ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインＡ様蛋白質の生産方法
【課題】本発明は、プロテインＡ様蛋白質の生産のための効率的で経済的な方法に関する。
【解決手段】プロテインＡ様蛋白質の遺伝子組換え技術を用いた生産は、大腸菌、枯草菌などの宿主が使用されているが生産性の低さにより高価格の大きな原因となっている。従って大腸菌や枯草菌以外の組換えＤＮＡ技術を用いたプロテインＡ様蛋白質の安価で大量な生産を可能にする技術の早急な確立が強く望まれている。本発明は、プロテインＡ様蛋白質の大量生産方法であり、組換えブレビバチルス属細菌により該蛋白質を培養液中へ大量に分泌発現させ、培養液中からその蓄積された該プロテインＡ様蛋白質を分離回収することからなる方法などを提供する。
【解決手段】プロテインＡ様蛋白質の遺伝子組換え技術を用いた生産は、大腸菌、枯草菌などの宿主が使用されているが生産性の低さにより高価格の大きな原因となっている。従って大腸菌や枯草菌以外の組換えＤＮＡ技術を用いたプロテインＡ様蛋白質の安価で大量な生産を可能にする技術の早急な確立が強く望まれている。本発明は、プロテインＡ様蛋白質の大量生産方法であり、組換えブレビバチルス属細菌により該蛋白質を培養液中へ大量に分泌発現させ、培養液中からその蓄積された該プロテインＡ様蛋白質を分離回収することからなる方法などを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブレビバチルス属細菌を使用した、イムノグロブリン結合能を有するプロテインＡ様蛋白質の製造方法に関する。詳細には、本発明は、遺伝子組換え技術により、ブレビバチルス属細菌にプロテインＡ様蛋白質を多量に分泌発現させること、その発現されたプロテインＡ様蛋白質を、プロテアーゼ等による分解を受けることなく高純度で分離回収すること、及び、その分離回収されたプロテインＡ様蛋白質を、抗体精製用のカラム樹脂等の用途へ有効に使用することに関する。
【０００２】
日本国特許出願２００４−１９８８３１号（２００４年７月６日出願）の明細書、請求の範囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体される。
【背景技術】
【０００３】
抗体（イムノグロブリン、またはＩｇとも呼ばれる）蛋白質は生体における有害な抗原の補足及び排除機能を有するため古くから医薬品として利用されてきた。近年では遺伝子工学技術や細胞融合技術の進歩により特異的な抗原に反応する抗体を分子設計し、動物細胞内で発現させることにより均一で高い抗原性を有するモノクローナル抗体の作製が可能となった。これらの抗体蛋白質は細胞培養液中に分泌されることから、比較的容易に分離精製回収することができる。
【０００４】
一般的に、イムノアッセイやイムノブロット解析に利用される抗体蛋白質の場合、通常の蛋白質精製において利用される方法、すなわち硫酸アンモニウムによる沈殿法やイオン交換クロマトグラフィー等を用いることによって、血清、腹水または細胞培養液のような天然生体サンプルから、十分な収量や純度で得ることができる。
【０００５】
一方、高純度を必要とする医薬品または診断薬等に利用される抗体蛋白質の場合、上記のような方法を用いて分離精製するには、様々な分離抽出条件の検討や数多くの他のクロマトグラフィーとの併用を必要とし、また、それぞれの抗体蛋白質に関して精製条件の最適化が必要となり、非常な労力を要する。従って、高純度を必要とする抗体蛋白質の精製の場合、他の夾雑物質から簡便に分離精製するために、抗体蛋白質を特異的に吸着することが可能なアフィニティークロマトグラフィーを用いるのが一般的である。
【０００６】
抗体結合能を有するアフィニティークロマトグラフィーとして最も良く利用されているのが、プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬなどの蛋白質を適当な樹脂に固定化した担体によるクロマトグラフィーである。これらの蛋白質の中で特に精製用担体のリガンドとしてよく利用されているのがプロテインＡである。プロテインＡはグラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁蛋白質の１種であり、約４２，０００の分子量であることが明らかとなっている。その構造は７つの機能ドメイン（アミノ末端からシグナル配列Ｓ、イムノグロブリン結合ドメインＥ、イムノグロブリン結合ドメインＤ，イムノグロブリン結合ドメインＡ、イムノグロブリン結合ドメインＢ、イムノグロブリン結合ドメインＣ、スタフィロコッカス・アウレウス細菌細胞壁結合ドメインＸ）(非特許文献１、２、３参照)から構成されている。プロテインＡの５つのイムノグロブリン結合ドメイン（ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）は、それぞれイムノグロブリン分子内のＦｃ部分で結合することができる（非特許文献３参照）。
【０００７】
このプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインに対する相対親和性は、ｐＨ、スタフィロコッカス・アウレウス菌株種（Cheung, A.ら Infec. Immun. 1987. 55:843-847）、またイムノグロブリンのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）及びサブクラス（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）などの多くの因子に依存することが知られ、特にイムノグロブリンのクラスではヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４及びマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ３のＦｃ部分と強い結合を示す。以上のような性質を持つプロテインＡは、イムノグロブリンとしての抗原結合能力、親和力や性質を損なうことなくイムノグロブリンに結合することができるため、様々な診断、医薬品及び基礎研究に用いられるイムノグロブリン、特にＩｇＧに対し精製用担体のリガンドとして広く使用されている。
【０００８】
また最近では、感作末梢血リンパ球の腫瘍細胞毒性作用を阻害する血清阻止因子（特異抗原、抗体、抗グロブリン及び免疫複合体で構成される）を、プロテインＡに吸着させ腫瘍患者の血清から除去するといった、癌治療への応用にも興味が持たれている（特許文献１−３参照）。さらにＩｇＧ結合活性とは別にプロテインＡは多クローン抗体合成を活性化する働きも有していることから、当初の精製樹脂リガンド用途だけでなく様々なバイオテクノロジー分野における使用用途が期待されている。
【０００９】
初期のプロテインＡの生産方法においてはスタフィロコッカス・アウレウス株の培養液から直接、分離精製を行ってきたが、この菌自身の病原性の問題や不純物の混入の問題により、現在では大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（特許文献１−３）やグラム陽性細菌である枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（特許文献４−５）を用いた組換えＤＮＡ技術を用いた生産方法へ移行している。ところが、大腸菌における組換え型プロテインＡの生産性は極めて低く、また、発現蛋白質の多くがインクルージョンボディーを形成したり、細胞内で分解されるため、分離回収が容易ではない（非特許文献４）。一方、スタフィロコッカス・アウレウスと同様にグラム陽性細菌である枯草菌を用いたプロテインＡの生産では、プロテインＡのＮ末端へ枯草菌分泌蛋白質のシグナル配列を付加することで培地中へ分泌発現させる方法が取られており、大腸菌での生産系と比較した場合、分離精製等が容易であり、生産性も高いことが報告されている（約４７−１００ｍｇ/Ｌ）（Fahnestock, S, R.ら J. Bacteriol. 1986. 165:796-804）。ところが、枯草菌において生産されたプロテインＡは、枯草菌が本来持つ菌体外プロテアーゼによる分解を受ける。そのため、枯草菌の数種の菌体外プロテアーゼ欠損株（非特許文献５）を宿主として用いることも試みられてきたが、プロテインＡの分解を抑えることは未だ達成できていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】日本国特願平０７−１８７０１９号公報
【特許文献２】米国特許番号ＵＳ５１５１３５０号公報
【特許文献３】欧州特許番号ＥＰ０１０７５０９号公報
【特許文献４】米国特許番号ＵＳ４６１７２６６号公報
【特許文献５】欧州特許番号ＥＰ０１２４３７４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Lofdahl, Sら.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. 80:697-701.
【非特許文献２】Shuttleworth, H. Lら.Gene. 1987. 58:283-295.
【非特許文献３】Uhlen, M.ら.J. Bio. Chem. 1984. 259:1695-1702.
【非特許文献４】Nilsson, Bら. Protein Eng. 1987. 1:107-113.
【非特許文献５】Fahnestock, S. Rら. Appl.Envron. Microbiol. 1987. 53:379-384.
【非特許文献６】Brigido, Mら, J. Basic Microbiology. 1991. 31: 337-345.
【非特許文献７】Sjostrom, J, -Eら. J. bacteriol. 1975. 123:905-915.
【非特許文献８】Bjorck, L.ら. 1984. J. Immunol. 133, 969-974.
