ブドウ球菌感染症用ワクチン
本発明は、組換えＤＮＡ技術を用いた、ヒト、ウシ及びその他の哺乳動物におけるブドウ球菌媒介性感染症の予防及び抑制のためのポリペプチドワクチン製剤の調製方法及び使用について記載している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物におけるブドウ球菌感染症の予防及び抑制用のワクチンとして用いるポリペプチド製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚及び粘膜に常在するグラム陽性菌であるブドウ球菌は、負傷中／手術中に内部組織へ侵入し、感染症を引き起こす。かかる細菌には、血管内カテーテル、脳脊髄液シャント、血液透析シャント、血管移植片及び長時間装着用コンタクトレンズをはじめとする医療用人工装具の設置位置の皮膚及びその近傍の組織を侵襲するという特徴的な傾向がある（Lowy 1998、Foster 2004）。重要な病原菌としては、コアグラーゼ陽性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）及びコアグラーゼ陰性表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）がある。これらはヒト及び動物において、皮膚病、局所感染、乳腺炎から、生命にかかわる心内膜炎、骨髄炎、慢性肺感染症まで、多様な疾患を引き起こす。細菌性髄膜炎の症例の１〜９％及び脳膿瘍の症例の１０〜１５％に、これらが関与している（Foster 2004）。ブドウ球菌菌血症による死亡率は、メチシリン及びバンコマイシンなどへの耐性を含む薬剤への耐性が現れたため、約２０〜５０％となっている（Enright 2002、Mongodin 2003）。ブドウ球菌は、市中感染型及び長期間の入院に付随する院内（病院感染型）感染症の主要な原因となっている（Franklin 2003）。
【０００３】
ブドウ球菌の毒性は、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ毒素、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ）、エンテロトキシン、ロイコシジン、プロテアーゼ、スタフィロキナーゼ、コアグラーゼ並びにクランピング因子などの多数の毒性因子により媒介される、多因子性のものである（Jin 2004、Martin 2003）。侵襲性感染を起こすために、ブドウ球菌は、多様な表面タンパク質（「付着因子」）によって、細胞外マトリックス基質及び真核細胞に付着する（Peacock 2002）。ブドウ球菌が産生するこうした表面タンパク質は、ＭＳＣＲＡＭＭ（接着性マトリックス分子を識別する微生物表面成分）と称される。これらは、血清タンパク質、ＩｇＧ、フィブロネクチン（Ｆｎ）、フィブリノゲン（Ｆｇ）、ビトロネクチン、トロンボスポンジンなどの生体基質に特異的に結合し、それによってかかる細菌を宿主の免疫系から遮蔽する（Hartford 1999、Harris 2002）。これらの表面タンパク質は、負傷した組織又は損傷した脈管壁の、細胞外マトリックス由来のコラーゲン、ラミニン、グリコサミノグリカン及びエラスチン（Snodgrass、1999）にも結合することができ、骨シアロタンパク質は、血小板（Siboo 2001）及び医療器具（カテーテル、シャント、ペースメーカー）などの非生体基質に結合する。こうした相互作用はすべて宿主組織の定着（colonization）に寄与するものであるが、さまざまな感染症におけるこうした結合機能それぞれの重要性は、いまだに不明である（Theresa 1999）。
【０００４】
抗生物質への耐性が相次いで現れたことで、ブドウ球菌による疾患を予防及び治療するための代替戦略の必要性が高まった。ほぼ一世紀にわたる実験にもかかわらず、一般的な哺乳動物共生細菌であるブドウ球菌に対しては、ワクチン接種は比較的成功率が低いことが判明した（Michie 2002）。これまでに数人の研究者が、死滅、弱毒化、固定又は溶解した黄色ブドウ球菌のワクチンの製造、及び／又は黄色ブドウ球菌への免疫を誘導する莢膜多糖類若しくは細胞壁成分の単離を試みている。しかし、こうした試みは何一つ成功していない。トキソイドは、いくつかの研究において高い抗体価を誘発したが、副作用を誘発したことから、ワクチン候補としては不合格であることが判明した。市中には無数の菌株が広まっているため、ブドウ球菌莢膜の多糖類抗原性成分の開発は、困難なものとなっている。Ali Fattom et al （1996）（Nabi Pharmaceuticals）は、黄色ブドウ球菌から精製した５型及び８型の多糖類を、キャリアタンパク質（無毒型の緑膿菌外毒素）に結合させることで、ワクチン（StaphVAX）を開発し、血液透析を受けている患者において、黄色ブドウ球菌に対して５６％という予防率を示した（Shinefield H. 2002）。薬効が高く、副作用が少ないにもかかわらず、このワクチンも従来のワクチンと同様に、侵襲性ブドウ球菌を長期にわたって予防することは不可能だった。Ing-Marie Nilsson et al（1998）は、コラーゲン付着因子の組換え型を用いたワクチン接種が、黄色ブドウ球菌の異種攻撃からマウスを守ったことを示した。Dr Gerald Pier et al（1999）は、黄色ブドウ球菌上の表面多糖類ＰＮＳＧ（ポリ−Ｎ−スクシニルベータ−１−６グルコサミン）の精製物を用いたワクチン接種が、黄色ブドウ球菌の攻撃からマウスを守ったことを示した。
【０００５】
しかし、現時点では、ブドウ球菌感染症を完全に予防するワクチンは市場に存在しない（Michie 2002）。接着性マトリックス分子を識別する微生物表面成分（ＭＳＣＲＡＭＭ）を標的としたワクチン戦略は、細菌の付着を妨げ、定着を予防し、血行性播種を最小限にして、感染症の発生及び進行を停止させるための実行可能なアプローチである。そのため、新規ワクチン候補の調査において、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の表面タンパク質をコンピュータで分析した。発症機序において付着は重要なステップであるため、これまでに知られていない／特徴付けがされていないブドウ球菌付着因子について、黄色ブドウ球菌株及び表皮ブドウ球菌株の公共データベースにて入手可能な完全ゲノム配列をコンピュータで分析した。本発明者らはここに、付着及び自己融解性に関与し、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の異種攻撃に対する防御となる、黄色ブドウ球菌由来の組換えタンパク質を用いたマウスへの免疫付与について、報告するものである。
【０００６】
黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌のワクチン接種で恩恵を受けると思われるのは、以下の患者である：長時間の心臓手術及び整形外科手術を受ける外科患者、外傷及び火傷患者、医療器具又は人工装具の移植を受けた患者、免疫系が未発達の新生児、長期療養中の人々、腎臓透析患者。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要：
本発明は、ブドウ球菌感染症のワクチンに関する。本発明は、哺乳動物全般、特にヒト及び又はウシにおけるブドウ球菌感染症のワクチンを提供する。本発明はまた、ワクチン組成物の抗原性分子として使用可能な、組換え型で免疫原性が高いタンパク質を、より具体的には、黄色ブドウ球菌由来の表面抗原を提供する。また、前記タンパク質は、ブドウ球菌溶菌活性を有している。本明細書で論じる本発明の組換えタンパク質は、ペプチドグリカン結合性を示すＬｙｓＭドメインの反復部分、及びペプチドグリカン切断性を示すＣＨＡＰ（システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ）ドメインを含んでいる。また、本発明は、前記組換えタンパク質の単離及び精製の方法を提供する。薬理学的及び薬学的に許容可能な担体／アジュバント／安定剤における前記タンパク質の組成物も提供する。前記タンパク質の医薬組成物は免疫原性であり、モデル動物においてブドウ球菌感染症のワクチンとして有効である。ブドウ球菌感染症の診断用に、免疫診断法も開発された。前記タンパク質は、予防及び診断を目的とする有望な候補である。
【０００８】
要約：
本発明は、哺乳動物におけるブドウ球菌感染症の予防及び抑制用ワクチンとして使用する組換えポリペプチド製剤に関する。本発明はまた、ブドウ球菌由来タンパク質抗原のクローニング及び発現方法についても記載している。前記タンパク質の医薬組成物は免疫原性であり、ブドウ球菌感染症のワクチンとして有効である。ブドウ球菌感染症の診断用に、免疫診断法も開発された。前記タンパク質は、予防及び診断を目的とする有望な候補である。
【０００９】
発明の陳述：
したがって、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、又はその突然変異体（mutants）及び変異体（variants）のいずれかを含むタンパク質の抗原性組成物であって、前記突然変異体及び変異体が、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するアミノ酸の欠失及び／又はドメイン置換、及び／又は細胞壁の標的化（cell wall targeting）の少なくとも１つを含み、前記組成物が、ブドウ球菌感染症の予防及び抑制用ワクチンとして使用される組成物を提供する。
【００１０】
アミノ酸配列が配列番号３からなることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【００１１】
アミノ酸配列が配列番号４からなることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【００１２】
アミノ酸配列が配列番号５からなることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【００１３】
アミノ酸配列が３個のＬｙｓＭドメイン及び１個のＣＨＡＰドメインからなることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【００１４】
（ｉ）ベクター及び（ii）請求項１記載のアミノ酸配列をコードする少なくとも１個の核酸断片又はその突然変異体及び／又はその変異体を含む、組換えＤＮＡコンストラクト。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ブドウ球菌感染症の予防及び治療のための免疫の誘導に有用な、黄色ブドウ球菌由来の組換えタンパク質ワクチンの開発に関する。本発明はさらに、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌関連感染症への免疫を付与するための、前記タンパク質の単離及び前記タンパク質の精製にも関する。本発明は、治療及び診断を目的とした抗体の製造にもタンパク質が有用であることを明らかにしている。本発明は、黄色ブドウ球菌株中で同定され発現されたタンパク質が付着に関与しており、免疫原性が高いとの知見に基づくものである。本発明は、精製タンパク質を適切なワクチン候補として使用する方法も提供する。本発明で発現され精製されたタンパク質は、ＮＣＢＩデータベースにおいて黄色ブドウ球菌由来のＤＮＡ配列アクセッション番号ＧＩ２２２１７９７４／ＥＭＢＡＪ２５０９０６（配列番号１を参照のこと）に相当するアクセッション番号ＧＩ２２２１７９７５／ＥＭＢＣＡＣ８０８３７（配列番号２及び配列番号３を参照のこと）として同定可能である。上記遺伝子及びタンパク質配列は、配列番号４及び配列番号５に記載の配列などの細胞及び細胞外タンパク質を用いて、起こりうるタンパク質−タンパク質相互作用を低下させる又は皆無にするために構築されたものである。本発明はまた、ワクチンとして使用可能なタンパク質の医薬組成物をも提供する。本発明はまた、免疫付与により抗原特異的免疫応答を引き出す方法についても記載している。
【００１６】
本発明は、付着因子／自己融解酵素をコードする遺伝子Ａａａ（配列番号１）のクローニング及び発現に基づくものである。かかる遺伝子は、３３４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードし、かかるタンパク質は、ペプチドグリカン結合性を示す３個のＬｙｓＭドメインの反復部分、ペプチドグリカン切断性を示す１個のＣＨＡＰドメイン、及びかかるタンパク質が細胞壁タンパク質であることを示唆する典型的なグラム陽性シグナルペプチドを備えている。細菌の付着は、多くの感染症の発生において重要な第一歩であるため、新規ワクチンの開発における魅力的な標的である。付着に基づくワクチンがブドウ球菌感染症を予防できるかどうかを確認するため、組換えタンパク質を用いてマウスに能動免疫を付与し、黄色ブドウ球菌で静脈内及び腹腔内への攻撃を行った。腎臓を処理した際、免疫を付与したマウスでは、コロニー形成単位が少なかった又は皆無であった。
