Ｋｉｎｇ，Ｔ．Ｐ．ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ６ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｐｉｇｓ，ｐｐ．２９０−２９３（１９９４））。ブタロタウイルスは、ＧＭ３（Ｎｅｕ５Ｇｃ）への結合によって新生ブタに感染して下痢を引き起こす。ブタ伝染性胃腸炎コロナウイルスは、α２，３結合Ｎｅｕ５Ｇｃを含む複合糖質への侵入によってブタに感染する（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｂら，．Ｌ Ｖｉｒｏｌ．，７０，ｐｐ．５６３４−５６３７（１９９６））。
【００１６】
マウスの肝臓およびブタの顎下腺からＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼが均一に単離され、特徴づけられている（Ｋａｗａｎｏ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，ｐｐ．９０２４−９０２９（１９９４）；Ｓｃｈｎｅｃｋｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｐ．ら，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，１１，ｐｐ．１９４−２０３（１９９４）；ａｎｄ，Ｓｃｈｌｅｎｚｋａ，Ｗ．ら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，４，ｐｐ．６７５−６８３（１９９４））。
【００１７】
Ｓｃｈｌｅｎｚｋａら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．６７５−６８３（１９９４））は、イオン交換クロマトグラフィ、固定化トリアジン色素を使用したクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、およびゲル濾過を使用して、ブタ顎下腺から酵素を精製した。Ｓｃｈｎｅｃｋｅｎｂｕｒｇｅｒら（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．１９４−２０３（１９９４））は、マウス肝臓からＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼを単離した。ブタ顎下腺およびマウス肝臓由来のＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼは共に分子量６５ｋＤａの可溶性単量体である。ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃおよびシトクロムｂ５とのその触媒的相互作用は、互いに類似している。これらの酵素の活性は、イオン含有補欠分子団に依存するようである。
【００１８】
ＪＰ−Ａ０６１１３８３８は、マウスＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼのタンパク質およびＤＮＡ配列ならびにこのヒドロキシラーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体を記載している。
【００１９】
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｈｅｉｍＧＭＢＨのＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／０３２００Ａ１は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの部分ｃＤＮＡを開示している。この出願は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のエクソン８の中央から始まるｃＤＮＡ配列を開示している（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｙ１５０１０としてさらに開示されている）。
【００２０】
Ｍａｒｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．５１５７−５１６６（２００１））は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの全長アミノ酸配列を開示している。
【００２１】
ＲＢＣ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０８８３５１号は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの部分ｃＤＮＡ配列およびゲノム配列（エクソン７〜１１および各エクソン周囲の部分ゲノム配列）を開示している。さらに、任意選択的に、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子および／または補体タンパク質の挿入などの他のゲノム修飾と組み合わせたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼエピトープを欠くブタ細胞および動物の作製方法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム配列および調節配列を提供することである。
【００２３】
本発明の目的は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の全長ｃＤＮＡおよび新規の変異型を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子をコードする新規の核酸配列およびアミノ酸配列を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠損した細胞、組織、および／または臓器を提供することである。
【００２６】
本発明の別の目的は、機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く動物（特にブタ）を作製することである。
【００２７】
本発明のなおさらなる目的は、必要とするヒトレシピエントへの非ヒト臓器の異種移植で使用するためのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠損した細胞、組織、および／または臓器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
（発明の要旨）
ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列、ペプチド配列、およびゲノム機構を決定した。今日まで、部分ｃＤＮＡおよびゲノム配列のみが同定されている。本発明は、新規のブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼのタンパク質、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ変異型、およびゲノムＤＮＡ配列を提供する。さらに、本発明は、ブタ動物、組織、および臓器、ならびに機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの発現を欠くこのような動物、組織、および臓器由来の細胞および細胞株を含む。このような動物、組織、臓器、および細胞を、研究および医学的治療法（異種移植が含まれる）で使用することができる。さらに、異種移植で使用するためのブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く臓器、組織、および細胞の調製方法を提供する。
【００２９】
本発明の１つの態様は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの全長ｃＤＮＡを提供する。全長ｃＤＮＡを、表１（配列番号１）に示し、全長ペプチド配列を表２（配列番号２）で提供する。全長ｃＤＮＡの開始コドンはエクソン４の３’部分に存在し、終止コドンはエクソン１７の３’部分で見出される。配列番号１および２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。さらに、配列番号１または２の少なくとも１０、１５、１７、２０、２５、または３０個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含むヌクレオチド配列およびペプチド配列も提供する。任意選択的にストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリッド形成する任意のヌクレオチド配列およびそれに相同なヌクレオチドをさらに提供する。
【００３０】
１つの実施形態では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの新規の変異型をコードする核酸配列およびペプチド配列を提供する（表３〜８、図２）。配列番号３は、エクソン１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５ａ、１６、１７、および１８を含む遺伝子の変異型（変異型１）のｃＤＮＡを示す。配列番号５は、エクソン１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１２ａを含む遺伝子の変異型（変異型２）のｃＤＮＡを示す。配列番号７は、エクソン１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１１ａを含む遺伝子の変異型（変異型３）のｃＤＮＡを示す。配列番号４、６、および８は、それぞれ変異型１、変異型２、および変異型３のアミノ酸配列を示す。配列番号３〜８と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。さらに、配列番号３〜８の少なくとも１０、１５、１７、２０、２５、または３０個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含むヌクレオチド配列およびペプチド配列も提供する。任意選択的にストリンジェントな条件下で配列番号３、５、および７とハイブリッド形成する任意のヌクレオチド配列ならびにそれに相同なヌクレオチドをさらに提供する。
【００３１】
さらなる実施形態は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を示す核酸配列を提供する（表９、図１）。配列番号１０〜２８は、それぞれエクソン１、４〜１１、１１ａ、１２、１２ａ、１３〜１５、１５ａ、１６〜１８を示し、配列番号２９〜４５は、それぞれイントロン１ａ、１ｂ、４〜１５、１５ａ、１６、および１７を示す。配列番号９は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の５’非翻訳領域を示す。配列番号４６（表１０）は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃヒドロキシラーゼのゲノムＤＮＡおよび調節配列を示す。
【００３２】
別の実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム配列を、配列番号４７に示す。配列番号４７は、５’ＵＴＲ、エクソン１、およびエクソン１（表１１）３’に存在するイントロン配列の一部を含む５’連続ゲノム配列を示す。
【００３３】
別の実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム配列を、配列番号４８に示す。配列番号４８は、エクソン４に対して５’方向に、エクソン４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７、イントロン７、エクソン８、イントロン８、エクソン９、イントロン９、エクソン１０、イントロン１０、エクソン１１、イントロン１１、エクソン１２、イントロン１２、エクソン１３、イントロン１３、エクソン１４、イントロン１４、エクソン１５、イントロン１５、エクソン１６、イントロン１６、エクソン１７、イントロン１７、およびエクソン１８でイントロン配列を含む連続ゲノム配列を示す（表１２）。さらに、配列番号４８の少なくとも２７７５、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、または１０，０００個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列ならびに配列番号４８と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム配列を、配列番号４９に示す。配列番号４９は、エクソン４に対して５’方向に、エクソン４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７、イントロン７、およびエクソン８でイントロン配列を含む連続ゲノム配列を示す。さらに、配列番号４９の少なくとも１７５０、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、または２００００個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列ならびに配列番号４９と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列を提供する。
【００３５】
別の実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム配列を、配列番号５０に示す。配列番号５０は、エクソン１２、イントロン１２、エクソン１３、イントロン１３、エクソン１４、イントロン１４、エクソン１５、イントロン１５、エクソン１６、イントロン１６、エクソン１７、イントロン１７、およびエクソン１８を含む連続ゲノム配列を示す。配列番号５０の少なくとも１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、または２０、０００個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列ならびに配列番号５０と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列を提供する。
【００３６】
さらなる実施形態では、配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。さらに、配列番号９〜４５、４６、４７、および４８の少なくとも１０、１５、１７、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、または１０００個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列およびペプチド配列も提供する。任意選択的にストリンジェントな条件下で配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０とハイブリッド形成する任意のヌクレオチド配列ならびにこれらに相同なヌクレオチドをさらに提供する。
【００３７】
本発明の別の態様は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃヒドロキシラーゼをコードするｃＤＮＡまたはその変異型を含む核酸構築物を提供する。これらのｃＤＮＡ配列は、配列番号１〜８またはその任意のフラグメントに由来し得る。構築物は、１つまたは１つを超える内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。構築物はまた、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得るか、構築物はプロモーターを含まなくてよい。別の実施形態では、宿主ゲノムへの挿入がランダムまたはターゲティングされている核酸配列を含む核酸構築物を提供する。核酸配列に加えて、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子配列、開始配列および／またはエンハンサー配列、ポリＡテール配列、および／または原核生物および／または真核生物の宿主細胞で構築物を発現させる核酸配列など）を含み得る。
【００３８】
別の実施形態では、体細胞中の相同組換えを行うことができる核酸ターゲティングベクター構築物も提供する。これらのターゲティングベクターを、相同組換えを介してＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子をターゲティングするために哺乳動物細胞に形質転換することができる。１つの実施形態では、ターゲティングベクターは、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼのゲノム配列に相同な３’組換えアームおよび５’組換えアームを含み得る。相同なＤＮＡ配列には、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ配列と少なくとも１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、２ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１０ｋｂｐ、１５ｋｂｐ、２０ｋｂｐ、または５０ｋｂｐが相同な配列が含まれ得る。別の実施形態では、相同ＤＮＡ配列には、１つまたは複数のイントロンおよび／またはエクソン配列が含まれ得る。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のイントロン５およびイントロン６に相同であり得る（例えば、図６〜８を参照のこと）。別の特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃのイントロン５、エクソン６の５５ｂｐ部分、およびイントロン６と相同であることができ、エクソン６の５５ｂｐ部分に対して３’方向にてインフレームで増強緑色蛍光タンパク質配列を含む（例えば、図１０〜１１を参照のこと）。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃヒドロキシラーゼのｃＤＮＡまたはゲノム配列（配列番号１、３、５、７、９〜４５、４７、または４８など）とハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。好ましい実施形態では、プライマーは、ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、または４８とハイブリッド形成する。別の実施形態は、配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、または４８などのブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ核酸配列とハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブは、本発明のポリヌクレオチドとハイブリッド形成する少なくとも１４塩基、２０塩基、好ましくは３０塩基、または５０塩基を有し得る。プローブまたはプライマーは、少なくとも１４ヌクレオチド長であり得るが、好ましい実施形態では、少なくとも１５、２０、２５、２８、または３０ヌクレオチド長である。
【００４０】
本発明の別の態様では、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子を欠く哺乳動物細胞を提供する。相同組換えの結果としてこれらの細胞を得ることができる。特に、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の不活化により、機能的Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗原の発現能力が低下した細胞を産生することができる。
【００４１】
本発明の実施形態では、得られたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ酵素がもはやＨａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗原を作製することができないように本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがってＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の対立遺伝子を不活化する。１つの実施形態では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子をＲＮＡに転写することができるが、タンパク質に翻訳することができない。別の実施形態では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を、不活性な短縮形態に転写することができる。このような短縮ＲＮＡは、翻訳することができないか、非機能的タンパク質に翻訳することができる。別の実施形態では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を遺伝子が転写しないような方法で不活化することができる。さらなる実施形態では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を転写し、その後非機能的タンパク質に翻訳することができる。
【００４２】
本発明のさらなる態様では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生されたゲノムターゲティング事象を介して不活化されたブタ動物を提供する。本発明の別の態様では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の両対立遺伝子が遺伝子ターゲティング事象を介して不活化されたブタ動物を提供する。相同組換えを介して遺伝子をターゲティングすることができる。他の実施形態では、遺伝子を破壊することができる（すなわち、遺伝コードの一部を変化させ、それにより遺伝子のそのセグメントの転写および／または翻訳に影響を与えることができる）。例えば、欠失（「ノックアウト」）技術または挿入（「ノックイン」）技術によって遺伝子を破壊することができる。既存配列の転写を調整する所望のタンパク質または調節配列のさらなる遺伝子を挿入することができる。
【００４３】
本発明の別の態様では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の１つの対立遺伝子、任意選択的に両対立遺伝子を欠くブタ細胞を、クローン化トランスジェニック動物を産生するための除核卵母細胞への核導入のためのドナー細胞として使用することができる。あるいは、胚幹細胞中でブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼノックアウトを作製し、その後子孫の産生に使用することができる。本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生した機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の１つの対立遺伝子を欠く子孫を交配して、メンデル型遺伝子によって両対立遺伝子の機能性を欠く子孫をさらに産生することができる。異種移植ストラテジーで使用するために、細胞、組織、および／または臓器をこれらの動物から回収することができる。Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗原は、Ｎｅｕ５Ｇｃエピトープに起因する移植細胞、組織、または臓器の免疫拒絶を軽減させることができる。
【００４４】
あるいは、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生したＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子を欠く動物は、腸管毒素原性感染および疾患（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ感染、ロタウイルス感染、および胃腸炎コロナウイルスなど）に対する感受性が低いか耐性を示し得る。このような動物を、例えば、商業的飼育で使用することができる。
【００４５】
本発明の１つの態様では、本発明の任意の態様にしたがった方法によってブタを調製することができる。遺伝子操作ブタを、移植療法のための組織および／または臓器供給源として使用することができる。この様式で調製したブタ胚またはそれから発生した細胞株も細胞移植療法で使用することができる。したがって、本発明のさらなる態様では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼを欠く胚または動物から調製されたブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼを欠く遺伝子操作細胞のブタへの投与を含む治療方法を提供する。本発明のこの態様は、薬物におけるこのような細胞の使用（例えば、細胞移植療法）および移植のための細胞または組織移植片の調製におけるこのような胚由来の細胞の使用にまで及ぶ。細胞を、組織または臓器（例えば、心臓、肺、腎臓、膵臓、角膜、神経（例えば、脳、中枢神経系、脊髄）、皮膚）に組織化することができるか、細胞は、島細胞、血球（例えば、血球（すなわち、赤血球、白血球））または造血幹細胞もしくは他の幹細胞（例えば、骨髄）であり得る。
【００４６】