【非特許文献９】Kastern, W.ら. J Biol Chem. 1992. 267:12820-12825
【非特許文献１０】Udaka, S.ら. Method Enzymol. 1993. 217:23-33.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このような背景から、大腸菌や枯草菌を用いた生産方法を上回る、効率の良いプロテインＡの生産技術の確立が、強く望まれていた。
【００１３】
本発明は、大腸菌や枯草菌を用いた生産方法を上回る、効率の良いプロテインＡの生産技術の提供を一つの課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、プロテインＡのような機能蛋白質を安定、大量に生産する技術を確立するため、ブレビバチルス属細菌を宿主に使い鋭意研究を行った結果、プロテインＡを効率良く培養液中へ大量に分泌発現、そして安定に蓄積させ、容易に高純度で分離回収できることを見いだした。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に従えば、ブレビバチルス属細菌を宿主に用いることにより、大腸菌や枯草菌などの微生物を宿主とした場合に報告されている生産量を大幅に上回るプロテインＡを培養液中へ分泌生産させ、イムノグロブリン結合機能を損なわずに容易に高純度にまで精製することができる。従って、本発明により、現在まで高価格の一因となっていたプロテインＡの低生産性や、精製工程の複雑さが解消される。
【００１６】
本発明は、以下の１または複数の対象を含む。
（１）本発明は、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列をコードするＤＮＡ配列、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターを含む、ＤＮＡ配列を提供する。
（３）本発明は、前記ＤＮＡ配列を含む、発現ベクターを提供する。
（４）本発明は、前記発現ベクターを含む、ブレビバチルス属細菌形質転換体を提供する。
（６）本発明は、前記形質転換体を培養すること、および該形質転換体によって分泌生産されるプロテインＡ様蛋白質、またはその部分的配列を有する蛋白質を回収することを含む、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質の製造方法を提供する。
（７）本発明は、前記製造方法によってプロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質を製造すること、および該プロテイン様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質を適当な基材に固定化すること、を含む、イムノグロブリン吸着担体の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、スタフィロコッカス・アウレウス・コワン（Ｃｏｗａｎ）Ｉ株のプロテインＡの塩基配列とアミノ酸配列とを示す図である（番号はアミノ酸残基数を示す）。
【図２】図２は、スタフィロコッカス・アウレウス株のプロテインＡの遺伝子配列とアミノ酸配列とを示す図である（番号はアミノ酸残基数を示す）。
【図３】図３は、プロテインＡ（ＳＰＡ）発現ベクター（Ｓｐａ−ｐＮＨ３０１）を示す図である。
【図４】図４は、プロテインＡ（ＳＰＡ）発現ベクター（Ｓｐａ−ｐＮＨ３０１）のプロモーター配列からプロテインＡ（ＳＰＡ）をコードする領域までの塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図５】図５は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株により生産されたプロテインＡ（ＳＰＡ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果を示す図である。
【図６】図６は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株により生産されたプロテインＡ（ＳＰＡ）の、抗体結合試験の結果を示す図である。
【図７】図７は、プロテインＡ（ＳＰＡ’）発現ベクター（Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０）を示す図である。
【図８】図８は、プロテインＡ（ＳＰＡ’）発現ベクター（Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０）のプロモーター配列、シャインダルガノ配列、シグナルペプチドおよびプロテインＡ（ＳＰＡ’）をコードするＤＮＡ配列を示す図である。
【図９】図９は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株により生産されたプロテインＡ（ＳＰＡ’）の培養液中での挙動およびその蓄積量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明者らは、組換えＤＮＡ技術が利用できる細菌の中でも、グラム陽性細菌であるブレビバチルス属細菌を用いることで、活性型のプロテインＡを大量に培養液中へ分泌発現させることができ、大腸菌及び枯草菌における低生産性の問題、並びに枯草菌における発現したプロテインＡの分解に対する問題が効果的に改善されることを発見した。すなわち、ブレビバチルス属細菌を用いることで、枯草菌で得られる発現量を容易に確保し、さらにこれを培地中へ蓄積させることができる。以下、実施形態に基づいて本発明について詳しく説明する。
【００１９】
１．プロテインＡ
プロテインＡは、前述のように、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウスによって生産される細胞壁蛋白質の１種であり、例えば、図１（配列番号２）にて示されるアミノ酸配列からなるスタフィロコッカス・アウレウス・コワン（Ｃｏｗａｎ）Ｉ株（ＪＣＭ２１７９）由来のもの（非特許文献２）、図２（配列番号４）にて示されるアミノ酸配列からなるもの（非特許文献６、Finck-Barbancon,V.ら FEMS Microbiol. Lett. 1992. 91:1-8）、Ｗｏｏｄｓ４６株由来のもの（非特許文献３）、８３２５−４株由来のもの（非特許文献３）、および既にクローニングされているプラスミドＤＮＡすなわちｐＳＰ１やｐＳＰ３等（非特許文献７）にコードされているspa遺伝子産物等を指す。
【００２０】
本発明にいうプロテインＡ様蛋白質には、プロテインＡ、またはプロテインＡと実質的に同一の蛋白質が含まれる。また、プロテインＡ様蛋白質には、当業者にとって公知の配列比較アルゴリズムを使用して、プロテインＡのアミノ酸配列と比較され、そして最大の一致のためにアラインメントされるときに、少なくとも６０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０−９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸残基の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、イムノグロブリン結合活性を有する蛋白質が含まれる。ここで、同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは５０残基長以上であり、より好ましくは１００残基長以上であり、さらに好ましくは１５０残基長以上であり、最も好ましい実施態様では、完全長に渡り同一性を有する。
【００２１】
パーセント配列同一性を決定するために好適であるアルゴリズムの例は、BLASTアルゴリズムであり、これはAltschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990)に記載されている。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公衆が利用可能である。
【００２２】
プロテインＡ様蛋白質は、例えば、配列番号１または配列番号３に示したＤＮＡ配列に対して相補的な配列を有するＤＮＡに、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質であり得る。該ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーション条件の例は：好ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中で約５０℃でハイブリダイゼーション、および約２ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中で５０℃の洗浄；より望ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、約１ｍＭのＥＤＴＡで５０℃でハイブリダイゼーション、および約１ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳで約５０℃の洗浄；より望ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、約１ｍＭのＥＤＴＡで約５０℃でハイブリダイゼーション、および約０．５ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳで約５０℃の洗浄；より好ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、約１ｍＭのＥＤＴＡで約５０℃でハイブリダイゼーション、および約０．１ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳで約５０℃の洗浄；並びになおより好ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、約１ｍＭのＥＤＴＡで約５０℃で、約０．１ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳで約６５℃の洗浄である。もっとも、該条件は、ヌクレオチド鎖の長さ、該配列、および異なる環境パラメーターに依存して異なり得る。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、例えばTijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2''Overview of principles of hybridization and the starategy of nucleic acid probe assay''Elsvier, New Yorkに見出される。
【００２３】
このように、図１（配列番号１および２）および図２（配列番号３および４）にて示されるプロテインＡをコードするＤＮＡ配列、およびプロテインＡのアミノ酸配列を知ることにより、「プロテインＡ様蛋白質」、およびそれをコードするＤＮＡ配列の存在を認識することは、遺伝子工学分野の技術者にとって容易である。
【００２４】
「プロテインＡ様蛋白質」には、例えば、プロテインＡを構成するイムノグロブリン結合ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）を任意の順列に並べ替えたものも含まれる。
【００２５】
さらに、「プロテインＡ様蛋白質」には、例えば、グループＣ及びＧのストレプトコッカス属細菌(Streptococcal)の有するプロテインＧ（非特許文献８）、またはペプトストレプトコッカス・マグニウス（Peptostreptococcus magnus）のプロテインＬ（非特許文献９）といったプロテインＡと同様なイムノグロブリン結合機能を有する蛋白質も含まれる。
【００２６】
２．プロテインＡ様蛋白質の部分的配列
プロテインＡ様蛋白質の「部分的配列」とは、上記プロテインＡ様蛋白質を構成するアミノ酸配列の任意の一部分から構成されるものであって、かつ、イムノグロブリン結合活性を有する蛋白質を指し、具体的には、例えば、プロテインＡから先述のシグナル配列Ｓおよび細胞壁結合ドメインＸの一部を除いて得られる、配列番号８の２４番目のＡｌａ以降で示されるアミノ酸配列（実施例１の「ＳＰＡ」に対応。図３および４、配列番号７および８参照。）、および、プロテインＡから先述のシグナル配列Ｓおよび細胞壁結合ドメインＸの全部を除いて得られる、配列番号１９の３１番目のＡｌａ以降で示されるアミノ酸配列（実施例５の「ＳＰＡ’」に対応。図７および８、配列番号１８および１９参照。）のそれぞれが、プロテインＡ様蛋白質の「部分的配列」に対応する。
【００２７】
さらに上記プロテインＧやＬが有するイムノグロブリン結合ドメインを構成するアミノ酸配列も「部分的配列」として挙げることができる。
【００２８】
本明細書にいうプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとは、例えば、図１における３７アミノ酸残基から３２７アミノ酸残基位（ドメインＥからＣ）、図２における３７アミノ酸残基から３５５アミノ酸残基（ドメインＥからＣ）のことを指す。
【００２９】
３．プロテインＡ様蛋白質をコードするＤＮＡ配列
本発明に用いられる、プロテインＡ様蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、そのＤＮＡ配列を翻訳したアミノ酸配列が、プロテインＡ様蛋白質を構成するものであればいずれでも良い。そのようなＤＮＡ配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり（Nucleic acids Res.1984. 12:4359）、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該ＤＮＡ配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても良く、ブレビバチルス属内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来のＤＮＡ配列と同一である必要性は無い。
【００３０】
４．発現ベクター
本発明の「発現ベクター」は、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列をコードするＤＮＡ配列、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターを含む。当該プロモーターは、ブレビバチルス属細菌で機能しうるものであればいかなるものでも良いが、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等細菌由来でブレビバチルス属細菌内にて作動可能なプロモーターが好ましく、ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）、同蛋白質であるｏｕｔｅｒ ｗａｌｌｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）(非特許文献１０)または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰ（Ebisu. Sら. J. Bacteriol. 1990. 172:1312-1320）をコードする遺伝子のプロモーターがより好ましい。実施例では、実施例１に示すブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ５プロモーター領域「ＭＷＰ−Ｐ５」（図３、４、配列番号７、８参照）、および、実施例５に示すブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ２プロモーター領域「ＭＷＰ−Ｐ２」（図７、８、配列番号１８、１９参照）のそれぞれが、「ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーター」に対応する。
【００３１】
また、「発現ベクター」は、該プロモーターの下流に、ブレビバチルス属細菌で機能しうるシャインダルガノ配列及びシグナル配列をさらに含むのが好ましい。発現ベクターは、所望によりマーカー配列を含んでもよい。
【００３２】
上記のプロモーター配列に続く「シャインダルガノ配列」は、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等細菌由来でブレビバチルス属細菌内にて作動可能なシャインダルガノ配列が好ましく、ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）、同蛋白質であるｏｕｔｅｒｗａｌｌｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）、または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰをコードする遺伝子の上流に存在するシャインダルガノ配列がより好ましい。
【００３３】
上記のシャインダルガノ配列に続く、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、以下の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列であれば特に制限は無く、ブレビバチルス・ブレビス内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来のＤＮＡ配列と同一である必要性は無い。分泌シグナルペプチドとしては、例えば、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等細菌由来で、ブレビバチルス属細菌内にて作動可能な分泌シグナルペプチドが好ましく、ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）、同蛋白質であるｏｕｔｅｒ ｗａｌｌｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰの分泌シグナルペプチドがより好ましい。また従来の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を改良したものでも構わない。具体的に言えばｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）のシグナルペプチド、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号１１）をＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号１２）の下線部ように塩基性や疎水性アミノ酸残基など付加または消失させた分泌シグナルペプチドでも構わない。また従来からブレビバチルス属の分泌蛋白質において使われている分泌シグナルペプチドでも構わない。さらに該プロテインＡが本来有するシグナルペプチド（図１、２）、すなわち、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ でも構わない。