【００１７】
タンパク質のアッセイ用にＥＬＩＳＡ法が開発されており、感染試料における抗原又はこのタンパク質に対する抗体を検出する診断法として、使用可能である。
【００１８】
以下の図面及び実施例は、図示を目的として記載するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００１９】
コンピュータによる分析：Ａａａ（黄色ブドウ球菌の自己融解酵素／付着因子――配列番号２）及びＡａｅ（表皮ブドウ球菌の自己融解酵素／付着因子）の両方について、Biology Workbench 3.2（http://workbench.sdsc.edu/）のCLUSTALW及びTEXSHADEによりヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のアラインメント並びに比較を行い、図１に示すように、それらが酷似していることがわかった。Pfam version 17.0（http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）を利用して、Ａａａアミノ酸配列のドメイン分析を行った。Pfamドメイン分析によって、図２に示すように、Ａａａタンパク質には３個のＬｙｓＭドメインの反復部分及び１個のＣＨＡＰドメインが含まれることがわかった。ＬｙｓＭ（リジンモチーフ）ドメインは、長さが約４０残基であり、残基４〜４７、６８〜１１１及び１３５〜１７８の間に存在するものであって、細菌細胞壁分解に関与する各種酵素中で見つかっており、一般的なペプチドグリカン結合機能を有している。ＣＨＡＰドメイン（システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ）は、長さが約１２０残基であり、残基１９１〜３１０の間に存在する。ＣＨＡＰドメインはアミダーゼ機能に関与しており、ＣＨＡＰドメインを有するタンパク質の多くは、細菌の細胞壁代謝に関与している。Signal P 3.0サーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、Target P 1.1サーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）及びPSORT version 6.4（http://www.psort.org/）により、Ａａａタンパク質が２５個の残基からなるシグナルペプチドを有すること、及び細胞壁に局在することが予測されている。
【実施例２】
【００２０】
細菌株、成長条件及びベクター：ＤＮＡ操作用に大腸菌株ＤＨ５αを使用し、自己融解酵素付着因子遺伝子のクローニング及び発現用に大腸菌ベクターpET11bを使用した。組換えタンパク質を大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ＲＩＬで発現させた。動物実験で用いたブドウ球菌株は、黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）ＡＴＣＣ２５９２３株、黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）ＡＴＣＣ３３５９１株、入院患者の大腿由来黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性――ＭＲＳＡ）の臨床単離株、表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８株であった。これらの黄色ブドウ球菌株及び表皮ブドウ球菌株を、血液寒天上で２４時間培養し、その後５％の濾過血清を含むトリプシン大豆培養液（tryptic soy broth）で後期対数期まで増殖させ、回収し、洗浄し、ＰＢＳで適切な濃度まで希釈し、マウスへの接種のために、混釈平板法で生菌数を測定した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むLuria-Bertani（ＬＢ）培養液／寒天上で、pET15b又はpET11bベクターを含む大腸菌株を選択した。０．１％の亜テルル酸カリウムを含むVogel Johnson寒天にて黄色ブドウ球菌株及び表皮ブドウ球菌株を増殖させた。
【実施例３】
【００２１】
タンパク質抗原をコードする遺伝子のクローニング及び配列決定：標準的な方法を用いて、すべてのＤＮＡ操作を行った。Lindberg et al（1972）にしたがい、ゲノムＤＮＡを黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２５９２３）から単離した。黄色ブドウ球菌自己融解酵素付着因子（Ａａａ）遺伝子（アクセッション番号ＡＪ２５０９０６．１ｇｉ｜２２２１７９７４；配列番号１内に含まれる；成熟タンパク質配列は配列番号３）の成熟タンパク質に相当する遺伝子断片を増幅させるために、オリゴヌクレオチドを設計した。ＰＣＲによる増幅に用いるフォワードプライマーの配列は、5'CGAGCTCCATATGGCTACAACTCACACAGTAAAAC3'であり、リバースプライマーの配列は、5'CGCTCGAGGGATCCTTATTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGAATATATCTATAATTATTTAC3'である。６ヒスチジンタグに相当するヌクレオチド配列は、リバースプライマーに含まれている。増幅させた遺伝子産物をアガロースゲルから精製し、制限酵素Nde1及びBamH1で分解し、同じ制限酵素で切断したpET11bベクターに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。ライゲーションしたベクターを、ＣａＣｌ２法により、大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。ABI PRISM 310ＤＮＡ配列決定装置を用いたジデオキシ鎖ターミネーション法によるＤＮＡ配列決定により、クローンを確認した。配列の取扱には、ＰＣ遺伝子プログラム（Intelligenetics社製）を用いた。標的タンパク質の発現のため、Ａａａ遺伝子を含むプラスミドを単離して、大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）ＲＩＬ株に形質転換した。
【００２２】
配列番号３のタンパク質をコードするＡａａ遺伝子の潜在的タンパク質−タンパク質相互作用部位を欠失させた後、配列番号４及び配列番号５に記載のタンパク質配列をコードする遺伝子を設計した。配列番号４及び配列番号５のタンパク質配列をコードする遺伝子を、米国のGenScript Corporation社で合成した。構築したタンパク質をコードするＯＲＦを、温熱誘導型プロモーターの制御下で、pGS100ベクターのEcoR1及びBamH1部位にクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）ＲＩＬ中に形質転換した。
【実施例４】
【００２３】
タンパク質の発現及び精製：組換えプラスミドpET11bを含む大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ＲＩＬ細胞を一晩培養したものを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１リットルのLuria培養液で１：５０に希釈した。Ａ６００が０．６になるまで大腸菌細胞を振盪しながら３７℃で増殖させ、そこでイソプロピル−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１ｍＭになるまで添加することで、Ｔ７ポリメラーゼによる標的タンパク質の発現を誘導した。４時間後、８，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、細胞を回収した。細菌ペレットを緩衝液Ａ（５０ｍＭのリン酸緩衝液、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、４Ｍの尿素、１％のTriton X 100、１ｍＭのＰＭＳＦ）に再懸濁した。振幅が１５ミクロン、持続時間が６０秒間、氷上にて６０秒間のインターバルという超音波処理を３０サイクル行って細胞を溶解させ、細菌の残骸を除去するため、細胞溶解液を１２，０００ｇで３０分間の遠心分離にかけた。標的タンパク質が封入体を形成していたことから、それらを除去するために、上記緩衝液からＰＭＳＦを除いたもので２回、及び上記緩衝液から尿素及びTriton X 100を除いたもので２回、細胞溶解ペレットを洗浄した。
【００２４】
標的タンパク質を含むペレットを、その１０倍量の５０ｍＭのリン酸緩衝液、０．５ＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素、ｐＨ８．０に懸濁して、攪拌機上に載置することにより可溶化した。４時間の可溶化の後に、１２，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行った。可溶性タンパク質を含む上清を０．４μｍの膜で濾過し、さらに精製するために保管した。Ｎｉ−ＮＴＡ金属アフィニティークロマトグラフィーにて固定化することで、組換えタンパク質を精製した。ＦＰＬＣシステムに接続された、Ｎｉ−ＮＴＡマトリックスを含むカラムを、５０ｍＭのリン酸緩衝液、０．５ＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素、ｐＨ８．０を含む緩衝液Ａで平衡化した。平衡化後、上清をカラムに入れ、カラムを１０ベッド容量の緩衝液で洗浄した。その後、５０ｍＭのリン酸緩衝液、０．５ＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素、ｐＨ８．０、２０〜２００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ｂで、カラムの溶出を行った。２８０ｎｍでの吸光度を確認することにより、タンパク質について溶出をモニターし、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、ピーク断片を分析した（図３）。
【実施例５】
【００２５】
黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌における自己融解酵素付着因子の出現：黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の各種臨床株における自己融解酵素付着因子遺伝子の存在を、ＰＣＲで確認した。敗血症、器具関連感染症、皮膚感染症、腎臓透析感染症などの患者から臨床株を単離した。黄色ブドウ球菌完全ゲノム配列の６株全部及び表皮ブドウ球菌完全ゲノム配列の２株に、タンパク質自己融解酵素（Ａａａ）付着因子が存在していることがわかった。図４に示すように、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の臨床単離株に自己融解酵素付着因子遺伝子が存在することが、ＰＣＲにより確認された。これは、黄色ブドウ球菌株及び表皮ブドウ球菌株の多くで自己融解酵素付着因子（Ａａａ）タンパク質が発現していることを示すものである。
【実施例６】
【００２６】
ペプチドグリカン加水分解活性のアッセイ――ザイモグラフアッセイ：先に記載した方法に少々の変更を加えた方法にしたがい、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でザイモグラムを行って、Ａａａタンパク質のブドウ球菌溶菌活性を確認した。すなわち、０．２％（ｗ／ｖ）の加熱殺菌黄色ブドウ球菌細胞を基質として含む１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを調製した。組換え精製タンパク質をロードし、４℃にて、縦型スラブゲル電気泳動アセンブリ（Hoefer miniVE）を用いて、２０ｍＡ定電流で電気泳動を行った。電気泳動に続いて、０．１％のTriton X 100を含む冷蒸留水でゲルを徹底的に洗浄し、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中で３７℃にてゲルを一晩インキュベートした。表皮ブドウ球菌を基質として用いて、同様のアッセイを行った。図５に示すように、半透明ゲル中の溶解バンド（lytic bands）を、間接光中で青を背景とした明瞭なバンドとして視覚化した。
【実施例７】
【００２７】
ブドウ球菌感染症を検出するための免疫診断法：