本発明の別の態様では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ欠損ブタは他の異種抗原（例えば、ブタｉＧｂ３シンターゼ（例えば、を米国特許出願６０／５１７，５２４号を参照のこと）および／またはブタＦｏｒｓｓｍａｎシンターゼ（例えば、米国特許出願６０／５６８，９２２号を参照のこと）など）をコードする遺伝子も欠く。別の実施形態では、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生されたα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子およびＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠くブタ細胞を提供する。別の実施形態では、ブタ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ノックアウト細胞を、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物によって産生されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子をノックアウトするようにさらに修飾する。さらに、任意選択的に不都合な免疫応答に関連する１つまたは複数のさらなる遺伝子を欠く本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ欠損ブタを補体阻害タンパク質（例えば、ＣＤ５９、ＤＡＦ、および／またはＭＣＰなど）を発現するように修飾することができ、ＭＣＰをＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の発現を消失するようにさらに修飾することができる。これらの動物を、移植療法のための組織および／または臓器の供給源として使用することができる。これらの動物を、移植療法のための組織および／または臓器の供給源として使用することができる。この様式で調製したブタ胚またはそれから発生した細胞株も細胞移植療法で使用することができる。
【００４７】
（発明の説明）
本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の消失により、Ｎｅｕ５Ｇｃエピトープに対するヒトの免疫応答を減少し、異種移植に対する免疫学的障壁を除去することができる。本発明は、全長ｃＤＮＡおよびペプチドをコードする新規の核酸配列に関する。遺伝子のゲノム機構、イントロン配列、および調節領域に関する情報も提供する。１つの態様では、本発明は、配列番号１、３、５、または７の１つをコードする単離および実質的に精製されたｃＤＮＡ分子またはそのフラグメントを提供する。本発明の別の態様では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロラーゼ遺伝子の全長ゲノムを含むＤＮＡ配列を、配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０またはそのフラグメントに提供する。別の態様では、配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、または５０由来のブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃヒドロキシラーゼｃＤＮＡまたはゲノム配列の増幅のためのプライマーを提供する。さらに、配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０またはそのフラグメント由来のＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ核酸配列を同定するためのプローブを提供する。配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０またはそのフラグメントによって示されるＤＮＡを使用して、機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠くブタを構築物ことができる。したがって、本発明はまた、機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠くブタ染色体および本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生された機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼタンパク質を欠くトランスジェニックブタを提供する。このようなブタを、ヒトへの異種移植のための組織供給源として使用することができる。別の実施形態では、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物によって産生されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ欠損ブタは、異種移植における不都合な免疫応答に関連する他の遺伝子（例えば、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、ｉＧｂ３シンターゼ遺伝子、またはＦＳＭシンターゼ遺伝子など）も欠く。別の実施形態では、本明細書中に記載のプロセス、配列、および／または構築物にしたがって産生されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼおよび／または異種移植における不都合な免疫応答に関連する他の遺伝子を欠くブタは、補体阻害因子（例えば、ＣＤ５９、ＤＡＦ、および／またはＭＣＰなど）を発現する。
【００４８】
（定義）
「標的ＤＮＡ配列」は、相同組換えによって修飾されるＤＮＡ配列である。標的ＤＮＡは、動物細胞の任意のオルガネラ（核およびミトコンドリアが含まれる）中に存在することができ、インタクトな遺伝子、エクソンもしくはイントロン、調節配列、または遺伝子間の任意の領域であり得る。
【００４９】
「ターゲティングＤＮＡ配列」は、所望の配列修飾を含むＤＮＡ配列である。ターゲティングＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡと実質的に同質遺伝子的であり得る。
【００５０】
「相同ＤＮＡ配列または相同ＤＮＡ」は、基準ＤＮＡ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のＤＮＡ配列である。相同配列は、ストリンジェントな条件下で標的配列とハイブリッド形成し、ストリンジェントな条件には、配列が少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％または９８％同一である場合にハイブリッド形成が起こる条件が含まれる。
【００５１】
「同質遺伝子または実質的に同質遺伝子のＤＮＡ配列」は、基準ＤＮＡ配列と同一であるかほぼ同一であるＤＮＡ配列である。用語「実質的に同質遺伝子的な」は、基準ＤＮＡ配列と少なくとも約９７〜９９％同一、好ましくは基準ＤＮＡ配列と少なくとも約９９．５〜９９．９％同一、一定の用途では基準ＤＮＡ配列と１００％同一のＤＮＡをいう。
【００５２】
「相同組換え」は、配列相同性に基づいたＤＮＡ組換えプロセスをいう。
【００５３】
「遺伝子ターゲティング」は、一方が染色体上に存在し、他方が染色体上に存在しない２つのＤＮＡ配列間の相同組換えをいう。
【００５４】
「非相同または無作為な組み込み」は、ＤＮＡが相同組換えに関与しないゲノムに組み込まれる任意のプロセスをいう。
【００５５】
「選択マーカー遺伝子」は、その発現により遺伝子を含む細胞が同定される遺伝子である。選択マーカーは、この遺伝子を含まない細胞の成長を防止または遅延させる培地上で細胞を増殖させるものであり得る。例には、抗生物質耐性遺伝子および生物を選択された代謝産物に対して成長させる遺伝子が含まれる。あるいは、この遺伝子は、細胞への容易に同定される表現型の付与によって形質転換体の目視によるスクリーニングを容易にすることができる。このような同定可能な表現型は、例えば、発光もしくは着色化合物の産生または細胞周囲の培地中の検出可能な変化であり得る。
【００５６】
用語「連続する」は、本明細書中でその標準的な意味（すなわち、途切れないまたは連続的な）で使用される。
【００５７】
用語「ブタ」は、任意のブタ種（Ｌａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅ、Ｌａｎｄｒａｃｅ、Ｍｅｉｓｈａｎ、Ｍｉｎｉｐｉｇが含まれる）をいう。
【００５８】
用語「卵母細胞」は、卵形成の最終産物であり、且つ前駆体形態がそれぞれ卵原細胞、一次卵母細胞および二次卵母細胞でもある成熟動物の卵を説明する。
【００５９】
用語「フラグメント」は、ヌクレオチドまたはペプチド配列の一部または部分配列を意味する。
【００６０】
用語「誘導体」および「アナログ」は、このようなヌクレオチドまたはペプチドと本質的に同一の生物機能または生物活性を保持するヌクレオチド配列またはペプチド配列を意味する。例えば、アナログには、活性成熟ポリペプチドを産生するためのプロタンパク質部分の切断によって活性化することができるプロタンパク質が含まれる。
【００６１】
本明細書中で提供したＤＮＡ（デオキシリボ核酸）配列を、塩基アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）によって示す。
【００６２】
本明細書中で提供したアミノ酸配列を、以下の略語で示す。
【００６３】
【表１】
「トランスフェクション」は、宿主細胞へのＤＮＡの移入をいう。細胞は、自然にはＤＮＡを取り込まない。したがって、種々の技術的「トリック」を使用して、遺伝子導入を容易にする。多数のトランスフェクション法（例えば、ＣａＰＯ４およびエレクトロポレーション）が当業者に公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。宿主細胞のトランスフェクションは、首尾の良いトランスフェクションの指標である。
【００６４】
（Ｉ．ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の完全なｃＤＮＡ配列および変異型）
本発明の１つの態様は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の新規の全長核酸ｃＤＮＡ配列を提供する（図２、表１、配列番号１）。本発明の別の態様は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の推定アミノ酸ペプチド配列を提供する（表２、配列番号２）。全長ｃＤＮＡのＡＴＧ開始コドンはエクソン４の３’部分に存在し、終止コドンＴＡＧはエクソン１７の３’部分で見出される。配列番号１または２と少なくとも９０、９５、９８、または９９％相同な核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。さらに、配列番号１または２の少なくとも１０、１５、１７、２０、または２５個の連続核酸またはアミノ酸を含むヌクレオチド配列およびペプチド配列も提供する。配列番号１〜２のフラグメント、誘導体、およびアナログをさらに提供する。配列番号１〜２のフラグメントには、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、５０００、または１０，０００個のヌクレオチドを含む任意の連続する核酸配列またはペプチド配列が含まれ得る。
【００６５】
【表１Ａ−１】
【００６６】
【表１Ａ−２】
【００６７】
【表１Ａ−３】
【００６８】
【表１Ａ−４】
【００６９】
【表２−１】
【００７０】
【表２−２】
（変異型）
本発明の別の態様は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子転写物の３つの新規の変異型の新規の核酸ｃＤＮＡ配列を提供する（図２、表３、５、および７、配列番号３、５、および７）。配列番号３は、エクソン１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５ａ、１６、１７、および１８を含む遺伝子の変異型（変異型１）のｃＤＮＡを示す。エクソン１５ａは、通常はイントロン１５（エクソン１６の約４６０ｂｐ上流）中で認められる潜在性のエクソンである。変異型１の開始コドンはエクソン４中に存在し、終止コドンはエクソン１７中に存在する。配列番号５は、エクソン１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１２ａを含む遺伝子の変異型（変異型２）のｃＤＮＡを示す。エクソン１２ａは、イントロン１２の部分配列から保持された潜在性のエクソンである（配列番号２１を参照のこと）。変異型２の開始コドンはエクソン４中に存在し、終止コドンはエクソン１２ａ中に存在する。配列番号７は、エクソン１、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１１ａを含む遺伝子の変異型（変異型３）のｃＤＮＡを示す。エクソン１１ａは、イントロン１１の部分配列から保持された潜在性のエクソンである（配列番号１９を参照のこと）。変異型３の開始コドンはエクソン４中に存在し、終止コドンはエクソン１１ａ中に存在する。本発明の別の態様は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子転写物の３つの新規の変異型の新規の推定アミノ酸ペプチド配列を提供する。配列番号４、６、および８は、それぞれ変異型１、変異型２、および変異型３のアミノ酸配列を示す。配列番号３〜８と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。さらに、配列番号３〜８の少なくとも１０、１５、１７、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、または１０００個の連続するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含むヌクレオチド配列およびペプチド配列も提供する。配列番号３〜８のフラグメント、誘導体、およびアナログをさらに提供する。配列番号３〜８のフラグメントには、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、１７ｂｐ、２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、５ｋｂｐ、または１０ｋｐｂを含む任意の連続核酸配列またはペプチド配列が含まれ得る。
【００７１】
【表３−１】
【００７２】
【表３−２】
【００７３】
【表３−３】
【００７４】
【表３−４】
【００７５】
【表４】
【００７６】
【表５−１】
【００７７】
【表５−２】
【００７８】
【表６】
【００７９】
【表７−１】
【００８０】
【表７−２】
【００８１】
【表７−３】
【００８２】
【表８】
本発明の他の態様では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃヒドロキシラーゼをコードするｃＤＮＡまたはその変異型を含む核酸構築物を提供する。これらのｃＤＮＡ配列は、配列番号１、３、５、または７であり得るか、配列番号２、４、６、もしくは８またはその任意のフラグメントに由来し得る。構築物は、１つまたは１つを超える内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。構築物はまた、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得るか、構築物はプロモーターを含まなくてよい。別の実施形態では、宿主ゲノムへの挿入がランダムまたはターゲティングされている核酸配列を含む核酸構築物を提供する。核酸配列に加えて、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子配列、開始配列および／またはエンハンサー配列、ポリＡテール配列、および／または原核生物および／または真核生物の宿主細胞で構築物を発現させる核酸配列など）を含み得る。適切なベクターおよび選択マーカーを以下に記載する。発現構築物は、転写開始、終結、および／またはリボゾーム結合部位のための部位をさらに含み得る。構築物は、任意の原核細胞または真核細胞（酵母細胞、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞、および／または植物細胞が含まれるが、これらに限定されない）で発現することができる。
【００８３】
このような構築物で使用するためのプロモーターには、λファージＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｈｏＡプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、ＰＧＫＩプロモーター、ＧＡＬＩプロモーター、ＧＡＬＩＯ遺伝子プロモーター、ＣＹＣｉプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＴＲＰＩプロモーター、ＡＤＨＩプロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ホルグリムアルデヒド（ｆｏｒｇｌｙｍａｌｄｅｈｙｄｅ）リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキソキナーゼプロモーター、ピルビン酸デカルボキシラーゼプロモーター、ホスホフルクロキナーゼプロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、ホスホグルコースイソメラーゼプロモーター、グルコキナーゼα接合因子フェロモンプロモーター、ＰＲＢＩプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤＩプロモーター、メタロチオネインプロモーター、および／またはアデノウイルスおよびワクシニアウイルス由来などの哺乳動物ウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。他のプロモーターが当業者に公知である。
【００８４】
（ＩＩ．ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム配列）
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ機構を示す核酸配列（図１、表９）も提供する。配列番号１０〜２８は、それぞれエクソン１、４〜１１、１１ａ、１２、１２ａ、１３〜１５、１５ａ、および１６〜１８を示す。エクソン１１ａ、１２ａ、および１５ａは、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの一定の変異転写物で保持される潜在的エクソンである。配列番号２９〜４５は、エクソン１とエクソン４との間のイントロン配列（以後それぞれイントロン１ａおよびイントロン１ｂ）、４〜１５、１５ａ、１６、および１７を示す。イントロン１５ａは、潜在的エクソン１５ａに続くイントロン１５の３’下流部分である。配列番号９は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の５’非翻訳領域を示す。ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を示す核酸配列（表１０、配列番号４６）も提供する。さらに、５’ＵＴＲ、エクソン１、およびエクソン１とエクソン４との間に存在するイントロン配列の一部（イントロン１ａ）を含む５’連続ゲノム配列を示す連続ゲノム配列（配列番号４７、表１１）を提供する。エクソン１とエクソン４からエクソン１８との間に存在するイントロン配列（イントロン１ｂ）を含む連続ゲノム配列（配列番号４８、表１２）も提供する。配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。さらに、配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、５０００、または１０，０００個の連続ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含むヌクレオチド配列およびペプチド配列ならびにこれらと少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同な任意のヌクレオチド配列も提供する。配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０のフラグメント、誘導体、およびアナログをさらに提供する。配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０のフラグメントには、任意の連続核酸配列もしくはペプチド配列または少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、１７ｂｐ、２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、５ｋｂｐ、もしくは１０ｋｐｂが含まれ得る。
【００８５】
さらに、ゲノム配列の推定転写因子結合部位の形態の調節領域を同定した（図４を参照のこと）。これらの結合部位は、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼゲノムの５’ＵＴＲおよびエクソン１に存在し、転写因子（例えば、ＥＴＳＦ、ＭＺＦ１、ＳＦ１、ＣＭＹＢ、ＭＥＦ２、ＴＡＴＡ、ＭＥＦ２、ＮＭＰ４、ＣＡＡＴ、ＡＰ１、ＢＲＮ２、ＳＡＴＢ１、ＡＴＦ、ＧＡＴ１、ＵＳＦ、ＷＨＮ、ＮＭＰ４、ＺＦ５、ＮＦＫＢ、ＺＢＰ８９、ＭＯＫ２、ＺＦ５、ＮＦＹ、およびＭＹＣＭＡＸなど）の結合部位が含まれる。
【００８６】
【表９−１】
【００８７】
【表９−２】
【００８８】
【表９−３】
【００８９】
【表９−４】
【００９０】
【表９−５】
【００９１】
【表９−６】
【００９２】
【表９−７】
【００９３】
【表９−８】
【００９４】
【表９−９】
【００９５】
【表９−１０】
【００９６】
【表９−１１】
【００９７】
【表９−１２】
【００９８】
【表９−１３】
【００９９】
【表９−１４】
【０１００】
【表９−１５】
【０１０１】
【表９−１６】
【０１０２】
【表９−１７】
【０１０３】
【表９−１８】
【０１０４】
【表９−１９】
【０１０５】
【表９−２０】
【０１０６】
【表９−２１】
【０１０７】
【表９−２２】
【０１０８】
【表９−２３】
【０１０９】
【表９−２４】
【０１１０】
【表９−２５】
【０１１１】
【表９−２６】
【０１１２】
【表９−２７】
【０１１３】
【表９−２８】
【０１１４】
【表１０−１】
【０１１５】
【表１０−２】
【０１１６】
【表１０−３】
【０１１７】
【表１０−４】
【０１１８】
【表１０−５】
【０１１９】
【表１０−６】
【０１２０】
【表１０−７】
【０１２１】
【表１０−８】
【０１２２】
【表１０−９】
【０１２３】
【表１０−１０】
【０１２４】
【表１０−１１】
【０１２５】
【表１０−１２】
【０１２６】
【表１０−１３】
【０１２７】
【表１０−１４】
【０１２８】
【表１０−１５】
【０１２９】
【表１０−１６】
【０１３０】
【表１０−１７】
【０１３１】
【表１０−１８】
【０１３２】
【表１０−１９】
【０１３３】
【表１０−２０】
【０１３４】
【表１０−２１】
【０１３５】
【表１０−２２】
【０１３６】
【表１１】
【０１３７】
【表１２−１】
【０１３８】
【表１２−２】
【０１３９】
【表１２−３】
【０１４０】
【表１２−４】
【０１４１】
【表１２−５】
【０１４２】
【表１２−６】
【０１４３】
【表１２−７】
【０１４４】
【表１２−８】
【０１４５】
【表１２−９】
【０１４６】
【表１２−１０】
【０１４７】
【表１２−１１】
【０１４８】
【表１２−１２】
【０１４９】
【表１２−１３】
【０１５０】
【表１２−１４】
【０１５１】
【表１２−１５】
【０１５２】
【表１２−１６】
【０１５３】
【表１２−１７】
【０１５４】
【表１２−１８】
【０１５５】
【表１２−１９】
【０１５６】
【表１２−２０】
【０１５７】
【表１２−２１】
【０１５８】
【表１３−１】
【０１５９】
【表１３−２】
【０１６０】
【表１３−３】
【０１６１】
【表１３−４】
【０１６２】
【表１３−５】
【０１６３】
【表１３−６】
【０１６４】
【表１３−７】
【０１６５】
【表１３−８】
【０１６６】
【表１３−９】
【０１６７】
【表１３−１０】
配列番号４９は、エクソン４に対して５’方向に、エクソン４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７、イントロン７、およびエクソン８を含む連続ゲノム配列を示す（表１３）。さらに、配列番号４９の少なくとも１７５０、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、または２００００個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列ならびに配列番号４９と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列を提供する。
【０１６８】
【表１４−１】
【０１６９】
【表１４−２】
【０１７０】
【表１４−３】
【０１７１】
【表１４−４】
【０１７２】
【表１４−５】
【０１７３】
【表１４−６】
【０１７４】
【表１４−７】
【０１７５】
【表１４−８】
【０１７６】
【表１４−９】
【０１７７】
【表１４−１０】
【０１７８】