【００３４】
上記のプロモーター配列、シャインダルガノ配列、および分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、例えば、ブレビバチルス属細菌から得ることができる。好ましくは、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＪＣＭ６２８５）（特開昭６０−５８０７４号公報参照）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０８）（非特許文献１０参照）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６６４）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）（特開平４−２７８０９１号公報参照）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）、またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３）（特開平６−２９６４８５号公報参照）の染色体ＤＮＡを鋳型として、公知のＰＣＲ法で特異的に増やすことにより取得できる。
【００３５】
本発明の「発現ベクター」においては、上記の任意のプロモーターと、上記の任意のシャインダルガノ配列、上記の任意のシグナルペプチド配列と、該プロテインＡ様蛋白質またはプロテインＡ様蛋白質の部分的配列をコードするＤＮＡ配列とが、ブレビバチルス属細菌内において作動可能に連結されていることが好ましい。
【００３６】
ベクターとしては、プラスミドベクターが好ましい。ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとして具体的には、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、またはｐＨＹ５００(特開平２−３１６８２号公報)、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１(J. Bacteriol. 1987. 1239-1245)、ｐＮＵ２００(鵜高重三、日本農芸化学会誌1987. 61: 669-676)、ｐＮＵ１００(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 30:75-80)、ｐＮＵ２１１(J. Biochem., 1992, 112:488-491)、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５(特開平７−１７０９８４号公報)、ｐＮＨ３０１（Shiga. Y.ら. Appl. Environ. Microbiol. 1992. 58:525-531.）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ishihara. Tら、1995. J. Bacteriol, 177:745-749）、ｐＨＴ２１０（特開平６−１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42:358-363)、または大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）が使用可能であるが、これらに限定されることはない。また、ブレビバチルス属細菌で機能するプロモーターとシャインダルガノ配列と目的蛋白質をコードするＤＮＡ配列とを含んだ発現ベクター、または、それらの各配列を含む遺伝子断片を染色体中へ直接組み込み、発現させる方法（特開平９−１３５６９３号公報）を用いても良い。そのような方法は、枯草菌や酵母で既に用いられている公知な方法である。
【００３７】
本発明において、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質は、分泌形態または非分泌形態のいずれで生産されても良いが、分離精製の容易さから培養液中へ分泌させる形態が好ましい。
【００３８】
プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質が分泌形態で生産される場合、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの上流にブレビバチルス属で機能するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを付加または連結するのが好ましい。
【００３９】
５．形質転換体
本発明はまた、上記発現ベクターで形質転換されている、ブレビバチルス属細菌形質転換体を提供する。
【００４０】
宿主細胞としては、任意のブレビバチルス属細菌を使用し得る。ブレビバチルス属細菌は、限定されないがBrevibacillus agri、B.borstelensis、B. brevis、B. centrosporus、B. choshinensis、B. formosus、B. invocatus、B. laterosporus、B. limnophilus、B. parabrevis、B. reuszeri、B. thermoruberを含む。好ましくは、ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・ブレビス４７株（ＪＣＭ６２８５）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株（ＪＣＭ８９７０）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）およびブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３）からなる群より選択される。特に上記のブレビバチルス・ブレビス４７株、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株やブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ株が適している。
【００４１】
生産量の向上などの目的に応じて、上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株や高発現株のような変異株を使用しても良い。具体的に挙げれば、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来のプロテアーゼ変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（特開平６−２９６４８５号公報）や、ヒト唾液アミラーゼ高生産株として取得されたブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（Konishi, H.ら. Appl Microbiol. Biotechnol. 1990. 34:297-302）が使用できる。また前記ブレビバチルス属細菌群に含まれるいずれかの株の変異体を使用してもよい。
【００４２】
上記微生物のうち、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６６４）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）、及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ；〒305-8566 茨城県つくば市東１丁目１−１中央第６）に、上記それぞれの受託番号にて寄託されている。また、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＪＣＭ６２８５）及びブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株（ＪＣＭ８９７０）は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ；〒351-0198 埼玉県和光市広沢２−１）から入手することができる。
【００４３】
６．蛋白質の発現調節
ブレビバチルス属細菌を含めた微生物において異種蛋白質を高発現させた場合、正しくフォールディングされずに不活性型の蛋白質を形成することが多く、特にジスルフィド結合の多い蛋白質を高発現させた場合、細胞内外にて不溶性化することも多い。一方で、目的蛋白質を発現させる際、シャペロン蛋白質やジスルフィド結合異性化酵素および／またはプロリン異性化酵素などを作用させることによって、目的蛋白質の不溶性化や分泌効率の低下を抑えられることが知られている。広く試みられている方法は、ＰＤＩ（プロテインジスルフィドイソメラーゼ）および／またはＤｓｂＡなどのジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質を作用させる方法（特開昭６３−２９４７９６号公報、特開平５−３３６９８６号公報）である。
【００４４】
さらに、ジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を宿主生物に導入し、目的蛋白質とジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質とを同時に発現させて正しいジスルフィド結合を有する蛋白質を生産する方法も知られている（特開２０００−８３６７０号公報、特表２００１−５１４４９０号公報等）。
【００４５】
本発明によるプロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質の発現の場合も、過度な蛋白質合成が行われることによる宿主細胞への負担を軽減し、蛋白質分泌をスムーズに行わせるために、当該蛋白質発現の際、数種類のシャペロン蛋白質、ジスルフィド結合酸化還元酵素、および／またはジスルフィド異性化酵素のようなフォールディングを促進する酵素を同時発現させることも可能である。具体的に挙げれば、ブレビバチルス属細菌において当該蛋白質発現時に、蛋白質のジスルフィド結合に関与し、プロテインジスルフィドイソメラーゼの類縁と考えられている大腸菌のＤｓｂＡ（Bardwell, J.C.A.ら. Cell. 1991. 67：582-589、Kamitani. Sら. EMBO. J. 1992. 11:57-62.）および／または、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ（特開平９−１８０５５８号公報）などのシャペロン蛋白質を同時に発現させることもできる。その他、ポリペプチドの正確なジスルフィド結合に関与している酵素ＰＤＩ（特願２００１−５６７３６７号公報）、ジスルフィド酸化還元酵素（特開２００３−１６９６７５号公報）（Kontinen, V, P. ら Molecular Microbiology. 1993. 8:727-737）、および／またはジスルフィド異性化酵素のようなフォールディングを促進する酵素を当該蛋白質と同時に発現させ、更に分泌効率を向上させることもできる。
【００４６】
７．形質転換体
本発明において用いられるブレビバチルス属細菌の宿主細胞の形質転換は、公知のＴａｋａｈａｈｉらの方法（Takahashi. Wら. J. Bacteriol. 1983. 156:1130-1134）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Takagi. H.ら. 1989. Agric. Biol. Chem, 53:3099-3100）、またはＯｋａｍｏｔｏらの方法(Okamoto. A.ら 1997. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61:202-203) により実施することができる。
【００４７】
得られた形質転換体の培養に用いる培地は、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的にはグルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的蛋白質の分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわちPhenylmethane sulfonyl fluoride (PMSF)、Benzamidine、4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride (AEBSF)、Antipain、Chymostatin、Leupeptin、Pepstatin A、Phosphoramidon、Aprotinin、Ethylenediaminetetra acetic acid (EDTA)、および／または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加しても良い。
【００４８】
培養温度は約１５−４２℃、好ましくは約２８−３７℃であり、通気攪拌条件で好気的に培養を行うことが望ましいが、必要であれば通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。
【００４９】
８．プロテインＡ様蛋白質の取得
本発明の実施形態によれば、形質転換されたブレビバチルス属細菌を培養することにより、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質は、菌体外、すなわち培養上清中に大量に蓄積されるので、培養上清中から活性型の当該蛋白質を採取、精製することが出来る。また菌体内、及び菌表層に残った当該蛋白質も、公知の方法、例えば超音波やフレンチプレス、アルカリやＳＤＳ処理などを利用した方法により菌を破砕し抽出出来る。得られた当該蛋白質は、公知の蛋白質精製方法、例えば硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、エタノールやアセトン等による濃縮、及び、ゲル濾過、イオン交換、ハイドロキシアパタイト、当該蛋白質のもつ抗体結合活性を利用した各種クロマトグラフィーおよび／または、当該蛋白質が有する親和性を利用したクロマトグラフィーなどを用いて、効果的に精製することができる。
【００５０】
本発明の「発現ベクター」により形質転換されたブレビバチルス属細菌形質転換体は、当該蛋白質を安定に発現し、大量に培養上清中へ分泌蓄積することができる。具体的には、適当な培地で培養することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量４万から５万付近に現れる活性型のプロテインＡを培養上清中へ大量に分泌、蓄積させることができる。実施形態による当該蛋白質の生産方法によれば、少なくとも約１５０ｍｇ/Ｌ培養液、好ましくは約２００ｍｇ/Ｌ培養液、より好ましくは約５００ｍｇ/Ｌ培養液、もっとも好ましくは約１０００ｍｇ/Ｌ以上の生産量を達成できる。もっとも、生産量は、培養条件等によって変化しうる。
【００５１】
９．プロテイン様蛋白質の基材への固定
本発明におけるプロテイン様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質を固定する「基材」としては、活性炭、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機基材、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子、または樹脂、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機基材、セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラス、さらには、これらの組み合わせによって得られうる有機−有機、有機−無機などの複合基材が代表例として挙げられるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。好ましくは、該基材は水、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン１１、ポリエチレン、ポリ（塩化ビニリデン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−ジビニルベンゼン、ポリ（トリフルオロエチレン）、ポリ（クロロトリフィルオロエチレン）、ポリ（テレフタル酸エチレン）、ポリプロピレン、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリアクリル酸エステル、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリメタクリル酸エステル、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアミドなどの合成高分子化合物からなる群より選択される。基材の形状としては、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状等いずれも有効に用いられるが、吸着性能面から球状または粒状がより好ましく用いられる。水不溶性多孔質体が球状または粒状である場合、平均粒径は約５μｍから１０００μｍであることが好ましく、より好ましくは約２０〜８００μｍ、最も好ましくは約３０〜６００μｍである。
【００５２】
本発明において、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質の該基材への固定化は、共有または非共有結合、例えばアフィニティ、会合、抗原抗体反応、水素結合、コンジュゲーションなどにより実施しうる。また、当業者に周知の手段により、当該蛋白質に対してアミノ酸残基の付加、置換、欠失などの分子改変を施し、該基材への固定化を容易にすることも可能である。例えば、プロテインＡ様蛋白質の分子内にシステイン残基を導入することによって、プロテインＡ様蛋白質を前記基材に容易に固定化することができる。
【００５３】
本発明の製造方法によって得られるイムノグロブリン吸着担体は、イムノグロブリン、特にＩｇＧの精製用担体として好適に用いられ得る。また、血漿からのＩｇＧの除去等、疾病治療への応用も可能である。
【実施例】
【００５４】
以下、参考例及び実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するものでない。本発明の実施にあたり、組換えＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。 (1) T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook著、「モレキュラー・クローニング／ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning/A Laboratory Manual）」、第２版（1989）、Cold Spring Harbor Laboratory 刊（米国）。 (2) 村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（1996）、丸善株式会社刊。