ＥＬＩＳＡ：Ａａａ自己融解酵素付着因子組換えタンパク質に対する抗体について、マウス及びヒトの血清を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で調べた。精製タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）を含む、１ウェル当たり１００μｌのコーティング緩衝液（１００ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．２）でマイクロタイターウェルをコーティングし、４℃にて一晩インキュベートした。２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む２００μｌ／ウェルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ――１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．１３ＭのＮａＣｌを含む）で、付加的なタンパク質結合部位を室温にて１時間ブロックし、ＰＢＳＴ（０．１％のTween 20を含むＰＢＳ）で５回洗浄した。ＰＢＳＴで希釈した１００μｌのマウス及びヒト血清標本を、別のウェルに添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでウェルを５回洗浄して、非結合抗体を除去した。結合抗体の検出のため、ＰＢＳＴで１：８，０００に希釈した１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、及びＰＢＳＴで１：８，０００に希釈した１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、それぞれのウェルに添加して、３７℃にて１時間インキュベートした。ウェルの洗浄後、基質であるｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）及びＨ２Ｏ２の、複合酵素による有色生成物への変換を、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad社製）にてＯＤ４９２ｎｍで測定することにより、抗原抗体複合体を定量した。感染マウス群及びヒト群の両方が、ＥＬＩＳＡで陽性の結果を示した。これは、黄色ブドウ球菌のタンパク質自己融解酵素／付着因子に対する抗体が、インビボで産生され、かつ免疫原性を有することを示している。
【実施例８】
【００２８】
ウェスタンブロット：組換えタンパク質を、還元性条件下で１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に流し、転写用緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、ｐＨ８．３を用いて、２００ｍＡにて２時間、ニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。その後、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の乾燥スキムミルクを含むＰＢＳの溶液で膜を１時間処理し、続いて、ＰＢＳで３回洗浄した後、マウスのタンパク質に対して作製された高力価血清を０．０５％のTween 20を含むＰＢＳで２００倍に希釈したもの（ポジティブコントロール）、黄色ブドウ球菌に感染したマウスのプール血清、黄色ブドウ球菌に感染したヒトのプール血清、並びにコントロールマウス及びヒト血清で、３７℃にて１時間のインキュベーションを行った。その後、ＰＢＳＴで膜を３回洗浄し、続いて、２，０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を含むＰＢＳＴ、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を含むＰＢＳＴにて、それぞれ３７℃にて１時間インキュベートした。洗浄後、発色性基質ジアミノベンゼデン（Diamino Benzedene）（ＤＡＢ）及びＨ２Ｏ２で膜を処理した。コントロールマウス及びコントロールヒト血清については、まったくバンドが現れなかったのに対し、ポジティブコントロール並びに黄色ブドウ球菌に感染したマウス及びヒトについては、図６に示すように、標的タンパク質に相当する陽性のバンドが現れた。これは、黄色ブドウ球菌に感染した際に、マウス及びヒトにおいてかかるタンパク質に対する抗体が産生されたことを示すものである。
【実施例９】
【００２９】
オプソニン化による食作用のアッセイ：タンパク質Ａａａに対して産生された抗体に、黄色ブドウ球菌の死滅をもたらす効果があるかどうかを確認するため、インビトロでのオプソニン化アッセイを行った。McKenney D 2000の修正プロトコルにより、アッセイを行った。精製タンパク質Ａａａをウサギに注入し、かかるタンパク質に対する抗体の豊富な源である過免疫血清を得た。健常な成体ウサギから採取した新鮮血から、多形核好中球を調製した。合計２５ｍｌのウサギの血液を、等量のデキストラン−ヘパリン−硫酸緩衝液（２０ｇ／リットルのDextran 500、６５．６ｇ／リットルの硫酸化ヘパリン、９ｇ／リットルの塩化ナトリウム）と混合し、３７℃にて１時間インキュベートした。白血球を含む上部層を回収し、１％のＮＨ４Ｃｌに再懸濁することで、残った赤血球の低張溶解を行った。１５％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩを用いて、その後の洗浄ステップを行った。多形核好中球数を１ｍｌ当たり４×１０６個に調整した。黄色ブドウ球菌で補体源（モルモット補体）を吸着させて、標的株と反応する可能性のある抗体を除去した。トリプシン大豆培養液で一晩増殖させた後、黄色ブドウ球菌細胞を遠心分離にかけ、ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。１００μｌの白血球、１００μｌの細菌（ＰＢＳ１ｍｌ当たり２×１０７個に調整）、１００μｌの高力価血清希釈物、及び１００μｌの補体源を用いて、オプソニン化による食作用のアッセイを行った。反応混合物を、ローターラック上で３７℃にて９０分間インキュベートした；試料の回収は、時間ゼロ及び９０分後に行った。各チューブに４Ｗで５秒間の超音波処理を行った後、０．５％のTweenを含むトリプシン大豆培養液で希釈し、Vogel Johnson寒天プレートに塗布（plate）した。血清が全く入っていないチューブ、及び正常ウサギ血清が入っているチューブをコントロールとして使用した。コントロールアッセイと比較してコロニー数が少ない被検血清により、アッセイを行った。これらにより、タンパク質Ａａａに対する抗体には、食細胞による黄色ブドウ球菌の死滅をもたらす効果があることが示された。
【実施例１０】
【００３０】
ワクチン製剤の開発及び有効性の研究：
組換え精製タンパク質及び上記ＰＢＳ、アジュバントを、濃度範囲０．０５％〜５％で用いられる以下の安定剤、ポリオール類（マンニトール、ソルビトール、グリセロール）、糖類（ラクトース、トレハロース、スクロース）、ヒト血清アルブミン、アミノ酸類（グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン）などの少なくとも１つと混合する。
【００３１】
マウスへの免疫付与及び攻撃：精製し、濾過滅菌した組換え自己融解酵素付着因子タンパク質（最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌ）及び同濃度のＢＳＡを、０．５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム（アジュバント）を含む滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水――０．１３Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）に懸濁した。精製タンパク質（１〜１０００マイクログラム）を抗原として含有する５００μｌの乳剤を含むワクチン製剤を、０日目にマウス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各群１８匹からなる４群のマウス）の腹腔内（ｉ．ｐ．）に注入し、５００μｌのＢＳＡ懸濁液を、コントロールＡ、コントロールＢ、コントロールＣ、コントロールＤの各群１５匹からなる４群のマウスに注入した。１４日目に、追加抗原投与量のタンパク質をＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ群に注入し、ＢＳＡをコントロール群に注入した。４つの異なるブドウ球菌株を致死未満量で用いて攻撃を行い、細菌の増殖（vegetation）を定量した。Ａ群及びコントロールＡ群の１０匹のマウスに対し、マウス１匹当たり３．４×１０８個のＡＴＣＣＭＳＳＡを静脈に注入して、攻撃を行った。Ｂ群及びコントロールＢ群の１０匹のマウスに対し、マウス１匹当たり３．８×１０８個のＡＴＣＣＭＲＳＡを静脈に注入して、攻撃を行った。Ｃ群及びコントロールＣ群の１０匹のマウスに対し、マウス１匹当たり３．２×１０６個の臨床ＭＲＳＡを静脈に注入して、攻撃を行った。Ｄ群及びコントロールＤ群の１０匹のマウスに対し、マウス１匹当たり４×１０８個のＡＴＣＣ表皮ブドウ球菌を静脈に注入して、攻撃を行った。攻撃時には、全部の群において５匹のマウスを取り出して、別のケージに入れておき、最後の免疫を付与してから１、３、５、７及び９週間後に、これらのマウスから血清を採取し、自己融解酵素付着因子に対する特異的ＩｇＧ抗体のアッセイを行った。黄色ブドウ球菌の腹腔内接種についても、これらの実験を繰り返した。
【実施例１１】
【００３２】
細菌研究：７２時間の攻撃後、全マウスを殺処分して解剖し、細菌研究のために腎臓を無菌的に除去した。エチルアルコール及び滅菌ＰＢＳで腎臓を洗浄し、表面に付着した細菌を除去して、滅菌した乳棒、乳鉢で別個に均質化した。細菌を定量するため、希釈が１０−５になるまで、滅菌ＰＢＳで１０倍の連続希釈を行った。１０−３〜１０−５の希釈物１ｍｌを、１％の亜テルル酸カリウムを含むVogel Johnson寒天（ＶＪ寒天）を用いた混釈平板法で塗布し、３７℃でインキュベートした。３６時間及び４８時間にわたるインキュベーションの後に、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を計数した。腹腔での増殖を識別するため、２ｍｌの滅菌ＰＢＳを各マウスの腹腔に注入し、各マウスの腹部を２分間マッサージし、洗浄液の試料をシリンジで吸引し、クックドミート培地で培養した。全身感染症の同定のため、血液の培養も行った。カタラーゼ及びコアグラーゼ活性についても、細菌のテストを行った。
【００３３】
本研究に使用した動物は、そのすべてが黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の攻撃を受けても生残した。ワクチンを接種したマウス及びワクチンを接種しなかったコントロールの腎臓における細菌数は、以下の通りである：ポジティブコントロールは、マウス１匹の腎臓一対当たり１．０〜８．１×１０６ｃｆｕを示し；３．４×１０８個のＭＳＳＡＡＴＣＣ２５９２３で攻撃されたマウス（Ａ群）は、腎臓一対当たり０〜７×１０２ｃｆｕを示し、マウス１０匹のうちの２匹が軽い感染症を示すにとどまり；３．８×１０８個のＭＲＳＡＡＴＣＣ３３５９１で攻撃されたマウス（Ｂ群）は、腎臓一対当たり０〜５．１×１０４ｃｆｕを示し、マウス１０匹のうちの３匹が軽い感染症を示すにとどまり；３．２×１０６個の臨床ＭＲＳＡ（入院患者の大腿骨から単離した多剤耐性株）で攻撃されたマウス（Ｃ群）は、腎臓一対当たり０〜９×１０３ｃｆｕを示し、マウス１０匹のうちの３匹が軽い感染症を示すにとどまり、及び４×１０８個の表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８で攻撃されたマウス（Ｄ群）は、腎臓一対当たり０〜１×１０４ｃｆｕを示し、マウス１０匹のうちの２匹が軽い感染症を示すにとどまった。分析した各動物における腎臓一対当たりの細菌数（ｃｆｕ）を、表１に示す。図８に示すように、最後の免疫を付与してから１、３、５、７及び９週間後に血清試料の抗体価を調べ、免疫付与の９週間後でさえも、非常に高い力価が認められた。
【００３４】
【表１】
【００３５】
ワクチン接種群とコントロール群との相違の有意性を確認するため、フィッシャー検定を応用した。免疫を付与したマウスの腎臓における細菌数の減少は、有意であった。表２に示すように、Ａ群の免疫付与マウスでは８０％、Ｂ群及びＣ群では７０％の腎臓について、黄色ブドウ球菌の攻撃後に細菌の存在が認められず、及びＤ群の免疫付与マウスでは８０％について、表皮ブドウ球菌の攻撃後に細菌の存在が認められなかった。表３に示すように、各群の対数平均ＣＦＵは、コントロール群の平均ＣＦＵとは有意に異なっていた。図７に示すように、そうした平均値から、ワクチン接種群に比べてコントロール群のマウスの感染がかなり高かったことがわかる。表４に示すように、コントロール群（コントロールＡ〜Ｄ）とワクチン接種群（Ａ〜Ｄ群）との相違は、統計学的に有意であった。