【表１４−１１】
【０１７９】
【表１４−１２】
配列番号５０は、エクソン１２、イントロン１２、エクソン１３、イントロン１３、エクソン１４、イントロン１４、エクソン１５、イントロン１５、エクソン１６、イントロン１６、エクソン１７、イントロン１７、およびエクソン１８を含む連続ゲノム配列を示す。さらに、配列番号５０の少なくとも１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、または２０、０００個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列ならびに配列番号５０と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％相同なヌクレオチド配列を提供する。
【０１８０】
（ＶＩＩＩ．オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー）
本発明は、さらに、上記配列（配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０）とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを提供する。配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０ならびにそのフラグメントと相同であり得るオリゴヌクレオチドを提供する。ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０ならびにそのフラグメントとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドも提供する。ストリンジェントな条件は、配列が少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または少なくとも約９８％相同である場合のみハイブリッド形成する条件を記載する。あるいは、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０ならびにそのフラグメントとハイブリッド形成する少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、７５、または１００塩基を有し得る。このようなオリゴヌクレオチドを、本明細書中に提供した配列を検出するためのプライマーおよびプローブとして使用することができる。プローブまたはプライマーは、少なくとも１４ヌクレオチド長であり得るが、好ましい実施形態では、少なくとも１５、２０、２５、２８、３０、または３５ヌクレオチド長である。
【０１８１】
上記配列を考えると、当業者は、標準的なアルゴリズムを使用して、配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０ならびにそのフラグメント中に含まれる配列と相同なオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを構築することができる。相補的対合の規則は周知である：シトシン（「Ｃ」）は常にグアニン（「Ｇ」）と対合し、チミン（「Ｔ」）またはウラシル（「Ｕ」）は常にアデニン（「Ａ」）と対合する。プライマーまたはプローブと十分にハイブリッド形成して対応する相補配列を認識することができる限り、プライマーまたはプローブは標的核酸配列と１００％相補的である必要はないと認識される。一般に、一定の程度の対ミスマッチを許容することができる。
【０１８２】
プライマーのハイブリッド形成領域として使用されるオリゴヌクレオチド配列を、プローブのハイブリッド形成領域として使用することもできる。プローブとして使用するためのプライマー配列の適合性は、プライマーのハイブリッド形成特性に依存する。同様に、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することができる。
【０１８３】
これらの特定の実施形態では、例えば、５’または３’末端のいずれかへの標的配列に相補的であるか標的配列に相補的ではないヌクレオチドの付加によって特定のプライマーおよびプローブを調製することができることが当業者に明らかである。プライマー組成物を標的配列上の伸長開始点として作用する限り、およびプライマーおよびプローブが上記配列番号内に含まれる少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含む限り、このような組成物は本発明の範囲内である。
【０１８４】
本明細書中のプローブおよびプライマーを、考慮すべき要因であるが、排他的でも決定的でもない以下の基準によって選択することができる。プローブおよびプライマーを、配列番号１、３、５、７、９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０ならびにそのフラグメントで同定されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ核酸配列領域から選択する。プローブおよびプライマーは、試験に悪影響を与えると予想される他の遺伝子配列との相同性を欠く。プローブまたはプライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは、そのＤＮＡポリメラーゼの一部はＫｌｅｎｏｗフラグメントと呼ばれる）などの増幅酵素による伸長を妨害することができる増幅核酸中での二次構造形成を欠く。増幅培地中での約１５重量％まで、好ましくは５〜１０重量％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および／または３０〜４０℃の漸増増幅温度の使用によってこれを行うことができる。
【０１８５】
好ましくは、プローブまたはプライマーは、式アデニン（Ａ）＋チミン（Ｔ）＋シトシン（Ｃ）＋グアニン（Ｇ）／シトシン（Ｃ）＋グアニン（Ｇ）によって測定したところ、約５０％のグアニンおよびシトシンヌクレオチドを含むべきである。好ましくは、プローブまたはプライマーは、ハイブリッドの安定性が減少し得るプライマーの３’末端に複数の連続したアデニン残基およびチミン残基を含まない。
【０１８６】
本発明のプローブおよびプライマーは、約１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、または２８ヌクレオチド長（詳細には、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドが含まれる）であり得る。本発明で使用されるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および修飾ヌクレオチド（そのハイブリッド形成特性が本質的に変化しない修飾基を含むイノシンまたはヌクレオチドなど）であり得る。プローブおよびプライマー配列を、本明細書を通して５’末端から３’末端の方向で一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして示す。このようなまたはその相補的形態またはそのＲＮＡ形態（ＴがＵに置換されている）で任意のプローブを使用することができる。
【０１８７】
本発明のプローブおよびプライマーを、対応するヌクレオチド配列を含むインサートを含む組換えプラスミドのクローニング、任意選択的に適切なヌクレアーゼの使用時のクローン化プラスミドからの後者の切断およびその回収（例えば、分子量による分画）によって調製することができる。本発明のプローブおよびプライマーを、例えば、従来のホスホトリエステル法もしくはホスホジエステル法またはその自動化実施形態によって化学合成することも出きる。１つのこのような自動化実施形態では、出発材料としてジエチルホスホラミダイトを使用し、Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−１８６２（１９８１）に記載のように合成することができる。修飾固相上での１つのオリゴヌクレオチド合成方法は、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。生物学的供給源（制限エンドヌクレアーゼ消化物など）から単離したプローブまたはプライマーを使用することも可能である。
【０１８８】
プライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ Ｓ．，Ｎａｉｂｕｎｐｉ Ｇａｋｋａｉ Ｚａｓｓｈｉ．４３（６）：５２７−３２（１９６７））、アルキルホスホロチオエート（Ｍｉｌｌｅｒ Ｐ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８（２３）：５１３４−４３（１９７９）、ペプチド核酸（Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｐ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（５０３７）：１４９７−５００（１９９１）；Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｐ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ−Ａｃｉｄｓ−Ｒｅｓ．２１（２）：１９７−２００（１９９３））、モルホリノ核酸、固定核酸、偽環状オリゴ核酸塩基、２’−０，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸などのヌクレオチドアナログも含み得るか、挿入剤（Ａｓｓｅｌｉｎｅ Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１１）：３２９７−３０１（１９８４））を含み得る。
【０１８９】
所望の特徴を有するプローブおよびプライマーのデザインのために、当業者に公知の以下の有用なガイドラインを適用することができる。ハイブリッド形成反応の範囲および特異性は多数の要因に影響を受け、１つまたは複数のこれらの要因の操作により、特定のプローブの正確な感度および特異性（その標的に完全に相補的であるかどうか）が決定される。本明細書中でさらに説明される種々のアッセイ条件の重要性および影響は、当業者に公知である。
【０１９０】
標的核酸ハイブリッドに対するプローブおよびプライマーの安定性は、アッセイ条件に適合するように選択すべきである。長いＡＴリッチな配列の回避、ＧＣ塩基対でのハイブリッドの終結、および／または適切なＴｍでのプローブのデザインによってこれを行うことができる。プローブの開始点および終点を、その長さおよびＧＣ率によってＴｍが最終アッセイが行われる温度よりも約２〜１０℃高くなるように選択すべきである。Ｇ−Ｃ塩基対がさらなる水素結合によってＡ−Ｔ塩基対と比較して熱安定性が高いので、プローブの塩基組成は有意である。したがって、より高いＧ−Ｃ含量の相補核酸を含むハイブリッド形成は、より高い温度で安定である。プローブデザイン時にプローブが使用されるイオン強度およびインキュベーション温度などの条件も考慮すべきである。反応混合物のイオン強度が増加するにつれてハイブリッド形成が増加し、イオン強度の増加と共にハイブリッドの熱安定性が増加することが公知である。水素結合を破壊するホルムアミド、尿素、ＤＩＶＩＳＯ、およびアルコールなどの化学試薬は、ハイブリッド形成のストリンジェンシーを増加させる。このような試薬による水素結合の不安定化によりＴｍが非常に減少し得る。一般に、所与の二重鎖の融解温度より５℃低い温度で約１０〜５０塩基長の合成オリゴヌクレオチドプローブの最適なハイブリッド形成が起こる。至適温度未満でのインキュベーションによりミスマッチ塩基配列がハイブリッド形成するので、特異性が減少し得る。高ストリンジェンシー条件下のみでハイブリッド形成するプローブを有することが望ましい。高ストリンジェンシー条件下のみで高相補核酸ハイブリッドが形成され、相補性が十分でないハイブリッドは形成されない。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーにより、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間に必要な相補性が決定される。標的核酸と形成されたハイブリッドと非標的核酸と形成されたハイブリッドとの間の安定性の相違を最大にするなどのためにストリンジェンシーの程度を選択する。この場合、１塩基対の変化を検出する必要があり、非常に高いストリンジェンシー条件が必要である。
【０１９１】
標的核酸配列の長さ（したがって、プローブ配列の長さ）も重要であり得る。いくつかの場合、所望のハイブリッド形成特性を有するプローブおよびプライマーが得られる特定の領域由来の種々の位置および長さのいくつかの配列が存在し得る。他の場合、ある配列が１塩基しか異ならない別の配列よりも有意に良好であり得る。
【０１９２】
完全に相補的ではない核酸をハイブリッド形成することが可能であるが、主に完全に相補的な塩基の最も長いストレッチによりハイブリッドの安定性が決定される。異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを使用することができるが、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは約１４塩基長と３０塩基長との間であり、標的核酸配列と完全に相補的な配列で十分なストレッチを有する。
【０１９３】
ハイブリッド形成に対して抑制的である強固な内部構造を形成することが公知の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の領域はあまり好ましくない。同様に、広範な自己相補性を有するプローブは回避すべきである。上記で説明するように、ハイブリッド形成は、水素結合した二本鎖を形成する相補核酸の２つの一本鎖の会合である。２つの鎖のうちの１つの全体または一部がハイブリッドに関与する場合、新規のハイブリッドの形成への関与が低下し得ると予想される。十分な自己相補性が存在する場合、１つのプローブ型の分子内で形成された分子内および分子間ハイブリッドが存在し得る。このような構造を、慎重なプローブデザインによって回避することができる。目的の配列の大部分が一本鎖であるようなプローブのデザインにより、ハイブリッド形成の比率および範囲が非常に増加し得る。この相互作用型を検索するためにコンピュータプログラムを利用可能である。しかし、一定の例では、この相互作用型を回避することができない。
【０１９４】
特異的プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブに特異的な配列を、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ核酸配列を増幅および検出することができるポリメラーゼ連鎖反応で使用することができる。
【０１９５】
（ＩＶ．ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の遺伝子ターゲティング）
遺伝子ターゲティングにより、動物細胞ゲノムの選択的操作が可能である。この技術を使用して、部位特異的様式および正確な様式で特定のＤＮＡ配列をターゲティングおよび修飾することができる。修飾のために異なるＤＮＡ配列型（調節領域、コード領域、および遺伝子間のＤＮＡ領域が含まれる）をターゲティングすることができる。調節領域の例には、プロモーター領域、エンハンサー領域、ターミネーター領域、およびイントロンが含まれる。これらの調節領域の修飾により、遺伝子発現のタイミングおよびレベルを変化させることができる。細胞内のタンパク質を変化、増強、または消失させるためにコード領域を修飾することができる。イントロンおよびエクソンならびに遺伝子間領域は、修飾に適切な標的である。
【０１９６】
ＤＮＡ配列の修飾には、いくつかの型（挿入、欠失、置換、またはその任意の組み合わせが含まれる）が存在し得る。修飾の特定の例は、遺伝子産物の発現を破壊するヌクレオチド配列の部位特異的に相互作用による遺伝子の不活化（すなわち、「ノックアウト」）である。例えば、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の１つの破壊アプローチは、ターゲティングＤＮＡと標的ＤＮＡとの間の相同組換えによって選択マーカーを標的遺伝子のコード領域に挿入することができるように選択マーカーをターゲティングＤＮＡに挿入することである。例えば、図３、１２、および１３を参照のこと。この方法では、例えば、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子配列が破壊され、コードされた酵素が機能しなくなる。
【０１９７】
（相同組換え）
相同組換えによって内因性遺伝子が部位特異的に修飾されるので、ゲノムを新規に変化するように操作することができる。最初の相同組換え工程は、ヘテロ二重鎖ＤＮＡを含む中間体組換え構造を形成するための相補配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ鎖とのＤＮＡ二重鎖の対合を含むＤＮＡ鎖交換である（例えば、Ｒａｄｄｉｎｇ，Ｃ．Ｍ．（１９８２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１６：４０５；米国特許第４，８８８，２７４号を参照のこと）。ヘテロ二重鎖ＤＮＡは、いくつかの形態（１つの相補鎖がＤＮＡ二重鎖に侵入した三重鎖形態を含む３つのＤＮＡ鎖が含まれる）を取ることができ（Ｈｓｉｅｈら，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ４：１９５１（１９９０）；Ｒａｏら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：２９８４））、２つの相補ＤＮＡ鎖がＤＮＡ二重鎖と対合する場合、古典的なＨｏｌｌｉｄａｙ組換え連結構造およびΧ構造（Ｈｏｌｌｉｄａｙ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．５：２８２（１９６４））または二重Ｄループ（“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ Ｌｏｏｐ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．０７／７５５，４６２，ｆｉｌｅｄ Ｓｅｐ．４，１９９１）を形成することができる。一旦形成されると、ヘテロ二重鎖構造を、侵入したＤＮＡ鎖の全部または一部がレシピエントＤＮＡ二重鎖にスプライシングされる鎖の破壊および交換、レシピエントＤＮＡ二重鎖の付加または置換によって解明することができる。あるいは、ヘテロ二重鎖構造によって遺伝子を変換することができ、テンプレートとして侵入鎖を使用したミスマッチ塩基の修復によって侵入鎖の配列がレシピエントＤＮＡ二重鎖に移行される（Ｇｅｎｅｓ，第３版（１９８７）Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｌｏｐｅｚら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５６４３（１９８７））。破壊および再連結機構または遺伝子変換機構のいずれかにより、相同対合連結部でのヘテロ二重鎖ＤＮＡの形成は、あるＤＮＡから別のＤＮＡへの遺伝子配列情報を伝達するように作用することができる。
【０１９８】
ＤＮＡ分子間の遺伝子配列情報を伝達する相同組換え（遺伝子変換および古典的な鎖の破壊／再連結）の能力により、ターゲティングされた相同組換えが遺伝子工学および遺伝子操作における強力な方法となる。
【０１９９】
相同組換えでは、組み込まれるＤＮＡが実質的に相同なＤＮＡ配列を含むゲノム中の部位と相互作用して組み込まれる。非相同性の（「無作為」または「不正の」）組み込みでは、組み込まれるＤＮＡはゲノム中の相同配列で見出されないが、他の場所（多数の潜在的な位置）に組み込まれる。一般に、高等真核細胞を使用した研究によって、相同組換えの頻度は無作為な組み込みの頻度よりもはるかに低いことが明らかとなった。これらの頻度の比は、相同組換えを介した相互作用に依存する「遺伝子ターゲティング」（すなわち、ゲノム中での外因性「ターゲティングＤＮＡ」と対応する「標的ＤＮＡ」との間の組換え）と直接関連する。
【０２００】
多数の論文に哺乳動物細胞における相同組換えの使用が記載されている。これらの論文の例は、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：３１５３−３１５７，１９８４；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら，ＭｏＬ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．５：７１４−７２０，１９８５；Ｓｍｉｔｈｉｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２３４，１９８５；Ｗａｋｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．８：２０８０−２０８９，１９８５；Ａｙａｒｅｓら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１１：３７５−３８８，１９８５；Ａｙａｒｅｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．７：１６５６−１６６２，１９８６；Ｓｏｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６８２０−６８２４，１９８７；ＴｈｏｍａｓらＣｅｌｌ ４４：４１９−４２８，１９８６；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２，１９８７；Ｎａｎｄｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３８４５−３８４９，１９８８；およびＭａｎｓｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２，１９８８；ＥｖａｎｓおよびＫａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９４：１４６−１５４，１９８１；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５７６−５７８，１９８７；ＴｈｏｍａおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２，４９８７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｃｅｌｌ ５６：３１６−３２１，１９８９である。
【０２０１】
本発明は、線維芽細胞などの細胞中でブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化するために相同組換えを使用する。ＤＮＡは、機能的酵素の発現およびＨａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗原分子の産生を防止するために、天然の遺伝子の少なくとも一方、任意選択的には両方のコピーが変化した特定の対立遺伝子に遺伝子の少なくとも一部を含み得る。変化は、挿入、欠失、置換、またはその組み合せであり得る。変化がたった１つの遺伝子のコピーが不活化する導入である場合、標的遺伝子の１つの非変異コピーを有する細胞が増幅され、変化が第１の変化と同一でも異なっていてもよく（通常異なっている）、且つ欠失または置換が含まれる第２のターゲティング工程に供することができ、最初に移入された変化の少なくとも一部が重複し得る。この第２のターゲティング工程では、同一の相同性アームを有するが、異なる哺乳動物選択マーカーを含むターゲティングベクターを使用することができる。得られた形質転換体を、機能的標的抗原の非存在についてスクリーニングし、野生型標的遺伝子の非存在を確認するために細胞のＤＮＡをさらにスクリーニングすることができる。あるいは、変異にヘテロ接合性を示す宿主の交配によって表現型に関するホモ接合性を達成することができる。
【０２０２】
遺伝子操作することができるブタ細胞を、種々の異なる臓器および組織（脳、心臓、肺、腺、脳、目、胃、脾臓、すい臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、鼻、口、唇、歯茎、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、幽門、甲状腺、胸腺、腎上体、骨、軟骨、腱、靭帯、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、副腎、卵巣、輸卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節、およびリンパ管などであるが、これらに限定されない）から得ることができる。本発明の１つの実施形態では、ブタ細胞は、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴ）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋肉細胞、リン酸細胞（□ｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｅｌｌ）、卵丘細胞、上皮細胞、内皮細胞、ランゲルハンス島細胞、血球、血液前駆細胞、骨細胞、骨前駆細胞、神経幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、ケラチノサイト、臍静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、線維芽細胞、肝臓星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クップフェル細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球、白血球、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、有毛細胞、気泡細胞、腎細胞、網膜細胞、桿状体細胞、錐状体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、記憶細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、筋細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、腟上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、尿細管周囲細胞、セルトリ細胞、ルテイン細胞、頸部細胞、子宮内膜細胞、乳房細胞、濾胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、および破骨細胞からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。