【００５５】
（実施例１） スタフィロコッカス・アウレウス ＡＴＣＣ６５３８Ｐ株由来のプロテインＡをコードするＤＮＡ配列のクローニング
スタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣ６５３８Ｐ株を、Ｔ２液体培地（ポリペプトン １％、イーストエキストラクト ０．２％、グルコース１％、魚肉エキス０．５％、ｐＨ７．０）で３７℃一晩振とう培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により回収後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２度洗浄した。菌体を同緩衝液に懸濁後、１％ＳＤＳで溶菌し、６０℃にて３０分間加熱後、フェノール抽出及びエタノール沈殿等の定法により全ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００５６】
次に、プロテインＡ遺伝子のＤＮＡ配列情報（非特許文献６）を基に、２つのオリゴヌクレオチドプライマー5'-TTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCGCAACACGATGAAGCT-3' (配列番号５)と5'-CGGGATCCCTAAAATACAGTTGTACCGATGAATGGATT-3'（配列番号６）を調製した。上記のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これら２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、プロテインＡからシグナルシーケンス（Ｓドメイン）及び細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）の一部を除いた部分（これ以降ＳＰＡと称する）をコードするＤＮＡ断片（約１．２ｋｂｐ（キロ塩基対））を増幅した。
【００５７】
得られたＤＮＡ断片は、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化した後、アガロースゲルより分離回収した。
【００５８】
一方、ブレビバチルス発現ベクターであるｐＮＨ３０１（Shiga. Y.ら. Appl. Environ. Microbiol. 1992. 58:525-531.）もまた同様に制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。
【００５９】
制限酵素処理したＳＰＡをコードする上記ＤＮＡ断片と上記発現ベクターｐＮＨ３０１とをＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、ＳＰＡ発現プラスミドＳｐａ−ｐＮＨ３０１を構築した（図３、４；配列番号７、８）。図３および図４において、「ＭＷＰ−Ｐ５」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ５プロモーター領域、「ＳＤＭ」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＳＤ配列、「ＳＰ」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのシグナルペプチド配列、「ｓｐａ」は「ＳＰＡ」をコードするＤＮＡ配列、「Ｎｍ」はネオマイシン耐性遺伝子コード領域、「Ｒｅｐ／ｐＵＢ１１０」はベクターｐＮＨ３０１の複製開始点を意味する。また図４において、「Ｐ５−３５」および「Ｐ５−１０」は、それぞれ、ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ５プロモーターの−３５領域および−１０領域意味する。公知の方法により、このＳｐａ−ｐＮＨ３０１を用いてブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ、またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株の形質転換を行った。
【００６０】
（実施例２） ブレビバチルス属細菌によるプロテインＡの発現試験
実施例１にて得られた形質転換体、及びその対照となるベクターｐＮＨ３０１のみを有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株のそれぞれを、生産培地３ＹＣ（ポリペプトンＳ ３％、酵母エキス０．５％、グルコース３％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１％、ＣａＣｌ2・７Ｈ2Ｏ ０．０１％、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０００１％ ｐＨ７．０）にネオマイシン６０ｍｇ/Ｌを添加した培地にて、３０℃で、好気的条件下、３日間培養を行った。培養液は遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、定法により、１０−２０％グラジエントゲルを用いた還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。電気泳動後、ゲルをＣＢＢ染色することにより、ＳＰＡのバンドを検出した（図５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果、その培養上清液中に大量のＳＰＡを確認することが出来た。
【００６１】
なお、プロテインＡの細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）を含めた完全長型のプロテインＡを発現させる場合には、以下の方法を採用することができる。実施例１で記載したスタフィロコッカス・アウレウスから調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー5'- TTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCGCAACACGATGAAGCT-3' (配列番号５)と、5'-CGCGGATCCTTATAGTTCGCGACGACG-3'（配列番号９）または5'- CGCGGATCCTCAACGTATATAAGTTAAAAT-3'（配列番号１０）とを用い、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅する。得られたプロテインＡをコードするＤＮＡ断片は、実施例１にて記載された方法によりｐＮＨ３０１のＮｃｏＩとＢａｍＨＩとの間へ連結する。得られたプラスミドをブレビバチルス・ブレビス４７Ｋまたはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株へ形質転換することで形質転換体を取得する。この形質転換体を実施例２に記載された培養方法にて培養した後、培養液中へ分泌されたプロテインＡを確認する。
【００６２】
（実施例３） ブレビバチルス属細菌により生産されたプロテインＡの抗体結合能の測定実施例１で得られた形質転換体により生産されたＳＰＡが抗体結合能を有するか確認するため、マウス抗ヒトＩｇＧ抗体及びアルカリフォスファターゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて結合試験を行った。
【００６３】
実施例１にて得られた、Ｓｐａ−ｐＮＨ３０１、及びその対照となるｐＮＨ３０１をそれぞれ有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株を、実施例２と同様に培養し、それぞれの培養上清液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、定法によりＰＶＤＦメンブランへ転写し、３％スキムミルクにてブロッキングを行い、Fahnestockら（Fahnestock. S. Rら. J. Bacteriol. 1986. 165:796-804.）らの方法に準じて抗体結合試験を行った。検出は、ＡＰ発色キット（バイオラッド社製）を用い、その取扱い説明書に従って実施した。その結果、比較対照であるベクターｐＮＨ３０１のみを有する形質転換体ではバンドは認められなかった。一方、ＳＰＡ発現ベクターＳｐａ−ｐＮＨ３０１を有する形質転換体では、ＳＰＡと同じ移動度、すなわちＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、ＣＢＢ染色で濃いバンドの認められた４２ｋＤａ付近に強い発色が認められた（図６）。図６において、「Ｍ」は分子量マーカー、「Ｃ」はベクターｐＮＨ３０１を有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株、ＳｐａはＳＰＡ発現ベクターＳｐａ−ｐＮＨ３０１を有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株のレーンを示す。これらの結果から、ＳＰＡ発現ベクターＳｐａ−ｐＮＨ３０１を有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株により生産された分子量約４２ｋＤａの蛋白質は、抗体結合活性を有することが確認された。
【００６４】
（実施例４） ブレビバチルス発現ベクターｐＮＫ３２６０の構築
ｐＮＨ３２６（Ishihara. Tら、1995. J. Bacteriol, 177:745-749）に含まれるＭＷＰのＰ５プロモーターをＭＷＰのＰ２プロモーターに変換して、ブレビバチルス発現ベクターｐＮＫ３２６０を以下のように構築した。
【００６５】
まず、ｐＮＨ３２６を鋳型として、２つのオリゴヌクレオチドプライマー5'-GGAATTCTGATTTCACTTTTTGCATTCTACA-3'（配列番号１３）および5'-AGTGCACTCGCACTTACTGT-3'（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行い、ｐＮＨ３２６のうちＭＷＰのＰ５プロモーターを除く部分を増幅し、その末端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化した。次に、ＭＷＰのＰ２プロモーターを含む２本鎖ＤＮＡ断片5'- GGTACCAATTGGCGCCGCAACTTTTGATTCGCTCAGGCGTTTAATAGGATGTAATTGTGAGCGGATAACAATTATTCTGCATGGCTTTCCTGCGAAAGGAGGTGCACCGCGCTTGCAGGATTCGGGCTTTAAAAAGAAAGATAGATTAACAACAAATATTCCCCAAGAACAATTTGTTTATACTGGAGGAGGAGAACACAAGGTCATGAAAAAAAGAAGGGTCGTTAACAGTGTATTGCTTCTGCTACTGCTAGCTAGTGCACTCGCACTTACTGTTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCAGGATCCGTCGACTCTAGACTCGAGGAATTCGGTACCCCGGGTTCGAAATCGATAAGCTTCTGT- 3'（配列番号１５）を定法に従い調製し、その末端を制限酵素ＭｕｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、ｐＮＫ３２６０を構築した。
【００６６】
（実施例５） スタフィロコッカス・アウレウス・コワンＩ株（ＪＣＭ２１７９）由来のプロテインＡをコードするＤＮＡ配列のクローニング
実施例１と同様に、スタフィロコッカス・アウレウス・コワンＩ株（ＪＣＭ２１７９）から全ゲノムＤＮＡを抽出した。次に、プロテインＡ遺伝子のＤＮＡ配列情報（非特許文献２）を基に、２つのオリゴヌクレオチドプライマー5'- TTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCGCAACACGATGAAGCTCAACAA-3' (配列番号１６)と 5'-CGGGATCCCTATTTTGGTGCTTGAGCATCGTTTAGCTTTTTAGCTTCTGCTAAAATTTTC-3'（配列番号１７）を調製した。上記のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これら２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、プロテインＡからシグナルシーケンス（Ｓドメイン）及び細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）を除いた部分（これ以降ＳＰＡ’と称する）をコードするＤＮＡ断片（約０．９ｋｂｐ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片は、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化した後、アガロースゲルより分離回収した。
【００６７】
一方、実施例４で構築したブレビバチルス発現ベクターｐＮＫ３２６０もまた同様に制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。
【００６８】
制限酵素処理後の、ＳＰＡ’をコードする上記ＤＮＡ断片と上記発現ベクターｐＮＫ３２６０とをＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、ＳＰＡ’発現プラスミドＳｐａ’−ｐＮＫ３２６０を構築した（図７、８；配列番号１８、１９）。図７および図８において、「ＭＷＰ−Ｐ２」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ２プロモーター領域、「ＳＤＭ」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＳＤ配列、「ＳＰ’」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのシグナルペプチド配列を一部改変した改変型シグナルペプチド配列、「ｓｐａ’」はＳＰＡ’をコードするＤＮＡ配列、「Ｎｍ」はネオマイシン耐性遺伝子コード領域、「Ｒｅｐ／ｐＵＢ１１０」はベクターｐＮＫ３２６０の複製開始点を意味する。また図８において、「Ｐ２−３５」および「Ｐ２−１０」は、それぞれ、ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ２プロモーターの−３５領域および−１０領域意味する。
【００６９】
公知の方法により、このＳｐａ’−ｐＮＫ３２６０を用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株の形質転換を行った。
【００７０】
（実施例６） ブレビバチルス属細菌により分泌発現されたプロテインＡの培養液中の挙動
実施例５にて得られた形質転換体を、生産培地３ＹＣ（ポリペプトンＳ ３％、酵母エキス０．５％、グルコース３％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１％、ＣａＣｌ2・７Ｈ2Ｏ ０．０１％、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０００１％ ｐＨ７．０）にネオマイシン６０ｍｇ/Ｌを添加した培地にて、３０℃の、好気的条件下で培養した。培養開始から、２４、４８、７２、７８時間後に培養液を分取し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、定法により、１０−２０％グラジエントゲルを用いた還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。電気泳動後、ゲルをＣＢＢ染色することにより、ＳＰＡ’のバンドを検出した（図９）。図９において、「レーン番号１」は分子量マーカーを、「レーン番号２」は対照として用いたＲｅｐｌｉｇｅｎ社製プロテインＡ（ｒＰＡ−５０）０．５２μｇを、「レーン番号３」は培養開始から２４時間経過後のＳＰＡ’発現ベクターＳｐａ’−ｐＮＫ３２６０を有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株の培養上清１μｌを、「レーン番号４」は培養開始から４８時間経過後の同培養上清１μｌを、「レーン番号５」は培養開始から７２時間経過後の同培養上清１μｌを、「レーン番号６」は培養開始から７８時間経過後の同培養上清１μｌを、それぞれ泳動したレーンを示す。
【００７１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果、目的とするＳＰＡ’は、培養開始後４８時間目（レーン番号４）には大量に発現し、それ以降もＳＰＡ’の濃度は上昇しつづけ、最終的に培養上清中に約２ｇ/Ｌの濃度で蓄積していた。培養上清中のＳＰＡ’の濃度は、レーン番号２で泳動したＲｅｐｌｉｇｅｎ社製プロテインＡ（ｒＰＡ−５０）０．５２μｇのバンドを対照として、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により測定した。
【００７２】
（実施例７） 形質転換体により生産されたプロテインＡのＮ末端アミノ酸配列の確認
図９に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のレーン番号６において、分子量３３ｋＤａ付近に見られるＳＰＡ’のバンドについて、そのＮ末端から１０残基のアミノ酸配列を、定法に従い解析した。その結果、配列番号２に示したプロテインＡのアミノ酸配列の３７番目のＡｌａ以降の配列と一致し、分泌シグナル配列が正確に除去されていることが確認された。
【００７３】
（実施例８） 形質転換体により生産されたプロテインＡの抗体結合活性
実施例６と同様に７８時間培養して得られた培養液の上清１Ｌを、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：アマシャムバイオサイエンス）に供し、ｐＨ７．０において０−１Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配により分離した。次にＳＰＡ’画分を回収し、疎水クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：アマシャムバイオサイエンス）に供し、ｐＨ７．０において１−０Ｍ硫酸アンモニウムの濃度勾配により分離した。さらに、ＳＰＡ’画分を回収し、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇ：アマシャムバイオサイエンス）に供し、ＳＰＡ’画分を回収した。以上の精製操作により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示す、約１００ｍｇのＳＰＡ’を調製した。
【００７４】