【００３６】
【表２】
【００３７】
【表３】
【００３８】
【表４】
【実施例１２】
【００３９】
免疫治療法の開発及びアッセイ：
腹腔内経路での免疫付与により、組換え精製Ａａａタンパク質でＢａｌｂ／ｃマウスに過免疫を付与した。特異的な過免疫血清を用いて、タンパク質ＧカラムによるＩｇＧ断片の精製を行った。精製したＩｇＧを用いてＢａｌｂ／ｃマウス（試験群ｎ＝８）に受動免疫を付与し、その後マウスを１０８ｃｆｕの黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣＭＳＳＡ株で攻撃した。コントロール群（コントロール群ｎ＝８）には、ＩｇＧ断片の代わりに等量のビヒクルを注入した。
【００４０】
両方の群について、死亡率を４８時間観察した。試験群（ｎ＝８）は、黄色ブドウ球菌の攻撃を受けても生残した。しかし、コントロール群（ｎ＝８）の動物については、１００％の死亡率が観察された。
【００４１】
均等物
上に記した明細書は、当業者が本発明を実施することができる程度に十分なものであると考えられる。本発明のある態様を一つの形で図示することが実施例の目的であるため、本発明は、提供された実施例によってその範囲を限定されるものではなく、他の機能的に同等の実施形態も本発明の範囲内にある。本明細書に示し、記載したものに加えて、本発明の各種修正も、当業者であれば上の記載から明白であり、添付の特許請求の範囲に該当する。本発明の利点及び課題は、必ずしも本発明の各実施形態に包含されるとは限らない。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】黄色ブドウ球菌のＡａａタンパク質（配列番号２）及び表皮ブドウ球菌遺伝子の相同遺伝子Ａａｅの保存アミノ酸に対して、TEXSHADE（Biology WorkBench社製）で同一性の閾値を５０％として影を付けたものを示す。
【図２】Pfam（http://www.sanger.ac.uk/ Software/Pfam/）によるＡａａ遺伝子のドメイン分析。このタンパク質は、残基４〜４７、６８〜１１１及び１３５〜１７８の間に３個のＬｙｓＭドメインを有し、残基１９１〜３１１の間に１個のＣＨＡＰドメインを有している。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）における精製タンパク質の分析を表す。１レーンはタンパク質分子量マーカーの遊走パターンを示し、２レーンは精製タンパク質を示す。
【図４】黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌における自己融解酵素付着因子遺伝子の存在を示すアガロースゲル。（Ａ）黄色ブドウ球菌臨床単離株及びＡＴＣＣ株は、自己融解酵素付着因子合成に必要なＡａａ遺伝子を含んでいる。黄色ブドウ球菌の臨床単離株４株及びＡＴＣＣ株３株由来の染色体ＤＮＡに対し、ＰＣＲを行った。１〜４レーン、菌血症、血管内カテーテル、腎臓透析患者、大腿からそれぞれ単離され、メチシリンに耐性を有する、入院患者由来の臨床単離株；５レーン、ＡＴＣＣ２５９２３；６レーン、ＡＴＣＣ３３５９１；７レーン、ＡＴＣＣ２９７３７。（Ｂ）表皮ブドウ球菌臨床単離株及びＡＴＣＣ株は、自己融解酵素付着因子合成に必要なＡａｅ遺伝子を含んでいる。表皮ブドウ球菌の臨床単離株３株及びＡＴＣＣ株２株由来の染色体ＤＮＡに対し、ＰＣＲを行った。１〜３レーン、菌血症、術後創感染、心内膜炎からそれぞれ単離された、入院患者由来の臨床単離株；５レーン、ＡＴＣＣ１２２２８；６レーン、ＡＴＣＣ３３５４７；７レーン、分子量マーカー；成熟タンパク質に相当する９３０塩基対断片を増幅するように、プライマーを設計した。
【図５】Ａａａの溶菌活性を示すザイモグラム。大腸菌から精製したＨｉｓ６タグＡａａのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２及び３レーン）。２レーンでは熱不活化黄色ブドウ球菌細胞（０．２％）が、及び３レーンでは熱不活化表皮ブドウ球菌細胞（０．２％）が、自己融解酵素の基質として分離ゲル（１０％）に含まれている。リン酸緩衝液中での３７℃でのインキュベーション後は、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の両方において、溶菌活性を透明な領域として目視できる。矢印はＡａａ関連溶菌活性を示す。分子量マーカーは１レーンに示されている。
【図６】黄色ブドウ球菌に感染したマウスのプール血清及び黄色ブドウ球菌に感染したヒトのプール血清を用いた、黄色ブドウ球菌の精製自己融解酵素付着因子のウェスタンブロットを示す。１レーン、分子量マーカーの位置（ｋＤ）；２レーン、患者のプール血清；３レーン、健常成人のプール血清；４レーン、ネガティブコントロール――小児（６〜１８カ月）のプール血清、バンドが現れていない；５レーン、黄色ブドウ球菌に感染したマウスのプール血清；６レーン、健常マウスのプール血清、バンドが現れていない。バンドは、ヒト又はマウスが黄色ブドウ球菌に暴露された際に、黄色ブドウ球菌の自己融解酵素付着因子に対する抗体が産生されたことを示す。矢印は、自己融解酵素付着因子に相当する３４ｋＤのバンドを示す。
【図７】組換えタンパク質の予防効果を表す。組換えタンパク質でマウスに能動免疫を付与することで、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌による攻撃に対する防御となる。バーは、タンパク質Ａａａ（黒バー）又は無関係なタンパク質ＢＳＡ（点描バー）で免疫付与したマウスにおける腎臓一対当たりの対数平均ＣＦＵを示す。マウス１匹当たりの攻撃に用いた菌種及び投与量のＣＦＵ値を、各群の下に示す；１群当たり、Ｎ＝１０マウスである。攻撃に用いた株は、Ａ群では黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５２９３株；Ｂ群では黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ３３５９１株；Ｃ群ではＭＲＳＡ（大腿骨）の臨床単離株；Ｄ群では表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８株である。
【図８】Ａａａタンパク質を用いて腹腔内免疫付与を行ったマウス（８）のプール血清で得られたＩｇＧ抗体価を示す。１００μｇのタンパク質を用いて、動物に２回の免疫付与を行った。最後の免疫付与後１〜９週の間に、２週間の間隔を空けて、血液試料を入手した。
【００４３】
【００４４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物におけるブドウ球菌感染症の予防及び抑制用のワクチンとして用いるポリペプチド製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚及び粘膜に常在するグラム陽性菌であるブドウ球菌は、負傷中／手術中に内部組織へ侵入し、感染症を引き起こす。かかる細菌には、血管内カテーテル、脳脊髄液シャント、血液透析シャント、血管移植片及び長時間装着用コンタクトレンズをはじめとする医療用人工装具の設置位置の皮膚及びその近傍の組織を侵襲するという特徴的な傾向がある（Lowy 1998、Foster 2004）。重要な病原菌としては、コアグラーゼ陽性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）及びコアグラーゼ陰性表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）がある。これらはヒト及び動物において、皮膚病、局所感染、乳腺炎から、生命にかかわる心内膜炎、骨髄炎、慢性肺感染症まで、多様な疾患を引き起こす。細菌性髄膜炎の症例の１〜９％及び脳膿瘍の症例の１０〜１５％に、これらが関与している（Foster 2004）。ブドウ球菌菌血症による死亡率は、メチシリン及びバンコマイシンなどへの耐性を含む薬剤への耐性が現れたため、約２０〜５０％となっている（Enright 2002、Mongodin 2003）。ブドウ球菌は、市中感染型及び長期間の入院に付随する院内（病院感染型）感染症の主要な原因となっている（Franklin 2003）。
【０００３】
ブドウ球菌の毒性は、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ毒素、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ）、エンテロトキシン、ロイコシジン、プロテアーゼ、スタフィロキナーゼ、コアグラーゼ並びにクランピング因子などの多数の毒性因子により媒介される、多因子性のものである（Jin 2004、Martin 2003）。侵襲性感染を起こすために、ブドウ球菌は、多様な表面タンパク質（「付着因子」）によって、細胞外マトリックス基質及び真核細胞に付着する（Peacock 2002）。ブドウ球菌が産生するこうした表面タンパク質は、ＭＳＣＲＡＭＭ（接着性マトリックス分子を識別する微生物表面成分）と称される。これらは、血清タンパク質、ＩｇＧ、フィブロネクチン（Ｆｎ）、フィブリノゲン（Ｆｇ）、ビトロネクチン、トロンボスポンジンなどの生体基質に特異的に結合し、それによってかかる細菌を宿主の免疫系から遮蔽する（Hartford 1999、Harris 2002）。これらの表面タンパク質は、負傷した組織又は損傷した脈管壁の、細胞外マトリックス由来のコラーゲン、ラミニン、グリコサミノグリカン及びエラスチン（Snodgrass、1999）にも結合することができ、骨シアロタンパク質は、血小板（Siboo 2001）及び医療器具（カテーテル、シャント、ペースメーカー）などの非生体基質に結合する。こうした相互作用はすべて宿主組織の定着（colonization）に寄与するものであるが、さまざまな感染症におけるこうした結合機能それぞれの重要性は、いまだに不明である（Theresa 1999）。
【０００４】
抗生物質への耐性が相次いで現れたことで、ブドウ球菌による疾患を予防及び治療するための代替戦略の必要性が高まった。ほぼ一世紀にわたる実験にもかかわらず、一般的な哺乳動物共生細菌であるブドウ球菌に対しては、ワクチン接種は比較的成功率が低いことが判明した（Michie 2002）。これまでに数人の研究者が、死滅、弱毒化、固定又は溶解した黄色ブドウ球菌のワクチンの製造、及び／又は黄色ブドウ球菌への免疫を誘導する莢膜多糖類若しくは細胞壁成分の単離を試みている。しかし、こうした試みは何一つ成功していない。トキソイドは、いくつかの研究において高い抗体価を誘発したが、副作用を誘発したことから、ワクチン候補としては不合格であることが判明した。市中には無数の菌株が広まっているため、ブドウ球菌莢膜の多糖類抗原性成分の開発は、困難なものとなっている。Ali Fattom et al （1996）（Nabi Pharmaceuticals）は、黄色ブドウ球菌から精製した５型及び８型の多糖類を、キャリアタンパク質（無毒型の緑膿菌外毒素）に結合させることで、ワクチン（StaphVAX）を開発し、血液透析を受けている患者において、黄色ブドウ球菌に対して５６％という予防率を示した（Shinefield H. 2002）。薬効が高く、副作用が少ないにもかかわらず、このワクチンも従来のワクチンと同様に、侵襲性ブドウ球菌を長期にわたって予防することは不可能だった。Ing-Marie Nilsson et al（1998）は、コラーゲン付着因子の組換え型を用いたワクチン接種が、黄色ブドウ球菌の異種攻撃からマウスを守ったことを示した。Dr Gerald Pier et al（1999）は、黄色ブドウ球菌上の表面多糖類ＰＮＳＧ（ポリ−Ｎ−スクシニルベータ−１−６グルコサミン）の精製物を用いたワクチン接種が、黄色ブドウ球菌の攻撃からマウスを守ったことを示した。
【０００５】
しかし、現時点では、ブドウ球菌感染症を完全に予防するワクチンは市場に存在しない（Michie 2002）。接着性マトリックス分子を識別する微生物表面成分（ＭＳＣＲＡＭＭ）を標的としたワクチン戦略は、細菌の付着を妨げ、定着を予防し、血行性播種を最小限にして、感染症の発生及び進行を停止させるための実行可能なアプローチである。そのため、新規ワクチン候補の調査において、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の表面タンパク質をコンピュータで分析した。発症機序において付着は重要なステップであるため、これまでに知られていない／特徴付けがされていないブドウ球菌付着因子について、黄色ブドウ球菌株及び表皮ブドウ球菌株の公共データベースにて入手可能な完全ゲノム配列をコンピュータで分析した。本発明者らはここに、付着及び自己融解性に関与し、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の異種攻撃に対する防御となる、黄色ブドウ球菌由来の組換えタンパク質を用いたマウスへの免疫付与について、報告するものである。