【０２０３】
１つの別の実施形態では、胚幹細胞を使用することができる。胚幹細胞株を使用することができるか、胚幹細胞株をブタ動物などの宿主から新たに得ることができる。細胞を、適切な線維芽細胞支持細胞層で成長させるか、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下で成長させることができる。好ましい実施形態では、ブタ細胞は線維芽細胞であり得るが、１つの特定の実施形態では、ブタ細胞は胎児線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、発育中の胎児および成体動物から大量に得ることができので、好ましい体細胞型である。
【０２０４】
これらの細胞を急速な倍加時間で容易に増殖することができ、遺伝子ターゲティング手順で使用するためにクローンで増殖することができる。
【０２０５】
（ターゲティングベクター）
ターゲティングした対立遺伝子でホモ接合性の細胞を、標的対立遺伝子に相同であり、且つマーカー遺伝子を含むＤＮＡの細胞への移入および組み込まれた構築物を含む細胞の選択によって産生することができる。標的対立遺伝子で標的ベクター中の相同ＤＮＡを染色体ＤＮＡで組換える（例えば、図３、１２、および１３を参照のこと）。マーカー遺伝子の両端を、相同ＤＮＡ配列、３’組換えアーム、および５’組換えアームと隣接させることができる（例えば、図１１を参照のこと）。ターゲティンベクターの構築方法は当該分野で記載されており、例えば、Ｄａｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：２５１−２５５，２００２；ＷＯ ００／５１４２４を参照のこと。
【０２０６】
標的対立遺伝子での相同組換えのために種々の構築物を調製することができる。通常、構築物には、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、２ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１０ｋｂｐ、１５ｋｂｐ、２０ｋｂｐ、または５０ｋｂｐの標的対立遺伝子と相同な配列が含まれ得る。配列には、任意のブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の任意の連続配列が含まれ得る（配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０またはその任意の組み合わせもしくはフラグメントの少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、５０００、または１０，０００個の連続ヌクレオチドが含まれる）。配列番号９〜４５、４６、４７、４８、４９、および５０のフラグメントには、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、１７ｂｐ、２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、５ｋｂｐ、または１０ｋｐｂを含む任意の連続核酸配列またはペプチド配列が含まれ得る。
【０２０７】
標的ＤＮＡ配列の相同性の範囲の決定に種々の検討材料（例えば、標的対立遺伝子のサイズ、配列の利用可能性、標的対立遺伝子における二重重複事象の相対的効率、および標的配列の他の配列との類似性など）が関与し得る。
【０２０８】
ターゲティングＤＮＡには、実質的に同質遺伝子のＤＮＡが修飾すべきゲノム中の対応する標的配列での所望の配列修飾物と隣接した配列が含まれ得る。実質的に同質遺伝子の配列は、対応する標的配列（所望の配列修飾を除く）を少なくとも約９５％、９７〜９８％、９９．０〜９９．５％、９９．６〜９９．９％、または１００％同一であり得る。ターゲティングＤＮＡおよび標的ＤＮＡは、好ましくは、１００％同一である少なくとも７５、１５０、または５００塩基対のＤＮＡストレッチを共有することができる。したがって、ターゲティングＤＮＡは、ターゲティングされる細胞株と密接に関連する細胞に由来し得るか、ターゲティングＤＮＡはターゲティングされる細胞と同一の細胞株または動物の細胞に由来し得る。
【０２０９】
内因性標的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼを修飾するようにＤＮＡ構築物をデザインすることができる。構築物のターゲティングのための相同配列は、得られる遺伝子産物の機能を破壊するようにデザインされた１つまたは複数の欠失、挿入、置換、またはその組み合わせを有し得る。１つの実施形態では、変化は、読み取り枠中で標的遺伝子の上流配列と融合した選択マーカー遺伝子の挿入であり得る。
【０２１０】
適切な選択マーカーには、ｔｋ遺伝子（チミジンキナーゼ）などの一定の培地基質で成長する能力を付与する遺伝子またはＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）で成長する能力を付与するｈｐｒｔ遺伝子（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）；ＭＡＸ培地（ミコフェノール酸）で成長させる細菌ｇｐｔ遺伝子（グアニン／キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｓｏｎｇ，Ｋ−Ｙ．らＰｒｏｃ．Ｎｅｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：６８２０−６８２４（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），Ｃｈａｐｔｅｒ １６を参照のこと。選択マーカーの他の例には、抗生物質などの化合物に体する耐性を付与する遺伝子、選択された基質で成長する能力を付与する遺伝子、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）などの発光物質などの検出可能なシグナルを発するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。広範な種々のこのようなマーカーが公知且つ利用可能であり、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．，およびＰ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））；およびハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：６８９５−６９１１（１９８３），およびＴｅ Ｒｉｅｌｅ，Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：６４９−６５１（１９９０））などの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。他の選択マーカー遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、およびその誘導体が含まれる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、フォスフィノスリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに耐性を付与する複数の選択マーカーを利用可能である。
【０２１１】
抗生物質耐性遺伝子およびネガティブ選択因子の組み込み方法は、当業者に熟知されている（例えば、ＷＯ ９９／１５６５０；米国特許第６，０８０，５７６号；米国特許第６．１３６，５６６号；Ｎｉｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：３４３−３４９（１９９３）；およびＹｏｓｈｉｄａら，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４：２７７−２８７（１９９５）を参照のこと）。
【０２１２】
本発明で有用なさらなる選択マーカー遺伝子は、例えば、以下の米国特許に記載されている：６，３１９，６６９；６，３１６，１８１；６，３０３，３７３；６，２９１，１７７；６，２８４，５１９；６，２８４，４９６；６，２８０，９３４；６，２７４，３５４；６，２７０，９５８；６，２６８，２０１；６，２６５，５４８；６，２６１，７６０；６，２５５，５５８；６，２５５，０７１；６，２５１，６７７；６，２５１，６０２；６，２５１，５８２；６，２５１，３８４；６，２４８，５５８；６，２４８，５５０；６，２４８，５４３；６，２３２，１０７；６，２２８，６３９；６，２２５，０８２；６，２２１，６１２；６，２１８，１８５；６，２１４，５６７；６，２１４，５６３；６，２１０，９２２；６，２１０，９１０；６，２０３，９８６；６，１９７，９２８；６，１８０，３４３；６，１７２，１８８；６，１５３，４０９；６，１５０，１７６；６，１４６，８２６；６，１４０，１３２；６，１３６，５３９；６，１３６，５３８；６，１３３，４２９；６，１３０，３１３；６，１２４，１２８；６，１１０，７１１；６，０９６，８６５；６，０９６，７１７；６，０９３，８０８；６，０９０，９１９；６，０８３，６９０；６，０７７，７０７；６，０６６，４７６；６，０６０，２４７；６，０５４，３２１；６，０３７，１３３；６，０２７，８８１；６，０２５，１９２；６，０２０，１９２；６，０１３，４４７；６，００１，５５７；５，９９４，０７７；５，９９４，０７１；５，９９３，７７８；５，９８９，８０８；５，９８５，５７７；５，９６８，７７３；５，９６８，７３８；５，９５８，７１３；５，９５２，２３６；５，９４８，８８９；５，９４８，６８１；５，９４２，３８７；５，９３２，４３５；５，９２２，５７６；５，９１９，４４５；および５，９１４，２３３。
【０２１３】
選択マーカーの組み合わせも使用することができる。例えば、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼをターゲティングするために、ｎｅｏ遺伝子（上記で考察のようにそれ自体のプロモーターを含むか含まない）を、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子に相同なＤＮＡ配列にクローン化することができる。マーカーの組み合わせを使用するために、ターゲティングＤＮＡの外側に存在するようにＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をクローン化することができる（所望ならば、別の選択マーカーを反対側に位置づけることができる）。ターゲティングされるべき細胞へのＤＮＡ構築物の移入後、適切な抗生物質に対して細胞を選択することができる。この特定の例では、Ｇ４１８およびガンシクロビルに耐性を示す細胞は、ｎｅｏ遺伝子がＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子に組換えられているが、二重重複領域の外側に存在することによりｔｋ遺伝子が失われている相同組換えによって惹起されている可能性が最も高い。
【０２１４】
欠失は、少なくとも約５０ｂｐ、より通常には少なくとも約１００ｂｐ、一般に、せいぜい約２０ｋｂｐであり得るが、欠失は、通常、少なくとも１つまたは複数のエクソンの一部を含むコード領域の一部、１つまたは複数のイントロンの一部を含むことができ、隣接非コード領域（特に、５’非コード領域（転写調節領域））の一部を含んでいても含んでいなくても良い。したがって、相同領域は、コード領域を超えて５’非コード領域または３’非コード領域に及び得る。挿入は、一般に１０ｋｂｐを超えず、通常５ｋｂｐを超えず、一般に少なくとも５０ｂｐ、より通常には少なくとも２００ｂｐであり得る。
【０２１５】
相同領域には、フレームシフトが起こる場合または鍵となるアミノ酸が変化した場合に標的遺伝子をさらに不活化することができるか、機能障害対立遺伝子などを修正することができる変異が含まれ得る。通常、変異は、約５％を超えない相同隣接配列のわずかな変化であり得る。
【０２１６】
当該分野で公知の方法にしたがって構築物を調製することができ、種々のフラグメントを１つにし、適切なベクターに移入し、クローン化し、分析し、その後所望の構築物を達成するまでさらに操作することができる（例えば、図５〜１１を参照のこと）。制限分析、切り出し、プローブの同定を行うために配列に種々の修飾を行うことができる。所望ならばサイレント変異を移入することができる。種々の段階で、制限分析、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応を使用した増幅、プライマー修復、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発などを使用することができる。
【０２１７】
原核生物複製系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉによって認識可能な供給源）を含む細菌ベクターを使用して構築物を調製することができ、各段階で、構築物をクローン化および分析することができる。標的細胞への移入前に除去することができるマーカー（挿入のために使用されるマーカーと同一または異なる）を使用することができる。一旦構築物を含むベクターが完成すると、細菌配列の欠失、線状化、相同配列への短い欠失の移入などによってさらに操作することができる。最終的操作後、構築物を細胞に移入することができる。
【０２１８】
ＤＮＡ構築物を宿主細胞に侵入させるために使用することができる技術には、リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈、核へのＤＮＡの微量注入、エレクトロポレーション、インタクトな細胞との細菌プロトプラストの融合、トランスフェクション、または当業者に公知の任意の他の技術が含まれる。ＤＮＡは、一本鎖もしくは二本鎖、線状もしくは環状、弛緩もしくはスーパーコイル状のＤＮＡであり得る。哺乳動物細胞の種々のトランスフェクション技術については、例えば、Ｋｅｏｗｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８５，ｐｐ．５２７−５３７（１９９０）を参照のこと。
【０２１９】
本発明は、さらに、上記で広範に記載されている１つまたは複数の配列を含む組換え構築物を含む（例えば、表９〜１２）。構築物は、本発明の配列が正方向または逆方向で挿入されたプラスミドベクターまたはウイルスベクターなどのベクターを含む。構築物は、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターが含まれる）も含み得る。多数の適切なベクターおよびプロモーターは当業者に公知であり、市販されている。例として以下のベクターを提供する：ｐＢｓ、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨｌ８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳｖ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰｖ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍｉａｃｉａ）。また、宿主中で複製可能且つ生存可能な限り、任意の他のプラスミドおよびベクターを使用することができる。当該分野で公知且つ市販されているベクター（およびその変異型または誘導体）を、本発明の方法で使用するために本発明にしたがって１つまたは複数の組換え部位を含むように操作することができる。このようなベクターを、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、およびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓから入手することができる。目的の他のベクターには、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、およびｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、およびｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨＩ １０、およびｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、およびｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）、およびｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ Ａ、Ｂ、およびＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、およびｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏｒｐ．）、ならびにその変異型または誘導体などの真核生物発現ベクターが含まれる。
【０２２０】
本発明での使用に適切な他のベクターには、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファージミド、ＹＡＣ’ｓ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ’ｓ（細菌人工染色体）、ＰＩ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉファージ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（ｑｕａｇａｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０、およびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにその変異型または誘導体が含まれる。レンチウイルスベクター（例えば、ＷＯ ０３／０５９９２３；ＴｉｓｃｏｒｎｉａらＰＮＡＳ１００：１８４４−１８４８（２００３）を参照のこと）などのウイルスベクターを使用することもできる。
【０２２１】
さらなる目的のベクターには、ｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＬＥＸ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＳｅｃＴａｇ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡ０８１５、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺＡ、ｐＰＩＣＺＢ、ｐＰＩＣＺＣ、ｐＧＡＰＺＡ、ｐＧＡＰＺＢ、ｐＧＡＰＺＣ、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ｐＳｉｎＨｉｓ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＶｇＲＸＲ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＹＥＳ２、ｐＺＥｒＯ１．１、ｐＺＥｒＯ−２．１、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＳｅ、ＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ｐＲＥＰ８、ｐＲＥＰ９、ｐＲＥＰ １０、ｐＣＥＰ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＣＲ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ、およびｐＣＲＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；λＥｘＣｅｌｌ、λｇｔｌｌ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−１λＴ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐＳＬ１１８０、ｐＮＥＯ、およびｐＵＣ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＳＣＲＥＥＮ−１ｂ（＋）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、ｐＣＩＴＥ−４ａｂｃ（＋）、ｐＯＣＵＳ−２、ｐＴＡｇ、ｐＥＴ−３２ＬＩＣ、ｐＥＴ−３０ＬＩＣ、ｐＢＡＣ−２ｃｐ ＬＩＣ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、λＳＣＲＥＥＮ−１、λＢｌｕｅＳＴＡＲ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−７ａｂｃ、ｐＥＴ９ａｂｃｄ、ｐＥＴｌｌａｂｃｄ、ｐＥＴ１２ａｂｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７ｂ−ｐＥＴ−１７ｘｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ− ３２ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＢＡＣ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ−１、ｐＢＡＣ４ｘ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ−１、ｐＢＡＣ−３ｃｐ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ、ｐＢＡＣｓｕｒｆ−１、ｐｌｇ、Ｓｉｇｎａｌｐｌｇ、ｐＹＸ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ−Ｎｅｏ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ−Ｈｙｇ、およびＳｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ−Ｇｐｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）；ｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＧＢＴ９、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤ ＧＬ、ｐＧＡＤ ＧＨ、ｐＧＡＤ１０、ｐＧｉｌｄａ、ｐＥＺＭ３、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−Ｎ、ｐＥＧＦＰ−Ｃ、ｐＥＢＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧＦＰ、ｐ６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒａｌ、ｐＳＥＡＰ２−プロモーター、ｐＳＥＡＰ２−エンハンサー、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐβｇａｌ−プロモーター、ｐβｇａｌ−エンハンサー、ｐＣＭＶ、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、ｐＴＫ−Ｈｙｇ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳｉ１ｈｙｇ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＣＡＴ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＬＵＣ、ｐＰＵＲ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＹＥＸ４Ｔ−１／２／３、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＡｃＵＷ３１、ＢａｃＰＡＫ６、ｐＴｒｉｐｌＥｘ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、ｐＷＥ１５、およびλＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ ＋／−、ｐＢｌｕｃｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ ＋／−、ｐＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＢＤ−ＧＡＬ４ Ｃａｍ、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔ、Ｌａｍｂｄａ ＦＩＸ ＩＩ、Ｌａｍｂｄａ ＤＡＳＨ、Ｌａｍｂｄａ ＥＭＢＬ３、Ｌａｍｂｄａ ＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣｏｓ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｇｔ Ａｍｐ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｄｉｒｅｃｔ ｐＢＳ ＋／−、ｐＢＣ ＫＳ ＋／−、ｐＢＣ ５Ｋ ＋／−、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＣＡＬ−ｎ、ｐＣＡＬ−ｃ、ｐＣＡＬ−ｋｃ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−１１ａｂｃｄ、ｐＳＰＵＴＫ、ｐＥＳＰ−Ｉ、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ、ｐＯＰＩ３ ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、ｐＭＣ１ｎｅｏ Ｐｏｌｙ Ａ、ｐＯＧ４４、ｐＯＧ４５、ｐＦＲＴβＧＡＬ、ｐＮＥＯβＧＡＬ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、およびｐＲＳ４１６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が含まれる。