上記で調製したＳＰＡ’のヒトＩｇＧ結合活性を以下の様に評価した。まず、５μｇ／ｍＬとなるようにＳＰＡ’をＰＢＳ緩衝液（タカラバイオ）で希釈し、９６穴イムノプレート（ＮＵＮＣ）に１００μＬずつ分注した。３７℃で１時間反応させた後に、ＰＢＳ緩衝液（２５０μＬ）にて二回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ溶液を２５０μＬ加え、４℃で一晩ブロッキングした。次に、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で調製した２５μｇ／ｍＬヒトＩｇＧ（シグマ）溶液１００μｌを加えて、３７℃で、１．５時間反応後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液で洗浄した。これに、ＰＢＳ緩衝液にて２０００倍に希釈したＨＲＰ標識プロテインＬ（０．３ｍｇ／ｍｌ；シグマ社）溶液を１００μｌ加え、３７℃で、１．５時間反応後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液で洗浄した。さらに、発色基質［２，２’−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリンー６−スルフォン酸）アンモニウム塩］溶液（シグマ社）を１００μｌ加え、暗所にて２０分間反応後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。この時、対照としてＲｅｐｌｉｇｅｎ社製プロテインＡ（ｒＰＡ−５０）についても同様の操作を行い、測定値を比較したところ、上記で調製したＳＰＡ’の単位質量当たりのヒトＩｇＧ結合活性は、上記Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製プロテインＡの約９７％であり、両者はほぼ同等の活性を有することが確認された。
【００７５】
以上の結果から、実施例によるプロテインＡの生産方法によれば、従来報告されていた大腸菌、枯草菌における組換え型プロテインＡの発現量を上回る生産性を達成でき、従来問題となっていた低生産性の問題を解決できることを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブレビバチルス属細菌を使用した、イムノグロブリン結合能を有するプロテインＡ様蛋白質の製造方法に関する。詳細には、本発明は、遺伝子組換え技術により、ブレビバチルス属細菌にプロテインＡ様蛋白質を多量に分泌発現させること、その発現されたプロテインＡ様蛋白質を、プロテアーゼ等による分解を受けることなく高純度で分離回収すること、及び、その分離回収されたプロテインＡ様蛋白質を、抗体精製用のカラム樹脂等の用途へ有効に使用することに関する。
【０００２】
日本国特許出願２００４−１９８８３１号（２００４年７月６日出願）の明細書、請求の範囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体される。
【背景技術】
【０００３】
抗体（イムノグロブリン、またはＩｇとも呼ばれる）蛋白質は生体における有害な抗原の補足及び排除機能を有するため古くから医薬品として利用されてきた。近年では遺伝子工学技術や細胞融合技術の進歩により特異的な抗原に反応する抗体を分子設計し、動物細胞内で発現させることにより均一で高い抗原性を有するモノクローナル抗体の作製が可能となった。これらの抗体蛋白質は細胞培養液中に分泌されることから、比較的容易に分離精製回収することができる。
【０００４】
一般的に、イムノアッセイやイムノブロット解析に利用される抗体蛋白質の場合、通常の蛋白質精製において利用される方法、すなわち硫酸アンモニウムによる沈殿法やイオン交換クロマトグラフィー等を用いることによって、血清、腹水または細胞培養液のような天然生体サンプルから、十分な収量や純度で得ることができる。
【０００５】
一方、高純度を必要とする医薬品または診断薬等に利用される抗体蛋白質の場合、上記のような方法を用いて分離精製するには、様々な分離抽出条件の検討や数多くの他のクロマトグラフィーとの併用を必要とし、また、それぞれの抗体蛋白質に関して精製条件の最適化が必要となり、非常な労力を要する。従って、高純度を必要とする抗体蛋白質の精製の場合、他の夾雑物質から簡便に分離精製するために、抗体蛋白質を特異的に吸着することが可能なアフィニティークロマトグラフィーを用いるのが一般的である。
【０００６】
抗体結合能を有するアフィニティークロマトグラフィーとして最も良く利用されているのが、プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬなどの蛋白質を適当な樹脂に固定化した担体によるクロマトグラフィーである。これらの蛋白質の中で特に精製用担体のリガンドとしてよく利用されているのがプロテインＡである。プロテインＡはグラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁蛋白質の１種であり、約４２，０００の分子量であることが明らかとなっている。その構造は７つの機能ドメイン（アミノ末端からシグナル配列Ｓ、イムノグロブリン結合ドメインＥ、イムノグロブリン結合ドメインＤ，イムノグロブリン結合ドメインＡ、イムノグロブリン結合ドメインＢ、イムノグロブリン結合ドメインＣ、スタフィロコッカス・アウレウス細菌細胞壁結合ドメインＸ）(非特許文献１、２、３参照)から構成されている。プロテインＡの５つのイムノグロブリン結合ドメイン（ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）は、それぞれイムノグロブリン分子内のＦｃ部分で結合することができる（非特許文献３参照）。
【０００７】
このプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインに対する相対親和性は、ｐＨ、スタフィロコッカス・アウレウス菌株種（Cheung, A.ら Infec. Immun. 1987. 55:843-847）、またイムノグロブリンのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）及びサブクラス（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）などの多くの因子に依存することが知られ、特にイムノグロブリンのクラスではヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４及びマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ３のＦｃ部分と強い結合を示す。以上のような性質を持つプロテインＡは、イムノグロブリンとしての抗原結合能力、親和力や性質を損なうことなくイムノグロブリンに結合することができるため、様々な診断、医薬品及び基礎研究に用いられるイムノグロブリン、特にＩｇＧに対し精製用担体のリガンドとして広く使用されている。
【０００８】
また最近では、感作末梢血リンパ球の腫瘍細胞毒性作用を阻害する血清阻止因子（特異抗原、抗体、抗グロブリン及び免疫複合体で構成される）を、プロテインＡに吸着させ腫瘍患者の血清から除去するといった、癌治療への応用にも興味が持たれている（特許文献１−３参照）。さらにＩｇＧ結合活性とは別にプロテインＡは多クローン抗体合成を活性化する働きも有していることから、当初の精製樹脂リガンド用途だけでなく様々なバイオテクノロジー分野における使用用途が期待されている。
【０００９】
初期のプロテインＡの生産方法においてはスタフィロコッカス・アウレウス株の培養液から直接、分離精製を行ってきたが、この菌自身の病原性の問題や不純物の混入の問題により、現在では大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（特許文献１−３）やグラム陽性細菌である枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（特許文献４−５）を用いた組換えＤＮＡ技術を用いた生産方法へ移行している。ところが、大腸菌における組換え型プロテインＡの生産性は極めて低く、また、発現蛋白質の多くがインクルージョンボディーを形成したり、細胞内で分解されるため、分離回収が容易ではない（非特許文献４）。一方、スタフィロコッカス・アウレウスと同様にグラム陽性細菌である枯草菌を用いたプロテインＡの生産では、プロテインＡのＮ末端へ枯草菌分泌蛋白質のシグナル配列を付加することで培地中へ分泌発現させる方法が取られており、大腸菌での生産系と比較した場合、分離精製等が容易であり、生産性も高いことが報告されている（約４７−１００ｍｇ/Ｌ）（Fahnestock, S, R.ら J. Bacteriol. 1986. 165:796-804）。ところが、枯草菌において生産されたプロテインＡは、枯草菌が本来持つ菌体外プロテアーゼによる分解を受ける。そのため、枯草菌の数種の菌体外プロテアーゼ欠損株（非特許文献５）を宿主として用いることも試みられてきたが、プロテインＡの分解を抑えることは未だ達成できていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】日本国特願平０７−１８７０１９号公報
【特許文献２】米国特許番号ＵＳ５１５１３５０号公報
【特許文献３】欧州特許番号ＥＰ０１０７５０９号公報
【特許文献４】米国特許番号ＵＳ４６１７２６６号公報
【特許文献５】欧州特許番号ＥＰ０１２４３７４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Lofdahl, Sら.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. 80:697-701.
【非特許文献２】Shuttleworth, H. Lら.Gene. 1987. 58:283-295.
【非特許文献３】Uhlen, M.ら.J. Bio. Chem. 1984. 259:1695-1702.
【非特許文献４】Nilsson, Bら. Protein Eng. 1987. 1:107-113.
【非特許文献５】Fahnestock, S. Rら. Appl.Envron. Microbiol. 1987. 53:379-384.
【非特許文献６】Brigido, Mら, J. Basic Microbiology. 1991. 31: 337-345.
【非特許文献７】Sjostrom, J, -Eら. J. bacteriol. 1975. 123:905-915.
【非特許文献８】Bjorck, L.ら. 1984. J. Immunol. 133, 969-974.
【非特許文献９】Kastern, W.ら. J Biol Chem. 1992. 267:12820-12825
【非特許文献１０】Udaka, S.ら. Method Enzymol. 1993. 217:23-33.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このような背景から、大腸菌や枯草菌を用いた生産方法を上回る、効率の良いプロテインＡの生産技術の確立が、強く望まれていた。
【００１３】
本発明は、大腸菌や枯草菌を用いた生産方法を上回る、効率の良いプロテインＡの生産技術の提供を一つの課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、プロテインＡのような機能蛋白質を安定、大量に生産する技術を確立するため、ブレビバチルス属細菌を宿主に使い鋭意研究を行った結果、プロテインＡを効率良く培養液中へ大量に分泌発現、そして安定に蓄積させ、容易に高純度で分離回収できることを見いだした。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に従えば、ブレビバチルス属細菌を宿主に用いることにより、大腸菌や枯草菌などの微生物を宿主とした場合に報告されている生産量を大幅に上回るプロテインＡを培養液中へ分泌生産させ、イムノグロブリン結合機能を損なわずに容易に高純度にまで精製することができる。従って、本発明により、現在まで高価格の一因となっていたプロテインＡの低生産性や、精製工程の複雑さが解消される。
【００１６】
本発明は、以下の１または複数の対象を含む。
（１）本発明は、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列をコードするＤＮＡ配列、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターを含む、ＤＮＡ配列を提供する。
（３）本発明は、前記ＤＮＡ配列を含む、発現ベクターを提供する。
（４）本発明は、前記発現ベクターを含む、ブレビバチルス属細菌形質転換体を提供する。
（６）本発明は、前記形質転換体を培養すること、および該形質転換体によって分泌生産されるプロテインＡ様蛋白質、またはその部分的配列を有する蛋白質を回収することを含む、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質の製造方法を提供する。
（７）本発明は、前記製造方法によってプロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質を製造すること、および該プロテイン様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質を適当な基材に固定化すること、を含む、イムノグロブリン吸着担体の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、スタフィロコッカス・アウレウス・コワン（Ｃｏｗａｎ）Ｉ株のプロテインＡの塩基配列とアミノ酸配列とを示す図である（番号はアミノ酸残基数を示す）。
【図２】図２は、スタフィロコッカス・アウレウス株のプロテインＡの遺伝子配列とアミノ酸配列とを示す図である（番号はアミノ酸残基数を示す）。
【図３】図３は、プロテインＡ（ＳＰＡ）発現ベクター（Ｓｐａ−ｐＮＨ３０１）を示す図である。
【図４】図４は、プロテインＡ（ＳＰＡ）発現ベクター（Ｓｐａ−ｐＮＨ３０１）のプロモーター配列からプロテインＡ（ＳＰＡ）をコードする領域までの塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図５】図５は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株により生産されたプロテインＡ（ＳＰＡ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果を示す図である。
【図６】図６は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株により生産されたプロテインＡ（ＳＰＡ）の、抗体結合試験の結果を示す図である。
【図７】図７は、プロテインＡ（ＳＰＡ’）発現ベクター（Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０）を示す図である。
【図８】図８は、プロテインＡ（ＳＰＡ’）発現ベクター（Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０）のプロモーター配列、シャインダルガノ配列、シグナルペプチドおよびプロテインＡ（ＳＰＡ’）をコードするＤＮＡ配列を示す図である。
【図９】図９は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株により生産されたプロテインＡ（ＳＰＡ’）の培養液中での挙動およびその蓄積量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明者らは、組換えＤＮＡ技術が利用できる細菌の中でも、グラム陽性細菌であるブレビバチルス属細菌を用いることで、活性型のプロテインＡを大量に培養液中へ分泌発現させることができ、大腸菌及び枯草菌における低生産性の問題、並びに枯草菌における発現したプロテインＡの分解に対する問題が効果的に改善されることを発見した。すなわち、ブレビバチルス属細菌を用いることで、枯草菌で得られる発現量を容易に確保し、さらにこれを培地中へ蓄積させることができる。以下、実施形態に基づいて本発明について詳しく説明する。
【００１９】
１．プロテインＡ
プロテインＡは、前述のように、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウスによって生産される細胞壁蛋白質の１種であり、例えば、図１（配列番号２）にて示されるアミノ酸配列からなるスタフィロコッカス・アウレウス・コワン（Ｃｏｗａｎ）Ｉ株（ＪＣＭ２１７９）由来のもの（非特許文献２）、図２（配列番号４）にて示されるアミノ酸配列からなるもの（非特許文献６、Finck-Barbancon,V.ら FEMS Microbiol. Lett. 1992. 91:1-8）、Ｗｏｏｄｓ４６株由来のもの（非特許文献３）、８３２５−４株由来のもの（非特許文献３）、および既にクローニングされているプラスミドＤＮＡすなわちｐＳＰ１やｐＳＰ３等（非特許文献７）にコードされているspa遺伝子産物等を指す。
【００２０】
本発明にいうプロテインＡ様蛋白質には、プロテインＡ、またはプロテインＡと実質的に同一の蛋白質が含まれる。また、プロテインＡ様蛋白質には、当業者にとって公知の配列比較アルゴリズムを使用して、プロテインＡのアミノ酸配列と比較され、そして最大の一致のためにアラインメントされるときに、少なくとも６０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０−９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸残基の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、イムノグロブリン結合活性を有する蛋白質が含まれる。ここで、同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは５０残基長以上であり、より好ましくは１００残基長以上であり、さらに好ましくは１５０残基長以上であり、最も好ましい実施態様では、完全長に渡り同一性を有する。
【００２１】
パーセント配列同一性を決定するために好適であるアルゴリズムの例は、BLASTアルゴリズムであり、これはAltschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990)に記載されている。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公衆が利用可能である。
【００２２】