【０００６】
黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌のワクチン接種で恩恵を受けると思われるのは、以下の患者である：長時間の心臓手術及び整形外科手術を受ける外科患者、外傷及び火傷患者、医療器具又は人工装具の移植を受けた患者、免疫系が未発達の新生児、長期療養中の人々、腎臓透析患者。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要：
本発明は、ブドウ球菌感染症のワクチンに関する。本発明は、哺乳動物全般、特にヒト及び又はウシにおけるブドウ球菌感染症のワクチンを提供する。本発明はまた、ワクチン組成物の抗原性分子として使用可能な、組換え型で免疫原性が高いタンパク質を、より具体的には、黄色ブドウ球菌由来の表面抗原を提供する。また、前記タンパク質は、ブドウ球菌溶菌活性を有している。本明細書で論じる本発明の組換えタンパク質は、ペプチドグリカン結合性を示すＬｙｓＭドメインの反復部分、及びペプチドグリカン切断性を示すＣＨＡＰ（システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ）ドメインを含んでいる。また、本発明は、前記組換えタンパク質の単離及び精製の方法を提供する。薬理学的及び薬学的に許容可能な担体／アジュバント／安定剤における前記タンパク質の組成物も提供する。前記タンパク質の医薬組成物は免疫原性であり、モデル動物においてブドウ球菌感染症のワクチンとして有効である。ブドウ球菌感染症の診断用に、免疫診断法も開発された。前記タンパク質は、予防及び診断を目的とする有望な候補である。
【０００８】
要約：
本発明は、哺乳動物におけるブドウ球菌感染症の予防及び抑制用ワクチンとして使用する組換えポリペプチド製剤に関する。本発明はまた、ブドウ球菌由来タンパク質抗原のクローニング及び発現方法についても記載している。前記タンパク質の医薬組成物は免疫原性であり、ブドウ球菌感染症のワクチンとして有効である。ブドウ球菌感染症の診断用に、免疫診断法も開発された。前記タンパク質は、予防及び診断を目的とする有望な候補である。
【０００９】
発明の陳述：
したがって、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、又はその突然変異体（mutants）及び変異体（variants）のいずれかを含むタンパク質の抗原性組成物であって、前記突然変異体及び変異体が、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するアミノ酸の欠失及び／又はドメイン置換、及び／又は細胞壁の標的化（cell wall targeting）の少なくとも１つを含み、前記組成物が、ブドウ球菌感染症の予防及び抑制用ワクチンとして使用される組成物を提供する。
【００１０】
アミノ酸配列が配列番号３からなることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【００１１】
アミノ酸配列が配列番号４からなることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【００１２】
アミノ酸配列が配列番号５からなることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【００１３】
アミノ酸配列が３個のＬｙｓＭドメイン及び１個のＣＨＡＰドメインからなることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【００１４】
（ｉ）ベクター及び（ii）請求項１記載のアミノ酸配列をコードする少なくとも１個の核酸断片又はその突然変異体及び／又はその変異体を含む、組換えＤＮＡコンストラクト。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ブドウ球菌感染症の予防及び治療のための免疫の誘導に有用な、黄色ブドウ球菌由来の組換えタンパク質ワクチンの開発に関する。本発明はさらに、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌関連感染症への免疫を付与するための、前記タンパク質の単離及び前記タンパク質の精製にも関する。本発明は、治療及び診断を目的とした抗体の製造にもタンパク質が有用であることを明らかにしている。本発明は、黄色ブドウ球菌株中で同定され発現されたタンパク質が付着に関与しており、免疫原性が高いとの知見に基づくものである。本発明は、精製タンパク質を適切なワクチン候補として使用する方法も提供する。本発明で発現され精製されたタンパク質は、ＮＣＢＩデータベースにおいて黄色ブドウ球菌由来のＤＮＡ配列アクセッション番号ＧＩ２２２１７９７４／ＥＭＢＡＪ２５０９０６（配列番号１を参照のこと）に相当するアクセッション番号ＧＩ２２２１７９７５／ＥＭＢＣＡＣ８０８３７（配列番号２及び配列番号３を参照のこと）として同定可能である。上記遺伝子及びタンパク質配列は、配列番号４及び配列番号５に記載の配列などの細胞及び細胞外タンパク質を用いて、起こりうるタンパク質−タンパク質相互作用を低下させる又は皆無にするために構築されたものである。本発明はまた、ワクチンとして使用可能なタンパク質の医薬組成物をも提供する。本発明はまた、免疫付与により抗原特異的免疫応答を引き出す方法についても記載している。
【００１６】
本発明は、付着因子／自己融解酵素をコードする遺伝子Ａａａ（配列番号１）のクローニング及び発現に基づくものである。かかる遺伝子は、３３４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードし、かかるタンパク質は、ペプチドグリカン結合性を示す３個のＬｙｓＭドメインの反復部分、ペプチドグリカン切断性を示す１個のＣＨＡＰドメイン、及びかかるタンパク質が細胞壁タンパク質であることを示唆する典型的なグラム陽性シグナルペプチドを備えている。細菌の付着は、多くの感染症の発生において重要な第一歩であるため、新規ワクチンの開発における魅力的な標的である。付着に基づくワクチンがブドウ球菌感染症を予防できるかどうかを確認するため、組換えタンパク質を用いてマウスに能動免疫を付与し、黄色ブドウ球菌で静脈内及び腹腔内への攻撃を行った。腎臓を処理した際、免疫を付与したマウスでは、コロニー形成単位が少なかった又は皆無であった。
【００１７】
タンパク質のアッセイ用にＥＬＩＳＡ法が開発されており、感染試料における抗原又はこのタンパク質に対する抗体を検出する診断法として、使用可能である。
【００１８】
以下の図面及び実施例は、図示を目的として記載するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００１９】
コンピュータによる分析：Ａａａ（黄色ブドウ球菌の自己融解酵素／付着因子――配列番号２）及びＡａｅ（表皮ブドウ球菌の自己融解酵素／付着因子）の両方について、Biology Workbench 3.2（http://workbench.sdsc.edu/）のCLUSTALW及びTEXSHADEによりヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のアラインメント並びに比較を行い、図１に示すように、それらが酷似していることがわかった。Pfam version 17.0（http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）を利用して、Ａａａアミノ酸配列のドメイン分析を行った。Pfamドメイン分析によって、図２に示すように、Ａａａタンパク質には３個のＬｙｓＭドメインの反復部分及び１個のＣＨＡＰドメインが含まれることがわかった。ＬｙｓＭ（リジンモチーフ）ドメインは、長さが約４０残基であり、残基４〜４７、６８〜１１１及び１３５〜１７８の間に存在するものであって、細菌細胞壁分解に関与する各種酵素中で見つかっており、一般的なペプチドグリカン結合機能を有している。ＣＨＡＰドメイン（システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ）は、長さが約１２０残基であり、残基１９１〜３１０の間に存在する。ＣＨＡＰドメインはアミダーゼ機能に関与しており、ＣＨＡＰドメインを有するタンパク質の多くは、細菌の細胞壁代謝に関与している。Signal P 3.0サーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、Target P 1.1サーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）及びPSORT version 6.4（http://www.psort.org/）により、Ａａａタンパク質が２５個の残基からなるシグナルペプチドを有すること、及び細胞壁に局在することが予測されている。
【実施例２】
【００２０】
細菌株、成長条件及びベクター：ＤＮＡ操作用に大腸菌株ＤＨ５αを使用し、自己融解酵素付着因子遺伝子のクローニング及び発現用に大腸菌ベクターpET11bを使用した。組換えタンパク質を大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ＲＩＬで発現させた。動物実験で用いたブドウ球菌株は、黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）ＡＴＣＣ２５９２３株、黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）ＡＴＣＣ３３５９１株、入院患者の大腿由来黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性――ＭＲＳＡ）の臨床単離株、表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８株であった。これらの黄色ブドウ球菌株及び表皮ブドウ球菌株を、血液寒天上で２４時間培養し、その後５％の濾過血清を含むトリプシン大豆培養液（tryptic soy broth）で後期対数期まで増殖させ、回収し、洗浄し、ＰＢＳで適切な濃度まで希釈し、マウスへの接種のために、混釈平板法で生菌数を測定した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むLuria-Bertani（ＬＢ）培養液／寒天上で、pET15b又はpET11bベクターを含む大腸菌株を選択した。０．１％の亜テルル酸カリウムを含むVogel Johnson寒天にて黄色ブドウ球菌株及び表皮ブドウ球菌株を増殖させた。
【実施例３】
【００２１】
タンパク質抗原をコードする遺伝子のクローニング及び配列決定：標準的な方法を用いて、すべてのＤＮＡ操作を行った。Lindberg et al（1972）にしたがい、ゲノムＤＮＡを黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２５９２３）から単離した。黄色ブドウ球菌自己融解酵素付着因子（Ａａａ）遺伝子（アクセッション番号ＡＪ２５０９０６．１ｇｉ｜２２２１７９７４；配列番号１内に含まれる；成熟タンパク質配列は配列番号３）の成熟タンパク質に相当する遺伝子断片を増幅させるために、オリゴヌクレオチドを設計した。ＰＣＲによる増幅に用いるフォワードプライマーの配列は、5'CGAGCTCCATATGGCTACAACTCACACAGTAAAAC3'であり、リバースプライマーの配列は、5'CGCTCGAGGGATCCTTATTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGAATATATCTATAATTATTTAC3'である。６ヒスチジンタグに相当するヌクレオチド配列は、リバースプライマーに含まれている。増幅させた遺伝子産物をアガロースゲルから精製し、制限酵素Nde1及びBamH1で分解し、同じ制限酵素で切断したpET11bベクターに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。ライゲーションしたベクターを、ＣａＣｌ２法により、大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。ABI PRISM 310ＤＮＡ配列決定装置を用いたジデオキシ鎖ターミネーション法によるＤＮＡ配列決定により、クローンを確認した。配列の取扱には、ＰＣ遺伝子プログラム（Intelligenetics社製）を用いた。標的タンパク質の発現のため、Ａａａ遺伝子を含むプラスミドを単離して、大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）ＲＩＬ株に形質転換した。
【００２２】