【０２２２】
さらなるベクターには、例えば、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤＩ−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＯＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ．、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳＴｒｐ、およびその変異型または誘導体が含まれる。
【０２２３】
また、宿主中で複製可能且つ生存可能である限り、当該分野で公知の任意の他のプラスミドおよびベクターを使用することができる。
【０２２４】
（相同組換えされた細胞の選択）
次いで、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の発現をノックアウトするために相同組換えを行った細胞を、適切に組み込まれた細胞を同定するために適切に選択された培地中で成長させることができる。次いで、所望の表現型を示す細胞を、制限分析、エレクトロポレーション、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応、または当該分野で公知の別の技術によってさらに分析することができる。標的遺伝子部位で適切な挿入を示すフラグメントの同定によって、標的遺伝子を不活化するか修飾するために相同組換えを行った細胞を同定することができる。
【０２２５】
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子に挿入した選択マーカー遺伝子の存在により、宿主ゲノムへの標的構築物の組み込みが確立される。次いで、所望の表現型を示す細胞を、制限分析、エレクトロポレーション、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応、モノクローナル抗体アッセイ、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）、または相同または非相同組換えが起こるかどうかを確立するためにＤＮＡを分析するための当該分野で公知の任意の他の技術もしくは方法によってさらに分析することができる。挿入のためのプローブの使用およびその後の構築物の隣接領域を超えて及ぶＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の存在のためのインサートに隣接する５’領域および３’領域の配列決定または欠失が組み込まれている場合の欠失の存在の同定によってこれを決定することができる。構築物内の配列に相補的であり、且つ構築物の外側および標的対立遺伝子の配列と相補的であるプライマーを使用することもできる。この方法では、相同組換えが起こった場合に相補鎖中に存在する両プライマーを有するＤＮＡ二重鎖のみを得ることができる。プライマー配列または予想されるサイズの配列の存在の証明によって、相同組換えの発生が支持される。
【０２２６】
相同組換え事象のスクリーニングのために使用されるポリメラーゼ連鎖反応は、例えば、ＫｉｍおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８８８７−８９０３，１９８８；およびＪｏｙｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６，１９８９に記載されている。
【０２２７】
相同組換え事象の別のスクリーニング方法には、例えば、Ｍａｌｙｋｈら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８０，４８−５８（２００１），Ｍａｌｙｋｈら，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１５，８８５−８９３（１９９８）に記載のブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼおよび／またはＮｅｕ５Ｇｃに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用が含まれる。
【０２２８】
相同組換え事象による機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ発現を欠くブタ細胞のさらなる特徴づけには、サザン分析、ノーザンブロット分析、特異的レクチン結合アッセイ、および／または配列分析、例えば、Ｙ．Ｍａｌｙｋｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３７０：６０１−６０７（２００３）；Ｙ．ＭａｌｙｋｈらＥｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８０：４８−５８（２００１）；Ｙ．ＭａｌｙｋｈらＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１５：８８５−８９３（１９９８）に記載の抗Ｎｅｕ５Ｇｃまたは抗ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ抗体アッセイの使用が含まれるが、これらに限定されない。一般に、Ａ．ＳｈａｒｍａらＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７５（４）：４３０−４３６（２００３）を参照のこと。
【０２２９】
第１ラウンドのターゲティングから得た細胞株は、ターゲティングされた対立遺伝子とヘテロ接合性である可能性がある。両対立遺伝子が修飾されたホモ接合性を多数の方法で達成することができる。１つのアプローチは、１つのコピーが修飾された多数の細胞を成長させ、その後これらの細胞を異なる選択マーカーを使用して残存するブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ対立遺伝子の別ラウンドのターゲティングに供することである。あるいは、伝統的なメンデルの遺伝的特徴にしたがった修飾対立遺伝子に対してヘテロ接合性の動物の交配によってホモ接合体を得ることができる。いくつかの状況では、２つの異なる修飾対立遺伝子を有することが望ましい。連続ラウンドの遺伝子ターゲティングまたはヘテロ接合体（それぞれ１つの所望の修飾対立遺伝子を保有する）の交配によってこれを行うことができる。
【０２３０】
（ＶＩＩＩ．異種移植の免疫学的障壁を克服するためのさらなる遺伝子の遺伝子操作）
本発明の１つの態様では、非機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子に対してホモ接合性の細胞を、さらなる遺伝子操作に供することができる。例えば、宿主に異なる遺伝子の能力を置換、交換、または提供するために、内因性ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ対立遺伝子が非機能的になっているホモ接合性宿主にさらなる遺伝子の能力を移入することができる。同系遺伝子接合体化（ｈｏｍｏｇｅｎｏｔｉｚａｔｉｏｎ）後にマーカー遺伝子を除去することができる。場合によって拡大された配列を有し、元の構築物のマーカー遺伝子部分が欠失された実質的に相同なＤＮＡを含む構築物の移入により、標的対立遺伝子との相同組換えを得ることができる。組み込みのためのマーカー遺伝子の組み合わせの使用により、ポジティブ選択および他のネガティブ選択を行い、除去工程でマーカー遺伝子が保持された細胞を選択することができる。
【０２３１】
１つの実施形態では、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子およびα（１，３）ＧＴ遺伝子を欠くブタ細胞を提供する。本発明にしたがって機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼを欠く動物を産生し、その後この動物由来の細胞を使用してα（１，３）ＧＴ遺伝子をノックアウトすることができる。ホモ接合性α（１，３）ＧＴネガティブブタが最近報告されている（Ｐｈｅｌｐｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３；ＷＯ ０４／０２８２４３）。あるいは、これらのα（１，３）ＧＴノックアウト動物由来の細胞を使用して、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化するようにさらに修飾することができる。
【０２３２】
別の実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠き、且つヒト補体阻害タンパク質を産生するブタ細胞も提供する。本発明にしたがって機能的ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く動物を産生し、この動物由来の細胞をヒト補体阻害タンパク質（ＣＤ５９（Ｐｈｉｌｂｒｉｃｋ，Ｗ．Ｍ．ら（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：８７−９２で報告されたｃＤＮＡ）、ヒト崩壊促進因子（ｈｕｍａｎ ｄｅｃａｙ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（ＤＡＦ）（Ｍｅｄｏｆら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２００７で報告されたｃＤＮＡ）、およびヒト膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）（Ｌｕｂｌｉｎ，Ｄ．ら（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１８１−１９４で報告されたｃＤＮＡ）などであるが、これらに限定されない）を発現するようにさらに修飾することができる。
【０２３３】
別の実施形態では、ヒト補体阻害タンパク質を産生するトランスジェニックブタ由来の細胞を使用して、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化するようにさらに修飾することができる。ヒト補体阻害タンパク質を産生するトランスジェニックブタは当該分野で公知である（例えば、米国特許第６，１６６，２８８号を参照のこと）。
【０２３４】
さらなる実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子およびブタＦｏｒｓｓｍａｎシンターゼ（ＦＳＭ）遺伝子を欠くブタ細胞を提供する。本発明にしたがって機能的ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く動物を産生し、その後この動物由来の細胞を、ｇａｌ−α−ｇａｌエピトープの産生に関与し、且つ異種移植拒絶で役割を果たすブタＦＳＭシンターゼ遺伝子をノックアウトするためにさらに修飾することができる。ブタＦＳＭシンターゼ遺伝子は最近同定された（米国特許出願６０／５６８，９２２号を参照のこと）。あるいは、これらのＦＳＭシンターゼ遺伝子ノックアウト動物由来の細胞を使用して、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化するようにさらに修飾することができる。
【０２３５】
なおさらなる実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子およびブタイソグロボシド（ｉｓｏｇｌｏｂｏｓｉｄｅ）３シンターゼ遺伝子を欠くブタ細胞を提供する。本発明にしたがって機能的ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く動物を産生し、その後この動物由来の細胞を、ブタｉＧｂ３シンターゼ遺伝子をノックアウトするために使用することができる。ブタｉＧｂ３シンターゼ遺伝子は最近報告されている（米国特許出願第６０／５１７，５２４号）。あるいは、これらのブタｉＧｂ３シンターゼ遺伝子ノックアウト動物由来の細胞を使用して、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化するようにさらに修飾することができる。
【０２３６】
別の実施形態では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子、α（１，３）ＧＴ遺伝子、ＦＳＭシンターゼ遺伝子、およびブタｉＧｂ３シンターゼ遺伝子を欠くブタ細胞を提供する。本発明にしたがって機能的ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く動物を産生し、その後この動物由来の細胞を、α（１，３）ＧＴ遺伝子、ＦＳＭシンターゼ遺伝子、およびブタｉＧｂ３シンターゼ遺伝子をノックアウトするために使用することができる。ホモ接合性α（１，３）ＧＴネガティブブタは最近報告されている（Ｐｈｅｌｐｓらｓｕｐｒａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３；ＷＯ ０４／０２８２４３）。あるいは、これらのα（１，３）ＧＴノックアウト動物由来の細胞を使用して、ブタｉＧｂ３シンターゼ遺伝子、ブタＦＳＭシンターゼ遺伝子、およびＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化し、さらに、ヒト補チア阻害タンパク質（ＣＤ５９、ヒト崩壊促進因子（ＤＡＦ）、およびヒト膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）などが含まれるが、これらに限定されない）を発現するようにさらに修飾することができる。
【０２３７】
（ＶＩＩＩ．遺伝子操作動物の産生）
本発明は、ブタ全能性幹細胞の遺伝子操作によるＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ発現を欠くトランスジェニックブタの産生方法を提供する。１つの実施形態では、（ａ）動物中の１つまたは複数の標的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ核酸ゲノム配列の同定、（ｂ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ核酸ゲノム配列をターゲティングする１つまたは複数の相同組換えベクターの調製、（ｃ）動物の複数の全能性細胞のゲノムへの１つまたは複数のターゲティングベクターの挿入およびそれによる複数のトランスジェニック全能性細胞の産生、（ｄ）動物の四倍体胚盤胞を得ること、（ｅ）四倍体胚盤胞への複数の全能性細胞の挿入およびそれによるトランスジェニック胚の産生、（ｆ）レシピエント雌動物への胚の導入、および（ｇ）雌動物中で胚を成長させて出産させることによって動物を産生することができる。トランスジェニックブタを作製するための本明細書中に記載のトランスジェニック動物の産生方法は、一般に、米国特許第６，４９２，５７５号に記載されている。
【０２３８】
別の実施形態では、全能性細胞は、胚幹（ＥＳ）細胞であり得る。胚盤胞からのＥＳ細胞の単離、ＥＳ細胞株の確立、およびその後のその培養を、例えば、Ｄｏｅｔｃｈｍａｎｎら，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．８７：２７−４５（１９８５）；Ｌｉら，Ｃｅｌｌ ６９：９１５−９２６（１９９２）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．“Ｔｅｔｒａｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８７）；ＷｕｒｓｔおよびＪｏｙｎｅｒ，”Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９３）；Ｈｏｇｅｎら，“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”Ｈｏｇａｎ，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＣｏｓｔａｎｔｉｎｉおよびＬａｃｙ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）；およびＷａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：７４１−７４４（１９９２）に記載の従来の方法によって行う。例えば、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を変化させるためのターゲティングベクターでの胚幹細胞の形質転換後、細胞を適切な培地（例えば、ウシ胎児血清増強ＤＭＥＭなど）中の支持細胞層にプレートすることができる。構築物を含む細胞を、選択培地の使用によって検出することができ、十分なコロニー成長期間後、コロニーを選別し、相同組換えの発生について分析することができる。構築物の配列内および配列外であるが標的対立遺伝子に存在するプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応を使用することができる。次いで、相同組換えを示すコロニーを、胚操作および胚盤胞注射のために使用することができる。胚盤胞を、過剰排卵雌から得ることができる。次いで、胚幹細胞をトリプシン処理し、修飾細胞を胚盤胞を含む液滴に添加することができる。少なくとも１つの修飾胚幹細胞を、胚盤胞の胞胚腔に注射することができる。注射後、少なくとも１つの胚盤胞を、偽妊娠雌の各子宮角に戻すことができる。次いで、雌を出産させ、得られた同腹子を構築物を含む変異細胞についてスクリーニングした。形質転換ＥＳ細胞と異なる比率の胚盤胞を選択する。胚盤胞およびＥＳ細胞の異なる表現型の提供により、キメラ子孫を容易に検出することができ、次いで、修飾ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の存在を探索するために遺伝子型同定を行うことができる。
【０２３９】
本発明のさらなる実施形態では、全能性細胞は、胚生殖（ＥＧ）細胞であり得る。胚生殖細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養およびトランスフェクトすることができ、その後にキメラの体細胞系列および生殖細胞系列に寄与する、ＥＳ細胞と機能的に等価な未分化の細胞である（Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６１：６２６−６２８（１９９４））。ＥＧ細胞は、成長因子（白血病抑制因子、スチール因子（ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ）、塩基性線維芽細胞成長因子）と組み合わせた始原生殖細胞（配偶子の先祖）の培養によって誘導される（Ｍａｔｓｕｉら，Ｃｅｌｌ ７０：８４１−８４７（１９９２）；Ｒｅｓｎｉｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：５５０−５５１（１９９２））。Ｄｏｎｏｖａｎら，“Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ，”Ｌ．Ｍ．Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ編，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９７）などに記載の当業者に公知の方法を使用して、ＥＧ細胞を培養することができる。
【０２４０】
例えば、Ｊａｍｅｓら，Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．Ｃａｍｂ．６０：１８５−１９４（１９９２）；ＮａｇｙおよびＲｏｓｓａｎｔ，“Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９３）；またはＫｕｂｉａｋおよびＴａｒｋｏｗｓｋｉ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５７：５６１−５６６（１９８５）に記載の天然の接合子の産生および発生または２つの細胞胚の電気融合およびその後の培養によって本発明で使用するための四倍体胚盤胞を得ることができる。
【０２４１】
例えば、Ｗａｎｇら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２４３７−２４５０（１９９１）に記載の当該分野で公知の任意の方法によって、胚盤胞へのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の移入を行うことができる。
【０２４２】
「複数」の全能性細胞は、１つを超える任意の数の細胞を含み得る。例えば、本発明で使用される全能性細胞数は、約２〜約３０細胞、約５〜約２０細胞、または約５〜約１０細胞であり得る。１つの実施形態では、１つの細胞懸濁液から採取した約５〜１０個のＥＳ細胞を、顕微操作装置中の保持ピペットによって固定された胚盤胞に注射する。次いで、当該分野で公知の方法（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．“Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８７）を参照のこと）によって、胚を少なくとも３時間（場合により一晩）インキュベート後、雌レシピエント動物に移入する。次いで、雌動物中で胚を成長させて出産させることができる。
【０２４３】
（クローン化トランスジェニック子孫を産生するための体細胞核導入）
本発明は、体細胞核導入による機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を欠くブタのクローニング方法を提供する。一般に、広範な種々の哺乳動物クローニング方法が現在急速に開発および報告されており、所望の結果を達成する任意の方法を本発明で使用することができる。このような方法の非限定的な例を以下に記載する。例えば、ドナー核の供給源として使用すべき所望の分化ブタ細胞を得る工程と、ブタから卵母細胞を得る工程と、卵母細胞を除核する工程と、除核卵母細胞に所望の分化細胞または細胞核を導入する工程と（例えば、ＮＴ単位を形成するための融合または注射による）、得られたＮＴ単位を活性化する工程と、ＮＴ単位が胎児に成長するように宿主ブタに培養したＮＴ単位を導入する工程とを含む核導入プロセスによってブタを産生することができる。
【０２４４】
核導入技術または核移植技術は当該分野で公知である（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４３：１８１（１９９５）；Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）；Ｋｅｅｆｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）；Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：６１４３−６１４７（１９９３）；ＷＯ ９４／２６８８４；ＷＯ ９４／２４２７４，ＷＯ ９０／０３４３２，米国特許第４，９４４，３８４号および同第５，０５７，４２０号）。１つの非限定的な例では、除核卵母細胞への挿入前にドナー染色体またはドナー細胞が再プログラミングされた哺乳動物のクローニング方法を記載したＣｏｌｌａｓらの米国特許出願番号２００３／００４６７２２号などに記載の方法などの方法を提供する。本発明は、染色体、核、または細胞の卵母細胞の挿入または融合方法も記載する。
【０２４５】