プロテインＡ様蛋白質は、例えば、配列番号１または配列番号３に示したＤＮＡ配列に対して相補的な配列を有するＤＮＡに、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質であり得る。該ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーション条件の例は：好ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中で約５０℃でハイブリダイゼーション、および約２ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中で５０℃の洗浄；より望ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、約１ｍＭのＥＤＴＡで５０℃でハイブリダイゼーション、および約１ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳで約５０℃の洗浄；より望ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、約１ｍＭのＥＤＴＡで約５０℃でハイブリダイゼーション、および約０．５ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳで約５０℃の洗浄；より好ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、約１ｍＭのＥＤＴＡで約５０℃でハイブリダイゼーション、および約０．１ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳで約５０℃の洗浄；並びになおより好ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、約１ｍＭのＥＤＴＡで約５０℃で、約０．１ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳで約６５℃の洗浄である。もっとも、該条件は、ヌクレオチド鎖の長さ、該配列、および異なる環境パラメーターに依存して異なり得る。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、例えばTijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2''Overview of principles of hybridization and the starategy of nucleic acid probe assay''Elsvier, New Yorkに見出される。
【００２３】
このように、図１（配列番号１および２）および図２（配列番号３および４）にて示されるプロテインＡをコードするＤＮＡ配列、およびプロテインＡのアミノ酸配列を知ることにより、「プロテインＡ様蛋白質」、およびそれをコードするＤＮＡ配列の存在を認識することは、遺伝子工学分野の技術者にとって容易である。
【００２４】
「プロテインＡ様蛋白質」には、例えば、プロテインＡを構成するイムノグロブリン結合ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）を任意の順列に並べ替えたものも含まれる。
【００２５】
さらに、「プロテインＡ様蛋白質」には、例えば、グループＣ及びＧのストレプトコッカス属細菌(Streptococcal)の有するプロテインＧ（非特許文献８）、またはペプトストレプトコッカス・マグニウス（Peptostreptococcus magnus）のプロテインＬ（非特許文献９）といったプロテインＡと同様なイムノグロブリン結合機能を有する蛋白質も含まれる。
【００２６】
２．プロテインＡ様蛋白質の部分的配列
プロテインＡ様蛋白質の「部分的配列」とは、上記プロテインＡ様蛋白質を構成するアミノ酸配列の任意の一部分から構成されるものであって、かつ、イムノグロブリン結合活性を有する蛋白質を指し、具体的には、例えば、プロテインＡから先述のシグナル配列Ｓおよび細胞壁結合ドメインＸの一部を除いて得られる、配列番号８の２４番目のＡｌａ以降で示されるアミノ酸配列（実施例１の「ＳＰＡ」に対応。図３および４、配列番号７および８参照。）、および、プロテインＡから先述のシグナル配列Ｓおよび細胞壁結合ドメインＸの全部を除いて得られる、配列番号１９の３１番目のＡｌａ以降で示されるアミノ酸配列（実施例５の「ＳＰＡ’」に対応。図７および８、配列番号１８および１９参照。）のそれぞれが、プロテインＡ様蛋白質の「部分的配列」に対応する。
【００２７】
さらに上記プロテインＧやＬが有するイムノグロブリン結合ドメインを構成するアミノ酸配列も「部分的配列」として挙げることができる。
【００２８】
本明細書にいうプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとは、例えば、図１における３７アミノ酸残基から３２７アミノ酸残基位（ドメインＥからＣ）、図２における３７アミノ酸残基から３５５アミノ酸残基（ドメインＥからＣ）のことを指す。
【００２９】
３．プロテインＡ様蛋白質をコードするＤＮＡ配列
本発明に用いられる、プロテインＡ様蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、そのＤＮＡ配列を翻訳したアミノ酸配列が、プロテインＡ様蛋白質を構成するものであればいずれでも良い。そのようなＤＮＡ配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり（Nucleic acids Res.1984. 12:4359）、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該ＤＮＡ配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても良く、ブレビバチルス属内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来のＤＮＡ配列と同一である必要性は無い。
【００３０】
４．発現ベクター
本発明の「発現ベクター」は、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列をコードするＤＮＡ配列、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターを含む。当該プロモーターは、ブレビバチルス属細菌で機能しうるものであればいかなるものでも良いが、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等細菌由来でブレビバチルス属細菌内にて作動可能なプロモーターが好ましく、ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）、同蛋白質であるｏｕｔｅｒ ｗａｌｌｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）(非特許文献１０)または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰ（Ebisu. Sら. J. Bacteriol. 1990. 172:1312-1320）をコードする遺伝子のプロモーターがより好ましい。実施例では、実施例１に示すブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ５プロモーター領域「ＭＷＰ−Ｐ５」（図３、４、配列番号７、８参照）、および、実施例５に示すブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ２プロモーター領域「ＭＷＰ−Ｐ２」（図７、８、配列番号１８、１９参照）のそれぞれが、「ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーター」に対応する。
【００３１】
また、「発現ベクター」は、該プロモーターの下流に、ブレビバチルス属細菌で機能しうるシャインダルガノ配列及びシグナル配列をさらに含むのが好ましい。発現ベクターは、所望によりマーカー配列を含んでもよい。
【００３２】
上記のプロモーター配列に続く「シャインダルガノ配列」は、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等細菌由来でブレビバチルス属細菌内にて作動可能なシャインダルガノ配列が好ましく、ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）、同蛋白質であるｏｕｔｅｒｗａｌｌｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）、または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰをコードする遺伝子の上流に存在するシャインダルガノ配列がより好ましい。
【００３３】
上記のシャインダルガノ配列に続く、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、以下の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列であれば特に制限は無く、ブレビバチルス・ブレビス内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来のＤＮＡ配列と同一である必要性は無い。分泌シグナルペプチドとしては、例えば、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等細菌由来で、ブレビバチルス属細菌内にて作動可能な分泌シグナルペプチドが好ましく、ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）、同蛋白質であるｏｕｔｅｒ ｗａｌｌｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰの分泌シグナルペプチドがより好ましい。また従来の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を改良したものでも構わない。具体的に言えばｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）のシグナルペプチド、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号１１）をＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号１２）の下線部ように塩基性や疎水性アミノ酸残基など付加または消失させた分泌シグナルペプチドでも構わない。また従来からブレビバチルス属の分泌蛋白質において使われている分泌シグナルペプチドでも構わない。さらに該プロテインＡが本来有するシグナルペプチド（図１、２）、すなわち、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ でも構わない。
【００３４】
上記のプロモーター配列、シャインダルガノ配列、および分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、例えば、ブレビバチルス属細菌から得ることができる。好ましくは、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＪＣＭ６２８５）（特開昭６０−５８０７４号公報参照）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０８）（非特許文献１０参照）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６６４）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）（特開平４−２７８０９１号公報参照）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）、またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３）（特開平６−２９６４８５号公報参照）の染色体ＤＮＡを鋳型として、公知のＰＣＲ法で特異的に増やすことにより取得できる。
【００３５】
本発明の「発現ベクター」においては、上記の任意のプロモーターと、上記の任意のシャインダルガノ配列、上記の任意のシグナルペプチド配列と、該プロテインＡ様蛋白質またはプロテインＡ様蛋白質の部分的配列をコードするＤＮＡ配列とが、ブレビバチルス属細菌内において作動可能に連結されていることが好ましい。
【００３６】
ベクターとしては、プラスミドベクターが好ましい。ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとして具体的には、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、またはｐＨＹ５００(特開平２−３１６８２号公報)、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１(J. Bacteriol. 1987. 1239-1245)、ｐＮＵ２００(鵜高重三、日本農芸化学会誌1987. 61: 669-676)、ｐＮＵ１００(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 30:75-80)、ｐＮＵ２１１(J. Biochem., 1992, 112:488-491)、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５(特開平７−１７０９８４号公報)、ｐＮＨ３０１（Shiga. Y.ら. Appl. Environ. Microbiol. 1992. 58:525-531.）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ishihara. Tら、1995. J. Bacteriol, 177:745-749）、ｐＨＴ２１０（特開平６−１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42:358-363)、または大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）が使用可能であるが、これらに限定されることはない。また、ブレビバチルス属細菌で機能するプロモーターとシャインダルガノ配列と目的蛋白質をコードするＤＮＡ配列とを含んだ発現ベクター、または、それらの各配列を含む遺伝子断片を染色体中へ直接組み込み、発現させる方法（特開平９−１３５６９３号公報）を用いても良い。そのような方法は、枯草菌や酵母で既に用いられている公知な方法である。
【００３７】
本発明において、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質は、分泌形態または非分泌形態のいずれで生産されても良いが、分離精製の容易さから培養液中へ分泌させる形態が好ましい。
【００３８】
プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質が分泌形態で生産される場合、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの上流にブレビバチルス属で機能するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを付加または連結するのが好ましい。
【００３９】
５．形質転換体
本発明はまた、上記発現ベクターで形質転換されている、ブレビバチルス属細菌形質転換体を提供する。
【００４０】
宿主細胞としては、任意のブレビバチルス属細菌を使用し得る。ブレビバチルス属細菌は、限定されないがBrevibacillus agri、B.borstelensis、B. brevis、B. centrosporus、B. choshinensis、B. formosus、B. invocatus、B. laterosporus、B. limnophilus、B. parabrevis、B. reuszeri、B. thermoruberを含む。好ましくは、ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・ブレビス４７株（ＪＣＭ６２８５）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株（ＪＣＭ８９７０）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）およびブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３）からなる群より選択される。特に上記のブレビバチルス・ブレビス４７株、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株やブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ株が適している。
【００４１】
生産量の向上などの目的に応じて、上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株や高発現株のような変異株を使用しても良い。具体的に挙げれば、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来のプロテアーゼ変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（特開平６−２９６４８５号公報）や、ヒト唾液アミラーゼ高生産株として取得されたブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（Konishi, H.ら. Appl Microbiol. Biotechnol. 1990. 34:297-302）が使用できる。また前記ブレビバチルス属細菌群に含まれるいずれかの株の変異体を使用してもよい。
【００４２】
上記微生物のうち、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６６４）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）、及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ；〒305-8566 茨城県つくば市東１丁目１−１中央第６）に、上記それぞれの受託番号にて寄託されている。また、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＪＣＭ６２８５）及びブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株（ＪＣＭ８９７０）は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ；〒351-0198 埼玉県和光市広沢２−１）から入手することができる。
【００４３】
６．蛋白質の発現調節
ブレビバチルス属細菌を含めた微生物において異種蛋白質を高発現させた場合、正しくフォールディングされずに不活性型の蛋白質を形成することが多く、特にジスルフィド結合の多い蛋白質を高発現させた場合、細胞内外にて不溶性化することも多い。一方で、目的蛋白質を発現させる際、シャペロン蛋白質やジスルフィド結合異性化酵素および／またはプロリン異性化酵素などを作用させることによって、目的蛋白質の不溶性化や分泌効率の低下を抑えられることが知られている。広く試みられている方法は、ＰＤＩ（プロテインジスルフィドイソメラーゼ）および／またはＤｓｂＡなどのジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質を作用させる方法（特開昭６３−２９４７９６号公報、特開平５−３３６９８６号公報）である。