配列番号３のタンパク質をコードするＡａａ遺伝子の潜在的タンパク質−タンパク質相互作用部位を欠失させた後、配列番号４及び配列番号５に記載のタンパク質配列をコードする遺伝子を設計した。配列番号４及び配列番号５のタンパク質配列をコードする遺伝子を、米国のGenScript Corporation社で合成した。構築したタンパク質をコードするＯＲＦを、温熱誘導型プロモーターの制御下で、pGS100ベクターのEcoR1及びBamH1部位にクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）ＲＩＬ中に形質転換した。
【実施例４】
【００２３】
タンパク質の発現及び精製：組換えプラスミドpET11bを含む大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ＲＩＬ細胞を一晩培養したものを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１リットルのLuria培養液で１：５０に希釈した。Ａ６００が０．６になるまで大腸菌細胞を振盪しながら３７℃で増殖させ、そこでイソプロピル−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１ｍＭになるまで添加することで、Ｔ７ポリメラーゼによる標的タンパク質の発現を誘導した。４時間後、８，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、細胞を回収した。細菌ペレットを緩衝液Ａ（５０ｍＭのリン酸緩衝液、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、４Ｍの尿素、１％のTriton X 100、１ｍＭのＰＭＳＦ）に再懸濁した。振幅が１５ミクロン、持続時間が６０秒間、氷上にて６０秒間のインターバルという超音波処理を３０サイクル行って細胞を溶解させ、細菌の残骸を除去するため、細胞溶解液を１２，０００ｇで３０分間の遠心分離にかけた。標的タンパク質が封入体を形成していたことから、それらを除去するために、上記緩衝液からＰＭＳＦを除いたもので２回、及び上記緩衝液から尿素及びTriton X 100を除いたもので２回、細胞溶解ペレットを洗浄した。
【００２４】
標的タンパク質を含むペレットを、その１０倍量の５０ｍＭのリン酸緩衝液、０．５ＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素、ｐＨ８．０に懸濁して、攪拌機上に載置することにより可溶化した。４時間の可溶化の後に、１２，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行った。可溶性タンパク質を含む上清を０．４μｍの膜で濾過し、さらに精製するために保管した。Ｎｉ−ＮＴＡ金属アフィニティークロマトグラフィーにて固定化することで、組換えタンパク質を精製した。ＦＰＬＣシステムに接続された、Ｎｉ−ＮＴＡマトリックスを含むカラムを、５０ｍＭのリン酸緩衝液、０．５ＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素、ｐＨ８．０を含む緩衝液Ａで平衡化した。平衡化後、上清をカラムに入れ、カラムを１０ベッド容量の緩衝液で洗浄した。その後、５０ｍＭのリン酸緩衝液、０．５ＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素、ｐＨ８．０、２０〜２００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ｂで、カラムの溶出を行った。２８０ｎｍでの吸光度を確認することにより、タンパク質について溶出をモニターし、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、ピーク断片を分析した（図３）。
【実施例５】
【００２５】
黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌における自己融解酵素付着因子の出現：黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の各種臨床株における自己融解酵素付着因子遺伝子の存在を、ＰＣＲで確認した。敗血症、器具関連感染症、皮膚感染症、腎臓透析感染症などの患者から臨床株を単離した。黄色ブドウ球菌完全ゲノム配列の６株全部及び表皮ブドウ球菌完全ゲノム配列の２株に、タンパク質自己融解酵素（Ａａａ）付着因子が存在していることがわかった。図４に示すように、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の臨床単離株に自己融解酵素付着因子遺伝子が存在することが、ＰＣＲにより確認された。これは、黄色ブドウ球菌株及び表皮ブドウ球菌株の多くで自己融解酵素付着因子（Ａａａ）タンパク質が発現していることを示すものである。
【実施例６】
【００２６】
ペプチドグリカン加水分解活性のアッセイ――ザイモグラフアッセイ：先に記載した方法に少々の変更を加えた方法にしたがい、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でザイモグラムを行って、Ａａａタンパク質のブドウ球菌溶菌活性を確認した。すなわち、０．２％（ｗ／ｖ）の加熱殺菌黄色ブドウ球菌細胞を基質として含む１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを調製した。組換え精製タンパク質をロードし、４℃にて、縦型スラブゲル電気泳動アセンブリ（Hoefer miniVE）を用いて、２０ｍＡ定電流で電気泳動を行った。電気泳動に続いて、０．１％のTriton X 100を含む冷蒸留水でゲルを徹底的に洗浄し、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中で３７℃にてゲルを一晩インキュベートした。表皮ブドウ球菌を基質として用いて、同様のアッセイを行った。図５に示すように、半透明ゲル中の溶解バンド（lytic bands）を、間接光中で青を背景とした明瞭なバンドとして視覚化した。
【実施例７】
【００２７】
ブドウ球菌感染症を検出するための免疫診断法：
ＥＬＩＳＡ：Ａａａ自己融解酵素付着因子組換えタンパク質に対する抗体について、マウス及びヒトの血清を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で調べた。精製タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）を含む、１ウェル当たり１００μｌのコーティング緩衝液（１００ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．２）でマイクロタイターウェルをコーティングし、４℃にて一晩インキュベートした。２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む２００μｌ／ウェルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ――１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．１３ＭのＮａＣｌを含む）で、付加的なタンパク質結合部位を室温にて１時間ブロックし、ＰＢＳＴ（０．１％のTween 20を含むＰＢＳ）で５回洗浄した。ＰＢＳＴで希釈した１００μｌのマウス及びヒト血清標本を、別のウェルに添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでウェルを５回洗浄して、非結合抗体を除去した。結合抗体の検出のため、ＰＢＳＴで１：８，０００に希釈した１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、及びＰＢＳＴで１：８，０００に希釈した１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、それぞれのウェルに添加して、３７℃にて１時間インキュベートした。ウェルの洗浄後、基質であるｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）及びＨ２Ｏ２の、複合酵素による有色生成物への変換を、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad社製）にてＯＤ４９２ｎｍで測定することにより、抗原抗体複合体を定量した。感染マウス群及びヒト群の両方が、ＥＬＩＳＡで陽性の結果を示した。これは、黄色ブドウ球菌のタンパク質自己融解酵素／付着因子に対する抗体が、インビボで産生され、かつ免疫原性を有することを示している。
【実施例８】
【００２８】
ウェスタンブロット：組換えタンパク質を、還元性条件下で１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に流し、転写用緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、ｐＨ８．３を用いて、２００ｍＡにて２時間、ニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。その後、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の乾燥スキムミルクを含むＰＢＳの溶液で膜を１時間処理し、続いて、ＰＢＳで３回洗浄した後、マウスのタンパク質に対して作製された高力価血清を０．０５％のTween 20を含むＰＢＳで２００倍に希釈したもの（ポジティブコントロール）、黄色ブドウ球菌に感染したマウスのプール血清、黄色ブドウ球菌に感染したヒトのプール血清、並びにコントロールマウス及びヒト血清で、３７℃にて１時間のインキュベーションを行った。その後、ＰＢＳＴで膜を３回洗浄し、続いて、２，０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を含むＰＢＳＴ、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を含むＰＢＳＴにて、それぞれ３７℃にて１時間インキュベートした。洗浄後、発色性基質ジアミノベンゼデン（Diamino Benzedene）（ＤＡＢ）及びＨ２Ｏ２で膜を処理した。コントロールマウス及びコントロールヒト血清については、まったくバンドが現れなかったのに対し、ポジティブコントロール並びに黄色ブドウ球菌に感染したマウス及びヒトについては、図６に示すように、標的タンパク質に相当する陽性のバンドが現れた。これは、黄色ブドウ球菌に感染した際に、マウス及びヒトにおいてかかるタンパク質に対する抗体が産生されたことを示すものである。
【実施例９】
【００２９】
オプソニン化による食作用のアッセイ：タンパク質Ａａａに対して産生された抗体に、黄色ブドウ球菌の死滅をもたらす効果があるかどうかを確認するため、インビトロでのオプソニン化アッセイを行った。McKenney D 2000の修正プロトコルにより、アッセイを行った。精製タンパク質Ａａａをウサギに注入し、かかるタンパク質に対する抗体の豊富な源である過免疫血清を得た。健常な成体ウサギから採取した新鮮血から、多形核好中球を調製した。合計２５ｍｌのウサギの血液を、等量のデキストラン−ヘパリン−硫酸緩衝液（２０ｇ／リットルのDextran 500、６５．６ｇ／リットルの硫酸化ヘパリン、９ｇ／リットルの塩化ナトリウム）と混合し、３７℃にて１時間インキュベートした。白血球を含む上部層を回収し、１％のＮＨ４Ｃｌに再懸濁することで、残った赤血球の低張溶解を行った。１５％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩを用いて、その後の洗浄ステップを行った。多形核好中球数を１ｍｌ当たり４×１０６個に調整した。黄色ブドウ球菌で補体源（モルモット補体）を吸着させて、標的株と反応する可能性のある抗体を除去した。トリプシン大豆培養液で一晩増殖させた後、黄色ブドウ球菌細胞を遠心分離にかけ、ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。１００μｌの白血球、１００μｌの細菌（ＰＢＳ１ｍｌ当たり２×１０７個に調整）、１００μｌの高力価血清希釈物、及び１００μｌの補体源を用いて、オプソニン化による食作用のアッセイを行った。反応混合物を、ローターラック上で３７℃にて９０分間インキュベートした；試料の回収は、時間ゼロ及び９０分後に行った。各チューブに４Ｗで５秒間の超音波処理を行った後、０．５％のTweenを含むトリプシン大豆培養液で希釈し、Vogel Johnson寒天プレートに塗布（plate）した。血清が全く入っていないチューブ、及び正常ウサギ血清が入っているチューブをコントロールとして使用した。コントロールアッセイと比較してコロニー数が少ない被検血清により、アッセイを行った。これらにより、タンパク質Ａａａに対する抗体には、食細胞による黄色ブドウ球菌の死滅をもたらす効果があることが示された。