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を変化させるように修飾したドナー細胞核を、レシピエントブタ卵母細胞に導入する。この方法の使用は、特定のドナー細胞型に制限されない。ドナー細胞は、Ｗｉｌｍｕｔら，Ｎａｔｕｒｅ ３８５ ８１０（１９９７）；Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ ３８０ ６４−６６（１９９６）；またはＣｉｂｅｌｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０ １２５６−１２５８（１９９８）などに記載のものであり得る。正常な核型の全細胞（核導入で首尾よく使用することができる胚細胞、胎児および成体の体細胞が含まれる）を、原理上は使用することができる。胎児線維芽細胞は、特に有用なドナー細胞クラスである。一般に適切な核導入方法は、Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ４３ １８１（１９９５），Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３８ ２６４−２６７（１９９４），Ｋｅｅｆｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５０ ９３５−９３９（１９９４），Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６１４３−６１４７（１９９３），ＷＯ−Ａ−９４２６８８４，ＷＯ−Ａ−９４２４２７４，ＷＯ−Ａ−９８０７８４１，ＷＯ−Ａ−９００３４３２，米国特許第４，９９４，３８４号および同第５，０５７，４２０号に記載されている。分化または少なくとも部分的に分化したドナー細胞も使用することができる。ドナー細胞は培養中および静止期でもあり得るが、必ずしもそうではない。休止期の核ドナー細胞は、静止期に入るように誘導されるかｉｎ ｖｉｖｏで休止状態で存在し得る細胞である。先行技術の方法は、クローニング手順で胚細胞型も使用している（Ｃａｍｐｂｅｌｌら（Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８，１９９６）およびＳｔｉｃｅら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２０ ５４：１００−１１０，１９９６）。
【０２４６】
体細胞核ドナー細胞を、種々の異なる臓器および組織（皮膚、間葉、肺、膵臓、心臓、腸、胃、膀胱、血管、腎臓、尿道、生殖器、および胚、胎児、または成体動物の全部または一部の脱凝集調製物）から得ることができる。本発明の適切な実施形態では、核ドナー細胞は、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴ）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋細胞、グラヌロース細胞、卵丘細胞、上皮細胞、または内皮細胞からなる群から選択される。別の実施形態では、核細胞は、胚幹細胞である。好ましい実施形態では、ドナー細胞として線維芽細胞を使用することができる。
【０２４７】
本発明の別の実施形態では、本発明の核ドナー細胞は、動物の生殖細胞である。胚、胎児、または成体期の動物種の任意の生殖細胞を、核ドナー細胞として使用することができる。適切な実施形態では、核ドナー細胞は胚生殖細胞である。
【０２４８】
受容細胞との連携を確実にするために、細胞周期の任意の時期（ＧＯ、ＧＩ、Ｇ２、Ｓ、Ｍ）で核ドナー細胞を停止することができる。当該分野で公知の任意の方法を使用して、細胞周期を操作することができる。細胞周期を制御する方法には、培養細胞の接触阻害によって誘導されたＧＯ期静止、血清または他の必須栄養素の除去によって誘導されたＧＯ期静止、老化によって誘導されたＧＯ期静止、特定の成長因子の添加によって誘導されたＧＯ期静止、熱ショック、高圧、もしくは化学物質、ホルモン、成長因子、もしくは他の物質での他の処理などの物理的もしくは化学的手段によって誘導されたＧＯもしくはＧＩ期静止；任意の複製点手順で妨害する化学物質での処理によるＳ期の制御；蛍光標示式細胞分取、有糸分裂の除去、微小管破壊剤、有糸分裂の進行を破壊する任意の化学物質での処理を使用した選択によるＭ期の制御が含まれるが、これらに限定されない（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ，．“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）も参照のこと）。
【０２４９】
卵母細胞の単離方法は当該分野で周知である。本質的に、これは、ブタの卵巣または生殖器官からの卵母細胞の単離を含み得る。ブタ卵母細胞の容易に利用可能な供給源は、食肉処理場の材料である。遺伝子工学、核導入、およびクローニングなどの技術の組み合わせのために、卵母細胞は遺伝学的に成熟していなければならず、その後にこれらの細胞を核導入のためのレシピエント細胞として使用することができ、これらの細胞を精子細胞による受精によって胚に発生することができる。このプロセスは、一般に、哺乳動物の卵巣（例えば、食肉処理場で得たウシ卵巣）からの未熟な（第Ｉ減数分裂前期（ｐｒｏｐｈａｓｅ Ｉ））卵母細胞の回収、卵母細胞が第ＩＩ減数分裂中期に達するまで（この場合、ウシ卵母細胞は一般に吸引後１８〜２４時間で起こる）の受精または除核前の成熟培地での卵母細胞の成熟を必要とする。この期間は、「成熟期」として公知である。
【０２５０】
第ＩＩ減数分裂中期の卵母細胞は、レシピエント卵母細胞であり得るが、この段階で卵母細胞は移入された核をそのままで受精精子で処理するために「活性化する」ことができるか、十分に活性化することができると考えられる。ｉｎ ｖｉｖｏで成熟した第ＩＩ減数分裂中期の卵母細胞は、核導入技術で首尾よく使用されている。本質的に第ＩＩ減数分裂中期の卵母細胞を、発情期またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）もしくは類似のホルモンの注射から３５〜４８時間後または３９〜４１時間後に非過剰排卵または過剰排卵ブタのいずれかから外科的に回収することができる。
【０２５１】
約１０〜４０時間、好ましくは約１６〜１８時間の範囲の定期成熟後、卵母細胞を除核することができる。除核前に卵母細胞を除去し、卵丘細胞の除去前に適切な培地（１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含むＨＥＣＭなど）に入れることができる。次いで、裸の卵母細胞を極体についてスクリーニングし、次いで、極体の存在によって決定した選択された第ＩＩ減数分裂中期の卵母細胞を核導入に使用する。除核を以下に示す。
【０２５２】
米国特許第４，９９４，３８４号などに記載の公知の方法によって除核を行うことができる。例えば、第ＩＩ減数分裂中期の卵母細胞を、即時除核のために任意選択的に７．５ｍｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含むＨＥＣＭに入れるか、適切な培地（例えば、ＣＲ１ａａ＋１０％発情期ウシ精子などの胚培養培地）に入れ、その後、好ましくはせいぜい２４時間後、より好ましくは１６〜１８時間後に除核することができる。
【０２５３】
極体および隣接細胞質を除去するために、マイクロピペットを使用した顕微鏡手術で除核することができる。次いで、首尾よく除核された卵母細胞を同定するために、卵母細胞をスクリーニングすることができる。卵母細胞の１つのスクリーニング方法は、卵母細胞を１ｍｇ／ｍｌの３３３４２Ｈｏｅｃｈｓｔ色素を含むＨＥＣＭで染色し、その後に１０秒未満の紫外線照射下で卵母細胞を視覚化することである。次いで、首尾よく除核された卵母細胞を、適切な培養培地（ＣＲ１ａａ＋１０％精子）に入れることができる。
【０２５４】
次いで、除核卵母細胞と同種の１つの哺乳動物細胞を、ＮＴ単位を産生するために使用される除核卵母細胞の卵黄周囲腔に導入することができる。当該分野で公知の方法にしたがって、哺乳動物の細胞および除核卵母細胞を使用してＮＴ単位を産生することができる。例えば、エレクトロポレーションによって細胞を融合することができる。原形質膜の一過性破壊に十分な電気パルスの印加によって電気融合を行う。膜が急速に再形成されるので、原形質膜のこの破壊は非常に短時間である。したがって、２つの隣接する膜の破壊が誘導され、再形成時に脂質二重層が混合する場合、２つの細胞間に小さなチャネルを開けることができる。このような小さな開口部の熱力学的不安定性のために、２つの細胞が１つになるまで拡大する。例えば、Ｐｒａｔｈｅｒらの米国特許第４，９９７，３８４号を参照のこと。種々の電気融合培地（例えば、スクロース、マンニトール、ソルビトール、およびリン酸緩衝化溶液）を使用することができる。融合誘導因子としてＳｅｎｄａｉウイルスを使用して融合を行うこともできる（Ｇｒａｈａｍ，Ｗｉｓｔｅｒ Ｉｎｏｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｎｏｇｒ．，９，１９，１９６９）。また、エレクトロポレーション融合を使用するよりもむしろ核を卵母細胞に直接注射することができる。例えば、ＣｏｌｌａｓおよびＢａｒｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）を参照のこと。融合後、得られた融合ＮＴ単位を、活性化まで適切な培地（例えば、ＣＲ１ａａ培地）に入れる。典型的には、その後短時間で（例えば、２４時間後または約４〜９時間後）活性化を行うことができる。
【０２５５】
所望の結果が達成される任意の方法によってＮＴ単位を活性化することができる。このような方法には、例えば、本質的にＮＴ単位への冷温または実質的に冷温ショックの印加による生物学的温度未満でのＮＴ単位の培養が含まれる。胚が通常曝露される生理学的温度条件と比較して低温である室温でのＮＴ単位の培養によってこれを最も都合良く行うことができる。あるいは、公知の活性化剤の適用によって活性化することができる。例えば、受精時の精子による卵母細胞の貫通は、融合前の卵母細胞を活性化して、核導入後により多数の生存可能な認識および複数の遺伝的に同一のブタが得られることを示した。また、電気的および化学的ショックなどの処理を使用して、融合後にＮＴ胚を活性化することができる。例えば、Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈらの米国特許第５，４９６，７２０号を参照のこと。さらに、卵母細胞中の２価の陽イオンレベルの増加および卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化の減少によって同時または連続的に活性化を行うことができる。一般に、卵母細胞の細胞質への２価の陽イオン（例えば、イオノフォアの形態のマグネシウム、ストロンチウム、バリウム、またはカルシウム）の移入によってこれを行うことができる。２価の陽イオンレベルの他の増加方法には、電気ショック、エタノールでの処理、およびケージ化キレート剤での処理が含まれる。公知の方法（例えば、キナーゼインヒビター（例えば、６−ジメチル−アミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリン、およびスフィンゴシンなどのセリン−トレオニンキナーゼインヒビター）の添加）によってリン酸化を減少させることができる。あるいは、卵母細胞へのリン酸塩（例えば、リン酸塩２Ａおよびリン酸塩２Ｂ）の移入によって細胞タンパク質のリン酸化を阻害することができる。
【０２５６】
次いで、細胞コロニーの作製まで適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ培養培地で活性化ＮＴ単位を培養することができる。胚の培養および成熟に適切な培養培地は、当該分野で周知である。胚の培養および維持に使用することができる公知の培地の例には、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、組織培養培地−１９９（ＴＣＭ−１９９）＋１０％ウシ胎児血清、タイロード−アルブミン−乳酸−ピルビン酸（ＴＡＬＰ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｅａｇｌｅ培地、およびＷｈｉｔｔｅｎ培地が含まれる。
【０２５７】
その後、培養ＮＴ単位を洗浄し、好ましくは適切なコンフルエントの支持細胞層を含むウェルプレート中に含まれる適切な培地に入れることができる。適切な支持細胞層には、例として、線維芽細胞および上皮細胞が含まれる。ＮＴ単位がレシピエント雌への導入に適切なサイズに到達するまで、または細胞コロニーを産生するために使用することができる細胞を得るために、ＮＴ単位を支持細胞層上で培養する。好ましくは、少なくとも約２〜４００個の細胞、より好ましくは約４〜１２８個の細胞、最も好ましくは少なくとも約５０個の細胞までこれらのＮＴ単位を培養することができる。
【０２５８】
次いで、活性化ＮＴ単位を、雌ブタの卵管に導入することができる（胚移植）。１つの実施形態では、雌ブタは、発情期同調レシピエント未経産ブタ（ｇｉｌｔ）であり得る。交配未経産ブタ（ｌａｒｇｅ ｗｈｉｔｅ／Ｄｕｒｏｃ／Ｌａｎｄｒａｃｅ）（２８０〜４８０ｌｂｓ）を使用することができる。未経産ブタを、飼料と混合した１８〜２０ｍｇのＲｅｇｕＭａｔｅ（Ａｌｔｒｅｎｏｇｅｓｔ，Ｈｏｅｃｈｓｔ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ）の経口投与によってレシピエント動物と同調させることができる。Ｒｅｇｕ−Ｍａｔｅを、１４日間連続して与えることができる。次いで、最後のＲｅｇｕ−Ｍａｔｅ処置から約１５０時間後に１０００単位のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ，Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＤＥ）をｉ．ｍ．投与することができる。ｈＣＧ注射から約２２〜２６時間後に胚移植を行うことができる。１つの実施形態では、妊娠出産させて生きた子孫を誕生させることができる。別の実施形態では、早期に出産を終了させて、胚細胞を採取することができる。
【０２５９】
本発明における胚移植方法およびレシピエント動物の管理は、胚移植産業で使用される標準的な手順である。同期導入は、本発明の成功で重要である（すなわち、ＮＴ胚の時期をレシピエント雌の発情周期と同調させる）。例えば、Ｓｉｅｄｅｌ，Ｇ．Ｅ．，Ｊｒ．“Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｗｉｔｈ ｃａｔｔｌｅ”ｉｎ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（１９８１）Ｌ．Ｍａｓｔｒｏｉａｎｎｉ，Ｊｒ．およびＪ．Ｄ．Ｂｉｇｇｅｒｓ編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐａｇｅ ３２３を参照のこと。
【０２６０】
（ＶＩＩＩ．ブタ動物、臓器、組織、細胞、および細胞株）
本発明は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の両対立遺伝子が不活化された生きたブタを提供する。本発明はまた、異種移植に有用なこのようなブタ由来の臓器、組織、および細胞を提供する。
【０２６１】
１つの実施形態では、機能的ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの任意の発現を欠くブタから得たブタ臓器、組織、および／または精製もしくは実質的に純粋な細胞もしくは細胞株を提供する。
【０２６２】
１つの実施形態では、本発明は、異種移植に有用な臓器を提供する。任意のブタ臓器（脳、心臓、肺、腺、脳、目、胃、脾臓、すい臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、鼻、口、唇、歯茎、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、幽門、甲状腺、胸腺、腎上体、骨、軟骨、腱、靭帯、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、副腎、卵巣、輸卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節、およびリンパ管が含まれるが、これらに限定されない）を使用することができる。
【０２６３】
別の実施形態では、本発明は、異種移植に有用な組織を提供する。任意のブタ組織（上皮組織、結合組織、血液組織、骨組織、軟骨組織、筋肉組織、神経組織、腺様組織、脂肪組織、疎性結合組織、骨組織、褐色脂肪組織、海綿状様骨組織、筋肉組織、軟骨細胞（ｃａｒｔａｇｉｎｏｕｓ）、海綿組織、軟骨様組織、クロム親和組織、肉様組織、弾性組織、上皮組織、脂肪組織、軟骨様組織、Ｇａｉｎｇｅｅ組織、膠様組織、肉芽組織、腸関連リンパ組織、ハーラー脈管組織、硬質（ｈａｒｄ）造血組織、未分化組織、間質細胞、被覆組織、島組織、リンパ組織、リンパ様組織、間葉組織、中腎性組織、粘液様結合細胞、多房性脂肪細胞、骨髄組織、軟組織鼻点、造腎細胞、結節組織、骨細胞、造骨組織、類骨組織、根尖周囲組織、細網組織、細毛組織、外科用ゴム敷布、骨格筋組織、平滑筋組織、および皮下組織）を使用することができる。
【０２６４】
さらなる実施形態では、本発明は、機能的α１，３ＧＴの発現を欠くブタ動物由来の細胞および細胞株を提供する。１つの実施形態では、これらの細胞または細胞株を異種移植のために使用することができる。任意のブタ組織または臓器由来の細胞（上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴ）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋細胞、リン酸細胞（□ｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｅｌｌ）、卵丘細胞、上皮細胞；内皮細胞、ランゲルハンス島細胞、膵臓インスリンを分泌する細胞、膵臓α−２細胞、膵臓β細胞、膵臓α−１細胞、血球、血液前駆細胞、骨細胞、骨前駆細胞、ニューロン幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、ケラチノサイト、臍帯静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、微小血管系内皮細胞、線維芽細胞、肝臓星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クップフェル細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球、白血球、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、有毛細胞、気泡細胞、腎細胞、網膜細胞、桿状体細胞、錐状体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、記憶細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、筋細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、腟上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、尿細管周囲細胞、セルトリ細胞、ルテイン細胞、頸部細胞、子宮内膜細胞、乳房細胞、濾胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、ドーパミン作動性細胞、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、胚幹細胞、線維芽細胞、および胎児線維芽細胞が含まれるが、これらに限定されない）を使用することができる。特定の実施形態では、機能的α−１，３−ＧＴ発現を欠くブタ由来の膵臓細胞（ランゲルハンス島細胞、インスリン分泌細胞、４８のα−２細胞、β細胞、α−１細胞が含まれる）を提供する。
【０２６５】
非生存誘導体には、これらの組織誘導体を移植で使用する前に架橋または他の化学的処理によってさらに処理することができる、酵素または化学的処理によって生存細胞を剥ぎ取られた組織が含まれる。好ましい実施形態では、誘導体には、種々の組織（皮膚、泌尿器組織、膀胱組織、または臓器粘膜下組織が含まれる）由来の細胞外基質が含まれる。また、医療機器として心臓弁および他の非生存組織を含むために生存組織を剥ぎ取られた腱、関節、および骨を提供する。
【０２６６】
（治療上の使用）
広範な種々の方法にしたがって宿主に細胞を投与することができる。好ましい投与様式は、非経口、腹腔内、静脈内、皮内、硬膜外、脊髄内、胸骨内、関節内、滑液内、くも膜下腔内、動脈内、心臓内、筋肉内、鼻腔内、皮下、眼窩内、嚢内、局所、経皮パッチ、座剤を含む直腸、膣、もしくは尿道投与、経皮、鼻噴霧、外科用インプラント、内部外科用塗布剤（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｐａｉｎｔ）、注入ポンプ、またはカテーテルである。１つの実施形態では、薬剤およびキャリアを、直接組織注射もしくはボーラス、インプラント、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、またはナノスフェアなどの持続放出処方物で投与する。
【０２６７】
開示の細胞の注入によって治療することができる障害には、正常な血球の産生および成熟の機能障害の不全に起因する疾患（すなわち、再生不良性貧血および低増殖性幹細胞障害）；造血臓器における新生物悪性疾患（例えば、白血病およびリンパ腫）；非造血臓器の広範な悪性固形腫瘍；自己免疫疾患；および遺伝病が含まれるが、これらに限定されない。このような障害には、正常な血球の産生および成熟の不全または機能障害に起因する疾患（超増殖性幹細胞障害）（薬物、照射、または感染による特発性の再生不良性貧血、汎血球減少症、顆粒球減少症、血小板減少症、赤血球欠如症、ブラックファン−ダイヤモンド症候群が含まれる）；造血性悪性腫瘍（急性リンパ芽球性（リンパ球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性悪性脊髄硬化症、多発性骨髄腫、真性多血症、原因不明の骨髄化生、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫が含まれる）；悪性固形腫瘍患者における免疫抑制（悪性黒色腫、胃癌、卵巣癌、乳癌、小細胞肺癌、網膜芽細胞種、睾丸癌、膠芽細胞腫、横紋筋肉腫、神経芽腫、ユーイング肉腫、リンホニア（ｌｙｍｐｈｏｎｉａ）が含まれる）；自己免疫疾患（関節リウマチ、１型糖尿病、慢性肝炎、多発性軟化症、全身性紅斑性狼瘡が含まれる）；遺伝性（先天性）障害（貧血（家族性、再生不良性）、ファンコーニ貧血、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損症、ホルムアミド転移酵素欠損症、レッシ−ナイハン症候群、先天性異常赤血球産生症症候群ＩＩＶ、シバッハマン−ダイヤモンド症候群、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損、ホリナミノ（ｆｏｒｉｎａｍｉｎｏ）転移酵素欠損症、レッシ−ナイハン症候群、先天性球状赤血球症、先天的性楕円赤血球症、先天性ストマトサイト増加症、先天性Ｒｈ陰性疾患、発作性夜間血色素尿症、Ｇ６ＰＤ（グルコースリン酸デヒドロゲナーゼ）変異型１、２、３、ピルビン酸キナーゼ欠損症、先天的性エリトロポイエチン感受性、欠損症、鎌状赤血球症および鎌状赤血球傾向、サラセミアα、β、γ、メトヘモグロビン血症、先天性免疫障害、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ベアリンパ球症候群、イオノフォア応答性複合型免役不全、キャップ形成異常を伴う複合型免疫不全、ヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症、顆粒球アクチン欠損症、乳児顆粒球減少症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、コストマン症候群、細網系異形成、先天性白血球機能障害症候群が含まれる）；その他（骨粗鬆症、脊髄硬化症、後天性溶血性貧血、後天性免疫不全、原発性または続発性免疫不全を発症する感染症、細菌感染（例えば、ブルセラ病、リステリア病、結核、ハンセン病）、寄生虫感染（例えば、マラリア、リーシュマニア症）、真菌感染、加齢によるリンパ系細胞組の不均衡（ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓｉｎ）および免疫機能障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｆｉｍｃｔｉｏｎｓ）を含む障害、貪食細胞障害、コストマン顆粒球減少症、慢性肉芽腫疾患、チェジアック−東症候群、好中球アクチン欠損症、好中球膜ＧＰ−１８０欠損症、代謝性貯蔵病、ムコ多糖沈着症、ムコリピドーシス、免疫機構に関与するその他の障害、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、αランチリプシン（ｌａｎｔｉｒｙｐｓｉｎ）欠損症など）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６８】