【００４４】
さらに、ジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を宿主生物に導入し、目的蛋白質とジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質とを同時に発現させて正しいジスルフィド結合を有する蛋白質を生産する方法も知られている（特開２０００−８３６７０号公報、特表２００１−５１４４９０号公報等）。
【００４５】
本発明によるプロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質の発現の場合も、過度な蛋白質合成が行われることによる宿主細胞への負担を軽減し、蛋白質分泌をスムーズに行わせるために、当該蛋白質発現の際、数種類のシャペロン蛋白質、ジスルフィド結合酸化還元酵素、および／またはジスルフィド異性化酵素のようなフォールディングを促進する酵素を同時発現させることも可能である。具体的に挙げれば、ブレビバチルス属細菌において当該蛋白質発現時に、蛋白質のジスルフィド結合に関与し、プロテインジスルフィドイソメラーゼの類縁と考えられている大腸菌のＤｓｂＡ（Bardwell, J.C.A.ら. Cell. 1991. 67：582-589、Kamitani. Sら. EMBO. J. 1992. 11:57-62.）および／または、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ（特開平９−１８０５５８号公報）などのシャペロン蛋白質を同時に発現させることもできる。その他、ポリペプチドの正確なジスルフィド結合に関与している酵素ＰＤＩ（特願２００１−５６７３６７号公報）、ジスルフィド酸化還元酵素（特開２００３−１６９６７５号公報）（Kontinen, V, P. ら Molecular Microbiology. 1993. 8:727-737）、および／またはジスルフィド異性化酵素のようなフォールディングを促進する酵素を当該蛋白質と同時に発現させ、更に分泌効率を向上させることもできる。
【００４６】
７．形質転換体
本発明において用いられるブレビバチルス属細菌の宿主細胞の形質転換は、公知のＴａｋａｈａｈｉらの方法（Takahashi. Wら. J. Bacteriol. 1983. 156:1130-1134）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Takagi. H.ら. 1989. Agric. Biol. Chem, 53:3099-3100）、またはＯｋａｍｏｔｏらの方法(Okamoto. A.ら 1997. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61:202-203) により実施することができる。
【００４７】
得られた形質転換体の培養に用いる培地は、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的にはグルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的蛋白質の分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわちPhenylmethane sulfonyl fluoride (PMSF)、Benzamidine、4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride (AEBSF)、Antipain、Chymostatin、Leupeptin、Pepstatin A、Phosphoramidon、Aprotinin、Ethylenediaminetetra acetic acid (EDTA)、および／または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加しても良い。
【００４８】
培養温度は約１５−４２℃、好ましくは約２８−３７℃であり、通気攪拌条件で好気的に培養を行うことが望ましいが、必要であれば通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。
【００４９】
８．プロテインＡ様蛋白質の取得
本発明の実施形態によれば、形質転換されたブレビバチルス属細菌を培養することにより、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質は、菌体外、すなわち培養上清中に大量に蓄積されるので、培養上清中から活性型の当該蛋白質を採取、精製することが出来る。また菌体内、及び菌表層に残った当該蛋白質も、公知の方法、例えば超音波やフレンチプレス、アルカリやＳＤＳ処理などを利用した方法により菌を破砕し抽出出来る。得られた当該蛋白質は、公知の蛋白質精製方法、例えば硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、エタノールやアセトン等による濃縮、及び、ゲル濾過、イオン交換、ハイドロキシアパタイト、当該蛋白質のもつ抗体結合活性を利用した各種クロマトグラフィーおよび／または、当該蛋白質が有する親和性を利用したクロマトグラフィーなどを用いて、効果的に精製することができる。
【００５０】
本発明の「発現ベクター」により形質転換されたブレビバチルス属細菌形質転換体は、当該蛋白質を安定に発現し、大量に培養上清中へ分泌蓄積することができる。具体的には、適当な培地で培養することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量４万から５万付近に現れる活性型のプロテインＡを培養上清中へ大量に分泌、蓄積させることができる。実施形態による当該蛋白質の生産方法によれば、少なくとも約１５０ｍｇ/Ｌ培養液、好ましくは約２００ｍｇ/Ｌ培養液、より好ましくは約５００ｍｇ/Ｌ培養液、もっとも好ましくは約１０００ｍｇ/Ｌ以上の生産量を達成できる。もっとも、生産量は、培養条件等によって変化しうる。
【００５１】
９．プロテイン様蛋白質の基材への固定
本発明におけるプロテイン様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質を固定する「基材」としては、活性炭、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機基材、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子、または樹脂、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機基材、セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラス、さらには、これらの組み合わせによって得られうる有機−有機、有機−無機などの複合基材が代表例として挙げられるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。好ましくは、該基材は水、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン１１、ポリエチレン、ポリ（塩化ビニリデン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−ジビニルベンゼン、ポリ（トリフルオロエチレン）、ポリ（クロロトリフィルオロエチレン）、ポリ（テレフタル酸エチレン）、ポリプロピレン、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリアクリル酸エステル、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリメタクリル酸エステル、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアミドなどの合成高分子化合物からなる群より選択される。基材の形状としては、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状等いずれも有効に用いられるが、吸着性能面から球状または粒状がより好ましく用いられる。水不溶性多孔質体が球状または粒状である場合、平均粒径は約５μｍから１０００μｍであることが好ましく、より好ましくは約２０〜８００μｍ、最も好ましくは約３０〜６００μｍである。
【００５２】
本発明において、プロテインＡ様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質の該基材への固定化は、共有または非共有結合、例えばアフィニティ、会合、抗原抗体反応、水素結合、コンジュゲーションなどにより実施しうる。また、当業者に周知の手段により、当該蛋白質に対してアミノ酸残基の付加、置換、欠失などの分子改変を施し、該基材への固定化を容易にすることも可能である。例えば、プロテインＡ様蛋白質の分子内にシステイン残基を導入することによって、プロテインＡ様蛋白質を前記基材に容易に固定化することができる。
【００５３】
本発明の製造方法によって得られるイムノグロブリン吸着担体は、イムノグロブリン、特にＩｇＧの精製用担体として好適に用いられ得る。また、血漿からのＩｇＧの除去等、疾病治療への応用も可能である。
【実施例】
【００５４】
以下、参考例及び実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するものでない。本発明の実施にあたり、組換えＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。 (1) T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook著、「モレキュラー・クローニング／ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning/A Laboratory Manual）」、第２版（1989）、Cold Spring Harbor Laboratory 刊（米国）。 (2) 村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（1996）、丸善株式会社刊。
【００５５】
（実施例１） スタフィロコッカス・アウレウス ＡＴＣＣ６５３８Ｐ株由来のプロテインＡをコードするＤＮＡ配列のクローニング
スタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣ６５３８Ｐ株を、Ｔ２液体培地（ポリペプトン １％、イーストエキストラクト ０．２％、グルコース１％、魚肉エキス０．５％、ｐＨ７．０）で３７℃一晩振とう培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により回収後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２度洗浄した。菌体を同緩衝液に懸濁後、１％ＳＤＳで溶菌し、６０℃にて３０分間加熱後、フェノール抽出及びエタノール沈殿等の定法により全ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００５６】
次に、プロテインＡ遺伝子のＤＮＡ配列情報（非特許文献６）を基に、２つのオリゴヌクレオチドプライマー5'-TTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCGCAACACGATGAAGCT-3' (配列番号５)と5'-CGGGATCCCTAAAATACAGTTGTACCGATGAATGGATT-3'（配列番号６）を調製した。上記のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これら２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、プロテインＡからシグナルシーケンス（Ｓドメイン）及び細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）の一部を除いた部分（これ以降ＳＰＡと称する）をコードするＤＮＡ断片（約１．２ｋｂｐ（キロ塩基対））を増幅した。
【００５７】
得られたＤＮＡ断片は、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化した後、アガロースゲルより分離回収した。
【００５８】
一方、ブレビバチルス発現ベクターであるｐＮＨ３０１（Shiga. Y.ら. Appl. Environ. Microbiol. 1992. 58:525-531.）もまた同様に制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。
【００５９】
制限酵素処理したＳＰＡをコードする上記ＤＮＡ断片と上記発現ベクターｐＮＨ３０１とをＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、ＳＰＡ発現プラスミドＳｐａ−ｐＮＨ３０１を構築した（図３、４；配列番号７、８）。図３および図４において、「ＭＷＰ−Ｐ５」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ５プロモーター領域、「ＳＤＭ」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＳＤ配列、「ＳＰ」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのシグナルペプチド配列、「ｓｐａ」は「ＳＰＡ」をコードするＤＮＡ配列、「Ｎｍ」はネオマイシン耐性遺伝子コード領域、「Ｒｅｐ／ｐＵＢ１１０」はベクターｐＮＨ３０１の複製開始点を意味する。また図４において、「Ｐ５−３５」および「Ｐ５−１０」は、それぞれ、ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ５プロモーターの−３５領域および−１０領域意味する。公知の方法により、このＳｐａ−ｐＮＨ３０１を用いてブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ、またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株の形質転換を行った。
【００６０】
（実施例２） ブレビバチルス属細菌によるプロテインＡの発現試験
実施例１にて得られた形質転換体、及びその対照となるベクターｐＮＨ３０１のみを有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株のそれぞれを、生産培地３ＹＣ（ポリペプトンＳ ３％、酵母エキス０．５％、グルコース３％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１％、ＣａＣｌ2・７Ｈ2Ｏ ０．０１％、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０００１％ ｐＨ７．０）にネオマイシン６０ｍｇ/Ｌを添加した培地にて、３０℃で、好気的条件下、３日間培養を行った。培養液は遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、定法により、１０−２０％グラジエントゲルを用いた還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。電気泳動後、ゲルをＣＢＢ染色することにより、ＳＰＡのバンドを検出した（図５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果、その培養上清液中に大量のＳＰＡを確認することが出来た。
【００６１】
なお、プロテインＡの細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）を含めた完全長型のプロテインＡを発現させる場合には、以下の方法を採用することができる。実施例１で記載したスタフィロコッカス・アウレウスから調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、２つのオリゴヌクレオチドプライマー5'- TTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCGCAACACGATGAAGCT-3' (配列番号５)と、5'-CGCGGATCCTTATAGTTCGCGACGACG-3'（配列番号９）または5'- CGCGGATCCTCAACGTATATAAGTTAAAAT-3'（配列番号１０）とを用い、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅する。得られたプロテインＡをコードするＤＮＡ断片は、実施例１にて記載された方法によりｐＮＨ３０１のＮｃｏＩとＢａｍＨＩとの間へ連結する。得られたプラスミドをブレビバチルス・ブレビス４７Ｋまたはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株へ形質転換することで形質転換体を取得する。この形質転換体を実施例２に記載された培養方法にて培養した後、培養液中へ分泌されたプロテインＡを確認する。
【００６２】
（実施例３） ブレビバチルス属細菌により生産されたプロテインＡの抗体結合能の測定実施例１で得られた形質転換体により生産されたＳＰＡが抗体結合能を有するか確認するため、マウス抗ヒトＩｇＧ抗体及びアルカリフォスファターゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて結合試験を行った。
【００６３】
実施例１にて得られた、Ｓｐａ−ｐＮＨ３０１、及びその対照となるｐＮＨ３０１をそれぞれ有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株を、実施例２と同様に培養し、それぞれの培養上清液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、定法によりＰＶＤＦメンブランへ転写し、３％スキムミルクにてブロッキングを行い、Fahnestockら（Fahnestock. S. Rら. J. Bacteriol. 1986. 165:796-804.）らの方法に準じて抗体結合試験を行った。検出は、ＡＰ発色キット（バイオラッド社製）を用い、その取扱い説明書に従って実施した。その結果、比較対照であるベクターｐＮＨ３０１のみを有する形質転換体ではバンドは認められなかった。一方、ＳＰＡ発現ベクターＳｐａ−ｐＮＨ３０１を有する形質転換体では、ＳＰＡと同じ移動度、すなわちＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、ＣＢＢ染色で濃いバンドの認められた４２ｋＤａ付近に強い発色が認められた（図６）。図６において、「Ｍ」は分子量マーカー、「Ｃ」はベクターｐＮＨ３０１を有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株、ＳｐａはＳＰＡ発現ベクターＳｐａ−ｐＮＨ３０１を有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株のレーンを示す。これらの結果から、ＳＰＡ発現ベクターＳｐａ−ｐＮＨ３０１を有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株により生産された分子量約４２ｋＤａの蛋白質は、抗体結合活性を有することが確認された。