【実施例１０】
【００３０】
ワクチン製剤の開発及び有効性の研究：
組換え精製タンパク質及び上記ＰＢＳ、アジュバントを、濃度範囲０．０５％〜５％で用いられる以下の安定剤、ポリオール類（マンニトール、ソルビトール、グリセロール）、糖類（ラクトース、トレハロース、スクロース）、ヒト血清アルブミン、アミノ酸類（グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン）などの少なくとも１つと混合する。
【００３１】
マウスへの免疫付与及び攻撃：精製し、濾過滅菌した組換え自己融解酵素付着因子タンパク質（最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌ）及び同濃度のＢＳＡを、０．５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム（アジュバント）を含む滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水――０．１３Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）に懸濁した。精製タンパク質（１〜１０００マイクログラム）を抗原として含有する５００μｌの乳剤を含むワクチン製剤を、０日目にマウス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各群１８匹からなる４群のマウス）の腹腔内（ｉ．ｐ．）に注入し、５００μｌのＢＳＡ懸濁液を、コントロールＡ、コントロールＢ、コントロールＣ、コントロールＤの各群１５匹からなる４群のマウスに注入した。１４日目に、追加抗原投与量のタンパク質をＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ群に注入し、ＢＳＡをコントロール群に注入した。４つの異なるブドウ球菌株を致死未満量で用いて攻撃を行い、細菌の増殖（vegetation）を定量した。Ａ群及びコントロールＡ群の１０匹のマウスに対し、マウス１匹当たり３．４×１０８個のＡＴＣＣＭＳＳＡを静脈に注入して、攻撃を行った。Ｂ群及びコントロールＢ群の１０匹のマウスに対し、マウス１匹当たり３．８×１０８個のＡＴＣＣＭＲＳＡを静脈に注入して、攻撃を行った。Ｃ群及びコントロールＣ群の１０匹のマウスに対し、マウス１匹当たり３．２×１０６個の臨床ＭＲＳＡを静脈に注入して、攻撃を行った。Ｄ群及びコントロールＤ群の１０匹のマウスに対し、マウス１匹当たり４×１０８個のＡＴＣＣ表皮ブドウ球菌を静脈に注入して、攻撃を行った。攻撃時には、全部の群において５匹のマウスを取り出して、別のケージに入れておき、最後の免疫を付与してから１、３、５、７及び９週間後に、これらのマウスから血清を採取し、自己融解酵素付着因子に対する特異的ＩｇＧ抗体のアッセイを行った。黄色ブドウ球菌の腹腔内接種についても、これらの実験を繰り返した。
【実施例１１】
【００３２】
細菌研究：７２時間の攻撃後、全マウスを殺処分して解剖し、細菌研究のために腎臓を無菌的に除去した。エチルアルコール及び滅菌ＰＢＳで腎臓を洗浄し、表面に付着した細菌を除去して、滅菌した乳棒、乳鉢で別個に均質化した。細菌を定量するため、希釈が１０−５になるまで、滅菌ＰＢＳで１０倍の連続希釈を行った。１０−３〜１０−５の希釈物１ｍｌを、１％の亜テルル酸カリウムを含むVogel Johnson寒天（ＶＪ寒天）を用いた混釈平板法で塗布し、３７℃でインキュベートした。３６時間及び４８時間にわたるインキュベーションの後に、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を計数した。腹腔での増殖を識別するため、２ｍｌの滅菌ＰＢＳを各マウスの腹腔に注入し、各マウスの腹部を２分間マッサージし、洗浄液の試料をシリンジで吸引し、クックドミート培地で培養した。全身感染症の同定のため、血液の培養も行った。カタラーゼ及びコアグラーゼ活性についても、細菌のテストを行った。
【００３３】
本研究に使用した動物は、そのすべてが黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の攻撃を受けても生残した。ワクチンを接種したマウス及びワクチンを接種しなかったコントロールの腎臓における細菌数は、以下の通りである：ポジティブコントロールは、マウス１匹の腎臓一対当たり１．０〜８．１×１０６ｃｆｕを示し；３．４×１０８個のＭＳＳＡＡＴＣＣ２５９２３で攻撃されたマウス（Ａ群）は、腎臓一対当たり０〜７×１０２ｃｆｕを示し、マウス１０匹のうちの２匹が軽い感染症を示すにとどまり；３．８×１０８個のＭＲＳＡＡＴＣＣ３３５９１で攻撃されたマウス（Ｂ群）は、腎臓一対当たり０〜５．１×１０４ｃｆｕを示し、マウス１０匹のうちの３匹が軽い感染症を示すにとどまり；３．２×１０６個の臨床ＭＲＳＡ（入院患者の大腿骨から単離した多剤耐性株）で攻撃されたマウス（Ｃ群）は、腎臓一対当たり０〜９×１０３ｃｆｕを示し、マウス１０匹のうちの３匹が軽い感染症を示すにとどまり、及び４×１０８個の表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８で攻撃されたマウス（Ｄ群）は、腎臓一対当たり０〜１×１０４ｃｆｕを示し、マウス１０匹のうちの２匹が軽い感染症を示すにとどまった。分析した各動物における腎臓一対当たりの細菌数（ｃｆｕ）を、表１に示す。図８に示すように、最後の免疫を付与してから１、３、５、７及び９週間後に血清試料の抗体価を調べ、免疫付与の９週間後でさえも、非常に高い力価が認められた。
【００３４】
【表１】
【００３５】
ワクチン接種群とコントロール群との相違の有意性を確認するため、フィッシャー検定を応用した。免疫を付与したマウスの腎臓における細菌数の減少は、有意であった。表２に示すように、Ａ群の免疫付与マウスでは８０％、Ｂ群及びＣ群では７０％の腎臓について、黄色ブドウ球菌の攻撃後に細菌の存在が認められず、及びＤ群の免疫付与マウスでは８０％について、表皮ブドウ球菌の攻撃後に細菌の存在が認められなかった。表３に示すように、各群の対数平均ＣＦＵは、コントロール群の平均ＣＦＵとは有意に異なっていた。図７に示すように、そうした平均値から、ワクチン接種群に比べてコントロール群のマウスの感染がかなり高かったことがわかる。表４に示すように、コントロール群（コントロールＡ〜Ｄ）とワクチン接種群（Ａ〜Ｄ群）との相違は、統計学的に有意であった。
【００３６】
【表２】
【００３７】
【表３】
【００３８】
【表４】
【実施例１２】
【００３９】
免疫治療法の開発及びアッセイ：
腹腔内経路での免疫付与により、組換え精製Ａａａタンパク質でＢａｌｂ／ｃマウスに過免疫を付与した。特異的な過免疫血清を用いて、タンパク質ＧカラムによるＩｇＧ断片の精製を行った。精製したＩｇＧを用いてＢａｌｂ／ｃマウス（試験群ｎ＝８）に受動免疫を付与し、その後マウスを１０８ｃｆｕの黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣＭＳＳＡ株で攻撃した。コントロール群（コントロール群ｎ＝８）には、ＩｇＧ断片の代わりに等量のビヒクルを注入した。
【００４０】
両方の群について、死亡率を４８時間観察した。試験群（ｎ＝８）は、黄色ブドウ球菌の攻撃を受けても生残した。しかし、コントロール群（ｎ＝８）の動物については、１００％の死亡率が観察された。
【００４１】
均等物
上に記した明細書は、当業者が本発明を実施することができる程度に十分なものであると考えられる。本発明のある態様を一つの形で図示することが実施例の目的であるため、本発明は、提供された実施例によってその範囲を限定されるものではなく、他の機能的に同等の実施形態も本発明の範囲内にある。本明細書に示し、記載したものに加えて、本発明の各種修正も、当業者であれば上の記載から明白であり、添付の特許請求の範囲に該当する。本発明の利点及び課題は、必ずしも本発明の各実施形態に包含されるとは限らない。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】黄色ブドウ球菌のＡａａタンパク質（配列番号２）及び表皮ブドウ球菌遺伝子の相同遺伝子Ａａｅの保存アミノ酸に対して、TEXSHADE（Biology WorkBench社製）で同一性の閾値を５０％として影を付けたものを示す。
【図２】Pfam（http://www.sanger.ac.uk/ Software/Pfam/）によるＡａａ遺伝子のドメイン分析。このタンパク質は、残基４〜４７、６８〜１１１及び１３５〜１７８の間に３個のＬｙｓＭドメインを有し、残基１９１〜３１１の間に１個のＣＨＡＰドメインを有している。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）における精製タンパク質の分析を表す。１レーンはタンパク質分子量マーカーの遊走パターンを示し、２レーンは精製タンパク質を示す。
【図４】黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌における自己融解酵素付着因子遺伝子の存在を示すアガロースゲル。（Ａ）黄色ブドウ球菌臨床単離株及びＡＴＣＣ株は、自己融解酵素付着因子合成に必要なＡａａ遺伝子を含んでいる。黄色ブドウ球菌の臨床単離株４株及びＡＴＣＣ株３株由来の染色体ＤＮＡに対し、ＰＣＲを行った。１〜４レーン、菌血症、血管内カテーテル、腎臓透析患者、大腿からそれぞれ単離され、メチシリンに耐性を有する、入院患者由来の臨床単離株；５レーン、ＡＴＣＣ２５９２３；６レーン、ＡＴＣＣ３３５９１；７レーン、ＡＴＣＣ２９７３７。（Ｂ）表皮ブドウ球菌臨床単離株及びＡＴＣＣ株は、自己融解酵素付着因子合成に必要なＡａｅ遺伝子を含んでいる。表皮ブドウ球菌の臨床単離株３株及びＡＴＣＣ株２株由来の染色体ＤＮＡに対し、ＰＣＲを行った。１〜３レーン、菌血症、術後創感染、心内膜炎からそれぞれ単離された、入院患者由来の臨床単離株；５レーン、ＡＴＣＣ１２２２８；６レーン、ＡＴＣＣ３３５４７；７レーン、分子量マーカー；成熟タンパク質に相当する９３０塩基対断片を増幅するように、プライマーを設計した。
【図５】Ａａａの溶菌活性を示すザイモグラム。大腸菌から精製したＨｉｓ６タグＡａａのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２及び３レーン）。２レーンでは熱不活化黄色ブドウ球菌細胞（０．２％）が、及び３レーンでは熱不活化表皮ブドウ球菌細胞（０．２％）が、自己融解酵素の基質として分離ゲル（１０％）に含まれている。リン酸緩衝液中での３７℃でのインキュベーション後は、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の両方において、溶菌活性を透明な領域として目視できる。矢印はＡａａ関連溶菌活性を示す。分子量マーカーは１レーンに示されている。
【図６】黄色ブドウ球菌に感染したマウスのプール血清及び黄色ブドウ球菌に感染したヒトのプール血清を用いた、黄色ブドウ球菌の精製自己融解酵素付着因子のウェスタンブロットを示す。１レーン、分子量マーカーの位置（ｋＤ）；２レーン、患者のプール血清；３レーン、健常成人のプール血清；４レーン、ネガティブコントロール――小児（６〜１８カ月）のプール血清、バンドが現れていない；５レーン、黄色ブドウ球菌に感染したマウスのプール血清；６レーン、健常マウスのプール血清、バンドが現れていない。バンドは、ヒト又はマウスが黄色ブドウ球菌に暴露された際に、黄色ブドウ球菌の自己融解酵素付着因子に対する抗体が産生されたことを示す。矢印は、自己融解酵素付着因子に相当する３４ｋＤのバンドを示す。
【図７】組換えタンパク質の予防効果を表す。組換えタンパク質でマウスに能動免疫を付与することで、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌による攻撃に対する防御となる。バーは、タンパク質Ａａａ（黒バー）又は無関係なタンパク質ＢＳＡ（点描バー）で免疫付与したマウスにおける腎臓一対当たりの対数平均ＣＦＵを示す。マウス１匹当たりの攻撃に用いた菌種及び投与量のＣＦＵ値を、各群の下に示す；１群当たり、Ｎ＝１０マウスである。攻撃に用いた株は、Ａ群では黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５２９３株；Ｂ群では黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ３３５９１株；Ｃ群ではＭＲＳＡ（大腿骨）の臨床単離株；Ｄ群では表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８株である。
【図８】Ａａａタンパク質を用いて腹腔内免疫付与を行ったマウス（８）のプール血清で得られたＩｇＧ抗体価を示す。１００μｇのタンパク質を用いて、動物に２回の免疫付与を行った。最後の免疫付与後１〜９週の間に、２週間の間隔を空けて、血液試料を入手した。