疾患または病変には、神経変性疾患、肝臓変性疾患病、腎臓変性疾患、脊髄損傷、頭部の外傷または手術、組織、臓器、または腺の変性を引き起こすウイルス感染などが含まれる。このような神経変性疾患には、ＡＩＤＳ痴呆；脱髄性疾患（多発性軟化症および急性トランスフェラーゼ脊髄炎など）；錐体外路および小脳障害（皮質脊髄系（ｅｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ ｓｙｓｔｅｍ）の損傷など）；大脳基底核障害または小脳障害；ハンティングトン舞踏病と老年舞踏病などの多動性障害；薬物油土迂生運動障害（ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬物によって誘導されるものなど）；低運動性障害（パーキンソン病など）；進行性過剰核形成（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａ−ｎｕｃｌｅｏ ｐａｌｓｙ）；小脳の構造損傷；脊髄小脳変性（脊髄性運動失調、フリートライヒ運動失調）、小脳皮質変性、多系統変性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ、およびＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）、全身性障害（ｓｙｓｔｅｒｍｉｏｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）（Ｒｕｆｓｕｍ疾患など）、βリポタンパク質欠損血症、失調症、毛細血管拡張；ミトコンドリア多システム障害；脱髄性コア障害（多発性軟化症、急性横断脊髄炎など）；運動単位障害（神経原性筋萎縮（前角細胞萎縮（筋萎縮性側索硬化症など）、幼児型脊髄性筋萎縮、および若年性脊髄性筋萎縮）など）；アルツハイマー病；中年のダウン症；びまん性レビー小体病；レビー小体型老人性痴呆；パーキンソン病、ヴェルニッケ−コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト・ヤコブ病；亜急性硬化性汎脳炎、ハレルホルデン−スパッツ疾患；ならびに拳闘家痴呆が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｅｒｋｏｗら（編）（１９８７），Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ（１５’）版），Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ．を参照のこと。
【０２６９】
（産業的飼育での使用）
本発明は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝位の一方または両方の対立遺伝子が不活化された飼育適用を目的とする生きたブタを提供する。ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの一方または両方の対立遺伝子の不活化により、人畜共通疾患、ブタにおける感染症（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ブタロタウイルス、およびブタ伝染性胃腸炎コロナウイルス）、ならびに宿主動物においてＮｅｕ５Ｇｃを使用する任意の他の人畜共通生物または腸管毒素原性生物に対するブタ動物の感受性を減少させることができる。疾患感受性の減少により、より多数の健康な動物の得る能力によって飼育操作がより経済的に実現し、腸管毒素原性生物に起因する動物の死亡が減少する。
【０２７０】
以下の実施例は例示目的で提供し、本発明を決して制限しない。
【実施例】
【０２７１】
（核酸の単離）
ＰＣＲベースの方法の組み合わせストラテジーを使用して、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子を同定した。このようなＰＣＲ方は、当該分野で周知であり、例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８９；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ，およびＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０に記載されている。
【０２７２】
Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して、成体ブタ（グレートヨークシャー種）から総ＲＮＡを抽出した。ＤＮアーゼＩ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）での処理後、ポリＡ＋ＲＮＡを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ精製キット（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用して分離した。ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子の５’末端または３’末端を同定するために、Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、５’または３’−ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な複製）手順を行った。転写物のエクソン−イントロン境界または５’もしくは３’隣接領域を同定するために、ＵｎｉｖｅｒｓａｌＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｅｒライブラリーキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ブタＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（登録商標）ライブラリーを構築した。ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡ５９０５８によって提供された部分的ｃＤＮＡ配列から、遺伝子特異的およびネスト化プライマー対をデザインした。
【０２７３】
（ｃＤＮＡおよびゲノムＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ配列の決定）
５’または３’ＲＡＣＥ分析：ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子構築物の５’末端および３’末端を同定するために、テンプレートとして成体ブタ脾臓から単離したポリＡ＋ＲＮＡと共にＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、５’および３’−ＲＡＣＥ手順を行った。２０ＵのＡＭＶ−ＲＴおよび１ｐｍｏｌの市販のｃＤＮＡ合成プライマーを使用して、４８℃で２時間のインキュベーションによって１μｇのポリＡ＋ＲＮＡから第１の鎖ｃＤＮＡを合成した。第２の鎖ｃＤＮＡ合成は、ＲＮアーゼＨ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＥ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼから構成される市販の酵素カクテルでの１６℃で１．５時間の全第１の鎖の反応を含んでいた。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる二本鎖ｃＤＮＡ末端の平滑末端化後、市販のＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡ Ａｄａｐｔｅｒを、精製された二本鎖ｃＤＮＡのアリコートにライゲーションした。キット中の１０ｍＭ ｔｉｃｍｅ−ＫＯＨ／０．１Ｍ ＥＤＴＡ緩衝液でのアダプターライゲーション産物の希釈により、ＰＣＲ増幅のためのｃＤＮＡを用意した。
【０２７４】
ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子転写物の５’および３’のほとんどの配列を得るために、提供されたＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ増幅プライマー組を、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ５９０５８によって提供された配列に基づいて、遺伝子特異的プライマーおよびネスト化遺伝子特異的プライマーと対合した。これらのプライマー組を、表１３に示す。この方法により、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ５９０５８中に含まれる配列に基づいたオリゴヌクレオチドプライマーを、３’方向および５’方向に配向させ、これを使用して重複ＰＣＲフラグメントを作製する。これらの重複３’および５’産物を組み合わせて、インタクトな全長ｃＤＮＡを産生する。この方法は、例えば、Ｉｎｎｉｓら，ｓｕｐｒａ；およびＦｒｏｈｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：８９９８，１９８８に記載されており、さらに、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されている。
【０２７５】
ゲノムウォーキング分析：ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ転写物のエクソン−イントロン境界または５’もしくは３’隣接領域を同定するために、ＵｎｉｖｅｒｓａｌＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（登録商標）ライブラリーキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、ブタＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（登録商標）ライブラリーを構築した。
【０２７６】
簡単に述べれば、ブタゲノムＤＮＡの５つのアリコートを、１平滑末端切断制限エンドヌクレアーゼ（Ｄｒａｌ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕｌＩ、ＳｃａＩ、またはＳｔｕＩ）で個別に消化した。フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、および制限消化フラグメントの再懸濁後、各消化アリコートの一部を、キット中にＧｅｎｏｍｕＷａｌｋｅｒアダプターとの個別のライゲーション反応で使用した。このプロセスにより、ＰＣＲベースのクローニングストラテジーで使用するための５つのライブラリーが作製された。表１３で同定したプライマー対を、ゲノムウォーキングストラテジーで使用した。ｅＬＯＮ−ＧａｓｅまたはＴａＫａＲａ ＬＡＴａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）酵素のいずれかを、全ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ実験およびゲノムＤＮＡの直接長（ｄｉｒｅｃｔ ｌｏｎｇ）ＰＣＲのために使用した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００または９７００サーモサイクラーによる全ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ実験で、製造者が推奨する熱サイクリング条件を使用した。
【０２７７】
【表１５】
増幅産物のサブクローニングおよび配列決定：ゲノムＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物、、ＧｅｎｅＷａｌｋｅｒ−ＰＣＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、および５’−３’−ＲＡＣＥを、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してゲル精製し、必要に応じて、Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中のｐＣＲＩＩベクターにサブクローン化した。ｐＣＲＩＩライゲーションインサートのプラスミドＤＮＡミニプレップを、説明書にしたがってＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した。ＡＢＩ ３７７自動化配列分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）をＴ７およびＳＰ６プロモータープライマーまたは内部インサート配列からデザインしたプライマーでプライミングしたローダミンまたはＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかと共に使用して、クローン化インサートの自動化蛍光配列決定を行った。
【０２７８】
プライマー合成：他で記載しない限り、種々のＰＣＲベースの方法でプライマーとして使用する全てのオリゴヌクレオチドを、固相合成およびホスホラミダイトヌクレオシド化学を使用したＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を使用して合成した。
【０２７９】
（転写因子結合部位の分析）
エクソン配列の２２８ｂｐおよびエクソン１の６０１ｂｐ上流を使用して、可能な転写因子結合部位の分析を行った。ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅで利用可能な「ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ」ソフトウェアを使用して、配列をスクリーニングした。配列は、以下の転写因子の結合部位を含む：ＭＺＦ１、ＥＴＳＦ、ＳＦ１、ＣＭＹＢ、ＭＥＦ２、ＮＭＰ４、ＢＲＮ２、ＡＰ１、ＧＡＴ１、ＳＡＴＢ１、ＡＴＦ、ＵＳＦ、ＷＨＮ、ＺＦ５、ＮＦκＢ、ＭＯＫ２、ＮＦＹ、ＭＹＣＭＡＸ、ＺＦ５。図４を参照のこと。
【０２８０】
ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ相同組換えターゲティングベクターの構築ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼノックアウト標的ベクター。ノックアウトのためのブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のエクソン６をターゲティングするベクターを構築することができる。第１の工程では、
【０２８１】
【化１】
などのプライマーを使用して、ターゲティングベクターの３’アームとして使用するためのイントロン６部分をＰＣＲによって増幅する（図５を参照のこと）。約３．７ｋｂの増幅されたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩを使用した制限酵素消化後にｐＣＲＩＩベクターに挿入することができる。図６を参照のこと。
【０２８２】
３’アームの挿入後、
【０２８３】
【化２】
などのプライマーを使用して、ターゲティングベクターの５’アームとして使用するためのイントロン５部分をＰＣＲによって増幅することができる（図５を参照のこと）。この最初の増幅後、それぞれ
【０２８４】
【化３】
などのプライマーと組み合わせてｐＤＨ１などのプライマーを使用してＥｃｏＮＩ制限部位を５’アームの３’部分に挿入するために連続的ＰＣＲ増幅を行うことができる（図５を参照のこと）。操作ＥｃｏＮＩ部位を含む約２．６ｋｂの増幅ＰＣＲ産物はＡｐａＩおよびＥｃｏＮＩを使用して消化した制限酵素であり、これを予め挿入した３’アームを含むｐＣＲＩＩベクターに挿入して（図７を参照のこと）、約６．３ｋｂのブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼターゲティング配列を含むターゲティングベクター（ｐＤＨΔｅｘ６）を作製することができる（図８を参照のこと）。
【０２８５】
ＥＧＦＰノックイン標的ベクター。ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のエクソン６の３’末端への増強緑色蛍光タンパク質配列のインフレーム挿入によって、ｐＤＨΔｅｘ６をさらに修飾することができる。第１の工程では、ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のイントロン５部分およびエクソン６部分を、
【０２８６】
【化４】
などのプライマーを使用したＰＣＲによって増幅し（図９を参照のこと）、ＭｕｎＩおよびＥｃｏＲｖでの制限酵素消化後にＥＧＦＰおよびポリＡテールを含むベクター（ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）に挿入することができる。挿入後、
【０２８７】
【化５】
などのプライマーを使用した挿入を含むｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクターでＰＣＲ増幅を行うことができる（図９を参照のこと）。ＰＣＲ増幅産物はＥｃｏＮＩおよびＭｕｎＩを使用して消化した制限酵素であり、これを予め構築したｐＤＨΔｅｘ６ターゲティングベクターに挿入することができる（図１０を参照のこと）。得られたターゲティングベクター（ｐＤＨΔｅｘ６）を図１１に例示する。
【０２８８】
（ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ欠損胎児線維芽細胞の産生）
妊娠３３日の同一妊娠の１０体の胎児から胎児線維芽細胞を単離する。頭部および内蔵の除去後、胎児をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，１ ５ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で洗浄し、２０ｍｌのＨＢＳＳに入れ、小さな手術用鋏でサイコロ状にする。組織をペレット化し、５０ｍｌ試験管中で胎児あたり４０ｍｌのＤＭＥＭおよび１００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼ（ｇｂｃｏ−ＢＲＬ）で再懸濁する。チューブを３７℃の水浴中で撹拌しながら４０分間インキュベートする。消化された組織を３〜４分間静置し、細胞豊富な上清を新たな５０ｍｌチューブに移し、ペレット化する。次いで、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１×非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および２ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを含む４０ｍｌのＤＭＥＭで再懸濁し、１０ｃｍの皿に播種する。トランスフェクションのために、１０μｇの線状化ｐＤＨΔｅｘ６ＥＧＦＰベクターを、製造者のガイドラインにしたがってリポフェクタミン２０００（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して２００万個の細胞に移入する。４８時間のトランスフェクション後、トランスフェクトした細胞を、２，０００細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに播種し、コンフルエンスまで成長させる。コンフルエンス後、細胞を、相同組換えが起こってＥＧＦＰを発現する細胞のみが選択される蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって分取する（例えば、図１３を参照のこと）。
【０２８９】
選択された細胞を、再播種し、コンフルエントまで成長させる。一旦コンフルエンスに到達すると、いくつかの小アリコートをその後の使用のために凍結させ、残りを相同組換えについてのＰＣＲおよびサザンブロットによる検証のために使用する。推定ターゲティングクローンを、ＥＧＦＰに相補的なプライマーおよびアンチセンスプライマーとしてベクターの外側の配列に相補的なプライマーを使用したエクソン６／ＥＧＦＰインサートを介したＰＣＲによってスクリーニングすることができる。ターゲティングされた対立遺伝子由来の推定バンドの存在によってポジティブクローンを同定するために、ＰＣＲ産物を、ＥＧＦＰプローブを使用したサザンブロッティングによって分析することができる。
【０２９０】
（核ドナーとして異種ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ欠損胎児線維芽細胞を使用したクローン化ブタの作製）
核導入のための細胞の調製：一般的に上記のようにブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼにヘテロ接合性を示す細胞を産生するために、ドナー細胞を遺伝子操作する。上記に詳述のように産生した核ドナーとしてＥＧＦＰ選択ブタ線維芽細胞を使用して、当該分野で周知の方法（Ｄａｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：２５１２５５，２００２；およびＰｏｌｅｊａｅｖａら，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：８６−９０，２０００）によって核導入を行うことができる。
【０２９１】
例えば、Ｉ．Ｐｏｌｅｊａｅｖａら，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：５０５（２０００）に記載のように、同期化された過剰排卵する性的に成熟したＬａｒｇｅ−ＷｈｉｔｅＸ Ｌａｎｄａｃｒｅ外部交配未経産ブタから卵母細胞を単離することができる。ドナー細胞を、血清枯渇（０．５％）によって２４時間と１２０時間との間の推定Ｇ０／Ｇ１期に同調させる。例えば、本質的にＡ．Ｃ．Ｂｏｑｕｅｓｔら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ６８：１２８３（２００２）に記載のように、卵母細胞の除核、核導入、電気融合、および電気活性化を行うことができる。再構築した胚を一晩培養し、非同期（−１日）レシピエントの卵管に導入することができる。妊娠を確認し、実時間超音波によってモニタリングすることができる。
【０２９２】
ヘテロ接合性ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ１ノックアウト（ＳＫＯ）雄ブタと雌ブタとの交配を行い、二重ノックアウト（ＤＫＯ）ブタの小集団を確立することができる。
【０２９３】
（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ欠損ブタの検証）
１ノックアウト雄ブタおよび雌ブタの交配後、二重ノックアウトブタの検証を行う。子孫由来の線維芽細胞を、１μｇの抗Ｎ−グリコシルＧＭ２モノクローナル抗体ＭＫ２−３４（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｋｏｇｙｏ，ＪＰ）と氷上で３０分間インキュベートする。ＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧを細胞および結合がＮｅｕ５ＧＣの有無を示す抗体に添加し、それにより活性なＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの有無をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって検出する。
【図面の簡単な説明】
【０２９４】
【図１】ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のゲノム機構を示す。黒塗りのバーは、それぞれ番号をつけたエクソンを示す。エクソン間のイントロンの長さは、相対距離を示す。（白抜きのボックスもいくつかの変異型で認められるエクソンを示す（図２を参照のこと）；「開始」および「終止」は、それぞれ開始コドンおよび終止コドンを示す）。図の下におおよそのスケールを示す。
【図２】ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。変異型１は、エクソン１４および１５の代わりにエクソン１５ａを含む。変異型２はエクソン１２ａを含み、変異型３はエクソン１１ａを含む。「開始」および「終止」は、それぞれ開始コドンおよび終止コドンを示す。
【図３】その対応するゲノム機構と共にターゲティングベクターの４つの非限定的な例を示す。この特定の非限定的な例における選択マーカー遺伝子は、ｅＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）である。ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃｅヒドロキシラーゼ遺伝子を不活化するためにＧＦＰをＤＮＡ構築物に挿入することができる。
【図４】エクソン１（２２８ｂｐ）内に存在する転写因子結合部位および６０１ｂｐにわたるその５’隣接領域を示す。
【図５】ブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子ターゲティングベクターのＤＮＡ構築のために使用することができるオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図６】プライマーｐＤＨ３およびｐＤＨ４を使用したブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子からの３’アームセグメントの産生およびベクター（ｐＣＲＩＩ）へのその挿入を示す略図である。