【００６４】
（実施例４） ブレビバチルス発現ベクターｐＮＫ３２６０の構築
ｐＮＨ３２６（Ishihara. Tら、1995. J. Bacteriol, 177:745-749）に含まれるＭＷＰのＰ５プロモーターをＭＷＰのＰ２プロモーターに変換して、ブレビバチルス発現ベクターｐＮＫ３２６０を以下のように構築した。
【００６５】
まず、ｐＮＨ３２６を鋳型として、２つのオリゴヌクレオチドプライマー5'-GGAATTCTGATTTCACTTTTTGCATTCTACA-3'（配列番号１３）および5'-AGTGCACTCGCACTTACTGT-3'（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行い、ｐＮＨ３２６のうちＭＷＰのＰ５プロモーターを除く部分を増幅し、その末端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化した。次に、ＭＷＰのＰ２プロモーターを含む２本鎖ＤＮＡ断片5'- GGTACCAATTGGCGCCGCAACTTTTGATTCGCTCAGGCGTTTAATAGGATGTAATTGTGAGCGGATAACAATTATTCTGCATGGCTTTCCTGCGAAAGGAGGTGCACCGCGCTTGCAGGATTCGGGCTTTAAAAAGAAAGATAGATTAACAACAAATATTCCCCAAGAACAATTTGTTTATACTGGAGGAGGAGAACACAAGGTCATGAAAAAAAGAAGGGTCGTTAACAGTGTATTGCTTCTGCTACTGCTAGCTAGTGCACTCGCACTTACTGTTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCAGGATCCGTCGACTCTAGACTCGAGGAATTCGGTACCCCGGGTTCGAAATCGATAAGCTTCTGT- 3'（配列番号１５）を定法に従い調製し、その末端を制限酵素ＭｕｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、ｐＮＫ３２６０を構築した。
【００６６】
（実施例５） スタフィロコッカス・アウレウス・コワンＩ株（ＪＣＭ２１７９）由来のプロテインＡをコードするＤＮＡ配列のクローニング
実施例１と同様に、スタフィロコッカス・アウレウス・コワンＩ株（ＪＣＭ２１７９）から全ゲノムＤＮＡを抽出した。次に、プロテインＡ遺伝子のＤＮＡ配列情報（非特許文献２）を基に、２つのオリゴヌクレオチドプライマー5'- TTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCGCAACACGATGAAGCTCAACAA-3' (配列番号１６)と 5'-CGGGATCCCTATTTTGGTGCTTGAGCATCGTTTAGCTTTTTAGCTTCTGCTAAAATTTTC-3'（配列番号１７）を調製した。上記のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これら２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、プロテインＡからシグナルシーケンス（Ｓドメイン）及び細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）を除いた部分（これ以降ＳＰＡ’と称する）をコードするＤＮＡ断片（約０．９ｋｂｐ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片は、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化した後、アガロースゲルより分離回収した。
【００６７】
一方、実施例４で構築したブレビバチルス発現ベクターｐＮＫ３２６０もまた同様に制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。
【００６８】
制限酵素処理後の、ＳＰＡ’をコードする上記ＤＮＡ断片と上記発現ベクターｐＮＫ３２６０とをＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し、ＳＰＡ’発現プラスミドＳｐａ’−ｐＮＫ３２６０を構築した（図７、８；配列番号１８、１９）。図７および図８において、「ＭＷＰ−Ｐ２」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ２プロモーター領域、「ＳＤＭ」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＳＤ配列、「ＳＰ’」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのシグナルペプチド配列を一部改変した改変型シグナルペプチド配列、「ｓｐａ’」はＳＰＡ’をコードするＤＮＡ配列、「Ｎｍ」はネオマイシン耐性遺伝子コード領域、「Ｒｅｐ／ｐＵＢ１１０」はベクターｐＮＫ３２６０の複製開始点を意味する。また図８において、「Ｐ２−３５」および「Ｐ２−１０」は、それぞれ、ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ２プロモーターの−３５領域および−１０領域意味する。
【００６９】
公知の方法により、このＳｐａ’−ｐＮＫ３２６０を用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株の形質転換を行った。
【００７０】
（実施例６） ブレビバチルス属細菌により分泌発現されたプロテインＡの培養液中の挙動
実施例５にて得られた形質転換体を、生産培地３ＹＣ（ポリペプトンＳ ３％、酵母エキス０．５％、グルコース３％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１％、ＣａＣｌ2・７Ｈ2Ｏ ０．０１％、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０００１％ ｐＨ７．０）にネオマイシン６０ｍｇ/Ｌを添加した培地にて、３０℃の、好気的条件下で培養した。培養開始から、２４、４８、７２、７８時間後に培養液を分取し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、定法により、１０−２０％グラジエントゲルを用いた還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。電気泳動後、ゲルをＣＢＢ染色することにより、ＳＰＡ’のバンドを検出した（図９）。図９において、「レーン番号１」は分子量マーカーを、「レーン番号２」は対照として用いたＲｅｐｌｉｇｅｎ社製プロテインＡ（ｒＰＡ−５０）０．５２μｇを、「レーン番号３」は培養開始から２４時間経過後のＳＰＡ’発現ベクターＳｐａ’−ｐＮＫ３２６０を有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株の培養上清１μｌを、「レーン番号４」は培養開始から４８時間経過後の同培養上清１μｌを、「レーン番号５」は培養開始から７２時間経過後の同培養上清１μｌを、「レーン番号６」は培養開始から７８時間経過後の同培養上清１μｌを、それぞれ泳動したレーンを示す。
【００７１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果、目的とするＳＰＡ’は、培養開始後４８時間目（レーン番号４）には大量に発現し、それ以降もＳＰＡ’の濃度は上昇しつづけ、最終的に培養上清中に約２ｇ/Ｌの濃度で蓄積していた。培養上清中のＳＰＡ’の濃度は、レーン番号２で泳動したＲｅｐｌｉｇｅｎ社製プロテインＡ（ｒＰＡ−５０）０．５２μｇのバンドを対照として、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により測定した。
【００７２】
（実施例７） 形質転換体により生産されたプロテインＡのＮ末端アミノ酸配列の確認
図９に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のレーン番号６において、分子量３３ｋＤａ付近に見られるＳＰＡ’のバンドについて、そのＮ末端から１０残基のアミノ酸配列を、定法に従い解析した。その結果、配列番号２に示したプロテインＡのアミノ酸配列の３７番目のＡｌａ以降の配列と一致し、分泌シグナル配列が正確に除去されていることが確認された。
【００７３】
（実施例８） 形質転換体により生産されたプロテインＡの抗体結合活性
実施例６と同様に７８時間培養して得られた培養液の上清１Ｌを、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：アマシャムバイオサイエンス）に供し、ｐＨ７．０において０−１Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配により分離した。次にＳＰＡ’画分を回収し、疎水クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：アマシャムバイオサイエンス）に供し、ｐＨ７．０において１−０Ｍ硫酸アンモニウムの濃度勾配により分離した。さらに、ＳＰＡ’画分を回収し、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇ：アマシャムバイオサイエンス）に供し、ＳＰＡ’画分を回収した。以上の精製操作により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示す、約１００ｍｇのＳＰＡ’を調製した。
【００７４】
上記で調製したＳＰＡ’のヒトＩｇＧ結合活性を以下の様に評価した。まず、５μｇ／ｍＬとなるようにＳＰＡ’をＰＢＳ緩衝液（タカラバイオ）で希釈し、９６穴イムノプレート（ＮＵＮＣ）に１００μＬずつ分注した。３７℃で１時間反応させた後に、ＰＢＳ緩衝液（２５０μＬ）にて二回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ溶液を２５０μＬ加え、４℃で一晩ブロッキングした。次に、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で調製した２５μｇ／ｍＬヒトＩｇＧ（シグマ）溶液１００μｌを加えて、３７℃で、１．５時間反応後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液で洗浄した。これに、ＰＢＳ緩衝液にて２０００倍に希釈したＨＲＰ標識プロテインＬ（０．３ｍｇ／ｍｌ；シグマ社）溶液を１００μｌ加え、３７℃で、１．５時間反応後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液で洗浄した。さらに、発色基質［２，２’−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリンー６−スルフォン酸）アンモニウム塩］溶液（シグマ社）を１００μｌ加え、暗所にて２０分間反応後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。この時、対照としてＲｅｐｌｉｇｅｎ社製プロテインＡ（ｒＰＡ−５０）についても同様の操作を行い、測定値を比較したところ、上記で調製したＳＰＡ’の単位質量当たりのヒトＩｇＧ結合活性は、上記Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製プロテインＡの約９７％であり、両者はほぼ同等の活性を有することが確認された。
【００７５】
以上の結果から、実施例によるプロテインＡの生産方法によれば、従来報告されていた大腸菌、枯草菌における組換え型プロテインＡの発現量を上回る生産性を達成でき、従来問題となっていた低生産性の問題を解決できることを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＡ様蛋白質、または、その配列の任意の一部分から構成されイムノグロブリン結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌で機能しうるプロモーターを含む、ＤＮＡ。
【請求項２】
該プロモーターが、ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質のプロモーターであり、該プロモーターの下流に、ブレビバチルス属細菌で機能しうるシャインダルガノ配列、及びブレビバチルス属細菌で機能しうる分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
発現した該蛋白質がＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示す、請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターを含む、ブレビバチルス属細菌形質転換体。
【請求項６】
該ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）４７株（ＪＣＭ６２８５）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株（ＪＣＭ８９７０）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）株およびブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３）、並びにこれらの株由来の変異体からなる群より選択される、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
培養上清中に約２ｇ/Ｌの濃度で該蛋白質を蓄積する、請求項５または６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換体を培養する工程、および、該形質転換体によって分泌生産されるプロテインＡ様蛋白質またはその配列の任意の一部分から構成されイムノグロブリン結合活性を有する蛋白質を回収する工程を含む、蛋白質の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の製造方法によってプロテインＡ様蛋白質またはその配列の任意の一部分から構成されイムノグロブリン結合活性を有する蛋白質を製造する工程、および該蛋白質を適当な基材に固定化する工程を含む、イムノグロブリン吸着担体の製造方法。
【請求項１】
プロテインＡ様蛋白質、または、その配列の任意の一部分から構成されイムノグロブリン結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌で機能しうるプロモーターを含む、ＤＮＡ。
【請求項２】
該プロモーターが、ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質のプロモーターであり、該プロモーターの下流に、ブレビバチルス属細菌で機能しうるシャインダルガノ配列、及びブレビバチルス属細菌で機能しうる分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
発現した該蛋白質がＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示す、請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターを含む、ブレビバチルス属細菌形質転換体。
【請求項６】
該ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）４７株（ＪＣＭ６２８５）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株（ＪＣＭ８９７０）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）株およびブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３）、並びにこれらの株由来の変異体からなる群より選択される、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
培養上清中に約２ｇ/Ｌの濃度で該蛋白質を蓄積する、請求項５または６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換体を培養する工程、および、該形質転換体によって分泌生産されるプロテインＡ様蛋白質またはその配列の任意の一部分から構成されイムノグロブリン結合活性を有する蛋白質を回収する工程を含む、蛋白質の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の製造方法によってプロテインＡ様蛋白質またはその配列の任意の一部分から構成されイムノグロブリン結合活性を有する蛋白質を製造する工程、および該蛋白質を適当な基材に固定化する工程を含む、イムノグロブリン吸着担体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図５】
【図６】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図５】
【図６】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−２４６５６９（Ｐ２０１０−２４６５６９Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７９３７８（Ｐ２０１０−１７９３７８）
【出願日】平成２２年８月１０日（２０１０．８．１０）
【分割の表示】特願２００６−５２８８６７（Ｐ２００６−５２８８６７）の分割
【原出願日】平成１７年７月１日（２００５．７．１）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１０日（２０１０．８．１０）
【分割の表示】特願２００６−５２８８６７（Ｐ２００６−５２８８６７）の分割
【原出願日】平成１７年７月１日（２００５．７．１）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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