【００４３】
【００４４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列のタンパク質又は修飾された配列番号２のアミノ酸配列のタンパク質を含む組成物であって、前記アミノ酸修飾が、タンパク質−タンパク質相互作用、及び／又は細胞壁の標的化を低下させるために、以下の
ｉ）アミノ酸の欠失
ii）アミノ酸のドメイン置換
iii）変異
の少なくとも１つを含み、
前記組成物が、ブドウ球菌感染症の予防及び抑制のために使用されることを特徴とする組成物。
【請求項２】
アミノ酸配列が、配列番号３を含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
アミノ酸配列が、配列番号４を含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
アミノ酸配列が、配列番号５を含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項５】
アミノ酸配列が、３個のＬｙｓＭドメイン及び１個のＣＨＡＰドメインを含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項６】
配列番号１のヌクレオチド断片、好ましくは、請求項１記載の抗原タンパク質をコードするヌクレオチド配列１０５〜１０３４からなるヌクレオチド断片。
【請求項７】
（ｉ）ベクター及び（ii）請求項１〜６のいずれか記載のアミノ酸配列をコードする少なくとも１個の核酸断片を含む、組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項８】
ベクターが、原核宿主生物、好ましくは大腸菌中でクローニングされた、原核生物のプラスミド発現ベクターであることを特徴とする請求項７記載の組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項９】
ベクターが、真核宿主生物中でクローニングされた、真核生物のプラスミド発現ベクターであることを特徴とする請求項７記載の組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項１０】
以下のステップを含む、請求項１記載のタンパク質の製造方法：
（ａ）請求項８記載の組換えＤＮＡコンストラクトをクローニングした宿主細胞を培養するステップ、
（ｂ）前記細胞を回収し、そこから組換えタンパク質を単離するステップ、及び
（ｃ）前記タンパク質を精製するステップ。
【請求項１１】
尿素及び塩酸グアニジンから選択される少なくとも１つの変性剤を０．１Ｍ〜１２Ｍの範囲で使用し、さらに前記タンパク質をアジュバント上で捕獲して、タンパク質の可溶化を実施することを特徴とする請求項１０記載の精製タンパク質を変性条件下で製造する方法。
【請求項１２】
以下のアジュバント：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、鉱物油、又はアジュバントとして使用可能な他の適切な化合物の少なくとも１つをさらに含むことを特徴とする請求項１〜５及び１１記載のタンパク質組成物。
【請求項１３】
有効量の、例えば１〜１０００μｇ、好ましくは５〜５００μｇ、より好ましくは１０〜１００μｇの範囲の請求項１〜５及び１２記載の精製タンパク質をさらに含み、薬学的及び生理学的に許容可能な担体においてワクチンとして使用されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
薬学的及び生理学的に許容可能な担体であって、ペプチド、多糖類、又はその他の有機、無機分子である担体に、リンカーを介して又はリンカーなしで結合した精製タンパク質を、さらに含むことを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
以下の担体緩衝液：リン酸緩衝液、リン酸クエン酸緩衝液又はその他の薬学的及び生理学的に許容可能な緩衝液の少なくとも１つをさらに含み、請求項１２記載の添加されたアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１６】
以下の薬学的及び生理学的に許容される安定剤：ポリオール、グリセロール、ヒト血清アルブミン、糖類及びアミノ酸類の少なくとも１つを、０．０５％〜５％の範囲でさらに含むことを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１７】
組換えプラスミド及び薬学的に許容可能な担体を含む製剤であって、前記プラスミドが、請求項１〜５記載の黄色ブドウ球菌タンパク質抗原の少なくとも１つのヌクレオチドコーディング配列からなり、ポリペプチドを哺乳動物中で発現させるために前記ヌクレオチド配列に作用可能に結合している転写及び翻訳制御配列を含むことを特徴とする製剤。
【請求項１８】
ブドウ球菌感染症の、何らかの形での免疫診断の準備をするための、請求項１〜１６記載の組成物の使用方法。
【請求項１９】
ブドウ球菌感染症に対する、何らかの形での免疫治療の準備をするための、請求項１〜１６記載の組成物の使用方法。
【請求項２０】
請求項１〜１６記載の医薬組成物を、以下の筋肉内、皮内、皮下、静脈内、経口、鼻腔内などの経路の少なくとも１つを介して投与する方法。
【請求項２１】
腎臓透析患者、手術を受ける患者、医療器具を留置している患者、外傷を負っている対象、症状のある保菌者及び無症候性保菌者を含むがこれに限定されるものではない、ヒト、ウシ及びその他の哺乳動物において、前記対象に請求項１〜２０記載の組成物を有効量投与することにより、ブドウ球菌関連感染症を予防及び抑制する方法。
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列のタンパク質又は修飾された配列番号２のアミノ酸配列のタンパク質を含む組成物であって、前記アミノ酸修飾が、タンパク質−タンパク質相互作用、及び／又は細胞壁の標的化を低下させるために、以下の
ｉ）アミノ酸の欠失
ii）アミノ酸のドメイン置換
iii）変異
の少なくとも１つを含み、
前記組成物が、ブドウ球菌感染症の予防及び抑制のために使用されることを特徴とする組成物。
【請求項２】
アミノ酸配列が、配列番号３を含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
アミノ酸配列が、配列番号４を含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
アミノ酸配列が、配列番号５を含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項５】
アミノ酸配列が、３個のＬｙｓＭドメイン及び１個のＣＨＡＰドメインを含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項６】
配列番号１のヌクレオチド断片、好ましくは、請求項１記載の抗原タンパク質をコードするヌクレオチド配列１０５〜１０３４からなるヌクレオチド断片。
【請求項７】
（ｉ）ベクター及び（ii）請求項１〜６のいずれか記載のアミノ酸配列をコードする少なくとも１個の核酸断片を含む、組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項８】
ベクターが、原核宿主生物、好ましくは大腸菌中でクローニングされた、原核生物のプラスミド発現ベクターであることを特徴とする請求項７記載の組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項９】
ベクターが、真核宿主生物中でクローニングされた、真核生物のプラスミド発現ベクターであることを特徴とする請求項７記載の組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項１０】
以下のステップを含む、請求項１記載のタンパク質の製造方法：
（ａ）請求項８記載の組換えＤＮＡコンストラクトをクローニングした宿主細胞を培養するステップ、
（ｂ）前記細胞を回収し、そこから組換えタンパク質を単離するステップ、及び
（ｃ）前記タンパク質を精製するステップ。
【請求項１１】
尿素及び塩酸グアニジンから選択される少なくとも１つの変性剤を０．１Ｍ〜１２Ｍの範囲で使用し、さらに前記タンパク質をアジュバント上で捕獲して、タンパク質の可溶化を実施することを特徴とする請求項１０記載の精製タンパク質を変性条件下で製造する方法。
【請求項１２】
以下のアジュバント：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、鉱物油、又はアジュバントとして使用可能な他の適切な化合物の少なくとも１つをさらに含むことを特徴とする請求項１〜５及び１１記載のタンパク質組成物。
【請求項１３】
有効量の、例えば１〜１０００μｇ、好ましくは５〜５００μｇ、より好ましくは１０〜１００μｇの範囲の請求項１〜５及び１２記載の精製タンパク質をさらに含み、薬学的及び生理学的に許容可能な担体においてワクチンとして使用されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
薬学的及び生理学的に許容可能な担体であって、ペプチド、多糖類、又はその他の有機、無機分子である担体に、リンカーを介して又はリンカーなしで結合した精製タンパク質を、さらに含むことを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
以下の担体緩衝液：リン酸緩衝液、リン酸クエン酸緩衝液又はその他の薬学的及び生理学的に許容可能な緩衝液の少なくとも１つをさらに含み、請求項１２記載の添加されたアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１６】
以下の薬学的及び生理学的に許容される安定剤：ポリオール、グリセロール、ヒト血清アルブミン、糖類及びアミノ酸類の少なくとも１つを、０．０５％〜５％の範囲でさらに含むことを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１７】
組換えプラスミド及び薬学的に許容可能な担体を含む製剤であって、前記プラスミドが、請求項１〜５記載の黄色ブドウ球菌タンパク質抗原の少なくとも１つのヌクレオチドコーディング配列からなり、ポリペプチドを哺乳動物中で発現させるために前記ヌクレオチド配列に作用可能に結合している転写及び翻訳制御配列を含むことを特徴とする製剤。
【請求項１８】
ブドウ球菌感染症の、何らかの形での免疫診断の準備をするための、請求項１〜１６記載の組成物の使用方法。
【請求項１９】
ブドウ球菌感染症に対する、何らかの形での免疫治療の準備をするための、請求項１〜１６記載の組成物の使用方法。
【請求項２０】
請求項１〜１６記載の医薬組成物を、以下の筋肉内、皮内、皮下、静脈内、経口、鼻腔内などの経路の少なくとも１つを介して投与する方法。
【請求項２１】
腎臓透析患者、手術を受ける患者、医療器具を留置している患者、外傷を負っている対象、症状のある保菌者及び無症候性保菌者を含むがこれに限定されるものではない、ヒト、ウシ及びその他の哺乳動物において、前記対象に請求項１〜２０記載の組成物を有効量投与することにより、ブドウ球菌関連感染症を予防及び抑制する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５０１２１３（Ｐ２００９−５０１２１３Ａ）
【公表日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２１０３７（Ｐ２００８−５２１０３７）
【出願日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００６／０００２４６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００７３５２
【国際公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【出願人】（５０６２２６１３１）バハラ バイオテック インターナショナル リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００６／０００２４６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００７３５２
【国際公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【出願人】（５０６２２６１３１）バハラ バイオテック インターナショナル リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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