【図７】プライマーｐＤＨ１およびｐＤＨ２、その後ｐＤＨ２ａ、ｐＤＨ２ｂ、およびｐＤＨ２ｃを使用したブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子からの５’アームセグメントの産生および３’アームが予め挿入されたベクター（ｐＣＲＩＩ）への挿入を示す略図である。
【図８】相同組換えによってブタＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子のエクソン６を欠失するために使用することができるターゲティングベクターを例示する図の非限定的な例である。
【図９】ノックインストラテジーで使用するための増強緑色蛍光タンパク質発現ベクターの作製で使用されるオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図１０】ポリＡシグナルを有するＥＧＦＰフラグメントのターゲティングベクターｐＤＨΔｅｘ６への挿入を例示する図である。
【図１１】ｅＧＦＰ発現のためのノックインベクターを例示する図である。
【図１２】ターゲティングカセットＤＮＡ構築物（ｐＤＨΔｅｘ６）とゲノムＤＮＡとの間でフレームシフトが起こる相同組換えを例示する図である。
【図１３】ターゲティングカセットＤＮＡ構築物（ｐＤＨΔｅｘ６）とゲノムＤＮＡとの間でフレームシフトが起こる相同組換えを例示する図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする単離全長ｃＤＮＡ配列。
【請求項２】
前記配列が配列番号１である、請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項３】
前記配列が配列番号３である、請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項４】
前記配列が配列番号５である、請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項５】
前記配列が配列番号７である、請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項６】
前記配列が配列番号２である、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする単離アミノ酸配列。
【請求項７】
前記配列が配列番号４である、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする単離アミノ酸配列。
【請求項８】
前記配列が配列番号６である、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする単離アミノ酸配列。
【請求項９】
前記配列が配列番号８である、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする単離アミノ酸配列。
【請求項１０】
ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列を含む、核酸構築物。
【請求項１１】
前記ｃＤＮＡが配列番号１である、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
前記ｃＤＮＡが配列番号３である、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１３】
前記ｃＤＮＡが配列番号５である、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１４】
前記ｃＤＮＡが配列番号７である、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１５】
プロモーターをさらに含む、請求項１０〜請求項１５のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１６】
選択マーカーをさらに含む、請求項１０〜請求項１５のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１７】
前記選択マーカーが緑色蛍光タンパク質である、請求項１６に記載の構築物。
【請求項１８】
請求項１０〜請求項１７のいずれか１項に記載の構築物を含む、トランスフェクトされた細胞。
【請求項１９】
ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質を発現する、細胞。
【請求項２０】
前記タンパク質配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択される、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相同な単離ヌクレオチド配列。
【請求項２２】
前記配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも８０％相同である、請求項２１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２３】
前記配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％相同である、請求項２１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２４】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項２５】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成する単離ヌクレオチド配列。
【請求項２６】
ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する、請求項２５に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２７】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２８】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプラスミド。
【請求項２９】
配列番号４６のヌクレオチド配列を含む、単離ヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号４７のヌクレオチド配列を含む、単離ヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号４８のヌクレオチド配列を含む、単離ヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８からなる群から選択される、単離ヌクレオチド配列。
【請求項３３】
配列番号９、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５からなる群から選択される、単離ヌクレオチド配列。
【請求項３４】
請求項３１〜請求項３３のいずれか１項に記載の配列を含む、ベクター。
【請求項３５】
請求項３１〜請求項３３のいずれか１項に記載の配列を含む、核酸構築物。
【請求項３６】
請求項３１〜請求項３３のいずれか１項に記載の配列を含む、プラスミド。
【請求項３７】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５からなる群から選択される配列の少なくとも１７個の連続核酸を含む、核酸構築物。
【請求項３８】
配列番号４７の少なくとも１７個の連続核酸を含む、核酸構築物。
【請求項３９】
配列番号４８の少なくとも２，７５５個の連続核酸を含む、核酸構築物。
【請求項４０】
配列番号４９の少なくとも１，７５０個の連続核酸を含む、核酸構築物。
【請求項４１】
配列番号５０の少なくとも１５０個の連続核酸を含む、核酸構築物。
【請求項４２】
請求項２９〜請求項３３のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列に相同な配列を含む、単離ヌクレオチド。
【請求項４３】
前記配列が請求項２９〜請求項３３のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列に少なくとも８０％相同である、請求項４１に記載のヌクレオチド。
【請求項４４】
前記配列が請求項２９〜請求項３３のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列に少なくとも９０％相同である、請求項２１に記載のヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項２９〜請求項３３のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列とハイブリッド形成する、単離ヌクレオチド。
【請求項４６】
ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する、請求項４５に記載のヌクレオチド。
【請求項４７】
（ａ）配列番号４７に相同な少なくとも１７個の連続核酸を含む第１のヌクレオチド配列と、
（ｂ）選択マーカー遺伝子と、
（ｃ）配列番号４８に相同な少なくとも１７個の連続核酸を含む第２のヌクレオチド配列とを含む、ターゲティングベクター。
【請求項４８】
（ａ）配列番号４８に相同な少なくとも１７個の連続核酸を含む第１のヌクレオチド配列と、
（ｂ）選択マーカー遺伝子と、
（ｃ）配列番号４８に相同な少なくとも１７個の連続核酸を含む第２のヌクレオチド配列とを含み、前記第１および第２のヌクレオチド配列が重複しない、ターゲティングベクター。
【請求項４９】
前記選択マーカーが緑色蛍光タンパク質である、請求項４７または請求項４８に記載のターゲティングベクター。
【請求項５０】
前記第１のヌクレオチド配列が５’組換えアームを示す、請求項４７または請求項４８に記載のターゲティングベクター。
【請求項５１】
前記第２のヌクレオチド配列が３’組換えアームを示す、請求項４７または請求項４８に記載のターゲティングベクター。
【請求項５２】
前記選択マーカーが緑色蛍光タンパク質である、請求項４９に記載のターゲティングベクター。
【請求項５３】
前記第１のヌクレオチド配列が、イントロン５の少なくとも１７個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に相同である、請求項４８に記載のターゲティングベクター。
【請求項５４】
前記第２のヌクレオチド配列が、イントロン６の少なくとも１７個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に相同である、請求項４８に記載のターゲティングベクター。
【請求項５５】
請求項４７〜請求項５４のいずれか１項に記載のターゲティングベクターでトランスフェクトした、細胞。
【請求項５６】
前記ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が相同組換えによって不活化されている、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５７】
請求項５５に記載の細胞を含む、ブタ動物。
【請求項５８】
前記ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が相同組換えによって不活化されている、請求項５７に記載の動物。
【請求項５９】
請求項５８に記載の動物から得た、臓器。
【請求項６０】
請求項５８に記載の動物から得た、組織。
【請求項６１】
前記臓器が、心臓、肺、腎臓、および肝臓からなる群から選択される、請求項５９に記載の臓器。
【請求項６２】
（ａ）請求項４７または請求項４８に記載のターゲティングベクターでブタ細胞をトランスフェクトする工程と、
（ｂ）ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活化されている、トランスフェクトされた細胞を選択する工程とを含む、遺伝子操作細胞を産生する方法。
【請求項６３】
（ａ）請求項４７または請求項４８に記載のターゲティングベクターでブタ細胞をトランスフェクトする工程と、
（ｂ）ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活化されている、トランスフェクトされた細胞（核ドナー細胞）を選択する工程と、
（ｃ）前記核ドナー細胞の核を除核卵母細胞に導入して胚を産生する工程と、
（ｄ）前記胚を動物に成長させる工程とを含む、遺伝子操作動物を産生する方法。
【請求項６４】
請求項６３に記載の動物に由来する、臓器。
【請求項６５】
前記臓器が、心臓、肺、腎臓、および肝臓からなる群から選択される、請求項６４に記載の臓器。
【請求項６６】
請求項６３に記載の動物に由来する、組織。
【請求項１】
ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする単離全長ｃＤＮＡ配列。
【請求項２】
前記配列が配列番号１である、請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項３】
前記配列が配列番号３である、請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項４】
前記配列が配列番号５である、請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項５】
前記配列が配列番号７である、請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項６】
前記配列が配列番号２である、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする単離アミノ酸配列。
【請求項７】
前記配列が配列番号４である、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする単離アミノ酸配列。
【請求項８】
前記配列が配列番号６である、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする単離アミノ酸配列。
【請求項９】
前記配列が配列番号８である、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする単離アミノ酸配列。
【請求項１０】
ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列を含む、核酸構築物。
【請求項１１】
前記ｃＤＮＡが配列番号１である、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
前記ｃＤＮＡが配列番号３である、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１３】
前記ｃＤＮＡが配列番号５である、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１４】
前記ｃＤＮＡが配列番号７である、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１５】
プロモーターをさらに含む、請求項１０〜請求項１５のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１６】
選択マーカーをさらに含む、請求項１０〜請求項１５のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１７】
前記選択マーカーが緑色蛍光タンパク質である、請求項１６に記載の構築物。
【請求項１８】
請求項１０〜請求項１７のいずれか１項に記載の構築物を含む、トランスフェクトされた細胞。
【請求項１９】
ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタンパク質を発現する、細胞。
【請求項２０】
前記タンパク質配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択される、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相同な単離ヌクレオチド配列。
【請求項２２】
前記配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも８０％相同である、請求項２１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２３】
前記配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％相同である、請求項２１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２４】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項２５】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成する単離ヌクレオチド配列。
【請求項２６】
ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する、請求項２５に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２７】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２８】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプラスミド。
【請求項２９】
配列番号４６のヌクレオチド配列を含む、単離ヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号４７のヌクレオチド配列を含む、単離ヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号４８のヌクレオチド配列を含む、単離ヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８からなる群から選択される、単離ヌクレオチド配列。
【請求項３３】
配列番号９、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５からなる群から選択される、単離ヌクレオチド配列。
【請求項３４】
請求項３１〜請求項３３のいずれか１項に記載の配列を含む、ベクター。
【請求項３５】
請求項３１〜請求項３３のいずれか１項に記載の配列を含む、核酸構築物。
【請求項３６】
請求項３１〜請求項３３のいずれか１項に記載の配列を含む、プラスミド。
【請求項３７】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５からなる群から選択される配列の少なくとも１７個の連続核酸を含む、核酸構築物。
【請求項３８】
配列番号４７の少なくとも１７個の連続核酸を含む、核酸構築物。
【請求項３９】
配列番号４８の少なくとも２，７５５個の連続核酸を含む、核酸構築物。
【請求項４０】
配列番号４９の少なくとも１，７５０個の連続核酸を含む、核酸構築物。
【請求項４１】
配列番号５０の少なくとも１５０個の連続核酸を含む、核酸構築物。
【請求項４２】
請求項２９〜請求項３３のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列に相同な配列を含む、単離ヌクレオチド。
【請求項４３】
前記配列が請求項２９〜請求項３３のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列に少なくとも８０％相同である、請求項４１に記載のヌクレオチド。
【請求項４４】
前記配列が請求項２９〜請求項３３のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列に少なくとも９０％相同である、請求項２１に記載のヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項２９〜請求項３３のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列とハイブリッド形成する、単離ヌクレオチド。
【請求項４６】
ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する、請求項４５に記載のヌクレオチド。
【請求項４７】
（ａ）配列番号４７に相同な少なくとも１７個の連続核酸を含む第１のヌクレオチド配列と、
（ｂ）選択マーカー遺伝子と、
（ｃ）配列番号４８に相同な少なくとも１７個の連続核酸を含む第２のヌクレオチド配列とを含む、ターゲティングベクター。
【請求項４８】
（ａ）配列番号４８に相同な少なくとも１７個の連続核酸を含む第１のヌクレオチド配列と、
（ｂ）選択マーカー遺伝子と、
（ｃ）配列番号４８に相同な少なくとも１７個の連続核酸を含む第２のヌクレオチド配列とを含み、前記第１および第２のヌクレオチド配列が重複しない、ターゲティングベクター。
【請求項４９】
前記選択マーカーが緑色蛍光タンパク質である、請求項４７または請求項４８に記載のターゲティングベクター。
【請求項５０】
前記第１のヌクレオチド配列が５’組換えアームを示す、請求項４７または請求項４８に記載のターゲティングベクター。
【請求項５１】
前記第２のヌクレオチド配列が３’組換えアームを示す、請求項４７または請求項４８に記載のターゲティングベクター。
【請求項５２】
前記選択マーカーが緑色蛍光タンパク質である、請求項４９に記載のターゲティングベクター。
【請求項５３】
前記第１のヌクレオチド配列が、イントロン５の少なくとも１７個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に相同である、請求項４８に記載のターゲティングベクター。
【請求項５４】
前記第２のヌクレオチド配列が、イントロン６の少なくとも１７個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に相同である、請求項４８に記載のターゲティングベクター。
【請求項５５】
請求項４７〜請求項５４のいずれか１項に記載のターゲティングベクターでトランスフェクトした、細胞。
【請求項５６】
前記ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が相同組換えによって不活化されている、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５７】
請求項５５に記載の細胞を含む、ブタ動物。
【請求項５８】
前記ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が相同組換えによって不活化されている、請求項５７に記載の動物。
【請求項５９】
請求項５８に記載の動物から得た、臓器。
【請求項６０】
請求項５８に記載の動物から得た、組織。
【請求項６１】
前記臓器が、心臓、肺、腎臓、および肝臓からなる群から選択される、請求項５９に記載の臓器。
【請求項６２】
（ａ）請求項４７または請求項４８に記載のターゲティングベクターでブタ細胞をトランスフェクトする工程と、
（ｂ）ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活化されている、トランスフェクトされた細胞を選択する工程とを含む、遺伝子操作細胞を産生する方法。
【請求項６３】
（ａ）請求項４７または請求項４８に記載のターゲティングベクターでブタ細胞をトランスフェクトする工程と、
（ｂ）ブタＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活化されている、トランスフェクトされた細胞（核ドナー細胞）を選択する工程と、
（ｃ）前記核ドナー細胞の核を除核卵母細胞に導入して胚を産生する工程と、
（ｄ）前記胚を動物に成長させる工程とを含む、遺伝子操作動物を産生する方法。
【請求項６４】
請求項６３に記載の動物に由来する、臓器。
【請求項６５】
前記臓器が、心臓、肺、腎臓、および肝臓からなる群から選択される、請求項６４に記載の臓器。
【請求項６６】
請求項６３に記載の動物に由来する、組織。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００７−５２５９５５（Ｐ２００７−５２５９５５Ａ）
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１５２６８（Ｐ２００６−５１５２６８）
【出願日】平成１６年６月７日（２００４．６．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１８１０６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０８９０４
【国際公開日】平成１６年１２月１６日（２００４．１２．１６）
【出願人】（５０４２７９９６８）ユニバーシティー オブ ピッツバーグ (24)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月７日（２００４．６．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１８１０６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０８９０４
【国際公開日】平成１６年１２月１６日（２００４．１２．１６）
【出願人】（５０４２７９９６８）ユニバーシティー オブ ピッツバーグ (24)
【Ｆターム（参考）】
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